TW202310880A - 靶向肌肉之基因療法之功效改進 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於能夠增強基因之橫膈膜特異性表現(尤其在橫膈膜本身中之表現以及在心肌及/或骨骼肌中之表現)的核酸調節元件、採用此等調節元件的方法及此等元件的用途。本發明亦揭示含有此等核酸調節元件之表現卡匣及載體。本發明尤其適用於使用基因療法(更尤其是肌肉及/或心臟組織定向基因療法)之應用，及適用於疫苗接種目的。

Description

靶向肌肉之基因療法之功效改進
本發明係關於能夠增強基因之肌肉特異性表現的核酸調節元件、採用此等調節元件的方法及其用途。本發明進一步涵蓋包含此等調節元件之表現卡匣、載體及醫藥組合物。本發明尤其適用於使用基因療法，更尤其肌肉定向基因療法或基因編輯的應用，且適用於疫苗接種目的。
減弱骨骼肌、心臟及/或橫膈膜功能之基因缺陷引起許多遺傳病症，例如龐貝氏症(Pompe)、肌肉萎縮症等。
通常，肌肉缺陷最終導致嚴重的肌無力及麻痹及/或心肺衰竭，後果通常是危及生命的。對肌肉、心臟及/或橫膈膜之基因療法由於基因遞送及基因表現之侷限性而相對低效。
基因療法因其能夠將治療性基因遞送至受影響組織以便獲得持續治療反應而給同時治療平滑肌、骨骼肌之功能障礙及退化及最終亦治療心臟及橫膈膜之功能障礙及退化提供前所未有的機會。儘管具有前景，但其缺點是達成所需治療作用需要的病毒載體劑量相對較高，從而阻礙可能的臨床轉譯。更特定言之，由於基因遞送及基因表現之限制，因此針對平滑肌、骨骼肌、心臟及/或橫膈膜，更尤其針對骨骼肌、心臟及/或橫膈膜之基因療法為相對低效的。此外，對治療性基因產物具有特異性之免疫反應減少針對平滑肌、骨骼肌、心臟及/或橫膈膜，更尤其針對骨骼肌、心臟及/或橫膈膜之基因療法應用的有效性。
妨礙臨床轉譯且阻止開發有效治癒肌肉缺乏之基因療法的難題亦關於：(i)治療性轉基因在受影響之骨骼肌、心臟及橫膈膜中的表現不足；及(ii)由於到達此危及生命之疾病所影響的主要肌肉群(亦即，骨骼肌、心臟及橫膈膜)以有效治療此疾病之不同臨床表現(包括骨骼肌無力/消瘦、心肌病變及橫膈膜功能障礙)所需的習知載體劑量極高而所致的潛在毒性及不良免疫反應。
將轉基因遞送至肌肉的努力集中於源自腺病毒、反轉錄病毒、慢病毒及腺相關病毒(AAV)的載體及質體。腺病毒相關病毒載體(AAV)為迄今用於肌肉定向基因療法之最有前景的基因遞送載具。AAV天然趨向於肌肉細胞的性質、其長期持久之轉基因表現、其多種血清型以及其最小免疫反應使AAV載體非常適合於肌肉定向基因療法。AAV9已知為心臟基因遞送之最有效載體(Pacak等人 2006. Circ. Res. 99(4):e3-9; VandenDriessche等人 2007. J. Thromb. Haemost. 5(1):16-24; Inagaki等人 2006. Mol. Ther. 2006 14(1):45-53)，且亦非常適合於骨骼肌基因遞送。AAV載體可藉助於局部、區域及全身投與遞送至骨骼肌、心肌、平滑肌及橫膈膜中。亦可考慮AAV向肌肉性衣殼之其他非限制性實例，諸如除AAV9以外之天然存在之AAV血清型(例如AAV1、AAV6、AAV8)所衍生的彼等衣殼或工程化衣殼，諸如AAVMYO (Weinmann等人2020. Nat. Commun. 11(1):5432)、NP22、NP66 (Paulk等人2018. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 10:144-155)、eAAV9 (Jackson等人2020. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 19:496-506)、myoAAV (Tabebordbar等人2021. Cell. 184:4919-38)或AAVrh74。
然而，一些基因遞送方法仍然存在功效及安全相關問題。主要限制因素為：轉基因表現量不足及/或短暫，及轉基因在不合需要之細胞類型中的不適當表現。特定言之，已表明轉基因在抗原呈遞細胞(APC)中之無意表現增加針對經基因修飾之細胞及/或治療性轉基因產物之不利免疫反應之風險，因此減少長期基因表現。
此問題已藉由使用肌肉特異性及橫膈膜特異性順式調節元件(CRE) (亦稱為順式調節模組(CRM))增強基因表現來解決。此等新穎且穩固的人類順式調節元件經由全基因體資料挖掘而獲得，且在橫膈膜及/或心臟及骨骼肌中產生穩固的特異性轉基因表現量，同時避免在非目標組織中表現(WO 2015/110449 A1；WO 2018/178067 A1)。
然而，僅在肌肉、心臟或橫膈膜中使用此等CRM中之一者表現治療蛋白可能不夠，原因尤其在於需要使載體劑量進一步減少至不引起任何不合需要之毒性(諸如基於全身性投與患者之高載體劑量之大部分(若非全部)基因療法試驗中出現的充分記載之肝毒性)的程度。
因此，此項技術中仍需要將基因安全且有效地遞送至肌肉。舉例而言，必須進一步改良靶向組織之基因療法的功效及安全性，理想地藉由開發甚至更穩固的基因療法載體來改良，該等基因療法載體允許治療性轉基因在較低且因此安全的載體(病毒)劑量下達成高且廣泛的橫膈膜、平滑肌、心臟及/或骨骼肌特異性表現，較佳達成橫膈膜、心臟及/或骨骼肌特異性表現。
此項技術中仍需要將基因安全且有效地遞送至肌肉組織而不必增加病毒劑量，由此避免對例如經AAV轉導之細胞及/或AAV載體產生免疫反應。
本發明人依賴於將先前報導之在轉錄水準下強化橫膈膜(亦即橫膈膜：Dph)中之基因表現的核酸調節元件(CRE或順式調節元件)組合，以用於強化肌肉組織(例如骨骼肌、心臟及橫膈膜)中之核酸表現。
如實驗部分中所示，本發明人鑑別出特異性增強肌肉組織(例如骨骼肌、心臟及橫膈膜)中之基因表現之此類核酸調節元件的特定組合。
此組合方法允許肌肉組織中之表現甚至更穩固。隨後證實橫膈膜調節元件組合之活體內產生效率及組織特異性基因表現。因此，此方法允許使用較低且因此安全之載體(病毒)劑量，同時使治療功效最大化。
因此，本發明提供以下態樣：
態樣1：一種核酸表現卡匣，其包含以下4個順式調節元件(CRE)之組合：Dph-CRE-05、Dph-CRE-02、Dph-CRE-04及Dph-CRE-06，分別由SEQ ID NO: 9至12之核酸序列定義，或由與該等序列具有至少80%、較佳至少85%、更佳至少90%、甚至更佳至少95%(諸如95%、96%、97%、98%或99%)一致性的序列、該等序列之互補序列或在嚴格條件下與由該等序列定義之核酸雜交的序列定義，該等調節元件可操作地連接於橫膈膜、心臟及/或骨骼肌特異性啟動子。
態樣2：如態樣1之核酸表現卡匣，其中Dph-CRE-05、Dph-CRE-02、Dph-CRE-04及Dph-CRE-06之序列分別由SEQ ID NO: 9至12定義。
態樣3：如態樣1或2之核酸表現卡匣，其中Dph-CRE-05、Dph-CRE-02、Dph-CRE-04及Dph-CRE-06之序列分別由SEQ ID NO: 9至12定義。
態樣4：如態樣1至3中任一項之核酸表現卡匣，其中該等CRE之組合係選自以下CRE元件排序或序列中之任一者： Dph-CRE-05_Dph-CRE-02_Dph-CRE-04_Dph-CRE-06， Dph-CRE-05_Dph-CRE-02_Dph-CRE-06_Dph-CRE-04， Dph-CRE-05_Dph-CRE-04_Dph-CRE-02_Dph-CRE-06， Dph-CRE-05_Dph-CRE-04_Dph-CRE-06_Dph-CRE-02， Dph-CRE-05_Dph-CRE-06_Dph-CRE-04_Dph-CRE-02， Dph-CRE-05_Dph-CRE-06_Dph-CRE-02_Dph-CRE-04， Dph-CRE-04_Dph-CRE-02_Dph-CRE-05_Dph-CRE-06， Dph-CRE-04_Dph-CRE-02_Dph-CRE-06_Dph-CRE-05， Dph-CRE-04_Dph-CRE-06_Dph-CRE-02_Dph-CRE-05， Dph-CRE-04_Dph-CRE-06_Dph-CRE-05_Dph-CRE-02， Dph-CRE-04_Dph-CRE-05_Dph-CRE-02_Dph-CRE-06， Dph-CRE-04_Dph-CRE-05_Dph-CRE-06_Dph-CRE-02， Dph-CRE-06_Dph-CRE-02_Dph-CRE-05_Dph-CRE-04， Dph-CRE-06_Dph-CRE-02_Dph-CRE-04_Dph-CRE-05， Dph-CRE-06_Dph-CRE-05_Dph-CRE-02_Dph-CRE-04， Dph-CRE-06_Dph-CRE-05_Dph-CRE-04_Dph-CRE-02， Dph-CRE-06_Dph-CRE-04_Dph-CRE-02_Dph-CRE-05， Dph-CRE-06_Dph-CRE-04_Dph-CRE-05_Dph-CRE-02， Dph-CRE-02_Dph-CRE-06_Dph-CRE-05_Dph-CRE-04， Dph-CRE-02_Dph-CRE-06_Dph-CRE-04_Dph-CRE-05， Dph-CRE-02_Dph-CRE-05_Dph-CRE-06_Dph-CRE-04， Dph-CRE-02-Dph-CRE-05_Dph-CRE-04_Dph-CRE-06， Dph-CRE-02_Dph-CRE-04_Dph-CRE-06_Dph-CRE-05，及 Dph-CRE-02_Dph-CRE-04_Dph-CRE-05_Dph-CRE-06。
在某一實施例中，該等CRE之組合定義為Dph-CRE-05、Dph-CRE-02、Dph-CRE-04及Dph-CRE-06，較佳由SEQ ID NO.19定義。
態樣5：如態樣1至4中任一項之核酸表現卡匣，其進一步包含內含子，較佳為小鼠細小病毒(MVM)內含子。
態樣6：如態樣1至5中任一項之核酸表現卡匣，其中該核酸調節元件可操作地連接於轉基因。
態樣7：如態樣1至6中任一項之核酸表現卡匣，其中啟動子為SPc5-12、MCK、MHCK7、MYL2、MB、DES、TNNC1、TCAP、MYH7、ALDA、ACTA1及TPM1，較佳為SPc5-12。
態樣8：如態樣1至7中任一項之核酸表現卡匣，其中該轉基因編碼治療蛋白或免疫原性蛋白。
態樣9：如態樣1至8中任一項之核酸表現卡匣，其中該轉基因編碼分泌型蛋白或結構蛋白，諸如脂聯素、酸性α葡萄糖苷酶(GAA)、肌微管素(MTM1)、卵泡抑素、肌縮蛋白、肌聚糖或質膜修復蛋白。
態樣10：如態樣1至9中任一項之核酸表現卡匣，其中該轉基因編碼酸性α葡萄糖苷酶(GAA)，更佳為密碼子優化之人類酸性α葡萄糖苷酶基因(hGAAco)。
態樣11：如態樣1至10中任一項之核酸表現卡匣，其進一步包含聚腺苷酸化信號，較佳為合成聚腺苷酸化信號(SEQ ID NO: 6)或猴病毒40 (SV40)聚腺苷酸化信號。
態樣12：一種載體，其包含如態樣1至10中任一項之核酸表現卡匣。
態樣13：如態樣12之載體，其係病毒載體，較佳為腺相關病毒(AAV)載體，更佳為AAV9載體。
態樣14：如態樣12之載體，其為非病毒載體，較佳為質體、小環、游離型載體或基於轉位子之載體，諸如基於PiggyBac之載體或基於睡美人(Sleeping Beauty)之載體。
態樣15：一種醫藥組合物，其包含如態樣1至11中任一項之核酸表現卡匣，或如態樣12至14中任一項之載體，及醫藥學上可接受之載劑。
態樣16：如態樣1至11中任一項之核酸表現卡匣、如態樣12至14中任一項之載體或如態樣15之醫藥組合物，其用於藥物中或用於活體內增加轉基因在肌肉及/或心臟組織中之表現。
態樣17：如態樣1至11中任一項之核酸表現卡匣、如態樣12至14中任一項之載體或如態樣15之醫藥組合物，其用於治療龐貝氏症、肌肉萎縮症及/或胞溶體貯積症(LSD)。
可替代地，以下疾病中之任一者可使用如態樣1至11中任一項之核酸表現卡匣、如態樣12至14中任一項之載體或如態樣15之醫藥組合物治療：血清β脂蛋白缺乏症(巴森·科恩茨維格(Bassen Kornzwieg))、乙醯膽鹼受體缺乏(先天性肌無力症候群)、夏洛瓦-薩格奈症候群/病(Charlevoix-Saguenay Syndrome/Disease)、良性先天性肌病、布羅迪病(Brody Disease)、中央核肌病(肌微管性肌病)、軟骨萎縮性肌強直(施瓦茨-詹佩爾症候群(Schwartz-Jampel Syndrome))、查德利症候群(Chudley Syndrome)、指紋肌病、遺傳性神經性肌萎縮(帕森吉-特納症候群(Parsonage-Turner Syndrome))、包涵體肌病(例如2型或3型)、包涵體肌炎、艾薩克氏症候群(Isaac's Syndrome) (神經性肌強直)、肯尼迪氏症(Kennedy's Disease) (脊髓延髓性(肌肉)萎縮)、巨噬細胞肌筋膜炎、麥克阿德爾氏病(McAdle's Disease) (肌磷酸化酶不足/V型肝糖貯積)、多發性單神經炎、肌-眼-腦病、線樣肌病、野中肌病(Nonaka Myopathy)、波紋肌肉病、脛骨肌肉萎縮症(Udd遠端肌病)、韋蘭德氏遠端肌病(Welander's Distal Myopathy)、酸性麥芽糖酶缺乏(龐貝氏症/II型肝糖貯積病)、達農病(Danon Disease)(IIb型肝糖貯積病/空泡性肌病)、去分支酶缺乏(III型肝糖貯積病/弗布斯氏病(Forbe's Disease))、安德森病/症候群(Andersen Disease/Syndrome)(IV型肝糖貯積病/分支酶缺乏)、妥瑞病(Tauri's Disease)(VII型肝糖貯積病/磷酸果糖激酶缺乏)、肌間線蛋白貯積肌病(肌原纖維肌病)、肌腺苷酸去胺酶缺乏、腎上腺腦白質失養症、先天性多發性關節攣縮、共濟失調伴先天性青光眼、共濟失調伴維生素E缺乏、巴氏症候群(Barth Syndrome)、貝特萊姆肌病(Bethlem Myopathy)、肉鹼棕櫚醯基轉移酶缺乏、肉鹼缺乏、中央核心病、遺傳性運動及感覺神經病變(例如夏柯-馬利-杜斯氏病(Charcot-Marie-Tooth Diseases；CMT)，諸如I型CMT、II型CMT、III型CMT (德傑林-索他二氏病(Dejerine-Sottas Disease))、IV型CMT (雷夫蘇姆氏病(Refsum's Disease))、V型CMT；腓骨肌萎縮；神經元型腓骨肌萎縮)、遺傳性感覺及自主神經性病變(例如，I型、III型(家族性自主不良/瑞尼-德伊二氏症候群(Riley-Day Syndrome))、IV型(先天性痛覺不敏感伴無汗症)、先天性纖維型不均衡性肌病、遠端脊髓性肌萎縮、家族性澱粉樣神經病變、家族性擴張型心肌病伴肌肉萎縮症、弗里德希氏共濟失調(Friedreich's Ataxia)、高血鉀週期性麻痹症(甘斯托普病(Gamstorp Disease))、巨軸索神經病變、格林-巴利症候群(Guillain-Barré Syndrome)(急性發炎性脫髓鞘/多發性神經根神經病變)、發熱(惡性發熱)、低血鉀週期性麻痹症、醫源性肌病、卡恩斯-塞爾症候群(Kearns-Sayre Syndrome)、庫格爾伯格威蘭德病(Kugelberg Welander Disease)(III型脊髓性肌萎縮)、萊恩遠端肌病(Laing Distal Myopathy)、蘭伯特-伊頓(肌無力)症候群(Lambert-Eaton (Myasthenic)Syndrome)、利氏症候群(Leigh's Syndrome)、小核肌病/多核肌病、粒線體肌病及/或神經病變、混合性結締組織重疊病、三好氏肌病(Miyoshi myopathy)、多灶性運動神經病變伴傳導阻滯、重症肌無力、先天性肌強直(湯姆森氏病(Thomsen's Disease))、肌強直性肌肉萎縮症(例如，I型(斯坦納特氏病(Steinert's Disease))、II型(近端肌強直性肌病))、眼咽肌肉萎縮症、橄欖體橋腦小腦萎縮、先天性副肌強直、伴腫瘤性神經病變、多發性肌炎、還原體肌病、肩胛骨肌萎縮、管狀聚集性肌病、沃克-瓦爾堡症候群(Walker-Warburg Syndrome)、韋爾德尼格-霍夫曼病(Werdnig-Hoffman Disease)(I型脊髓性肌萎縮)、斑馬體肌病、核膜病、肌肉萎縮症(例如，杜興氏肌肉萎縮症(Duchenne muscular dystrophy；DMD)/貝氏肌肉萎縮症(Becker muscular dystrophy；BMD))；運動神經元疾病(MND)，例如夏柯-馬利-杜斯氏病(CMT)，諸如I型CMT、II型CMT、III型CMT (德傑林-索他二氏病)、IV型CMT (雷夫蘇姆氏病)、V型CMT、脊髓性肌萎縮(SMA)及肌萎縮性側索硬化(ALS)；埃默里-德雷弗斯氏肌肉萎縮症(Emery-Dreifuss muscular dystrophy)、面肩胛肱型肌肉萎縮症(FSHD)、先天性肌肉萎縮症、先天性肌病、肢帶型肌肉萎縮症、代謝性肌病、胞溶體貯積病(例如，法布立病(Fabry disease))、肌肉發炎性疾病、肌無力、粒線體肌病、離子通道異常、核膜病、心肌病、心肥大、心衰竭、遠端肌病或心血管病。
舉例而言，該基因療法可用於選自以下之疾病或病症：胞溶體貯積病(例如，法布立病)，包括肝糖貯積症(例如，龐貝氏症II型肝糖貯積症(GSD)、達農病、IIb型GSD、GSD III或GSD3 (亦稱為科里氏病(Cori's disease)或弗布斯氏病)、GSD IV或GSD4 (亦稱為安德森病)、GSD V或GSD5 (亦稱為麥克阿德爾氏病)、GSD VII或GSD7 (亦稱為妥瑞病(Tarui's disease))、GSD X或GSD10、GSD XII或GSD 12 (亦稱為醛縮酶A缺乏)、GSD XIII或GSD13、GSD XV或GSD15)及黏多糖症(例如，亨特症候群(Hunter syndrome)、聖菲利柏症候群(Sanfilippo syndrome)、黏多糖症(MPS) I、MPS II、MPS III、MPS IIIA、MPS IIIB、MPS IIIC、MPS IV、MPS VI、MPS VII、MPS IX)；粒線體病(例如，巴氏症候群(Barth syndrome))；離子通道病(例如布魯加達症候群(Brugada syndrome))；代謝紊亂；肌微管性肌病(MTM)；肌肉萎縮症(例如，杜興氏肌肉萎縮症(DMD)、貝氏肌肉萎縮症(BMD))；肌強直性營養不良；肌強直性肌肉萎縮症(DM)；三好氏肌病；福山型先天性肌肉萎縮症(Fukuyama type congenital muscular dystrophy)；質膜修復蛋白病(dysferlinopathies)；肌神經病；運動神經元病(MND) (例如，夏克-馬利-杜斯氏病(CMT))、脊髓性肌萎縮(SMA)或肌萎縮性側索硬化(ALS))；埃默里-德雷弗斯氏肌肉萎縮症；面肩胛肱型肌肉萎縮症(FSHD)；先天性肌肉萎縮症；先天性肌病；肢帶型肌肉萎縮症(例如，2E型肢帶型肌肉萎縮症(LGMD2E)、2D型肢帶型肌肉萎縮症(LGMD2D)、2C型肢帶型肌肉萎縮症(LGMD2C)、2B型肢帶型肌肉萎縮症(LGMD2B)、2L型肢帶型肌肉萎縮症(LGMD2L)、2A型肢帶型肌肉萎縮症(LGMD2A))；代謝性肌病；肌肉發炎性疾病；肌無力；粒線體肌病；離子通道異常；核膜病；心肌病；心肥大；心衰竭；遠端肌病、心血管疾病及心臟病。
心血管疾病之非限制性實例包括動脈粥樣硬化、動脈硬化、冠心病、冠狀動脈疾病、周邊動脈疾病、先天性心臟病、充血性心衰竭、心衰竭(亦稱為心功能不全)、心肌梗塞(亦稱為心臟病發作)、心肌局部缺血、急性冠狀動脈症候群、不穩定絞痛、穩定絞痛、心肌病、肥厚性心肌病、擴張型心肌病、限制型心肌病、由基因突變引起之原發性心肌病(諸如布魯加達症候群、龐貝氏症、達農病及及法布立病)、心臟澱粉樣變性(亦稱為心臟僵硬症候群)、心肌炎(亦稱為發炎性心肌病)、心臟瓣膜病、心瓣狹窄、瓣閉鎖不全、心內膜炎、風濕性心臟病、心包炎(亦即，由心包發炎及/或感染引起的病)、心臟填塞(亦稱為心包填塞)、心內膜炎、心律不整、高血壓、低血壓、血管狹窄、心瓣狹窄或再狹窄。
另外，如態樣1至11中任一項之核酸表現卡匣、如態樣12至14中任一項之載體或如態樣15之醫藥組合物，可用於治療以下疾病或病症中之任一或多者：神經肌肉性失常及心臟病，諸如血清β脂蛋白缺乏症(巴森·科恩茨維格)、乙醯膽鹼受體不足(先天性肌無力症候群)、夏洛瓦-薩格奈症候群/病、良性先天性肌病、布羅迪病、中央核肌病(肌微管性肌病)、軟骨萎縮性肌強直(施瓦茨-詹佩爾症候群)、查德利症候群、指紋肌病、遺傳性神經性肌萎縮(帕森吉-特納症候群)、包涵體肌病(例如，2型或3型)、包涵體肌炎、艾薩克氏症候群(神經性肌強直)、肯尼迪氏症(脊髓延髓性(肌肉)萎縮)、巨噬細胞肌筋膜炎、麥克阿德爾氏病(肌磷酸化酶不足/V型肝糖貯積)、多發性單神經炎、肌-眼-腦病、線樣肌病、野中肌病、波紋肌肉病、脛骨肌肉萎縮症(Udd遠端肌病)、韋蘭德氏遠端肌病、酸性麥芽糖酶缺乏(龐貝氏症/II型肝糖貯積病)、達農病(IIb型肝糖貯積病/空泡性肌病)、去分支酶缺乏(III型肝糖貯積病/弗布斯氏病)、安德森病/症候群(IV型肝糖貯積病/分支酶缺乏)、妥瑞病(VII型肝糖貯積病/磷酸果糖激酶缺乏)、肌間線蛋白貯積肌病(肌原纖維肌病)、肌腺苷酸去胺酶缺乏、腎上腺腦白質失養症、先天性多發性關節攣縮、共濟失調伴先天性青光眼、共濟失調伴維生素E缺乏、巴氏症候群、貝特萊姆肌病、肉鹼棕櫚醯基轉移酶缺乏、肉鹼缺乏、中央核心病、遺傳性運動及感覺神經病變(例如，夏柯-馬利-杜斯氏病(CMT)，諸如I型CMT、II型CMT、III型CMT (德傑林-索他二氏病)、IV型CMT (雷夫蘇姆氏病)、V型CMT；腓骨肌萎縮；神經元型腓骨肌萎縮)、遺傳性感覺及自主神經性病變(例如，I型、III型(家族性自主不良/瑞尼-德伊二氏症候群)、IV型(先天性痛覺不敏感伴無汗症)、先天性纖維型不均衡性肌病、遠端脊髓性肌萎縮、家族性澱粉樣神經病變、家族性擴張型心肌病伴肌肉萎縮症、弗里德希氏共濟失調、高血鉀週期性麻痹症(甘斯托普病)、巨軸索神經病變、格林-巴利症候群(急性發炎性脫髓鞘/多發性神經根神經病變)、發熱(惡性發熱)、低血鉀週期性麻痹症、醫源性肌病、卡恩斯-塞爾症候群、庫格爾伯格威蘭德病(III型脊髓性肌萎縮)、萊恩遠端肌病、蘭伯特-伊頓(肌無力)症候群、利氏症候群、小核肌病/多核肌病、粒線體肌病及/或神經病變、混合性結締組織重疊病、三好氏肌病、多灶性運動神經病變伴傳導阻滯、重症肌無力、先天性肌強直(湯姆森氏病)、肌強直性肌肉萎縮症(例如，I型(斯坦納特氏病)、 II型(近端肌強直性肌病))、眼咽肌肉萎縮症、橄欖體橋腦小腦萎縮、先天性副肌強直、伴腫瘤性神經病變、多發性肌炎、還原體肌病、肩胛骨肌萎縮、管狀聚集性肌病、沃克-瓦爾堡症候群、韋爾德尼格-霍夫曼病(I型脊髓性肌萎縮)、斑馬體肌病、核膜病、肌肉萎縮症(例如，杜興氏肌肉萎縮症(DMD)/貝氏肌肉萎縮症(BMD))；運動神經元疾病(MND)，例如夏柯-馬利-杜斯氏病(CMT)(諸如I型CMT、II型CMT、III型CMT(德傑林-索他二氏病)、IV型CMT(雷夫蘇姆氏病)、V型CMT、脊髓性肌萎縮(SMA)及肌萎縮性側索硬化(ALS))；埃默里-德雷弗斯氏肌肉萎縮症、面肩胛肱型肌肉萎縮症(FSHD)、先天性肌肉萎縮症、先天性肌病、肢帶型肌肉萎縮症、代謝性肌病、肌肉發炎性疾病、肌無力、粒線體肌病、離子通道異常、核膜病、心肌病、心肥大、心衰竭、遠端肌病、心血管疾病、血友病(包括A型及B型血友病)及糖尿病。
在一個實施例中，可受益於使用如態樣1至11中任一項之核酸表現卡匣、如態樣12至14中任一項之載體或如態樣15之醫藥組合物的基因療法(其中使用肌間線蛋白啟動子(例如，人類DES 1.4kb啟動子(SEQ ID NO: 20)或人類DES 1.0kb啟動子(SEQ ID NO: 21)啟動子))的疾病及病症為影響骨骼肌之疾病，且包括血清β脂蛋白缺乏症(巴森·科恩茨維格)、乙醯膽鹼受體不足(先天性肌無力症候群)、夏洛瓦-薩格奈症候群/病、良性先天性肌病、布羅迪病、中央核肌病(肌微管性肌病)、軟骨萎縮性肌強直(施瓦茨-詹佩爾症候群)、查德利症候群、指紋肌病、遺傳性神經性肌萎縮(帕森吉-特納症候群)、包涵體肌病(例如，2型或3型)、包涵體肌炎、艾薩克氏症候群(神經肌強直)、肯尼迪氏症(脊髓延髓性(肌肉)萎縮症)、巨噬細胞肌筋膜炎、麥克阿德爾氏症(肌磷酸化酶缺乏/V型肝糖貯積)、多發性單神經炎、肌-眼-腦病、線樣肌病、野中肌病、波紋肌肉病、脛骨肌肉萎縮症(Udd遠端肌病)及韋蘭德氏遠端肌病。
在一個實施例中，可受益於使用如態樣1至11中任一項之核酸表現卡匣、如態樣12至14中任一項之載體或如態樣15之醫藥組合物的基因療法(其中使用SPc5-12啟動子(例如，由SEQ ID NO: 4定義之SPc5-12啟動子))的疾病及病症為影響骨骼肌及心臟兩者之疾病，且包括酸性麥芽糖酶缺乏(龐貝氏症/II型肝糖貯積病)、達農病(IIb型肝糖貯積病/空泡性肌病)、去分支酶缺乏(III型肝糖貯積病/弗布斯氏病)、安德森病/症候群(IV型肝糖貯積病/分支酶缺乏)、妥瑞病(VII型肝糖貯積病/磷酸果糖激酶缺乏)、肌間線蛋白貯積肌病(肌原纖維肌病)、肌腺苷酸去胺酶缺乏、腎上腺腦白質失養症、先天性多發性關節攣縮、共濟失調伴先天性青光眼、共濟失調伴維生素E缺乏、巴氏症候群、貝特萊姆肌病、肉鹼棕櫚醯基轉移酶缺乏、肉鹼缺乏、中央核心病、遺傳性運動及感覺神經病變(例如，夏柯-馬利-杜斯氏病(CMT)，諸如I型CMT、II型CMT、III型CMT (德傑林-索他二氏病)、IV型CMT (雷夫蘇姆氏病)、V型CMT；腓骨肌萎縮；神經元型腓骨肌萎縮)、遺傳性感覺及自主神經性病變(例如，I型、III型(家族性自主不良/瑞尼-德伊二氏症候群)、IV型(先天性痛覺不敏感伴無汗症)、先天性纖維型不均衡性肌病、遠端脊髓性肌萎縮、家族性澱粉樣神經病變、家族性擴張型心肌病伴肌肉萎縮症、弗里德希氏共濟失調、高血鉀週期性麻痹症(甘斯托普病)、巨軸索神經病變、格林-巴利症候群(急性發炎性脫髓鞘/多發性神經根神經病變)、發熱(惡性發熱)、低血鉀週期性麻痹症、醫源性肌病、卡恩斯-塞爾症候群、庫格爾伯格威蘭德病(III型脊髓性肌萎縮)、萊恩遠端肌病、蘭伯特-伊頓(肌無力)症候群、利氏症候群、小核肌病/多核肌病、粒線體肌病及/或神經病變、混合性結締組織重疊病、三好氏肌病、多灶性運動神經病變伴傳導阻滯、重症肌無力、先天性肌強直(湯姆森氏病)、肌強直性肌肉萎縮症(例如，I型(斯坦納特氏病)、II型(近端肌強直性肌病))、眼咽肌肉萎縮症、橄欖體橋腦小腦萎縮、先天性副肌強直、伴腫瘤性神經病變、多發性肌炎、還原體肌病、肩胛骨肌萎縮、管狀聚集性肌病、沃克-瓦爾堡症候群、韋爾德尼格-霍夫曼病(I型脊髓性肌萎縮)、斑馬體肌病及核膜病。
態樣18：如態樣1至11中任一項之核酸表現卡匣、如態樣12至14中任一項之載體或如態樣15之醫藥組合物，其適用作疫苗、較佳預防性疫苗，或適用於疫苗接種療法、較佳預防性疫苗接種。
態樣19：如態樣1至11中任一項之核酸表現卡匣、如態樣12至14中任一項之載體或如態樣15之醫藥組合物，其用於治療選自包含以下之群的非肌肉疾病：血友病(例如，A型血友病及B型血友病)；亨特症候群、苯酮尿症(PKU)、遺傳性血管水腫(HAE)、α抗胰蛋白酶(AAT)缺乏、甲狀腺素轉運蛋白澱粉樣變性、法布立病、糖尿病及癌症，其中如態樣1至11中任一項之該核酸表現卡匣、如態樣12至14中任一項之載體或如態樣15之醫藥組合物表現用於治療該疾病或病症的分泌型蛋白。
態樣20：一種用於在橫膈膜、骨骼肌及/或心臟細胞中表現轉基因產物的方法，較佳為活體外或離體方法，其包含： - 將如態樣1至11中任一項之核酸表現卡匣或如態樣13至14中任一項之載體引入該等細胞中；及 - 在該等細胞中表現該轉基因產物。
態樣21：一種如態樣1至11中任一項之核酸表現卡匣用於增強橫膈膜、骨骼肌及/或心臟組織中之基因表現的用途。
態樣22：一種用於在橫膈膜、骨骼肌及/或心臟細胞中表現轉基因產物的方法，較佳為活體外或離體方法，其包含： - 將如態樣1至11中任一項之核酸表現卡匣或如態樣12至14中任一項之載體引入該等細胞中；及 - 在該等細胞中表現該轉基因產物。
態樣23：一種用於治療MTM之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量的如態樣1至11中任一項之核酸表現卡匣、如態樣12至14中任一項之載體或如態樣15之醫藥組合物。
態樣24：一種用於治療龐貝氏症的方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量的如態樣1至11中任一項之核酸表現卡匣、如態樣12至14中任一項之載體或如態樣15之醫藥組合物，其各自包含如態樣1、4、5及7中任一項之核酸調節元件。在某一實施例中，轉基因為α酸性葡萄糖苷酶(GAA)。
態樣25：一種用於治療以上態樣17中所列出之疾病或病症中之任一者的方法，更尤其選自包含以下之群的彼等疾病或病症：肌肉萎縮症(例如，杜興氏肌肉萎縮症(DMD)/貝氏肌肉萎縮症(BMD))、肌強直性營養不良、肌強直性肌肉萎縮症(DM)、杜興氏肌肉萎縮蛋白病(Duchenne dystrophinopathy)、肌聚糖病、三好氏肌病、福山型先天性肌肉萎縮症、質膜修復蛋白病、肌神經病、運動神經元疾病(MND)(諸如夏柯-馬利-杜斯氏病(CMT)、脊髓性肌萎縮(SMA)及肌萎縮性側索硬化(ALS))、埃默里-德雷弗斯氏肌肉萎縮症、面肩胛肱型肌肉萎縮症(FSHD)、先天性肌肉萎縮症、先天性肌病、肢帶型肌肉萎縮症、代謝性肌病、肌肉發炎性疾病、肌無力、粒線體肌病、離子通道異常、核膜病、心肌病、心肥大、心衰竭、遠端肌病、心血管疾病、血友病(包括A型血友病及B型血友病)及糖尿病，該方法包含投與治療有效量之如態樣1至11中任一項之核酸表現卡匣、如態樣12至14中任一項之載體或如態樣15之醫藥組合物。
在某一實施例中，所使用之轉基因為用於治療肌肉萎縮症，更尤其杜興氏肌肉萎縮症或用於治療肌聚糖缺乏的脂聯素。
在某一實施例中，所使用之轉基因為用於治療肌肉萎縮症，更尤其杜興氏肌肉萎縮症或用於治療肌聚糖缺乏的卵泡抑素。
在某一實施例中，轉基因為肌微管素1 (MTM1)，用於治療X連鎖肌微管性肌病。
態樣26. 在以上態樣中之任一項中，載體可為由SEQ ID NO: 1編碼之AAV-Dph-CRE05-CRE02-CRE04-CRE06-SPc5-12-MVM-Luc-pA載體或由SEQ ID NO: 14編碼之AAV-Dph-CRE05-CRE02-CRE04-CRE06-SPc5-12-MVM-h(脂聯素)-pA載體。
態樣27. 在以上態樣中之任一者中，儘管肌肉定向表現通常基於蛋白質表現，但諸如siRNA、gRNA、circRNA、lncRNA、shRNA、miRNA等非編碼RNA (ncRNA)之表現可藉由如態樣1至11中任一項之核酸表現卡匣、如態樣12至14中任一項之載體或如態樣15之醫藥組合物來達成。
態樣28. 如態樣1至11中任一項之核酸表現卡匣、如態樣12至14中任一項之載體或如態樣15之醫藥組合物，其用於基因疫苗接種(例如，針對COVID-19)或用於表現抗體或奈米抗體或用於表現CRISPR/Cas組分，尤其CRISPR/Cas9。
通用定義 如本文所使用，除非上下文另外明確規定，否則單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括單數及複數種指代物二者。
如本文所使用之術語「包含(comprising/comprises/comprised of)」與「包括(including/includes)」或「含有(containing/contains)」同義，且為包括性或開放性的，且不排除額外的未敍述成員、元件或方法步驟。該等術語亦涵蓋「由…組成(consisting of)」及「基本上由…組成(consisting essentially of)」，其在專利術語中享有公認含義。
藉由端點敍述之數值範圍包括包含於各別範圍內之所有數字及分數，以及所述端點。
在提及諸如參數、量、時距及其類似者之可量測值時，如本文中所使用之術語「約」或「大約」意欲涵蓋所指定值之變化及相對於所指定值之變化，諸如所指定值之+/-10%或更小、較佳地+/-5%或更小、更佳地+/-1%或更小且再更佳地+/-0.1%或更小的變化及相對於所指定值之變化，就此而言，此等變化適合於本發明的實施。應理解，修飾詞「約」所指之值自身亦特定地為其本身，且較佳揭示其本身。
鑒於術語「一或多個」或「至少一個」(諸如一群成員中之一或多個成員或至少一個成員)藉助於進一步範例而使得本身為清楚的，該術語尤其涵蓋提及該等成員中之任一者或該等成員中之任何兩者或更多者，諸如該等成員之任何≥3、≥4、≥5、≥6或≥7者等，及直至所有該等成員。在另一實例中，「一或多個(one or more)」或「至少一個(at least one)」可指1、2、3、4、5、6、7個或更多個。
本文中對本發明背景的論述係為了解釋本發明之上下文而包括在內。此並不視為承認所提及之任何材料為任何國家截至任何申請專利範圍之優先權日期已公開、已知的或為公共常識的一部分。
在通篇本發明中，藉由鑑別引用參考各種公開案、專利及所公開之專利說明書。在本說明書中所引用之所有文獻皆以全文引用之方式併入本文中。特定言之，本文中特定提及之此類文獻之教示內容或章節以引用之方式併入。
除非另外定義，否則用於揭示本發明之所有術語(包括技術及科學術語)具有如一般熟習本發明所屬技術者通常所理解之含義。藉助於進一步導引，術語定義包括在內以更好地瞭解本發明之教示內容。當結合本發明之特定態樣或本發明之特定實施例定義特定術語時，除非另外定義，否則此類內涵意欲應用於通篇本說明書中，亦即本發明之其他態樣或實施例之上下文中。
在以下段落中，更詳細地定義本發明之不同態樣或實施例。除非明顯相反地指示，否則如此定義之各態樣或實施例可與任何其他態樣或實施例組合。特定言之，指示為較佳或有利之任何特徵可與指示為較佳或有利之任何其他特徵組合。
在通篇本說明書中，提及「一個實施例」或「一實施例」意謂結合實施例所描述之特定特徵、結構或特性包括於本發明之至少一個實施例中。因此，在通篇本說明書之不同位置中出現的片語「在一個實施例中」或「在一實施例中」未必皆指同一實施例，而是可指同一實施例。此外，如熟習此項技術者將由本發明顯而易見，在一或多個實施例中，特定特徵、結構或特性可以任何適合方式組合。此外，當本文所描述之一些實施例包括一些特徵而非包括於其他實施例中之其他特徵時，不同實施例之特徵之組合意欲在本發明之範疇內且形成不同實施例，如熟習此項技術中者所瞭解。舉例而言，在隨附申請專利範圍中，所主張之實施例中之任一者可以任何組合使用。
對於與本發明相關之一般方法，尤其參考熟知教科書，包括例如「Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版」(Sambrook等人, 1989)、「Current Protocols in Molecular Biology」(Ausubel等人, 1987)。
在一個態樣中，本發明係關於用於增強肌肉細胞或組織中之基因表現的特異性核酸調節元件(順式調節元件或CRE)的組合，該等CRE包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 9至12，或與此等序列中之任一者具有至少80%、較佳至少85%、更佳至少90%、甚至更佳至少95% (諸如95%、96%、97%、98%或99%)一致性的序列，或選自由SEQ ID NO: 9至12組成之群之序列的功能性片段。以下實例中之表1描繪用於增強肌肉細胞或組織(例如骨骼肌、心臟及橫膈膜)中之基因表現的不同核酸調節元件的核心核苷酸序列及其對應基因及長度。在本文中，基本上由…組成暗示調節元件可例如另外包含用於選殖目的之序列，但所指示之序列構成調節元件之基本部分，例如其不形成較大調節區(諸如啟動子)之一部分。
如本文所用，『核酸調節元件」』或『調節元件』亦稱為「CRE」(順式調節元件)、「CRM」(順式調節模組)或「SH」係指能夠調節及/或控制基因轉錄、尤其基因組織特異性轉錄的非編碼順式作用轉錄控制元件。調節元件包含至少一個轉錄因子結合位點(TFBS)，更尤其用於組織特異性轉錄因子之至少一個結合位點，最尤其用於肌肉特異性轉錄因子之至少一個結合位點。通常，與無調節元件僅依靠啟動子的基因轉錄相比，如本文所使用之調節元件增加或增強啟動子驅動之基因表現。因此，調節元件尤其包含增強子序列，但應理解增強轉錄之調節元件不限於典型遠端上游增強子序列，而是可出現在調節元件調節基因之任何距離處。實際上，如此項技術中已知，調節轉錄之序列可位於其在活體內調節之基因的上游(例如啟動子區中)或下游(例如3'UTR中)，且可位於基因附近或遠一點或在基因自身內。值得注意的是，儘管如本文所揭示之調節元件通常包含天然存在之序列，但此類調節元件(一部分)的組合或調節元件之若干複本(亦即包含非天然存在之序列之調節元件)本身亦設想為調節元件。如本文所用之調節元件可包含涉及轉錄控制之較大序列之一部分，例如啟動子序列之一部分。然而，單獨的調節元件通常不足以引發轉錄，但為此目的需要啟動子。本文中所揭示之調節元件係以核酸分子形式提供，亦即分離之核酸或經分離之核酸分子。該等核酸調節元件因此具有僅為天然存在之基因體序列的一小部分且因此並非天然存在，而是自其分離的序列。
如本文所用之術語「核酸」通常係指基本上由核苷酸組成之任何長度的寡聚物或聚合物(較佳線性聚合物)。核苷酸單元通常包括雜環鹼基、糖基及至少一個(例如一個、兩個或三個)磷酸酯基，包括經修飾或經取代之磷酸酯基。雜環鹼基尤其可包括嘌呤及嘧啶鹼基，諸如腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U)，其在天然存在之核酸、其他天然存在之鹼基(例如黃嘌呤、肌苷、次黃嘌呤)以及化學或生物化學修飾(例如甲基化)、非天然或衍生鹼基中分佈廣泛。糖基尤其可包括戊糖(戊呋喃糖)基團，諸如較佳為天然存在之核酸中之核糖及/或2-去氧核糖，或阿拉伯糖(arabinose)、2-去氧阿拉伯糖(2-deoxyarabinose)、蘇糖或己糖基團，以及經修飾或經取代之糖基團。如本文所預期之核酸可包括天然存在之核苷酸、經修飾之核苷酸或其混合物。經修飾之核苷酸可包括經修飾之雜環鹼基、經修飾之糖部分、經修飾之磷酸酯基或其組合。可引入磷酸酯基或糖之修飾以改良穩定性、酶促降解之抗性或一些其他有用性質。術語「核酸」更佳涵蓋DNA、RNA及DNA/RNA雜交分子，特定地包括hnRNA、前mRNA、mRNA、cDNA、基因體DNA、擴增產物、寡核苷酸及合成(例如化學合成) DNA、RNA或DNA/RNA雜交體。核酸可為天然存在的，例如存在於自然界中或自自然界中分離；或可為非天然存在的，例如重組，亦即藉由重組DNA技術產生，及/或部分或完全以化學或生物化學方式合成。「核酸」可為雙股、部分雙股或單股的。在單股之情況下，核酸可為有義股或反義股。另外，核酸可為環狀或線性的。
如本文所用，「轉錄因子結合位點」、「轉錄因子結合序列」或「TFBS」係指轉錄因子所結合之核酸區域的序列。TFBS之非限制性實例包括轉錄因子3之結合位點，亦稱為TCF3或E2A；核因子I之結合位點，亦稱為NF1；CCAAT-增強子-結合蛋白之結合位點，亦稱為C/EBP；肌原性分化之結合位點，亦稱為MyoD；固醇調節元件-結合蛋白之結合位點，亦稱為SREBP；白血病/淋巴瘤相關因子之結合位點，亦稱為LRF；蛋白質53結合位點，亦稱為p53；肝細胞核因子3-α之結合位點，亦稱為HNF3a；肝細胞核因子3-β之結合位點，亦稱為HNF3b；肝細胞核因子4之結合位點，亦稱為HNF4；肌細胞特異性增強子因子2A之結合位點，亦稱為MEF2A或RSRFC4；過氧化體增殖因子活化受體之結合位點，亦稱為PPAR；血清反應因子之結合位點，亦稱為SRF；轉錄活化因子樣蛋白1b之結合位點，亦稱為Tal1_b。轉錄因子結合位點可見於資料庫中，諸如Transfac®中。
本文所揭示之序列可為能夠控制活體內橫膈膜特異性及骨骼肌特異性基因轉錄之調節元件的部分序列。尤其用於橫膈膜特異性及骨骼肌特異性調節元件之特定實例可控制以下基因(參見表1)：ACTA1及CKM。
因此，在實施例中，本文中所揭示之核酸調節元件包含來自ACTA1調節元件之序列，亦即控制ACTA1基因(α-肌動蛋白-1基因)活體內表現之調節元件，例如包含SEQ ID NO: 9至11中之任何一或多者或其功能片段的調節元件。
在其他實施例中，本文揭示之核酸調節元件包含來自CKM調節元件的序列，亦即活體內控制CKM基因(肌肉肌酸激酶基因)表現之調節元件，例如包括SEQ ID NO: 12或其功能片段的調節元件。
本文所揭示之序列可為能夠控制活體內橫膈膜特異性、骨骼肌特異性及心臟特異性基因轉錄之調節元件的部分序列。尤其用於橫膈膜特異性、骨骼肌特異性及心臟特異性調節元件之特定實例可控制以下基因：ACTA1及/或CKM。因此，在實施例中，本文中所揭示之核酸調節元件包含來自ACTA1調節元件之序列，亦即控制ACTA1基因(α-肌動蛋白-1基因)活體內表現之調節元件，例如包含SEQ ID NO: 9至11中之任何一或多者或其功能片段的調節元件。在其他實施例中，本文揭示之核酸調節元件包含來自CKM調節元件的序列，亦即活體內控制CKM基因(肌肉肌酸激酶基因)表現之調節元件，例如包括SEQ ID NO: 12或其功能片段的調節元件。
如本文所用，術語「一致性」及「一致」及其類似者係指兩種聚合物分子之間，例如兩種核酸分子(例如兩種DNA分子)之間的序列相似性。序列比對及序列一致性之測定可例如使用最初由以下描述之鹼基局部比對檢索工具(BLAST)進行：Altschul等人1990 (J. Mol. Biol. 215:403-10)，諸如「Blast 2序列」算法，其由Tatusova及Madden 1999 (FEMS Microbiol. Lett. 174:247-250)描述。通常，在整個序列長度內計算序列一致性百分比。如本文所用，術語「實質上一致」表示至少90%，較佳至少95%，諸如95%、96%、97%、98%或99%的序列一致性。
如本申請案中所用，術語『功能性片段』係指本文所揭示之調節元件序列的片段，其保持調節肌肉特異性表現的能力，亦即，其可仍賦予組織特異性且其能夠以與衍生其之序列相同之方式(儘管程度可能不同)調節(轉)基因的表現。功能性片段較佳可包含衍生其之序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少120、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350或至少400個連續核苷酸。亦較佳地，功能性片段可包含衍生其之序列中存在的至少1個、更佳至少2個、至少3個、或至少4個、甚至更佳至少5個、至少10個、或至少15個轉錄因子結合位點(TFBS)。
如本申請案中所用之「橫膈膜及骨骼肌特異性表現」係指相比於其他(亦即非橫膈膜或骨骼肌)組織，(轉)基因(如RNA及/或多肽)在橫膈膜及骨骼肌細胞或橫膈膜或骨骼肌組織中之表現優先或占主導。根據特定實施例，至少50%、更特定言之至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%之(轉)基因表現發生在橫膈膜及/或骨骼肌細胞或組織內。根據特定實施例，橫膈膜及骨骼肌特異性表現需要『洩漏』至除肌肉外之其他器官或組織(諸如肺、肝、腦、腎及/或脾)的所表現基因產物小於10%、小於5%、小於2%或甚至小於1%。
如本文所用，「橫膈膜、骨骼肌及心臟特異性表現」係指(轉)基因在橫膈膜、心臟、骨骼肌細胞或組織且尤其心臟肌肉中之表現優先或占主導。根據特定實施例，至少50%、更特定言之至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%之(轉)基因表現發生在橫膈膜、骨骼肌細胞及心臟組織內。因此，根據特定實施例，小於10%、小於5%、小於2%或甚至小於1%之(轉)基因表現發生在除橫膈膜、心臟及骨骼肌以外的器官或組織中。
細節上作必要修改後同樣適用於肌細胞特異性及肌母細胞特異性表現，其可視為肌肉特異性表現之特定形式。在通篇申請案中，在表現之上下文中提及肌肉特異性的情況下，亦明確地設想肌細胞特異性及肌母細胞特異性表現。類似地，在本申請案中使用心肌及骨骼肌特異性表現之情況下，亦明確地設想心肌細胞及骨骼肌細胞特異性表現及心肌母細胞及骨骼肌母細胞特異性表現。類似地，在本申請案中使用骨骼肌特異性表現之情況下，亦明確地設想骨骼肌細胞特異性及骨骼肌母細胞特異性表現。
如本文所用，術語「心臟肌肉(heart muscle)」或「心肌(cardiac muscle)」係指心臟中發現的自動調節的橫紋肌類型。
如本文所用，術語「骨骼肌」係指附接至骨架之自主控制的橫紋肌類型。骨骼肌之非限制性實例包括二頭肌、三頭肌、四頭肌、脛骨內肌以及腓腸肌。
如本文所用，術語「肌細胞」係指已自肌母細胞祖細胞分化的細胞，使得其能夠在適當條件下表現肌肉特異性表現型。終末分化之肌細胞彼此融合形成肌管(肌纖維之主要組分)。術語「肌細胞」亦指去分化之肌細胞。該術語包括活體內細胞及離體培養之細胞，不管此類細胞為初級的抑或繼代的。
如本文所用，術語「肌母細胞」係指中胚層中分化以產生肌肉細胞或肌細胞的(胚胎)細胞。該術語包括活體內細胞及離體培養之細胞，不管此類細胞為初級的抑或繼代的。
在實施例中，本發明係關於以下四種核酸調節元件之組合，用於增強橫膈膜及骨骼肌中之基因表現：Dph-CRE-05、Dph-02、Dph-04及Dph-06。該等CRE分別包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：由SEQ ID NO: 9至12定義之序列(表1)；與該等序列具有至少80%、較佳至少85%、更佳至少90%、甚至更佳至少95% (諸如95%、96%、97%、98%或99%)一致性的序列；或其功能性片段，其中該等功能性片段包含衍生其之序列的至少20、較佳至少25、更佳至少50、至少100、至少200或至少250個連續核苷酸，且其中該等功能性片段包含衍生其之序列中存在的至少1、較佳至少5、更佳至少10或至少15個轉錄因子結合位點(TFBS)。
在以單股核酸形式提供調節元件的情況下，例如，當使用單股AAV載體時，認為互補序列股等效於所揭示之序列。因此，亦揭示用於增強肌肉特異性基因表現之核酸調節元件，其包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：本文中所描述之序列的互補序列，亦即由SEQ ID NO: 9至12定義；與此等序列中之任一者具有至少80%、較佳至少85%、更佳至少90%、甚至更佳至少95% (諸如95%、96%、97%、98%或99%)一致性的序列；或其功能性片段。
本文亦揭示用於增強肌肉特異性基因表現之該等核酸調節元件，其在嚴格條件下與由以下定義之核酸調節元件中之任一者雜交：SEQ ID NO: 9至12；與此等序列中之任一者具有至少90%、較佳至少95% (諸如95%、96%、97%、98%或99%)一致性的序列；其功能性片段；或其互補序列。該等核酸調節元件不需要具有與其雜交之序列相等的長度。在較佳實施例中，該雜交核酸調節元件在長度上的尺寸與與其所雜交之序列差異不超過25%，特定言之20%，更特定言之15%，最特定言之10%。
表述『在嚴格條件下雜交』係指核酸分子能夠在定義之溫度及鹽濃度條件下與目標核酸分子雜交。通常，嚴格雜交條件比原生雙螺旋體之解鏈溫度(Tm)低不超過25℃至30℃ (例如20℃、15℃、10℃或5℃)。計算Tm之方法為此項技術中所熟知。作為非限制性實例，實現嚴格雜交之代表性鹽及溫度條件為：在65℃下，1×SSC，0.5% SDS。縮寫SSC係指核酸雜交溶液中所用之緩衝液。一公升20× (二十倍濃縮)儲備SSC緩衝溶液(pH 7.0)含有175.3 g氯化鈉及88.2 g檸檬酸鈉。實現雜交之代表性時間段係12小時。
較佳地，如本文所描述之調節元件僅在長度有限時完全起作用。此允許其用於載體或核酸表現卡匣而不過度地限制其有效負載容量。相應地，在實施例中，本文揭示之調節元件中之任一者為1500個核苷酸或更少、1000個核苷酸或更少、900個核苷酸或更少、800個核苷酸或更少、700個核苷酸或更少、更佳600個核苷酸或更少的核酸，諸如550個核苷酸或更少、500個核苷酸或更少、450個核苷酸或更少、400個核苷酸或更少、350個核苷酸或更少、或300個核苷酸或更少的核酸(亦即，該核酸調節元件的最大長度為：1500個核苷酸、1000個核苷酸、900個核苷酸、800個核苷酸、700個核苷酸，較佳為600個核苷酸，諸如550個核苷酸、500個核苷酸、450個核苷酸、400個核苷酸、350個核苷酸或300個核苷酸)。
然而，應理解，所揭示之核酸調節元件保留調節活性(亦即就轉錄之特異性及/或活性而言)，且因此其尤其具有20個核苷酸、25個核苷酸、30個核苷酸、35個核苷酸、40個核苷酸、45個核苷酸、50個核苷酸、100個核苷酸、150個核苷酸、200個核苷酸、250個核苷酸、300個核苷酸、350個核苷酸或400個核苷酸之最小長度。
在某些實施例中，本發明提供選自由以下組成之群之序列之1000個核苷酸或更少、較佳900個核苷酸或更少、較佳800個核苷酸或更少、較佳700個核苷酸或更少的核酸調節元件：SEQ ID NO: 1至89；與該等序列中之任一者具有至少80%、較佳至少85%、更佳至少90%、甚至更佳至少95% (諸如95%、96%、97%、98%或99%)一致性的序列；或其功能性片段。
本文中所揭示之核酸調節元件組合可用於核酸表現卡匣中。因此，在一態樣中，本發明提供如本文中所描述之核酸調節元件在核酸表現卡匣中之用途。
在一態樣中，本發明提供一種核酸表現卡匣，其包含如本文中所描述之核酸調節元件之組合，該等核酸調節元件可操作地連接於啟動子。在實施例中，核酸表現卡匣不含轉基因。此類核酸表現卡匣可用於驅動內源基因之表現。在較佳實施例中，核酸表現卡匣包含如本文中所描述之核酸調節元件，該等核酸調節元件可操作地連接於啟動子及轉基因。
如本文所用，術語『核酸表現卡匣』係指核酸分子，其包括在一或多種所需細胞類型、組織或器官中導引(轉)基因表現的一或多種轉錄控制元件(諸如(但不限於)啟動子、增強子及/或調節元件、聚腺苷酸化序列及內含子)。通常，其亦將含有轉基因，但亦設想核酸表現卡匣導引內源基因在插有核酸卡匣之細胞中的表現。
如本文所用，術語『可操作地連接』係指各種核酸分子元件相對於彼此之排列，使得該等元件在功能上連接且能夠彼此間相互作用。此類元件可包括(但不限於)啟動子、增強子及/或調節元件、聚腺苷酸化序列、一或多個內含子及/或外顯子，及待表現之所關注基因(亦即，轉基因)之編碼序列。核酸序列元件當經適當定向或可操作地連接時共同作用以調節彼此之活性，且最終可影響轉基因之表現量。調節意謂增加、減少或維持特定元件之活性水準。各元件相對於其他元件之位置可依據各元件之5'端及3'端表示，且任何特定元件之間的距離可藉由該等元件之間插入核苷酸或鹼基對的數量提及。如熟習此項技術者所理解，可操作地連接暗示功能活性，且未必與天然位置連接有關。實際上，當用於核酸表現卡匣中時，調節元件通常將緊鄰於啟動子上游定位(儘管情況通常如此，但其不應明確地解釋為限制或排除核酸表現卡匣內之位置)，但此不必係活體內情況。舉例而言，天然存在於基因下游、從而影響該基因轉錄之調節元件序列能夠以與位於啟動子上游時相同的方式起作用。因此，根據一特定實施例，調節元件之調節或增強效應對位置無依賴性。
在特定實施例中，核酸表現卡匣包含選殖於該表現卡匣中的如本文所描述之四個核酸調節元件，亦即Dph-CRE-05、Dph-CRE-02、Dph-CRE-04及Dph-CRE-06 (表1)，其中某一數目個核苷酸(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個，諸如至多20個核酸)存在於各別CRE之間以便有助於選殖(例如，限制位點)。替代地，或CRE可直接相互緊鄰(例如，在合成時)。此等中間核苷酸對於核酸調節元件之功能發揮並非關鍵且對表現卡匣所產生之表現量不會產不利地影響。表現卡匣中不同CRE為純系之次序(序列)對其表現效能亦無影響。
載體系統或核酸表現卡匣中不同CRE之次序可選自以下中之任一者： Dph-CRE-05_Dph-CRE-02_Dph-CRE-04_Dph-CRE-06， Dph-CRE-05_Dph-CRE-02_Dph-CRE-06_Dph-CRE-04， Dph-CRE-05_Dph-CRE-04_Dph-CRE-02_Dph-CRE-06， Dph-CRE-05_Dph-CRE-04_Dph-CRE-06_Dph-CRE-02， Dph-CRE-05_Dph-CRE-06_Dph-CRE-04_Dph-CRE-02， Dph-CRE-05_Dph-CRE-06_Dph-CRE-02_Dph-CRE-04， Dph-CRE-04_Dph-CRE-02_Dph-CRE-05_Dph-CRE-06， Dph-CRE-04_Dph-CRE-02_Dph-CRE-06_Dph-CRE-05， Dph-CRE-04_Dph-CRE-06_Dph-CRE-02_Dph-CRE-05， Dph-CRE-04_Dph-CRE-06_Dph-CRE-05_Dph-CRE-02， Dph-CRE-04_Dph-CRE-05_Dph-CRE-02_Dph-CRE-06， Dph-CRE-04_Dph-CRE-05_Dph-CRE-06_Dph-CRE-02， Dph-CRE-06_Dph-CRE-02_Dph-CRE-05_Dph-CRE-04， Dph-CRE-06_Dph-CRE-02_Dph-CRE-04_Dph-CRE-05， Dph-CRE-06_Dph-CRE-05_Dph-CRE-02_Dph-CRE-04， Dph-CRE-06_Dph-CRE-05_Dph-CRE-04_Dph-CRE-02， Dph-CRE-06_Dph-CRE-04_Dph-CRE-02_Dph-CRE-05， Dph-CRE-06_Dph-CRE-04_Dph-CRE-05_Dph-CRE-02， Dph-CRE-02_Dph-CRE-06_Dph-CRE-05_Dph-CRE-04， Dph-CRE-02_Dph-CRE-06_Dph-CRE-04_Dph-CRE-05， Dph-CRE-02_Dph-CRE-05_Dph-CRE-06_Dph-CRE-04， Dph-CRE-02-Dph-CRE-05_Dph-CRE-04_Dph-CRE-06， Dph-CRE-02_Dph-CRE-04_Dph-CRE-06_Dph-CRE-05，及 Dph-CRE-02_Dph-CRE-04_Dph-CRE-05_Dph-CRE-06。
在一些實施例中，核酸表現卡匣可包含對另一組織型具有特異性之額外核酸調節元件(順式調節元件、CRE、CRM或SH)，諸如同一作者之先前申請案中所揭示者：WO2015110449；WO2009130208；WO2009071679；WO2011051450；WO2016146757、WO2014063753；或WO2014064277。
如本申請案中所用，術語『啟動子』係指直接或間接調節與其可操作地連接之相應核酸編碼序列(例如轉基因或內源基因)之轉錄的核酸序列。啟動子可單獨起調節轉錄作用或可與一或多個其他調節序列(例如增強子或緘默子，或調節元件)協同作用。在本申請案之上下文中，啟動子通常可操作地連接於如本文所揭示之調節元件以調節(轉)基因之轉錄。當如本文所描述之調節元件可操作地連接於啟動子及轉基因兩者時，該調節元件可(1)活體內賦予轉基因顯著程度之橫膈膜特異性表現，詳言之，橫膈膜及骨骼肌特異性或橫膈膜、心肌及骨骼肌特異性表現(及/或活體外在源自心臟、橫膈膜及骨骼肌細胞或組織之細胞株中)，及/或(2)可增加轉基因在橫膈膜及骨骼肌中或在橫膈膜、心肌及骨骼肌中(及/或活體外在源自心臟、橫膈膜及骨骼肌細胞或組織之細胞株中)的表現量。
啟動子可為同源的(亦即，來自與經核酸表現卡匣轉染之動物(特定言之，哺乳動物)相同之物種)或異源的(亦即，來自除經表現卡匣轉染之動物物種(特定言之，哺乳動物)以外的來源)。因此，啟動子來源可為任何病毒、任何單細胞原核或真核有機體、任何脊椎動物或無脊椎動物有機體或任何植物，或甚至可為合成啟動子(亦即具有非天然存在之序列)，其限制條件為啟動子與本文所描述之調節元件組合起作用。在較佳實施例中，啟動子為哺乳動物啟動子，尤其鼠類或人類啟動子。
啟動子可為誘導性或組成型啟動子。
非限制性例示性骨骼肌及/或橫膈膜特異性啟動子係肌間線蛋白啟動子，其他肌肉特異性啟動子諸如肌肉肌酸激酶啟動子(MCK)(Wang B等人, Gene Ther, 2008, 15(22):1489-99)；α-肌凝蛋白重鏈(a-MHC)、肌凝蛋白輕鏈(MLC-2)、心肌鈣蛋白C (cTnC)、成肌素MYF4啟動子(Pacak等人, Genet. Vaccines Ther. 2008; 6: 13)；病毒啟動子，諸如鼠類幹細胞病毒(MSCV)啟動子(Suga等人, 2011, PLoS ONE 6(3): e16908)及可用於在橫膈膜核酸調節元件下游選殖之所有潛在啟動子。本文所揭示之調節元件可結合其天然啟動子以及另一啟動子用於核酸表現卡匣中。較佳地，本文中所揭示之核酸表現卡匣包含橫膈膜、心臟及/或骨骼肌特異性啟動子，以便增加橫膈膜、心臟及/或骨骼肌特異性及/或避免表現洩漏至其他組織中。此類啟動子之實例為橫膈膜及/或骨骼肌特異性啟動子，諸如選自包含以下之群之基因中之一者的啟動子：ACTA1、CKM、TPM2、MYL1、TNNC2、FHL1、TNNT1、TNNI2、MYLPF、TNNT3、MYH2、SLN、MYBPC1、ENO3、CA3、ATP2A1及MYH1基因；或橫膈膜特異性、骨骼肌特異性及心臟特異性啟動子，諸如選自包含以下之群：ACTA1、CKM、MYL2、MB、DES、TNNC1、TCAP、MYH7、ALDOA及TPM1基因。肌肉特異性啟動子之非限制性實例包括肌間線蛋白(DES)啟動子、合成SPc-5-12啟動子(SPc5-12-GTRM)、α-肌動蛋白1啟動子(ACTA1)、肌酸激酶、肌肉(CKM)啟動子、四個半LIM結構域蛋白1 (FHL1)啟動子、α2肌動蛋白原(ACTN2)啟動子、細絲蛋白-C (FLNC)啟動子、肌質網/內質網鈣ATP酶1 (ATP2A1)啟動子、1型肌鈣蛋白I (TNNI1)啟動子、肌凝蛋白-1 (MYH1)啟動子、可磷酸化快速骨骼肌肌凝蛋白輕鏈(MYLPF)啟動子、α-3鏈肌旋蛋白(TPM3)啟動子、含錨蛋白重複結構域之蛋白2 (ANKRD2)啟動子、肌凝蛋白重鏈(MHC)啟動子、肌凝蛋白輕鏈(MLC)啟動子、肌肉肌酸激酶(MCK)啟動子、合成性肌肉啟動子，如描述於Li等人(1999, Nature Biotechnol. 17:241-245)中，諸如SPc5-12啟動子、肌肉肌酸激酶(MCK)啟動子、dMCK啟動子及tMCK啟動子，其分別由MCK增強子至MCK基礎啟動子之雙或三串聯體組成，如描述於Wang等人(2008, Gene Ther. 15:1489-1499)中。
在尤其較佳實施例中，啟動子為哺乳動物啟動子，尤其鼠類或人類啟動子。
在較佳實施例中，啟動子來自肌間線蛋白基因，特定言之，人類肌間線蛋白基因，諸如如SEQ ID NO: 15 (1.0 kb)或SEQ ID NO: 14 (1.4 kb)中所定義之啟動子。在較佳實施例中，肌間線蛋白啟動子為SEQ ID NO: 14之1.4 kb啟動子，其已顯示可進一步增加表現量。
在較佳實施例中，啟動子來自SPc5-12基因，尤其人類SPc5-12啟動子，更佳如SEQ ID NO: 4中所定義。
在實施例中，啟動子為骨骼肌特異性啟動子，尤其肌肉肌酸激酶(MCK)啟動子，更尤其由MCK增強子及MCK基礎啟動子之雙或三串聯體組成的雙MCK啟動子或三MCK啟動子，如描述於Wang等人(2008, Gene Ther. 15:1489-1499)。此外，啟動子不一定為核酸表現卡匣中轉基因之啟動子，但轉基因可自其自身啟動子轉錄。
為使核酸表現卡匣之長度降至最低，調節元件可連接至最小啟動子，或本文所描述之啟動子的縮短版本。如本文所用之『最小啟動子』(亦稱為基礎啟動子或核心啟動子)為全尺寸啟動子的一部分，其仍能夠驅動表現，但缺乏有助於調節(例如組織特異性)表現之序列的至少部分。此定義涵蓋(組織特異性)調節元件已缺失且能夠驅動基因表現、但已失去其以組織特異性方式表現彼基因之能力的啟動子；及(組織特異性)調節元件已缺失且能夠驅動(可能減少的)基因表現、但未必失去其以組織特異性方式表現彼基因之能力的啟動子。較佳地，本文所揭示之核酸表現卡匣中所含有之啟動子長度為1000個核苷酸或更少、900個核苷酸或更少、800個核苷酸或更少、700個核苷酸或更少、600個核苷酸或更少、500個核苷酸或更少、400個核苷酸或更少、300個核苷酸或更少、或250個核苷酸或更少。
如本文所用，術語『轉基因』係指編碼多肽或多肽之一部分的特定核酸序列，該多肽或多肽之一部分將在引入核酸序列之細胞中表現。然而，轉基因亦可以RNA形式表現，通常控制(例如降低)特定多肽在插入核酸序列之細胞中的量。此等RNA分子包括(但不限於)經由RNA干擾(shRNA、RNAi)、微RNA調節(miR) (其可用於控制特定基因之表現)、催化RNA、反義RNA、RNA適體等發揮其功能之分子。核酸序列如何引入至細胞中並非本發明所必需，其可例如經由整合於基因體中或作為附加型質體。值得注意的是，轉基因之表現可能受限於引入核酸序列之細胞亞群。術語『轉基因』意謂包括(1)非天然發現於細胞中的核酸序列(亦即，異源核酸序列)；(2)作為天然發現於已引入核酸序列之細胞中的核酸序列突變形式的核酸序列；(3)用以增加天然存在於已引入核酸序列之細胞中之相同(亦即，同源)或相似核酸序列之額外複本的核酸序列；或(4)在已引入之細胞中誘導表現緘默的天然存在或同源核酸序列。
轉基因可與啟動子同源或異源(及/或與引入該轉基因的動物(尤其哺乳動物或人類)同源或異源，例如在核酸表現卡匣用於基因療法之情況下)。
轉基因可為全長cDNA或基因體DNA序列，或具有至少一些生物活性之其任何片段、次單元或突變體。特定言之，轉基因可為小型基因，亦即，缺乏其內含子序列之一部分、大部分或全部之基因序列。轉基因由此視情況可含有內含子序列。視情況，轉基因可為雜交核酸序列，亦即，由同源及/或異源cDNA及/或基因體DNA片段建構之序列。『突變形式』意謂含有一或多個不同於野生型或天然存在序列的核苷酸的核酸序列，亦即，突變核酸序列含有一或多個核苷酸取代、缺失及/或插入。核苷酸取代、缺失及/或插入可產生在其胺基酸/核酸序列方面與野生型胺基酸/核酸序列不同的基因產物(亦即蛋白質或核酸)。此類突變體之製備為此項技術中所熟知。在一些情況下，轉基因亦可包括編碼前導肽或信號序列之序列，使得細胞分泌轉基因產物。
可以包含在本文所描述之核酸表現卡匣中的轉基因通常編碼基因產物，諸如RNA或多肽(蛋白質)。
在實施例中，轉基因編碼治療蛋白。治療蛋白可為分泌型蛋白。分泌型蛋白(尤其分泌型治療蛋白)之非限制性實例包括葡萄糖苷酶、卵泡抑素、凝血因子(諸如因子VIII或因子IX)、胰島素、紅血球生成素、脂蛋白脂肪酶、抗體或奈米抗體、生長因子、細胞介素、趨化介素、血漿因子等。治療蛋白亦可為結構型蛋白。結構蛋白(尤其結構治療蛋白)之非限制性實例包含肌微管素、質膜修復蛋白、卵泡抑素、微肌縮蛋白1、肌縮蛋白及肌聚糖。在較佳實施例中，轉基因包含微肌縮蛋白1 ( MD1及 MD2)基因或卵泡抑素( FST)基因，較佳包含卵泡抑素之外顯子跳躍構建體。本申請案中所設想之轉基因之非詳盡及非限制性清單包括用於治療性血管生成之血管生成因子，諸如VEGF、PlGF，或導向分子，諸如蝶素(ephrin)、信號蛋白(semaphorin)、縫蛋白(Slit)及網蛋白(netrin)或其同源受體；細胞介素及/或生長因子，諸如紅血球生成素(EPO)、干擾素-α、干擾素-β、干擾素-γ、介白素1 (IL-1)、介白素2 (IL-2)、介白素3 (IL-3)、介白素4 (IL-4)、介白素5 (IL-5)、介白素6 (IL-6)、介白素7 (IL-7)、介白素8 (IL-8)、介白素9 (IL-9)、介白素10 (IL-10)、介白素11 (IL-11)、介白素12 (IL-12)、趨化介素(C-X-C模體)配位體5 (CXCL5)、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、幹細胞因子(SCF)、角質細胞生長因子(KGF)、單核球趨化蛋白-1 (MCP-1)、腫瘤壞死因子(TNF)；涉及鈣處理之蛋白質，諸如SERCA (肌質網/內質網Ca2+-ATP酶)、鈣調神經磷酸酶、微肌縮蛋白1 ( MD1)、卵泡抑素 ( FST)、酸性α-葡萄糖苷酶 ( GAA )、肌微管素1 (MTM1)、編碼抗體之轉基因、奈米抗體、抗病毒顯性負性蛋白，及其片段、次單元或突變體。
在實施例中，轉基因編碼免疫原性蛋白。免疫原性蛋白之非限制性實例包括來源於病原體之抗原決定基及抗原。
如本文所用，術語「免疫原性」係指能夠引發免疫反應的物質或組合物。
其他序列亦可併入本文中所揭示之核酸表現卡匣中，通常用於進一步增加或穩定轉基因產物(例如內含子及/或聚腺苷酸化序列)的表現。
任何內含子均可用於本文所描述之表現卡匣中。術語「內含子」涵蓋整個內含子之任何部分，其大到足以被核剪接設備識別及剪接。通常，為了使表現卡匣之尺寸保持儘可能小以有助於表現卡匣之建構及操縱，短的功能性內含子序列為較佳。在一些實施例中，內含子係獲自編碼蛋白質的基因，該蛋白質由表現卡匣內的編碼序列編碼。內含子可位於編碼序列之5'、編碼序列之3'或位於編碼序列內。將內含子定位於編碼序列之5'的優點為將內含子干擾聚腺苷酸化信號之功能的機率降至最低。在實施例中，本文揭示之核酸表現卡匣進一步包含內含子。適合內含子之非限制性實例係小鼠細小病毒(MVM)內含子、β-血球蛋白內含子(βIVS-II)、因子IX (FIX)內含子A、猴病毒40 (SV40)小-t內含子及β-肌動蛋白內含子。
較佳地，內含子係MVM內含子，較佳如由SEQ ID NO: 5定義。
引導polyA尾之合成的任何聚腺苷酸化信號可用於本文中所描述之表現卡匣中，熟習此項技術者熟知彼等之實例。例示性聚腺苷酸化信號包括(但不限於)來源於猴病毒40 (SV40)晚期基因、牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號、最小兔β-血球蛋白(mRBG)基因及合成polyA (SPA)位點的polyA序列，如描述於Levitt等人(1989, Genes Dev. 3:1019-1025)中，較佳如由SEQ ID NO: 6定義。
較佳地，聚腺苷酸化信號為合成polyA (SPA)。
在特定實施例中，本發明提供一種核酸表現卡匣，其包含四種核酸調節元件之組合，該等核酸調節元件包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：根據SEQ ID NO: 9至12之核酸序列(分別參見Dph-CRE05、Dph-CRE02、Dph-CRE04及Dph-CRE06 - 表1)或與該等序列具有95%一致性之序列，該等核酸調節元件可操作地連接於肌肉特異性啟動子(較佳為選自由來自肌間線蛋白基因之啟動子或SPc5-12啟動子組成之群的啟動子)及轉基因(較佳為編碼螢光素酶之轉基因)。在其他實施例中，核酸表現卡匣進一步包含MVM內含子。在其他實施例中，核酸表現卡匣進一步包含聚腺苷酸化信號，較佳為來源於合成polyA (SynthpA：SEQ ID: 127以及圖9 A及B)的聚腺苷酸化信號。
在特定實施例中，本發明提供一種核酸表現卡匣，其包含四種核酸調節元件之組合，該等核酸調節元件包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：根據SEQ ID NO: 9至12之核酸序列(分別參見Dph-CRE05、Dph-CRE02、Dph-CRE04及Dph-CRE06 - 表1)或與該等序列具有95%一致性之序列，該等核酸調節元件可操作地連接於肌肉特異性啟動子(較佳為來自肌間線蛋白基因之啟動子)及轉基因(較佳為編碼微肌縮蛋白、外顯子跳躍構建體或卵泡抑素的轉基因)。在其他實施例中，核酸表現卡匣進一步包含MVM內含子。在其他實施例中，核酸表現卡匣進一步包含聚腺苷酸化信號。可替代地，可引入以下轉基因中之任一者：分泌型蛋白，尤其分泌型治療蛋白，包括葡萄糖苷酶、卵泡抑素、凝血因子(諸如因子VIII或因子IX)、胰島素、紅血球生成素、脂蛋白脂肪酶、抗體或奈米抗體、生長因子、細胞介素、趨化介素、血漿因子等；或結構蛋白，諸如結構治療蛋白，包括肌微管素、質膜修復蛋白、卵泡抑素、微肌縮蛋白1、肌縮蛋白及肌聚糖。在實施例中，轉基因包含微肌縮蛋白1 ( MD1)基因或卵泡抑素( FST)基因，較佳包含卵泡抑素之外顯子跳躍構建體。
本文中所揭示之核酸調節元件及核酸表現卡匣可按原樣使用，或通常，其可為核酸載體之一部分。因此，另一態樣係關於如本文中所描述之核酸調節元件或如本文中所描述之核酸表現卡匣在載體、尤其核酸載體中之用途。
在一態樣中，本發明亦提供一種載體，其包含如本文所揭示之核酸調節元件。在進一步實施例中，載體包含如本文所揭示之核酸表現卡匣。
如本申請案中所用之術語『載體』係指核酸分子，例如雙股DNA，其可以插入另一核酸分子(插入核酸分子)中，諸如但不限於cDNA分子。載體用於將插入核酸分子轉移至適合宿主細胞中。載體可含有允許插入核酸分子轉錄且視情況將轉錄本轉譯成多肽之必需元件。插入核酸分子可源自宿主細胞，或可源自不同細胞或有機體。進入宿主細胞中之後，載體可獨立於宿主染色體DNA複製或與其一致，且可產生載體及插入其之核酸分子之若干複本。載體可為附加型載體(亦即不整合至宿主細胞之基因體中)，或可為整合至宿主細胞基因體中之載體。因此，術語『載體』因此亦可定義為促進基因轉移至目標細胞中之基因遞送載具。此定義包括非病毒載體與病毒載體。非病毒載體包括(但不限於)陽離子型脂質、脂質體、奈米粒子、PEG、PEI、質體載體(例如，pUC載體、bluescript載體(pBS)及pBR322或不含細菌序列之其衍生物(小環))、基於轉位子之載體(例如，PiggyBac (PB)載體或睡美人(SB)載體)等。病毒載體衍生自病毒且包括(但不限於)反轉錄病毒、慢病毒、腺相關病毒、腺病毒、疱疹病毒、肝炎病毒載體或其類似者。通常，但未必，由於在既定細胞中傳播之能力損失，因此病毒載體為複製缺乏型的，因為複製必需之病毒基因已自病毒載體去除。然而，一些病毒載體亦可經調適以特定地在既定細胞(諸如癌細胞)中複製，且通常用於觸發(癌)細胞特異性(腫瘤)溶解。病毒體係包含病毒與非病毒元件之載體的非限制性實例，特定言之，其將脂質體與不活化HBV、HIV或流感病毒組合(例如Yamada等人, 2003, Nature Biotechnology第21卷, 第885-890頁)。另一實例涵蓋與陽離子型脂質混合的病毒載體。
在較佳實施例中，載體為病毒載體，諸如反轉錄病毒、慢病毒、腺病毒或腺相關病毒(AAV)載體，更佳為AAV載體。AAV載體較佳用作自身互補的雙股AAV載體(scAAV)，以便克服AAV轉導(亦即，單股向雙股AAV的轉化)中之限制性步驟中之一者(McCarty等人, Gene Ther. 2001年8月;8(16):1248-54; McCarty等人, Gene Ther 2003年12月;10(26):2112-8.; Nathwani等人, Blood, 2006年4月 1: 107(7):2653-2661; Wu等人, Vision Research, 第48卷, 第15期, 2008年7月, 第1648-1654頁)，且另外，本文中亦涵蓋單股AAV載體(ssAAV)之使用(圖9 A及B)。
AAV血清型9 (AAV9)理想地適合於實現心臟及骨骼肌中之有效轉導。因此，在尤其較佳實施例中，載體為AAV9載體。
AAV載體粒子之製造可例如藉由將編碼AAV血清型9衣殼之AAV-報導子及AAV輔助構建體短暫共轉染至HEK293細胞中，接著基於氯化銫(CsCl)密度梯度超速離心進行純化步驟來達成，如描述於(Vanden Driessche等人, 2007, J Thromb Haemost 5:16-24)中。
由於核酸調節元件實際上係模組，因此亦測試使所需目標組織中之表現最大化的最佳橫膈膜特異性核酸調節元件與任何其他肌肉特異性及/或心臟特異性核酸調節元件的組合。因此，由此可產生多功能肌肉特異性核酸調節元件平台，該平台係針對影響骨骼肌、橫膈膜且在一些情況下亦影響心臟(例如MTM或GSD II)之疾病而定製。此外，橫膈膜特異性核酸調節元件亦可與其他目標組織中具活性的啟動子或核酸調節元件組合。
在其他實施例中，載體為非病毒載體，較佳為質體、小環或基於轉位子之載體，諸如基於睡美人(SB)之載體或基於piggyBac (PB)之載體。
在另外其他實施例中，載體包含病毒及非病毒元件。
在特定實施例中，本發明提供一種載體，其包含四種核酸調節元件之組合，該等核酸調節元件包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：根據SEQ ID NO: 9至12之核酸序列(分別參見Dph-CRE05、Dph-CRE02、Dph-CRE04及Dph-CRE06 - 表1)，該等核酸調節元件可操作地連接於肌肉特異性啟動子(較佳為來自肌間線蛋白基因之啟動子)、MVM內含子、轉基因(較佳為編碼微肌縮蛋白1/2或其外顯子跳躍構建體的轉基因)及聚腺苷酸化信號。可替代地，可引入以下轉基因中之任一者：分泌型蛋白，尤其分泌型治療蛋白，包括葡萄糖苷酶、卵泡抑素、凝血因子(諸如因子VIII或因子IX)、胰島素、紅血球生成素、脂蛋白脂肪酶、抗體或奈米抗體、生長因子、細胞介素、趨化介素、血漿因子等；或結構蛋白，諸如結構治療蛋白，包括肌微管素、質膜修復蛋白、卵泡抑素、微肌縮蛋白1、肌縮蛋白及肌聚糖。在實施例中，轉基因包含微肌縮蛋白1 ( MD1或 2)基因或卵泡抑素( FST)基因，較佳包含卵泡抑素之外顯子跳躍構建體。
在特定實施例中，本發明提供一種載體，其包含四種核酸調節元件之組合，該等核酸調節元件包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：根據SEQ ID NO: 9至12之核酸序列(分別參見Dph-CRE05、Dph-CRE02、Dph-CRE04及Dph-CRE06 - 表1)，該等核酸調節元件可操作地連接於肌肉特異性啟動子(較佳為來自肌間線蛋白基因之啟動子)、MVM內含子、轉基因(較佳為編碼卵泡抑素的轉基因)及聚腺苷酸化信號。可替代地，可引入以下轉基因中之任一者：分泌型蛋白，尤其分泌型治療蛋白，包括葡萄糖苷酶、卵泡抑素、凝血因子(諸如因子VIII或因子IX)、胰島素、紅血球生成素、脂蛋白脂肪酶、抗體或奈米抗體、生長因子、細胞介素、趨化介素、血漿因子等；或結構蛋白，諸如結構治療蛋白，包括肌微管素、質膜修復蛋白、卵泡抑素、微肌縮蛋白1、肌縮蛋白及肌聚糖。在實施例中，轉基因包含微肌縮蛋白1 ( MD1或 2)基因或卵泡抑素( FST)基因，較佳包含卵泡抑素之外顯子跳躍構建體。
本文中所揭示之核酸表現卡匣及載體可用於例如表現正常表現於且用於肌肉中的蛋白質(亦即結構蛋白)，或用於表現在肌肉中表現且隨後輸出至血流中以運輸至身體之其他部分的蛋白質(亦即分泌型蛋白)。舉例而言，出於治療目的，尤其用於基因療法，本文所揭示之表現卡匣及載體可用於表現治療量的基因產物(諸如多肽，尤其治療蛋白或RNA)。通常，基因產物係由表現卡匣或載體內之轉基因編碼，但原則上出於治療目的，亦有可能增加內源基因之表現。在一替代實例中，本文揭示之表現卡匣及載體可用於表現免疫量的基因產物(諸如多肽，尤其免疫原性蛋白或RNA)以用於疫苗接種目的。
如本文中所教示之核酸表現卡匣及載體可用醫藥學上可接受之賦形劑(亦即一或多種醫藥學上可接受之載劑物質及/或添加劑，例如緩衝劑、載劑、賦形劑、穩定劑等)調配成醫藥組合物。醫藥組合物可以套組形式提供。
如本文所用之術語「醫藥學上可接受」與此項技術一致且意謂與醫藥組合物之其他成分相容且對其接受者無害。
因此，本發明之另一態樣係關於包含本文所描述之核酸表現卡匣或載體的醫藥組合物。
本文亦揭示本文所描述之核酸調節元件用於製造此等醫藥組合物的用途。
在實施例中，醫藥組合物可為疫苗。疫苗可進一步包含一或多種用於增強免疫反應之佐劑。適合之佐劑包括例如(但不限於)皂素、無機凝膠(諸如氫氧化鋁)、表面活性物質(諸如溶血卵磷脂)、普洛尼克(pluronic)多元醇、聚陰離子、胜肽、油或烴乳液、卡介苗(bacille Calmette-Guerin；BCG)、小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)及合成佐劑QS-21。視情況，疫苗可進一步包含一或多種免疫刺激分子。免疫刺激分子之非限制性實例包括具有免疫刺激、免疫增強及促發炎活性之不同細胞介素、淋巴介質及趨化介素，諸如介白素(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13)；生長因子(例如，顆粒球巨噬細胞(GM)群落刺激因子(CSF))；及其他免疫刺激分子，諸如巨噬細胞發炎因子、Flt3配位體、B7.1；B7.2等。
在另一態樣中，本發明係關於本文中所描述之核酸調節元件、核酸表現卡匣、載體或醫藥組合物，其係用於藥品中。
如本文所用，術語「治療(treat/treatment)」係指治療性治療及防治性或預防性措施兩者。有益或所需臨床結果包括(但不限於)預防非所需臨床狀態或病症、降低病症發病率、緩解與病症相關之症狀、減輕病症程度、穩定(亦即不惡化)病症狀態、延遲或減緩病症惡化、改善或緩和病症狀態、緩解(無論部分或總體)，無論可偵測或不可偵測，或其組合。「治療」亦可意謂存活期與未接受治療之預期存活期相比延長。
如本文所用，術語「治療性治療」或「療法」及其類似者係指目標為以下的治療：使個體身體或其部位自非所需之生理變化或病症達成所需狀態，諸如不太嚴重或不適的狀態(例如，改善或緩和)，或回到其正常、健康狀態(例如，恢復個體之健康、身體健全及身體健康)；使其保持該等非所需生理變化或病症(例如，穩定或不惡化)；或與該等非所需生理變化或病症相比，防止或減緩進展至更嚴重或惡化狀態。
如本文所用，術語「預防」、「預防性治療」或「防治性治療」及其類似者涵蓋預防疾病或病症發作，包括在罹患該疾病或病症之前降低疾病或病症之嚴重程度或與其相關之症狀。罹病之前的此類預防或減輕係指將本文所描述之核酸調節元件、核酸表現卡匣、載體或醫藥組合物投與患者，該患者在投與時並未罹患疾病或病症之明顯症狀。「預防」亦涵蓋例如在一定時段之改善之後預防疾病或病症的復發或對疾病或病症進行復發性預防。
在實施例中，本文所描述之根據SEQ ID NO: 9至12之四種核酸調節元件(分別參見Dph-CRE05、Dph-CRE02、Dph-CRE04及Dph-CRE06 - 表1)的組合、核酸表現卡匣、載體或醫藥組合物可用於基因療法，特定言之，橫膈膜及骨骼肌定向基因療法。
在實施例中，本文所描述之根據SEQ ID NO: 9至1 2之四種核酸調節元件(分別參見Dph-CRE05、Dph-CRE02、Dph-CRE04及Dph-CRE06 - 表1)的組合、核酸表現卡匣、載體或醫藥組合物可用於基因療法，特定言之，橫膈膜、骨骼肌及心臟定向基因療法。
本文亦揭示本文所描述之根據SEQ ID NO: 9至12之四種核酸調節元件(分別參見Dph-CRE05、Dph-CRE02、Dph-CRE04及Dph-CRE06 - 表1)的組合、核酸表現卡匣、載體或醫藥組合物，其用於製造用於基因療法(特定言之，橫膈膜及骨骼肌定向基因療法)的藥物。
本文亦揭示本文所描述之根據SEQ ID NO: 9至12之四種核酸調節元件(分別參見Dph-CRE05、Dph-CRE02、Dph-CRE04及Dph-CRE06 - 表1)的組合、核酸表現卡匣、載體或醫藥組合物，其用於製造用於基因療法(特定言之，橫膈膜、骨骼肌及心臟定向基因療法)的藥物。
本文亦揭示一種基因治療方法，特定言之，對需要該基因療法之個體進行橫膈膜及骨骼肌定向基因療法的方法，其包含： -   在個體中，尤其在個體之橫膈膜及/或骨骼肌組織或細胞中引入本文所描述之核酸表現卡匣、載體或醫藥組合物，其中該核酸表現卡匣、該載體或該醫藥組合物包含根據SEQ ID NO: 9至12之四種核酸調節元件(分別參見Dph-CRE05、Dph-CRE02、Dph-CRE04及Dph-CRE06 - 表1)的組合，該等核酸調節元件可操作地連接於啟動子及轉基因；及 -   在該個體中，尤其在該個體之橫膈膜及/或骨骼肌組織或細胞中表現治療有效量之該轉基因產物。
本文亦揭示一種基因治療方法，特定言之，對需要該基因療法之個體進行橫膈膜、骨骼肌及心臟定向基因療法的方法，該方法包含： -   在個體中，尤其在個體之橫膈膜、骨骼肌及心臟組織或細胞中引入本文所描述之核酸表現卡匣、載體或醫藥組合物，其中該核酸表現卡匣、該載體或該醫藥組合物包含根據SEQ ID NO: 9至12之四種核酸調節元件(分別參見Dph-CRE05、Dph-CRE02、Dph-CRE04及Dph-CRE06 - 表1)的組合，該等核酸調節元件可操作地連接於啟動子及轉基因；及 -   在該個體中，尤其在該個體之橫膈膜、骨骼肌及心臟組織或細胞中表現治療有效量之該轉基因產物。
可引入可為以下轉基因中之任一者的轉基因產物：分泌型蛋白，尤其分泌型治療蛋白，包括葡萄糖苷酶、卵泡抑素、凝血因子(諸如因子VIII或因子IX)、胰島素、紅血球生成素、脂蛋白脂肪酶、抗體或奈米抗體、生長因子、細胞介素、趨化介素、血漿因子等；或結構蛋白，諸如結構治療蛋白，包括肌微管素、質膜修復蛋白、卵泡抑素、微肌縮蛋白1、肌縮蛋白及肌聚糖。在實施例中，轉基因包含微肌縮蛋白1 ( MD1 或 2)基因或卵泡抑素( FST)基因，較佳包含卵泡抑素之外顯子跳躍構建體。在特定實施例中，轉基因產物為卵泡抑素或微肌縮蛋白，尤其微肌縮蛋白1 (MTM1)。可替代地，轉基因產物可為RNA，諸如siRNA。
可受益於使用本文所描述之核酸調節元件、核酸表現卡匣、載體或醫藥組合物之基因療法的例示性疾病及病症包括肌微管性肌病(MTM)、龐貝氏症、肌肉萎縮症(例如，杜興氏肌肉萎縮症(DMD)/貝氏肌肉萎縮症(BMD))、肌強直性營養不良、肌強直性肌肉萎縮症(DM)、三好氏肌病、先天性福山型肌肉萎縮症、質膜修復蛋白病肌神經病、運動神經元疾病(MND)(諸如夏柯-馬利-杜斯氏病(CMT)、脊髓性肌萎縮(SMA)及肌萎縮性側索硬化(ALS))、埃默里-德雷弗斯氏肌肉萎縮症、面肩胛肱型肌肉萎縮症(FSHD)、先天性肌肉萎縮症、先天性肌病、肢帶型肌肉萎縮症、代謝性肌病、肌肉發炎疾病、肌無力、粒線體肌病、離子通道異常、核膜病、心肌病、心肥大、心衰竭、遠端肌病、心血管疾病、血友病(包括A型血友病及B型血友病)及糖尿病。另外，許多神經肌肉病症由於橫膈膜及呼吸道肌肉之減弱而影響呼吸功能(www.medscape.com/viewarticle/805299_3) Semin Respir Crit Care Med. 2022年6月;23(3):191-200)。橫膈膜之疾病原因不同，但其可歸因於直接影響橫膈膜功能之基因缺陷。特定言之，存在多種遺傳病症，其歸因於基因中影響橫膈膜功能的突變，該等病症常常與骨骼肌及/或心臟層面上的異常組合。舉例而言，肌微管性肌病(MTM)係歸因於肌微管素基因中之突變且影響骨骼肌及橫膈膜。患有MTM之患者通常在出生時存在低張症、全身性肌無力及呼吸衰竭。產後期之外的存活期需要強力支援，通常包括胃造口術進食及機械換氣。由於其嚴重呼吸問題，罹患MTM之患者通常不會存活超過2歲。對於MTM，肌肉定向基因療法為目前臨床上唯一相關選項。或者，龐貝氏症(亦稱作II型肝糖貯積症或GSD II)主要影響骨骼肌、橫膈膜及心臟。GSD II導致胞溶體酶酸性α葡萄糖苷酶(GAA)缺乏，其導致胞溶體貯積缺陷。在GSD II患者中，肝糖無法有效地分解為葡萄糖。GSD II患者中肝糖累積引起肌病伴進行性肌無力。在無醫學介入之情況下，罹患最嚴重形式之GSD II之患者由於生命第一年內之呼吸衰竭而死亡。大約每3500個存活男性新生兒有一個罹患其他肌肉疾病，諸如杜興氏肌肉萎縮症。該疾病導致骨骼肌肉(包括橫膈膜)之進行性破壞，受影響之大部分個體在生命的第三個十年中死亡。許多其他肌病亦影響肺部功能，包括(但不限於)多發性肌炎/皮肌炎、遺傳性通道病症、粒線體腦肌病、酸性麥芽糖酶缺乏及先天性肌病、廢用性萎縮。影響橫膈膜之其他疾病包括先天性肌肉萎縮症(CMD)、貝氏肌肉萎縮症(BMD)、面肩胛肱型肌肉萎縮症(FSHD)、肢帶型肌肉萎縮症(LGMD)、肌強直性肌肉萎縮症(DM)、三好氏肌病、先天性福山型肌肉萎縮症、質膜修復蛋白病。許多神經病變性病症亦弱化橫膈膜及呼吸道肌肉。此包括肌肉萎縮性側索硬化、脊髓灰質炎、脊髓灰質炎後症候群、肯尼迪氏症候群、中風、多發性硬化症、脊髓性肌萎縮、脊髓空洞病、神經痛性神經病變及運動神經元疾病。臂神經叢炎及孤立性單側或兩側膈神經病變亦可顯著弱化橫膈膜。影響呼吸之外周神經病變主要為急性病症，諸如格林-巴利症候群、卟啉症(porphyria)及危重病神經病變，但慢性疾病(諸如慢性發炎去髓鞘型多發性神經病變(CIDP)及夏柯-馬利-杜斯氏病(CMT))亦可引起呼吸道功能不全。諸如蘭伯特-伊頓症候群及重症肌無力之神經肌肉傳遞病症通常影響呼吸。可替代地，橫膈膜功能障礙可為導致解剖學異常之先天缺陷(例如阿諾德-基亞里畸形(Arnold-Chiari malformation))或後天缺陷的結果，其由於損傷、外傷、感染(例如西尼羅河病毒、肉毒中毒)、暴露於有機磷酸鹽、放射療法、營養不良、腫瘤壓迫或手術而發生。在心臟手術中使用之低溫心臟麻痹為膈神經損傷之另一常見原因。另外，放射療法可影響膈神經，導致橫膈膜功能障礙。影響肺部之阻塞性氣管疾病，諸如慢性阻塞性肺病(COPD)及哮喘，可導致顯著過度充氣，導致橫膈膜缺陷及無力。最後，已知狼瘡及甲狀腺病症亦可導致橫膈膜功能障礙。
基因治療方案已在此項技術中廣泛地描述。此等方案包括(但不限於)肌肉內注射質體(裸質體或在脂質體中)、在不同組織中之流體動力基因遞送，包括肌肉、間質注射、呼吸道滴注、施用至內皮、肝內實質及靜脈內或動脈內投與。已開發用於增強DNA對目標細胞之可用性的多種裝置。簡單的方法為使目標細胞與含有DNA之導管或可植入材料發生實體接觸。另一方法為利用無針噴射裝置，其在高壓下將液柱直接投射至目標組織中。此等遞送範例亦可用以遞送載體。靶向基因遞送之另一方法為使用由蛋白質或合成配位體組成的分子結合物，該蛋白質或合成配位體已與核酸結合劑或DNA結合劑連接以用於使核酸特異性靶向細胞(Cristiano等人, 1993, PNAS 第90卷: 11548-11552)。在實施例中，本文所描述之核酸調節元件、核酸表現卡匣、載體或醫藥組合物可用作疫苗，更特定言之，用作預防性疫苗。
本文亦揭示本文中所描述之核酸調節元件、核酸表現卡匣、載體或醫藥組合物用於製造藥劑或疫苗，尤其用於製造預防性疫苗之用途。
本文亦揭示一種在需要該疫苗接種之個體中接種疫苗(詳言之，預防性疫苗接種)的方法，其包含： -   在個體中，尤其在個體之橫膈膜及骨骼肌組織或細胞中引入本文所描述之核酸表現卡匣、載體或醫藥組合物，其中該核酸表現卡匣、該載體或該醫藥組合物包含如SEQ ID NO: 9至12之四種核酸調節元件(分別參見Dph-CRE05、Dph-CRE02、Dph-CRE04及Dph-CRE06 - 表1)的組合，該等核酸調節元件可操作地連接於啟動子及轉基因；及 -   在該個體中，尤其在該個體之橫膈膜及骨骼肌細胞或組織中表現免疫學上有效量之該轉基因產物。
本文亦揭示一種在需要該疫苗接種之個體中接種疫苗(詳言之，預防性疫苗接種)的方法，其包含： -   在個體中，尤其在個體之橫膈膜、骨骼肌及心臟組織或細胞中引入本文所描述之核酸表現卡匣、載體或醫藥組合物，其中該核酸表現卡匣、該載體或該醫藥組合物包含根據SEQ ID NO: 9至12之四種核酸調節元件(分別參見Dph-CRE05、Dph-CRE02、Dph-CRE04及Dph-CRE06 - 表1)的組合，該等核酸調節元件可操作地連接於啟動子及轉基因；及 -   在該個體中，尤其在該個體之橫膈膜、骨骼肌及心臟細胞或組織中表現免疫學上有效量之該轉基因產物。
如本文中所使用，諸如「需要治療之個體」之片語包括將受益於所述疾病或病症之治療的個體。此類個體可包括(但不限於)已診斷患有該疾病或病症之個體、易於感染或發展該疾病或病症之個體及/或應預防該疾病或病症之個體。
術語「個體」及「患者」在本文中可互換使用且係指動物，較佳指脊椎動物，更佳指哺乳動物，且特定言之，包括人類患者及非人類哺乳動物。「哺乳動物」個體包括(但不限於)人類；家畜；商用動物；農畜；動物園動物；運動型動物；寵物及實驗動物，諸如狗、貓、天竺鼠、家兔、大鼠、小鼠、馬、家牛、乳牛；靈長類動物，諸如猿、猴、紅毛猩猩及黑猩猩；犬科動物，諸如狗及狼；貓科動物，諸如貓、獅子及老虎；馬科動物，諸如馬、驢及斑馬；食用動物，諸如乳牛、豬及綿羊；有蹄動物，諸如鹿及長頸鹿；嚙齒動物，諸如小鼠、大鼠、倉鼠及天竺鼠；等。較佳患者或個體為人類個體。
如本文所用之「治療量」或「治療有效量」係指基因產物的量，其有效治療個體之疾病或病症，亦即獲得所需局部或全身性效應。因此，該術語係指研究人員、獸醫、醫生或其他臨床醫師所尋求之在組織、系統、動物或人類中引起生物或醫學反應的基因產物之數量。此類量將通常視基因產物及疾病嚴重程度而定，但可由熟習此項技術者可經由常規實驗確定。
如本文所用，「免疫有效量」係指(轉)基因產物之量，其有效增強個體針對後續暴露於由(轉)基因編碼之免疫原之免疫反應。可測定誘導性免疫水準，例如藉由量測中和分泌及/或血清抗體之量，例如藉由噬菌斑中和、補體結合、酶聯免疫吸附劑或微量中和分析。
通常，當使用如本文所描述之表現卡匣或載體(亦即具有至少一個核酸調節元件)時所表現的(轉)基因產物之量高於當使用相同表現卡匣或載體但其中無核酸調節元件時的(轉)基因產物之量。更特定言之，與無核酸調節元件之相同核酸表現卡匣或載體相比，表現高至少兩倍、高至少五倍、高至少十倍、高至少20倍、高至少30倍、高至少40倍、高至少50倍或甚至高至少60倍。較佳地，較高表現仍對橫膈膜、心臟及骨骼肌肉組織或細胞具有特異性。此外，本文所描述之表現卡匣及載體導引治療量之基因產物表現延長的時間段。通常，設想治療性表現持續至少20天、至少50天、至少100天、至少200天且在一些情況下300天或更多天。基因產物(例如多肽)之表現可藉由任何公認方式量測，諸如基於抗體之分析，例如西方墨點法或ELISA分析，例如以評估是否實現基因產物之治療性表現。基因產物之表現亦可在偵測基因產物之酶或生物活性的生物分析中量測。
本文亦揭示根據SEQ ID NO: 9至12之四種核酸調節元件(分別參見Dph-CRE05、Dph-CRE02、Dph-CRE04及Dph-CRE06 - 表1)的組合或本文所揭示之包含核酸調節元件之該組合的核酸表現卡匣或載體用於轉染或轉導橫膈膜及/或骨骼肌細胞的用途。
本文亦揭示根據SEQ ID NO: 9至12之四種核酸調節元件(分別參見Dph-CRE05、Dph-CRE02、Dph-CRE04及Dph-CRE06-表1)的組合或本文所揭示之包含核酸調節元件之該組合的核酸表現卡匣或載體用於轉染或轉導橫膈膜、骨骼肌及/或心臟細胞的用途。
本文進一步揭示本文所揭示之包含根據SEQ ID NO: 9至12之四種核酸調節元件(分別參見Dph-CRE05、Dph-CRE02、Dph-CRE04及Dph-CRE06-表1)之組合的核酸表現卡匣或載體用於在橫膈膜及/或骨骼肌細胞中表現轉基因產物的用途，其中該核酸表現卡匣或該載體包含本文所揭示之可操作地連接於啟動子及轉基因的核酸調節元件。
本文進一步揭示本文所揭示之包含根據SEQ ID NO: 9至12之四種核酸調節元件(分別參見Dph-CRE05、Dph-CRE02、Dph-CRE04及Dph-CRE06 - 表1)之組合的核酸表現卡匣或載體用於在橫膈膜、骨骼肌及心臟細胞中表現轉基因產物的用途，其中該核酸表現卡匣或該載體包含本文所揭示之可操作地連接於啟動子及轉基因的核酸調節元件。
本文進一步揭示一種用於在橫膈膜及/或骨骼肌細胞中表現轉基因產物的方法，其包含： -   用本文所揭示之核酸表現卡匣或載體轉染或轉導該等細胞，其中該核酸表現卡匣或該載體包含根據SEQ ID NO: 9至12之四種核酸調節元件(分別參見Dph-CRE05、Dph-CRE02、Dph-CRE04及Dph-CRE06 - 表1)之組合，該等核酸調節元件可操作地連接於啟動子及轉基因；及 -   在該等細胞中表現該轉基因產物。
本文進一步揭示一種用於在橫膈膜、骨骼肌及心臟細胞中表現轉基因產物的方法，其包含： -   用本文所揭示之核酸表現卡匣或載體轉染或轉導該等細胞，其中該核酸表現卡匣或該載體包含根據SEQ ID NO: 9至12之四種核酸調節元件(分別參見Dph-CRE05、Dph-CRE02、Dph-CRE04及Dph-CRE06 - 表1)之組合，該等核酸調節元件可操作地連接於啟動子及轉基因；及 -   在該等細胞中表現該轉基因產物。
可藉由活體外、離體或活體內程序對橫膈膜、心臟及/或骨骼肌細胞進行非病毒轉染或病毒載體介導之轉導。活體外方法需要活體外轉染或轉導橫膈膜、心臟及/或骨骼肌細胞，例如預先自個體採集之細胞、自例如經誘導之多能幹細胞或胚胎細胞分化的細胞株或細胞。離體方法需要自個體採集橫膈膜、骨骼肌及心臟細胞，活體外轉染或轉導，且視情況將經轉染細胞再引入個體中。活體內方法需要向個體投與本文中所揭示之核酸表現卡匣或載體。在較佳實施例中，活體外或離體進行橫膈膜、骨骼肌及心臟細胞之轉染。
熟習此項技術者應瞭解，本文所揭示之核酸調節元件、核酸表現卡匣及載體的用途涵義已超出基因療法，例如：幹細胞共軸分化成橫膈膜、骨骼肌及心臟細胞；用於橫膈膜、骨骼肌及心臟中蛋白質之過度表現的轉基因模型等。
本發明進一步藉由以下非限制性實例說明。
實例 實例 1 ： 含有重新計算設計之調節元件 ( CRE ) 的新穎 AAV 載體之設計及建構 圖 1描繪經設計及建構之不同AAV載體。AAV9載體設計成利用合成SPc5-12啟動子(SEQ ID NO: 4)與橫膈膜(Dph)源CRE元件串聯陣列(稱為Dph-CRE05-CRE02-CRE04-CRE06)的組合來表現螢光素酶報導基因(Luc) (SEQ ID NO: 3)。已知個別CRE元件介導橫膈膜及骨骼肌中之高轉基因表現(本文中表示為Dph-CRE)。載體亦含有小鼠細小病毒(MVM)內含子(SEQ ID NO: 5)及合成聚腺苷酸化位點(SyntpA) (SEQ ID NO: 6)。不含任何CRE元件之AAV載體建構為對照(在本文中稱為AAV-SPc5-12-MVM-luc-pA)。藉由習知選殖建構載體。簡言之，將5'及3'端皆側接Hind III及BstBI限制位點的所有編碼螢光素酶之報導基因(SEQ ID NO: 3)選殖於SPc5-12啟動子下游。在單股腺相關病毒載體(AAVss)主鏈之情形下，將其選殖於MVM內含子(SEQ ID NO: 5)上游。載體亦含有49 bp合成聚腺苷酸化位點(Levitt N等人, 1989) (SEQ ID NO: 6)。
圖1A中所描繪之載體(AAV-SPc5-12-MVM-Luc-pA) (SEQ ID NO: 2)充當用於選殖不同Dph-CRE之主鏈。四種橫膈膜CRE (Dph-CRE05 (SEQ ID NO: 9)、Dph-CRE02 (SEQ ID NO: 10)、Dph-CRE04 (SEQ ID NO: 11)、Dph-CRE06 (SEQ ID NO: 12))選殖於SPc5-12啟動子上游以產生表現Luc之構建體(稱為AAV-Dph-CRE05-CRE02-CRE04-CRE06-SPc5-12-MVM-Luc-pA) (圖1B) (SEQ ID NO: 1)。AAV-SPc5-12-MVM-Luc-pA (SEQ ID NO: 2)及AAV-Dph-CRE05-CRE02-CRE04-CRE06-SPc5-12-MVM-Luc-pA (SEQ ID NO: 1)載體的序列展示於 圖 2 及 3中。各別CRE序列描繪於下表1中： 表1：CRE序列。
SEQ ID NO. 基因 Dph-CRE (CRE) 尺寸 (bp ) 序列
9 ACTA1 Dph-CRE05 169 CCTTTTAGAGAATCCACACCTGTCCCAGTTGCTGGGTTCCACTACCAAAAGTGAATTGCAACTATTTTAGGAGCACTTAAGCACATCCGAAAAATGAGTGATTCTGTTCTGGCCCACACCACATCACTGATGTACCCCCTTAAAGCATGTCCCTGAGTTCATCACAGAA
10 ACTA1 Dph-CRE02 452 GACAGGTGCGGTTCCCGGAGCGCAGGCGCACACATGCACCCACCGGCGAACGCGGTGACCCTCGCCCCACCCCATCCCCTCCGGCGGGCAACTGGGTCGGGTCAGGAGGGGCAAACCCGCTAGGGAGACACTCCATATACGGCCCGGCCCGCGTTACCTGGGACCGGGCCAACCCGCTCCTTCTTTGGTCAACGCAGGGGACCCGGGCGGGGGCCCAGGCCGCGAACCGGCCGAGGGAGGGGGCTCTAGTGCCCAACACCCAAATATGGCTCGAGAAGGGCAGCGACATTCCTGCGGGGTGGCGCGGAGGGAATGCCCGCGGGCTATATAAAACCTGAGCAGAGGGACAAGCGGCCACCGCAGCGGACAGCGCCAAGTGAAGCCTCGCTTCCCCTCCGCGGCGACCAGGGCCCGAGCCGAGAGTAGCAGTTGTAGCTACCCGCCCAGGTAGG
11 ACTA1 Dph-CRE04 509 CCTTTTAGAGAATCCACACCTGTCCCAGTTGCTGGGTTCCACTACCAAAAGTGAATTGCAACTATTTTAGGAGCACTTAAGCACATCCGAAAAATGAGTGATTCTGTTCTGGCCCACACCACATCACTGATGTACCCCCTTAAAGCATGTCCCTGAGTTCATCACAGAAGACTGCTCCTCCTGTGCCCTCCACAAGGTTAGAACTGTCCTTGTCTTAGGGAAAAAGGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGGGACAGGCACCAACTGGGTAACCTCTGCTGACCCCCACTCTACTTTACCATAAGTAGCTCCAAATCCTTCTAGAAAATCTGAAAGGCATAGCCCCATATATCAGTGATATAAATAGAACCTGCAGCAGGCTCTGGTAAATGATGACTACAAGGTGGACTGGGAGGCAGCCCGGCCTTGGCAGGCATCATCCTCTAAATATAAAGATGAGTTTGTTCAGCCTTTGCAGAAGGA
12 CKM Dph-CRE06 400 GGGCCAGGGGACGGTGGCTTCTACGTGCTTGGGACGTTCCCAGCCACCGTCCCATGTTCCCGGCGGGGGGCCAGCTGTCCCCACCGCCAGCCCAACTCAGCACTTGGTCAGGGTATCAGCTTGGTGGGGGGGCGTGAGCCCAGCCCCTGGGGCGGCTCAGCCCATACAAGGCCATGGGGCTGGGCGCAAAGCATGCCTGGGTTCAGGGTGGGTATGGTGCGGGAGCAGGGAGGTGAGAGGCTCAGCTGCCCTCCAGAACTCCTCCCTGGGGACAACCCCTCCCAGCCAATAGCACAGCCTAGGTCCCCCTATATAAGGCCACGGCTGCTGGCCCTTCCTTTGGGTCAGTGTCACCTCCAGGATACAGACAGCCCCCCTTCAGCCCAGCCCAGCCAGGTAC
19 Dph-CRE05-CRE02-CRE04-CRE06與側接序列之組合 1564 bp CCTTTTAGAGAATCCACACCTGTCCCAGTTGCTGGGTTCCACTACCAAAAGTGAATTGCAACTATTTTAGGAGCACTTAAGCACATCCGAAAAATGAGTGATTCTGTTCTGGCCCACACCACATCACTGATGTACCCCCTTAAAGCATGTCCCTGAGTTCATCACAGAAACCGGTGACAGGTGCGGTTCCCGGAGCGCAGGCGCACACATGCACCCACCGGCGAACGCGGTGACCCTCGCCCCACCCCATCCCCTCCGGCGGGCAACTGGGTCGGGTCAGGAGGGGCAAACCCGCTAGGGAGACACTCCATATACGGCCCGGCCCGCGTTACCTGGGACCGGGCCAACCCGCTCCTTCTTTGGTCAACGCAGGGGACCCGGGCGGGGGCCCAGGCCGCGAACCGGCCGAGGGAGGGGGCTCTAGTGCCCAACACCCAAATATGGCTCGAGAAGGGCAGCGACATTCCTGCGGGGTGGCGCGGAGGGAATGCCCGCGGGCTATATAAAACCTGAGCAGAGGGACAAGCGGCCACCGCAGCGGACAGCGCCAAGTGAAGCCTCGCTTCCCCTCCGCGGCGACCAGGGCCCGAGCCGAGAGTAGCAGTTGTAGCTACCCGCCCAGGTAGGGGCGCGCCCCTTTTAGAGAATCCACACCTGTCCCAGTTGCTGGGTTCCACTACCAAAAGTGAATTGCAACTATTTTAGGAGCACTTAAGCACATCCGAAAAATGAGTGATTCTGTTCTGGCCCACACCACATCACTGATGTACCCCCTTAAAGCATGTCCCTGAGTTCATCACAGAAGACTGCTCCTCCTGTGCCCTCCACAAGGTTAGAACTGTCCTTGTCTTAGGGAAAAAGGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGGGACAGGCACCAACTGGGTAACCTCTGCTGACCCCCACTCTACTTTACCATAAGTAGCTCCAAATCCTTCTAGAAAATCTGAAAGGCATAGCCCCATATATCAGTGATATAAATAGAACCTGCAGCAGGCTCTGGTAAATGATGACTACAAGGTGGACTGGGAGGCAGCCCGGCCTTGGCAGGCATCATCCTCTAAATATAAAGATGAGTTTGTTCAGCCTTTGCAGAAGGAGGCGCGCCGTCGACGGATCCGGGCCAGGGGACGGTGGCTTCTACGTGCTTGGGACGTTCCCAGCCACCGTCCCATGTTCCCGGCGGGGGGCCAGCTGTCCCCACCGCCAGCCCAACTCAGCACTTGGTCAGGGTATCAGCTTGGTGGGGGGGCGTGAGCCCAGCCCCTGGGGCGGCTCAGCCCATACAAGGCCATGGGGCTGGGCGCAAAGCATGCCTGGGTTCAGGGTGGGTATGGTGCGGGAGCAGGGAGGTGAGAGGCTCAGCTGCCCTCCAGAACTCCTCCCTGGGGACAACCCCTCCCAGCCAATAGCACAGCCTAGGTCCCCCTATATAAGGCCACGGCTGCTGGCCCTTCCTTTGGGTCAGTGTCACCTCCAGGATACAGACAGCCCCCCTTCAGCCCAGCCCAGCCAGGTAC
表1之CRE選殖於SEQ ID NO: 2之AAV載體主鏈中。在該等CRE區域之間，可存在某一數目個核苷酸(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個，諸如至多20個核酸)以便促進選殖(例如，限制位點)，或CRE可彼此直接相鄰(例如，在合成時)。
載體亦包含其他建構嵌段，諸如SPc5-12啟動子、MVM內含子、螢光素酶報導基因及聚腺苷酸化信號，如表2中所呈現：
SEQ ID NO. 描述 序列
3 螢光素酶報導基因(Luc) ATGGAAGATGCCAAAAACATTAAGAAGGGCCCAGCGCCATTCTACCCACTCGAAGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCTGCACAAAGCCATGAAGCGCTACGCCCTGGTGCCCGGCACCATCGCCTTTACCGACGCACATATCGAGGTGGACATTACCTACGCCGAGTACTTCGAGATGAGCGTTCGGCTGGCAGAAGCTATGAAGCGCTATGGGCTGAATACAAACCATCGGATCGTGGTGTGCAGCGAGAATAGCTTGCAGTTCTTCATGCCCGTGTTGGGTGCCCTGTTCATCGGTGTGGCTGTGGCCCCAGCTAACGACATCTACAACGAGCGCGAGCTGCTGAACAGCATGGGCATCAGCCAGCCCACCGTCGTATTCGTGAGCAAGAAAGGGCTGCAAAAGATCCTCAACGTGCAAAAGAAGCTACCGATCATACAAAAGATCATCATCATGGATAGCAAGACCGACTACCAGGGCTTCCAAAGCATGTACACCTTCGTGACTTCCCATTTGCCACCCGGCTTCAACGAGTACGACTTCGTGCCCGAGAGCTTCGACCGGGACAAAACCATCGCCCTGATCATGAACAGTAGTGGCAGTACCGGATTGCCCAAGGGCGTAGCCCTACCGCACCGCACCGCTTGTGTCCGATTCAGTCATGCCCGCGACCCCATCTTCGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCTATCCTCAGCGTGGTGCCATTTCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACGCTGGGCTACTTGATCTGCGGCTTTCGGGTCGTGCTCATGTACCGCTTCGAGGAGGAGCTATTCTTGCGCAGCTTGCAAGACTATAAGATTCAATCTGCCCTGCTGGTGCCCACACTATTTAGCTTCTTCGCTAAGAGCACTCTCATCGACAAGTACGACCTAAGCAACTTGCACGAGATCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCTCAGCAAGGAGGTAGGTGAGGCCGTGGCCAAACGCTTCCACCTACCAGGCATCCGCCAGGGCTACGGCCTGACAGAAACAACCAGCGCCATTCTGATCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCTGGCGCAGTAGGCAAGGTGGTGCCCTTCTTCGAGGCTAAGGTGGTGGACTTGGACACCGGTAAGACACTGGGTGTGAACCAGCGCGGCGAGCTGTGCGTCCGTGGCCCCATGATCATGAGCGGCTACGTTAACAACCCCGAGGCTACAAACGCTCTCATCGACAAGGACGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCGCCTACTGGGACGAGGACGAGCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGAGCCTGATCAAATACAAGGGCTACCAGGTAGCCCCAGCCGAACTGGAGAGCATCCTGCTGCAACACCCCAACATCTTCGACGCCGGGGTCGCCGGCCTGCCCGACGACGATGCCGGCGAGCTGCCCGCCGCAGTCGTCGTGCTGGAACACGGTAAAACCATGACCGAGAAGGAGATCGTGGACTATGTGGCCAGCCAGGTTACAACCGCCAAGAAGCTGCGCGGTGGTGTTGTGTTCGTGGACGAGGTGCCTAAAGGACTGACCGGCAAGTTGGACGCCCGCAAGATCCGCGAGATTCTCATTAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGATCGCCGTGTAA
4 SPc5-12啟動子 TGGCCACCGCCTTCGGCACCATCCTCACGACACCCAAATATGGCGACGGGTGAGGAATGGTGGGGAGTTATTTTTAGAGCGGTGAGGAAGGTGGGCAGGCAGCAGGTGTTGGCGCTCTAAAAATAACTCCCGGGAGTTATTTTTAGAGCGGAGGAATGGTGGACACCCAAATATGGCGACGGTTCCTCACCCGTCGCCATATTTGGGTGTCCGCCCTCGGCCGGGGCCGCATTCCTGGGGGCCGGGCGGTGCTCCCGCCCGCCTCGATAAAAGGCTCCGGGGCCGGCGGCGGCCCACGAGCTACCCGGAGGAGCGGGAGGCGCCAAGCTCTAGA
5 小鼠細小病毒(MVM)內含子 AAGAGGTAAGGGTTTAAGGGATGGTTGGTTGGTGGGGTATTAATGTTTAATTACCTGGAGCACCTGCCTGAAATCACTTTTTTTCAGGTTGG
6 合成聚腺苷酸化位點(SyntpA) AATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTG
20 人類肌間線蛋白啟動子(1.4 kb) ACACACCTACTAGTAACCCCTCCAGCTGGTGATGGCAGGTCTAGGGTAGGACCAGTGACTGGCTCCTAATCGAGCACTCTATTTTCAGGGTTTGCATTCCAAAAGGGTCAGGTCCAAGAGGGACCTGGAGTGCCAAGTGGAGGTGTAGAGGCACGGCCAGTACCCATGGAGAATGGTGGATGTCCTTAGGGGTTAGCAAGTGCCGTGTGCTAAGGAGGGGGCTTTGGAGGTTGGGCAGGCCCTCTGTGGGGCTCCATTTTTGTGGGGGTGGGGGCTGGAGCATTATAGGGGGTGGGAAGTGATTGGGGCTGTCACCCTAGCCTTCCTTATCTGACGCCCACCCATGCCTCCTCAGGTACCCCCTGCCCCCCACAGCTCCTCTCCTGTGCCTTGTTTCCCAGCCATGCGTTCTCCTCTATAAATACCCGCTCTGGTATTTGGGGTTGGCAGCTGTTGCTGCCAGGGAGATGGTTGGGTTGACATGCGGCTCCTGACAAAACACAAACCCCTGGTGTGTGTGGGCGTGGGTGGTGTGAGTAGGGGGATGAATCAGGGAGGGGGCGGGGGACCCAGGGGGCAGGAGCCACACAAAGTCTGTGCGGGGGTGGGAGCGCACATAGCAATTGGAAACTGAAAGCTTATCAGACCCTTTCTGGAAATCAGCCCACTGTTTATAAACTTGAGGCCCCACCCTCGACAGTACCGGGGAGGAAGAGGGCCTGCACTAGTCCAGAGGGAAACTGAGGCTCAGGGCTAGCTCGCCCATAGACATACATGGCAGGCAGGCTTTGGCCAGGATCCCTCCGCCTGCCAGGCGTCTCCCTGCCCTCCCTTCCTGCCTAGAGACCCCCACCCTCAAGCCTGGCTGGTCTTTGCCTGAGACCCAAACCTCTTCGACTTCAAGAGAATATTTAGGAACAAGGTGGTTTAGGGCCTTTCCTGGGAACAGGCCTTGACCCTTTAAGAAATGACCCAAAGTCTCTCCTTGACCAAAAAGGGGACCCTCAAACTAAAGGGAAGCCTCTCTTCTGCTGTCTCCCCTGACCCCACTCCCCCCCACCCCAGGACGAGGAGATAACCAGGGCTGAAAGAGGCCCGCCTGGGGGCTGCAGACATGCTTGCTGCCTGCCCTGGCGAAGGATTGGCAGGCTTGCCCGTCACAGGACCCCCGCTGGCTGACTCAGGGGCGCAGGCCTCTTGCGGGGGAGCTGGCCTCCCCGCCCCCACGGCCACGGGCCGCCCTTTCCTGGCAGGACAGCGGGATCTTGCAGCTGTCAGGGGAGGGGAGGCGGGGGCTGATGTCAGGAGGGATACAAATAGTGCCGACGGCTGGGGGCCCTGTCTCCCCTCGCCGCATCCACTCTCCGGCCGGCCGCCTGCCCGCCGCCTCCTCCGTGCGCCCGCCAGCCTCGCCCGCGCCGTCACC
21 人類最小肌間線蛋白啟動子(1 kb) GTACCCCCTGCCCCCCACAGCTCCTCTCCTGTGCCTTGTTTCCCAGCCATGCGTTCTCCTCTATAAATACCCGCTCTGGTATTTGGGGTTGGCAGCTGTTGCTGCCAGGGAGATGGTTGGGTTGACATGCGGCTCCTGACAAAACACAAACCCCTGGTGTGTGTGGGCGTGGGTGGTGTGAGTAGGGGGATGAATCAGGGAGGGGGCGGGGGACCCAGGGGGCAGGAGCCACACAAAGTCTGTGCGGGGGTGGGAGCGCACATAGCAATTGGAAACTGAAAGCTTATCAGACCCTTTCTGGAAATCAGCCCACTGTTTATAAACTTGAGGCCCCACCCTCGACAGTACCGGGGAGGAAGAGGGCCTGCACTAGTCCAGAGGGAAACTGAGGCTCAGGGCTAGCTCGCCCATAGACATACATGGCAGGCAGGCTTTGGCCAGGATCCCTCCGCCTGCCAGGCGTCTCCCTGCCCTCCCTTCCTGCCTAGAGACCCCCACCCTCAAGCCTGGCTGGTCTTTGCCTGAGACCCAAACCTCTTCGACTTCAAGAGAATATTTAGGAACAAGGTGGTTTAGGGCCTTTCCTGGGAACAGGCCTTGACCCTTTAAGAAATGACCCAAAGTCTCTCCTTGACCAAAAAGGGGACCCTCAAACTAAAGGGAAGCCTCTCTTCTGCTGTCTCCCCTGACCCCACTCCCCCCCACCCCAGGACGAGGAGATAACCAGGGCTGAAAGAGGCCCGCCTGGGGGCTGCAGACATGCTTGCTGCCTGCCCTGGCGAAGGATTGGCAGGCTTGCCCGTCACAGGACCCCCGCTGGCTGACTCAGGGGCGCAGGCCTCTTGCGGGGGAGCTGGCCTCCCCGCCCCCACGGCCACGGGCCGCCCTTTCCTGGCAGGACAGCGGGATCTTGCAGCTGTCAGGGGAGGGGAGGCGGGGGCTGATGTCAGGAGGGATACAAATAGTGCCGACGGCTGGGGGCCCTGTCTCCCCTCGCCGCATCCACTCTCCGGCCGGCCGCCTGCCCGCCGCCTCCTCCGTGCGCCCGCCAGCCTCGCCCGCGCCGTCACC
實例 2 ： 經由報導基因對調節元件進行的活體內驗證為評估新穎Dph-CRE05-CRE02-CRE04-CRE06串聯陣列是否增加基因表現，將利用SPc5-12啟動子表現螢光素酶基因(Luc)且含有不同CRE組合的AAV-Dph-CRE05-CRE02-CRE04-CRE06-SPc5-12-MVM-Luc-pA載體注射至CB17-SCID小鼠中，且與不含CRE之對照AAV-SPc5-12-MVM-Luc-pA載體的效能加以對比。
實驗程序 AAV 載體產生 及純化AAV9載體由SignaGen實驗室利用定製的AAV產生服務產生(http://signagen.com/AAV-Production-Service)。
藉由定量即時PCR，使用SYBR Green混合物(其多合一式包括SYBR Green染料、Taqman聚合酶、ROX及dNTP)及螢光素酶特異性引子，在ABI 7500即時PCR系統(Applied Biosystem, Foster city, CA, USA)上測定載體效價(以病毒基因體(vg)/ml為單位)。所用正向及反向引子分別為5'-CCCACCGTCGTATTCGTGAG-3' (SEQ ID NO: 7)及5'-TCAGGGCGATGGTTTTGTCCC-3' (SEQ ID NO: 8)。使用用於產生相應AAV載體、攜載適當cDNA的各別載體質體之已知複本數(10 2-10 7)產生標準曲線。
動物研究成年4-5週齡雄性CB17-SCID小鼠靜脈內注射5×10 9vg/小鼠之劑量。藉由全身生物發光分析(BLI)，在注射後6至7天評估螢光素酶活性( 圖 4)。在注射後4個月處死每組之各小鼠且進行個別器官BLI以定量各個別器官及肌肉組織中之螢光素酶的表現量( 圖 4 及 5)。
結果全身生物發光分析顯示不同Dph-CRE之組合(亦即Dph-CRE05-CRE02-CRE04-CRE06) (圖2-SEQ ID NO: 1)相比於不含任何CRE之對照SPc5-12啟動子引起螢光素酶表現之實質性增加( 圖 4)。另外，在安樂死後，吾等解剖出所注射小鼠之不同肌肉組織及器官(亦即四頭肌、腓腸肌、脛骨、三頭肌、二頭肌、心臟、橫膈膜以及非肌肉組織，諸如肝、脾、腎、肺、腦)且使用BLI檢查生物發光活性( 圖 4 及 5)。此等結果證實了全身BLI結果，該等結果顯示使用Dph-CRE陣列Dph-CRE05-CRE02-CRE04-CRE06使得luc基因表現穩健增加。對照組小鼠注射磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)且未顯示螢光活性( 圖 4)。
實例 3 ： 含有合成 SPc5 - 12 啟動子與驅動治療基因表現之橫膈膜 ( Dph ) 源 CRE 元件串聯陣列 ( 稱為 Dph - CRE05 - CRE02 - CRE04 - CRE06 ) 之 AAV 載體的活體外驗證 目的 ：為了展現橫膈膜(Dph)源CRE元件(Dph-CRE05-CRE02-CRE04-CRE06)高量表現治療基因的能力。
材料及方法 質體 AAV - Dph - CRE05 - CRE02 - CRE04 - CRE06 - SPc5 - 12 - MVM - h ( 脂聯素 )- pA 之選殖藉由將人類脂聯素基因插入含有片段(Dph-CRE05-CRE02-CRE04-CRE06-SPc5-12-MVM)及合成poly A之AAV主鏈來選殖質體AAV-Dph-CRE05-CRE02-CRE04-CRE06-SPc5-12-MVM-h(脂聯素)-pA。人類脂聯素基因序列獲自NCBI且藉由習知寡核苷酸合成(GeneArt, Thermo Fisher Scientific)與kozak序列(SEQ ID NO: 13)以及用於方便選殖之側接BsiWI及ECO72I酶限制位點合成。將此脂聯素插入片段接合至AAV載體主鏈以產生含有脂聯素治療性基因之質體，該脂聯素治療性基因被靶向肌肉之SPc5-12啟動子以及橫膈膜CRE陣列(即CRE05-CRE02-CRE04-CRE06)驅動，從而產生質體AAV-Dph-CRE05-CRE02-CRE04-CRE06-SPc5-12-MVM-h(脂聯素)-pA。(圖6) (SEQ ID NO: 14)。脂聯素基因序列呈現為SEQ ID NO: 13 ＞ NM_001177800.2:100-834智人脂聯素、C1Q及含有(ADIPOQ)、轉錄本變異體1、mRNA之膠原蛋白域。 SEQ ID NO: 13 ( 741 bp)：
Figure 02_image005
GCCACC：Kozak序列 ATG：起始密碼子 TGA：終止密碼子
質體序列呈現為SED ID NO: 14。 SEQ ID NO: 14 (5778 bp)：
Figure 02_image007
Figure 02_image009
Figure 02_image011
Figure 02_image013
用 AAV - Dph - CRE05 - CRE02 - CRE04 - CRE06 - SPc5 - 12 - MVM - h ( 脂聯素 )- pA 質體轉染人類骨骼肌肌母細胞 ( HSMM ) 。使用購自Lonza之人類骨骼肌肌母細胞(HSMM)進行轉染。在100 mm組織培養盤中接種250萬個HSMM細胞以在轉染日期達到70%至90%匯合。接種三個100 mm組織培養盤以供轉染。接種三個額外培養盤以用作非轉染對照。在轉染之前兩小時，將8 ml SkGM-2 BulletKit培養基(Lonza，目錄號CC-3245)將添加至各培養盤中。待轉染之質體DNA (亦即AAV-Dph-CRE05-CRE02-CRE04-CRE06-SPc5-12-MVM-h(脂聯素)-pA)含有橫膈膜CRE陣列且使用PureLink™ HiPure質體過濾器Maxiprep套組(InvitrogenTM, ThermoFisher Scientific)純化。
轉染混合物之製備遵循製造商說明書之脂染胺LTX方案步驟。簡言之，將脂染胺LTX試劑稀釋於Opti-MEM®培養基中(混合物A)且亦將質體DNA稀釋於Opti-MEM®培養基中(混合物B)，之後添加PLUS™試劑且在室溫下保溫5分鐘。使用總量15 μg的質體DNA (AAV-Dph-CRE05-CRE02-CRE04-CRE06-SPc5-12-MVM-h(脂聯素)-pA)進行轉染。將經稀釋之DNA (混合物B)以1:1比率添加至經稀釋之Lipofectamine® LTX試劑(混合物A)中且在室溫下保溫20分鐘。隨後將1.5 ml此DNA-脂質複合物(混合物C)添加至細胞培養盤中，平緩振盪以均勻分佈試劑且隨後放回細胞培養保溫箱中。
轉染之後六小時，移除細胞培養基。細胞用10 ml PBS洗滌，且隨後將10 ml新鮮SkGM-2 BulletKit培養基添加於各培養盤中。轉染之後24小時，收集盤中之上清液。在4℃下在1500 rpm下離心上清液10分鐘且接著轉移至潔淨管且等分試樣。將此上清液儲存於80℃下用於進一步ELISA。
偵測人類脂聯素表現之 ELISA人類脂聯素ELISA (活體外酶聯免疫吸附分析)購自Abcam (目錄號ab99968)(參見鏈接： https://www.abcam.com/ps/products/99/ab99968/documents/Human-Adiponectin-ELISA-Kit-protocol-book-v6b-ab99968%20(website).pdf 且遵循製造商說明書進行ELISA分析以偵測經轉染之上清液中之人類脂聯素表現。
此分析使用對96孔培養盤上所塗佈之人類脂聯素具有特異性的抗體。將標準物及樣品吸移至孔中且藉由固定抗體使樣品中所存在之脂聯素結合至孔。洗滌各孔，且隨後添加經生物素標記之抗人類脂聯素抗體。洗掉未結合的經生物素標記之抗體之後，將HRP結合之鏈黴抗生物素蛋白吸移至孔中。再次洗滌各孔，隨後將TMB受質溶液添加至孔中且呈現的顏色與脂聯素之結合量成比例。終止溶液的顏色自藍色變成黃色，且在450 nm下量測顏色強度。
結果對質體-AAV-Dph-CRE05-CRE02-CRE04-CRE06-SPc5-12-MVM-h(脂聯素)-pA轉染24小時收集的HSMM細胞上清液進行ELISA。
測試3個培養盤之上清液，且平均值呈現於下圖7中。亦收集非轉染細胞的上清液以確定分析之基線值。
脂聯素 mRNA 表現之定量另外，在轉染之後24小時收集細胞集結粒，以便藉由定量逆轉錄酶聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)進一步進行脂聯素mRNA定量。人類脂聯素cDNA之擴增產生191 bp擴增子，而用作參考之hGAPDH cDNA在擴增後產生131 bp擴增子。
首先，使用AllPrep® DNA/RNA/miRNA通用套組(Qiagen，目錄號80224)，遵循製造商說明書提取RNA。隨後，使用SuperScript™ IV第一股合成系統套組(Invitrogen，目錄號18091050)，遵循製造商說明書，用oligo(dT)20引子由200 ng總RNA合成cDNA。
cDNA用如下文所指示之人類脂聯素特異性引子在StepOne Plus即時PCR系統(Applied Biosystem, USA)上進行PCR擴增： 人類脂聯素正向引子：5'- GCTGTTCTACTGCTATTAGCTC -3' (SEQ ID NO: 15) 人類脂聯素反向引子：5'- CCTTTCTCACCCTTCTCACC -3' (SEQ ID NO: 16) 且hGAPDH之引子序列為： hGAPDH正向引子：5'- GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3' (SEQ ID NO: 17) hGAPDH反向引子：5'- ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA -3' (SEQ ID NO: 18) 此處為qPCR中1個反應之組分：
qPCR 中 1 個反應之組分
SYBR™ Green PCR主混合物(Applied Biosystem, USA) 12.5 μL
正向引子(10 μM) 0.85 μL
反向引子(10 μM) 0.85 μL
H 2O 8.3 μL
cDNA模板 2.5 μL
總計 25 μL
在StepOne Plus即時PCR系統(Applied Biosystems, USA)上進行定量PCR (qPCR)。qPCR循環條件由以下組成：95℃持續10分鐘，隨後為95℃持續15秒及60℃持續1分鐘之40個循環。PCR後之解鏈曲線設定為95℃持續15秒，60℃持續1分鐘，溫度遞增0.3℃直至95℃為止且在95℃保持15秒。各樣品一式三份地進行。
結果 ： 脂聯素 mRNA 表現吾等據此證明，當橫膈膜(Dph)源CRE元件(Dph-CRE05-CRE02A-CRE04-CRE06)併入基因表現載體中時，肌肉細胞可容易表現治療性基因(亦即脂聯素)，如在蛋白質及mRNA層面上分別藉由ELISA及qRT-PCR所展示。
圖 1 ： AAV 載體 設計。AAV-Dph-CRE05-CRE02-CRE04-CRE06-SPc5-12-MVM-Luc-pA載體含有Dph-CRE Dph-CRE05-CRE02-CRE04-CRE06之串聯陣列，而對照AAV-SPc5-12-MVM-Luc-pA載體不含CRE。顯示SPc5-12啟動子、MVM內含子、Luc及合成聚腺苷酸化位點(pA)及AAV反向末端重複序列(5' itr及3' itr)。 圖 2 ：質體之核苷酸序列：AAV-Dph-CRE05-CRE02-CRE04-CRE06-SPc5-12-MVM-Luc-pA (SEQ ID NO: 1)。 圖 3 ：質體之核苷酸序列：AAV-SPc5-12-MVM-Luc-pA (SEQ ID NO: 2)。 圖 4 ： 生物發光分析注射磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、AAV-SPc5-12-MVM-Luc-pA或AAV-Dph-CRE05-CRE02-CRE04-CRE06-SPc5-12-MVM-Luc-pA載體之CB17-SCID小鼠的全身生物發光分析(A-C)。顯示所解剖之個別器官及肌肉組織(D-F) (各組n=3隻小鼠)。 圖 5 ： 螢光素酶活性之量化注射AAV-SPc5-12-MVM-Luc-pA或AAV-Dph-CRE05-CRE02-CRE04-CRE06-SPc5-12-MVM-Luc-pA載體之CB17-SCID小鼠之個別器官及肌肉組織中的螢光素酶活性與圖4D至圖4F中示出之BLI信號對應(各組n=3隻小鼠)。 圖 6 ： AAV 載體 設計 ：AAV-Dph-CRE05-CRE02-CRE04-CRE06-SPc5-12-MVM-h(脂聯素)-pA。在AAV載體設計中，在驅動人類脂聯素治療性基因之靶向肌肉之特異性啟動子SPc5-12上游選殖來源於橫膈膜(Dph)的CRE元件串聯陣列，命名為Dph-CRE05-CRE02-CRE04-CRE06。MVM (小鼠之細小病毒)內含子亦包括於載體設計中。 圖 7 ： 骨骼肌肌纖維母細胞 ( HSMM ) 中之脂聯素表現。使用人類脂聯素特異性Elisa分析(購自Abcam)定量經轉染之人類骨骼肌成肌細胞(HSMM)中所表現之脂聯素的量。在用脂染胺LTX試劑轉染之後24小時，收集上清液且定量三份樣品且計算脂聯素蛋白表現之平均量。每毫升上清液偵測到超過1600 pg脂聯素蛋白。 圖 8 ： 經轉染 HSMM 細胞中脂聯素 mRNA 之定量。使經轉染及未經轉染之HSMM細胞經胰蛋白酶處理。隨後，提取RNA且使用脂聯素特異性引子合成cDNA，進行qRT-PCR且定量脂聯素mRNA表現。
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Claims (33)

  1. 一種核酸表現卡匣，其包含以下4種順式調節元件(cis-regulatory element；CRE)之組合：Dph-CRE-05、Dph-CRE-02、Dph-CRE-04及Dph-CRE-06，該等順式調節元件分別以SEQ ID NO: 9至12之核酸序列定義，或以與該等序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%一致性之序列、該等序列之互補序列或在嚴格條件下與以該等序列定義之核酸雜交的序列定義，該等順式調節元件可操作地連接於橫膈膜、心臟及/或骨骼肌特異性啟動子。
  2. 如請求項1之核酸表現卡匣，其中Dph-CRE-05、Dph-CRE-02、Dph-CRE-04及Dph-CRE-06之序列分別以SEQ ID NO: 9至12定義。
  3. 如請求項1或2之核酸表現卡匣，其中Dph-CRE-05、Dph-CRE-02、Dph-CRE-04及Dph-CRE-06之序列以SEQ ID NO: 19定義。
  4. 如請求項1至3中任一項之核酸表現卡匣，其中該等CRE之組合係選自CRE元件之以下序列中之任一者： Dph-CRE-05_Dph-CRE-02_Dph-CRE-04_Dph-CRE-06， Dph-CRE-05_Dph-CRE-02_Dph-CRE-06_Dph-CRE-04， Dph-CRE-05_Dph-CRE-04_Dph-CRE-02_Dph-CRE-06， Dph-CRE-05_Dph-CRE-04_Dph-CRE-06_Dph-CRE-02， Dph-CRE-05_Dph-CRE-06_Dph-CRE-04_Dph-CRE-02， Dph-CRE-05_Dph-CRE-06_Dph-CRE-02_Dph-CRE-04， Dph-CRE-04_Dph-CRE-02_Dph-CRE-05_Dph-CRE-06， Dph-CRE-04_Dph-CRE-02_Dph-CRE-06_Dph-CRE-05， Dph-CRE-04_Dph-CRE-06_Dph-CRE-02_Dph-CRE-05， Dph-CRE-04_Dph-CRE-06_Dph-CRE-05_Dph-CRE-02， Dph-CRE-04_Dph-CRE-05_Dph-CRE-02_Dph-CRE-06， Dph-CRE-04_Dph-CRE-05_Dph-CRE-06_Dph-CRE-02， Dph-CRE-06_Dph-CRE-02_Dph-CRE-05_Dph-CRE-04， Dph-CRE-06_Dph-CRE-02_Dph-CRE-04_Dph-CRE-05， Dph-CRE-06_Dph-CRE-05_Dph-CRE-02_Dph-CRE-04， Dph-CRE-06_Dph-CRE-05_Dph-CRE-04_Dph-CRE-02， Dph-CRE-06_Dph-CRE-04_Dph-CRE-02_Dph-CRE-05， Dph-CRE-06_Dph-CRE-04_Dph-CRE-05_Dph-CRE-02， Dph-CRE-02_Dph-CRE-06_Dph-CRE-05_Dph-CRE-04， Dph-CRE-02_Dph-CRE-06_Dph-CRE-04_Dph-CRE-05， Dph-CRE-02_Dph-CRE-05_Dph-CRE-06_Dph-CRE-04， Dph-CRE-02-Dph-CRE-05_Dph-CRE-04_Dph-CRE-06， Dph-CRE-02_Dph-CRE-04_Dph-CRE-06_Dph-CRE-05，及 Dph-CRE-02_Dph-CRE-04_Dph-CRE-05_Dph-CRE-06。
  5. 如請求項1至4中任一項之核酸表現卡匣，其進一步包含內含子，較佳為小鼠細小病毒(Minute Virus of Mouse；MVM)內含子。
  6. 如請求項1至5中任一項之核酸表現卡匣，其中該核酸調節元件可操作地連接於轉基因。
  7. 如請求項1至6中任一項之核酸表現卡匣，其中該啟動子為SPc5-12、MCK、MHCK7、MYL2、MB、DES、TNNC1、TCAP、MYH7、ALDA、ACTA1及TPM1，較佳為SPc5-12。
  8. 如請求項1至7中任一項之核酸表現卡匣，其中該轉基因編碼治療蛋白或免疫原性蛋白。
  9. 如請求項1至8中任一項之核酸表現卡匣，其中該轉基因編碼分泌型蛋白或結構蛋白，諸如脂聯素、酸性α葡萄糖苷酶(acid alpha glucosidase；GAA)、肌微管素(myotubularin；MTM1)、卵泡抑素、肌縮蛋白、肌聚糖(sarcoglycan)或質膜修復蛋白(dysferlin)。
  10. 如請求項1至9中任一項之核酸表現卡匣，其中該轉基因編碼酸性α葡萄糖苷酶(GAA)，更佳為密碼子優化之人類酸性α葡萄糖苷酶基因(codon-optimised human acid alpha glucosidase gene；hGAAco)。
  11. 如請求項1至10中任一項之核酸表現卡匣，其進一步包含聚腺苷酸化信號，較佳為合成聚腺苷酸化信號(SEQ ID NO: 127)或猴病毒40 (Simian Virus 40；SV40)聚腺苷酸化信號。
  12. 一種載體，其包含如請求項1至11中任一項之核酸表現卡匣。
  13. 如請求項12之載體，其係病毒載體，較佳為腺相關病毒(AAV)載體，更佳為AAV9載體。
  14. 如請求項12之載體，其為非病毒載體，較佳為質體、小環、游離型載體或基於轉位子之載體，諸如基於PiggyBac之載體或基於睡美人(Sleeping Beauty)之載體。
  15. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至11中任一項之核酸表現卡匣或如請求項12至14中任一項之載體及醫藥學上可接受之載劑。
  16. 如請求項1至11中任一項之核酸表現卡匣、如請求項12至14中任一項之載體或如請求項15之醫藥組合物，其用於醫藥中。
  17. 如請求項1至11中任一項之核酸表現卡匣、如請求項12至14中任一項之載體或如請求項15之醫藥組合物，其用於治療如態樣17中所揭示之疾病中之任一者，更特定言之，用於治療龐貝氏症(Pompe disease)、肌肉萎縮症及/或胞溶體貯積症(ysosomal storage disorder；LSD)。
  18. 如請求項1至11中任一項之核酸表現卡匣、如請求項12至14中任一項之載體或如請求項15之醫藥組合物，其用作疫苗、較佳用作預防性疫苗，或用於疫苗接種療法、較佳用於預防性疫苗接種。
  19. 如請求項1至11中任一項之核酸表現卡匣、如請求項12至14中任一項之載體或如請求項15之醫藥組合物，其用於治療選自包含以下之群的非肌肉疾病：血友病(例如，A型血友病及B型血友病)；亨特症候群(Hunter syndrome)、苯酮尿症(phenylketonuria；PKU)、遺傳性血管水腫(hereditary angioedema；HAE)、α抗胰蛋白酶(alpha anti-trypsin；AAT)缺乏、甲狀腺素轉運蛋白澱粉樣變性、法布立病(Fabry disease)、糖尿病及癌症，其中如請求項1至11中任一項之核酸表現卡匣、如請求項12至14中任一項之載體或如請求項15之醫藥組合物表現適於治療該疾病或病症的分泌型蛋白。
  20. 一種用於在橫膈膜、骨骼肌及/或心臟組織或細胞中表現轉基因產物的方法，較佳為活體外或離體方法，其包含： 將如請求項1至11中任一項之核酸表現卡匣或如請求項13至14中任一項之載體引入至該等組織或細胞中；及 在該等組織或細胞中表現該轉基因產物。
  21. 一種如請求項1至11中任一項之核酸表現卡匣用於增強橫膈膜、骨骼肌及/或心臟組織或細胞中之基因表現的用途。
  22. 一種用於在橫膈膜、骨骼肌及/或心臟組織或細胞中表現轉基因產物的方法，較佳為活體外或離體方法，其包含： 將如請求項1至11中任一項之核酸表現卡匣或如請求項12至14中任一項之載體引入至該等組織或細胞中；及 在該等組織或細胞中表現該轉基因產物。
  23. 一種用於治療MTM或X連鎖肌微管性肌病之方法，其包含向有需要個體投與治療有效量之如請求項1至11中任一項之核酸表現卡匣、如請求項12至14中任一項之載體或如請求項15之醫藥組合物。
  24. 如請求項23之方法，其中該轉基因為肌微管素(MTM1)。
  25. 一種用於治療龐貝氏症的方法，其包含向有需要個體投與治療有效量之如請求項1至11中任一項之核酸表現卡匣、如請求項12至14中任一項之載體或如請求項15之醫藥組合物。
  26. 如請求項25之方法，其中該轉基因為酸性α葡萄糖苷酶(GAA)。
  27. 一種用於治療在以上請求項或態樣17中列出之疾病或病症中之任一者的方法，更尤其選自包含以下之群的彼等疾病或病症：肌肉萎縮症(例如，杜興氏肌肉萎縮症(Duchenne muscular dystrophy；DMD)/貝氏肌肉萎縮症(Becker muscular dystrophy；BMD))、肌強直性營養不良、肌強直性肌肉萎縮症(DM)、杜興氏肌肉萎縮蛋白病(Duchenne dystrophinopathy)、肌聚糖病、三好氏肌病(Miyoshi myopathy)、福山型先天性肌肉萎縮症(Fukuyama type congenital muscular dystrophy)、質膜修復蛋白病、肌神經病；運動神經元疾病(motor neuron disease；MND)，諸如夏柯-馬利-杜斯氏病(Charcot-Marie-Tooth disease；CMT)、脊髓性肌萎縮(SMA)及肌萎縮性側索硬化(ALS)；埃默里-德雷弗斯氏肌肉萎縮症(Emery-Dreifuss muscular dystrophy)、面肩胛肱型肌肉萎縮症(facioscapulohumeral muscular dystrophy；FSHD)、先天性肌肉萎縮症、先天性肌病、肢帶型肌肉萎縮症、代謝性肌病、肌肉發炎疾病、肌無力、粒線體肌病、離子通道異常、核膜病、心肌病、心肥大、心衰竭、遠端肌病、心血管疾病；血友病，包括A型血友病及B型血友病；及糖尿病，該方法包含投與治療有效量之如請求項1至11中任一項之核酸表現卡匣、如請求項12至14中任一項之載體或如請求項15之醫藥組合物。
  28. 如請求項27之方法，其用於治療肌肉萎縮症，更尤其杜興氏肌肉萎縮症，或用於治療肌聚糖缺乏，其中該轉基因為脂聯素(adiponectin)。
  29. 如請求項之27方法，其用於治療肌肉萎縮症，更尤其杜興氏肌肉萎縮症，或用於治療肌聚糖缺乏，其中該轉基因為卵泡抑素(follistatin)。
  30. 如請求項之27方法，其用於治療肌肉萎縮症，更尤其杜興氏肌肉萎縮症，或用於治療肌聚糖缺乏，其中該轉基因為肌縮蛋白、肌聚糖或質膜修復蛋白。
  31. 如請求項28之方法，其中該載體係以SEQ ID NO: 14編碼之AAV-Dph-CRE05-CRE02-CRE04-CRE06-SPc5-12-MVM-h(脂聯素)-pA載體。
  32. 在請求項1至31中之任一項中，儘管肌肉定向表現通常基於蛋白質表現，但諸如siRNA、gRNA、circRNA、lncRNA、shRNA、miRNA等非編碼RNA (ncRNA)之表現可藉由如請求項1至11中任一項之核酸表現卡匣、如請求項12至14中任一項之載體或如請求項15之醫藥組合物來達成。
  33. 如請求項1至11中任一項之核酸表現卡匣、如請求項12至14中任一項之載體或如請求項15之醫藥組合物，其用於基因疫苗接種或用於表現抗體或奈米抗體或用於表現CRISPR/Cas組分，特定言之，CRISPR/Cas9。
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