CN105769871A - Nik蛋白激酶抑制剂作为制备治疗肝病的药物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化学药物技术领域，具体涉及NIK蛋白激酶抑制剂作为治疗肝脏炎症、急性肝损伤、肝纤维化和肝硬化的药物。本发明的实验结果表明，NIK抑制剂可以抑制肝实质细胞里NIK诱导的NF‑κB2活化——由无活性的前体p100转化到有活性的p52。可以抑制NIK诱导的NF‑κB启动子活性。可以抑制肝实质细胞里NIK诱导的炎症相关基因的表达。可以抑制四氯化碳（CCL4）诱导的肝损伤、炎症、纤维化。本发明实现了以NIK抑制剂制备一种药物，在缓解治疗肝脏炎症、损伤、纤维化和肝硬化方面有显著的疗效。
Description
技术领域
本发明化学药物技术领域，具体涉及NIK蛋白激酶抑制剂作为治疗肝脏炎症、急性肝损伤、肝纤维化和肝硬化药物的应用。
背景技术
NF-κB是重要的转录因子，参与了免疫应答、细胞死亡和存活等生命活动，在癌症、炎症、肥胖、糖尿病、肝脏损伤和纤维化等疾病中起重要作用1-6。
NF-κB家族包括5个成员:p65(RelA)、p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)、RelB和c-Rel，他们两两形成同源或者异源二聚体2,3。静息情况下，NF-κB与其抑制蛋白IκB（包括IκBα、IκBβ和IκBε）结合，并不表现出转录活性。NF-κB的活化主要有2个主要途径：经典（canonical）和非经典（noncanonical）。经典的NF-κB活化主要由促炎症细胞因子TNFα、IL-1β和IL-6等触发，炎症细胞因子引起IKK磷酸化后，催化底物IkBs磷酸化，促进SCF-E3泛素化酶复合体的催化IkBs多泛素化而被蛋白酶降解，NF-κB因失去IκB的抑制作用而得以进入细胞核参与相关基因的表达1,2。非经典NF-κB活化路径主要由肿瘤坏死因子配体（CD40L、BAFF和LTβR）诱导，NF-κB诱导激酶（NIK）蛋白稳定性增加，与IκBα共同作用下，p100被降解为具有活性的p52，并且RelB组成异源二聚体而进入细胞核调控基因的转录，NIK在非经典NF-κB活化过程中起重要作用7。然而NIK在经典NF-κB活化中也起重要作用:NIK可以直接结合并活化IKKα和IKKβ，而且使IKKα磷酸化程度远大于IKKβ，NIK直接引起IKKαSer-17磷酸化，这个残基突变为丙氨酸阻断了NIK诱导的IKKα活化，破坏了IL-1和TNFα诱导的信号8,9。
NIK介导的非经典NF-κB信号通路在B和T细胞的存活和活化中起重要作用。缺失NIK的病人出现B细胞存活降低，导致淋巴细胞减少10，NIK/NF-κB2信号对B细胞的成熟至关重要7。NIK在T细胞活化中起重要作用11，树突状细胞NIK敲除损伤了效应T细胞的活化并影响了细胞免疫12。
NIK/NF-κB2在糖尿病发生起重要作用。P52在肥胖小鼠肝脏中异常高表达，基因敲除NIK降低了p52表达和血糖，提示NIK/p52在肥胖小鼠肝脏糖异生中起重要作用6。炎症信号分子会诱导NIK/p52在胰岛中高表达，NIK/p52过表达促进胰岛β细胞死亡和血糖增加13。
NIK/NF-κB2参与了肝脏炎症、损伤、纤维化和肝硬化4。在CCl4和酒精诱导的肝损伤以及肝硬化病人肝脏中，NIK/NF-κB2均异常高表达4。STOP-NIK转基因小鼠成年开始的肝脏特异的过表达NIK引起肝脏损伤和纤维化，导致小鼠死亡4。
数个小分子化合物可以抑制NIK活性14，这些小分子化合物可以抑制肿瘤细胞生长15。这些小分子化合物能否抑制肝脏炎症、肝脏损伤、纤维化和肝硬化还不清楚。这些小分子化合物能否治疗肝脏炎症、肝脏损伤、纤维化和肝硬化还没有任何报道。
发明内容
本发明的目的是确定NIK抑制剂可以缓解肝脏炎症、肝损伤和肝脏纤维化，NIK抑制剂可以是治疗肝炎、肝损伤、肝纤维化和肝硬化的药物。
本发明使用的NIK抑制剂已在文章和专利WO2009158011A1里报道过14,16，合成的步骤按照专利WO2009158011A1说明进行16。
根据本发明的结果，NIK抑制剂可以抑制肝实质细胞里NIK诱导的NF-κB2活化——由无活性的前体p100转化到有活性的p52。本发明首先使用其中一个抑制剂B022处理被NIK和p100感染的肝实质细胞（HEP1），B022可以剂量依赖的抑制NIK诱导的p100到p52的转化，B022在0.5μM就有显著抑制作用，5μMB022更显著抑制p100转化到p52。
根据本发明的结果，NIK抑制剂可以抑制NIK诱导的NF-κB启动子活性。本发明首先使用其中一个抑制剂B022处理被NIK和NF-κB启动子荧光素载体的HEK293细胞，B022可以剂量依赖的抑制NIK诱导的NF-κB启动子荧光素活性，B022在0.5μM就有显著抑制作用，5μMB022就可以完全抑制NF-κB启动子荧光素活性。
根据本发明的结果，NIK抑制剂可以抑制肝实质细胞里NIK诱导的炎症相关基因的表达。本发明首先使用其中一个抑制剂B022处理被NIK腺病毒感染的肝实质细胞（HEP1），B022可以剂量依赖的抑制NIK诱导的TNFα、iNOS、MCP1、CCL2、CCL5和CXCL5等基因的表达，B022在0.5μM就有显著抑制作用，5μMB022就可以完全抑制NIK细胞活性。B022还可以时间依赖的抑制NIK诱导的TNFα、iNOS、MCP1、CCL2、CCL5和CXCL5等基因的表达，5μMB022孵育细胞1个小时，就可以抑制基因表达，8个小时就可以完全抑制TNFα、iNOS、MCP1、CCL2、CCL5和CXCL5等基因的表达。
根据本发明的结果，NIK抑制剂对正常小鼠的肝脏没有毒性。本发明首先使用其中一个抑制剂B022处理正常小鼠，B022没有引起ALT、体重、血糖和肝脏形态的变化。
根据本发明的结果，NIK抑制剂可以抑制四氯化碳（CCL4）诱导的肝损伤、炎症、纤维化。本发明首次使用其中一个抑制剂B022处理注射四氯化碳的小鼠，B022可以降低四氯化碳诱导的ALT、肝脏纤维化、肝脏损伤、肝脏炎症基因的表达和肝细胞的死亡。
本发明提供了NIK抑制剂的一种新用途——缓解治疗肝脏炎症、损伤、纤维化和肝硬化。
附图说明
图1：B022合成步骤；
图2：荧光素酶报告基因实验检测B022对NIK诱导的NF-kB2（p52）在Q293T细胞中表达的影响；
图3：westernblot检测B022对Hep1细胞中NIK诱导的NF-kB2(p52)表达的影响；
图4：荧光定量PCR检测B022作用浓度对NIK诱导Hep1细胞产生促炎性细胞因子、趋化因子和诱生型一氧化氮合酶基因转录的影响；
图5：荧光定量PCR检测B022作用时间对NIK诱导Hep1细胞产生促炎性细胞因子、趋化因子和诱生型一氧化氮合酶基因转录的影响；
图6：B022对CCl4诱导的小鼠肝脏损伤血清中谷丙转氨酶（ALT）含量的影响；
图7：HE染色检测B022对CCl4诱导的小鼠肝脏纤维化的保护作用；
图8和9：末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的缺口末端dUTP标记法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediateddUTPnickendlabeling，TUNEL）检测B022对CCl4诱导的小鼠肝脏细胞凋亡的影响；
图10：荧光定量PCR检测B022对CCl4诱导的小鼠肝脏损伤的NIK、p100、促炎性细胞因子、趋化因子和诱生型一氧化氮合酶基因转录的影响；
具体实施方式
实施例1：NIK抑制剂B022的合成。
材料与方法：
2-氨基-5-氯嘧啶-4-醇(2)
室温下，向圆底烧瓶中依次加入2-氨基嘧啶-4-醇(1g,9.1mmol)、乙酸(10mL)和NCS(1.32g,10mmol)，100oC下反应1h。旋蒸，除去乙酸，加入水(20mL)。滤出沉淀物，然后真空干燥过夜。得目标化合物720mg，收率为54%。1HNMR(DMSO-d6,300MHz):7.77(s,1H),6.83(s,2H).ESI-MS理论计算值C4H5ClN3O[M+H]+=146.01,实验测得:145.75.
4，5-二氯嘧啶-2-胺(3)
向圆底烧瓶中先后加入2-氨基-5-氯嘧啶-4-醇(5.16g,36.5mmol)和POCl3(40mL,过量)，110oC下反应3h。加入饱和NaHCO3水溶液调节pH>8。过滤混合物，收集滤液，得目标化合物0.94g，收率为16%。水层用乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，依次用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发仪浓缩。得到另一批目标化合物1.07g，收率为18%。所得产物无需纯化，直接投下一步。1HNMR(DMSO-d6,300MHz):8.35(s,1H),7.33(s,2H).ESI-MS理论计算值C4H435Cl2N3[M+H]+=163.98,实验测得:164.00.实验数据与文献(WO2009/158011A1patent)数据吻合.
4-(6′-溴-1′-吲哚啉基)-5-二氯嘧啶-2-胺(5)
向含有4，5-二氯嘧啶-2-胺(2g,12.2mmol)和6-溴吲哚啉(2.04g,10.2mmol)的圆底烧瓶中先后加入异丙醇(30mL)和浓盐酸(2mL)，回流过夜。然后，用旋转蒸发仪浓缩反应混合物，加入NaHCO3饱和水溶液调节pH>8。水层用乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，依次用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发仪浓缩。快速柱层析法纯化粗品，得目标化合物1.32g，收率为40%。1HNMR(DMSO-d6,300MHz):11.02(s,1H),8.20(s,1H),7.19(d,J=7.86Hz,1H),7.16(dd,J=7.86,1.76Hz,1H),4.12(t,J=8.40Hz,2H),3.10(t,J=8.56Hz,2H).ESI-MS理论计算值C12H1179Br35ClN4[M+H]+=324.99,实验测得:325.00.
4-(1′-(2″-氨基-5″-氯-4″-嘧啶基)-6′-吲哚啉基)-2-(2′-噻唑基)-3-丁炔-2-醇(B022)
向圆底烧瓶中依次加入4-(6′-溴-1′-吲哚啉基)-5-二氯嘧啶-2-胺(340mg,1.0mmol)，CuI(19mg,0.1mmol)，Pd(PPh3)2Cl2(70mg,0.1mmol)和PPh3(52mg,0.2mmol)。然后滴入溶解于甲苯(10mL)的二异丙胺(0.5mL,7mmol)。抽真空后，加入报道的化合物2-(2′-噻唑基)-3-丁炔-2-醇(350mg,2.0mmol)。再次抽真空，80oC下反应16h。反应混合物直接上硅胶柱，快速柱层析法纯化，得固体目标化合物。高效液相色谱法进一步纯化，得到B022的CF3CO2H盐133mg，收率为26%。高效液相色谱法分析确定，最终化合物的纯度为97%。1HNMR(MeOD-d4,300MHz):8.18(s,1H),8.07(s,1H),7.78(d,J=3.30Hz,1H),7.57(d,J=3.30Hz,1H),7.28(d,J=7.73Hz,1H),7.23(d,J=7.73Hz,1H),4.59(t,J=7.90Hz,2H),3.21(t,J=7.93Hz,2H),1.94(s,3H).ESI-MS理论计算值C19H1735ClN5OS[M+H]+=398.08,实验测得:398.20.
结果见图1：B022合成成功。
实施例2：荧光素酶报告基因实验检测B022对NIK诱导的NF-kB2（p52）在Q293T细胞中表达的影响。
材料与方法：
Q293T细胞
pShuttletrackNIK质粒
pGL3NF-kB2质粒（含荧光素酶报告基因）
βGal质粒
共设计6个实验条件，分别为：
（1）双重转染βGal质粒和NF-kB2质粒，B022浓度为0μM；
（2）双重转染βGal质粒和NF-kB2质粒，B022浓度为0.5μM；
（3）双重转染βGal质粒和NF-kB2质粒，B022浓度为5μM；
（4）三重转染βGal质粒、NIK质粒和NF-kB2质粒，B022浓度为0μM；
（5）三重转染βGal质粒、NIK质粒和NF-kB2质粒，B022浓度为0.5μM；
（6）三重转染βGal质粒、NIK质粒和NF-kB2质粒，B022浓度为5μM；
具体做法如下：
将Q293T细胞铺于24孔板中，当细胞密度达到70%-90%时，准备转染。使用PEI转染试剂，利用带有荧光素酶报告基因的pGl3NF-kB质粒和pShuttletrackNIK质粒单一或双重转染。每孔需要配制25μl转染试剂，包括5μlPEI和相应质粒（1μgβGal质粒+1μgNF-kB2质粒或1μgβGal质粒+1μgNIK质粒+1μgNF-kB2质粒），使用无血清DMEM培养基将体积补齐至25μl。将转染试剂混合均匀后，室温下静置15min。在等待期间，将24孔板内的含血清DMEM培养基替换成无血清DMEM培养基，体积为225μl。静置15min后，将转染试剂缓慢加入至各个孔中。将24孔板置于37℃，5%CO2培养箱中培养，4h后，向每孔中添加250μl含血清DMEM培养基。12h时后，将转染试剂弃掉，添加500μl相应浓度B022的含血清DMEM培养基。48h后，裂解细胞，以荧光素为底物，使用荧光分析测度仪测定荧光素酶的活力。
结果见图2：NIK可以诱导NF-kB2的表达。加入B022后，其可以呈浓度依赖性的降低NF-kB2的表达，说明B022可以呈浓度依赖性地抑制NIK的活性。
实施例3：westernblot检测B022对Hep1细胞中NIK诱导的NF-kB2(p52)表达的影响。
以βGal、NIK和p100腺病毒单一、双重或三重感染Hep1细胞，westernblot检测NF-kB2(p52)表达。
材料与方法：
Hep1细胞
βGal、NIK和p100腺病毒
B022
共设计5个实验条件，分别为：
（1）βGal单一感染；
（2）p100单一感染；
（3）p100+NIK双重感染，NIK病毒的含量为p100的1/10,B022浓度为0μM；
（4）p100+NIK双重感染，NIK病毒的含量为p100的1/10,B022浓度为0.5μM；
（5）p100+NIK双重感染，NIK病毒的含量为p100的1/10,B022浓度为5μM；
具体实验步骤：
（1）Hep1细胞的准备：将Hep1细胞铺至6孔板，当细胞密度为90%左右时，准备感染病毒；
（2）每孔使用800μl含血清DMEM培养基溶解相应病毒和相应含量的B022；
（3）将病毒和B022混合均匀后，缓慢加入各孔中；
（4）将六孔板置于37℃，5%CO2培养箱中处理8h后，弃掉培养基，每孔加入60μl含1%PMSF的L-RIPAbuffer，用细胞刮铲将细胞刮下，转移至EP管中，裂解细胞，时间为20min，每隔5min涡旋震荡。12000rpm，4℃离心10min；
（5）吸取上清，蛋白定量，加入4×上样缓冲液，100℃煮10min，准备上样；
（6）120V电泳90min；
（7）100V转印90min；
（8）5%脱脂奶粉封闭1h；
（9）一抗4℃孵育12h；
（10）0.05%PBST洗膜，10min/次，共3次；
（11）二抗室温孵育1h；
（12）0.05%PBST洗膜，10min/次，共3次；
（13）ECL化学发光显色液曝光。
结果见图3：在Hep1细胞中，NIK可以促进p100转化为活性形式p52。加入B022后，可以呈浓度依赖性的降低p52的表达，B022浓度越高，p52表达量越少。
实施例4：荧光定量PCR检测B022作用浓度对NIK诱导Hep1细胞产生促炎性细胞因子、趋化因子和诱生型一氧化氮合酶基因转录的影响。
材料与方法：
Hep1细胞
βGal和NIK腺病毒
B022
以βGal、NIK单一感染Hep1细胞，检测B022处理浓度对一些促炎性细胞因子和趋化因子基因、诱生型一氧化氮合酶基因转录的影响。共设计4个实验条件：
（1）βGal感染；
（2）NIK感染，B022浓度为0μM；
（3）NIK感染，B022浓度为0.5μM；
（4）NIK感染，B022浓度为5μM。
具体实验步骤为：
（1）Hep1细胞的准备：将Hep1细胞铺至24孔板，当细胞密度为90%左右时，准备感染病毒；
（2）每孔使用300μl含血清DMEM培养基溶解相应病毒和相应含量的B022；
（3）将病毒及B022混合均匀后，缓慢加入各孔中；
（4）将24孔板置于37℃，5%CO2培养箱中处理8h后，弃掉培养基，每孔加入500μlTRIZOL试剂裂解细胞；
（5）以TRIZOL反复吹打细胞，吹打完毕后，将液体移至EP管中，室温静置2min；
（6）每管加入100μl氯仿，剧烈震荡，室温静置2min；
（7）12000rpm4℃离心10min，将上清转移至新的EP管；
（8）加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置10min；
（9）12000rpm4℃离心10min，白色沉淀为RNA，弃去上清；
（10）加入75%乙醇，洗涤RNA沉淀一次，8000rpm4℃离心5min，弃去上清；
（11）EP管开口，室温干燥5-10min，加入12μlDEPC水溶解；
（12）检测RNA浓度；
（13）取3μgRNA，1μgRandomPrimer，加DEPC水至15μl，70℃孵育10min，立即至于冰上5min；
（14）加入15μl反转录液（6μl5×RTbuffer，3μl10mMdNTP，0.5μlMMLV,5.5μlddH2O），42℃孵育1h，99℃孵育5min；
（15）加入30μlDEPC水，取1μl作为RT-PCR的模板；
（16）以荧光定量PCR检测TNFα、MCP-1、CCL2、CCL5、CXCL5和iNOSmRNA的表达；
结果见图4：在Hep1细胞中，NIK可以诱导促炎性因子（TNFα）、趋化因子（MCP-1、CCL2、CCL5、CXCL5）基因的转录，也可以促进诱生型一氧化氮核酶（iNOS）基因的转录。当加入不同剂量的B022以后，它可以呈浓度依赖性地降低以上基因的转录，B022浓度越高，基因转录水平越低。
实施例5：荧光定量PCR检测B022作用时间对NIK诱导Hep1细胞产生促炎性细胞因子、趋化因子和诱生型一氧化氮合酶基因转录的影响。
材料与方法：
Hep1细胞
βGal和NIK腺病毒
B022
以βGal、NIK单一感染Hep1细胞，检测B022处理时间对一些促炎性细胞因子、趋化因子和诱生型一氧化氮基因转录的影响。共设计4个实验条件：
（1）βGal感染；
（2）NIK感染，B022浓度为5μM，作用时间为1h；
（3）NIK感染，B022浓度为5μM，作用时间为2h；
（4）NIK感染，B022浓度为5μM，作用时间为4h；
（5）NIK感染，B022浓度为5μM，作用时间为8h；
具体实验步骤为：
（1）Hep1细胞的准备：将Hep1细胞铺至24孔板，当细胞密度为90%左右时，准备感染病毒；
（2）每孔使用300μl含血清DMEM培养基溶解相应病毒和相应含量的B022；
（3）将病毒及B022混合均匀后，缓慢加入各孔中；
（4）将24孔板置于37℃，5%CO2培养箱中处理8h后，弃掉培养基，每孔加入500μlTRIZOL试剂裂解细胞；
（5）以TRIZOL反复吹打细胞，吹打完毕后，将液体移至EP管中，室温静置2min；
（6）每管加入100μl氯仿，剧烈震荡，室温静置2min；
（7）12000rpm4℃离心10min，将上清转移至新的EP管；
（8）加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置10min；
（9）12000rpm4℃离心10min，白色沉淀为RNA，弃去上清；
（10）加入75%乙醇，洗涤RNA沉淀一次，8000rpm4℃离心5min，弃去上清；
（11）EP管开口，室温干燥5-10min，加入12μlDEPC水溶解；
（12）检测RNA浓度；
（13）取3μgRNA，1μgRandomPrimer，加DEPC水至15μl，70℃孵育10min，立即至于冰上5min；
（14）加入15μl反转录液（6μl5×RTbuffer，3μl10mMdNTP，0.5μlMMLV,5.5μlddH2O），42℃孵育1h，99℃孵育5min；
（15）加入30μlDEPC水，取1μl作为RT-PCR的模板；
（16）以荧光定量PCR检测TNFα、MCP-1、CCL2、CCL5、CXCL5和iNOSmRNA的表达；
结果见图5：在Hep1细胞中，NIK可以诱导促炎性因子（TNFα）、趋化因子（MCP-1、CCL2、CCL5、CXCL5）基因的转录，也可以促进诱生型一氧化氮核酶（iNOS）基因的转录。当加入相同剂量的B022以后，处理不同时间，它可以呈时间依赖性地降低以上基因的转录，B022处理时间越长，基因转录水平越低。
实施例6：CCl4诱导小鼠肝损伤模型的建立
材料与方法：
C57BL/6小鼠，周龄为8周，平均体重为22-23g；
体积分数为10%CCl4的橄榄油溶液；
将小鼠分为2组，每组7只，分别为CCl4处理组和B022保护组。CCl4处理组以2μl/g的剂量进行腹腔注射CCl4的橄榄油溶液，B022保护组以相同剂量腹腔注射CCl4的橄榄油溶液，同时每隔3h尾静脉注射1次B022，剂量为25mg/kg，一共注射4次，12h后，将小鼠处死，保留血清和肝脏组织。
实施例7：B022对CCl4诱导的小鼠肝脏损伤血清中谷丙转氨酶（ALT）含量的影响。
材料与方法：
使用南京建成谷丙转氨酶（ALT/GPT）测试盒测定小鼠血清中ALT含量。
结果见图6：谷丙转氨酶（ALT）是重要的评估肝脏损伤的生化指标。在CCl4处理组中，小鼠血清中ALT含量较正常小鼠显著升高，而在B022组保护中，小鼠血清中ALT含量较CCl4处理组显著下降。
实施例8：HE染色检测B022对CCl4诱导的小鼠肝脏纤维化的保护作用。
材料与方法：
将小鼠处死后，取出肝脏，4%多聚甲醛固定24h，石蜡包埋，切片，常规HE染色。在显微镜放大200倍视野下，观察切片。
结果如图7：CCl4处理组，肝小叶结构破坏，肝索排列紊乱，肝血窦扩张，肝细胞明显肿胀，伴有炎性细胞浸润。而在B022保护组中，肝小叶结构较为清晰，肝细胞排列整齐，但伴有少量呈气球状重大的细胞，中央静脉周围呈放射状分布，炎性细胞浸润减少。
实施例9：末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的缺口末端dUTP标记法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediateddUTPnickendlabeling，TUNEL）检测B022对CCl4诱导的小鼠肝脏细胞凋亡的影响。
材料与方法：
RocheInsitucelldeathdetectionkit，Fluorescein
将小鼠肝脏组织以4%多聚甲醛固定24h，30%蔗糖PBS溶液脱水12h后，OCT包埋剂包埋，至于-80℃保存，用于冰冻切片制作。
冰冻切片具体做法如下：
（1）将包埋冻好的组织夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平；
（2）调节欲切厚度10μm，选取细胞密集的位置开始切片；
（3）取一载玻片，将切片附于其上；
（4）切片后，以PBS清洗2次，每次3min；
（5）透化，加入透化液（0.5%Triton-X100,0.05%SDS溶解在PBS中），室温下孵育30min；
（6）以PBS清洗2次，每次3min；
（7）载玻片干燥后，用PAP笔在组织样品周围画一个圈；
（8）使用TUNEL试剂盒染色，37℃潮湿环境中孵育1h；
（9）以PBS清洗2次，每次3min；
（10）使载玻片干燥后，在组织样片上滴加DAPI荧光染色剂，室温下避光孵育10min；
（11）以PBS清洗，载玻片干燥后，向载玻片上滴加一滴防荧光淬灭剂，封片；
（12）荧光显微镜下观察拍照，具体按每张切片在200倍视野下随机选取5个视野，计数每个视野中凋亡肝细胞和肝细胞总数，其每个视野中凋亡率（%）=（凋亡肝细胞数/肝细胞总数）×100%。
结果见图8、9：在荧光显微镜下观察发现，CCl4+B022处理组TUNEL阳性细胞显著少于CCl4处理组。
实施例10：荧光定量PCR检测B022对CCl4诱导的小鼠肝脏损伤的NIK、p100、促炎性细胞因子、趋化因子和诱生型一氧化氮合酶基因转录的影响。
（1）取50-100mg小鼠肝脏组织，置于玻璃匀浆器中，加入1mlTRIZOL，匀浆，室温放置2min；
（2）加入200μl氯仿，剧烈震荡，室温静置2min；
（3）12000rpm4℃离心10min，将上清转移至新的EP管；
（4）加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置10min；
（5）12000rpm4℃离心10min，白色沉淀为RNA，弃去上清；
（6）加入75%乙醇，洗涤RNA沉淀一次，8000rpm4℃离心5min，弃去上清；
（7）EP管开口，室温干燥5-10min，加入100μlDEPC水溶解；
（8）检测RNA浓度；
（9）取3μgRNA，1μgRandomPrimer，加DEPC水至15μl，70℃孵育10min，立即至于冰上5min；
（10）加入15μl反转录液（6μl5×RTbuffer，3μl10mMdNTP，0.5μlMMLV,5.5μlddH2O），42℃孵育1h，99℃孵育5min；
（11）加入30μlDEPC水，取1μl作为RT-PCR的模板；
（12）以荧光定量PCR仪检测NIK、p100、TNFα、MCP-1、CCL2、CCL5、CXCL5和iNOSmRNA的表达；
结果见图10：在CCl4处理组中，NIK、p100、TNFα、MCP-1、CCL2、CCL5、CXCL5和iNOSmRNA表达水平显著高于正常小鼠，而在B022保护组中，B022可以显著降低p100、TNFα、MCP-1、CCL2、CXCL5和iNOSmRNA的表达。
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1.NIK蛋白激酶抑制剂作为制备治疗肝脏炎症、急性肝损伤、肝纤维化和肝硬化的药物的应用。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN110373426A (zh) * | 2019-09-03 | 2019-10-25 | 哈尔滨工业大学 | 非肥胖性糖尿病动物模型、构建方法及其应用 |
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-
2016
- 2016-03-03 CN CN201610119409.4A patent/CN105769871A/zh active Pending
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