CN110494168A - 肾病症和肝病症的人源化模型 - Google Patents

Abstract

本文提供的尤其是包含编码包含人序列的C3蛋白的核酸序列的非人动物，以及包含其全部或部分为人的C3基因的转基因非人动物，以及关于使用其筛选候选治疗分子以治疗补体相关性肾病的方法。本文还提供的是用于改善被诊断患有或被认为患有补体相关性肾病的个体中的肾功能的方法。

Description

肾病症和肝病症的人源化模型

相关专利申请的交叉引用

本专利申请要求于2017年2月27日提交的美国临时申请号62/464,262、于2017年7月7日提交的美国临时申请号62/529,916、以及于2017年11月9日提交的美国临时申请号62/583,780的优先权，所有所述美国临时申请的全部内容以引用的方式并入本文。

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6KB的命名为35469_10207US01_SequenceListing.txt、于2018年2月12日创建，并且经由EFS-Web提交给美国专利及商标局(United States Patent and Trademark)的ASCII文本文件中的序列表，以引用的方式并入本文。

技术领域

本文提供的尤其是关于使用遗传修饰的非人动物以筛选用于治疗补体相关性肾病和肝纤维化的候选治疗试剂或化合物的方法，所述非人动物包含其全部或部分为人的C3基因，以及用于治疗被诊断患有或被认为患有补体相关性肾病的个体的方法。

背景技术

补体蛋白C3是用于治疗各种人疾病、病症和状况的治疗靶。C3通过特异性C3转化酶的蛋白酶解切割在补体途径活化中起主要作用。C3转化酶生成C3b的形式，其依次又是新C3转化酶分子的潜在组分，从而刺激且扩增补体级联。

旁路补体途径的不希望的激活已提出作为肾病的可能原因，所述肾病例如非典型溶血尿毒综合征(aHUS)和C3肾小球病(C3G)，其是涵盖致密沉积物病(DDD)和C3肾小球肾炎(C3GN)的膜增生性肾小球肾炎形式。随着其进展，这些疾病危害且降低肾功能。由于肾小球膜缺乏内源性补体调节膜蛋白，其否则可以抑制补体途径活化，C3的连续和不受调节的切割发生在患有补体相关性肾病的个体中的该位点处，导致补体活化产物的沉积、C3转化酶介导的肾小球基底膜损伤、对上皮小管和内皮细胞的损伤、由于细胞外基质沉积的膜增厚、补体系统组分(例如，C3切割产物)的沉积、以及最终有缺陷的过滤(蛋白尿)和肾衰竭。

特异性靶向人C3蛋白用于治疗补体相关性肾病的候选治疗分子的药代动力学(PK)和药效学(PD)评估照常规在非人动物中执行，所述非人动物例如啮齿类动物，例如小鼠或老鼠。然而，此类治疗分子的PD不能在某些非人动物中适当地确定，因为这些治疗分子不靶向内源C3蛋白或基因。

相应地，需要其中非人动物的C3基因全部或部分人源化、或者替换(例如，在内源性非人基因座处)为包含编码人或人源化C3蛋白的序列的人C3基因的非人动物，例如啮齿类动物，例如鼠类动物，例如小鼠或大鼠。此类动物可以潜在地充当用于评价候选治疗剂用于治疗补体相关性肾病的功效的理想模型，所述肾病例如与由于肾中C3沉积的病理水平的旁路补体途径的过度活化相关的那些，特别是如果改造的非人动物显示出对应于人疾病中观察到的那些的这些状况的症状。

说明书自始至终，提及了各种专利、专利申请和其它类型的出版物(例如，期刊论文、电子数据库条目等)。本文引用的所有专利、专利申请和其它出版物的公开内容出于所有目的以引用的方式在此整体并入。

发明内容

本文提供的尤其是关于使用遗传修饰的非人动物以筛选或鉴定用于治疗补体相关性肾病和/或肝纤维化的候选治疗化合物或试剂的方法，所述非人动物包含其全部或部分为人的C3基因，并且显示出对应于患有补体相关性肾病和/或肝纤维化的人中观察到的那些的一种或多种症状。本文还提供的是用于改善被诊断患有或被认为患有补体相关性肾病的个体中的肾功能的方法。

相应地，在一些方面，本文提供的是用于评价用于在补体相关性肾病的治疗中使用的试剂的体内治疗功效的方法，所述方法包括：(a)将所述试剂施用于啮齿类动物，其基因组包含在包含C3基因的外显子的啮齿类动物基因序列的内源性啮齿类动物C3基因座处由包含人C3基因的至少一个外显子的核酸序列的替换，以形成经修饰的C3基因，其中所述经修饰的C3基因的表达处于在内源性啮齿类动物C3基因座处的啮齿类动物调节元件的控制下；并且(b)与未施用所述试剂的对照啮齿类动物相比，评价所述试剂是否抑制(例如，预防、改善或缓解)肾病的一种或多种症状。在一些实施例中，啮齿类动物是小鼠或大鼠。在一些实施例中，包含人C3基因的至少一个外显子的核酸序列包含人C3基因的外显子1到外显子41。在一些实施例中，包含人C3基因的至少一个外显子的核酸序列包含人C3基因的外显子2到外显子41。在一些实施例中，啮齿类动物是不能表达小鼠C3蛋白的小鼠。在一些实施例中，啮齿类动物是表达由内源性小鼠C5基因编码的小鼠C5蛋白的小鼠。在一些实施例中，所述试剂选自小分子化学化合物、肽和抗体。在一些实施例中，所述试剂是抗体。在一些实施例中，所述试剂是单克隆抗体或其功能性结合片段。在一些实施例中，所述试剂是抑制性核酸。在一些实施例中，抑制性核酸选自siRNA、shRNA、适体、反义寡核苷酸、三链体形成寡核苷酸和核酶。在一些实施例中，肾病的一种或多种症状包括自发性死亡。在一些实施例中，肾病的一种或多种症状包括重量降低、骨密度降低、体脂降低或其组合。在一些实施例中，肾病的一种或多种症状选自肾小球肾炎、嗜碱性小管、硬化肾小球、具有蛋白管型的扩张小管、系膜基质扩张、肾小球肥大和单核间质炎症中的一种或多种。在一些实施例中，肾病的一种或多种症状包括肾中的C3蛋白沉积。在一些实施例中，肾病的一种或多种症状包括肾中的C5b-9膜攻击复合物形成。在一些实施例中，肾病的一种或多种症状包括升高的血尿素氮(BUN)、血清脂肪酶、血清胱抑素C或血清非高密度脂蛋白中的一种或多种。在一些实施例中，C3肾小球病的一种或多种症状包括增加的尿白蛋白或尿C5a。在一些实施例中，补体相关性肾病的一种或多种症状通过确定一种或多种疾病标记基因的表达来评价，所述疾病标记基因即，与没有补体相关性肾病的野生型啮齿类动物相比，在患有补体相关性肾病的啮齿类动物中差异表达的基因。

在另一个方面，本文还提供的是用于评价用于在肝纤维化的治疗中使用的试剂的体内治疗功效的方法，所述方法包括：(a)将所述试剂施用于啮齿类动物，其基因组包含在包含C3基因的外显子的啮齿类动物基因序列的内源性啮齿类动物C3基因座处由包含人C3基因的至少一个外显子的核酸序列的替换，以形成经修饰的C3基因，其中所述经修饰的C3基因的表达处于在内源性啮齿类动物C3基因座处的啮齿类动物调节元件的控制下；并且(b)与未施用所述试剂的对照啮齿类动物相比，评价所述试剂是否抑制(例如，预防、改善或缓解)肝纤维化的一种或多种症状。在一些实施例中，啮齿类动物是小鼠或大鼠。在一些实施例中，包含人C3基因的至少一个外显子的核酸序列包含人C3基因的外显子1到外显子41。在一些实施例中，包含人C3基因的至少一个外显子的核酸序列包含人C3基因的外显子2到外显子41。在一些实施例中，啮齿类动物是不能表达小鼠C3蛋白的小鼠。在一些实施例中，啮齿类动物是表达由内源性小鼠C5基因编码的小鼠C5蛋白的小鼠。在一些实施例中，所述试剂选自小分子化学化合物、肽和抗体。在一些实施例中，所述试剂是抗体。在一些实施例中，所述试剂是单克隆抗体或其功能性结合片段。在一些实施例中，所述试剂是抑制性核酸。在一些实施例中，抑制性核酸选自siRNA、shRNA、适体、反义寡核苷酸、三链体形成寡核苷酸和核酶。在一些实施例中，肝纤维化的一种或多种症状包括升高的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)或碱性磷酸酶(ALP)中的一种或多种。在一些实施例中，肝纤维化的一种或多种症状通过确定一种或多种疾病标记基因的表达来评价，所述疾病标记基因即，与没有肝纤维化的野生型啮齿类动物相比，在患有肝纤维化的啮齿类动物中差异表达的基因。

在进一步的方面，本文提供的是用于鉴定抑制啮齿类动物中的补体相关性肾病症状的试剂的方法，所述啮齿类动物的基因组包含在包含C3基因的外显子的啮齿类动物基因序列的内源性啮齿类动物C3基因座处由包含人C3基因的至少一个外显子的核酸序列的替换，以形成经修饰的C3基因，其中所述经修饰的C3基因的表达处于在内源性啮齿类动物C3基因座处的啮齿类动物调节元件的控制下，所述方法包括：(a)将所述试剂施用于啮齿类动物；以及(b)如果所述试剂抑制啮齿类动物中的补体相关性肾病的一种或多种症状，则将所述试剂鉴定为抑制补体相关性肾病症状的试剂。在一些实施例中，啮齿类动物是小鼠或大鼠。在一些实施例中，包含人C3基因的至少一个外显子的核酸序列包含人C3基因的外显子1到外显子41。在一些实施例中，包含人C3基因的至少一个外显子的核酸序列包含人C3基因的外显子2到外显子41。在一些实施例中，啮齿类动物是不能表达小鼠C3蛋白的小鼠。在一些实施例中，啮齿类动物是表达由内源性小鼠C5基因编码的小鼠C5蛋白的小鼠。在一些实施例中，所述试剂选自小分子化学化合物、肽和抗体。在一些实施例中，所述试剂是抗体。在一些实施例中，所述试剂是单克隆抗体或其功能性结合片段。在一些实施例中，所述试剂是抑制性核酸。在一些实施例中，抑制性核酸选自siRNA、shRNA、适体、反义寡核苷酸、三链体形成寡核苷酸和核酶。在一些实施例中，肾病的一种或多种症状包括自发性死亡。在一些实施例中，肾病的一种或多种症状包括重量降低、骨密度降低、体脂降低或其组合。在一些实施例中，肾病的一种或多种症状选自肾小球肾炎、嗜碱性小管、硬化肾小球、具有蛋白管型的扩张小管、系膜基质扩张、肾小球肥大和单核间质炎症中的一种或多种。在一些实施例中，肾病的一种或多种症状包括肾中的C3蛋白沉积。在一些实施例中，肾病的一种或多种症状包括肾中的C5b-9膜攻击复合物形成。在一些实施例中，肾病的一种或多种症状包括升高的血尿素氮(BUN)、血清脂肪酶、血清胱抑素C或血清非高密度脂蛋白中的一种或多种。在一些实施例中，C3肾小球病的一种或多种症状包括增加的尿白蛋白或尿C5a。在一些实施例中，补体相关性肾病的一种或多种症状通过确定一种或多种疾病标记基因的表达来评价。

在另外其它方面，本文还提供的是人补体相关性肾病的啮齿类动物模型，其中所述啮齿类动物的基因组包含在内源性C3基因座处的经修饰的C3基因，其中所述经修饰的C3基因包括包含人C3基因的至少一个外显子的核酸序列，并且其中所述经修饰的C3基因的表达处于在内源性啮齿类动物C3基因座处的啮齿类动物调节元件的控制下。在一些实施例中，核酸序列与在啮齿类动物C3基因座处的内源性啮齿类动物C3启动子可操作地连接。在一些实施例中，啮齿类动物是小鼠或大鼠。在一些实施例中，包含人C3基因的至少一个外显子的核酸序列包含人C3基因的外显子1到外显子41。在一些实施例中，包含人C3基因的至少一个外显子的核酸序列包含人C3基因的外显子2到外显子41。在一些实施例中，啮齿类动物是不能表达小鼠C3蛋白的小鼠。在一些实施例中，啮齿类动物是表达由内源性小鼠C5基因编码的小鼠C5蛋白的小鼠。在一些实施例中，啮齿类动物显示出选自以下的人补体相关性肾病的一种或多种症状：自发性死亡、重量降低、骨密度降低、体脂降低、肾小球肾炎、嗜碱性小管、硬化肾小球、具有蛋白管型的扩张小管、系膜基质扩张、肾小球肥大、单核间质炎症、肾中的C3蛋白沉积、肾中的C5b-9膜攻击复合物形成、血尿素氮(BUN)升高、血清脂肪酶升高、血清胱抑素C升高、血清非高密度脂蛋白升高、尿白蛋白增加、尿C5a增加和疾病基因标记。

在另一个方面，本文提供的是用于评价候选治疗试剂用于抑制补体相关性肾病症状的治疗有效性的啮齿类动物模型，其包括(a)啮齿类动物，其基因组包含在包含C3基因的外显子的啮齿类动物基因序列的内源性啮齿类动物C3基因座处由包含人C3基因的至少一个外显子的核酸序列的替换，以形成经修饰的C3基因，其中所述经修饰的C3基因的表达处于在内源性啮齿类动物C3基因座处的啮齿类动物调节元件的控制下，其中所述啮齿类动物显示出补体相关性肾病的一种或多种症状；以及(b)一种或多种候选治疗试剂。在一些实施例中，啮齿类动物是小鼠或大鼠。在一些实施例中，包含人C3基因的至少一个外显子的核酸序列包含人C3基因的外显子1到外显子41。在一些实施例中，包含人C3基因的至少一个外显子的核酸序列包含人C3基因的外显子2到外显子41。在一些实施例中，啮齿类动物是不能表达小鼠C3蛋白的小鼠。在一些实施例中，啮齿类动物是表达由内源性小鼠C5基因编码的小鼠C5蛋白的小鼠。在一些实施例中，所述试剂选自小分子化学化合物、肽和抗体。在一些实施例中，所述试剂是抗体。在一些实施例中，所述试剂是单克隆抗体或其功能性结合片段。在一些实施例中，所述试剂是抑制性核酸。在一些实施例中，抑制性核酸选自siRNA、shRNA、适体、反义寡核苷酸、三链体形成寡核苷酸和核酶。在一些实施例中，肾病的一种或多种症状包括自发性死亡。在一些实施例中，肾病的一种或多种症状包括重量降低、骨密度降低、体脂降低或其组合。在一些实施例中，肾病的一种或多种症状选自肾小球肾炎、嗜碱性小管、硬化肾小球、具有蛋白管型的扩张小管、系膜基质扩张、肾小球肥大和单核间质炎症中的一种或多种。在一些实施例中，肾病的一种或多种症状包括肾中的C3蛋白沉积。在一些实施例中，肾病的一种或多种症状包括肾中的C5b-9膜攻击复合物形成。在一些实施例中，肾病的一种或多种症状包括升高的血尿素氮(BUN)、血清脂肪酶、血清胱抑素C或血清非高密度脂蛋白中的一种或多种。在一些实施例中，C3肾小球病的一种或多种症状是增加的尿白蛋白或尿C5a。在一些实施例中，补体相关性肾病的一种或多种症状通过确定一种或多种疾病标记基因的表达来评价。

在进一步的方面，本文提供的是用于鉴定抑制啮齿类动物中的肝纤维化的试剂的方法，所述啮齿类动物的基因组包含在包含C3基因的外显子的啮齿类动物基因序列的内源性啮齿类动物C3基因座处由包含人C3基因的至少一个外显子的核酸序列的替换，以形成经修饰的C3基因，其中所述经修饰的C3基因的表达处于在内源性啮齿类动物C3基因座处的啮齿类动物调节元件的控制下，所述方法包括：(a)将所述试剂施用于啮齿类动物；以及(b)如果所述试剂抑制啮齿类动物中的肝纤维化的一种或多种症状，则将所述试剂鉴定为抑制肝纤维化的试剂。在一些实施例中，啮齿类动物是小鼠或大鼠。在一些实施例中，包含人C3基因的至少一个外显子的核酸序列包含人C3基因的外显子1到外显子41。在一些实施例中，编码人C3蛋白的人C3基因包含人C3基因的外显子2到外显子41。在一些实施例中，啮齿类动物是不能表达小鼠C3蛋白的小鼠。在本文公开的任何实施例的一些实施例中，啮齿类动物是表达由内源性小鼠C5基因编码的小鼠C5蛋白的小鼠。在一些实施例中，所述试剂选自小分子化学化合物、肽和抗体。在一些实施例中，所述试剂是抗体。在一些实施例中，所述试剂是单克隆抗体或其功能性结合片段。在一些实施例中，所述试剂是抑制性核酸。在一些实施例中，抑制性核酸选自siRNA、shRNA、适体、反义寡核苷酸、三链体形成寡核苷酸和核酶。在一些实施例中，肝纤维化的一种或多种症状是升高的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)或碱性磷酸酶(ALP)中的一种或多种。在一些实施例中，肝纤维化的一种或多种症状通过确定一种或多种疾病标记基因的表达来评价。

在另一个方面，本文提供的是人肝纤维化的啮齿类动物模型，其中所述啮齿类动物的基因组包含在内源性C3基因座处的经修饰的C3基因，其中所述经修饰的C3基因包括包含人C3基因的至少一个外显子的核酸序列，并且其中所述经修饰的C3基因的表达处于在内源性啮齿类动物C3基因座处的啮齿类动物调节元件的控制下。在一些实施例中，核酸序列与在啮齿类动物C3基因座处的内源性小鼠C3启动子可操作地连接。在一些实施例中，核酸序列与在啮齿类动物C3基因座处的内源性啮齿类动物C3启动子可操作地连接。在一些实施例中，啮齿类动物是小鼠或大鼠。在一些实施例中，包含人C3基因的至少一个外显子的核酸序列包含人C3基因的外显子1到外显子41。在一些实施例中，包含人C3基因的至少一个外显子的核酸序列包含人C3基因的外显子2到外显子41。在一些实施例中，啮齿类动物是不能表达小鼠C3蛋白的小鼠。在一些实施例中，啮齿类动物是表达由内源性小鼠C5基因编码的小鼠C5蛋白的小鼠。在一些实施例中，啮齿类动物显示出选自以下的肝纤维化的一种或多种症状：丙氨酸氨基转移酶(ALT)升高、天冬氨酸氨基转移酶(AST)升高和碱性磷酸酶(ALP)升高。在一些实施例中，肝纤维化的一种或多种症状通过确定一种或多种疾病标记基因的表达来评价。

在另外的方面，本文提供的是用于评价候选治疗试剂用于抑制肝纤维化症状的治疗有效性的啮齿类动物模型，其包括(a)啮齿类动物，其基因组包含在包含C3基因的外显子的啮齿类动物基因序列的内源性啮齿类动物C3基因座处由包含人C3基因的至少一个外显子的核酸序列的替换，以形成经修饰的C3基因，其中所述经修饰的C3基因的表达处于在内源性啮齿类动物C3基因座处的啮齿类动物调节元件的控制下，其中所述啮齿类动物显示出肝纤维化的一种或多种症状；以及(b)一种或多种候选治疗试剂。在一些实施例中，啮齿类动物是小鼠或大鼠。在一些实施例中，包含人C3基因的至少一个外显子的核酸序列包含人C3基因的外显子1到外显子41。在一些实施例中，包含编码人C3蛋白的人C3基因的至少一个外显子的核酸序列包含人C3基因的外显子2到外显子41。在一些实施例中，啮齿类动物是不能表达小鼠C3蛋白的小鼠。在一些实施例中，啮齿类动物是表达由内源性小鼠C5基因编码的小鼠C5蛋白的小鼠。在一些实施例中，所述试剂选自小分子化学化合物、肽和抗体。在一些实施例中，所述试剂是抗体。在一些实施例中，所述试剂是单克隆抗体或其功能性结合片段。在一些实施例中，所述试剂是抑制性核酸。在一些实施例中，抑制性核酸选自siRNA、shRNA、适体、反义寡核苷酸、三链体形成寡核苷酸和核酶。在一些实施例中，肝纤维化的一种或多种症状包括升高的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)或碱性磷酸酶(ALP)中的一种或多种。在一些实施例中，肝纤维化的一种或多种症状通过确定一种或多种疾病标记基因的表达来评价。

在进一步的方面，本文提供的是用于治疗被诊断患有或被认为患有补体相关性肾病或肝纤维化的个体的方法，其包括向个体施用临床有效量的治疗剂。施用于个体的治疗剂包括例如抑制C5的表达或活性的试剂、抑制C3的表达或活性的试剂、以及抑制C3蛋白酶解切割产物(C3a或C3b)的活性的试剂。施用改善肾或肝功能，并且改善补体相关性肾病或肝纤维化的一种或多种症状。

在一些实施例中，本文提供的是用于改善被诊断患有或被认为患有补体相关性肾病的个体中的肾功能的方法，其包括施用临床有效量的治疗剂，其中相对于未施用治疗剂的被诊断患有补体相关性肾病的个体，所述施用改善肾功能。在一些实施例中，改善的肾功能包括降低的血尿素氮(BUN)浓度、降低的血清胱抑素C浓度和/或降低的尿C5a浓度中的一种或多种。在一些实施例中，施用抑制C5的表达或活性的治疗剂，并且BUN在个体中降低约10-50％。在一些实施例中，施用抑制C5的表达或活性的治疗剂，并且血清胱抑素C浓度在个体中降低约10-60％。在一些实施例中，施用抑制C5的表达或活性的治疗剂，并且尿C5a浓度在个体中降低约40-85％。

在其它实施例中，本文提供的是用于降低被诊断患有或被认为患有补体相关性肾病的个体中的肾小球膜攻击复合物(MAC)形成的方法，其包括施用临床有效量的治疗剂，其中相对于未施用治疗剂的被诊断患有补体相关性肾病的个体，所述施用降低肾小球MAC形成。在一些实施例中，施用抑制C5的表达或活性的治疗剂，并且MAC形成在个体中降低约5-20％。在本文公开的任何实施例的一些实施例中，MAC形成通过个体的肾小球簇中的C9沉积来确定。

在另外其它实施例中，本文提供的是用于降低免疫细胞浸润到被诊断患有或被认为患有补体相关性肾病的个体的肾的肾小球或间质内的方法，其包括施用临床有效量的治疗剂，其中相对于未施用治疗剂的被诊断患有补体相关性肾病的个体，所述施用降低个体的肾中的免疫细胞浸润。在一些实施例中，免疫细胞是浸润肾小球的嗜中性粒细胞。在一些实施例中，施用抑制C5的表达或活性的治疗剂，并且肾小球的嗜中性粒细胞浸润降低约50-100％。在一些实施例中，免疫细胞是浸润间质的巨噬细胞。在一些实施例中，施用抑制C5的表达或活性的治疗剂，并且间质的巨噬细胞浸润降低约30-70％。

在一些实施例中，本文提供的是用于降低被诊断患有或被认为患有补体相关性肾病的个体的肾中的肾小球大小和/或系膜基质扩张的方法，其包括施用临床有效量的治疗剂，其中相对于未施用治疗剂的被诊断患有补体相关性肾病的个体，所述施用降低个体的肾中的肾小球大小和/或系膜基质扩张。在一些实施例中，施用抑制C5的表达或活性的治疗剂，并且肾小球大小和/或系膜基质扩张降低约15-30％。

在本文公开的任何实施例的一些实施例中，补体相关性肾病是非典型溶血尿毒综合征(aHUS)或C3肾小球病(C3G)。在一些实施例中，C3G包含致密沉积物病(DDD)或C3肾小球肾炎(C3GN)。

在本文公开的任何实施例的一些实施例中，治疗剂(例如，抑制C5的表达或活性的试剂、抑制C3的表达或活性的试剂、或者抑制C3a或C3b的活性的试剂)是抗体、抑制性核酸、非抗体结合多肽、或小分子化学化合物中的一种或多种。在一些实施例中，抑制性核酸选自反义寡核苷酸、siRNA、微小RNA(miR)或核酶。在一些实施例中，治疗剂是抗体或其功能片段。在一些实施例中，抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施例中，抗体选自人抗体、人源化抗体、骆驼科化抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv(sdFv)、Fab片段和F(ab')片段。在一些实施例中，个体施用约50mg/kg的抗体(例如，抗C5抗体或抗C3b抗体)。在一些实施例中，个体每周施用抗体三次。在一些实施例中，个体施用抗体(例如，抗C5抗体或抗C3b抗体)约9周。

在进一步方面，本文公开的是用于在补体相关性肾病或肝纤维化的治疗中使用的治疗剂。治疗剂包括例如抑制C5的表达或活性的试剂、抑制C3的表达或活性的试剂、以及抑制C3蛋白酶解切割产物(C3a或C3b)的活性的试剂。在一些实施例中，治疗剂是抗C5抗体。在一些实施例中，治疗剂是抗C3b抗体。在一些实施例中，与不使用治疗剂的治疗相比，治疗剂在治疗中的使用改善肾功能(例如，如通过血尿素氮(BUN)浓度降低、血清胱抑素C浓度降低和/或尿C5a浓度降低或其组合来证明的)。在一些实施例中，与不使用治疗剂的治疗相比，治疗剂在治疗中的使用降低肾小球MAC形成。在一些实施例中，与不使用治疗剂的治疗相比，治疗剂在治疗中的使用降低肾中的免疫细胞浸润。在一些实施例中，与不使用治疗剂的治疗相比，治疗剂在治疗中的使用降低肾中的肾小球大小和/或系膜基质扩张。

附图说明

本专利或申请文件包含至少一个用彩色表现的附图。根据请求并支付必要的费用后，专利局将提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。

图1A提供了小鼠(mC3)和人源化(hC3)C3基因组基因座的未按比例的图示。跨越5'调节元件和外显子1到外显子41的编码区的小鼠C3基因被缺失，并且替换为人C3基因的5'调节元件和外显子1到外显子41的编码区以及loxP位点，如分别由粗线和箭头指示的。图1B提供了小鼠(mC3)和人源化(hC3)C3基因组基因座的未按比例的图示。跨越内含子1的一部分和外显子2到外显子41的编码区的小鼠C3基因被缺失，并且替换为人C3基因的内含子1的一部分和外显子2到外显子41的编码区以及loxP位点，如分别由粗线和箭头指示的。

图2A和图2B是描绘对于鼠C3(图2A)或鼠C3a(图2B)执行的，源自MAID 6156和MAID6149纯合小鼠的血清和血浆的ELISA分析结果的图。圆圈代表6149或6156野生型(WT)对照；方块代表MAID 6156和MAID 6149纯合小鼠(HO)，菱形代表C3敲除(无效)动物；并且三角形代表正常人血浆(NHP)或正常人血清(NHS)。ND＝未检测。

图3A和图3B是描绘对于人C3(图3A)或人C3a(图3B)执行的，源自MAID 6156和MAID6149纯合小鼠的血清和血浆的ELISA分析结果的图。圆圈代表6149或6156野生型(WT)对照；方块代表MAID 6156和MAID 6149纯合小鼠(HO)，菱形代表C3敲除动物；并且三角形代表正常人血浆(NHP)或正常人血清(NHS)。ND＝未检测。

图4是描绘对于小鼠血清淀粉样蛋白A蛋白(mSAA)执行的，源自MAID 6156和MAID6149纯合小鼠的血清和血浆的ELISA分析结果的图。圆圈代表6149或6156野生型(WT)对照；方块代表MAID 6156和MAID 6149纯合小鼠(HO)，菱形代表来自C3敲除动物的血浆。

图5描绘了对源自MAID 6149(图5A)和MAID 6156纯合小鼠(图5B)的血清执行的蛋白质印迹。本研究中使用的抗人C3抗体与小鼠C3交叉反应。

图6描绘了MAID 6149(左)和MAID 6156纯合小鼠(右)的F2、F3和F4代随着时间过去的存活曲线。

图7描绘了显示MAID 6149(左)和MAID 6156(右)纯合(HO)和野生型(WT)小鼠随着时间过去的重量减轻/增加的图。

图8A和图8B描绘了显示对野生型(WT)与MAID 6149(图8A)和MAID 6156(图8B)纯合(HO)小鼠进行的体脂分析结果的图。

图9A和图9B描绘了显示对野生型(WT)与MAID 6149(图9A)和MAID 6156(图9B)纯合(HO)小鼠进行的骨密度和骨矿物质含量分析结果的图。

图10A描绘了从正常小鼠获得的苏木精和曙红(H&E)染色的肾组织的横截面。图10B描绘了从MAID 6156纯合(HO)小鼠获得的H&E染色的肾组织。

图11A描绘了从野生型(WT)和纯合的人源化的C3小鼠(huC3)MAID 6149小鼠获得的高碘酸-希夫(PAS)染色的肾组织的横截面。图像代表切片的平均病理学。箭头指向硬化肾小球的例子。图11B描绘了显示与野生型(C3wt)小鼠相比，人源化的C3小鼠(huC3)小鼠的肾中的系膜基质扩张的定量的图。增加的肾小球簇区域指示肾小球肥大。肾小球中PAS染色区域的增加指示系膜基质扩张。

图12描绘了显示关于野生型(WT)与MAID 6149和MAID 6156纯合(HO)小鼠之间的钠、钾、氯化物、钙、葡萄糖、总蛋白、肌酸酐、肌酸激酶、白蛋白、淀粉酶、总胆红素、镁、无机磷酸盐、尿酸、磷、非酯化脂肪酸、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)水平的血清化学实验对象组分析结果的图。

图13A描绘了显示关于野生型(WT)与MAID 6149和MAID 6156纯合(HO)小鼠之间的血尿素氮、非高密度脂蛋白(非HDL)和脂肪酶水平的血清化学实验对象组分析结果的图。图13B描绘了显示关于野生型(WT)与MAID 6149和MAID 6156纯合(HO)小鼠之间的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、ALT/AST比率和碱性磷酸酶(ALP)水平的肝酶分析结果的图。

图14A描绘了显示关于野生型(WT)和人源化C3(huC3)MAID 6149小鼠中的白蛋白的尿实验对象组分析结果的图。图14B描绘了野生型(WT)和人源化C3(huC3)小鼠中的血清BUN和胱抑素C的分析。

图15A描绘了免疫荧光显微照片，其显示了从对于人C3蛋白染色的野生型(WT)和纯合(HO)的人源化C3 MAID 6149小鼠获得的肾组织的横截面。图15B描绘了免疫荧光显微照片，其显示了从对于C5b-9膜攻击复合物(红色)染色的野生型(WT)和人源化C3(huC3)小鼠获得的肾组织的横截面。DNA用DAPI染成蓝色。图15C描绘了从野生型(WT)和人源化C3(huC3)MAID 6149小鼠获得的尿C5a水平。

图16描绘了显示MAID 6149和MAID 6156纯合(HO)小鼠中的RNA表达中的器官特异性总体变化的条形图。

图17描绘了基因标记图和表，其显示了MAID 6149和MAID 6156纯合(HO)小鼠相对于野生型(WT)配对物的肝中的RNA标记中的重叠。

图18描绘了显示MAID 6149和MAID 6156纯合小鼠的肝中的顶部富集的基因表达途径的表。

图19描绘了显示MAID 6156纯合小鼠的肝中上调(以黄色突出显示)或下调(以蓝色突出显示)的纤维化基因标记的表。并未达到统计显著性的变化已由"-"鉴定。

图20描绘了基因标记图和表，其显示了MAID 6149和MAID 6156纯合(HO)小鼠相对于野生型(WT)配对物的肾中的RNA标记中的重叠。

图21A描绘了显示与野生型(WT)小鼠相比，MAID 6149人源化C3(huC3)小鼠中的肾特异性基因表达变化的条形图。图21B描绘了与野生型(WT)小鼠相比，人源化C3(huC3)小鼠中的肾毒性基因表达变化。图21C描绘了与野生型(WT)小鼠相比，人源化C3(huC3)小鼠中的细胞外基质基因表达变化。图21D描绘了与野生型(WT)小鼠相比，人源化C3(huC3)小鼠中的细胞因子基因表达变化。图21E描绘了与野生型(WT)小鼠相比，人源化C3(huC3)小鼠中的趋化因子基因表达变化。在图21B-21E中，具有黄色突出显示的数目代表更新的表达；具有蓝色突出显示的数目代表下调表达；并且留空的细胞代表并未达到统计显著性的变化。

图22描绘了用同种型对照(WT+Ctl Ab)处理的野生型小鼠、以及用同种型对照(HumIn C3+Ctl Ab)或抗C5抗体M1M17628N(HumIn C3+M1M17628N)处理的C3人源化MAID6149小鼠的存活曲线。

图23描绘了用同种型对照(WT+Ctl Ab)处理的野生型小鼠、以及用同种型对照(HumIn C3+Ctl Ab)或抗C5抗体M1M17628N(HumIn C3+M1M17628N)处理的C3人源化MAID6149小鼠的体重图。

图24A和图24B描绘了在用同种型对照(WT+Ctl Ab)处理的野生型小鼠、以及用同种型对照(HumIn C3+Ctl Ab)或抗C5抗体M1M17628N(HumIn C3+M1M17628N)处理的C3人源化MAID 6149小鼠中的肾功能标记物的水平。图24A显示了血尿素氮(BUN)，而图24B显示了血清胱抑素C浓度。

图25描绘了显示在用同种型对照(WT+Ctl Ab)处理的野生型小鼠、以及用同种型对照(HumIn C3+Ctl Ab)或抗C5抗体M1M17628N(HumIn C3+M1M17628N)处理的C3人源化MAID 6149小鼠中的尿C5a水平(左)和标准化C5a水平(右)的图。

图26描绘了定量在用同种型对照(WT+Ctl Ab)处理的野生型小鼠、以及用同种型对照(HumIn C3+Ctl Ab)或抗C5抗体M1M17628N(HumIn C3+M1M17628N)处理的C3人源化MAID 6149小鼠中的肾小球膜攻击复合物(MAC)含量(C5b-9)的免疫荧光染色的图。

图27A描绘了显示在用同种型对照(WT+Ctl Ab)处理的野生型小鼠、以及用同种型对照(HumIn C3+Ctl Ab)或抗C5抗体M1M17628N(HumIn C3+M1M17628N)处理的C3人源化MAID 6149小鼠中的肾小球Gr-1⁺嗜中性粒细胞浸润的图(上图)，以及在源自用同种型对照(WT+Ctl Ab)处理的野生型小鼠、以及用同种型对照(HumIn C3+Ctl Ab)或抗C5抗体M1M17628N(HumIn C3+M1M17628N)处理的C3人源化MAID 6149小鼠的肾组织中的Gr-1⁺嗜中性粒细胞的免疫组织化学染色(下图)。图27B描绘了显示在用同种型对照(WT+Ctl Ab)处理的野生型小鼠、以及用同种型对照(HumIn C3+Ctl Ab)或抗C5抗体M1M17628N(HumIn C3+M1M17628N)处理的C3人源化MAID 6149小鼠中的间质F4/80⁺巨噬细胞浸润的图(上图)，以及在源自用同种型对照(WT+Ctl Ab)处理的野生型小鼠、以及用同种型对照(HumIn C3+CtlAb)或抗C5抗体M1M17628N(HumIn C3+M1M17628N)处理的C3人源化MAID 6149小鼠的肾组织中的F4/80⁺巨噬细胞的免疫组织化学染色(下图)。

图28描绘了定量在用同种型对照(WT+Ctl Ab)处理的野生型小鼠、以及用同种型对照(HumIn C3+Ctl Ab)或抗C5抗体M1M17628N(HumIn C3+M1M17628N)处理的C3人源化MAID 6149小鼠中的肾小球大小(左)和系膜基质扩张(右侧；通过PAS评价)的图。

图29A、29B和29C显示了抗C5处理导致人源化的C3小鼠(MAID 6149)中的疾病基因标记的深度援救。图29A显示了抗C5抗体治疗逆转人源化的C3小鼠中的疾病标记基因。图29B显示了援救的疾病标记包括免疫、细胞外基质、细胞因子、补体和代谢相关基因。图29C显示了在人源化的C3小鼠中上调的免疫细胞类型标记物显示随后通过抗C5抗体处理而减弱。

图30显示了C5的连续阻断延长人源化C3 MAID 6149小鼠的存活。

图31A-31C显示了C3b的阻断还在人源化C3 MAID 6149小鼠中提供保护。图31A显示了抗C3b阻断抗体改善人源化的C3小鼠的存活。图31B-31C显示了抗C3b阻断抗体还改善人源化的C3小鼠中的体重。

具体实施方式

补体系统是先天免疫系统的必要组分，并且发挥作为抵抗入侵病原体的防御机制的关键作用，引发适应性免疫应答，并且帮助去除免疫复合物和凋亡细胞。虽然补体系统在许多保护性免疫功能中起关键作用，但补体活化是广泛范围的自身免疫疾病和炎性疾病过程，包括补体相关性肾病中的组织损伤的重要介质。

本公开内容尤其提供了在血清中表达人或人源化C3蛋白的非人动物。令人惊讶的是，本发明人已发现，关于人或人源化C3基因纯合的啮齿类动物易于高比率的自发性死亡，并且另外显示出生理学、形态学和组织学症状，所述症状紧密类似补体相关性肾病，其特征在于肾中的病理性C3蛋白积累，例如C3肾小球病。像这样，本文所述的非人动物被认为代表能够复制人中观察到的补体相关性肾病的症状的第一模型生物，并且可以用于评估候选化合物或试剂用于治疗这些病症的治疗有效性。此外，本发明人还已发现这些啮齿类动物展示与肝纤维化一致的症状。相应地，本公开内容提供了关于使用包含编码人或人源化C3蛋白的核酸序列的非人动物的方法，以评价用于在治疗补体相关性肾病和/或肝纤维化中使用的试剂的体内治疗功效。

I.定义

如本文使用的，术语“补体相关性肾病(complement-related nephropathy)”或“补体相关性肾病(complement-related nephrosis)”指肾的损伤或者肾疾病或肾病症，包括与不希望有的旁路补体途径活化和/或补体活化产物沉积相关的疾病/病症，所述补体活化产物例如但不限于肾组织，特别是肾单位，且更特别是肾小球中的C3和/或C5b-9膜攻击复合物。在一些实施例中，补体相关性肾病包括称为非典型溶血尿毒综合征(aHUS)和/或C3肾小球病(C3G)的一种或多种状况，其是涵盖致密沉积物病(DDD)和C3肾小球肾炎(C3GN)的膜增生性肾小球肾炎的形式。

如本文使用的，术语“啮齿类动物”指分类学目啮齿目(Rodentia)的任何成员。啮齿类动物的例子包括但不限于小鼠、大鼠、松鼠、草原犬鼠、豪猪、河狸、豚鼠和仓鼠。在一个实施例，啮齿类动物是大鼠。在另一个实施例，啮齿类动物是小鼠。

“个体”或“受试者”可以是脊椎动物、哺乳动物或人。哺乳动物包括但不限于农场动物(例如牛)、运动动物、宠物、灵长类动物、小鼠和大鼠。个体还包括伴侣动物，包括但不限于犬和猫。在一个方面，个体是人。

“有效量”指作为单一剂量或一系列剂量的部分施用于个体的治疗化合物，例如用于补体相关性肾病的疗法的量，所述量有效产生所需治疗或预防结果。

“治疗有效量”或“临床有效量”是至少显示特定病症的可测量改善所需的最小浓度。本文的治疗有效量可以根据因素例如患者的疾病状态、年龄、性别和重量，以及治疗剂在个体中引发所需应答的能力而变。治疗有效量也可以是其中治疗剂的有益效应超过治疗剂的任何毒性或有害效应的量。在补体相关性肾病的情况下，治疗有效量可以增加或改善整体肾功能，预防肾细胞死亡，或者改善或预防对肾细胞、肾小球或其相关组分的损伤。

II.补体相关性肾病

A.C3和补体系统

补体是免疫系统的必要组分，由涉及三种连锁生化级联的超过30种循环蛋白和细胞蛋白组成：经典、凝集素和旁路途径。补体作用于帮助免疫系统破坏入侵微生物以及维持组织稳态。人中的C3缺乏与对细菌感染的易感性增加有关。然而，补体的过度活化或不受调节的活化造成组织损伤，并且与特征在于异常补体活化的各种各样的人疾病、病症和状况有关。

C3基因编码血清补体蛋白C3，其在经典、凝集素和旁路补体活化途径的活化中起关键作用。人C3基因位于染色体19上的19p13.3-p13.2处。人C3基因具有41个外显子，并且编码1663个氨基酸的前体多肽，包括22氨基酸信号肽、645氨基酸β链和992氨基酸α链。在补体活化期间，α链被切割，从而生成9种不同的肽，包括77氨基酸C3a蛋白，其是有力的促炎过敏毒素。

C3基因在几个物种之间是保守的，包括灵长类动物例如黑猩猩、恒河猴，其它哺乳动物例如犬、牛，啮齿类动物例如小鼠，鸡，斑马鱼和青蛙。小鼠C3基因位于染色体17上的1729.72cM19处。小鼠C3基因具有41个外显子，并且编码1663个氨基酸的前体多肽，包括24氨基酸信号肽、642氨基酸β链和993氨基酸α链。与人相似，小鼠中的补体活化导致α链切割，从而生成9种不同的肽，包括78氨基酸C3a，其是有力的促炎过敏毒素。C3敲除小鼠已遵循本领域已知的标准程序生成(参见例如，Drouin等人(2001)Cutting edge:the absence of3demonstrates a role for complement in Th2 effector functions in a murinemodel of pulmonary allergy,J Immunology 167:4141-4144)。

B.肾特异性、C3介导的补体相关性疾病

几种补体相关性肾病已知涉及肾，特别是肾单位的肾小球中异常高水平的C3沉积。

1.非典型HUS

溶血尿毒综合征(或溶血性尿毒综合征)，缩写为HUS，是特征在于溶血性贫血(由红血细胞的破坏引起的贫血)、急性肾衰竭(尿毒症)和低血小板计数(血小板减少症)的疾病。它主要但并非唯一地影响儿童。大多数情况之前为传染性腹泻，有时是血性腹泻的发作，所述腹泻由于食源性疾病或由大肠杆菌(E.coli)O157:H7、其它非o157:H7大肠杆菌血清型、志贺氏菌属(Shigella)和弯曲杆菌属(Campylobacter)引起的污染水供应而获得。

尽管支持性护理的使用，估计33-40％的患者将死亡或患有晚期肾疾病(ESRD)，伴随aHUS的第一临床表现，并且65％的患者将死亡，需要透析，或尽管血浆置换或血浆输注(PE/PI)疗法，但在诊断后的第一年内仍具有永久性肾损伤。在呈现aHUS体征和症状后存活的患者忍受慢性血栓和炎症状态，这使他们处于终生升高的突然血液凝固、肾衰竭和其它严重并发症包括过早死亡的风险中。

2.DDD、C3肾小球肾炎和C3肾小球病

致密沉积物病(DDD)是特征在于肾小球中的大量C3积累的罕见病症。该状况因使用透射电子显微镜检查在肾小球基膜(GBM)中观察到的非常致密的沉积物而命名。在2013年，作为共识会议的结果，科学家们推荐将DDD在新的标题下再分组：“C3肾小球病”(C3G；Pickering等人，Kidney Intl.,2013,84:1079-89)。这一新术语由以下了解造成：存在显示出肾小球疾病的另一组患者，其肾活组织检查暗示DDD。在这些个体中，当使用电子显微镜观察时，C3沉积物颜色较浅并且在位置中更广泛。然而，在免疫荧光评估后，并且与DDD患者相似，在肾小球中存在大量的C3。因而，这些患者目前被诊断患有“C3肾小球肾炎”或“C3GN”。在其症状相似性的认识中，DDD和C3GN两者现在均归类为C3G的亚型。

III.人源化C3非人动物的产生

可以使用本领域已知的方法生成本文公开的方法中使用的人源化C3动物(一般参见，"Gene Targeting:A Practical Approach,"Joyner，编辑，Oxford University Press,Inc.(2000))。在一个实施例中，小鼠的生成可以任选地涉及鼠C3基因的破坏和编码人或人源化C3的基因引入鼠基因组内。在一个实施例中，编码人或人源化C3的基因的引入在与内源性鼠C3基因相同的位置处。

可以通过将转基因引入动物的种系内来产生本文公开的方法中使用的遗传修饰的非人动物(人源化C3动物)。处于不同发育阶段的胚胎靶细胞可以用于引入转基因。根据胚胎靶细胞的发育阶段使用不同方法。选择本方法中使用的任何动物的特定系，用于一般的良好健康、良好的胚胎产率、胚胎中良好的原核可见性和良好的繁殖适度。当要生产遗传修饰的小鼠时，经常使用品系如C57BL/6或C57BL/6×DBA/2F1、或者FVB系(从CharlesRiver Labs,Boston,Mass.,The Jackson Laboratory,Bar Harbor,Me.或Taconic Labs.商业获得)。

将转基因引入胚胎内可以通过本领域已知的任何手段来完成，所述手段例如显微注射、电穿孔或脂转染。例如，通过将构建体显微注射到受精哺乳动物卵的原核内，可以将转基因引入哺乳动物内，以促使构建体的一个或多个拷贝保留在发育中的哺乳动物的细胞中。在将转基因构建体引入受精卵内之后，可以将卵在体外温育不同的时间量，或再植入代孕宿主内，或两者。体外温育至成熟在本公开内容的范围内。一种常见方法是根据物种在体外温育胚胎约1-7天，然后将其再植入代孕宿主内。

使用标准方法完成再植入。通常，将代孕宿主麻醉，并且将胚胎插入输卵管内。植入特定宿主内的胚胎数目因物种而异，但通常与物种天然产生的后代数目可比较。

逆转录病毒感染也可以用于将转基因引入非人动物内。发育中的非人胚胎可以在体外培养至胚泡期。在此期间，卵裂球可以是用于逆转录病毒感染的靶(Jaenich,R.(1976)PNAS 73:1260-1264)。通过酶促处理去除透明带来获得卵裂球的有效感染(Manipulatingthe Mouse Embryo,Hogan编辑(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,1986)。用于引入转基因的病毒载体系统通常是携带转基因的复制缺陷型逆转录病毒(Jahner等人(1985)PNAS82:6927-6931；Van der Putten等人(1985)PNAS 82:6148-6152)。

用于转基因引入的第三类靶细胞是胚胎干(ES)细胞。通过DNA转染或通过逆转录病毒介导的转导，可以将转基因有效地引入ES细胞内。其后可以将此类转化的ES细胞与来自非人动物的胚泡组合。其后ES细胞定殖胚胎并且促成所得到的嵌合动物的种系。

包含人源化C3的遗传修饰动物可以与其它动物杂交。制备方式是生成一系列哺乳动物，各自含有所需构建体或转基因之一。此类哺乳动物通过一系列杂交、回交和选择一起育种，以最终生成含有所有所需构建体和/或转基因的单一哺乳动物，其中所述哺乳动物与野生型在其它方面同基因(遗传上相同)，除了存在所需构建体和/或转基因之外。在一个实施例中，以这种方式产生包含人或人源化C3基因的小鼠。

通常，根据育种过程中每个特定步骤的目标，通过将同胞或亲代品系与后代交配来完成杂交和回交。在某些情况下，可能需要生成大量后代，以便生成含有在适当的染色体位置中的每个敲除构建体和/或转基因的单个后代。另外，可能需要经过几代交叉或回交以最终获得所需基因型。

在一个方面，提供了表达人或人源化C3蛋白的遗传修饰的啮齿类动物，例如小鼠或大鼠，其中表达人或人源化C3蛋白的啮齿类动物包含正常补体系统，即，表达人或人源化C3蛋白的啮齿类动物的血液、血浆或血清中的补体蛋白水平类似于表达功能性内源C3蛋白的啮齿类动物的血液、血浆或血清中的补体蛋白水平。在一个实施例中，啮齿类动物是小鼠。在一个实施例中，啮齿类动物是大鼠。

在一个方面，提供了包含如本文所述的遗传修饰的多能或全能非人动物，例如啮齿类动物，例如小鼠或大鼠。在一个实施例中，细胞是啮齿类动物细胞。在一个实施例中，细胞是小鼠细胞。在一个实施例中，细胞是啮齿类动物ES细胞。在一个实施例中，细胞是小鼠ES细胞。

在一个方面，提供了非人动物，例如啮齿类动物，例如小鼠或大鼠卵，其中所述非人动物卵包含异位非人动物染色体，其中所述异位非人动物染色体包含如本文所述的遗传修饰。在一个实施例中，非人动物是啮齿类动物。在一个实施例中，啮齿类动物是小鼠。在一个实施例中，啮齿类动物是大鼠。

在一个方面，经遗传修饰以包含人C3基因的小鼠胚胎、卵或细胞是具有选自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BU6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL品系的小鼠。在另一个实施例中，小鼠是选自其为129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如，129S1/SV、129S1/Svlm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2的品系的129品系(参见例如，Festing等人(1999)Revised nomenclature for strain129mice,Mammalian Genome 10:836，还参见Auerbach等人(2000)Establishment andChimera Analysis of 129/SvEv-and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem CellLines)。在一个具体实施例中，遗传修饰的小鼠是前述129品系和前述C57BL/6品系的混合物。在另一个具体实施例中，小鼠是上述129品系的混合物、或上述BL/6品系的混合物。在一个具体实施例中，混合物的129品系是129S6(129/SvEvTac)品系。在另一个实施例中，小鼠是BALB品系，例如BALB/c品系。在另外一个实施例中，小鼠是BALB品系和另一种上述品系的混合物。在一个在实施例中，鼠标是Swiss或Swiss Webster小鼠。

关于人源化C3啮齿类动物的进一步信息及其制备方法可以在美国专利申请公开号20150313194中找到，所述美国专利申请的公开内容以引用的方式并入本文。

像这样，本文提供的是遗传修饰的啮齿类动物，例如小鼠或大鼠，其表达来自人源化C3基因的C3蛋白，其中所述啮齿类动物在其血清中表达人或人源化C3蛋白。在一个实施例中，啮齿类动物是小鼠。在一个实施例中，啮齿类动物是大鼠。表达人或人源化C3蛋白的啮齿类动物的血清可以具有与表达功能性内源C3蛋白的啮齿类动物，例如野生型小鼠或大鼠大致相同水平的C3蛋白。在一个实施例中，小鼠在血清中表达人或人源化C3蛋白(hC3)，其浓度为年龄匹配小鼠的血清中存在的C3蛋白水平的至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％，所述年龄匹配小鼠表达功能性内源C3蛋白，但不包含在内源性小鼠C3基因座处内源C3基因由人C3基因或其片段的替换。

在一个实施例中，啮齿类动物在血清中表达人C3蛋白，其浓度为年龄匹配小鼠的血清中存在的小鼠C3蛋白水平的约1％至约5％、约3％至约7％、约5％至约15％、约10％至约20％、约10％至约200％、约20％至约150％、或约30％至约100％，所述年龄匹配小鼠表达功能性内源C3蛋白，但不包含在内源性小鼠C3基因座处内源C3基因由人C3基因或其片段的替换。

在一个实施例中，啮齿类动物在血清中表达人或人源化C3蛋白，其浓度为约1μg/ml至约5μg/ml、约3μg/ml至约7μg/ml、约5μg/ml至约15μg/ml、约10μg/ml至约20μg/ml、约15μg/ml至约30μg/ml、约20μg/ml至约40μg/ml、约30μg/ml至约60μg/ml、约50μg/ml至约100μg/ml、约75μg/ml至约125μg/ml约100μg/ml至约1500μg/ml、约100μg/ml至约1500μg/ml、约200μg/ml至约1250μg/ml、或约300μg/ml至约1000μg/ml。在另一个实施例中，小鼠在血清中表达人或人源化C3蛋白，其浓度为至少约1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml、7μg/ml、8μg/ml、9μg/ml、10μg/ml、11μg/ml、12μg/ml、13μg/ml、14μg/ml、15μg/ml、16μg/ml、17μg/ml、18μg/ml、19μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml、1000μg/ml、1250μg/ml或1500μg/ml，包括落入这些浓度之间的值和范围在内。

IV.人源化C3非人动物用于鉴定或评价能够治疗补体相关性肾病的试剂的体内治疗功效的用途

A.鉴定改善补体相关性肾病或肝纤维化的试剂

在一些方面，本文提供的是用于1)鉴定候选试剂(即化合物或治疗分子)、或2)评价候选试剂用于在补体相关性肾病的治疗中使用的体内治疗功效的方法，所述补体相关性肾病例如但不限于aHUS、DDD、C3肾小球肾炎和/或C3肾小球病。该方法利用本文公开的任何人源化C3非人动物(例如，小鼠或大鼠)。在一些实施例中，将候选化合物直接施用于显示出补体相关性肾病症状的非人动物，以确定所述试剂或化合物是否可以减少补体相关性肾病和/或肝纤维化的一种或多种症状。在其它实施例中，使候选化合物与得自这些非人动物的血清接触，并且使用任何常用的体外评价技术(例如但不限于CH50测定)来评价补体活性。

在一些实施例中，候选化合物或试剂可以通过减少、降低或抑制本文所述的人源化C3非人动物(例如啮齿类动物，例如小鼠或大鼠)的肾或肝中的补体活化(例如但不限于旁路途径补体活化和/或C3介导的补体途径活化)或C3蛋白切割和/或沉积来调节补体活化。与未用候选化合物或试剂处理的对照非人动物相比，所述化合物或试剂可以使本文公开的任何非人动物中的补体活化或C3蛋白切割和/或沉积减少约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一种。

在另一个实施例中，候选化合物可以减少、降低或抑制本文所述的任何人源化C3非人动物(例如啮齿类动物，例如小鼠或大鼠)的肾或肝中的补体活化(例如但不限于旁路途径补体活化和/或C3介导的补体途径活化)或C3蛋白切割和/或沉积高达1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、42小时、48小时、54小时、60小时、66小时、72小时、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或三周(包括这些值之间的任何时间段)。

在其它实施例中，候选化合物还可以通过增加、扩增或激活本文所述的任何人源化C3非人动物(例如啮齿类动物，例如小鼠或大鼠)的肾或肝中的补体活性(例如但不限于旁路途径补体活性或C3介导的补体途径活性)来调节补体活化。与未用候选化合物或试剂处理的对照非人动物相比，所述化合物可以使本文公开的任何啮齿类动物中的补体活性增加10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一种。

在另一个实施例中，候选化合物可以增加、扩增或激活本文所述的任何人源化C3非人动物(例如啮齿类动物，例如小鼠或大鼠)的肾或肝中的补体活性(例如但不限于旁路途径补体活性或C3介导的补体途径活性)高达1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、42小时、48小时、54小时、60小时、66小时、72小时、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或三周(包括这些值之间的任何时间段)。

在其它实施例中，与未施用候选试剂或化合物的对照非人动物相比，候选试剂或化合物改善或治疗非人动物(例如啮齿类动物，例如小鼠或大鼠)中的补体相关性肾病或肝纤维化的一种或多种症状。除非另有说明，否则如本文使用的，术语“改善”或“治疗”意指消除一种或多种症状、延迟一种或多种症状的发生、或者减少一种或多种症状的流行率、频率或严重性，所述一种或多种症状与补体相关性肾病(例如但不限于aHUS、DDD、C3肾小球肾炎和/或C3肾小球病)或肝纤维化相关。

在一些实施例中，补体相关性肾病(例如但不限于aHUS、DDD、C3肾小球肾炎和/或C3肾小球病)的一种或多种症状可以是自发性死亡。像这样，与未用候选化合物或试剂处理的对照非人动物相比，所述候选化合物或试剂可以使本文所述的任何人源化C3非人动物(例如啮齿类动物，例如小鼠或大鼠)中自发性死亡的出现改善1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一种。

如下文实例2中所示，相对于不表达人或人源化C3蛋白的野生型同窝仔畜或啮齿类动物，本文所述的纯合的人源化C3啮齿类动物显示出重量降低(即，不能正常增长重量)、骨密度和/或矿物质含量降低、和/或体脂降低。相应地，在一些实施例中，由候选试剂或化合物改善的补体相关性肾病(例如但不限于aHUS、DDD、C3肾小球肾炎和/或C3肾小球病)的一种或多种症状是重量降低、骨密度降低或体脂降低中的一种或多种。像这样，与未用候选化合物或试剂处理的对照非人动物相比，所述候选化合物或试剂可以使本文所述的任何人源化C3非人动物(例如小鼠或大鼠)中的低体重、骨密度或矿物质含量降低、和/或体脂降低中的一种或多种改善10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一种。体重减轻或增加、骨密度或矿物质含量和体脂肪的测定是常规的，并且可以根据本领域众所周知的方法来完成。

另外，如下文实例4中所述，相对于不表达人或人源化C3蛋白的野生型同窝仔畜或啮齿类动物，本文所述的纯合的人源化C3啮齿类动物显示出在肾中，特别是在肾单元中(例如，在肾小球中)高水平的C3蛋白沉积。相应地，在一些实施例中，由候选试剂或化合物改善的补体相关性肾病(例如但不限于aHUS、DDD、C3肾小球肾炎和/或C3肾小球病)的一种或多种症状是肾中的C3蛋白沉积。像这样，与未用候选化合物或试剂处理的对照非人动物相比，所述候选化合物或试剂可以使本文所述的任何人源化C3非人动物(例如小鼠或大鼠)中的肾C3蛋白沉积改善10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一种。肾C3蛋白沉积的测定可以通过本领域已知的许多手段进行分析，所述手段包括但不限于免疫组织化学、免疫荧光和电子显微镜检查(包括免疫电子显微检查)。

实例4还显示相对于不表达人或人源化C3蛋白(其指示活化的补体途径)的野生型同窝仔畜或啮齿类动物，人源化C3啮齿类动物的肾小球中的C5b-9膜攻击复合物沉积增加。相应地，在一些实施例中，由候选试剂或化合物改善的补体相关性肾病(例如但不限于aHUS、DDD、C3肾小球肾炎和/或C3肾小球病)的一种或多种症状是C5b-9膜攻击复合物的形成增加。像这样，与未用候选化合物或试剂处理的对照非人动物相比，所述候选化合物或试剂可以使本文所述的任何人源化C3非人动物(例如小鼠或大鼠)中的C5b-9膜攻击复合物形成改善10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一种。C5b-9膜攻击复合物形成可以通过本领域已知的许多手段来确定，所述手段包括但不限于免疫组织化学、免疫荧光(例如免疫荧光标记的抗C9抗体)和电子显微镜检查(包括免疫电子显微镜检查)。

如实例3中所示，相对于不表达人或人源化C3蛋白的野生型同窝仔畜或啮齿类动物，本文所述的纯合的人源化C3啮齿类动物显示出升高水平的血清和/或血浆血尿素氮(BUN)、脂肪酶、胱抑素和非高密度脂蛋白。相应地，在一些实施例中，由候选试剂或化合物改善的补体相关性肾病(例如但不限于aHUS、DDD、C3肾小球肾炎和/或C3肾小球病)的一种或多种症状是升高水平的血清和/或血浆BUN、脂肪酶、胱抑素和非高密度脂蛋白。像这样，与未用候选化合物或试剂处理的对照非人动物相比，所述候选化合物或试剂可以使本文所述的任何人源化C3非人动物(例如小鼠或大鼠)中升高水平的血清和/或血浆BUN、脂肪酶、胱抑素和非高密度脂蛋白改善10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一种。评价BUN、脂肪酶、胱抑素和非高密度脂蛋白的血清和/或血浆水平可以使用本领域众所周知的许多方法来完成。

实例3进一步显示相对于不表达人或人源化C3蛋白的野生型同窝仔畜或啮齿类动物，本文所述的纯合的人源化C3啮齿类动物显示出升高的尿白蛋白浓度。实例4显示相对于不表达人或人源化C3蛋白的野生型同窝仔畜或啮齿类动物，本文所述的纯合的人源化C3啮齿类动物显示出升高的尿C5a水平。相应地，在一些实施例中，由候选试剂或化合物改善的补体相关性肾病(例如但不限于aHUS、DDD、C3肾小球肾炎和/或C3肾小球病)的一种或多种症状是尿白蛋白和/或C5a增加。像这样，与未用候选化合物或试剂处理的对照非人动物相比，所述候选化合物或试剂可以使本文所述的任何人源化C3非人动物(例如小鼠或大鼠)中升高水平的尿白蛋白和/或C5a改善10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一种。评价尿白蛋白水平可以使用本领域众所周知的许多方法来完成。

本文所述的纯合的人源化C3啮齿类动物进一步显示出与肝损伤或纤维化一致的症状。纤维化是在修复或反应过程中在器官或组织中的过量纤维结缔组织形成。在生理学上，纤维化起到沉积结缔组织的作用，所述结缔组织可以消除下面的器官或组织的体系结构和功能。由细胞外基质(ECM)蛋白的病理积累限定，纤维化导致受累组织的瘢痕形成和增厚，其本质上是干扰正常器官功能的过分的伤口愈合应答。肝纤维化经常被称为肝硬化，并且可以由多种状况引起，所述状况尤其如酒精性肝病(ALD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、慢性丙型肝炎、慢性乙型肝炎、原发性硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、遗传性血色病、威尔森氏病、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、半乳糖血症、糖原贮积病IV型、囊性纤维化、或者暴露于肝毒性药物或毒素。

实例3进一步显示本文所述的纯合的人源化C3啮齿类动物显示出升高水平的肝酶丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)或碱性磷酸酶(ALP)。相应地，在一些实施例中，由候选试剂或化合物改善的肝纤维化的一种或多种症状是升高水平的ALT、AST或ALP。像这样，与未用候选化合物或试剂处理的对照非人动物相比，所述候选化合物或试剂可以使本文所述的任何人源化C3非人动物(例如小鼠或大鼠)中升高水平的ALT、AST和/或ALP改善10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一种。评价ALT、AST或ALP肝酶水平可以使用本领域众所周知的许多方法来完成。

在一些实施例中，补体相关性肾病或肝纤维化的一种或多种症状由疾病基因标记，即疾病特有的基因标记反映，所述疾病即补体相关性肾病或肝纤维化。疾病基因标记包括与没有疾病的野生型对照受试者相比，在患有疾病的受试者(例如啮齿类动物)中差异表达的一组基因。“差异表达”意指与没有疾病的野生型对照中的标记基因的表达相比，标记基因的表达增加或降低至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多。在一些实施例中，关于补体相关性肝纤维化的基因标记包括图17中列出的一种或多种基因、或者图19中的一种或多种差异表达的基因。在一些实施例中，关于补体相关性肾病的基因标记包括图21B中列出的一种或多种肾毒性基因、图21C中列出的一种或多种细胞外基质(ECM)基因、图21D中列出的一种或多种细胞因子基因、图21E中列出的一种或多种趋化因子基因或其组合。在一些实施例中，关于补体相关性肾病和肝纤维化的基因标记包括图29C中列出的一种或多种基因，例如，选自Timp1、Spp1、Col13a1、Mmp14、Tgfbi、Mmp2、Col1a1和Tnc的一种或多种ECM基因；选自Ccl22、Ccr1、Tnfsf8、Il1f6、Ccl5、Il1rn、Tlr1、Itgb2、Ccr2、C3ar1和Fos的一种或多种细胞因子和受体基因；选自Btla、Cd86、Cd3e、Icos、H2-Ab1、Cd14、Cd28、H2-Eb1、Tyrobp、Tlr8、Cd200r1、Itgam、Cd2、Cd84、Klrk1、C1qc、H2-Oa和H2-Aa的一种或多种免疫信号传导分子；选自Cd4、Cd3g、Lcp2、H2-Oa、H2-Aa、Cd247、Ptprc和Lck的一种或多种T细胞相关基因；选自C5ar1、Cfi、C3ar1、C6、C1qc、C7、C1qa、C1qb、Serpine1、F13a1和Cfh的一种或多种补体和凝血基因；选自Cyp7b1、Akr1c188、Agps和Lpl的一种或多种脂质代谢基因。在一些实施例中，关于补体相关性肾病和肝纤维化的基因标记包括图29B中列出的一种或多种免疫细胞类型标记物，例如，选自Ms4a1、Cd79a、Cd79b、Cd19、Cd3d、Cd3e、Cd3g、Cd8a、Cd8b1、Cd4、Foxp3、Prf1、Gzma、Kird1、Kirk1、Ncr1、Ccl22、Clec9a、Cd207、Adam23、Marco、Msr1、C1qb、Ms4a7、Cxcr2、Csf3r、Robo4、Tek、Tie1、Cdh5、Kdr、Esam、Tagln、Acta2、Fap和Tnc的标记物。

在一些实施例中，通过测定疾病标记基因中的一种或多种，例如多重或集合的表达，来评价补体相关性肾病或肝纤维化的一种或多种症状。如实例7中所示，可以评价候选化合物改善，即完全或部分逆转疾病标记基因的表达升高或降低的能力。例如，与未用候选化合物或试剂处理的对照非人动物相比，所述候选化合物或试剂可以使本文所述的任何人源化C3非人动物(例如小鼠或大鼠)中的疾病基因标记集合中的一种或多种基因的表达水平升高或降低改善10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％中的任一种。

B.候选试剂或化合物

候选治疗剂或化合物可以是但不限于，小分子化学化合物、抗体、蛋白质、抑制性核酸或其任何组合。

1.抗体

在一些方面，候选试剂或化合物结合(例如优先结合)补体蛋白(例如但不限于C5、C3或其蛋白酶解产物(例如C3a或C3b))，并且是抗体。术语“抗体(antibody)”和“抗体(antibodies)”指全人抗体、人源化抗体、骆驼科化抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv(sdFv)、Fab片段、F(ab')片段和任何前述的抗原结合片段。特别地，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的抗原结合活性片段，即含有抗原结合位点的分子。此类片段可以融合或不融合至另一个免疫球蛋白结构域，包括但不限于Fc区或其片段。技术人员将了解，可以生成其它融合产物，包括但不限于scFv-Fc融合物、可变区(例如VL和VH)-Fc融合物和scFv-scFv-Fc融合物。免疫球蛋白分子可以是任何类型，包括IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY，以及任何类别，包括IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂)，或任何亚类。在一些实施例中，抗体是C5和/或C3拮抗剂，并且可以降低补体活化(例如旁路补体途径活化，例如在肾或肝中)。在其它实施例中，抗体是C5和/或C3激动剂，并且可以增加补体活化。

还可以基于本领域已知的信息制备抗体变体，而基本上不影响抗体的活性。例如，抗体变体可以具有在抗体分子中由不同的残基替换的至少一个氨基酸残基。对于抗体，对于取代诱变最有利的位点一般包括高变区，但也考虑了构架区(FR)改变。

对于抗体，一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，选择用于进一步开发的所得到的变体相对于它们由其生成的亲本抗体将具有改善的生物学特性。用于生成此类取代变体的便利方式涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简言之，使几个高变区位点(例如6-7个位点)突变，以在每个位点处生成所有可能的氨基酸取代。因此生成的抗体从丝状噬菌体颗粒展示为与包装在每个颗粒内的M13的基因产物的融合物。然后如本文公开的，筛选噬菌体展示的变体的生物活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可以执行丙氨酸扫描诱变，以鉴定显著促成抗原结合的高变区残基。

编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子可以通过本领域已知的各种方法制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在的氨基酸序列变体的情况下)，或者通过早期制备的抗体变体或非变体形式的寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变制备。

可能期望在免疫球蛋白多肽的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，从而生成Fc区变体。Fc区变体可以包含人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)，其包含在一个或多个氨基酸位置包括铰链半胱氨酸的位置处的氨基酸修饰(例如取代)。

具有改变的(改善的或缩小的)Clq结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的Fc区变体描述于国际专利申请公开号：WO99/51642(以引用的方式并入本文)中。此类变体可以包含在Fc区的一个或多个氨基酸位置处的氨基酸取代。还参见Duncan&Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；以及涉及Fc区变体的国际专利申请公开号：WO94/29351，所述专利各自的公开内容以引用的方式并入本文。

2.非抗体结合多肽

在一些方面，候选化合物结合(例如优先结合)补体蛋白(例如，C5、C3或其蛋白酶解产物(例如C3a或C3b))，并且是非抗体结合多肽。在一些实施例中，非抗体结合多肽是C5和/或C3拮抗剂，并且可以降低补体活化(例如旁路补体途径活化，例如在肾或肝中)。在其它实施例中，非抗体结合多肽是C5和/或C3激动剂，并且可以增加补体活化。

结合多肽可以使用已知的多肽合成方法化学合成，或可以使用重组技术制备且纯化。结合多肽通常为长度至少约5个氨基酸，可替代地长度至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个氨基酸或更多，其中此类结合多肽能够结合靶，例如本文讨论的任何补体蛋白质(例如C5、C3、C3a或C3b)。

使用众所周知的技术无需过度实验可以鉴定结合多肽。在这方面，应注意用于在多肽文库中筛选能够结合多肽靶的结合多肽的技术是本领域众所周知的(参见例如，美国专利号5,556,762、5,750,373、4,708,871、4,833,092、5,223,409、5,403,484、5,571.689、5,663,143；PCT申请公开号WO 84/03506和WO84/03564；Geysen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81:3998-4002(1984)；Geysen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82:178-182(1985)；Geysen等人，J.Immunol.Meth,102:259-274(1987)；Clackson,T.等人，(1991)Nature,352:624；Kang,A.S.等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:8363，以及Smith,G.P.(1991)Current Opin.Biotechnol,2:668，所述参考文献各自公开内容以引用的方式并入本文。

用于生成肽文库和筛选这些文库的方法也公开于美国专利号5,723,286、5,432,018、5,580,717、5,427,908、5,498,530、5,770,434、5,734,018、5,698,426、5,763,192和5,723,323中，所述专利各自的公开内容以引用的方式并入本文。

可以修饰结合多肽以增强其抑制和/或治疗效应(包括例如增强的亲和力，改善的药代动力学特性例如半衰期、稳定性和清除率、减少的毒性等)。此类修饰包括但不限于糖基化，聚乙二醇化，用非天然存在但功能上等价的氨基酸取代，连接基团等。

3.小分子化学化合物

在一些方面，候选化合物结合(例如优先结合)补体蛋白(例如，C5、C3或其蛋白酶解产物(例如C3a或C3b))，并且是小分子。在一些实施例中，小分子是C5和/或C3，并且可以降低补体活化(例如旁路补体途径活化，例如在肾或肝中)。在其它实施例中，小分子是C5和/或C3激动剂，并且可以增加补体活化。

小分子优选是除如本文定义的结合多肽或抗体外的有机分子。可以使用已知方法鉴定且化学合成有机小分子(参见例如，PCT申请公开号WO00/00823和WO 00/39585)。有机小分子通常尺寸小于约2000道尔顿，可替代地尺寸小于约1500、750、500、250或200道尔顿，其中使用众所周知的技术无需过度实验，可以鉴定能够结合如本文所述的多肽的此类有机小分子。在这方面，应注意，用于筛选能够结合多肽靶的分子的有机小分子文库的技术是本领域众所周知的(参见例如，PCT申请公开号WO 00/00823和WO00/39585)。

有机小分子可以是例如醛、酮、肟、腙、缩氨基脲、卡巴肼、伯胺、仲胺、叔胺、N-取代的肼、酰肼、醇、醚、硫醇、硫醚、二硫化物、羧酸、酯、酰胺、脲、氨基甲酸酯、碳酸酯、缩酮、硫代缩酮、缩醛、硫代缩醛、芳基卤化物、芳基磺酸盐、烷基卤化物、烷基磺酸盐、芳族化合物、杂环化合物、苯胺、烯烃、炔烃、二醇、氨基醇、噁唑烷、噁唑啉、噻唑烷、噻唑啉、烯胺、磺酰胺、环氧化物、氮丙啶、异氰酸酯、磺酰氯、重氮化合物、酰氯等等。

在一些方面，小分子化学化合物是组合化学文库的组分。组合化学文库是由较小亚基或单体组成的多种化学化合物的集合。组合文库具有各种大小，范围从几百到几十万个不同种类的化学化合物。还存在各种文库类型，包括由化合物如碳水化合物、寡核苷酸和小有机分子等组成的寡聚和聚合文库。此类文库具有各种用途，如化学化合物的固定和层析分离，以及用于鉴定且表征能够结合靶分子(例如，C5、C3、C3a或C3b)或介导目的生物活性(例如但不限于补体活性的抑制或活化)的配体的用途。

用于在固相支持物上合成化合物文库的各种技术是本领域已知的。固相支持物通常是聚合物体，其表面被官能化以与亚基或单体结合，以形成文库的化合物。一个文库的合成通常涉及大量固相支持物。为了制备组合文库，固相支持物与化合物的一个或多个亚基以及一种或多种试剂以小心控制的预定化学反应顺序反应。换言之，文库亚基在固相支持物上“生长”。文库越大，所需反应的次数越多，使跟踪构成文库的多重种类的化合物的化学组成的任务变得复杂。在一些实施例中，小分子尺寸小于约2000道尔顿，可替代地尺寸小于约1500、750、500、250或200道尔顿。

本文任何方面中描述的小分子试剂可以源自可以在固体支持物上进行的任何类型的化学反应。此类化学反应包括但不限于2+2环加成，包括丁二烯的捕获；[2+3]环加成，包括异噁唑啉、呋喃和修饰肽的合成；缩醛形成，包括二醇、醛和酮的固定；羟醛缩合，包括醛的衍生化、丙二醇的合成；苯偶姻缩合，包括醛的衍生化；环缩合，包括苯二氮卓和乙内酰脲、噻唑烷、回折模拟物、卟啉、酞菁；迪克曼环化，包括二酯的环化；狄尔斯–阿尔德反应，包括丙烯酸的衍生化；亲电加成，包括醇对烯烃的添加；格氏反应，包括醛的衍生化；赫克反应，包括二取代烯烃的合成；亨利反应，包括氧化腈的原位合成(参见2+3环加成)；催化氢化，包括信息素和肽的合成(烯烃的氢化)；迈克尔反应，包括磺酰酮、双环[2.2.2]辛烷的合成；光延反应，包括芳基醚、肽基膦酸酯和硫醚的合成；亲核芳香族取代，包括喹诺酮的合成；氧化，包括醛和酮的合成；葆森-侃德环加成，包括降冰片二烯与戊炔醇的环化；光化学环化，包括螺烯的合成；与有机金属化合物的反应，包括醛和酰氯的衍生化；用复合氢化物和锡化合物的还原，包括羰基、羧酸、酯和硝基基团的还原；Soai反应，包括羧基基团的还原；Stille反应，包括联苯衍生物的合成；施托克反应，包括取代环己酮的合成；还原胺化，包括喹诺酮的合成；铃木反应，包括苯乙酸衍生物的合成；以及沃兹沃思-埃蒙斯(Wittig-Horner)反应，包括醛、信息素和磺酰酮的反应。

公开了化学文库的合成以及这些文库的各个化合物在各个固相支持物上的解卷积的参考文献可以在美国专利申请号2009/0032592；Needels等人，(1993),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10700-10704；以及PCT申请公开号WO 97/15390中找到，所述参考文献的公开内容以引用的方式并入本文。

4.抑制性核酸

在本公开内容的一个方面，候选补体调节化合物是靶向补体系统的组分(例如mRNA)的一种或多种寡核苷酸。抑制性核酸可以是但不限于反义寡核苷酸、小抑制性RNA(siRNA)或核酶中的任一种。

本公开内容的寡核苷酸可以是编码补体系统的蛋白质组分的mRNA。寡核苷酸与mRNA结合，并且通过介导其破坏或通过预防翻译成蛋白质来干扰其功能。绝对互补性尽管是优选的，但不是必需的。如本文提及的，与RNA的一部分“互补”的寡核苷酸序列意指序列具有足够的互补性以能够与RNA杂交，形成稳定的双链体。杂交的能力取决于互补性程度和寡核苷酸的长度两者。一般地，杂交核酸越长，与其可能含有的RNA的碱基错配越多，并且仍形成稳定的双链体。通过使用标准程序测定杂交复合物的熔点，本领域技术人员可以确定可容忍的错配程度。

一般而言，制造为与关于补体系统的蛋白质的mRNA杂交的互补寡核苷酸靶向mRNA的任何区域，包括mRNA的5非翻译区、AUG起始密码子的互补区、或3'非翻译区。

寡核苷酸可以具有交替的核苷间键合，例如但不限于硫代磷酸酯(Mag等人，Nucleic Acids Res.19:1437-1441,1991；和美国专利号5,644,048)、肽核酸或PNA(Egholm,Nature,3685:566-568,1993；和美国专利号6,656,687)、磷酰胺(Beaucage,Methods Mol.Biol.20:33-61,1993)、二硫代磷酸酯(Capaldi等人，Nucleic Acids Res.,28:E40,2000)。其它寡核苷酸类似物包括例如但不限于吗啉代(Summerton,Biochim.Biophys.Acta.,1489:141-158,1999)、锁寡核苷酸(Wahlestedt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:5633-5638,2000)、肽核酸或PNA(Nielsen等人，1993；Hyrup和Nielsen，1996)或2-o-(2-甲氧基)乙基修饰的5'和3'末端寡核苷酸(McKay等人，J.Biol.Chem.,274:1715-1722,1999)。所有这些参考文献都在此明确以引用的方式并入。核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任何组合，以及碱基的任何组合，所述碱基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤等。

根据本公开内容的互补寡核苷酸可以包含至少一个经修饰的碱基部分，其选自包括但不限于5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷(galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2,6-二氨基嘌呤。

互补寡核苷酸还可以包含选自包括但不限于阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖的至少一种经修饰的糖部分。

互补寡核苷酸应该为长度至少十个核苷酸，并且范围可以为长度10至约50个核苷酸，例如长度11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。

V.补体相关性肾病的治疗

本文另外提供的是用于治疗一种或多种补体相关性肾病(例如但不限于非典型溶血尿毒综合征(aHUS)或C3肾小球病(C3G；例如致密沉积物病(DDD)或C3肾小球肾炎(C3GN))的方法。如实例6-7中所示，用临床有效量的抑制C5的表达或活性的治疗剂治疗人源化的C3小鼠(其显示出补体相关性肾病的一种或多种症状)，可以导致改善的存活和肾功能、降低的与补体相关性肾病有关的肾和肾小球损伤的组织学体征、以及完全或部分逆转的疾病标记基因表达。另外，如实例9中所示，用临床有效量的抑制C3的活性表达或其蛋白酶解切割产物(C3a或C3b)的活性的治疗剂治疗人源化的C3小鼠(其显示出补体相关性肾病的一种或多种症状)，也可以导致改善的存活。

如本文使用的，“抑制C5的表达或活性的治疗剂”指能够抑制补体因子5(C5)的生物学功能或活性的任何试剂。这包括这样的试剂、物质或化合物，其预防C5蛋白如其在补体途径中通常那样起作用，预防C5基因的表达，预防C5前RNA加工为成熟mRNA，预防C5 mRNA翻译为C5多肽，预防对于其正常生理功能所必需的C5多肽的翻译后修饰或加工，和/或阻断或干扰C5蛋白的活性。

如本文使用的，“抑制C3的表达或活性的治疗剂”指能够抑制补体因子3(C3)的生物学功能或活性的任何试剂。这包括这样的试剂、物质或化合物，其预防C3蛋白如其在补体途径中通常那样起作用，预防C3基因的表达，预防C3前RNA加工为成熟mRNA，预防C3 mRNA翻译为C3多肽，预防对于其正常生理功能所必需的C3多肽的翻译后修饰或加工，和/或阻断或干扰C3蛋白的活性。

“抑制C3a或C3b活性的治疗剂”指能够抑制C3a或C3b的生物学功能或活性的任何试剂。

在一些实施例中，治疗剂是抑制性核酸、非抗体结合多肽或小分子化学化合物中的一种或多种，例如抗体、抑制性核酸(例如但不限于反义寡核苷酸、siRNA、微小RNA(miR)或核酶)或本文讨论的非抗体结合多肽中的任一种。

在其它实施例中，治疗剂是抗体或其功能片段(例如但不限于，单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼科化抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv(sdFv)、Fab片段或F(ab')片段)。抗体可以每天、每隔一天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周一次或每两周一次施用于个体。在一些情况下，可以向被诊断患有或被认为患有补体相关性肾病的个体施用约40mg/kg至约60mg/kg的抗体(例如约40mg/kg、41mg/kg、42mg/kg、43mg/kg、44mg/kg、45mg/kg、46mg/kg、47mg/kg、48mg/kg、49mg/kg、50mg/kg、51mg/kg、52mg/kg、53mg/kg、54mg/kg、55mg/kg、56mg/kg、57mg/kg、58mg/kg、59mg/kg、60mg/kg或更多中的任一种)。抗体施用可以经由本领域已知的任何手段，包括但不限于注射、动脉递送、吹入、摄取或经由栓剂。抗C5抗体疗法可以持续8-56周(例如约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55或56周中的任一种)、1-5年或无限期。在一些实施例中，适用于本文公开的任何治疗方法中的抗C5抗体可以使用已知方法制备，例如，如美国专利申请号15/621,689中所述，所述专利的公开内容以引用的方式并入本文。在一些实施例中，可以使用已知方法制备适用于本文公开的任何治疗方法中的抗C3、抗C3a或抗C3b抗体。

本文提供的是用于改善被诊断患有或被认为患有补体相关性肾病的个体中的肾功能的方法。该方法包括施用临床有效量的治疗剂，例如上述治疗剂中的任一种。相对于未施用治疗剂的被诊断患有补体相关性肾病的个体，治疗剂的施用导致改善的肾功能。在一些实施例中，改善的肾功能可以通过降低的血尿素氮(BUN)水平显示。具体地，相对于被诊断患有补体相关性肾病的个体中的BUN水平，所述个体未施用抑制C5的表达或活性的抑制剂，将临床有效量的抑制C5的表达或活性的治疗剂施用于被诊断患有或被认为患有补体相关性肾病的个体，可以导致约10-50％降低的BUN水平(例如约10％、11％、12％、13％、15％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％降低的BUN水平中的任一种)。BUN的测量是本领域常规的，并且可以通过任何已知的手段执行。

在其它实施例中，改善的肾功能可以通过降低的血清胱抑素C浓度显示。例如，相对于被诊断患有补体相关性肾病的个体中的血清胱抑素C浓度，所述个体未施用抑制C5的表达或活性的抑制剂，将临床有效量的抑制C5的表达或活性的治疗剂施用于被诊断患有或被认为患有补体相关性肾病的个体，可以导致10-60％降低的血清胱抑素C浓度(例如约10％、11％、12％、13％、15％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或60％降低的血清胱抑素C浓度中的任一种)。血清胱抑素C浓度的测量是本领域常规的，并且可以通过任何已知的手段执行。

在进一步的实施例中，改善的肾功能可以通过降低的尿C5a浓度显示。具体地，相对于被诊断患有补体相关性肾病的个体中的尿C5a浓度，所述个体未施用抑制C5的表达或活性的抑制剂，将临床有效量的抑制C5的表达或活性的治疗剂施用于被诊断患有或被认为患有补体相关性肾病的个体，可以导致约40-85％降低的尿C5α浓度(例如约40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、56％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％或85％降低的尿C5a浓度中的任一种)。尿C5a浓度的测量是本领域常规的，并且可以通过任何已知的手段执行。

本文还提供的是用于降低被诊断患有或被认为患有补体相关性肾病的个体中的肾小球膜攻击复合物(MAC)形成的方法。该方法包括施用临床有效量的治疗剂，例如上述治疗剂中的任一种。相对于未施用治疗剂的被诊断为补体相关性肾病的个体中的肾小球MAC形成，治疗剂的施用导致降低的肾小球MAC形成。例如，相对于被诊断患有补体相关性肾病的个体中的MAC形成，所述个体未施用抑制C5的表达或活性的抑制剂，将临床有效量的抑制C5的表达或活性的治疗剂施用于被诊断患有或被认为患有补体相关性肾病的个体，可以导致约5-20％降低的MAC形成(例如约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、15％、15％、16％、17％、18％、19％或20％降低的MAC形成中的任一种)。MAC形成的测量是本领域常规的，并且可以通过任何已知的手段(例如但不限于MAC的C9组分对来自个体的肾组织中的肾小球簇的免疫组织化学染色)执行。

本文还提供的是用于降低免疫细胞浸润到被诊断患有或被认为患有补体相关性肾病的个体的肾的肾小球或间质内的方法。该方法需要施用临床有效量的治疗剂，例如上述治疗剂中的任一种。相对于未施用治疗剂的被诊断患有补体相关性肾病的个体的肾中的免疫细胞浸润，治疗剂的施用导致个体的肾中降低的免疫细胞浸润。在一些实施例中，免疫细胞是浸润肾小球的嗜中性粒细胞。免疫细胞也可以是浸润间质的巨噬细胞。例如，相对于被诊断患有补体相关性肾病的个体的肾中的肾小球嗜中性粒细胞浸润，所述个体未施用抑制C5的表达或活性的抑制剂，将临床有效量的抑制C5的表达或活性的治疗剂施用于被诊断患有或被认为患有补体相关性肾病的个体，可以导致约50-100％降低的肾小球嗜中性粒细胞浸润(例如约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、56％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％降低的肾小球嗜中性粒细胞浸润中的任一种)。作为另一个例子，相对于被诊断患有补体相关性肾病的个体的肾中的间质巨噬细胞浸润，所述个体未施用抑制C5的表达或活性的抑制剂，将临床有效量的抑制C5的表达或活性的治疗剂施用于被诊断患有或被认为患有补体相关性肾病的个体，可以导致约30-70％降低的间质巨噬细胞浸润(例如约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、56％、66％、67％、68％、69％或70％降低的间质巨噬细胞浸润中的任一种)。免疫细胞浸润的测量是本领域公知的，并且可以通过任何已知的手段执行(例如但不限于，嗜中性粒细胞的表面上Gr-1的免疫组织化学染色或巨噬细胞的表面上F4/80的染色)。

本文另外提供的是用于降低被诊断患有或被认为患有补体相关性肾病的个体的肾中的肾小球大小和/或系膜基质扩张的方法。该方法包括施用临床有效量的治疗剂，例如上述治疗剂中的任一种。相对于未施用治疗剂的被诊断患有补体相关性肾病的个体的肾中的肾小球大小和/或系膜基质扩张，治疗剂的施用导致降低的肾小球大小和/或系膜基质扩张。具体地，相对于被诊断患有补体相关性肾病的个体中的肾小球大小和/或系膜基质扩张，所述个体未施用抑制C5的表达或活性的抑制剂，将临床有效量的抑制C5的表达或活性的治疗剂施用于被诊断患有或被认为患有补体相关性肾病的个体，可以导致约15-30％降低的肾小球大小和/或系膜基质扩张(例如约15％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％降低的肾小球大小和/或系膜基质扩张中的任一种)。肾小球大小和/或系膜基质扩张的测量是本领域常规的，并且可以通过任何已知的手段(例如通过源自个体的肾组织的染色和光学显微镜评估)执行。

本文还提供的是用于改善被诊断患有或被认为患有补体相关性肾病的个体的预期寿命的方法。该方法包括施用临床有效量的治疗剂，例如上述治疗剂中的任一种。相对于未施用治疗剂的被诊断患有补体相关性肾病的个体的预期寿命，治疗剂的施用导致增加的预期寿命。具体地，相对于被诊断患有补体相关性肾病的个体中的预期寿命，所述个体未施用抑制C5的表达或活性的抑制剂，将临床有效量的抑制C5的表达或活性的治疗剂施用于被诊断患有或被认为患有补体相关性肾病的个体，可以导致约10-70％增加的预期寿命(例如约10％、11％、12％、13％、15％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、56％、66％、67％、68％、69％或70％增加的预期寿命中的任一种)。

本文还提供的是用于降低被诊断患有或被认为患有补体相关性肾病的个体中的重量减轻的方法。该方法包括施用临床有效量的治疗剂，例如上述治疗剂中的任一种。相对于未施用治疗剂的被诊断患有补体相关性肾病的个体的重量减轻，治疗剂的施用导致降低的重量减轻。具体地，相对于被诊断患有补体相关性肾病的个体中的重量减轻，所述个体未施用抑制C5的表达或活性的抑制剂，将临床有效量的抑制C5的表达或活性的治疗剂施用于被诊断患有或被认为患有补体相关性肾病的个体，可以导致约10-70％降低的重量减轻(例如约10％、11％、12％、13％、15％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、56％、66％、67％、68％、69％或70％降低的重量减轻中的任一种)。

通过参考下述实例可以进一步理解本文公开的方法，所述实例以举例说明的方式提供，并且决不意味着是限制性的。

实例

实例1：用人C3基因替换内源性小鼠C3基因。

(I)MAID 6149HO和MAID 6156HO小鼠的产生。

MAID 6149小鼠-用人C3启动子和编码外显子1到41的替换：含有5'调节元件和人C3基因的编码外显子1到41全部的人C3基因替换跨越5'调节元件和编码外显子1到41全部的鼠C3基因基因座(图1A)。

初步地，通过用floxed neo盒替换编码外显子2到41，并且包括对聚腺苷酸化位点3'的900bp，在小鼠ES细胞中生成25kb小鼠C3基因的靶向缺失。所得的小鼠ES细胞，12132ES细胞是杂合的C3敲除。根据本领域已知的程序，使用12132细胞来生成C3敲除小鼠。

生成靶向构建体，其含有侧接人C3序列的小鼠C3上游和下游同源臂，所述人C3序列从编码外显子1上游的5'调节元件延伸到编码外显子41和3'非翻译区以及floxed hygro选择盒，并且电穿孔到12132ES细胞内。用瞬时Cre表达载体进一步电穿孔正确靶向的ES细胞(MAID 6148)，以去除药物选择盒。将不含药物盒的靶向ES细胞克隆(MAID 6149)引入8细胞期小鼠胚胎内。通过使用等位基因测定的修饰，对于小鼠等位基因的丢失和人等位基因的获得进行基因分型，来鉴定完全源自携带人源化C3基因的供体ES细胞的F0小鼠(参见Valenzuela等人(2003))。MAID 6149小鼠含有约53.4kb的人序列，包括人C3外显子1上游约9kb、约42.8kb的完整人C3基因、以及聚A信号下游约1.5kb的人序列；并且该53.4kb的人序列已替换约30.6kb的小鼠序列，包括小鼠C3外显子1上游约6.5kb的小鼠序列、以及从外显子1开始到终止密码子的约24.1kb的小鼠C3基因。

通过TaqMan^TM qPCR测定来确认floxed neo盒替换C3敲除12132ES细胞中缺失的小鼠C3基因序列的确认，所述测定包含下述引物-探针组(5'至3'书写)：12132TU，小鼠C3内含子1：正向引物，GGCCTGATTACATGGACCTG TC(SEQ ID NO:1)；反向引物，CCCAGGCTTGGCTGGAATG(SEQ ID NO:2)；探针，FAM-TGTCCACTCT GGAAGCCCAGGC-BHQ(SEQ IDNO:3)；12132TD，小鼠C3外显子41的3'：正向引物，GCCAGGAGAG GAAGCTGGAG(SEQ ID NO:4)；反向引物，TGGCTCAGCAGTAAAGAACA C(SEQ ID NO:5)；探针，FAM-ACAGATTGCTGTGAGCTGCCCAAA-BHQ(SEQ ID NO:6)；neo盒：正向引物，GGTGGAGAGG CTATTCGGC(SEQ ID NO:7)；反向引物，GAACACGGCGGCATCAG(SEQ ID NO:8)；探针，FAM-TGGGCACAAC AGACAATCGGCTG-BHQ(SEQID NO:9)。

通过TaqMan^TM qPCR测定来确认人C3基因序列替换人源化等位基因中缺失的小鼠C3基因序列的确认，所述测定包含下述引物-探针组(5'至3'书写)：mC3-1，小鼠C3启动子：正向引物，GCCAGCCTAG CCTACTTCA(SEQ ID NO:10)；反向引物，GCCACCCATC CCAGTTCT(SEQID NO:11)；探针，FAM-CAGCCCAGGC CCTTTAGATT GCA-BHQ(SEQ ID NO:12)；mC3-2，小鼠C33'非翻译区，正向引物，TACGGTGTTA GGTTCACTAT TGGT(SEQ ID NO:13)；反向引物，GTCGCCAGCA GTCTCATACA G(SEQ ID NO:14)；探针，CAL Orange-AGTGGGCATC CCTTGCCAGGC-BHQ(SEQ ID NO:26)；hygro盒：正向引物，TGCGGCCGAT CTTAGCC(SEQ ID NO:15)；反向引物，TTGACCGATT CCTTGCGG(SEQ ID NO:16)；探针，FAM-ACGAGCGGGT TCGGCCCATT C-BHQ(SEQID NO:27)；hC3-1，人C3启动子：正向引物，GGGCCTCCTA AGTTTGTTGA GTATC(SEQ ID NO:17)；反向引物，CAGGGCTGGT TCCCTAGAAA TC(SEQ ID NO:18)；探针，FAM-TACAATAGCAGGCACAGCAC CCA-BHQ(SEQ ID NO:19)；hC3-2，人C3内含子1：正向引物，GGCTGAGAGTGGGAGTCATG(SEQ ID NO:20)；反向引物，GCACTTGCCA ATGCCATTAT C(SEQ ID NO:21)；探针，FAM-CTGCTGTCCT GCCCATGTGG TTG-BHQ(SEQ ID NO:22)；hC3-3，人C3外显子41：正向引物，CGAATGCCAA GACGAAGAGA AC(SEQ ID NO:23)；反向引物，GGGCACCCAA AGACAACCAT(SEQ IDNO:24)；探针，CAL Orange-CAGAAACAAT GCCAGGACCT CGGC-BHQ(SEQ ID NO:25)。

相同的LONA测定用于测定对于源自靶向ES细胞的小鼠从尾部活组织检查纯化的DNA，以确定其C3基因型并且确认人源化C3等位基因已通过种系传递。育种对于替换杂合的两个幼崽以生成小鼠，其对于通过人C3基因替换内源性小鼠C3基因是纯合的。对于替换纯合的幼崽用于表型分型。

小鼠C3基因座与含有人C3基因的序列的连接、含有人C3基因的序列与floxedhygro选择盒的连接、以及floxed hygro选择盒的序列与鼠C3基因座的连接顺序，如上文在美国专利申请公开号20150313194中所述进行测定，所述美国专利申请的公开内容以引用的方式并入本文。

MAID 6156小鼠-用人C3编码外显子2到41的替换：含有人C3基因的编码外显子2到41的人C3基因替换跨越编码外显子2到41的鼠C3基因基因座。上述方法基本上用于用人C3基因序列替换小鼠C3基因序列(图1B)。

初步地，通过用floxed neo盒替换编码外显子2到41，并且包括对聚腺苷酸化位点3'的900bp，在小鼠ES细胞中生成25kb小鼠C3基因的靶向缺失。所得的小鼠ES细胞，12132ES细胞是杂合的C3敲除。

生成靶向构建体，其含有侧接人C3序列的小鼠C3上游和下游同源臂，所述人C3序列从编码外显子2上游延伸到编码外显子41和3'非翻译区以及floxed hygro选择盒，并且电穿孔到12132ES细胞内。用瞬时Cre表达载体进一步电穿孔正确靶向的ES细胞(MAID6155)，以去除药物选择盒。将不含药物盒的靶向ES细胞克隆(MAID 6156)引入8细胞期小鼠胚胎内。如上所述，通过对于小鼠等位基因的丢失和人等位基因的获得进行基因分型，来鉴定完全源自携带人源化C3基因的供体ES细胞的F0小鼠。

通过TaqMan^TM qPCR测定来确认floxed neo盒替换C3敲除12132ES细胞中缺失的小鼠C3基因序列，以及人C3基因序列替换人源化等位基因中缺失的小鼠C3基因序列的确认，所述测定包含如上文对于MAID 6149小鼠描述的相同引物-探针组(5'至3'书写)。

相同的LONA测定用于测定对于源自靶向ES细胞的小鼠从尾部活组织检查纯化的DNA，以确定其C3基因型并且确认人源化C3等位基因已通过种系传递。育种对于替换杂合的两个幼崽以生成小鼠，其对于通过人C3基因替换内源性小鼠C3基因是纯合的。对于替换纯合的幼崽用于表型分型。

小鼠C3基因座与含有人C3基因的序列的连接、含有人C3基因的序列与floxedhygro选择盒的连接、以及floxed hygro选择盒的序列与鼠C3基因座的连接顺序如上文所述进行测定。

(II)关于C3血清浓度的测定。

使用ELISA和蛋白质印迹在MAID 6149小鼠和MAID 6156小鼠中测定血清C3浓度。简言之，如下完成蛋白质印迹分析：小鼠或正常人血清(NHS)在PBS中进行稀释。纯化的人C3b蛋白(Calbiochem)用作阳性对照。小鼠C3缺乏的血清用作阴性对照。将血清或纯化的hC3蛋白加入含有巯基乙醇和SDS的电泳样品上样缓冲液中，并且在还原/变性条件下在聚丙烯酰胺凝胶上运行，然后转移到硝酸纤维素膜上。将印迹阻断，然后用多克隆山羊抗小鼠C3一抗(Abnova)或针对人C3的多克隆山羊抗血清(Quidel)探测，随后为用驴抗山羊IgGHRP(Santa Cruz)的检测。ThermoScientific Super Signal West PicoChemiluminescent Substrate用于发展印迹。GE Image Quant LAS4000用于成像。根据制造商的说明，用补体C3人ELISA试剂盒和补体C3小鼠ELISA试剂盒(Abcam)测定血清C3浓度。如下通过ELISA测定蛋白质水平：根据制造商的说明，分别用补体C3小鼠ELISA试剂盒(Abcam)和补体C3人ELISA试剂盒(Abcam)测量小鼠和人C3。用BD OptEIA^TM Human C3aELISA试剂盒(BD Biosciences)测量人C3a。根据制造商的说明，用来自BD Biosciences的下述试剂测量小鼠C3a：纯化的大鼠抗小鼠C3a抗体、生物素大鼠抗小鼠C3a抗体和纯化的小鼠C3a蛋白(天然的)。

如图2中所示，ELISA测定揭示相对于野生型对照，在六周龄和10周龄两者时，小鼠C3(图2A)和小鼠C3a(图2B)在源自6156纯合小鼠和6149纯合小鼠的血清以及血浆中均无法检测到。相比之下，图3显示在源自6156纯合小鼠和6149纯合小鼠的血浆和血清中检测到人C3(图3A)以及人C3a(图3B)，尽管其浓度低于在正常人血浆或血清中对于这些蛋白质观察到的浓度。测定小鼠血清淀粉样蛋白A蛋白(mSAA)存在的对照实验发现，与其野生型配对物相比，C3人源化的纯合小鼠中表达的可比较水平。对源自MAID6149和MAID 6156纯合动物两者的血清执行的蛋白质印迹证实它们表达人而非鼠C3蛋白。在这些实验中使用的抗hC3抗体与小鼠C3蛋白交叉反应(图5A和图5B)。

总之，该实例证实人源化的C3小鼠的产生。MAID 6156纯合小鼠和MAID6149纯合小鼠两者均表达人C3蛋白，并且不表达任何鼠C3蛋白。

实例2：C3人源化小鼠的寿命和总体形态。

(I)C3人源化小鼠相对于野生型的平均死亡年龄和重量。

对于这些实验，从动物饲养所记录中获得死亡率和死亡年龄。另外，在小鼠群组中监测MAID 6156纯合和MAID 6149纯合小鼠的重量。最后，如下测定瘦组织体积、全身脂肪体积和％脂肪体积：使用体内QuantumμCT系统(PerkinElmer)扫描小鼠。将X射线源设定为160μA的电流、90kVp的电压。通过异氟烷麻醉小鼠，用60mm x 120mm的视野扫描全身，排除头部。扫描花费34秒，其体素尺寸为240μm。通过Analyze软件(Mayo Clinic)分析成像。通过灰度值分割骨、脂肪和瘦组织，并且计算组织体积、脂肪体积分数、骨矿物质密度(BMD)和骨矿物质含量。

MAID 6156纯合小鼠和MAID 6149纯合小鼠两者均显示出高比率的自发性死亡，特别是在F2代中。然而，在后代(F3和F4；图6)中观察到存活增加。

另外，与同等年龄的野生型小鼠相比，两个小鼠品系均显示出降低的重量(图7)。特别地，MAID 6149小鼠在第20周龄左右开始减轻重量。类似地，与野生型配对物相比，两个小鼠品系均显示出瘦组织体积、全身脂肪体积和体脂百分比中的降低(图8A和图8B)。如图9中所示，与野生型配对物相比，MAID 6149(图9A)和MAID 6156(图9B)纯合小鼠两者均显示出降低的骨密度和降低的骨矿物质含量。

总之，该实例证实，与野生型配对物相比，人源化的C3小鼠显示出高比率的自发性死亡、降低的重量、降低的体脂百分比、骨密度和骨矿物质含量。

(II)C3人源化小鼠相对于野生型的总体形态

在自发性死亡后，通过有资格的兽医在MAID 6156纯合的C3人源化小鼠中评价总体形态。验尸检查揭示，与野生型配对物相比，纯合小鼠显示出骨形成不全(肋骨、颅骨和所有其它骨骼)和皮下脂肪的明显缺乏。

实例3：C3人源化小鼠中肾和肝损伤的表征

(I)肾组织病理学

简言之，苏木精和伊红(H&E)染色涉及用苏木精染色，用酸性乙醇区分，随后为用曙红染色。使用商业供应商(Histoserv Inc.)进行肾切片的过碘酸-希夫(PAS)染色。简言之，沿着矢状面由福尔马林固定、石蜡包埋的小鼠肾组织制备5微米的薄切片，以包括肾的所有解剖区域。使切片脱石蜡并且用PAS染色，以检测组织中的糖蛋白、糖脂和粘蛋白。如下执行PAS染色切片中的系膜基质扩张的定量测定。简言之，PAS染色的切片在具有40X物镜的Aperio AT2载玻片扫描仪中成像。对于系膜细胞基质扩张的测量，至少25个肾小球/切片经受PAS阳性区域的测量。使用Indica Labs Area Quantification算法的修改，将基于光密度的阈值应用于每个肾小球簇，从希夫阳性基质(亮紫色)中分离核染色(深蓝色)和背景(浅粉色)。测量并报告基质和总簇面积，连同作为簇面积百分比的系膜细胞基质。

正常肾(图10A)和MAID 6156纯合小鼠肾(图10B)之间的组织学比较揭示肾小球肾炎的证据，其包括嗜碱性小管、硬化肾小球和具有蛋白管型的扩张小管，其与单核间质炎症相关。观察到6/7小鼠存在自发性肾病。这些小鼠中的三只具有显著的肾小球肾炎，考虑到小鼠的幼龄，所述肾小球肾炎被视为该状况的早期发作。此外，纯合小鼠显示出免疫抑制的证据，具有在脾和派氏斑(Peyer’s patch)中观察到降低数目的淋巴细胞。此外，如图11A中所显示且如图11B中所定量的，与野生型小鼠相比，来自人源化的C3小鼠的过碘酸-希夫(PAS)染色的肾显示出系膜基质扩张。关于图11B中所示的定量，增加的肾小球簇区域指示肾小球肥大。肾小球中PAS染色区域的增加指示系膜基质扩张。

(II)血清、肝和尿化学

如下测定钠、钾、氯化物、钙、葡萄糖、BUN、脂肪酶、总蛋白、肌酸酐、肌酸激酶、白蛋白、淀粉酶、胆红素、镁、磷酸盐、尿酸、磷、游离脂肪酸、胆固醇、甘油三酯、HDL、非HDL和LDL的血清水平。简言之，根据制造商的说明，在ADVIA Chemistry System上测试血清。类似地，根据制造商的说明，还在ADVIA Chemistry System上测试血清肝酶。

根据制造商的说明书，测量尿白蛋白、尿肌酐(Exocell Inc.)、BUN(BioAssaySystems)和血清胱抑素C(BioVendor)。

在野生型和人源化的C3小鼠之间，关于钠、钾、氯化物、钙、葡萄糖、总蛋白、肌酸酐、肌酸激酶、白蛋白、淀粉酶、总胆红素、镁、无机磷酸盐、尿酸、磷、非酯化脂肪酸、总胆固醇、甘油三酯、HDL和LDL的血清化学实验对象组分析中未发现差异(图12)。然而，与野生型配对物相比，在从人源化的C3小鼠获得的血清中观察到升高的血尿素氮(BUN)以及升高水平的脂酶和非HDL(图13A)。这些结果指示肾功能障碍，并且还与心血管状况如充血性心力衰竭或近期发生的心肌梗塞有关。此外，肝酶实验对象组的结果显示升高的丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶和碱性磷酸酶水平，这指示肝损伤(图13B)。尿分析显示，与野生型配对物相比，白蛋白在人源化的C3小鼠中升高，指示肾功能障碍(图14A)。进一步的时程血清分析揭示，血清BUN和胱抑素C在人源化的C3小鼠中增加，指示肾衰竭(图14B)。

总之，关于人源化的C3小鼠的血清、肝酶和尿分析结果指示肾功能障碍和/或衰竭以及与纤维化一致的肝缺陷。

实例4：C3人源化小鼠的肾中的异常补体沉积

根据下述方案，就C3沉积和C5b-9膜攻击复合物的存在，免疫荧光评价来自MAID6149纯合小鼠和野生型小鼠的肾组织的横切面。简言之，矢状切片由冷冻的OCT包埋的肾制成，并且用大鼠抗小鼠C3单克隆抗体(Abcam)或兔多克隆C5b-9抗体(Abcam)染色。Cy3驴抗大鼠(Jackson ImmunoResearch)或Cy3驴抗兔二抗(Jackson ImmunoResearch)分别用于显现染色。分别使用Leica DM5500或DM6000显微镜获取荧光图像。

荧光染色揭示人源化的C3小鼠的肾中的大量C3沉积(图15A)。另外的染色显示huC3小鼠的肾小球中的C3b-9膜攻击复合物沉积增加，这指示活化的补体途径(图15B)。由这些发现以及先前讨论的肾小球C3片段沉积以及增加的系膜基质和电子致密沉积物的那些提示的旁路补体途径的异常调节，与肾小球病如C3肾小球病相关联。根据制造商的方案，使用小鼠补体组分C5a DuoSet(R&D systems)，在huC3小鼠中测量尿C5a水平。与WT小鼠相比，尿C5a水平在huC3小鼠中高度上升(图15C)。

除升高的尿C5a水平之外，肾中增加的C5b-9染色提示huC3小鼠的肾中补体途径的局部活化。

实例5：C3人源化小鼠的RNA序列标记

如下执行比较MAID 6149和MAID 6156纯合小鼠两者针对彼此以及野生型配对物的表达RNA序列标记的确定。

转录组测序数据生成和读数映射：使用MagMAX试剂盒(Life tech,Carlsbad,CA)，从小鼠组织样品中提取总RNA。使用mRNA纯化试剂盒(Invitrogen,Waltham,MA)，从4μg总RNA中纯化mRNA。使用ScriptSeq^TM mRNA-Seq文库制备试剂盒(Epicentre)，随后为十二个PCR扩增循环，制备链特异性RNA-seq文库。通过具有33个循环的多路单读运行，在Illumina2000(Illumina)上执行测序。经由Illumina Casava 1.8.2，将Illumina Hiseq2000图像文件(BCL文件)中的序列读数转换为FASTQ格式。读数基于其条形码进行解码，并且对于每个个别样品进行合并。用FastQC评估每个样品的总读数质量，以仅保留具有足够质量的样品。随后，使用具有一个允许错配的商业软件CLCBio，将读数映射到小鼠基因组(构建mm10)。

差异表达基因的统计分析：对于每个基因，鉴定且计数映射到基因的有义链外显子的读数。可检测基因基于其在基因水平上概括的总外显子有义链读数计数来标记。应用经验最小外显子读数计数10，以确定每个样品中基因的不存在和存在。为了比较两组样品，如果基因在较高表达组的所有样品中并未标记为存在，则它们被消除。接下来，使用DESeq包[Genome Biology2010,11:R106]，计算与比较相关的倍数变化和p值。选择在任一方向上具有≥1.5的倍数变化(即，比率)和p值<0.01的基因，作为显著扰乱的基因标记。

如图16中所示，RNA表达的器官特异性分析显示，与野生型配对物相比，人源化的C3小鼠在肝中具有最多的基因表达变化，并且在肾中程度较小。该分析还显示相对于在MAID 6156小鼠中观察到的那种，MAID 6149小鼠在心脏中具有更高数目的基因表达变化。

MAID 6149和MAID 6156小鼠之间的肝基因表达标记的比较显示在两个小鼠品系之间上调或下调的基因数目中的显著重叠(图17)。在两个品系之间最扰乱的基因表达途径涉及与细胞外基质的产生、对创伤的应答和小分子的跨膜转运相关的那些(图18)。特别地，与肝纤维化相关的基因表达模式显示在MAID 6156纯合小鼠中是特别升高的(图19)。

对于肾执行的类似比较显示有限的基因标记重叠，但总体上MAID 6149和MAID6156小鼠在RNA表达的扰乱趋势/模式中共享一致性(图20)。特别地，与肾损伤相关的基因在人源化的C3品系中富集。

总之，RNA表达的分析指示肝基因在MAID 6149和MAID 6156纯合小鼠品系两者中是最扰乱的。关于MAID 6156品系，与细胞周期和纤维化以及炎症相关的基因具有最显著的标记。炎症和类固醇代谢基因标记在MAID 6149纯合小鼠中富集。特别地，Tnfsf14基因在两个人源化的C3小鼠品系的肝中高度上调。Tnfsf14基因编码LIGHT蛋白，也称为肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14)，其为TNF超家族的分泌蛋白。然而，由于该基因是小鼠基因组中C3的3'邻居，它的过表达可能是假象。其为编码与血管生成和发育相关的蛋白质的基因Prok1，是纯合小鼠品系之间的最高下调基因。

通过RNASeq执行具有晚期肾病的huC3小鼠的肾中的基因表达的进一步表征(与WT小鼠中的20-35mg/dl相比，这些小鼠中的BUN水平为60-120mg/dl)。huC3小鼠显示几种上调或下调的基因表达变化(图21A)。数据的进一步分析揭示了几种肾毒性基因(图21B)、ECM基因(图21C)、细胞因子(图21D)和趋化因子(图21E)的上调表达。

总之，具有晚期肾病的huC3小鼠的肾中的基因表达数据指示进行中的损伤和炎症。

实例6：抗C5抗体在治疗补体相关性肾病中的功效

如上所述，发现对于C3人源化的小鼠具有自发性死亡、正常至低溶血活性、低循环C3(约40ug/mL，与正常小鼠中可见的1000ug/mL相对)、以及多器官病理学包括肾炎症和肾中C3沉积物的存在。

在该实例中，用50mg/kg的抗C5抗体M1M17628N或同种型对照皮下处理8周龄的C3人源化小鼠，每周三次，共9周。如上所述研究死亡率、血尿素氮、血清胱抑素C、尿白蛋白和C5a水平。如上所述通过组织病理学染色研究C3和C5b-9。

用抗C5抗体处理显著改善了人源化的C3小鼠中的存活率，与用同种型对照处理的小鼠中81％的死亡率相比，用抗C5抗体处理的小鼠仅显示20％的死亡率(图22)。用抗C5抗体处理改善了人源化的C3小鼠中的体重(图23)和改善的肾功能标记物，例如BUN(图24A)和血清胱抑素C(图24B)。不存在对尿白蛋白可见的作用(数据未显示)；然而，用抗C5抗体处理后尿C5a水平降低(图25)。

组织病理学染色显示，与用抗C5抗体处理的C3人源化小鼠和用同种型对照处理的野生型小鼠相比，用同种型对照处理的C3人源化小鼠中增加的肾小球膜攻击复合物(MAC)含量(C5b-9)(图26)。用抗C5抗体处理显著降低肾小球嗜中性粒细胞(图27A)和间质巨噬细胞浸润(图27B)到人源化的C3动物的肾内。此外，与用抗C5抗体处理的C3人源化小鼠和用同种型对照处理的野生型小鼠相比，用同种型对照处理的C3人源化小鼠显示出增加的肾小球大小以及系膜基质扩张(图28)。

总之，结果指示抗C5疗法可以显著改善死亡率和肾功能，以及降低显示出补体相关性肾病症状的啮齿类动物的肾中损伤的组织学体征。

实例7：抗-C5治疗导致人源化的C3小鼠(MAID 6149)中疾病基因标记的深度援救。

从8周龄开始，用小鼠抗小鼠C5抗体或同种型对照抗体(n＝16)处理人源化的C3小鼠(MAID 6149)。用同种型对照(n＝5)处理野生型小鼠。抗体以50mg/kg皮下注射，三次/周。处理持续直至17周龄。在研究结束时，通过下一代测序(NGS)检查存活小鼠的肾中的基因表达。

如图29A中所示，抗C5抗体处理逆转人源化C3 MAID 6149小鼠中的疾病标记基因。援救的疾病标记包括免疫、细胞外基质、细胞因子、补体和代谢相关基因(图29B)。在人源化的C3小鼠中上调的免疫细胞类型标记物显示随后通过抗C5抗体处理而减弱(图29C)。

实例8：C5的连续阻断可能是延长人源化的C3小鼠(MAID 6149)的存活所必需的。

从8周龄开始，用小鼠抗小鼠C5抗体或同种型对照抗体(n＝15)处理人源化的C3小鼠。抗体以50mg/kg皮下注射，三次/周。处理在24周龄时停止。

在16周处理期(8-24周龄)过程中，15只小鼠中仅2只死于抗C5抗体。在同一时期，同种型对照组的16只中的13只死亡(图30)。在停止处理后四周内，抗C5抗体处理的几只小鼠死亡(剩余13只中的12只)。该数据提示C5的连续阻断可能是延长人源化的C3 MAID 6149小鼠的存活所必需的。

实例9：C3b的阻断也在人源化的C3小鼠中提供保护。

从8周龄开始，用抗C3b结合/阻断抗体(n＝14)或同种型对照抗体(n＝14)处理人源化的C3小鼠(MAID 6149)。抗体以50mg/kg皮下注射，三次/周。处理持续直至18周龄(总共10周处理期)。

在10周研究期过程中，具有同种型对照的14只小鼠中的十一只死亡(图31A)。14只小鼠中仅1只在同一时期死于抗3b抗体，提示C3b阻断在人源化的C3 MAID 6149小鼠中提供了显著的存活益处。抗C3b阻断抗体还改善了人源化的C3小鼠中的体重，提示健康状况中的改善(图31B和图31C)。总之，这些数据指示C5上游的C3b的阻断也在人源化的C3小鼠中提供保护。

序列表

<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

<120> 肾病症和肝病症的人源化模型

<130> P19H44594A (10207WO01)

<150> 62/583,780

<151> 2017-11-09

<150> 62/529,916

<151> 2017-07-07

<150> 62/464,262

<151> 2017-02-27

<160> 27

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 1

ggcctgatta catggacctg tc 22

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 2

cccaggcttg gctggaatg 19

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 3

tgtccactct ggaagcccag gc 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 4

gccaggagag gaagctggag 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 5

tggctcagca gtaaagaaca c 21

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 6

acagattgct gtgagctgcc caaa 24

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 7

ggtggagagg ctattcggc 19

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 8

gaacacggcg gcatcag 17

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 9

tgggcacaac agacaatcgg ctg 23

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 10

gccagcctag cctacttca 19

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 11

gccacccatc ccagttct 18

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 12

cagcccaggc cctttagatt gca 23

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 13

tacggtgtta ggttcactat tggt 24

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 14

gtcgccagca gtctcataca g 21

<210> 15

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 15

tgcggccgat cttagcc 17

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 16

ttgaccgatt ccttgcgg 18

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 17

gggcctccta agtttgttga gtatc 25

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 18

cagggctggt tccctagaaa tc 22

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 19

tacaatagca ggcacagcac cca 23

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 20

ggctgagagt gggagtcatg 20

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 21

gcacttgcca atgccattat c 21

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 22

ctgctgtcct gcccatgtgg ttg 23

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 23

cgaatgccaa gacgaagaga ac 22

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 24

gggcacccaa agacaaccat 20

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 25

cagaaacaat gccaggacct cggc 24

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 26

agtgggcatc ccttgccagg c 21

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 27

acgagcgggt tcggcccatt c 21

Claims (68)

1.一种用于评价用于在补体相关性肾病的治疗中使用的试剂的体内治疗功效的方法，所述方法包括：

(a)将所述试剂施用于啮齿类动物，其基因组包含在包含C3基因的外显子的啮齿类动物基因序列的内源性啮齿类动物C3基因座处由包含人C3基因的至少一个外显子的核酸序列的替换，以形成经修饰的C3基因，其中所述经修饰的C3基因的表达处于在内源性啮齿类动物C3基因座处的啮齿类动物调节元件的控制下；以及

(b)与未施用所述试剂的对照啮齿类动物相比，评价所述试剂是否抑制肾病的一种或多种症状。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述啮齿类动物是小鼠或大鼠。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中包含人C3基因的至少一个外显子的所述核酸序列包含人C3基因的外显子1到外显子41。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中包含人C3基因的至少一个外显子的所述核酸序列包含人C3基因的外显子2到外显子41。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述啮齿类动物是不能表达小鼠C3蛋白的小鼠。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述啮齿类动物是表达由内源性小鼠C5基因编码的小鼠C5蛋白的小鼠。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述试剂选自小分子化学化合物、肽和抗体。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述试剂是抗体。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述试剂是单克隆抗体或其功能性结合片段。

10.根据权利要求7所述的方法，其中所述试剂是抑制性核酸。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述抑制性核酸选自siRNA、shRNA、适体、反义寡核苷酸、三链体形成寡核苷酸和核酶。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述肾病的一种或多种症状包含自发性死亡。

13.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述肾病的一种或多种症状包含重量降低、骨密度降低、体脂降低或其组合。

14.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述肾病的一种或多种症状选自肾小球肾炎、嗜碱性小管、硬化肾小球、具有蛋白管型的扩张小管、系膜基质扩张、肾小球肥大和单核间质炎症中的一种或多种。

15.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述肾病的一种或多种症状包含肾中的C3蛋白沉积。

16.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述肾病的一种或多种症状包含肾中的C5b-9膜攻击复合物沉积。

17.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述肾病的一种或多种症状包含升高的血尿素氮(BUN)、血清脂肪酶、血清胱抑素C或血清非高密度脂蛋白中的一种或多种。

18.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述肾病的一种或多种症状包含增加的尿白蛋白或C5a。

19.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述肾病的一种或多种症状基于确定一种或多种肾病标记基因的表达来评价。

20.一种用于评价用于在肝纤维化的治疗中使用的试剂的体内治疗功效的方法，所述方法包括：

(a)将所述试剂施用于啮齿类动物，其包含在包含C3基因的外显子的啮齿类动物基因序列的内源性啮齿类动物C3基因座处由包含人C3基因的至少一个外显子的核酸序列的替换，以形成经修饰的C3基因，其中所述经修饰的C3基因的表达处于在内源性啮齿类动物C3基因座处的啮齿类动物调节元件的控制下；以及

(b)与未施用所述试剂的对照啮齿类动物相比，评价所述试剂是否抑制肝纤维化的一种或多种症状。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述啮齿类动物是小鼠或大鼠。

22.根据权利要求20或权利要求21所述的方法，其中包含人C3基因的至少一个外显子的所述核酸序列包含人C3基因的外显子1到外显子41。

23.根据权利要求20-22中任一项所述的方法，其中包含人C3基因的至少一个外显子的所述核酸序列包含人C3基因的外显子2到外显子41。

24.根据权利要求20-23中任一项所述的方法，其中所述啮齿类动物是不能表达小鼠C3蛋白的小鼠。

25.根据权利要求20-23中任一项所述的方法，其中所述啮齿类动物是表达由内源性小鼠C5基因编码的小鼠C5蛋白的小鼠。

26.根据权利要求20-25中任一项所述的方法，其中所述试剂选自小分子化学化合物、肽和抗体。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述试剂是抗体。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述试剂是单克隆抗体或其功能性结合片段。

29.根据权利要求26所述的方法，其中所述试剂是抑制性核酸。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述抑制性核酸选自siRNA、shRNA、适体、反义寡核苷酸、三链体形成寡核苷酸和核酶。

31.根据权利要求20-30中任一项所述的方法，其中所述肝纤维化的一种或多种症状是升高的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)或碱性磷酸酶(ALP)中的一种或多种。

32.根据权利要求20-30中任一项所述的方法，其中所述肝纤维化的一种或多种症状基于确定一种或多种肝纤维化标记基因的表达来评价。

33.一种用于鉴定抑制啮齿类动物中的补体相关性肾病症状的试剂的方法，所述啮齿类动物的基因组包含在编码C3基因的外显子的啮齿类动物基因序列的内源性啮齿类动物C3基因座处由包含人C3基因的至少一个外显子的核酸序列的替换，以形成经修饰的C3基因，其中所述经修饰的C3基因的表达处于在内源性啮齿类动物C3基因座处的啮齿类动物调节元件的控制下，所述方法包括：(a)将所述试剂施用于啮齿类动物；以及(b)如果所述试剂抑制啮齿类动物中的补体相关性肾病的一种或多种症状，则将所述试剂鉴定为抑制补体相关性肾病症状的试剂。

34.一种人补体相关性肾病的啮齿类动物模型，其包含在内源性啮齿类动物C3基因座处的经修饰的C3基因，其中所述经修饰的C3基因包括包含人C3基因的至少一个外显子的核酸序列，并且其中所述经修饰的C3基因的表达处于在内源性啮齿类动物C3基因座处的啮齿类动物调节元件的控制下。

35.根据权利要求34所述的啮齿类动物模型，其中所述核酸序列与在啮齿类动物C3基因座处的内源性小鼠C3启动子可操作地连接。

36.一种用于评价候选治疗试剂用于抑制补体相关性肾病症状的治疗有效性的啮齿类动物模型，其包括(a)啮齿类动物，其包含在包含C3基因的外显子的啮齿类动物基因序列的内源性啮齿类动物C3基因座处由包含人C3基因的至少一个外显子的核酸序列的替换，以形成经修饰的C3基因，其中所述经修饰的C3基因的表达处于在内源性啮齿类动物C3基因座处的啮齿类动物调节元件的控制下，其中所述啮齿类动物显示出补体相关性肾病的一种或多种症状；以及(b)一种或多种候选治疗试剂。

37.一种用于鉴定抑制啮齿类动物中的肝纤维化的试剂的方法，所述啮齿类动物的基因组包含在包含C3基因的外显子的啮齿类动物基因序列的内源性啮齿类动物C3基因座处由包含人C3基因的至少一个外显子的核酸序列的替换，以形成经修饰的C3基因，其中所述经修饰的C3基因的表达处于在内源性啮齿类动物C3基因座处的啮齿类动物调节元件的控制下，所述方法包括：(a)将所述试剂施用于啮齿类动物；以及(b)如果所述试剂抑制啮齿类动物中的肝纤维化的一种或多种症状，则将所述试剂鉴定为抑制肝纤维化的试剂。

38.一种人肝纤维化的啮齿类动物模型，其中所述啮齿类动物的基因组包含在内源性啮齿类动物C3基因座处的经修饰的C3基因，其中所述经修饰的C3基因包括包含人C3基因的至少一个外显子的核酸序列，并且其中所述经修饰的C3基因的表达处于在内源性啮齿类动物C3基因座处的啮齿类动物调节元件的控制下。

39.根据权利要求38所述的啮齿类动物模型，其中所述核酸序列与在啮齿类动物C3基因座处的内源性小鼠C3启动子可操作地连接。

40.一种用于评价候选治疗试剂用于抑制肝纤维化症状的治疗有效性的啮齿类动物模型，其包括(a)啮齿类动物，其基因组包含在包含C3基因的外显子的啮齿类动物基因序列的内源性啮齿类动物C3基因座处由包含人C3基因的至少一个外显子的核酸序列的替换，以形成经修饰的C3基因，其中所述经修饰的C3基因的表达处于在内源性啮齿类动物C3基因座处的啮齿类动物调节元件的控制下，其中所述啮齿类动物显示出补体相关性肾病的一种或多种症状；以及(b)一种或多种候选治疗试剂。

41.一种用于治疗被诊断患有补体相关性肾病的个体的方法，其包括施用临床有效量的抑制C5的表达或活性或者抑制C3b的活性的治疗剂。

42.根据权利要求41所述的方法，其中相对于未施用所述治疗剂的被诊断患有补体相关性肾病的个体，所述施用改善肾功能。

43.根据权利要求41所述的方法，其中改善的肾功能包含降低的血尿素氮(BUN)浓度、降低的血清胱抑素C浓度、和/或降低的尿C5a浓度中的一种或多种。

44.根据权利要求41所述的方法，其中相对于未施用所述治疗剂的被诊断患有补体相关性肾病的个体，所述施用降低肾小球MAC形成。

45.根据权利要求41所述的方法，其中相对于未施用抑制C5的表达或活性的治疗剂的被诊断患有补体相关性肾病的个体，所述施用降低所述个体的肾中的免疫细胞浸润。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述免疫细胞是浸润肾小球的嗜中性粒细胞或巨噬细胞。

47.根据权利要求41所述的方法，其中相对于未施用所述治疗剂的被诊断患有补体相关性肾病的个体，所述施用降低所述个体的肾中的肾小球大小和/或系膜基质扩张。

48.根据权利要求41-47中任一项所述的方法，其中所述治疗剂抑制C5的表达或活性。

49.根据权利要求48所述的方法，其中BUN在所述个体中降低约10-50％。

50.根据权利要求48所述的方法，其中血清胱抑素C浓度在所述个体中降低约10-60％。

51.根据权利要求48所述的方法，其中尿C5a浓度在所述个体中降低约40-85％。

52.根据权利要求48所述的方法，其中MAC形成在所述个体中降低约5-20％。

53.根据权利要求48所述的方法，其中所述肾小球的嗜中性粒细胞浸润降低约50-100％。

54.根据权利要求48所述的方法，其中所述间质的巨噬细胞浸润降低约30-70％。

55.根据权利要求48所述的方法，其中肾小球大小和/或系膜基质扩张降低约15-30％。

56.根据权利要求41-55中任一项所述的方法，其中所述补体相关性肾病是非典型溶血尿毒综合征(aHUS)或C3肾小球病(C3G)。

57.根据权利要求57所述的方法，其中所述C3G包含致密沉积物病(DDD)或C3肾小球肾炎(C3GN)。

58.根据权利要求41-55中任一项所述的方法，其中所述治疗剂抑制C5的表达或活性，并且选自抗体、抑制性核酸、非抗体结合多肽、小分子化学化合物及其组合。

59.根据权利要求58所述的方法，其中所述抑制性核酸选自反义寡核苷酸、siRNA、微小RNA(miR)和核酶。

60.根据权利要求41-47中任一项所述的方法，其中抑制C3b的活性的所述治疗剂是抗体、非抗体结合多肽或小分子化学化合物中的一种或多种。

61.根据权利要求58或60所述的方法，其中所述治疗剂是抗体或其功能片段。

62.根据权利要求61所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。

63.根据权利要求61或权利要求62所述的方法，其中所述抗体选自人抗体、人源化抗体、骆驼科化抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv(sdFv)、Fab片段和F(ab')片段。

64.根据权利要求61-63中任一项所述的方法，其中所述个体施用约50mg/kg的抗C5抗体。

65.根据权利要求61-64中任一项所述的方法，其中所述个体每周施用抗C5抗体三次。

66.根据权利要求61-65中任一项所述的方法，其中所述个体施用抗C5抗体约9周。

67.一种抗C3抗体，其用于在补体相关性肾病或肝纤维化的治疗中使用。

68.一种抗C5抗体，其用于在补体相关性肾病或肝纤维化的治疗中使用。