JP6980005B2 - 前立腺がんの増殖および転移を処置するための医薬品の調製におけるホスホジエステラーゼ４阻害剤ＺＬ−ｎ−９１の適用 - Google Patents

Description

本発明は、ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤の適用に関し、詳細には、ＰＤＥ４阻害剤ＺＬ−ｎ−９１の適用に関する。本発明は、腫瘍生物学の分野に属する。

前立腺がんは、欧州および米国で男性において最も一般的な悪性腫瘍である。前立腺がんは、米国において男性間で発生率において１位に、かつ死亡率において肺がんのみに次いで２位にランクする。前立腺がん発生率は、中国において近年継続的に上昇しており、中国の患者の組織学的悪性度は、米国の患者のものよりも高い。上海において泌尿器科のがんを有する患者の相対生存率の調査によれば、８０．０％〜９０．０％の患者は、中国において診断時に進行性前立腺がんを発症しており、５年生存率が３０％未満である。中国では人口が多いので、前立腺がんを有する患者の数は、劇的に増加し、そのため、前立腺がんの予防および治療を向上させることが必要である。前立腺がんのための従来の治療には、外科手術、内分泌療法、ならびに放射線療法および化学療法が含まれるが、治療効果は十分でない。再発性前立腺がんには、アンドロゲン欠乏を用いた内分泌療法が採用されることが多い。前立腺がんは、一般に、継続的な内分泌療法の２〜５年後にアンドロゲン非依存性を獲得する。アンドロゲン非依存性前立腺がんを有する患者のために現在使用される療法には、化学療法、放射線療法、放射性核種に対する内部曝露およびビスホスホネート治療法などが含まれるが、効能は十分でない。前立腺がんの治療は窮地にあり、新しい治療法を開発することは急を要する。したがって、科学者および臨床専門家は、より安全かつより有効な治療法を積極的に探求している。

ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は、細胞内二次メッセンジャーｃＡＭＰまたはｃＧＭＰを加水分解して、これらの二次メッセンジャーによって媒介されるシグナル伝達経路に作用し、細胞機能を制御する機能を有する。ＰＤＥは、１１種のサブタイプを含み、そのうちのＰＤＥ４は、ｃＡＭＰを特異的に加水分解する。ＰＤＥ４は、肥満細胞、マクロファージリンパ球、上皮細胞などを含む多様な炎症細胞内に主に分布する。それは、単球およびマクロファージの活性化、好中球浸潤、脈管平滑筋の増殖、血管拡張および心筋収縮などを促進することを含む、関連する生理学的および病理学的な過程に関与し、中枢神経系機能、心血管系機能、炎症／免疫系、および細胞接着に対する影響を有する。研究により、ＰＤＥ４阻害剤（ＰＤＥ４ｉ）は、抗炎症、抗アレルギー、および抗血小板活性化の機能を有することが示されている。その主な機序には、以下が含まれる：１）多様な炎症性メディエーター／サイトカインの放出を阻害し、ＩＬ−４およびＩＬ−５遺伝子の発現を阻害する；２）白血球の活性化（呼吸バーストなど）を阻害し、白血球遊走を阻害する；３）細胞接着分子（ＣＡＭ）の発現または上方制御を阻害する；４）阻害活性を有するサイトカイン、例えば、ＩＬ−６などの生成を誘導する；５）アポトーシスを誘導する；６）内因性のホルモンおよびカテコールアミンの放出を刺激する。

開発中のまたは開発されたＰＤＥ４阻害剤は、主に、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、炎症性腸疾患、関節炎などを標的とするが、多くの研究により、ＰＤＥ４阻害剤は、悪性腫瘍に対する著しい阻害効果を有することが示されている。Ｐａｔｒｉｃｉａ Ｇｏｌｄｈｏｆｆは、ヒト脳アストログリオーマ細胞Ｕ８７をヌードマウス内に異種移植し、ＰＤＥ４阻害剤は、腫瘍を有するマウスの生存期間を延長させた。２００６年に、Ｍｏｔｏｓｈｉ Ｎａｒｉｔａは、ＰＤＥ４ｉが、ヒトのメラノーマ細胞の増殖を阻害できることを見出した。Ｐｅｔｒｏｓ Ｘ．Ｅ．Ｍｏｕｒａｔｉｄｉｓは、ＰＤＥ４阻害剤ＣＣ−８０７５およびＣＣ−８０６２を膵がん細胞に添加することにより、細胞増殖を低下させかつアポトーシスを上昇させることができることを見出した。

既存のＰＤＥ４阻害剤には、主に、ロリプラム、シロミラスト、ロフルミラストなどが挙げられる。ロリプラムおよびシロミラストは、眩暈、頭痛および消化管有害反応、例えば、悪心および嘔吐などを引き起こしうるので、それらの適用は制限される。可能性のある消化管副作用の原因のうちの１つは、全ＰＤＥファミリーを阻害する、ＰＤＥ４阻害剤の弱い特異性である。例えば、シロミラストは、ＰＤＥ１、２、３および５についてのＫｉのわずか５００から１０００倍である、９２ｎＭのＫｉでＰＤＥ４を阻害する。したがって、高用量のシロミラストは、他のＰＤＥファミリーメンバーと相互作用して副作用を引き起こしうる。実際に、高用量で嘔吐の副作用を引き起こすことは、大部分のＰＤＥ４阻害剤に共通している。ロフルミラストは、米国ＦＤＡによってＣＯＰＤの治療用に承認されているが、肺炎症を低減し、酸化ストレスに抵抗し、肺の線維症を効果的に軽減し、かつ粘膜クリアランスを促進して気道を再構築するなどし、主に、下痢、体重減少、悪心、心房細動および精神病（例えば、不眠症、不安症、鬱病など）の悪化などを含む、いくつかの有害反応を引き起こすこともある。

本発明の目的は、前立腺がん増殖を阻害するための薬物の調製におけるＰＤＥ４阻害剤ＺＬ−ｎ−９１の適用を提供することである。

上記の目的を達成するために、本発明は、以下の技術的解決策を採用する。

前立腺がんの増殖を阻害するための薬物の調製におけるＰＤＥ４阻害剤ＺＬ−ｎ−９１の適用は、本発明の保護の範囲内である。

本発明において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍細胞および皮下異種移植モデルは、ＺＬ−ｎ−９１の病態生理学的効果を調査するために使用される。実験により、この阻害剤は、ヒト前立腺がんＰＣ−３細胞の増殖および移植された腫瘍の増殖を有意に阻害できることが確認されており、これは、前立腺がんの増殖を阻害する薬物を調製するための基礎を構築するものである。

前立腺がんの転移を抑制するための薬物の調製におけるＰＤＥ４阻害剤ＺＬ−ｎ−９１の適用も、本発明の保護の範囲内である。

本発明は、ヒト前立腺がん細胞ＰＣ−３を使用してＺＬ−ｎ−９１の生物学的効果を調査する。実験結果により、この阻害剤は、前立腺がん細胞の遊走を有意に阻害できることが示され、これは、前立腺がんの転移を抑制する薬物を調製するための基礎を構築するものである。

前立腺がんの増殖および転移を治療するための薬物の調製におけるＰＤＥ４阻害剤ＺＬ−ｎ−９１の適用も、本発明の保護の範囲内である。

上記の適用のための投与の経路は、好ましくは、経口、注射、または吸入である。

本発明のＰＤＥ４阻害剤ＺＬ−ｎ−９１の構造式は、以下の図に示される。

本発明のＰＤＥ４阻害剤ＺＬ−ｎ−９１は、直接に購入または合成されうる。例えば、それは、文献［Ｒｕｉｈｏｎｇ Ｍａ、Ｂｉｎ−ｙａｎ Ｙａｎｇ、Ｃｈａｎｇ−ｙｏｕ Ｗｕ．Ａ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ ４ （ＰＤＥ４） ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｚｌ−ｎ−９１ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ＩＬ−１７ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｍｅｍｏｒｙ Ｔｈ１７ ｃｅｌｌｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２００８、８（１０）：１４０８〜１４１７］を参照して合成されうる。

本発明において化合物の効果を実証するために、マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの異種移植増殖阻害実験およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞実験が下記の実施例において行われ、前立腺がんの増殖および転移に対する本発明のＰＤＥ阻害剤ＺＬ−ｎ−９１の効果がさらに解明される。

本発明は、以下の有益な効果を達成することができる。本発明の選択的ＰＤＥ４阻害剤ＺＬ−ｎ−９１は、腫瘍細胞の増殖および遊走を有意に阻害することができ、このことは、ＰＤＥ４阻害剤ＺＬ−ｎ−９１が、前立腺がんの増殖および転移を阻害するための重要な標的になると予想されることを示している。これは、前立腺がんの増殖に対抗する薬物を調製するための基礎を構築することになり、適用の良好な見込みを示す。ＰＤＥ４Ｄに対するＺＬ−ｎ−９１の阻害効果は、他のＰＤＥファミリーメンバーの阻害効果の５，０００倍を超える。他のＰＤＥ４阻害剤と比較して、この化合物は、ＰＤＥ４Ｄについて、より高い選択性および特異性ならびにより少ない副作用を有し、これにより、嘔吐などの有害反応を効果的に減少させまたはさらに回避することができる。

左図および右図において、異なる用量のＺＬ−ｎ−９１でのヒト前立腺がん細胞ＰＣ−３処理後それぞれ２４時間および４８時間での細胞増殖の結果を示す図である。 ヒト前立腺がん細胞ＰＣ−３を皮下移植したヌードマウスの、ＺＬ−ｎ−９１での治療後の体重における変化を示す図である。 前立腺がん細胞ＰＣ−３皮下異種移植を有するヌードマウスにおけるＺＬ−ｎ−９１の投与後の腫瘍体積および腫瘍重量の変化を示す図である。 前立腺がん細胞ＰＣ−３皮下異種移植を有するヌードマウスからの、ＺＬ−ｎ−９１の投与後の腫瘍の写真を示す図である。 腫瘍組織におけるＫｉ６７の発現を示す図である。左図は免疫組織化学的検査結果を示し、右図は定量分析を示す。 異なる用量のＺＬ−ｎ−９１の投与２４時間後におけるヒト前立腺がん細胞ＰＣ−３の遊走を示す図である。

発明の具体的説明

本発明は、以下の実施例と組み合わせてさらに理解することができる。しかし、当業者は、それらの実施形態の説明が、本発明を例示することのみを意図するものであり、特許請求の範囲に記載されている本発明を限定するものとして解釈されるべきではないことを認識するはずである。

実施例１：ＣＣＫ８アッセイによって検出される前立腺がん細胞の増殖に対するＺＬ−ｎ−９１の効果
１）対数増殖期にあるＰＣ−３細胞を採取して単一細胞懸濁液を調製した。１ウェルあたり１００μｌの細胞懸濁液（１×１０^４細胞を含む）を９６ウェルプレート内に播種し、５つの群：溶媒対照群、１０μＭ群、５０μＭ群、１００μＭ群、２００μＭ群に分けた。それぞれの群は、６つの複製物を含む。細胞を（３７℃、５％ＣＯ_２において）２４時間プレインキュベートした；
２）新しい培地を使用し、異なる濃度のＺＬ−ｎ−９１をそれぞれの群に添加した。細胞を（３７℃、５％ＣＯ_２において）それぞれ２４時間および４８時間継続して培養した；
３）１００μｌの１０％ＣＣＫ−８溶液を各ウェルに気泡なく添加した；
４）細胞を１〜２時間インキュベートし、プレートをそれぞれ３０分、６０分、および９０分で取り出した。マイクロプレートリーダーを使用して、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。

これらの結果を図１に示したが、これは、ヒト前立腺がん細胞ＰＣ−３の増殖が、ＺＬ−ｎ−９１の濃度の上昇に伴って有意に低下したことを示している。

実施例２：ＰＣ−３細胞を皮下移植したヌードマウスの処置
１）対数増殖期にあるＰＣ−３細胞を採取して無血清Ｆ−１２Ｋ培地中に単一細胞懸濁液を調製し、１．５ｍｌのＥＰチューブに１２０μｌずつ分注した（２×１０^６細胞を含む）；
２）調製した細胞懸濁液のうちの０．１ｍｌを１ｍｌの滅菌シリンジでヌードマウス内に皮下接種した；
３）接種３日後にマウスを薬物治療した。
４）ヌードマウスを２つの群：溶媒対照群および投与群（１０ｍｇ／ｋｇ）に分けた。マウスに毎日投薬した。マウスの腫瘍体積および体重を週２回測定した；
５）腫瘍体積が１５００ｍｍ^３に到達したとき、腫瘍を摘出した。腫瘍サイズを測定し、腫瘍重量を記録した。

これらの結果を図２に示した。これらの結果より、この薬物治療は、マウスの体重に影響しないことが示された。図３および４に示したように、この薬物治療後、腫瘍体積および腫瘍重量は、対照群におけるそれらの約１／２であり、このことは、ＺＬ−ｎ−９がＰＣ−３皮下腫瘍の増殖を有意に阻害したことを示している。

実施例３：ＺＬ−ｎ−９１による、腫瘍組織におけるＫｉ−６７の発現の阻害
切除した腫瘍を４％ホルマリン中で一晩固定し、切片化のためにパラフィン中に包埋した。次いで、腫瘍増殖抗原Ｋｉ６７を染色した。

図５に示したように、薬物投与群の腫瘍組織におけるＫｉ６７陽性細胞の百分率は、溶媒対照群におけるものよりも有意に低く、このことは、薬物投与群における腫瘍細胞の増殖が低下したことを示している。

実施例４：ＰＣ−３ヒト前立腺がん細胞の転移に対するＺＬ−ｎ−９１の効果
１）対数増殖期にある細胞を採取して無血清ＤＭＥＭ培地中に懸濁液を調製した。１ウェルあたり１００μｌの細胞懸濁液（５×１０^４細胞を含む）をＴｒａｎｓｗｅｌｌの上方のチャンバーに添加した。それを３つの群：溶媒対照群、１０μＭ群、５０μＭ群に分けた。それぞれの群は、３つの複製を含む。
２）１０％のＦＢＳを含む完全ＤＭＥＭ培地を１２ウェルプレートの下方のチャンバーに添加した。
３）１２時間後、上方のチャンバーを取り出し、氷冷メタノール中で３０分間固定し、室温で自然乾燥させた。
４）６００μｌの０．１％クリスタルバイオレット溶液を１２ウェルプレートに添加し、チャンバーの下の表面にある細胞を１５分間染色した。
５）ＰＢＳをチャンバーに添加し、次いで、５分後にそのＰＢＳをピペットで取り出した。メンブレンの上部からの細胞をきれいな綿棒で優しく拭き取った。チャンバーをＰＢＳで３回洗浄し、次いで、室温で自然乾燥させた。
６）３００μｌの１０％酢酸溶液を１２ウェルプレートに添加し、チャンバーの下の表面を１０分間浸漬して細胞内のクリスタルバイオレット粒子を溶解させた。
７）１２ウェルプレートの各ウェルからの１００μｌの溶液を９６ウェルプレートに入れ、マイクロプレートリーダーを使用して５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。

これらの結果を図６に示したが、このことから、ＺＬ−ｎ−９１は、薬物濃度が５０μＭであったときに、ヒト前立腺がんＰＣ−３細胞の転移を阻害したことが示された。

上記の結果から、本発明において使用されるＰＤＥ４阻害剤ＺＬ−ｎ−９１は、前立腺がん細胞の増殖および転移を阻害することができ、良好な抗腫瘍効果を示すことが示される。

Claims (4)

1. 前立腺がんの増殖を阻害するための薬物の調製における、下記式
   
   

   

   で表されるＰＤＥ４阻害剤ＺＬ−ｎ−９１の適用。
2. 前立腺がんの転移を抑制するための薬物の調製における、下記式
   
   

   

   で表されるＰＤＥ４阻害剤ＺＬ−ｎ−９１の適用。
3. 前立腺がんの増殖および転移を標的にするための薬物の調製における、下記式
   
   

   

   で表されるＰＤＥ４阻害剤ＺＬ−ｎ−９１の適用。
4. 薬物が、経口、注射、または吸入で投与されうる、請求項１から３に記載の適用。

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