JP5823969B2 - 心臓特異的核酸調節因子ならびにこの方法および使用 - Google Patents
心臓特異的核酸調節因子ならびにこの方法および使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5823969B2 JP5823969B2 JP2012535849A JP2012535849A JP5823969B2 JP 5823969 B2 JP5823969 B2 JP 5823969B2 JP 2012535849 A JP2012535849 A JP 2012535849A JP 2012535849 A JP2012535849 A JP 2012535849A JP 5823969 B2 JP5823969 B2 JP 5823969B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- vector
- heart
- promoter
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4716—Muscle proteins, e.g. myosin, actin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
- C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
- C12N2799/025—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a parvovirus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/15—Vector systems having a special element relevant for transcription chimeric enhancer/promoter combination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/30—Vector systems having a special element relevant for transcription being an enhancer not forming part of the promoter region
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
- C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本明細書において記載される核酸調節因子がプロモーターおよび導入遺伝子に機能的に連結された核酸発現カセットを心臓細胞内に導入する段階;
導入遺伝子産物を心臓細胞内で発現させる段階
を含む、心臓細胞において導入遺伝子産物を発現させるための方法を提供する。
核酸発現カセットを被験体の心臓内に導入する段階であって、ここで、本明細書において記載される核酸調節因子は、プロモーター、および治療用タンパク質をコードする導入遺伝子に機能的に連結されている段階;
治療量の(治療用)タンパク質を心臓内で発現させる段階
を含む。
本発明は特定の実施形態に関しておよびある図面を参照して以下に説明されるが、本発明はこれらに限定されるものではなく、特許請求のみによって限定される。特許請求の範囲におけるいずれの引用表示も本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。記載されている図面は概要図に過ぎず、限定的なものではない。図面においては、因子の幾つかのサイズは誇張されていることがあり、例示を目的として、実物大では描かれていないことがある。「含む」という用語が本明細書および特許請求の範囲において用いられている場合、これは他の因子または段階を除外しない。例として「a」「an」、「the」のついた単数形の名詞が用いられている場合、特に示されていない限り、複数形の名詞を含む。
レギュロンの同定
距離差行列(DDM)アルゴリズム(De Bleser,2007)と称される新規で有効なデータマイニングアルゴリズムを、専ら心臓において高く独占的に発現しており、シス作用調節因子の組み合わせに比較的豊富に存在しているプロモーターを同定するのに使用した。簡潔に説明すると、ある与えられた刺激に対する、示差的に調節される肝臓特異的遺伝子のプロモーターの2つのセットの応答性は、プロモーターの両セットにより共有される転写因子結合部位(TFBS)により説明され得ると予想され得る。もっとも、これは応答の方向性を説明しないかもしれない。TFBSの共通セットと並んで、プロモーターの各セットは、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされる遺伝子群のプロモーターに、より特徴的な1つ以上のTFBSを含む可能性があり、観察される示差的挙動を少なくとも部分的に説明し得る。これらの「示差的(differential)」TFBSは、以下の手法を用いて見出され得る。第一に、Match(商標)プログラム(Kel et al.,2003)、または位置特異的重み行列(PWM)のプレコンパイル化ライブラリーを使用してプログラム上でTFBSを予測するいずれかの他の類似プログラムのための入力として、各セットの各プロモーターを使用する。プロモーター当たりのPWM当たりの予測TFBSの数(さらに、カウントと称される。)であるこの結果を、各行がプロモーター配列に対応し列が使用PWMに対応する行列の形態で集める。列はさらに、PWM−ベクトルと称され、PWMを、プロモーター当たりの予測TFBSのこの数により特徴づけるものである。プロモーター当たりのPWM当たりの予測TFBSの総数を用いる選択は、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)の調節領域が多コピーの強固モチーフおよびより弱いコピーを含むというPapatsenkoら(Papatsenko et al.,2002)の観察により動機づけられる。一般に、転写因子に対する複数の結合部位の存在は重要な役割を果たしていると考えるのが合理的である。さらに、TFBSのペアを共有するプロモーターを伴う遺伝子は、ただ1つのTFBSを共通に有するプロモーターを伴う遺伝子よりも、共発現される可能性が有意に高いことが、酵母において示された(Pilpel et al.,2001)。この観察に沿って、複合エンハンサー因子を得るための単一肝臓特異的TFBSの単なる組み合わせは、失望させる結果を生み出した(Lemken et al.,2005)。DDM法は過剰発現および関連性の両方を考慮するものであるため、プロモーター当たりの複数のマッチを考慮することは、過剰発現による推定機能性TFBSを発見するのを助け得る。2つのTFBSは、行列内のこれらの対応列が類似している場合に、相関しているとみなされる。これらの列の間の類似性は、距離関数を用いて測定され得る。この方法を用いて、プロモーターの両セットにおけるTFBSに関して、全てのTFBS関連性を要約する距離行列を構築する。最後に、DDMを計算し、この行列上で多次元尺度法(MDS)を行って二次元におけるこの含量を可視化することにより、観察された示差的遺伝子発現に寄与しないTFBS(これらはDDM−MDSプロットの原点付近に位置づけられる。)を、観察された示差的遺伝子発現をもたらす可能性のある「偏向」TFBSから区別することが可能である。MDS法は、強く関連しているTFBSを、より弱く関連しているTFBSよりも密集してプロットするため、これは、他の方法を用いた場合にはしばしば曖昧となるプロモーターデータベース内のTFBS間の相互作用のほとんどを際立たせて表示する。または、結果は表において要約され得る。
pfx DNAポリメラーゼ酵素に基づくAccuprime PCR反応キット(Invitrogen)を用いて、30サイクルの増幅で本研究に関する全てのPCRを実施した。
αミオシン重鎖(αMHC)プロモーターは、他の心臓特異的プロモーターの中で、導入遺伝子の広範囲で非常に高いレベルの心臓特異的発現をもたらすことが示されているので(Pacak et al,2008)、本プロジェクトに関してはαミオシン重鎖(αMHC)プロモーターを選択した。
標準条件を使用して、Stratageneのプラスミド構築物pAAV−hrGFPから、Invitrogenから入手したプライマーを使用してhrGFPを増幅した。使用したプライマーはInvitrogenから入手したものであり、以下に列挙する。2個の制限部位NheIおよびBglIIをプライマー中に組み込んで、増幅した断片に隣接させた(NheI制限部位を有するフォワードプライマー(40塩基):5’から3’−TTG CTA GCA CCA TGG TGA GCA AGC AGA TCC TGA AGA ACA C(配列番号22);BglII制限部位を有するリバースプライマー(36塩基):5’から3’−TTA AGA TCT TTA CAC CCA CTC GTG CAG GCT GCC CAG(配列番号23))。
Invitrogenから入手したプライマーを使用して、Stratageneプラスミド構築物(pAAV−hrGFP)からベータグロビンイントロン(βグロビンイントロン)を増幅した。他の構築物と同じように標準的な手順に従って、この増幅を実施した。使用したプライマーは以下の通りである。
Qiagenのゲル抽出キットに従って、スピンカラムを使用して、αMHC、hrGFPおよびβグロビンイントロンの得られた増幅断片を精製した。溶離後、Acc65IおよびNheI制限酵素を用いてαMHCを分解し、NheIおよびBglII制限酵素を用いてhrGFPを分解し、XbaIおよびNheI制限酵素を用いてβグロビンイントロンを分解した。分解は、ベクターへのライゲーションを可能にするために断片の付着末端を作製することを目的としていた。次いで、Qiagenゲル抽出アッセイキットにおけるスピンカラムを用いて、断片を精製した。必要とするまで、断片を−20℃の冷凍庫に保管した。
構築物(pAAV−αMHCp−βグロビンイントロン−hrGFP−pA)(図4[C])の作製は、以下に記載される4個のサブクローニングを含んでいた。このベクターをクローニングし、配列決定によって確認するとすぐに、8個の同定したレギュロンをこの汎用AAV構築物に続いてクローニングした。
本研究において使用したプラスミド構築物の骨格は、アンピシリン選択マーカー遺伝子、AAV2ウイルス遺伝子のL−およびR−ITRセグメントならびにウシ成長ホルモンポリアデニル化(ポリA)cDNAを含んでいた(図4[A])。本発明者らの研究室からのプラスミド構築物pAAV−TTRserp−FIXIA−pAから、このプラスミド骨格を作製した。プラスミド中の3個の特徴的な制限部位(BglII、NheIおよびXbaI)によって、3個の制限酵素BglII、NheIおよびXbaIを用いて断片を作製した。BglII制限部位はpAのすぐ下流に位置し、NheI部位はL−ITR部位に隣接しこの下流でもあり、XbaI部位はBglIIとNheI部位との間の中ほどに位置していた。BglIIおよびNheI付着末端に隣接する作製したより大きい骨格断片を、他の2個のより小さい断片(一方の断片は各制限部位のNheIおよびXbaI付着末端に隣接し、他方は各制限部位のXbaIおよびBglII付着末端に隣接する。)から容易に分離することが可能なので、これらの部位を使用した。
hrGFPおよびITRを含むベクターの骨格、選択可能なマーカー遺伝子ならびにpAを一緒にライゲーションした。これが可能だったのは、hrGFPおよび骨格が両方とも、末端のライゲーションを仲介することができるNheIおよびBglII制限付着末端を有していたからである。ライゲーション反応物を一晩培養した後、新たに作製した構築物pAAV−hrGFP−pAを、アンピシリンを含むLB寒天固形培地上に置いて一晩培養したStratageneのXL−10ゴールドウルトラコンピテント細菌細胞を形質転換するのに使用した。InvitrogenのMiniprepアッセイキットを使用して、20個のコロニーからプラスミドDNAを抽出した。次いで、BglII−NheI制限酵素を使用して、陽性クローンに関して得られたDNAをスクリーニングした。
2個の付着末端をhrGFPの上流に作り出すAcc65IおよびNheI制限酵素を用いて、pAAV−hrGFP−pAプラスミド構築物を最初に制限した。次いで、上記のようにこれらの2個の制限酵素を用いて制限したαMHCpを、Acc65IおよびNheI制限部位の付着末端に隣接する開環pAAV−hrGFP−pAとライゲーションした。次いで、得られたプラスミドpAAV−αMHCp−hrGFP−pAをXL−10ゴールドウルトラコンピテント細菌細胞に形質転換した。αMHCpのサイズに対応する363bpのバンドを示す構築物の残りからαMHCpを除去するAcc65I−NheI制限を使用して、陽性クローンをスクリーニングした。NotIはプロモーター領域内部に位置しているので、制限においてNotI−Ndeを一緒に使用してさらなる確認試験を実施したところ、これがαMHCpの329bp断片を切り出した。
このクローンを得るために、NheI制限酵素を用いてpAAV−αMHCp−hrGFP−pA選択クローンを分解して、αMHCp遺伝子とhrGFP遺伝子との間に位置するNheI部位に1個の制限を作り出した(図4[C])。制限反応中、ホスファターゼを制限反応物に添加して、制限した断片から5’リン酸基を除去した。これは、開環プラスミドベクターの再ライゲーションを防ぐために行った。次いで、Qiagenプラスミドゲル抽出キットを使用して、断片を精製した。
pAAV−αMHCp−βGI−hrGFP−pAプラスミドの選択および確認した陽性クローンを、XL−10ゴールドウルトラコンピテント細菌細胞における形質転換に使用した。一晩培養した後、1個のコロニーだけを注意深く採取したものを培養チューブ中の2mlLBアンピシリン固形培地に入れて、前培養を行った。培養物をl50rpm、37℃培養にさらした。培養物を、LBアンピシリン培地2リットル(L)の培養フラスコを播種するのに使用した。このフラスコを、37℃およびl50rpmのインキュベーター中で振動させながら約13時間培養(一晩放置)した(ただし、細菌増殖が、吸光度280nmにおいて1.6から1.9の間の光学密度(OD)に達するまで)。このODにおいて、InvitrogenのMaxiprepアッセイキットを使用してプラスミドDNAを抽出した。エタノール沈殿および精製した後、Nanodrop ND−1000分光光度計(Nanodrop Technologies、ロックランド、デラウェア州、米国)を使用して純プラスミドの濃度を測定し、濃度を1.0μg/μlに調整した。AAVベクターの製造に必要とするまで、精製プラスミドを−20℃で保管した。対照配列決定から得られた結果により、ベクターpAAV−αMHCp−βGI−hrGFP−pAが全てのクローニングした断片を適切な方向(即ち、センス方向)で含むことが明らかになった。
合成した8個のレギュロン全て:Myl3、Brd7、Myl2、Casq2e1、Casq2e2、Ankrd1e1、Ankrd1e2およびAnkrd1e3をベクターにクローニングして、合計8個の異なる発現カセットを得、pAAV−Reg−αMHCp−βGI−hrGFP−pAと指定した新たな構築物を得た(図6[A]、Reg=レギュロンの位置)。レギュロンをαMHCpの上流にクローニングした。
この製造は、レギュロン1個当たり1個の選択した陽性クローンの増大を伴った。プラスミドを、XL−10ゴールドウルトラコンピテント細菌細胞を形質転換および培養するのに使用した。一晩培養した後、1個のコロニーを注意深く採取したものを培養チューブ中の2mlLBアンピシリン液体培地に入れて、前培養を行った。次いで、培養物をl50rpm、37℃で培養にさらし、LBアンピシリン培地2リットル(L)の培養フラスコを播種するのに使用した。これらのフラスコを、37℃およびl50rpmのインキュベーター中で振動させながら約13時間(通常は一晩)培養した(ただし、細菌増殖が、吸光度280nmにおいて1.6から1.9の間の光学密度(OD)に達するまで)。このODにおいて、InvitrogenのMaxiprepアッセイキットを使用してプラスミドDNAを抽出して、非常に純粋なプラスミドベクターを得、これをトランスフェクションの準備ができるまで−20℃で保管した。AAVベクターの製造に使用する前に、KpnI、MluI、MluI−NheI、MluI−NdeI制限酵素を使用して、制限により各精製プラスミドを再確認した。
リン酸カルシウムトランスフェクション
Stratageneによって提供される293細胞と称される特別なAAV製造細胞株をリン酸カルシウムトランスフェクションに使用した。このトランスフェクションは、3個のプラスミド、製造したAAVベクター(3.3.5節)、プラスミド構築物中のAAV9rep/capヘルパー遺伝子およびStratageneから入手したアデノウイルスヘルパー遺伝子を含む3個のプラスミド成分系であった。キットのHepes緩衝生理食塩水(HBS)によって提供される塩化カルシウム(CaCl2)およびリン酸塩の添加によって、アデノウイルスヘルパー遺伝子104μgを含むDNAならびにAAVベクターおよびAAV9rep/capヘルパー遺伝子各50μgを沈殿させ、調製したHEK293細胞にリン酸カルシウムトランスフェクションによって取り込ませた。
AAVはこの宿主を溶解しないので、細胞の冷凍および解凍の過程後の超音波処理によって、宿主細胞からウイルス粒子を回収した。次いで、超遠心分離機中で18から20時間の間の塩化セシウム(CsCl)勾配遠心分離を3回(3X)することによって、細胞溶解物中の放出されたウイルス粒子を精製した。CsCl勾配の設定において、最初に0.454gCsCl/ml細胞溶解物の混合物を作った後、1.31g/mlCsCl、1.41g/mlCsClおよび1.61g/mlCsClを含む異なる勾配のCsCl溶液を続いて添加した。アッベ屈折計を使用して、スピンからのフラクションの屈折率(RI)を測定し、1.3650から1.3760の間のRIを有していたものをスピンの後続ラウンドのために一緒に取り出した。次いで、最終的に得られた純粋なベクター懸濁液を4℃で保管した。
最初に、精製rAAVベクター懸濁液4μlをDNaseで処理し、99℃で5分間培養した。この段階は、トランスフェクションに使用したか、またはトランスフェクションに使用した細胞のゲノムに由来するあらゆる残存DNAを含むAAV9ウイルス粒子の外部に存在するあらゆるベクターDNAを破壊するのに必要であった。これは、リアルタイムまたは定量的ポリメラーゼ連鎖反応(QPCR)中にウイルス粒子の内部のDNAだけが力価測定されたことを意味する。この温度はまた、ウイルス粒子を破裂させて、これらのベクターDNAを溶液に放出することを可能にする。
AAV9ウイルスベクターの注射
表2に要約したように、合計11匹の23日齢NOD−SCIDγc欠損マウスに特定の組換え(r)AAV9を尾静脈注射によって静脈注射した。ウイルスベクターをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈し、1.25x1011vg(ベクターゲノム)の注射量を得た。
半定量的RT−PCRを、全てのマウスに由来する組織においてhrGFPのmRNA量を検出するのに使用した。InvitrogenのPureLink Micro−to−Midi Total RNA精製システムキットに添付のプロトコールに従って、マウスの心臓および脾臓組織から総RNAを抽出した。ゲノムDNAまたはベクターDNAを分解するためにDNase処理段階が含まれた。この後、InvitrogenスーパースクリプトVILOcDNA合成キットおよびこれに添付のプロトコールを使用して、2μgの総RNAでcDNAを合成した。cDNAにおけるhrGFPのレベルを検出するために、100ngの総cDNAをPCRを実施するのに使用した。これは、hrGFP特異的プライマー(上記と同じもの)を使用して行った(フォワードプライマー:5’から3’−TTG CTA GCA CCA TGG TGA GCA AGC AGA TCC TGA AGA ACA C(配列番号22)およびリバースプライマー:5’から3’−TTA AGA TCT TTA CAC CCA CTC GTG CAG GCT GCC CAG(配列番号23))。サーマルサイクラー中で増幅を行った。グリセロアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)cDNAは、試料注入の標準化に関する内部対照遺伝子としての役割を果たした。GAPDHに関して使用したプライマーは、フォワードプライマーとしてTGTGTCCGTCGTGGATCTGA(配列番号29)、およびリバースプライマーとしてCCTGCTTCACCACCTTCTTGA(配列番号30)であった。基準に使用したプラスミドは、hrGFPに関してpAVV−hrGFP、およびGAPDHに関してpGEMTイージー−マウスGAPDHであった。
距離差行列(DDM)法による過活性心臓特異的レギュロンの作製
TFBSが単に存在するだけではなく、「レギュロン」と定義される転写因子結合部位(TFBS)の特定の組み合わせが、高いレベルの組織特異的発現を指示するのに重要であることが知られている。DDMに基づく新規なデータマイニングアルゴリズムを使用して、TFBSに非常に豊富に存在する8個の心臓特異的レギュロンを同定し、各配列を表1に示した。DDM法の原理は、ヒトゲノム上のMYL3エンハンサーのマッピングの例によって例示することができる。遺伝子ミオシン軽鎖3は心臓において特異的に発現しており、このエンハンサー領域は、Sox5、Pax4、RREB1などの幾つかの心臓特異的転写因子結合部位(TFBS)を含む。さらに、これらのTFBSは幾つかの種内で高度に保存されており、これは、対応する転写因子のこれらのDNA結合部位への結合が強い進化的圧力の下にあることを示している。このような相互作用を変化させる突然変異が起こると、この結果として生じた遺伝子発現における変化は生存に不適合であり得る。このDDM法によって同定した8個のレギュロン、即ち:Myl2、Brd7、Myl3、Casq2e1、Casq2e2、Ankrd1e1、Ankrd1e2およびAnkrd1e3は、アカゲザル、マウス、アルマジロ、イヌ、ウマ、トカゲ、ニワトリなどの異なる種間で強い相同性を示した。
安全性プロファイルおよび心筋遺伝子導入における改善に関して、遺伝子治療のためのAAVの使用における最近の進歩(Vandendriessche et al,2007;Muller et al.,2006)は、心臓を標的とする本プロジェクトにAAVベクターを選択した理由であった。本研究で使用したAAV発現カセットの作製において、AAV2をAAV9カプシドにシュードタイピング(pseudotyping)することによって、組換えAAVを作った。これは、AAV9が他の抗原型と比較して最も高い心臓指向性を有し(Inagaki et al,2006)、rAAV2/9媒介性遺伝子送達が強い心臓遺伝子送達をもたらした(Pacak et al,2008)という事実と合致していた。ベクタープラスミドの特異性を高めるために、αミオシン重鎖プロモーター(αMHCp)をカセットに組み込んで、hrGFP導入遺伝子の発現を促進させた。hrGFP導入遺伝子の高いレベルの発現を指示するために、ベータグロビンイントロン(βグロビンイントロン)も含まれていた(Buzina et al,2008)。
アンピシリン耐性遺伝子およびbghポリAを含むpUCベクターをhrGFP断片とライゲーションすることによって、pAAV−hrGFP−pAを得た(図4[A])。スクリーニングした後、ライゲーションを行った制限部位であるNheIおよびBglIIを使用して、最良のクローンを選択した。図5[A]における電気泳動の画像で認められるように、この制限は、hrGFPのサイズである716bp断片サイズを生成した。NheI−BglII制限はベクターからhrGFP断片を切り出すので、これは予想されていた。これは、pAAV−hrGFP−pA選択ベクターがhrGFP断片の正しい挿入物を含んでおり、さらにこのベクターを使用してクローニングが続いて行われ得たことの証拠であった。
次の段階は、選択したpAAV−hrGFP−pA陽性クローンにαミオシン重鎖プロモーター(αMHCp)をクローニングすることであった。ベクターおよび増幅したαMHCpの両方において存在するAcc65IならびにNheI制限部位を利用することによって、pAAV−αMHCp−hrGFP−pAベクターを得た(図4[B])。Acc65I−NheIを用いてこのベクターの正確性を確認したところ、αMHCpのサイズに対応する363bpの断片サイズを得た(図5[B]左側のラダー)。NotI−NdeI制限を使用して、プロモーターの329bp部分を切断するさらなる確認試験を実施した(図5[B]最右側5個のウェルのラダー)。これは、NdeI制限部位がプロモーター領域の内部約20bpからプロモーター配列の末端に位置していたので、マウスゲノムからのプロモーター増幅の有効性および存在を試験するためのものであった。この20bp未満の完全なプロモーター領域により、Acc65I−NheI制限から生成されたバンドと比較して小さい、NotI−NdeI制限で生成されたバンドが説明される(図5[B])。
レギュロンをクローニングする前の最終構築物は、ベータグロビンイントロン(βグロビンイントロン)をpAAV−αMHCp−hrGFP−pAベクターにクローニングして、pAAV−αMHCp−βGI−hrGFP−pAを得るためのものであった。図4[C]に示されるように、Nhel制限酵素を用いて前記ベクター(即ち、pAAV−αMHCp−hrGFP−pA)を分解して、プロモーターとベクターのhrGFP領域との間にシングルカットを得た。ベクターの再ライゲーションを防ぐために、制限した断片の5’末端からリン酸基を除去するホスファターゼを用いてこの制限反応物を処理した。βグロビンイントロン断片はXbaI部位に隣接する1個の末端を有していたが、NheI制限酵素を用いて切断したベクターにこれを上手くクローニングすることができた。これは、NheIおよびXbaIエンドヌクレアーゼそれぞれが、これらのエンドヌクレアーゼによって生成された断片の間でライゲーションを可能にする異なる認識配列(XbaIに関して5’−TCTAGA、およびNheIに関して5’−GCTAGC)を有するが、これらは両方とも制限後に5’−CTAGオーバーハングを生成するからである。
前節において記載したように得た電気泳動の画像に基づいて、pAAV−αMHCp−βGI−hrGFP−pAを得るための全てのクローニングおよびスクリーニングが成功したと判断した。配列決定のためのABI PRISM(登録商標)ビッグダイ(商標)ターミネーターサイクル配列決定キットと組み合わせてキャピラリーシーケンサー(Applied Biosystems 3730 DNA分析器)を使用するVIBサービス設備を使用して、ベクタープラスミドpAAV−αMHCp−βGI−hrGFP−pAが配列決定されたかを検証した。2個のフォワードプライマーおよび2個のリバースプライマーを、プラスミドベクター中のαMHCpおよびβグロビンイントロンを配列決定するのに使用した。CLUSTAL2.0.11多配列アライメントツールを使用して、配列決定から得られた結果を、作製した理論上の配列rAAV9とアライメントした(添付物2における完全なアライメント)。以下に示されるように、プロモーターを配列決定するためにプライマー1および2を設計したのに対して、βグロビンイントロンに関してプライマー4および5を設計した。rAAV9は、L−ITRからR−ITRまでの配列を表しているので、プロモーター、イントロン、hrGFPおよびBGHpA配列を含んでいる。配列が正しいか確認した。
本研究のための最終構築物は、レギュロンを有する発現カセットの作製であった(図6[A])。レギュロンを、L−ITRとαミオシン重鎖プロモーターとの間にクローニングした。Acc65Iを用いた制限後のベクター断片の両末端は、互いに非常にライゲーションしやすい付着末端を生成するので、上述のように、ホスファターゼを用いてベクターを処理して、ベクターの再ライゲーションを防いだ。図6[B]は、クローニング前の8個のレギュロン全ておよびベクターpAAV−αMHCp−βGI−hrGFP−pAのサイズを示す電気泳動の画像である。得られたバンドは、これら理論上の配列の長さに非常によく対応している。ウェルが番号付けられた順番に、1から8の数字がMyl3(150bp)、Brd7(689bp)、Myl2(183bp)、Casq2e1(219bp)、Casq2e2(117bp)、Ankrd1e1(299bp)、Ankrd1e2(277bp)およびAnkrd1e3(397)にそれぞれ対応する。
rAAV2/9ベクターの製造および力価測定
ベクターのトランスフェクション効率
レギュロンを含む8個のAAVプラスミドベクター(pAAV−Reg−αMHCp−βGI−hrGFP−pA)のそれぞれ、およびいかなるレギュロンも有しない別の対照ベクター(pAAV−αMHCp−βGI−hrGFP−pA)をMaxiPrepアッセイキットによって抽出し、その後これらの精製プラスミドをAAVベクターの製造に使用した。サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターの制御下にあるGFPをコードするAAVベクターを、AAVベクターの製造におけるトランスフェクションおよび力価測定対照として使用した。リン酸カルシウム沈殿によって、9個のベクターのそれぞれを、アデノウイルスヘルパープラスミドおよびAAV9rep/capプラスミドと一緒に、ヒト胎児腎臓(HEK)293細胞(この高いトランスフェクション効率およびタンパク質産生、ならびに翻訳後修飾を行う能力が知られている、Thomas,et al.,2005)にトランスフェクションした。全てのベクターのレポーター遺伝子hrGFPの発現に基づくトランスフェクション効率を、トランスフェクション後24時間および48時間に測定した。トランスフェクションした細胞の量(蛍光顕微鏡の下で観察されるトランスフェクション効率と称される。)によって、全てのベクター構築物の有効性を、このレベルのトランスフェクションにおいて確認した。図7および表3に示されるように、全てのトランスフェクションは、トランスフェクション後48時間に約90パーセント(90%)または95パーセント(95%)の高いトランスフェクション率(細胞をほとんど全て緑色に見せている。)をもたらした。このようなトランスフェクション効率は非常に高いと考えられ、従ってトランスフェクションの成功を表し、全てのプラスミドベクター構築物の有効性を裏付けている。
AAVは製造からのこの低い力価が知られており、これが力価測定を、AAVベクターの製造の非常に重要な構成因子にする。基準グラフ(図8)および得られたCt値によって、各試料のゲノムコピー数を評価することができた。20ウェルプレートを利用するリアルタイムPCRによって、コピー数が1011から1013vg/mlの範囲であると予想した。得られた全ての値(表3)はこの範囲内であり、従ってインビボ実験に使用することができた。
rAAV9ベクターのインビボ検証
8個の異なるレギュロンを含むAAVベクターおよび対照構築物(レギュロンを有しないαMHCプロモーターによって駆動されるGFPを有する。):比較的良好なベクター力価を有するpAAV−αMHCp−βGI−hrGFP−pAを成功裡に製造した(表3)。予備実験として、本発明者らは、マウス1匹当たり1.25×1011vgの低投与量だけを試験した。これらのベクターのそれぞれを、成体γCNod−SCID欠損マウスに尾静脈を通じて静脈注射した(表2)。AAVベクターで注射したマウスに由来する異なる臓器のGFP発現を検出するのに、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を使用した。マウスの心臓および脾臓からメッセンジャーRNA(mRNA)を抽出し、hrGFP特異的プライマーを、GFPcDNAを逆転写および増幅するのに使用した。得られたPCR産物をアガロースゲル上で可視化した(図9)。Casq2e1レギュロン含有ベクターの心臓組織からGFPに対応する716bpの目立つバンドが検出され、レギュロンを有しないベクターの心臓組織は心臓組織におけるごく微量のGFPcDNAを示したが、脾臓においてはいずれのベクターもいかなる発現も示さなかった(図9[A])。レギュロンを有しない対照ベクターと比較して、Myl2レギュロン含有ベクターは、GFPmRNAのわずかな増加を示した。
エンハンサー因子が心臓特異的発現を増加させただけでなく、依然として組織特異的であり続ける持続的(即ち、長期の)発現も保証したか否かを評価するために最初の実験を設定し、この実験で、新生仔免疫不全NODSCID/γ欠損マウスにおいて2.5×1010AAVベクターゲノムの注射(静脈)後1ヶ月にGFP発現を評価した。ベクター注射後1ヶ月に、落射蛍光顕微鏡を使用してGFP蛍光を評価した(データは示さない。)。配列番号6(Ankrd1e3)をエンハンサーとして使用した。
レギュロンを含む8個の異なるAAV構築物およびレギュロンを含まない1個を成功裡にクローニングし、続いて対応するAAV9ベクターを製造した。多制限酵素分析(multiple restriction enzymes analysis)を使用して、全てのクローンを十分に検査および確認した。DNA配列決定によって、陽性クローンをさらに確認した。AAVベクターの製造中、トランスフェクション後48時間に90%のトランスフェクション効率を達成したが、これは、プラスミドDNA抽出が上手く行われて、トランスフェクションのための高純度のDNAが得られたことを示している。この段階は、製造後の高いAAVベクター力価を達成するのに重要である。全てのAAV9ベクターの力価測定分析は、高いベクター力価を示したが(表3およびデータは示さない。)(範囲:3×1011から1013vg/ml)、これは、過去に報告された研究(VandenDriessche et al.,2007)と一致している。これらのベクター投与量は、マウスモデルにおける予備インビボ実験を開始するのに十分であった。インビトロの結果からインビボ観察を常に推定することはできないので、本発明者らは、心臓細胞株におけるいかなるインビトロ予備検証研究も行わないことを選択したが、この代わりにインビボにおける直接的なAAV9遺伝子送達に焦点を合わせた。
Claims (17)
- 配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、これらの配列のいずれかに対して少なくとも95%の同一性を有する配列、およびこれらの機能性断片からなる群から選択される配列を含む、心臓特異的遺伝子発現を増強するための600ヌクレオチド以下の核酸調節因子。
- 配列番号1、これに対して少なくとも95%の同一性を有する配列、またはこれらの機能性断片を含む、請求項1に記載の核酸調節因子。
- 250ヌクレオチド以下である、請求項1または2に記載の核酸調節断片。
- プロモーターおよび導入遺伝子に機能的に連結された、請求項1〜3のいずれか一項に記載の核酸調節因子を含む、核酸発現カセット。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の2つ以上の核酸調節因子を含む、請求項4に記載の核酸発現カセット。
- 2つ以上の調節因子が同一である、請求項5に記載の核酸発現カセット。
- プロモーターが心臓特異的プロモーターである、請求項4〜6のいずれか一項に記載の核酸発現カセット。
- プロモーターがミオシン重鎖遺伝子由来である、請求項7に記載の核酸発現カセット。
- βグロビンイントロンをさらに含む、請求項4〜8のいずれか一項に記載の核酸発現カセット。
- 導入遺伝子が、血管形成因子、ATPアーゼ、イオンチャネル、サイトカインおよび成長因子からなる群から選択される治療用タンパク質をコードする、請求項4〜9のいずれか一項に記載の核酸発現カセット。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の調節因子を含む、ベクター。
- 請求項4〜10のいずれか一項に記載の核酸発現カセットを含む、請求項11に記載のベクター。
- ウイルスベクターである、請求項11または12に記載のベクター。
- AAV9ベクターまたはAAV2/9ベクターである、請求項13に記載のベクター。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の核酸調節因子、請求項4〜10のいずれか一項に記載の核酸発現カセット、または請求項11〜14のいずれか一項に記載のベクターを含む、遺伝子治療のための医薬組成物。
- 請求項4〜10のいずれか一項に記載の核酸発現カセットを心臓細胞内に導入する段階;
導入遺伝子タンパク質産物を心臓細胞内で発現させる段階
を含む、心臓細胞においてタンパク質を発現させるためのインビトロ方法。 - 請求項10に記載の核酸発現カセット、または請求項10に記載の核酸発現カセットを含むベクターを被験体の心臓内に導入する段階;
治療量のタンパク質を心臓内で発現させる段階
を含む、遺伝子治療を必要とするヒト以外の被験体に対する遺伝子治療の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP09174519.0 | 2009-10-29 | ||
EP09174519 | 2009-10-29 | ||
PCT/EP2010/066474 WO2011051450A1 (en) | 2009-10-29 | 2010-10-29 | Cardiac-specific nucleic acid regulatory elements and methods and use thereof |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013509168A JP2013509168A (ja) | 2013-03-14 |
JP2013509168A5 JP2013509168A5 (ja) | 2013-12-19 |
JP5823969B2 true JP5823969B2 (ja) | 2015-11-25 |
Family
ID=43414855
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012535849A Expired - Fee Related JP5823969B2 (ja) | 2009-10-29 | 2010-10-29 | 心臓特異的核酸調節因子ならびにこの方法および使用 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9353164B2 (ja) |
EP (1) | EP2494058B1 (ja) |
JP (1) | JP5823969B2 (ja) |
AU (1) | AU2010311376B2 (ja) |
CA (1) | CA2778945A1 (ja) |
WO (1) | WO2011051450A1 (ja) |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011051450A1 (en) | 2009-10-29 | 2011-05-05 | Vib Vzw | Cardiac-specific nucleic acid regulatory elements and methods and use thereof |
US8859517B2 (en) * | 2011-08-08 | 2014-10-14 | Fondazione Salvatore Maugeri Clinica Del Lavoro E Della Riabilitazione | Method of gene transfer for the treatment of recessive catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) |
US20130136729A1 (en) * | 2011-11-11 | 2013-05-30 | University of Virginia Patent Foundation, d/b/a University of Virginia Licensing & Ventures Group | Compositions and methods for targeting and treating diseases and injuries using adeno-associated virus vectors |
US20150322439A1 (en) * | 2012-11-19 | 2015-11-12 | Nature Technology Corporation | Replicative minicircle vectors with improved expression |
US9732345B2 (en) | 2013-12-09 | 2017-08-15 | Baylor College Of Medicine | Hippo and dystrophin complex signaling in cardiomyocyte renewal |
US11072801B2 (en) * | 2014-01-21 | 2021-07-27 | Vrije Universiteit Brussel | Muscle-specific nucleic acid regulatory elements and methods and use thereof |
US10570183B2 (en) * | 2016-04-19 | 2020-02-25 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Use of a small native peptide activator of SERCA pump for treatment of heart failure and other disorders characterized by cytosolic calcium overload |
WO2018178067A1 (en) | 2017-03-27 | 2018-10-04 | Vrije Universiteit Brussel | Diaphragm-specific nucleic acid regulatory elements and methods and use thereof |
CN112912112A (zh) | 2018-10-26 | 2021-06-04 | Vrije布鲁塞尔大学 | 肝特异性核酸调节元件以及其方法及用途 |
US20230047424A1 (en) * | 2019-12-09 | 2023-02-16 | Ucl Business Ltd | Gene therapy composition and treatment for myh7-linked cardiomyopathy |
CN115151646A (zh) * | 2019-12-24 | 2022-10-04 | 阿斯克肋匹奥生物制药公司 | 调节核酸序列 |
JP2023515443A (ja) | 2020-02-18 | 2023-04-13 | フレイエ ユニヴェルシテイト ブリュッセル | 核酸調節エレメントの新規な組合せ並びにその方法及び使用 |
EP4263828A1 (en) | 2020-12-21 | 2023-10-25 | Vrije Universiteit Brussel | Cardiomyocyte-derived nucleic acid regulatory elements and methods and use thereof |
AR126660A1 (es) | 2021-07-28 | 2023-11-01 | Univ Brussel Vrije | Mejorando la eficacia de la terapia génica dirigida a músculos |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2797273B1 (fr) | 1999-08-06 | 2004-01-02 | Pasteur Institut | Polynucleotides dirigeant l'activation de l'expression d'un gene dans le coeur et ses applications a la therapie genique |
KR20030032912A (ko) | 2000-01-14 | 2003-04-26 | 베쓰 이스라엘 디코니스 메디칼 센터 | 심장세포-특이적 인핸서 인자 및 이의 용도 |
DE60130465T2 (de) * | 2000-07-14 | 2008-06-12 | The Regents Of The University Of Michigan, Ann Arbor | Mutierte muskelspezifische enhancer |
US20050004058A1 (en) * | 2000-12-07 | 2005-01-06 | Patrick Benoit | Sequences upstream of the carp gene, vectors containing them and uses thereof |
US7714100B2 (en) * | 2004-01-27 | 2010-05-11 | Compugen Ltd | Nucleotide and amino acid sequences, and assays and methods of use thereof for diagnosis of cardiac disease |
CA2575614A1 (en) * | 2004-07-29 | 2006-02-09 | Stem Cell Innovations, Inc. | Differentiation of stem cells |
US20080081354A1 (en) * | 2006-10-02 | 2008-04-03 | Cardiac Pacemakers, Inc. | Devices, vectors and methods for inducible ischemia cardioprotection |
WO2008054713A2 (en) | 2006-10-30 | 2008-05-08 | Thomas Jefferson University | Tissue specific gene therapy treatment |
US20110027234A1 (en) * | 2007-04-11 | 2011-02-03 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Methods for identification and selection of human embryonic stem cell derived cells |
JP5797551B2 (ja) | 2008-04-22 | 2015-10-21 | フエー・イー・ベー・フエー・ゼツト・ウエー | 肝特異的核酸調節要素ならびにその方法および用途 |
WO2011051450A1 (en) | 2009-10-29 | 2011-05-05 | Vib Vzw | Cardiac-specific nucleic acid regulatory elements and methods and use thereof |
-
2010
- 2010-10-29 WO PCT/EP2010/066474 patent/WO2011051450A1/en active Application Filing
- 2010-10-29 EP EP10771459.4A patent/EP2494058B1/en not_active Not-in-force
- 2010-10-29 CA CA2778945A patent/CA2778945A1/en not_active Abandoned
- 2010-10-29 JP JP2012535849A patent/JP5823969B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2010-10-29 US US13/504,614 patent/US9353164B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-10-29 AU AU2010311376A patent/AU2010311376B2/en not_active Ceased
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2010311376B2 (en) | 2014-07-03 |
CA2778945A1 (en) | 2011-05-05 |
US9353164B2 (en) | 2016-05-31 |
EP2494058A1 (en) | 2012-09-05 |
JP2013509168A (ja) | 2013-03-14 |
WO2011051450A1 (en) | 2011-05-05 |
US20120252882A1 (en) | 2012-10-04 |
EP2494058B1 (en) | 2017-04-05 |
AU2010311376A1 (en) | 2012-05-24 |
AU2010311376A2 (en) | 2012-07-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5823969B2 (ja) | 心臓特異的核酸調節因子ならびにこの方法および使用 | |
US20240076698A1 (en) | Methods and compositions for modulating a genome | |
JP7315475B2 (ja) | 高活性制御エレメント | |
US11492614B2 (en) | Stem loop RNA mediated transport of mitochondria genome editing molecules (endonucleases) into the mitochondria | |
CN112639108A (zh) | 治疗非综合征性感觉神经性听力损失的方法 | |
TW202310880A (zh) | 靶向肌肉之基因療法之功效改進 | |
WO2010010887A1 (ja) | 組織発現プロモーター | |
TW202323524A (zh) | Hbb—調節組合物及方法 | |
CN115279184A (zh) | B4galt1介导的功能的啮齿动物模型 | |
CN114423863A (zh) | 用于细胞遗传修饰的表达构建体 | |
AU2014240247B2 (en) | Cardiac-specific nucleic acid regulatory elements and methods and use thereof | |
JP2022512831A (ja) | 網膜疾患の遺伝子治療 | |
US20240026324A1 (en) | Methods and compositions for modulating a genome | |
JP6153205B2 (ja) | Va遺伝子破壊アデノウイルスベクターおよびそれを調製するための前駆体ベクター | |
US20240093186A1 (en) | Cftr-modulating compositions and methods | |
RU2742435C2 (ru) | Композиции промоторов | |
US20230220361A1 (en) | Crispr-cas9 mediated disruption of alcam gene inhibits adhesion and trans-endothelial migration of myeloid cells | |
LLADO SANTAEULARIA | THERAPEUTIC GENOME EDITING IN RETINA AND LIVER | |
JP2024502257A (ja) | 心筋細胞由来核酸調節エレメント並びにその方法及び使用 | |
WO2023147558A2 (en) | Crispr methods for correcting bag3 gene mutations in vivo | |
KR20230142576A (ko) | 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 | |
WO2023220732A1 (en) | Methods and systems for correcting mutations in prph2 | |
CN117980482A (zh) | Rbm20突变的基因组编辑 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20131028 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20131028 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20141126 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20141222 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20150317 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150619 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150915 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20151008 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5823969 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |