TWI811219B - 高活性調控元件 - Google Patents

Abstract

本文提供用於驅動轉基因高表現之組合物及方法。提供用於驅動包含一或多個源於人類之調控元件之轉基因高表現之組合物及方法，該等源於人類之調控元件在可操作連接至轉基因時，可引起該轉基因在一或多種細胞類型或組織中高表現。

Description

高活性調控元件

基因工程具有治療疾病及產生蛋白質以用於治療或其他用途之巨大潛力。患者、尤其具有潛在遺傳因素之彼等可藉由直接靶向潛在病因來治療，而非依賴於藥物或手術。此外，藉由靶向潛在病因本身，基因療法具有有效治癒患者之潛能。然而，儘管如此，基因療法之臨床應用仍需要在若干態樣進行改良。一個挑戰係在一或多個目標組織中達成轉基因之高表現率或在一或多個目標組織中達成基因編輯之高效率。另一挑戰係由常用載體之包裝限制(或選殖能力)引入。需要可驅動可操作連接之轉基因之高表現的短調控元件。

本文闡述用於轉基因之高表現之組合物及方法。本文亦闡述用於包含一或多個人類或源於人類之調控元件(RE)之轉基因之高表現的組合物及方法，該等人類或源於人類之調控元件在可操作連接至轉基因時可有利於或引起轉基因在一或多個靶細胞類型或組織中之高(或增加)表現。在一些情形下，測得與對照(例如組成型啟動子、CAG、CMV啟動子、超級核心啟動子(SCP)、TTR啟動子、Proto 1啟動子、UCL-HLP啟動子或CMVe啟動子)相比，本文揭示之任一實施例之轉基因表現高或增加。可用於比較以測定由本文揭示之調控元件之高或增加之轉基因表現的其他對照包括單獨緩衝液、minCMV、EFS、單獨載體或不驅動表現之序列。在一些實施例中，本文揭示之一或多個調控元件驅動轉基因在細胞中或在活體內、活體外及/或離體高表現。在一些實施例中，包含一或多個本文所述可操作連接至轉基因之調控元件的表現盒或載體可適合用於任何表現系統或基因療法以驅動細胞、個體或動物模式中轉基因之高表現，或在細胞、個體或動物模式中引起治療有效程度之轉基因表現。在一些實施例中，本揭示內容之一或多個RE可操作連接至大的轉基因(例如序列超過1 kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、5.5kb、6kb、6.5kb、7kb或7.5kb之轉基因)以引起轉基因在細胞中或在活體內高表現。在一些情形下，轉基因在細胞中或在活體內之該高表現係相對於無該等RE之轉基因之表現，其中與無RE之轉基因表現相比，具有RE之轉基因之表現係至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍或至少50倍。在一些情形下，一或多個RE在至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10種不同細胞類型中引起該高轉基因表現。在一些情形下，本揭示內容之一或多個RE可操作連接至轉基因用於適於全身投與之基因療法治療。在一些情形下，本揭示內容之一或多個RE可操作連接至轉基因用於適於在肝或肝細胞中表現之基因療法治療。在一些情形下，轉基因係DNA結合蛋白，例如調節內源基因之轉錄調節劑。在一些情形下，本文揭示之任一實施例之RE包含啟動子序列、內含子序列、5’ UTR序列或其任一組合。在一些情形下，本文揭示之任一實施例之RE係源於人類之序列(或與人類參照基因體中序列具有至少80%、90%、95%或99%序列一致性之序列)。在一些情形下，本文揭示之任一實施例之RE之長度小於或等於300bp、250bp、200bp、150bp、140bp、130bp、120bp、110bp、100bp、70bp或50bp。在一些情形下，表現構築體(例如載體、AAV或病毒載體)包含一或多個可操作連接至本揭示內容之轉基因之外源RE序列，其中每一外源RE序列選自表 1 或SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41中所列示之序列；或其中每一外源RE序列包含表 1 或SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41之序列；或其中每一外源RE序列包含與表 1 或SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41之序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性(例如局部序列一致性)的序列(例如如藉由BLAST量測之序列一致性)。在一些情形下，表現盒(例如載體、AAV或病毒載體)包含一或多個可操作連接至任何轉基因之RE序列，其中每一RE序列不超過49bp、50bp、56bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、110bp、117bp、120bp、130bp、140bp、150bp、160bp、170bp、180bp、190bp、200bp、210bp、220bp、230bp、240bp、250bp、259bp、260bp、265bp、270bp、280bp、290bp、300bp、310bp、320bp、330bp、340bp、350bp、360bp、370bp、380bp、390bp或400bp，且包含根據表 1 或SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41中之任一者之序列。在一些情形下，表現構築體(例如載體、AAV或病毒載體)包含一或多個可操作連接至本揭示內容之轉基因之外源RE序列，其中每一RE序列不超過49bp、50bp、56bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、110bp、117bp、120bp、130bp、140bp、150bp、160bp、170bp、180bp、190bp、200bp、210bp、220bp、230bp、240bp、250bp、259bp、260bp、265bp、270bp、280bp、290bp、300bp、310bp、320bp、330bp、340bp、350bp、360bp、370bp、380bp、390bp或400bp，且包含與表 1 或SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41中之任一者具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的序列。在一些情形下，局部序列一致性係使用BLAST量測。在一些情形下，序列一致性百分比係指涵蓋表現盒中整個外源RE之總體序列一致性。在其他情形下，序列一致性百分比係指涵蓋對應於表 1 中所列示序列之區的局部序列一致性。在一些情形下，序列一致性百分比係指涵蓋包含不超過49bp、50bp、56bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、110bp、117bp、120bp、130bp、140bp、150bp、160bp、170bp、180bp、190bp、200bp、210bp、220bp、230bp、240bp、250bp、259bp、260bp、265bp、270bp、280bp、290bp、300bp、310bp、320bp、330bp、340bp、350bp、360bp、370bp、380bp、390bp或400bp之表現盒(不包括轉基因)之區的局部序列一致性。如本文所用之「相對較短」在闡述本揭示內容之RE時較佳係不超過45bp、49bp、50bp、56bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、110bp、117bp、120bp、130bp、140bp、150bp、160bp、170bp、180bp、190bp、200bp、210bp、220bp、230bp、240bp、250bp、259bp、260bp、265bp、270bp、280bp、290bp、300bp、310bp、320bp、330bp、340bp、350bp、360bp、370bp、380bp、390bp或400bp之RE序列。相對較短RE之實例包括表 1 或SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41中所列示之序列；或與其具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列，且亦不超過45bp、49bp、50bp、56bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、110bp、117bp、120bp、130bp、140bp、150bp、160bp、170bp、180bp、190bp、200bp、210bp、220bp、230bp、240bp、250bp、259bp、260bp、265bp、270bp、280bp、290bp、300bp、310bp、320bp、330bp、340bp、350bp、360bp、370bp、380bp、390bp或400bp。

在一些情形下，本文揭示之任一實施例之RE序列位於轉基因之上游或下游。在一些情形下，本文揭示之任一實施例之兩個或更多個RE可操作連接至轉基因，其中RE中之至少一者或多者位於轉基因之上游或下游。在一些情形下，本揭示內容之任一實施例之一或多個RE可操作連接至轉基因以驅動轉基因之總體表現，其中總體表現係指至少2、3、4、5、6、7、8、9或10種不同細胞類型中之表現。在一些情形下，本揭示內容之任一實施例之一或多個RE可操作連接至轉基因以驅動轉基因之總體表現，其中總體表現意指包含RE及轉基因之構築體可經由(例如)經口、靜脈內、肌內、腹膜內、鞘內、經腸或非經腸投與全身遞送。在各個實施例中，本文揭示之RE係來自人類(或與人類參照基因體中之序列具有至少80%、90%、95%或99%序列一致性的序列)。在一些情形下，本文揭示之任一實施例之RE係非天然的。

在一些情況下，表現載體包含具有小於或等於400bp、300bp、250bp、200bp、150bp、140bp、130bp、120bp、110bp、100bp、70bp或50bp之可操作連接至轉基因的源於人類之調控元件，其中與無調控元件之第二表現載體相比，該調控元件將轉基因之總體表現(例如在至少2、3、4、5、6或更多種不同細胞類型中之表現)增加至少兩倍。在一些情形下，第二表現載體包含可操作連接至對照啟動子(例如CMV啟動子)之轉基因。

在一些情形下，本揭示內容之RE包含源於人類之內含子序列，例如SEQ ID NO: 1-2。在一些情形下，本揭示內容之表現盒包含可操作連接至轉基因之SEQ ID NO: 1-2中之一或多者。在一些情形下，包含SEQ ID NO: 1-2中之任一或多者之RE位於轉基因之上游、下游或上游及下游二者。

在一些情形下，本揭示內容之RE包含源於人類之啟動子序列，例如SEQ ID NO: 13-17及22-41。在一些情形下，本揭示內容之表現盒包含可操作連接至轉基因之SEQ ID NO: 13-17及22-41中之一或多者。在一些情形下，包含SEQ ID NO: 13-17及22-41中之任一或多者之RE位於轉基因之上游、下游或上游及下游二者。

在一些情形下，本揭示內容之RE包含源於人類之內含子序列及啟動子序列，例如SEQ ID NO: 1-2, 13-17及22-41中之兩者或更多者；或表 1 所列示之序列中之兩者或更多者。在一些情形下，本揭示內容之表現盒包含可操作連接至轉基因之表 1 所列示之序列中的一或多者、兩者或更多者、三者或更多者、四者或更多者或五者或更多者。在一些情形下，表 1 所列示之一或多個RE位於表現盒中之轉基因之上游、下游或上游及下游二者。在一些情形下，表 1 所列示之一或多個RE位於本文揭示之表現盒中之轉基因的上游。

在一些情況下，本文揭示之任一實施例之RE由選自表 1 或SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41及其任何組合之序列組成。在一些情形下，在無連接體序列情況下組合表 1 中所列示之兩個或更多個RE。在一些情形下，使用1-50bp之連接體序列組合表 1 中所列示之兩個或更多個RE。在一些情形下，將表 1 中所列示之兩個或更多個RE放置於表現構築體中，使得RE序列之5’起點間隔小於2bp、5bp、10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、5.5kb、6kb、6.5kb、7kb或7.5kb。

在一些情況下，表現載體包含具有小於或等於300bp、250bp、200bp、150bp、140bp、130bp、120bp、110bp、100bp、70bp或50bp之可操作連接至轉基因的源於人類之調控元件，其中轉基因之表現高於由對照調控元件(例如組成型啟動子、CMV啟動子、超級核心啟動子、TTR啟動子、Proto 1啟動子、UCL-HLP啟動子或CMVe啟動子)表現之相同轉基因的表現。在一些情形下，轉基因之表現高於由UCL-HLP啟動子表現之相同轉基因的表現。

在一些情形下，表現載體包含可操作連接至轉基因之源於人類之調控元件，其中由轉基因編碼之蛋白質具有(i) ＞1.0 IU/mL、＞1.5 IU/mL、＞2.0 IU/mL、＞2.5 IU/mL或＞3.0 IU/mL之濃度，如藉由其組態在於檢測轉基因之ELISA分析所量測；及/或(ii) ＞ 20%、＞25%、＞30%、＞35%、＞40%、＞45%、＞50%、＞55%、＞60%、＞65%、＞70%、＞75%、＞80%、＞85%、＞90%或＞95%之活性，如藉由Coatest分析所量測。在一些情形下，在動物模式(例如小鼠)中分析該活性或轉基因表現。在一些情形下，將本文所述轉基因表現或活性標準化成遞送至細胞或小鼠之表現盒、載體、病毒或DNA之劑量，例如每隻小鼠16 μg表現載體之劑量。

在一些情形下，載體包含具有小於或等於300bp、250bp、200bp、150bp、140bp、130bp、120bp、110bp、100bp、70bp或50bp之大小之序列的可操作連接至轉基因之源於人類之調控元件，該轉基因在細胞或活體內未發現與調控元件相關，或通常未連接至調控元件。

在一些情形下，本文所述表現盒或載體包含調控元件，其係內含子序列、啟動子序列、增強子序列或其組合。在一些情形下，表現盒或載體包含調控元件，其係SEQ ID NO: 1、2、3、4、13、14、15、16、17、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或其組合；或與其具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之序列。在一些情形下，表現盒或載體包含轉基因，其係報導基因，例如螢光素酶。在一些情形下，使用報導基因(例如螢光素酶)作為轉基因引起大於1×10⁸ 個光子/sec之總體表現，如整個小鼠中所量測；或引起動物(例如小鼠)中至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種不同細胞類型中之轉基因表現增加。在一些情形下，將如本文所述表現盒或載體之活性或轉基因表現標準化成遞送至小鼠之表現盒、載體、病毒或DNA之劑量，例如每隻小鼠12 μg表現載體之劑量或10-20 μg之劑量。在一些情形下，本文揭示之轉基因之內源型式未連接至細胞中或活體內之調控元件，或通常未連接至細胞中或活體內之調控元件或與其相關。在一些情形下，轉基因之總體表現大於使用具有選自由以下組成之群之調控元件之載體的轉基因表現：CMV啟動子、CMVe啟動子、超級核心啟動子、TTR啟動子、Proto 1啟動子及UCL-HLP啟動子。在一些情形下，表現可在至少2、3、4、5、6、7或更多種不同細胞類型中在活體內(例如在小鼠中或在不同人類細胞系中)檢測到。在一些情形下，不同細胞類型係選自由以下組成之群：肺泡細胞、心肌細胞、上皮細胞、肝細胞、腸細胞、肌細胞、神經元及腎細胞。在一些情形下，如本文揭示之調控元件係或包含增強子、啟動子、5’ UTR序列、內含子序列或其任一組合。在一些情形下，如本文揭示之調控元件係或包含啟動子序列。在一些情形下，調控元件包含啟動子，其係CMV啟動子、CMV、啟動子、超級核心啟動子、TTR啟動子、Proto 1啟動子、UCL-HLP啟動子、AAT啟動子、KAR啟動子、EFla啟動子、EFS啟動子、或CMVe增強子/CMV啟動子組合或其任何組合、變體或片段。

在一些情形下，本文揭示之表現載體進一步包含一或多個轉錄後修飾位點。在一些情形下，表現載體或盒包含轉基因，該轉基因係Cas9、saCas9或dCas9。在一些情形下，表現載體或盒包含轉基因，該轉基因係DNA結合蛋白或轉錄調節劑(例如轉錄活化劑)。在一些情形下，該轉錄調節劑蛋白質作用於內源基因以增加內源基因在細胞中或活體內之表現。

在其他情況下，表現載體包含可操作連接至調控序列之因子VIII轉基因，該調控序列能夠驅動因子VIII表現至＞1.0 IU/mL之濃度，如藉由其組態在於檢測細胞中或活體內之因子VIII之ELISA分析所量測。

在一些情形下，本文揭示之任一實施例中之轉基因係與單一對偶基因不足相關之基因。在一些情形下，該單一對偶基因不足係在肝或肝細胞中。在一些情形下，轉基因係以下任一者：因子VIII、Cas9、激素、生長或分化因子、胰島素、生長激素、VEGF、神經營養因子、纖維母細胞上皮因子；細胞介素、介白素、淋巴介質、腫瘤壞死因子、抗體、免疫球蛋白、干擾素、嵌合T細胞受體；脂蛋白受體、囊性纖維化跨膜調控因子、與I、II、III或IV型黏多醣貯積症相關之基因、β球蛋白或脂蛋白脂酶或其變體或片段。在一些情形下，治療性轉基因係ATP7A、ATP7B、ATP8B1、ABCB4、ABCB11或其變體、亞單位或功能片段。在一些情形下，治療性轉基因係CDKL5、CNTNAP2、ZEB2或其變體或片段。在一些情形下，轉基因係纖維蛋白原、凝血酶原、凝血因子或血液凝固因子(例如因子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)。

在一些情形下，如本文所述表現載體或盒中之任一者係病毒顆粒，或使用病毒顆粒遞送，或殼體化或提供於病毒顆粒中。在一些情形下，病毒顆粒係腺相關病毒或AAV。在一些情形下，AAV係選自由以下組成之群：AAV1、AAV2、AAV3、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-DJ及scAAV。在其他情形下，病毒顆粒係慢病毒。在一些情形下，病毒顆粒係腺病毒。

在一些情況下，本文揭示之表現載體或盒中之任一者包含轉基因，該轉基因係治療性轉基因。在一些情形下，治療性轉基因係因子VIII、Cas9、DNA結合蛋白、激素、生長或分化因子、胰島素、生長激素、VEGF、神經營養因子、纖維母細胞上皮因子；細胞介素、介白素、淋巴介質、腫瘤壞死因子、抗體、免疫球蛋白、干擾素、嵌合T細胞受體；脂蛋白受體、囊性纖維化跨膜調控因子、與I、II、III或IV型黏多醣貯積症相關之基因、β球蛋白或脂蛋白脂酶或其變體或片段。在一些情形下，治療性轉基因係ATP7A、ATP7B、ATP8B1、ABCB4、ABCB11或其變體、亞單位或功能片段。在一些情形下，轉基因係以下任一者：ATP7A、ATP7B、AT8B1 (或ATP8B1)、MDR3 (或ABCB4)、ABCBB (或ABCB11)、CDKL5、CNTP2 (或CNTNAP2)、ZEB2、因子V、因子VIII、因子IX或因子X。在一些情形下，治療性轉基因係CDKL5、CNTNAP2、ZEB2或其變體、亞單位或功能片段。在一些情形下，轉基因係纖維蛋白原、凝血酶原、凝血因子或血液凝固因子(例如因子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)。

在一些情況下，用於遞送轉基因至動物(例如哺乳動物、人類、小鼠等)中之複數個不同組織或細胞類型的方法包含向該動物投與本文揭示之表現載體中之任一者。在一些情形下，投與包含全身投與，例如經由經口、靜脈內、肌內、腹膜內、鞘內、經腸或非經腸投與。

在一些情況下，用於產生蛋白質、抗體或其他生物製品之方法包含使細胞與本文揭示之表現載體中之任一者接觸。在一些情形下，用於產生蛋白質之細胞係CHO細胞或HEK293T細胞。在一些情形下，本文揭示之任一實施例之表現構築用於基因療法治療，例如在肝細胞、腎細胞及/或神經元中(或在中樞神經系統(CNS)中)表現。在其他情形下，本文揭示之任一實施例之表現構築用於離體、例如在任何哺乳動物或任何人類細胞系(例如腎細胞、上皮細胞、肝細胞、肝細胞、神經元、纖維母細胞或CNS細胞)中產生蛋白質。

在一些情況下，用於產生轉基因動物或植物之方法包含向動物或植物投與本文揭示之表現載體或盒中之任一者。在一些情形下，本文揭示之表現載體或盒中之任一者中所用之調控元件係40-50bp、50-60bp、60-70bp、70-80bp、80-90bp、90-100bp、100- 110bp、110-120bp或120-130bp。在一些情形下，本文揭示之表現盒中之RE係49bp、56bp、100bp、117bp、259bp或266bp。在一些情形下，本文揭示之表現載體或盒中之任一者中所用之調控元件係45-50bp、50-60bp、45-60bp、90-117bp、95-110bp、115-120bp、250-260bp或260-270bp。在一些情形下，本文揭示之表現載體或盒中之任一者中所用之調控元件係約100bp。在一些情形下，本文揭示之表現載體或盒中之任一者中所用之調控元件小於或等於300bp、250bp、200bp、150bp、140bp、130bp、120bp、110bp、100bp、70bp或50bp。在一些情形下，本文揭示之表現載體或盒中之任一者中所用之調控元件係100bp或更小。在一些情形下，組合兩個或更多個相對較短之本文揭示之RE且將其可操作連接至轉基因以驅動轉基因高表現。在一些情形下，可組合兩個或更多個RE而無任何插入核苷酸，或使用1-50bp之連接體組合。

在一些態樣中，本文揭示之表現盒包含可操作連接至治療性轉基因之源於人類之調控元件，其中調控元件包含以下中之一或多者：(i) SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41；(ii)其片段或組合；或(iii) 與(i)及(ii)中之任一者具有至少80%序列一致性之序列。在一些情形下，調控元件係源自hg19之人類序列。在一些情形下，調控元件係非天然的。在一些情形下，調控元件包含內含子序列。在一些情形下，內含子序列位於啟動子與治療性轉基因之間。在一些情形下，調控元件包含啟動子序列。在一些情形下，調控元件係盒中之唯一啟動子。在一些情形下，調控元件不超過100bp。在一些情形下，調控元件不超過60bp。在一些情形下，調控元件不超過50bp。在一些情形下，表現盒係rAAV之一部分。在一些情形下，rAAV係rAAV8。在一些情形下，治療性轉基因係ATP7B。在一些情形下，治療性轉基因係因子VIII。在一些態樣中，治療威爾森氏症(Wilson’s disease)之方法包含投與本文揭示之表現盒，且其中轉基因係ATP7B。在一些情形下，治療ATP7B之單一對偶基因不足或遺傳缺陷之方法包含投與本文揭示之表現盒，且其中轉基因係ATP7B。在一些情形下，治療血液凝固疾患之方法包含投與本文揭示之表現盒，且其中轉基因係因子VIII。在一些情形下，治療單一對偶基因不足或遺傳缺陷之方法包含投與本文揭示之表現盒，且其中轉基因係選自：ATP7A；ATP7B；ATP8B1；ABCB4；ABCB11；CDKL5；CNTNAP2；ZEB2；因子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及12；及其變體或功能片段。在一些情形下，治療單一對偶基因不足或遺傳缺陷之方法包含投與本文揭示之表現盒，且其中轉基因係調節內源基因表現之轉錄調節劑。在一些情形下，治療單一對偶基因不足或遺傳缺陷之方法包含投與本文揭示之表現盒，且其中轉基因係以下任一種內源基因之轉錄活化劑：ATP7A；ATP7B；ATP8B1；ABCB4；ABCB11；CDKL5；CNTNAP2；ZEB2；及因子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及12。

在一些態樣中，AAV表現盒包含可操作連接至至少3kb之轉基因之不超過120bp的源於人類之調控元件，其中與在可操作連接至CMV啟動子時轉基因表現相比，該調控元件引起轉基因表現增加至少2倍。在一些情形下，調控元件係選自：SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41。在一些情形下，調控元件包含(i) SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41；(ii) 其組合；或(iii) 或與(i)及(ii)中之任一者具有至少80%序列一致性之序列。在一些情形下，轉基因表現增加至少50倍。在一些情形下，轉基因表現增加至少100倍。在一些情形下，增加之轉基因表現發生在至少2種不同細胞類型(例如肝細胞及腎細胞)中。在一些情形下，增加之轉基因表現發生在至少3種不同細胞類型(例如肝細胞、腎細胞、神經元及/或上皮細胞)中。在一些情形下，調控元件包含SEQ ID NO: 22-41中之任一或多者，且其中表現盒中不存在其他啟動子序列。在一些情形下，調控元件位於轉基因之上游。在一些情形下，調控元件包含SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2中之一或多者。在一些情形下，調控元件位於啟動子之下游。在一些情形下，轉基因係選自：ATP7A；ATP7B；ATP8B1；ABCB4；ABCB11；CDKL5；CNTNAP2；ZEB2；因子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及12；及其變體或功能片段。在一些情形下，轉基因係ATP7A或ATP7B。在一些情形下，轉基因係因子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及12中之任一者。在一些情形下，轉基因係因子8。在一些情形下，轉基因係基因編輯蛋白。在一些情形下，基因編輯蛋白係Cas。在一些情形下，轉基因係DNA結合蛋白。在一些情形下，轉基因係增加內源基因表現之轉錄活化劑。在一些情形下，轉基因係減少內源基因表現之轉錄抑制子。在一些情形下，轉錄活化劑增加以下任一種內源基因之表現：ATP7A；ATP7B；ATP8B1；ABCB4；ABCB11；CDKL5；CNTNAP2；ZEB2；及因子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及12。在一些情形下，AAV係選自由以下組成之群：AAV1、AAV2、AAV3、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-DJ及scAAV。

在一些態樣中，產生重組蛋白之方法包含將編碼蛋白質之序列與以下中之一或多者可操作地連接：(i) SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41；(ii) 其組合；或(iii) 與(i)及(ii)中之任一者具有至少80%序列一致性之序列。

在一些態樣中，治療肝疾病或病症之方法包含投與基因療法，其包含可操作連接至一或多個選自以下之調控元件之治療性轉基因：(i) SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41；(ii) 其組合；或(iii) 與(i)及(ii)中之任一者具有至少80%序列一致性之序列。在一些情形下，肝疾病或病症係威爾森氏症。在一些情形下，肝疾病或病症係血液凝固疾患。在一些情形下，轉基因係ATP7A或ATP7B或其變體或功能片段。在一些情形下，轉基因係因子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或其變體或功能片段。在一些情形下，轉基因係因子8或其變體或功能片段。在一些情形下，調控元件引起在至少2種細胞類型中轉基因表現增加。在一些情形下，調控元件引起在至少3種細胞類型中轉基因表現增加。在一些情形下，調控元件引起在肝細胞中轉基因表現增加。在一些情形下，與在可操作連接至CMV啟動子時轉基因表現相比，調控元件使得轉基因表現增加至少2倍之程度。在一些情形下，基因療法係AAV。在一些情形下，AAV係AAV8。

在一些態樣中，表現載體包含具有小於或等於100bp之可操作連接至轉基因之源於人類之調控元件，其中與無調控元件之第二表現載體相比，該調控元件使轉基因之總體表現增加至少兩倍。在一些情形下，第二表現載體包含可操作連接至CMV啟動子之轉基因。

在一些態樣中，表現載體包含具有小於或等於100bp之可操作連接至轉基因的源於人類之調控元件，其中轉基因之表現高於由CMV啟動子、超級核心啟動子、TTR啟動子、Proto 1啟動子、UCL-HLP啟動子或CMVe啟動子表現之相同轉基因的表現。在一些情形下，轉基因之表現高於由UCL-HLP啟動子表現之相同轉基因的表現。在一些態樣中，表現載體包含可操作連接至轉基因之源於人類之調控元件，其中由轉基因編碼之蛋白質具有(i) ＞1.0 IU/mL之濃度，如藉由其組態在於檢測轉基因之ELISA分析所量測；或(ii) ＞ 25%活性，如藉由Coatest分析所量測。在一些態樣中，本文揭示之載體包含具有小於或等於100bp大小之序列之可操作連接至轉基因的源於人類之調控元件，該轉基因在細胞中或活體內未發現與調控元件相關。在一些情形下，本文揭示之載體包含調控元件，其係內含子序列。在一些情形下，調控元件係SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2或與其具有至少80%同源性之序列。在一些情形下，使用螢光素酶作為轉基因引起大於1×10⁸ 個光子/sec之總體表現，如在整個小鼠中所量測。在一些情形下，活性或轉基因表現對應於每隻小鼠16 μg表現載體之劑量。在一些情形下，活性或轉基因表現對應於每隻小鼠12 μg表現載體之劑量。在一些情形下，轉基因之內源型式在活體內未連接至調控元件。在一些情形下，轉基因之總體表現大於使用具有選自由以下組成之群之調控元件之載體的轉基因表現：CMV啟動子、CMVe啟動子、超級核心啟動子、TTR啟動子、Proto 1啟動子及UCL-HLP啟動子。在一些情形下，表現可在小鼠活體內之至少3、4、5、6或7種不同細胞類型中檢測到。在一些情形下，不同細胞類型係選自由以下組成之群：肺泡細胞、心肌細胞、上皮細胞、肝細胞、腸細胞、肌細胞、神經元及腎細胞。在一些情形下，調控元件係增強子。在一些情形下，本文揭示之載體進一步包含啟動子。在一些情形下，啟動子係CMV啟動子、CMV、啟動子、超級核心啟動子、TTR啟動子、Proto 1啟動子、UCL-HLP啟動子、AAT啟動子、KAR啟動子、EFla啟動子、EFS啟動子或CMVe增強子/CMV啟動子組合。在一些情形下，本文揭示之載體進一步包含一或多個轉錄後修飾位點。在一些情形下，轉基因係Cas9。在一些情形下，轉基因係saCas9。

在一些態樣中，表現載體包含可操作連接至調控序列之因子VIII轉基因，該調控序列能夠驅動因子VIII表現至＞1.0 IU/mL之濃度，如藉由其組態在於檢測活體內因子VIII之ELISA分析所量測。在一些情形下，病毒顆粒包含本文揭示之表現載體。在一些情形下，病毒顆粒係AAV。在一些情形下，AAV係選自由以下組成之群：AAV1、AAV2、AAV3、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-DJ及scAAV。在一些情形下，病毒顆粒係慢病毒。在一些情形下，病毒顆粒係腺病毒。在一些情形下，轉基因係治療性轉基因。在一些情形下，治療性轉基因係因子VIII、Cas9、DNA結合蛋白、激素、生長或分化因子、胰島素、生長激素、VEGF、神經營養因子、纖維母細胞上皮因子；細胞介素、介白素、淋巴介質、腫瘤壞死因子、抗體、免疫球蛋白、干擾素、嵌合T細胞受體；脂蛋白受體、囊性纖維化跨膜調控因子、與I、II、III或IV型黏多醣貯積症相關之基因、β球蛋白或脂蛋白脂酶。在一些情形下，治療性轉基因係ATP7A、ATP7B、ATP8B1、ABCB4、ABCB11或其變體或片段。在一些情形下，治療性轉基因係CDKL5、CNTNAP2、ZEB2或其變體或片段。在一些情形下，遞送轉基因至動物之複數個不同組織之方法包含向該動物投與本文揭示之表現載體。在一些情形下，產生蛋白質之方法包含用本文揭示之表現載體轉染細胞。在一些情形下，細胞係CHO細胞或HEK293T細胞。在一些情形下，產生轉基因動物或植物之方法包含向動物或植物投與本文揭示之任一實施例之表現載體。在一些情形下，調控元件係40-50bp。在一些情形下，調控元件係50- 60bp。

在一些態樣中，表現載體包含可操作連接至轉基因之源於人類之調控元件，其中由轉基因編碼之蛋白質具有(i) ＞0.1 IU/mL之濃度，如藉由其組態在於檢測轉基因之ELISA分析所量測；或(ii) ＞ 10%活性，如藉由Coatest分析所量測。在其他態樣中，表現載體包含具有＜120bp之可操作連接至轉基因之源於人類之調控元件，其中轉基因之表現高於由UCL-HLP啟動子表現之相同轉基因之表現。在一些情形下，調控元件係啟動子。在一些情形下，治療性轉基因係包含DNA結合結構域及轉錄調控結構域之融合蛋白。

交叉參考

本申請案主張於2017年5月19日提出申請之美國臨時申請案第62/508,968號之權益，該臨時申請案以引用方式全文併入本文中。序列表

本申請案含有序列表，其已用ASCII格式電子發文，且其全文以引用方式併入本文中。於2018年5月17日創建之該ASCII拷貝命名為46482-707_601_SL.txt且大小為16,836個字節。以引用方式併入

本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案皆以引用方式併入本文中，其併入程度如同明確地且個別地指示將每一個別公開案、專利或專利申請案以引用方式併入一般。

本發明涵蓋用於轉基因之高表現之組合物及方法。本文亦闡述用於包含一或多個人類或源於人類之調控元件(RE)之轉基因之高表現的組合物及方法，該等人類或源於人類之調控元件在可操作連接至轉基因時可有利於或引起轉基因在一或多個靶細胞類型或組織中之高(或增加)表現。在一些實施例中，本文揭示之一或多個調控元件驅動轉基因在細胞中或在活體內、活體外及/或離體高表現。在一些實施例中，包含一或多個本文所述可操作連接至轉基因之調控元件的表現盒或載體可適合用於任何表現系統或基因療法以驅動細胞、個體或動物模式中轉基因之高表現，或在細胞、個體或動物模式中引起治療有效程度之轉基因表現。在一些實施例中，本揭示內容之一或多個RE可操作連接至大的轉基因(例如序列超過1 kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、5.5kb、6kb、6.5kb、7kb或7.5kb之轉基因)以引起轉基因在細胞中或在活體內高表現。在一些情形下，轉基因在細胞中或活體內之該高表現係相對於無該等RE之轉基因之表現，其中與無RE之轉基因表現相比，或與由陰性對照(例如單獨緩衝液、單獨載體或包含已知無表現活性之序列的載體)之轉基因表現相比，具有RE之轉基因之表現係至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍、至少250倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍、至少1000倍、至少1010倍、至少1020倍、至少1030倍、至少1040倍或至少1050倍。

在一些情形下，一或多個RE在至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10種不同細胞類型中引起該高轉基因表現。在一些情形下，本揭示內容之一或多個RE可操作連接至轉基因用於適於全身投與之基因療法治療。在一些情形下，本揭示內容之一或多個RE可操作連接至轉基因用於適於在肝或肝細胞中表現之基因療法治療。在一些情形下，轉基因係在肝或肝細胞中表現之基因，或係在肝疾病或病症中相關之基因，例如與威爾森氏症相關之ATP7B；與3型進行性家族性肝內膽汁淤積相關之ABCB4；與遺傳性果糖不耐受相關之ALDOB；與IV型肝醣貯積病相關之GBE1；與I型酪胺酸血症相關之FAH；與精胺基琥珀酸裂解酶缺乏相關之ASL；與檸檬素缺乏(CTLN2、NICCD)相關之SLC25A13；與膽固醇基酯貯積病相關之LIPA；與α-1抗胰蛋白酶缺乏相關之SERPINA1；與囊性纖維化相關之CFTR；與遺傳性血色素沉著症相關之HFE；或與阿爾斯特倫症候群(Alström syndrome)相關之ALMS1。在一些情形下，本文揭示之一或多個調控元件用於基因療法治療以治療遺傳性肝病，例如膽汁酸合成病症、碳水化合物代謝病症、胺基酸代謝病症、尿素循環病症或脂質代謝病症。在一些情形下，轉基因係DNA結合蛋白，例如調節內源基因之轉錄調節劑。在一些情形下，本文揭示之任一實施例之RE包含啟動子序列、內含子序列、5’ UTR序列或其任一組合。在一些情形下，本文揭示之任一實施例之RE係源於人類之序列(或與人類參照基因體中序列具有至少80%、90%、95%或99%序列一致性之序列)。在一些情形下，本文揭示之任一實施例之RE之長度小於或等於50bp、60bp、100bp、120bp、260bp或270bp。在一些情形下，本文揭示之任一實施例之RE小於或等於300bp、250bp、200bp、150bp、140bp、130bp、120bp、110bp、100bp、70bp或50bp。在一些情形下，表現盒(例如載體、AAV或病毒載體)包含一或多個可操作連接至本揭示內容之轉基因之RE序列，其中每一RE序列係表 1 所列示之序列或與表 1 之序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性(例如局部序列一致性)的序列中之任一者。在一些情形下，表現構築體(例如載體、AAV或病毒載體)包含一或多個可操作連接至本揭示內容之轉基因的RE序列，其中每一RE序列不超過50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、110bp、120bp、130bp、140bp、150bp、160bp、170bp、180bp、190bp、200bp、210bp、220bp、230bp、240bp、250bp、260bp、270bp、280bp、290bp、300bp、310bp、320bp、330bp、340bp、350bp、360bp、370bp、380bp、390bp或400bp，且包含根據表 1 之序列中之任一或多者的序列。在一些情形下，表現盒(例如載體、AAV或病毒載體)包含一或多個可操作連接至本揭示內容之轉基因之RE序列，其中每一RE序列不超過50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、110bp、120bp、130bp、140bp、150bp、160bp、170bp、180bp、190bp、200bp、210bp、220bp、230bp、240bp、250bp、260bp、270bp、280bp、290bp、300bp、310bp、320bp、330bp、340bp、350bp、360bp、370bp、380bp、390bp或400bp，且包含與表 1 所列示之序列中之任一者具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%局部序列一致性的序列。在一些情形下，局部序列一致性係使用BLAST量測。在一些情形下，本文揭示之任一實施例之RE序列位於轉基因之上游或下游。在一些情形下，本文揭示之任一實施例之兩個或更多個RE可操作連接至轉基因，其中RE中之至少一者或多者位於轉基因之上游、下游或上游及下游二者。

在一些情形下，本揭示內容之任一實施例之一或多個RE可操作連接至轉基因以驅動轉基因之總體表現，其中總體表現係指至少2、3、4、5、6、7、8、9或10種不同細胞類型中之轉基因表現。在一些情形下，本揭示內容之任一實施例之一或多個RE可操作連接至轉基因以在全身性遞送至個體或動物中時驅動轉基因之總體表現。在一些情形下，本文揭示之表現盒之全身性遞送或投與係經由經口、靜脈內、肌內、腹膜內、鞘內、經腸及/或非經腸投與來遞送。在各個實施例中，本文揭示之任一實施例之RE係來自人類(或與人類參照基因體中序列具有至少80%、90%、95%或99%序列一致性之序列)。在一些情形下，本文揭示之任一實施例之RE係非天然的。

基因工程方法可替代基因、修飾基因或添加基因以達成期望結果。基因療法係使用基因工程來治療疾病或病症。基因工程亦可用於修飾細胞或生物體，以產生一或多種所需蛋白質。基因工程之一個挑戰係具有以足夠高至達成治療效應之程度或以足夠高至達成工業/生產程度之程度驅動表現的控制元件。基因工程之另一挑戰係設計足夠小以適應期望載體、但含有感興趣蛋白質之完整編碼序列及足夠確保高表現之調控序列的表現盒。對於大轉基因之表現而言，載體或病毒表現載體之選殖能力極具挑戰。舉例而言，AAV載體之包裝容量為約4.8kb，慢病毒之容量為約8kb，腺病毒之容量為約7.5kb，且α病毒之容量為約7.5 kb。一些病毒具有較大之包裝容量，例如疱疹病毒之容量＞30kb且牛痘之容量為約25kb，然而，使用其他病毒可能存在優點。舉例而言，AAV之優點包括低致病性、整合至宿主基因體中之頻率極低以及感染分裂及未分裂細胞之能力。

基因療法之一個挑戰係確保轉基因在至少一或多種靶細胞類型或組織中以足夠高之程度表現以引起活體內治療效應。在一些情形下，在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種不同細胞類型或組織(例如腎細胞、上皮細胞、肝細胞(liver cell)、肝細胞(hepatocyte)、神經元、纖維母細胞及/或CNS細胞)中期望增加之轉基因表現。在一些情形下，在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種用於蛋白質合成之離體細胞系(例如哺乳動物或人類細胞系，例如腎細胞、上皮細胞、肝細胞(liver cell)、肝細胞(hepatocyte)、神經元、纖維母細胞及/或CNS細胞)中期望增加之轉基因表現。用於基因療法之傳統方法通常依賴於遞送方法及/或載體(例如改變使用之病毒或病毒之殼體序列)。尤其當轉基因較大時，該領域之一個技術挑戰係增加一或多種細胞類型或組織中之基因表現程度以發揮治療效應。大轉基因之表現與技術挑戰相關，此乃因載體(例如，病毒或AAV載體)具有有限之選殖能力。為了表現較大轉基因(例如序列超過1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、5.5kb、6kb、6.5kb、7kb或7.5kb之轉基因)，必須使用較小之調控元件來容納載體中較大轉基因。因此，需要新的短調控元件(例如小於或等於300bp、250bp、200bp、150bp、140bp、130bp、120bp、110bp、100bp、70bp或50bp之RE)，與無RE或陰性對照(例如，已知不驅動任何表現之序列、空載體或單獨之緩衝液控制)之表現相比，其造成轉基因表現增加。

除非上下文另有明確指示，否則如本文中所用之單數形式「一(a、an)」及「該(the)」意欲亦包括複數形式。另外，在詳細說明及/或申請專利範圍中使用術語「包括(including)」、「包括(includes)」、「具有(having)」、「具有(has)」、「具有(with)」或其變化形式時，該等術語意欲以類似於術語「包含(comprising)」之方式具有包括性。

術語＂約＂或＂近似地＂意指熟習此項技術者所測定之特定值的可接受誤差範圍，其部分地取決於該值之量測或測定方式，亦即，量測系統之侷限性。舉例而言，根據業內實踐，「約」可意指在一個或多於一個標準偏差內。或者，「約」可意指給定值之高達20%、高達15%、高達10%、高達5%或高達1%之範圍。

術語「測定」、「量測」、「評估」、「評價」、「分析」、「研究」及其語法等同物在本文中可互換使用以指代任何形式之量測，且包括確定要素是否存在(例如，檢測)。該等術語可包括定量及/或定性測定。評價可為相對或絕對的。

術語「表現」係指核酸序列或多核苷酸自DNA模板轉錄(例如轉錄成mRNA或其他RNA轉錄本)之過程及/或轉錄之mRNA隨後轉譯成肽、多肽或蛋白質之過程。轉錄本及編碼之多肽可統稱為「基因產物」。若多核苷酸係源自基因體DNA，則真核細胞中之表現可包括mRNA之剪接。在一些情形下，總體表現係期望的且係指基因(例如轉基因)在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種不同細胞類型或組織中表現，或基因在複數種細胞類型中表現。細胞類型藉由具有不同細胞標記、形態、表型、基因型、功能及/或任何其他用於分類細胞類型之方式來區分。在一些情形下，不同細胞類型或組織係指活體內細胞類型或組織。在一些情形下，不同細胞類型或組織係指離體細胞類型或組織。在一些情形下，不同細胞類型或組織包括(但不限於)不同哺乳動物細胞系、人類細胞系、腎細胞、上皮細胞、肝細胞(liver cell)、肝細胞(hepatocyte)、神經元、纖維母細胞及/或CNS細胞。

如本文所用之「可操作連接(operably linked、operable linkage、operatively linked)」或其語法等同物係指遺傳元件(例如，啟動子、增強子、多腺苷酸化序列等)之並置，其中該等元件處於允許其以預計方式操作之關係。例如，若可包含啟動子及/或增強子序列之調控元件有助於起始編碼序列之轉錄，則該調控元件可操作連接至編碼區。只要維持此功能關係，在調控元件與編碼區之間可能存在中間殘基。

如本文所用之「載體」係指包含多核苷酸或與多核苷酸締合之巨分子或巨分子之締合，且其可用於介導多核苷酸至細胞之遞送。載體之實例包括質體、病毒載體、脂質體及其他基因遞送媒劑。載體通常包含可操作連接至基因以有利於基因在靶標中表現的遺傳元件，例如調控元件。調控元件與一或多個其可操作連接用於表現之基因的組合稱為「表現盒」。

術語「AAV」係腺相關病毒之縮寫，且可用於指病毒自身或其衍生物。該術語涵蓋所有血清型、亞型及天然及重組形式，另有需要除外。縮寫「rAAV」係指重組腺相關病毒，亦稱為重組AAV載體(或「rAAV載體」)。術語「AAV」包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rh10及其雜合體、鳥類AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、靈長類動物AAV、非靈長類動物AAV及綿羊AAV。AAV之各種血清型之基因體序列以及天然末端重複(TR)之序列、Rep蛋白及殼體亞單位為業內已知。該等序列可參見文獻或公開資料庫，例如基因庫。如本文所用之「rAAV載體」係指包含並非AAV起源之多核苷酸序列、通常用於細胞之遺傳轉變之感興趣序列的AAV載體(即，與AAV異源之多核苷酸)。一般而言，異源多核苷酸側接至少一個且通常兩個AAV反向末端重複序列(ITR)。術語rAAV載體涵蓋rAAV載體顆粒及rAAV載體質體。rAAV載體可為單鏈的(ssAAV)或自補的(scAAV)。「AAV病毒」或「AAV病毒顆粒」或「rAAV載體顆粒」係指由至少一種AAV殼體蛋白及殼體化多核苷酸rAAV載體組成之病毒顆粒。若顆粒包含異源多核苷酸(即，除野生型AAV基因體外之多核苷酸，例如欲遞送至哺乳動物細胞之轉基因)，則其通常稱作「rAAV載體顆粒」或簡稱為「rAAV載體」。因此，rAAV顆粒之產生必需包括rAAV載體之產生，因此載體包含於rAAV顆粒內。

如本文所用術語「治療(treat)」、「治療(treatment)」、「療法」及諸如此類係指獲得期望藥理學及/或生理效應，包括但不限於，緩和、延遲或減緩進展，減少效應或症狀，預防發作，抑制、改善疾病或病症之發作，獲得關於疾病、病症或醫學病症之有益或期望結果，例如治療益處及/或預防性益處。如本文所用之「治療」涵蓋哺乳動物、特定而言人類中疾病之任何治療，且包括：(a) 預防疾病在可能易患該疾病或處於獲得該疾病之風險但尚未診斷為患有該疾病之個體中發生；(b) 抑制該疾病，即停止其發展；以及(c) 減輕該疾病，即引起該疾病之消退。治療益處包括消滅或改善所治療之潛在病症。而且，可藉由以下方式來達成治療益處：消滅或改善一或多種與潛在病症相關之生理學症狀，以使得在個體中觀察到改良，但該個體仍可患有該潛在病症。在一些情形下，對於預防性益處，向處於發生特定疾病之風險的個體或向報告疾病之一或多種生理學症狀之個體投與組合物，即使可能無法診斷此疾病。本發明之方法可與任何哺乳動物一起使用。在一些情形下，治療可導致症狀減輕或停止(例如癲癇發作之頻率或持續時間減少)。預防性效應包括延遲或消除疾病或病症之出現，延遲或消除疾病或病症症狀之發作，減緩、停止或逆轉疾病或病症之進展，或其任一組合。

術語「有效量」或「治療有效量」係指足以影響預期應用之本文所述組合物之量，包括(但不限於)疾病治療，如下文所定義。治療有效量可根據預期治療應用(在細胞中或活體內)、或受治療之個體及疾病狀況(例如，個體之體重及年齡、疾病狀況之嚴重程度、投與方式及可由熟習此項技術者容易地確定之諸如此類)而變。該術語亦適用於在靶細胞中誘導特定反應之劑量。具體劑量將根據所選擇之特定組合物、欲遵循之給藥方案、是否與其他化合物組合投與、投與之時間、投與之組織以及攜帶其之物理遞送系統而變。

核苷酸或肽序列之「片段」意指小於被認為係「全長」序列之序列。

分子之「變體」係指該等序列之等位基因變化，亦即在結構及生物活性上與整個分子或其片段基本類似之序列。如本文所用，基因之變體係指與最常見之野生型DNA序列相比具有遺傳改變或突變之序列(例如cDNA或由其基因庫提及之序列或對應於由其UniProt登錄號提及之蛋白質序列的序列)。基因變體涵蓋突變體，例如與野生型序列相比具有增強之活性或功能之突變體；蛋白質之任何已知亞單位；及由選擇式剪接產生之基因之已知同種型。

術語「功能片段」意欲包括分子之「片段」、「變體」、「類似物」或「化學衍生物」。DNA或蛋白質序列之「功能片段」至少具有序列之生物活性片段，其係指保留實質上類似於全長DNA或蛋白質序列之生物活性的生物活性(功能性或結構性)之片段。DNA序列之生物活性可以係其以已知歸因於全長序列之方式影響表現的能力。舉例而言，調控元件之功能片段將保留影響轉錄為全長RE之能力。

術語「個體(subject)」及「個體(individual)」在本文中可互換使用以指脊椎動物、較佳哺乳動物、更佳人類。「個體」係指動物，例如哺乳動物，例如人類。本文所述方法可用於疾病或病症之動物模式中之人類治療、獸醫應用及/或臨床前研究。在一些情形下，個體係哺乳動物，且在一些情形下，個體係人類。

術語「活體內」係指在個體體內發生之事件。

術語「活體外」係指在個體體外發生之事件。舉例而言，活體外分析涵蓋在個體外運行之任何分析。活體外分析涵蓋基於細胞之分析，其中採用活細胞或死細胞。活體外分析亦涵蓋無細胞分析，其中不採用完整細胞。

例如出於評價屬性(identity)、突變或測試序列之一或多個位置相對於參照序列之一或多個指定位置的位置的目的，可藉由任何適宜比對算法實施序列比較，該等比對算法包括(但不限於) Needleman-Wunsch算法(例如，參見於www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/獲得之EMBOSS Needle比對器，視情況具有默認設置)、BLAST算法(例如，參見於blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi獲得之BLAST比對工具，視情況具有默認設置)及Smith-Waterman算法(例如，參見於www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/獲得之EMBOSS Water比對器，視情況具有默認設置)。可使用所選算法之任何適宜參數(包括默認參數)來評價最佳比對。

一般而言，「序列一致性」或「序列同源性」可互換使用，分別係指兩個多核苷酸或多肽序列之確切之核苷酸與核苷酸或胺基酸與胺基酸對應性。通常，用於測定序列一致性之技術包括測定多核苷酸之核苷酸序列及/或測定由其編碼之胺基酸序列，並將該等序列與第二核苷酸或胺基酸序列進行比較。兩個或更多個序列(多核苷酸或胺基酸)可藉由測定其「一致性百分比」(亦稱為「同源性百分比」)來進行比較。與參照序列(例如核酸或胺基酸序列) (其可為較長分子(例如多核苷酸或多肽)內之序列)之一致性百分比可以計算為兩個最佳比對序列之間之精確匹配數除以參照序列之長度並乘以100。一致性百分比亦可(例如)藉由使用高級BLAST電腦程式(包括2.2.9版)比較可自國立衛生研究院(National Institutes of Health)獲得之序列資訊來測定 BLAST程式係基於以下之比對方法：Karlin及Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990)及如Altschul等人，J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)中所論述；Karlin及Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 (1993)；及Altschul等人，Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)。簡言之，BLAST程序將屬性定義為相同之比對符號(即，一或多種核苷酸)之數量除以兩個序列中較短之符號總數。該程式可用於測定在所比較之序列之整個長度中之一致性百分比。提供默認參數以最佳化具有短查詢序列之搜索，例如，具有blastp程式。該程式亦容許使用SEG過濾器以屏蔽查詢序列之片段，如藉由Wootton及Federhen，Computers and Chemistry 17: 149-163 (1993)之SEG程式所測定。期望序列一致性程度之範圍係約80%至100%及其之間之整數。通常，揭示序列與所主張序列之間之一致性百分比係至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%。一般而言，精確匹配表示與參照序列之長度具有100%一致性。在一些情形下，在提及序列一致性百分比時係指如使用BLAST (基本局部比對搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool))量測之序列一致性。在其他情形下，可利用ClustalW進行多序列比對。

除非另外指示，否則本文使用之所有術語皆具有與熟習此項技術者所使用之相同含義，且本發明之操作將採用熟習此項技術者之知識範圍內之分子生物學、微生物學及重組DNA技術之習用技術。調控元件

調控元件之功能在DNA及/或RNA層級。調控元件之功能可在所需之細胞類型中調節基因表現選擇性。調控元件之功能可在基因表現之轉錄期、轉錄後期或轉譯期調節基因表現。調控元件包括(但不限於)啟動子、增強子、內含子或其他非編碼序列。在RNA層級，可在轉譯(例如，穩定mRNA用於轉譯之穩定元件)、RNA裂解、RNA剪接及/或轉錄終止層級進行調控。在一些情形下，調控元件可招募轉錄因子至編碼區，其增加所需細胞類型中之基因表現選擇性。在一些情形下，調控元件可增加RNA轉錄本之產生率、增加所產生RNA之穩定性、及/或增加自RNA轉錄本之蛋白質合成率。

調控元件係能影響(例如增加)基因(例如報導基因，例如eGFP、轉基因或治療性基因)在一或多種細胞類型或組織中之表現的核酸序列或遺傳元件。在一些情形下，調控元件可為轉基因、內含子、啟動子、增強子、UTR、反向末端重複(ITR)序列、長末端重複序列(LTR)、穩定元件、轉譯後反應元件、或聚A序列、或其組合。在一些情形下，調控元件係啟動子、增強子、內含子序列或其組合。在一些情形下，調控元件係源自人類序列(例如hg19)。

分離調控元件之一種方法包括自動物模式分離出一或多種細胞類型之核，此可藉由使用分離一或多種組織或細胞類型(例如，結合至某些細胞類型之珠粒)之親和純化方法來達成，其中使用高通量自然引發及DNA合成法，自核中之開放染色質區產生序列庫，在序列庫中進行測序以鑑別推定序列，該等推定序列驅動在一或多個組織或細胞類型中之表現，及在活體外及/或在動物模式中之一或多個細胞系中之報導基因系統中表現。在一些情形下，組合以兩個或更多個調控元件以形成較大RE。在一些情形下，組合之調控元件在複數種細胞類型中(例如在至少2、3、4、5、6或更多種細胞類型)中展現增強之基因表現。在一些情況下，調控元件一次截短一或多個鹼基以測定保留其增加轉基因表現之能力之序列的最小量。保留轉基因表現活性之較小調控元件有助於製備包含較大轉基因之基因療法，或鑒於希望使用基因療法遞送之轉基因的大小，載體或質體之選殖能力受到限制。舉例而言，本揭示內容之一或多個RE在可操作連接至轉基因時會驅動增加之轉基因表現，其中轉基因係至少1 kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、5.5kb、6kb、6.5kb、7kb或7.5kb。在一些情形下，與陰性對照、組成型啟動子、CMV啟動子、超級核心啟動子、TTR啟動子、Proto 1啟動子、UCL-HLP啟動子或CMVe啟動子相比，該轉基因表現增加至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍或至少1000倍。

在一些情形下，本揭示內容之調控元件引起可操作連接之轉基因的高或增加之表現，其中高或增加之表現係與對照(例如組成型啟動子、CMV啟動子、CAG、超級核心啟動子(SCP)、TTR啟動子、Proto 1啟動子、UCL-HLP啟動子、minCMV、EFS或CMVe啟動子)相比測得。可用於測定由本文揭示之調控元件之高或增加之轉基因表現的其他對照包括單獨緩衝液或單獨載體。在一些情形下，陽性對照係指具有已知表現活性之RE，例如SEQ ID NO: 4，其可用於比較。在一些情形下，與陽性對照(例如SEQ ID NO: 4或可操作連接至轉基因之已知啟動子)相比，調控元件驅動相當或更高之轉基因表現。

在一些情形下，可去除SEQ ID NO: 13-17之最靠5’的17個核苷酸以形成保留表現活性之較短RE。舉例而言，無最靠5’的17個核苷酸之SEQ ID NO: 13-17分別係SEQ ID NO: 30、26、28、23及22。

在其他情形下，可組合兩個或更多個相對較短RE以形成具有高轉基因表現活性及/或經過分子大小標準化之基因表現活性的較大RE。舉例而言，SEQ ID NO: 17可與SEQ ID NO: 22組合；或SEQ ID NO: 16可與SEQ ID NO: 22組合。

本發明涵蓋增加可操作連接之轉基因之表現的短的源於人類之調控元件。在一些情形下，短的源於人類之RE係表 1 之序列或SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41中之任一者。

表 1 ：調控元件 (RE) 之實例

在一些情形下，短的源於人類之RE包含表 1 或SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41之序列；或與表 1 或SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41之序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性(例如局部序列一致性)的序列。在一些情形下，短的源於人類之RE包含與hg19之人類序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的非天然序列。在一些情形下，短的源於人類之RE包含與位於表 2 中所列示之以下基因體或染色體位置中之一者的人類序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的非天然序列。

表 2 ：用於衍生 RE 之基因體位置的實例

在一些情形下，相對較短之源於人類之RE係源自表 2 中所列示之基因體位置的啟動子，且與陰性對照(例如單獨載體對照、緩衝液對照或已知無表現活性之序列)相比或與組成型啟動子、CMV啟動子、超級核心啟動子、TTR啟動子、Proto 1啟動子、UCL-HLP啟動子或CMVe啟動子相比，展現至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍或至少1000倍轉基因表現。

在一些情形下，本揭示內容之相對較短之RE包含在可操作連接至表現盒中之轉基因時引起與在SCP或陰性對照(例如單獨載體或單獨緩衝液)控制下之螢光素酶表現相比至少50倍、100倍、500倍、1000倍、或5000倍、或超過1000倍之正規化基因(例如螢光素酶)表現的內含子序列(例如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2)。在一些情形下，本揭示內容之相對較短之RE (例如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2)在可操作連接至表現盒中之轉基因時引起與SCP或CAG之經過分子大小標準化之活性相比至少1.5倍、2.5倍、5倍、10倍、15倍或20或更大倍的經過分子大小標準化之活性。在一些情形下，本揭示內容之相對較短之RE (例如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2)在可操作連接至表現盒中之轉基因時引起與在SCP、SerpE_TTR、Proto1、minCMV、UCL-HLP或CMVe控制下之螢光素酶相比或與緩衝液對照相比至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、10或更大倍的總螢光素酶發光(以光子/sec表示)。在一些情形下，本揭示內容之相對較短之RE (例如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2)在可操作連接至表現盒中之人類FVIII時引起活體內人類FVIII濃度增加，其中與緩衝液對照或可操作連接至FVIII之UCL-HLP相比，濃度增加係至少1 IU/mL、1.2 IU/mL、1.5 IU/mL或超過1 IU/mL之FVIII。

在一些情形下，本揭示內容之相對較短之RE係源自人類啟動子序列(例如SEQ ID NO: 13-17及22-41)，其在可操作連接至表現盒中之轉基因(例如螢光素酶)時引起與陰性對照(例如單獨載體、單獨緩衝液或已知無表現活性之序列)相比至少50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍或1000或更大倍的正規化螢光素酶表現。在一些情況下，與在CMV或CMV+CMVe控制下之螢光素酶表現相比，RE引起至少5倍、10倍或100或更大倍之正規化螢光素酶表現。在一些實施例中，可組合兩個或更多個RE以形成較大RE。在一些情形下，RE位於轉基因之上游。

在一些情形下，本文揭示之短的源於人類之RE包含不超過40bp、45bp、49bp、50bp、56bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、110bp、117bp、120bp、130bp、140bp、150bp、160bp、170bp、180bp、190bp、200bp、210bp、220bp、230bp、240bp、250bp、259bp、260bp、265bp、270bp、280bp、290bp、300bp、310bp、320bp、330bp、340bp、350bp、360bp、370bp、380bp、390bp或400bp，且包含根據表 1 或SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41中之任一者之序列。在一些情形下，表 1 中所列示之序列或SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41中之兩者或更多者、三者或更多者、四者或更多者、五者或更多者、六者或更多者、七者或更多者、八者或更多者、九者或更多者或十者或更多者可組合或串聯使用。

在各個態樣中，當對載體(例如AAV基因療法中)具有大小限制或需要極高程度之表現(例如在離體蛋白產生中)時，短的源於人類之調控元件尤其有用。本文中之調控元件可為組成型或誘導型。因此，本發明提供高表現以及短調控元件之益處。在一些情形下，與對照調控元件(例如組成型啟動子、CMV啟動子、超級核心啟動子、TTR啟動子、Proto 1啟動子、UCL-HLP啟動子或CMVe啟動子)相比，本文揭示之RE每鹼基對或每核苷酸展現較高表現程度。在一些情形下，SEQ ID NO: 4作為對照用於比較基因表現之程度。

在一些情形下，本揭示內容之一或多個RE適於增加大轉基因(例如基因療法中或表現盒中)之表現，此乃因RE增強轉基因表現而未佔用顯著選殖能力。在一些情形下，本揭示內容之RE不超過49bp、50bp、56bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、110bp、117bp、120bp、130bp、140bp、150bp、160bp、170bp、180bp、190bp、200bp、210bp、220bp、230bp、240bp、250bp、259bp、260bp、265bp、270bp、280bp、290bp、300bp、310bp、320bp、330bp、340bp、350bp、360bp、370bp、380bp、390bp或400bp，且包含根據表 1 或SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41中之任一者之序列或與其具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性的序列。在一些情形下，與無RE之轉基因表現相比或與陰性對照(例如單獨載體對照、單獨緩衝液或已知無表現活性之序列)相比，本揭示內容之相對較短之RE將轉基因表現增加至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍或至少1000倍。在一些情形下，對照係可操作連接至相同轉基因(例如螢光素酶)之組成型啟動子。可作為對照以與可操作連接至轉基因之RE之轉基因表現進行比較的其他啟動子之實例包括(但不限於) CMV啟動子、超級核心啟動子、TTR啟動子、Proto 1啟動子、UCL-HLP啟動子、AAT啟動子、KAR啟動子、EFla啟動子、EFS啟動子或CMVe增強子/CMV啟動子組合。

本文中之調控元件可為啟動子，且在包括於表現盒中時將驅動下游序列之轉錄，其可緊密相關或直接接觸。啟動子可驅動連接之轉基因之高、中等或低表現。在一些情形下，啟動子可對一或多種細胞類型具有特異性，或可在許多或所有細胞類型中(例如在至少2、3、4、5、6、7、8、9或10種細胞類型)中以類似程度表現。

在一些情形下，本文揭示之RE包含源於人類之序列。在一些情形下，本揭示內容之RE係非天然的。如本文所用術語「源於人類」係指與人類參照基因體(或人類基因體區塊，例如hg19)中序列具有至少80%、90%、95%或99%序列一致性之序列。同源序列可為具有與人類基因體之區相比具有至少80%序列一致性(例如如藉由BLAST所量測)之區的序列。舉例而言，將與人類序列至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同源之序列視為源於人類之序列。

在一些情形下，調控元件含有源於人類之序列及額外序列，使得調控元件整體與人類基因體具有低序列一致性，而調控元件之一部分與人類基因體中之序列具有100%序列一致性(或局部序列一致性)。在一些情況下,序列一致性百分比係指涵蓋表 1 中所列示之序列或SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41中之任一者之至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的區內之同源性。

在一些情形下，源於人類之調控元件係與人類序列具有100%一致性之序列。在一些情況下，調控元件之序列係100%源於人類，其中RE與人類序列相差至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95個核苷酸或鹼基對。

在其他情況下，至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%之調控元件序列係源於人類。舉例而言，調控元件之50%序列可源於人類，且其餘50%為非源於人類(例如小鼠源或完全合成)。對於其他實例，被視為50%源於人類且包含300bp之調控元件可與人類基因體中之序列具有整體45%序列一致性，而RE之1-150個鹼基對可與人類基因體之類似大小之區具有90%一致性(例如局部序列一致性)。

在一些情形下，本揭示內容之RE包含啟動子序列、內含子序列、增強子序列、5’ UTR序列或其組合。在一些情形下，本揭示內容之RE係非天然的。在一些情形下，本揭示內容之RE係來自人類(或與人類參照基因體中序列具有至少80%、90%、95%或99%序列一致性之序列)。

在一些情形下，本文揭示之相對較短之調控元件可源自基因體啟動子序列(例如表 2 中之基因體位置)。在一些情形下，本文揭示之調控元件可源自基因體啟動子序列及3’未轉譯之區(3’ UTR)。在一些情形下，本文揭示之調控元件可源自基因間序列。在一些情形下，本文揭示之調控元件可源自基因下游之基因體序列，或源自5’ UTR序列或5’ UTR與下游序列之混合物。

本文中之調控元件可為增強子，且與由無增強子之啟動子之相同轉基因的表現相比，其在表現載體或盒以及啟動子中之存在增加了可操作連接之轉基因之表現。增強子可經由轉錄機制、轉錄後機制或二者增加連接之轉基因之表現。

在一些情形下，本文中之調控元件係內含子序列(例如SEQ ID NO: 1-2)，或包含內含子，且與由無內含子序列之啟動子之相同轉基因的表現相比，其在表現載體或盒以及啟動子中之存在增加了可操作連接之轉基因之表現。內含子序列或調控元件可經由轉錄機制、轉錄後機制或二者增加連接之轉基因之表現。

在一些情形下，本文中之調控元件係啟動子序列(例如SEQ ID NO: 13-17及22-41)，或包含啟動子序列，且其可操作連接至無任何其他啟動子序列及/或增強子序列之表現盒中之轉基因以表現轉基因。

在各個實施例中，表 1 之RE中之一或多者可驅動可操作連接轉基因之增加表現而無需表現盒中之啟動子。在一些實施例中，若大轉基因(例如序列超過1 kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、5.5kb、6kb、6.5kb、7kb或7.5kb之轉基因)過大以致於不能在習用表現盒中表現，則該轉基因可操作連接表 1 至之一或多個RE而無需習用啟動子且可以與無RE之表現盒中之轉基因表現相比或與對照(例如空載體、組成型啟動子、CMV啟動子、超級核心啟動子、TTR啟動子、Proto 1啟動子、UCL-HLP啟動子或CMVe啟動子)相比較高之程度表現。

本文揭示之調控元件之益處之一係其相對較短長度。在一些情況下，本發明之調控元件之長度小於或等於40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp或400bp。在一些情況下，調控元件之長度小於或等於100bp，長度＜90bp、＜80bp、＜70bp、＜60bp或＜50bp，或介於48-57bp之間或介於40-60bp或50-100bp之間。在一些情形下，本文所述調控元件係40-50bp、45-55bp、50-60bp或55-65bp。在一些情形下，調控元件係45-60bp。在一些情形下，本文所述調控元件係49bp或56bp。舉例而言，調控元件SEQ ID NO: 1之長度係56bp，且調控元件SEQ ID NO: 2之長度係49bp。在一些情形下，調控元件可介於100bp與150bp之間、介於110bp與140bp之間、介於110bp與130bp之間或介於115bp與125bp之間。舉例而言，調控元件SEQ ID No. 13-17之長度係117bp。在一些情形下，調控元件係或係約100bp。舉例而言，SEQ ID NO: 22-41之長度各自係100bp。

本揭示內容之調控元件較佳具有源於人類之序列。調控元件可源自轉錄起始位點、5’ UTR序列、外顯子序列、內含子序列或3’ UTR序列上游之基因體序列。在一些實施例中，源於人類之調控元件係內含子源於人類之序列。在一些情形下，源於人類之調控元件係源自人類序列之啟動子序列。在一些實施例中，源於人類之調控元件係SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或其組合之內含子序列或與其具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性(例如如藉由BLAST所量測)之序列。在一些實施例中，源於人類之調控元件係SEQ ID NO: 13、14、15、16、17、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或其組合之啟動子序列或與其具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性(例如如藉由BLAST所量測)之序列。

在一些情形下，調控元件包含5’未轉譯區(5’ UTR)之部分或全部。5’ UTR調控元件可以若干不同方式影響基因之表現。5’ UTR調控元件可含有RNA結合蛋白之結合位點。此外，由5’ UTR中之調控元件形成之二級結構可影響轉譯所需之RNA結合蛋白的結合。在一些實例中，調控元件可具有高程度之二級結構。在一些情形下，調控元件可具有極少或不具有二級結構。調控元件亦可含有內部核糖體進入位點(IRES)，其容許5’端獨立轉譯。調控元件可含有上游轉譯起始密碼子(uAUG)。在一些實施例中，調控元件不含上游轉譯起始密碼子。在一些實施例中，調控元件在AUG密碼子之一個鹼基內不含任何密碼子，或含有比偶然預計少之類似於AUG密碼子之密碼子。在一些情形下，調控元件可含有上游開放閱讀框(當存在上游AUG (或足夠類似之序列)時出現)、之後為框內終止密碼子。在一些實例中，調控元件不包含uORF。在一些情形下，調控元件含有微小RNA結合位點或RNA結合蛋白之結合位點。

在一些情況下，本揭示內容之調控元件包含與源於人類之序列同源之序列。若序列與人類序列具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性，則該序列「與源於人類之序列同源」。較佳地，與源於人類之調控序列同源之序列與人類序列具有至少90%一致性。在一些實施例中，本文中之調控元件係與SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性者。當調控元件與SEQ ID NO: 1-2中之任一者同源時，與無調控元件之類似載體相比，該調控元件仍引起可操作連接之轉基因之較高表現(當表現載體或盒中亦存在啟動子時)。可在(例如) HEK293T或CHO細胞中之表現中觀察到轉基因之該較高表現。在一些情形下，可在複數種細胞類型(例如兩種或更多種哺乳動物細胞系、人類細胞系、腎細胞、上皮細胞、肝細胞(liver cell)、肝細胞(hepatocyte)、神經元、纖維母細胞及/或CNS細胞)中觀察到轉基因之該較高表現。

在一些情形下，當調控元件與SEQ ID NO: 13-17及22-41中之任一者同源時，與無調控元件之類似載體相比，該調控元件仍引起可操作連接之轉基因之較高表現(即使當表現載體或盒中不存在其他啟動子時)。可在(例如) HEK293T或CHO細胞中之表現中觀察到轉基因之該較高表現。在一些情形下，可在複數種細胞類型(例如兩種或更多種哺乳動物細胞系、人類細胞系、腎細胞、上皮細胞、肝細胞(liver cell)、肝細胞(hepatocyte)、神經元、纖維母細胞及/或CNS細胞)中觀察到轉基因之該較高表現。

本揭示內容之調控元件亦可為上述任一者之功能片段，例如SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41及其任何組合之片段。當與無調控元件之類似表現盒或載體相比時，該功能片段亦增加表現盒或載體中轉基因之表現。當功能片段係增強子、內含子序列、啟動子序列或其組合時，當片段可操作連接至轉基因時，與無功能片段之類似載體或盒相比，觀察到較高表現。片段之長度較佳小於或等於25bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp或110bp。在一些情形下，源自人類啟動子序列之本揭示內容之RE可增加可操作連接之轉基因之表現，而表現盒或載體中無需第二啟動子。在一些情形下，習用表現盒或載體中之啟動子可經一或多個SEQ ID NO: 13-17及22-41、其組合、或與SEQ ID NO: 13-17及2241或其組合具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性(例如如藉由BLAST所量測)的序列置換。

在一些實施例中，調控元件係以下任一者：(i) SEQ ID NO: 1、2、3、4、13、14、15、16、17、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41，(ii) 與SEQ ID NO: 1、2、3、4、13、14、15、16、17、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41中之任一者具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核酸序列，(iii) (i)或(ii)之任何序列之功能片段，或(iv) (i)、(ii)及(iii)之任何序列的組合。在一些實施例中，使用調控元件之兩個或更多個拷貝以增強轉基因表現，例如SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41中之一或多者之兩個或更多個拷貝。在一些實施例中，SEQ ID NO: 1及2之組合或其功能片段之組合用作調控元件以增加轉基因表現。在其他實施例中，SEQ ID NO: 1及/或2中之一或多者偶合或可操作連接至另一調控元件(例如啟動子或增強子)以增加轉基因表現。在其他實施例中，SEQ ID NO: 1及/或2中之一或多者偶合或可操作連接至SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41中之一或多者以增加轉基因表現。在一些實施例中，當作為內含子序列之調控元件偶合或可操作連接至任何啟動子時，該調控元件可增加轉基因表現。在一些情形下，當源自人類啟動子序列之調控元件偶合或可操作連接至無任何其他啟動子序列之轉基因時，該調控元件可增加轉基因表現。在一些情形下，當組合之調控元件偶合或可操作連接至無任何其他啟動子序列之轉基因時，包含源於人類之啟動子序列及內含子序列之調控元件可增加轉基因表現。

在一些實施例中，可藉由添加一或多個如本文揭示之調控元件(例如SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41)以改良或增加基因療法之轉基因表現來增強任何基因療法或已知基因療法。

在一些情況下，調控元件含有源於人類之序列及非源於人類之序列，使得調控元件整體與人類基因體具有低序列一致性。然而，調控元件之一部分與人類基因體具有100%序列一致性。在其他情況下，至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%之調控元件序列係源於人類，或至少10、20、30、40或50個鄰接核苷酸係源於人類。舉例而言，調控元件之50%序列可為源於人類，且其餘50%為非源於人類(例如小鼠源、病毒源或完全合成)。

表現增加可以轉錄或轉錄後程度發生。舉例而言，在轉錄程度下，調控元件可藉由招募轉錄因子及/或RNA聚合酶、增加轉錄之起始或招募增加轉錄程度之DNA及/或組織蛋白修飾來增加表現。該等表現增加可藉由量測代表轉基因之RNA轉錄本的量之增加來檢測。在轉錄後程度下，調控元件可藉由增加轉譯成蛋白質之蛋白質之量來增加表現。此可經由各種機制來達成，例如藉由增加mRNA之穩定性或增加轉譯所需之蛋白質之招募及組裝。該表現增加可藉由量測代表轉基因之所表現蛋白質之量來檢測。所產生蛋白質之量可藉由(例如)酶聯免疫吸附分析(ELISA)直接量測，或藉由(例如)功能分析間接量測。功能分析中通常量測之蛋白質係螢光素酶。然而，亦可藉由功能分析量測諸如因子VIII等其他蛋白質。較佳地，與使用減去調控元件之相同表現載體的轉基因表現相比，本文中之調控元件將表現載體或盒之基因、轉基因或治療性轉基因之表現增加至少1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8、9或10倍、或超過5倍或超過10倍。在一些情形下，與使用減去調控元件之相同表現載體的轉基因表現相比，本文中之調控元件將表現載體或盒之基因、轉基因或治療性轉基因之表現增加至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍或至少1000倍。該等表現載體或盒可包括與調控元件分開之啟動子。啟動子之實例包括：minCMV啟動子、超級核心啟動子(SCP)、TTR啟動子、Proto 1啟動子、UCL-HLP啟動子、AAT啟動子、KAR啟動子、EF1a啟動子及EFS啟動子。在一些情形下，包含可操作連接至轉基因之SEQ ID NO: 13-17及22-41中之一或多者的表現載體或盒無需單獨啟動子用於轉基因表現。

在一些情況下，可操作連接至本文中之調控元件中之任一者以及minCMV啟動子之轉基因的表現高於連接至無本文所述調控元件之minCMV啟動子之轉基因的表現。在一些情形下，轉基因在連接至minCMV啟動子及如本文所述調控元件時之表現高於轉基因在連接至以下啟動子中之任一者而無調控元件時的表現：超級核心啟動子、TTR啟動子、Proto 1啟動子、UCL-HLP啟動子、AAT啟動子、KAR啟動子、EFla啟動子或EFS啟動子。

在一些情況下，可操作連接至本文中之調控元件(例如SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41)中之任一者之轉基因的表現高於轉基因在連接至UCL-HLP啟動子時之表現。

在一些情況下，本文所述調控元件驅動相對於其長度高之表現。舉例而言，長度係CMV啟動子之一半之本揭示內容之調控元件驅動超過CMV啟動子之程度之一半的表現。在一些情形下，藉由每個鹼基對之活性(或轉基因表現)或稱作經過分子大小標準化之活性界定調控元件。舉例而言，驅動與CMV啟動子相同程度之表現但係CMV啟動子長度之一半之調控元件每個鹼基對具有兩倍活性。如圖 1A 中所示，SEQ ID NO: 3 (SEQ ID NO: 1與minCMV啟動子之組合)引起5552之正規化螢光素酶值，其產生約21之經過分子大小標準化之活性值，如圖 1B 中所示(SEQ ID NO: 3係266bp)。SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 2與minCMV啟動子之組合)引起53之經過分子大小標準化值。單獨minCMV啟動子產生19之經過分子大小標準化值，且SCP啟動子及CAG啟動子分別產生1及10之經過分子大小標準化值，如圖 1B 中所示。

表現、高基因表現具體而言可使用業內已知之任何技術量測。在一些情況下，在由本揭示內容之調控元件控制時，使用RNA量化/測序技術(例如定量PCR、北方墨點法或次世代定序)量測轉基因之相對及較高表現。

在一些情況下，可藉由自所需轉基因/基因產生/表現之蛋白質的濃度量測高表現。可藉由業內已知之任何方法量測蛋白質之濃度。用於量測蛋白質表現之方法之非限制性實例包括(但不限於) ELISA、放射免疫分析、西方墨點法或高效液相層析。參見(例如) Noble JE, Quantification of protein concentration using UV absorbance and Coomassie dyes, Methods Enzymol. 2014；536:17-26；Kurien BT, Scofield RH. A brief review of other notable protein detection methods on acrylamide gels, Methods Mol Biol. 2012；869:617-20；及Daniel M. Bollag, Michael D. Rozycki及Stuart J. Edelstein, Protein Methods，第2版，Wiley Publishers (1996)。可在活體外或活體內量測蛋白質表現。

在各個實施例中，可藉由量測使用PCR方法自轉基因產生之mRNA或RNA轉錄本的量測定轉基因表現。在一些情形下，可使用與基因產物相互作用之蛋白質或免疫分析量測轉基因基因表現。在一些情形下，亦可使用北方墨點分析及/或原位雜交來分析活體內轉基因表現。亦可監測自轉基因表達之蛋白質之含量(例如螢光報導基因轉基因之螢光)以測定在轉錄方面轉基因表現之增加以及在細胞中或活體內蛋白質合成(即，轉譯)之增加。亦可使用各種方法(包括但不限於西方墨點分析、免疫組織化學、免疫螢光組織化學及/或ELISA分析)分析蛋白質含量。

在一些實例中，本揭示內容之調控元件引起可操作連接之轉基因以至少0.5、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5或3 IU/ml之程度在相關細胞類型中表現，如藉由ELISA所量測。相關細胞類型之實例包括(但不限於)肝細胞(liver cell)、肝細胞(hepatocyte)、肌肉細胞、肺細胞、上皮細胞及腎細胞(例如293T及CHO細胞)。在一些實施例中，可在小鼠中評價調控元件增加轉基因表現之能力，其中量測總小鼠中轉基因表現之總量及/或具有轉基因表現之細胞類型或組織類型的總數。在一些情形下，本揭示內容之調控元件可引起可操作連接之轉基因以至少0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5或3.0 IU/ml之整體程度在小鼠或其他生物體之血液中表現，如藉由ELISA所量測。

當評價表現盒或載體之活性時，活性或表現可表示為每單位劑量之活性或表現程度，或標準化成投與或遞送至細胞或小鼠中之表現盒或載體之劑量。在一些實施例中，轉基因之表現或活性標準化成所用質體或DNA之量(例如每隻小鼠之μg/kg)、或病毒顆粒之量(例如標準化成基因體拷貝/kg/小鼠之量)，以容許在具有或無調控元件之不同表現載體或盒之間進行比較。舉例而言，當評價調控元件在小鼠中之活性時，所分析表現或活性可正規化每隻小鼠約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或大於10或20 μg表現載體、盒或質體之劑量。在一些實施例中，表現程度或活性可標準化成每隻小鼠10¹⁰ 、10¹¹ 、10¹² 、10¹³ 、10¹⁴ 或10¹⁵ gc/kg之含有如本文揭示之表現載體或盒之病毒顆粒。

在其他實例中，藉由用於表現蛋白之活性之功能分析量測連接之轉基因。功能分析之實例包括用於量化螢光素酶活性之螢光素酶分析及用於量化因子VIII活性之Coatest分析。在Coatest分析中，活因因子VIII (一種輔因子)之表現促進釋放發色基團pNA之反應。在405 nm用光度法讀取與釋放之發色基團相關之顏色，且顏色之強度與因子VIII活性之量成正比。因子VIII活性可量測為由含有1.0 IU/mL因子VIII之血漿所示之活性含量之百分比。當蛋白質之濃度係1.0 IU/mL時，與無調控元件之類似表現載體(例如無調控元件之UCL-HLP)相比，可操作連接至minCMV及因子VIII之本揭示內容之調控元件(例如SEQ ID NO: 1或2)可引起超過10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、250%或超過250%之活性程度之因子VIII活性程度。在一些情形下，當蛋白質之濃度係1.0 IU/mL時，與具有UCL- HLP啟動子之類似表現載體相比，可操作連接至因子VIII之本揭示內容之調控元件(例如SEQ ID NO: 13、14、15、16、17、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41)可引起超過10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、250%或超過250%之活性程度之因子VIII活性程度。

本文揭示之調控元件可驅動或增加轉基因在一或多種不同細胞類型中之表現。當調控元件能增加轉基因在多種細胞類型中之表現時，將該表現視為總體表現。總體表現無需轉基因在生物體之每個細胞中表現。總體調控元件可以類似程度在不同表現細胞類型中或以一系列表現程度在不同細胞類型中表現轉基因。在一些情形下，整體調控元件可驅動或增加轉基因在至少2、3、4、5、10、15或20種不同細胞類型中表現。舉例而言，具有總體表現之調控元件可驅動或增加轉基因在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個不同細胞系中表現。細胞系之實例包括293細胞、CHO細胞、癌細胞系及永生化細胞系。在一些情況下，調控元件驅動或增加轉基因在一或多種細胞類型中在動物活體內之表現。

在一些實施例中，本文中之調控元件驅動基因在肝細胞中表現。在一些實施例中，調控元件驅動基因在以下細胞類型中之任一或多者中表現：肺泡細胞、心肌細胞、上皮細胞、肝細胞、腎細胞、腸細胞、肌細胞、神經元、卵巢細胞及腎細胞。在一些實施例中，調控元件驅動基因在以下細胞系中之任一或多者中表現：中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、小鼠骨髓瘤細胞(NSO)、幼小倉鼠腎細胞(BHK)、B16黑色素瘤細胞、HEK293T細胞、HeLa細胞、HT- 1080細胞及PER.C5細胞。在一些情況下，調控元件驅動基因在細胞系中離體或活體外表現。

本揭示內容之調控元件可組合在一起或與其他調控元件組合。該等其他調控元件包括(例如)組成型啟動子、誘導型啟動子、抑制子、增強子或轉錄後穩定元件。在一個實施例中，載體包含在連接之轉基因上游之SEQ ID NO: 3之調控元件，其包含SEQ ID NO: 1及minCMV啟動子。本文涵蓋之啟動子之實例包括：minCMV啟動子、超級核心啟動子、TTR啟動子、Proto 1啟動子、UCL-HLP啟動子、CMVe增強子/CMV啟動子組合、AAT啟動子、KAR啟動子、EF1a啟動子、EFS啟動子或CBA啟動子。

本揭示內容之組合之調控元件可仍較短。組合之調控元件可具有長度為約50至500、100至400、50至200、100至200或150至300個鹼基對之總長度。組合之調控元件可具有長度小於約500、450、400、350、300、250、200、150或100個鹼基對之組合長度。在一些實施例中，調控元件係40-50bp、45-50、49、50-60、56、50-55或45-60bp。

組合之調控元件可來自不同物種。在較佳實例中，組合之調控元件之至少一部分係源於人類。非源於人類之元件可源自哺乳動物、病毒或合成序列。 表現盒

術語「表現盒」及「核酸盒」可互換使用，以指多核苷酸分子或核酸序列。在一些情形下，表現盒包含一或多個本文揭示之可操作連接至轉基因之調控元件。在一些情形下，表現盒包含一或多個調控元件。在一些情形下，表現盒進一步包含啟動子。在一些情形下，表現盒包含SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41及/或其任一組合之一或多個序列。在一些情形下，表現盒包含SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41中之一或多者，(ii) 與SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41中之任一者具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性之核酸序列，(iii) (i)或(ii)之任一序列之功能片段，或(iv) (i)、(ii)及/或(iii)之任一序列之組合。在一些情形下，藉由BLAST量測序列一致性。在一些情形下，調控元件位於表現盒中轉基因之上游。在一些情形下，調控元件位於表現盒中轉基因之下游。

在一些態樣中，本文所述一或多個調控元件(例如SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41)可操作連接至表現盒中之轉基因(例如報導基因或治療性轉基因)。在一些情形下，基因療法包含表現盒，該表現盒包含可操作連接至本發明之一或多個、兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個或五個或更多個調控元件的轉基因以引起轉基因(例如，報導基因、eGFP、RFP、因子VIII、Cas9、DNA結合蛋白、激素、生長或分化因子、胰島素、生長激素、VEGF、神經營養因子、纖維母細胞上皮因子；細胞介素、介白素、淋巴介質、腫瘤壞死因子、抗體、免疫球蛋白、干擾素、嵌合T細胞受體；脂蛋白受體、囊性纖維化跨膜調控因子、與I、II、III或IV型黏多醣貯積症相關之基因、β球蛋白或脂蛋白脂酶或其變體或片段)之增加表現。在一些情形下，轉基因係ATP7A、ATP7B、ATP8B1、ABCB4、ABCB11或其變體或片段、或與其具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之序列。在一些情形下，轉基因係CDKL5、CNTNAP2、ZEB2或其變體或片段、或與其具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%序列一致性之序列。在一些情形下，轉基因係纖維蛋白原、凝血酶原、凝血因子或血液凝固因子(例如因子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)。

在一些情形下，表現盒適於經由基因療法遞送。在一些情形下，表現盒係直鏈或圓形構築體。在一些情形下，表現盒係質體、載體、病毒載體或rAAV之一部分。在一些情形下，包含本揭示內容之可操作連接至轉基因之一或多個RE的表現盒適於在複數個細胞中(例如在任何哺乳動物或人類細胞系、腎細胞、上皮細胞、肝細胞(liver cell)、肝細胞(hepatocyte)、神經元、纖維母細胞及/或CNS細胞中)表現。在一些情形下，包含可操作連接至轉基因之本揭示內容之一或多個RE (例如SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41)的表現盒適於在2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個或5個或更多個哺乳動物或人類細胞系或細胞類型中表現。在一些情形下，轉基因分子2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個、5個或更多個以下細胞類型中發生：腎細胞、上皮細胞、肝細胞、神經元、纖維母細胞、心肌細胞、CNS細胞、肌肉細胞、血球及/或幹細胞。

在一些情形下，包含可操作連接至轉基因之本揭示內容之一或多個RE (例如SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41)的表現盒適於肝中或肝細胞中之轉基因表現。在一些情形下，包含可操作連接至轉基因之本揭示內容之一或多個RE的表現盒適於經由(例如)經口、靜脈內、肌內、腹膜內、鞘內、經腸或非經腸投與全身遞送轉基因。在一些情形下，轉基因之全身遞送涉及肝中或肝細胞中增加之轉基因表現。在一些情形下，與無RE之表現盒相比或與對照(例如單獨載體對照、緩衝液對照或無任何表現活性之序列)相比，包含可操作連接至轉基因之本揭示內容之一或多個RE的表現盒引起轉基因在肝細胞中以至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍或至少1000倍之程度表現。在一些情形下，將由相對較短之RE驅動之表現與可操作連接至相同轉基因之組成型啟動子、CMV啟動子、超級核心啟動子、TTR啟動子、Proto 1啟動子、UCL-HLP啟動子或CMVe啟動子的表現進行比較。

在一些情形下，包含本揭示內容之調控元件之表現盒引起可操作連接之轉基因之高或增加之表現，其中高或增加之表現係與對照(例如組成型啟動子、CMV啟動子、超級核心啟動子(SCP)、TTR啟動子、Proto 1啟動子、UCL-HLP啟動子或CMVe啟動子)相比測得。可用於比較以測定高或增加之轉基因表現之其他對照包括單獨緩衝液、minCMV、EFS、單獨載體或已知無表現活性之序列。在一些情形下，CAG或SEQ ID NO: 4用作比較表現程度及/或經過分子大小標準化活性之陽性對照。

所需轉基因或基因之表現可經由表現載體或表現盒發生。該表現載體或盒可包括以下額外元件啟動子、增強子或轉錄後調控元件中之任一或多者。本揭示內容之調控元件可位於轉基因之上游或下游，且可經轉錄或未經轉錄。在一些實例中，本揭示內容之調控元件位於啟動子之下游及轉基因之上游。在一些實例中，調控元件定位為轉基因之啟動子。在一些情形下，本揭示內容之一或多個RE可操作連接至轉基因而表現載體或盒中無任何其他啟動子。

表現載體或盒可為圓形或直鏈核酸分子。在一些情形下，將載體或盒遞送至細胞(例如複數種不同細胞或細胞類型，包括靶細胞或細胞類型及/或非靶細胞或細胞類型)。載體或盒可為整合或非整合載體，係指載體或盒將部分或整個表現載體或盒及/或轉基因整合至細胞之基因體中的能力。整合載體或非整合載體可用於遞送可操作連接至調控元件之轉基因。載體或盒之實例包括(但不限於) (a) 非病毒載體，例如包括直鏈寡核苷酸及圓形質體之核酸載體；人工染色體，例如人類人工染色體(HAC)、酵母人工染色體(YAC)及細菌人工染色體(BAC或PAC))；游離型載體；轉位子(例如PiggyBac)；及(b) 病毒載體，例如反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體及腺相關之病毒載體(AAV)。病毒對於核酸之遞送具有若干優點，包括高感染性。在一些實施例中，使用病毒以遞送包含一或多個如本文所述可操作連接至轉基因之調控元件的核酸分子或表現盒。

本文所述載體可直接或經由遞送系統遞送至所需細胞。遞送系統之實例包括(但不限於)病毒載體(例如反轉錄病毒、腺病毒、腺相關之病毒(AAV)、輔助病毒依賴性腺病毒系統、雜合腺病毒系統、單純疱疹、痘病毒、慢病毒、及艾司坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus))、物理系統(裸DNA、DNA轟擊、電穿孔、流體動力學、超音波及磁轉染)及化學系統(陽離子脂質、不同陽離子聚合物及脂質聚合物)。

可使用任何已知技術以將調控元件及可操作連接之轉基因、或包含調控元件及轉基因之組合物遞送至所需細胞以賦予或誘導轉基因在所需細胞類型、組織或生物體中之活體外、活體內或離體表現。

病毒基因療法載體或基因遞送載體之較佳特徵包括如下能力：可重複且穩定繁殖且純化至高效價；介導靶向遞送(例如將轉基因特異性遞送至所需組織或器官而在其他地方無廣泛載體傳播)；以及介導基因遞送及轉基因表現而不誘導有害副作用。

出於基因遞送之目的，已工程化若干類型之病毒(例如，非致病性小病毒、腺相關病毒)。用於各種基因療法應用之基於病毒之載體可利用病毒感染路徑，但避免可導致複製及毒性之隨後之病毒基因表現。該等基於病毒之載體可藉由自病毒基因體刪除所有或一些編碼區、但保留功能(例如將表現載體包裝至病毒殼體中或將載體核酸或異源基因或DNA整合至宿主基因體中)所必需之彼等完整序列(例如末端重複序列)來獲得。例如，可將包含轉基因之表現載體或盒選殖至病毒主鏈(例如無病毒基因之經修飾或工程化之病毒主鏈)中，且與(例如)當共轉染時可產生重組病毒載體顆粒之其他載體(例如包裝載體)結合使用。

出於基因遞送之目的，已工程化AAV (一種非致病性小病毒)之若干血清型，其中一些已知對於某些組織或細胞類型具有向性。用於各種基因療法應用之病毒可經工程化以具有複製缺陷或在個體或宿主中具有低毒性及低致病性。該等基於病毒之載體可藉由自病毒基因體刪除所有或一些編碼區、但保留功能(例如將載體基因體包裝至病毒殼體中或將載體核酸(例如異源DNA序列)整合至宿主基因體中)所必需之彼等完整序列(例如反向末端重複序列)來獲得。例如，可將包含轉基因之表現載體或盒選殖至病毒主鏈(例如無病毒基因之經修飾或工程化之病毒主鏈)中，且與(例如)當共轉染時可產生重組病毒載體顆粒之其他載體(例如包裝載體)結合使用。

在一些實施例中，用於將一或多個調控元件及轉基因在活體內、離體或活體外遞送至細胞、細胞類型或組織之AAV載體或AAV病毒顆粒或病毒顆粒較佳具有複製缺陷。在一些實施例中，AAV病毒經工程化或經遺傳修飾，以使僅在輔助因子存在下其才能複製並產生病毒顆粒。

在一些實施例中，表現載體或盒經設計以由AAV或重組AAV (rAAV)遞送。在一些實施例中，使用慢病毒或慢病毒載體遞送表現載體或盒。在一些實施例中，較佳使用慢病毒或慢病毒載體遞送較大轉基因、即超過AAV之選殖能力之基因。

表現載體或盒可經設計以由AAV遞送。AAV可為任何血清型，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-DJ或嵌合、雜合或變體AAV。AAV亦可為自補AAV (scAAV)。經設計由AAV遞送之表現載體或盒可包含5’ ITR、一或多個調控元件、可選最小啟動子、轉基因、視情況一或多個內含子、可選聚A信號及3’ ITR。在一些情況下，表現載體或盒亦含有一或多個轉錄後RNA調控元件。

含有SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2之實例性表現載體或盒分別示於圖 6B 及圖 6C 中。可在啟動子位置中含有SEQ ID NO: 13-17及22-41中之任一者之實例性表現載體示於圖 7 中。該等表現載體或盒可適於使用本文所述遞送系統或基因療法(包括但不限於AAV、慢病毒或反轉錄病毒)中之任一者之轉基因表現。

表現載體或盒可經設計以由最佳化治療性反轉錄病毒載體遞送。反轉錄病毒載體可為包含以下之慢病毒：左(5’) LTR；有助於病毒之包裝及/或核輸入之序列、至少一種核酸細胞類型選擇性調控元件、視情況慢病毒逆向反應元件(RRE)；視情況啟動子或其活性部分；可操作連接至各種調控元件之治療性轉基因；視情況隔離物；及右(3’) 反轉錄病毒LTR。

在一些實施例中，表現載體或盒包含一或多個調控元件。在一些實例中，載體或盒含有兩個或更多個組合之調控元件。在一些實例中，載體或盒含有兩個或更多個組合之調控元件，例如在轉基因上游之啟動子及在轉基因下游之增強子。在一些實施例中，內含子序列在啟動子下游。

在一些情形下，表現載體或盒含有高驅動器調控元件、總體調控元件或短的調控元件。在一些情形下，高驅動器調控元件驅動總體表現及/或係短的。在一些情形下，調控元件係短的總體調控元件。在一些實施例中，含有調控元件之表現載體或盒用於病毒載體中，或包裝於病毒中，其可用於活體內感染動物模式或離體或活體外轉染細胞以評價調控元件在整個動物模式中或在某些細胞類型或靶細胞類型中之活性。

在一些實施例中，含有本揭示內容之調控元件之表現盒亦包含一或多個轉基因。轉基因可為編碼蛋白質之基因。在一些情形下，表現盒含有治療性轉基因。治療性轉基因可替代不存在的或缺陷性基因，或補償蛋白質之缺陷表現。治療性轉基因可參與細胞信號傳導路徑。在一些情形下，表現載體或盒含有用於商業生產之轉基因。在一些實施例中，用於商業生產之轉基因可產生治療蛋白，或改良宿主細胞之功能，或恢復或挽救宿主細胞之表型。

本文揭示之調控元件可位於表現載體或盒內之任何位置。舉例而言，調控元件可位於增強子上游、增強子下游但啟動子上游、轉基因之5’ UTR內、轉基因內之內含子內、轉基因之3’ UTR中或轉基因下游。在一些情形下，一或多個調控元件位於可操作連接之轉基因上游或下游。舉例而言，SEQ ID NO: 3及4在minCMV啟動子下游分別含有SEQ ID NO: 1及2之序列。調控元件對於自表現盒或載體內之不同位置之轉基因表現可具有不同效應。每一調控元件可在表現載體或盒內具有較佳位置，其引起自該調控元件之最佳表現。

利用具有高活性之較短調控元件可容許遞送相同包裝容量內之較大轉基因且不犧牲轉基因表現或高表現。在一些情形下，使用較短調控元件容許遞送單一載體中之兩個或更多個轉基因，或與無調控元件之類似載體或盒相比以相對較高表現程度遞送大的轉基因。兩個或更多個轉基因可包含兩種或更多種不同的編碼蛋白質之基因或一種編碼蛋白質之基因及一個非編碼元件。在一實例中，載體包含Cas9編碼序列及一或多個嚮導RNA，如實例4中所述。在一些情形下，調控元件之長度係約20至100、30至100、40至80或50至60個鹼基對。在一些情形下，調控元件之長度小於150、120、110、100、90、80、70或60個鹼基對。本揭示內容之組合之調控元件可為短的。組合之調控元件可具有長度為約50至500、100至400、50至200、100至200或150至300個鹼基對之總長度。組合之調控元件可具有長度小於約500、450、400、350、300、250、200、150或100個鹼基對之組合長度。

在一些情形下，表現盒或載體包含一或多個可操作連接至大的轉基因之本揭示內容之RE，該轉基因之序列超過1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、5.5kb、6kb、6.5kb、7kb或7.5kb。在一些情形下，大的轉基因可操作連接至一或多個RE，其中每一RE不超過49bp、50bp、56bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、110bp、117bp、120bp、130bp、140bp、150bp、160bp、170bp、180bp、190bp、200bp、210bp、220bp、230bp、240bp、250bp、259bp、260bp、265bp、270bp、280bp、290bp、300bp、310bp、320bp、330bp、340bp、350bp、360bp、370bp、380bp、390bp或400bp，且包含根據表 1 或SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41中之任一者之序列。在一些情形下，與無RE之表現載體或盒相比或與陰性對照(例如單獨載體對照或包含無已知表現活性之序列的載體)相比，RE將轉基因之表現增加至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍或至少1000倍。

當評價表現盒或載體之活性時，活性或表現可表示為每單位劑量之活性或表現程度，或標準化成投與或遞送至細胞、小鼠或個體之表現盒或載體之劑量。在一些情形下，轉基因之表現或活性標準化成所用質體或DNA之量(例如μg/kg/小鼠)、或病毒顆粒之量(例如標準化成基因體拷貝/kg/小鼠或個體之量)，以容許在具有或無調控元件之不同表現載體或盒之間進行比較。舉例而言，當評價調控元件在小鼠中之活性時，所分析細胞中之轉基因表現或轉基因活性可正規化每隻小鼠約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20 μg或大於10 μg或大於20 μg表現載體、盒或質體之劑量。在一些情形下，表現程度或活性可標準化成每隻小鼠10¹⁰ 、10¹¹ 、10¹² 、10¹³ 、10¹⁴ 或10¹⁵ gc/kg之含有如本文揭示之表現載體或盒之病毒顆粒。

使用基因療法(例如rAAV)遞送本揭示內容之表現盒的一個優點在於該等療法可提供隨時間更靶向及持續之治療效應。另外，病毒基因療法可經工程化以對於一或多種所需細胞類型或組織(例如肝細胞或肝)具有向性。舉例而言，病毒基因療法可經工程化以在活體內感染及遞送酬載或治療劑(例如轉錄調節劑或轉基因)至一或多個區、組織或細胞類型。轉基因

本文揭示之構築體(例如表現盒或載體)可用於驅動轉基因在所需細胞或複數個細胞中之表現。在一些情形下，本文揭示之構築體用於重組蛋白表現。舉例而言，本文揭示之調控元件可用於驅動重組蛋白之表現。利用本揭示內容之方法產生重組蛋白可出於治療目的、研究目的或商業目的而產生。可表現為活體內、離體或活體外蛋白表現系統之一部分之轉基因的實例包括(但不限於)：Cas9、因子VIII、DNA結合蛋白、激素、生長/分化因子，例如胰島素、生長激素、VEGF、神經營養因子、纖維母細胞上皮因子；調控或調節免疫系統之治療蛋白，例如細胞介素、介白素、淋巴介質、腫瘤壞死因子、抗體、免疫球蛋白、干擾素、嵌合T細胞受體；脂蛋白受體；囊性纖維化跨膜調控因子；與I、II、III及IV型黏多醣貯積症相關之基因；β球蛋白；及脂蛋白脂酶。在一些情形下，表現之轉基因係ATP7A、ATP7B、ATP8B1、ABCB4、ABCB11或其變體或片段。在一些情形下，表現之轉基因係CDKL5、CNTNAP2、ZEB2或其變體或片段。在一些情形下，轉基因係纖維蛋白原、凝血酶原、凝血因子或血液凝固因子(例如因子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)。

在一些情形下，包含可操作連接至轉基因之本揭示內容之一或多個RE的表現盒適於基因療法治療。在一些情形下，基因療法治療投與或適於全身遞送，例如藉由靜脈內輸注或注射。在一些情形下，基因療法適於在肝或肝細胞中表現。在一些情形下，可操作連接之轉基因係在肝或肝細胞中表現之基因，或係在肝疾病或病症中相關之基因，例如與威爾森氏症相關之ATP7B；與3型進行性家族性肝內膽汁淤積相關之ABCB4；與遺傳性果糖不耐受相關之ALDOB；與IV型肝醣貯積病相關之GBE1；與I型酪胺酸血症相關之FAH；與精胺基琥珀酸裂解酶缺乏相關之ASL；與檸檬素缺乏(CTLN2、NICCD)相關之SLC25A13；與膽固醇基酯貯積病相關之LIPA；與α-1抗胰蛋白酶缺乏相關之SERPINA1；與囊性纖維化相關之CFTR；與遺傳性血色素沉著症相關之HFE；或與阿爾斯特倫症候群相關之ALMS1。在一些情形下，一或多個調控元件或包含本文揭示之RE之表現盒用於基因療法治療以治療遺傳性肝病，例如膽汁酸合成病症、碳水化合物代謝病症、胺基酸代謝病症、尿素循環病症或脂質代謝病症。在一些情形下，一或多個調控元件或包含本文揭示之RE之表現盒用於基因療法治療(例如AAV基因療法)以治療威爾森氏症；3型進行性家族性肝內膽汁淤積；遺傳性果糖不耐受；IV型肝醣貯積病；I型酪胺酸血症；精胺基琥珀酸裂解酶缺乏；檸檬素缺乏(CTLN2, NICCD)；膽固醇基酯貯積病；α-1抗胰蛋白酶缺乏；囊性纖維化；遺傳性血色素沉著症；或阿爾斯特倫症候群。在一些情形下，一或多個調控元件或包含本文揭示之RE之表現盒用於基因療法治療(例如AAV基因療法)以治療血液凝固疾患(例如血友病或血友病A)或威爾森氏症。

在一些情形下，表現重組蛋白之方法包含向一個細胞或複數個細胞中引入表現盒或載體，其中表現盒或載體包含一或多個可操作連接至轉基因之本揭示內容之RE (SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41)。在一些情形下，轉基因係以下任一者：Cas9、因子VIII、DNA結合蛋白、激素、生長/分化因子，例如胰島素、生長激素、VEGF、神經營養因子、纖維母細胞上皮因子；調控或調節免疫系統之治療蛋白，例如細胞介素、介白素、淋巴介質、腫瘤壞死因子、抗體、免疫球蛋白、干擾素、嵌合T細胞受體；脂蛋白受體；囊性纖維化跨膜調控因子；與I、II、III及IV型黏多醣貯積症相關之基因；β球蛋白；及脂蛋白脂酶。在一些情形下，表現之轉基因係ATP7A、ATP7B、ATP8B1、ABCB4、ABCB11或其變體或片段。在一些情形下，表現之轉基因係CDKL5、CNTNAP2、ZEB2或其變體或片段。在一些情形下，轉基因係纖維蛋白原、凝血酶原、凝血因子或血液凝固因子(例如因子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)。

本文揭示之人類基因之核苷酸及蛋白質序列可參見基因庫(NCBI)或UniProKB資料庫。舉例而言，人類UniProtKB登錄號包括：Q04656 (ATP7A)；P35670 (ATP7B)；O43520 (AT8B1)；P21439 (MDR3，亦稱為ABCB4)；O95342 (ABCBB，亦稱為ABCB11)；O76039 (CDKL5)；Q9UHC6 (CNTP2，亦稱為CNTNAP2)；O60315 (ZEB2)；P12259 (F5或因子V)；P00451 (F8或因子VIII)；P00740 (F9或因子IX)；P00742 (F10或因子X)。該等蛋白質序列中之任一者可由本文揭示之表現盒中之核酸序列編碼。

重組蛋白可在細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、植物細胞或哺乳動物細胞中產生。在一些實例中，重組蛋白係在哺乳動物細胞中產生。在一些情形下，蛋白質係在動物模式中產生。可用於產生蛋白質之細胞系之實例包括中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、小鼠骨髓瘤細胞(NSO)、幼小倉鼠腎細胞(BHK)及B16黑色素瘤細胞。在一些實例中，使用源於人類之細胞系。可用於產生蛋白質之人類細胞系之實例包括HEK293T、HeLa、HT-1080及PER.C5。重組蛋白亦可在動物中或在動物產物中產生。重組蛋白亦可在植物中產生。重組蛋白可在植物之葉、莖、花、果實或種子中表現。

在一些實施例中，本揭示內容之調控元件可用於驅動或增加報導基因(例如螢光素酶)之表現。在一些實施例中，一或多個調控元件可造成該可操作連接之螢光素酶轉基因表現，其程度可以產生如根據實例2之方法所量測超過10¹⁷ 、10¹⁸ 、10¹⁹ 、10²⁰ 或10²¹ 個光子/sec/小鼠之輸出量。

本文亦涵蓋治療單一對偶基因不足或與不足基因表現及/或蛋白質活性或合成相關之任何疾患或病症的方法，其包含在有此需要之個體中投與表現盒或載體，其中表現盒或載體包含一或多個可操作連接至轉基因之本揭示內容之RE (SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41)。在一些情形下，轉基因係造成內源基因增加表現之DNA結合蛋白或轉錄調節劑(例如轉錄活化劑)。在一些情形下，表現盒或載體中之轉基因係治療性轉基因。在一些情形下，治療性轉基因係以下任一者：Cas9、因子VIII、DNA結合蛋白、激素、生長/分化因子，例如胰島素、生長激素、VEGF、神經營養因子、纖維母細胞上皮因子；調控或調節免疫系統之治療蛋白，例如細胞介素、介白素、淋巴介質、腫瘤壞死因子、抗體、免疫球蛋白、干擾素、嵌合T細胞受體；脂蛋白受體；囊性纖維化跨膜調控因子；與I、II、III及IV型黏多醣貯積症相關之基因；β球蛋白；及脂蛋白脂酶。在一些情形下，表現之轉基因係ATP7A、ATP7B、AT8B1 (或ATP8B1)、MDR3 (或ABCB4)、ABCBB (或ABCB11)、CDKL5、CNTP2 (或CNTNAP2)、ZEB2、因子V、因子VIII、因子IX、或因子X或其變體、同種型或功能片段。進行性家族性肝內膽汁淤積(PFIC)包括PFIC1、PFIC2及PFIC3，其與ATP8B1、ABCB11及ABCB4基因之突變相關。2型進行性家族性肝內膽汁淤積(PFIC2)與ABCB11之缺陷或突變相關。ATP8B1基因突變可引起PFIC1。ABCB11基因突變可引起PFIC2。ABCB4基因突變可引起PFIC3。在一些情形下，本文揭示之轉基因係CDKL5且在基因療法中用於治療CDKL5缺乏病症。CNTNAP2突變或缺陷可引起自閉症譜系障礙。在一些情形下，轉基因係纖維蛋白原、凝血酶原、凝血因子或血液凝固因子(例如因子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)。在一些情形下，轉基因優先在肝細胞中表現。在一些情形下，投與係全身性的，例如經由經口、靜脈內、肌內、腹膜內、鞘內、經腸或非經腸投與。在一些情形下，該方法包含經由靜脈內輸注或注射遞送表現盒或載體。在一些情形下，投與係局部的，例如經由注射至肝、CNS或體內器官中。在一些情形下，表現盒或載體係AAV。

在一些情形下，本文涵蓋治療與基因過表現相關之病症或病症之方法，該方法包含向有需要之個體中投與表現盒或載體，其中表現盒或載體包含一或多個可操作連接至轉基因之本揭示內容之RE (SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41)。在一些情形下，轉基因係減小內源基因表現之DNA結合蛋白或轉錄調節劑(例如轉錄抑制子)。在一些情形下，轉基因優先在肝細胞中表現。在一些情形下，投與係全身性的，例如經由經口、靜脈內、肌內、腹膜內、鞘內、經腸或非經腸投與。在一些情形下，該方法包含經由靜脈內輸注或注射遞送表現盒或載體。在一些情形下，投與係局部的，例如經由注射至肝、CNS或體內器官中。在一些情形下，表現盒或載體係AAV。

在一些情形下，本文涵蓋治療與以下基因中之任一者之缺陷相關的遺傳病症或病症之方法：ATP7A、ATP7B、AT8B1 (或ATP8B1)、MDR3 (或ABCB4)、ABCBB (或ABCB11)、CDKL5、CNTP2 (或CNTNAP2)、ZEB2、因子V、因子VIII、因子IX、因子X、纖維蛋白原、凝血酶原、凝血因子或血液凝固因子(例如因子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)。在一些情形下，本文揭示治療威爾森氏症之方法。在一些情形下，治療威爾森氏症或與ATP7A、ATP7B、AT8B1 (或ATP8B1)、MDR3 (或ABCB4)、ABCBB (或ABCB11)、CDKL5、CNTP2 (或CNTNAP2)、ZEB2、因子V、因子VIII、因子IX、因子X、纖維蛋白原、凝血酶原、凝血因子或血液凝固因子(例如因子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)相關之任何其他遺傳病症或病症的方法包含向有需要之個體(例如動物或人類)投與本文揭示之表現盒或載體，其中表現盒或載體包含一或多個可操作連接至本揭示內容之轉基因的本揭示內容之RE，例如ATP7A、ATP7B、AT8B1 (或ATP8B1)、MDR3 (或ABCB4)、ABCBB (或ABCB11)、CDKL5、CNTP2 (或CNTNAP2)、ZEB2、因子V、因子VIII、因子IX、因子X、纖維蛋白原、凝血酶原、凝血因子、血液凝固因子(例如因子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)、DNA結合蛋白或轉錄調節劑。在一些情形下，轉基因係編輯內源基因之Cas及/或嚮導RNA (例如Cas自內源基因移除突變)。在一些情形下，表現盒或載體在肝中優先表現轉基因。在一些情形下，投與係全身性的，例如經由靜脈內輸注或注射。在一些情形下，投與係局部的，例如直接注射至肝或CNS中。

在一些情形下，本文揭示之表現盒或載體用於治療威爾森氏症，其中表現盒或載體包含一或多個可操作連接至治療性轉基因之RE (例如SEQ ID NO: 1、2、3、4、13、14、15、16、17、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41)，其中轉基因係ATP7B或作用於內源ATP7B基因以增加細胞中或活體內之ATP7B表現的轉錄調節劑。在一些情形下，該表現盒或載體遞送至診斷有威爾森氏症或處於威爾森氏症風險之個體。在一些情形下，該表現盒或載體經由靜脈內輸注或注射遞送至個體。在一些情形下，遞送係全身性的。在一些情形下，治療威爾森氏症之方法包含向有需要之個體投與基因療法(例如AAV基因療法)，其中基因療法包含一或多個可操作連接至治療性轉基因之RE (例如SEQ ID NO: 1、2、3、4、13、14、15、16、17、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41)，其中轉基因係ATP7B或作用於內源ATP7B基因以增加細胞中或活體內之ATP7B表現的轉錄調節劑。在一些情形下，表現盒或載體係AAV。在一些情形下，表現盒或載體在肝細胞中或在肝中優先表現。

在一些情形下，本文揭示之表現盒或載體用於治療血液凝固疾患，其中表現盒或載體包含一或多個可操作連接至治療性轉基因之RE (例如SEQ ID NO: 1、2、3、4、13、14、15、16、17、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41)，其中轉基因係纖維蛋白原、凝血酶原、凝血因子或血液凝固因子(例如因子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)或作用於對應於纖維蛋白原、凝血酶原、凝血因子或血液凝固因子(例如因子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)之內源基因的轉錄調節劑。在一些情形下，轉基因係因子VIII。在一些情形下，該表現盒或載體遞送至診斷有血液凝固疾患或處於血液凝固疾患風險之個體。在一些情形下，該表現盒或載體經由靜脈內輸注或注射遞送至個體。在一些情形下，遞送係全身性的。在一些情形下，治療血液凝固疾患之方法包含向有需要之個體投與基因療法(例如AAV基因療法)，其中基因療法包含一或多個可操作連接至治療性轉基因之本揭示內容之RE (例如SEQ ID NO: 1、2、3、4、13、14、15、16、17、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41)，其中轉基因係因子VIII或作用於內源因子VIII基因以增加其在細胞中或活體內之表現的轉錄調節劑。在一些情形下，轉基因係因子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中之任一者。在一些情形下，表現盒或載體係AAV。在一些情形下，表現盒或載體在肝細胞中或在肝中優先表現。

在一些情形下，轉基因可為DNA結合蛋白或與DNA結合相關之蛋白質。在一些情形下，DNA結合蛋白可為轉錄因子或轉錄因子之一部分。在一些情形下，DNA結合蛋白可為Cas9 (一種Cas家族蛋白質)、dCas9 (一種dCas家族蛋白質)、轉錄活化劑樣效應物(TALE)或鋅指。在一些情形下，治療遺傳病症之方法包含投與包含基因編輯複合物(例如Cas9及嚮導RNA)及一或多個本揭示內容之RE (例如SEQ ID NO: 1、2、3、4、13、14、15、16、17、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41)的表現盒或載體。

在一些情形下，本文揭示之構築體用於遞送基因療法。具體而言，本揭示內容之短的調控元件尤其可用於需要表現大的轉基因(例如因子VIII)之基因療法。在一些實施例中，大的轉基因在肝細胞(liver cell) (例如肝細胞(hepatocyte))中表現。在其他實施例中，大的轉基因在中樞神經系統(CNS) (例如神經元)中表現。在一些實施例中，本文揭示之轉基因中之任一者可操作連接至一或多個本文揭示之調控元件以增加轉基因之表現。在一些情形下，本文揭示之轉基因在細胞中或活體內、活體外及/或離體表現。在一些情形下，使用基因療法、重組表現載體或質體或病毒載體或質體將該等大的轉基因遞送至細胞。可離體或活體外表現為基因療法或表現系統之一部分之大的轉基因之實例包括(但不限於)：Menkes氏蛋白(ATP7A)、ATP結合盒亞家族b成員4 (ABCB4)、ATP酶磷脂轉運8B1 (ATP8B1)、ATP酶銅轉運β (ATP7B)、週期蛋白依賴性激酶樣5 (CDKL5)、接觸蛋白相關之蛋白質樣2 (CNTNAP2)、ATP結合盒亞家族B成員11 (ABCB11)及鋅指E-盒結合同源異形盒2 (ZEB2)、及其任何變體、亞單位、突變體或功能片段，包括密碼子最佳化變體。

在一些實施例中，本文揭示之構築體用於基因編輯。舉例而言，構築體可包含如本文揭示之調控元件、Cas9編碼序列及嚮導RNA。在一些情形下，Case9編碼序列編碼saCas9。具有Cas9或saCas9編碼序列及嚮導RNA之構築體可用於例如藉由校正突變來校正功能障礙基因。

本文亦涵蓋包含一或多個如本文揭示之調控元件的基因療法或表現載體以治療各種疾病，包括各種遺傳病症，例如嚴重組合免疫缺失(ADA-SCID)、Menkes病、家族性肝內膽汁淤積、Byler症候群、威爾森氏症、皮質發育不良-局灶性癲癇症候群、Mowat-Wilson症候群、PFIC2、PFIC3、慢性肉芽腫病症、血友病、先天失明、代謝失調、溶酶體儲積症、肌肉營養不良症、癌症、病毒感染、心臟病及糖尿病。在一些情形下，包含一或多個如本文揭示之調控元件之基因療法可用於治療威爾森氏症。

在一些實施例中，本文揭示之調控元件用於患有血液凝固疾患之個體。舉例而言，含有本揭示內容之調控元件及FVIII之編碼序列之表現盒可用於挽救FVIII缺乏之個體之凝血障礙或疾病。將含有本揭示內容之調控元件及FVIII之編碼序列的表現盒轉染至患有凝血障礙之個體可引起損傷後之血液損失減少，如圖 5A 及圖 10 中所示。將含有本揭示內容之調控元件及FVIII之編碼序列之表現盒轉染至患有凝血障礙之個體可引起至少約10%、20%、30%之血液損失。將含有本揭示內容之調控元件及FVIII之編碼序列之表現盒轉染至患有凝血障礙之個體可引起損傷後出血停止之時間減少，如圖 5B 及圖 11 中所示。

可經本揭示內容之構築體、基因療法或表現載體/盒中之任一者治療之個體包括人類、靈長類動物、狗、貓、齧齒類動物、馬、牛、綿羊、豬及其他家畜。在一些情形下，個體患有疾病/病症或處於疾病/病症風險。舉例而言，個體可患有遺傳疾病，或具有已知與遺傳疾病或疾病之傾向性相關聯的DNA序列。在一些情形下，個體患有血友病。在一些情形下，個體患有血友病A。在一些實施例中，個體具有因子VIII缺陷。在一些實施例中，包含一或多個可操作連接至因子VIII之本文所述調控元件的基因療法用於治療經診斷患有血友病A之個體。實例

僅出於闡釋目的提供該等實例且並不限制本文所提供申請專利範圍之範疇。實例 1 HEK293T 細胞中之高表現

在若干不同調控元件中之一者控制下(即，無啟動子控制、SCP、CMV、SEQ ID NO: 3 (可操作連接至minCMV之SEQ ID NO: 1)、SEQ ID NO: 4 (可操作連接至minCMV之SEQ ID NO: 2)及CAG)，用含有螢光素酶基因之質體DNA轉染HEK293T細胞。每一構築體之正規化螢光素酶值闡釋於圖 1A 中。每一構築體之經過分子大小標準化活性值闡釋於圖 1B 中。本文所用調控元件及啟動子之序列提供於上表 1 及下表 3 中。連接至minCMV啟動子之調控元件SEQ ID NO: 1及連接至minCMV啟動子之調控元件SEQ ID NO: 2比單獨minCMV及單獨SCP驅動更高程度之螢光素酶表現。與對照、SCP或無調控元件(即，SEQ ID NO: 1或2)之minCMV啟動子相比，SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2二者在連接至minCMV啟動子時驅動螢光素酶在HEK293T腎細胞中高表現。

利用額外對照及調控序列進行類似正規化螢光素酶表現實驗，如圖 1C 、圖 1D 及圖 1E 中所圖解說明。亦分析螢火蟲表現以確保所有測試樣品中之類似轉染效率。在圖 1C 中，將組合之調控元件SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 17及22 (或SEQ ID NO: 17/22)、組合之SEQ ID NO: 16及23 (或SEQ ID NO: 16/23)、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32及SEQ ID NO: 33的正規化螢光素酶表現與兩個陰性對照(即，已知不驅動任何表現之序列)進行比較。所測試調控元件中之每一者引起高程度之螢光素酶表現，例如，與陰性對照相比，至少10、50或100或更多倍。

在圖 1D 中，將包含調控元件SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 26或SEQ ID NO: 27之質體的正規化螢光素酶表現與陰性對照及包含連接至CMVe之CMV或可操作連接至螢光素酶之CMV的類似質體進行比較。所測試之每一調控元件(即， SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 26及SEQ ID NO: 27)引起比陰性對照、單獨CMV及CMV+CMVe高之螢光素酶表現。與包含連接至螢光素酶之CMV啟動子或CMV+CMVe的質體相比，所測試相對較短之RE顯示至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍或超過50倍之正規化螢光素酶表現。

在圖 1E 中，將包含可操作連接至螢光素酶之調控元件SEQ ID NO: 17/22、SEQ ID NO: 16/23、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40或SEQ ID NO: 41之質體的正規化螢光素酶表現與陰性對照(即，已知無表現活性之序列)進行比較。每一調控元件(即， SEQ ID NO: 17/22、16/23及34-41)驅動比陰性對照高之螢光素酶表現，而SEQ ID NO: 35及SEQ ID NO: 39中之每一者驅動比陰性對照高102倍之正規化螢光素酶表現或高至少100倍之螢光素酶表現。

表 3 ：本文揭示之額外序列 實例 2 總體高驅動器

為評價調控元件SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2之表現型式，製備含有連接至螢光素酶之每一調控元件的重組AAV載體。所用調控元件：SCP、SERpE_TTR、Proto1、CMV、UCL-HLP、CMVe、SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2。經由流體動力學尾靜脈注射將質體DNA遞送至SCID灰棕色小鼠(每隻小鼠12 μg表現載體)且藉由注射後48小時向小鼠注射5 ug (約0.25 mg/kg)福利馬嗪(furimazine)分析螢光素酶之表現。圖 2A 圖解說明在不同調控元件控制下螢光素酶之表現，且圖解說明SEQ ID NO: 1及2，在每一RE連接至minCMV時，其能夠驅動可操作連接之轉基因在至少一種額外細胞類型以及腎細胞中之表現，如指示小鼠各種組織中螢光素酶表現之白色區所闡釋。如圖 2B 中所圖解說明，與其他調控元件相比，調控元件SEQ ID NO: 3及SEQ ID NO: 4各自引起高程度之螢光素酶表現，如藉由螢光素酶發光(以光子/sec表示)所量測。實例 3 人類因子 VIII 之表現

向SCID灰棕色小鼠注射16 μg含有以下之編碼序列之表現盒DNA：與UCL-HLP可操作連接之因子VIII (NIH蛋白登記ID ABV90867.1)；具有SEQ ID NO: 1之minCMV；或具有SEQ ID NO: 2之minCMV。向至少8隻小鼠注射3種質體中之每一者，且向至少額外8隻小鼠注射緩衝液。注射rAAV後24小時，取血樣並使用確立方法(COATEST® SP4 FVIII，Chromogenix；Visualize™ DVIII抗原套組，Affinity Biologicals INC.)分析血漿之因子VIII活性及濃度。如圖 3A 中所圖解說明，具有SEQ ID NO: 1之minCM及具有SEQ ID NO: 2之minCMV表現盒產生1.5 IU/ml或更高之程度因子VIII之高血漿濃度。圖 3B 圖解說明SEQ ID NO: 3 (具有SEQ ID NO: 1之minCMV)及SEQ ID NO: 4 (具有SEQ ID NO: 2之minCMV)產生100%或更高之血漿因子VIII活性值。調控元件SEQ ID NO: 1及/或2在與minCMV一起可操作連接至因子VIII編碼序列時分別產生114%及166%之血液因子VIII活性值，其比利用UCL-HLP啟動子所觀察到之活性高約10倍及15倍。實例 4 基因編輯

研發一體式重組AAV病毒顆粒以在轉基因小鼠Ai9 (Jax貨號：007909)中之tdTomato上游刪除停止盒。一旦由saCas9刪除停止盒，tdTomato即在CAG啟動子控制下表現。研發含有在EFS啟動子、CMV啟動子或具有SEQ ID NO: 2之CMV啟動子控制下之saCas9的rAAV。rAAV進一步包含兩個在U6啟動子控制下之Sa嚮導RNA支架。將該等rAAV病毒顆粒注射至上述轉基因小鼠之齒狀回中。3週後將腦固定並切片，且評價tdTomato在齒狀回中之表現。如圖 4B 中所圖解說明，具有SEQ ID NO: 2 (或SEQ ID NO: 4)之CMV比單獨CMV或EFS產生更多tdTomato表現細胞。圖 4A 圖解說明，SEQ ID NO: 2在連接至CMV (或SEQ ID NO: 4)時驅動連接之轉基因(RFP)在腦細胞之至少一亞群體(例如神經元)中表現。實例 5 凝血障礙之基因療法治療

遺傳工程化FVIII剔除小鼠(F8tm1Srcmo，缺失F8基因之外顯子16-19；自Shanghai Model Organism Center, Inc., Shanghai, China獲得)具有凝血缺乏，可藉由量測藉由切斷尾端及使其出血直至發生凝血所釋放之血液體積或直至發生凝血所逝去之時間對該凝血缺乏進行分析。向FVIII剔除小鼠注射磷酸鹽緩衝鹽水(PBS對照)或含有驅動FVIII轉基因表現之SEQ ID NO: 4的重組AAV病毒顆粒。以兩個不同劑量注射rAAV病毒顆粒：3¹¹ gc/kg或3¹² gc/kg。注射後3週，將處理之FVIII-剔除小鼠切斷尾部並量測直至凝血之血液體積損失。亦切斷一組未剔除小鼠之尾部並針對直至凝血之血液體積及時間進行評價。如圖 5A 中所示，PBS處理之FVIII剔除小鼠損失之血液體積為未處理之未剔除小鼠的兩倍以上。然而，rAAV處理之FVIII剔除小鼠所損失之血液比PBS處理之小鼠少。於較高rAAV劑量下，經處理之小鼠損失之血液體積與未處理之未剔除小鼠相同。針對出血時間分析觀察到類似結果，如圖 5B 中所圖解說明。儘管較低rAAV劑量對出血時間不顯示效應，但較高劑量之含有可操作連接至FVIII之SEQ ID NO: 4之rAAV將出血時間幾乎減少至未剔除小鼠之時間。實例 6 凝血障礙之基因療法治療

向FVIII剔除小鼠(如實例5中所述)注射磷酸鹽緩衝鹽水或含有驅動FVIII表現之SEQ ID NO: 13-17中之每一者之重組AAV病毒顆粒或含有驅動FVIII表現之SEQ ID NO: 9 (UCL-HLP)之對照病毒顆粒。圖 8 圖解說明未處理之剔除小鼠(KO)及經各種病毒顆粒處理之小鼠轉染後3週血液中FVIII之濃度。含有SEQ ID NO 13、SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 17之病毒顆粒引起最高之FVIII活體內表現；與其他調控元件相比，SEQ ID NO: 15引起中等FVIII表現；且與其他序列相比，SEQ ID NO: 16引起低的FVIII表現。然而，SEQ ID NO: 16仍產生比利用UCL-HLP啟動子高約2倍之FVIII濃度。

亦分析表現之FVIII之活性，如實例3中所述，如圖 9 及表 4 中所闡釋。不同病毒顆粒之活性值遵循與表現程度相同之型式。

表 4 ：經轉染小鼠之血液中之 FVIII 的活性

注射後3週，將經處理之FVIII剔除小鼠切斷尾部並量測直至凝血之時間及血液體積。亦切斷一組未剔除小鼠之尾部並針對直至凝血之血液體積及時間進行評價。如圖 10 及表 5 中所闡釋，PBS處理之FVIII剔除小鼠損失之血液體積為未處理之未剔除小鼠(或WT小鼠)的兩倍以上。然而，rAAV處理之FVIII剔除小鼠所損失之血液比PBS處理之小鼠少。接受含有SEQ ID NO: 17之病毒顆粒之小鼠損失與未處理之未剔除小鼠類似之血液體積。對於出血時間分析觀察到類似結果，如圖 11 及表 6 中所示。經包含SEQ ID NO: 15之病毒顆粒處理之小鼠之出血時間顯示出血時間及血液損失之最強減少。

表 5 ：經不同病毒顆粒轉染之小鼠中在凝血之前損失之血液體積

表 6 ：經不同病毒顆粒轉染之小鼠直至凝血之出血時間 實例 7 肝中之 ATP7B 表現

向C57BL6/J小鼠靜脈內注射含有在SEQ ID NO: 13控制下之ATP7B的AAV8載體。病毒遞送後2週，收穫肝。破壞肝穿孔樣品(punch)並在補充有10ul /mL β-巰基乙醇之600 μl RLT中勻漿，並使用RNeasy Mini套組(Qiagen)根據製造商之方案(包括柱上DNA酶處理)提取RNA。對於每一樣品，使用OligoDT引子用Superscript IV (Invitrogen)使RNA (3ug)逆轉錄(65℃ 5m，55℃ 10m，85℃ 10m)。利用標準曲線驗證針對人類ATP7B (5’- CATTCCAGGACTGTCCATTCT-3’(SEQ ID NO: 18)；5’- GGCCTGAACGTAGAAGTACCA-3’ (SEQ ID NO: 19))及GAPDH (5’ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’ (SEQ ID NO: 20)；5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’ (SEQ ID NO: 21))之引子以確保可靠性，並在以下擴增條件下用於qPCR (Phusion, SYBR Green)：(98℃ 2m，40X[98℃ 10s，67℃ 30s，92℃ 15 s])。將ATP7B表現標準化成GAPDH並使用δ-δ Ct方法提供為相對於基線之變化倍數。如圖 12 及表 7 中所闡釋，SEQ ID NO: 13在三個不同劑量下驅動ATP7B在肝中表現，且顯示與最高病毒劑量之劑量反應，從而引起最高ATP7B表現。

表 7 ：經轉染小鼠之肝中之 ATP7B 表現

實例7闡釋包含一或多個可操作連接至ATP7B轉基因之本文揭示之RE的表現盒可用於治療有需要之動物、哺乳動物或人類個體之與ATP7B缺乏相關之病症或病症(例如威爾森氏症)。此外，該等表現盒可使用rAAV8 (例如)經由靜脈內注射或輸注活體內全身性遞送。實例 8 肝中之高 EGFP 轉錄

向C57BL6/J小鼠靜脈內注射含有在以下各種RE控制下之EGFP的AAV8載體：SEQ ID NO: 4、13、14、15、16、17及27。每一AAV8載體係以5×10¹¹ gc/小鼠之劑量投與。病毒遞送後2週，收穫肝。破壞肝穿孔樣品並在補充有10ul /mL β-巰基乙醇之600 μl RLT中勻漿，並使用RNeasy Mini套組(Qiagen)根據製造商之方案(包括柱上DNA酶處理)提取RNA。對於每一樣品，使用OligoDT引子用Superscript IV (Invitrogen)使RNA (3ug)逆轉錄(65℃ 5m，55℃ 10m，85℃ 10m)。在以下擴增條件下使用針對EGFP (5’- GCTACCCCGACCACATGAAG -3’ (SEQ ID NO: 42)；5’- TCTTGTAGTTGCCGTCGTCC -3’ (SEQ ID NO: 43)及GAPDH (SEQ ID NO: 20及SEQ ID NO: 21)之引子進行qPCR (Phusion, SYBR Green)：(98 ℃ 2m，40X[98 ℃ 10s，65 ℃ 30s，92 ℃ 15s])。將EGFP表現標準化成GAPDH並使用δ-δ Ct方法提供為相對於基線之變化倍數(圖 13 )。如圖 13 中所圖解說明，所測試RE中之每一者增加肝中之EGFP表現，如藉由RNA轉錄本所量測。此外，SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 27及SEQ ID NO: 14產生相當之EGFP含量。

實例8闡釋本揭示內容之相對較短之RE可引起肝中高程度之轉基因表現，如藉由RNA轉錄本所量測。

儘管已在本文中顯示並闡述了本發明之較佳實施例，但熟習此項技術者將顯而易見，該等實施例僅作為實例來提供。熟習此項技術者現將在不背離本發明之情況下構想出多種變化、改變及取代。應瞭解，可在實踐本發明中採用本文所闡述之本發明實施例之各種替代。以下申請專利範圍意欲界定本發明範疇並由此覆蓋該等申請專利範圍及其等效形式範疇內之方法及結構。

參照以下編號之條款界定本揭示內容之各個實施例。 1. 一種包含可操作連接至治療性轉基因之調控元件的表現盒，其中該調控元件包含以下中之一或多者：(i) SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41；或(ii) 與(i)中之任一者具有至少80%、85%、90%或95%序列一致性之序列。 2. 如條款1之表現盒，其中該調控元件係非天然的。 3. 如條款1至2中任一條款之表現盒，其中該調控元件包含內含子序列。 4. 如條款1至3中任一條款之表現盒，其中該調控元件位於啟動子與該治療性轉基因之間。 5. 如條款1至2中任一條款之表現盒，其中該調控元件包含啟動子序列。 6. 如條款5之表現盒，其中該調控元件係該盒中之唯一啟動子。 7. 如條款1至6中任一條款之表現盒，其中該調控元件係相對較短的。 8. 如條款1至6中任一條款之表現盒，其中該調控元件不超過100bp。 9. 如條款1至8中任一條款之表現盒，其中該調控元件不超過60bp。 10. 如條款1至9中任一條款之表現盒，其中該調控元件不超過50bp。 11. 如條款1至10中任一條款之表現盒，其中該表現盒係rAAV之一部分。 12. 如條款11之表現盒，其中該rAAV係rAAV8。 13. 如條款1至10中任一條款之表現盒，其中該表現盒係腺病毒之一部分。 14. 如條款1至10中任一條款之表現盒，其中該表現盒係慢病毒之一部分。 15. 如條款1至14中任一條款之表現盒，其中該治療性轉基因大於1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、5.5kb、6kb、6.5kb、7kb或7.5kb。 16. 如條款1至14中任一條款之表現盒，其中該治療性轉基因係ATP7B或其變體或功能片段。 17. 如條款1至14中任一條款之表現盒，其中該治療性轉基因係ATP7A或其變體或功能片段。 18. 如條款1至14中任一條款之表現盒，其中該治療性轉基因係ATP8B1或其變體或功能片段。 19. 如條款1至14中任一條款之表現盒，其中該治療性轉基因係ABCB4或其變體或功能片段。 20. 如條款1至14中任一條款之表現盒，其中該治療性轉基因係ABCB11或其變體或功能片段。 21. 如條款1至14中任一條款之表現盒，其中該治療性轉基因係CDKL5或其變體或功能片段。 22. 如條款1至14中任一條款之表現盒，其中該治療性轉基因係CNTNAP2或其變體或功能片段。 23. 如條款1至14中任一條款之表現盒，其中該治療性轉基因係ZEB2或其變體或功能片段。 24. 如條款1至14中任一條款之表現盒，其中該治療性轉基因係因子V或其變體或功能片段。 25. 如條款1至14中任一條款之表現盒，其中該治療性轉基因係因子VIII或其變體或功能片段。 26. 如條款1至14中任一條款之表現盒，其中該治療性轉基因係因子IX或其變體或功能片段。 27. 如條款1至14中任一條款之表現盒，其中該治療性轉基因係因子X或其變體或功能片段。 28. 如條款1至14中任一條款之表現盒，其中該治療性轉基因係血液凝固因子。 29. 如條款28之表現盒，其中該血液凝固因子係因子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12或其變體或功能片段中之任一者。 30. 如條款1至14中任一條款之表現盒，其中該治療性轉基因係DNA結合蛋白。 31. 如條款30之表現盒，其中該DNA結合蛋白係內源基因之轉錄調節劑。 32. 如條款31之表現盒，其中該轉錄調節劑係轉錄活化劑。 33. 如條款32之表現盒，其中該內源基因在活體內低表現。 34. 如條款30至33中任一條款之表現盒，其中該內源基因與肝疾病或病症相關。 35. 如條款30至33中任一條款之表現盒，其中該內源基因與1型、2型或3型進行性家族性肝內膽汁淤積(PFIC)相關。 36. 如條款30至33中任一條款之表現盒，其中該內源基因與自閉症譜系障礙相關。 37. 如條款30至33中任一條款之表現盒，其中該內源基因與血友病相關。 38. 如條款29至32中任一條款之表現盒，其中該內源基因與威爾森氏症相關。 39. 如條款30至33中任一條款之表現盒，其中該內源基因與Menkes病或後角症候群相關。 40. 如條款30至33中任一條款之表現盒，其中該內源基因係CDKL5。 41. 如條款35之表現盒，其中該內源基因係ABCB11，其與2型進行性家族性肝內膽汁淤積(PFIC2)相關。 42. 如條款35之表現盒，其中該內源基因係ATP8B1，其與1型進行性家族性肝內膽汁淤積(PFIC1)相關。 43. 如條款35之表現盒，其中該內源基因係ABCB4，其與3型進行性家族性肝內膽汁淤積(PFIC3)相關。 44. 如條款36之表現盒，其中該內源基因係CNTNAP2，其與自閉症譜系障礙相關。 45. 如條款37之表現盒，其中該內源基因係因子VIII或其變體，其與血友病A相關。 46. 如條款37之表現盒，其中該內源基因係因子IX或其變體，其與血友病B相關。 47. 如條款37之表現盒，其中該內源基因係因子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12或其變體中之任一者。 48. 如條款38之表現盒，其中該內源基因係ATP7B或其變體，其與威爾森氏症相關。 49. 如條款39之表現盒，其中該內源基因係ATP7A或其變體，其與Menkes病或後角症候群相關。 50. 如條款1至14中任一條款之表現盒，其中該治療性轉基因係基因編輯蛋白。 51. 如條款50之表現盒，其中該基因編輯蛋白係Cas蛋白。 52. 如條款51之表現盒，其進一步包含將該Cas蛋白靶向包含內源基因之基因體基因座的嚮導RNA。 53. 如條款52之表現盒，其中該內源基因包含突變。 54. 如條款53之表現盒，其中該突變引起該內源基因之低表現。 55. 如條款51至54中任一條款之表現盒，其中該內源基因係ATP7A、ATP7B、ATP8B1、ABCB4、ABCB11、CDKL5、CNTNAP2、ZEB2或因子VIII或其變體。 56. 如條款51至54中任一條款之表現盒，其中該內源基因係因子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12或其變體。 57. 如條款1至56中任一條款之表現盒，其中與無該調控元件之表現盒相比，該調控元件使得該治療性轉基因表現增加至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍或至少1000倍。 58. 如條款57之表現盒，其中該增加之表現係藉由使用PCR分析自該治療性轉基因之RNA轉錄本的量測定。 59. 如條款57之表現盒，其中該增加之表現係藉由使用免疫分析自該治療性轉基因合成之蛋白質之含量測定。 60. 如條款30至56中任一條款之表現盒，其中與無該調控元件之表現盒相比，該調控元件使得該內源基因表現增加至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍或至少1000倍。 61. 如條款30至56中任一條款之表現盒，其中該調控元件以與健康個體中該內源基因之表現相當之程度引起增加之該內源基因表現。 62. 如條款60至61中任一條款之表現盒，其中該增加表現係藉由使用PCR分析自該內源基因之RNA轉錄本的量測定。 63. 如條款60至61中任一條款之表現盒，其中該增加之表現係藉由使用免疫分析自該內源基因合成之蛋白質之含量測定。 64. 一種治療威爾森氏症之方法，其包含投與根據條款1至16、30至34、38、48、50至55及57至63之表現盒。 65. 一種治療ATP7B之遺傳缺陷的方法，其包含投與根據條款1至16、30至34、38、48、50至55及57至63中任一條款之表現盒。 66. 一種血液凝固疾患之方法，其包含投與根據條款1至15、24至34、37、45至47及50至63中任一條款之表現盒。 67. 一種治療單一對偶基因不足或遺傳缺陷之方法，其包含投與根據條款1至66中任一條款之表現盒。 68. 如條款67之方法，其中該治療性轉基因或該內源基因係ATP7A、ATP7B、ATP8B1、ABCB4、ABCB11、CDKL5、CNTNAP2、ZEB2或因子VIII或其變體。 69. 如條款67之方法，其中該治療性轉基因或該內源基因係因子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12或其變體。 70. 如條款67或68之方法，其中該轉基因係ATP7B或其變體或功能片段。 71. 如條款67或68之方法，其中該轉基因係調節內源基因表現之轉錄調節劑。 72. 如條款71之方法，其中該內源基因係ATP7A、ATP7B、ATP8B1、ABCB4、ABCB11、CDKL5、CNTNAP2、ZEB2或因子VIII或其變體或功能片段。 73. 一種產生重組蛋白或生物製品之方法，其包含向細胞中引入根據條款1至63中任一條款之表現盒。 74. 一種AAV表現盒，其包含不超過120bp之可操作連接至至少3kb之轉基因的源於人類之調控元件，其中與該轉基因當可操作連接至CMV啟動子時之表現相比，該調控元件使得轉基因表現增加至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍或至少1000倍。 75. 一種AAV表現盒，其包含可操作連接至至少3kb之轉基因的相對較短之源於人類之調控元件，其中與無該調控元件之相當表現盒相比，該相對較短之調控元件使得轉基因表現增加至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍或至少1000倍。 76. 如條款74或75之AAV表現盒，其中該調控元件包含(i) SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41；(ii) 其組合；或(iii)或與(i)及(ii)中之任一者具有至少80%、85%、90%或95%序列一致性的序列。 77. 如條款74至76中任一條款之AAV表現盒，其中與該轉基因在可操作連接至CMV啟動子時之表現相比，該轉基因表現增加至少50倍。 78. 如條款77之AAV表現盒，其中該轉基因表現增加至少100倍。 79. 如條款74至78中任一條款之AAV表現盒，其中與可操作連接至該轉基因之CMV啟動子之經過分子大小標準化之表現活性相比，該調控元件展現至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍之經過分子大小標準化之表現活性。 80. 如條款74至79中任一條款之AAV表現盒，其中該增加之轉基因表現發生在至少2種細胞類型中。 81. 如條款80之AAV表現盒，其中該至少2種細胞類型係選自由以下組成之群：腎細胞、上皮細胞、神經元及肝細胞。 82. 如條款74至81中任一條款之AAV表現盒，其中該調控元件包含SEQ ID NO: 22-41中之任一或多者，且其中該表現盒中不存在其他啟動子序列。 83. 如條款74至82中任一條款之AAV表現盒，其中該調控元件包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2。 84. 如條款83之AAV表現盒，其中該調控元件位於啟動子下游。 85. 如條款74至84中任一條款之AAV表現盒，其中該調控元件位於該轉基因上游。 86. 如條款74至85中任一條款之AAV表現盒，其中該轉基因係ATP7A；ATP7B；ATP8B1；ABCB4；ABCB11；CDKL5；CNTNAP2；ZEB2；因子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12；或其變體或功能片段。 87. 如條款86之AAV表現盒，其中該轉基因係ATP7B或其變體或功能片段。 88. 如條款86之AAV表現盒，其中該轉基因係FVIII或其變體或功能片段。 89. 如條款74至85中任一條款之AAV表現盒，其中該轉基因係基因編輯蛋白。 90. 如條款89之AAV表現盒，其中該基因編輯蛋白係Cas。 91. 如條款74至85中任一條款之AAV表現盒，其中該轉基因係DNA結合蛋白。 92. 如條款91之AAV表現盒，其中該DNA結合蛋白係增加內源基因表現之轉錄活化劑。 93. 如條款91之AAV表現盒，其中該DNA結合蛋白係降低內源基因表現之轉錄抑制子。 94. 如條款92之AAV表現盒，其中該轉錄活化劑增加以下之表現：ATP7A；ATP7B；ATP8B1；ABCB4；ABCB11；CDKL5；CNTNAP2；ZEB2；或因子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12或其變體。 95. 如條款94之AAV表現盒，其中該轉錄活化劑增加內源ATP7A之表現。 96. 如條款94之AAV表現盒，其中該轉錄活化劑增加內源ATP7B之表現。 97. 如條款94之AAV表現盒，其中該轉錄活化劑增加內源ATP8B1之表現。 98. 如條款94之AAV表現盒，其中該轉錄活化劑增加內源ABCB4之表現。 99. 如條款94之AAV表現盒，其中該轉錄活化劑增加內源ABCB11之表現。 100. 如條款94之AAV表現盒，其中該轉錄活化劑增加內源FVIII之表現。 101. 如條款74至100中任一條款之AAV表現盒，其中該AAV係選自由以下組成之群：AAV1、AAV2、AAV3、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-DJ及scAAV。 102. 如條款101之AAV表現盒，其中該AAV係AAV8。 103. 一種產生重組蛋白之方法，該方法包含將編碼該蛋白質之序列與以下中之一或多者可操作地連接：(i) SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41；(ii) 其組合；或(iii) 與(i)及(ii)中之任一者具有至少80%、85%、90%或95%序列一致性的序列。 104. 如條款103之方法，其中編碼該蛋白質之該序列超過1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、5.5kb、6kb、6.5kb、7kb或7.5kb。 105. 一種治療肝疾病或病症之方法，其包含投與包含可操作連接至一或多個選自以下之調控元件之治療性轉基因的基因療法：(i) SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41；(ii) 其組合；或(iii) 與(i)及(ii)中之任一者具有至少80%、85%、90%或95%序列一致性的序列。 106. 如條款105之方法，其中該肝疾病或病症係威爾森氏症。 107. 如條款105之方法，其中該肝疾病或病症係血液凝固疾患。 108. 如條款105之方法，其中該轉基因係ATP7A或ATP7B或其變體或功能片段。 109. 如條款105之方法，其中該轉基因係因子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或其變體或功能片段。 110. 如條款109之方法，其中該轉基因係因子8或其變體或功能片段。 111. 如條款105至110中任一條款之方法，其中該等調控元件在至少2種細胞類型中造成轉基因表現增加。 112. 如條款150至110中任一條款之方法，其中該等調控元件在至少3種細胞類型中造成轉基因表現增加。 113. 如條款105至112中任一條款之方法，其中該等調控元件在肝細胞中造成轉基因表現增加。 114. 如條款105至113中任一條款之方法，其中與該轉基因在可操作連接至CMV啟動子時之表現相比，該等調控元件使得轉基因表現增加至少2倍之程度。 115. 如條款105至114中任一條款之方法，其中該基因療法利用AAV。 116. 如條款115之方法，其中該AAV係AAV8。 117. 如條款105至114中任一條款之方法，其中該基因療法利用腺病毒。 118. 如條款105至114中任一條款之方法，其中該基因療法利用慢病毒。 119. 一種表現載體，其包含：具有小於或等於100bp之可操作連接至轉基因之源於人類之調控元件，其中與無該調控元件之第二表現載體相比，該調控元件使該轉基因之總體表現增加至少2倍。 120. 如條款119之表現載體，其中該第二表現載體包含可操作連接至CMV啟動子之該轉基因。 121. 一種包含具有小於或等於100bp之可操作連接至轉基因之源於人類之調控元件的表現載體，其中該轉基因之表現高於由CMV啟動子、超級核心啟動子、TTR啟動子、Proto 1啟動子、UCL-HLP啟動子或CMVe啟動子表現之相同轉基因之表現。 122. 如條款121之表現載體，其中該轉基因之表現高於由UCL-HLP啟動子表現之相同轉基因之表現。 123. 一種包含可操作連接至轉基因之源於人類之調控元件的表現載體，其中由該轉基因編碼之蛋白質具有(i) ＞1.0 IU/mL之濃度，如藉由其組態在於檢測轉基因之ELISA分析所量測；或(ii) ＞ 25%活性，如藉由Coatest分析所量測。 124. 一種包含具有大小小於或等於100bp之可操作連接至轉基因之序列的源於人類之調控元件之載體，該轉基因在細胞中或活體內未發現與該調控元件相關。 125. 如條款119至124中任一條款之載體，其中該調控元件係內含子序列。 126. 如條款125之載體，其中該調控元件係SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2或與其具有至少80%、85%、90%或95%同源性之序列。 127. 如條款1至63、74至102及119至126中任一條款之表現載體或盒，其中使用螢光素酶作為該轉基因引起大於1×10⁸ 個光子/sec之總體表現，如整個小鼠中所量測。 128. 如條款127之表現載體或盒，其中該活性或轉基因表現對應於每隻小鼠16 μg表現載體之劑量。 129. 如條款127之表現載體或盒，其中該活性或轉基因表現對應於每隻小鼠12 μg表現載體之劑量。 130. 如條款1至63、74至102及119至129中任一條款之表現載體或盒，其中該轉基因之內源型式在活體內並不連接至該調控元件。 131. 如條款127之表現載體或盒，其中該轉基因之該總體表現程度大於使用具有選自由以下組成之群之調控元件的載體或盒之轉基因表現：CMV啟動子、CMVe啟動子、超級核心啟動子、TTR啟動子、Proto 1啟動子及UCL-HLP啟動子。 132. 如條款1至63、74至102及119至131中任一條款之表現載體或盒，其中表現在小鼠活體內至少3、4、5、6或7種不同細胞類型中可檢測。 133. 如條款132之表現載體或盒，其中該等不同細胞類型係選自由以下組成之群：肺泡細胞、心肌細胞、上皮細胞、肝細胞、腸細胞、肌細胞、神經元及腎細胞。 134. 如條款119至133中任一條款之表現載體或盒，其中該調控元件係增強子。 135. 如條款134之表現載體或盒，其進一步包含啟動子。 136. 如條款135之表現載體或盒，其中該啟動子係CMV啟動子、CMV、啟動子、超級核心啟動子、TTR啟動子、Proto 1啟動子、UCL-HLP啟動子、AAT啟動子、KAR啟動子、EFla啟動子、EFS啟動子或CMVe增強子/CMV啟動子組合。 137. 如條款119至136中任一條款之表現載體，其進一步包含一或多個轉錄後修飾位點。 138. 如條款119至138中任一條款之表現載體，其中該轉基因係Cas9。 139. 如條款138之表現載體，其中該轉基因係saCas9。 140. 一種包含可操作連接至調控序列之因子VIII轉基因的表現載體，該調控序列能夠驅動該因子VIII之表現至＞1.0 IU/mL之濃度，如藉由其組態在於檢測細胞中或活體內之因子VIII的ELISA分析所量測。 141. 如條款140之表現載體，其中該調控序列相對較短的。 142. 如條款140或141之表現載體，其中該調控序列包含SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41或其組合中之一或多者；或與其具有至少80%、85%、90%或95%序列一致性之序列。 143. 一種包含如條款119至142中任一條款之表現載體的病毒顆粒。 144. 如條款143之病毒顆粒，其中該病毒顆粒係AAV。 145. 如條款144之病毒顆粒，其中該AAV係選自由以下組成之群：AAV1、AAV2、AAV3、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV-DJ及scAAV。 146. 如條款143之病毒顆粒，其中該病毒顆粒係慢病毒。 147. 如條款143之病毒顆粒，其中該病毒顆粒係腺病毒。 148. 如條款119至147之表現載體，其中該轉基因係治療性轉基因。 149. 如條款148之表現載體，其中該治療性轉基因係因子VIII、Cas9、DNA結合蛋白、激素、生長或分化因子、胰島素、生長激素、VEGF、神經營養因子、纖維母細胞上皮因子；細胞介素、介白素、淋巴介質、腫瘤壞死因子、抗體、免疫球蛋白、干擾素、嵌合T細胞受體；脂蛋白受體、囊性纖維化跨膜調控因子、與I、II、III或IV型黏多醣貯積症相關之基因、β球蛋白或脂蛋白脂酶。 150. 如條款148之表現載體，其中該治療性轉基因係ATP7A、ATP7B、ATP8B1、ABCB4、ABCB11或其變體或功能片段。 151. 如條款148之表現載體，其中該治療性轉基因係CDKL5、CNTNAP2、ZEB2或其變體或功能片段。 152. 一種將轉基因遞送至動物中之複數種不同組織之方法，其包含向該動物投與如條款119至151中任一條款之表現載體。 153. 一種產生蛋白質、抗體或其他生物製品之方法，其包含使細胞與如條款119至151中任一條款之表現載體接觸。 154. 如條款153之方法，其中該細胞係CHO細胞或HEK293T細胞。 155. 一種產生轉基因動物或植物之方法，其包含向動物或植物投與如條款119至151中任一條款之表現載體。 156. 如條款119至151中任一條款之表現載體，其中該調控元件係40-50bp。 157. 如條款119至151中任一條款之表現載體，其中該調控元件係50-60bp。 158. 一種包含可操作連接至轉基因之源於人類之調控元件的表現載體，其中由該轉基因編碼之蛋白質具有(i) ＞0.1 IU/mL之濃度，如藉由其組態在於檢測轉基因之ELISA分析所量測；或(ii) ＞ 10%活性，如藉由Coatest分析所量測。 159. 一種包含具有小於或等於120bp之可操作連接至轉基因之源於人類之調控元件的表現載體，其中該轉基因之表現高於由UCL-HLP啟動子表現之相同轉基因之表現。 160. 如條款158至159中任一條款之表現載體，其中該調控元件係啟動子。 161. 如條款158至160中任一條款之表現載體，其中該治療性轉基因係包含DNA結合結構域及轉錄調控結構域之融合蛋白。 162. 一種包含可操作連接至治療性轉基因之相對較短之調控元件(RE)的表現盒。 163. 如條款162之表現盒，其中該相對較短之RE包含以下中之一或多者：(i) SEQ ID NO: 1-2、13-17及22-41；或(ii) 與(i)中之任一者具有至少80%、85%、90%或95%序列一致性之序列。 164. 如條款64至72及105至118中任一條款之方法，其中該投與係全身性的。 165. 如條款164之方法，其中該投與包含在個體中靜脈內注射或輸注。 166. 如條款165之方法，其中該個體係人類。 167. 如條款165之方法，其中該個體係動物。

本發明之新穎特徵具體闡述於隨附申請專利範圍中。參照陳述其中利用本發明原理之闡釋性實施例的下文詳細說明及附圖將會更好地瞭解本發明之特徵及優點，在附圖中：

圖 1A 圖解說明包含不同調控元件(例如SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2)之質體的正規化螢光素酶值，其展現RE對HEK293T細胞中螢光素酶之表現具有效應。舉例而言，SEQ ID NO: 3 (包含SEQ ID NO: 1，與最小CMV (minCMV)啟動子組合)驅動螢光素酶之表現程度比由單獨minCMV啟動子驅動之表現高約1.4倍，且比由SCP啟動子驅動之表現高約60倍。

圖 1B 圖解說明與HEK293T細胞中SCP、minCMV及CAG相比，每一調控元件(例如SEQ ID NO: 3及SEQ ID NO: 4)之經過分子大小標準化之活性(藉由將正規化螢光素酶活性除以調控元件之長度(以鹼基對表示)來計算)。SEQ ID NO: 4 (包含連接至minCMV啟動子之SEQ ID NO: 2)以比單獨minCMV啟動子高約3.5倍且比SCP啟動子高約140倍之程度引起經過分子大小標準化之活性。

圖 1C 圖解說明與陰性對照及陽性對照(SEQ ID NO: 4)相比，調控元件組合之SEQ ID NO: 17及22、組合之SEQ ID NO: 16及23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32及SEQ ID NO: 33的正規化螢光素酶表現。所有RE皆引起與由SEQ ID NO: 4驅動之表現程度相當之高螢光素酶表現程度。

圖 1D 圖解說明與HEK293T細胞中陰性對照、陽性對照(SEQ ID NO: 4)、CMV+CMVe及單獨CMV相比，調控元件SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 26或SEQ ID NO: 27之正規化螢光素酶表現。每一調控元件驅動比單獨CMV及CMV+CMVe高之螢光素酶表現。

圖 1E 圖解說明與HEK293T細胞中陰性對照相比，調控元件組合之SEQ ID NO: 17及22、組合之SEQ ID NO: 16及23、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40或SEQ ID NO: 41的正規化螢光素酶表現。每一測試調控元件驅動比陰性對照高之螢光素酶表現。

圖 2A 圖解說明在不同調控元件(SCP、SerpE_TTR、Proto1、minCMV、UCL-HLP、CMVe、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4)控制下投用包含螢光素酶之表現盒之小鼠中螢光素酶之表現。

圖 2B 圖解說明來自注射圖 2A 之表現盒之3隻小鼠中觀察到的螢光素酶表現之平均總發光(光子/sec)的量化。

圖 3A 圖解說明各種調控元件(UCL-HLP、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4)對小鼠中人類因子8 (FVIII)之表現的效應，如藉由酶聯免疫吸附分析所量測。包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID 4之表現盒產生升高含量之人類FVIII (IU/mL)。

圖 3B 圖解說明各種調控元件(UCL-HLP、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4)對小鼠中人類因子8 (FVIII)之表現的效應，如藉由Coatest分析所量測，該分析分析了人類FVIII之活性%。

圖 4A 圖解說明在具有含有Cas9酶、嚮導RNA及若干調控元件(minCMV、EFS或SEQ ID NO: 4)中之一者之單一AAV的小鼠腦之齒狀回中實施之基因編輯，以刪除在tdTomato (亦稱為紅色螢光蛋白(RFP))上游提供之末端序列。RFP係由淺灰色表示。與陰性對照、minCMV及EFS相比，包含SEQ ID NO: 4之表現盒產生導致RFP高表現之基因編輯。

圖 4B 圖解說明圖 4A 中表現RFP之細胞之平均數目的量化。

圖 5A 圖解說明用於使用包含本揭示內容之調控元件之rAAV表現盒處理FVIII剔除小鼠活體內血液凝固缺乏的基因療法之實例。將用3¹¹ 個基因體拷貝/kg (gc/kg)之劑量或3¹² gc/kg之劑量的PBS對照或包含本揭示內容之調控元件之rAAV處理的小鼠之血液損失(g)結果與未處理之未剔除小鼠進行比較。與對照(例如PBS對照小鼠)相比，用3¹² gc/kg之劑量之rAAV基因療法處理小鼠引起血液損失減少。

圖 5B 圖解說明直至凝固之小鼠之出血時間，以分鐘(min)表示。

圖 6A 圖解說明本揭示內容之實例性表現盒、載體或質體，其包含AAV ITR-L及ITR-R及一或多個可操作連接至轉基因之調控元件，例如增強子、啟動子、穩定元件及聚A信號。該rAAV載體可用於基因療法。

圖 6B 圖解說明表現盒之特寫鏡頭，其中調控元件SEQ ID NO: 1可操作連接至轉基因，且其中調控元件位於啟動子之下游及基因及多腺苷酸化信號之上游。

圖 6C 圖解說明表現盒，其中調控元件SEQ ID NO: 2可操作連接至轉基因，且其中調控元件位於啟動子之下游及基因及多腺苷酸化信號之上游。

圖 7 圖解說明本揭示內容之實例性表現盒、載體或質體，其包含AAV ITR-L及ITR-R及一或多個可操作連接至大的轉基因之本揭示內容之短的源於人類之調控元件(例如SEQ ID NO: 13-17及22-41)，其中轉基因之大小係至少3kb或3-5kb。該rAAV載體可用於基因療法治療。

圖 8 圖解說明與未處理之剔除小鼠及SEQ ID NO: 9 (UCL-HLP)相比，在用本揭示內容之各種表現盒(例如包含調控元件SEQ ID NO: 13-17中之任一者之表現盒)處理之小鼠中表現的人類FVIII (IU/mL)之濃度。

圖 9 圖解說明在用本揭示內容之各種表現盒處理之小鼠中人類FVIII的活性%，其中SEQ ID NO: 13-17係指調控元件。

圖 10 圖解說明利用經本揭示內容之各種表現盒處理之小鼠的血液損失實驗，以克(g)量測，其中SEQ ID NO: 13-17係指調控元件。

圖 11 圖解說明在用本揭示內容之各種表現盒處理之小鼠中直至凝固的出血時間，以分鐘(min.)表示，其中SEQ ID NO: 13-17係指調控元件。

圖 12 圖解說明在用包含具有SEQ ID NO: 13之序列之調控元件的表現盒處理之小鼠中ATP7B之相對表現(Log₂ )，劑量為1E10 (或10¹⁰ )個基因體拷貝/小鼠(gc/小鼠)、1E11 (或10¹¹ ) gc/小鼠或1E12 (或10¹² ) gc/小鼠。數據顯示包含SEQ ID NO: 13之表現盒與ATP7B之活體內表現正相關。

圖 13 圖解說明在用包含具有SEQ ID NO: 4、13、14、15、16、17或27之序列之調控元件的表現盒處理且以5E11 gc/小鼠之劑量投與之小鼠中EGFP (Log10)的相對表現。數據顯示RE在小鼠肝中活體內引起升高程度之EGFP表現，如藉由RNA轉錄本所量測。

<110> 美商編碼製藥公司(ENCODED THERAPEUTICS,INC.)

<120> 高活性調控元件

<130> 46482-707,601

<140> TW 107117128

<141> 2018-05-18

<150> US 62/508,968

<151> 2017-05-19

<160> 43

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成寡核苷酸

<400> 1

<210> 2

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成寡核苷酸

<400> 2

<210> 3

<211> 266

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列之說明：合成多核苷酸

<400> 3

<210> 4

<211> 259

Claims (21)

1. 一種包含可操作連接至轉基因之調控元件的表現盒，其中該轉基因之內源型式並不連接至該調控元件，且其中該調控元件包含與SEQ ID NOs：14、2、4、1、13、15-17及22-41中任一者至少90%一致性之序列。
2. 如請求項1之表現盒，其中該調控元件係非天然性。
3. 如請求項1之表現盒，其中該調控元件包含內含子序列。
4. 如請求項3之表現盒，其中該調控元件位於啟動子與該轉基因之間。
5. 如請求項1之表現盒，其中該調控元件包含啟動子序列。
6. 如請求項5之表現盒，其中該調控元件係該盒中之唯一啟動子。
7. 如請求項1之表現盒，其中該調控元件不超過120bp。
8. 如請求項1之表現盒，其中該調控元件包含SEQ ID NO：14或與其具有95%序列一致性之序列。
9. 如請求項8之表現盒，其中該調控元件包含SEQ ID NO：14。
10. 一種病毒顆粒，其包含如請求項1至9中任一項之表現盒。
11. 如請求項10之病毒顆粒，其中該病毒顆粒係重組腺相關病毒(rAAV)、重組慢病毒、重組腺病毒、或重組反轉錄病毒。
12. 如請求項11之病毒顆粒，其中該rAAV係rAAV1、rAAV2、rAAV3、rAAV3b、rAAV4、rAAV5、rAAV6、rAAV7、rAAV8、rAAV9、rAAV10、rAAV11、rAAV12、rAAV-DJ、或rscAAV。
13. 如請求項1至9中任一項之表現盒，其中該轉基因(i)係與單一對偶基因不足相關的基因，或遺傳缺陷，(ii)編碼激素、生長因子、分化因子、神經營養因子、細胞介素、介白素、淋巴介質、免疫球蛋白、嵌合T細胞受體、干擾素、DNA結合蛋白、基因編輯蛋白、轉錄活化劑、轉錄抑制子，或(iii)係前述轉基因中任一項之變體或功能片段。
14. 如請求項1至9中任一項之表現盒，其中該轉基因編碼治療性蛋白質。
15. 如請求項14之表現盒，其中該治療性蛋白質係(i)ATP7B、ATP7A、ATP8B1、ABCB4、ABCB11、CDKL5、CNTNAP2、ZEB2、因子1、因子2、因子3、因子4、因子5、因子6、因子7、因子8、因子9、因子10、因子11或因子12；或(ii)(i)中任一項之變體或功能片段。
16. 如請求項14之表現盒，其中該治療性轉基因編碼ATP7B或其變體或功能片段。
17. 如請求項14之表現盒，其中該治療性轉基因編碼因子8或其變體或功能片段。
18. 如請求項14之表現盒，其係用作藥劑。
19. 一種如請求項14至17中任一項之表現盒之用途，其係用於製備治療個體之單一對偶基因不足或遺傳缺陷之藥劑。
20. 一種如請求項16之表現盒之用途，其係用於製備治療個體之威爾森氏症(Wilson’s disease)之藥劑。
21. 一種如請求項17之表現盒之用途，其係用於製備治療個體之血液凝固疾患之藥劑。