CN112266931A - 特异性表达hMRGPRX4的转基因大鼠的构建方法及其应用 - Google Patents

特异性表达hMRGPRX4的转基因大鼠的构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种特异性表达hMRGPRX4的转基因大鼠的构建方法及其应用。本发明通过将hMRGPRX4表达在大鼠痒觉神经元中，成功构建出一种人源化大鼠，具体方法包括：分别构建转基因大鼠品系hMRGPRX4‑Cre和lsl‑hMRGPRX4‑mScarlet，并将两个转基因大鼠品系进行交配，得到特异性表达hMRGPRX4的转基因大鼠。本发明为研究hMRGPRX4的功能和筛选靶向hMRGPRX4的抗瘙痒药物提供了动物模型。

Description

特异性表达hMRGPRX4的转基因大鼠的构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种特异性表达hMRGPRX4的转基因大鼠的构建方法及其应用。
背景技术
慢性肝病患者常伴有难以忍受的瘙痒，高达60％的原发性胆汁性胆管炎(Primarybiliary cholangitis,PBC)患者有慢性瘙痒的症状，严重影响患者的生活质量。但目前仍然缺乏缓解或治疗该瘙痒的有效药物。最近研究表明，人源MRGPRX4介导胆酸引起的胆汁淤积性瘙痒。胆酸(cholic acid,CA)及其衍生物可以激活hMRGPRX4；患有瘙痒症状的慢性肝病患者血清中胆酸含量显著高于正常人；胆酸以及hMRGPRX4的激动剂可以在健康人皮肤中引起明显的瘙痒。因此，hMRGPRX4是治疗人胆汁淤积性瘙痒的药物靶点，hMRGPRX4的拮抗剂将是治疗这类瘙痒的备选药物。
目前开发治疗瘙痒药物面临的技术瓶颈主要在于，人与模式动物的痒觉感受存在分子机制的差异，使其缺乏有效的动物模型。因此，动物实验中应用有效的药物在转向临床用于人类时往往无效。这种药物疗效的差异导致昂贵的临床前和临床研究失败。因此，特异性靶向人源蛋白/受体开发治疗疾病的药物将是今后药物开发的趋势。此外，对于开发治疗人胆汁淤积性瘙痒的药物，由于MRGPRX4是灵长类特有的受体，在小鼠和大鼠中均没有功能同源的基因2，因此无法通过传统的遗传学方法，比如基因敲除，在模式动物中研究此基因的功能，以及在体筛选备选药物。
因此，亟需建立合适的动物模型用于在体研究hMRGPRX4的功能，筛选和验证hMRGPRX4拮抗剂对瘙痒的抑制作用，鉴定引起瘙痒的胆酸类似物，以及筛选降低瘙痒副作用的胆酸衍生物。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性表达hMRGPRX4(人源MRGPRX4)的转基因大鼠的构建方法及其应用。
本发明的技术原理：人源胆酸受体MRGPRX4可以介导胆汁淤积性瘙痒；大鼠的MrgA受体标记大鼠DRG痒觉神经元；通过MRGPRX4激活大鼠DRG痒觉神经元可以引起瘙痒。本发明利用CRISPR-Cas9基因敲入技术，构建特异性表达hMRGPRX4的转基因大鼠模型。此模型可以用于研究hMRGPRX4介导痒觉感受的功能，筛选并验证hMRGPRX4的拮抗剂，开发用于治疗胆汁淤积性瘙痒的药物。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种特异性表达hMRGPRX4的转基因大鼠的构建方法，包括：
A、构建CRISPR-Cas9系统介导的大鼠MrgA基因敲除且定点整合外源基因①的转基因大鼠品系I；其中，所述外源基因①是hMRGPRX4基因和重组酶基因之间通过P2A自切割肽段序列(5′-GCCACCAACTTCAGCCTGCTCAAGCAGGCCGGAGATGTGGAAGAGAACCCCGGCCCT-3′)连接而成，且所述CRISPR-Cas9系统靶向MrgA阳性的大鼠DRG神经元细胞；
B、构建CRISPR-Cas9系统介导的大鼠Rosa26基因敲除且定点整合外源基因②的转基因大鼠品系II；其中，所述外源基因②是hMRGPRX4基因和荧光报告基因之间通过iP2A自切割肽段序列(5′-GCGACGAATTTTAGTCTACTGAAACAAGCGGGAGACGTGGAGGAAAACCCTGGACCT-3′)连接而成，所述外源基因②由CAG启动子驱动，且在所述CAG或CMV启动子(也可以使用其它强启动子)启动子与外源基因之间包含一段受步骤A中所述重组酶条件性控制的STOP序列；其中，CAG启动子的序列如SEQ ID NO:4所示。
C、将品系I与品系II大鼠进行交配，得到特异性表达hMRGPRX4的转基因大鼠。
本发明中，所述hMRGPRX4基因(SEQ ID NO:2)编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQID NO:1所示。所述STOP序列如SEQ ID NO:3所示。
优选地，步骤A中gRNA作用位点的DNA序列为5′-TCCGGTTAGGAGTAAATTCC-3′和5′-TGAGACAGCGGAAAACACGG-3′。
优选地，步骤B中gRNA作用位点的DNA序列为5′-GACTCCAGTTGCAGATCACG-3′。
前述的方法，所述重组酶可以是Cre或Flp，优选Cre重组酶。
可选地，步骤B中所述荧光报告基因编码红色荧光蛋白mScarlet，其序列如SEQ IDNO:5所示(也可以使用其它荧光蛋白)。
前述的方法，步骤A包括：根据大鼠MrgA基因序列，构建基于CRISPR-Cas9系统的gRNA和Cas9表达载体，分别体外转录得到gRNA和Cas9 mRNA，并根据gRNA作用位点构建含有外源基因①的且可以整合至宿主基因组中的供体质粒，然后将体外转录得到的Cas9 mRNA、gRNA和供体质粒共同转入野生型大鼠的受精卵中，然后将克隆胚胎通过非手术法移入大鼠子宫内进行妊娠，获得转基因大鼠。
前述的方法，步骤B包括：根据大鼠Rosa26基因序列，构建基于CRISPR-Cas9系统的gRNA和Cas9表达载体，分别体外转录得到gRNA和Cas9 mRNA，并根据gRNA作用位点构建含有外源基因②的且可以整合至宿主基因组中的供体质粒，然后将体外转录得到的Cas9 mRNA、gRNA和供体质粒共同转入野生型大鼠受精卵中，然后将克隆胚胎通过非手术法移入大鼠子宫内进行妊娠，获得转基因大鼠。
优选地，步骤A和B中所述hMRGPRX4基因的3’端带有3×Flag标签序列。
优选地，所述大鼠为SD大鼠。
第二方面，本发明提供按照上述方法构建的转基因大鼠的以下任一应用：
(1)用作筛选治疗或缓解人胆汁淤积性瘙痒症药物的动物模型；
(2)用于筛选治疗或缓解人胆汁淤积性瘙痒症的药物；
(3)用于检测引起人胆汁淤积性瘙痒症的物质；
(4)用于筛选hMRGPRX4受体的激动剂或抑制剂；
(5)用于hMRGPRX4基因功能的研究。
第三方面，本发明提供一种提高hMRGPRX4基因在大鼠MrgA阳性神经元表达量的方法，包括：将转基因大鼠品系I与转基因大鼠品系II进行交配。
本发明利用CRISPR-Cas9技术，构建了两个大鼠转基因品系，分别命名为hMRGPRX4-Cre和lsl-hMRGPRX4-mScarlet。在hMRGPRX4-Cre大鼠品系中，本发明用包含hMRGPRX4和Cre重组酶的基因序列取代大鼠的MrgA基因，其中hMRGPRX4和Cre重组酶之间用P2A自切割肽段序列连接，使其在翻译的过程中断裂成两个功能完整的蛋白。此外，本发明在hMRGPRX4基因的3’端插入3×Flag标签序列，可以在后期通过抗体染色确定受体的表达。在此品系中，hMRGPRX4将利用MrgA的启动子进行转录和翻译表达在MrgA阳性的大鼠DRG神经元中；由于Cre重组酶的表达，此品系与报告品系交配，可以将多种工具基因表达在MrgA阳性的大鼠DRG神经元中，用于MrgA阳性的大鼠DRG神经元的标记和操作。在lsl-hMRGPRX4-mScarlet大鼠品系中，本发明构建了条件性表达的hMRGPRX4转基因大鼠，将包含hMRGPRX4的重组核酸插入到大鼠的Rosa26的基因座，该重组核酸包含一段CAG启动子序列，并在CAG启动子之后hMRGPRX4起始密码子之前包含一段Cre重组酶或Flp重组酶条件性控制的STOP序列。此外，本发明在hMRGPRX4基因的3’端插入3×Flag标签序列，这样可以在后期通过抗体染色确定受体的表达。为了后期可以直接观察到表达hMRGPRX4的神经元，本发明在hMRGPRX4的下游通过P2A自切割肽段序列连接红色荧光蛋白mScarlet基因序列。因此，此品系通过与重组酶驱动大鼠系交配可以实现hMRGPRX4在特定细胞的高表达和标记。
将hMRGPRX4-Cre大鼠与lsl-hMRGPRX4-mScarlet大鼠交配得到hMRGPRX4-Cre；lsl-hMRGPRX4-mScarlet双阳性的大鼠，可以实现hMRGPRX4在MrgA阳性的大鼠DRG神经元的高表达。提取和培养该大鼠的DRG神经元，超过80％的神经元有红色荧光，表明MRGPRX4的表达；钙成像结果显示，对脱氧胆酸(deoxycholic acid,DCA)有反应的DRG神经元比例为7％左右；行为学实验结果显示，皮下注射hMRGPRX4配体DCA后，相对于注射前，大鼠抓挠次数显著增加。
本发明首次构建出一种用于筛选治疗人胆汁淤积性瘙痒药物分子的转基因大鼠模型。通过构建两个转基因大鼠品系，本发明实现了将hMRGPRX4特异性表达在大鼠痒觉相关的DRG神经元中。免疫荧光染色和体外细胞培养证明了hMRGPRX4功能性地表达在大鼠DRG痒觉神经元中。在体皮下注射DCA证明了hMRGPRX4可以介导痒觉感受。该人源化大鼠模型可用于筛选特异且有效治疗人胆汁淤积性瘙痒的药物分子，为后续开展临床实验提供理论基础和实验依据。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中hMRGPRX4-Cre；lsl-hMRGPRX4-mScarlet转基因大鼠的基因型鉴定结果；其中，a：hMRGPRX4-Cre转基因大鼠基因信息模式图；b：hMRGPRX4-Cre转基因大鼠的基因型鉴定结果，如图所示，利用F1/R1引物，hMRGPRX4-Cre等位基因的条带大小为301bp，对应的野生型大鼠等位基因条带大小为505bp；可见编号为5的大鼠为纯和子，编号1、2、4和6的大鼠为杂合子，编号3的大鼠为野生型；c：lsl-hMRGPRX4-mScarlet转基因大鼠基因信息模式图；d：lsl-hMRGPRX4-mScarlet转基因大鼠的基因型鉴定结果，如图所示，利用F2/R2引物，lsl-hMRGPRX4-mScarlet等位基因的条带大小为385bp，对应的野生型大鼠等位基因没有条带；利用F3/R3引物，lsl-hMRGPRX4-mScarlet等位基因的条带大小为6712bp，对应的野生型大鼠等位基因的条带大小为646bp；可见编号为2、3和5的大鼠为纯和子，编号6的大鼠为杂合子，编号4的大鼠为野生型。从图1可知各大鼠的基因型，例如6号大鼠的基因型为hX4-Cre/WT；lsl-hMRGPRX4-mScarlet/WT，即双杂合。
图2为本发明较佳实施例中hMRGPRX4-Cre；lsl-hMRGPRX4-mScarlet转基因大鼠的细胞水平验证结果；其中，a：培养的6号转基因大鼠的DRG神经元在荧光共聚焦显微镜下的成像结果，红色荧光表示mScarlet的表达，如红色虚线标出的细胞所示；白色虚线标出的细胞是未表达mScarlet的细胞。Fluo-8 AM是钙离子指示剂；比例尺为50μm；b：a中mScarlet阳性和阴性神经元的钙成像结果代表性曲线，红色曲线为a中红色虚线标出的神经元的反应，黑色曲线为a中白色虚线标出的神经元的反应；c：杂合6号转基因大鼠的DRG神经元钙成像统计结果；d：免疫荧光的结果。d1-d4为孵育兔抗hMRGRPX4实验组；d5-d8为没有一抗孵育的对照组。d1和d5为细胞核染色结果，d2和d6为mScarlet的荧光结果，d3和d7为hMRGPRX4的染色结果，d4和d8为明场。
图3为本发明较佳实施例中DCA可以引起hMRGPRX4-Cre；lsl-hMRGPRX4-mScarlet转基因大鼠抓挠行为；其中，a：痒觉行为学实验的流程图；注射药物之前(pre)，记录大鼠1小时内的左侧颈部抓挠次数，作为本底水平；然后，在大鼠左侧颈部皮下注射500μg/50μl的DCA；统计注射后(post)1小时内大鼠左侧颈部的抓挠次数；b：DCA在杂合不同基因型大鼠中引起的抓挠次数统计结果。hX4-Cre是指hMRGPRX4-Cre大鼠，lsl-hX4是指lsl-hMRGPRX4-mScarlet大鼠，hX4-Cre；lsl-hX4大鼠是指hMRGPRX4-Cre；lsl-hMRGPRX4-mScarlet双杂合大鼠。
图4为本发明较佳实施例中DCA不能激活hMRGPRX4-Cre转基因大鼠的感觉神经元，说明将hMRGPRX4-Cre转基因大鼠感觉神经元中的hMRGPRX4表达量不足以介导胆酸引起的激活；其中，a：将hMRGPRX4-Cre转基因大鼠与一种报告大鼠杂交，该报告大鼠是一种条件性表达红色荧光蛋白tdTomato的转基因大鼠，在Cre重组酶的作用下，STOP序列被切除，从而tdTomato会成功表达。因此，可根据tdTomato的红色荧光判断表达Cre的细胞；b：hMRGPRX4-Cre；Reporter双杂和大鼠的DRG神经元成像结果；箭头所指是有tdTomato红色荧光的细胞，即表达Cre的细胞，也就是表达hMRGPRX4的细胞；c：b图中红色荧光DRG神经元的钙成像结果。
具体实施方式
本发明提供一种特异性表达hMRGPRX4受体的转基因大鼠，并首次证明DCA可以通过激活hMRGPRX4在大鼠体内引起痒觉。该大鼠模型可以用于研究hMRGPRX4介导痒觉感受的功能，筛选并验证hMRGPRX4的拮抗剂，开发用于治疗胆汁淤积性瘙痒的药物。
本发明的理论基础是基于人体内的MRGPRX4，其特异性地表达在人体痒觉相关的背根神经节神经元中，这一特性对于反应化合物致痒特性紧密相关。本发明最终得到在DRG神经元中成功表达hMRGPRX4的人源化大鼠，并首次证明人体内源胆酸分子DCA通过激活hMRGPRX4在该人源化大鼠体内引起痒觉，而该活性是这一药物具有瘙痒副作用的分子机制。
用人源MRGPRX4替换大鼠MrgA得到转基因大鼠hMRGPRX4-Cre，其中hMRGPRX4的表达是依赖于大鼠内源MrgA的启动子。但由于人源与鼠源受体的差别，尽管大鼠MrgA正常表达，但hMRGRPX4表达量较低，这是构建模型前所未知的。本发明巧妙地构建了lsl-hMRGPRX4-mScarlet大鼠，通过外源引入的CAG启动子，来驱动MRGRPX4的高表达。
本发明提供一种利用表达hMRGPRX4的转基因大鼠来鉴定导致瘙痒化合物的方法。为了达到该目的，本发明将hMRGPRX4表达在大鼠的痒觉神经元——MrgA阳性神经元中。同时为进一步增加hMRGPRX4的表达量，本发明又构建了条件性表达的hMRGPRX4转基因大鼠。在Cre重组酶的作用下，可以特异性在MrgA阳性神经元中表达hMRGPRX4。利用颈部注射的方法，将DCA注射到转基因大鼠的颈部，可以引起显著的抓挠行为。
在基于动物模型的药物筛选实验中，使用本发明中的转基因大鼠，阳性结果(即引起大鼠抓挠行为)提示，该药物将会激活hMRGPRX4引起痒，阴性结果提示该化合物不能激活hMRGPRX4引起痒觉。
本发明中涉及的术语：
背根神经节(或脊神经节，也称为后根神经节)(Dorsal root ganglion,DRG)是脊髓神经背根中的神经元簇，是初级感觉神经元胞体的所在处。DRG神经元控制多种体感觉，包括痒觉、痛觉、触觉和温度感觉等。一般认为，大直径DRG神经元与机械感觉有关，小直径神经元与痛觉和痒觉有关4。
MRGPRX4：mas相关G蛋白偶联受体成员X4(MRGPRX4)是灵长类特有的G蛋白偶联受体2。该受体表达在TRPV1(Transient receptor potential V1)阳性的人DRG神经元中，且超过90％的MRGPRX4阳性的神经元表达组胺受体H1。MRGPRX4可被胆酸及其衍生物激活，其中脱氧胆酸(deoxycholic acid,DCA)的亲和力最高，EC50达到2μM。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中使用的SD大鼠按照常规饲养方法进行。载体pCS、pUC57购自北京百奥赛图基因生物技术有限公司。
实施例1
本发明通过将人源MRGPRX4表达在大鼠痒觉神经元中，构建了一种人源化大鼠，为研究MRGPRX4的功能和筛选靶向人源MRGPRX4的抗瘙痒药物提供了动物模型。具体方法如下：
(一)hMRGPRX4-Cre大鼠的构建
在大鼠MrgA基因中，用hMRGPRX4-3xFlag-P2A-iCre-WPRE-pA(SEQ ID NO:6)替换MrgA基因外显子2(exon2)上第28位氨基酸到终止子对应的核苷酸序列。sgRNA分别设计在MrgA基因内含子1(intron1)和外显子2。基于sgRNA的设计原则，在靶位点区域设计多条sgRNA。将sgRNA(5′-TCCGGTTAGGAGTAAATTCC-3′和5′-TGAGACAGCGGAAAACACGG-3′)和Cas9基因连入带T7启动子的质粒载体pCS上并进行体外转录，得到进行显微注射的gRNA和Cas9mRNA。
根据靶基因序列，分别设计并合成5’、3’同源臂片段(SEQ ID NO:8和9)，然后将5’同源臂片段、目的基因(hMRGPRX4-3xFlag-P2A-iCre-WPRE-pA)片段和3’同源臂片段依次连接到pUC57载体上，即为供体质粒。
将Cas9 mRNA、gRNA和供体质粒按等摩尔比混合，显微注射到大鼠受精卵中，注射后至出生得到F0大鼠。由于胚胎早期卵裂速度很快，因此得到的F0大鼠为嵌合体。故以F0大鼠鼠尾进行鉴定得到的F0基因型仅供参考，不能代表其一定为可遗传的基因突变型，可遗传的基因型需待F1大鼠鼠尾检测后确定。
(二)lsl-hMRGRPX4-mScarlet大鼠的构建
根据Rosa26基因的特点，在Rosa26位点插入CAG-loxP-Frt-Stop-loxP-Frt-hMRGPRX4-3xflag-iP2A-mScarlet-f-WPRE-pA(SEQ ID NO:7)，sgRNA设计在插入位置周围。基于sgRNA的设计原则，在靶位点区域共设计多条sgRNA。将sgRNA(5′-GACTCCAGTTGCAGATCACG-3′)和Cas9基因连入带T7启动子的质粒载体pCS上并进行体外转录，得到进行显微注射的gRNA和Cas9mRNA。
根据靶基因序列，分别设计并合成5’、3’同源臂片段(SEQ ID NO:10和11)，然后将5’同源臂片段、目的基因(CAG-loxP-Frt-Stop-loxP-Frt-hMRGPRX4-3xflag-iP2A-mScarlet-f-WPRE-pA)片段和3’同源臂片段依次连接到pUC57载体上，即为供体质粒。
将Cas9 mRNA、gRNA和供体质粒按等摩尔比混合，显微注射到大鼠受精卵中，注射后至出生得到F0大鼠。由于胚胎早期卵裂速度很快，因此得到的F0大鼠为嵌合体。故以F0大鼠鼠尾进行鉴定得到的F0基因型仅供参考，不能代表其一定为可遗传的基因突变型，可遗传的基因型需待F1大鼠鼠尾检测后确定。
(三)hMRGPRX4-Cre；lsl-hMRGPRX4-mScarlet转基因大鼠的构建
将hMRGPRX4-Cre大鼠和lsl-hMRGRPX4-mScarlet大鼠进行交配，得到具有高表达量且特异性表达hMRGPRX4的转基因大鼠(hMRGPRX4-Cre；lsl-hMRGPRX4-mScarlet)。
1、hMRGPRX4-Cre；lsl-hMRGPRX4-mScarlet转基因大鼠的基因型鉴定结果
1)采用一步裂解法提取大鼠组织(脚趾)的基因组：含有0.1mg/ml的蛋白酶K的一步裂解液。
2)将200ul上述裂解液加到组织中，56℃孵育10小时；然后80℃孵育10分钟。
3)按照正常PCR程序扩增目的片段用于鉴定大鼠基因型。
4)用于鉴定hMRGPRX4-Cre等位基因的引物为(5′-3′)：
F1：ACCTTAACGACGGGGAGCTAGATGG
R1：CAAGGTCCCAGGACCTAGAGGGA
利用上述引物，WT等位基因片段大小为301bp，hMRGPRX4-Cre等位基因片段大小为505bp。
5)用于鉴定lsl-hMRGPRX4等位基因的引物为(5′-3′)：
F1：TTGTATTGGAGACAAGAAGCACTTGCTC
R1：TTGATAGGGCTGCAGAAGTGGGAG
F2：CAGTAGTGCCAACCCCATCATTTACT
R2：GATCTCGAACTCGTGGCCGTTCAT
利用引物F1和R1，WT等位基因片段大小为646bp，lsl-hMRGPRX4等位基因片段大小为6712bp。利用引物F2和R2，lsl-hMRGPRX4等位基因片段大小为385bp，WT等位基因没有条带。
hMRGPRX4-Cre；lsl-hMRGPRX4-mScarlet转基因大鼠的基因型鉴定结果见图1。
2、hMRGPRX4-Cre；lsl-hMRGPRX4-mScarlet转基因大鼠的细胞水平验证结果
1)利用钙成像溶液将DCA配制成100uM的溶液；
2)按照文献(Yu et al.,2019eLife,8,e48431)中的方法提取大鼠的DRG神经元；
3)用钙成像溶液稀释Fluo-8 AM到5uM；将稀释好的Fluo-8 AM加入到细胞中，500ul/孔，室温静置40分钟；
4)在共聚焦显微镜下观察细胞，灌流上述溶液，记录细胞内钙信号的变化。
hMRGPRX4-Cre；lsl-hMRGPRX4-mScarlet转基因大鼠的细胞水平验证结果见图2。
3、hMRGPRX4-Cre；lsl-hMRGPRX4-mScarlet转基因大鼠的行为学水平鉴定结果
1)将DCA配制成500ug/50ul的浓度；
2)将hMRGPRX4-Cre；lsl-hMRGPRX4-mScarlet转基因大鼠在行为学箱中适应5天，30分钟/天；
3)实验当天，注射前拍摄录制1小时用于统计大鼠本底的抓挠水平；
4)将上述DCA溶液50ul注射到大鼠的颈部；
5)注射后，持续拍摄录制1小时。
图3结果显示，DCA可以引起hMRGPRX4-Cre；lsl-hMRGPRX4-mScarlet转基因大鼠抓挠行为。
实施例2
图4进一步证明了hMRGPRX4-Cre；lsl-hMRGPRX4-mScarlet转基因大鼠作为动物模型更具优势。如图4a所示，将hMRGPRX4-Cre的纯合大鼠与一种报告大鼠交配，在Cre重组酶的作用下，子代大鼠Cre阳性的细胞中会表达一种红色荧光蛋白tdTomato。提取并培养该子代大鼠的DRG神经元，如图4b所示，箭头所示为表达tdTomato的DRG神经元，说明Cre重组酶是表达且有功能的，同时理论上也说明hMRGPRX4表达的；如图4c所示，钙成像结果显示，加入DCA并不能在这些神经元引起明显的钙信号，说明hMRGPRX4虽然表达了，但是可能由于表达量比较低，不能介导DCA在DRG神经元引起的反应。这也说明通过将hMRGPRX4-Cre大鼠与lsl-hMRGPRX4-mScarlet大鼠交配，增加MRGPRX4的表达量是必须的。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
参考文献:
[1]Le Pichon,C.E.,&Chesler,A.T.(2014).The functional and anatomicaldissection of somatosensory subpopulations using mouse genetics.FrontNeuroanat,8,21.doi:10.3389/fnana.2014.00021.
[2]Oeda,S.,Takahashi,H.,Yoshida,H.,Ogawa,Y.,Imajo,K.,Yoneda,M.,...Japan Study Group of Nonalcoholic Fatty Liver,D.(2018).Prevalence ofpruritus in patients with chronic liver disease:A multicenter study.HepatolRes,48(3),E252-E262.doi:10.1111/hepr.12978.
[3]Yu,H.,Zhao,T.,Liu,S.,Wu,Q.,Johnson,O.,Wu,Z.,...Li,Y.(2019).MRGPRX4is a bile acid receptor for human cholestatic itch.Elife,8.doi:10.7554/eLife.48431.
[4]Oeda,S.；Takahashi,H.；Yoshida,H.；Ogawa,Y.；Imajo,K.；Yoneda,M.；Koshiyama,Y.；Ono,M.；Hyogo,H.；Kawaguchi,T.；Fujii,H.；Nishino,K.；Sumida,Y.；Tanaka,S.；Kawanaka,M.；Torimura,T.；Saibara,T.；Kawaguchi,A.；Nakajima,A.；Eguchi,Y.；Japan Study Group of Nonalcoholic Fatty Liver,D.,Prevalence of pruritus inpatients with chronic liver disease:A multicenter study.Hepatol Res 2018,48(3),E252-E262.
[5]Yu,H.；Zhao,T.；Liu,S.；Wu,Q.；Johnson,O.；Wu,Z.；Zhuang,Z.；Shi,Y.；Peng,L.；He,R.；Yang,Y.；Sun,J.；Wang,X.；Xu,H.；Zeng,Z.；Zou,P.；Lei,X.；Luo,W.；Li,Y.,MRGPRX4 is a bile acid receptor for human cholestatic itch.Elife 2019,8.
[6]Meixiong,J.；Vasavda,C.；Snyder,S.H.；Dong,X.,MRGPRX4 is a G protein-coupled receptor activated by bile acids that may contribute to cholestaticpruritus.Proc Natl Acad Sci U S A 2019,116(21),10525-10530.
[7]Le Pichon,C.E.；Chesler,A.T.,The functional and anatomicaldissection of somatosensory subpopulations using mouse genetics.FrontNeuroanat 2014,8,21.
序列表
<110> 北京大学
<120> 特异性表达hMRGPRX4的转基因大鼠的构建方法及其应用
<130> KHP201116294.6
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 322
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Asp Pro Thr Val Pro Val Phe Gly Thr Lys Leu Thr Pro Ile Asn
1 5 10 15
Gly Arg Glu Glu Thr Pro Cys Tyr Asn Gln Thr Leu Ser Phe Thr Val
20 25 30
Leu Thr Cys Ile Ile Ser Leu Val Gly Leu Thr Gly Asn Ala Val Val
35 40 45
Leu Trp Leu Leu Gly Tyr Arg Met Arg Arg Asn Ala Val Ser Ile Tyr
50 55 60
Ile Leu Asn Leu Ala Ala Ala Asp Phe Leu Phe Leu Ser Phe Gln Ile
65 70 75 80
Ile Arg Ser Pro Leu Arg Leu Ile Asn Ile Ser His Leu Ile Arg Lys
85 90 95
Ile Leu Val Ser Val Met Thr Phe Pro Tyr Phe Thr Gly Leu Ser Met
100 105 110
Leu Ser Ala Ile Ser Thr Glu Arg Cys Leu Ser Val Leu Trp Pro Ile
115 120 125
Trp Tyr Arg Cys Arg Arg Pro Thr His Leu Ser Ala Val Val Cys Val
130 135 140
Leu Leu Trp Gly Leu Ser Leu Leu Phe Ser Met Leu Glu Trp Arg Phe
145 150 155 160
Cys Asp Phe Leu Phe Ser Gly Ala Asp Ser Ser Trp Cys Glu Thr Ser
165 170 175
Asp Phe Ile Pro Val Ala Trp Leu Ile Phe Leu Cys Val Val Leu Cys
180 185 190
Val Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Arg Ile Leu Cys Gly Ser Arg Lys
195 200 205
Met Pro Leu Thr Arg Leu Tyr Val Thr Ile Leu Leu Thr Val Leu Val
210 215 220
Phe Leu Leu Cys Gly Leu Pro Phe Gly Ile Leu Gly Ala Leu Ile Tyr
225 230 235 240
Arg Met His Leu Asn Leu Glu Val Leu Tyr Cys His Val Tyr Leu Val
245 250 255
Cys Met Ser Leu Ser Ser Leu Asn Ser Ser Ala Asn Pro Ile Ile Tyr
260 265 270
Phe Phe Val Gly Ser Phe Arg Gln Arg Gln Asn Arg Gln Asn Leu Lys
275 280 285
Leu Val Leu Gln Arg Ala Leu Gln Asp Lys Pro Glu Val Asp Lys Gly
290 295 300
Glu Gly Gln Leu Pro Glu Glu Ser Leu Glu Leu Ser Gly Ser Arg Leu
305 310 315 320
Gly Pro
<210> 2
<211> 966
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 2
atggatccaa ccgtcccagt cttcggtaca aaactgacac caatcaacgg acgtgaggag 60
actccttgct acaatcagac cctgagcttc acggtgctga cgtgcatcat ttcccttgtc 120
ggactgacag gaaacgcggt tgtgctctgg ctcctgggct accgcatgcg caggaacgct 180
gtctccatct acatcctcaa cctggccgca gcagacttcc tcttcctcag cttccagatt 240
atacgttcgc cattacgcct catcaatatc agccatctca tccgcaaaat cctcgtttct 300
gtgatgacct ttccctactt tacaggcctg agtatgctga gcgccatcag caccgagcgc 360
tgcctgtctg ttctgtggcc catctggtac cgctgccgcc gccccacaca cctgtcagcg 420
gtcgtgtgtg tcctgctctg gggcctgtcc ctgctgttta gtatgctgga gtggaggttc 480
tgtgacttcc tgtttagtgg tgctgattct agttggtgtg aaacgtcaga tttcatccca 540
gtcgcgtggc tgattttttt atgtgtggtt ctctgtgttt ccagcctggt cctgctggtc 600
aggatcctct gtggatcccg gaagatgccg ctgaccaggc tgtacgtgac catcctgctc 660
acagtgctgg tcttcctcct ctgcggcctg cccttcggca ttctgggggc cctaatttac 720
aggatgcacc tgaatttgga agtcttatat tgtcatgttt atctggtttg catgtccctg 780
tcctctctaa acagtagtgc caaccccatc atttacttct tcgtgggctc ctttaggcag 840
cgtcaaaata ggcagaacct gaagctggtt ctccagaggg ctctgcagga caagcctgag 900
gtggataaag gtgaagggca gcttcctgag gaaagcctgg agctgtcggg aagcagattg 960
gggcca 966
<210> 3
<211> 1349
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
attaagggtt ccggatcctc ggggacacca aatatggcga tctcggcctt ttcgtttctt 60
ggagctggga catgtttgcc atcgatccat ctaccaccag aacggccgtt agatctgctg 120
ccaccgttgt ttccaccgaa gaaaccaccg ttgccgtaac caccacgacg gttgttgcta 180
aagaagctgc caccgccacg gccaccgttg tagccgccgt tgttgttatt gtagttgctc 240
atgttatttc tggcacttct tggttttcct cttaagtgag gaggaacata accattctcg 300
ttgttgtcgt tgatgcttaa attttgcact tgttcgctca gttcagccat aatatgaaat 360
gcttttcttg ttgttcttac ggaataccac ttgccaccta tcaccacaac taactttttc 420
ccgttcctcc atctctttta tatttttttt ctcgagggat ctttgtgaag gaaccttact 480
tctgtggtgt gacataattg gacaaactac ctacagagat ttaaagctct aaggtaaata 540
taaaattttt aagtgtataa tgtgttaaac tactgattct aattgtttgt gtattttaga 600
ttccaaccta tggaactgat gaatgggagc agtggtggaa tgcctttaat gaggaaaacc 660
tgttttgctc agaagaaatg ccatctagtg atgatgaggc tactgctgac tctcaacatt 720
ctactcctcc aaaaaagaag agaaaggtag aagaccccaa ggactttcct tcagaattgc 780
taagtttttt gagtcatgct gtgtttagta atagaactct tgcttgcttt gctatttaca 840
ccacaaagga aaaagctgca ctgctataca agaaaattat ggaaaaatat tctgtaacct 900
ttataagtag gcataacagt tataatcata acatactgtt ttttcttact ccacacaggc 960
atagagtgtc tgctattaat aactatgctc aaaaattgtg tacctttagc tttttaattt 1020
gtaaaggggt taataaggaa tatttgatgt atagtgcctt gactagagat cataatcagc 1080
cataccacat ttgtagaggt tttacttgct ttaaaaaacc tcccacacct ccccctgaac 1140
ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt gttaacttgt ttattgcagc ttataatggt 1200
tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct 1260
agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctggatctg acatggtaag 1320
taagcttggg ctgcaggtcg agggaccta 1349
<210> 4
<211> 1716
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc 60
gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 120
tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 180
aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 240
caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 300
acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 360
ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 420
ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 480
ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga 540
gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc 600
ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcggggagt cgctgcgacg 660
ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 720
gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 780
gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttgaggggct 840
ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggggt gcgtgcgtgt gtgtgtgcgt 900
ggggagcgcc gcgtgcggct ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg ggcgcggcgc 960
ggggctttgt gcgctccgca gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg gtgccccgcg 1020
gtgcgggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg tgggggggtg 1080
agcagggggt gtgggcgcgt cggtcgggct gcaacccccc ctgcaccccc ctccccgagt 1140
tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtacg gggcgtggcg cggggctcgc 1200
cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc cgcctcgggc 1260
cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg cccccggagc gccggcggct gtcgaggcgc 1320
ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg gacttccttt 1380
gtcccaaatc tgtgcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct ctagcgggcg 1440
cggggcgaag cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc ggggagggcc ttcgtgcgtc 1500
gccgcgccgc cgtccccttc tccctctcca gcctcggggc tgtccgcggg gggacggctg 1560
ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg gcggctctag 1620
agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg gcaacgtgct 1680
ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaatt 1716
<210> 5
<211> 753
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgagcaagg gcgaggcagt gatcaaggag ttcatgcggt tcaaggtgca catggagggc 60
tccatgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc 120
acccagaccg ccaagctgaa ggtgaccaag ggtggccccc tgcccttctc ctgggacatc 180
ctgtcccctc agttcatgta cggctccagg gccttcacca agcaccccgc cgacatcccc 240
gactactata agcagtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag 300
gacggcggcg ccgtgaccgt gacccaggac acctccctgg aggacggcac cctgatctac 360
aaggtgaagc tccgcggcac caacttccct cctgacggcc ccgtaatgca gaagaagaca 420
atgggctggg aagcgtccac cgagcggttg taccccgagg acggcgtgct gaagggcgac 480
attaagatgg ccctgcgcct gaaggacggc ggccgctacc tggcggactt caagaccacc 540
tacaaggcca agaagcccgt gcagatgccc ggcgcctaca acgtcgaccg caagttggac 600
atcacctccc acaacgagga ctacaccgtg gtggaacagt acgaacgctc cgagggccgc 660
cactccaccg gcggcatgga cgagctgtac aagaagctga accctcctga tgagagtggc 720
cccggctgca tgagctgctg tgtgctctcc taa 753
<210> 6
<211> 2983
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggatccaa ccgtcccagt cttcggtaca aaactgacac caatcaacgg acgtgaggag 60
actccttgct acaatcagac cctgagcttc acggtgctga cgtgcatcat ttcccttgtc 120
ggactgacag gaaacgcggt tgtgctctgg ctcctgggct accgcatgcg caggaacgct 180
gtctccatct acatcctcaa cctggccgca gcagacttcc tcttcctcag cttccagatt 240
atacgttcgc cattacgcct catcaatatc agccatctca tccgcaaaat cctcgtttct 300
gtgatgacct ttccctactt tacaggcctg agtatgctga gcgccatcag caccgagcgc 360
tgcctgtctg ttctgtggcc catctggtac cgctgccgcc gccccacaca cctgtcagcg 420
gtcgtgtgtg tcctgctctg gggcctgtcc ctgctgttta gtatgctgga gtggaggttc 480
tgtgacttcc tgtttagtgg tgctgattct agttggtgtg aaacgtcaga tttcatccca 540
gtcgcgtggc tgattttttt atgtgtggtt ctctgtgttt ccagcctggt cctgctggtc 600
aggatcctct gtggatcccg gaagatgccg ctgaccaggc tgtacgtgac catcctgctc 660
acagtgctgg tcttcctcct ctgcggcctg cccttcggca ttctgggggc cctaatttac 720
aggatgcacc tgaatttgga agtcttatat tgtcatgttt atctggtttg catgtccctg 780
tcctctctaa acagtagtgc caaccccatc atttacttct tcgtgggctc ctttaggcag 840
cgtcaaaata ggcagaacct gaagctggtt ctccagaggg ctctgcagga caagcctgag 900
gtggataaag gtgaagggca gcttcctgag gaaagcctgg agctgtcggg aagcagattg 960
gggccagact acaaagacca tgacggtgat tataaagatc atgacatcga ttacaaggat 1020
gacgatgaca agggaagcgg agccaccaac ttcagcctgc tcaagcaggc cggagatgtg 1080
gaagagaacc ccggccctat ggtgcccaag aagaagagga aagtctccaa cctgctgact 1140
gtgcaccaaa acctgcctgc cctccctgtg gatgccacct ctgatgaagt caggaagaac 1200
ctgatggaca tgttcaggga caggcaggcc ttctctgaac acacctggaa gatgctcctg 1260
tctgtgtgca gatcctgggc tgcctggtgc aagctgaaca acaggaaatg gttccctgct 1320
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gctggggaga gagccaagca ggccctggcc tttgaacgca ctgactttga ccaagtcaga 1560
tccctgatgg agaactctga cagatgccag gacatcagga acctggcctt cctgggcatt 1620
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ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 2460
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 2520
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 2580
gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 2640
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 2700
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgca tcgataccgt 2760
cgacctcgac ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg 2820
tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa 2880
ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca 2940
gcaaggggga ggattgggaa gacaatggca ggcatgctgg gga 2983
<210> 7
<211> 6029
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc 60
gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 120
tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 180
aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 240
caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 300
acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 360
ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 420
ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 480
ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga 540
gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc 600
ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcggggagt cgctgcgacg 660
ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 720
gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 780
gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttgaggggct 840
ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggggt gcgtgcgtgt gtgtgtgcgt 900
ggggagcgcc gcgtgcggct ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg ggcgcggcgc 960
ggggctttgt gcgctccgca gtgtgcgcga ggggagcgcg gccgggggcg gtgccccgcg 1020
gtgcgggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg tgggggggtg 1080
agcagggggt gtgggcgcgt cggtcgggct gcaacccccc ctgcaccccc ctccccgagt 1140
tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtacg gggcgtggcg cggggctcgc 1200
cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc cgcctcgggc 1260
cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg cccccggagc gccggcggct gtcgaggcgc 1320
ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg gacttccttt 1380
gtcccaaatc tgtgcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct ctagcgggcg 1440
cggggcgaag cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc ggggagggcc ttcgtgcgtc 1500
gccgcgccgc cgtccccttc tccctctcca gcctcggggc tgtccgcggg gggacggctg 1560
ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg gcggctctag 1620
agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg gcaacgtgct 1680
ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattgatt tgataccgca tttaaatata 1740
acttcgtata gcatacatta tacgaagtta tttaagaagt tcctatactt tctagagaat 1800
aggaacttct cgcgatgaat aaatgaaagc ttgcaattaa gggttccgga tcctcgggga 1860
caccaaatat ggcgatctcg gccttttcgt ttcttggagc tgggacatgt ttgccatcga 1920
tccatctacc accagaacgg ccgttagatc tgctgccacc gttgtttcca ccgaagaaac 1980
caccgttgcc gtaaccacca cgacggttgt tgctaaagaa gctgccaccg ccacggccac 2040
cgttgtagcc gccgttgttg ttattgtagt tgctcatgtt atttctggca cttcttggtt 2100
ttcctcttaa gtgaggagga acataaccat tctcgttgtt gtcgttgatg cttaaatttt 2160
gcacttgttc gctcagttca gccataatat gaaatgcttt tcttgttgtt cttacggaat 2220
accacttgcc acctatcacc acaactaact ttttcccgtt cctccatctc ttttatattt 2280
tttttctcga gggatctttg tgaaggaacc ttacttctgt ggtgtgacat aattggacaa 2340
actacctaca gagatttaaa gctctaaggt aaatataaaa tttttaagtg tataatgtgt 2400
taaactactg attctaattg tttgtgtatt ttagattcca acctatggaa ctgatgaatg 2460
ggagcagtgg tggaatgcct ttaatgagga aaacctgttt tgctcagaag aaatgccatc 2520
tagtgatgat gaggctactg ctgactctca acattctact cctccaaaaa agaagagaaa 2580
ggtagaagac cccaaggact ttccttcaga attgctaagt tttttgagtc atgctgtgtt 2640
tagtaataga actcttgctt gctttgctat ttacaccaca aaggaaaaag ctgcactgct 2700
atacaagaaa attatggaaa aatattctgt aacctttata agtaggcata acagttataa 2760
tcataacata ctgttttttc ttactccaca caggcataga gtgtctgcta ttaataacta 2820
tgctcaaaaa ttgtgtacct ttagcttttt aatttgtaaa ggggttaata aggaatattt 2880
gatgtatagt gccttgacta gagatcataa tcagccatac cacatttgta gaggttttac 2940
ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg 3000
ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 3060
atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca 3120
atgtatctta tcatgtctgg atctgacatg gtaagtaagc ttgggctgca ggtcgaggga 3180
cctacccatc aagctgatcc ggaaccctta atataacttc gtatagcata cattatacga 3240
agttatttaa gaagttccta tactttctag agaataggaa cttctaggtc cctcgacctg 3300
cagcccaagc tagatcgaat tcaggcgcgc cgccaccatg gatccaaccg tcccagtctt 3360
cggtacaaaa ctgacaccaa tcaacggacg tgaggagact ccttgctaca atcagaccct 3420
gagcttcacg gtgctgacgt gcatcatttc ccttgtcgga ctgacaggaa acgcggttgt 3480
gctctggctc ctgggctacc gcatgcgcag gaacgctgtc tccatctaca tcctcaacct 3540
ggccgcagca gacttcctct tcctcagctt ccagattata cgttcgccat tacgcctcat 3600
caatatcagc catctcatcc gcaaaatcct cgtttctgtg atgacctttc cctactttac 3660
aggcctgagt atgctgagcg ccatcagcac cgagcgctgc ctgtctgttc tgtggcccat 3720
ctggtaccgc tgccgccgcc ccacacacct gtcagcggtc gtgtgtgtcc tgctctgggg 3780
cctgtccctg ctgtttagta tgctggagtg gaggttctgt gacttcctgt ttagtggtgc 3840
tgattctagt tggtgtgaaa cgtcagattt catcccagtc gcgtggctga tttttttatg 3900
tgtggttctc tgtgtttcca gcctggtcct gctggtcagg atcctctgtg gatcccggaa 3960
gatgccgctg accaggctgt acgtgaccat cctgctcaca gtgctggtct tcctcctctg 4020
cggcctgccc ttcggcattc tgggggccct aatttacagg atgcacctga atttggaagt 4080
cttatattgt catgtttatc tggtttgcat gtccctgtcc tctctaaaca gtagtgccaa 4140
ccccatcatt tacttcttcg tgggctcctt taggcagcgt caaaataggc agaacctgaa 4200
gctggttctc cagagggctc tgcaggacaa gcctgaggtg gataaaggtg aagggcagct 4260
tcctgaggaa agcctggagc tgtcgggaag cagattgggg ccagactaca aagaccatga 4320
cggtgattat aaagatcatg acatcgatta caaggatgac gatgacaagg cgacgaattt 4380
tagtctactg aaacaagcgg gagacgtgga ggaaaaccct ggacctgtga gcaagggcga 4440
ggcagtgatc aaggagttca tgcggttcaa ggtgcacatg gagggctcca tgaacggcca 4500
cgagttcgag atcgagggcg agggcgaggg ccgcccctac gagggcaccc agaccgccaa 4560
gctgaaggtg accaagggtg gccccctgcc cttctcctgg gacatcctgt cccctcagtt 4620
catgtacggc tccagggcct tcaccaagca ccccgccgac atccccgact actataagca 4680
gtccttcccc gagggcttca agtgggagcg cgtgatgaac ttcgaggacg gcggcgccgt 4740
gaccgtgacc caggacacct ccctggagga cggcaccctg atctacaagg tgaagctccg 4800
cggcaccaac ttccctcctg acggccccgt aatgcagaag aagacaatgg gctgggaagc 4860
gtccaccgag cggttgtacc ccgaggacgg cgtgctgaag ggcgacatta agatggccct 4920
gcgcctgaag gacggcggcc gctacctggc ggacttcaag accacctaca aggccaagaa 4980
gcccgtgcag atgcccggcg cctacaacgt cgaccgcaag ttggacatca cctcccacaa 5040
cgaggactac accgtggtgg aacagtacga acgctccgag ggccgccact ccaccggcgg 5100
catggacgag ctgtacaaga agctgaaccc tcctgatgag agtggccccg gctgcatgag 5160
ctgctgtgtg ctctcctaag cgatcgccaa attcgatatc aagcttatcg ataatcaacc 5220
tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg ctccttttac 5280
gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt 5340
cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt tgtggcccgt 5400
tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca ctggttgggg 5460
cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc ctattgccac 5520
ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac 5580
tgacaattcc gtggtgttgt cggggaaatc atcgtccttt ccttggctgc tcgcctgtgt 5640
tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc ccttcggccc tcaatccagc 5700
ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc ttcgccttcg 5760
ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg catcgatacc gtcgacctcg 5820
actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc 5880
ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt 5940
ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat 6000
tgggaagaca atagcaggca tgctgggga 6029
<210> 8
<211> 1400
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tggtatcttc tgccctgaga ttctatcttt tatctcctgt attctgttgg taacgcttgt 60
gtctatgact atgatctctt tcctaggttt tctatctcca gggttgtctc cctttgtgct 120
ttctttattg tttctatttc tatttttaga tcctggatgg ctttgttcaa ttccttcacc 180
tgtttggttg tgttttcctg taattcttta agggattttt gtgtttcctc ttcaagggct 240
tctacttgtt tacttgtgtt gtcctgtgtt tctttaagga agttatttat gtccttctta 300
aaatcctcta tcatcatcat aagatgtgat tttaaatcca aatctcgctt ttcctgtgtg 360
ttgggatttg aagcatttgc tgtggtggga gaactgggtt ctgatgatgc cacgtggcct 420
tggtttctgt tgcttaggtt cttgtccttg cctctcacca tctgactgtc tctggtgtta 480
gctggtcttg ctgtctctga ctggagcttt tccctcctgt gggcctgtaa gcctgtgatc 540
ttagtagtga gagggctcct tggagaccag ctccctcagg gcagattttg tgtccaaggg 600
ctgtggaaga gccccagctc tgggtgcaga cagagatcag aagggtcctg tcctaggcag 660
ccctgtggct cccacacccc atgtcctcct ggcgggcctc tccttggaca gtcaatggag 720
agagcatggg tcttacctgt gggctgtggg attaggaggg agagcactcc tggcagacca 780
gctctctgcc agcaggtttt gaaccagcta ggtggtttct taatctgcag tattggctgc 840
catctcaaac ctagcttgga tatttcttct ctggcttttc tcccctccac atataatcaa 900
taaacagtgg tgatggttct aaaggtctgc tcaaaagtga aggggtgggg ttcttaacaa 960
gttgtcttcc ctctgccagc ctgtaccacc tcccctgaaa cacaaaaacc attattccta 1020
tatggcaagg taggcctgac aattaattaa taattattaa aaaagtacct tataaatgtc 1080
ataaaagctc atagtaaaac tcatcccctt atacagttaa tatgttgtgg agtcttctta 1140
aatccaacat aaatccaaca taactcaagt accatgtcat acagatgaca aaaatttgtt 1200
gtgatcaagc tgactctggt ccgtcggggc ctcagaacag acccaagagc tgaactatga 1260
ccctgaagga atgttgcaca gcttagttaa agaatgaaac cttaacgacg gggagctaga 1320
tggcctatag cattgtccaa tcatattttg acacaaaggg ttgagcaaag gagttttcac 1380
caatccggtt aggagtaaat 1400
<210> 9
<211> 1400
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgaagggcct ctgcctggac ctcagaggtg gctttggcgt gagcactgcc ctgctgcact 60
tgaccactgt ccactctcct ctcagtcttg ggcctcgaca tgcctcagtg atccaccatc 120
cgcagctctc cattgacttg gttttccaac ctctcctgag taaaagcatt aatcagaaag 180
tatggagtct ccatccttct tgacgtaaat aaaagtctca tgctaacttc ctctgaagct 240
ttcttgctgt ttctttgcaa ctttcgctgc catagaaatt gtccaggtcc aaaaccatga 300
ctctcttgtc tatgattgtt ctgtacctaa atgtaaagac aggagtcccc tggtttcctg 360
tgaaacatcc tcaggagaca acgccttcaa caaaaatgct tcacaccaat ccggccacaa 420
cactcaccgt gctgataatg gcataagact tacacgaaat tgacaaagac aggtgtaaga 480
cccagacacc acaccacact aacactctta ggaccctgtg gctcagcagg agaatcccat 540
gtctccagcc agccaacccc agcatcgagg agtcctcaag tacctgagga tgtagactct 600
gtgagttcta aatgatgaag agcagcgaga ctatatttct gagctgatta aatcatggcc 660
accttagagc tcctgtccat ccgtggaagc agaagcaggt aacggagtta caacatgtca 720
ctggtctgat cttattccat aagaaatgtg ggcctgcttt ctgaacaagg ctgtgagatt 780
tgacttcacc gcaatcatgg cctaaataga agagccatat tgattaagaa agacctagaa 840
acgcatcctc tctacctctc tataatcgaa atgagcacat actctttgca ctggactggc 900
ggctgcctgg catttggagg gactgctgtg acatgttctt tccgtatgtg gagatggtgc 960
atgtcaggca ccaatattac cgtaacagtt ttggccatag aaatagatgt gatttttacc 1020
cctagtatca ggtgctccca gcagtataga aaaggtctcc ttacacaaat ctgtcagaca 1080
gatacaactg actctgaatc catccaggat gaaaaaaaac catagatatg tcaaaagaca 1140
agagtatctt gtttataaga tttagttaca actatgcgat tgaggtgggt aaactgggga 1200
cgatttccag ggatgcttga aatctgaatt gatgactcta caattttgac cgtcatatta 1260
aacatttttg tggctggtgt gggaagataa acagtctaga cacaataaaa tggaagaagg 1320
gataattcat tgcatcattt tgttaataat aataataaca ataacaataa caataaactt 1380
aagattctta accagagaat 1400
<210> 10
<211> 1400
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cagcggcggc agcggcggca gctcactcag cccgctgccc gagcggaaac gccactgacc 60
gcacggggat tcccagtgcc ggcgccaggg gcacgcggga cacgccccct cccgccgcgc 120
cattggcctc tccgcccacc gccccacact tattggccag ctccccgcca atcagcggag 180
gctgccgggg ccgcctaaag aagaggctgt gctctggggc tccggctcct cagagagcct 240
cggctaggta ggggatcggg actctggcgg gagggtggct tggcgcgttt gcgggggcgg 300
gcggccgcgg taggccctcc aaggacggtg gagccgcttt gtgggacagc tgggttcgat 360
tcgttaaccc tggaaggggc aagcgggtgg tagtcaggaa tccggccgcc ctgcagcaac 420
cggaggggga gggagaaggg agcggaaaag tctccaccgg acgcggccat ggctcccacg 480
gggggcggag aagcgcttcc ggtcgatgtc tcatcgctga ttggctgctt ttcctcccgc 540
cgcgtgtgaa aacacaaatg gcgtgttttg gttggagtga ggcgcctgtc aattaacggc 600
tgccggagtg cgcagccgct gactgcctcg ctgtgcccac tgggtggggc gggaggtagg 660
tggggtgagg cgagctggac gtgcgggcgc ggtcggcctc tggcggggcg ggggagggga 720
gggtcagcga aagtggctgg cgcgtgagcg gcctcccacc ctccccttcc tctgggggag 780
tcgttttacc cgccgccggc ctggcctcgt catctgattg gctctcgggg ctcagaaaac 840
tggcctttgc aattggcccg cgttcatgca agttcagtcc ctaagctggc tggcgggggc 900
ggcagggagg cgctcacagg ttccggccct ccccccaggc cccgcgccgc agagtctggc 960
cccgcgcccc tgcgcaacgt ggcaggaagc gcgcgctggg ggcggggacg ggcggtcggt 1020
ctgagcggcg ggcgggtgca aacgggattc ctccttgagt tgtggcactg aggaacgtgc 1080
tgaacaagac ctacattgca ctccagggag tggatgaagg agttggggct cagtcgggtt 1140
gtattggaga caagaagcac ttgctctcca aaagtcggtt tgagttatca ttaagggagc 1200
tgcagtggag taggcggaga aaaggccgca cccttctcag gacgggggag gggagtgttg 1260
caataccttt ctgggagttc tctgctgcct cctgtcttct gaggaccgcc ctgggcctgg 1320
aagattccct tcccccttct tccctcgtga tcggtacccg ggagatcttt aattaaccgt 1380
ttaaacaatt ctgcaggaat 1400
<210> 11
<211> 1400
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaattctgca gatgtgcacc cggggcgatc gccaaattcg atatcaagct tatcgataat 60
caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct 120
tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg 180
gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg 240
cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt 300
tggggcattg ccaccacctg tcagctcctt tccgggactt tcgctttccc cctccctatt 360
gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg 420
ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg aaatcatcgt cctttccttg gctgctcgcc 480
tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat 540
ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc 600
cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt tgggccgcct ccccgcatcg ataccgtcga 660
cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct 720
tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc 780
attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg 840
aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggaactagt acgcgttgca actggagtct 900
ttctggaaga taggcgggag tcttctgggc aggcttaaag gctaacctgg tgcgtggggc 960
gttgtcctgc agaggaattg aacaggtgta aaattggagg ggcaagactt cccacagatt 1020
ttcgattgtg ttgttaagta ttgtaatagg ggcaaataag ggaaatagac taggcactca 1080
cctggggttt tatgcagcaa aactacaggt tattattgct tgtgatccgc cctggagaat 1140
ttttcaccga ggtagattga agacatgccc acccaaattt taatattctt ccacttgcga 1200
tccttgctac agtatgaaat tacagtatcg tgaattagaa tatataagca gaattttaag 1260
cattttaaaa gagcccagta cttcatgtct gtctctccca cttctgcagc cctatcaaag 1320
ggtattttag cacactcatt ttagtcccat tttcatttgt tgtactggct tatccaatcc 1380
ctagacagag cactggcatt 1400

Claims (10)

1.特异性表达hMRGPRX4的转基因大鼠的构建方法，其特征在于，包括：
A、构建CRISPR-Cas9系统介导的大鼠MrgA基因敲除且定点整合外源基因①的转基因大鼠品系I；其中，所述外源基因①是hMRGPRX4基因和重组酶基因之间通过P2A自切割肽段序列连接而成，且所述CRISPR-Cas9系统靶向MrgA阳性的大鼠DRG神经元细胞；
B、构建CRISPR-Cas9系统介导的大鼠Rosa26基因敲除且定点整合外源基因②的转基因大鼠品系II；其中，所述外源基因②是hMRGPRX4基因和荧光报告基因之间通过iP2A自切割肽段序列连接而成，所述外源基因②由CAG或CMV启动子驱动，且在所述CAG启动子与外源基因之间包含一段受步骤A中所述重组酶条件性控制的STOP序列；
C、将品系I与品系II大鼠进行交配，得到特异性表达hMRGPRX4的转基因大鼠；
其中，所述hMRGPRX4基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述STOP序列如SEQ ID NO:3所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中gRNA作用位点的DNA序列为5′-TCCGGTTAGGAGTAAATTCC-3′和5′-TGAGACAGCGGAAAACACGG-3′；和/或
步骤B中gRNA作用位点的DNA序列为5′-GACTCCAGTTGCAGATCACG-3′。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组酶为Cre或Flp，优选Cre。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中所述荧光报告基因编码红色荧光蛋白mScarlet。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A包括：根据大鼠MrgA基因序列，构建基于CRISPR-Cas9系统的gRNA和Cas9表达载体，分别体外转录得到gRNA和Cas9 mRNA，并根据gRNA作用位点构建含有外源基因①的且可以整合至宿主基因组中的供体质粒，然后将体外转录得到的Cas9 mRNA、gRNA和供体质粒共同转入野生型大鼠的受精卵中，然后将克隆胚胎通过非手术法移入大鼠子宫内进行妊娠，获得转基因大鼠。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B包括：根据大鼠Rosa26基因序列，构建基于CRISPR-Cas9系统的gRNA和Cas9表达载体，分别体外转录得到gRNA和Cas9 mRNA，并根据gRNA作用位点构建含有外源基因②的且可以整合至宿主基因组中的供体质粒，然后将体外转录得到的Cas9 mRNA、gRNA和供体质粒共同转入野生型大鼠受精卵中，然后将克隆胚胎通过非手术法移入大鼠子宫内进行妊娠，获得转基因大鼠。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A和B中所述hMRGPRX4基因的3’端带有3×Flag标签序列。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述大鼠为SD大鼠。
9.根据权利要求1-8任一项所述方法构建的转基因大鼠的以下任一应用：
(1)用作筛选治疗或缓解人胆汁淤积性瘙痒症药物的动物模型；
(2)用于筛选治疗或缓解人胆汁淤积性瘙痒症的药物；
(3)用于检测引起人胆汁淤积性瘙痒症的物质；
(4)用于筛选hMRGPRX4受体的激动剂或抑制剂；
(5)用于hMRGPRX4基因功能的研究。
10.提高hMRGPRX4基因在大鼠MrgA阳性神经元表达量的方法，其特征在于，包括：将转基因大鼠品系I与转基因大鼠品系II进行交配；
其中，所述转基因大鼠品系I、转基因大鼠品系II同权利要求1-8中任一项所述。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114085869A (zh) * 2021-11-19 2022-02-25 许川 一种特异性表达人源性sirpg的转基因小鼠的构建方法及其应用
CN116814689A (zh) * 2023-06-30 2023-09-29 海湃泰克(北京)生物医药科技有限公司 特异性表达hMRGPRX2的转基因小鼠的构建方法及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001083555A2 (en) * 2000-05-04 2001-11-08 California Institute Of Technology Pain signaling molecules
CN110373426A (zh) * 2019-09-03 2019-10-25 哈尔滨工业大学 非肥胖性糖尿病动物模型、构建方法及其应用
CN110771573A (zh) * 2019-11-15 2020-02-11 西安医学院 PirB基因敲入的小鼠动物模型及其构建方法
CN111182790A (zh) * 2017-07-31 2020-05-19 瑞泽恩制药公司 Crispr报告体非人类动物及其用途
CN111566215A (zh) * 2017-06-16 2020-08-21 约翰·霍普金斯大学 治疗g蛋白偶联受体介导的病症的组合物和方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001083555A2 (en) * 2000-05-04 2001-11-08 California Institute Of Technology Pain signaling molecules
CN111566215A (zh) * 2017-06-16 2020-08-21 约翰·霍普金斯大学 治疗g蛋白偶联受体介导的病症的组合物和方法
CN111182790A (zh) * 2017-07-31 2020-05-19 瑞泽恩制药公司 Crispr报告体非人类动物及其用途
CN110373426A (zh) * 2019-09-03 2019-10-25 哈尔滨工业大学 非肥胖性糖尿病动物模型、构建方法及其应用
CN110771573A (zh) * 2019-11-15 2020-02-11 西安医学院 PirB基因敲入的小鼠动物模型及其构建方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUASHENG YU等: "MRGPRX4 is a bile acid receptor for human cholestatic itch", 《ELIFE》 *
JAMES MEIXIONG等: "MRGPRX4 is a G protein-coupled receptor activated by bile acids that may contribute to cholestatic pruritus", 《PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES》 *
LIANG HAN等: "A subpopulation of nociceptors specifically linked to itch", 《NATURE NEUROSCIENCE》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114085869A (zh) * 2021-11-19 2022-02-25 许川 一种特异性表达人源性sirpg的转基因小鼠的构建方法及其应用
CN116814689A (zh) * 2023-06-30 2023-09-29 海湃泰克(北京)生物医药科技有限公司 特异性表达hMRGPRX2的转基因小鼠的构建方法及其应用
CN116814689B (zh) * 2023-06-30 2024-04-05 海湃泰克(北京)生物医药科技有限公司 特异性表达hMRGPRX2的转基因小鼠的构建方法及其应用

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