JP2020520643A - 高活性制御エレメント - Google Patents

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Abstract

導入遺伝子の高い発現を駆動させるための組成物および方法が、本明細書において提供される。導入遺伝子に作動可能に連結された場合に、１つまたは複数の細胞型または組織において導入遺伝子の高い発現をもたらすことができる１つまたは複数のヒト由来制御エレメントを含む、導入遺伝子の高い発現を駆動させるための組成物および方法。治療用導入遺伝子に作動可能に連結された制御エレメントを含む発現カセットであって、前記制御エレメントが、（ｉ）配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１；または（ｉｉ）（ｉ）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列のうちの１つまたは複数を含む、発現カセット。

Description

相互参照
本願は、２０１７年５月１９日に出願した米国仮出願第６２／５０８，９６８号の利益を主張する。この出願は、その全体が本明細書に参考として援用される。
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、この配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１８年５月１７日に作成されたこのＡＳＣＩＩコピーは、４６４８２−７０７＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、そのサイズは１６，８３６バイトである。
開示の背景
遺伝子操作は、疾患の処置にとって、および治療的または他の使用のいずれかのためのタンパク質の産生にとって、莫大な可能性を有する。薬物または外科手術に依存するのではなく、患者、特に、根底にある遺伝学的要因を有するものは、根底にある原因を直接的に標的とすることによって、処置することができる。さらに、根底にある原因自体を標的とすることによって、遺伝子療法は、患者を効果的に治癒する可能性を有する。しかしながら、それにもかかわらず、遺伝子療法の臨床適用は、依然として、いくつかの側面で改善を必要とする。１つの課題は、１つもしくは複数の標的組織における導入遺伝子の高率の発現、または１つもしくは複数の標的組織における遺伝子編集の高い効率を達成することである。別の課題は、一般に使用されるベクターのパッケージング制限（またはクローニング能力）によって導入される。作動可能に連結された導入遺伝子の高い発現を駆動させることができる短い制御エレメントが必要とされている。
開示の概要
導入遺伝子の高い発現を駆動させるための（for driving）組成物および方法が、本明細書に記載される。１つまたは複数のヒトまたはヒト由来制御エレメント（ＲＥ）を含む、導入遺伝子の高い発現を駆動させるための組成物および方法もまた本明細書に記載され、このエレメントは、導入遺伝子に作動可能に連結されると、１つまたは複数の標的細胞型または組織において導入遺伝子の高い（または増加した）発現を促進することができるか、またはもたらすことができる。一部の事例では、本明細書に開示される任意の実施形態の高いまたは増加した導入遺伝子発現は、対照、たとえば、構成的プロモーター、ＣＡＧ、ＣＭＶプロモーター、スーパーコアプロモーター（ＳＣＰ）、ＴＴＲプロモーター、Ｐｒｏｔｏ１プロモーター、ＵＣＬ−ＨＬＰプロモーターまたはＣＭＶｅプロモーターと比較して判定される。本明細書に開示される制御エレメントによる高いまたは増加した導入遺伝子発現を判定するための比較に使用され得る他の対照としては、緩衝液単独、ｍｉｎＣＭＶ、ＥＦＳ、ベクター単独、または発現を駆動させない配列が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に開示される１つまたは複数の制御エレメントは、細胞中で、またはｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／もしくはｅｘ ｖｉｖｏで、導入遺伝子の高い発現を駆動させる。一部の実施形態では、導入遺伝子に作動可能に連結された本明細書に記載される１つまたは複数の制御エレメントを含む発現カセットまたはベクターは、細胞、対象もしくは動物モデルにおける導入遺伝子の高い発現を駆動させるため、または細胞、対象もしくは動物モデルにおける導入遺伝子発現の治療有効レベルをもたらすために、任意の発現系または遺伝子療法における使用のために適合され得る。一部の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＲＥは、細胞中でまたはｉｎ ｖｉｖｏで導入遺伝子の高い発現をもたらすために、大きな導入遺伝子（たとえば、その配列が、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、５．５ｋｂ、６ｋｂ、６．５ｋｂ、７ｋｂまたは７．５ｋｂを上回る導入遺伝子）に作動可能に連結される。一部の事例では、細胞中でまたはｉｎ ｖｉｖｏでの導入遺伝子のそのような高い発現は、前記ＲＥなしの導入遺伝子の発現に対しての比較であり、ここで、ＲＥありの導入遺伝子の発現は、ＲＥなしの導入遺伝子発現と比較して少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍であり、または１００倍を上回る。一部の事例では、１つまたは複数のＲＥは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０個の異なる細胞型において、そのような高い導入遺伝子発現をもたらす。一部の事例では、本開示の１つまたは複数のＲＥは、全身投与のために適合された遺伝子療法処置のために、導入遺伝子に作動可能に連結される。一部の事例では、本開示の１つまたは複数のＲＥは、肝臓または肝細胞における発現のために適合された遺伝子療法処置のために、導入遺伝子に作動可能に連結される。一部の事例では、導入遺伝子は、ＤＮＡ結合タンパク質、たとえば、内因性遺伝子をモジュレートする転写モジュレーターである。一部の事例では、本明細書に開示される任意の実施形態のＲＥは、プロモーター配列、イントロン配列、５’ＵＴＲ配列、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の事例では、本明細書に開示される任意の実施形態のＲＥは、ヒト由来配列（またはヒト参照ゲノム中の配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％もしくは９９％の配列同一性を有する配列）である。一部の事例では、本明細書に開示される任意の実施形態のＲＥは、長さが３００ｂｐ、２５０ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１４０ｂｐ、１３０ｂｐ、１２０ｂｐ、１１０ｂｐ、１００ｂｐ、７０ｂｐもしくは５０ｂｐ未満であるかまたはそれと等しい。一部の事例では、発現構築物（たとえば、ベクター、ＡＡＶまたはウイルスベクター）は、本開示の導入遺伝子に作動可能に連結された１つまたは複数の外因性ＲＥ配列を含み、ここで、各外因性ＲＥ配列は、表１に列挙された配列もしくは配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１から選択される；または各外因性ＲＥ配列は、表１の配列もしくは配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１を含む；または各外因性ＲＥ配列は、表１の配列もしくは配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性（たとえば、局所的な配列同一性）（たとえば、ＢＬＡＳＴによって測定された配列同一性）を有する配列を含む。一部の事例では、発現カセット（たとえば、ベクター、ＡＡＶまたはウイルスベクター）は、任意の導入遺伝子に作動可能に連結された１つまたは複数のＲＥ配列を含み、ここで、各ＲＥ配列は、４９ｂｐ、５０ｂｐ、５６ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、１１０ｂｐ、１１７ｂｐ、１２０ｂｐ、１３０ｂｐ、１４０ｂｐ、１５０ｂｐ、１６０ｂｐ、１７０ｂｐ、１８０ｂｐ、１９０ｂｐ、２００ｂｐ、２１０ｂｐ、２２０ｂｐ、２３０ｂｐ、２４０ｂｐ、２５０ｂｐ、２５９ｂｐ、２６０ｂｐ、２６５ｂｐ、２７０ｂｐ、２８０ｂｐ、２９０ｂｐ、３００ｂｐ、３１０ｂｐ、３２０ｂｐ、３３０ｂｐ、３４０ｂｐ、３５０ｂｐ、３６０ｂｐ、３７０ｂｐ、３８０ｂｐ、３９０ｂｐまたは４００ｂｐ以下であり、表１または配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１のうちのいずれか１つに従う配列を含む。一部の事例では、発現構築物（たとえば、ベクター、ＡＡＶまたはウイルスベクター）は、本開示の導入遺伝子に作動可能に連結された１つまたは複数の外因性ＲＥ配列を含み、ここで、各ＲＥ配列は、４９ｂｐ、５０ｂｐ、５６ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、１１０ｂｐ、１１７ｂｐ、１２０ｂｐ、１３０ｂｐ、１４０ｂｐ、１５０ｂｐ、１６０ｂｐ、１７０ｂｐ、１８０ｂｐ、１９０ｂｐ、２００ｂｐ、２１０ｂｐ、２２０ｂｐ、２３０ｂｐ、２４０ｂｐ、２５０ｂｐ、２５９ｂｐ、２６０ｂｐ、２６５ｂｐ、２７０ｂｐ、２８０ｂｐ、２９０ｂｐ、３００ｂｐ、３１０ｂｐ、３２０ｂｐ、３３０ｂｐ、３４０ｂｐ、３５０ｂｐ、３６０ｂｐ、３７０ｂｐ、３８０ｂｐ、３９０ｂｐまたは４００ｂｐ以下であり、表１または配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１のうちのいずれか１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の事例では、局所的な配列同一性は、ＢＬＡＳＴを使用して測定される。一部の事例では、パーセント配列同一性は、発現カセット中の外因性ＲＥ全体をカバーする全体的配列同一性を指す。他の事例では、パーセント配列同一性は、表１に列挙された配列のうちのいずれか１つに対応する領域または領域の一部をカバーする局所的な配列同一性を指す。一部の事例では、パーセント配列同一性は、導入遺伝子を含まない、発現カセットの４９ｂｐ、５０ｂｐ、５６ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、１１０ｂｐ、１１７ｂｐ、１２０ｂｐ、１３０ｂｐ、１４０ｂｐ、１５０ｂｐ、１６０ｂｐ、１７０ｂｐ、１８０ｂｐ、１９０ｂｐ、２００ｂｐ、２１０ｂｐ、２２０ｂｐ、２３０ｂｐ、２４０ｂｐ、２５０ｂｐ、２５９ｂｐ、２６０ｂｐ、２６５ｂｐ、２７０ｂｐ、２８０ｂｐ、２９０ｂｐ、３００ｂｐ、３１０ｂｐ、３２０ｂｐ、３３０ｂｐ、３４０ｂｐ、３５０ｂｐ、３６０ｂｐ、３７０ｂｐ、３８０ｂｐ、３９０ｂｐまたは４００ｂｐ以下を構成する領域をカバーする局所的な配列同一性を指す。本明細書で使用される場合、「比較的短い」は、本開示のＲＥを記述する場合、好ましくは、４５ｂｐ、４９ｂｐ、５０ｂｐ、５６ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、１１０ｂｐ、１１７ｂｐ、１２０ｂｐ、１３０ｂｐ、１４０ｂｐ、１５０ｂｐ、１６０ｂｐ、１７０ｂｐ、１８０ｂｐ、１９０ｂｐ、２００ｂｐ、２１０ｂｐ、２２０ｂｐ、２３０ｂｐ、２４０ｂｐ、２５０ｂｐ、２５９ｂｐ、２６０ｂｐ、２６５ｂｐ、２７０ｂｐ、２８０ｂｐ、２９０ｂｐ、３００ｂｐ、３１０ｂｐ、３２０ｂｐ、３３０ｂｐ、３４０ｂｐ、３５０ｂｐ、３６０ｂｐ、３７０ｂｐ、３８０ｂｐ、３９０ｂｐまたは４００ｂｐ以下であるＲＥ配列である。比較的短いＲＥの例としては、表１に列挙された配列もしくは配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１；またはそれに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列が挙げられ、これらはまた、４５ｂｐ、４９ｂｐ、５０ｂｐ、５６ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、１１０ｂｐ、１１７ｂｐ、１２０ｂｐ、１３０ｂｐ、１４０ｂｐ、１５０ｂｐ、１６０ｂｐ、１７０ｂｐ、１８０ｂｐ、１９０ｂｐ、２００ｂｐ、２１０ｂｐ、２２０ｂｐ、２３０ｂｐ、２４０ｂｐ、２５０ｂｐ、２５９ｂｐ、２６０ｂｐ、２６５ｂｐ、２７０ｂｐ、２８０ｂｐ、２９０ｂｐ、３００ｂｐ、３１０ｂｐ、３２０ｂｐ、３３０ｂｐ、３４０ｂｐ、３５０ｂｐ、３６０ｂｐ、３７０ｂｐ、３８０ｂｐ、３９０ｂｐまたは４００ｂｐ以下である。
一部の事例では、本明細書に開示される任意の実施形態のＲＥ配列は、導入遺伝子の上流または下流に位置する。一部の事例では、本明細書に開示される任意の実施形態の２つまたはそれよりも多くのＲＥは、導入遺伝子に作動可能に連結され、ここで、ＲＥのうちの少なくとも１つまたは複数は、導入遺伝子の上流または下流に位置する。一部の事例では、本開示の任意の実施形態の１つまたは複数のＲＥは、導入遺伝子の全体的発現を駆動させるために、導入遺伝子に作動可能に連結され、ここで、全体的発現は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の異なる細胞型における発現を指す。一部の事例では、本開示の任意の実施形態の１つまたは複数のＲＥは、導入遺伝子の全体的発現を駆動させるために、導入遺伝子に作動可能に連結され、ここで、ＲＥおよび導入遺伝子を含む構築物は、全身的に、たとえば、経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、くも膜下腔内、経腸または非経口投与を介して送達され得る。種々の実施形態では、本明細書に開示されるＲＥは、ヒト由来（またはヒト参照ゲノム中の配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を有する配列）である。一部の事例では、本明細書に開示される任意の実施形態のＲＥは、天然に存在しない。
一部の事例では、発現ベクターは、導入遺伝子に作動可能に連結された、４００ｂｐ、３００ｂｐ、２５０ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１４０ｂｐ、１３０ｂｐ、１２０ｂｐ、１１０ｂｐ、１００ｂｐ、７０ｂｐもしくは５０ｂｐ未満であるかまたはそれと等しいｂｐを有するヒト由来制御エレメントを含み、ここで、制御エレメントは、制御エレメントなしの第２の発現ベクターと比較して、導入遺伝子の全体的発現（たとえば、少なくとも２、３、４、５、６つまたはそれよりも多くの異なる細胞型における発現）を少なくとも２倍増加させる。一部の事例では、第２の発現ベクターは、ＣＭＶプロモーターなどの対照プロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子を含む。
一部の事例では、本開示のＲＥは、ヒト由来イントロン配列、たとえば、配列番号１〜２を含む。一部の事例では、本開示の発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結された、配列番号１〜２のうちの１つまたは複数を含む。一部の事例では、配列番号１〜２のうちのいずれか１つまたは複数を含むＲＥは、導入遺伝子の上流、下流、または上流および下流の両方に位置する。
一部の事例では、本開示のＲＥは、ヒト由来プロモーター配列、たとえば、配列番号１３〜１７および２２〜４１を含む。一部の事例では、本開示の発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結された、配列番号１３〜１７および２２〜４１のうちの１つまたは複数を含む。一部の事例では、配列番号１３〜１７および２２〜４１のうちのいずれか１つまたは複数を含むＲＥは、導入遺伝子の上流、下流、または上流および下流の両方に位置する。
一部の事例では、本開示のＲＥは、ヒト由来のイントロン配列および／またはプロモーター配列、たとえば、配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１のうちの２つもしくはそれよりも多く；または表１に列挙された配列のうちの２つもしくはそれよりも多くを含む。一部の事例では、本開示の発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結された、表１に列挙された配列のうちの１つもしくは複数、２つもしくはそれよりも多く、３つもしくはそれよりも多く、４つもしくはそれよりも多く、または５つもしくはそれよりも多くを含む。一部の事例では、表１に列挙された１つまたは複数のＲＥは、発現カセット中の導入遺伝子の上流、下流、または上流および下流の両方に位置する。一部の事例では、表１に列挙された１つまたは複数のＲＥは、本明細書に開示される発現カセット中の導入遺伝子の上流に位置する。
一部の事例では、本明細書に開示される任意の実施形態のＲＥは、表１から選択される配列または配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１、ならびにそれらの任意の組合せからなる。一部の事例では、表１に列挙された２つまたはそれよりも多くのＲＥは、リンカー配列を用いることなく、組み合わされる。一部の事例では、表１に列挙された２つまたはそれよりも多くのＲＥは、１〜５０ｂｐのリンカー配列を使用して組み合わされる。一部の事例では、表１に列挙された２つまたはそれよりも多くのＲＥは、ＲＥ配列の５’開始が、２ｂｐ、５ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、５．５ｋｂ、６ｋｂ、６．５ｋｂ、７ｋｂまたは７．５ｋｂ未満で離れるように、発現構築物中に置かれる。
一部の事例では、発現ベクターは、導入遺伝子に作動可能に連結された、３００ｂｐ、２５０ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１４０ｂｐ、１３０ｂｐ、１２０ｂｐ、１１０ｂｐ、１００ｂｐ、７０ｂｐもしくは５０ｂｐ未満であるかまたはそれと等しいｂｐを有するヒト由来制御エレメントを含み、ここで、導入遺伝子の発現は、対照制御エレメント、たとえば、構成的プロモーター、ＣＭＶプロモーター、スーパーコアプロモーター、ＴＴＲプロモーター、Ｐｒｏｔｏ１プロモーター、ＵＣＬ−ＨＬＰプロモーターまたはＣＭＶｅプロモーターによって発現される同じ導入遺伝子の発現よりも高い。一部の事例では、ＲＥに作動可能に連結された導入遺伝子の発現は、ＲＥなしにＵＣＬ−ＨＬＰプロモーターに連結された同じ導入遺伝子の発現よりも高い。
一部の事例では、発現ベクターは、導入遺伝子に作動可能に連結されたヒト由来制御エレメントを含み、ここで、導入遺伝子によってコードされるタンパク質は、（ｉ）導入遺伝子を検出するように構成されたＥＬＩＳＡアッセイによって測定した場合に、濃度＞１．０ＩＵ／ｍＬ、＞１．５ＩＵ／ｍＬ、＞２．０ＩＵ／ｍＬ、＞２．５ＩＵ／ｍＬもしくは＞３．０ＩＵ／ｍＬ；および／または（ｉｉ）Ｃｏａｔｅｓｔアッセイによって測定した場合に、＞２０％、＞２５％、＞３０％、＞３５％、＞４０％、＞４５％、＞５０％、＞５５％、＞６０％、＞６５％、＞７０％、＞７５％、＞８０％、＞８５％、＞９０％もしくは＞９５％の活性を有する。一部の事例では、そのような活性または導入遺伝子発現は、動物モデル、たとえば、マウスにおいてアッセイされる。一部の事例では、本明細書に記載される導入遺伝子発現または活性は、細胞またはマウスに送達された発現カセット、ベクター、ウイルスまたはＤＮＡの用量、たとえば、１マウス当たり１６μｇ（または１０〜２０μｇ）の用量の発現ベクターに対して正規化される。
一部の事例では、ベクターは、細胞中でもｉｎ ｖｉｖｏでも制御エレメントと関連して見出されない、または制御エレメントに通常は連結されない導入遺伝子に作動可能に連結された、サイズが３００ｂｐ、２５０ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１４０ｂｐ、１３０ｂｐ、１２０ｂｐ、１１０ｂｐ、１００ｂｐ、７０ｂｐもしくは５０ｂｐ未満であるかまたはそれと等しい配列を有するヒト由来制御エレメントを含む。
一部の事例では、本明細書に記載される発現カセットまたはベクターは、イントロン配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、またはそれらの組合せである制御エレメントを含む。一部の事例では、発現カセットまたはベクターは、配列番号１、２、３、４、１３、１４、１５、１６、１７、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０もしくは４１、またはそれらの組合せ、あるいはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列である制御エレメントを含む。一部の事例では、発現カセットまたはベクターは、レポーター遺伝子、たとえば、ルシフェラーゼである導入遺伝子を含む。一部の事例では、導入遺伝子としてのレポーター遺伝子、たとえば、ルシフェラーゼの使用は、マウス全体で測定した場合に、１×１０８光子／秒よりも高い全体的発現をもたらす、または動物、たとえば、マウスにおける少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個もしくはそれよりも多くの細胞型において増加した導入遺伝子発現をもたらす。一部の事例では、本明細書に記載される発現カセットまたはベクターの活性または導入遺伝子発現は、マウスに送達された発現カセット、ベクター、ウイルスまたはＤＮＡの用量、たとえば、１マウス当たり１２μｇの用量または１０〜２０μｇの用量の発現ベクターに対して正規化される。一部の事例では、内因性バージョンの本明細書に開示される導入遺伝子は、細胞中でもｉｎ ｖｉｖｏでも制御エレメントに連結されない、または細胞中でもｉｎ ｖｉｖｏでも制御エレメントに通常は連結されることもそれと関連することもない。一部の事例では、導入遺伝子の全体的発現は、ＣＭＶプロモーター、ＣＭＶｅプロモーター、スーパーコアプロモーター、ＴＴＲプロモーター、Ｐｒｏｔｏ１プロモーターおよびＵＣＬ−ＨＬＰプロモーターからなる群から選択される制御エレメントを有するベクターを使用した導入遺伝子の発現よりも高いレベルである。一部の事例では、発現は、ｉｎ ｖｉｖｏで（たとえば、マウスまたは異なるヒト細胞系における）少なくとも２、３、４、５、６、７つまたはそれよりも多くの異なる細胞型において検出可能である。一部の事例では、異なる細胞型は、肺胞細胞、心筋細胞、上皮細胞、肝細胞、腸細胞、筋細胞、ニューロンおよび腎細胞からなる群から選択される。一部の事例では、本明細書に開示される制御エレメントは、エンハンサー、プロモーター、５’ＵＴＲ配列、イントロン配列、もしくはそれらの任意の組合せである、またはエンハンサー、プロモーター、５’ＵＴＲ配列、イントロン配列、もしくはそれらの任意の組合せを含む。一部の事例では、本明細書に開示される制御エレメントは、プロモーター配列である、またはプロモーター配列を含む。一部の事例では、制御エレメントは、ＣＭＶプロモーター、ＣＭＶ、プロモーター、スーパーコアプロモーター、ＴＴＲプロモーター、Ｐｒｏｔｏ１プロモーター、ＵＣＬ−ＨＬＰプロモーター、ＡＡＴプロモーター、ＫＡＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＥＦＳプロモーターもしくはＣＭＶｅエンハンサー／ＣＭＶプロモーター組合せ、またはそれらの任意の組合せ、バリアントもしくは断片であるプロモーターを含む。
一部の事例では、本明細書に開示される発現ベクターまたはカセットは、１つまたは複数の転写後修飾部位をさらに含む。一部の事例では、発現ベクターまたはカセットは、Ｃａｓ９、ｓａＣａｓ９またはｄＣａｓ９である導入遺伝子を含む。一部の事例では、発現ベクターまたはカセットは、ＤＮＡ結合タンパク質または転写モジュレーター、たとえば、転写活性化因子である導入遺伝子を含む。一部の事例では、そのような転写モジュレータータンパク質は、細胞中でまたはｉｎ ｖｉｖｏで内因性遺伝子の発現を増加させるように、内因性遺伝子に対して作用する。
他の事例では、発現ベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏで第ＶＩＩＩ因子を検出するように構成されたＥＬＩＳＡアッセイによって測定した場合に、第ＶＩＩＩ因子の発現を濃度＞１．０ＩＵ／ｍＬまで駆動させることができる本明細書に開示される制御配列に作動可能に連結された第ＶＩＩＩ因子導入遺伝子を含む。
一部の事例では、本明細書に開示される任意の実施形態における導入遺伝子は、ハプロ不全と関連する遺伝子である。一部の事例では、そのようなハプロ不全は、肝臓または肝細胞中にある。一部の事例では、導入遺伝子は、第ＶＩＩＩ因子、Ｃａｓ９、ホルモン、増殖もしくは分化因子、インスリン、成長ホルモン、ＶＥＧＦ、神経栄養因子、線維芽細胞上皮因子（fibroblast epithelial factor）；サイトカイン、インターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子、抗体、免疫グロブリン、インターフェロン、キメラＴ細胞受容体；リポタンパク質受容体、嚢胞性線維症膜貫通制御因子（cystic fibrosis transmembrane regulator）、ムコ多糖症Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型もしくはＩＶ型と関連する遺伝子、ベータグロビンまたはリポタンパク質リパーゼ、あるいはそれらのバリアント、サブユニットまたは機能性断片のうちのいずれか１つである。一部の事例では、治療用導入遺伝子は、ＡＴＰ７Ａ、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはそれらのバリアント、サブユニットもしくは機能性断片である。一部の事例では、治療用導入遺伝子は、ＣＤＫＬ５、ＣＮＴＮＡＰ２、ＺＥＢ２、またはそれらのバリアントもしくは機能性断片である。一部の事例では、導入遺伝子は、フィブリノゲン、プロトロンビン、凝固因子もしくは血液凝固因子（たとえば、第１因子、第２因子、第３因子、第４因子、第５因子、第６因子、第７因子、第８因子、第９因子、第１０因子、第１１因子または第１２因子）、またはそれらのバリアントもしくは機能性断片である。
一部の事例では、本明細書に記載される発現ベクターまたはカセットのうちのいずれか１つは、ウイルス粒子である、またはウイルス粒子を使用して送達される、またはキャプシド形成されるもしくはウイルス粒子中に提供される。一部の事例では、ウイルス粒子は、アデノ随伴ウイルス、すなわちＡＡＶである。一部の事例では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ−ＤＪおよびｓｃＡＡＶからなる群から選択される。他の事例では、ウイルス粒子は、レンチウイルスである。一部の事例では、ウイルス粒子は、アデノウイルスである。
一部の事例では、本明細書に開示される発現ベクターまたはカセットのうちのいずれか１つは、治療用導入遺伝子である導入遺伝子を含む。一部の事例では、治療用導入遺伝子は、第ＶＩＩＩ因子、Ｃａｓ９、ＤＮＡ結合タンパク質、ホルモン、増殖もしくは分化因子、インスリン、成長ホルモン、ＶＥＧＦ、神経栄養因子、線維芽細胞上皮因子；サイトカイン、インターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子、抗体、免疫グロブリン、インターフェロン、キメラＴ細胞受容体；リポタンパク質受容体、嚢胞性線維症膜貫通制御因子、ムコ多糖症Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型もしくはＩＶ型と関連する遺伝子、ベータグロビンまたはリポタンパク質リパーゼ、あるいはそれらのバリアントまたは機能性断片である。一部の事例では、治療用導入遺伝子は、ＡＴＰ７Ａ、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはそれらのバリアント、サブユニットもしくは機能性断片である。一部の事例では、導入遺伝子は、ＡＴＰ７Ａ、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴ８Ｂ１（すなわちＡＴＰ８Ｂ１）、ＭＤＲ３（すなわちＡＢＣＢ４）、ＡＢＣＢＢ（すなわちＡＢＣＢ１１）、ＣＤＫＬ５、ＣＮＴＰ２（すなわちＣＮＴＮＡＰ２）、ＺＥＢ２、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子もしくは第Ｘ因子、またはそれらのバリアント、サブユニットもしくは機能性断片のうちのいずれか１つである。一部の事例では、治療用導入遺伝子は、ＣＤＫＬ５、ＣＮＴＮＡＰ２、ＺＥＢ２、またはそれらのバリアント、サブユニットもしくは機能性断片である。一部の事例では、導入遺伝子は、フィブリノゲン、プロトロンビン、凝固因子もしくは血液凝固因子（たとえば、第１因子、第２因子、第３因子、第４因子、第５因子、第６因子、第７因子、第８因子、第９因子、第１０因子、第１１因子または第１２因子）、またはそれらのバリアントもしくは機能性断片である。
一部の事例では、動物（たとえば、哺乳動物、ヒト、マウスなど）中の複数の異なる組織または細胞型に導入遺伝子を送達するための方法は、前記動物に、本明細書に開示される発現ベクターのうちのいずれか１つを投与することを含む。一部の事例では、投与することは、たとえば、経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、くも膜下腔内、経腸または非経口投与を介した、全身投与を含む。
一部の事例では、タンパク質、抗体または他の生物製剤の産生のための方法は、細胞を、本明細書に開示される発現ベクターのうちのいずれか１つと接触させることを含む。一部の事例では、タンパク質の産生に使用される細胞は、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。一部の事例では、本明細書に開示される任意の実施形態の発現構築物は、遺伝子療法処置、たとえば、肝細胞、腎臓細胞および／またはニューロンにおける（または中枢神経系（ＣＮＳ）における）発現のために使用される。他の事例では、本明細書に開示される任意の実施形態の発現構築物は、タンパク質を、ｅｘ ｖｉｖｏで、たとえば、任意の哺乳動物または任意のヒト細胞系、たとえば、腎臓細胞、上皮細胞、肝臓細胞、肝細胞、ニューロン、線維芽細胞またはＣＮＳ細胞において産生するために使用される。
一部の事例では、トランスジェニック動物または植物を産生するための方法は、動物または植物に、本明細書に開示される発現ベクターまたはカセットのうちのいずれか１つを投与することを含む。一部の事例では、本明細書に開示される発現ベクターまたはカセットのうちのいずれか１つにおいて使用される制御エレメントは、比較的短い、または４０〜５０ｂｐ、５０〜６０ｂｐ、６０〜７０ｂｐ、７０〜８０ｂｐ、８０〜９０ｂｐ、９０〜１００ｂｐ、１００〜１１０ｂｐ、１１０〜１２０ｂｐもしくは１２０〜１３０ｂｐである。一部の事例では、本明細書に開示される発現カセット中のＲＥは、４９ｂｐ、５６ｂｐ、１００ｂｐ、１１７ｂｐ、２５９ｂｐまたは２６６ｂｐである。一部の事例では、本明細書に開示される発現ベクターまたはカセットのうちのいずれか１つにおいて使用される制御エレメントは、４５〜５０ｂｐ、５０〜６０ｂｐ、４５〜６０ｂｐ、９０〜１１７ｂｐ、９５〜１１０ｂｐ、１１５〜１２０ｂｐ、２５０〜２６０ｂｐまたは２６０〜２７０ｂｐである。一部の事例では、本明細書に開示される発現ベクターまたはカセットのうちのいずれか１つにおいて使用される制御エレメントは、約１００ｂｐである。一部の事例では、本明細書に開示される発現ベクターまたはカセットのうちのいずれか１つにおいて使用される制御エレメントは、３００ｂｐ、２５０ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１４０ｂｐ、１３０ｂｐ、１２０ｂｐ、１１０ｂｐ、１００ｂｐ、７０ｂｐもしくは５０ｂｐ未満であるかまたはそれと等しい。一部の事例では、本明細書に開示される発現ベクターまたはカセットのうちのいずれか１つにおいて使用される制御エレメントは、１００ｂｐまたはそれよりも小さい。一部の事例では、導入遺伝子の高い発現を駆動させるために、本明細書に開示される２つまたはそれよりも多くの比較的短いＲＥが組み合わされ、導入遺伝子に作動可能に連結される。一部の事例では、２つまたはそれよりも多くのＲＥは、いずれの介在するヌクレオチドもなしに組み合わされ得、または１〜５０ｂｐのリンカーを使用して組み合わされる。
一部の態様では、本明細書に開示される発現カセットは、治療用導入遺伝子に作動可能に連結されたヒト由来制御エレメントを含み、ここで、制御エレメントは、（ｉ）配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１；（ｉｉ）それらの断片もしくは組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列のうちの１つまたは複数を含む。一部の事例では、制御エレメントは、ｈｇ１９のヒト配列に由来する。一部の事例では、制御エレメントは、天然に存在しない。一部の事例では、制御エレメントは、イントロン配列を含む。一部の事例では、イントロン配列は、プロモーターと治療用導入遺伝子との間に位置する。一部の事例では、制御エレメントは、プロモーター配列を含む。一部の事例では、制御エレメントは、カセット中の唯一のプロモーターである。一部の事例では、制御エレメントは、１００ｂｐ以下である。一部の事例では、制御エレメントは、６０ｂｐ以下である。一部の事例では、制御エレメントは、５０ｂｐ以下である。一部の事例では、発現カセットは、ｒＡＡＶの一部である。一部の事例では、ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ８である。一部の事例では、治療用導入遺伝子は、ＡＴＰ７Ｂである。一部の事例では、治療用導入遺伝子は、第ＶＩＩＩ因子である。一部の態様では、ウィルソン病を処置する方法は、本明細書に開示される発現カセットを投与することを含み、ここで、導入遺伝子は、ＡＴＰ７Ｂである。一部の事例では、ＡＴＰ７Ｂにおけるハプロ不全または遺伝的欠陥を処置する方法は、本明細書に開示される発現カセットを投与することを含み、ここで、導入遺伝子は、ＡＴＰ７Ｂである。一部の事例では、血液凝固障害を処置する方法は、本明細書に開示される発現カセットを投与することを含み、ここで、導入遺伝子は、第ＶＩＩＩ因子である。一部の事例では、ハプロ不全または遺伝的欠陥を処置する方法は、本明細書に開示される発現カセットを投与することを含み、ここで、導入遺伝子は、ＡＴＰ７Ａ；ＡＴＰ７Ｂ；ＡＴＰ８Ｂ１；ＡＢＣＢ４；ＡＢＣＢ１１；ＣＤＫＬ５；ＣＮＴＮＡＰ２；ＺＥＢ２；第１因子、第２因子、第３因子、第４因子、第５因子、第６因子、第７因子、第８因子、第９因子、第１０因子、第１１因子および第１２因子；ならびにそれらのバリアントまたは機能性断片から選択される。一部の事例では、ハプロ不全または遺伝的欠陥を処置する方法は、本明細書に開示される発現カセットを投与することを含み、ここで、導入遺伝子は、内因性遺伝子の発現をモジュレートする転写モジュレーターである。一部の事例では、ハプロ不全または遺伝的欠陥を処置する方法は、本明細書に開示される発現カセットを投与することを含み、ここで、導入遺伝子は、以下の内因性遺伝子：ＡＴＰ７Ａ；ＡＴＰ７Ｂ；ＡＴＰ８Ｂ１；ＡＢＣＢ４；ＡＢＣＢ１１；ＣＤＫＬ５；ＣＮＴＮＡＰ２；ＺＥＢ２；ならびに第１因子、第２因子、第３因子、第４因子、第５因子、第６因子、第７因子、第８因子、第９因子、第１０因子、第１１因子および第１２因子のうちのいずれか１つの転写活性化因子である。
一部の態様では、ＡＡＶ発現カセットは、少なくとも３ｋｂの導入遺伝子に作動可能に連結された１２０ｂｐ以下のヒト由来制御エレメントを含み、ここで、制御エレメントは、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結された場合の導入遺伝子の発現と比較して少なくとも２倍（by at least 2 fold）増加した導入遺伝子発現をもたらす。一部の事例では、制御エレメントは、配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１から選択される。一部の事例では、制御エレメントは、（ｉ）配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１；（ｉｉ）それらの組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む。一部の事例では、増加した導入遺伝子発現は、少なくとも５０倍である。一部の事例では、増加した導入遺伝子発現は、少なくとも１００倍である。一部の事例では、増加した導入遺伝子発現は、少なくとも２つの異なる細胞型（たとえば、肝細胞および腎臓細胞）において生じる。一部の事例では、増加した導入遺伝子発現は、少なくとも３つの異なる細胞型（たとえば、肝細胞、腎臓細胞、ニューロンおよび／または上皮細胞）において生じる。一部の事例では、制御エレメントは、配列番号２２〜４１のうちのいずれか１つまたは複数を含み、他のプロモーター配列は、発現カセット中に存在しない。一部の事例では、制御エレメントは、導入遺伝子の上流に位置する。一部の事例では、制御エレメントは、配列番号１および配列番号２のうちの１つまたは複数を含む。一部の事例では、制御エレメントは、プロモーターの下流に位置する。一部の事例では、導入遺伝子は、ＡＴＰ７Ａ；ＡＴＰ７Ｂ；ＡＴＰ８Ｂ１；ＡＢＣＢ４；ＡＢＣＢ１１；ＣＤＫＬ５；ＣＮＴＮＡＰ２；ＺＥＢ２；第１因子、第２因子、第３因子、第４因子、第５因子、第６因子、第７因子、第８因子、第９因子、第１０因子、第１１因子および第１２因子；ならびにそれらのバリアントまたは機能性断片から選択される。一部の事例では、導入遺伝子は、ＡＴＰ７ＡもしくはＡＴＰ７Ｂ、またはそれらのバリアントもしくは機能性断片である。一部の事例では、導入遺伝子は、第１因子、第２因子、第３因子、第４因子、第５因子、第６因子、第７因子、第８因子、第９因子、第１０因子、第１１因子および第１２因子、またはそれらのバリアントもしくは機能性断片のうちのいずれか１つである。一部の事例では、導入遺伝子は、第８因子、またはそのバリアントもしくは機能性断片である。一部の事例では、導入遺伝子は、遺伝子編集タンパク質である。一部の事例では、遺伝子編集タンパク質は、Ｃａｓ（たとえば、Ｃａｓ９）である。一部の事例では、導入遺伝子は、ＤＮＡ結合タンパク質である。一部の事例では、導入遺伝子は、内因性遺伝子の発現を増加させる転写活性化因子である。一部の事例では、導入遺伝子は、内因性遺伝子の発現を減少させる転写抑制因子である。一部の事例では、転写活性化因子は、以下の内因性遺伝子：ＡＴＰ７Ａ；ＡＴＰ７Ｂ；ＡＴＰ８Ｂ１；ＡＢＣＢ４；ＡＢＣＢ１１；ＣＤＫＬ５；ＣＮＴＮＡＰ２；ＺＥＢ２；ならびに第１因子、第２因子、第３因子、第４因子、第５因子、第６因子、第７因子、第８因子、第９因子、第１０因子、第１１因子および第１２因子のうちのいずれか１つの発現を増加させる。一部の事例では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ−ＤＪおよびｓｃＡＡＶからなる群から選択される。
一部の態様では、組換えタンパク質を産生する方法は、タンパク質をコードする配列を、（ｉ）配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１；（ｉｉ）それらの組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列のうちの１つまたは複数に作動可能に連結させることを含む。
一部の態様では、肝臓の疾患または状態を処置する方法は、（ｉ）配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１；（ｉｉ）それらの組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される１つまたは複数の制御エレメントに作動可能に連結された治療用導入遺伝子を含む遺伝子療法（gene therapy）を投与することを含む。一部の事例では、肝臓の疾患または状態は、ウィルソン病である。一部の事例では、肝臓の疾患または状態は、血液凝固障害である。一部の事例では、導入遺伝子は、ＡＴＰ７ＡもしくはＡＴＰ７Ｂ、またはそれらのバリアントもしくは機能性断片である。一部の事例では、導入遺伝子は、第１因子、第２因子、第３因子、第４因子、第５因子、第６因子、第７因子、第８因子、第９因子、第１０因子、第１１因子、第１２因子、またはそれらのバリアントもしくは機能性断片である。一部の事例では、導入遺伝子は、第８因子、またはそのバリアントもしくは機能性断片である。一部の事例では、制御エレメントは、少なくとも２つの細胞型において増加した導入遺伝子発現をもたらす。一部の事例では、制御エレメントは、少なくとも３つの細胞型において増加した導入遺伝子発現をもたらす。一部の事例では、制御エレメントは、肝細胞において増加した導入遺伝子発現をもたらす。一部の事例では、制御エレメントは、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結された場合の導入遺伝子の発現と比較して少なくとも２倍であるレベルの、増加した導入遺伝子発現をもたらす。一部の事例では、遺伝子療法は、ＡＡＶである。一部の事例では、ＡＡＶは、ＡＡＶ８である。
一部の態様では、発現ベクターは、導入遺伝子に作動可能に連結された１００ｂｐ未満であるかまたはそれと等しいｂｐを有するヒト由来制御エレメントを含み、ここで、制御エレメントは、制御エレメントなしの第２の発現ベクターと比較して、導入遺伝子の全体的発現を少なくとも２倍増加させる。一部の事例では、第２の発現ベクターは、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子を含む。
一部の態様では、発現ベクターは、導入遺伝子に作動可能に連結された１００ｂｐ未満であるかまたはそれと等しいｂｐを有するヒト由来制御エレメントを含み、ここで、導入遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーター、スーパーコアプロモーター、ＴＴＲプロモーター、Ｐｒｏｔｏ１プロモーター、ＵＣＬ−ＨＬＰプロモーターまたはＣＭＶｅプロモーターによって発現される同じ導入遺伝子の発現よりも高い。一部の事例では、導入遺伝子の発現は、ＵＣＬ−ＨＬＰプロモーターによって発現される同じ導入遺伝子の発現よりも高い。一部の態様では、発現ベクターは、導入遺伝子に作動可能に連結されたヒト由来制御エレメントを含み、ここで、導入遺伝子によってコードされるタンパク質は、（ｉ）導入遺伝子を検出するように構成されたＥＬＩＳＡアッセイによって測定した場合に、濃度＞１．０ＩＵ／ｍＬ；および／または（ｉｉ）Ｃｏａｔｅｓｔアッセイによって測定した場合に、＞２５％の活性を有する。一部の態様では、本明細書に開示されるベクターは、細胞中でもｉｎ ｖｉｖｏでも制御エレメントと関連して見出されない導入遺伝子に作動可能に連結された、サイズが１００ｂｐ未満であるかまたはそれと等しい配列を有するヒト由来制御エレメントを含む。一部の事例では、本明細書に開示されるベクターは、イントロン配列である制御エレメントを含む。一部の事例では、制御エレメントは、配列番号１もしくは配列番号２、またはそれに対して少なくとも８０％の相同性を有する配列である。一部の事例では、導入遺伝子としてのルシフェラーゼの使用は、マウス全体で測定した場合に、１×１０８光子／秒よりも高い全体的発現をもたらす。一部の事例では、活性または導入遺伝子発現は、１マウス当たり１６μｇの用量の発現ベクターに対応する。一部の事例では、活性または導入遺伝子発現は、１マウス当たり１２μｇの用量の発現ベクターに対応する。一部の事例では、内因性バージョンの導入遺伝子は、ｉｎ ｖｉｖｏでは制御エレメントに連結されない。一部の事例では、導入遺伝子の全体的発現は、ＣＭＶプロモーター、ＣＭＶｅプロモーター、スーパーコアプロモーター、ＴＴＲプロモーター、Ｐｒｏｔｏ１プロモーターおよびＵＣＬ−ＨＬＰプロモーターからなる群から選択される制御エレメントを有するベクターを使用した導入遺伝子の発現よりも高いレベルである。一部の事例では、発現は、マウスにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏで、または細胞系において、少なくとも２、３、４、５、６または７つの異なる細胞型において検出可能である。一部の事例では、異なる細胞型は、肺胞細胞、心筋細胞、上皮細胞、肝細胞、腸細胞、筋細胞、ニューロンおよび腎細胞からなる群から選択される。一部の事例では、制御エレメントは、エンハンサーである。一部の事例では、本明細書に開示されるベクターは、プロモーターをさらに含む。一部の事例では、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＣＭＶ、プロモーター、スーパーコアプロモーター、ＴＴＲプロモーター、Ｐｒｏｔｏ１プロモーター、ＵＣＬ−ＨＬＰプロモーター、ＡＡＴプロモーター、ＫＡＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＥＦＳプロモーターまたはＣＭＶｅエンハンサー／ＣＭＶプロモーター組合せである。一部の事例では、本明細書に開示されるベクターは、１つまたは複数の転写後修飾部位をさらに含む。一部の事例では、導入遺伝子は、Ｃａｓ９である。一部の事例では、導入遺伝子は、ｓａＣａｓ９である。
一部の態様では、発現ベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏで第ＶＩＩＩ因子を検出するように構成されたＥＬＩＳＡアッセイによって測定した場合に、第ＶＩＩＩ因子の発現を濃度＞１．０ＩＵ／ｍＬまで駆動させることができる制御配列に作動可能に連結された第ＶＩＩＩ因子導入遺伝子を含む。一部の事例では、ウイルス粒子は、本明細書に開示される発現ベクターを含む。一部の事例では、ウイルス粒子は、ＡＡＶである。一部の事例では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ−ＤＪおよびｓｃＡＡＶからなる群から選択される。一部の事例では、ウイルス粒子は、レンチウイルスである。一部の事例では、ウイルス粒子は、アデノウイルスである。一部の事例では、導入遺伝子は、治療用導入遺伝子である。一部の事例では、治療用導入遺伝子は、第ＶＩＩＩ因子、Ｃａｓ９、ＤＮＡ結合タンパク質、ホルモン、増殖もしくは分化因子、インスリン、成長ホルモン、ＶＥＧＦ、神経栄養因子、線維芽細胞上皮因子；サイトカイン、インターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子、抗体、免疫グロブリン、インターフェロン、キメラＴ細胞受容体；リポタンパク質受容体、嚢胞性線維症膜貫通制御因子、ムコ多糖症Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型もしくはＩＶ型と関連する遺伝子、ベータグロビンまたはリポタンパク質リパーゼである。一部の事例では、治療用導入遺伝子は、ＡＴＰ７Ａ、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはそれらのバリアントもしくは機能性断片である。一部の事例では、治療用導入遺伝子は、ＣＤＫＬ５、ＣＮＴＮＡＰ２、ＺＥＢ２、またはそれらのバリアントもしくは機能性断片である。一部の事例では、動物中の複数の異なる組織または細胞型に導入遺伝子を送達するための方法は、前記動物に、本明細書に開示される発現ベクターを投与することを含む。一部の事例では、タンパク質の産生のための方法は、細胞に、本明細書に開示される発現ベクターをトランスフェクトすることを含む。一部の事例では、細胞は、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。一部の事例では、トランスジェニック動物または植物を産生するための方法は、動物または植物に、本明細書に開示される任意の実施形態の発現ベクターを投与することを含む。一部の事例では、制御エレメントは、４０〜５０ｂｐである。一部の事例では、制御エレメントは、５０〜６０ｂｐである。
一部の態様では、発現ベクターは、導入遺伝子に作動可能に連結されたヒト由来制御エレメントを含み、ここで、導入遺伝子によってコードされるタンパク質は、（ｉ）導入遺伝子を検出するように構成されたＥＬＩＳＡアッセイによって測定した場合に、濃度＞０．１ＩＵ／ｍＬ；および／または（ｉｉ）Ｃｏａｔｅｓｔアッセイによって測定した場合に、＞１０％の活性を有する。他の態様では、発現ベクターは、導入遺伝子に作動可能に連結された、＜１２０ｂｐのｂｐを有するヒト由来制御エレメントを含み、ここで、導入遺伝子の発現は、ＵＣＬ−ＨＬＰプロモーターによって発現される同じ導入遺伝子の発現よりも高い。一部の事例では、制御エレメントは、プロモーターである。一部の事例では、治療用導入遺伝子は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写制御ドメインを含む融合タンパク質である。
参照による援用
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれ個別の刊行物、特許、または特許出願が、具体的かつ個別に参照により援用されると示されるのと同程度に、参照により本明細書に援用される。
本発明の新規な特徴を、添付の特許請求の範囲において具体的に示す。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理を利用する例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、および以下の添付の図面を参照することによって得られる。
図１Ａは、異なる制御エレメント（たとえば、配列番号１および配列番号２）を含むプラスミドの正規化されたルシフェラーゼ値を示し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるルシフェラーゼの発現に対してＲＥが有した影響を実証する。たとえば、配列番号３（ミニマルＣＭＶ（ｍｉｎＣＭＶ）プロモーターと組み合わせた配列番号１を含む）は、ｍｉｎＣＭＶプロモーター単独によって駆動された発現よりも約１．４倍高いレベルで、またＳＣＰプロモーターによって駆動された発現よりも約６０倍高いレベルで、ルシフェラーゼの発現を駆動させた。
図１Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、ＳＣＰ、ｍｉｎＣＭＶおよびＣＡＧと比較した、各制御エレメント（たとえば、配列番号３および配列番号４）のサイズ正規化された活性（正規化されたルシフェラーゼ活性を、塩基対で表される制御エレメントの長さで除することによって計算される）を示す。配列番号４（ｍｉｎＣＭＶプロモーターに連結された配列番号２を含む）は、ｍｉｎＣＭＶプロモーター単独よりも約３．５倍高いレベルで、またＳＣＰプロモーターよりも約１４０倍高いレベルで、サイズ正規化された活性をもたらした。
図１Ｃは、陰性対照および陽性対照（配列番号４）と比較した、組み合わせた配列番号１７および２２、組み合わせた配列番号１６および２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３２、ならびに配列番号３３の制御エレメントの、正規化されたルシフェラーゼ発現を示す。すべてのＲＥは、配列番号４によって駆動された発現のレベルと同等の、高いレベルの正規化されたルシフェラーゼ発現をもたらした。
図１Ｄは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、陰性対照、陽性対照（配列番号４）、ＣＭＶ＋ＣＭＶｅおよびＣＭＶ単独と比較した、配列番号２８、配列番号３０、配列番号２６または配列番号２７の制御エレメントの正規化されたルシフェラーゼ発現を示す。各制御エレメントは、ＣＭＶ単独およびＣＭＶ＋ＣＭＶｅよりも高いルシフェラーゼ発現を駆動させた。
図１Ｅは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、陰性対照と比較した、組み合わせた配列番号１７および２２、組み合わせた配列番号１６および２３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、または配列番号４１の制御エレメントの正規化されたルシフェラーゼ発現を示す。試験した各制御エレメントは、陰性対照よりも高いルシフェラーゼ発現を駆動させた。
図２Ａは、異なる制御エレメント（ＳＣＰ、ＳｅｒｐＥ＿ＴＴＲ、Ｐｒｏｔｏ１、ｍｉｎＣＭＶ、ＵＣＬ−ＨＬＰ、ＣＭＶｅ、配列番号３または配列番号４）の制御下にルシフェラーゼを含む発現カセットを投薬したマウスにおけるルシフェラーゼの発現を示す。
図２Ｂは、図２Ａの発現カセットを注射した３匹のマウスにおいて観察されたルシフェラーゼ発現からの平均総発光（光子／秒）の定量を示す。
図３Ａは、酵素結合免疫吸着アッセイによって測定した場合の、マウスにおけるヒト第８因子（ＦＶＩＩＩ）の発現に対する、様々な制御エレメント（ＵＣＬ−ＨＬＰ、配列番号３または配列番号４）の影響を示す。配列番号３または配列番号４のいずれかを含む発現カセットは、上昇したレベルのヒトＦＶＩＩＩ（ＩＵ／ｍＬ）をもたらした。
図３Ｂは、ヒトＦＶＩＩＩのパーセント活性をアッセイするＣｏａｔｅｓｔアッセイによって測定した場合の、マウスにおけるヒト第８因子（ＦＶＩＩＩ）の発現に対する、様々な制御エレメント（ＵＣＬ−ＨＬＰ、配列番号３または配列番号４）の影響を示す。
図４Ａは、ｔｄＴｏｍａｔｏ（赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）とも称される）の上流に提供された終結配列を欠失させるために、Ｃａｓ９酵素、ガイドＲＮＡ、およびいくつかの制御エレメント（ｍｉｎＣＭＶ、ＥＦＳまたは配列番号４）のうちの１つを含む単一のＡＡＶを用いてマウス脳の歯状回（dente gyrus）において実施した遺伝子編集を示す。ＲＦＰは、薄い灰色によって示される。配列番号４を含む発現カセットは、陰性対照、ｍｉｎＣＭＶおよびＥＦＳと比較して、ＲＦＰのより高い発現をもたらす遺伝子編集をもたらした。
図４Ｂは、図４ＡのＲＦＰ発現細胞の平均数の定量を示す。
図５Ａは、本開示の制御エレメントを含むｒＡＡＶ発現カセットを使用した、ＦＶＩＩＩノックアウトマウスにおいて血液凝固欠損をｉｎ ｖｉｖｏで処置するために使用される遺伝子療法の例を示す。ＰＢＳ対照、または３１１ゲノムコピー／ｋｇ（ｇｃ／ｋｇ）の用量もしくは３１２ｇｃ／ｋｇの用量の、本開示の制御エレメントを含むｒＡＡＶで処置したマウスの血液喪失（ｇ）結果を、未処置の非ノックアウトマウスと比較した。３１２ｇｃ／ｋｇの用量のｒＡＡＶ遺伝子療法によるマウスの処置は、対照（たとえば、ＰＢＳ対照マウス）と比較して、血液喪失の低減をもたらした。
図５Ｂは、凝固までの分数（分）で表されるマウスの出血時間を示す。
図６Ａは、ＡＡＶ ＩＴＲ−ＬおよびＩＴＲ−Ｒ、ならびに導入遺伝子に作動可能に連結された１つまたは複数の制御エレメント、たとえば、エンハンサー、プロモーター、安定性エレメントおよびポリＡシグナルを含む本開示の例示的な発現カセット、ベクターまたはプラスミドを示す。そのようなｒＡＡＶベクターは、遺伝子療法に使用され得る。
図６Ｂは、配列番号１の制御エレメントが導入遺伝子に作動可能に連結され、制御エレメントが、プロモーターの下流かつ遺伝子およびポリアデニル化シグナルの上流に位置する、発現カセットの拡大図を示す。
図６Ｃは、配列番号２の制御エレメントが導入遺伝子に作動可能に連結され、制御エレメントが、プロモーターの下流かつ遺伝子およびポリアデニル化シグナルの上流に位置する、発現カセットを示す。
図７は、ＡＡＶ ＩＴＲ−ＬおよびＩＴＲ−Ｒ、ならびに大きな導入遺伝子に作動可能に連結された本開示の１つまたは複数の比較的短いヒト由来制御エレメント（たとえば、配列番号１３〜１７および２２〜４１）を含む本開示の例示的な発現カセット、ベクターまたはプラスミドを示し、ここで、導入遺伝子は、サイズが少なくとも３ｋｂまたは３〜５ｋｂである。そのようなｒＡＡＶベクターは、遺伝子療法処置に使用され得る。
図８は、未処置のノックアウトマウスおよび配列番号９（ＵＣＬ−ＨＬＰ）と比較した、本開示の様々な発現カセット、たとえば、配列番号１３〜１７の制御エレメントのうちのいずれか１つを含む発現カセットで処置したマウスにおいて発現されたヒトＦＶＩＩＩの濃度（ＩＵ／ｍＬ）を示す。
図９は、本開示の様々な発現カセットで処置したマウスにおけるヒトＦＶＩＩＩのパーセント活性を示し、ここで、配列番号１３〜１７は、制御エレメントを指す。
図１０は、本開示の様々な発現カセットで処置したマウスを用いた、グラム（ｇ）で測定した血液喪失実験を示し、ここで、配列番号１３〜１７は、制御エレメントを指す。
図１１は、本開示の様々な発現カセットで処置したマウスにおける、凝固までの分数（分）で表される出血時間を示し、ここで、配列番号１３〜１７は、制御エレメントを指す。
図１２は、１マウス当たりのゲノムコピー（ｇｃ／マウス）１Ｅ１０（すなわち１０１０）、１Ｅ１１（すなわち１０１１）ｇｃ／マウスまたは１Ｅ１２（すなわち１０１２）ｇｃ／マウスの用量の、配列番号１３の配列を有する制御エレメントを含む発現カセットで処置したマウスにおける、ＡＴＰ７Ｂの相対的発現（Ｌｏｇ２）を示す。データは、配列番号１３を含む発現カセットの用量とｉｎ ｖｉｖｏでのＡＴＰ７Ｂの発現との間の正の相関を示した。
図１３は、５Ｅ１１ｇｃ／マウスの用量で投与した、配列番号４、１３、１４、１５、１６、１７または２７の配列を有する制御エレメントを含む発現カセットで処置したマウスにおける、ＥＧＦＰの相対的発現（Ｌｏｇ１０）を示す。データは、ＲＮＡ転写物によって測定した場合に、これらのＲＥが、マウスの肝臓においてｉｎ ｖｉｖｏで、上昇したレベルのＥＧＦＰ発現をもたらしたことを示した。
開示の詳細な説明
本開示は、導入遺伝子の高い発現のための組成物および方法を企図する。１つまたは複数のヒトまたはヒト由来制御エレメント（ＲＥ）を含む、導入遺伝子の高い発現のための組成物および方法もまた本明細書に記載され、このエレメントは、導入遺伝子に作動可能に連結されると、１つまたは複数の標的細胞型または組織において導入遺伝子の高い（または増加した）発現を促進することができるか、またはもたらすことができる。一部の実施形態では、本明細書に開示される１つまたは複数の制御エレメントは、細胞中で、またはｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／もしくはｅｘ ｖｉｖｏで、導入遺伝子の高い発現を駆動させる。一部の実施形態では、導入遺伝子に作動可能に連結された本明細書に記載される１つまたは複数の制御エレメントを含む発現カセットまたはベクターは、細胞、対象もしくは動物モデルにおける導入遺伝子の高い発現を駆動させるため、または細胞、対象もしくは動物モデルにおける導入遺伝子発現の治療有効レベルをもたらすために、任意の発現系または遺伝子療法における使用のために適合され得る。一部の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＲＥは、細胞中でまたはｉｎ ｖｉｖｏで導入遺伝子の高い発現をもたらすために、大きな導入遺伝子（たとえば、その配列が、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、５．５ｋｂ、６ｋｂ、６．５ｋｂ、７ｋｂまたは７．５ｋｂを上回る導入遺伝子）に作動可能に連結される。一部の事例では、細胞中でまたはｉｎ ｖｉｖｏでの導入遺伝子のそのような高い発現は、前記ＲＥなしの導入遺伝子の発現に対しての比較であり、ここで、ＲＥありの導入遺伝子の発現は、ＲＥなしの導入遺伝子発現と比較して、または陰性対照（たとえば、緩衝液単独、ベクター単独、または発現活性を有さないことが既知の配列を含むベクター）による導入遺伝子発現と比較して少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍、少なくとも２００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも１０１０倍、少なくとも１０２０倍、少なくとも１０３０倍、少なくとも１０４０倍または少なくとも１０５０倍である。
一部の事例では、１つまたは複数のＲＥは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０個の異なる細胞型において、高い導入遺伝子発現をもたらす。一部の事例では、本開示の１つまたは複数のＲＥは、全身投与のために適合された遺伝子療法処置のために、導入遺伝子に作動可能に連結される。一部の事例では、本開示の１つまたは複数のＲＥは、肝臓または肝細胞における発現のために適合された遺伝子療法処置のために、導入遺伝子に作動可能に連結される。一部の事例では、導入遺伝子は、肝臓もしくは肝細胞において発現される遺伝子であり、または肝臓の疾患もしくは状態と関連する遺伝子、たとえば、ウィルソン病と関連するＡＴＰ７Ｂ；進行性家族性肝内胆汁うっ滞症３型と関連するＡＢＣＢ４；遺伝性フルクトース不耐症と関連するＡＬＤＯＢ；ＩＶ型糖原病と関連するＧＢＥ１；チロシン血症Ｉ型と関連するＦＡＨ；アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症と関連するＡＳＬ；シトリン欠損症（ＣＴＬＮ２、ＮＩＣＣＤ）と関連するＳＬＣ２５Ａ１３；コレステロールエステル蓄積症と関連するＬＩＰＡ；アルファ−１アンチトリプシン欠損症と関連するＳＥＲＰＩＮＡ１；嚢胞性線維症と関連するＣＦＴＲ；遺伝性ヘモクロマトーシスと関連するＨＦＥ；もしくはアルストレーム症候群と関連するＡＬＭＳ１である。一部の事例では、本明細書に開示される１つまたは複数の制御エレメントは、遺伝性の肝臓疾患、たとえば、胆汁酸合成の障害、炭水化物代謝の障害、アミノ酸代謝の障害、尿素サイクル異常症、または脂質代謝の障害を処置するための遺伝子療法処置のために使用される。一部の事例では、導入遺伝子は、ＤＮＡ結合タンパク質、たとえば、内因性遺伝子をモジュレートする転写モジュレーターである。一部の事例では、本明細書に開示される任意の実施形態のＲＥは、プロモーター配列、イントロン配列、５’ＵＴＲ配列、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の事例では、本明細書に開示される任意の実施形態のＲＥは、ヒト由来配列（またはヒト参照ゲノム中の配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％もしくは９９％の配列同一性を有する配列）である。一部の事例では、本明細書に開示される任意の実施形態のＲＥは、長さが５０ｂｐ、６０ｂｐ、１００ｂｐ、１２０ｂｐ、２６０ｂｐもしくは２７０ｂｐ未満であるかまたはそれと等しい。一部の事例では、本明細書に開示される任意の実施形態のＲＥは、３００ｂｐ、２５０ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１４０ｂｐ、１３０ｂｐ、１２０ｂｐ、１１０ｂｐ、１００ｂｐ、７０ｂｐもしくは５０ｂｐ未満であるかまたはそれと等しい。一部の事例では、発現カセット（たとえば、ベクター、ＡＡＶまたはウイルスベクター）は、本開示の導入遺伝子に作動可能に連結された１つまたは複数のＲＥ配列を含み、ここで、各ＲＥ配列は、表１に列挙された配列のうちのいずれか１つ、または表１の配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性（たとえば、局所的な配列同一性）を有する配列である。一部の事例では、発現構築物（たとえば、ベクター、ＡＡＶまたはウイルスベクター）は、本開示の導入遺伝子に作動可能に連結された１つまたは複数のＲＥ配列を含み、ここで、各ＲＥ配列は、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、１１０ｂｐ、１２０ｂｐ、１３０ｂｐ、１４０ｂｐ、１５０ｂｐ、１６０ｂｐ、１７０ｂｐ、１８０ｂｐ、１９０ｂｐ、２００ｂｐ、２１０ｂｐ、２２０ｂｐ、２３０ｂｐ、２４０ｂｐ、２５０ｂｐ、２６０ｂｐ、２７０ｂｐ、２８０ｂｐ、２９０ｂｐ、３００ｂｐ、３１０ｂｐ、３２０ｂｐ、３３０ｂｐ、３４０ｂｐ、３５０ｂｐ、３６０ｂｐ、３７０ｂｐ、３８０ｂｐ、３９０ｂｐまたは４００ｂｐ以下であり、表１の配列のうちのいずれか１つまたは複数に従う配列を含む。一部の事例では、発現カセット（たとえば、ベクター、ＡＡＶまたはウイルスベクター）は、本開示の導入遺伝子に作動可能に連結された１つまたは複数のＲＥ配列を含み、ここで、各ＲＥ配列は、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、１１０ｂｐ、１２０ｂｐ、１３０ｂｐ、１４０ｂｐ、１５０ｂｐ、１６０ｂｐ、１７０ｂｐ、１８０ｂｐ、１９０ｂｐ、２００ｂｐ、２１０ｂｐ、２２０ｂｐ、２３０ｂｐ、２４０ｂｐ、２５０ｂｐ、２６０ｂｐ、２７０ｂｐ、２８０ｂｐ、２９０ｂｐ、３００ｂｐ、３１０ｂｐ、３２０ｂｐ、３３０ｂｐ、３４０ｂｐ、３５０ｂｐ、３６０ｂｐ、３７０ｂｐ、３８０ｂｐ、３９０ｂｐまたは４００ｂｐ以下であり、表１に列挙された配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の局所的な配列同一性を有する配列を含む。一部の事例では、局所的な配列同一性は、ＢＬＡＳＴを使用して測定される。一部の事例では、本明細書に開示される任意の実施形態のＲＥ配列は、導入遺伝子の上流または下流に位置する。一部の事例では、本明細書に開示される任意の実施形態の２つまたはそれよりも多くのＲＥは、導入遺伝子に作動可能に連結され、ここで、ＲＥのうちの少なくとも１つまたは複数は、導入遺伝子の上流、下流、または上流および下流の両方に位置する。
一部の事例では、本開示の任意の実施形態の１つまたは複数のＲＥは、導入遺伝子の全体的発現を駆動させるために、導入遺伝子に作動可能に連結され、ここで、全体的発現は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の異なる細胞型における導入遺伝子発現を指す。一部の事例では、本開示の任意の実施形態の１つまたは複数のＲＥは、対象または動物中に全身送達された場合に導入遺伝子の全体的発現を駆動させるために、導入遺伝子に作動可能に連結される。一部の事例では、本明細書に開示される発現カセットの全身送達または投与は、経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、くも膜下腔内、経腸および／または非経口投与を介した送達である。種々の実施形態では、本明細書に開示される任意の実施形態のＲＥは、ヒト由来（またはヒト参照ゲノム中の配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％もしくは９９％の配列同一性を有する配列）である。一部の事例では、本明細書に開示される任意の実施形態のＲＥは、天然に存在しない。
遺伝子操作法は、所望される結果を達成するために、遺伝子を置き換える、遺伝子を修飾する、または遺伝子を付加することができる。遺伝子療法は、疾患または障害を処置するための遺伝子操作の使用である。遺伝子操作は、目的の１つまたは複数のタンパク質の産生のために、細胞または生物を修飾するためにも使用され得る。遺伝子操作の１つの課題は、治療効果を達成するのに十分に高いレベルで、または産業的／産生レベルを達成するのに十分に高いレベルで、発現を駆動させる制御エレメントを有することである。遺伝子操作の別の課題は、所望されるベクター内に収まるのに十分に小さいが、目的のタンパク質の完全コーディング配列を含み、高い発現を確実にするのに十分な制御配列を含む発現カセットを設計することである。ベクターまたはウイルス発現ベクターのクローニング能力は、大きな導入遺伝子の発現にとって、特に問題である。たとえば、ＡＡＶベクターは、約４．８ｋｂのパッケージング能力を有し、レンチウイルスは、約８ｋｂの能力を有し、アデノウイルスは、約７．５ｋｂの能力を有し、アルファウイルスは、約７．５ｋｂの能力を有する。一部のウイルスは、より大きなパッケージング能力を有し、たとえば、ヘルペスウイルスは、３０ｋｂを上回る能力を有し、ワクシニアは、約２５ｋｂの能力を有するが、他のウイルスを使用することには利点があり得る。たとえば、ＡＡＶの利点としては、病原性が低いこと、宿主ゲノムに組み込まれる頻度が非常に低いこと、ならびに分裂細胞および非分裂細胞に感染する能力が挙げられる。
遺伝子療法における１つの課題は、導入遺伝子が、ｉｎ ｖｉｖｏで治療効果をもたらすために、少なくとも１つまたは複数の標的細胞型または組織において十分に高いレベルで発現されることを確実にすることである。一部の事例では、増加した導入遺伝子発現は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれよりも多くの異なる細胞型または組織、たとえば、腎臓細胞、上皮細胞、肝臓細胞、肝細胞、ニューロン、線維芽細胞および／またはＣＮＳ細胞において所望される。一部の事例では、増加した導入遺伝子発現は、タンパク質合成のために、ｅｘ ｖｉｖｏで、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の細胞系、たとえば、哺乳動物またはヒト細胞系、たとえば、腎臓細胞、上皮細胞、肝臓細胞、肝細胞、ニューロン、線維芽細胞、免疫細胞および／またはＣＮＳ細胞において所望される。遺伝子療法のための従来的な方法は、送達方法および／またはビヒクル（たとえば、使用されるウイルスまたはウイルスのキャプシド配列を変化させること）に頼ることが多かった。当該分野における１つの技術的課題は、特に、遺伝子が、大型である場合に、治療効果を発揮するために、１つまたは複数の細胞型または組織における遺伝子発現のレベルを増加させることである。大きな導入遺伝子の発現は、技術的な課題と関連するが、これは、ベクター、たとえば、ウイルスまたはＡＡＶベクターが、限定的なクローニング能力を有するからである。より大きな導入遺伝子（たとえば、その配列が、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、５．５ｋｂ、６ｋｂ、６．５ｋｂ、７ｋｂまたは７．５ｋｂを上回る導入遺伝子）を発現させるために、ベクター中により大きな導入遺伝子を収容するために、より小さな制御エレメントを使用しなくてはならない。したがって、ＲＥなしの発現；陰性対照（たとえば、いずれの発現も駆動させないことが既知の配列、空のベクター、または緩衝液単独対照）と比較して、または導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター（たとえば、ＣＭＶプロモーター、ＳＣＰ、ＵＣＬ−ＨＬＰなど）と比較して、細胞中でまたはｉｎ ｖｉｖｏで増加した導入遺伝子発現をもたらす新規な短い制御エレメント（たとえば、３００ｂｐ、２５０ｂｐ、２００ｂｐ、１５０ｂｐ、１４０ｂｐ、１３０ｂｐ、１２０ｂｐ、１１０ｂｐ、１００ｂｐ、７０ｂｐもしくは５０ｂｐ未満であるかまたはそれと等しいＲＥ）が必要とされている。
本明細書で使用される場合、単数形の「１つの（a）」、「１つの（an）」、および「その（the）」は、文脈により別途明確に示されない限り、複数形も含むことが意図される。さらに、「含むこと（including）」、「含む（includes）」、「有すること（having）」、「有する（has）」、「有する（with）」、またはこれらの変形が、詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかにおいて使用される範囲内で、そのような用語は、「含む（comprising）」という用語と同様の様式で、包含的であることが意図される。
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって判定される、特定の値に対する許容可能な誤差の範囲内であることを意味し、これは、部分的に、その値が、どのように測定または判定されるか、すなわち、測定システムの制限に依存するであろう。たとえば、「約」は、当該技術分野における慣例に従い、１または１を上回る標準偏差以内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、最大１５％、最大１０％、最大５％、または最大１％）の範囲を意味し得る。
「判定すること」、「測定すること」、「評価すること（evaluating）」、「評価すること（assessing）」、「アッセイすること」、「分析すること」という用語、およびそれらの文法上の同等物は、任意の形態の測定を指して、本明細書において互換可能に使用することができ、ある要素が存在するかしないかを判定すること（たとえば、検出）を含む。これらの用語は、定量的および／または定性的判定の両方を含み得る。アッセイすることは、相対的であっても絶対的であってもよい。
「発現」という用語は、核酸配列またはポリヌクレオチドが、ＤＮＡ鋳型から（たとえば、ｍＲＮＡもしくは他のＲＮＡ転写物へと）転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡが、続いて、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされるポリペプチドは、集合的に、「遺伝子産物」と称され得る。ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡに由来する場合は、発現には、真核生物細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングが含まれ得る。一部の事例では、全体的発現が所望され、全体的発現は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個もしくはそれよりも多くの異なる細胞型もしくは組織における遺伝子（たとえば、導入遺伝子）の発現、または複数の細胞型における遺伝子の発現を指す。細胞型は、異なる細胞マーカー、形態学、表現型、遺伝子型、機能を有することによって、および／または細胞型を分類するための任意の他の手段によって、区別される。一部の事例では、異なる細胞型または組織は、ｉｎ ｖｉｖｏの細胞型または組織を指す。一部の事例では、異なる細胞型または組織は、ｅｘ ｖｉｖｏの細胞型または組織を指す。一部の事例では、異なる細胞型または組織としては、異なる哺乳動物細胞系、ヒト細胞系、腎臓細胞、上皮細胞、肝臓細胞、肝細胞、ニューロン、線維芽細胞および／またはＣＮＳ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された（operably linked）」、「作動可能な連結」、「操作可能に連結された（operatively linked）」、またはこれらの文法上の同等物は、遺伝子エレメント、たとえば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化配列などの並置を指し、ここで、これらのエレメントは、エレメントが予測された様式で作動するのを許容する関係性にある。たとえば、プロモーターおよび／またはエンハンサー配列を含み得る制御エレメントは、制御エレメントがコーディング配列の転写開始を補助する場合に、コーディング領域に操作可能に連結されている。この機能的関係性が維持される限り、制御エレメントとコーディング領域との間に、介在する残基が存在してもよい。
「ベクター」は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドを含むかまたはそれと会合し、ポリヌクレオチドを細胞に送達するのを媒介するために使用することができる、巨大分子または巨大分子の会合を指す。ベクターの例としては、プラスミド、ウイルスベクター、リポソーム、および他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。ベクターは、一般に、標的における遺伝子の発現を促進するために、遺伝子に操作可能に連結された、遺伝子エレメント、たとえば、制御エレメントを含む。制御エレメントと、発現のために制御エレメントが作動可能に連結される１つまたは複数の遺伝子との組合せは、「発現カセット」と称される。
「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスの略語であり、ウイルスそのものまたはその誘導体を指して使用され得る。この用語は、すべての血清型、サブタイプ、ならびに天然に存在する形態および組換え形態の両方を包含するが、そうでないことが求められる場合を除く。「ｒＡＡＶ」という略語は、組換えアデノ随伴ウイルスを指し、組換えＡＡＶベクター（または「ｒＡＡＶベクター」）とも称される。「ＡＡＶ」という用語には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、およびそれらのハイブリッド、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、ならびにヒツジＡＡＶが含まれる。様々な血清型のＡＡＶのゲノム配列、ならびに天然の末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、およびキャプシドサブユニットの配列は、当該技術分野において公知である。そのような配列は、文献、または公的なデータベース、たとえば、ＧｅｎＢａｎｋにおいて見出すことができる。「ｒＡＡＶベクター」は、本明細書で使用される場合、ＡＡＶ起源のものではないポリヌクレオチド配列（すなわち、ＡＡＶにとって異種のポリヌクレオチド）、典型的には、細胞の遺伝子形質転換の目的とされる配列を含む、ＡＡＶベクターを指す。一般に、異種ポリヌクレオチドには、少なくとも１つの、および一般的には２つの、ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）が隣接している。ｒＡＡＶベクターという用語は、ｒＡＡＶベクター粒子およびｒＡＡＶベクタープラスミドの両方を包含する。ｒＡＡＶベクターは、一本鎖（ｓｓＡＡＶ）または自己相補性（ｓｃＡＡＶ）のいずれであってもよい。「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ｒＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質およびキャプシド形成されたポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターから構成される、ウイルス粒子を指す。粒子が、異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子など、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合は、典型的には、「ｒＡＡＶベクター粒子」または単純に「ｒＡＡＶベクター」と称される。したがって、そのようなベクターは、ｒＡＡＶ粒子内に含まれるため、ｒＡＡＶ粒子の産生には、必然的に、ｒＡＡＶベクターの産生が含まれる。
本明細書で使用される場合、「処置する」、「処置」、「治療法」などの用語は、所望される薬理学的および／または生理学的作用を得ることを指し、これには、疾患または障害を軽減すること、その進行を遅延もしくは緩徐化すること、その作用もしくは症状を低減すること、その発症を予防すること、それを阻害すること、その発症を緩和すること、疾患、障害、または病態に関して有益または所望される結果、たとえば、治療上の利益および／または予防上の利益を得ることが含まれるが、これらに限定されない。「処置」は、本明細書で使用される場合、哺乳動物、特に、ヒトにおける疾患のあらゆる処置を包含し、これには、（ａ）疾患の素因があり得るかまたは疾患を生じる危険性にあり得るが、まだ疾患を有すると診断されていない被験体において、疾患が発症するのを予防すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発生を停止させること、および（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の退縮を引き起こすことが含まれる。治療上の利益には、処置されている根底にある障害の根絶または緩和が含まれる。また、治療上の利益は、根底にある障害と関連する生理学的症状のうちの１つまたは複数の根絶または緩和により達成され、そのため、被験体が、根底にある障害に依然として罹患している場合があったとしても、改善が、被験体において観察される。一部の事例では、予防上の利益については、本組成物は、特定の疾患を発症する危険性にある被験体、または疾患の生理学的症状のうちの１つもしくは複数を報告している被験体に投与されるが、この疾患の診断は、まだ行われていなくてもよい。本開示の方法は、任意の哺乳動物に使用することができる。一部の事例では、処置は、症状の減少または停止（たとえば、けいれんの頻度または期間の低減）をもたらし得る。予防的効果としては、疾患もしくは状態の出現の遅延もしくは排除、疾患もしくは状態の症状の発症の遅延もしくは排除、疾患もしくは状態の進行の緩徐化、停止、もしくは逆転、またはこれらの任意の組合せが挙げられる。
「有効量」または「治療有効量」という用語は、以下に定義されるように、これに限定されないが疾患の処置を含む意図される適用を達成するのに十分な本明細書に記載される組成物の量を指す。治療有効量は、当業者によって容易に判定することができる、意図される処置適用（細胞中またはｉｎ ｖｉｖｏ）、または処置されている被験体および疾患状態、たとえば、被験体の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与の様式などに応じて、変動し得る。この用語はまた、標的細胞において特定の応答を誘導するであろう用量にも当てはまる。具体的な用量は、選択される具体的な組成物、従うべき投薬レジメン、組成物が他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、組成物が投与される組織、および組成物が運搬される物理的な送達システムに応じて、変動するであろう。
ヌクレオチドまたはペプチド配列の「断片」とは、「全長」配列であると考えられるものよりも短い配列を指すことを意味する。
分子の「バリアント」は、そのような配列の対立遺伝子変形形態、すなわち、分子全体またはその断片のいずれかに、構造および生物学的活性が実質的に類似である配列を指す。本明細書で使用される場合、遺伝子のバリアントは、最も一般的な野生型ＤＮＡ配列（たとえば、ｃＤＮＡ、またはそのＧｅｎＢａｎｋによって参照される配列、もしくはそのＵｎｉＰｒｏｔ受託番号によって参照されるタンパク質配列に対応する配列）と比較して、遺伝的変更または突然変異を有する配列を指す。遺伝子バリアントは、突然変異体、たとえば、野生型配列と比較して強化された強化された活性または機能を有する突然変異体；タンパク質の任意の公知のサブユニット；および選択的スプライシングからもたらされる遺伝子の公知のアイソフォームを包含する。
「機能性断片」という用語は、分子の「断片」、「バリアント」、「類似体」、または「化学的誘導体」を含むことが意図される。ＤＮＡまたはタンパク質配列の「機能性断片」は、配列の少なくとも生物学的に活性な断片を有するが、これは、全長ＤＮＡまたはタンパク質配列の生物学的活性に実質的に類似する生物学的活性（機能的または構造的のいずれかで）を保持する断片を指す。ＤＮＡ配列の生物学的活性は、全長配列に帰属することが公知の様式で、発現に影響を及ぼすその能力であり得る。たとえば、制御エレメントの機能性断片は、全長ＲＥとして転写に影響を及ぼす能力を保持する。
「被験体」および「個体」という用語は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指して、本明細書において互換可能に使用される。「被験体」とは、動物、たとえば、哺乳動物、たとえば、ヒトを指す。本明細書に記載される方法は、ヒトの治療法、獣医学的適用、および／または疾患もしくは状態の動物モデルにおける前臨床研究において、有用であり得る。一部の事例では、被験体は、哺乳動物であり、一部の事例では、
被験体は、ヒトである。
「ｉｎ ｖｉｖｏ」という用語は、被験体の身体において生じる事象を指す。
「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」という用語は、被験体の身体の外部で生じる事象を指す。たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、被験体の外部で行われる任意のアッセイを包含する。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、生存細胞または死細胞を用いる、細胞に基づくアッセイを包含する。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイはまた、インタクトな細胞を用いない、無細胞アッセイも包含する。
同一性、変異、または試験配列の１つもしくは複数の位置が、参照配列の１つもしくは複数の指定された位置と比較してどこに含まれるかを評価するなどの目的での配列比較は、ニードルマン・ウンシュアルゴリズム（たとえば、www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/において利用可能なＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅアライナーを、必要に応じてデフォルトの設定とともに参照されたい）、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（たとえば、blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiにおいて利用可能なＢＬＡＳＴアルゴリズムツールを、必要に応じてデフォルトの設定とともに参照されたい）、およびスミス・ウォーターマンアルゴリズム（たとえば、www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/において利用可能なＥＭＢＯＳＳ Ｗａｔｅｒアライナーを、必要に応じてデフォルトの設定とともに参照されたい）を含むがこれらに限定されない、任意の好適なアライメントアルゴリズムによって行うことができる。最適なアライメントは、デフォルトパラメーターを含め、選択されたアルゴリズムの任意の好適なパラメーターを使用して、評価することができる。
一般に、互換可能に使用することができる「配列同一性」または「配列相同性」は、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のヌクレオチド間またはアミノ酸間での厳密な対応を指す。典型的に、配列同一性を判定するための技法には、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を判定することおよび／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を判定すること、ならびにこれらの配列を、第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することが含まれる。２つまたはそれを上回る配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、「相同性パーセント」とも称される、それらの「同一性パーセント」を判定することによって、比較することができる。より長い分子（たとえば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）内の配列であり得る、参照配列（たとえば、核酸またはアミノ酸配列）に対する同一性パーセントは、２つの最適にアライメントした配列間での厳密な一致の数を、参照配列の長さで除し、１００を乗じたものとして、計算することができる。同一性パーセントはまた、たとえば、バージョン２．２．９を含め、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈから入手可能なａｄｖａｎｃｅｄ ＢＬＡＳＴコンピュータプログラムを使用して、配列情報を比較することによって、判定することもできる。ＢＬＡＳＴプログラムは、KarlinおよびAltschul、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８７巻：２２６４〜２２６８頁（１９９０年）のアライメント方法に基づくものであり、Altschulら、J. Mol. Biol.、２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）、KarlinおよびAltschul、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９０巻：５８７３〜５８７７頁（１９９３年）、ならびにAltschulら、Nucleic Acids Res.、２５巻：３３８９〜３４０２頁（１９９７年）において考察されている通りである。簡単に述べると、ＢＬＡＳＴプログラムは、アライメントされた同一の記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を、２つの配列のうちの短い方における記号の総数で除したものとして、同一性を定義する。このプログラムを使用して、比較されている配列の全長にわたって、同一性パーセントを判定することができる。デフォルトのパラメーターは、短いクエリ配列での、たとえば、ｂｌａｓｔｐプログラムでの検索を最適化するように提供される。このプログラムはまた、WoottonおよびFederhen、Computers and Chemistry、１７巻：１４９〜１６３頁（１９９３年）のＳＥＧプログラムによって判定される、クエリ配列のセグメントをマスキングにより排除（mask-off）するＳＥＧフィルターの使用が可能である。所望される配列同一性の程度の範囲は、およそ８０％〜１００％、およびこれらの間の整数値である。典型的には、開示される配列と、請求される配列との間の同一性パーセントは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％である。一般に、厳密な一致は、参照配列の長さにわたって１００％の同一性を示す。一部の事例では、配列同一性パーセントへの言及は、ＢＬＡＳＴ（基本的な局所的アライメント検索ツール、Basic Local Alignment Search Tool）を使用して測定される、配列同一性を指す。他の事例では、ＣｌｕｓｔａｌＷが、複数の配列のアライメントに使用され得る。
別途示されない限り、本明細書において使用されるすべての用語は、当業者にとってのものと同じ意味を有し、本発明の実施は、分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術の従来的な技法を採用することになるが、これらは、当業者の知識の範囲内である。
制御エレメント
制御エレメントは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡレベルで機能し得る。制御エレメントは、目的の細胞型において、遺伝子発現の選択性をモジュレートするように機能し得る。制御エレメントは、遺伝子発現の転写の段階、翻訳後の段階、または翻訳の段階で、遺伝子発現をモジュレートするように機能し得る。制御エレメントとしては、プロモーター、エンハンサー、イントロン配列、または他の非コード配列が挙げられるが、これらに限定されない。ＲＮＡレベルでは、制御は、翻訳（たとえば、翻訳のためにｍＲＮＡを安定化する安定性エレメント）、ＲＮＡ切断、ＲＮＡスプライシング、および／または転写終結のレベルで、生じ得る。一部の事例では、制御エレメントは、転写因子を、目的の細胞型における遺伝子発現の選択性を増加させるコーディング領域に動員することができる。一部の事例では、制御エレメントは、ＲＮＡ転写物が産生される速度を増加させる、産生されるＲＮＡの安定性を増加させる、および／またはＲＮＡ転写物からのタンパク質合成の速度を増加させることができる。
制御エレメントは、１つまたは複数の細胞型または組織における遺伝子（たとえば、レポーター遺伝子、たとえば、ＥＧＦＰもしくはルシフェラーゼ；導入遺伝子；または治療用遺伝子）の発現に影響を及ぼす（たとえば、増加させる）ことが可能な核酸配列または遺伝子エレメントである。一部の事例では、制御エレメントは、導入遺伝子、イントロン、プロモーター、エンハンサー、ＵＴＲ、末端逆位反復（ＩＴＲ）配列、長い末端反復配列（ＬＴＲ）、安定性エレメント、翻訳後応答エレメントもしくはポリＡ配列、またはそれらの組合せであり得る。一部の事例では、制御エレメントは、プロモーター、エンハンサー、イントロン配列、またはそれらの組合せである。一部の事例では、制御エレメントは、ヒト配列（たとえば、ｈｇ１９）に由来する。
制御エレメントを単離する１つの方法は、動物モデルに由来する１つまたは複数の細胞型から核を単離すること（これは、１つまたは複数の組織または細胞型を単離する親和性精製方法（たとえば、ある特定の細胞型に結合するビーズ）を使用することによって、達成することができる）、高スループットの天然のプライミングおよびＤＮＡ合成を使用して、核内のオープンクロマチン領域に由来する配列のプールを生成すること、この配列のプールをシーケンシングして、１つまたは複数の組織または細胞型における遺伝子発現を駆動させる推定上の配列を特定すること、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏで１つもしくは複数の細胞系におけるおよび／または動物モデルにおける、レポーター系における発現が含まれる。一部の事例では、２つまたはそれよりも多くの制御エレメントは、より大きなＲＥを形成するために組み合わされる。一部の事例では、組み合わされた制御エレメントは、複数の細胞型、たとえば、少なくとも２、３、４、５、６つまたはそれよりも多くの細胞型において、強化された遺伝子発現を呈する。一部の事例では、制御エレメントは、導入遺伝子発現を増加させるその能力を保持する最小限の量の配列を判定するために、一度に１つまたは複数の塩基が短縮される。導入遺伝子発現活性を保持するより小さな制御エレメントは、大きな導入遺伝子を含む遺伝子療法を作製するのに役立つか、またはベクターもしくはプラスミドのクローニング能力が、遺伝子療法を使用して送達したい導入遺伝子のサイズの観点で制限される場合に役立つ。たとえば、本開示の１つまたは複数のＲＥは、導入遺伝子に作動可能に連結された場合に、増加した導入遺伝子発現を駆動させ、ここで、導入遺伝子は、少なくとも１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、５．５ｋｂ、６ｋｂ、６．５ｋｂ、７ｋｂまたは７．５ｋｂである。一部の事例では、導入遺伝子発現のそのような増加は、陰性対照、構成的プロモーター、ＣＭＶプロモーター、スーパーコアプロモーター、ＴＴＲプロモーター、Ｐｒｏｔｏ１プロモーター、ＵＣＬ−ＨＬＰプロモーターまたはＣＭＶｅプロモーターと比較して少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍または少なくとも１０００倍である。
一部の事例では、本開示の制御エレメントは、作動可能に連結された導入遺伝子の高いまたは増加した発現をもたらし、ここで、高いまたは増加した発現は、対照、たとえば、構成的プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧ、スーパーコアプロモーター（ＳＣＰ）、ＴＴＲプロモーター、Ｐｒｏｔｏ１プロモーター、ＵＣＬ−ＨＬＰプロモーター、ｍｉｎＣＭＶ、ＥＦＳまたはＣＭＶｅプロモーターと比較して判定される。本明細書に開示される制御エレメントによる高いまたは増加した導入遺伝子発現を判定するために使用され得る他の対照としては、緩衝液単独またはベクター単独が挙げられる。一部の事例では、陽性対照は、比較のために使用できる、公知の発現活性を有するＲＥ、たとえば、配列番号４を指す。一部の事例では、制御エレメントは、陽性対照（たとえば、導入遺伝子に作動可能に連結された配列番号４または公知のプロモーター）と同等の、またはそれと比較してより高い導入遺伝子発現を駆動させる。
一部の事例では、配列番号１３〜１７の最も５’側の１７ヌクレオチドは、発現活性を保持するより短いＲＥを形成するために除去され得る。たとえば、最も５’側の１７ヌクレオチドを有さない配列番号１３〜１７は、それぞれ、配列番号３０、２６、２８、２３および２２である。
他の事例では、２つまたはそれよりも多くの比較的短いＲＥは、高い導入遺伝子発現活性および／またはサイズ正規化された遺伝子発現活性を有するより大きなＲＥを形成するために組み合わされ得る。たとえば、配列番号１７は、配列番号２２と組み合わされ得；または配列番号１６は、配列番号２２と組み合わされ得る。
本開示は、作動可能に連結された導入遺伝子の発現を増加させる比較的短いヒト由来制御エレメントを企図する。一部の事例では、短いヒト由来ＲＥは、表１の配列、または配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１のうちのいずれか１つである。
一部の事例では、比較的短いヒト由来ＲＥは、表１の配列もしくは配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１；または表１の配列もしくは配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性（たとえば、局所的な配列同一性）を有する配列を含む。一部の事例では、短いヒト由来ＲＥは、ｈｇ１９のヒト配列に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する、天然に存在しない配列を含む。一部の事例では、比較的短いヒト由来ＲＥは、表２に列挙された以下のゲノム位置または染色体位置のうちの１つに位置するヒト配列に対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する、天然に存在しない配列を含む。
一部の事例では、比較的短いヒト由来ＲＥは、表２に列挙されたゲノム位置におけるプロモーターに由来し、陰性対照（たとえば、ベクター単独対照、緩衝液対照、または発現活性を有さないことが既知の配列）と比較して、または構成的プロモーター、ＣＭＶプロモーター、スーパーコアプロモーター、ＴＴＲプロモーター、Ｐｒｏｔｏ１プロモーター、ＵＣＬ−ＨＬＰプロモーターもしくはＣＭＶｅプロモーターと比較して少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍または少なくとも１０００倍の導入遺伝子発現を呈する。
一部の事例では、本開示の比較的短いＲＥは、イントロン配列（たとえば、配列番号１または配列番号２）を含み、これは、発現カセット中の導入遺伝子に作動可能に連結されると、ＳＣＰの制御下での導入遺伝子発現または陰性対照（たとえば、ベクター単独、緩衝液単独、またはいずれの発現活性も有さない配列）と比較して少なくとも５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍もしくは５０００倍の、または１０００倍を上回る、正規化された遺伝子（たとえば、ルシフェラーゼ、ＡＴＰ７ＢまたはＦＶＩＩＩ）発現をもたらす。一部の事例では、本開示の比較的短いＲＥ（たとえば、配列番号１または配列番号２）は、発現カセット中の導入遺伝子に作動可能に連結されると、ＳＣＰまたはＣＡＧのサイズ正規化された活性と比較して少なくとも１．５倍、２．５倍、５倍、１０倍、１５倍もしくは２０倍またはそれよりも高い、サイズ正規化された活性をもたらす。一部の事例では、本開示の比較的短いＲＥ（たとえば、配列番号１または配列番号２）は、発現カセット中の導入遺伝子（たとえば、ルシフェラーゼ）に作動可能に連結されると、ＳＣＰ、ＳｅｒｐＥ＿ＴＴＲ、Ｐｒｏｔｏ１、ｍｉｎＣＭＶ、ＵＣＬ−ＨＬＰもしくはＣＭＶｅの制御下でのルシフェラーゼと比較して；または緩衝液対照と比較して少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、５倍、１０倍またはそれよりも高い、総ルシフェラーゼ発光（光子／秒）をもたらす。一部の事例では、本開示の比較的短いＲＥ（たとえば、配列番号１または配列番号２）は、発現カセット中のヒトＦＶＩＩＩに作動可能に連結されると、緩衝液対照、またはＦＶＩＩＩに作動可能に連結されたＵＣＬ−ＨＬＰと比較して、ｉｎ ｖｉｖｏでヒトＦＶＩＩＩ濃度の増加をもたらし、ここで、濃度の増加は、少なくとも１ＩＵ／ｍＬ、１．２ＩＵ／ｍＬ、１．５ＩＵ／ｍＬの、または１ＩＵ／ｍＬを上回るＦＶＩＩＩである。
一部の事例では、本開示の比較的短いＲＥは、ヒトプロモーター配列（たとえば、配列番号１３〜１７および２２〜４１）に由来し、発現カセット中の導入遺伝子（たとえば、ルシフェラーゼ、ＡＴＰ７ＢまたはＦＶＩＩＩ）に作動可能に連結されると、陰性対照（たとえば、ベクター単独、緩衝液単独、または発現活性を有さないことが既知の配列）と比較して少なくとも５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍もしくは１０００倍またはそれよりも高い、正規化された導入遺伝子発現をもたらす。一部の事例では、ＲＥは、ＣＭＶまたはＣＭＶ＋ＣＭＶｅの制御下でのルシフェラーゼ発現と比較して少なくとも５倍、１０倍もしくは１００倍またはそれよりも高い、正規化されたルシフェラーゼ発現をもたらす。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多くのＲＥは、より大きなＲＥを形成するために組み合わされ得る。一部の事例では、ＲＥは、導入遺伝子の上流に位置する。
一部の事例では、本明細書に開示される比較的短いヒト由来ＲＥは、４０ｂｐ、４５ｂｐ、４９ｂｐ、５０ｂｐ、５６ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、１１０ｂｐ、１１７ｂｐ、１２０ｂｐ、１３０ｂｐ、１４０ｂｐ、１５０ｂｐ、１６０ｂｐ、１７０ｂｐ、１８０ｂｐ、１９０ｂｐ、２００ｂｐ、２１０ｂｐ、２２０ｂｐ、２３０ｂｐ、２４０ｂｐ、２５０ｂｐ、２５９ｂｐ、２６０ｂｐ、２６５ｂｐ、２７０ｂｐ、２８０ｂｐ、２９０ｂｐ、３００ｂｐ、３１０ｂｐ、３２０ｂｐ、３３０ｂｐ、３４０ｂｐ、３５０ｂｐ、３６０ｂｐ、３７０ｂｐ、３８０ｂｐ、３９０ｂｐまたは４００ｂｐ以下を構成し、表１または配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１のうちのいずれか１つに従う配列を含む。一部の事例では、表１に列挙された配列または配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１のうちの、２つもしくはそれよりも多く、３つもしくはそれよりも多く、４つもしくはそれよりも多く、５つもしくはそれよりも多く、６つもしくはそれよりも多く、７つもしくはそれよりも多く、８つもしくはそれよりも多く、９つもしくはそれよりも多く、または１０個もしくはそれよりも多くは、発現カセットまたはベクター中で組み合わされ得るまたはタンデムで使用され得る。
様々な態様では、比較的短いヒト由来制御エレメントは、ベクターに対するサイズに関する制約が存在する場合（たとえば、ＡＡＶ遺伝子療法において）、または非常に高いレベルの発現の必要性が存在する場合（たとえば、ｅｘ ｖｉｖｏタンパク質産生において）に、特に有用である。本明細書に開示される制御エレメントは、構成的または誘導性であり得る。したがって、本開示は、高い発現ならびに短い制御エレメントの両方の利益を提供する。一部の事例では、本明細書に開示されるＲＥは、対照制御エレメント、たとえば、構成的プロモーター、ＣＭＶプロモーター、スーパーコアプロモーター、ＴＴＲプロモーター、Ｐｒｏｔｏ１プロモーター、ＵＣＬ−ＨＬＰプロモーターまたはＣＭＶｅプロモーターと比較して、１塩基対当たりまたは１ヌクレオチド当たり、より高い発現レベルを呈する。一部の事例では、配列番号４は、遺伝子発現のレベルを比較するための対照として使用される。
一部の事例では、本開示の１つまたは複数のＲＥは、顕著なクローニング能力をとることなしに導入遺伝子発現を強化するので、これらのＲＥは、（たとえば、遺伝子療法または発現カセット中の）大きな導入遺伝子の発現を増加させるために適合される。一部の事例では、本開示のＲＥは、４９ｂｐ、５０ｂｐ、５６ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、１１０ｂｐ、１１７ｂｐ、１２０ｂｐ、１３０ｂｐ、１４０ｂｐ、１５０ｂｐ、１６０ｂｐ、１７０ｂｐ、１８０ｂｐ、１９０ｂｐ、２００ｂｐ、２１０ｂｐ、２２０ｂｐ、２３０ｂｐ、２４０ｂｐ、２５０ｂｐ、２５９ｂｐ、２６０ｂｐ、２６５ｂｐ、２７０ｂｐ、２８０ｂｐ、２９０ｂｐ、３００ｂｐ、３１０ｂｐ、３２０ｂｐ、３３０ｂｐ、３４０ｂｐ、３５０ｂｐ、３６０ｂｐ、３７０ｂｐ、３８０ｂｐ、３９０ｂｐまたは４００ｂｐ以下であり、表１もしくは配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１のうちのいずれか１つに従う配列、またはそれに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の事例では、本開示の比較的短いＲＥは、ＲＥなしの導入遺伝子発現と比較して、または陰性対照（たとえば、ベクター単独対照、緩衝液単独、または発現活性を有さないことが既知の配列）と比較して、導入遺伝子発現を、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍または少なくとも１０００倍増加させる。一部の事例では、対照は、同じ導入遺伝子（たとえば、ルシフェラーゼ）に作動可能に連結された構成的プロモーターである。導入遺伝子に作動可能に連結されたＲＥの導入遺伝子発現との比較のための対照として使用され得る他のプロモーターの例としては、ＣＭＶプロモーター、スーパーコアプロモーター、ＴＴＲプロモーター、Ｐｒｏｔｏ１プロモーター、ＵＣＬ−ＨＬＰプロモーター、ＡＡＴプロモーター、ＫＡＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＥＦＳプロモーターまたはＣＭＶｅエンハンサー／ＣＭＶプロモーター組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書の制御エレメントは、プロモーターであり得、発現カセット中に含めた場合、下流配列の転写を駆動させ、下流配列（たとえば、導入遺伝子）と近接して関連していても、直接接触していてもよい。プロモーターは、連結された導入遺伝子の高い、中間の、または低い発現を駆動させ得る。一部の事例では、プロモーターは、１つもしくは複数の細胞型に対して特異的であり得、または多数のもしくは複数の細胞型（たとえば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の細胞型）において、類似のレベルで発現し得る。
一部の事例では、本明細書に開示されるＲＥは、ヒト由来配列を含む。一部の事例では、本開示のＲＥは、天然に存在しない。「ヒト由来」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト参照ゲノム（またはヒトゲノム構造、たとえばｈｇ１９）中の配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を有する配列を指す。相同な配列は、ヒトゲノムの領域と比較して少なくとも８０％の配列同一性（たとえば、ＢＬＡＳＴによって測定した場合）を有する領域を有する配列であり得る。たとえば、ヒト配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％相同である配列は、ヒト由来配列とみなされる。
一部の事例では、制御エレメントは、制御エレメント全体が、ヒトゲノム中の配列に対して低い配列同一性を有するように、ヒト由来配列および追加の配列を含むが、一方で、制御エレメントの一部は、ヒトゲノム中の配列に対して１００％の配列同一性（または局所的な配列同一性）を有する。一部の事例では、パーセント配列同一性は、表１に列挙された配列または配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１のうちのいずれかの、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％をカバーする領域内の相同性を指す。
一部の事例では、ヒト由来制御エレメントは、ヒト配列に対して１００％同一である配列である。一部の事例では、制御エレメントの配列は、１００％ヒト由来であり、ここで、ＲＥは、ヒト配列とは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０または９５ヌクレオチドまたは塩基対異なる。
他の事例では、制御エレメント配列の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％は、ヒト由来である。たとえば、制御エレメントは、その配列のうちの５０％がヒト由来であり、残りの５０％が、非ヒト由来（たとえば、マウス由来または完全に合成）であり得る。さらなる例として、５０％がヒト由来であるとみなされ、３００ｂｐを含む制御エレメントは、ヒトゲノムにおける配列に対して、全体としては４５％の配列同一性を有し得るが、一方で、ＲＥの塩基対１〜１５０は、同様にサイズ決定したヒトゲノムの領域に対して９０％の同一性（局所的な配列同一性）を有し得る。
一部の事例では、本開示のＲＥは、プロモーター配列、イントロン配列、エンハンサー配列、５’ＵＴＲ配列、またはそれらの組合せを含む。一部の事例では、本開示のＲＥは、天然に存在しない。一部の事例では、本開示のＲＥは、ヒト由来（またはヒト参照ゲノム中の配列に対して少なくとも８０％、９０％、９５％もしくは９９％の配列同一性を有する配列）である。
一部の事例では、本明細書に開示される比較的短い制御エレメントは、ゲノムプロモーター配列（たとえば、表２中のゲノム位置）に由来し得る。一部の事例では、本明細書に開示される制御エレメントは、ゲノムプロモーター配列および３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）の両方に由来し得る。一部の事例では、本明細書に開示される制御エレメントは、遺伝子間配列に由来し得る。一部の事例では、本明細書に開示される制御エレメントは、遺伝子の下流のゲノム配列に由来し得る、または５’ＵＴＲ配列、もしくは５’ＵＴＲおよび下流配列の混合に由来し得る。
本明細書の制御エレメントは、エンハンサーであり得、プロモーターと併せて発現ベクターまたはカセットにおけるその存在は、エンハンサーなしのプロモーターによる同じ導入遺伝子の発現と比較して、作動可能に連結された導入遺伝子の発現を増加させる。エンハンサーは、転写機序、転写後機序、または両方のいずれかを通じて、連結された導入遺伝子の発現を増加させ得る。
一部の事例では、本明細書の制御エレメントは、イントロン配列（たとえば、配列番号１〜２）であり、またはイントロンを含み、プロモーターと併せて発現ベクターまたはカセットにおけるその存在は、イントロン配列なしのプロモーターによる同じ導入遺伝子の発現と比較して、作動可能に連結された導入遺伝子の発現を増加させる。イントロン配列または制御エレメントは、転写機序、転写後機序、または両方のいずれかを通じて、連結された導入遺伝子の発現を増加させ得る。
一部の事例では、本明細書の制御エレメントは、プロモーター配列（たとえば、配列番号１３〜１７および２２〜４１）であり、またはプロモーター配列を含み、これは、導入遺伝子を発現させるための任意の他のプロモーター配列および／またはエンハンサー配列なしに、発現カセット中の導入遺伝子に作動可能に連結され得る。
種々の実施形態では、表１のＲＥのうちの１つまたは複数は、発現カセット中のプロモーターを必要とせずに、作動可能に連結された導入遺伝子の増加した発現を駆動させることができる。一部の実施形態では、大きな導入遺伝子（たとえば、その配列が、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、５．５ｋｂ、６ｋｂ、６．５ｋｂ、７ｋｂまたは７．５ｋｂを上回る導入遺伝子）が、従来的な発現カセットにおいて発現されるには大きすぎる場合、そのような導入遺伝子は、従来的なプロモーターを必要とせずに、表１の１つまたは複数のＲＥに作動可能に連結され得、ＲＥなしの発現カセットにおける導入遺伝子発現と比較して、または対照（たとえば、空のベクター、構成的プロモーター、ＣＭＶプロモーター、スーパーコアプロモーター、ＴＴＲプロモーター、Ｐｒｏｔｏ１プロモーター、ＵＣＬ−ＨＬＰプロモーターまたはＣＭＶｅプロモーター）と比較して、より高いレベルで発現され得る。
本明細書に開示される制御エレメントの利点の１つは、それらの比較的短い長さである。一部の事例では、本発明の制御エレメントは、長さが４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐもしくは４００ｂｐ未満であるかまたはそれと等しい。一部の事例では、制御エレメントは、長さが１００ｂｐ未満であるかもしくはそれと等しい、長さが＜９０ｂｐ、＜８０ｂｐ、＜７０ｂｐ、＜６０ｂｐもしくは＜５０ｂｐである、または４８〜５７ｂｐの間または４０〜６０ｂｐもしくは５０〜１００ｂｐの間である。一部の事例では、本明細書に記載される制御エレメントは、４０〜５０ｂｐ、４５〜５５ｂｐ、５０〜６０ｂｐまたは５５〜６５ｂｐである。一部の事例では、制御エレメントは、４５〜６０ｂｐである。一部の事例では、本明細書に記載される制御エレメントは、４９ｂｐまたは５６ｂｐである。たとえば、配列番号１の制御エレメントは、長さが５６ｂｐであり、配列番号２の制御エレメントは、長さが４９ｂｐである。一部の事例では、制御エレメントは、１００ｂｐと１５０ｂｐとの間、１１０ｂｐと１４０ｂｐとの間、１１０ｂｐと１３０ｂｐとの間または１１５ｂｐと１２５ｂｐとの間であり得る。たとえば、配列番号１３〜１７の制御エレメントは、長さが１１７ｂｐである。一部の事例では、制御エレメントは、１００ｂｐであるまたは約１００ｂｐである。たとえば、配列番号２２〜４１は各々、長さが１００ｂｐである。
本開示の制御エレメントは、好ましくは、ヒト由来配列を有する。制御エレメントは、転写開始部位の上流のゲノム配列、５’ＵＴＲ配列、エクソン配列、イントロン配列、または３’ＵＴＲ配列に由来し得る。一部の実施形態では、ヒト由来制御エレメントは、ヒト由来イントロン配列である。一部の事例では、ヒト由来制御エレメントは、ヒト配列由来のプロモーター配列である。一部の実施形態では、ヒト由来制御エレメントは、配列番号１、配列番号２、もしくはそれらの組合せのイントロン配列、またはそれに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性（たとえば、ＢＬＡＳＴによって測定した場合）を有する配列である。一部の実施形態では、ヒト由来制御エレメントは、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、もしくはそれらの組合せのプロモーター配列、またはそれに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性（たとえば、ＢＬＡＳＴによって測定した場合）を有する配列である。
一部の事例では、制御エレメントは、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）の一部またはすべてを含む。５’ＵＴＲ制御エレメントは、いくつかの異なる方法で、遺伝子の発現に影響を及ぼし得る。５’ＵＴＲ制御エレメントは、ＲＮＡ結合タンパク質のための結合部位を含み得る。さらに、５’ＵＴＲにおいて制御エレメントによって形成される二次構造は、翻訳に必要なＲＮＡ結合タンパク質の結合に影響を及ぼし得る。一部の例では、制御エレメントは、高度の二次構造を有し得る。一部の事例では、制御エレメントは、二次構造をほとんど有さなくても、全く有さなくてもよい。制御エレメントは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）もまた含み得、５’キャップ非依存的翻訳を可能にする。制御エレメントは、上流の翻訳開始コドン（ｕＡＵＧ）を含み得る。一部の実施形態では、制御エレメントは、上流の翻訳開始コドンを含まない。一部の実施形態では、制御エレメントは、ＡＵＧコドンの１塩基以内のいずれのコドンも含まず、または偶然により予測されるよりも少ない、ＡＵＧコドンと類似のコドンを含む。一部の事例では、制御エレメントは、上流のＡＵＧ（または十分に類似の配列）が存在し、その後にインフレームの停止コドンが続く場合に存在する、上流のオープンリーディングフレームを含み得る。一部の例では、制御エレメントは、ｕＯＲＦを含まない。一部の事例では、制御エレメントは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位、またはＲＮＡ結合タンパク質のための結合部位を含む。
一部の事例では、本開示の制御エレメントは、ヒト由来配列に対して相同である配列を含む。配列は、ヒト配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する場合、「ヒト由来配列に対して相同」である。好ましくは、ヒト由来制御配列に対して相同である配列は、ヒト配列に対して少なくとも９０％同一である。一部の実施形態では、本明細書の制御エレメントは、配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有する制御エレメントである。制御エレメントが、配列番号１〜２のいずれかに対して相同である場合、そのような制御エレメントは、制御エレメントなしの類似のベクターと比較して、作動可能に連結された導入遺伝子のより高い発現をなおももたらす（プロモーターも発現ベクターまたはカセット中に存在する場合）。導入遺伝子のそのようなより高い発現は、たとえば、ＨＥＫ２９３ＴまたはＣＨＯ細胞における発現において観察され得る。一部の事例では、導入遺伝子のそのようなより高い発現は、複数の細胞型、たとえば、２つまたはそれよりも多くの哺乳動物細胞系、ヒト細胞系、腎臓細胞、上皮細胞、肝臓細胞、肝細胞、ニューロン、線維芽細胞および／またはＣＮＳ細胞において観察され得る。
一部の事例では、制御エレメントが、配列番号１３〜１７および２２〜４１のいずれかに対して相同である場合、そのような制御エレメントは、制御エレメントなしの類似のベクターと比較して、作動可能に連結された導入遺伝子のより高い発現をもたらす（他のプロモーターが発現ベクターまたはカセット中に存在しない場合であっても）。導入遺伝子のそのようなより高い発現は、たとえば、ＨＥＫ２９３ＴまたはＣＨＯ細胞における発現において観察され得る。一部の事例では、導入遺伝子のそのようなより高い発現は、複数の細胞型、たとえば、２つまたはそれよりも多くの哺乳動物細胞系、ヒト細胞系、腎臓細胞、上皮細胞、肝臓細胞、肝細胞、ニューロン、線維芽細胞および／またはＣＮＳ細胞において観察され得る。
本開示の制御エレメントはまた、上記のいずれかの機能性断片、たとえば、配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１の断片、またはそれらの任意の組合せであり得る。そのような機能性断片もまた、制御エレメントなしの類似の発現カセットまたはベクターと比較した場合、発現カセットまたはベクター中の導入遺伝子の発現を増加させる。機能性断片が、エンハンサー、イントロン配列、プロモーター配列、またはそれらの組合せである場合、より高い発現が、機能性断片なしの類似のベクターまたはカセットと比較して、断片が導入遺伝子に作動可能に連結された場合に観察される。断片は、好ましくは、長さが２５ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐもしくは１１０ｂｐ未満であるかまたはそれと等しい。一部の事例では、ヒトプロモーター配列由来の本開示のＲＥは、発現カセットまたはベクター中の第２のプロモーターを必要とせずに、作動可能に連結された導入遺伝子の発現を増加させ得る。一部の事例では、従来的な発現カセットまたはベクター中のプロモーターは、１つもしくは複数の配列番号１３〜１７および２２〜４１、それらの組合せ、あるいは配列番号１３〜１７および２２〜４１に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性（たとえば、ＢＬＡＳＴによって測定した場合）を有する配列、またはそれらの組合せで置き換えられ得る。
一部の実施形態では、制御エレメントは、（ｉ）配列番号１、２、３、４、１３、１４、１５、１６、１７、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、（ｉｉ）配列番号１、２、３、４、１３、１４、１５、１６、１７、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の任意の配列の機能性断片、または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の任意の配列の組合せのうちのいずれか１つである。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多くのコピーの制御エレメント、たとえば、２つまたはそれよりも多くのコピーの配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１のうちの１つまたは複数が、導入遺伝子発現を強化するために使用される。一部の実施形態では、配列番号１および２の組合せ、またはそれらの機能性断片の組合せが、導入遺伝子発現を増加させるために制御エレメントとして使用される。他の実施形態では、配列番号１および／または２のうちの１つまたは複数は、導入遺伝子発現を増加させるために、別の制御エレメント、たとえば、プロモーターまたはエンハンサーに結合または作動可能に連結される。他の実施形態では、配列番号１および／または２のうちの１つまたは複数は、導入遺伝子発現を増加させるために、配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１のうちの１つまたは複数に結合または作動可能に連結される。一部の実施形態では、イントロン配列である制御エレメントは、制御エレメントが任意のプロモーターに結合または作動可能に連結された場合に、導入遺伝子発現を増加させ得る。一部の事例では、ヒトプロモーター配列由来の制御エレメントは、制御エレメントが、いずれの他のプロモーター配列もなしに、導入遺伝子に結合または作動可能に連結された場合に、導入遺伝子発現を増加させ得る。一部の事例では、ヒト由来のプロモーター配列およびイントロン配列を含む制御エレメントは、組み合わされた制御エレメントが、いずれの他のプロモーター配列もなしに、導入遺伝子に結合または作動可能に連結された場合に、導入遺伝子発現を増加させ得る。
一部の実施形態では、遺伝子療法からの導入遺伝子発現を改善または増加させるために、本明細書に開示される１つまたは複数の制御エレメント（たとえば、配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１）を付加することによって、任意の遺伝子療法または公知の遺伝子療法を強化することができる。
一部の事例では、制御エレメントは、制御エレメント全体がヒトゲノムに対して低い配列同一性を有するように、ヒト由来配列および非ヒト由来配列を含む。しかし、制御エレメントの一部は、ヒトゲノムに対して１００％の配列同一性を有する。他の事例では、制御エレメント配列の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％は、ヒト由来である、または少なくとも１０、２０、３０、４０もしくは５０の連続的なヌクレオチドは、ヒト由来である。たとえば、制御エレメントは、その配列のうちの５０％がヒト由来であり、残りの５０％が、非ヒト由来（たとえば、マウス由来、ウイルス由来または完全合成）であり得る。
発現の増加は、転写または転写後レベルで生じ得る。たとえば、転写レベルでは、制御エレメントは、転写因子および／もしくはＲＮＡポリメラーゼを動員し、転写の開始を増加させ、または転写のレベルを増加させるＤＮＡおよび／もしくはヒストン修飾を動員することによって、発現を増加させ得る。発現のそのような増加は、導入遺伝子を代表するＲＮＡ転写物の量の増加を測定することによって検出され得る。転写後レベルでは、制御エレメントは、タンパク質へと翻訳されるタンパク質の量を増加させることによって、発現を増加させ得る。これは、様々な機序を介して、たとえば、ｍＲＮＡの安定性を増加させること、または翻訳に必要なタンパク質の動員および組み立てを増加させることによって、達成され得る。発現のそのような増加は、導入遺伝子を代表する発現されたタンパク質の量を測定することによって検出され得る。産生されたタンパク質の量は、たとえば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって直接的に、またはたとえば、機能的アッセイによって間接的に、測定され得る。機能的アッセイで一般に測定されるタンパク質は、ルシフェラーゼである。しかし、他のタンパク質、たとえば、第ＶＩＩＩ因子もまた、機能的アッセイによって測定され得る。好ましくは、本明細書の制御エレメントは、発現ベクターまたはカセットの遺伝子、導入遺伝子または治療用導入遺伝子の発現を、制御エレメントなしの同じ発現ベクターを使用した導入遺伝子の発現と比較して少なくとも１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、５、６、７、８、９もしくは１０倍、または５倍を上回って、または１０倍を上回って増加させる。一部の事例では、本明細書の制御エレメントは、発現ベクターまたはカセットの遺伝子、導入遺伝子または治療用導入遺伝子の発現を、制御エレメントなしの同じ発現ベクターを使用した導入遺伝子の発現と比較して少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍または少なくとも１０００倍増加させる。そのような発現ベクターまたはカセットは、制御エレメントとは別のプロモーターを含み得る。プロモーターの例としては、ｍｉｎＣＭＶプロモーター、スーパーコアプロモーター（ＳＣＰ）、ＴＴＲプロモーター、Ｐｒｏｔｏ１プロモーター、ＵＣＬ−ＨＬＰプロモーター、ＡＡＴプロモーター、ＫＡＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーターおよびＥＦＳプロモーターが挙げられる。一部の事例では、導入遺伝子に作動可能に連結された配列番号１３〜１７および２２〜４１のうちの１つまたは複数を含む発現ベクターまたはカセットは、導入遺伝子発現のために別のプロモーターを必要としない。
一部の事例では、ｍｉｎＣＭＶプロモーターと一緒に本明細書の制御エレメントのいずれかに作動可能に連結された導入遺伝子の発現は、本明細書に記載される制御エレメントなしにｍｉｎＣＭＶプロモーターに連結された導入遺伝子の発現よりも高い。一部の事例では、ｍｉｎＣＭＶプロモーターおよび本明細書に記載される制御エレメントに連結された場合、導入遺伝子の発現は、制御エレメントなしに以下のプロモーター：スーパーコアプロモーター、ＴＴＲプロモーター、Ｐｒｏｔｏ１プロモーター、ＵＣＬ−ＨＬＰプロモーター、ＡＡＴプロモーター、ＫＡＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーターまたはＥＦＳプロモーターのうちのいずれか１つに連結された場合の導入遺伝子の発現よりも高い。
一部の事例では、本明細書の制御エレメント（たとえば、配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１）のいずれかに作動可能に連結された導入遺伝子の発現は、ＵＣＬ−ＨＬＰプロモーターに連結された場合の導入遺伝子の発現よりも高い。
一部の事例では、本明細書に記載される制御エレメントは、それらの長さに対して高い発現を駆動させる。たとえば、ＣＭＶプロモーターの長さの半分である本開示の制御エレメントは、ＣＭＶプロモーターのレベルの半分を上回る発現を駆動させる。一部の事例では、制御エレメントは、１塩基対当たりの活性（または導入遺伝子発現）によって定義される、またはサイズ正規化された活性と称される。たとえば、ＣＭＶプロモーターと同じレベルの発現を駆動させるが、ＣＭＶプロモーターの長さの半分である制御エレメントは、１塩基対当たり２倍の活性を有する。図１Ａに示されるように、配列番号３（ｍｉｎＣＭＶプロモーターと組み合わされた配列番号１）は、５５５２の正規化されたルシフェラーゼ値をもたらし、図１Ｂに示されるように、約２１のサイズ正規化された活性値を生じる（配列番号３は、２６６ｂｐである）。配列番号４（ｍｉｎＣＭＶプロモーターと組み合わされた配列番号２）は、５３のサイズ正規化された値をもたらす。図１Ｂに示されるように、ｍｉｎＣＭＶプロモーター単独は、１９のサイズ正規化された値を生じ、ＳＣＰプロモーターおよびＣＡＧプロモーターは、それぞれ、１および１０のサイズ正規化された値を生じる。
発現、特に、高い遺伝子発現は、当該分野において公知の任意の技法を使用して測定され得る。一部の事例では、本開示の制御エレメントによって制御される場合の、導入遺伝子の相対的およびより高い発現は、ＲＮＡ定量／シーケンシング技術、たとえば、定量的ＰＣＲ、ノーザンブロッティングまたは次世代シーケンシングを使用して測定される。
一部の事例では、高い発現は、目的の導入遺伝子／遺伝子から産生／発現されたタンパク質の濃度によって測定され得る。タンパク質の濃度は、当該分野において公知の任意の方法によって測定され得る。タンパク質発現を測定するための方法の非限定的な例としては、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロッティングまたは高速液体クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。たとえば、Noble JE、Quantification of protein concentration using UV absorbance and Coomassie dyes、Methods Enzymol. ２０１４年；５３６巻：１７〜２６頁；Kurien BT、Scofield RH. A brief review of other notable protein detection methods on acrylamide gels、Methods Mol Biol. ２０１２年；８６９巻：６１７〜２０頁；ならびにDaniel M. Bollag、Michael D. RozyckiおよびStuart J. Edelstein、Protein Methods、第２版、Wiley Publishers（１９９６年）を参照されたい。タンパク質発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで測定され得る。
種々の実施形態では、導入遺伝子発現は、ＰＣＲ法を使用して、導入遺伝子から産生されたｍＲＮＡまたはＲＮＡ転写物の量を測定することによって判定することができる。一部の事例では、導入遺伝子の遺伝子発現は、遺伝子産物と相互作用するタンパク質またはイムノアッセイを使用することによって測定され得る。一部の事例では、ノーザンブロット分析および／またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションもまた、導入遺伝子発現をｉｎ ｖｉｖｏで分析するために使用され得る。導入遺伝子から発現されたタンパク質（たとえば、蛍光レポーター導入遺伝子からの蛍光）のレベルもまた、転写に関しての導入遺伝子発現の増加、ならびに細胞中またはｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質合成（すなわち、翻訳）の増加を判定するために、モニタリングされ得る。タンパク質レベルは、ウェスタンブロット分析、免疫組織化学、免疫蛍光組織化学、および／またはＥＬＩＳＡアッセイを含む様々な方法を使用してアッセイすることができるが、これらに限定されない。
一部の例では、本開示の制御エレメントは、ＥＬＩＳＡによって測定した場合、関連細胞型において、少なくとも０．５、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５または３ＩＵ／ｍｌのレベルで、作動可能に連結された導入遺伝子の発現をもたらす。関連細胞型の例としては、肝細胞、肝臓細胞、筋肉細胞、肺細胞、上皮細胞、ならびに腎臓細胞、たとえば、２９３ＴおよびＣＨＯ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、導入遺伝子発現を増加させる制御エレメントの能力は、マウスにおいて評価することができ、ここで、マウス全体における導入遺伝子発現の総量および／または導入遺伝子発現を有する細胞型もしくは組織型の総数が測定される。一部の事例では、本開示の制御エレメントは、ＥＬＩＳＡによって測定した場合、マウスまたは他の生物の血液中に、少なくとも０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５または３．０ＩＵ／ｍｌの全体的レベルで、作動可能に連結された導入遺伝子の発現をもたらすことができる。
発現カセットまたはベクターの活性を評価するとき、活性または発現は、単位用量当たりの活性もしくは発現レベルとして表すことができるか、または細胞もしくはマウスに投与もしくは送達された発現カセットもしくはベクターの用量に対して正規化され得る。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現または活性は、制御エレメントありまたはなしでの様々な発現ベクターまたはカセットにわたる比較を可能にするために、使用されたプラスミドもしくはＤＮＡの量に対して正規化されるか（たとえば、１マウス当たりのμｇ／ｋｇ）、またはウイルス粒子の量に対して正規化される（たとえば、１マウス当たりのゲノムコピーの量／ｋｇに対して正規化される）。たとえば、マウスにおける制御エレメントの活性を評価する場合、アッセイした発現または活性は、１マウス当たり、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０μｇの、または１０もしくは２０μｇを上回る、発現ベクター、カセット、またはプラスミドの用量に対して、正規化され得る。一部の実施形態では、発現レベルまたは活性は、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、または１０１５ｇｃ／ｋｇの、１マウス当たりの本明細書に開示される発現ベクターまたはカセットを含むウイルス粒子に対して、正規化され得る。
他の例では、連結された導入遺伝子の発現は、発現されたタンパク質の活性についての機能的アッセイによって測定される。機能的アッセイの例としては、ルシフェラーゼ活性を定量するためのルシフェラーゼアッセイおよび第ＶＩＩＩ因子活性を定量するためのＣｏａｔｅｓｔアッセイが挙げられる。Ｃｏａｔｅｓｔアッセイでは、補因子である活性な第ＶＩＩＩ因子の発現は、発色団ｐＮＡを放出する反応を促進する。放出された発色団と関連する色は、４０５ｎｍで測光法で読み取られ、色の強度は、第ＶＩＩＩ因子活性の量と比例する。第ＶＩＩＩ因子活性は、１．０ＩＵ／ｍＬの第ＶＩＩＩ因子を含む血漿によって示される活性レベルのパーセンテージとして測定できる。ｍｉｎＣＭＶおよび第ＶＩＩＩ因子に作動可能に連結された本開示の制御エレメント、たとえば、配列番号１または２は、タンパク質が１．０ＩＵ／ｍＬの濃度である場合、制御エレメントなしの類似の発現ベクター、たとえば、制御エレメントなしのＵＣＬ−ＨＬＰと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％を上回る第ＶＩＩＩ因子活性レベル、または２５０％を上回る活性レベルをもたらし得る。一部の事例では、第ＶＩＩＩ因子に作動可能に連結された本開示の制御エレメント、たとえば、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１は、たとえば、タンパク質が１．０ＩＵ／ｍＬの濃度である場合、ＵＣＬ−ＨＬＰプロモーターありの類似の発現ベクターと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％を上回る第ＶＩＩＩ因子活性レベル、または２５０％を上回る活性レベルをもたらし得る。
本明細書に開示される制御エレメントは、１つまたは複数の異なる細胞型において導入遺伝子の発現を駆動または増加させることができる。制御エレメントが、複数の細胞型において導入遺伝子の発現を増加させることが可能である場合、そのような発現は、全体的発現とみなされる。全体的発現は、生物のすべての細胞における導入遺伝子の発現を要求しない。全体的制御エレメントは、異なる発現性細胞型において類似のレベルで、または異なる細胞型においてある範囲の発現レベルで、導入遺伝子を発現できる。一部の事例では、全体的制御エレメントは、少なくとも２、３、４、５、１０、１５または２０個の異なる細胞型において導入遺伝子の発現を駆動または増加させることができる。たとえば、全体的発現を有する制御エレメントは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個の異なる細胞系における導入遺伝子の発現を駆動または増加させることができる。細胞系の例としては、２９３細胞、ＣＨＯ細胞、がん細胞系および不死化細胞系が挙げられる。一部の事例では、制御エレメントは、ｉｎ ｖｉｖｏで、動物中の１つまたは複数の細胞型において導入遺伝子の発現を駆動または増加させる。
一部の実施形態では、本明細書の制御エレメントは、肝臓細胞において遺伝子の発現を駆動させる。一部の実施形態では、制御エレメントは、以下の細胞型：肺胞細胞、心筋細胞、上皮細胞、肝細胞、腎臓細胞、腸細胞、筋細胞、ニューロン、卵巣細胞および腎細胞のうちのいずれか１つまたは複数において遺伝子の発現を駆動させる。一部の実施形態では、制御エレメントは、以下の細胞系：チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、マウス骨髄腫細胞（ＮＳＯ）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、Ｂ１６黒色腫細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＴ−１０８０細胞およびＰＥＲ．Ｃ５細胞のうちのいずれか１つまたは複数において遺伝子の発現を駆動させる。一部の事例では、制御エレメントは、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞系において遺伝子の発現を駆動させる。
本開示の制御エレメントは、一緒に組み合わされ得る、または他の制御エレメントと組み合わされ得る。そのような他の制御エレメントとしては、たとえば、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、リプレッサー、エンハンサーまたは転写後安定性エレメントが挙げられる。一実施形態では、ベクターは、連結された導入遺伝子の上流に配列番号１およびｍｉｎＣＭＶプロモーターを含む配列番号３の制御エレメントを含む。本明細書で企図されるプロモーターの例としては、ｍｉｎＣＭＶプロモーター、スーパーコアプロモーター、ＴＴＲプロモーター、Ｐｒｏｔｏ１プロモーター、ＵＣＬ−ＨＬＰプロモーター、ＣＭＶｅエンハンサー／ＣＭＶプロモーター組合せ、ＡＡＴプロモーター、ＫＡＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＥＦＳプロモーターまたはＣＢＡプロモーターが挙げられる。
本開示の組み合わされた制御エレメントは、なおも短くすることができる。組み合わされた制御エレメントは、長さが約５０〜５００、１００〜４００、５０〜２００、１００〜２００または１５０〜３００塩基対の全長を有し得る。組み合わされた制御エレメントは、長さが約５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０または１００塩基対未満の組み合わされた長さを有し得る。一部の実施形態では、制御エレメントは、４０〜５０ｂｐ、４５〜５０、４９、５０〜６０、５６、５０〜５５または４５〜６０ｂｐである。
組み合わされた制御エレメントは、異なる種に由来し得る。好ましい例では、組み合わされた制御エレメントの少なくとも１つの部分は、ヒト由来である。非ヒト由来エレメントは、哺乳動物、ウイルスまたは合成配列に由来し得る。
発現カセット
「発現カセット」および「核酸カセット」という用語は、ポリヌクレオチド分子または核酸配列を指して、互換可能に使用される。一部の事例では、発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結された本明細書に開示される１つまたは複数の制御エレメントを含む。一部の事例では、発現カセットは、１つまたは複数の制御エレメントを含む。一部の事例では、発現カセットは、プロモーターをさらに含む。一部の事例では、発現カセットは、配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１のうちの１つまたは複数の配列ならびに／またはそれらの任意の組合せを含む。一部の事例では、発現カセットは、配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１、（ｉｉ）配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列、（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の任意の配列の機能性断片、または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および／もしくは（ｉｉｉ）の任意の配列の組合せのうちの１つまたは複数を含む。一部の事例では、配列同一性は、ＢＬＡＳＴによって測定される。一部の事例では、制御エレメントは、発現カセット中で導入遺伝子の上流に位置する。一部の事例では、制御エレメントは、発現カセット中で導入遺伝子の下流に位置する。
一部の態様では、本明細書に記載される１つまたは複数の制御エレメント（たとえば、配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１）は、発現カセット中の導入遺伝子（たとえば、レポーター遺伝子または治療用導入遺伝子）に作動可能に連結される。一部の事例では、遺伝子療法は、導入遺伝子、たとえば、レポーター遺伝子、ｅＧＦＰ、ＲＦＰ、第ＶＩＩＩ因子、Ｃａｓ９、ＤＮＡ結合タンパク質、ホルモン、増殖もしくは分化因子、インスリン、成長ホルモン、ＶＥＧＦ、神経栄養因子、線維芽細胞上皮因子；サイトカイン、インターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子、抗体、免疫グロブリン、インターフェロン、キメラＴ細胞受容体；リポタンパク質受容体、嚢胞性線維症膜貫通制御因子、ムコ多糖症Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型もしくはＩＶ型と関連する遺伝子、ベータグロビンまたはリポタンパク質リパーゼ、あるいはそれらのバリアントまたは断片の増加した発現をもたらすために、１つもしくは複数、２つもしくはそれよりも多く、３つもしくはそれよりも多く、４つもしくはそれよりも多く、または５つもしくはそれよりも多くの本開示の制御エレメントに作動可能に連結された導入遺伝子を含む発現カセットを含む。一部の事例では、導入遺伝子は、ＡＴＰ７Ａ、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはそれらのバリアントもしくは機能性断片、あるいはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列である。一部の事例では、導入遺伝子は、ＣＤＫＬ５、ＣＮＴＮＡＰ２、ＺＥＢ２、またはそれらのバリアントもしくは機能性断片、あるいはそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列である。一部の事例では、導入遺伝子は、フィブリノゲン、プロトロンビン、凝固因子もしくは血液凝固因子（たとえば、第１因子、第２因子、第３因子、第４因子、第５因子、第６因子、第７因子、第８因子、第９因子、第１０因子、第１１因子または第１２因子）、またはそれらのバリアントもしくは機能性断片である。
一部の事例では、発現カセットは、遺伝子療法を介する送達のために適合される。一部の事例では、発現カセットは、直鎖状または環状の構築物である。一部の事例では、発現カセットは、プラスミド、ベクター、ウイルスベクターまたはｒＡＡＶの一部である。一部の事例では、導入遺伝子に作動可能に連結された本開示の１つまたは複数のＲＥを含む発現カセットは、複数の細胞、たとえば、任意の哺乳動物もしくはヒト細胞系、腎臓細胞、上皮細胞、肝臓細胞、肝細胞、ニューロン、線維芽細胞および／またはＣＮＳ細胞における発現のために適合される。一部の事例では、導入遺伝子に作動可能に連結された本開示の１つまたは複数のＲＥ（たとえば、配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１）を含む発現カセットは、２つもしくはそれよりも多く、３つもしくはそれよりも多く、４つもしくはそれよりも多く、または５つもしくはそれよりも多くの哺乳動物またはヒト細胞系または細胞型における発現のために適合される。一部の事例では、導入遺伝子発現は、以下の細胞型：腎臓細胞、上皮細胞、肝細胞、ニューロン、線維芽細胞、心筋細胞、ＣＮＳ細胞、筋肉細胞、血球および／または幹細胞のうちの２つもしくはそれよりも多く、３つもしくはそれよりも多く、４つもしくはそれよりも多く、または５つもしくはそれよりも多くにおいて生じる。
一部の事例では、導入遺伝子に作動可能に連結された本開示の１つまたは複数のＲＥ（たとえば、配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１）を含む発現カセットは、肝臓または肝細胞における導入遺伝子発現のために適合される。一部の事例では、導入遺伝子に作動可能に連結された本開示の１つまたは複数のＲＥを含む発現カセットは、たとえば、経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、くも膜下腔内、経腸または非経口投与を介した、導入遺伝子の全身送達のために適合される。一部の事例では、導入遺伝子の全身送達には、肝臓または肝細胞における増加した導入遺伝子発現が関与する。一部の事例では、導入遺伝子に作動可能に連結された本開示の１つまたは複数のＲＥを含む発現カセットは、ＲＥなしの発現カセットと比較して、または対照（たとえば、ベクター単独対照、緩衝液対照、またはいずれの発現活性も有さない配列）と比較して少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍または少なくとも１０００倍であるレベルで、肝細胞における導入遺伝子の発現をもたらす。一部の事例では、比較的短いＲＥによって駆動される発現は、同じ導入遺伝子に作動可能に連結された構成的プロモーター、ＣＭＶプロモーター、スーパーコアプロモーター、ＴＴＲプロモーター、Ｐｒｏｔｏ１プロモーター、ＵＣＬ−ＨＬＰプロモーターまたはＣＭＶｅプロモーターによって駆動される発現と比較される。
一部の事例では、本開示の制御エレメントを含む発現カセットは、作動可能に連結された導入遺伝子の高いまたは増加した発現をもたらし、ここで、高いまたは増加した発現は、対照、たとえば、構成的プロモーター、ＣＭＶプロモーター、スーパーコアプロモーター（ＳＣＰ）、ＴＴＲプロモーター、Ｐｒｏｔｏ１プロモーター、ＵＣＬ−ＨＬＰプロモーターまたはＣＭＶｅプロモーターと比較して判定される。高いまたは増加した導入遺伝子発現を判定するための比較に使用され得る他の対照としては、緩衝液単独、ｍｉｎＣＭＶ、ＥＦＳ、ベクター単独、または発現活性を有さないことが既知の配列が挙げられる。一部の事例では、ＣＡＧまたは配列番号４は、発現レベルおよび／またはサイズ正規化された活性を比較するための陽性対照として使用される。
目的の導入遺伝子または遺伝子の発現は、発現ベクターまたは発現カセットを介して生じ得る。そのような発現ベクターまたはカセットは、以下の追加のエレメント：プロモーター、エンハンサーまたは転写後制御エレメントのうちのいずれか１つまたは複数を含み得る。本開示の制御エレメントは、導入遺伝子の上流または下流に位置し得、転写されても転写されなくてもよい。一部の例では、本開示の制御エレメントは、プロモーターの下流かつ導入遺伝子の上流に位置する。一部の例では、制御エレメントは、導入遺伝子のプロモーターとして位置する。一部の事例では、本開示の１つまたは複数のＲＥは、発現ベクターまたはカセット中で、いずれの他のプロモーターもなしに導入遺伝子に作動可能に連結される。
発現ベクターまたはカセットは、環状または直鎖状の核酸分子であり得る。一部の事例では、ベクターまたはカセットは、細胞（たとえば、標的細胞もしくは細胞型および／または非標的細胞もしくは細胞型を含む、複数の異なる細胞または細胞型）に送達される。ベクターまたはカセットは、発現ベクターもしくはカセットを一部もしくは全体として、および／または導入遺伝子を細胞のゲノムに組み込むベクターまたはカセットの能力に言及して、組込みベクターであっても非組込みベクターであってもよい。組込みベクターであっても非組込みベクターであっても、制御エレメントに作動可能に連結された導入遺伝子を送達するために使用することができる。ベクターまたはカセットの例としては、（ａ）非ウイルスベクター、たとえば、直鎖状オリゴヌクレオチドおよび環状プラスミドを含む核酸ベクター；人工染色体、たとえば、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）および細菌人工染色体（ＢＡＣまたはＰＡＣ））；エピソームベクター；トランスポゾン（たとえば、ＰｉｇｇｙＢａｃ）；ならびに（ｂ）ウイルスベクター、たとえば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスは、高い感染性を含め、核酸の送達に関していくつかの利点を有する。一部の実施形態では、ウイルスは、本明細書に記載されるように、導入遺伝子に作動可能に連結された１つまたは複数の制御エレメントを含む核酸分子または発現カセットを送達するために使用される。
本明細書に記載されるベクターは、直接、または送達システムを介して、目的の細胞に送達され得る。送達システムの例としては、ウイルスベクター（たとえば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴（ＡＡＶ）、ヘルパー依存性アデノウイルス系、ハイブリッドアデノウイルス系、単純ヘルペス、ポックスウイルス、レンチウイルスおよびエプスタイン・バーウイルス）、物理系（ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ衝突、電気穿孔、流体力学、超音波、およびマグネトフェクション）、ならびに化学系（カチオン性脂質、異なるカチオン性ポリマー、および脂質ポリマー）が挙げられるが、これらに限定されない。
任意の公知の技法を使用して、制御エレメント（複数可）および作動可能に連結された導入遺伝子、または制御エレメントおよび導入遺伝子を含む組成物を、目的の細胞に送達して、目的の細胞型、組織または生物において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏにおける導入遺伝子の発現をもたらすか、または誘導することができる。
ウイルス遺伝子療法ベクターまたは遺伝子送達ベクターの好ましい特徴としては、高い力価で再生可能かつ安定に繁殖および精製される能力、標的化された送達を媒介する能力（たとえば、ベクターが他の場所に広く散らばることなく、目的の組織または臓器に特異的に導入遺伝子を送達する能力）、ならびに有害な副作用を誘導することなく、遺伝子の送達および導入遺伝子の発現を媒介する能力が挙げられる。
いくつかの型のウイルス、たとえば、非病原性パルボウイルス、アデノ随伴ウイルスが、遺伝子送達の目的で操作されている。様々な遺伝子療法適用のためのウイルスに基づくベクターは、ウイルス感染経路を利用できるが、複製および毒性をもたらし得るウイルス遺伝子の続く発現を回避できる。そのようなウイルスに基づくベクターは、ウイルスゲノムからコーディング領域のすべてまたは一部を欠失させるが、発現ベクターをウイルスキャプシドにパッケージングすることあるいはベクター核酸または異種遺伝子もしくはＤＮＡの宿主ゲノムへの組込みなどの機能に必要とされる配列（たとえば、末端反復配列）をインタクトなまま残すことによって、得ることができる。導入遺伝子を含む発現ベクターまたはカセットは、たとえば、ウイルス骨格、たとえば、ウイルス遺伝子が欠如した修飾または操作されたウイルス骨格にクローニングすることができ、追加のベクター（たとえば、パッケージングベクター）と併せて使用することができ、これらは、たとえば、コトランスフェクションを行うと、組換えウイルスベクター粒子を産生することができる。
非病原性パルボウイルスであるＡＡＶのいくつかの血清型が、遺伝子送達の目的で操作されており、そのうちのいくつかは、ある特定の組織または細胞型に対する指向性を有することが公知である。様々な遺伝子療法適用に使用されるウイルスは、対象または宿主において、複製欠損となるか、または低い毒性および低い病原性を有するように、操作され得る。そのようなウイルスに基づくベクターは、ウイルスゲノムからコーディング領域のすべてまたは一部を欠失させ、ベクターゲノムをウイルスキャプシドにパッケージングすることまたはベクター核酸（たとえば、異種ＤＮＡ配列）の宿主ゲノムへの組込みなどの機能に必要とされる配列（たとえば、末端逆位反復配列）をインタクトなまま残すことによって、得ることができる。導入遺伝子を含む発現ベクターまたはカセットは、たとえば、ウイルス骨格、たとえば、ウイルス遺伝子が欠如した修飾または操作されたウイルス骨格にクローニングすることができ、追加のベクター（たとえば、パッケージングベクター）と併せて使用することができ、これらは、たとえば、コトランスフェクションを行うと、組換えウイルスベクター粒子を産生することができる。
一部の実施形態では、１つまたは複数の制御エレメントおよび導入遺伝子を、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、細胞、細胞型、または組織に送達するために使用されるＡＡＶベクターもしくはＡＡＶウイルス粒子、またはビリオンは、好ましくは、複製欠損性である。一部の実施形態では、ＡＡＶウイルスは、ヘルパー因子の存在下においてのみ複製し、ビリオンを生成することができるように、操作または遺伝子修飾される。
一部の実施形態では、発現ベクターまたはカセットは、ＡＡＶまたは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）による送達のために設計される。一部の実施形態では、発現ベクターまたはカセットは、レンチウイルスまたはレンチウイルスベクターを使用して送達される。一部の実施形態では、より大きな導入遺伝子、すなわち、ＡＡＶのクローニング能力を上回る遺伝子は、好ましくは、レンチウイルスまたはレンチウイルスベクターを使用して送達される。
発現ベクターまたはカセットは、ＡＡＶによる送達のために設計することができる。ＡＡＶは、任意の血清型、たとえば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ−ＤＪ、またはキメラ、ハイブリッドもしくはバリアントＡＡＶであり得る。ＡＡＶは、自己相補性ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）であってもよい。ＡＡＶによる送達のために設計される発現ベクターまたはカセットは、５’ＩＴＲ、１つまたは複数の制御エレメント、必要に応じてミニマルプロモーター、導入遺伝子、必要に応じて１つまたは複数のイントロン、必要に応じてポリＡシグナル、および３’ＩＴＲを含み得る。一部の事例では、発現ベクターまたはカセットは、１つまたは複数の転写後ＲＮＡ制御エレメントもまた含む。
配列番号１または配列番号２を含む例示的な発現ベクターまたはカセットは、それぞれ、図６Ｂおよび図６Ｃに示される。プロモーター位置に配列番号１３〜１７および２２〜４１のうちのいずれか１つまたは複数を含むことができる例示的な発現ベクターは、図７に示される。そのような発現ベクターまたはカセットは、ＡＡＶ、レンチウイルス、アデノウイルスまたはレトロウイルスが挙げられるが、これらに限定されない、本明細書に記載される送達システムまたは遺伝子療法のうちのいずれか１つを使用する導入遺伝子発現のために適合され得る。
発現ベクターまたはカセットは、最適化された治療用レトロウイルスベクターによる送達用に設計することができる。レトロウイルスベクターは、左端（５’）ＬＴＲ；ウイルス、少なくとも１つの核酸細胞型選択的制御エレメント、必要に応じてレンチウイルス逆転応答エレメント（ＲＲＥ）のパッケージングおよび／または核内移行を補助する配列；必要に応じてプロモーターまたはその活性部分；様々な制御エレメントに作動可能に連結された治療用導入遺伝子；必要に応じてインシュレーター；ならびに右端（３’）レトロウイルスＬＴＲを含む、レンチウイルスであり得る。
一部の実施形態では、発現ベクターまたはカセットは、１つまたは複数の制御エレメントを含む。一部の例では、ベクターまたはカセットは、組み合わされた２つまたはそれよりも多くの制御エレメントを含む。一部の例では、ベクターまたはカセットは、組み合わされていない２つまたはそれよりも多くの制御エレメント、たとえば、導入遺伝子の上流のプロモーターおよび導入遺伝子の下流に位置するエンハンサーを含む。一部の実施形態では、イントロン配列は、プロモーターの下流に位置する。
一部の事例では、発現ベクターまたはカセットは、高駆動体制御エレメント、全体的制御エレメントまたは短い制御エレメントを含む。一部の事例では、高駆動体制御エレメントは、全体的発現を駆動させるおよび／または短い。一部の事例では、制御エレメントは、短い全体的制御エレメントである。一部の実施形態では、制御エレメントを含む発現ベクターまたはカセットは、ウイルスベクターにおいて使用され、またはウイルス中にパッケージングされ、これは、動物モデルにおいて全体として、またはある特定の細胞型もしくは標的細胞型において制御エレメントの活性を評価するために、動物モデルにｉｎ ｖｉｖｏで感染するためまたは細胞をｅｘ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフェクトするために使用され得る。
一部の実施形態では、本開示の制御エレメントを含む発現カセットは、１つまたは複数の導入遺伝子もまた含む。導入遺伝子は、タンパク質コーディング遺伝子であり得る。一部の事例では、発現カセットは、治療用導入遺伝子を含む。治療用導入遺伝子は、不在もしくは欠陥のある遺伝子を置き換えるか、またはタンパク質の発現欠損を補うことができる。治療用導入遺伝子は、細胞シグナル伝達経路に関与し得る。一部の事例では、発現ベクターまたはカセットは、商業的産生のための導入遺伝子を含む。一部の実施形態では、商業的産生のための導入遺伝子は、治療用タンパク質を産生でき、または宿主細胞の機能を改善でき、または宿主細胞の表現型を回復もしくはレスキューできる。
本明細書に開示される制御エレメントは、発現ベクターまたはカセット内の任意の位置に位置することができる。たとえば、制御エレメントは、エンハンサーの上流、エンハンサーの下流であるが、プロモーターの上流、導入遺伝子の５’ＵＴＲ内、導入遺伝子のイントロン内、導入遺伝子の３’ＵＴＲ内、または導入遺伝子の下流に位置し得る。一部の事例では、１つまたは複数の制御エレメントは、作動可能に連結された導入遺伝子の上流または下流に位置する。たとえば、配列番号３および４は、ｍｉｎＣＭＶプロモーターの下流に、それぞれ配列番号１および２の配列を含む。制御エレメントは、発現カセットまたはベクター内の異なる位置からの導入遺伝子発現に対して異なる影響を有し得る。各制御エレメントは、その制御エレメントからの最適な発現をもたらす、発現ベクターまたはカセット内の好ましい位置を有し得る。
高い活性を有するより短い制御エレメントを利用することで、導入遺伝子発現も高い発現も犠牲にすることなしに、同じパッケージング能力内でのより大きな導入遺伝子の送達を可能にすることができる。一部の事例では、より短い制御エレメントの使用は、単一のベクターでの２つもしくはそれよりも多くの導入遺伝子の送達、または制御エレメントなしの類似のベクターもしくはカセットと比較して比較的高いレベルの発現での大きな導入遺伝子の送達を可能にする。２つまたはそれよりも多くの導入遺伝子は、２つもしくはそれよりも多くの異なるタンパク質コーディング遺伝子、またはタンパク質コーディング遺伝子および非コーディングエレメントを含み得る。一例では、ベクターは、実施例４において記載されるように、Ｃａｓ９コーディング配列および１つまたは複数のガイドＲＮＡを含む。一部の事例では、制御エレメントは、長さが約２０〜１００、３０〜１００、４０〜８０または５０〜６０塩基対である。一部の事例では、制御エレメントは、長さが１５０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０または６０塩基対未満である。本開示の組み合わされた制御エレメントは、短くてもよい。組み合わされた制御エレメントは、長さが約５０〜５００、１００〜４００、５０〜２００、１００〜２００または１５０〜３００塩基対の全長を有し得る。組み合わされた制御エレメントは、長さが約５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０または１００塩基対未満の組み合わされた長さを有し得る。
一部の事例では、発現カセットまたはベクターは、その配列が１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、５．５ｋｂ、６ｋｂ、６．５ｋｂ、７ｋｂまたは７．５ｋｂを上回る大きな導入遺伝子に作動可能に連結された本開示の１つまたは複数のＲＥを含む。一部の事例では、大きな導入遺伝子は、１つまたは複数のＲＥに作動可能に連結され、ここで、各ＲＥは、４９ｂｐ、５０ｂｐ、５６ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、１１０ｂｐ、１１７ｂｐ、１２０ｂｐ、１３０ｂｐ、１４０ｂｐ、１５０ｂｐ、１６０ｂｐ、１７０ｂｐ、１８０ｂｐ、１９０ｂｐ、２００ｂｐ、２１０ｂｐ、２２０ｂｐ、２３０ｂｐ、２４０ｂｐ、２５０ｂｐ、２５９ｂｐ、２６０ｂｐ、２６５ｂｐ、２７０ｂｐ、２８０ｂｐ、２９０ｂｐ、３００ｂｐ、３１０ｂｐ、３２０ｂｐ、３３０ｂｐ、３４０ｂｐ、３５０ｂｐ、３６０ｂｐ、３７０ｂｐ、３８０ｂｐ、３９０ｂｐまたは４００ｂｐ以下であり、表１または配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１のうちのいずれか１つに従う配列を含む。一部の事例では、ＲＥは、導入遺伝子の発現を、ＲＥなしの発現ベクターもしくはカセットと比較して、または陰性対照（たとえば、ベクター単独対照、または既知の発現活性を有さない配列を含むベクター）と比較して少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍または少なくとも１０００倍増加させる。
発現カセットまたはベクターの活性を評価するとき、活性または発現は、単位用量当たりの活性もしくは発現レベルとして表すことができるか、または細胞、マウス、もしくは被験体に投与もしくは送達された発現カセットもしくはベクターの用量に対して正規化され得る。一部の事例では、導入遺伝子の発現または活性は、制御エレメントありまたはなしでの様々な発現ベクターまたはカセットにわたる比較を可能にするために、使用されたプラスミドもしくはＤＮＡの量に対して正規化されるか（たとえば、１マウス当たりのμｇ／ｋｇ）、またはウイルス粒子の量に対して正規化される（たとえば、１マウスもしくは被験体当たりのゲノムコピーの量／ｋｇに対して正規化される）。たとえば、マウスにおける制御エレメントの活性を評価する場合、アッセイした細胞における導入遺伝子の発現または導入遺伝子の活性は、１マウス当たり、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０μｇ、または１０を上回るか、または２０μｇを上回る発現ベクター、カセット、またはプラスミドの用量に対して、正規化され得る。一部の事例では、発現レベルまたは活性は、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、または１０１５ｇｃ／ｋｇの、１マウス当たりの本明細書に開示される発現ベクターまたはカセットを含むウイルス粒子に対して、正規化され得る。
遺伝子療法、たとえば、ｒＡＡＶを使用して、本開示の発現カセットを送達することの１つの利点は、そのような療法が、より標的化された持続的な治療効果を長時間にわたり提供できることである。加えて、ウイルス遺伝子療法は、目的の１つまたは複数の細胞型または組織（たとえば、肝細胞または肝臓）に対して指向性を有するように操作することができる。たとえば、ウイルス遺伝子療法は、１つまたは複数の領域、組織、または細胞型に、ｉｎ ｖｉｖｏで感染し、ペイロードまたは治療剤、たとえば、転写モジュレーターまたは導入遺伝子を送達するように、操作することができる。
導入遺伝子
本明細書に開示される構築物（たとえば、発現カセットまたはベクター）は、目的の細胞または複数の細胞における導入遺伝子の発現を駆動させるために使用できる。一部の事例では、本明細書に開示される構築物は、組換えタンパク質発現のために使用される。たとえば、本明細書に開示される制御エレメントは、組換えタンパク質の発現を駆動させるために使用できる。本開示の方法で産生された組換えタンパク質は、治療目的、研究目的または商業目的のために産生され得る。ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのタンパク質発現系の一部として発現され得る導入遺伝子の例としては、Ｃａｓ９、第ＶＩＩＩ因子、ＤＮＡ結合タンパク質、ホルモン、増殖／分化因子、たとえば、インスリン、成長ホルモン、ＶＥＧＦ、神経栄養因子、線維芽細胞上皮因子；免疫系を制御またはモジュレートする治療用タンパク質、たとえば、サイトカイン、インターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子、抗体、免疫グロブリン、インターフェロン、キメラＴ細胞受容体；リポタンパク質受容体；嚢胞性線維症膜貫通制御因子；ムコ多糖症Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型と関連する遺伝子；ベータグロビン；ならびにリポタンパク質リパーゼが挙げられるが、これらに限定されない。一部の事例では、発現される導入遺伝子は、ＡＴＰ７Ａ、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはそれらのバリアントもしくは機能性断片である。一部の事例では、発現される導入遺伝子は、ＣＤＫＬ５、ＣＮＴＮＡＰ２、ＺＥＢ２、またはそれらのバリアントもしくは機能性断片である。一部の事例では、導入遺伝子は、フィブリノゲン、プロトロンビン、凝固因子または血液凝固因子（たとえば、第１因子、第２因子、第３因子、第４因子、第５因子、第６因子、第７因子、第８因子、第９因子、第１０因子、第１１因子または第１２因子）、それらのバリアントまたは機能性断片である。
一部の事例では、導入遺伝子に作動可能に連結された本開示の１つまたは複数のＲＥを含む発現カセットは、遺伝子療法処置のために適合される。一部の事例では、遺伝子療法処置は、たとえば、静脈内注入もしくは注射によって投与される、または静脈内注入もしくは注射による全身送達のために適合される。一部の事例では、遺伝子療法は、肝臓または肝細胞における発現のために適合される。一部の事例では、作動可能に連結された導入遺伝子は、肝臓もしくは肝細胞において発現される遺伝子であり、または肝臓の疾患もしくは状態と関連する遺伝子、たとえば、ウィルソン病と関連するＡＴＰ７Ｂ；進行性家族性肝内胆汁うっ滞症３型と関連するＡＢＣＢ４；遺伝性フルクトース不耐症と関連するＡＬＤＯＢ；ＩＶ型糖原病と関連するＧＢＥ１；チロシン血症Ｉ型と関連するＦＡＨ；アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症と関連するＡＳＬ；シトリン欠損症（ＣＴＬＮ２、ＮＩＣＣＤ）と関連するＳＬＣ２５Ａ１３；コレステロールエステル蓄積症と関連するＬＩＰＡ；アルファ−１アンチトリプシン欠損症と関連するＳＥＲＰＩＮＡ１；嚢胞性線維症と関連するＣＦＴＲ；遺伝性ヘモクロマトーシスと関連するＨＦＥ；もしくはアルストレーム症候群と関連するＡＬＭＳ１である。一部の事例では、１つもしくは複数の制御エレメント、または本明細書に開示されるＲＥを含む発現カセットは、遺伝性の肝臓疾患、たとえば、胆汁酸合成の障害、炭水化物代謝の障害、アミノ酸代謝の障害、尿素サイクル異常症、または脂質代謝の障害を処置するための遺伝子療法処置のために使用される。一部の事例では、１つもしくは複数の制御エレメント、または本明細書に開示されるＲＥを含む発現カセットは、ウィルソン病；進行性家族性肝内胆汁うっ滞症３型；遺伝性フルクトース不耐症；ＩＶ型糖原病；チロシン血症Ｉ型；アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症；シトリン欠損症（ＣＴＬＮ２、ＮＩＣＣＤ）；コレステロールエステル蓄積症；アルファ−１アンチトリプシン欠損症；嚢胞性線維症；遺伝性ヘモクロマトーシス；またはアルストレーム症候群を処置するための遺伝子療法処置（たとえば、ＡＡＶ遺伝子療法）のために使用される。一部の事例では、１つもしくは複数の制御エレメント、または本明細書に開示されるＲＥを含む発現カセットは、血液凝固障害（たとえば、血友病、血友病Ａもしくは血友病Ｂ）またはウィルソン病を処置するための遺伝子療法処置（たとえば、ＡＡＶ遺伝子療法）のために使用される。
一部の事例では、組換えタンパク質を発現させる方法は、細胞または複数の細胞中に発現カセットまたはベクターを導入することを含み、ここで、発現カセットまたはベクターは、導入遺伝子に作動可能に連結された、本開示の１つまたは複数のＲＥ（配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１）を含む。一部の事例では、導入遺伝子は、Ｃａｓ９、第ＶＩＩＩ因子、ＤＮＡ結合タンパク質、ホルモン、増殖／分化因子、たとえば、インスリン、成長ホルモン、ＶＥＧＦ、神経栄養因子、線維芽細胞上皮因子；免疫系を制御またはモジュレートする治療用タンパク質、たとえば、サイトカイン、インターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子、抗体、免疫グロブリン、インターフェロン、キメラＴ細胞受容体；リポタンパク質受容体；嚢胞性線維症膜貫通制御因子；ムコ多糖症Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型と関連する遺伝子；ベータグロビン；ならびにリポタンパク質リパーゼのうちのいずれか１つである。一部の事例では、発現される導入遺伝子は、ＡＴＰ７Ａ、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはそれらのバリアントもしくは断片である。一部の事例では、発現される導入遺伝子は、ＣＤＫＬ５、ＣＮＴＮＡＰ２、ＺＥＢ２、またはそれらのバリアントもしくは断片である。一部の事例では、導入遺伝子は、フィブリノゲン、プロトロンビン、凝固因子、もしくは血液凝固因子（たとえば、第１因子、第２因子、第３因子、第４因子、第５因子、第６因子、第７因子、第８因子、第９因子、第１０因子、第１１因子または第１２因子）である。
本明細書に開示されるヒト遺伝子のヌクレオチドおよびタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）またはＵｎｉＰｒｏＫＢデータベースを含む様々な公的なデータベースにおいて見出すことができる。たとえば、ヒトＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号としては、Ｑ０４６５６（ＡＴＰ７Ａ）；Ｐ３５６７０（ＡＴＰ７Ｂ）；Ｏ４３５２０（ＡＴ８Ｂ１）；Ｐ２１４３９（ＡＢＣＢ４とも称されるＭＤＲ３）；Ｏ９５３４２（ＡＢＣＢ１１とも称されるＡＢＣＢＢ）；Ｏ７６０３９（ＣＤＫＬ５）；Ｑ９ＵＨＣ６（ＣＮＴＮＡＰ２とも称されるＣＮＴＰ２）；Ｏ６０３１５（ＺＥＢ２）；Ｐ１２２５９（Ｆ５すなわち第Ｖ因子）；Ｐ００４５１（Ｆ８すなわち第ＶＩＩＩ因子）；Ｐ００７４０（Ｆ９すなわち第ＩＸ因子）；Ｐ００７４２（Ｆ１０すなわち第Ｘ因子）が挙げられる。そのようなタンパク質配列のうちのいずれか１つは、本明細書に開示される発現カセット中の核酸配列（すなわち導入遺伝子）によってコードされ得る。
組換えタンパク質は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳動物細胞において産生され得る。一部の例では、組換えタンパク質は、哺乳動物細胞において産生される。一部の事例では、タンパク質は、動物モデルにおいて産生される。タンパク質を産生するために使用され得る細胞系の例としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、マウス骨髄腫細胞（ＮＳＯ）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）およびＢ１６黒色腫細胞が挙げられる。一部の例では、ヒト由来細胞系が使用される。タンパク質を産生するために使用され得るヒト細胞系の例としては、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨｅＬａ、ＨＴ−１０８０およびＰＥＲ．Ｃ５が挙げられる。組換えタンパク質は、動物または動物産物においても産生され得る。組換えタンパク質は、植物においても産生され得る。組換えタンパク質は、植物の葉、茎、花、果実または種子において発現され得る。
一部の実施形態では、本開示の制御エレメントは、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子の発現を駆動または増加させるために使用され得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の制御エレメントは、実施例２の方法に従って測定した場合、１０１７、１０１８、１０１９、１０２０または１０２１光子／秒／マウスを上回るアウトプットを生じるレベルで、作動可能に連結されたルシフェラーゼ導入遺伝子の発現をもたらし得る。
不十分な遺伝子発現および／またはタンパク質活性もしくは合成（または遺伝子の過小発現）と関連するハプロ不全または任意の障害もしくは状態を処置する方法であって、それを必要とする対象において発現カセットまたはベクターを投与することを含み、ここで、発現カセットまたはベクターは、導入遺伝子に作動可能に連結された本開示の１つまたは複数のＲＥ（配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１）を含む、方法もまた本明細書で企図される。一部の事例では、導入遺伝子は、内因性遺伝子の増加した発現をもたらすＤＮＡ結合タンパク質または転写モジュレーター（たとえば、転写活性化因子）である。一部の事例では、発現カセットまたはベクター中の導入遺伝子は、治療用導入遺伝子である。一部の事例では、治療用導入遺伝子は、Ｃａｓ９、第ＶＩＩＩ因子、ＤＮＡ結合タンパク質、ホルモン、増殖／分化因子、たとえば、インスリン、成長ホルモン、ＶＥＧＦ、神経栄養因子、線維芽細胞上皮因子；免疫系を制御またはモジュレートする治療用タンパク質、たとえば、サイトカイン、インターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子、抗体、免疫グロブリン、インターフェロン、キメラＴ細胞受容体；リポタンパク質受容体；嚢胞性線維症膜貫通制御因子；ムコ多糖症Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型と関連する遺伝子；ベータグロビン；ならびにリポタンパク質リパーゼのうちのいずれか１つである。一部の事例では、発現される導入遺伝子は、ＡＴＰ７Ａ、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴ８Ｂ１（すなわちＡＴＰ８Ｂ１）、ＭＤＲ３（すなわちＡＢＣＢ４）、ＡＢＣＢＢ（すなわちＡＢＣＢ１１）、ＣＤＫＬ５、ＣＮＴＰ２（すなわちＣＮＴＮＡＰ２）、ＺＥＢ２、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子もしくは第Ｘ因子、またはそれらのバリアント、サブユニット、アイソフォームもしくは機能性断片である。進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（ＰＦＩＣ）としては、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１およびＡＢＣＢ４遺伝子中の突然変異（複数可）と関連するＰＦＩＣ１、ＰＦＩＣ２およびＰＦＩＣ３が挙げられる。進行性家族性肝内胆汁うっ滞症２型（ＰＦＩＣ２）は、ＡＢＣＢ１１中の欠陥または突然変異と関連する。ＡＴＰ８Ｂ１遺伝子突然変異は、ＰＦＩＣ１を引き起こし得る。ＡＢＣＢ１１遺伝子における突然変異は、ＰＦＩＣ２を引き起こし得る。ＡＢＣＢ４遺伝子突然変異は、ＰＦＩＣ３を引き起こし得る。一部の事例では、本明細書に開示される導入遺伝子は、ＣＤＫＬ５であり、ＣＤＫＬ５欠損障害を処置するための遺伝子療法において使用される。ＣＮＴＮＡＰ２における突然変異または欠陥は、自閉症スペクトラム障害をもたらし得る。一部の事例では、導入遺伝子は、フィブリノゲン、プロトロンビン、凝固因子もしくは血液凝固因子（たとえば、第１因子、第２因子、第３因子、第４因子、第５因子、第６因子、第７因子、第８因子、第９因子、第１０因子、第１１因子または第１２因子）、またはそれらのバリアントもしくは機能性断片である。一部の事例では、導入遺伝子は、肝細胞において優先的に発現される。一部の事例では、投与することは、たとえば、経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、くも膜下腔内、経腸または非経口投与を介して、全身である。一部の事例では、この方法は、静脈内注入または注射を介して発現カセットまたはベクターを送達することを含む。一部の事例では、投与することは、たとえば、肝臓、ＣＮＳ、または身体中の臓器への注射を介して、局所である。一部の事例では、発現カセットまたはベクターは、ＡＡＶ、たとえば、ＡＡＶ８である。
一部の事例では、遺伝子の過剰発現と関連する障害または状態を処置する方法であって、それを必要とする対象に発現カセットまたはベクターを投与することを含み、ここで、発現カセットまたはベクターは、導入遺伝子に作動可能に連結された本開示の１つまたは複数のＲＥ（配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１）を含む、方法が本明細書で企図される。一部の事例では、導入遺伝子は、内因性遺伝子の減少した発現をもたらすＤＮＡ結合タンパク質または転写モジュレーター（たとえば、転写抑制因子）である。一部の事例では、導入遺伝子は、肝細胞において優先的に発現される。一部の事例では、投与することは、たとえば、経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、くも膜下腔内、経腸または非経口投与を介して、全身である。一部の事例では、この方法は、静脈内注入または注射を介して発現カセットまたはベクターを送達することを含む。一部の事例では、投与することは、たとえば、肝臓、ＣＮＳ、または身体中の臓器への注射を介して、局所である。一部の事例では、発現カセットまたはベクターは、ＡＡＶ、たとえば、ＡＡＶ８である。
一部の事例では、以下の遺伝子のうちのいずれか１つにおける欠陥と関連する遺伝性障害または状態を処置する方法が本明細書で企図される：ＡＴＰ７Ａ、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴ８Ｂ１（すなわちＡＴＰ８Ｂ１）、ＭＤＲ３（すなわちＡＢＣＢ４）、ＡＢＣＢＢ（すなわちＡＢＣＢ１１）、ＣＤＫＬ５、ＣＮＴＰ２（すなわちＣＮＴＮＡＰ２）、ＺＥＢ２、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、フィブリノゲン、プロトロンビン、凝固因子または血液凝固因子（たとえば、第１因子、第２因子、第３因子、第４因子、第５因子、第６因子、第７因子、第８因子、第９因子、第１０因子、第１１因子または第１２因子）。一部の事例では、ウィルソン病を処置する方法が、本明細書に開示される。一部の事例では、ウィルソン病、またはＡＴＰ７Ａ、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴ８Ｂ１（すなわちＡＴＰ８Ｂ１）、ＭＤＲ３（すなわちＡＢＣＢ４）、ＡＢＣＢＢ（すなわちＡＢＣＢ１１）、ＣＤＫＬ５、ＣＮＴＰ２（すなわちＣＮＴＮＡＰ２）、ＺＥＢ２、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、フィブリノゲン、プロトロンビン、凝固因子もしくは血液凝固因子（たとえば、第１因子、第２因子、第３因子、第４因子、第５因子、第６因子、第７因子、第８因子、第９因子、第１０因子、第１１因子または第１２因子）と関連する任意の他の遺伝性障害もしくは状態を処置する方法は、それを必要とする対象（たとえば、動物またはヒト）に、本明細書に開示される発現カセットまたはベクターを投与することを含み、ここで、発現カセットまたはベクターは、本開示の導入遺伝子、たとえば、ＡＴＰ７Ａ、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴ８Ｂ１（すなわちＡＴＰ８Ｂ１）、ＭＤＲ３（すなわちＡＢＣＢ４）、ＡＢＣＢＢ（すなわちＡＢＣＢ１１）、ＣＤＫＬ５、ＣＮＴＰ２（すなわちＣＮＴＮＡＰ２）、ＺＥＢ２、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、フィブリノゲン、プロトロンビン、凝固因子、血液凝固因子（たとえば、第１因子、第２因子、第３因子、第４因子、第５因子、第６因子、第７因子、第８因子、第９因子、第１０因子、第１１因子または第１２因子）、ＤＮＡ結合タンパク質または転写モジュレーターに作動可能に連結された、本開示の１つまたは複数のＲＥを含む。一部の事例では、導入遺伝子は、内因性遺伝子を編集するＣａｓタンパク質（たとえば、Ｃａｓ９またはｓａＣａｓ９タンパク質）および／またはガイドＲＮＡである（たとえば、Ｃａｓは、内因性遺伝子から突然変異を除去する）。一部の事例では、発現カセットまたはベクターは、肝臓において導入遺伝子を優先的に発現させる。一部の事例では、投与することは、たとえば、静脈内注入または注射を介して全身である。一部の事例では、投与することは、局所、たとえば、組織または臓器への直接注射、たとえば、肝臓またはＣＮＳへの注射である。
一部の事例では、本明細書に開示される発現カセットまたはベクターは、ウィルソン病を処置するために使用され、ここで、発現カセットまたはベクターは、治療用導入遺伝子に作動可能に連結された１つまたは複数のＲＥ（たとえば、配列番号１、２、３、４、１３、１４、１５、１６、１７、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１）を含み、ここで、導入遺伝子は、ＡＴＰ７Ｂ、または細胞中でもしくはｉｎ ｖｉｖｏでＡＴＰ７Ｂ発現を増加させるように内因性ＡＴＰ７Ｂ遺伝子に対して作用する転写モジュレーターもしくはＤＮＡ結合タンパク質である。一部の事例では、そのような発現カセットまたはベクターは、ウィルソン病と診断されたまたはその危険性がある対象に送達される。一部の事例では、そのような発現カセットまたはベクターは、静脈内注入または注射を介して対象に送達される。一部の事例では、送達は、全身である。一部の事例では、ウィルソン病を処置する方法は、それを必要とする対象に遺伝子療法（たとえば、ＡＡＶ遺伝子療法）を投与することを含み、ここで、遺伝子療法は、治療用導入遺伝子に作動可能に連結された１つまたは複数のＲＥ（たとえば、配列番号１、２、３、４、１３、１４、１５、１６、１７、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１）を含み、ここで、導入遺伝子は、ＡＴＰ７Ｂ、または細胞中でもしくはｉｎ ｖｉｖｏでＡＴＰ７Ｂ発現を増加させるように内因性ＡＴＰ７Ｂ遺伝子に対して作用する転写モジュレーターである。一部の事例では、発現カセットまたはベクターは、ＡＡＶ、たとえば、ＡＡＶ８である。一部の事例では、発現カセットまたはベクターは、肝細胞または肝臓において優先的に発現される。
一部の事例では、本明細書に開示される発現カセットまたはベクターは、血液凝固障害を処置するために使用され、ここで、発現カセットまたはベクターは、治療用導入遺伝子に作動可能に連結された１つまたは複数のＲＥ（たとえば、配列番号１、２、３、４、１３、１４、１５、１６、１７、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１）を含み、ここで、導入遺伝子は、フィブリノゲン、プロトロンビン、凝固因子もしくは血液凝固因子（たとえば、第１因子、第２因子、第３因子、第４因子、第５因子、第６因子、第７因子、第８因子、第９因子、第１０因子、第１１因子または第１２因子）、またはフィブリノゲン、プロトロンビン、凝固因子もしくは血液凝固因子（たとえば、第１因子、第２因子、第３因子、第４因子、第５因子、第６因子、第７因子、第８因子、第９因子、第１０因子、第１１因子または第１２因子）に対応する内因性遺伝子に対して作用する転写モジュレーターである。一部の事例では、導入遺伝子は、第ＶＩＩＩ因子である。一部の事例では、そのような発現カセットまたはベクターは、血液凝固障害と診断されたまたはその危険性がある対象に送達される。一部の事例では、そのような発現カセットまたはベクターは、静脈内注入または注射を介して対象に送達される。一部の事例では、送達は、全身である。一部の事例では、血液凝固障害を処置する方法は、それを必要とする対象に遺伝子療法（たとえば、ＡＡＶ遺伝子療法）を投与することを含み、ここで、遺伝子療法は、治療用導入遺伝子に作動可能に連結された本開示の１つまたは複数のＲＥ（たとえば、配列番号１、２、３、４、１３、１４、１５、１６、１７、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１）を含み、ここで、導入遺伝子は、第ＶＩＩＩ因子、または細胞中でもしくはｉｎ ｖｉｖｏでその発現を増加させるように内因性第ＶＩＩＩ因子遺伝子に対して作用する転写モジュレーターである。一部の事例では、導入遺伝子は、第１因子、第２因子、第３因子、第４因子、第５因子、第６因子、第７因子、第８因子、第９因子、第１０因子、第１１因子または第１２因子のうちのいずれか１つである。一部の事例では、発現カセットまたはベクターは、ＡＡＶである。一部の事例では、発現カセットまたはベクターは、肝細胞または肝臓において優先的に発現される。
一部の事例では、導入遺伝子は、ＤＮＡ結合タンパク質、またはＤＮＡ結合と関連するタンパク質であり得る。一部の事例では、ＤＮＡ結合タンパク質は、転写因子、または転写因子の一部であり得る。一部の事例では、ＤＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃａｓファミリータンパク質、ｓａＣａｓ９、ｄＣａｓ９、ｄＣａｓファミリータンパク質、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質もしくは亜鉛フィンガータンパク質、または融合タンパク質であり得る。一部の事例では、遺伝性障害を処置する方法は、遺伝子編集タンパク質（たとえば、Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡ）および本開示の１つまたは複数のＲＥ（たとえば、配列番号１、２、３、４、１３、１４、１５、１６、１７、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１）を含む発現カセットまたはベクターを投与することを含む。一部の事例では、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質を、目的とされる内因性遺伝子または本明細書に開示される内因性遺伝子に標的化する。
一部の事例では、本明細書に開示される構築物は、遺伝子療法を送達するために使用される。特に、本開示の比較的短い制御エレメントは、第ＶＩＩＩ因子またはＡＴＰ７Ｂなどの大きな導入遺伝子の発現を必要とする遺伝子療法に特に有用であり得る。一部の実施形態では、大きな導入遺伝子は、肝細胞などの肝臓細胞において発現される。他の実施形態では、大きな導入遺伝子は、ニューロンなど、中枢神経系（ＣＮＳ）において発現される。一部の実施形態では、本明細書に開示される導入遺伝子のうちのいずれか１つは、導入遺伝子の発現を増加させるために、本明細書に開示される１つまたは複数の制御エレメントに作動可能に連結される。一部の事例では、本明細書に開示される導入遺伝子は、細胞中で、またはｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／もしくはｅｘ ｖｉｖｏで発現される。一部の事例では、そのような大きな導入遺伝子は、遺伝子療法、組換え発現ベクターもしくはプラスミド、またはウイルスベクターもしくはプラスミドを使用して、細胞に送達される。遺伝子療法または発現系の一部としてｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで発現され得る大きな導入遺伝子の例としては、メンケスタンパク質（ＡＴＰ７Ａ）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーｂメンバー４（ＡＢＣＢ４）、ＡＴＰａｓｅリン脂質輸送８Ｂ１（ＡＴＰ８Ｂ１）、ＡＴＰａｓｅ銅輸送ベータ（ＡＴＰ７Ｂ）、サイクリン依存性キナーゼ様５（ＣＤＫＬ５）、コンタクチン関連タンパク質様２（ＣＮＴＮＡＰ２）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＢメンバー１１（ＡＢＣＢ１１）および亜鉛フィンガーＥ−ボックス結合ホメオボックス２（ＺＥＢ２）、ならびにコドン最適化されたバリアントを含む、それらの任意のバリアント、サブユニット、突然変異体または機能性断片が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、本明細書に開示される構築物は、遺伝子編集のために使用される。たとえば、構築物は、本明細書に開示される制御エレメント、Ｃａｓ９コーディング配列、およびガイドＲＮＡを含み得る。一部の事例では、Ｃａｓｅ９コーディング配列は、ｓａＣａｓ９をコードする。Ｃａｓ９またはｓａＣａｓ９コーディング配列およびガイドＲＮＡを有する構築物は、たとえば、突然変異を補正すること（たとえば、未成熟停止コドンを除去すること）によって、機能不全遺伝子を補正するために使用され得る。
様々な遺伝性障害、たとえば、重症複合免疫不全症（ＡＤＡ−ＳＣＩＤ）、メンケス病、家族性肝内胆汁うっ滞症、バイラー症候群、ウィルソン病、皮質異形成−焦点性てんかん症候群、モワット・ウィルソン症候群、ＰＦＩＣ２、ＰＦＩＣ３、慢性肉芽腫性障害、血友病、先天性失明、代謝障害、リソソーム蓄積症、筋ジストロフィー、がん、ウイルス感染症、心臓疾患および糖尿病を含む様々な疾患を処置するための、本明細書に開示される１つまたは複数の制御エレメントを含む遺伝子療法または発現ベクターもまた、本明細書で企図される。一部の事例では、本明細書に開示される１つまたは複数の制御エレメントを含む遺伝子療法は、ウィルソン病を処置するために使用され得る。
一部の実施形態では、本明細書に開示される制御エレメントは、血液凝固障害を有する対象を処置するために使用される。たとえば、本開示の制御エレメントおよびＦＶＩＩＩのコーディング配列を含む発現カセットは、ＦＶＩＩＩ欠損を有する対象において、凝固障害または疾患をレスキューするために使用され得る。本開示の制御エレメントおよびＦＶＩＩＩのコーディング配列を含む発現カセットを、凝固障害を有する対象中にトランスフェクトすることは、図５Ａおよび図１０に示されるように、傷害後の血液喪失の減少をもたらし得る。本開示の制御エレメントおよびＦＶＩＩＩのコーディング配列を含む発現カセットを、凝固障害を有する対象中にトランスフェクトすることは、少なくとも約１０％、２０％、３０％の血液喪失をもたらし得る。本開示の制御エレメントおよびＦＶＩＩＩのコーディング配列を含む発現カセットを、凝固障害を有する対象中にトランスフェクトすることは、図５Ｂおよび図１１に示されるように、傷害後に出血が停止するまでの時間の減少をもたらし得る。
本開示の構築物、遺伝子療法または発現ベクター／カセットのうちのいずれか１つで処置され得る対象としては、ヒト、霊長類、イヌ、ネコ、齧歯動物、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタおよび他の家畜が挙げられる。一部の事例では、対象は、疾患／障害を有する、または疾患／障害の危険性がある。たとえば、対象は、遺伝性疾患を有し得る、または遺伝性疾患もしくはその疾患の素因と関連することが公知のＤＮＡ配列を有し得る。一部の事例では、対象は、血友病を有する。一部の事例では、対象は、血友病Ａを有する。一部の実施形態では、対象は、第ＶＩＩＩ因子中に欠陥を有する。一部の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子に作動可能に連結された本明細書に記載される１つまたは複数の制御エレメントを含む遺伝子療法は、血友病Ａと診断された対象を処置するために使用される。
これらの実施例は、例示的な目的のみで提供され、本明細書において提供される特許請求の範囲を限定するためのものではない。
（実施例１）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における高い発現
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、いくつかの異なる制御エレメント、すなわち、プロモーターなしの対照、ＳＣＰ、ＣＭＶ、配列番号３（ｍｉｎＣＭＶに作動可能に連結された配列番号１）、配列番号４（ｍｉｎＣＭＶに作動可能に連結された配列番号２）およびＣＡＧのうちの１つの制御下にルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。各構築物からの正規化されたルシフェラーゼ値は、図１Ａに示される。各構築物からのサイズ正規化された活性値は、図１Ｂに示される。本明細書で使用される制御エレメントおよびプロモーターの配列は、上記表１および下記表３に提供される。ｍｉｎＣＭＶプロモーターに連結された配列番号１の制御エレメントおよびｍｉｎＣＭＶプロモーターに連結された配列番号２の制御エレメントは、ｍｉｎＣＭＶ単独およびＳＣＰ単独よりも高いレベルのルシフェラーゼ発現を駆動させた。配列番号１および配列番号２は共に、ｍｉｎＣＭＶプロモーターに連結されると、対照、ＳＣＰ、または制御エレメント（すなわち、配列番号１または２）なしのｍｉｎＣＭＶプロモーターと比較して、ＨＥＫ２９３Ｔ腎臓細胞においてルシフェラーゼの高い発現を駆動させた。
類似の正規化されたルシフェラーゼ発現実験を、図１Ｃ、図１Ｄおよび図１Ｅに示されるように、追加の対照および制御配列を用いて実施した。ホタル発現もまたアッセイして、試験したすべての試料における類似のトランスフェクション効率を確実にした。図１Ｃでは、配列番号４、組み合わせた配列番号１７および２２（すなわち配列番号１７／２２）、組み合わせた配列番号１６および２３（すなわち配列番号１６／２３）、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３２、ならびに配列番号３３の制御エレメントの正規化されたルシフェラーゼ発現を、２つの陰性対照（すなわち、いずれの発現も駆動させないことが既知の配列）と比較した。試験した制御エレメントは各々、陰性対照と比較して、たとえば、少なくとも１０、５０もしくは１００倍またはそれよりも高い、高いレベルのルシフェラーゼ発現を生じた。
図１Ｄでは、配列番号４、配列番号２８、配列番号３０、配列番号２６または配列番号２７の制御エレメントを含むプラスミドからの正規化されたルシフェラーゼ発現を、陰性対照、およびルシフェラーゼに作動可能に連結された、ＣＭＶｅに連結されたＣＭＶまたはＣＭＶのいずれかを含む類似のプラスミドと比較した。試験した各制御エレメント（すなわち、配列番号４、配列番号２８、配列番号３０、配列番号２６および配列番号２７）は、陰性対照、ＣＭＶ単独およびＣＭＶ＋ＣＭＶｅよりも高いルシフェラーゼ発現をもたらした。試験した比較的短いＲＥは、ルシフェラーゼに連結されたＣＭＶプロモーターまたはＣＭＶ＋ＣＭＶｅを含むプラスミドと比較して少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍の、または５０倍を上回る、正規化されたルシフェラーゼ発現を示した。
図１Ｅでは、ルシフェラーゼに作動可能に連結された配列番号１７／２２、配列番号１６／２３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０または配列番号４１の制御エレメントを含むプラスミドからの正規化されたルシフェラーゼ発現を、陰性対照（すなわち、発現活性を有さないことが既知の配列）と比較した。各制御エレメント（すなわち、配列番号１７／２２、１６／２３および３４〜４１）は、陰性対照よりも高いルシフェラーゼ発現を駆動させたが、一方で、配列番号３５および配列番号３９は各々、１０２よりも高い正規化されたルシフェラーゼ発現、または陰性対照よりも少なくとも１００倍高いルシフェラーゼ発現を駆動させた。
（実施例２）
全体的高駆動体
配列番号１および配列番号２の制御エレメントの発現パターンを評価するために、ルシフェラーゼに連結された各制御エレメントを含む組換えＡＡＶベクターを作製した。以下の制御エレメントを使用した：ＳＣＰ、ＳＥＲｐＥ＿ＴＴＲ、Ｐｒｏｔｏ１、ＣＭＶ、ＵＣＬ−ＨＬＰ、ＣＭＶｅ、配列番号１および配列番号２。プラスミドＤＮＡを、流体力学的尾静脈注射を介してＳＣＩＤ−ベージュマウスに送達し（１マウス当たり１２μｇの発現ベクター）、ルシフェラーゼの発現を、注射の４８時間後にマウスに５ｕｇ（約０．２５ｍｇ／ｋｇ）のフリマジン（furimazine）を注射することによってアッセイした。図２Ａは、異なる制御エレメントの制御下でのルシフェラーゼの発現を示し、各ＲＥがｍｉｎＣＭＶに連結された場合に、配列番号１および２が、マウス中の様々な組織におけるルシフェラーゼ発現を示す白い領域によって示されるように、少なくとも１つの追加の細胞型ならびに腎臓細胞において、作動可能に連結された導入遺伝子の発現を駆動させることができたことを示す。図２Ｂに示されるように、配列番号３および配列番号４の制御エレメントは各々、光子／秒で表されるルシフェラーゼ発光によって測定した場合、他の制御エレメントと比較して、高いレベルのルシフェラーゼ発現をもたらした。
（実施例３）
ヒト第ＶＩＩＩ因子の発現
ＳＣＩＤ−ベージュマウスに、ＵＣＬ−ＨＬＰに作動可能に連結された第ＶＩＩＩ因子（ＮＩＨ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＩＤ ＡＢＶ９０８６７．１）のコーディング配列；配列番号１を伴うｍｉｎＣＭＶ；または配列番号２を伴うｍｉｎＣＭＶを含む１６μｇの発現カセットＤＮＡを注射した。少なくとも８匹のマウスに、３つのプラスミドの各々を注射し、追加の少なくとも８匹のマウスに、緩衝液を注射した。プラスミドＤＮＡ注射の２４時間後、血液試料を採取し、確立された方法（ＣＯＡＴＥＳＴ（登録商標）ＳＰ４ ＦＶＩＩＩ、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ；Ｖｉｓｕａｌｉｚｅ（商標）ＤＶＩＩＩ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｋｉｔ、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＩＮＣ．）を使用して、第ＶＩＩＩ因子の活性および濃度について血漿を分析した。図３Ａに示されるように、配列番号１を伴うｍｉｎＣＭＶおよび配列番号２を伴うｍｉｎＣＭＶの両方の発現カセットは、１．５ＩＵ／ｍｌまたはそれよりも高いレベルの、第ＶＩＩＩ因子の高い血漿濃度をもたらした。図３Ｂは、配列番号３（配列番号１を伴うｍｉｎＣＭＶ）および配列番号４（配列番号２を伴うｍｉｎＣＭＶ）が共に、１００％またはそれよりも高い血漿第ＶＩＩＩ因子活性レベルをもたらしたことを示している。配列番号１および／または２の制御エレメントは、ｍｉｎＣＭＶと一緒に第ＶＩＩＩ因子コーディング配列に作動可能に連結された場合に、それぞれ１１４％および１６６％の血液第ＶＩＩＩ因子活性レベルをもたらし、これらは、ＵＣＬ−ＨＬＰプロモーターを用いて見られた活性よりも、約１０倍および１５倍高かった。
（実施例４）
遺伝子編集
トランスジェニックマウスＡｉ９（Ｊａｘ Ｓｔｏｃｋ Ｎｏ：００７９０９）において、ｔｄＴｏｍａｔｏの上流の停止カセットを欠失させるために、オールインワン組換えＡＡＶビリオンを開発した。停止カセットをｓａＣａｓ９によって欠失させた後、ｔｄＴｏｍａｔｏを、ＣＡＧプロモーターの制御下で発現させる。配列番号２と共に、ＥＦＳプロモーター、ＣＭＶプロモーターまたはＣＭＶプロモーターのいずれかの制御下にｓａＣａｓ９を含むｒＡＡＶを開発した。これらのｒＡＡＶは、Ｕ６プロモーターの制御下に２つのＳａガイドＲＮＡ足場をさらに含んだ。これらのｒＡＡＶビリオンを、上記トランスジェニックマウスの歯状回に注射した。３週間後に脳を固定して切片化し、歯状回におけるｔｄＴｏｍａｔｏの発現を評価した。図４Ｂに示されるように、配列番号２を伴うＣＭＶ（すなわち配列番号４）は、ＣＭＶ単独またはＥＦＳよりも多くのｔｄＴｏｍａｔｏ発現細胞をもたらした。図４Ａは、ＣＭＶに連結された配列番号２（すなわち配列番号４）が、脳細胞、たとえば、ニューロンの少なくとも部分集団において、連結された導入遺伝子（ＲＦＰ）の発現を駆動させたことを示している。
（実施例５）
血液凝固障害の遺伝子療法処置
遺伝子操作されたＦＶＩＩＩノックアウトマウス（Ｆ８ｔｍ１Ｓｒｃｍｏ、Ｆ８遺伝子のエクソン１６〜１９の欠失；Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｍｏｄｅｌ Ｏｒｇａｎｉｓｍ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａから得た）は、凝固欠損を有し、凝固欠損は、尾の終端を切り、凝固が生じるまで出血させることによって放出された血液の容積、または凝固が生じるまでに経過した時間のいずれかを測定することによってアッセイすることができる。ＦＶＩＩＩノックアウトマウスに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ対照）、またはＦＶＩＩＩ導入遺伝子の発現を駆動させる配列番号４を含む組換えＡＡＶビリオンを注射した。ｒＡＡＶビリオンを、２つの異なる用量：３１１ｇｃ／ｋｇまたは３１２ｇｃ／ｋｇで注射した。注射の３週間後、処置されたＦＶＩＩＩ−ノックアウトマウスの尾を切り、凝固までの時間および血液容積喪失を測定した。非ノックアウトマウスの群の尾も切り、凝固までの血液容積および時間について評価した。図５Ａに示されるように、ＰＢＳ処置したＦＶＩＩＩノックアウトマウスは、未処置の非ノックアウトマウスの２倍を上回る容積の血液を喪失した。しかし、ｒＡＡＶ処置したＦＶＩＩＩノックアウトマウスは、ＰＢＳ処置したマウスよりも少ない血液を喪失した。より高いｒＡＡＶ用量では、処置したマウスは、未処置の非ノックアウトマウスと同じ血液容積を喪失した。図５Ｂに示されるように、類似の結果が、出血時間アッセイについて見られた。より低いｒＡＡＶ用量は、出血時間に対する影響を示さなかったが、一方で、ＦＶＩＩＩに作動可能に連結された配列番号４を含むｒＡＡＶのより高い用量は、出血時間をほぼ非ノックアウトマウスについての時間まで低減させた。
（実施例６）
血液凝固障害の遺伝子療法処置
ＦＶＩＩＩノックアウトマウス（実施例５に記載した通り）に、リン酸緩衝生理食塩水、またはＦＶＩＩＩの発現を駆動させる配列番号１３〜１７の各々を含む組換えＡＡＶビリオン、またはＦＶＩＩＩの発現を駆動させる配列番号９（ＵＣＬ−ＨＬＰ）を含む対照ビリオンを注射した。図８は、未処置のノックアウトマウス（ＫＯ）および様々なビリオンで処置したマウスについての、トランスフェクションの３週間後の血液中のＦＶＩＩＩの濃度を示す。配列番号１３、配列番号１４または配列番号１７を含むビリオンは、ｉｎ ｖｉｖｏでＦＶＩＩＩの最も高い発現をもたらした；配列番号１５は、他の制御エレメントと比較して、ＦＶＩＩＩの中程度の発現をもたらした；配列番号１６は、他の配列と比較して、ＦＶＩＩＩの低い発現をもたらした。しかし、配列番号１６はなおも、ＵＣＬ−ＨＬＰプロモーターを用いた場合よりも約２倍高いＦＶＩＩＩ濃度をもたらした。
発現されたＦＶＩＩＩの活性もまた、実施例３に記載したようにアッセイし、図９および表４に示した。様々なビリオンからの活性レベルは、発現レベルと同じパターンに従った。
注射の３週間後、処置したＦＶＩＩＩノックアウトマウスの尾を切り、凝固までの時間および血液容積を測定した。非ノックアウトマウスの群の尾も切り、凝固までの血液容積および時間について評価した。図１０および表５に示されるように、ＰＢＳ処置したＦＶＩＩＩノックアウトマウスは、未処置の非ノックアウトマウス（すなわちＷＴマウス）の２倍を上回る容積の血液を喪失した。しかし、ｒＡＡＶ処置したＦＶＩＩＩノックアウトマウスは、ＰＢＳ処置したマウスよりも少ない血液を喪失した。配列番号１７を含むビリオンを受けたマウスは、未処置の非ノックアウトマウスと類似の血液容積を喪失した。図１１および表６に示されるように、類似の結果が、出血時間アッセイについて観察された。配列番号１５を含むビリオンで処置したマウスについての出血時間は、出血時間および血液喪失の最も強い低減を示した。
（実施例７）
肝臓におけるＡＴＰ７Ｂ発現
Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスに、配列番号１３の制御下にＡＴＰ７Ｂを含むＡＡＶ８ベクターを静脈内注射した。ウイルス送達の２週間後、肝臓を採取した。肝臓パンチを、１０ｕｌ／ｍＬのベータ−メルカプトエタノールを補充した６００ｕｌのＲＬＴ中で破壊およびホモジナイズし、ＲＮＡを、オン−カラムＤＮａｓｅ処理を含む製造業者のプロトコルに従ってＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。各試料について、ＲＮＡ（３ｕｇ）を、ＯｌｉｇｏＤＴプライマーを使用してＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写した（６５℃ ５分、５５℃ １０分、８５℃ １０分）。ヒトＡＴＰ７Ｂに対するプライマー（５’−ＣＡＴＴＣＣＡＧＧＡＣＴＧＴＣＣＡＴＴＣＴ−３’（配列番号１８）；５’−ＧＧＣＣＴＧＡＡＣＧＴＡＧＡＡＧＴＡＣＣＡ−３’（配列番号１９））、およびＧＡＰＤＨに対するプライマー（５’ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ−３’（配列番号２０）；５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’（配列番号２１））を、検量線を用いて検証して、信頼性を確実にし、以下の増幅条件下でのｑＰＣＲ（Ｐｈｕｓｉｏｎ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）に使用した：（９８℃ ２分、４０×［９８℃ １０秒、６７℃ ３０秒、９２℃ １５秒］）。ＡＴＰ７Ｂ発現を、ＧＡＰＤＨに対して正規化し、デルタ−デルタＣｔ法を使用して、ベースラインと比べた変化倍数として表した。図１２および表７に示されるように、配列番号１３は、３つの異なる用量で肝臓においてＡＴＰ７Ｂの発現を駆動させ、最も高いウイルス用量で最も高いＡＴＰ７Ｂ発現をもたらす用量応答を示した。
実施例７は、ＡＴＰ７Ｂ導入遺伝子に作動可能に連結された本明細書に開示される１つまたは複数のＲＥを含む発現カセットが、それを必要とする動物、哺乳動物またはヒト対象において、ＡＴＰ７Ｂ欠損と関連する障害または状態、たとえば、ウィルソン病を処置するために使用することができることを示している。さらに、そのような発現カセットは、たとえば、静脈内注射または注入を介して、ｒＡＡＶ８を使用してｉｎ ｖｉｖｏで全身送達することができる。
（実施例８）
肝臓における高いＥＧＦＰ転写
Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスに、様々なＲＥ：配列番号４、１３、１４、１５、１６、１７および２７の制御下にＥＧＦＰを含むＡＡＶ８ベクターを静脈内注射した。各ＡＡＶ８ベクターを、５×１０１１ｇｃ／マウスの用量で投与した。ウイルス送達の２週間後、肝臓を採取した。肝臓パンチを、１０ｕｌ／ｍＬのベータ−メルカプトエタノールを補充した６００ｕｌのＲＬＴ中で破壊およびホモジナイズし、ＲＮＡを、オン−カラムＤＮａｓｅ処理を含む製造業者のプロトコルに従ってＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。各試料について、ＲＮＡ（３ｕｇ）を、ＯｌｉｇｏＤＴプライマーを使用してＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写した（６５℃ ５分、５５℃ １０分、８５℃ １０分）。ＥＧＦＰに対するプライマー（５’−ＧＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧ−３’（配列番号４２）；５’−ＴＣＴＴＧＴＡＧＴＴＧＣＣＧＴＣＧＴＣＣ−３’（配列番号４３））、およびＧＡＰＤＨに対するプライマー（配列番号２０および配列番号２１）を、以下の増幅条件下でのｑＰＣＲ（Ｐｈｕｓｉｏｎ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）に使用した：（９８℃ ２分、４０×［９８℃ １０秒、６５℃ ３０秒、９２℃ １５秒］）。ＥＧＦＰ発現を、ＧＡＰＤＨに対して正規化し、デルタ−デルタＣｔ法を使用して、ベースラインと比べた変化倍数として表した（図１３）。図１３に示されるように、試験したＲＥの各々は、ＲＮＡ転写物によって測定した場合、肝臓において、ＥＧＦＰ発現を増加させた。さらに、配列番号４、配列番号２７および配列番号１４は、同等のレベルのＥＧＦＰをもたらした。
実施例８は、本開示の比較的短いＲＥが、ＲＮＡ転写物によって測定した場合、肝臓において、高いレベルの導入遺伝子発現をもたらすことができることを示している。
本発明の好ましい実施形態が、本明細書に示され記載されてきたが、一方で、そのような実施形態が例のみとして提供されていることは、当業者に明らかである。多数のバリエーション、変化および置換が、本発明から逸脱することなしに当業者に想起される。本明細書に記載される発明の実施形態の様々な代替法が、本発明を実施する際に使用され得ると理解すべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲およびそれらの同等物の範囲内の方法および構造がそれによってカバーされることが意図される。
本開示の様々な実施形態は、以下の番号を付けた項を参照して定義される。
項１．治療用導入遺伝子に作動可能に連結された制御エレメントを含む発現カセットであって、制御エレメントが、（ｉ）配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１；または（ｉｉ）（ｉ）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を有する配列のうちの１つまたは複数を含む、発現カセット。
項２．制御エレメントが、天然に存在しない、項１に記載の発現カセット。
項３．制御エレメントが、イントロン配列を含む、項１〜２のいずれか一項に記載の発現カセット。
項４．制御エレメントが、プロモーターと治療用導入遺伝子との間に位置する、項１〜３のいずれか一項に記載の発現カセット。
項５．制御エレメントが、プロモーター配列を含む、項１〜２のいずれか一項に記載の発現カセット。
項６．制御エレメントが、カセット中の唯一のプロモーターである、項５に記載の発現カセット。
項７．制御エレメントが、比較的短い、項１〜６のいずれか一項に記載の発現カセット。
項８．制御エレメントが、１００ｂｐ以下である、項１〜６のいずれか一項に記載の発現カセット。
項９．制御エレメントが、６０ｂｐ以下である、項１〜８のいずれか一項に記載の発現カセット。
項１０．制御エレメントが、５０ｂｐ以下である、項１〜９のいずれか一項に記載の発現カセット。
項１１．ｒＡＡＶの一部である、項１〜１０のいずれか一項に記載の発現カセット。
項１２．ｒＡＡＶが、ｒＡＡＶ８である、項１１に記載の発現カセット。
項１３．アデノウイルスの一部である、項１〜１０のいずれか一項に記載の発現カセット。
項１４．レンチウイルスの一部である、項１〜１０のいずれか一項に記載の発現カセット。
項１５．治療用導入遺伝子が、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、５．５ｋｂ、６ｋｂ、６．５ｋｂ、７ｋｂまたは７．５ｋｂよりも大きい、項１〜１４のいずれか一項に記載の発現カセット。
項１６．治療用導入遺伝子が、ＡＴＰ７Ｂ、またはそのバリアントもしくは機能性断片である、項１〜１４のいずれか一項に記載の発現カセット。
項１７．治療用導入遺伝子が、ＡＴＰ７Ａ、またはそのバリアントもしくは機能性断片である、項１〜１４のいずれか一項に記載の発現カセット。
項１８．治療用導入遺伝子が、ＡＴＰ８Ｂ１、またはそのバリアントもしくは機能性断片である、項１〜１４のいずれか一項に記載の発現カセット。
項１９．治療用導入遺伝子が、ＡＢＣＢ４、またはそのバリアントもしくは機能性断片である、項１〜１４のいずれか一項に記載の発現カセット。
項２０．治療用導入遺伝子が、ＡＢＣＢ１１、またはそのバリアントもしくは機能性断片である、項１〜１４のいずれか一項に記載の発現カセット。
項２１．治療用導入遺伝子が、ＣＤＫＬ５、またはそのバリアントもしくは機能性断片である、項１〜１４のいずれか一項に記載の発現カセット。
項２２．治療用導入遺伝子が、ＣＮＴＮＡＰ２、またはそのバリアントもしくは機能性断片である、項１〜１４のいずれか一項に記載の発現カセット。
項２３．治療用導入遺伝子が、ＺＥＢ２、またはそのバリアントもしくは機能性断片である、項１〜１４のいずれか一項に記載の発現カセット。
項２４．治療用導入遺伝子が、第Ｖ因子、またはそのバリアントもしくは機能性断片である、項１〜１４のいずれか一項に記載の発現カセット。
項２５．治療用導入遺伝子が、第ＶＩＩＩ因子、またはそのバリアントもしくは機能性断片である、項１〜１４のいずれか一項に記載の発現カセット。
項２６．治療用導入遺伝子が、第ＩＸ因子、またはそのバリアントもしくは機能性断片である、項１〜１４のいずれか一項に記載の発現カセット。
項２７．治療用導入遺伝子が、第Ｘ因子、またはそのバリアントもしくは機能性断片である、項１〜１４のいずれか一項に記載の発現カセット。
項２８．治療用導入遺伝子が、血液凝固因子である、項１〜１４のいずれか一項に記載の発現カセット。
項２９．血液凝固因子が、第１因子、第２因子、第３因子、第４因子、第５因子、第６因子、第７因子、第８因子、第９因子、第１０因子、第１１因子もしくは第１２因子、またはそれらのバリアントもしくは機能性断片のうちのいずれか１つである、項２８に記載の発現カセット。
項３０．治療用導入遺伝子が、ＤＮＡ結合タンパク質である、項１〜１４のいずれか一項に記載の発現カセット。
項３１．ＤＮＡ結合タンパク質が、内因性遺伝子の転写モジュレーターである、項３０に記載の発現カセット。
項３２．転写モジュレーターが、転写活性化因子である、項３１に記載の発現カセット。
項３３．内因性遺伝子が、ｉｎ ｖｉｖｏで過少発現される、項３２に記載の発現カセット。
項３４．内因性遺伝子が、肝臓の疾患または状態と関連する、項３０〜３３のいずれか一項に記載の発現カセット。
項３５．内因性遺伝子が、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（ＰＦＩＣ）１型、２型または３型と関連する、項３０〜３３のいずれか一項に記載の発現カセット。
項３６．内因性遺伝子が、自閉症スペクトラム障害と関連する、項３０〜３３のいずれか一項に記載の発現カセット。
項３７．内因性遺伝子が、血友病と関連する、項３０〜３３のいずれか一項に記載の発現カセット。
項３８．内因性遺伝子が、ウィルソン病と関連する、項３０〜３３のいずれか一項に記載の発現カセット。
項３９．内因性遺伝子が、メンケス病またはオクシピタル・ホーン症候群と関連する、項３０〜３３のいずれか一項に記載の発現カセット。
項４０．内因性遺伝子が、ＣＤＫＬ５である、項３０〜３３のいずれか一項に記載の発現カセット。
項４１．内因性遺伝子が、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症２型（ＰＦＩＣ２）と関連するＡＢＣＢ１１である、項３５に記載の発現カセット。
項４２．内因性遺伝子が、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症１型（ＰＦＩＣ１）と関連するＡＴＰ８Ｂ１である、項３５に記載の発現カセット。
項４３．内因性遺伝子が、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症３型（ＰＦＩＣ３）と関連するＡＢＣＢ４である、項３５に記載の発現カセット。
項４４．内因性遺伝子が、自閉症スペクトラム障害と関連するＣＮＴＮＡＰ２である、項３６に記載の発現カセット。
項４５．内因性遺伝子が、血友病Ａと関連する第ＶＩＩＩ因子またはそのバリアントである、項３７に記載の発現カセット。
項４６．内因性遺伝子が、血友病Ｂと関連する第ＩＸ因子またはそのバリアントである、項３７に記載の発現カセット。
項４７．内因性遺伝子が、第１因子、第２因子、第３因子、第４因子、第５因子、第６因子、第７因子、第８因子、第９因子、第１０因子、第１１因子または第１２因子のうちのいずれか１つである、項３７に記載の発現カセット。
項４８．内因性遺伝子が、ウィルソン病と関連するＡＴＰ７Ｂまたはそのバリアントである、項３８に記載の発現カセット。
項４９．内因性遺伝子が、メンケス病またはオクシピタル・ホーン症候群と関連するＡＴＰ７Ａまたはそのバリアントである、項３９に記載の発現カセット。
項５０．治療用導入遺伝子が、遺伝子編集タンパク質である、項１〜１４のいずれか一項に記載の発現カセット。
項５１．遺伝子編集タンパク質が、Ｃａｓタンパク質である、項５０に記載の発現カセット。
項５２．内因性遺伝子を含むゲノム遺伝子座にＣａｓタンパク質を標的化するガイドＲＮＡをさらに含む、項５１に記載の発現カセット。
項５３．内因性遺伝子が、突然変異を含む、または異常に発現される、項５２に記載の発現カセット。
項５４．突然変異が、内因性遺伝子の過小発現をもたらす、項５３に記載の発現カセット。
項５５．内因性遺伝子が、ＡＴＰ７Ａ、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、ＣＤＫＬ５、ＣＮＴＮＡＰ２、ＺＥＢ２または第ＶＩＩＩ因子である、項５１〜５４のいずれか一項に記載の発現カセット。
項５６．内因性遺伝子が、第１因子、第２因子、第３因子、第４因子、第５因子、第６因子、第７因子、第８因子、第９因子、第１０因子、第１１因子または第１２因子である、項５１〜５４のいずれか一項に記載の発現カセット。
項５７．制御エレメントが、制御エレメントなしの発現カセットと比較して、治療用導入遺伝子または内因性遺伝子の、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍または少なくとも１０００倍増加した発現をもたらす、項１〜５６のいずれか一項に記載の発現カセット。
項５８．増加した発現が、ＰＣＲアッセイを使用して、治療用導入遺伝子または内因性遺伝子からのＲＮＡ転写物の量によって判定される、項５７に記載の発現カセット。
項５９．増加した発現が、イムノアッセイを使用して、治療用導入遺伝子または内因性遺伝子から合成されたタンパク質のレベルによって判定される、項５７に記載の発現カセット。
項６０．制御エレメントが、制御エレメントなしの発現カセットと比較して、内因性遺伝子の、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍または少なくとも１０００倍増加した発現をもたらす、項３０〜５６のいずれか一項に記載の発現カセット。
項６１．制御エレメントが、健康な対象における内因性遺伝子の発現と同等のレベルで、内因性遺伝子の増加した発現をもたらす、項３０〜５６のいずれか一項に記載の発現カセット。
項６２．増加した発現が、ＰＣＲアッセイを使用して、内因性遺伝子からのＲＮＡ転写物の量によって判定される、項６０〜６１のいずれか一項に記載の発現カセット。
項６３．増加した発現が、イムノアッセイを使用して、内因性遺伝子から合成されたタンパク質のレベルによって判定される、項６０〜６１のいずれか一項に記載の発現カセット。
項６４．項１〜１６、３０〜３４、３８、４８、５０〜５５および５７〜６３に記載の発現カセットを投与することを含む、ウィルソン病を処置する方法。
項６５．項１〜１６、３０〜３４、３８、４８、５０〜５５および５７〜６３のいずれか一項に記載の発現カセットを投与することを含む、ＡＴＰ７Ｂにおける遺伝的欠陥を処置する方法。
項６６．項１〜１５、２４〜３４、３７、４５〜４７および５０〜６３のいずれか一項に記載の発現カセットを投与することを含む、血液凝固障害を処置する方法。
項６７．項１〜６６のいずれか一項に記載の発現カセットを投与することを含む、ハプロ不全または遺伝的欠陥を処置する方法。
項６８．治療用導入遺伝子または内因性遺伝子が、ＡＴＰ７Ａ、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、ＣＤＫＬ５、ＣＮＴＮＡＰ２、ＺＥＢ２もしくは第ＶＩＩＩ因子、またはそれらのバリアントである、項６７に記載の方法。
項６９．治療用導入遺伝子または内因性遺伝子が、第１因子、第２因子、第３因子、第４因子、第５因子、第６因子、第７因子、第８因子、第９因子、第１０因子、第１１因子もしくは第１２因子、またはそれらのバリアントである、項６７に記載の方法。
項７０．導入遺伝子が、ＡＴＰ７Ｂ、またはそのバリアントもしくは機能性断片である、項６７または６８に記載の方法。
項７１．導入遺伝子が、内因性遺伝子の発現をモジュレートする転写モジュレーターである、項６７または６８に記載の方法。
項７２．内因性遺伝子が、ＡＴＰ７Ａ、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、ＣＤＫＬ５、ＣＮＴＮＡＰ２、ＺＥＢ２もしくは第ＶＩＩＩ因子、またはそれらのバリアントである、項７１に記載の方法。
項７３．細胞中に項１〜６３のいずれか一項に記載の発現カセットを導入することを含む、組換えタンパク質または生物製剤を産生する方法。
項７４．少なくとも３ｋｂの導入遺伝子に作動可能に連結された１２０ｂｐ以下のヒト由来制御エレメントを含むＡＡＶ発現カセットであって、制御エレメントが、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結された場合の導入遺伝子の発現と比較して少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍または少なくとも１０００倍増加した導入遺伝子発現をもたらす、ＡＡＶ発現カセット。
項７５．少なくとも３ｋｂの導入遺伝子に作動可能に連結された比較的短いヒト由来制御エレメントを含むＡＡＶ発現カセットであって、比較的短い制御エレメントが、制御エレメントなしの同等の発現カセットと比較して少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍または少なくとも１０００倍増加した導入遺伝子発現をもたらす、ＡＡＶ発現カセット。
項７６．制御エレメントが、（ｉ）配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１；（ｉｉ）それらの組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を有する配列を含む、項７４または７５に記載のＡＡＶ発現カセット。
項７７．増加した導入遺伝子発現が、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結された場合の導入遺伝子の発現と比較して少なくとも５０倍である、項７４〜７６のいずれか一項に記載のＡＡＶ発現カセット。
項７８．増加した導入遺伝子発現が、少なくとも１００倍である、項７７に記載のＡＡＶ発現カセット。
項７９．制御エレメントが、導入遺伝子に作動可能に連結されたＣＭＶプロモーターのサイズ正規化された発現活性と比較して少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍または少なくとも１００倍であるサイズ正規化された発現活性を呈する、項７４〜７８のいずれか一項に記載のＡＡＶ発現カセット。
項８０．増加した導入遺伝子発現が、少なくとも２つの細胞型において生じる、項７４〜７９のいずれか一項に記載のＡＡＶ発現カセット。
項８１．少なくとも２つの細胞型が、腎臓細胞、上皮細胞、ニューロンおよび肝臓細胞からなる群から選択される、項８０に記載のＡＡＶ発現カセット。
項８２．制御エレメントが、配列番号２２〜４１のうちのいずれか１つまたは複数を含み、他のプロモーター配列が、発現カセット中に存在しない、項７４〜８１のいずれか一項に記載のＡＡＶ発現カセット。
項８３．制御エレメントが、配列番号１または配列番号２を含む、項７４〜８２のいずれか一項に記載のＡＡＶ発現カセット。
項８４．制御エレメントが、プロモーターの下流に位置する、項８３に記載のＡＡＶ発現カセット。
項８５．制御エレメントが、導入遺伝子の上流に位置する、項７４〜８４のいずれか一項に記載のＡＡＶ発現カセット。
項８６．導入遺伝子が、ＡＴＰ７Ａ；ＡＴＰ７Ｂ；ＡＴＰ８Ｂ１；ＡＢＣＢ４；ＡＢＣＢ１１；ＣＤＫＬ５；ＣＮＴＮＡＰ２；ＺＥＢ２；第１因子、第２因子、第３因子、第４因子、第５因子、第６因子、第７因子、第８因子、第９因子、第１０因子、第１１因子もしくは第１２因子；またはそれらのバリアントもしくは機能性断片である、項７４〜８５のいずれか一項に記載のＡＡＶ発現カセット。
項８７．導入遺伝子が、ＡＴＰ７Ｂ、またはそのバリアントもしくは機能性断片である、項８６に記載のＡＡＶ発現カセット。
項８８．導入遺伝子が、ＦＶＩＩＩ、またはそのバリアントもしくは機能性断片である、項８６に記載のＡＡＶ発現カセット。
項８９．導入遺伝子が、遺伝子編集タンパク質である、項７４〜８５のいずれか一項に記載のＡＡＶ発現カセット。
項９０．遺伝子編集タンパク質が、Ｃａｓである、項８９に記載のＡＡＶ発現カセット。
項９１．導入遺伝子が、ＤＮＡ結合タンパク質である、項７４〜８５のいずれか一項に記載のＡＡＶ発現カセット。
項９２．ＤＮＡ結合タンパク質が、内因性遺伝子の発現を増加させる転写活性化因子である、項９１に記載のＡＡＶ発現カセット。
項９３．ＤＮＡ結合タンパク質が、内因性遺伝子の発現を減少させる転写抑制因子である、項９１に記載のＡＡＶ発現カセット。
項９４．転写活性化因子が、ＡＴＰ７Ａ；ＡＴＰ７Ｂ；ＡＴＰ８Ｂ１；ＡＢＣＢ４；ＡＢＣＢ１１；ＣＤＫＬ５；ＣＮＴＮＡＰ２；ＺＥＢ２；または第１因子、第２因子、第３因子、第４因子、第５因子、第６因子、第７因子、第８因子、第９因子、第１０因子、第１１因子もしくは第１２因子、あるいはそれらのバリアントの発現を増加させる、項９２に記載のＡＡＶ発現カセット。
項９５．転写活性化因子が、内因性ＡＴＰ７Ａの発現を増加させる、項９４に記載のＡＡＶ発現カセット。
項９６．転写活性化因子が、内因性ＡＴＰ７Ｂの発現を増加させる、項９４に記載のＡＡＶ発現カセット。
項９７．転写活性化因子が、内因性ＡＴＰ８Ｂ１の発現を増加させる、項９４に記載のＡＡＶ発現カセット。
項９８．転写活性化因子が、内因性ＡＢＣＢ４の発現を増加させる、項９４に記載のＡＡＶ発現カセット。
項９９．転写活性化因子が、内因性ＡＢＣＢ１１の発現を増加させる、項９４に記載のＡＡＶ発現カセット。
項１００．転写活性化因子が、内因性ＦＶＩＩＩの発現を増加させる、項９４に記載のＡＡＶ発現カセット。
項１０１．ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ−ＤＪおよびｓｃＡＡＶからなる群から選択される、項７４〜１００のいずれか一項に記載のＡＡＶ発現カセット。
項１０２．ＡＡＶが、ＡＡＶ８である、項１０１に記載のＡＡＶ発現カセット。
項１０３．組換えタンパク質を産生する方法であって、タンパク質をコードする配列を、（ｉ）配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１；（ｉｉ）それらの組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を有する配列のうちの１つまたは複数に作動可能に連結させることを含む、方法。
項１０４．タンパク質をコードする配列が、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、５．５ｋｂ、６ｋｂ、６．５ｋｂ、７ｋｂまたは７．５ｋｂを上回る、項１０３に記載の方法。
項１０５．肝臓の疾患または状態を処置する方法であって、（ｉ）配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１；（ｉｉ）それらの組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を有する配列から選択される１つまたは複数の制御エレメントに作動可能に連結された治療用導入遺伝子を含む遺伝子療法を投与することを含む、方法。
項１０６．肝臓の疾患または状態が、ウィルソン病である、項１０５に記載の方法。
項１０７．肝臓の疾患または状態が、血液凝固障害である、項１０５に記載の方法。
項１０８．導入遺伝子が、ＡＴＰ７ＡもしくはＡＴＰ７Ｂ、またはそれらのバリアントもしくは機能性断片である、項１０５に記載の方法。
項１０９．導入遺伝子が、第１因子、第２因子、第３因子、第４因子、第５因子、第６因子、第７因子、第８因子、第９因子、第１０因子、第１１因子、第１２因子、またはそれらのバリアントもしくは機能性断片である、項１０５に記載の方法。
項１１０．導入遺伝子が、第８因子、またはそのバリアントもしくは機能性断片である、項１０９に記載の方法。
項１１１．制御エレメントが、少なくとも２つの細胞型において増加した導入遺伝子発現をもたらす、項１０５〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
項１１２．制御エレメントが、少なくとも３つの細胞型において増加した導入遺伝子発現をもたらす、項１５０〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
項１１３．制御エレメントが、肝細胞において増加した導入遺伝子発現をもたらす、項１０５〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
項１１４．制御エレメントが、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結された場合の導入遺伝子の発現と比較して少なくとも２倍であるレベルで、増加した導入遺伝子発現をもたらす、項１０５〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
項１１５．遺伝子療法が、ＡＡＶを利用する、項１０５〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
項１１６．ＡＡＶが、ＡＡＶ８である、項１１５に記載の方法。
項１１７．遺伝子療法が、アデノウイルスを利用する、項１０５〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
項１１８．遺伝子療法が、レンチウイルスを利用する、項１０５〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
項１１９．導入遺伝子に作動可能に連結された１００ｂｐ未満であるかまたはそれと等しいｂｐを有するヒト由来制御エレメントを含む発現ベクターであって、制御エレメントが、制御エレメントなしの第２の発現ベクターと比較して、導入遺伝子の全体的発現を少なくとも２倍増加させる、発現ベクター。
項１２０．第２の発現ベクターが、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子を含む、項１１９に記載の発現ベクター。
項１２１．導入遺伝子に作動可能に連結された１００ｂｐ未満であるかまたはそれと等しいｂｐを有するヒト由来制御エレメントを含む発現ベクターであって、ここで、導入遺伝子の発現が、ＣＭＶプロモーター、スーパーコアプロモーター、ＴＴＲプロモーター、Ｐｒｏｔｏ１プロモーター、ＵＣＬ−ＨＬＰプロモーターまたはＣＭＶｅプロモーターによって発現される同じ導入遺伝子の発現よりも高い、発現ベクター。
項１２２．導入遺伝子の発現が、ＵＣＬ−ＨＬＰプロモーターによって発現される同じ導入遺伝子の発現よりも高い、項１２１に記載の発現ベクター。
項１２３．導入遺伝子に作動可能に連結されたヒト由来制御エレメントを含む発現ベクターであって、導入遺伝子によってコードされるタンパク質が、（ｉ）導入遺伝子を検出するように構成されたＥＬＩＳＡアッセイによって測定した場合に、濃度＞１．０ＩＵ／ｍＬ；または（ｉｉ）Ｃｏａｔｅｓｔアッセイによって測定した場合に、＞２５％の活性を有する、発現ベクター。
項１２４．細胞中でもｉｎ ｖｉｖｏでも制御エレメントと関連して見出されない導入遺伝子に作動可能に連結された、サイズが１００ｂｐ未満であるかまたはそれと等しい配列を有するヒト由来制御エレメントを含む、ベクター。
項１２５．制御エレメントが、イントロン配列である、項１１９〜１２４のいずれか一項に記載のベクター。
項１２６．制御エレメントが、配列番号１もしくは配列番号２、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％の相同性を有する配列である、項１２５に記載のベクター。
項１２７．導入遺伝子としてのルシフェラーゼの使用が、マウス全体で測定した場合に、１×１０８光子／秒よりも高い全体的発現をもたらす、項１〜６３、７４〜１０２および１１９〜１２６のいずれか一項に記載の発現ベクターまたはカセット。
項１２８．活性または導入遺伝子発現が、１マウス当たり、１６μｇの用量の発現ベクターに対応する、項１２７に記載の発現ベクターまたはカセット。
項１２９．活性または導入遺伝子発現が、１マウス当たり１２μｇの用量の発現ベクターに対応する、項１２７に記載の発現ベクターまたはカセット。
項１３０．内因性バージョンの導入遺伝子が、ｉｎ ｖｉｖｏでは制御エレメントに連結されない、項１〜６３、７４〜１０２、および１１９〜１２９のいずれか一項に記載の発現ベクターまたはカセット。
項１３１．導入遺伝子の全体的発現が、ＣＭＶプロモーター、ＣＭＶｅプロモーター、スーパーコアプロモーター、ＴＴＲプロモーター、Ｐｒｏｔｏ１プロモーターおよびＵＣＬ−ＨＬＰプロモーターからなる群から選択される制御エレメントを有するベクターまたはカセットを使用した導入遺伝子の発現よりも高いレベルである、項１２７に記載の発現ベクターまたはカセット。
項１３２．発現が、マウスにおける少なくとも３、４、５、６または７つの異なる細胞型においてｉｎ ｖｉｖｏで検出可能である、項１〜６３、７４〜１０２、および１１９〜１３１のいずれか一項に記載の発現ベクターまたはカセット。
項１３３．異なる細胞型が、肺胞細胞、心筋細胞、上皮細胞、肝細胞、腸細胞、筋細胞、ニューロンおよび腎細胞からなる群から選択される、項１３２に記載の発現ベクターまたはカセット。
項１３４．制御エレメントが、エンハンサーである、項１１９〜１３３のいずれか一項に記載の発現ベクターまたはカセット。
項１３５．プロモーターをさらに含む、項１３４に記載の発現ベクターまたはカセット。
項１３６．プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、ＣＭＶ、プロモーター、スーパーコアプロモーター、ＴＴＲプロモーター、Ｐｒｏｔｏ１プロモーター、ＵＣＬ−ＨＬＰプロモーター、ＡＡＴプロモーター、ＫＡＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＥＦＳプロモーターまたはＣＭＶｅエンハンサー／ＣＭＶプロモーター組合せである、項１３５に記載の発現ベクターまたはカセット。
項１３７．１つまたは複数の転写後修飾部位をさらに含む、項１１９〜１３６のいずれか一項に記載の発現ベクター。
項１３８．導入遺伝子が、Ｃａｓ９である、項１１９〜１３７のいずれか一項に記載の発現ベクター。
項１３９．導入遺伝子が、ｓａＣａｓ９である、項１３８に記載の発現ベクター。
項１４０．細胞中でまたはｉｎ ｖｉｖｏで第ＶＩＩＩ因子を検出するように構成されたＥＬＩＳＡアッセイによって測定した場合に、第ＶＩＩＩ因子の発現を濃度＞１．０ＩＵ／ｍＬまで駆動させることができる制御配列に作動可能に連結された第ＶＩＩＩ因子導入遺伝子を含む、発現ベクター。
項１４１．制御配列が、比較的短い、項１４０に記載の発現ベクター。
項１４２．制御配列が、配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１、もしくはそれらの組合せ；またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性を有する配列のうちの１つまたは複数を含む、項１４０または１４１に記載の発現ベクター。
項１４３．項１１９〜１４２のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む、ウイルス粒子。
項１４４．ＡＡＶである、項１４３に記載のウイルス粒子。
項１４５．ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ−ＤＪおよびｓｃＡＡＶからなる群から選択される、項１４４に記載のウイルス粒子。
項１４６．レンチウイルスである、項１４３に記載のウイルス粒子。
項１４７．アデノウイルスである、項１４３に記載のウイルス粒子。
項１４８．導入遺伝子が、治療用導入遺伝子である、項１１９〜１４７に記載の発現ベクター。
項１４９．治療用導入遺伝子が、第ＶＩＩＩ因子、Ｃａｓ９、ＤＮＡ結合タンパク質、ホルモン、増殖もしくは分化因子、インスリン、成長ホルモン、ＶＥＧＦ、神経栄養因子、線維芽細胞上皮因子；サイトカイン、インターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子、抗体、免疫グロブリン、インターフェロン、キメラＴ細胞受容体；リポタンパク質受容体、嚢胞性線維症膜貫通制御因子、ムコ多糖症Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型もしくはＩＶ型と関連する遺伝子、ベータグロビンまたはリポタンパク質リパーゼである、項１４８に記載の発現ベクター。
項１５０．治療用導入遺伝子が、ＡＴＰ７Ａ、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはそれらのバリアントもしくは機能性断片である、項１４８に記載の発現ベクター。
項１５１．治療用導入遺伝子が、ＣＤＫＬ５、ＣＮＴＮＡＰ２、ＺＥＢ２、またはそれらのバリアントもしくは機能性断片である、項１４８に記載の発現ベクター。
項１５２．動物中の複数の異なる組織に導入遺伝子を送達するための方法であって、前記動物に、項１１９〜１５１のいずれか一項に記載の発現ベクターを投与することを含む、方法。
項１５３．タンパク質、抗体または他の生物製剤の産生のための方法であって、細胞を、項１１９〜１５１のいずれか一項に記載の発現ベクターと接触させることを含む、方法。
項１５４．細胞が、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、項１５３に記載の方法。
項１５５．トランスジェニック動物または植物を産生するための方法であって、動物または植物に、項１１９〜１５１のいずれか一項に記載の発現ベクターを投与することを含む、方法。
項１５６．制御エレメントが、４０〜５０ｂｐである、項１１９〜１５１のいずれか一項に記載の発現ベクター。
項１５７．制御エレメントが、５０〜６０ｂｐである、項１１９〜１５１のいずれか一項に記載の発現ベクター。
項１５８．導入遺伝子に作動可能に連結されたヒト由来制御エレメントを含む発現ベクターであって、導入遺伝子によってコードされるタンパク質が、（ｉ）導入遺伝子を検出するように構成されたＥＬＩＳＡアッセイによって測定した場合に、濃度＞０．１ＩＵ／ｍＬ；または（ｉｉ）Ｃｏａｔｅｓｔアッセイによって測定した場合に、＞１０％の活性を有する、発現ベクター。
項１５９．導入遺伝子に作動可能に連結された１２０ｂｐ未満であるかまたはそれと等しいｂｐを有するヒト由来制御エレメントを含む発現ベクターであって、ここで、導入遺伝子の発現が、ＵＣＬ−ＨＬＰプロモーターによって発現される同じ導入遺伝子の発現よりも高い、発現ベクター。
項１６０．制御エレメントが、プロモーターである、項１５８〜１５９のいずれか一項に記載の発現ベクター。
項１６１．治療用導入遺伝子が、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写制御ドメインを含む融合タンパク質である、項１５８〜１６０のいずれか一項に記載の発現ベクター。
項１６２．治療用導入遺伝子に作動可能に連結された比較的短い制御エレメント（ＲＥ）を含む、発現カセット。
項１６３．比較的短いＲＥが、（ｉ）配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１；または（ｉｉ）（ｉ）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％もしくは９５％の配列同一性を有する配列のうちの１つまたは複数を含む、項１６２に記載の発現カセット。
項１６４．投与することが、全身である、項６４〜７２および１０５〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
項１６５．投与することが、対象における静脈内注射または注入を含む、項１６４に記載の方法。
項１６６．対象が、ヒトである、項１６５に記載の方法。
項１６７．対象が、動物である、項１６５に記載の方法。

Claims (126)

  1. 治療用導入遺伝子に作動可能に連結された制御エレメントを含む発現カセットであって、前記制御エレメントが、（ｉ）配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１；または（ｉｉ）（ｉ）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列のうちの１つまたは複数を含む、発現カセット。
  2. 前記制御エレメントが、天然に存在しない、請求項１に記載の発現カセット。
  3. 前記制御エレメントが、イントロン配列を含む、請求項１に記載の発現カセット。
  4. 前記制御エレメントが、プロモーターと前記治療用導入遺伝子との間に位置する、請求項３に記載の発現カセット。
  5. 前記制御エレメントが、プロモーター配列を含む、請求項１に記載の発現カセット。
  6. 前記制御エレメントが、前記カセット中の唯一のプロモーターである、請求項５に記載の発現カセット。
  7. 前記制御エレメントが、１００ｂｐ以下である、請求項１に記載の発現カセット。
  8. 前記制御エレメントが、６０ｂｐ以下である、請求項１に記載の発現カセット。
  9. 前記制御エレメントが、５０ｂｐ以下である、請求項１に記載の発現カセット。
  10. 前記発現カセットが、ｒＡＡＶの一部である、請求項１に記載の発現カセット。
  11. 前記ｒＡＡＶが、ｒＡＡＶ８である、請求項１に記載の発現カセット。
  12. 前記治療用導入遺伝子が、ＡＴＰ７Ｂまたはそのバリアントである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の発現カセット。
  13. 前記治療用導入遺伝子が、第ＶＩＩＩ因子またはそのバリアントである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の発現カセット。
  14. 請求項１から１１のいずれか一項に記載の発現カセットを投与することを含む、ウィルソン病を処置する方法であって、前記導入遺伝子が、ＡＴＰ７Ｂまたはそのバリアントである、方法。
  15. 請求項１から１１のいずれか一項に記載の発現カセットを投与することを含む、ＡＴＰ７Ｂにおける遺伝的欠陥を処置する方法であって、前記導入遺伝子が、ＡＴＰ７Ｂまたはそのバリアントである、方法。
  16. 請求項１から１１のいずれか一項に記載の発現カセットを投与することを含む、血液凝固障害を処置する方法であって、前記導入遺伝子が、第ＶＩＩＩ因子またはそのバリアントである、方法。
  17. 請求項１から１１のいずれか一項に記載の発現カセットを投与することを含む、ハプロ不全または遺伝的欠陥を処置する方法。
  18. 前記導入遺伝子が、ＡＴＰ７Ａまたはそのバリアントである、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記導入遺伝子が、ＡＴＰ７Ｂまたはそのバリアントである、請求項１７に記載の方法。
  20. 前記導入遺伝子が、ＡＴＰ８Ｂ１またはそのバリアントである、請求項１７に記載の方法。
  21. 前記導入遺伝子が、ＡＢＣＢ４またはそのバリアントである、請求項１７に記載の方法。
  22. 前記導入遺伝子が、ＡＢＣＢ１１またはそのバリアントである、請求項１７に記載の方法。
  23. 前記導入遺伝子が、ＣＤＫＬ５またはそのバリアントである、請求項１７に記載の方法。
  24. 前記導入遺伝子が、ＣＮＴＮＡＰ２またはそのバリアントである、請求項１７に記載の方法。
  25. 前記導入遺伝子が、ＺＥＢ２またはそのバリアントである、請求項１７に記載の方法。
  26. 前記導入遺伝子が、第Ｖ因子またはそのバリアントである、請求項１７に記載の方法。
  27. 前記導入遺伝子が、第ＶＩＩ因子またはそのバリアントである、請求項１７に記載の方法。
  28. 前記導入遺伝子が、第ＶＩＩＩ因子またはそのバリアントである、請求項１７に記載の方法。
  29. 前記導入遺伝子が、第ＩＸ因子またはそのバリアントである、請求項１７に記載の方法。
  30. 前記導入遺伝子が、第ＸＩ因子またはそのバリアントである、請求項１７に記載の方法。
  31. 請求項１から１１のいずれか一項に記載の発現カセットを投与することを含む、ハプロ不全または遺伝的欠陥を処置する方法であって、前記導入遺伝子が、内因性遺伝子の発現をモジュレートする転写モジュレーターである、方法。
  32. 前記転写モジュレーターが、前記内因性遺伝子の転写活性化因子である、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記内因性遺伝子が、ＡＴＰ７Ａである、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記内因性遺伝子が、ＡＴＰ７Ｂである、請求項３２に記載の方法。
  35. 前記内因性遺伝子が、ＡＴＰ８Ｂ１である、請求項３２に記載の方法。
  36. 前記内因性遺伝子が、ＡＢＣＢ４である、請求項３２に記載の方法。
  37. 前記内因性遺伝子が、ＡＢＣＢ１１である、請求項３２に記載の方法。
  38. 前記内因性遺伝子が、ＣＤＫＬ５である、請求項３２に記載の方法。
  39. 前記内因性遺伝子が、ＣＮＴＮＡＰ２である、請求項３２に記載の方法。
  40. 前記内因性遺伝子が、ＺＥＢ２である、請求項３２に記載の方法。
  41. 前記導入遺伝子が、第Ｖ因子である、請求項３２に記載の方法。
  42. 前記導入遺伝子が、第ＶＩＩ因子である、請求項３２に記載の方法。
  43. 前記導入遺伝子が、第ＶＩＩＩ因子である、請求項３２に記載の方法。
  44. 前記導入遺伝子が、第ＩＸ因子である、請求項３２に記載の方法。
  45. 前記導入遺伝子が、第ＸＩ因子である、請求項３２に記載の方法。
  46. 少なくとも３ｋｂの導入遺伝子に作動可能に連結された１２０ｂｐ以下のヒト由来制御エレメントを含むＡＡＶ発現カセットであって、前記制御エレメントが、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結された場合の前記導入遺伝子の発現と比較して少なくとも２倍増加した導入遺伝子発現をもたらす、ＡＡＶ発現カセット。
  47. 前記制御エレメントが、（ｉ）配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１；（ｉｉ）それらの組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項４６に記載のＡＡＶ発現カセット。
  48. 前記増加した導入遺伝子発現が、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結された場合の前記導入遺伝子の発現と比較して少なくとも５０倍である、請求項４６に記載のＡＡＶ発現カセット。
  49. 前記増加した導入遺伝子発現が、少なくとも１００倍である、請求項４６に記載のＡＡＶ発現カセット。
  50. 前記制御エレメントが、前記導入遺伝子に作動可能に連結されたＣＭＶプロモーターのサイズ正規化された発現活性と比較して少なくとも１．５倍であるサイズ正規化された発現活性を呈する、請求項４６に記載のＡＡＶ発現カセット。
  51. 前記増加した導入遺伝子発現が、少なくとも２つの異なる細胞型において生じる、請求項４６に記載のＡＡＶ発現カセット。
  52. 前記少なくとも２つの異なる細胞型が、腎臓細胞、ニューロンおよび肝臓細胞から選択される、請求項５１に記載のＡＡＶ発現カセット。
  53. 前記制御エレメントが、配列番号２２〜４１のうちのいずれか１つまたは複数を含み、他のプロモーター配列が、前記発現カセット中に存在しない、請求項４６に記載のＡＡＶ発現カセット。
  54. 前記制御エレメントが、配列番号１または配列番号２を含む、請求項４６に記載のＡＡＶ発現カセット。
  55. 前記制御エレメントが、プロモーターの下流に位置する、請求項５４に記載のＡＡＶ発現カセット。
  56. 前記導入遺伝子が、ＡＴＰ７ａ；ＡＴＰ７Ｂ；ＡＴＰ８Ｂ１；ＡＢＣＢ４；ＡＢＣＢ１１；ＣＤＫＬ５；ＣＮＴＮＡＰ２；ＺＥＢ２；第１因子、第２因子、第３因子、第４因子、第５因子、第６因子、第７因子、第８因子、第９因子、第１０因子、第１１因子および第１２因子；またはそれらのバリアントもしくは機能性断片のうちのいずれか１つである、請求項４６に記載のＡＡＶ発現カセット。
  57. 前記導入遺伝子が、ＡＴＰ７Ｂまたはそのバリアントである、請求項４６に記載のＡＡＶ発現カセット。
  58. 前記導入遺伝子が、ＦＶＩＩＩまたはそのバリアントである、請求項４６に記載のＡＡＶ発現カセット。
  59. 前記導入遺伝子が、遺伝子編集タンパク質である、請求項４６に記載のＡＡＶ発現カセット。
  60. 前記遺伝子編集タンパク質が、Ｃａｓである、請求項５９に記載のＡＡＶ発現カセット。
  61. 前記導入遺伝子が、ＤＮＡ結合タンパク質である、請求項４６に記載のＡＡＶ発現カセット。
  62. 前記ＤＮＡ結合タンパク質が、内因性遺伝子の発現を増加させる転写活性化因子である、請求項６１に記載のＡＡＶ発現カセット。
  63. 前記導入遺伝子が、内因性遺伝子の発現を減少させる転写抑制因子である、請求項６１に記載のＡＡＶ発現カセット。
  64. 前記転写活性化因子が、以下の内因性遺伝子：ＡＴＰ７Ａ；ＡＴＰ７Ｂ；ＡＴＰ８Ｂ１；ＡＢＣＢ４；ＡＢＣＢ１１；ＣＤＫＬ５；ＣＮＴＮＡＰ２；ＺＥＢ２；ならびに第１因子、第２因子、第３因子、第４因子、第５因子、第６因子、第７因子、第８因子、第９因子、第１０因子、第１１因子および第１２因子のうちのいずれか１つの発現を増加させる、請求項６２に記載のＡＡＶ発現カセット。
  65. 前記転写活性化因子が、内因性ＡＴＰ７Ａの発現を増加させる、請求項６２に記載のＡＡＶ発現カセット。
  66. 前記転写活性化因子が、内因性ＡＴＰ７Ｂの発現を増加させる、請求項６２に記載のＡＡＶ発現カセット。
  67. 前記転写活性化因子が、内因性ＡＴＰ８Ｂ１の発現を増加させる、請求項６２に記載のＡＡＶ発現カセット。
  68. 前記転写活性化因子が、内因性ＡＢＣＢ４の発現を増加させる、請求項６２に記載のＡＡＶ発現カセット。
  69. 前記転写活性化因子が、内因性ＡＢＣＢ１１の発現を増加させる、請求項６２に記載のＡＡＶ発現カセット。
  70. 前記転写活性化因子が、内因性ＦＶＩＩＩの発現を増加させる、請求項６２に記載のＡＡＶ発現カセット。
  71. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ−ＤＪおよびｓｃＡＡＶからなる群から選択される、請求項４６から７０のいずれか一項に記載のＡＡＶ発現カセット。
  72. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ８である、請求項７１に記載のＡＡＶ発現カセット。
  73. 組換えタンパク質を産生する方法であって、前記タンパク質をコードする配列を、（ｉ）配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１；（ｉｉ）それらの組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列のうちの１つまたは複数に作動可能に連結させることを含む、方法。
  74. 肝臓の疾患または状態を処置する方法であって、（ｉ）配列番号１〜２、１３〜１７および２２〜４１；（ｉｉ）それらの組合せ；または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列から選択される１つまたは複数の制御エレメントに作動可能に連結された治療用導入遺伝子を含む遺伝子療法を投与することを含む、方法。
  75. 前記肝臓の疾患または状態が、ウィルソン病である、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記肝臓の疾患または状態が、血液凝固障害である、請求項７４に記載の方法。
  77. 前記導入遺伝子が、ＡＴＰ７ＡもしくはＡＴＰ７Ｂ、またはそれらのバリアントもしくは機能性断片である、請求項７５に記載の方法。
  78. 前記導入遺伝子が、第１因子、第２因子、第３因子、第４因子、第５因子、第６因子、第７因子、第８因子、第９因子、第１０因子、第１１因子、第１２因子、またはそれらのバリアントもしくは機能性断片である、請求項７６に記載の方法。
  79. 前記導入遺伝子が、第８因子、またはそのバリアントもしくは機能性断片である、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記制御エレメントが、少なくとも２つの細胞型において増加した導入遺伝子発現をもたらす、請求項７４に記載の方法。
  81. 前記制御エレメントが、少なくとも３つの細胞型において増加した導入遺伝子発現をもたらす、請求項７４に記載の方法。
  82. 前記制御エレメントが、肝細胞において増加した導入遺伝子発現をもたらす、請求項７４に記載の方法。
  83. 前記制御エレメントが、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結された場合の前記導入遺伝子の発現と比較して少なくとも２倍であるレベルの、増加した導入遺伝子発現をもたらす、請求項７４から８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記遺伝子療法が、ＡＡＶを利用する、請求項７４に記載の方法。
  85. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ８である、請求項８４に記載の方法。
  86. 導入遺伝子に作動可能に連結された１００ｂｐ未満であるかまたはそれと等しいｂｐを有するヒト由来制御エレメントを含む発現ベクターであって、前記制御エレメントが、前記制御エレメントなしの第２の発現ベクターと比較して、前記導入遺伝子の全体的発現を少なくとも２倍増加させる、発現ベクター。
  87. 前記第２の発現ベクターが、ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結された前記導入遺伝子を含む、請求項８６に記載の発現ベクター。
  88. 導入遺伝子に作動可能に連結された１００ｂｐ未満であるかまたはそれと等しいｂｐを有するヒト由来制御エレメントを含む発現ベクターであって、それにより、前記導入遺伝子の発現が、ＣＭＶプロモーター、スーパーコアプロモーター、ＴＴＲプロモーター、Ｐｒｏｔｏ１プロモーター、ＵＣＬ−ＨＬＰプロモーターまたはＣＭＶｅプロモーターによって発現される同じ導入遺伝子の発現よりも高い、発現ベクター。
  89. 前記導入遺伝子の発現が、ＵＣＬ−ＨＬＰプロモーターによって発現される同じ導入遺伝子の発現よりも高い、請求項８８に記載の発現ベクター。
  90. 導入遺伝子に作動可能に連結されたヒト由来制御エレメントを含む発現ベクターであって、前記導入遺伝子によってコードされるタンパク質が、（ｉ）前記導入遺伝子を検出するように構成されたＥＬＩＳＡアッセイによって測定した場合に、濃度＞１．０ＩＵ／ｍＬ；または（ｉｉ）Ｃｏａｔｅｓｔアッセイによって測定した場合に、＞２５％の活性を有する、発現ベクター。
  91. サイズが１００ｂｐ未満であるかまたはそれと等しい配列を有するヒト由来制御エレメントを含む、ベクターであって、前記制御エレメントは、細胞中でもｉｎ ｖｉｖｏでも前記制御エレメントと関連して見出されない導入遺伝子に作動可能に連結されている、ベクター。
  92. 前記制御エレメントが、イントロン配列である、請求項８６、８８、９０または９１に記載のベクター。
  93. 前記制御エレメントが、配列番号１もしくは配列番号２、またはそれに対して少なくとも８０％の相同性を有する配列である、請求項８６、８８、９０または９１に記載のベクター。
  94. 前記導入遺伝子としてのルシフェラーゼの使用が、マウス全体で測定した場合に、１×１０８光子／秒よりも高い全体的発現をもたらす、請求項８６、８８または９０に記載の発現ベクター。
  95. 前記活性または導入遺伝子発現が、１マウス当たり１６μｇの用量の発現ベクターに対応する、請求項９０に記載の発現ベクター。
  96. 前記活性または導入遺伝子発現が、１マウス当たり１２μｇの用量の発現ベクターに対応する、請求項９４に記載の発現ベクター。
  97. 内因性バージョンの前記導入遺伝子が、ｉｎ ｖｉｖｏでは前記制御エレメントに連結していない、請求項８６、８８または９０に記載の発現ベクター。
  98. 前記導入遺伝子の全体的発現が、ＣＭＶプロモーター、ＣＭＶｅプロモーター、スーパーコアプロモーター、ＴＴＲプロモーター、Ｐｒｏｔｏ１プロモーターおよびＵＣＬ−ＨＬＰプロモーターからなる群から選択される制御エレメントを有するベクターを使用した前記導入遺伝子の発現よりも高いレベルである、請求項８６に記載の発現ベクター。
  99. 発現が、マウスにおける少なくとも３、４、５、６または７つの異なる細胞型においてｉｎ ｖｉｖｏで検出可能である、請求項８６、８８、９０または９１に記載の発現ベクター。
  100. 前記異なる細胞型が、肺胞細胞、心筋細胞、上皮細胞、肝細胞、腸細胞、筋細胞、ニューロンおよび腎細胞からなる群から選択される、請求項８８に記載の発現ベクター。
  101. 前記制御エレメントが、エンハンサーである、請求項８６、８８、９０または９１に記載の発現ベクター。
  102. プロモーターをさらに含む、請求項１０１に記載の発現ベクター。
  103. 前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、ＣＭＶ、プロモーター、スーパーコアプロモーター、ＴＴＲプロモーター、Ｐｒｏｔｏ１プロモーター、ＵＣＬ−ＨＬＰプロモーター、ＡＡＴプロモーター、ＫＡＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＥＦＳプロモーターまたはＣＭＶｅエンハンサー／ＣＭＶプロモーターの組合せである、請求項１０２に記載の発現ベクター。
  104. １つまたは複数の転写後修飾部位をさらに含む、請求項１０１に記載の発現ベクター。
  105. 前記導入遺伝子が、Ｃａｓ９である、請求項８６、８８、９０または９１に記載の発現ベクター。
  106. 前記導入遺伝子が、ｓａＣａｓ９である、請求項１０５に記載の発現ベクター。
  107. 細胞中でまたはｉｎ ｖｉｖｏで第ＶＩＩＩ因子を検出するように構成されたＥＬＩＳＡアッセイによって測定した場合に、前記第ＶＩＩＩ因子の発現を濃度＞１．０ＩＵ／ｍＬまで駆動させることができる制御配列に作動可能に連結された第ＶＩＩＩ因子導入遺伝子を含む、発現ベクター。
  108. 請求項８６から１０７のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む、ウイルス粒子。
  109. 前記ウイルス粒子が、ＡＡＶである、請求項１０８に記載のウイルス粒子。
  110. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ−ＤＪおよびｓｃＡＡＶからなる群から選択される、請求項１０９に記載のウイルス粒子。
  111. 前記ウイルス粒子が、レンチウイルスである、請求項１０８に記載のウイルス粒子。
  112. 前記ウイルス粒子が、アデノウイルスである、請求項１０８に記載のウイルス粒子。
  113. 前記導入遺伝子が、治療用導入遺伝子である、請求項８６、８８、９０または９１に記載の発現ベクター。
  114. 前記治療用導入遺伝子が、第ＶＩＩＩ因子、Ｃａｓ９、ＤＮＡ結合タンパク質、ホルモン、増殖もしくは分化因子、インスリン、成長ホルモン、ＶＥＧＦ、神経栄養因子、線維芽細胞上皮因子；サイトカイン、インターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子、抗体、免疫グロブリン、インターフェロン、キメラＴ細胞受容体；リポタンパク質受容体、嚢胞性線維症膜貫通制御因子、ムコ多糖症Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型もしくはＩＶ型と関連する遺伝子、ベータグロビンまたはリポタンパク質リパーゼである、請求項１１３に記載の発現ベクター。
  115. 前記治療用導入遺伝子が、ＡＴＰ７Ａ、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＢ１１、またはそれらのバリアントもしくは断片である、請求項１１３に記載の発現ベクター。
  116. 前記治療用導入遺伝子が、ＣＤＫＬ５、ＣＮＴＮＡＰ２、ＺＥＢ２、またはそれらのバリアントもしくは断片である、請求項１１３に記載の発現ベクター。
  117. 動物中の複数の異なる組織に導入遺伝子を送達するための方法であって、前記動物に、請求項８６から１１６のいずれか一項に記載の発現ベクターを投与することを含む、方法。
  118. タンパク質、抗体または他の生物製剤の産生のための方法であって、細胞を、請求項８６から１１６のいずれか一項に記載の発現ベクターと接触させることを含む、方法。
  119. 前記細胞が、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、請求項１１８に記載の方法。
  120. トランスジェニック動物または植物を産生するための方法であって、動物または植物に、請求項８６から１１６のいずれか一項に記載の発現ベクターを投与することを含む、方法。
  121. 前記制御エレメントが、４０〜５０ｂｐである、請求項８６、８８、９０または９１に記載の発現ベクター。
  122. 前記制御エレメントが、５０〜６０ｂｐである、請求項８６、８８、９０または９１に記載の発現ベクター。
  123. 導入遺伝子に作動可能に連結されたヒト由来制御エレメントを含む発現ベクターであって、前記導入遺伝子によってコードされるタンパク質が、（ｉ）前記導入遺伝子を検出するように構成されたＥＬＩＳＡアッセイによって測定した場合に、濃度＞０．１ＩＵ／ｍＬ；または（ｉｉ）Ｃｏａｔｅｓｔアッセイによって測定した場合に、＞１０％の活性を有する、発現ベクター。
  124. 導入遺伝子に作動可能に連結された１２０ｂｐ未満であるかまたはそれと等しいｂｐを有するヒト由来制御エレメントを含む発現ベクターであって、それにより、前記導入遺伝子の発現が、ＵＣＬ−ＨＬＰプロモーターによって発現される同じ導入遺伝子の発現よりも高い、発現ベクター。
  125. 前記制御エレメントが、プロモーターである、請求項１２３または１２４に記載の発現ベクター。
  126. 前記治療用導入遺伝子が、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写制御ドメインを含む融合タンパク質である、請求項１２３または１２４に記載の発現ベクター。
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