DE69534741T2

DE69534741T2 - In hefe exprimierte heteologe g-protein-gekoppelte rezeptoren, fusionen desselben mit g-proteinen und deren verwendung im biotest

Info

Publication number: DE69534741T2
Application number: DE69534741T
Authority: DE
Inventors: Henry Mark Robbinsville PAUSCH; Alton Bradley Yardley OZENBERGER; Richard John Mount Holly HADCOCK; Alicia Laura Langhorne PRICE; Marie Eileen Ringoes KAJKOWSKI; Richard Donald Princeton KIRSCH; Tardy Deborah Pennington CHALEFF
Original assignee: BASF SE
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 1994-02-14
Filing date: 1995-02-14
Publication date: 2006-11-02
Anticipated expiration: 2015-02-15
Also published as: JPH09510087A; DE69534741D1; AU1846995A; US7148053B2; US20090081764A1; US6406871B1; US5691188A; EP0745130B1; CA2183166A1; US20040023315A1; EP0745130A1; WO1995021925A1; US6607906B1; SG49061A1; US5846819A; ATE315657T1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Expressionskonstrukte für heterologe G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, derartige Rezeptoren exprimierende Hefezellen, zur Herstellung solcher Zellen geeignete Vektoren sowie Verfahren zur Herstellung und Verwendung davon.
Technischer Hintergrund der Erfindung
Die Wirkungen für viele extrazelluläre Signale, beispielsweise Neurotransmitter, Hormone, Duftstoffe und Licht, werden von Rezeptoren mit sieben Transmembrandomänen (G-Protein-gekoppelten Rezeptoren) sowie heterotrimären guaninnukleotidbindenden regulatorischen Proteinen (G-Proteinen) vermittelt. G-Proteine umfassen drei Untereinheiten: eine guanylnukleotidbindende α-Untereinheit, eine β-Untereinheit sowie eine γ-Untereinheit [für eine Übersicht, siehe Conklin, B.R. und Bourne, H.R. (1993 Cell 73, 631-641]. Je nachdem, ob GDP oder GTP an die α-Untereinheit gebunden ist, zyklieren G-Proteine zwischen zwei Formen. Ist GDP gebunden, so existiert das G-Protein als ein Heterotrimer in Form des Gαßγ-Komplexes. Ist GTP gebunden, so dissoziiert die α-Untereinheit, wobei ein Gβγ-Komplex zurückbleibt. Von Bedeutung ist dabei, daß, wenn ein Gαβγ-Komplex mit einem aktivierten G-Protein-gekoppelten Rezeptor in einer Zellmembran operativ in Verbindung tritt, die Geschwindigkeit des Austauschs von gebundenem GDP gegen GTP steigt und sich somit die Geschwindigkeit der Dissoziation der gebundenen Gα-Untereinheit vom Gβγ-Komplex erhöht. Die freie Gα-Untereinheit und der Gβγ-Komplex sind in der Lage, ein Signal auf nachgeschaltete Elemente verschiedener Signaltransduktionswege zu übertragen. Dieses grundlegende Schema von Ereignissen bildet die Grundlage für eine Vielzahl unterschiedlicher Zellsignalisierungs phänomene. Für eine Übersicht, siehe H.G. Dohlman, J. Thorner, M. Caron und R.J. Lefkowitz, Ann. Rev. Biochem, 60, 653-688 (1991). G-Protein-vermittelte Signalisierungssysteme sind in so verschiedenen Organismen wie Hefe und Mensch vorhanden. Die Hefe Saccharomyces cerevisiae wird als eukaryontischer Modellorganismus genutzt. Aufgrund der Leichtigkeit, mit der sich die genetische Konstitution der Hefe Saccharomyces cerevisiae manipulieren läßt, hat sich unter den Forschern ein detailliertes Verständnis vieler komplexer biologischer Wege herausgebildet. Dabei konnte bei zahlreichen Systemen demonstriert werden, daß die Proteinstruktur evolutionär so konserviert ist, daß viele heterologe Proteine ihre Hefeäquivalente ersetzen können. So können beispielsweise Gα-Proteine aus Säugern heterotrimere Komplexe mit Gβγ-Proteinen aus Hefe bilden [Kang, Y.-S., Kane, J., Kurjan, J., Stadel, J.M. und Tipper, D.J. (1990) Mol. Cell. Biol. 10, 2582-2590]. Ferner konnte von Murphy et al. (J. Cell. Biochem. Bd. 18B, Seite 224, 1994) eine autokrine Stimulierung der Hefe durch Austausch der Gα-Untereinheit der Hefe gegen ein modifiziertes menschliches Gα_i2 demonstriert werden. Dies repräsentiert ein sehr spezifisches System, das auf der Expression des Angiotensin-II-Typ-Rezeptors (der die menschliche G-Protein-α-Untereinheit (Gαi2) übernimmt) und dem Angiotensin-II-Octapeptid als entsprechenden Liganden beruht. Die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren stellen wichtige Ziele für neue therapeutische Arzneistoffe dar. Die Entdeckung solcher Arzneistoffe erfordert notwendigerweise Screening-Tests mit hoher Spezifität und hohem Durchsatz. So erfordert beispielsweise ein therapeutisches Eingreifen in die Somatostatin-Wachstumshormon-Achse neue chemische Wirkstoffe, die Somatostatinrezeptorsubtyp-selektiv wirken. Bei dem Somatostatinrezeptor (SSTR) handelt es sich um einen Prototyp der Klasse von Rezeptoren mit sieben Transmembrandomänen in Säugerzellen. Das zyklische Tetradecapeptidsomatostatin wurde zuerst aus Hypothalamus isoliert, und es konnte gezeigt werden, daß es sich dabei um einen starken Inhibitor der Freisetzung von Wachstumshormon aus dem Hypophysenvorderlappen handelt und daß es breite modulatorische Wirkungen im ZNS und in peripheren Geweben aufweist. Als Reaktion auf die Bindung von Somatostatin aktiviert der SSTR ein heterotrimeres G-Protein, das wiederum die Aktivität verschiedener Effektorproteine, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Adenylatcyclasen, Ionenkanälen und Phospholipasen, modifiziert. Die Somatostatineffekte werden über die Wirkungsweise von in fünf unterschiedlichen Rezeptorsubtypen codierten Genprodukten, die kürzlich kloniert werden konnten, weitergeleitet [Strnad, J., Eppler, C.M., Corbett, M. und Hadcock, J.R. (1993) BBRC 191, 968-976; Yamada, Y., Post, S.R., Wang, K., Tager, H.S., Bell, G.I. und Seino, S. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 251-255; Meyerhof, W., Paust, H.-J., Schonrock, C. und Richter, D. (1991); Kluxen, F.-W., Bruns, C. und Lubbert, H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4618-4622; Li, X.-J., Forte, M., North, R.A., Rose, C.A. und Snyder, S. (1992) J. Biol. Chem. 267, 21307-21312; Bruno, J.F., Xu, Y., Song, J. und Berelowitz, M. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 11151-11154; O'Carrol, A.-M., Lolait, S.J., Konig, M. und Mahan, L. (1992) Mol. Pharmacol. 42, 939-946]. Screening-Tests, bei denen zur Anpassung an die funktionelle Expression der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren genetisch modifizierte Hefestämme eingesetzt werden, bieten bei der Forschung an der Bindung von Liganden an den Somatostatinrezeptor ebenso wie eine Reihe weiterer Rezeptoren, die mit verschiedenen Krankheitszuständen in Verbindung gebracht werden, signifikante Vorteile.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung richtet sich auf Expressionsvektoren sowie damit transformierte Hefezellen, wobei die Vektoren eine erste, für einen G- Protein-gekoppelten Rezeptor, beispielsweise den Somatostatinrezeptor, codierende heterologe Nukleotidsequenz sowie eine zweite, für einen G-Protein-αßγ-Komplex in seiner Gesamtheit oder einen Teil davon codierende Nukleotidsequenz enthalten. In bestimmten Ausführungsformen ist eine für eine α-Untereinheit eines heterologen G-Proteins codierende Nukleotidsequenz in ihrer Gesamtheit oder teilweise an eine Nukleotidsequenz von der Hefe-G-Protein-α-Untereinheit fusioniert. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen enthalten die Expressionsvektoren und transformierten Zellen eine dritte heterologe Nukleotidsequenz, die einen auf Pheromon reagierenden Promotor sowie ein stromabwärts von dem auf Pheromon reagierenden Promotor liegendes und damit operativ assoziiertes Indikatorgen umfaßt. Die Vektoren und Zellen können ferner mehrere Mutationen enthalten. Dazu gehören 1) eine Mutation des SCG1/GPA1-Gens aus Hefe, durch die das Hefe-Gα-Protein inaktiviert wird, was die Wechselwirkung des heterologen Rezeptors mit dem G-Protein erleichtert; 2) eine Mutation eines Hefegens, um dessen Funktion zu inaktivieren und der Hefezelle zu ermöglichen, trotz der Aktivierung des Signaltransduktionswegs der Reaktion auf Pheromon weiterzuwachsen, wobei es sich hier bei bevorzugten Ausführungsformen um Mutationen der Gene FAR1 und/oder FUS3 handelt, und 3) eine Mutation eines Hefegens, deren Effekt in einem starken Anstieg der Empfindlichkeit der Reaktion der Zelle auf die rezeptorabhängige Aktivierung des Signaltransduktionswegs der Reaktion auf Pheromon besteht, wobei es sich bei bevorzugten Genen diesbezüglich um die Gene SST2, STE50, SGV1, STE2, STE3, PIK1, AFRI, MSG5 und SIG1 handelt.
Bei einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung handelt es sich um ein chimärisches Expressionskonstrukt sowie damit transformierte Hefezellen, wobei das Konstrukt eine erste, für einen Hefe-G-Protein-gekoppelten Rezeptor codierende Nukleotidsequenz in operativer Assoziation mit einer heterologen Nukleotidsequenz, die für einen heterologen G-Protein-gekoppelten Rezeptor codiert, umfaßt. Dabei können die Konstrukte und Zellen eine zweite heterologe Nukleotidsequenz enthalten, die einen auf Pheromon reagierenden Promotor sowie ein stromabwärts von dem auf Pheromon reagierenden Promotor liegendes und mit diesem operativ assoziiertes Indikatorgen umfaßt. Die Konstrukte und Zellen können ferner mehrere Mutationen enthalten. Zu diesen gehören 1) eine Mutation eines Hefegens, um dessen Funktion zu inaktivieren und der Hefezelle zu ermöglichen, trotz der Aktivierung des Signaltransduktionswegs der Reaktion auf Pheromon weiterzuwachsen, wobei es sich hier bei bevorzugten Ausführungsformen um Mutationen der Gene FAR1 und/oder FUS3 handelt, und 2) eine Mutation eines Hefegens, deren Effekt in einem starken Anstieg der Empfindlichkeit der Reaktion der Zelle auf die rezeptorabhängige Aktivierung des Signaltransduktionswegs der Reaktion auf Pheromon besteht, wobei es sich bei bevorzugten Genen diesbezüglich um die Gene SST2, STE50, SGV1, STE2, STE3, PIK1, AFRI, MSG5 und SIG1 handelt. Ein produktives Signal wird in einem Bioassay durch Kopplung des heterologen Rezeptors an ein Hefeprotein nachgewiesen.
Bei einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung handelt es sich um ein Verfahren zum Testen von Verbindungen zur Bestimmung der Auswirkungen einer Ligandenbindung an die heterologen Rezeptoren durch Messung der Auswirkungen auf das Zellwachstum. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen werden dabei Hefezellen der oben beschriebenen Art in zur Auslösung der Expression heterologer Proteine geeignetem Wachstumsmedium kultiviert, in Agar-Wachstumsmedium eingebettet und auf die Oberfläche der Agarplatten ausgebrachten Verbindungen ausgesetzt. Dabei erwartet man Auswirkungen auf das Wachstum der eingebetteten Zellen um Verbindungen herum, die den heterologen Rezeptor aktivieren. Ein verstärktes Wachstum könnte bei Verbindungen, die als Agonisten wirken, beobachtet werden, während ein reduziertes Wachstum bei solchen, die als Antagonisten wirken, beobachtet werden könnte.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1. Die angegebenen Gα-Expressionsplasmide enthaltende Stämme werden mit Paarungspheromon (α-Faktor) behandelt. Ein Maß für die erhaltene Signaltransduktion wird durch ein FUS1-lacZ tragendes Reporterplasmid bereitgestellt. Die Daten sind als Prozent β-Galactosidaseaktivität, gemessen in einem lediglich das Wildtyp-Gα-Protein exprimierenden Stamm, dargestellt.
2. Das angegebene CUP1p-Gα-Expressionsplasmid enthaltende Stämme, die in die angegebene Kupferkonzentration enthaltendem Medium angezogen wurden, werden mit Paarungspheromon (α-Faktor) behandelt. Ein Maß für die erhaltene Signaltransduktion wird durch ein FUS1-lacZ tragendes Reporterplasmid bereitgestellt. Die Daten sind als Prozent β-Galactosidaseaktivität, gemessen in einem kein exogenes Gα-Protein exprimierenden Stamm, dargestellt.
3. Sättigungsbindung von ³H-Spiperon an aus einem den Serotoninrezeptor 5HT1a exprimierenden Stamm (CY382) präparierte Hefemembranfraktionen. Bmax = 3,2 pmol/mg Protein; Kd – 115 nM.
4. Aminoterminale chimärische Ste2/5HT1a-Rezeptoren. Der CHI11-Rezeptor enthält die ersten 14 Aminosäuren des Hefeproteins Ste2. Der CHI17-Rezeptor weist einen Austausch des Aminoterminus des Rezeptors 5HT1a über die ersten beiden Transmembrandomänen gegen den entsprechenden Bereich des Rezeptors Ste2 auf. Der CHI18-Rezeptor weist die gleichen Ste2-Sequenzen auf, und zwar direkt an den Aminoterminus des 5HT1a- Rezeptors fusioniert, so daß ein Rezeptor erzeugt wird, von dem vorhergesagt wird, daß er die Zellmembran neunmal überspannt. Die Bmax-Werte wurden durch Messen der maximalen Bindung des radioaktiv markierten Liganden 3H-Spiperon bestimmt. Die Werte sind als pmol gebundener radioaktiv markierter Ligand pro mg Gesamtprotein angegeben.
5. Analyse der kompetitiven Bindung der Agonisten Isoproterenol oder Epinephrin gegenüber ¹²⁵I-Cyanopindolol mit von einem den β₂-adrenergen Rezeptor exprimierenden Wildtyp-Hefestamm präparierten Rohmembranextrakten. Die Daten sind als Prozent Maximalbindung des radioaktiv markierten Liganden dargestellt. IC₅₀-Werte = 10 nM, Isoproterenol; 200 nM, Epinephrin.
6. Analyse der kompetitiven Bindung der Agonisten Isoproterenol oder Epinephrin gegenüber ¹²⁵I-Cyanopindolol mit aus einem den β₂-adrenergen Rezeptor sowie Säuger-G_αs coexprimierenden Hefestamm präparierten Extrakten. Die Daten sind als Prozent Maximalbindung des radioaktiv markierten Liganden dargestellt. IC₅₀-Werte = 10 nM, Isoproterenol; 60 nM, Epinephrin.
7. Sättigungsbindung von [¹²⁵I]tyr¹¹S-14 an Membranen von den SSTR2-Subtyp sowie Scgl/G_iα2 coexprimierenden Hefezellen. Membranen von den SSTR2-Subtyp exprimierenden Hefezellen wurden wie unter Experimentelle Vorgehensweisen beschrieben präpariert. Die Sättigungsbindung wurde mit 20-1600 pM [¹²⁵I]tyr¹¹S-14 durchgeführt. Die nichtspezifische Bindung für jeden Punkt in Form von gebundenen cpm in Gegenwart von 1 μM kaltem S-14 reichte von 10 bis 40%. Dargestellt ist ein mit Doppelbestimmung durchgeführtes repräsentatives Experiment.
8. Immunoblot, der die Expression des Somatostatinrezeptors zeigt. Membranfraktionen wurden aus den angegebenen Hefestämmen isoliert. Teilmengen von 5 bis 30 μm Protein werden mittels Polyacrylamidgelelektrophorese/Western-Blot-Analyse untersucht. Die Molekulargewichtsmarker sind in Kilodalton angegeben. Die Somatostatinrezeptor-Proteinbanden sind mit Pfeilen gekennzeichnet. Mehrere Spezies dieses Rezeptors sind zu sehen, und zwar Doppel- sowie Dreifachbanden zusätzlich zu dem 43 kd großen einfachen Rezeptor. Spuren 1+2: CY602 (siehe Tabelle 1); 3+4: CY603; 5+6: CY624; 7: keinen Rezeptor exprimierender kongener Stamm.
9. Immunoblot, der die Expression des muskarinischen Acetylcholinrezeptors (mAchR) zeigt. Membranfraktionen werden aus den angegebenen Hefestämmen isoliert. Teilmengen von jeweils 30 μg Protein werden mittels Polyacrylamidgelelektrophorese/Western-Blot-Analyse, wie im Text beschrieben, untersucht. Die Molekulargewichtsmarker sind in Kilodalton angegeben. mAchR-Proteinbanden sind mit Pfeilen gekennzeichnet.
10. Immunoblot, der die Expression von α2-AR zeigt. Membranfraktionen werden aus den angegebenen Hefestämmen isoliert. Teilmengen von jeweils 30 μg Protein werden mittels Polyacrylamidgelelektrophorese/Western-Blot-Analyse untersucht. Die Molekulargewichtsmarker sind in Kilodalton angegeben. α2-AR-Proteinbanden sind mit Pfeilen gekennzeichnet.
11. Somatostatinrezeptor-Expressionsplasmid pJH1.
12. G-Protein-Expressionsplasmid pLP82.
13 (A&B). Dosisabhängige Reaktion des Wachstums von Hefezellen auf Somatostatin. Kulturen des Hefestamms LY268 werden in Agar (obere Platte) eingebettet oder gleichmäßig über die Oberfläche von Agarplatten ausgestrichen (untere Platte) und den angegebenen, auf oben auf den Agar gelegte Papierscheibchen punktförmig aufgetragenen Mengen an den genannten Verbindungen ausgesetzt. Die Platten werden bei 30°C inkubiert.
14 (A,B,C,&D). Die Reaktion des Wachstums von Somatostatin ausgesetzten Hefezellen hängt von der Menge des exprimierten chimärischen G-Proteins ab. Kulturen von im Text beschriebenen Hefestämmen werden in Agar eingebettet und den angegebenen, auf oben auf den Agar gelegte Papierscheibchen punktförmig aufgetragenen Mengen an den genannten Verbindungen ausgesetzt. Die Platten werden bei 30°C inkubiert.
15 (A,B,C,&D). Die Reaktion des Wachstums von Somatostatin ausgesetzten Hefezellen hängt von der Menge des exprimierten Hefe-G-Proteins ab. Kulturen von im Text beschriebenen Hefestämmen werden in Agar eingebettet und den angegebenen, auf oben auf den Agar gelegte Papierscheibchen punktförmig aufgetragenen Mengen an den genannten Verbindungen ausgesetzt. Die Platten werden bei 30°C inkubiert.
16 (A&B). Hefezellen, die eine Mutation im sst2-Gen zeigen, zeigen eine erhöhte Resistenz gegenüber AT, wenn sie Paarungspheromon ausgesetzt werden. Kulturen von Hefestämmen werden in Agar eingebettet und den angegebenen, auf oben auf den Agar gelegte Papierscheibchen punktförmig aufgetragenen Mengen an α-Paarungsfaktor ausgesetzt. Die Platten werden bei 30°C inkubiert.
17 (A,B,C,&D). Eine Mutation im sst2-Gen verbessert das Wachstum der Somatostatin ausgesetzten Hefezellen. Kulturen von im Text beschriebenen Hefestämmen werden in Agar eingebettet und den angegebenen, auf oben auf den Agar gelegte Papierscheibchen punktförmig aufgetragenen Mengen an den genannten Verbindungen ausgesetzt. Die Platten werden bei 30°C inkubiert.
18. Ligandenbindung an den in Hefe exprimierten CCK_B-Rezeptor der Ratte. Aus Über-Nacht-Flüssigkulturen von LY613-Zellen wurden Rohmembranfraktionen präpariert und danach wie in Methoden und Material beschrieben Sättigungsagonistenbindungstests durchgeführt. Die Sättigungsbindung wurde mit 4-60 nM[³H] CCK-8 (25 μg Protein/Röhrchen) durchgeführt. Die nichtspezifische Bindung für jeden Punkt in Form von gebundenen cpm in Gegenwart von 1 μM kaltem CCK-8 reichte von 20 bis 60%. Dargestellt ist ein mit Doppelbestimmung durchgeführtes repräsentatives Experiment.
19 (A&B). Wachstum von Hefe als Reaktion auf CCK_B-Rezeptoragonisten. Hefestämme, die den CCK_B-Rezeptor der Ratte funktionell exprimieren (LY628, LLY631), wurden wie in Material und Methoden beschrieben kultiviert und auf SC-Galactose (2%)-ura, trp, his-Agarmedium ausplattiert (2 × 10⁴ Zellen/ml). Sterile Filterscheibchen wurden auf die Oberfläche des verfestigten Agars gelegt und mit 10 μl DMSO, das jeweils eine Menge von 10 μl der angegebenen Verbindungen enthielt, gesättigt. Anschließend wurden die Platten 3 Tage bei 30°C inkubiert. (A) CCK-8, (B) CCK-4.
20. A_2a-Adenosinrezeptor-Sättigungsbindungstest. Radioligandenbindungstests wurden in 96-Loch-Mikroliterplatten unter Verwendung von Bindungspuffern (50 nM HEPES, pH 7,4, 10 mM MgCl₂, 0,25% BSA) mit Proteaseinhibitoren (5 μg/ml Leupeptin, 5 μg/ml Aprotinin, 100 μg/ml Bacitracin und 100 μg/ml Benzamidin) durchgeführt. Alle Komponenten wurden in Proteaseinhibitoren enthaltendem Bindungspuffer verdünnt und in der folgenden Reihenfolge in die Löcher der Mikroliterplatte gegeben: Bindungspuffer, kalter Kompetitor (NECA, Endkonzentration 1 μM), [³H]NECA (1-50 nM). Die Bindungsreaktionen wurden durch Zugabe von 82 μg Membranprotein in einem Volumen von 170 μl gestartet. Das endgültige Reaktionsvolumen betrug 200 μl/Loch. Alle Inkubationen wurden über einen Zeitraum von 2 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Freier Radioligand wurde von gebundenem Liganden mittels schneller Filtration durch ein Glasfaserfilter unter Verwendung eines Zellernters von der Firma Inotech getrennt. Die Filterscheibchen wurden danach mehrere Male mit kaltem (4°C) Bindungspuffer ohne BSA vor dem Zählen gewaschen.
21. Wachstum von Hefe als Reaktion auf A_2A-Adenonsinrezeptoragonisten. Wie in Material und Methoden beschrieben kultivierte LY595-Zellen wurden auf SC-Galactose (2%)-ura, trp, his-Agarmedium (2 × 10⁴ Zellen/ml) ausplattiert. Sterile Filterscheibchen wurden auf die Oberfläche des verfestigten Agars gelegt und mit 10 μl DMSO, das die 10 μg der angegebenen Verbindungen enthielt, gesättigt. Anschließend wurden die Platten 3 Tage bei 30°C inkubiert. (A, B) CGS-21680, (B) NECA (C) DPMA.
22. Wachstum von SSTR5 enthaltenden Hefezellen als Reaktion auf Somatostatinrezeptoragonisten. Wie in Material und Methoden beschrieben kultivierte LY620-Zellen wurden auf SC-Galactose (2%)-ura, trp, his-Agarmedium (2 × 10⁴ Zellen/ml) ausplattiert. Sterile Filterscheibchen wurden auf die Oberfläche des verfestigten Agars gelegt und mit 10 μl sterilem Wasser, das die angegebenen Mengen der angegebenen Verbindungen enthielt, gesättigt. Anschließend wurden die Platten 3 Tage bei 30°C inkubiert. (A) 60 nmol S-14, (B) 30 nmol S-28.
23. Wachstum von Schweine-SSTR2 enthaltenden Hefezellen als Reaktion auf Somatostatinrezeptoragonisten. LY474 (zwei unabhängige Isolate: 21,22) wurden wie in Material und Methoden beschrieben kultiviert und auf SC-Galactose (2%)-ura, trp, his-Agarmedium (2 × 10⁴ Zellen/ml) ausplattiert. Sterile Filterscheibchen wurden auf die Oberfläche des verfestigten Agars gelegt und mit 10 μl sterilem Wasser, das die angegebenen Mengen der angegebenen Verbindungen enthielt, gesättigt. Anschließend wurden die Platten 3 Tage bei 30°C inkubiert. (1) 600 pmol, (2) 60 pmol.
24. Die Deletion von MSG5 erhöht die Empfindlichkeit des Hefe-Biotests. Kulturen von Hefestämmen wurden zur Expression des SSTR2 wie in Material und Methoden beschrieben induziert und auf SC-Galactose (2%)-ura, trp, his-Agarmedium (2 × 10⁴ Zellen/ml) ausplattiert. Sterile Filterscheibchen wurden auf die Oberfläche des verfestigten Agars gelegt und mit 10 μl sterilem Wasser, das die angegebenen Mengen an S-14 enthielt, gesättigt. Anschließend wurden die Platten 3 Tage bei 30°C inkubiert. (A) MPY459 sst2ΔADE2 msg5ΔLEU2, (B) MPY458 SST2 msg5ΔLEU2, (C) LY288 SST2 MSG5, (D) LY268 sst2ΔADE2 MSG5.
25 (A&B). Wachstum von Hefe als Reaktion auf GRF-rezeptoragonisten. Wie in Material und Methoden beschrieben kultivierte CY990-Zellen wurden auf SC-Galactose (2%)-ura, trp, his-Agarmedium (2 × 10⁴ Zellen/ml) ausplattiert. Sterile Filterscheibchen wurden auf die Oberfläche des verfestigten Agars gelegt und mit 10 μl sterilem Wasser, das 20 nmol der angegebenen Verbindungen enthielt, gesättigt. Anschließend wurden die Platten 3 Tage bei 30°C inkubiert. (A) hGRF(1-29)-NH₂, (B) hGRF (1-29), (D-arg²)-hGRF(1-29).
26 (A&B). Auswirkung der Überexpression von STE50 auf den SSTR2-Biotest. Das Testmedium sowie die Hefestämme wurden wie in Material und Methoden beschrieben hergestellt. Platte A enthält den STE50-Überexpressionsstamm CY560; Platte B enthält den Kontrollstamm CY562. Auf jede Platte wurden mit Lösungen der folgenden Peptide gesättigte Filterscheibchen aufgebracht: 1 mM Hefe-α-Pheromon (links, Mitte), 1 μg/ml Somatostatin-14 (rechts, oben), 100 μg/ml Somatostatin-14 (rechts, unten). Die Platten wurden 3 Tage bei 30°C inkubiert.
27 (A&B). Biotest von Verbindungen mit Somatostatinrezeptor- und/oder Antagonisteneigenschaften. LY364-Zellen wurden auf SC-Galactose (2%)-ura, trp, his-Agarmedium (2 × 10⁴ Zellen/ml) ausplattiert. Für den Antagonistentest wurde Somatostatin (20 nM S-14) vor dem Gießen zu dem geschmolzenen Agar gegeben. Sterile Filterscheibchen wurden auf die Oberfläche des verfestigten Agars gelegt und mit 10 μl sterilem Wasser, das die Testverbindungen enthielt, gesättigt. Anschließend wurden die Platten 3 Tage bei 30°C inkubiert. (Links) Test für Somatostatinagonisten. Somatostatin (S-14) wurde auf Positionen in der unteren Reihe, linke Seite aufgetragen (6 nmol, 600 pmol, 60 pmol, 600 pmol), (Rechts) Test für Somatostatinantagonisten. Somatostatin (S-14) wurde auf Positionen in der unteren Reihe, linke Seite aufgetragen (6 nmol, 600 pmol, 60 pmol, 600 pmol).
28 (A&B) Fusion von STE2-Sequenzen an den Aminoterminus von SSTR2 reduziert die Signalisierungseffizienz als Reaktion auf Somatostatin. LY268- und LY322-Zellen wurden auf SC-Galactose (2%)-ura, trp, his-Agarmedium ausplattiert (2 × 10⁴ Zellen/ml). Sterile Filterscheibchen wurden auf die Oberfläche des verfestigten Agars gelegt und mit 10 μl Somatostatin (S-14) gesättigt. Anschließend wurden die Platten 3 Tage bei 30°C inkubiert. (A) LY268. S-14 wurde im Uhrzeigersinn von oben auf Filterscheibchen aufgetragen: Träger, 60 nmol, 6 nmol, 600 pmol, 60 pmol, 6 pmol. (B) LY322. S-14 wurde im Uhrzeigersinn von oben auf Filterscheibchen aufgetragen: 0,6 pmol, Träger, 60 nmol, 6 nmol, 600 pmol, 60 pmol, 6 pmol.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Nukleotidbasen werden im vorliegenden Text wie folgt abgekürzt:

A-Adenin G-Guanin

C-Cytosin T-Thymin

U-Uracil (hier manchmal mit „ura" abgekürzt)

Aminosäurereste werden im vorliegenden Text entweder auf drei Buchstaben oder einen einzigen Buchstaben wie folgt abgekürzt:

Ala; A-Alanin	Leu; L-Leucin
Arg; R-Arginin	Lys; K-Lysin
Asn; N-Asparagin	Met; M-Methionin
Asp; D-Asparaginsäure	Phe; F-Phenylalanin
Cys; C-Cystein	Pro; P-Prolin
Gln; Q-Glutamin	Ser; S-Serin
Glu; E-Glutaminsäure	Thr; T-Threonin
Gly; G-Glycin	Trp; W-Tryptophan
His; H-Histidin	Tyr; Y-Tyrosin
Ile; I-Isoleucin	Val; V-Valin

Die Begriffe „DNA" und „Nukleotidsequenz" werden gegeneinander austauschbar verwendet und sollen ohne Beschränkung alle Formen linearer Polymere, die Nukleotidbasen umfassen, einschließen, einschließlich gegebenenfalls RNA.
Der Begriff „Säuger", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine beliebige Säugerspezies (z.B. Mensch, Maus, Ratte und Affe).
Der Begriff „heterolog" wird hier in bezug auf Hefe verwendet und bezieht sich somit auf DNA-Sequenzen, Proteine und andere Materialien, die aus anderen Organismen als Hefe stammen (z.B. Säuger, Vögel, Amphibien, Insekten, Pflanzen), oder auf Kombinationen davon, die nicht natürlicherweise in der Hefe angetroffen werden.
Der Begriff „stromaufwärts" bzw. „stromabwärts" wird hier unter Bezug auf die Richtung der Transkription und Translation verwendet, wobei eine vor einer anderen Sequenz transkribierte oder translatierte Sequenz als „stromaufwärts" von der letzteren liegend bezeichnet wird.
Alle G-Protein-gekoppelten Rezeptoren oder Teile davon können ebenso wie die sie codierenden Nukleotidsequenzen zur Praktizierung der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Zu derartigen Rezeptoren gehören beispielsweise, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Adenosinrezeptoren, Somatostatinrezeptoren, Dopaminrezeptoren, Cholecystokininrezeptoren, muskarinische cholinerge Rezeptoren, α-adrenerge Rezeptoren, β-adrenerge Rezeptoren, Opiatrezeptoren, Cannabinoidrezeptoren sowie Rezeptoren für Wachstumshormon freisetzender Faktor, Glucagon und Serotonin. Der Begriff Rezeptor, wie er hier verwendet wird, soll Subtypen der genannten Rezeptoren sowie Mutanten und Homologe davon zusammen mit den diese codierenden Nukleotidsequenzen umfassen. Dem Fachmann ist ebenso ersichtlich, daß in manchen Fällen nicht der gesamte Rezeptor exprimiert zu werden braucht, um die gewünschten Zwecke zu erzielen. Dementsprechend soll der Rezeptor verkürzte Formeln sowie andere Formvarianten eines gegebenen Rezeptors ohne Beschränkung umfassen.
Zur Praktizierung der folgenden Erfindung können alle DNA-Sequenzen, die für eine Gα-Untereinheit (Gα) codieren, verwendet werden. Zu den Gα-Untereinheiten gehören beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, Gs-Untereinheiten, Gi-Untereinheiten, Go-Untereinheiten, Gz-Untereinheiten sowie Gq-, G11-, G16- und transduzierende Untereinheiten. Zu den zur Praktizierung der folgenden Erfindung geeigneten G-Proteinen und Untereinheiten gehören Subtypen sowie Mutanten und Homologe davon zusammen mit den diese codierenden DNA-Sequenzen.
Einem Fachmann ist aus den Lehren, wie sie hier dargestellt sind, ersichtlich, daß die für die Konstrukte und Hefezellen der vorliegenden Erfindung geeigneten G-Proteine heterologe Gα-Untereinheiten, Hefe-Gα-Untereinheiten oder chimärische Hefe-/heterologe Versionen umfassen können. Dabei ist leicht bestimmbar, welche Konfiguration sich am besten für eine angemessene Kopplung an einen bestimmten heterologen Rezeptor eignet, indem man einfach, wie hier gelehrt, Vektoren konstruiert und die Signalgebung der Ligandenbindung als Reaktion auf einen gegebenen Test mißt. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist Gα_i2 die Gα-Untereinheit der Wahl, insbesondere, wenn es sich bei dem heterologen G-gekoppelten-Protein um einen vollständigen Somatostatinrezeptor oder einen Teil davon handelt. In diesem Fall ist es besonders bevorzugt, daß die Gα_i2-Untereinheit an einen Hefe-Gβγ-Komplex gekoppelt wird. Ebenso können bestimmte chimärische Konstrukte eine verbesserte Signaltransduktion im Hinblick auf bestimmte heterologe Rezeptoren liefern. Dabei ist ein chimärisches Konstrukt, das aus der Fusion der aminoterminalen Domäne des Hefe-GPA1/SCG1 mit der carboxyterminalen Domäne eines heterologen Gα_i, Gα_s und vor allem Gα_i2 hervorgeht, besonders bevorzugt.
Zur Praktizierung der vorliegenden Erfindung können alle DNA-Sequenzen, die für eine Gβγ-Untereinheit (Gβγ) codieren, verwendet werden. Zu den zur Praktizierung der vorliegenden Erfindung geeigneten G-Proteinen und Untereinheiten gehören Subtypen sowie Mutanten und Homologe davon zusammen mit den diese codierenden DNA-Sequenzen. Die Wirtszellen können dabei entweder endogenes Gβγ exprimieren oder können zur Expression von heterologem Gβγ (z.B. aus Säugern) gegebenenfalls gentechnisch auf die gleiche Weise manipuliert werden, wie sie zur Expression von heterologem Gα gentechnisch manipuliert würden.
Heterologe DNA-Sequenzen werden in einem Wirt mittels eines Expressions "konstrukts" oder -„vektors" exprimiert. Bei einem Expressionsvektor handelt es sich um ein replizierbares DNA-Konstrukt, in dem eine für die heterologe DNA-Sequenz codierende DNA-Sequenz mit geeigneten Kontrollsequenzen, die die Expression eines Proteins oder einer Proteinuntereinheit, das bzw. die von der heterologen DNA-Sequenz codiert wird, in dem vorgesehenen Wirt beeinflussen können, operativ verknüpft ist. Dabei umfassen eukaryontische Kontrollsequenzen im allgemeinen einen Transkriptionspromotor, doch kann es auch angebracht sein, daß eine für geeignete mRNA-ribosome Bindungsstellen codierende Sequenz sowie (gegebenenfalls) Sequenzen, die die Termination der Transkription kontrollieren, bereitgestellt werden. Zu zur Praktizierung der vorliegenden Erfindung geeigneten Vektoren gehören Plasmide, Viren (einschließlich Bakteriophagen) sowie integrationsfähige DNA-Fragmente (d.h. Fragmente, die zur Integration in das Wirtsgenom mittels genetischer Rekombination fähig sind). Der Vektor kann unabhängig vom Wirtsgenom replizieren und funktionieren, wie im Fall eines Plasmids, oder kann in das Genom selbst integrieren, wie im Fall eines integrationsfähigen DNA-Fragments. Geeignete Vektoren enthalten Replikon- und Kontrollsequenzen, die aus mit dem vorgesehenen Expressionswirt kompatiblen Spezies stammen. So handelt es sich beispielsweise bei einem Promotor, der in einer Wirtszelle betrieben werden kann, um einen Promotor, der die RNA-Polymerase dieser Zelle bindet, und bei einer ribosomen Bindungsstelle, die in einer Wirtszelle betrieben werden kann, um eine Bindungsstelle, die die endogenen Ribosomen dieser Zelle bindet.
DNA-Bereiche sind operativ assoziiert, wenn sie miteinander funktionell verwandt sind. So steht beispielsweise ein Promotor in operativer Verknüpfung mit einer codierenden Sequenz, wenn er die Transkription der Sequenz kontrolliert; eine Ribosomenbindungsstelle steht in operativer Verknüpfung mit einer codierenden Sequenz, wenn sie so positioniert ist, daß sie die Translation gestattet. Im allgemeinen bedeutet operativ verknüpft zusammenhängend sowie im Fall von Leader-Sequenzen zusammenhängend und im Leseraster.
Bei den transformierten Wirtszellen der vorliegenden Erfindung handelt es sich um Zellen, die mit den unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken konstruierten Vektoren transformiert oder transfiziert wurden und die das bzw. die von den heterologen DNA-Sequenzen codierte Protein oder Proteinuntereinheit exprimieren. Dabei sind verschiedene Hefekulturen und geeignete Expressionsvektoren zur Transformation von Hefezellen bekannt. Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4,745,057; US-Patent Nr. 4,797,359; US-Patent Nr. 4,615,974; US-Patent Nr. 4,880,734; US-Patent Nr. 4,711,844; und US-Patent Nr. 4,865,989. Unter den Hefen am häufigsten verwendet wird Saccharomyces cerevisiae, obwohl eine Reihe anderer Hefespezies allgemein verfügbar sind. Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4,806,472 (Kluveromyces lactis und Expressionsvektoren dafür); 4,855,231 (Pichia pastoris und Expressionsvektoren dafür). Hefevektoren können einen Replikationsursprung aus dem endogenen 2-Mikron-Hefeplasmid oder eine autonom replizierende Sequenz (ARS), die dem Plasmid die Fähigkeit verleiht, in der Hefezelle mit einer hohen Kopienzahl zu replizieren, zentromere (CEN-) Sequenzen, die die Fähigkeit des Plasmids auf eine Replikation mit einer nur geringen Kopienzahl in der Hefezelle beschränken, einen Promotor, die heterologen DNA-Sequenzen codierende DNA, Sequenzen für die Polyadenylierung und Transkriptionstermination sowie ein selektionierbares Markergen enthalten. Beispielhafte Plasmide und Einzelheiten der Materialien und Methoden zur Herstellung und Verwendung derselben sind im Beispielteil aufgeführt.
Zur Verwendung in den Konstrukten und Zellen der vorliegenden Erfindung kann ein beliebiger, in Hefesystemen funktionsfähiger Promotor ausgewählt werden. Zu geeigneten Promotorsequenzen in Hefevektoren gehören die Promotoren für Metallothionein, 3-Phosphoglyceratkinase (PGK) [Hitzeman et al., (1980) J. Biol. Chem. 255, 2073] oder andere glykolytische Enzyme [(Hess et al., (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149]; und Holland et al., (1978) Biochemistry 17, 4900], wie beispielsweise Enolase, Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-isomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefeexpression sind ferner bei R. Hitzeman et al., EPO-Veröffentlichung Nr. 73657 beschrieben. Weitere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil einer durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription aufweisen, sind die Promotorbereiche für Alkoholdehydrogenase, 1,2-Isocytochrom C, Säurephosphate, abbauende Enzyme, die mit dem Stickstoffmetabolismus assoziiert sind, sowie die oben erwähnte Metallothionein- und Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase ebenso wie für die Maltose- und Galactoseverwertung verantwortliche Enzyme, wie beispielsweise der durch Galactose induzierbare Promotor GAL1. Zur Verwendung hier besonders bevorzugt sind der PGK-Promoter, der GAL1-Promotor und Alkoholdehydrogenase (ADH)-Promotoren. Schließlich können bei der Konstruktion geeigneter Expressionsplasmide auch die mit diesen Genen assoziierten Terminationssequenzen in den Expressionsvektor ligiert werden, und zwar 3' von den heterologen codierenden Sequenzen, um so für die Polyadenylierung und Termination der mRNA zu sorgen. Bei der Herstellung der bevorzugten Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung werden zur Vermittlung der effizientesten Expression einer gegebenen Nukleinsäuresequenz in der Hefezelle Translationsinitiationsstellen gewählt [siehe Cigan, M. und T.F. Donahue 1987, GENE, Band 59, S. 1-18 für eine Beschreibung geeigneter Translationsinitiationsstellen].
Ein zur Durchführung der vorliegenden Erfindung geeigneter, besonders bevorzugter Nukleotidexpressionsvektor umfaßt eine solche oben erwähnte Promotorsequenz, die sich stromaufwärts von der Translationsinitiationsstelle der für den heterologen G-Protein-gekoppelten Rezeptor, den sie exprimieren soll, codierenden heterologen Nukleotidsequenz sowie im korrekten Leseraster damit befindet. Diesbezüglich besonders bevorzugte Promotoren sind die Promotoren GAL1, PGK und ADH. Die Positionierung des oben erwähnten Promotors stromaufwärts von der gewählten Translationsinitiationsstelle kann die Expression eines heterologen Proteins verbessern. In diesen bevorzugten Ausführungsformen wird kein Segment eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors aus Hefe an das Segment des heterologen G-Protein-gekoppelten Rezeptors fusioniert. Von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung wurde festgestellt, daß solche Hybridrezeptoren zur Erzielung der Rezeptorexpression in Hefe nicht kritisch sind. Dies steht im Gegensatz zu der diesbezüglichen, im Fachgebiet akzeptierten Lehre [siehe King et al., unten zitiert].
Allerdings wird in bestimmten anderen Ausführungsformen mindestens ein Fragment des 5'-nichttranslatierten Bereichs eines Hefegens stromaufwärts vom heterologen G-Protein-gekoppelten Segment positioniert und mit diesem operativ assoziiert. Hierzu werden von der vorliegenden Erfindung auch Konstrukte mit geeigneten Promotoren und Translationsinitiationsstellen, wie oben beschrieben, bereitgestellt, doch enthalten diese Konstrukte ein Hefesegment, das mindestens ein Fragment der äußersten aminoterminalen codierenden Nukleotidsequenz eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors aus Hefe umfaßt, sowie ein zweites Segment, das stromabwärts vom ersten Segment liegt und sich im korrekten Leseraster damit befindet, wobei das zweite Segment eine einen heterologen G-Protein-gekoppelten Rezeptor codierende Nukleotidsequenz umfaßt. Diesbezüglich kann das Hefesegment dazu vorgesehen sein, daß es tatsächlich wie eine Reportersequenz wirkt, statt zur Verbesserung der wirksamen Expression des heterologen G-Proteins im Hefesystem zu dienen. Somit umfassen bestimmte Ausführungsformen eine ein Hefesegment eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors aus Hefe codierende Gensequenz, die als ein Reportersegment fungiert, indem sie nämlich für ein Peptid codiert, das über herkömmliche Mittel, wie beispielsweise Antikörperbindung und dergleichen nachgewiesen werden kann. Diesbezüglich bevorzugt ist ein vollständiger Hefe-Pheromonrezeptor oder ein Teil davon, der mit einem heterologen G-Protein-gekoppelten Rezeptor fusioniert ist und der hauptsächlich als „Epitop-Tag" für den hochspezifischen Nachweis der Expression des gewünschten heterologen Rezeptors unter Verwendung von spezifisch gegen die exprimierte Epitopsequenz gerichteten Antikörpern verwendet werden kann. Bei der Konstruktion eines solchen Vektors kann das Hefesegment stromaufwärts zum heterologen Protein positioniert werden, oder es kann als Alternative ein Fragment der äußersten aminoterminalen codierenden Sequenz des heterologen G-Protein-gekoppelten Rezeptors deletiert und das Hefesegment direkt daran fusioniert werden. In einigen Fällen werden dabei eine oder mehrere der aminoterminalen Transmembrandomänen oder intrazellulären Domänen des heterologen Proteins deletiert. Als Alternative kann das Hefesegment direkt an den Aminoterminus des heterologen Rezeptors angefügt werden, wodurch die Gesamtlänge des chimärischen Rezeptorkonstrukts vergrößert wird.
Das erste und das zweite Segment sind operativ mit einem Promotor, wie beispielsweise dem GAL1-Promotor, der in einer Hefezelle operativ ist, operativ assoziiert. Codierende Sequenzen für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren aus Hefe, die bei der Konstruktion derartiger Vektoren verwendet werden können, sind durch die für Hefe-Pheromonrezeptoren codierenden Gensequenzen beispielhaft dargestellt (z.B. das STE2-Gen, das für den α-Faktor-Rezeptor codiert, und das STE3-Gen, das für den a-Faktor-Rezeptor codiert).
Bestimmte, hier bereitgestellte bevorzugte chimärische Rezeptoren umfassen ein Ste2-Proteinsegment aus Hefe, das direkt an einen vollständigen heterologen G-Proteinrezeptor oder einen Teil davon fusioniert ist, und vorzugsweise den 5HT1a-Rezeptor, muskarinischen Rezeptor, α-adrenergen Rezeptor oder einen Somatostatinrezeptor.
Für den Nachweis der Auswirkungen einer Ligandenbindung kann ein beliebiges aus einer Vielfalt von Mitteln genutzt werden. So läßt sich beispielsweise die Messung der Dissoziation von Gα von Gβγ über herkömmliche biochemische Techniken messen. Dabei soll jedoch angemerkt werden, daß die Bindung eines Liganden an einen Rezeptor eine nachweisbare biologische Reaktion, die ihrerseits sich möglicherweise auch zur Messung eignet, entweder auslösen oder blockieren kann. Bei einer solchen biologischen Reaktion handelt es sich um die Fähigkeit von Hefezellen zur Paarung. Die Verwendung des pheromoninduzierten Paarungssignaltransduktionswegs ist ein bevorzugtes Verfahren zum Nachweis der Ligandenbindungseffekte in den hier vorgestellten Testsystemen, deren Grundlage nachfolgend ausführlicher erörtert wird.
In der Hefe wird von G-Protein-gekoppelten Pheromonrezeptoren ein Entwicklungsprogramm gesteuert, das in der Paarung (Fusion) haploider a- und α-Zellarten unter Bildung des a/α-Diploids kulminiert (für eine Übersicht, siehe G.F. Sprague, Jr. und J.W. Thorner, in Molecular Biology and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces: Band II, Gene Expression). Der Paarungsprozeß wird dabei durch extrazelluläre Peptide, die Paarungspheromone gestartet. Die Zellen des a-Paarungstyps sezernieren α-Faktor, der eine Antwort in α-Zellen hervorruft; Zellen des α-Paarungstyps sezernieren a-Faktor, der nur auf a-Zellen wirkt. Haploide Zellen reagieren auf die Gegenwart der Peptidpaarungspheromone über die Wirkung endogener G-Protein-gekoppelter Pheromonrezeptoren (STE2: α-Faktor-Rezeptor, nur in α-Zellen exprimiert, und STE3: a-Faktor-Rezeptor, nur in a-Zellen exprimiert. Beide Rezeptoren wechselwirken mit den gleichen heterotrimeren G-Proteinen und einer Signaltransduktionskaskade, die beiden haploiden Zellarten gemeinsam ist. Nach Pheromonbindung an den Rezeptor macht dieser vermutlich eine Konformationsänderung durch, die zur Aktivierung des G-Proteins führt. Die α-Untereinheit SCG1/GPA1 übt eine negative Wirkung auf den Pheromonantwortweg aus, die durch rezeptorabhängige Aktivierung aufgehoben wird. Man nimmt an, daß der Komplex der βγ-Untereinheiten (STE4, STE18) das positive Signal auf einen Effektor, möglicherweise STE20, eine putative Proteinkinase, überträgt [Leberer, E., Dignard, D., Harcus, D., Thomas, D.Y., Whiteway, M. (1992) EMBO J. 11, 4815-4824]. Der Effektor aktiviert wiederum nachgeschaltete Elemente des Signaltransduktionswegs, einschließlich STE5, sowie eine vermutete, sich aus den Produkten der Gene STE11, STE7, FUS3 und KSS1 zusammensetzende Proteinkinasekaskade, was letztendlich zum Zellzyklusarrest und zur Transkriptionsinduktion führt. Die Hauptschnittstelle zwischen Elementen des Pheromonantwortwegs und dem Zellzyklusregulationsapparat ist das FAR1-Genprodukt. Bestimmte rezessive Allele von FAR1 und FUS3 machen nicht den Zellzyklusarrest als Reaktion auf Pheromon mit, während sie die pheromonabhängige Transkription stattfinden lassen. Die pheromonabhängige Transkription wird durch die Wirkung des sequenzspezifischen DNA-Bindungsproteins STE12 vemittelt. Die Aktivierung von STE12 führt zur Transkription von Genen, die eine in cis wirkende DNA-Sequenz, das Pheromonantwortelement, besitzen. Diese auf Pheromon reagierenden Gene codieren für Produkte, die für die Pheromonsynthese (MFa1, MFa2, MFA1, MFA2, STE6, STE13) und die Reaktion auf Pheromon (STE2, STE3, SCG1/GPA1, FUS3) benötigt werden und die die Zellassoziation und -fusion (FUS1), den Zellzyklusarrest (FAR1) und die zur Paarung erforderlichen morphologischen Ereignisse erleichtern oder daran beteiligt sind. Falls der Paarungsvorgang nicht vollzogen wird, adaptieren Hefezellen an die Gegenwart von Pheromon und nehmen das mitotische Wachstum wieder auf. Somit ist in bestimmten bevorzugten Ausführungsformen das FUS3- oder FAR1-Gen mutiert oder komplett deletiert, wodurch der Zellzyklusarrestweg vom Signaltransduktionsweg getrennt und das fortgesetzte Wachstum der Zellen als Antwort auf die Bindung von Paarungspheromon an den heterologen Rezeptor gestattet wird. Da es sich bei FAR1 um einen Hauptfaktor im Zellzyklusregulationsweg handelt, ist seine Deletion bzw. Mutation in den Expressionskonstrukten der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Mit derartigen Konstrukten transformierte Hefezellen ergeben hervorragende Hefestämme für Ligandenbindungstests.
Es ist bekannt, daß der Paarungssignaltransduktionsweg durch mehrere Mechanismen, einschließlich Pheromonabbau und Modifikation der Funktion des Rezeptors, der G-Proteine und/oder nachgeschalteter Elemente der Pheromonsignaltransduktion durch die Produkte der Gene SST2, STE50, AFR1 [Konopka, J.B. (1993) Mol. Cell. Biol. 13, 6876-6888] sowie SGV1, MSG5 und SIG1, desensibilisiert wird. Ausgewählte Mutationen in diesen Genen können zur Überempfindlichkeit gegenüber Pheromon sowie zu einer Unfähigkeit zur Anpassung an die Gegenwart von Pheromon führen. So stellt beispielsweise die Einführung von funktionsstörenden Mutationen in heterologe G-Protein-gekoppelte Rezeptoren exprimierende Stämme eine signifikante Verbesserung gegenüber Wildtypstämmen dar und ermöglicht die Entwicklung äußerst empfindlicher Biotests für mit den Rezeptoren wechselwirkende Verbindungen. Andere Mutationen, z.B. STE50, sgv1, ste2, ste3, pik1, msg5, sig1 und afr1, weisen den ähnlichen Effekt einer Erhöhung der Empfindlichkeit des Biotests auf. Dem Fachmann ist ersichtlich, daß eine erhöhte Empfindlichkeit des Testsystems durch die Deletion eines oder mehrerer dieser oben erwähnten Gene sowie die Einführung von deren Expression herunterregulierenden oder in bestimmten Fällen deren Überexpression bewirkenden Mutationen erreicht wird. Beispielsweise ist bei dem STE50-Konstrukt die Überexpression des Gens und nicht die Deletion des Gens gewünscht.
Die Einführung einer Konstellation von Mutationen im Paarungssignaltransduktionsweg führt zu einer Hefezelle, die sich gut zur Expression heterologer G-Protein-gekoppelter Rezeptoren eignet, welche zu einer funktionellen Reaktion auf ihre zugehörigen Liganden fähig sind, wobei eine biologische Antwort geliefert wird, die die Bindung des Rezeptors an den Liganden signalisiert.
In Verbindung mit einer oder mehrerer der oben angeführten Mutationen besteht ein besonders zweckmäßiges Verfahren zum Nachweis von Ligandenbindung an in Hefezellen exprimierten heterologen Rezeptor in der Nutzung eines herkömmlichen genetischen Indikatorsystems. Somit werden in bestimmten bevorzugten Ausführungsformen die Zellen mit einer zusätzlichen heterologen Nukleotidsequenz versehen, die einen auf Pheromon reagierenden Promotor sowie ein stromabwärts von dem auf Pheromon reagierenden Promotor liegendes und damit operativ assoziiertes Indikatorgen umfaßt. Bei Vorliegen einer solchen Sequenz kann der Nachweisschritt durch Verfolgen der Expression des Indikatorgens in der Zelle erfolgen. Dabei könnten verschiedene auf Pheromon reagierende Promotoren zum Einsatz kommen, beispielsweise ein Promotor, der eines der oben erwähnten auf Pheromon reagierenden Gene (z.B. mFa1, mFa2, MFA1, MFA2, STE6, STE13) steuert, der Promotor des Gens BAR1 und der Promotor des Gens FUS1. Ebenfalls könnte eines aus einer breiten Vielfalt von Indikatorgenen verwendet werden, zu denen beispielsweise die Gene HIS3, G418r, URA3, LYS2, CAN1, CYH2 und LacZ zählen. Ein besonders bevorzugtes Reportergenkonstrukt wird genutzt, indem man Transkriptionskontrollelemente eines FUS1-Gens an für das HIS3-Protein codierende Sequenzen fusioniert und das ursprüngliche FUS1-Gen durch dieses Reporterkonstrukt ersetzt. Dadurch wird die Expression des HIS3-Genprodukts unter die Kontrolle des Pheromonsignaltransduktionswegs gestellt. Hefestämme (his3), die dieses Konstrukt tragen, können auf supplementiertem Minimalmedium ohne Histidin schlecht wachsen und sind gegenüber einem Inhibitor des HIS3-Genprodukts empfindlich. In anderen bevorzugten Ausführungsformen tragen Plasmide eine FUS1-lacZ-Genfusion. Dabei wird die Expression des FUS1-Gens als Reaktion auf Rezeptoraktivierung durch Pheromonbindung stimuliert. Daher läßt sich die Signaltransduktion quantifizieren, indem man die von dem FUS1-lacZ-Reportergen erzeugte β-Galactosidase-Aktivität mißt.
An weiteren sinnvollen Reportergenkonstrukten, die weiterhin unter der Kontrolle von Elementen des Pheromonsignaltransduktionswegs stehen, bei denen es sich jedoch um Alternativen zu den oben erörterten Reportersystemen handelt, können Signale beteiligt sein, die über andere heterologe Effektorproteine, die koexprimiert werden, transduziert werden. Beispielsweise kann 1) die ligandenabhängige Stimulierung einer heterologen Adenylylcyclase das Überleben eines Hefestamms, dem aufgrund einer Mutation im Gen cdc35 seine eigene Adenylylcyclase fehlt, 2) die ligandenabhängige Stimulierung eines heterologen G-Protein-gekoppelten Kaliumkanals das Überleben eines Hefestamms, der nicht in Medium mit einer niedrigen Kaliumkonzentration wachsen kann [(trk1, trk2), siehe beispielsweise Anderson, J.A. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 3736-3740], oder 3) die ligandenabhängige Stimulierung einer heterologen Phospholipase C (vor allem PLC-β) das Überleben eines Hefestamms, dem seine eigene PLC fehlt [(plc), siehe beispielsweise Payne, W.E. und Fitzgerald-Hayes, M. (1993) Mol. Cell Biol. 13, 4351-4363], gestatten.
Zur Praktizierung der vorliegenden Erfindung können alle für eine Adenylylcyclase codierenden DNA-Sequenzen verwendet werden. Zu den Beispielen für eine Adenylylcyclase gehören das Produkt des Rutabaga-Gens aus D. melanogaster und die Untereinheitstypen I-VIII aus Säugern [für eine Übersicht, siehe Tang, W.-J. und Gilman, A.G. (1992) Cell 70, 869-872] sowie Mutanten und Homologe davon zusammen mit den dafür codierenden DNA-Sequenzen, die sich zur Praktizierung der vorliegenden Erfindung eignen.
Zur Praktizierung der vorliegenden Erfindung können alle für einen G-Protein-gesteuerten Kaliumkanal codierenden DNA-Sequenzen verwendet werden. Zu den Beispielen für einen G-Protein-gesteuerten Kaliumkanal gehören GIRK1 [Kubo, Y., Reuveny, E., Slesinger, P.A., Jan, Y.N. und Jan, L.Y. (1992) Nature 365, 802-806], zur Praktizierung der vorliegenden Erfindung geeignete Untereinheiten sowie Mutanten und Homologe davon zusammen mit den dafür codierenden DNA-Sequenzen.
Zur Praktizierung der vorliegenden Erfindung können alle für ein Phospholipaseprotein codierenden DNA-Sequenzen verwendet werden. Zu den Phospholipaseproteinen (PLC-Proteinen) gehören beispielsweise das norpA-Genprodukt aus D. melanogaster und die PLC-β-Proteine [für eine Übersicht, siehe Rhee, S.G. und Choi, K.D. (1992) J. Biol. Chem. 267, 12392-12396], zur Praktizierung der vorliegenden Erfindung geeignete Untereinheiten sowie Mutanten und Homologe davon zusammen mit den dafür codierenden DNA-Sequenzen.
Vorliegend wird ein besonders bevorzugtes Hefe-Expressionssystem beschrieben, das SSTR und ein chimärisches G-Protein tragende Hefezellen aufweist, deren kontinuierliches Wachstum vom Vorhandensein von Somatostatin abhängt. Wie oben angemerkt exprimieren transformierte Wirtszellen der vorliegenden Erfindung die von den heterologen DNA-Sequenzen codierten Proteine oder Proteinuntereinheiten. Wird der G-Protein-gekoppelte Rezeptor exprimiert, so ist er in der Wirtszellmembran lokalisiert (d.h. er ist darin physikalisch in der korrekten Orientierung sowohl für die stereoselektive Bindung von Liganden als auch für die funktionelle Wechselwirkung mit G-Proteinen auf der zytoplasmatischen Seite der Zellmembran positioniert). Die Realisierung des hier beschriebenen empfindlichen und spezifischen Hefe-Expressionssystems erleichtert die Beschreibung struktureller und funktioneller Aspekte von Rezeptor/Ligand- und Rezeptor/G-Protein-Wechselwirkungen. Durch die Modifikation von Elementen des Paarungssignaltransduktionswegs ermöglichte leistungsfähige genetische Selektionsschemata können zur Identifizierung von Aspekten des Rezeptors, die sich auf Agonistenselektivität, Ligandenstereoselektivität sowie Determinanten der Agonisten-/Antagonistenbindung auswirken, eingesetzt werden. Mit Hilfe dieses leistungsfähigen genetischen Systems kann die Rolle von Proteinen, die die Reaktion von Rezeptoren und G-Proteinen auf Liganden modifizieren, im Detail verstanden werden. Wichtig ist, daß durch das System ein verallgemeinerter Ansatz zur Untersuchung der Funktionsweise und der Komponenten des G-Protein-gekoppelten Signaltransduktionssystems ebenso wie ein verallgemeinerter Ansatz für Screening-Tests unter Verwendung des G-Protein-gekoppelten Signaltransduktionssystems bereitgestellt wird. Mit dem vorliegenden Verfahren werden an die Aufnahme eines von verschiedenen heterologen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren angepaßte Expressionskonstrukte und Testsysteme in Form von "Expressionskassetten" bereitgestellt. Dabei wird der zu untersuchende heterologe G-Protein-gekoppelte Rezeptor einfach in die hier bereitgestellten Vektoren inseriert und in Hefezellen exprimiert. Möglicherweise an den exprimierten Rezeptor bindende Liganden läßt man in der Art eines beliebigen herkömmlichen Tests mit den Zellen in Kontakt treten, wobei sich die Auswirkungen der Wechselwirkung leicht verfolgen lassen. Die hier vorliegenden Systeme sind somit bei der Identifizierung von Liganden für "orphan" ["verwaiste"] G-Protein-gekoppelte Rezeptoren sowie für die Entdeckung neuer therapeutisch geeigneter Liganden für medizinisch, tiermedizinisch und landwirtschaftlich wichtige Rezeptoren von enormem Nutzen.
Zur weiteren Veranschaulichung verschiedener Aspekte der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Beispiele bereitgestellt, die jedoch nicht als Beschränkung der Erfindung aufzufassen sind.
BEISPIEL 1
Funktionelle Expression von G-α-Proteinen aus Säugern in Saccharomyces cerevisiae
Zur Messung der Störung der Wechselwirkungen von Gα und Gβγ der Hefe durch die Expression heterologer Gα-Proteine wird ein empfindlicher Biotest genutzt. Dabei werden Säuger-Gα-Gene von 2μ- oder zentromertragenden Plasmiden unter der Kontrolle des konstitutiven PGK- oder des induzierbaren CUP1-Promotors exprimiert. Die Daten demonstrieren, daß Gα_s und Gα_i2 der Ratte sowie ein chimärisches Hefe/Säuger-Gα auf wirksame Weise mit Hefe-Gβγ wechselwirken können.
Medien und Stämme. Die Anzucht der Bakterienstämme sowie die Plasmidmanipulationen werden nach Standardverfahren (Maniatis T., Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982)) durchgeführt. Die Anzucht und Transformation von Hefestämmen erfolgt wie bei Rose et al. beschrieben (Rose M.D., Methods in yeast genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990). Die in diesen Arbeiten verwendeten Hefestämme (CY414, MATa ura3-52 trp1 leu2 his3 pep4::HIS3) leiten sich von bei E. Jones (Jones, E.W., Ann. Rev. Genet 18:233, 1984) beschriebenen Stämmen ab. CY414 wird nacheinander mit dem FUS1-lacZ-Fusionsplasmid pSB234 (Trueheart, J. et al. Mol. Cell. Biol. 7(7): 2316-2328, 1987) und Gα-Expressionsplasmiden transformiert.
Konstruktion. der Gα-Expressionsplasmide. Ratten-cDNA-Klone für Gα_s und Gα_i2 sowie für Fusionen mit dem Hefe-SCG1-Gen sind an anderer Stelle beschrieben [Kang, Y.-S., Kane, J., Kurjan, J., Stadel, J.M. und Tipper, D.J. (1990) Mol. Cell. Biol. 10, 2582-2590]. Zur Expression dieser Gene von Plasmiden mit niedriger Kopienzahl werden XhoI-SalI-Fragmente, die jede Expressionskassette (einschließlich der PGK-Promotor- und Terminatorsequenzen) enthalten, isoliert und in das mit XhoI verdaute CEN-Plasmid pRS414 kloniert. Für die induzierbare Expression wird das PGK-Promotorsequenzen enthaltende DNA-Segment durch stromaufwärts liegende aktivierende Sequenzen aus dem CUP1-Gen ersetzt.
β-Galactosidase-Tests. Kulturen werden auf 5 × 10⁷ Zellen/ml verdünnt und in getrennte Röhrchen aliquotiert. Zu einer Probe gibt man Pheromon mit einer Endkonzentration von 10^–9 M. Danach werden die Kulturen 4 Std. bei 30°C inkubiert. Die anschließende Messung der β-Galactosidase-Aktivität erfolgt wie an anderer Stelle beschrieben (Rose, M.D., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990).
Plasmide mit hoher bzw. niedriger Kopienzahl, die die jeweils vom Hefe-PGK-Promotor exprimierten Gene Hefe-SCG1 oder Säuger-Gα_s oder -Gα_i oder chimärisches Hefe/Säuger-Gα tragen, werden in einen Wildtyp-Hefestamm, der auch ein eine FUS1-lacZ-Genfusion tragendes Plasmid enthält, transformiert. Die Expression des FUS1-Gens wird als Reaktion auf die Rezeptoraktivierung durch Pheromonbindung stimuliert. Daher läßt sich die Signaltransduktion quantifizieren, indem man die von dem FUS1-lacZ-Reportergen erzeugte β-Galactosidase-Aktivität mißt. Dabei wird die Störung der normalen Signaltransduktion durch die Expression eines heterologen Gα-Proteins als Abnahme der β-Galactosidase-Aktivität beobachtet.
Eingeführte Gα-Gene exprimierende Stämme werden auf pheromoninduzierte Genaktivierung getestet. Die Daten sind als Prozent Wildtyp-Reaktion in 1 dargestellt. Die FUS1-lacZ-Expressionsniveaus wurden durch die Expression von allen Gα-Plasmiden reduziert, wodurch demonstriert wird, daß die Gα-Proteine funktionell an Hefe-Gβγ koppelten. Für Scg1, Gα_s und Gα_i2 wurde eine Dosisabhängigkeit beobachtet. Die Signalgebung wird durch die Expression von Plasmiden mit hoher Kopienzahl stark reduziert, was vermuten läßt, daß ein großer Überschuß an heterologem Gα-Protein vorhanden ist. Das chimärische Scg-Gαi2-Protein reduziert selbst vom Plasmid mit niedriger Kopienzahl die Signalgebung fast auf die nichtstimulierten Hintergrundniveaus. Mit anderen CEN-Expressionsplasmiden wird die Signalgebung auf 53 bis 84% der Wildtypniveaus reduziert.
Um eine genauere Kontrolle der Gα-Expression zu erreichen und die Expression auf ein hinreichend niedriges Niveau zu reduzieren, so daß minimale Auswirkungen auf die pheromoninduzierte Signalgebung auftreten, werden Gα-Gene (außer Gαs) unter die Kontrolle des induzierbaren CUP1-Promotors gestellt und auf Plasmiden mit niedriger Kopienzahl in Hefe transformiert. Das Niveau der von diesen Plasmiden vermittelten Repression der Signalgebung hängt von der Konzentration des dem Medium zugesetzten Cu++4 ab (2). Allerdings entsprach die Grundexpression (ohne Zugabe von Cu++4) den beobachteten Niveaus vom PGK-Promotor (1). Das chimärische SCG-Gαi2-Protein reduziert wie im vorherigen Experiment die Signalgebung fast auf Hintergrundniveaus.
Die in 1 und 2 dargestellten Daten deuten darauf hin, daß alle untersuchten Gα-Expressionsplasmide funktionelle Gα-Proteine produzieren, indem sie alle den Signaltransduktionsweg hemmen. Bei Verwendung eines konstitutiven Promotors (PGK) zeigen die meisten Gα-Gene einen dosisabhängigen Effekt, wobei mit den in hoher Kopienzahl vorliegenden 2-Mikron-Plasmiden die Signalgebung drastisch reduziert wird (1). Durch die niedrigere Expression von CEN-Plasmiden werden die Signalgebungsniveaus bis hinunter zu 16% reduziert (siehe G_i, 1). Die Expression der Gα-Gene vom CUP1-Promotor zeigt die erwarteten Dosis/Wirkung-Effekte, wobei die reduzierte Signalgebung mit erhöhten Cu++-Konzentrationen korreliert ist (2).
BEISPIEL 2
Pharmakologische Bewertung in Saccharomyces cerevisiae exprimierter heterologer G-Protein-gekoppelter Rezeptoren
Hefestämme. Die Anzucht und Transformation von Hefestämmen erfolgt wie bei Rose et al. beschrieben (Rose M.D., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990). Die in diesen Arbeiten verwendeten Hefestämme (CY414, MATa ura3-52 trp1 leu2 his3 pep4ΔHIS3) leiten sich von bei E. Jones (Jones, E.W., Ann. Rev. Genet 18:233, 1984) beschriebenen Stämmen ab.
Nukleinsäuremanipulation. Die Anzucht der Bakterienstämme sowie die Plasmidmanipulationen werden nach Standardverfahren [Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis T., Molecular Cloning, 2. Aufl. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)] durchgeführt. Die DNA-Sequenzierung wird mittels "High temperature cycle"-Sequenzierung (Applied Biosystems) durchgeführt.
Proteinanalyse. Die Rezeptorexpressionsstämme werden in synthetischem Komplettmedium ohne spezifische Nährstoffe zur Selektion auf Plasmidretention sowie mit 3% Galactose zur Induktion der Rezeptorgenexpression angezogen. Die Zellen werden pelletiert und in Lysepuffer (10 mM Natriumhydrogencarbonat pH 7,2, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA) gewaschen, anschließend in Lysepuffer plus Proteaseinhibitoren (5 μg/ml Leupeptin, 10 μg/ml Benzamidin, 10 μg/ml Bacitracin, 5 μg/ml Pepstatin, 5 μg/ml Aprotinin) resuspendiert und durch physikalischen Aufschluß mit Glasperlen lysiert. Zelltrümmer werden durch 10minütige Zentrifugation bei 1000 × g abgetrennt. Die Membranfraktion wird durch 10minütige Zentrifugation bei 100000 × g isoliert. Dieses Pellet wird einmal in Lysepuffer plus Inhibitoren gewaschen. Die Polyacrylamidgelelektrophorese der Hefeextrakte wird nach Standardverfahren durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Proben nicht aufgekocht werden. Die Proteine werden mit der Semi-Dry-Technik auf Immobilon-P-Millipore-Filter übertragen. Rezeptorprotein wird unter Verwendung von ECL-Reagentien mit Kaninchen-Anti-Ste2-Antikörpern sichtbar gemacht.
Radioligandenbindungstests. Die Reaktionen werden in einem Volumen von 0,2 μl mit 5 bis 50 μg Protein durchgeführt. Bei den Bindungstests für Liganden des 5HT1a-Rezeptors oder des β2-adrenergen Rezeptors wird ein Puffer aus 50 mM Tris pH 7,4, 10 mM MgCl₂ verwendet. Somatostatinbindung wird in einem Puffer von 50 mM HEPES, pH 7,4, 5 mM MgCl₂ durchgeführt. Man läßt die Ligandenbindung bis zum Erreichen des Gleichgewichts bei Raumtemperatur ablaufen und isoliert anschließend die Membranfraktionen auf GFC-Glasfaserfiltern. Dabei werden die folgenden Ligandenendkonzentrationen verwendet: Radioliganden: ³H-Spiperon, 80 nM; ¹²⁵I-Cyanopindolol, 250 pM; [¹²⁵I-tyr¹¹]-Somatostatin 14, 250 pM; Kompetitoren: Serotonin, 10 μm; Propanolol, 20 μM; Somatostatin 14, 1 μM. Es werden 100 μM des Guanosintriphosphat-Analogs Gpp(NH)p verwendet.
Expression des menschlichen serotonergen Rezeptors 5HT1a. Das für den menschlichen 5HT1a-Rezeptor codierende Gen wird unter Addition der ersten 14 Aminosäuren des Ste2-Proteins der Hefe modifiziert, in das Expressionsplasmid pMP3 kloniert und mit pCHI11 bezeichnet. Dieser Stamm mit der Bezeichnung CY382 wird zur Induktion der Rezeptorexpression in galactosehaltigem Medium angezogen, fraktioniert und über die Bindung des radioaktiv markierten Antagonisten ³H-Spiperon auf Rezeptoraktivität getestet. Die Sättigungsbindung zeigt, daß der Rezeptor auf hohem Niveau exprimiert wird (Bmax = 3,2 pmol/mg Protein) und daß er Spiperon mit einer ähnlichen Affinität (Kd = 115 nM; 3) wie der in Säugergeweben beobachteten (Kd = 20 bis 100 nM) bindet.
Zwei chimärische Rezeptorgene werden gentechnisch hergestellt: in pCH117 sind für den N-Terminus einschließlich der ersten beiden Transmembrandomänen des 5HT1a-Rezeptors codierende Sequenzen durch die entsprechenden Sequenzen des Ste2-Rezeptors ersetzt, und in pCH118 sind diese Ste2-Sequenzen direkt an den N-Terminus des 5HT1a-Rezeptors angefügt, so daß ein neuer Rezeptor mit neun Transmembrandomänen entsteht (4). Diese Rezeptoren exprimierende Stämme werden auf die Bindung von radioaktiv markiertem Liganden untersucht. Beide Rezeptoren zeigen spezifische Bindung des 5HT-Rezeptor-Antagonisten ³H-Spiperon (4). Der Austausch der ersten beiden Transmembrandomänen gegen solche eines nicht verwandten Rezeptors wirkt sich anscheinend nicht auf die Bindung dieses Liganden aus. Das Hinzufügen von Transmembrandomänen bewirkt keine Bindung, was vermuten läßt, daß dieser ungewöhnliche Rezeptor eine funktionelle Konformation in der Zellmembran einnehmen kann. pCHI11, pCHI17 bzw. pCHI18 tragende Stämme produzieren Bmax-Werte von 3,1, 1,6 bzw. 0,7 pmol/mg. Zwar ergeben diese chimärischen Rezeptoren im Hinblick auf die Rezeptorstruktur interessante Ergebnisse, doch werden dadurch die Gesamtniveaus an funktionellen Rezeptoren in der Zelle nicht gesteigert.
Alle intrazellulären Sequenzen des 5HT1a-Rezeptors werden zur direkten Kopplung des Rezeptors an das Hefe-G-Protein durch entsprechende Sequenzen des Hefe-Ste2-Proteins ersetzt. Der dabei erhaltene chimärische Rezeptor CHI16 wird in einem Wildtyp-Hefestamm exprimiert und auf die hochaffine Bindung von 5HT1a-Rezeptor-Agonisten untersucht. Eine Agonistenbindung wird nicht nachgewiesen. Allerdings entspricht das Niveau der Bindung des radioaktiv markierten Spiperons dem von CHI11, was darauf hindeutet, daß dieser Rezeptor auf hohem Niveau und in einer funktionellen Konformation exprimiert wird.
Expression des menschlichen β2-adrenergen Rezeptors. Der menschliche adrenerge Rezeptor wird in der Hefe mit der Absicht, ihn als Modell zur Optimierung der Expression und G-Protein-Kopplung zu verwenden, exprimiert. Ein den Rezeptor exprimierender Hefestamm wird mittels Scatchard-Analyse auf die Bindung des Liganden ¹²⁵I-Cyanopindolol untersucht. Die Bindung läßt sich absättigen und zeigt einen zu dem bei Säugergeweben angegebenen Wert ähnlichen Kd-Wert (23 pM). Danach werden Stämme mit und ohne koexprimiertes Gαs in Kompetitionstests untersucht, bei denen die Bindung dieses Radioliganden mit den Agonisten Isoproterenol oder Epinephrin konkurriert. In beiden Stämmen wurde eine hochaffine Bindung beobachtet, die erwartungsgemäß nur dann auftritt, wenn der Rezeptor aktiv an G-Protein gekoppelt wird (5 und 6). Die extrapolierten Ki-Werte für diese Liganden (Isoproterenol = 10 nM; Epinephrin = 60 nM) sind mit den in Säugergeweben beobachteten Affinitäten vereinbar und zeigen die erwartete Potency-Reihenfolge. Andere Daten lassen jedoch vermuten, daß die hochaffine Bindung von Agonisten an den β2-adrenergen Rezeptor in Hefe anomal ist. und nicht von einer Kopplung an G-Protein herrührt. Insbesondere wird der dritte intrazelluläre Loop (der die primären Gα-Kontaktpunkte enthält) des β2-adrenergen Rezeptors durch die entsprechende Domäne des Hefe-Ste2-Rezeptors ersetzt. Dieser Rezeptor zeigt die gleichen Affinitäten für adrenerge Agonisten, was vermuten läßt, daß der β2-adrenerge Rezeptors in der Hefe eine ungeeignete Konformation einnimmt.
Expression des Somatostatinrezeptors der Ratte. Die hochaffine Bindung von Somatostatin an SSTR2 hängt von der Ausbildung eines Rezeptor/G-Protein-Komplexes ab (Strnad et al., 1993). Sind SSTR und G-Protein voneinander entkoppelt, so ist die hochaffine Bindung von [¹²⁵I]tyr¹¹S-14 abgeschwächt. Wie in 8 gezeigt, läßt sich die Bindung von [¹²⁵I]tyr¹¹S-14 an in Scg1/Gα_i2 koexprimierender Hefe exprimierten SSTR2 absättigen und weist eine hohe Affinität auf. Der berechnete K_d-Wert für in Hefe exprimierten SSTR2 bindendes [¹²⁵I]tyr¹¹S-14 beträgt 600 pM. Ähnliche Bindungsaffinitäten werden beobachtet, wenn statt Scg1/Gα_i2 Gα_i2 mit SSTR2 koexprimiert wird. Der in der Hefe beobachtete K_d-Wert stimmt gut mit dem berechneten K_d-Wert der [¹²⁵I]tyr¹¹S-14-Bindung von in Säugerzellen exprimiertem SSTR2 (Strnad et al., 1993) überein. Es wird gezeigt, daß die Addition des Hefe-Ste2-Rezeptors an den N-Terminus dieses Rezeptors keine Auswirkung auf dessen Fähigkeit zur Bindung von S-14 hat. Die Ste2-Sequenzen fungieren als Tag für die immunchemische Untersuchung der Rezeptorexpression. Der in 7 gezeigte Immunoblot veranschaulicht das hohe Niveau der SSTR2-Expression in drei unterschiedlichen Stämmen. Den Somatostatinrezeptor SSTR2 sowie unterschiedliche Gα-Proteine exprimierende Hefestämme leiten sich von dem Stamm YPH500 ab. Diese Stämme teilen den Genotyp MATa scg1ΔhisG lys2-801 ura3-52 leu2Δ1 trp1Δ63 his3Δ200 ade2 SSTR2. Stämme mit der Bezeichnung CY624 (Gα_i2), CY602 (Gα_s) und CY603 (Scg1) werden auf die spezifische Bindung von radioaktiv markiertem Somatostatin-14 (S-14) untersucht. Alle drei zeigen einen gewissen Grad an Somatostatinbindung (Tabelle 1). Die hochaffine Bindung dieses Liganden erfordert die Kopplung des Rezeptors an G-Protein, normalerweise Gαi (Luthin D.R. 1993; Strnad J. 1993), so daß das hohe Bindungsniveau in Abwesenheit von Gαi unerwartet ist. Als Bestätigung für die Kopplung des Rezeptors an G-Proteine wird die Bindung in Gegenwart des nicht hydrolysierbaren Guanosintriphosphat-Analogs Gpp(NH)p untersucht. Die Zugabe dieser Verbindung hebt die Ligandenbindung auf (Tabelle 1), wodurch demonstriert wird, daß der SSTR2-Rezeptor an G-Protein gekoppelt ist. Diese Daten zeigen, daß ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor aus Säugern eine funktionelle Wechselwirkung mit einem aus seinem bevorzugten Gα-Protein plus den Gβ- und Gγ-Untereinheiten aus Hefe zusammengesetzten G-Protein eingehen kann und daß ein heterologer Rezeptor in der Lage ist, funktionell an ein vollständig aus Hefe-Untereinheiten zusammengesetztes G-Protein zu koppeln. TABELLE 1. Bindung von [¹²⁵I]-Somatostatin

^a Aus den Ratte-SSTR-Somatostatinrezeptor-Subtyp und das angegebene Gα-Protein exprimierenden Hefestämmen wurden Membranrohextrakte präpariert. Die maximale Bindung von radioaktiv markiertem Somatostatin 14 wurde wie im Text beschrieben gemessen. ^b Bmax-Werte sind als fmol/mg Gesamtprotein angegeben. ^c Zur Entkopplung von Rezeptor und G-Protein wurden Proben mit dem nicht hydrolysierbaren GTP-Analog Gpp(NH)p versetzt. Die Daten sind als Prozent gebundener Radioligand verglichen mit unbehandelten Proben dargestellt.

Expression des muskarinischen Acetylcholinrezeptors aus Drosophila. Einen muskarinischen Acetylcholinrezeptor aus Drosophila (Dm-mAChR) codierende DNA-Sequenzen werden durch das Hinzufügen einer SalI-Stelle in den 5'-codierenden Sequenzen unter Verwendung von PCR modifiziert. Für die ersten 23 Aminosäuren des STE2-Genprodukts codierende DNA-Sequenzen werden an das 5'-Ende von Dm-mAChR in Form eines BamHI/SalI-Fragments angefügt. Die modifizierte Dm-mRChR-Sequenz wird in die BamHI-Stelle im Plasmid pMP3 inseriert, wobei die Expression des Rezeptors unter die Kontrolle des GAL1-Promotors gestellt und das Plasmid pMP3-Dm-mAChR gebildet wird. Der Stamm CY414 wird mit diesem Plasmid transformiert und zur Rezeptorexpression nach Standardverfahren kultiviert. Von diesen Zellen werden Membranrohpräparationen hergestellt und auf das Vorhandensein spezifischer Bindungsstellen für den muskarinischen Antagonisten 3H-Chinuclidinylbenzilat (10 nM) in Konkurrenz mit Atropin (50 μM) getestet. Es werden spezifische Bindungsstellen (Bmax 10 bzw. 30 fmol/mg) beobachtet.
Die Expression von Drosophila-mAChR ist auch mit Immunoblot-Verfahren nachweisbar. In Übereinstimmung mit dem aus der Primärsequenz von mAChR vorhergesagten Molekulargewicht wird unter Verwendung eines gegen das assoziierte Ste2-Epitop gerichteten Antikörpers ein reichlich vorhandenes 75 kDa großes Polypeptid in Proteinproben (30 μg/Spur) aus Membranrohpräparationen von mAchR von pMP3 exprimierenden Zellen nachgewiesen (9). Wesentlich weniger Protein wird nachgewiesen, wenn mAchR von pMP2, einem Derivat von pMP3 ohne GAL4-Sequenzen, exprimiert wird, womit keine Bestätigung einer Expression von mAchR auf hohem Niveau erwartet wird.
Expression eines α2-adrenergen Rezeptors (α2-AR). Ein EcoRI-NarI-Fragment aus dem Plasmid pMP3, einschließlich dem GAL1,10-Promotor-EcoRI-BamHI-Fragment, für die ersten 23 Aminosäuren des STE2-Genprodukts codierenden und auf einem BamHI-SalI-Fragment liegenden DNA-Sequenzen, dem SalI-SphI-Polylinker-Fragment aus YEp352 sowie STE7-Terminatorsequenzen, wird unter Bildung von pLP15 auf pRS424 übertragen. Ein für einen α2A-AR aus Schwein [Guyer, C.A., Horstman, D.A., Wilson, A.L., Clark, J.D., Cragoe, E.J. und Limbird, L.E. (1990) J. Biol. Chem. 265, 17307-17317] codierendes PstI-PvuII-Fragment wird in die PstI-SmaI-Stellen von pLP15 inseriert, wobei pLP50 gebildet wird. Ein EcoRI-Fragment von GAL4 wird in die EcoRI-Stelle von pLP50 unter Bildung von pLP60 inseriert. Der Stamm LY124 [ein Derivat von YPH500 (Stratagene), das das scg1ΔhisG-Allel enthält sowie das Plasmid pLP10 [pLP10:pUN75 (Elledge, S. J. und Davis, R. W. Genetics 87, 189-194) mit dem in die SalI-Stelle inserierten PGK-Scg1-Gαi2-XhoI-SalI-Fragment aus pPGKH-Scg1Gαi2] trägt, wird mit pLP60 transformiert und auf Rezeptorexpression nach Standardverfahren kultiviert. Von diesen Zellen werden Membranrohpräparationen hergestellt und auf das Vorhandensein spezifischer Bindungsstellen für den α2-AR-Antagonisten 3H-Rauwolscin (200 nM) in Konkurrenz mit Phentolamin (10 μM) getestet. Es wurden spezifische Bindungsstellen mit einem Bmax zwischen 10 und 84 fmol/mg beobachtet.
Die Expression von Schweine-α2AR ist auch mit Immunoblot-Verfahren nachweisbar (10). Dabei werden unter Verwendung eines gegen das assoziierte Ste2-Epitop gerichteten Antikörpers in Proteinproben (30 μg/Spur) aus Membranrohextrakten von α2AR von pMP3 exprimierenden Zellen mehrere reichlich vorhandene Polypeptide nachgewiesen.
Beispiel 3
Agonistenabhängiges Wachstum von Hefe als Reaktion auf Somatostatinrezeptor-Agonisten
Hefestämme, die auf Somatostatin reagieren, werden durch Einführung mehrerer Modifikationen in typische Laborhefestämme erzeugt. Dabei wird erstens eine für den Somatostatinrezeptor Subtyp 2 (SSTR2) codierende cDNA in einem Mehrkopien-Hefeplasmid unter die Kontrolle des galactoseinduzierbaren GAL1-Promotors gestellt (11). Eine Rezeptorexpression auf hohem Niveau wird durch induzierbare Koüberexpression des Transkriptionsaktivierungsproteins GAL4 vom gleichen Plasmid erreicht. Zweitens wird das endogene Gα-Proteingen GPA1/SCG1 durch ein sich aus einer aminoterminalen Domäne aus GPA1/SCG1 sowie C-terminalen Sequenzen aus Ratte-Gαi2 zusammensetzendes chimärisches Gen ersetzt (12). Es konnte bereits gezeigt werden, daß die Expression chimärischer G-Proteine in Hefe den Wachstumsdefekt von scg1/gpa1-Mutantenzellen supprimiert [Kang, Y. -S., Kane, J., Kurjan, J., Stadel, J. M. und Tipper, D. J. (1990) Mol. Cell. Biol. 10, 2582-2590]. Drittens wird das FAR1-Gen deletiert, was die Fortsetzung des Wachstums bei Vorhandensein eines aktivierten Paarungssignaltransduktionswegs gestattet. Es wird vermutet, daß das FAR1-Protein als primäre Schnittstelle zwischen dem Paarungssignaltransduktionsweg und dem Zellzyklusapparat dient [Chang, F. und Herskowitz, I. (1990) Cell 63, 999-1012; Peter, M., Gartner, A., Horecka, J., Ammerer, G. und Herskowitz, I. (1993) Cell. Biol. 13, 5659- 5669]. Viertens wird das FUS1-Gen durch ein durch Fusion von Transkriptionskontrollelementen des FUS1-Gens an für das HIS3-Protein codierende Sequenzen gebildetes Reportergenkonstrukt ersetzt, wodurch die Expression des HIS3-Genprodukts unter die Kontrolle des Paarungssignaltransduktionswegs gestellt wird. Dieses Konstrukt tragende Hefestämme (his3) können auf supplementiertem Minimalmedium ohne Histidin schwach wachsen und sind gegenüber 3-Amino-1,2,4-triazol (AT), einem Inhibitor des HIS3-Genprodukts, empfindlich. Die Rezeptoraktivierung durch Agonistenbindung führt zu einer erhöhten HIS3-Proteinexpression, einem entsprechenden Anstieg der Resistenz gegenüber AT und daher der Fähigkeit zum Wachstum auf Medium ohne Histidin und/oder in Gegenwart des Inhibitors. Die Einstellung des pH-Werts des Wachstumsmediums auf > pH 5,5 verstärkt die Fähigkeit solcher Zellen, in Gegenwart eines Agonisten zu wachsen, vermutlich aufgrund einer erhöhten Fähigkeit von Somatostatin zur Bindung an SSTR2.
Der Nutzen des Hefe-Expressionssystems liegt in seiner Anpassungsfähigkeit an schnelles Massen-Screening. Zur Erleichterung des Screening auf neue, auf die SSTRs gerichtete Therapeutika wird ein zweckmäßiger Agarplatten-Biotest entwickelt, bei dem die funktionelle Kopplung der Somatostatinbindung an Rezeptor und der anschließenden Aktivierung des Paarungssignaltransduktionswegs als eine Wachstumszone (Hof) um die aufgetragenen Verbindungen herum nachgewiesen wird (13). Übernacht-Flüssigkulturen von LY268 [einem Derivat von YPH500 (Stratagene) MATa ura3-52 lys2-801 ade2 trp1Δ63 his3Δ200 leu2Δ1 far1ΔLYS2 scg1ΔhisG fus1ΔFUS1-HIS3 sst2ΔADE2, das das SSTR2-Expressionsplasmid und das SCG1-Gαi2-Expressionsplasmid pLP82 trägt] in SC-Dextrose (2%) ohne ura, trp wurden auf SC-Lactat-Medium (2%) ohne ura und trp und anschließend auf SC-Galactose-Medium (2%) ohne ura und trp überführt. Die Zellen (2 × 10⁵) werden dann in 30 ml SC-Galactose-Agar (2%) ohne ura, trp und his ausplattiert (13A obere Abbildung) oder gleichmäßig auf der Oberfläche verteilt (13B, untere Abbildung), die angegebenen Mengen an ausgewählten Verbindungen auf auf der Oberfläche der Agarplatte befindliche Papierscheibchen aufgetragen und 3-5 Tage bei 30°C inkubiert. Wachstumshöfe werden um mit verschiedenen Konzentrationen an Somatostatin (S-14) und MK678 [einem Hexapeptidanalog von Somatostatin, das eine hochaffine Bindung zu SSTR2 zeigt [Verber, D., Saperstein, R., Nutt, R., Friedinger, R., Brady, P., Curley, P., Perlov, D., Paleveda, W., Zacchei, A., Cordes, E., Anderson, P. und Hirschmann, R. (1981) Life Sci, 35, 1371-1378] gesättigten Scheibchen herum beobachtet. Die Hofgröße nimmt proportional zur aufgetragenen Menge an Agonist zu, wobei sogar bei der geringsten aufgetragenen Menge (6 nmol S-14) eine signifikante Reaktion beobachtet wird, was die ausgezeichnete Empfindlichkeit des Tests demonstriert. Mit dem Träger allein sowie gegenüber Metenkephalin, einem Opiatrezeptor-Agonisten, wird keine nachweisbare Reaktion beobachtet.
Das Hefemedium sowie die Kultivierungsbedingungen werden gemäß Standardverfahren formuliert, und die DNA-vermittelte Transformation der Hefe erfolgt mit dem LiAc-Verfahren [Sherman, F., Fink, G. R. und Hicks, J. B. (1986) Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory Press)]. LY268 wird mittels sequentieller Insertionsdeletion unter Verwendung der rekombinanten Allele scg1:ΔhisG, far1ΔLYS2, FUS1ΔHIS3 und sst2ΔADE2 konstruiert. Dabei wird das scg1ΔhisG-Allel durch Insertion des hisG-URA3-hisG-Fragments aus pNKY51 [Alani, E., Cao, L. und Kleckner, N. (1987) Genetics 116, 541-545] zwischen das 5'-EcoRI-HindIII-Fragment und das 3'-SphI-SnaBI-Fragment von SCG1/GPA1 zusammengebaut. Nach der DNA-vermittelten Transformation entsprechender Hefestämme und der Selektion auf den Austausch des chromosomalen Allels wird das URA3-Gen entfernt, indem man durch Wachstum auf 5-Fluororotsäure (FOA) enthaltendem Medium die Rekombination zwischen hisG-Wiederholungen induziert [Boeke, J., Lacroute, F. und Fink, G. (1984) Mol. Gen. Genet. 197, 345-346]. Das far1ΔLYS2-Allel wird konstruiert, indem man zwei Fragmente des FAR1-Gens [Chang, F. und Herskowitz, I. (1990) Cell 63, 999-1012] aus genomischer Hefe-DNA (Stamm YPH501, Stratagene) unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide, durch die im 5'-Fragment an Position 1201 eine EcoRI-Stelle sowie im 3'-Fragment an Position 2017 eine HindIII-Stelle und in Position 2821 eine SalI-Stelle eingeführt werden, amplifiziert. Die Fragmente werden in das EcoRI/SalI-Fragment von pBSK (Stratagene) kloniert. Das vollständige far1ΔLYS2-Konstrukt wird mit EcoRI verdaut und zur Hefetransformation verwendet. Ein für das FUS1-HIS3-Reportergen codierendes EcoRI-Fragment wird aus pSL1497 [Stevenson, B. J., Rhodes, N., Errede, B. und Sprague, G. F. (1992) Genes Dev. 6, 1293] herausgetrennt und zur Transformation entsprechender Hefestämme verwendet. Das sst2ΔADE2-Allel [Dietzel, C. und Kurjan, J. (1987) Mol. Cell. Biol. 7, 4169-4177] wird aus einem mit PCR unter Verwendung von Oligos, mit denen an Position 1 eine Cla-Stelle und an Position 2518 eine NheI-Stelle plaziert wurde, amplifizierten 2,5 kb großen Fragment des ADE2-Gens aufgebaut. Dieses Fragment wird für den Austausch des internen ClaI-NheI-Fragments in SST2 verwendet. Das sst2ΔADE2-Fragment wird durch Verdauung mit SalI freigesetzt und zur Transformation entsprechender Hefestämme verwendet.
Die aus mehreren Schritten bestehende Konstruktion des SSTR2-Expressionsplasmids pJH2 (11) wird durch die Insertion eines SphI/NarI-Fragments des 3'-nichttranslatierten Bereichs aus dem STE7-Gen [Teague, M. A., Chaleff, D. T. und Errede, B. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7371-7375] sowie eines EcoRI/BamHI-Fragments des GAL1/10-Promotors [Yocum, R. R., Hanley, S., West, R., and Ptashne, M. (1984) Mol. Cell. Biol. 4, 1985-1998] in entsprechende Stellen in YEp352 [Hill, J. E., Myers, A. M., Koerner, T. J. und Tzagoloff, (1986) Yeast 2, 163-167] gestartet, wobei pEK1 erzeugt wird. Ein für das offene Leseraster und Transkriptionsterminationssequenzen des GAL4-Gens codierendes PCR-Produkt wird mit 5'-EcoRI- und 3'-AatII-Stellen enthaltenden Oligos amplifiziert und in pEK1 inseriert, wobei pMP3 entsteht. Die für Ratte-SSTR2 codierende cDNA [Strnad, J., Eppler, C. M., Corbett, M. und Hadcock, J. R. (1993) BBRC 191, 968-976] wird mittels PCR unter Verwendung von Oligonukleotiden, die den für den Aminoterminus von SSTR2 codierenden DNA-Sequenzen eine BglII-Stelle sowie direkt hinter der Translationsstoppstelle eine BglII-Stelle hinzufügen, modifiziert. Für SSTR2 codierende Sequenzen werden als BglII-PCR-Fragment in die BamHI-Stelle von pMP3 inseriert.
Das Plasmid pLP82 (12) wird konstruiert, indem man zunächst das XhoI/EcoRI-Promotorfragment in pPGKH-SCG1-Gαs [Kang, Y. -S., Kane, J., Kurjan, J., Stadel, J. M. und Tipper, D. J. (1990) Mol. Cell. Biol. 10, 2582-2590] durch ein aus genomischer Hefe-DNA unter Verwendung von Oligonukleotiden, durch die an den Positionen -200 and -42 5'-XhoI- und 3'-EcoRI-Stellen eingeführt werden, modifiziertes SCG1-Promotorfragment [Dietzel, C. und Kurjan, J. (1987) Cell 50, 1001-1010] ersetzt, wobei das Plasmid pLP61 gebildet wird. Das für die Gαs-Domäne codierende BamHI-Fragment wird durch ein vergleichbares, für Gαi2 codierendes Fragment ersetzt, wobei das Plasmid pLP71 gebildet wird. Das für ein unter der Kontrolle des SCG1-Promotors exprimiertes chimärisches SCG1-Gαi2-G-Protein codierendes XhoI/SalI-Fragment von pLP71 wird in die SalI-Stelle in pRS414 (Stratagene) übertragen, wobei pLP82 gebildet wird.
Das Plasmid pLP83 wird konstruiert, indem man das EcoRI-Fragment in pLP71 durch das für I codierende EcoRI-Fragment aus pPGKH-SCG1 [Kang, Y. -S., Kane, J., Kurjan, J., Stadel, J. M. und Tipper, D. J. (1990) Mol. Cell. Biol. 10, 2582-2590] ersetzt, wobei das Plasmid pLP75 gebildet wird. Das für SCG1 codierende XhoI/SalI-Fragment wird in die SalI-Stelle in pRS414 (Stratagene) übertragen, wobei das Plasmid pLP83 gebildet wird.
BEISPIEL 4
Auswirkungen der G-Protein-Expression auf die Empfindlichkeit des Biotests
Die Hefestämme LY268 (pLP82: CEN pSCG1-Scg1-Gαi2), LY262 (pRS414-PGK-Scg1-Gαi2: pRS414 mit dem PGK-Scg1-Gαi2-Xho/SalI-Fragment aus pPGKH-Scg1-Gαi2 in der SalI-Stelle), LY324 (pLP84: 2μ pSCG1-Scg-Gαi2) und LY284 (pRS424-PGK-Scg-Gαi2: pRS424 mit dem PGK-Scg1-Gαi2-Xho/SalI-Fragment aus pPGKH-Scg1-Gαi2 in der SalI-Stelle) wurden durch Einbringen der genannten Plasmide in den Stamm LY260 [einem Derivat von YPH500 (Stratagene) MATa ura 3-52 lys2-801 ade2 trp1D63 his3Δ200 leu2α1 far1ΔLYS2 scg1ΔhisG fus1ΔFUS1-HIS3 sst2ΔADE2, das das SSTR2-Expressionsplasmid trägt] konstruiert. Übernacht-Flüssigkulturen in SC-Dextrose (2%) ohne ura und trp wurden auf SC-Lactat-Medium (2%) ohne ura und trp und anschließend auf SC-Galactose-Medium (2%) ohne ura und trp überführt. Die Zellen (2 × 10⁵) werden dann in 30 ml SC-Galactose-Agar (2%) ohne ura, trp und his ausplattiert, die angegebenen Mengen an ausgewählten Verbindungen auf auf der Oberfläche der Agarplatte befindliche Papierscheibchen aufgetragen und 3-5 Tage bei 30°C inkubiert (14). Das Ausmaß an Wachstum um S-14 herum hängt jeweils von dem im jeweiligen Stamm enthaltenen G-Protein- Expressionsplasmid ab. Das ausgiebigste Wachstum wird als Reaktion auf S-14 bei LY268 (pLP82: CEN pSCG1-Scg1-Gαi2) beobachtet, ein geringeres Wachstum ist bei den Stämmen LY262 (pRS414-PGK-Scg1-Gαi2) und LY324 (pLP84: 2μ-pSCG1-Scg-Gαi2) zu sehen, während LY284 (pRS424-PGK-Scg1-Gαi2) nur wenig nachweisbares Wachstum zeigt. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit der beobachteten Hemmung pheromonstimulierter Transkriptionsinduktion durch erhöhte Mengen an exprimiertem Gα-Protein. Somit ist eine präzise Regulation der G-Protein-Expressionsniveaus in heterologe G-Protein-gekoppelte Rezeptoren exprimierenden Stämmen für die Entwicklung und erfolgreiche Realisierung eines Biotests für mit dem Rezeptor wechselwirkende Verbindungen entscheidend.
Das Plasmid pLP84 wird konstruiert, indem man zunächst das XhoI/EcoRI-Promotorfragment in pPGKH-SCG1-Gα_s [Kang, Y. -S., Kane, J., Kurjan, J., Stadel, J. M. und Tipper, D. J. (1990) Mol. Cell. Biol. 10, 2582-2590] durch ein aus genomischer Hefe-DNA unter Verwendung von Oligonukleotiden, durch die an den Positionen -200 and -42 5'-XhoI- und 3'-EcoRI-Stellen eingeführt werden, modifiziertes SCG1-Promotorfragment [Dietzel, C. und Kurjan, J. (1987) Cell 50, 1001-1010] ersetzt, wobei das Plasmid pLP61 gebildet wird. Das für die Gα_s-Domäne codierende BamHI-Fragment wird durch ein vergleichbares für Gα_i2 codierendes Fragment ersetzt, wobei das Plasmid pLP71 gebildet wird. Das für ein unter der Kontrolle des SCG1-Promotors exprimiertes chimärisches SCG1-Gα_i2-G-Protein codierende XhoI/SalI-Fragment aus pLP71 wird in die SalI-Stelle in pRS424 (Stratagene) übertragen, wobei pLP84 gebildet wird.
BEISPIEL 5
Der Somatostatin-Rezeptor kann ein Signal über das endogene Hefe-Gα-Protein übermitteln
Man nimmt an, daß SSTR2 in Säugerzellen an Gαi₂ und Gα_i3 koppeln kann [Luthin, D. R., Eppler, C. M. und Linden, J. (1993) J. Biol. Chem. 268, 5990-5996]. Es konnte jedoch gezeigt werden, daß SSTR2 ein Signal über das endogene Hefe-Gα-Protein übermitteln kann, wenn er in entsprechenden Hefestämmen (unten beschrieben) exprimiert wird. Diese Beobachtung impliziert eine notwendige Kopplung von SSTR2 an das endogene Gα-Protein. Die Fähigkeit heterologer G-Protein-gekoppelter Rezeptoren zur Kopplung an das endogene Gα-Protein bedeutet eine signifikante Verbesserung der existierenden Technologie und wird im Stand der Technik nicht für möglich gehalten (King K., Dohlman, H. G., Thorner, J., Caron, M. G. und Lefkowitz, R. J. (1990) Science 250, 121-123). Die Hefestämme LY266 (pLP83: CEN pSCG1-Scg1), LY280 (pRS414-PGK-Scg1: pRS414 mit dem PGK-Scg1-Xho-SalI-Fragment aus pPGKH-ScgI in der SalI-Stelle), LY326 (pLP86: 2μ-pSCG1-Scg) und LY282 (pRS424-pPGK-Scg: pRS424 mit dem PGK-Scg1-Xho-SalI-Fragment aus pPGKH-Scg1 in der SalI-Stelle) wurden durch Einbringen der genannten Plasmide in den Stamm LY260 konstruiert. Übernacht-Flüssigkulturen dieser Stämme, die nur SCG1/GPA1 exprimieren können, in SC-Dextrose (2%) ohne ura und trp wurden auf SC-Lactat-Medium (2%) ohne ura, trp und anschließend auf SC-Galactose-Medium (2%) ohne ura und trp überführt. Die Zellen (2 × 10⁵) werden dann in 30 ml SC-Galactose-Medium (2%) ohne ura, trp und his ausplattiert, die angegebenen Mengen an ausgewählten Verbindungen auf auf der Oberfläche der Agarplatte befindliche Papierscheibchen aufgetragen und 3-5 Tage bei 30°C inkubiert. Wachstumshöfe werden um mit verschiedenen Konzentrationen an S-14 gesättigten Scheibchen herum beobachtet, wodurch demonstriert wird, daß ein produktives Signal über eine Wechselwirkung zwischen SSTR2 und dem Hefeprotein SCG1/GPA1 übertragen werden kann (15). Diese Beobachtungen zeigen, daß ein einfacher und breit anwendbarer Biotest realisiert werden kann, bei dem ein beliebiges Mitglied der Klasse der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in entsprechend modifizierten Hefestämmen exprimiert und zur Kopplung an das endogene Gα-Protein veranlaßt werden kann.
Das Plasmid pLP86 wird konstruiert, indem man das EcoRI-Fragment in pLP71 durch das für SCG1 codierende EcoRI-Fragment aus pPGKH-SCG1 [Kang, Y. -S., Kane, J., Kurjan, J., Stadel, J. M. und Tipper, D. J. (1990) Mol. Cell. Biol. 10, 2582-2590] ersetzt, wobei das Plasmid pLP75 gebildet wird. Das für SCG1 codierende XhoI/SalI-Fragment wird in die SalI-Stelle in pRS424 (Stratagene) übertragen, wobei das Plasmid pLP86 gebildet wird.
BEISPIEL 6
Mutationen in SST2 verbessern die Empfindlichkeit der Reaktion auf Somatostatin
Mutationen im SST2-Gen führen zur Supersensitivität von Zellen, bei denen es sich ansonsten um Wildtypzellen handelt, gegenüber Paarungspheromon. Die Auswirkung dieser Mutation auf die in far1-, FUS1-HIS3-Stämmen exprimierten AT-Resistenzniveaus wird untersucht. (16). Zellen (5 × 10⁵) aus Übernachtkulturen von LY230 [einem Derivat von YPH50 (Stratagene) MATa SST2 ura3-52 lys2-801 ade2 trp1Δ63 his3Δ200 leu2Δ1 far1ΔFUS1-HIS3] und LY238 (einer Modifikation von LY230 sst2ΔADE2) in SCD-ura, trp werden auf SCD-ura, trp, his plus 10 mM AT ausplattiert und 2 Tage bei 30 °C inkubiert. LY238 (sst2) zeigt eine erhöhte AT-Resistenz als Reaktion auf Paarungsfaktor. Dabei wird LY238-Wachstum um Scheibchen mit 10 pmol Paarungspheromon herum beobachtet, während LY230 (SST2) 1 nmol Paarungsfaktor benötigt, so daß ein signifikantes Wachstum beobachtet werden kann. Somit steigert die Einführung von sst2 in diese Stämme die Empfindlichkeit des Biotests um mindestens das 100fache, wodurch ebenso eine Erhöhung der Empfindlichkeit des SSTR-abhängigen Biotests ermöglicht wird.
Hefestämme, die SSTR2 exprimieren und ein defektes sst2-Gen tragen, zeigen ein weitaus stärkeres Wachstum um Scheibchen mit verschiedenen Somatostatinkonzentrationen herum als Stämme mit einem funktionsfähigen SST2-Gen. Übernachtkulturen der Stämme LY268 (sst2, mit pLP82), LY266 (sst2, mit pLP83), LY288 [einem das SSTR2-Expressionsplasmid und das SCG1-Gα_i2-Expressionsplasmid pLP82 tragenden Derivat von YPH500 (Stratagene) MATa SST2 ura3-52 lys2-801 ade2 trp1Δ63 his3Δ200 leu2Δ1 far1ΔLYS2 scg1ΔhisG fus1ΔFUS1-HIS3] und LY290 (einer pLP83 enthaltenden Modifikation von LY288) in SC-Dextrose (2%) ohne ura, trp wurden auf SC-Lactat-Medium (2%) ohne ura und trp und anschließend auf SC-Galactose-Medium (2%) ohne ura und trp überführt. Die Zellen (2 × 10⁵) werden dann auf 30 ml SC-Galactose-Platten (2%) ohne ura, trp und his ausplattiert, die angegebenen Mengen an ausgewählten Verbindungen auf auf der Oberfläche der Agarplatte befindliche Papierscheibchen aufgetragen und 3-5 Tage bei 30°C inkubiert. Wachstumshöfe werden um mit verschiedenen Konzentrationen an S-14 gesättigten Scheibchen herum sowohl bei sst2Δ- als auch SST2-Stämmen beobachtet (17), doch ist der von den Stämmen LY268 und LY266 (sst2) gezeigte Wachstumsgrad deutlich höher als der für die Stämme LY288 und LY290 (SST2) beobachtete. Weiterhin tritt der Herunterregulationseffekt von SST2 stärker in denjenigen Stämmen zutage, die lediglich das SCG1/GPA1-Wildtypprotein exprimieren, was damit übereinstimmt, daß man von SST2 eine festere Wechselwirkung mit dem nativen Protein als mit dem chimärischen SCG1-Gα_i2-Protein erwartet.
BEISPIEL 7
Funktionelle Expression eines Cholecystokinin (CCK_B)-Rezeptors der Ratte in Hefe
Cholecystokinin (CCK) ist ein Haupthormon im Verdauungstrakt, das eine wichtige Rolle bei der Steuerung der pankreatischen Sekretion und dem Ausstoß von Gallenflüssigkeit spielt (1). CCK ist ebenfalls eines der am weitesten verbreiteten Neuropeptide des Gehirns (2). Die CCK-Effekte werden über die Wirkung von Zelloberflächenrezeptoren vermittelt, die sich unter Verwendung pharmakologischer Kriterien in zwei Subtypen, nämlich CCK_A und CCK_B, klassifizieren lassen (3). Durch molekulare Klonierungsarbeiten konnten cDNAs identifiziert werden, die für G-Protein-gekoppelte CCK_A- (4) bzw. CCK_B- (5-8) Rezeptoren codieren. Kürzlich wurden Verbindungen mit selektiven CCK_B-Rezeptor-Antagonisteneigenschaften und einer starken anxiolytischen Aktivität identifiziert (9). Die funktionelle Expression von CCK_B-Rezeptoren in Hefe sollte ein schnelles Screening auf neue Verbindungen mit CCK_B-Antagonisteneigenschaften gestatten und die für die rationale Konstruktion neuer CCK_B-Liganden erforderliche molekulare Charakterisierung struktureller Aspekte des CCK_B-Rezeptors erleichtern.
Material und Methoden
Plasmidkonstruktionen. Alle molekularbiologischen Manipulationen wurden gemäß Standardverfahren (10) durchgeführt. Der Ratte-CCK_B-Rezeptor wurde von Rattenhirn-cDNA mittels PCR unter Verwendung von Oligonukleotidprimern, mit denen an den 5'- und 3'-Enden BglII-Stellen eingeführt werden (5'-AAAAGATCTAAAATGGACCTGCTCAAGCTG, 3'-AAAAGATCTTCAGCCAGGCCCCAGTGTGCT), kloniert. Das CCK_B-Rezeptor-Expressionsplasmid pJH20 wurde konstruiert, indem das mit BglII verdaute PCR-Fragment in der korrekten Orientierung in das mit BamHI geschnittene pMP3 (11) inseriert wurde. Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Gα-Protein-Expressionsplasmide wurden konstruiert, indem für die 47 carboxyterminalen Aminosäuren von GPA1 codierende DNA-Sequenzen in pLP83 (11) durch solche für Gα_s (pLP122), Gα_i2 (pLP121) ersetzt wurden.
Stammkonstruktionen. Die Konstruktion der Hefestämme sowie die Formulierung der Wachstumsmedien und Kultivierungsbedingungen erfolgten nach Standardverfahren (12). Die DNA-vermittelte Hefetransformation wurde mit dem Lithiumacetatverfahren durchgeführt. Die als Grundlage für alle in diesem Bericht beschriebenen Experimente verwendeten Hefestämme wurden mittels sequentieller Insertionsdeletion unter Verwendung rekombinanter Allele konstruiert. Den Ratte-CCK_B-Rezeptor exprimierende Hefestämme wurden mittels sequentieller DNA-vermittelter Transformation von LY296 (MATa ura3-52 trp1Δ63 his3Δ200 leu2Δ1 ade2-101 lys2-801 gpa1ΔhisG far1ΔLYS2 FUS1-HIS3 sst2ΔADE2, Ref. 7) mit pJH20 und danach mit den oben beschriebenen Gα-Protein-Expressionsplasmiden konstruiert.
Sättigungsbindungstests mit radioaktiv markiertem Agonisten. Hefemembranrohextrakte wurden von Kulturen in der späten log-Phase mittels Glasperlenlyse und Zentrifugation bei 40000 × g nach einem veröffentlichten Verfahren (13) präpariert. Der Proteingehalt der Membranrohfraktionen wurde mit dem Biorad-Proteintestkit gemäß den Angaben des Herstellers gemessen. Radioligandenbindungstests wurden gemäß Strnad et al. (14) mit ³H-CCK-8 (Amersham) in Gegenwart von 150 mM NaCl ausgeführt. Als nicht-spezifische Bindung wurde die in Gegenwart von 1 μM CCK-4 beobachtete Bindung definiert. In aus Zellen ohne CCK_B-Rezeptor hergestellten Membranfraktionen wurde eine vernachlässigbare spezifische Bindung beobachtet (Daten nicht gezeigt).
Biotest. Ein Funktionstest für in Hefe exprimierten CCK_B-Rezeptor wurde unter Verwendung einer Modifikation eines Standardverfahrens (11) ausgeführt. Dabei wurden Hefestämme über Nacht in 2 ml synthetischem komplettem Flüssigmedium mit Glucose (2%) und ohne Uracil und Tryptophan (SCD-ura-trp) angezogen, zur Entfernung von Glucoseresten gewaschen und über Nacht in 5 ml SC-Galactose (2%)-ura-trp-Flüssigmedium angezogen. Geschmolzenes (50 °C) SC-Galactose (2%)-ura-trp-his-Agarmedium (30 ml, durch Zugabe von konzentriertem KOH oder NH₄OH vor dem Autoklavieren auf pH 6,8 eingestellt) wurde mit der Übernachtkultur (2 × 10⁴ Zellen/ml) angeimpft und in quadratische (9 × 9 cm) Petrischalen gegossen. Auf die Oberfläche des verfestigten Agars wurden sterile Filterscheibchen gelegt und mit 10 μl die angegebenen Mengen der genannten Verbindungen enthaltendem DMSO gesättigt. Die Platten wurden 3 Tage bei 30 °C inkubiert. Cholecystokinine (CCK-4, CCK-8), Somatostatin (S-14) und Metenkephalin stammten von Bachem. Oxymetazolin, Isoproterenol und Carbachol stammten von Sigma.
ERGEBNISSE
Bindung von Cholecystokinin an den in Hefe exprimierten Ratte-CCK_B-Rezeptor. Die funktionelle Expression des Ratte-CCK_B-Rezeptors auf hohem Niveau in der Hefe war eine notwendige Voraussetzung für die Entwicklung eines sinnvollen Biotests. Dabei wurde die Ratte-CCK_B-Rezeptor-cDNA unter die Kontrolle des GAL1-Promotors im Plasmid pJH20 gestellt. Mit diesem Konstrukt wird auch die induzierbare Überexpression von Gal4p, dem Transkriptionsaktivierungsprotein für galactoseinduzierbare Gene, verliehen, was zu deutlich erhöhten Niveaus an Rezeptorprotein in Membranrohfraktionen im Vergleich zu einem von einem Plasmid ohne GAL4-Sequenzen exprimierten Rezeptor führt (Daten nicht gezeigt). CCK_B-Rezeptorsequenzen wurden in pJH20 ohne Modifikation der proteincodierenden Sequenzen eingeführt. Von King et al. wurde bereits berichtet, daß der Austausch der aminoterminalen Domäne des β₂-adrenergen Rezeptors gegen die äquivalente STE2-Sequenz für eine effiziente Rezeptorexpression in der Hefe notwendig war (15). Im Gegensatz dazu benötigt die funktionelle Expression des CCK_B-Rezeptors in der Hefe keine Addition von Hefesequenzen an den Aminoterminus. Es wurden die Expression chimärischer Gα-Proteine, die sich aus der aminoterminalen βγ-Wechselwirkungsdomäne von Gpa1p und carboxyterminalen Rezeptorwechselwirkungsdomänen von Ratte-Gα_i2 (pLP121) oder -Gα_s (pLP122) zusammensetzen, unter der Kontrolle des GPA1-Promotors verleihende Plasmide konstruiert. Hefestämme, die exprimierten CCK_B-Rezeptor sowie chimärisches Gα_i2-(LY628) bzw. Gα_s- (LY631) Protein enthalten, wurden durch Transformation eines durch die Deletion von für Komponenten des Paarungssignaltransduktionswegs codierenden Genen modifizierten Hefestamms (LY296) mit CCK_B-Rezeptor- und Gα-Protein-Expressionsplasmiden konstruiert. Die meisten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zeigen jeweils agonistenabhängige hoch- und niedrigaffine Zustände. Die hochaffine Agonistenbindung hängt von der funktionellen Assoziation des Rezeptors mit einem heterotrimeren G-Protein ab. Falls der Rezeptor nicht mit dem G-Protein assoziiert oder von diesem entkoppelt ist, liegt eine niedrigaffine Agonistenbindung vor, die in Sättigungsbindungstests mit radioaktiv markiertem Agonisten nicht nachweisbar ist. In aus LY631-Zellen hergestellten Hefe-Membranrohfraktionen band der Agonist ³H-CCK-8 mit hoher Affinität und auf sättigbare Weise an den CCK_B-Rezeptor (18), womit demonstriert wurde, daß (1) eine funktionelle ligandenbindende Konformation des CCK_B-Rezeptors in der Hefe exprimiert wurde und (2) der Rezeptor funktionell mit dem chimärischen Gα-Protein unter Ausbildung eines hochaffinen Agonistenbindungszustands assoziiert war. Der in Hefe exprimierte CCK_B-Rezeptor zeigte eine Affinität für ³H-CCK-8 (K_d = 8 nM), die wesentlich niedriger als der hochaffine Bindungszustand des in Säugerzellen exprimierten CCK_B-Rezeptors (K_d = 100 pM, Ref. 5) war, was vielleicht an einer ineffizienten Wechselwirkung mit der Rezeptorwechselwirkungsdomäne von Ratte-Gα_s lag. Man würde erwarten, daß diese Bindungsparameter den nativen Werten in Extrakten aus das zugehörige Gα-Protein Gαq (5-8) enthaltenden Zellen stärker ähneln. Die Gesamtzahl an beobachteten ³H-CCK-8-Bindungsstellen (B_max = 206 fmol/mg) stand im Einklang mit Werten, die für den α-Paarungspheromon-Rezeptor der Hefe erhalten wurden (200 fmol/mg, Ref. 16). Bei vielen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren ist die hochaffine Agonistenbindung gegenüber GTP und dessen Analogen empfindlich. GTP-Analoge induzieren die Dissoziation des Rezeptor/G-Protein-Komplexes, was zu einem niedrigaffinen Agonistenbindungszustand führt. Die Zugabe von GppNHp (100 μM), einem nicht hydrolysierbaren GTP-Analog, zu einem Agonistenbindungstest reduziert die spezifische Bindung von ³H-CCK-8 an den CCK_B-Rezeptor in Membranrohfraktionen aus LY631-Zellen um mehr als 50%. Diese Ergebnisse stellen einen weiteren Hinweis auf die funktionelle Kopplung zwischen dem CCK_B-Rezeptor und dem chimärischen Gα-Protein dar. Somit zeigt der in Hefe exprimierte Ratte-CCK_B-Rezeptor Eigenschaften einer hochaffinen Agonistenbindung, die mit den in Säugergeweben beobachteten vergleichbar sind.
Die Agonistenselektivität des CCK_B-Rezeptors blieb bei der Expression in Hefe erhalten. Es wurde ein selektiver und empfindlicher Biotest entwickelt, bei dem Hefestämme verwendet werden, die die oben beschriebenen genetischen Modifikationen sowie die Expression des CCK_B-Rezeptors und chimärischer Gα_i2- und Gα_s-Proteine verleihende Plasmide tragen. Eine dosisabhängige Wachstumsreaktion von LY628- und LY631-Zellen war um das aufgetragene CCK-4 deutlich erkennbar (19). Der Test war selektiv: der Durchmesser der Wachstumszonen war zur angegebenen Affinität der Liganden für den CCK_B-Rezeptor (CCK-8 > Gastrin > CCK-4) proportional, was die Fähigkeit des Biotests zur Unterscheidung zwischen Liganden mit unterschiedlicher Potency (5-8) widerspiegelt. Nachweisbare Wachstumsreaktionen wurden weder als Antwort auf verschiedene für andere G-Protein-gekoppelte Rezeptoren selektive Agonisten (Somatostatin, Metenkephalin, Oxymetazolin, Isoproterenol, Carbachol) noch für Hefezellen, denen der CCK_B-Rezeptor fehlt, beobachtet (Daten nicht gezeigt). Eine nachweisbare Reaktion wurde gegenüber 10 μg CCK-4 beobachtet.
DISKUSSION
An den CCK-Rezeptoren wirkende Verbindungen, insbesondere Antagonisten, können ein großes therapeutisches Potential besitzen (3). In der Peripherie machen die Hemmwirkungen von CCK-Antagonisten diese zu ausgezeichneten Kandidaten für die Behandlung von Pankreatitis, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Gallenkolik, Störungen der Magenentleerung und Reizkolon. Durch CCK-Antagonisten wird die Entwicklung einer Übersättigung aufgehoben, so daß sie sich zur Verbesserung des Appetits bei Patienten mit Anorexie oder anderen, bei denen eine erhöhte Nahrungsaufnahme erforderlich ist, eignen könnten. Umgekehrt könnten CCK-Agonisten als Appetitzügler geeignet sein. Durch CCK-Antagonisten wird auch die Opiatanalgesie potenziert, so daß sie sich zur Verwendung bei der Kontrolle klinischer Schmerzzustände eignen könnten. Im ZNS zeigen ausgewählte CCK-Antagonisten Potential als leistungsfähige Anxiolytika (9). Ferner lindern CCK-Antagonisten das mit dem Absetzen von Arzneimitteln assoziierte Angstgefühl und könnten somit eine Verwendung bei der Behandlung der Entziehung von allgemein mißbrauchten Arzneimitteln finden. CCK-Agonisten könnten als Antipsychotika eingesetzt werden.
IN DIESEM BEISPIEL ZITIERTE LITERATURSTELLEN

1. Ivy, A.C. und E. Oldberg. 1928. J. Physiol. (London) 86: 599-613.
2. Dockray, G.J.R. 1976. Immunochemical evidence of cholecystokinin-like peptides in brain. Nature 264: 568-570.
3. Woodruff, G.N. und J. Hughes. 1991. Cholecystokinin antagonists. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 31: 469-501.
4. Wank, S.A., R. Harkins, R.T. Jensen, H. Shapiro, A. de Weerth und T. Slattery. 1992. Purification, molecular cloning, and function expression of the cholecystokinin receptor from rat pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3125-3129.
5. Kopin, A.S., Y-M. Lee, E.W. McBride, L.J. Miller, M. Liu, H.Y. Lin, L.F. Kolakowski und M. Beinborn. 1992. Expression cloning and characterization of the canine parietal cell gastrin receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3605-3609.
6. Wank, S.A., J.R. Pisenga und A. de Weerth. 1992. Brain and gastrointestinal cholecystokinin receptor family: Structure and function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8691-8695.
7. Lee, Y-M., M. Beinborn, E.W. McBride, M. Lu, L.F. Kolakowski und A.S. Kopin. 1993. The human brain cholecystokinin-B/gastrin Receptor. J. Biol. Chem. 268: 8164-8169.
8. Ito, M., T. Matsui, T. Taniguchi, T. Tsukamoto, T. Murayama, N. Arima, H. Nakata, T. Chiba und K. Chibura. 1993. Functional characterization of a human brain cholecystokinin-B receptor. J. Biol. Chem. 268: 18300-18305.
9. Hughes, J., P. Boden, B. Costall, A. Domeney, E. Kelly, D.C. Horwell, J.C. Hunter, R.D. Pinnock und G.N. Woodruff. 1990. Development of a class of selective cholecystokinin type B receptor antagonists having potent anxiolytic activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6728-6732.
10. Sambrook, J., E. F. Fritsch und T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Handbook. Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor, NY.
11. Price, L.A., E.M. Kajkowski, J.R. Hadcock, B.A. Ozenberger und M.H. Pausch. 1995. Yeast cell growth in response to agonist dependent activation of a mammalian somatostatin receptor. Eingereicht.
12. Rose, M., F. Winston und P. Hieter. 1990. Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor, NY.
13. Blumer, K. J., J. E. Reneke und J. Thorner. 1988. The STE2 gene product is the ligand-binding component of the α-factor receptor of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 263: 10836-10842.
14. Strnad, J., C. M. Eppler,, M. Corbett und J. R. Hadcock. 1993. The rat SSTR2 somatostatin receptor subtype is coupled to inhibition of cyclic AMP accumulation. Biochem. Biophys. Res. Comm. 191: 968-976.
15. King, K., H. G. Dohlman, J. Thorner, M. G. Caron und R.J. Lefkowitz. 1990. Control of yeast mating signal transduction by a mammalian β₂-adrenergic receptor and G_s α subunit. Science 250: 121-123.
16. Weiner, J. L., C. Guttierez-Steil und K. J. Blumer. 1993. Disruption of receptor-G protein coupling in yeast promotes the function of an SST2-dependent adaptation pathway. J. Biol. Chem. 268: 8070-8077.

BEISPIEL 9
Funktionelle Expression eines Adenosinrezeptors A_2a der Ratte in Hefe
Adenosin wirkt ebenso wie ATP und verwandte purinerge Verbindungen sowohl als neurohormonales Agens als auch als den Vorgang der Kommunikation von Zelle zu Zelle steuerndes Autokoid (1). In dieser Rolle reguliert Adenosin eine große Bandbreite physiologischer Funktionen, einschließlich Herzschlagfrequenz und Kontraktilität, Tonus der glatten Muskulatur, Sedation, Freisetzung von Neurotransmittern, Blutplättchenfunktion, Lipolyse, Nierenfunktion und Funktion der weißen Blutkörperchen. Dabei werden die Adenosineffekte über die Wirkung von Zelloberflächenrezeptoren vermittelt, die sich unter Anwendung pharmakologischer Kriterien in drei Subtypen, nämlich A₁, A_2a und A_2b sowie A₃, klassifizieren lassen. Durch molekulare Klonierungsarbeiten konnten cDNAs identifiziert werden, die für G-Protein-gekoppelte A₁- (2-5), A_2a- und A_2b- (6-9) und A₃- (10) Adenosinrezeptoren codieren. Die funktionelle Expression von Adenosinrezeptoren in Hefe sollte ein schnelles Screening auf neue Verbindungen mit Adenosin-Agonisten- und -Antagonisteneigenschaften gestatten und die für die rationale Konstruktion neuer Adenosinliganden erforderliche molekulare Charakterisierung struktureller Aspekte des Adenosinrezeptors erleichtern.
MATERIAL UND METHODEN
Plasmidkonstruktionen. Alle molekularbiologischen Manipulationen wurden gemäß Standardverfahren (11) durchgeführt. Der Ratte-A_2a-Adenosinrezeptor (9) wurde von Rattenhirn-cDNA mittels PCR unter Verwendung von Oligonukleotidprimern, mit denen an den 5'- und 3'-Enden BamHI-Stellen eingeführt werden (5'-GAAGATCTAAAAAATGGGCTCCTCGGTGTAC, 3'-ACATGCATGCAGATCTTCAGGAAGGGGCAAACTC), kloniert. Das A_2a-Adenosinrezeptor-Expressionsplasmid pJH21 wurde konstruiert, indem das mit BglII verdaute PCR-Fragment in der korrekten Orientierung in das mit BamHI geschnittene pMP3 (12) inseriert wurde. Zur konstitutiven Expression des A_2a-Adenosinrezeptors in glucosehaltigem Medium wurde der Expressionsvektor pLP100 konstruiert. Dabei wurden für Transkriptionsregulationssequenzen aus dem ADH1-Gen (&) codierende DNA-Fragmente mittels PCR amplifiziert und in pRS426 inseriert. Ein ADH1-Transkriptionsterminatorfragment wurde aus genomischer Hefe-DNA (YPH501, Stratagene) unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide, mit denen eine 5'-XhoI- (TTTCTCGAGCGAATTTCTTATGATTT) und eine 3'-KpnI- (TTTGGTACCGGGCCCGGACGGATTACAACAGGT) Stelle hinzugefügt wurden, amplifiziert. Ein ADH1-Promotorfragment wurde aus genomischer Hefe-DNA unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide, mit denen eine 5'-SacI- (GGGAGCTCTGATGGTGGTACATRACG) und eine 3'-BamHI- (GGGGGATCCTGTATATGAGATAGTTGA) Stelle hinzugefügt wurden, amplifiziert. Das A_2a-Adenosinrezeptor-Expressionsplasmid pLP116 wurde konstruiert, indem ein für den A_2a-Adenosinrezeptor codierendes und unter Verwendung von Oligonukleotiden, mit denen eine 5'-BglII- (AAAGATCTAAAATGGGCTCCTCGGTGTAC) und eine 3'-SalI- (AAGTCGACTCAGGAAGGGGCAAACTC) Stelle hinzugefügt wurden, amplifiziertes PCR-Fragment in das mit BamHI und SalI geschnittene pLP100 inseriert wurde. Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Gα-Protein-Expressionsplasmide wurden konstruiert, indem für die 47 carboxyterminalen Aminosäuren von GPA1 codierende DNA-Sequenzen in pLP83 (12) durch solche für Gα_s (pLP122) und Gα_i2 (pLP121) ersetzt wurden.
Stammkonstruktionen. Die Konstruktion der Hefestämme sowie die Formulierung der Wachstumsmedien und Kultivierungsbedingungen erfolgten nach Standardverfahren (13). Die DNA-vermittelte Hefetransformation wurde mit dem Lithiumacetatverfahren durchgeführt. Die als Grundlage für alle in diesem Bericht beschriebenen Experimente verwendeten Hefestämme wurden mittels sequentieller Insertionsdeletion unter Verwendung rekombinanter Allele konstruiert. Den Ratte-A_2a-Adenosinrezeptor exprimierende Hefestämme wurden mittels sequentieller DNA-vermittelter Transformation von LY296 (MATa ura3-52 trpiΔ63 his3Δ200 leu2Δ1 ade2-101 lys2-801 gpa1ΔhisG far1ΔLYS2 FUS1-HIS3 sst2ΔAΔE2, Ref. 12) mit A_2a-Adenosinrezeptor-Expressionsplasmiden und danach mit den oben beschriebenen Gα-Protein-Expressionsplasmiden konstruiert.
Sättigungsbindungstests mit radioaktiv markiertem Agonisten. Hefemembranrohextrakte wurden von Kulturen in der späten log-Phase mittels Glasperlenlyse und Zentrifugation bei 40000 × g nach einem veröffentlichten Verfahren (14) präpariert. Der Proteingehalt der Membranrohfraktionen wurde mit dem Biorad-Proteintestkit gemäß den Herstellerangaben gemessen. Radioligandenbindungstests wurden gemäß Strnad et al. (15) mit ³H-NECA (Amersham) ausgeführt. Als nichtspezifische Bindung wurde die in Gegenwart von 1 μM NECA beobachtete Bindung definiert. In aus Zellen ohne A_2a-Adenosinrezeptor hergestellten Membranfraktionen wurde eine vernachlässigbare spezifische Bindung beobachtet (Daten nicht gezeigt).
Biotest. Ein Funktionstest für den in Hefe exprimierten A_2a-Adenosinrezeptor wurde unter Verwendung einer Modifikation eines Standardverfahrens (12) ausgeführt. Dabei wurden Hefestämme über Nacht in 2 ml synthetischem komplettem Flüssigmedium mit Glucose (2%) und ohne Uracil und Tryptophan (SCD-ura-trp-Medium) angezogen, zur Entfernung von Glucoseresten gewaschen und über Nacht in 5 ml SC-Galactose (2%)-ura-trp-Flüssigmedium angezogen. Geschmolzenes (50 °C) SC-Galactose (2%)-ura-trp-his-Agarmedium (30 ml, durch Zugabe von konzentriertem KOH oder NH₄OH vor dem Autoklavieren auf pH 6,8 eingestellt) wurde mit der Übernachtkultur (2 × 10⁴ Zellen/ml) angeimpft und in quadratischen (9 × 9 cm) Petrischalen ausplattiert. Zur Expression des A_2a-Adenosinrezeptors in glucosehaltigem Medium wurden der ersten Übernachtkultur Proben entnommen und in wie oben zusammengesetztem Agarmedium mit Glucose (2%) statt Galactose getestet. Auf die Oberfläche des verfestigten Agars wurden sterile Filterscheibchen gelegt und mit 10 μl die angegebenen Mengen der genannten Verbindungen enthaltendem DMSO gesättigt. Die Platten wurden 3 Tage bei 30 °C inkubiert. Die Adenosinliganden CGS-21680, NECA und DPMA wurden von RBI bezogen. Somatostatin (S-14) und Metenkephalin stammten von Bachem. Oxymetazolin, Isoproterenol und Carbachol stammten von Sigma.
ERGEBNISSE
Bindung von Adenosin-Agonisten an den in Hefe exprimierten Ratte-A_2a-Adenosinrezeptor. Die funktionelle Expression des Ratte-A_2a-Adenosinrezeptors auf hohem Niveau in der Hefe war eine notwendige Voraussetzung für die Entwicklung eines sinnvollen Biotests. Dabei wurde im Plasmid pJH21 die Ratte-A_2a-Adenosinrezeptor-cDNA unter die Kontrolle des induzierbaren GAL1-Promotors gestellt. Mit diesem Konstrukt wird auch die induzierbare Überexpression von Gal4p, dem Transkriptionsaktivierungsprotein für galactoseinduzierbare Gene, verliehen, was zu deutlich erhöhten Niveaus an Rezeptorprotein in Membranrohfraktionen im Vergleich zu einem von einem Plasmid ohne GAL4-Sequenzen exprimierten Rezeptor führt (Daten nicht gezeigt). Das Plasmid pLP116 verleiht eine konstitutive Expression des A_2a-Adenosinrezeptors auf hohem Niveau unter der Kontrolle des ADH1-Promotors. Bei beiden Plasmiden wurden für den A_2a-Adenosinrezeptor codierende DNA-Sequenzen ohne Modifikation der proteincodierenden Sequenzen eingeführt. Von King et al. wurde bereits berichtet, daß der Austausch der aminoterminalen Domäne des β₂-adrenergen Rezeptors gegen die äquivalente STE2-Sequenz für eine effiziente Rezeptorexpression in der Hefe notwendig war (16). Im Gegensatz dazu benötigt die funktionelle Expression des A_2a-Adenosinrezeptors in der Hefe keine Addition von Hefesequenzen an den Aminoterminus. Es wurde ein chimärisches Gα-Protein, das sich aus der vorgeschlagenen aminoterminalen βγ-Wechselwirkungsdomäne von Gpa1p und einer carboxyterminalen Rezeptorwechselwirkungsdomäne von Ratte-Gα_s (pLP122) unter der Kontrolle des GPA1-Promotors zusammensetzt, konstruiert. Hefestämme, die exprimierten A_2a-Adenosinrezeptor sowie chimärisches Gα-Protein enthalten, wurden durch Transformation eines durch die Deletion von für Komponenten des Paarungssignaltransduktionswegs codierenden Genen modifizierten Hefestamms (LY296) mit A_2a-Adenosinrezeptor- und Gα-Protein-Expressionsplasmiden konstruiert.
Die meisten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zeigen jeweils agonistenabhängige hoch- und niedrigaffine Zustände. Die hochaffine Agonistenbindung hängt von der funktionellen Assoziation des Rezeptors mit einem heterotrimeren G-Protein ab. Falls der Rezeptor nicht mit dem G-Protein assoziiert oder von diesem entkoppelt ist, liegt eine niedrigaffine Agonistenbindung vor, die in Sättigungsbindungstests mit radioaktiv markiertem Agonisten nicht nachweisbar ist. In Hefe-Membranrohfraktionen aus pLP116 und pLP122 tragenden Zellen (LY626) band der Agonist ³H-NECA mit hoher Affinität und auf sättigbare Weise an den A_2a-Adenosinrezeptor (20), womit demonstriert wurde, daß (1) eine funktionelle ligandenbindende Konformation des A_2a-Adenosinrezeptors in der Hefe exprimiert wurde und (2) der Rezeptor funktionell mit dem chimärischen Gα-Protein unter Ausbildung eines hochaffinen Agonistenbindungszustands assoziiert war. Die Gesamtzahl an beobachteten ³H-NECA-Bindungsstellen (B_max = 242 fmol/mg) überschritt Werte, die für den α-Paarungspheromon-Rezeptor der Hefe erhalten worden waren (200 fmol/mg, Ref. 17). Die Affinität von [³H]-NECA für den A_2a-Adenosinrezeptor in Hefemembranen (Kd-8 μM) ist mit der in Säugerzellen beobachteten gleichwertig, was auf eine funktionelle Kopplung zwischen Rezeptor und G-Protein hindeutet.
Die Agonistenselektivität des A_2a-Adenosinrezeptors blieb bei der Expression in Hefe erhalten. Es wurde ein selektiver und empfindlicher Biotest entwickelt, bei dem ein Hefestamm (LY595) verwendet werden, der die oben beschriebenen genetischen Modifikationen sowie die Expression des A_2a-Adenosinrezeptors (pLP116) und von GPA1 (pLP83) verleihende Plasmide trägt. Eine dosisabhängige Wachstumsreaktion von LY595-Zellen war um aufgetragenes CGS-21680, einem A_2a-Adenosinrezeptor selektiven Agonisten, deutlich erkennbar, wobei die Wachstumsreaktion deutlich stärker als die von auf NECA und DPMA reagierenden Zellen war (21). Der Test war selektiv: der Durchmesser der Wachstumszonen war zur angegebenen Affinität der Liganden für den A_2a-Adenosinrezeptor (CGS-21680>NECA=DPMA) proportional, was die Fähigkeit des Biotests zur Unterscheidung zwischen Liganden mit unterschiedlicher Potency widerspiegelt. Nachweisbare Wachstumsreaktionen wurden weder als Antwort auf verschiedene für andere G-Protein-gekoppelte Rezeptoren selektive Agonisten (Somatostatin, Metenkephalin, Oxymetazolin, Isoproterenol, Carbachol) noch für Hefezellen, denen der A_2a-Adenosinrezeptor fehlt, beobachtet (Daten nicht gezeigt). Eine nachweisbare Reaktion wurde gegenüber 10 μg CGS-21680 beobachtet.
DISKUSSION
Für Verbindungen, die die Funktion der Adenosinrezeptoren modulieren (1), gibt es viele therapeutische Anwendungsmöglichkeiten. Adenosin-Agonisten können bei der Behandlung epileptischer Anfälle und zur Verhinderung einer neuronalen Schädigung bei Schlaganfall und neurodegenerativen Erkrankungen geeignet sein. Die antidysrhythmische Wirkung von Adenosin läßt vermuten, daß Adenosin-Agonisten bei der Behandlung der Komplex-Tachykardie wirksam sein könnten. A₂-Adenosin-Agonisten besitzen eine starke sedative, antikonvulsive und anxiolytische Aktivität. A_2a-Adenosin-selektive Agonisten können für die Stimulierung der Lipolyse in Fettgewebe geeignet sein, was ihnen eine Eignung als Therapien zur Gewichtsabnahme oder als Antidiabetika sowie bei der Verbesserung der Fleischqualität landwirtschaftlicher Nutztiere verleiht. A₁-Adenosin-Antagonisten können bei der Behandlung von akuter Nierenfehlfunktion geeignet sein. A₃-Adenosin-Antagonisten können bei der Modulation der Mastzellen-Degranulierung zur Behandlung entzündlicher Erkrankungen, einschließlich Asthma, nützlich sein.
IN DIESEM BEISPIEL ZITIERTE LITERATURSTELLEN

1. Jacobsen, K.A., P.J.M. van Galen und M. Williams. 1992. Adenosine receptors: Pharmacology, structureactivity relationships, and therapeutic potential. J. Med. Chem. 35: 407-422.
2. Libert, F., S.N. Schiffmann, A. Lefort, M. Parmentier, C. Gerard, J.E. Dumont, J.-J. Vanderhaeghen und G. Vassart. 1991. The orphan receptor cDNA RDC7 encodes an A1 adenosine receptor. EMBO J. 10: 1677-1682.
3. Mahan, L.C., L.D. McVittie, E.M. Smyk-Randal, H. Nakata, F.J. Monsma, C.R. Green und D.R. Sibley. 1991. Cloning and expression of an A₁ adenosine receptor from rat brain. Mol. Pharmacol: 40: 1-7.
4. Olah, M.E., H. Ren, J. Ostrowski, K.A. Jacobsen und G.L. Stiles. 1992. Cloning, expression and characterization of the unique bovine A₁ adenosine receptor. J. Biol. Chem. 267: 10764-10770.
5. Tucker, A.L., J. Linden, A.S. Robeva, D.D. D'angelo und K.R. Lynch. 1992. Cloning and expression of a bovine adenosine A₁ receptor cDNA. FEBS Lett. 297: 107-111.
6. Maenhaut, C., J. van Sande, F. Libert, M. Abramowicz, M. Parmentier, J.-J. E. Dumont, G. Vassart und S Schiffmann. 1990. RDC8 codes for an adenosine A2 receptor with physiological constitutive activity. Bioch. Biophys. Res. Comm. 173: 1169-1178.
7. Pierce, K.D., Furlong, T.J., L.A. Stehle und J. Shine. 1992. Molecular cloning and expression of an adenosine A2b receptor from human brain. Bioch. Biophys. Res. Comm. 187: 86-93.
8. Chern, Y., K. King, H.-L. Lai und H.-T. Lai. 1992. Molecular cloning of a novel adenosine receptor gene from rat brain. Bioch. Biophys. Res. Comm. 185: 304-309.
9. Stehle, J.H., S.A. Rivkees, J.J. Lee, D.R. Weaver, J.D. Deeds und S.M. Reppert. 1992. Molecular cloning and expression of the cDNA for a novel A₂ adenosine receptor subtype. Mol. Endocrinol. 6: 384-393.
10. Zhou, Q.-Y., C. Li, M.E. Olah, R.A. Johnson, G.L. Stiles und O. Civelli. 1992. Molecular cloning and characterization of an adenosine receptor: The A3 adenosine receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7432-7436.
11. Sambrook, J., E. F. Fritsch und T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Handbook. Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor, NY.
12. Price, L.A., E.M. Kajkowski, J.R. Hadcock, B.A. Ozenberger und M.H. Pausch. 1995. Yeast cell growth in response to agonist dependent activation of a mammalian somatostatin receptor. Eingereicht.
13. Rose, M., F. Winston und P. Hieter. 1990. Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor, NY.
14. Blumer, K. J., J. E. Reneke und J. Thorner. 1988. The STE2 gene product is the ligand-binding component of the α-factor receptor of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 263: 10836-10842.
15. Strnad, J., C. M. Eppler,, M. Corbett und J. R. Hadcock. 1993. The rat SSTR2 somatostatin receptor subtype is coupled to inhibition of cyclic AMP accumulation. Biochem. Biophys. Res. Comm. 191: 968-976.
16. King, K., H. G. Dohlman, J. Thorner, M. G. Caron und R.J. Lefkowitz. 1990. Control of yeast mating signal transduction by a mammalian β₂-adrenergic receptor and G_s α subunit. Science 250: 121-123.
17. Weiner, J. L., C. Guttierez-Steil und K. J. Blumer. 1993. Disruption of receptor-G protein coupling in yeast promotes the function of an SST2-dependent adaptation pathway. J. Biol. Chem. 268: 8070-8077.

BEISPIEL 8
Funktionelle Expression eines Somatostatin-Subtyp-5-Rezeptors der Ratte in Hefe
Das zyklische Tetradecapeptid Somatostatin ist ein starker Inhibitor der Sekretion mehrerer Hormone, einschließlich Wachstumshormon aus der Hypophyse, Glucagon und Insulin aus der Bauchspeicheldrüse und Gastrin aus dem Darm. Somatostatin wirkt auch als Neurotransmitter, und es konnte gezeigt werden, daß es breite modulatorische Effekte im ZNS und in peripheren Geweben besitzt (1). Die Somatostatineffekte werden über die Bindung des Hormons an hochaffine, plasmamembranständige Somatostatinrezeptoren (SSTR) transduziert (2). Die in fünf verschiedenen Subtypen (SSTR1-5) codierten SSTR, was teilweise die gewebespezifischen Unterschiede in den Reaktionen auf Somatostatin erklärt (3-10), umfassen eine Unterfamilie der Superfamilie der Sieben-Transmembrandomänen-, G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, die Reaktionen auf eine breite Vielfalt extrazellulärer Signale vermittelt. Die funktionelle Expression von SSTR5 in Hefe sollte ein schnelles Screening auf neue subtypenselektive Somatostatin-Agonisten und Verbindungen mit Antagonisteneigenschaften gestatten und die für die rationale Konstruktion neuer Somatostatinliganden erforderliche molekulare Charakterisierung struktureller Aspekte des SSTR5 erleichtern.
MATERIAL UND METHODEN
Plasmidkonstruktionen. Alle molekularbiologischen Manipulationen wurden gemäß Standardverfahren (11) durchgeführt. Der Ratte-SSTR5 (7) wurde aus genomischer Ratten-DNA mittels PCR unter Verwendung von Oligonukleotidprimern, mit denen an den 5'- und 3'-Enden BglII-Stellen eingeführt werden (5'-AAAAAGATCTAAAATGGAGCCCCTCTCTCTG, 3'-AGCAGATCTTCAGATCCCAGAAGACAAC), kloniert. Das SSTR5-Expressionsplasmid pJH19 wurde konstruiert, indem das mit BglII verdaute PCR-Fragment in der korrekten Orientierung in das mit BamHI geschnittene pMP3 (12) inseriert wurde. Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Gα-Protein-Expressionsplasmide wurden konstruiert, indem für die 47 carboxyterminalen Aminosäuren von GPA1 codierende DNA-Sequenzen in pLP83 (12) durch solche für Gα_s (pLP122) und Gα_i2 (pLP121) ersetzt wurden.
Stammkonstruktionen. Die Konstruktion der Hefestämme sowie die Formulierung der Wachstumsmedien und Kultivierungsbedingungen erfolgten nach Standardverfahren (13). Die DNA-vermittelte Hefetransformation wurde mit dem Lithiumacetatverfahren durchgeführt. Die als Grundlage für alle in diesem Bericht beschriebenen Experimente verwendeten Hefestämme wurden mittels sequentieller Insertionsdeletion unter Verwendung rekombinanter Allele konstruiert. SSTR5 exprimierende Hefestämme wurden mittels sequentieller DNA-vermittelter Transformation von LY296 (MATa ura3-52 trp1Δ63 his3Δ200 leu2Δ1 ade2-101 lys2-801 gpa1ΔhisG far1ΔLYS2 FUS1-HIS3 sst2ΔADE2, Ref. 12) mit pJH19 und danach mit den oben beschriebenen Gα-Protein-Expressionsplasmiden konstruiert.
Biotest. Ein Funktionstest für den in Hefe exprimierten SSTR5 wurde unter Verwendung einer Modifikation eines Standardverfahrens (12) ausgeführt. Dabei wurden Hefestämme über Nacht in 2 ml synthetischem komplettem Flüssigmedium mit Glucose (2%) und ohne Uracil und Tryptophan (SCD-ura-trp-Medium) angezogen, zur Entfernung von Glucoseresten gewaschen und über Nacht in 5 ml SC-Galactose (2%)-ura-trp-Flüssigmedium angezogen. Geschmolzenes (55 °C) SC-Galactose (2%)-ura-trp-his-Agarmedium (30 μl, durch Zugabe von konzentriertem KOH oder NH₄OH vor dem Autoklavieren auf pH 6,8 eingestellt) wurde mit der Übernachtkultur (2 × 10⁴ Zellen/ml) angeimpft und in quadratischen (9 × 9 cm) Petrischalen ausplattiert. Auf die Oberfläche des verfestigten Agars wurden sterile Filterscheibchen gelegt und mit 10 μl die angegebenen Mengen der genannten Verbindungen enthaltendem sterilem Wasser gesättigt. Die Platten wurden 3 Tage bei 30 °C inkubiert. Somatostatin (S-14, S-28) und Metenkephalin sowie CCK-8 stammten von Bachem. Oxymetazolin, Isoproterenol und Carbachol stammten von Sigma.
ERGEBNISSE
Somatostatin-abhängige Wachstumsreaktion von den SSTR5 exprimierenden Hefezellen. Die funktionelle Expression des SSTR5 auf hohem Niveau in der Hefe war eine notwendige Voraussetzung für die Entwicklung eines sinnvollen Biotests. Dabei wurde im Plasmid pJH19 die SSTR5-cDNA unter die Kontrolle des induzierbaren GAL1-Promotors gestellt. Mit diesem Konstrukt wird auch die induzierbare Überexpression von Gal4p, dem Transkriptionsaktivierungsprotein für galactoseinduzierbare Gene, verliehen, was zu deutlich erhöhten Niveaus an Rezeptorprotein in Membranrohfraktionen im Vergleich zu einem von einem Plasmid ohne GAL4-Sequenzen exprimierten Rezeptor führt (Daten nicht gezeigt). SSTR5-Sequenzen wurden in pJH19 ohne Modifikation der proteincodierenden Sequenzen eingeführt. Von King et al. wurde bereits berichtet, daß der Austausch der aminoterminalen Domäne des β2-adrenergen Rezeptors gegen die äquivalente STE2-Sequenz für eine effiziente Rezeptorexpression in der Hefe notwendig war (15). Im Gegensatz dazu benötigt die funktionelle Expression von SSTR5 in der Hefe keine Addition von Hefesequenzen an den Aminoterminus. Es wurde ein chimärisches Gα-Protein, das sich aus der vorgeschlagenen aminoterminalen β2-Wechselwirkungsdomäne von Gpa1p und einer carboxyterminalen Rezeptorwechselwirkungsdomäne von Ratte-Gα_i2 (pLP121) unter der Kontrolle des GPA1-Promotors zusammensetzt, konstruiert. Ein Hefestamm (LY620), der exprimierten SSTR5 sowie chimärisches Gα-Protein enthält, wurde durch Transformation eines durch die Deletion von für Komponenten des Paarungssignaltransduktionswegs codierenden Genen modifizierten Hefestamms (LY296) mit SSTR5- (pJH19) und Gα-Protein-Expressionsplasmiden (pLP121) konstruiert. Eine dosisabhängige Wachstumsreaktion von LY620-Zellen war um das aufgetragene S-14 herum deutlich erkennbar (22). Nachweisbare Wachstumsreaktionen wurden weder als Antwort auf verschiedene für andere G-Protein-gekoppelte Rezeptoren selektive Agonisten (CCK 8, Metenkephalin, Oxymetazolin, Isoproterenol, Carbachol) noch für Hefezellen, denen der SSTR5 fehlt, beobachtet (Daten nicht gezeigt). Eine nachweisbare Reaktion wurde gegenüber 60 nmol S-14 beobachtet.
IN DIESEM BEISPIEL ZITIERTE LITERATURSTELLEN

1. Brazeau, P., W. Vale, R. Burgus, N. Ling, M. Butcher, J. Rivier und R. Guillemin. 1973. Hypothalamic polypeptide that inhibits the secretion of immunoreactive pituitary growth hormone. Science 129: 77-79.
2. Raisine, T. und G. I. Bell. 1993. Molecular biology of somatostatin receptors. Trends Neurosci. 16: 34-38.
3. Meyerhof, W., H.-J. Paust, C. Schonrock und D. Richter. 1991. Cloning of a cDNA encoding a novel putative G protein-coupled receptor expressed in specific rat brain regions. DNA Cell Biol. 10: 689-694.
4. Bruno, J. F., Y. Xu, J. Song und M. Berelowitz. 1992. Molecular cloning and functional expression of a brain specific somatostatin receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11151-11155.
5. Kluxen, F.-W., C. Bruns und H. Lubbert. 1992. Expression cloning of a rat brain somatostatin receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4618-4622.
6. Li, X.-J., M. Forte, R. A. North, C. A. Ross und S. H. Snyder. 1992. Cloning and expression of a rat somatostatin receptor enriched in brain. J. Biol. Chem. 267: 21307-21312.
7. O'Carrol, A.-M., S. J. Lolait, M. Konig und L. Mahan. 1992. Molecular cloning and expression of a pituitary somatostatin receptor with preferential affinity for somatostatin-28. Mol. Pharmacol. 42: 939-946.
8. Yasuda, K., S. Rens-Domiano, C. D. Breder, S. F. Law, C. B. Saper, T. Reisine und G. I. Bell. 1992. Cloning of a novel somatostatin receptor, SSTR3, coupled to adenylylcyclase. J. Biol. Chem. 267 (28): 20422-20428.
9. Yamada, Y., S. R. Post, K. Wang, H. S. Tager, G. I. Bell und S. Seino. 1992. Cloning and functional characterization of a family of human and mouse somatostatin receptors expressed in brain, gastrointestinal tract, and kidney. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 251-255.
10. Strnad, J., C. M. Eppler,, M. Corbett and J. R. Hadcock. 1993. The rat SSTR2 somatostatin receptor subtype is coupled to inhibition of cyclic AMP accumulation. Biochem. Biophys. Res. Comm. 191: 968-976.
11. Sambrook, J., E. F. Fritsch und T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Handbook. Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor, NY.
12. Price, L.A., E.M. Kajkowski, J.R. Hadcock, B.A. Ozenberger und M.H. Pausch. 1995. Yeast cell growth in response to agonist dependent activation of a mammalian somatostatin receptor. Eingereicht.
13. Rose, M., F. Winston und P. Hieter. 1990. Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor, NY.
14. Blumer, K. J., J. E. Reneke und J. Thorner. 1988. The STE2 gene product is the ligand-binding component of the α-factor receptor of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 263: 10836-10842.
15. King, K., H. G. Dohlman, J. Thorner, M. G. Caron und R.J. Lefkowitz. 1990. Control of yeast mating signal transduction by a mammalian β₂-adrenergic receptor and Gα α subunit. Science 250: 121-123.
16. Weiner, J. L., C. Guttierez-Steil und K. J. Blumer. 1993. Disruption of receptor-G protein coupling in yeast promotes the function of an SST2-dependent adaptation pathway. J. Biol. Chem. 268: 8070-8077.

Beispiel 10
Funktionelle Expression des Somatostatin-Subtyp-2-Rezeptors (SSTR2) des Schweins in Hefe
Das zyklische Tetradecapeptid Somatostatin ist ein starker Inhibitor der Sekretion mehrerer Hormone, einschließlich Wachstumshormon aus der Hypophyse, Glucagon und Insulin aus der Bauchspeicheldrüse und Gastrin aus dem Darm. Somatostatin wirkt auch als Neurotransmitter, und es konnte gezeigt werden, daß es breite modulatorische Effekte im ZNS und in peripheren Geweben besitzt (1). Die Somatostatineffekte werden über die Bindung des Hormons an hochaffine, plasmamembranständige Somatostatinrezeptoren (SSTR) transduziert (2). Die in fünf verschiedenen Subtypen (SSTR1-5) codierten SSTR, was teilweise die gewebespezifischen Unterschiede in den Reaktionen auf Somatostatin erklärt (3-11), umfassen eine Unterfamilie der Superfamilie der Sieben-Transmembrandomänen-, G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, die Reaktionen auf eine breite Vielfalt extrazellulärer Signale vermittelt. Die funktionelle Expression von Schwein-SSTR2 in Hefe sollte ein schnelles Screening auf neue subtypenselektive Somatostatin-Agonisten und Verbindungen mit Antagonisteneigenschaften gestatten und die für die rationale Konstruktion neuer Somatostatinliganden erforderliche molekulare Charakterisierung struktureller Aspekte des Schwein-SSTR2 erleichtern. In Screens mit hohem Durchsatz auf Mechanismusbasis identifizierte Verbindungen stellen Anhaltspunkte für neue wachstumsverbessernde Agentien zur Verwendung in Schweinen dar.
MATERIAL UND METHODEN
Plasmidkonstruktionen. Alle molekularbiologischen Manipulationen wurden gemäß Standardverfahren (12) durchgeführt. Der Schwein-SSTR2 (11) wurde aus einer cDNA-Bank von menschlichem Gehirn mittels PCR unter Verwendung von Oligonukleotidprimern, mit denen an den 5'- und 3'-Enden BglII-Stellen eingeführt werden (5'-AAAAGATCTAAAATGTCCATTCCATTTGAC, 3'-AAAAGGTACCAGATCTTCAGATACTGGTTTGGAG), kloniert. Das Schwein-SSTR2-Expressionsplasmid pJH18 wurde konstruiert, indem das mit BglII verdaute PCR-Fragment in der korrekten Orientierung in das mit BamHI geschnittene pMP3 (13) inseriert wurde.
Stammkonstruktionen. Die Konstruktion der Hefestämme sowie die Formulierung der Wachstumsmedien und Kultivierungsbedingungen erfolgten nach Standardverfahren (14). Die DNA-vermittelte Hefetransformation wurde mit dem Lithiumacetatverfahren durchgeführt. Die als Grundlage für alle in diesem Bericht beschriebenen Experimente verwendeten Hefestämme wurden mittels sequentieller Insertionsdeletion unter Verwendung rekombinanter Allele konstruiert. Den Schwein-SSTR2 exprimierende Hefestämme wurden mittels sequentieller DNA-vermittelter Transformation von LY296 (MATa ura3-52 trp1Δ63 his3Δ200 leu2Δ1 ade2-101 lys2-801 gpa1ΔhisG far1ΔLYS2 FUS1-HIS3 sst2ΔADE2, Ref. 13) mit dem chimärischen Gα_i2-Protein-Expressionsplasmid pLP82 (13) und danach mit pJH18 oder pJH17 konstruiert.
Sättigungsbindungstests mit radioaktiv markiertem Agonisten. Hefemembranrohextrakte wurden von Kulturen in der späten log-Phase mittels Glasperlenlyse und Zentrifugation bei 40000 × g nach einem veröffentlichten Verfahren (15) präpariert. Der Proteingehalt der Membranrohfraktionen wurde mit dem Biorad- Proteintestkit gemäß den Herstellerangaben gemessen. Radioligandenbindungstests wurden gemäß Strnad et al. (10) mit radioaktiv markiertem Somatostatin (¹²⁵I-tyr¹¹-S-14, Amersham) ausgeführt. Als nicht-spezifische Bindung wurde die in Gegenwart von 1 μM S-14 beobachtete Bindung definiert. In aus Zellen ohne Schwein-SSTR2 hergestellten Membranfraktionen wurde eine vernachlässigbare spezifische Bindung beobachtet (Daten nicht gezeigt).
Biotest. Ein Funktionstest für den in Hefe exprimierten Schwein-SSTR2 wurde unter Verwendung einer Modifikation eines Standardverfahrens (13) ausgeführt. Dabei wurden Hefestämme über Nacht in 2 ml synthetischem komplettem Flüssigmedium mit Glucose (2%) und ohne Uracil und Tryptophan (SCD-ura-trp-Medium) angezogen, zur Entfernung von Glucoseresten gewaschen und über Nacht in 5 ml SC-Galactose (2%)-ura-trp-Flüssigmedium angezogen. Geschmolzenes (55 °C) SC-Galactose (2%)-ura-trp-his-Agarmedium (30 ml, durch Zugabe von konzentriertem KOH oder NH₄OH vor dem Autoklavieren auf pH 6,8 eingestellt) wurde mit der Übernachtkultur (2 × 10⁴ Zellen/ml) angeimpft und in quadratischen (9 × 9 cm) Petrischalen ausplattiert. Auf die Oberfläche des verfestigten Agars wurden sterile Filterscheibchen gelegt und mit 10 μl die angegebenen Mengen der genannten Verbindungen enthaltendem sterilem Wasser gesättigt. Die Platten wurden 3 Tage bei 30 °C inkubiert. Somatostatin (S-14, S-28) und Metenkephalin stammten von Bachem. Oxymetazolin, Isoproterenol und Carbachol stammten von Sigma. MK678 und Sandostatin wurden synthetisiert.
ERGEBNISSE
Bindung von Somatostatin an den in Hefe exprimierten Schwein-SSTR2-Rezeptor. Die funktionelle Expression des Schwein-SSTR2-Rezeptors auf hohem Niveau in der Hefe war eine notwendige Voraussetzung für die Entwicklung eines sinnvollen Biotests. Dabei wurde im Plasmid pJH17 und 18 die Schwein-SSTR2-cDNA unter die Kontrolle des GAL1-Promotors gestellt. Mit diesen Konstrukten wird auch die induzierbare Überexpression von Gal4p, dem Transkriptionsaktivierungsprotein für galactoseinduzierbare Gene, verliehen, was zu deutlich erhöhten Niveaus an Rezeptorprotein in Membranrohfraktionen im Vergleich zu einem von einem Plasmid ohne GAL4-Sequenzen exprimierten Rezeptor führt (Daten nicht gezeigt). Die Schwein-SSTR2-Rezeptor-Sequenzen wurden in pJH18 ohne Modifikation der proteincodierenden Sequenzen eingeführt. Von King et al. wurde bereits berichtet, daß der Austausch der aminoterminalen Domäne des β₂-adrenergen Rezeptors gegen die äquivalente STE2-Sequenz für eine effiziente Rezeptorexpression in der Hefe notwendig war (16). Im Gegensatz dazu benötigt die funktionelle Expression des Schwein-SSTR2-Rezeptors in der Hefe keine Addition von Hefesequenzen an den Aminoterminus. Es wurde ein chimärisches Gα-Protein, das sich aus der vorgeschlagenen aminoterminalen βγ-Wechselwirkungsdomäne von Gpa1p und einer carboxyterminalen Rezeptorwechselwirkungsdomäne von Ratte-Gα_i2 (pLP82) unter der Kontrolle des GPA1-Promotors zusammensetzt, konstruiert. Hefestämme, die exprimierten Schwein-SSTR2 sowie chimärisches G_α-Protein enthalten, wurden durch Transformation eines durch die Deletion von für Komponenten des Paarungssignaltransduktionswegs codierenden Genen modifizierten Hefestamms (LY296) mit Expressionsplasmiden für Schwein-SSTR2 (pJH17, pJH18) und G_a-Protein (pLP82) konstruiert.
Die meisten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zeigen jeweils agonistenabhängige hoch- und niedrigaffine Zustände. Die hochaffine Agonistenbindung hängt von der funktionellen Assoziation des Rezeptors mit einem heterotrimeren G-Protein ab. Falls der Rezeptor nicht mit dem G-Protein assoziiert oder von diesem entkoppelt ist, liegt eine niedrigaffine Agonistenbindung vor, die in Sättigungsbindungstests mit radioaktiv markiertem Agonisten nicht nachweisbar ist. In Hefe-Membranrohfraktionen aus pJH17 tragenden Zellen band der Agonist ¹²⁵I-tyr¹¹-S-14 mit hoher Affinität und auf sättigbare Weise an den Schwein-SSTR2, womit demonstriert wurde, daß (1) eine funktionelle 1igandenbindende Konformation des Schwein-SSTR2 in der Hefe exprimiert wurde und (2) der Rezeptor funktionell mit dem chimärischen Gα-Protein unter Ausbildung eines hochaffinen Agonistenbindungszustands assoziiert war. Die Gesamtzahl an beobachteten ¹²⁵I-tyr¹¹-S-14-Bindungsstellen (B_max = 146 fmol/mg) stand im Einklang mit Werten, die für den α-Paarungspheromon-Rezeptor der Hefe erhalten worden waren (200 fmol/mg, Ref. 17).
Die Agonistenselektivität des Schwein-SSTR2 blieb bei der Expression in Hefe erhalten. Es wurde ein selektiver und empfindlicher Biotest entwickelt, bei dem ein Hefestamm (LY474) verwendet wird, der die oben beschriebenen genetischen Modifikationen sowie die Expression des Schwein-SSTR2 (pJH18) und eines chimärischen Gpa1-Gα_i2-Proteins (pLP82) verleihende Plasmide trägt. Eine dosisabhängige Wachstumsreaktion von LY474-Zellen war um aufgetragenes S-14, MK678 und Sandostatin deutlich erkennbar (23). Der Test war selektiv: der Durchmesser der Wachstumszonen war zur angegebenen Affinität der Liganden für den Schwein-SSTR2 (S-14=MK678>Sandostatin) proportional, was die Fähigkeit des Biotests zur Unterscheidung zwischen Liganden mit unterschiedlicher Potency widerspiegelt (18). Nachweisbare Wachstumsreaktionen wurden weder als Antwort auf verschiedene für andere G-Protein-gekoppelte Rezeptoren selektive Agonisten (Metenkephalin, Oxymetazolin, Isoproterenol, Carbachol) noch für Hefezellen, denen der Schwein-SSTR2 fehlt, beobachtet (Daten nicht gezeigt). Eine nachweisbare Reaktion wurde gegenüber nur 60 pmol S-14 beobachtet, wodurch die außerordentliche Empfindlichkeit des Biotests veranschaulicht wird.
IN DIESEM BEISPIEL ZITIERTE LITERATURSTELLEN

1. Brazeau, P., W. Vale, R. Burgus, N. Ling, M. Butcher, J. Rivier und R. Guillemin. 1973. Hypothalamic polypeptide that inhibits the secretion of immunoreactive pituitary growth hormone. Science 129: 77-79.
2. Reisine, T. und G. I. Bell. 1993. Molecular biology of somatostatin receptors. Trends Neurosci. 16: 34-38.
3. Meyerhof, W., H.-J. Paust, C. Schonrock und D. Richter. 1991. Cloning of a cDNA encoding a novel putative G protein-coupled receptor expressed in specific rat brain regions. DNA Cell Biol. 10: 689-694.
4. Bruno, J. F., Y. Xu, J. Song und M. Berelowitz. 1992. Molecular cloning and functional expression of a brain specific somatostatin receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11151-11155.
5. Kluxen, F.-W., C. Bruns und H. Lobbert. 1992. Expression cloning of a rat brain somatostatin receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4618-4622.
6. Li, X.-J., M. Forte, R. A. North, C. A. Ross und S. H. Snyder. 1992. Cloning and expression of a rat somatostatin receptor enriched in brain. J. Biol. Chem. 267: 21307-21312.
7. O'Carrol, A.-M., S. J. Lolait, M. Konig und L. Mahan. 1992. Molecular cloning and expression of a pituitary somatostatin receptor with preferential affinity for somatostatin-28. Mol. Pharmacol. 42: 939-946.
8. Yasuda, K., S. Rens-Domiano, C. D. Breder, S. F. Law, C. B. Saper, T. Reisine und G. I. Bell. 1992. Cloning of a novel somatostatin receptor, SSTR3, coupled to adenylylcyclase. J. Biol. Chem. 267 (28): 20422-20428.
9. Yamada, Y., S. R. Post, K. Wang, H. S. Tager, G. I. Bell und S. Seino. 1992. Cloning and functional characterization of a family of human and mouse somatostatin receptors expressed in brain, gastrointestinal tract, and kidney. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 251-255.
10. Strnad, J., C. M. Eppler, M. Corbett und J. R. Hadcock. 1993. The rat SSTR2 somatostatin receptor subtype is coupled to inhibition of cyclic AMP accumulation. Biochem. Biophys. Res. Comm. 191: 968-976.
11. Matsumoto, K., Y. Yokogoshi, Y. Fujinaka, C. Z. Xhang und S. Saito. 1994. Molecular cloning and sequencing of porcine somatostatin receptor 2. Biochem. Biophys. Res. Comm. 199: 298-305.
12. Sambrook, J., E. F. Fritsch und T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Handbook. Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor, NY.
13. Price, L.A., E.M. Kajkowski, J.R. Hadcock, B.A. Ozenberger und M.H. Pausch. 1995. Yeast cell growth in response to agonist dependent activation of a mammalian somatostatin receptor. Eingereicht.
14. Rose, M., F. Winston und P. Hieter. 1990. Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor, NY.
15. Blumer, K. J., J. E. Reneke und J. Thorner. 1988. The STE2 gene product is the ligand-binding component of the α-factor receptor of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 263: 10836-10842.
16. King, K., H. G. Dohlman, J. Thorner, M. G. Caron und R.J. Lefkowitz. 1990. Control of yeast mating signal transduction by a mammalian β₂-adrenergic receptor and G_s α subunit. Science 250: 121-123.
17. Weiner, J. L., C. Guttierez-Steil und K. J. Blumer. 1993. Disruption of receptor-G protein coupling in yeast promotes the function of an SST2-dependent adaptation pathway. J. Biol. Chem. 268: 8070-8077.
18. Marbach, P., W. Bauer und U. Briner. 1988. Structure-function relationships of somatostatin analogs. Horm. Res. 29: 54-58.

BEISPIEL 11
Die Empfindlichkeit der Antwort gegenüber Agonisten wird durch die Deletion von MSG5 erhöht.
Die Reaktionsfähigkeit eines Signaltransduktionssystems gegenüber einem Dauerreiz nimmt mit der Zeit ab. Dieses Phänomen, das unter dem Namen Desensibilisierung oder Adaption bekannt ist, ist ein allgemeines Kennzeichen eines Signalantwortsystems. Für den Paarungssignaltransduktionsweg der Hefe wurden mehrere molekulare Mechanismen für die Adaption beschrieben (1). Mutationen im SST2-Gen vermitteln Adaptionsdefekte sowie eine erhöhte Paarungspheromonempfindlichkeit (2,3). Die Reaktion von den Ratte-SSTR2 funktionell exprimierenden Hefezellen auf appliziertes Somatostatin ist in sst2-Mutantenzellen stark erhöht (4). Man würde erwarten, daß Mutationen in anderen Genen, deren Produkte eine Rolle bei der Adaptionsantwort spielen, ähnliche Effekte hervorrufen. Durch Mutationen im MSG5-Gen, das für eine putative Protein-Tyrosinphosphatase codiert, wird die Empfindlichkeit gegenüber Paarungspheromon stark erhöht (5). In der vorliegenden Arbeit führt die Deletion von MSG5 in den Ratte-SSTR2 exprimierenden Zellen zu einem starken Anstieg der Empfindlichkeit gegenüber Somatostatin. Der Effekt der MSG5-Mutation ist bei einer SST2-Deletionsmutation additiv. Die sst2-msg5-Doppelmutantenzellen bilden die Grundlage für einen äußerst empfindlichen Biotest auf Verbindungen, die mit G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und G-Proteinen wechselwirken.
MATERIAL UND METHODEN
Stammkonstruktionen. Alle molekularbiologischen Manipulationen wurden gemäß Standardverfahren (6) durchgeführt. Die Konstruktion der Hefestämme sowie die Formulierung der Wachstumsmedien und Kultivierungsbedingungen erfolgten nach Standard verfahren (7). Die DNA-vermittelte Hefetransformation wurde mit dem Lithiumacetatverfahren durchgeführt. Die in diesen Experimenten beschriebenen Hefestämme wurden unter Verwendung des rekombinanten msg5ΔLeu2-Allels in pS/PDel und Multikopien-YEpMSG5 (5) konstruiert. Veränderte MSG5-Niveaus tragende Hefestämme wurden über DNA-vermittelte Hefetransformation von LY268 (MATa ura3-52 trp1D63 his3D200 leu2D1 ade2-101 lys2-801 gpa1ΔhisG far1ΔLYS2 FUS1-HIS3 sst2ΔADE2, pJH2, pLP82) unter Erhalt von MPY459 (LY268 msg5ΔLeu2 sst2ΔADE2) und MPY467 (LY268 YEpMSG5) sowie von LY288 (LY268 SST2) unter Erhalt von MPY458 (LY288 msg5ΔLeu2 SST2) und MPY466 (LY288 YEpMSG5) konstruiert (4).
Biotest. Ein Funktionsbiotest für den in Hefe exprimierten Ratte-SSTR2 wurde unter Verwendung einer Modifikation eines Standardverfahrens (4) ausgeführt. Dabei wurden Hefestämme über Nacht in 2 ml synthetischem komplettem Flüssigmedium mit Glucose (2%) und ohne Uracil, Tryptophan und Leucin (SCD-ura-trp-leu-Medium) angezogen, zur Entfernung von Glucoseresten gewaschen und über Nacht in 5 ml SC-Galactose (2%)-ura-trp-leu-Flüssigmedium angezogen. Geschmolzenes (55 °C) SC-Galactose (2%)-ura-trp-leu-his-Agarmedium (35 ml, durch Zugabe von konzentriertem NH₄OH vor dem Autoklavieren auf pH 6,8 eingestellt) wurde mit der Übernachtkultur (2 × 10⁴ Zellen/ml) angeimpft und in quadratischen (9 × 9 cm) Petrischalen ausplattiert. Auf die Oberfläche des verfestigten Agars wurden sterile Filterscheibchen gelegt und mit 10 μl die angegebenen Mengen des Somatostatins (S-14) enthaltendem sterilem Wasser gesättigt. Die Platten wurden 3 Tage bei 30 °C inkubiert. Somatostatin (S-14) stammte von Bachem.
ERGEBNISSE
Die Empfindlichkeit gegenüber Ligand wird durch Deletion von MSG5 gesteigert. Die Effekte von Änderungen in der Expression des MSG5-Genprodukts wurden analysiert, indem die Wachstumsreaktion von den Ratte-SSTR2 exprimierenden Zellen gegenüber S-14 verglichen wurde (24). Man würde erwarten, daß Mutationen, durch die die MSG5-Adaptionsfunktion aufgehoben wird, zu einer erhöhten Empfindlichkeit des Biotests gegenüber aufgetragenem S-14 führt, während die Überexpression von MSG5 die Wachstumsreaktion abschwächen sollte. Wie erwartet wurde bei LY288 (SST2 MSG5) eine dosisabhängige Wachstumsreaktion gegenüber aufgetragenem S-14 beobachtet. In Übereinstimmung mit den Erwartungen führt die Deletion des MSG5-Gens in MPY458 zu einer wesentlichen Verbesserung der Empfindlichkeit des Biotests. Die Wachstumsreaktion von MPY458 ist mit der von LY268 (sst2ΔADE2, MSG5) gezeigten vergleichbar. Bei der Doppelmutante MPY459 (msg5ΔLeu2 sst2ΔADE2), die eine weitere Verbesserung der Wachstumsreaktion zeigte, wurden die Effekte von Mutationen in beiden Genen beobachtet. Durch die Überexpression von MSG5 in SST2- (MPY466) und sst2ΔADE2- (MPY467) Stämmen wurde die Wachstumsreaktion stark reduziert.
IN DIESEM BEISPIEL ZITIERTE LITERATURSTELLEN

1. Sprague, G. F. und J. W. Thorner. 1992. Pheromone response and signal transduction during the mating process of Saccharomyces cerevisiae, 657-744. In J. R. Pringle, E. W. Jones and J. R. Broach, Gene expression, 2. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
2. Chan, R. K. und C. A. Otte. 1982. Isolation and genetic analysis of Saccharomyces cerevisiae mutants supersensitive to G1 arrest by α factor and a factor pheromones. Mol. Cell. Biol. 2: 11-20.
3. Chan, R. K. und C. A. Otte. 1982. Physiological characterization of Saccharomyces cerevisiae mutants supersensitive to G1 arrest by α factor and a factor pheromones. Mol. Cell. Biol. 2: 21-29.
4. Price, L.A., E.M. Kajkowski, J.R. Hadcock, B.A. Ozenberger und M.H. Pausch. 1995. Yeast cell growth in response to agonist dependent activation of a mammalian somatostatin receptor. Eingereicht.
5. Doi, K., A. Gartner, G. Ammerer, B. Errede, H. Shinkawa, K. Sugimoto und K. Matsumoto. 1994. MSG5, a novel protein phosphatase promotes adaptation to pheromone response in S. cerevisiae. EMBO J. 13: 61-70.
6. Sambrook, J., E. F. Fritsch und T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Handbook. Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor, NY.
7. Rose, M., F. Winston und P. Hieter. 1990. Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor, NY.

BEISPIEL 12
Funktionelle Expression eines menschlichen GRF (Growth Hormone Release Factor) -Rezeptors in Hefe
Bei dem GRF (Growth Hormone Release Factor) handelt es sich um einen starken Stimulator der Sekretion von Wachstumshormon aus der Hypophyse (1). Die GRF-Effekte werden über die Bindung des Hormons an hochaffine, plasmamembranständige GRF-Rezeptoren transduziert. Der GRF-Rezeptor sowie verwandte Rezeptoren der Secretin-Klasse bilden eine Unterfamilie der Superfamilie der Sieben-Transmembrandomänen-, G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, die Reaktionen auf eine breite Vielfalt extrazellulärer Signale vermittelt, und zeichnen sich durch das Vorhandensein einer großen aminoterminalen Ligandenbindungsdomäne aus (2). Die funktionelle Expression des menschlichen GRF-Rezeptors (3) in Hefe sollte ein schnelles Screening auf neue speziesselektive Agonisten gestatten und die für die rationale Konstruktion neuer Liganden des GRF-Rezeptors erforderliche molekulare Charakterisierung erleichtern. GRF-Agonisten repräsentieren eine neue Klasse wachstumsfördernder Agentien zur Verwendung in landwirtschaftlichen Nutztieren und könnten eine therapeutische Anwendung beim Menschen bei der Kontrolle des Wachstums von kleinwüchsigen Kindern finden.
MATERIAL UND METHODEN
Plasmidkonstruktionen. Alle molekularbiologischen Manipulationen wurden gemäß Standardverfahren (4) durchgeführt. Der menschliche GRF-Rezeptor (3) wurde aus einer cDNA-Bank von menschlichem Gehirn mittels PCR unter Verwendung von Oligonukleotidprimern, mit denen an den 5'- und 3'-Enden BamHI-Stellen eingeführt werden (5'-ATAGGATCCAAAATGGACCGCCGGATGTGGGGG, 3'-ATATGGATCCCTAGCACATAGATGTCAG), kloniert. Das GRF-Rezeptor-Expressionsplasmid pJH25 wurde konstruiert, indem das mit BamHI verdaute PCR-Fragment in der korrekten Orientierung in das mit BamHI geschnittene pMP3 (5) inseriert wurde. Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten G_a-Protein-Expressionsplasmide wurden konstruiert, indem für die 47 carboxyterminalen Aminosäuren von GPA1 codierende DNA-Sequenzen in pLP83 (12) durch solche für Gα_s (pLP122) ersetzt wurden.
Stammkonstruktionen. Die Konstruktion der Hefestämme sowie die Formulierung der Wachstumsmedien und Kultivierungsbedingungen erfolgten nach Standardverfahren (6). Die DNA-vermittelte Hefetransformation wurde mit dem Lithiumacetatverfahren durchgeführt. Die als Grundlage für alle in diesem Bericht beschriebenen Experimente verwendeten Hefestämme wurden mittels sequentieller Insertionsdeletion unter Verwendung rekombinanter Allele konstruiert. Den menschlichen GRF-Rezeptor exprimierende Hefestämme wurden mittels sequentieller DNA-vermittelter Transformation von LY296 (MATa ura3-52 trp1Δ63 his3Δ200 leu2Δ1 ade2-101 lys2-801 gpa1ΔhisG far1ΔLYS2 FUS1-HIS3 sst2ΔADE2, Ref. 5) mit pJH25 und danach mit dem chimärischen G_as-Protein-Expressionsplasmid pLP122 (5) konstruiert.
Biotest. Ein Funktionstest für den in Hefe exprimierten menschlichen GRF-Rezeptor wurde unter Verwendung einer Modifikation eines Standardverfahrens (5) ausgeführt. Dabei wurden Hefestämme über Nacht in 2 ml synthetischem komplettem Flüssigmedium mit Glucose (2%) und ohne Uracil und Tryptophan (SCD-ura-trp-Medium) angezogen, zur Entfernung von Glucoseresten gewaschen und über Nacht in 5 ml SC-Galactose (2%)-ura-trp-Flüssigmedium angezogen. Geschmolzenes (55 °C) SC-Galactose (2%)-ura-trp-his-Agarmedium (30 ml, durch Zugabe von konzentriertem KOH oder NH₄OH vor dem Autoklavieren auf pH 6,8 eingestellt) wurde mit der Übernachtkultur (2 × 10⁴ Zellen/ml) angeimpft und in quadratische (9 × 9 cm) Petrischalen gegossen. Auf die Oberfläche des verfestigten Agars wurden sterile Filterscheibchen gelegt und mit 10 μl die angegebenen Mengen der genannten Verbindungen enthaltendem sterilem Wasser gesättigt. Die Platten wurden 3 Tage bei 30 °C inkubiert. Menschlicher GRF (hGRF (1-29)-NH₂), (D-ala²)-hGRF (1-29)-NH₂ und Metenkephalin stammten von Bachem. Oxymetazolin, Isoproterenol und Carbachol stammten von Sigma.
ERGEBNISSE
Bindung von GRF an den in Hefe exprimierten menschlichen GRF-Rezeptor. Die funktionelle Expression des menschlichen GRF-Rezeptors auf hohem Niveau in der Hefe war eine notwendige Voraussetzung für die Entwicklung eines sinnvollen Biotests. Dabei wurde im Plasmid pJH25 die GRF-Rezeptor-cDNA unter die Kontrolle des GAL1-Promotors gestellt. Mit diesen Konstrukten wird auch die induzierbare Überexpression von Gal4p, dem Transkriptionsaktivierungsprotein für galactoseinduzierbare Gene, verliehen, was zu deutlich erhöhten Niveaus an Rezeptorprotein in Membranrohfraktionen im Vergleich zu einem von einem Plasmid ohne GAL4-Sequenzen exprimierten Rezeptor führt (Daten nicht gezeigt). Die GRF-Rezeptor-Sequenzen wurden in pJH25 ohne Modifikation der proteincodierenden Sequenzen eingeführt. Von King et al. wurde bereits berichtet, daß der Austausch der aminoterminalen Domäne des β₂-adrenergen Rezeptors gegen die äquivalente STE2-Sequenz für eine effiziente Rezeptorexpression in der Hefe notwendig war (9). Im Gegensatz dazu benötigt die funktionelle Expression des GRF-Rezeptors in der Hefe keine Addition von Hefesequenzen an den Aminoterminus. Es wurde ein chimärisches Gα-Protein, das sich aus der vorgeschlagenen aminoterminalen βγ-Wechselwirkungsdomäne von Gpa1p und einer carboxyterminalen Rezeptorwechselwirkungsdomäne von Ratte-G_as (pLP122) unter der Kontrolle des GPA1-Promotors zusammensetzt, konstruiert. Hefestämme, die exprimierten GRF-Rezeptor sowie chimärisches G_a-Protein enthalten, wurden durch Transformation eines durch die Deletion von für Komponenten des Paarungssignaltransduktionswegs codierenden Genen modifizierten Hefestamms (LY296) mit Expressionsplasmiden für menschlichen GRF-Rezeptor (pJH25) und chimärisches Gpa1-Gα_s-Protein (pLP122) konstruiert.
Die Agonistenselektivität des menschlichen GRF-Rezeptors blieb bei der Expression in Hefe erhalten. Es wurde ein selektiver und empfindlicher Biotest entwickelt, bei dem ein Hefestamm (CY990) verwendet wird, der die oben beschriebenen genetischen Modifikationen sowie die Expression des menschlichen GRF-Rezeptors (pJH25) und eines chimärischen Gpa1-Gα_s-Proteins (pLP122) verleihende Plasmide trägt. Eine dosisabhängige Wachstumsreaktion von CY990-Zellen war um ein aufgetragenes Agonistenanalog von GRF [hGRF (1-29)-NH₂] herum deutlich erkennbar [25A], die durch die Koapplikation eines Antagonistenanalogs [(D-arg²)-hGRF (1-29)-NH₂] gehemmt wurde [25B]. Der Test war selektiv: nachweisbare Wachstumsreaktionen wurden weder als Antwort auf verschiedene für andere G-Protein-gekoppelte Rezeptoren selektive Agonisten (Metenkephalin, Oxymetazolin, Isoproterenol, Carbachol) noch für Hefezellen, denen der GRF-Rezeptor fehlt, beobachtet (Daten nicht gezeigt). Eine nachweisbare Reaktion wurde gegenüber 20 nmol GRF beobachtet, wodurch die Empfindlichkeit des Biotests veranschaulicht wird.
IN DIESEM BEISPIEL ZITIERTE LITERATURSTELLEN

1. Bohlen, P. F. Esch, P. Brazeau, N. Ling und Guillemin. 1983. Isolation and characterization of the porcine hypothalamic growth hormone releasing factor. Biochem. Biophys. Res. Comm. 116: 726-734.
2. Segre, G. V, und S. R. Goldring. 1993. Receptors for secretin, calcitonin, parathyroid hormone (PTH)/PTH-related peptide, vasoactive intestinal peptide, glucagonlike peptide 1, growth hormone releasing hormone, and glucagon belong to a newly discovered G protein linked receptor family. Trends Endo. Metab. 4: 309-314.
3. Gaylinn, B. D., J. K. Harrison, J. R. Zysk, C. E. Lyons, K. R. Lynch und M. O. Thorner. 1993. Molecular cloning and expression of a human anterior pituitary receptor for growth hormonereleasing hormone. Mol. Endocrinol. 7: 77-84.
4. Sambrook, J., E. F. Fritsch und T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Handbook. Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor, NY.
5. Price, L.A., E.M. Kajkowski, J.R. Hadcock, B.A. Ozenberger und M.H. Pausch. 1995. Yeast cell growth in response to agonist dependent activation of a mammalian somatostatin receptor. Eingereicht.
6. Rose, M., F. Winston und P. Hieter. 1990. Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor, NY.
7. Blumer, K. J., J. E. Reneke und J. Thorner. 1988. The STE2 gene product is the ligand-binding component of the α-factor receptor of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 263: 10836-10842.
8. Strnad, J., C. M. Eppler, M. Corbett und J. R. Hadcock. 1993. The rat SSTR2 somatostatin receptor subtype is coupled to inhibition of cyclic AMP accumulation. Biochem. Biophys. Res. Comm. 191: 968-976.
9. King, K., H. G. Dohlman, J. Thorner, M. G. Caron und R.J. Lefkowitz. 1990. Control of yeast mating signal transduction by a mammalian β₂-adrenergic receptor and G_s α subunit. Science 250: 121-123.
10. Weiner, J. L., C. Guttierez-Steil und K. J. Blumer. 1993. Disruption of receptor-G protein coupling in yeast promotes the function of an SST2-dependent adaptation pathway. J. Biol. Chem. 268: 8070-8077.

BEISPIEL 13
Die Empfindlichkeit des Hefe-Biotests wird durch die Überexpression von STE50 verbessert.
Für den Paarungssignaltransduktionsweg der Hefe wurden mehrere molekulare Adaptionsmechanismen beschrieben (1). Veränderungen an einem oder mehreren dieser Mechanismen sollten der Verbesserung der Empfindlichkeit eines Biotests dienen, und zwar durch Veränderung von Desensibilisierungswegen und daher Verlängerung des durch Agonistenbindung an den Rezeptor initiierten Signals. Die Auswirkungen einer sst2-Mutation auf die Empfindlichkeit des Hefe-Biotests wurden bereits beschrieben (Beispiel 6). Es wurde vorhergesagt, daß eine als Alternative zur genetischen Modifikation an sst2 vorgesehene Überexpression des Hefegens STE50 ähnliche Auswirkungen haben sollte (2), allerdings über einen unterschiedlichen Wirkmechanismus (2,3). Das STE50-Gen wurde isoliert und unter die Kontrolle eines starken konstitutiven Promotors in einem Plasmid mit hoher Kopienzahl gestellt, was zu einer signifikanten Überexpression des Gens führte. Es stellte sich heraus, daß auf eine Reaktion gegenüber dem Säugerhormon Somatostatin über einen exprimierten SSTR2-Somatostatinrezeptor hin manipulierte Hefe eine robustere Reaktion auf Hormon zeigte, wenn STE50 überexprimiert wurde.
MATERIAL UND METHODEN
Konstruktion des STE50-Expressionsplasmids. Die Anzucht der Bakterienstämme und die Plasmidmanipulationen wurden nach Standardverfahren durchgeführt (4). Die proteincodierenden Sequenzen für STE50 wurden mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von durch Untersuchung der veröffentlichten Sequenz (2) ausgewählten Oligonukleotiden amplifiziert. Das Sense-Oligonukleotid (5'-GTCGACAAATCAG ATG GAG GAC GGT AAA CAG G-3') enthielt das Translationsstartcodon (unterstrichen) sowie eine SalI-Restriktionsstelle und das Antisense-Oligonukleotid (5'-GAGCTCA TTA GAG TCT TCC ACC GGG GG-3') das Translationsstoppcodon (unterstrichen) sowie eine SacI-Restriktionsstelle. Diese Oligonukleotide wurden als Primer in einer Standard-PCR zur Amplifikation von STE50 aus genomischer Saccharomyces cerevisiae-DNA eingesetzt. Das 1100 Basenpaar große Amplifikationsprodukt wurde in den Vektor pCR2 (Invitrogen Corp., San Diego, CA, USA) kloniert und durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Die STE50-Sequenzen wurden dann auf einem SalI-SacI-Restriktionsfragment isoliert und in einen pADH-Expressionsvektor (5) kloniert, wodurch die Expression von STE50 unter die Kontrolle des starken konstitutiven ADH1-Promotors gestellt wurde. Dieses Plasmid wurde mit pOZ162 bezeichnet.
Hefestammkonstruktion. Die Anzucht und Transformation von Hefestämmen wurde wie bei Rose et al. (6) beschrieben durchgeführt. Der SSTR2-Somatostatinrezeptor-Expressionsstamm LY268 (MATa ura3-52 trp1Δ63 his3Δ200 leu2Δ1 ade2-101 lys2-801 gpa1ΔhisG far1ΔLYS2 FUS1-HIS3 sst2ΔADE2, pJH2, pLP82) wurde in vorhergehenden Beispielen sowie bei Price et al. (7) beschrieben. Der Stamm LY268 wurde entweder mit dem STE50-Expressionsplasmid pOZ162 oder dem pADH-Vektor transformiert. Diese Stämme werden mit CY560 bzw. CY562 bezeichnet.
Biotest. Der Biotest für in Hefe exprimierten SSTR2-Somatostatinrezeptor wurde in vorhergehenden Beispielen sowie bei Price et al. (7) beschrieben. In Kürze: Hefestämme wurden über Nacht in 2 ml synthetischem komplettem Flüssigmedium mit Glucose (2%) und ohne Uracil, Tryptophan und Leucin (SCD-ura-trp-leu) angezogen, zur Entfernung von Glucoseresten gewaschen und über Nacht in 5 ml SC-Galactose (2%)-ura-trp-leu-Flüssigmedium angezogen. Geschmolzenes (52 °C) SC-Galactose (2%)-ura-trp-leu-his-Agarmedium (30 ml, durch Zugabe von KOH vor dem Autoklavieren auf pH 6,8 eingestellt) wurde mit 0,06 ml der Übernachtkultur angeimpft, so daß sich eine endgültige Zelldichte von ungefähr 10⁵ Zellen/ml ergab, und in quadratische (9 × 9 cm) Petrischalen gegossen. Auf die Oberfläche des verfestigten Agars wurden sterile Filterscheibchen gelegt und mit 10 μl die angegebenen Mengen an Somatostatin-14 (Bachem Bioscience Inc., Philadelphia, PA, USA) oder α-Paarungspheromon (Sigma, St. Louis, MO, USA) enthaltendem sterilem Wasser gesättigt. Die Platten wurden 3 Tage bei 30 °C inkubiert.
ERGEBNISSE
Die Auswirkung der STE50-Überexpression auf die Empfindlichkeit des Hefe-Biotests wurde untersucht, indem sich nur im Niveau der STE50-Expression unterscheidende Stämme verglichen wurden (26). Es wurden Biotestplatten hergestellt, die entweder den STE50-Überexpressionsstamm CY560 oder den Kontrollstamm CY562 enthielten. Die Reaktionen dieser Stämme auf Somatostatin oder Hefepheromon wurden wie in Material und Methoden beschrieben untersucht. Beide Stämme wiesen sehr schwache Reaktionen gegenüber Hefepheromon auf, da das Gα-wildtyphefegen GPA1 unterbrochen und durch ein ein chimärisches Gpa1/Gα_i2-Protein exprimierendes Gen funktionell ersetzt worden war (7). Dieses chimärische Gα-Protein kann mit dem Hefepheromonrezeptor keine effiziente Wechselwirkung eingehen. Die Reaktion dieser Zellen auf Somatostatin ist jedoch stark (26). Wie vorhergesagt führte die Überexpression von STE50 zu einer robusteren Reaktion (26a). Durch diese Daten wird demonstriert, daß die Überexpression von STE50 eine Überempfindlichkeit gegenüber Liganden, die über an den Hefe-Signaltransduktionsweg gekoppelte G-Protein-gekoppelte Rezeptoren wirken, hervorruft, selbst wenn der Ligand und der Rezeptor aus einer heterologen Quelle stammen.
IN DIESEM BEISPIEL ZITIERTE LITERATURSTELLEN

1. Sprague GF, Thorner JW. Pheromone response and signal transduction during the mating process of Saccharomyces cerevisiae. In: The molecular and cellular biology of the yeast Saccharomyces. EW Jones JR Pringle und JR Broach, Hrsg. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992.
2. Ramezani-Rad M, Xu G, Hollenberg CP 1992. STE50, a novel gene required for activation of conjugation at an early step in mating in Saccharomyces cerevisiae. Mol Gen Genet 236:145-154.
3. Chan RK, Otte CA 1982. Isolation and genetic analysis of Saccharomyces cerevisiae mutants supersensitive to G1 arrest by α factor and α factor pheromones. Mol Cell Biol 2: 11-20.
4. Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982.
5. Martin GA, Viskochil D, Bollag G et al. 1990. The GAP-related domain of the neurofibromatosis type 1 gene product interacts with ras p21. Cell 63:843-849.
6. Rose MD, Winston F, Hieter P. Methods in yeast genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990.
7. Price LA, Kajkowski EM, Hadcock JA, Ozenberger BA, Pausch MH 1995. Yeast cell growth in response to agonist-dependent activation of a mammalian somatostatin receptor. Eingereicht.

BEISPIEL 14
IDENTIFIZIERUNG VON VERBINDUNGEN MIT SOMATOSTATINREZEPTOR-AGONISTEN- UND/ODER -ANTAGONISTENEIGENSCHAFTEN
Neue subtypselektive Verbindungen mit Somatostatinagonisteneigenschaften besitzen ein signifikantes therapeutisches Potential beim Nachweis und bei der Behandlung verschiedener Krebsarten. Verbindungen mit Somatostatinagonisteneigenschaften können sich zur Förderung der Wachstumshormonausschüttung in landwirtschaftlichen Spezies eignen. Eine erhöhte Wachstumshormonausschüttung kann zu beachtlichen Verbesserungen der Wachstumsleistung und Fleischqualität führen. Hierzu wurde ein auf einen Mechanismus auf Hefebasis beruhender Screening-Test entwickelt, um auf solche Verbindungen zu testen, die wünschenswerte Somatostatinagonisten- und/oder -antagonisteneigenschaften besitzen.
Biotest. Ein für den Nachweis von Verbindungen mit Somatostatinagonisten- und/oder -antagonisteneigenschaften vorgesehener Biotest wurde unter Verwendung eines den Ratte-SSTR2 funktionell exprimierenden Hefestamms (LY 364 MATa ura3-52 trp1Δ63 his3Δ200 leu2Δ1 ade2-101 lys2-801 gpa1ΔhisG far1ΔLYS2 FUS1-HIS3 sst2ΔADE2, pJH2, pLP82) mobilisiert. Der Test wurde unter Verwendung einer Modifikation eines Standardverfahrens ausgeführt. Dabei wurde LY364 über Nacht in 2 ml synthetischem komplettem Flüssigmedium mit Glucose (2%) und ohne Uracil und Tryptophan (SCD-ura-trp-Medium) angezogen, zur Entfernung von Glucoseresten gewaschen und über Nacht in 5 ml SC-Galactose (2%)-ura-trp-Flüssigmedium angezogen. Geschmolzenes (55 °C) SC-Galactose (2%)-ura-trp-his-Agarmedium (150 ml, durch Zugabe von konzentriertem (2 × 10⁴ Zellen/ml) auf pH 6,8 eingestellt und in quadratischen (500 cm²) Petrischalen ausplattiert. Für den Antagonistentest wurde dem geschmolzenen Agar vor dem Gießen Somatostatin (20 nM S-14) zugesetzt. Auf die Oberfläche des verfestigten Agars wurden sterile Filterscheibchen gelegt und mit 10 μl die Kandidatenverbindungen enthaltendem sterilem Wasser gesättigt. Die Platten wurden 3 Tage bei 30 °C inkubiert.
Ergebnisse. Mit einem primären Screening erhaltene aktive Verbindungen wurden erneut getestet, wobei die Ergebnisse in 27 dargestellt sind. Dabei zeigt die linke Abbildung die Ergebnisse eines Tests auf Verbindungen mit Somatostatinagonisteneigenschaften. Vier Verbindungen zeigten eine von Verbindungen mit Somatostatinagonisteneigenschaften erwartete beträchtliche wachstumsfördernde Aktivität. Bei den in den vier Positionen unten links vorhandenen Verbindungen handelt es sich um als Kontrolle aufgetragene unterschiedliche Mengen an Somatostatin. Die rechte Abbildung zeigt die Ergebnisse eines Tests auf Verbindungen mit Somatostatinantagonistenaktivität. Im Antagonisten-Biotest wird dem geschmolzenen Agar vor dem Gießen Somatostatin zugesetzt. Auf diese Weise wird bei allen Zellen auf der Platte als Reaktion auf Somatostatin Wachstum induziert. Mit der Diffusion der aufgetragenen aktiven Verbindungen mit Antagonisteneigenschaften in das Agarmedium und deren Inkontakttreten mit den Zellen darin wird die durch Somatostatin induzierte Wachstums reaktion unterbrochen, wordurch eine klare Zone mit gehemmtem Wachstum entsteht. Mehrere Verbindungen zeigten nachweisbare wachstumshemmende Eigenschaften.
BEISPIEL 15
Die Signalgebungseffizienz als Reaktion auf Somatostatin wird durch die Fusion von STE2-Sequenzen an den Aminoterminus von SSTR2 reduziert.
Die funktionelle Expression von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren im allgemeinen und des SSTR2 im besonderen auf hohem Niveau war eine notwendige Voraussetzung für die Entwicklung eines sinnvollen Biotests. Von King et al. wurde berichtet, daß der Austausch der aminoterminalen Domäne des β₂-adrenergen Rezeptors gegen äquivalente STE2-Sequenz für eine effiziente Rezeptorexpression in der Hefe notwendig war. Um diese Hypothese sowie die Auswirkung von STE2-Sequenzen auf die Expression des Somatostatin-Rezeptors in der Hefe zu testen, wurde die Ratte-SSTR2-cDNA in den Plasmiden pJH1 und pJH2 unter die Kontrolle des GAL1-Promotors gestellt. Mit diesen Konstrukten wird die induzierbare Überexpression von Gal4p, dem Transkriptionsaktivierungsprotein für galactoseinduzierbare Gene, verliehen, was zu deutlich erhöhten Niveaus an Rezeptorprotein in Membranrohfraktionen im Vergleich zu einem von einem Plasmid ohne GAL4-Sequenzen exprimierten Rezeptor führt (Daten nicht gezeigt). Im SSTR2-Expressionsplasmid pJH1 wurden für die ersten 13 Aminosäuren von SSTR2 codierende DNA-Sequenzen durch für die ersten 23 Aminosäuren von STE2 codierende Sequenz ersetzt (11). Die Ratte-SSTR2-Sequenzen wurden in pJH2 ohne Modifikation der proteincodierenden Sequenzen eingeführt. Hefestämme mit diesen Konstrukten (LY322: MATa ura3-52 trp1Δ63 his3Δ200 leu2Δ1 ade2-101 lys2-801 gpa1ΔhisG far1ΔLYS2 FUS1-HIS3 sst2ΔADE2, pJH1, pLP82; LY268: MATa ura3-52 trp1Δ63 his3Δ200 ade2-101 lys2-801 gpa1ΔhisG far1ΔLYS2 FUS1-HIS3 sst2ΔADE2, pJH2, pLP82) tragen ein Plasmid (pLP82), durch das die Expression eines chimärischen Gα-Protein, das sich aus der vorgeschlagenen aminoterminalen βγ-Wechselwirkungsdomäne von Gpa1p und einer carboxyterminalen Rezeptorwechselwirkungsdomäne von Ratte-G_αi2 unter der Kontrolle des GPA1-Promotors zusammensetzt, vermittelt wird. Es wurde die Stärke der Reaktion dieser Stämme auf appliziertes Somatostatin (S-14) gemessen (28). LY268-Zellen zeigten eine robuste Wachstumsreaktion auf appliziertes S-14, womit demonstriert wird, daß für die funktionelle Expression des Ratte-SSTR2 in der Hefe keine STE2-Sequenzen benötigt werden (28A). Die Wachstumsreaktion von LY268-Zellen war wesentlich stärker als die von LY322-Zellen gezeigte (28B). Der einzige Unterschied zwischen diesen Stämmen besteht im Vorhandensein von STE2-Sequenzen im in LY322 vorliegenden pJH1. Somit wird durch den Austausch des Aminoterminus von SSTR2 gegen das äquivalente STE2-Segment die Effizienz der Signalgebung als Reaktion auf appliziertes Somatostatin stark reduziert. Trotz der Beobachtungen von King et al. benötigen in Hefe exprimierte heterologe G-Protein-gekoppelte Rezeptoren für die funktionelle Expression keinerlei aminoterminale proteincodierende Sequenzen von Hefeproteinen.

Claims

Transformierte Hefezelle, umfassend: (i) eine für einen heterologen G-Protein-gekoppelten Rezeptor codierende Nukleotidsequenz, (ii) eine Genmutation, a) die eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Rezeptoraktivierung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus sst2, STE50, sgv1, ste2, ste3, pik1, afr1, msg5 und sig1, verursacht und b) die die transkriptionale Aktivierung von auf Pheromon reagierenden Genen ohne Zellzyklusarrest gestattet, wobei die genetische Mutation ausgewählt ist aus der Gruppe, die im wesentlichen aus einer Mutation an einem die Expression herunterregulierenden Gen, einer Deletion eines Gens oder einer Überexpression eines Gens besteht, und (iii) ein Reportergen unter der Kontrolle eines auf Pheromon reagierenden Promotors, dessen Expression als Reaktion auf die exogene Zuführung eines Liganden für den heterologen Rezeptor in Schritt i stimuliert wird.
Transformierte Hefezelle nach Anspruch 1, wobei die genetische Mutation wenigstens eine weitere Genmutation an einem Gen, ausgewählt aus der Gruppe von Genen, bestehend aus FAR1 und FUS3, umfaßt.
Transformierte Hefezelle nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Reportergen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus HIS3, G418r, URA3, LYS2, CAN1, Lacz und CYH2 und es sich bei dem auf Pheromon reagierenden Promotor um FUS1 handelt.
Transformierte Hefezelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die genetische Mutation wenigstens eine genetische Mutation, ausgewählt aus der Gruppe, die im wesentlichen aus sgv1, ste2 und ste3 besteht, umfaßt.
Transformierte Hefezelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend fus3 und ferner umfassend eine Mutation an SST2.
Transformierte Hefezelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend far1 und ferner umfassend eine Mutation an SST2.
Transformierte Hefezelle nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Gen um STE50 und bei der Mutation um eine Überexpression handelt.
Transformierte Hefezelle nach Anspruch 1, wobei das G-Protein-Rezeptorgen einen Rezeptor, ausgewählt aus der Gruppe, die im wesentlichen aus dem beta-2-adrenergen Rezeptor, dem alpha-2-adrenergen Rezeptor, dem 5HT-IA-Rezeptor, dem muskarinischen Acetylcholinrezeptor, dem Rezeptor des Wachstumshormon freisetzenden Faktors, dem Somatostatinrezeptor, dem Cholecystokininrezeptor und dem Adenosinrezeptor besteht, codiert.
Transformierte Hefezelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, die ferner eine heterologe G_βγ-Untereinheit umfaßt.
Transformierte Hefezelle nach Anspruch 1 oder 2, ferner umfassend eine Mutation an einem GPA1/SCG1-Gen.
Transformierte Hefezelle nach Anspruch 10, wobei die Mutation bei der Herunterregulierung der Expression wirksam ist.
Transformierte Hefezelle nach Anspruch 1 oder 2, die ferner eine heterologe Gα-Untereinheit umfaßt.
Transformierte Hefezelle nach Anspruch 12, wobei die G_α-Untereinheit eine G_α-Untereiheit, ausgewählt aus der Gruppe, die im wesentlichen aus einer
-Untereinheit,
-Untereinheit,
Untereinheit,
Untereinheit,
-Untereinheit,
-Untereinheit und
-Untereinheit besteht, umfaßt.
Transformierte Hefezelle nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei es sich bei der Mutation an SST2 um eine Punktmutation oder Deletion handelt.
Verfahren zum Testen von Verbindungen zur Bestimmung der Auswirkungen einer Ligandenbindung an einen heterologen G-Protein-gekoppelten Rezeptor, das die folgenden Schritte umfaßt: a) Bereitstellen einer Kultur einer transformierten Hefezelle, umfassend: (i) eine erste Nukleotidsequenz, die für einen heterologen G-Protein-gekoppelten Rezeptor codiert, (ii) eine zweite Nukleotidsequenz, die für einen gesamten G-Protein-Komplex oder einen Teil davon codiert, (iii) eine Mutation eines Hefegens, um dessen Funktion zu inaktivieren und der Hefezelle zu ermöglichen, trotz Aktivierung des Signaltransduktionswegs der Reaktion auf Pheromon weiterzuwachsen, (iv) ein Reportergen unter der Kontrolle eines auf Pheromon reagierenden Promotors, dessen Expression als Reaktion auf die exogene Zuführung eines Liganden für den heterologen Rezeptor in Schritt i stimuliert wird, und (v) eine Genmutation, die eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Rezeptoraktivierung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus sst2, SET50, sgv1, ste2, ste3, pik1, afr1, msg5 und sig1, verursacht; b) Zusammenbringen der Zellen mit einer zu testenden Verbindung und c) Bestimmen des Wachstums der Zelle oder der Aktivierung des Reportergens als Anzeichen für die Aktivierung des heterologen G-Protein-gekoppelten Rezeptors bei Bindung der Verbindung.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die transformierte Hefezelle die Genmutation umfaßt, wobei die Genmutation wenigstens eine Genmutation an einem Gen, ausgewählt aus der Gruppe von Genen, die im wesentlichen aus FUS3 und FAR1 besteht, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei das Reportergen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus HIS3, G418r, URA3, LYs2, CAN1, Lacz und CYH2m und es sich bei dem auf Pheromon reagierenden Promotor um FUS1 handelt.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die transformierte Hefezelle ferner eine Mutation an einem Gen, die die transkriptionale Aktivierung von auf Pheromon reagierenden Genen ohne Zellzyklusarrest gestattet, umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei der heterologe G-Protein-gekoppelte Rezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem beta2-adrenergen Rezeptor, dem muskarinischen Acetylcholinrezeptor und dem Somatostatinrezeptor