DE69428689T2

DE69428689T2 - Hefe zellen so konstruiert, dass sie proteinsurrogate des pheromensystems produzieren und anwendungen dafuer

Info

Publication number: DE69428689T2
Application number: DE69428689T
Authority: DE
Inventors: Jim Broach; Merriman Fowlkes; Christine Klein; John Manfredi; J. Murphy; Jeremy Paul; Joshua Trueheart
Original assignee: Cadus Pharmaceutical Corp
Current assignee: Cadus Pharmaceutical Corp
Priority date: 1993-03-31
Filing date: 1994-03-23
Publication date: 2002-08-08
Anticipated expiration: 2014-03-24
Also published as: AU685103B2; WO1994023025A1; ATE207118T1; PT692025E; AU6490994A; CA2158274C; JPH08510115A; AU6354198A; CA2158274A1; EP0692025B1; ES2166371T3; DE69428689D1; EP0915154A1; DK0692025T3; JP2004357713A; EP0692025A1; JP2004337174A

Description

AUSGANGSPUNKT DER ERFINDUNG

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft das Screenen von Arzneistoffen, insbesondere von zufälligen beziehungsweise ungeordneten Peptiden, in Hefezellen auf die Fähigkeit, mit Proteinen in Wechselwirkung zu treten, die in die posttranslationale Modifikation, den Transport und die Reaktion auf Hefe-Pheromone oder Ersatzstoffe hierfür involviert sind.

Beschreibung des Stands der Technik

Arzneistoff-Screening

Die Identifizierung einer biologischen Aktivität in neuen Molekülen wurde historisch durch die Verwendung von in vitro- Assays oder von ganzen Tieren erreicht. Intakte biologische Einheiten, entweder Zellen oder Ganzorganismen wurden zum Screenen nach antibakteriellen, antifungalen, antiparasitären und antiviralen Mitteln in vitro verwendet. Kultivierte Säugetierzellen wurden ebenfalls in Screens bzw. Screenings verwendet, die dazu entwickelt wurden, potentielle therapeutische Verbindungen nachzuweisen. Eine Vielzahl von Bioassay- Endpunkten werden in Säugetierzellenscreenings ausgenutzt, einschließlich der Stimulation des Wachstums oder der Differenzierung von Zellen, Veränderungen der Zell-Motilität beziehungsweise -Beweglichkeit, der Erzeugung spezieller Metaboliten, der Expression spezieller Proteine innerhalb der Zellen, der veränderten Proteinfunktion und der veränderten Leitfähigkeit-Eigenschaften. Cytotoxische Verbindungen, die in der Krebschemotherapie verwendet wurden, wurden durch ihr Vermögen identifiziert, das Wachstum von Tumorzellen in vitro und in vivo zu hemmen. Zusätzlich zu Kulturen dispergierter Zellen spielten Gesamtgewebe in Bioassays eine Rolle, wie bei denjenigen, die auf der Muskelkontraktilität basieren.
Ein in vitro Test ist eine bevorzugte Methodologie, insofern als sie die Entwicklung von Screenings mit hohem Durchsatz beziehungsweise high-throughput-screens ermöglicht: kleine Mengen von großen Anzahlen von Verbindungen können in einer kurzen Zeitspanne und unter nur geringen Kosten getestet werden. Optimalerweise sind die späteren Stadien der Verbindungs-Evaluation Tieren vorbehalten und diese werden nicht für die Entdeckung beziehungsweise Entwicklungsphase verwendet; die Verwendung von Ganztieren ist laborintensiv und extrem kostspielig.
Mikroorganismen können in einem viel größeren Ausmaß als Säugetierzellen und Gewebe in einfacher Weise zur Verwendung in schnellen Arzneistoff-Screenings ausgenutzt werden. Die Hefe stellt ein besonders attraktives Testsystem bereit; eine umfassende Analyse dieses Organismus hat die Konservierung von Struktur und Funktion einer Vielzahl von Proteinen enthüllt, die in grundlegenden zellulären Prozessen sowohl bei der Hefe als auch bei höheren Eukaryoten aktiv sind.
Die Suche nach Agonisten und Antagonisten von Zellrezeptoren war ein intensives Gebiet der Forschung, das die Arzneistoff- Entdeckung zum Ziel hatte, die auf die elegante Spezifität dieser Molekültargets- beziehungsweise -ziele zurückzuführen war. Ein Arzneistoff-Screening wurde unter Verwendung von Ganzzellen durchgeführt, die funktionelle Rezeptoren exprimieren und kürzlich wurden Bindungsassays entwickelt, die Membran-Fraktionen beziehungsweise Bruchstücke oder gereinigte Rezeptoren verwenden, um Verbindungsbibliotheken beziehungsweise -banken auf kompetitive Liganden hin zu screenen beziehungsweise zu durchmustern. Duke University, WO92/05244 (2. April 1992) beschreibt die Expression von G Proteingebundenen Säugetierrezeptoren in der Hefe und ein Mittel zum Identifizieren von Agonisten und Antagonisten dieser Rezeptoren unter Verwendung des Organismus.
Zusätzlich wird Hefe selbstverständlich bei der Entdeckung von antifungalen beziehungsweise antimykotischen Verbindungen verwendet; Etienne et al. (1990) beschreiben die Verwendung von mutierten Saccharomyces cerevisiae-Stämmen die gegenüber einem großen Bereich von Antibiotika empfindlich sind, zum schnellen Nachweis von Antimykotika.

Proteine des Hefe-Phermonsystems und deren metabolische Funktion

Haploide Hefezellen sind nicht nur dazu in der Lage, vegetativ zu wachsen, sondern sind ebenfalls dazu in der Lage, sich zu paaren, um eine diploide Zelle zu bilden. Die beiden Paarungstypen ("Geschlechter") der haploiden Zellen werden als a und α bezeichnet. Die a-Zellen erzeugen den Dodecapeptid- a- Faktor und die α-Zellen den Tridecapeptid α-factor; weil der a-Faktor und der α-Faktor in der Hefezelle des entgegengesetzten "Geschlechtes" eine Paarungsreaktion hervorrufen, werden sie als "Pheremone" bezeichnet. Diese Pheromone ebenso wie andere Proteine, die speziell in die Herstellung oder den Transport oder die Reaktion auf Pheromone involviert sind, werden als die "Proteine des Pheromonsystems" betrachtet.
Das Gen, das das a-Faktor-Pheromon kodiert, wie das α- Faktorrezeptorgen, ist ein a-Zell-spezifisches Gen; a-Zell- spezifische Gene werden nur in a-Zellen exprimiert. Das Gen, das ein a-Faktor-Pheromon kodiert, wie das a-Faktorrezeptorgen, ist ein α-zellspezifisches Gen; α-zellspezifische Gene werden nur in α-Zellen exprimiert. Andere Hefegene gehören zu einem haploidspezifischen Gensatz und werden in haploiden Zellen exprimiert (a Zellen oder α-Zellen), jedoch nicht in Diploiden (a/α)-Zellen. Zusätzlich existiert ein Gensatz, der für diploide Zellen spezifisch ist, der diejenigen Gene einschließt, die in die Sporenbildung involviert sind.
In eukaryotischen Zellen enthalten die RNA Polymerase II- Promotoren eine spezifische Sequenz (die TATA-Box), an die der Transkriptionsfaktor TFIID (TATA Bindungsprotein oder TBP) bindet. Ein aktiver Transkriptionsstartkomplex schließt die TFIID, akzessorische Startproteine und RNA Pol II. Wie in höheren eukaryotischen Zellen ist die TATA-Box in Hefepromotoren eine essentielle Kontrollsequenz. Das Hefe TATA-Box Bindungsprotein (TBP) wurde auf Grund seiner Fähigkeit identifiziert, bezüglich seiner Funktion Säugetier TFIID zu substituieren [Buratowski et al., Nature 334, 37 (1988); Cavallini et al., Nature 334, 77 (1988)]. Mit nur einigen wenigen offensichtlichen Ausnahmen [Transkription einiger glycolytischer Enzyme, siehe Struhl, Mol. Cell, Biol. 6, 3847 (1986) und Ogden et al., Mol. Cell Biol. 6, 4335 (1986)] erfordert die Transkription von Hefegenen das proximale TATA-Boxelement und eine TFIID-Bindung zum Start der Transkription. Für eine effiziente Transkription sind ebenfalls genspezifische Aktivator-Proteine erforderlich; der genaue Mechanismus, durch den diese genspezifischen Regulatorproteine die Transkription beeinflussen, wurde bis jetzt nicht vollständig aufgeklärt.
MCM1p (kodiert im MCM1-Gen) ist ein nicht-zellspezifischer Transkriptionsfaktor in der Hefe. MCM1p dient alleine oder zusammen mit anderen regulatorischen Proteinen zur Kontrolle der Expression von a- und α-zellspezifischen Genen. Die Hefe-Paarungstyp-Loci beziehungsweise Genorte kodieren die regulatorischen Proteine, die zur Kontrolle beziehungsweise Steuerung der zelltyp-spezifischen Expression beitragen. Diese Proteine sind Mata1p (kodiert durch das MATa-Gen) und Matα1p und Matα2p (kodiert durch den MATα-Lokus beziehungsweise Genort). MCM1p aktiviert die Transkription von a- spezifischen Genen durch Bindung an eine stromaufwärts gelegene Aktivierungssequenz (upstream activation sequence = UAS), die sich in der Kontrollregion der a-spezifischen Gene befindet. Matα1p und MCM1p stehen miteinander in Wechselwirkung, um die jeweils andere Bindung an spezifische UAS- Bindungsstellen zur Aktivierung einer α-zellspezifischen Gentranskription in α-Zellen zu vergrößern. Matα2p verbindet sich mit MCM1p, um eine a-spezifische Gentranskription in α- Zellen zu unterdrücken. In diploiden (a/α) Zellen, binden sich Matα1p und Matα2p, um die Transkription der haploidspezifischen Gene zu unterdrücken. Die regulatorische Einheit Matα1p/Matα2p ist nur in diploiden Zellen zu finden.
Hefen enthalten 2 Gene, die das α-Faktorpheromon kodieren, nämlich MFα1 und MFα2. Die Untersuchung von Hefen, die Mutationen in diesen Sequenzen tragen, zeigt, daß MFα1 den Großteil des α-Faktors entstehen läßt, der von den Zellen erzeugt wird. Die Expression tritt auf einem höheren Niveau von MFα1 als von MFα2 ein (Kurjan, Mol. Cell. Biol. 5, 787 (1985). Das MFα1-Gen der Hefe kodiert ein Vorläuferprotein von 165 aa (= amino acids = Aminosäuren), das eine 85 aa Leadersequenz am End-Terminus enthält. Die Leadersequenz schließt eine Signalsequenz von 19 aa und eine Sequenz von 66 aa ein, die Stellen für die Addition beziehungsweise Hinzufügung von drei Oligosaccharid-Seitenketten enthält (Kurjan und Herskowitz, Cell 39, 933 (1982); Singh et al. Nuc. Acids Res. 11, 4049 (1983); Julius et al. Cell 36, 309 (1984). Vier Tandem-Kopien des 13 aa α-Faktors liegen im C-terminalen Anteil des Vorläufers vor; 6-8 aa Spacer-Peptide gehen den α- Faktorsequenzen voran (siehe Fig. 2).
Nach Translokation des naszierenden α-Faktor Polypeptids zum ER wird die Signalsequenz vom Vorläuferprotein abgespalten, um den pro-α-Faktor zu gewinnen (Waters et al. J. Biol. Chem. 263, 6209 (1988). Das Kern-N-gebundene Kohlenhydrat wird den 3 Stellen im N-Terminus des Pro-α-Faktors hinzugefügt (Emter et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 116, 822 (1983); Julius et al. Cell 36, 309 (1984); Julius et al. Cell 37, 1075 (1984). Eine zusätzliche Glykosylierung tritt im Golgi-Apparat vor Spaltung des pro-α-Faktors durch die KEX2- Endopeptidase ein. Dieses Enzym spaltet innerhalb jeder der Spacer-Wiederholungen und läßt eine Lys-Arg-Sequenz zurück, die am C-Terminus des α-Faktorpeptids gebunden ist (Julius et al. Cell 37, 1075 (1984). Die Lys-Arg Sequenz wird durch die Wirkung der KEX-1 Protease entfernt (Dmochowska et al. Cell 50, 573 (1987). Die zusätzlichen Spacer-Reste, die am N- Terminus des α-Faktorpeptids vorliegen, werden durch die Dipeptidylaminopeptidase entfernt, die durch STE13 (Julius et al. Cell 32, 839 (1983) kodiert werden. Vier α-Faktorpeptide werden aus jedem Vorläuferprotein über die proteolytische Verarbeitung freigesetzt, die oben dargelegt wurde, und der reife α-Faktor wird von der Zelle sezerniert.
Die Vorläufer des reifen 12 aa-Faktorpeptids sind in den MFa1 und MFa2-Genen kodiert und sind jeweils 36 aa beziehungsweise 38 aa Reste (für ein Schema des MFa1-Genes siehe Fig. 5). Die Vorläufer enthalten eine Kopie eines a-Faktors und die Produkte der beiden Gene unterscheiden sich in der Sequenz bei einer Aminosäure. Die beiden Formen des a-Faktors werden von a-Zellen in gleichen Mengen produziert (Manney et al. in Sexual interactions in eukaryotic microbes, S. 21, Academic Press, New York (1981).
Die Verarbeitung des a-Faktors schließt einen Prozeß ein, der sich in jeder Einzelheit von derjenigen des α-Faktors unterscheidet. Die Verarbeitung beziehungsweise Prozessierung des α-Faktors beginnt im Cytosol und schließt die Farnesylierung des C-terminalen Cystein-Restes durch eine Farnesyltransferase ein, der sich nahe des C-Terminus befindet (-CVIA) (Schafer et al., Science 245, 379 (1989); Schafer et al. Science 249, 1133 (1990). Die α-und β Untereinheiten der Farnesyltransferase werden die die RAM2 beziehungsweise RAM1-Gene kodiert (He et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 11373 (1991). Im Anschluß an die Farnesylierung ereignet sich die proteolytische Entfernung der drei Aminosäuren, die bezüglich des modifizierten Cysteins C-Terminal ständig sind, durch eine Membran-gebundene Endoprotease. Als nächstes wird der Carboxy-terminale farnesylierte Cystein-Rest weiter modifiziert: Die Carboxylgruppe wird durch das Produkt des STE14-Gens methyliert. STE14p ist eine membrangebundene S-Farnesyl-Cystein Carboxymethyltransferase (Hrycyna et al. EMBO. J. 10, 1699 (1991). Die Mechanismen der N-terminalen Verarbeitung beziehungsweise Bearbeitung des a-Faktors wurden bis jetzt nicht aufgeklärt. Nachdem die Verarbeitung der Vorläufer abgeabgeschlossen ist, wird der reife a-Faktor durch das Produkt des STEG-Genes in den extrazellulären Raum transportiert (Kuchler et. Al. EMBO J. 8, 3973 (1989), ein ATP-Bindungs Kassetten (ABC)-Transporter.
In der normalen S. cerevisiae (keimende Hefe) a-Zellen bindet der α-Faktor den G-Protein-gebundenen Membranrezeptor STE2. Das G-Protein dissoziiert in Gα und Gβγ-Untereinheiten und das Gβγ bindet an einen nichtidentifizierten Effektor, der wiederum eine Anzahl von Genen aktiviert. STE20, eine Kinase, aktiviert STE5, ein Protein unbekannter Funktion. STE5 aktiviert die STE11-Kinase, die die STE7-Kinase stimuliert, die wiederum die KSS1 und/oder FUS3-Kinasen induziert. Diese schalten die Expression des Transkriptionsfaktors an. STE12 stimuliert die Expression einer großen Vielzahl von Genen, die in die Paarung involviert sind, einschließlich FUS1 (Zellfusion), FAR1 (Stop des Zell-Zyklus), STE2 (der Rezeptor), MFAl (das Pheromon), SST2 (Gewinnung), KAR3 (Kernfusion beziehungsweise Kernverschmelzung) und STEG (Pheromonsekretion). Andere durch diesen Weg aktivierte Gene sind CHS1, AGα1 und KAR3. Die multiple Tandern-Sequenz TGAAACA wurde als "Pheromon responsives Element" erkannt, das in den 5'-flankierenden Regionen vieler der Gene dieses Weges zu finden ist.
Eine der Reaktionen auf Paarungs-Pheromon ist der vorübergehende Stillstand der Hefezelle in der G1-Phase des Zellzyklus. Dies macht erforderlich, daß alle 3 G1-Cycline (CLN1, CLN2, CLN3) inaktiviert sind. Es wird angenommen, daß FUS3 CLN3 inaktiviert und FAR1 CLN2 hemmt. (Das für die Inaktivierung von CLN1 verantwortliche Produkt ist unbekannt).
Der Wachstumsstillstand wird durch eine Anzahl unterschiedlicher Mechanismen beendet. Zuerst wird der α-Faktorrezeptor im Anschluß an die Bindung des Pheromons internalisiert, was eine vorübergehende Abnahme der Anzahl der Pheromon- Bindungsstellen zur Folge hat. Zweitens wird der C-terminale Rest beziehungsweise Schwanz des Rezeptors im Anschluß an die Liganden-Bindung phosphoryliert, was die Entkopplung des Rezeptors von den transduzierenden G-Proteinen zur Folge hat. Drittens erhöhen Pheromon-induzierte Zunahmen der Expression von GPA1p- (die Gα-Untereinheit des heterotrimeren G- Proteins) den Spiegel der α-Untereinheit bezüglich der Gβ und Gβγ Einheiten, was die Reduktion des Spiegels von freiem Gβγ und die anschließende Inaktivierung des Pheromon-Reaktions- Weges zur Folge hat. Zusätzliche Mechanismen schließen die Induktion der Expression von SST2 und BAR1 und die Phosphorylierung der α-Untereinheit (vielleicht durch SVG1) ein.
Die Signalgebung bzw. der Signalstoffwechsel bzw. das Signaling wird durch Expression einer Anzahl von Genen gehemmt, einschließlich CDC36, CDC39, CDC72 und CDC73 und SRM1. Die Inaktivierung dieser Gene führt zur Aktivierung des Signalstoff-Stoffwechselweges.
Ein ähnlicher Pheromon-Signalstoff-Stoffwechselweg kann in α-Zellen wahrgenommen werden, jedoch ist die Nomenklatur in einigen Fällen unterschiedlich (beispielsweise STE3 anstatt STE2):
Andere Hefen weisen ebenfalls G-Protein vermittelte Paarungsfaktorreaktions-Wege auf. Beispielsweise bindet in der Spalthefe S. pombe der M-Faktor den MAP3-Rezeptor oder der P- Faktor bindet den MAM2-Rezeptor. Die Dissoziation des G- Proteins aktiviert eine Kinase-Kaskade (BYR2, BYR1, SPK1), die wiederum einen Transkriptionsfaktor (STE11) stimuliert. Jedoch überträgt in S. pombe die Gα-Untereinheit das Signal und es existieren selbstverständlich andere Unterschiede in den Details.

Mutanten des Pheromon-Wegs

Die Wirkungen von spontanen und induzierten Mutationen in den Genen des Pheromon-Weges wurden untersucht. Diese schließen die α-Faktor (MFα1 und MFα2)-Gene ein, siehe Kurjan, Mol. Cell. Biol., 5:787 (1985); die α-Faktor (MFa1 und MFa2)-Gene, siehe Michaelis und Herskowitz, Mol. Cell. Biol. 8:1309 (1988); die Pheromonrezeptor (STE2 und STE3)-Gene, siehe Mackay und Manney, Genetics, 76:273 (1974), Hartwell, J. Cell. Biol. 85:811 (1980), Hagen, et al., P. N. A. S. (USA), 83:1418 (1986); das FAR1-Gen, siehe Chang und Herskowitz, Cell, 63:999 (1990); und das SST2-Gen, siehe Chan und Otte, Mol. Cell. Biol., 2:11 (1982).

Expression von Fremdproteinen in Hefezellen

Eine breite Vielzahl von Fremdproteinen wurde in S. cerevisiae erzeugt, entweder allein im Hefe-Cytoplasma oder durch Ausnutzung des Hefesekretionsweges (Kingsman et al., TIBTECH 5, 53 (1987). Diese Proteine schließen als Beispiele insulinartige Wachstumsfaktor-Rezeptoren (Steube et al. Eur. J. Biochem. 198, 651 (1991), das Influenzavirus Hämagglutinin (Jabber et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 2019 (1985), Rattenleber-Cytochrom P-450 (Oeda et al. DANN 4, 203 (1985) und funktionelle Säugetierantikörper (Wood et al. Nature 314, 446 (1985) ein. Die Verwendung des Hefesekretionsweges wird bevorzugt, weil die Wahrscheinlichkeit, eine genaue Faltung, die Glykosylierung und die Stabilität des Fremdproteines zu erreichen, erhöht wird. Somit schließt die Expression von heterologen Proteinen in der Hefe oftmals die Fusion der Signalsequenzen, die in den Genen der Hefe-Sekretions-Proteine kodiert sind, ein (beispielsweise das α-Faktor-Pheromon oder das SUC2 [Invertase-Gen]) an die kodierende Region von Fremdprotein-Genen.
Eine Anzahl von Hefe-Expressionsvektoren wurde entwickelt, um die konstituive oder regulierte Expression von Fremdproteinen zu ermöglichen. Konstitutive Promotoren werden aus in hohem Masse exprimierten Genen abgeleitet, wie beispielsweise denjenigen, die von metabolischen Enzymen wie Phosphoglyzeratkinase (PGK1) oder Alkoholdehydrokinase I (ADH1) kodiert werden und regulierbare Promotoren wurden von einer Anzahl von Genen abgeleitet, die das Galaktokinase (GAL1)-Gen einschließen. Zusätzlich können supersezernierende Hefe-Mutanten gewonnen werden; diese Stämme sezernieren Säugetierproteine effizienter und werden als "Produktions-Stämme" verwendet, um große Mengen an biologisch aktiven Säugetier-Proteinen in der Hefe zu erzeugen (Moir und Davidow, Meth. in Enzymol. 194, 491 (1991).
Eine Vielzahl von heterologen Proteinen wurde in Hefezellen als Mittel zur Erzeugung der für die kommerzielle Verwendung oder für biochemische Studien erforderlichen Menge an Protein exprimiert (Kingsman et al. TIBTECH 5, 53 (1987). Zusätzlich wurde eine Anzahl von Säugetierproteinen in Hefe exprimiert, um zu bestimmen, ob die Proteine (1) funktionell bekannte Proteine substituieren werden, die üblicherweise innerhalb dieses Organismus exprimiert werden oder (2) mit akzessorischen Hefe-Proteinen in Wechselwirkung treten werden, um eine spezielle Funktion zu erreichen. Somit wurde bestimmt, daß ein menschliches TBP mit veränderter Bindungsspezifität zur Initiation der Transkription in der Hefe dienen kann [Strubin und Struhl, Cell 68, 721 (1992)]. Es wurde zusätzlich gezeigt, daß Säugetier-Steroidhormon-Rezeptoren [Metzger et al. (1988); Schena und Yamamoto (1988)] und menschliches p53 [Schärer und Iggo, Nuc. Acids Res. 20, 1539 (1992)] die Transkription in der Hefe aktivieren.
Die Expression des gag-pol-Gens von HIV-1 in der Hefe hat die Verarbeitung des gag-Proteinvorläufers zur Folge, so daß die Produkte gewonnen werden, die normalerweise innerhalb des Virions entstehen; das Processing beziehungsweise die Reifung beziehungsweise die Verarbeitung in der Hefe, wie auch im Virus, ist auf die Wirkung der Protease zurückzuführen, die innerhalb des gag-pol-Gens kodiert ist (Kramer et al. Science 231, 1580 (1986)
Eine Anzahl von Säugetier-ABC-Transportern wurde in Hefen exprimiert, um ihre Fähigkeit zu bestimmen, Hefe Ste6p beim Transport von Pheromon zu ersetzen. Die Säugetierproteine, die bis jetzt getestet wurden, schließen menschliches Mdr1 (Kuchler and Thorner, Proc. Natl. Acad. Sci. 89, 2302 (1992) und murines Mdr3 (Raymond et al. Science 256, 232 (1992) ein, Proteine die in eine Resistenz gegen mehrere Arzneistoffe (multidrug resistance) involviert sind; zusätzlich wurde gezeigt, daß ein chimäres Protein, das menschliches CFTR (cystic fibrosis transmembran conductance regulator = transmembranischer Konduktanz-Regulator der cystischen Fibrose) und die Hefe-STEG-Sequenz enthält, ein a-Faktor- Pheromon in der Hefe transportiert (Teem et al. Cell 73, 335 (1993).
Eine a-Zelle kann gentechnisch verändert werden, so daß sie den a-Faktor-Rezeptor erzeugt und eine α-Zelle kann so verändert werden, daß sie einen α-Faktorrezeptor herstellt. Nakayama, et al., EMBO J. 6:249-54 (1987); Bender and Sprague, Jr., Genetics 121:463-76 (1989).
Heterologe G-Protein gebundene Rezeptoren wurden funktionell in S. cerevisiae exprimiert. Marsh und Hershkowitz, Cold Spring Harbor Symp., Qunat. 5101. 53:557-565 (1988) ersetzen das S. cerevisiae STE2 mit seinem Homolog von S. Kluyven. Noch dramatischer wurde ein beta-adrenerger Säugetier- Rezeptor und eine Gα-Untereinheit in der Hefe exprimiert und es stellte sich heraus, daß sie den Hefepaarungs-Signalstoff- Stoffwechselweg steuern. King et al., Science, 250:121-123 (1990).
Duke University, WO92/05244 (2. April 1992) beschreibt eine transformierte Hefezelle, die nicht dazu in der Lage ist, eine Hefe-G-Protein α-Untereinheit zu erzeugen, die jedoch so gentechnisch verändert wurde, daß sie sowohl eine Säugetier G-Protein α-Untereinheit als auch einen Säugetierrezeptor erzeugt, der an die vorher erwähnte Säugetier G-Protein α- Untereinheit "gebunden" ist (das heißt mit diesem in Wechselwirkung steht). Insbesondere berichtet Duke von der Expression des menschlichen beta-2 adrenergen Rezeptors (hβAR), ein Sieben-Transmembranrezeptor (seven transmembrane receptor = STR) in der Hefe, unter Kontrolle des GAL1 Promotors, wobei das hβAR-Gen durch Ersetzen der ersten 63 Basenpaare der kodierenden Sequenz durch 11 Basenpaare einer nichtkodierenden und 42 Basenpaare kodierenden Sequenz aus dem STE2-Gen modifiziert wurde (STE2 kodiert den Hefe α-Faktorrezeptor). Duke hat herausgefunden, daß das modifizierte hβAR funktionell in die Membran integriert wurde, wie durch Studien der Fähigkeit von isolierten Membranen, in geeigneter Weise mit verschiedenen bekannten Agonisten und Antagonsiten von hβAR zu interagieren, gezeigt wurde. Die Liganden Bindungs-Affinität von für Hefe exprimiertes hβAR wurde als derjenigen, die für natürlich erzeugtes hβAR beobachtet wurde, beinahe identisch bezeichnet.
Duke koexprimierte eine Ratten G-Protein α-Untereinheit in denselben Zellen, nämlich Hefestamm 8C, dem das verwandte bzw. zugehörige Hefe-Protein fehlt. Eine Ligandenbindung hatte die G-Protein vermittelte Signal-Transduktion zur Folge.
Duke lehrt, daß diese Zellen beim Screening von Verbindungen auf ihre Fähigkeit, die Dissoziationsgeschwindigkeit von Gα und Gβγ in eine Zelle zu beeinflussen, verwendet werden können. Zu diesem Zweck enthält die Zelle weiterhin einen Pheromon-responsiven Promotor (beispielsweise BAR1 oder FUS1), der an ein Indikatorgen gebunden ist (beispielsweise HIS3 oder LacZ). Die Zellen werden in Multititer-Platten angeordnet und unterschiedliche Verbindungen in jedem Well beziehungsweise in jeder Vertiefung angeordnet. Die Kolonien werden dann bezüglich der Expression des Indikatorgens bewertet.
Die Duke'schen Hefezellen erzeugen tatsächlich jedoch die Verbindungen, die gescreent werden sollen, nicht. Als Folge kann nur eine relativ kleine Anzahl von Verbindungen gescreent werden, weil der Wissenschaftler sicher stellen muß, daß eine vorgegebene Gruppe von Zellen mit nur einer einzigen, bekannten Verbindung in Berührung gebracht wird.
Hefe wurde gentechnisch verändert, um Fremdpolypeptid- Varianten zu exprimieren, die als potentielle Antagonisten von Säugetier-Rezeptoren getestet werden sollen. Bibliotheken beziehungsweise Banken, die mutierte Glukagon-Moleküle kodieren, wurden durch zufällige Fehl-Einfügung von Nukleotiden während der Synthese von Oligonukleotiden erzeugt, die die kodierende Sequenz des Säugetier-Glukagons enthielten. Diese Banken wurden in Hefe exprimiert und Kulturnährlösungen von transformierten Zellen wurden beim Testen auf eine Antagonisten-Aktivität auf Glukagon-Rezeptoren verwendet, die in Ratten-Hepatozytenmembranen vorliegen (Smith et al. 1993).
Arzneistoffe, die die multiple Arzneistoffresistenz (MDR) von Krebszellen überwinden, können durch Verwendung von transformierten Hefezellen identifiziert werden, die das P- Glycoprotein exprimieren (Suntory Ltd., Patentanmeldung JP 2257873 mit dem Titel "Multiple drug resistance-relating gene comprises P-glycoprotein accumulated in cell membrane part of transformed yeast"). Die Arzneistoffe wurden nicht durch die fraglichen Hefezellen erzeugt.
Ein Hefestamm wurde gewonnen, der die Identifizierung von Inhibitoren der Protein-Farnesyltransferase ermöglicht, die eine Aktivität beziehungsweise Wirksamkeit gegen Säugetier Ras zeigen, und die deswegen als Antitumor-Arzneistoffe dienen können (Hara et al. 1993).

Genetische Marker in Hefestämmen

Hefestämme, die für Histidin auxotroph sind (HIS3) sind bekannt, siehe Struhl und Hill, Mol. Cell. Biol. 7:104 (1987); Fasullo und Davis, Mol. Cell. Biol., 8:4370 (1988). Das HIS3 (Imidazolglyzerolphosphatdehydratase) Gen wurde als selektiver Marker in der Hefe verwendet. Siehe Sikorski und Heiter, Genetics, 122:19(1989); Struhl et al., P. N. A. S. 76:1035 (1979) und bezüglich FUS1-HIS3-Fusionen, siehe Stevenson et al., Genes Dev., 6:1293 (1992).
Peptidbanken. Peptidbanken sind Systeme, die in einer Form, die eine Interaktion mit einem Ziel beziehungsweise Target ermöglicht, eine hochdiverse und zahlreiche Sammlung von Peptiden zeigt. Diese Peptide können in Lösung (Houghton) oder auf Perlen (Lam), Chips (Fodor), Bakterien (Ladner USP 5 223 409), Sporen (Ladner USP '409), Plasmiden (Cull) oder auf Phagen (Scott, Devlin, Cwirla, Felici, Ladner '409) präsentiert werden. Viele dieser Systeme sind bezüglich der maximalen Länge des Peptides oder der Zusammensetzung des Peptides (beispielsweise ausgeschlossen Cys) beschränkt. Sterische Faktoren, wie beispielsweise die Nähe eines Trägers, können die Bindung stören. Üblicherweise erfolgt das Screening bezüglich einer Bindung in vitro an ein künstlich präsentiertes Target, nicht zur Aktivierung oder Hemmung eines Zellsignalübertragungs-Weges in einer lebenden Zelle. Während ein Zelloberflächen-Rezeptor als ein Ziel bzw. Target verwendet werden kann, wird das Screening nicht enthüllen, ob die Bindung des Peptids eine allosterische Veränderung in der Konformation des Rezeptors verursachte.
Ladner, USP 5 096 815 beschreibt ein Verfahren zum Identifizieren neuartiger Proteine oder Polypeptide mit einer erwünschten DNA- Bindungsaktivität. Semi-Random ("variegierte") DNA, die eine große Anzahl unterschiedlicher potentieller Bindungsproteine kodiert, wird in exprimierbarer Form in geeignete Wirtszellen eingeführt. Die Ziel-DNA- Sequenz wird in ein gentechnisch verändertes Operon eingebracht, so daß die Bindung des Proteins oder des Polypeptids die Expression eines Genproduktes, das für das Gen unter selektiven Bedingungen schädlich ist, verhindern wird. Zellen, die die selektiven Bedingungen überleben, sind somit Zellen, die ein Protein exprimieren, das die Ziel-DNA bindet. Während gelehrt wird, daß Hefezellen zum Testen verwendet werden können, werden Bakterienzellen bevorzugt. Die Interaktionen zwischen dem Protein und der Ziel-DNA tritt nur in der Zelle, nicht im Periplasma ein und das Ziel ist eine Nukleinsäure und nicht ein Pheromonsystemprotein-Surrogat.
Das Ersetzen funktioneller Domänen in zellulären Proteinen durch ungeordnete beziehungsweise zufällige Peptid-Sequenzen ermöglicht eine gewisse Bestimmung der spezifischen Sequenz- Erfordernisse zur Erreichung der Funktion. Obwohl die Einzelheiten der Erkennungsphänomene, die die Lokalisierung der Proteine innerhalb der Zellen mit sich bringt, weitestgehend unbekannt sind, wurden die Beschränkungen beziehungsweise Zwänge auf die Sequenzvariation mitochondraler Ziel-Sequenzen und auf die Proteinsekretion von Signalsequenzen unter Verwendung von Random-Peptiden ans Licht gebracht (Lemire et al., J. Biol. Chem. 264, 20206 (1989) beziehungsweise Kaiser et al. Science 235, 312 (1987).

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung ist durch die hierzu beigefügten Ansprüche definiert.
In der vorliegenden Erfindung wird eine Hefezelle gentechnisch verändert, so daß sie eine exogenes Protein exprimiert, das jedoch dazu in der Lage ist, ein Hefe-Protein zu ersetzen, das in die posttranslationale Modifikation, den Transport, die Erkennung oder die Signalübertragung eines Hefe- Pheromons involviert ist, und zwar in so ausreichender Weise, daß es dazu in der Lage ist, zumindest unter bestimmten Umständen, diese Rolle des Hefeproteins durchzuführen. Aus Gründen der Vereinfachung werden diese Hefe-Proteine als "Pheromonsystem-Proteine" (PSP) bezeichnet und deren bekannte Nicht-Hefeproteine werden als PSP-Surrogate beziehungsweise Ersatzstoffe bezeichnet.
Das Pheromonsystem einer Zelle wird somit umgewandelt, so daß die Reaktion beziehungsweise Antwort der Zelle auf ein hefe- Pheromon zumindest teilweise durch die Aktivität des Surrogat-PSP's bestimmt wird. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das verwandte Hefe-PSP nicht in funktioneller Form hergestellt, so daß die Reaktion im Wesentlichen vollständig von der Aktivität des Surrogat-PSP's abhängig ist.
Derartige Hefezellen können dazu verwendet werden, Arzneistoffe zu identifizieren, die in einem nachweisbaren Ausmaß die Fähigkeit des Surrogats, das verwandte Hefe-PSP zu ersetzen, hemmen oder aktivieren. Um bezüglich eines Inhibitors beziehungsweise Hemmstoffes zu screenen wird normales funktionelles Surrogat exprimiert und das Vorhandensein eines Inhibitors wird durch eine Unterdrückung der zellulären Reaktion angezeigt. Um auf einen Aktivator zu screenen wird ein Surrogat verwendet, das in Hefe funktionell ist oder eines, das normalerweise in Hefe nicht funktionell ist, das jedoch aktivierbar ist, (das letztere wird bevorzugt um den Störpegel zu minimieren) und der Aktivator wird durch diese hervorgerufene Erhöhung der zellulären Reaktion nachgewiesen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist der Testarzneistoff ein Peptid und eine Hefezelle ist gentechnisch verändert, so daß sie den Test-Arzneistoff ebenso wie das Surrogat PSP exprimiert.
Eine weitere Erwägung ist, das mit Wildtyp Hefezellen zur Erreichung einer Pheromon-Sekretion und Reaktion, sowohl α als auch a-Zellen bereitgestellt werden müssen. In einigen bevorzugten Ausführungsformen werden α-Zellen gentechnisch verändert, so daß sie α-Faktor-Rezeptor exprimieren oder a-Zellen werden gentechnisch verändert, so daß sie a-Faktor-Rezeptor exprimieren. Diese modifizierten Zellen können als "autokrin" betrachtet werden, weil sie "selbststimulierend" sind. Zellen, die sowohl ein Surrogat für den Pheromon-Rezeptor als auch einen heterologen Peptid-Agonisten für den Surrogat- Rezeptor exprimieren werden ebenfalls als "autokrin" betrachtet, weil sie auf den co-produzierten Agonisten reagieren.
Es existieren vielfältige Klassen von PSPs. Jedoch können einige Beispiele hilfreich sein.
Farnesyltransferasen und Carboxymethyltransferasen. Nach der Expression wird a-Faktor durch RAM1p und RAM2p farnesyliert und durch Ste14p carboxymethyliert. Diese Modifikationen sind für die Aktivität erforderlich.
RAM1p und RAM2p sind zu den Untereinheiten der heterodimeren Säugetier-Farnesyltransferase homolog, die selbst für die Membran-Bindung von Säugetier-Ras-Proteinen notwendig ist. Wenn eine Hefezelle gentechnisch verändert wird, so daß sie die Säugetier-Farnesyltransferase exprimiert, kann sie dazu verwendet werden, Arzneistoffe zu identifizieren, die mit diesem Enzym in Wechselwirkung treten, indem bestimmt wird, ob funktioneller a-Faktor erzeugt wird. In ähnlicher Weise ist Ste14p zu Säugetier-Carboxymethyltransferase homolog, die regulatorische Rollen bei der Steuerung der Funktion von G- proteinen mit niedrigem Molekulargewicht spielen (RAS, Rho, Rab).
Proteasen. Das PSP kann eine Hefe-Protease, wie beispielsweise KEX2, STE13 oder KEX1 sein. Das Hefe α-Faktorpheromon wird durch die kontrollierte und begrenzte Proteolyse von Vorläufer-Proteinen durch diese Proteasen erzeugt. Eine Hefezelle kann gentechnisch verändert werden, so daß sie einen inaktiven Vorläufer des Hefe α-Faktors exprimiert, bei dem ein Peptid-Linker, der der Spaltstelle einer Surrogat- Nichthefe-Protease entspricht, eingebaut wird, so daß die Spaltung den reifen α-Faktor freisetzen wird (oder dessen funktionelles Homolog). Beispielsweise kann das PSP-Surrogat HIV-Protease sein, wobei die Spaltstellen der Hefe-Protease im α-Faktorvorläufer durch die Spaltstelle von HIV-Protease ersetzt werden. Der Vorläufer und die HIV-Protease werden in der Hefezelle coexprimiert beziehungsweise zusammen exprimiert. Die Proteolyse durch die HIV-Protease läßt die Erzeugung von reifen α-Faktor entstehen und den Start der Signalübertragung. Dieses System kann dazu verwendet werden, Inhibitoren der HIV-Protease zu identifizieren.
Anders als Hefezellen, die in der Natur vorkommen, wird die Hefezelle vorzugsweise gentechnisch verändert, so daß sie nicht nur den α-Faktor-Vorläufer exprimiert, sondern auch den α-Faktor-Rezeptor, so daß ein einzelner haploider Typ der Hefe alles ist, was dazu erforderlich ist, um den Assay durchzuführen.
ABC Transporter. Ste6 ist der Hefe-ABC-Transporter, der für den Export eines a-Faktors notwendig ist. Die Hefezelle wird gentechnisch verändert, so daß sie sowohl a-Faktor als auch einen fremden ABC-Transporter exprimiert. Dieser Transporter kann derartig ausgebildet sein, daß er selbst nicht dazu in der Lage ist, einen a-Faktor zu transportieren, der jedoch in Gegenwart eines interessierenden Arzneistoffes dazu in der Lage ist, dieses zu tun oder derartig ausgebildet sein kann, daß er bereits funktionell ist.
Vorzugsweise ist die Hefezelle gentechnisch verändert, so daß sie nicht nur a-Faktor, sondern auch den a-Faktor-Rezeptor exprimiert.
G-Protein-gebundene Rezeptoren. Das PSP kann ein Hefe- Pheromonrezeptor sein. Das Surrogat ist ein Nicht-Hefe-G- Protein-gebundener Rezeptor. Um die Bindung an den Pheromonsignal-Übertragungsweg zu erreichen, kann es notwendig sein, eine fremde oder chimäre Gα oder Gβγ-Untereinheit bereitzustellen.
Die gentechnisch veränderte Hefezelle kann dazu verwendet werden, um auf Agonisten ebenso wie Antagonisten zu screenen. Wenn sie dazu verwendet wird, nach Agonisten zu screenen, wird bevorzugt, daß das Hefe-Pheromon nicht in funktioneller Form erzeugt wird.
Protein Kinasen. Das PSP kann eine Proteinkinase wie beispielsweise FUS1, KSS1, STE11 oder STE7-Proteine sein, die an der zellulären Reaktion auf Pheromone teilhaben. Das PSP- Surrogat würde beispielsweise eine Säugetier Mitogenaktivierte Proteinkinase sein. Hefezellen, die gentechnisch verändert wurden, so daß sie Surrogat-Proteinkinase exprimieren, könnten dazu verwendet werden, auf Aktivatoren oder Inhibitoren hiervon zu screenen.
Cycline. Das PSP kann ein Cyclin, wie beispielsweise CLN1, CLN2 oder CLN3 sein. Die Cycline regulieren das Fortschreiten der Zellen durch den Zellzyklus. Die menschlichen C, D1 und E-Cycline sind dazu in der Lage, die CLN-Proteine der Hefe funktionell zu ersetzen. Die Inhibitoren der Säugetier- Cycline können in der Krebs-Chemotherapie brauchbar sein. Hefezellen, die zum Exprimieren eines Surrogat-Cyclins gentechnisch verändert wurden, können dazu verwendet werden, Moleküle zu identifizieren, die dessen Aktivität hemmen (oder steigern).

Peptid-Banken

Während Andere Hefezellen gentechnisch verändert haben, um das Screenen von exogenen Arzneistoffen als Rezeptor- Agonisten und -Antagonisten zu erleichtern, erzeugten die Zellen selbst weder die Arzneistoffe noch die Rezeptoren. Hefezellen, die gentechnisch verändert wurden, um den Rezeptor zu produzieren, die jedoch die Arzneistoffe selbst nicht produzieren, sind nicht effizient. Um diese zu nutzen, muß man eine ausreichende Konzentration jedes Arzneistoffs mit einer Anzahl von Zellen in Berührung bringen, um nachzuweisen, ob der Arzneistoff eine Wirkung aufweist oder nicht. Deswegen muß eine Mikrotiterplatte oder ein Teströhrchen für jeden Arzneistoff verwendet werden. Der Arzneistoff muß im voraus synthetisiert und ausreichend rein sein, um dessen Wirksamkeit beziehungsweise Wirkung auf Hefezellen zu beurteilen. Wenn die Hefezelle den Arzneistoff produziert, ist die wirksame Konzentration höher.
In der vorliegenden Erfindung erzeugen die Hefezellen kollektiv eine "Peptid-Bank", die vorzugsweise zumindest 10&sup7; unterschiedliche Peptide einschließt, so daß vielfältige beziehungsweise verschiedene Peptide gleichzeitig bezüglich des Vermögens untersucht werden können, mit dem PSP-Surrogat in Wechselwirkung zu treten.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden zumindest einige Peptide der Peptid-Bank in das Periplasma sezerniert, wo sie mit der (den) "extrazellulären" Bindungsstelle (n) eines exogenen Rezeptors interagieren können. Sie ahmen somit die klinische Wechselwirkung von Arzneistoffen mit zellulären Rezeptoren genauer nach. Diese Ausführungsform kann wahlweise weiter verbessert werden (in Assays, die eine Pheromon-Sekretion nicht erfordern), indem die Pheromon- Sekretion verhindert wird und in dem dadurch eine Konkurrenz zwischen dem Peptid und dem Pheromon für eine Signalpeptidase und andere Bestandteile des Sekretionssystems vermieden wird.

Nachweis der Signalübertragung

Hefezellen können ebenfalls gentechnisch verändert werden, so daß deren Pheromonsignal-Übertragungswege einen einfacher nachweisbaren Beweis der Wirksamkeit eines verdächtigten Arzneistoffes bereit stellen. In diesen Ausführungsformen muß der Arzneistoff kein Peptid sein, das durch die selbe Hefezelle erzeugt wird oder muß überhaupt kein Peptid sein.
Wie vorher erwähnt, ist eine der Konsequenzen der Aktivierung des Pheromonsignal-Weges in Wildtyp-Hefe ein Wachstumsstop. Wenn man auf einen Antagonisten eines G-Protein-gebundenen Rezeptors oder auf andere Pheromon-Systemproteine testet, kann diese normale Reaktion des Wachstumsstops dazu verwendet werden, Zellen zu selektieren, bei denen der Pheromon- Reaktionsweg gehemmt wird. Das heißt, daß Zellen die gegenüber sowohl einem bekannten Agonisten als auch einem Peptid mit unbekannter Aktivität ausgesetzt werden, in ihrem Wachstum angehalten werden, wenn das Peptid neutral oder ein Agonist ist, werden jedoch normal wachsen, wenn das Peptid ein Antagonist ist. Somit kann die Reaktion des Wachstumsstops in vorteilhafter Weise verwendet werden, um Peptide zu entdecken, die als Agonisten dienen.
Wenn man jedoch nach Peptiden sucht, die als Agonisten von G- Protein-gebundenen Rezeptoren oder anderen Pheromonsystem- Proteinen dienen, ist der Wachstumsstop, der der Aktivierung des Pheromonreaktions-Weges folgt, aus diesem Grund eine unerwünschte Wirkung: Zellen, die Peptid-Agonisten binden, stoppen das Wachstum, während umgebende Zellen, die nicht Peptide binden, fortfahren werden, zu wachsen. Die interessierenden Zellen werden dann überwuchert oder deren Nachweis durch die Zellen im Hintergrund undeutlich, was die Identifizierung der interessierenden Zellen durcheinanderbringt. Um dieses Problem zu überwinden lehrt die vorliegende Erfindung eine gentechnische Veränderung der Zelle derartig, daß: 1.) Ein Wachstumsstopp nicht als Folge der Aktivierung des Pheromonsignal-Weges eintritt (beispielsweise durch Inaktivierung des FAR1-Gens) und/oder 2.) Ein selektiver Wachstums-Vorteil wird durch Aktivierung des Weges verliehen wird (beispielsweise durch Transformieren einer auxotrophen Mutante mit einem HIS3-Gen unter der Kontrolle eines Pheromon-responsiven Promotors und unter Anwendung von selektiven Bedingungen).
Es ist natürlich wünschenswert, daß der exogene Rezeptor (oder ein anderes PSP-Surrogat) den Peptiden auf kontinuierlicher Basis ausgesetzt wird. Dies hat jedoch wahrscheinlich eine Desensibilisierung des Pheromon-Weges gegenüber dem Stimulus zur Folge. Eine Desensibilisierung kann vermieden werden, indem das SST2-Gen mutiert wird (was auch die Deletion einschließen kann), so daß es nicht länger ein funktionelles Protein produziert, und/oder in dem andere Gene mutiert werden, die zur Desensibilisierung beitragen können, beispielsweise BAR1 im Falle von a-Zellen und SVG1 für entweder a oder α-Zellen.
Wenn der endogene Pheromonrezeptor (oder anderes zugehöriges PSP) durch die Hefezelle erzeugt wird, wird der Test nicht dazu in der Lage sein, zwischen Peptiden, die mit dem Pheromonrezeptor interagieren (oder anderen Verwandten PSP) und denjenigen zu unterscheiden, die mit dem exogenen Rezeptor (oder einem anderen PSP-Surrogat) interagieren. Es ist deswegen wünschenswert, daß das endogene Gen deletiert oder in anderer Weise unfunktionell gemacht wird.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1. Grundzüge der aufeinander folgenden Stadien bzw. Stufen in der Entwicklung vom autokrinen Hefe-Systemen.
Ein Grundriß der normalen Synthese und der Freisetzung von Paarungspheromonen ist links von Tigla dargestellt. Zwei Gene, nämlich MFα1 und MFα2 kodieren Vorläuferproteine (MFα1p und MFα2p), die vier beziehungsweise zwei Wiederholungen des Tridecapeptids enthalten, das den reifen α-Faktor repräsentiert. Diese Vorläufer werden proteolytisch in einer Reihe von enzymatischen Reaktionen verarbeitet, die mit der Abspaltung der Signalsequenz im endoplasmatischen Reticulum beginnen und sowohl die Glykosylierung des Leader-Peptids als auch die Abspaltung durch die Proteasen KEX2p, STE13p und KEX1P einschließen. Das Ergebnis ist die Sekretion von reifem α- Faktor, der nach Bindung an STE2p, das normalerweise auf der Oberfläche von a-Zellen exprimiert wird, eine Anzahl von Veränderungen in den a-Zellen hervorruft, einschließlich eines Wachstumsstopps. Die a-Zellen wiederum exprimieren zwei Gene, nämlich MFa1 und MFa2, die Vorläufer (MFa1p und MFa2p) für den a-Faktor, wie rechts in Fig. 1 dargestellt, kodieren. Diese Vorläufer werden durch RAM1 und RAM2 einer Farnesylierung, einem proteolytischen Trimming der C-terminalen drei Aminosäuren (durch ein Protein, das vorläufig als RAM3p identifiziert wurde), Carboxymethylierung des neu exponierten C- terminalen Cysteins durch STE14p und endoproteolytische Entfernung der N-terminalen Leader-Sequenz durch eine Aktivität unterworfen, die vorzugsweise als STE19p identifiziert wird. Nach Export des reifen a-Faktors aus der Zelle über STE6p bindet dieser an STE3p, das auf der Oberfläche von a-Zellen exprimiert wird und stoppt deren Wachstum.
Stadium 1 beziehungsweise Stufe 1, die in Fig. 1b dargestellt ist, schließt die Entwicklung von Hefe-Stämmen ein, bei denen SST2, FAR1 und HIS3 inaktiviert sind und bei denen ein geeignetes Reporterkonstrukt wie fus1::HIS3 in die Genome sowohl von α- als auch a-Zellen integriert ist, α-Zellen werden weiterhin durch Ersetzen des normalerweise exprimierten STE3p durch STE2p verändert, wohingegen a-Zellen weiter durch Ersetzen des normalerweise exprimierten STE2p durch STE3p modifiziert sind. Die sich ergebenden Stämme sollten auf Histidin-defizienten Medien in Abwesenheit von exogenem Pheromon ein Wachstum zeigen.
Stadium 2, dargestellt in Fig. 1c schließt zuerst die Inaktivierung von MFα1 und MFα2 in Zellen und die Inaktivierung von MFa1 und MFa2 in a-Zellen, die in Stadium 1 entwickelt wurden, ein. Diese Modifikationen haben Stämme zur Folge, die bezüglich Histidin auxotroph sind. Als nächstes wird das geeignete Expressionsplasmid eingeführt werden: Das Expressionsplasmid pADC-MF (siehe Fig. 4), das ein Oligonukleotid enthält, das den α-Faktor kodiert, sollte auf α-Zellen die Fähigkeit übertragen, auf Histidin-defizienten Medien zu wachsen; die Expression des Plasmids pADC-MFa (siehe Fig. 6), die ein Oligonukleotid enthält, das einen α-Faktor enthält, sollte a-Zellen in die Lage versetzen, auf Histidindefizienten Medien zu wachsen.
Stadium 3, dargestellt in Fig. 1d verwendet die Zellen, die in Stadium 2 entwickelt wurden, zur Einführung von Expressionsplasmiden. Anstatt Plasmide zu verwenden, die Oligonukleotide enthalten, die genuines Pheromon kodieren, wird die Hefe jedoch mit Expressionsplasmiden transformiert werden, die zufällige oder halb-zufällige Oligonukleotide enthalten. Transformanten, die auf Histidin-defizienten Medien wachsen, werden expandiert und ihre Plasmide isoliert, um das eingefügte Oligonukleotid zu sequenzieren.
Fig. 2. Diagramm des zur Mutagenese von MFα1 verwendeten Plasmids. Ein 1,8 kb EcoRI-Bruchstück, das MFα1 enthält, wird in die EcoRI-Stelle von pALTER cloniert, derartig, daß einsträngige DNA, die den MFα1 Minus-Strang enthält, synthetisiert werden kann. Das Diagramm veranschaulicht die unterschiedlichen Regionen von MFα1, die Promotor-, Transkriptionsterminator und unterschiedliche Domänen des Vorläuferproteins einschließen: das Signalpeptid, das Propeptid, die vier Wiederholungen des reifen α-Faktors und die drei Spacer, die diese Wiederholungen trennen. Über dem Blockdiagramm der Regionen von MFα1 befinden sich die Aminosäuresequenzen des Signalpeptids und des Propeptids; darunter sind diejenigen der Pheromon-Wiederholungen und der Spacer dargestellt. Die Stellen der proteolytischen Verarbeitung des Vorläufer-Proteins sind durch Pfeile gekennzeichnet, wobei jede proteolytische Aktivität durch einen unterschiedlichen Pfeil dargestellt ist, wie es in der Figur angezeigt wird.
Fig. 3. Diagramm des Plasmids, das bei der Herstellung beziehungsweise Konstruktion der MFα Expressionskassette verwendet wird. pAAH5 enthält den ADC1-Promotor, der dazu verwendet werden wird, die Expression synthetischer Oligonukleotide anzutreiben, die in die MFα Expressionskassette eingefügt wurde. Das 1,5 kb BamHI oder HindIII-Bruchstück, das den ADC1-Promotor enthält, wird in pRS426 kloniert werden, ein Plasmid, das als high-copy Episom in der Hefe dient, um pRS- ADC zu erhalten. pRS-ADC wird der Empfänger von MFα1- Sequenzen sein, die wie folgt mutiert wurden: Die Region von MFα1, die reifen α-Faktor kodiert, wird durch Restriktionsstellen ersetzt werden, die Oligonukleotide mit AflII und BglII-Enden akzeptieren. Die Einfügung der Oligonukleotide mit AflII und BglII-Enden werden zu einem Plasmid führen, das ein Protein kodiert, das das MFα1-Signal und die Leader- Sequenzen stromaufwärts der Sequenzen enthält, die durch das Oligonukleotid kodiert sind. Das MFα1-Signal und die Leadersequenzen sollten die Verarbeitung beziehungsweise das Prozessieren dieses Vorläuferproteines durch den Weg lenken, der normalerweise zur Sekretion von reifen α-Faktor verwendet wird.
Fig. 4. Diagramm von Konstrukten, die zur Expression von Zufalls-Oligonukleotiden im Zusammenhang von MFα1 verwendet werden. Oligonukleotide, die eine Region von 39 zufälligen Basenpaaren (dargestellt im Oberteil der Figur) enthalten, werden in die AflII und BglII-Stellen der MFα1- Expressionskassette kloniert werden. Diese Oligonukleotide kodieren die sechs Aminosäuren, die unmittelbar N-terminal zur ersten Wiederholung des α-Faktors in MFα1 angeordnet sind, anschließend gefolgt von einem Tridecapeptid einer zufälligen Sequenz und von einem Stoppcodon. Hefe, die mit diesem Konstrukten transformiert wurde und bezüglich ihrer Fähigkeit selektiert wurde, auf Medien zu wachsen, die Uracil- defizient sind, verwenden den ADC1-Promotor, um ein Protein zu exprimieren, das aus der MFα1-Leadersequenz (sowohl Prä- als auch Propeptide) gefolgt von 13 zufälligen Aminosäuren besteht. Eine Verarbeitung der Leader-Sequenzen hat die Sekretion des Tridecapeptids zur Folge.
Fig. 5. Diagramm des zur Mutagenese von MFa1 verwendeten Plasmids. Eine 1,6 kb BamHI Bruchstück, das MFa1 enthält, wird in die BamHI-Stelle von pALTER kloniert, so daß einsträngige DNA, die den MFa1-Minus-Strang enthält, synthetisiert werden kann. Das Diagramm veranschaulicht die unterschiedlichen Regionen von MFa1, die den Promotor, den Transkriptionsterminator und unterschiedliche Domänen des Vorläuferproteins einschließen: das Leader-Peptid; das Dodecapetid, das den Peptid-Bestandteil von reifen a-Faktor repräsentiert und dessen C-terminales Cystein während der Verarbeitung farnesyliert und carboxymethyliert wird; und die C- terminalen drei Aminosäuren, die während der Verarbeitung des Vorläufers entfernt werden. Oberhalb des Blockdiagramms der Regionen von MFa1 ist die Aminosäuresequenz des primären Translationsproduktes angegeben.
Fig. 6. Diagramm von Konstrukten, die zur Expression von zufälligen Oligonukleotiden im Kontext von MFa1 verwendet werden. Oligonukleotide, die eine Region von 33 zufälligen Basenpaaren enthielten (dargestellt oben in der Figur) werden in die XhoI und AFlII-Stellen der MFa1-Expressionskassette kloniert. Diese Oligonukleotide kodieren die sieben Aminosäuren, die zur ersten Aminosäure des reifen a-Faktor unmittelbar N-terminal gelegen sind, gefolgt von einem Monodecapeptid einer zufälligen Sequenz, einem Cystein, das während der Verarbeitung des Vorläufers farnesyliert und carboxymethyliert wird, drei Aminosäuren (VIA), die während der Verarbeitung proteolytisch entfernt werden und einem Stoppkodon. Hefe, die mit diesen Konstrukten transformiert und bezüglich ihres Vermögens auf einem Uracil-defizienten Medium zu wachsen ausgewählt ist, wird den ADC1-Promotor verwenden, um ein Vorläuferprotein zu exprimieren, das aus der MFa1-Leader-Sequenz gefolgt von 11 zufälligen Aminosäuren und einem C-terminalen Tetrapeptid CVIA besteht. Die Verarbeitung dieses Vorläufers hat die Sekretion eines C-terminal farnesylierten carboxymethylierten Dodecapeptids zur Folge, das aus 11 zufälligen Aminosäuren und einem C-terminalen Cystein besteht.
Fig. 7. Der autokrine Mata-Stamm sezerniert und reagiert auf die Signalgebung durch einen α-Faktor.
Ein synthetisches Oligonukleotid, das das Hefe-α-Pheromon kodiert, wurde in Mata-Zellen exprimiert. Diese Zellen exprimieren normalerweise das a-Faktor-Pheromon, es wurde jedoch dies durch Deletion des endogenen a-Faktor-kodierenden Genes verhindert. Die Expression und Freisetzung von α-Faktor durch diese Zellen macht diese "autokrin" bezüglich der Pheromon-Signalgebung. Das Peptid, das den reifen a-Faktor enthält, wurde innerhalb dieser Zellen für den Transport durch den Hefesekretionsweg an die extrazelluläre Umgebung verarbeitet. Der Signalstoff-Stoffwechsel beziehungsweise Signalling durch Pheromon im Stamm-Hintergrund, der bei diesen Experimenten verwendet wurde, hatte ein Wachstum von responsiven Zellen auf Medien zufolge, die Histidin-defizient waren, dargestellt in Fig. 7a. Das Hintergrundwachstum von Kontrollzellen, die α-Faktor nicht exprimieren, wird durch zunehmende Konzentrationen des HIS3-Inhibitors, nämlich Aminotriazol, verhindert, wie in den Fig. 7b, 7c und 7d dargestellt ist.
Fig. 8. Der autokrine Mata-Stamm sezerniert und reagiert auf Signalstoff-Stoffwechsel durch a-Faktor.
Der Hefe a-Faktor wurde aus einem Plasmid exprimiert, das ein synthetisches, Pheromon-kodierendes Oligonukleotid in Mata- Zellen enthielt. Die in diesen Experimenten verwendete Hefe wurde durch Ersetzen des normalerweise exprimierten Ste2- Proteins durch den Rezeptor für a-Faktor, nämlich Ste3, "autokrin" gemacht. Das a-Faktor Peptid wurde in diesen Zellen verarbeitet und durch das endogene Ste6-Protein, ein ATP- abhängiger Transmembran-Transporter, an die extrazelluläre Umgebung transportiert. Die Phermon-Signalgebung, die durch den durch diese Zellen freigesetzten a-Faktor gestartet wurde, wenn er an Ste3 gebunden wurde, wird durch das Wachstum der Zellen auf Histidin-defizienten Medien angezeigt, was in Fig. 8 dargestellt ist. Das Hintergrundwachstum von Kontrollzellen, die nicht zur Expression von a-Faktor in der Lage sind (diese α-Zellen weisen das Plasmid nicht auf, das das Pheromon kodiert) wird durch zunehmende Konzentrationen des HIS3-Inhibitors, nämlich Aminotriazol, verhindert, dargestellt in den Fig. 8b, 8c und 8d.
Fig. 9. Plasmid pYMA177, das mutiertes menschliches MDR1 enthält (G185 V Mutation).
Das Plasmid pYMA177 wurde von Karl Kuchler konstruiert und erlaubt die gleichzeitige Überexpression von sowohl einem mutierten menschlichen Mdr1-Protein als auch des Hefe a-Faktor- Pheromon-Vorläufer (Kuchler & Thorner, Proc. Natl. Acad. Sci. 89, 2302 (1992).

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die vorliegende Erfindung betrachtet die Untersuchung von Peptiden, insbesondere wenn sie in Peptid-Banken vorliegen, die in gentechnisch veränderten Hefezellen exprimiert werden, bezüglich der Fähigkeit der Peptide, mit Proteinen des Pheromonsystems und PSP-Surrogaten, die von diesen Hefe-Zellen erzeugt werden, in Wechselwirkung zu treten.
Für den Zweck dieser Erfindung ist ein "exogenes" Protein eines, das sich in seiner Aminosäuresequenz ausreichend von den Proteinen unterscheidet, die natürlicherweise durch die fragliche Hefezelle erzeugt werden, so daß dessen engstes Verwandtes ein Protein ist, das von einer anderen Zelle als einer Hefezelle erzeugt wird. Die Zelle, die dieses verwandte Protein produziert, kann eine mikrobielle Zelle (eine andere als eine Hefezelle), eine Pflanzenzelle oder eine Tierzelle sein. Wenn sie eine Tierzelle ist, kann sie von einem wirbellosen Tier (beispielsweise Insekt oder Nematode) oder von einem Wirbeltier (beispielsweise Vogel, Fisch oder Säugetier, insbesondere Mensch) abstammen. Ein Protein wird beispielsweise als menschlichen Ursprungs betrachtet, unabhängig davon, ob es von einem Chromosom eines normalen Menschen oder vom Genom eines Virus kodiert wird, der menschliche Zellen infiziert und sich in diesem repliziert.
Ein "Aktivator" eines Phermonsystem-Proteinsurrogats ist eine Substanz, die in einer geigneten Hefezelle verursacht, daß das Pheromonsystem Protein-Surrogat aktiver beziehungsweise wirksamer wird und dabei das durch den angeborenen oder modifizierten Pheromonsignal-Weg übertragene Signal der Zelle in einem nachweisbaren Grad erhöht. Das Surrogat kann anfänglich nicht funktionell sein, kann jedoch als Folge der Wirkung des Aktivators funktionell gemacht werden oder es kann funktionell sein und die Wirkung des Aktivators ist es, die Aktivität des Surrogats zu erhöhen. Die Aktivierungsweise des Aktivators kann direkt sein, beispielsweise durch Bindung des Surrogats, oder indirekt, beispielsweise durch Bindung eines anderen Moleküls, das in anderer Weise mit dem Surrogat in Wechselwirkung tritt. Wenn das PSP-Surrogat ein Ersatzstoff für einen Pheromon-Rezeptor darstellt und der Aktivator die Stelle des Pheromons einnimmt, ist es üblich, den Aktivator als einen Agonisten des Rezeptors zu bezeichnen.
Im Gegensatz hierzu ist ein "Inhibitor" eines Pheromonsystem- Proteinsurrogats eine Substanz, die in einer geeigneten Hefezelle verursacht, daß das PSP-Surrogat weniger aktiv wird und dadurch das übertragene Signal in einem nachweisbaren Ausmaß reduziert. Die Reduktion kann vollständig oder teilweise erfolgen. Wenn das PSP-Surrogat ein Ersatzstoff für einen Pheromon-Rezeptor ist und der Inhibitor mit dem Pheromon um die Bindung an den Rezeptor konkurriert, ist es üblich, daß der Inhibitor als ein "Antagonist" bezeichnet wird.
Der Begriff "Modulator" schließt sowohl "Aktivatoren" als auch "Inhibitoren" ein.
Ein Surrogat-PSP Protein ist zu einem Hefeprotein "funktionell homolog", wenn es entweder alleine oder nach Modifizierung durch einen Arzneistoff dazu in der Lage ist, die Funktion des Hefe-PSP oder eine analoge Funktion innerhalb der gentechnisch veränderten Hefe-Zelle durchzuführen. Es ist nicht notwendig, daß sie genauso effizient wie das Hefe- Protein arbeitet, es ist jedoch wünschenswert, daß sie zumindest 10% von zumindest einer der Pheromonsystem-bezogenen Aktivitäten des Hefe-Proteins aufweist. Es ist desgleichen nicht notwendig, daß es dasselbe Wirtsspektrum wie das Hefe- Protein aufweist, beispielsweise wenn es ein Rezeptor ist kann es auf vollkommen unterschiedliche Liganden reagieren, als es der endogene Rezeptor tut oder kann auf einige gemeinsame Liganden reagieren und auf einige Neue. Die Rezeptoren von Tabelle 2 werden als funktionell homolog mit den Hefe- Pheromon-Rezeptoren betrachtet, selbst wenn sie nicht auf Hefe-Pheromone reagieren und können nicht an die unmodifizierten endogenen G-Proteine binden, obwohl sie G Proteingebundene Rezeptoren sind. Dies wird als eine "analoge" Funktion betrachtet.
Das PSP-Surrogat kann ein Protein sein, das durch einen Arzneistoff in gewisser Weise modifiziert werden muß, um funktionell zu sein. Beispielsweise könnte der Arzneistoff eine allosterische Veränderung der Konformation des PSP-Surrogats verursachen oder könnte einen Anteil des Surrogat abspalten, wobei der Rest des Proteins dann ein funktionelles Molekül darstellt.
Das PSP-Surrogat kann ebenfalls eines sein, das nur funktionell ist, wenn andere Modifikationen in der Hefezelle vorgenommen werden, beispielsweise Expression einer chimären G α- Untereinheit, um mit einem exogenen G-Protein gekoppelten Rezeptor in Wechselwirkung zu treten.
Der Begriff "im wesentlichen homolog" bedeutet, wenn er in Verbindung mit den Aminosäuresequenzen verwendet wird, Sequenzen, die bezüglich der Sequenz im wesentlichen identisch oder ähnlich sind, wodurch eine Homologie in der Konformation entsteht und somit eine ähnliche biologische Aktivität. Der Begriff soll nicht eine übliche Evolution der Sequenzen implementieren.
Typischerweise sind "im wesentlichen homologe" Sequenzen zu zumindest 50%, bevorzugter zu zumindest 80% in ihrer Sequenz identisch und zwar zumindest über jede Region, von der bekannt ist, daß sie in die erwünschte Aktivität involviert ist. Am meisten bevorzugt sind nicht mehr als fünf Reste, anderen als denen an den Termini, unterschiedlich. Vorzugsweise liegt die Sequenzabweichung zumindest in den vorher erwähnten Regionen in Form von "konservativen Modifikationen" vor.
"Konservative Modifikationen" werden als
(a) konservative Substitutionen von Aminosäuren, wie hierin nachstehend definiert; und
(b) einfache oder mehrfache Insertionen oder Deletionen von Aminosäuren an den Termini an Zwischendomän-Grenzen in Schleifen bzw. loops oder anderen Segmenten einer relativ hohen Mobilität, definiert.
Vorzugsweise werden außer an den Termini beziehungsweise Enden nicht mehr als ungefähr fünf Aminosäuren an einem speziellen Ort eingefügt oder deletiert und die Modifikationen liegen außerhalb von Bereichen von denen bekannt ist, daß sie für die Aktivität wichtige Bindungsstellen enthalten.
Konservative Substitutionen sind hierin definiert als Austausch innerhalb einer der folgenden fünf Gruppen:
1. Kleine aliphatische, unpolare oder schwach polare Reste:
Ala, Ser, Thr (Pro, Gly)
II. Polare, negativ geladene Reste: und deren Amide:
Asp, Asn, Glu, Gln
III. Polare, positiv geladene Rest:
His, Arg, Lys
IV. große, aliphatische, unpolare Reste:
Met, Leu, Ile, Val (Cys)
V. große, aromatische Reste:
Phe, Tyr, Trp
Die Reste Pro, Gly und Cys sind in Klammern gesetzt, weil sie eine spezielle konformationale Rolle aufweisen. Cys hat an der Bildung von Disulfid-Bindungen teil. Gly verleiht der Kette Flexibilität. Pro verleiht der Kette Starrheit und unterbricht α-Helizes. Diese Reste können in bestimmten Regionen des Peptids essentiell sein, sind jedoch an anderer Stelle ersetzbar.
Zwei regulatorische DNA-Sequenzen (beispielsweise Promotoren) sind "im wesentlichen homolog", wenn sie im wesentlichen diese regulatorische Wirkung als Folge einer beträchtlichen Identität der Nukleotid-Sequenz aufweisen. Typischerweise sind "im wesentlichen homologe" Sequenzen zumindest 50%, bevorzugt zumindest 80% zumindest in Regionen identisch, von denen bekannt ist, daß sie in die erwünschte Regulation involviert sind. Am meisten bevorzugt sind nicht mehr als fünf Basen unterschiedlich.
Der Begriff "autokrine Zelle" wird hierin verwendet, betrifft eine Zelle, die eine Substanz produziert, die den Pheromonsystem-Weg der Zelle stimuliert. Wildtyp α- und a-Zellen sind nicht autokrin. Jedoch ist eine Hefezelle, die sowohl den α-Faktor als auch α-Faktorrezeptor oder sowohl a-Faktor als auch a-Faktorrezeptor in funktioneller Form produziert, autokrin. Darüber hinaus werden Hefezellen, die α-Peptid produzieren, den Pheromon-Systemweg aktivieren (beispielsweise durch Aktivieren eines G-Protein-gebundenen Rezeptors), als "autokrine Zellen" bezeichnet, obwohl es genauer sein könnte, sie "vermeintliche autokrine Zellen" zu nennen. Selbstverständlich ist es in einer Bank derartiger Zellen, in denen eine Vielzahl unterschiedlicher Peptide hergestellt werden, wahrscheinlich, daß eine oder mehrere der Zellen "autokrin" in der genaueren Bedeutung des Begriffes sein werden.

Farnesyltransferasen

Die Aktivität des Hefe a-Faktors erfordert dessen Farnesyllerung (vermittelt durch Protein-Farnesyltransferase, die Ram1p und Ram2p umfaßt), proteolytische Spaltung der C-terminalen drei Aminosäuren des primären Translationsproduktes (vermittelt von einem bis jetzt nicht erkannten Enzym) und Carboxymethylierung des C-terminalen Cysteins (vermittelt durch Ste14p). Die Hefe- und Säugetierfarnesyltransferasen sind strukturell und funktionell ähnlich (Gomez R et al., Biochem. J. 289:25-31, 1993; Kohl NE et al., J. Biol. Chem. 266:18884- 8, 1991). Sequenzhomologien existieren zwischen den Genen, die die α- und β-Untereinheiten der Hefe-Farnesyltransferase (RAM2 beziehungsweise RAM1) kodieren und den Genen, die die α- und β-Untereinheiten der Säugetierfarnesyltransferase kodieren (Kohl NE et al., J. Biol. Chem. 266:18884-8, 1991; Chen WJ et al., Cell 66:327-334, 1991). Es wurde beobachtet, daß die β-Untereinheit von Säugetierfarnesyltransferase und Ram1p bezüglich ihrer Aminosäuresequenz zu 37% identisch sind (Chen WJ et al., Cell 66:327-334, 1991).
Die Bedeutung eines Screenings nach Inhibitoren der Farnesyltransferase ist durch die Tatsache nahegelegt, daß Säugetier p21ras, ein preeminenter Regulator des Wachstums und der Differenzierung von Säugetierzellen, der in einer Vielzahl von Krebsarten involviert ist, ein Substrat für die Farnesyltransferase ist und daß die Farnesylierung von p21ras für dessen Aktivität erforderlich ist. Es wurde tatsächlich gezeigt, daß ein synthetischer organischer Inhibitor der Farnesylprotein-transferase selektiv die ras-abhängige Zelltransformation hemmt (Kohl et al., Science 260, 1934 (1993). Von den beiden Untereinheiten der Farnesyltransferase ist die β- Untereinheit ein attraktiveres Ziel für Inhibitoren, weil sie offensichtlich in die Farnesylierung involviert ist. Die α- Untereinheit wird im Gegensatz hierzu von Geranylgeranyltransferase I geteilt, einem Enzym, das in die Modifikation der Gγ-Untereinheiten heterodimerer G-Proteine und von G- Proteinen mit kleinem Molekulargewicht der Rho/Rac-Familie involviert ist. Während die β-Untereinheit in die Farnesylierung involviert ist, weist die Säugetierfarnesyltransferase eine Vielzahl von Substraten zusätzlich zu p21ras auf. Die Wirkung von Inhibitoren der β-Untereinheit auf die Farnesylierung dieser anderen Substrate, beispielsweise Lamin- Proteine, Transducin-γ und Rhodopsin-Kinase, werden in der Entwicklung und Verwendung potentieller Farnesyltransferase- Inhibitoren berücksichtigt.
Es wurde bis jetzt nicht gezeigt, daß ein homologes Säugetier-Gen Hefe Ram1p funktionell ersetzen wird, dies kann jedoch formal unter Verwendung von ram1-Mutanten und eines Vektors getestet werden, der das Säugetiergen-exprimiert, das die β-Untereinheit der Farnesyltransferase kodiert. Wenn die Säugetier β-Untereinheit anstelle von Ram1p funktionieren kann, werden die Testzellen beide lebensfähig sein (als Folge der Farnesylierung von Ras) und werden für die Paarung geeignet sein (als Folge der Farnesylierung des a-Faktors).
Wenn das Säugetiergen, das die β-Untereinheit der Farnesyltransferase kodiert, ram1 komplementiert, würde die Hefe ein Testsystem zur Entdeckung potentieller Inhibitoren der Säugetier-Farnesyltransferase bereitstellen. Insbesondere könnten MATa Hefe-Testerzellen genutzt werden die: 1. Das Gen für die β-Untereinheit der Säugetier-Farnesyltransferase anstelle von RAM 1 tragen; 2. Die Cam-Mutation tragen, die die Stämme gegenüber einem Verlust der Ras-Funktion in Gegenwart von cAMP resistent macht; 3. Die auf a-Faktor reagieren, den sie mittels der heterologen Expression von Ste3p exportieren; 4. Die auf autokrinen a-Faktor derartig reagieren, daß sie auf Medien, die Galaktose enthalten, nicht wachsen können. Die letztere Eigenschaft erfordert die Expression von GAL1 unter der Kontrolle eine Pheromon-responsiven Promotors und Zellen, die so gentechnisch verändert wurden, daß sie mutierte GAL7 oder GAL10-Gene enthalten. Die Expression von GAL1 ist in Gegenwart von Galaktose in Stämmen toxisch, die Mutationen entweder in GAL7 oder GAL10-Genen enthalten. Der Signalstoff-Stoffwechsel durch den Pheromon-Reaktionsweg würde so gentechnisch veränderte Zellen Galaktose-empfindlich machen. Die Exposition derartiger Stämme gegenüber Verbindungen, die die β-Untereinheit der Farnesyltransferase hemmen, wird diesen Zellen die Fähigkeit verleihen, auf Medien zu wachsen, die Galaktose und cAMP enthalten.
Wenn das Säugetiergen, das die der β-Untereinheit der Farnesyltransferase kodiert (und alle modifizierten Versionen des Gens), ram1 nicht ergänzen kann, können wir Wildtyp Ram1p als ein Surrogat-Ziel für potentielle Effektoren der Säugetier- Farnesyltransferase verwenden. Wir werden insbesondere MATa- Hefestämme als Testerzellen verwenden die: 1. Die Cam- Mutation tragen, die die Stämme gegenüber einem Verlust der RAS Funktion in Gegenwart von cAMP resistent machen; 2. Die auf a-Faktor reagieren, den sie mittels heterologer Expression von Ste3p exportieren; 3. Auf autokrinen a-Faktor reagieren, derartig, daß sie nicht auf Medien wachsen können, die Galaktose enthalten. Eine Exposition derartiger Stämme gegenüber Verbindungen, die die β-Untereinheit der Farnesyltransferase hemmen, wird diesen Zellen die Fähigkeit verleihen, auf Medien zu wachsen, die Galaktose und cAMP enthalten.
In den oben dargelegten Strategien ist es wünschenswert, die Inhibitoren der Farnesyltransferase von Verbindungen zu unterscheiden, die entweder die negative Reaktion auf a-Faktor direkt blockieren, beispielsweise durch Stören der Interaktion des Ste4-Ste18-Komplexes mit dessen Effektor, oder durch Blockieren der Produktion von a-Faktor durch einen Mechanismus, der Farnesyltransferase nicht einschließt. Kontrollen würden derartige falschpositive Ergebnisse identifizieren. Testmittel werden auf einem MATa-Stamm getestet, der so gentechnisch verändert wurde, daß er a-Faktor sezerniert und daß er auf den sezernierten a-Faktor reagiert, indem er auf galaktosehaltigen Medien nicht wächst, wie es in dem oben dargestellten negativen Selektions-Schema dargestellt ist. Der Stamm wird Wildtyp-RamIp exprimieren. Jedes Mittel, das diesen Zellen ermöglicht, auf Medien zu wachsen, die Galaktose und cAMP enthalten, wird nicht als Inhibitor der Farnesyltransferase dienen.
Kandidaten-Verbindungen, die den vorhergehenden Test bestehen, können dienen, indem ein Targeting von Ste14p, Ste6p oder anderen Proteinen durchgeführt wird, die in die Reifung und den Export eines a-Faktors involviert sind, eher als Farnesyltransferase (es sei jedoch angemerkt, daß Verbindungen, die für das Zellüberleben entscheidende Vorgänge starten, keine falschpositiven Ergebnisse entstehen lassen. Weil die für die endoproteolytische Entfernung des C-terminalen Tripeptids des a-Faktor-Vorläufers verantwortliche Protease wahrscheinlich an der Verarbeitung von Gg und Mitgliedern der Rho/Rac-Familienproteine teilnimmt, können Inhibitoren dieser Enzyme beispielsweise nicht das Wachstum der Testerzellen ermöglichen). Von den bei der Herstellung des a-Faktors involvierten Proteinen ist nur die Farnesyltransferase eine Hauptdeterminante der RAS-Funktion. Wegen dieser Wirkung weisen ram1-Mutanten bei 30ºC einen Wachstumsmangel auf und sind bei 37ºC vollkommen unfähig zu wachsen (He B et al., Proc Natl Acad Sci 88:11373-7, 1991). Testerzellen (oben beschrieben) können in Gegenwart eines Test- bzw. Kandidaten- Inhibitors auf galaktosehaltigen Medium ± cAMP gezüchtet werden. Wenn die Testverbindung Farnesyltransferase hemmt werden die Zellen zum Wachstum auf Galaktose + cAMP in der Lage sein, jedoch nicht auf Galaktose bei Fehlen von cAMP. Dieser Unterschied mag bei 37ºC am offensichtlichsten sein. Wenn die Testverbindung andererseits andere Proteine hemmt, die in der a-Faktorproduktion involviert sind, werden die Zellen auf galaktosehaltigen Medium ohne Rücksicht auf Gegenwart oder Fehlen von cAMP wachsen.
Verbindungen, die die obigen Tests bestehen sind wahrscheinliche Inhibitoren der Farnesyltransferase. Dies kann durch direkte in vitro Enzym-Assays bestätigt werden und deren Wirkstärken bestimmt werden. Es sei angemerkt, daß die dargelegten Strategien Farnesyltransferase-Inhibitoren identifizieren, die Ram1p beeinflussen. Mittel, die Ram2p blockieren, würden vermutlich unter keinen Bedingungen wachsen. In der Tat sind ram2-null Mutationen lethal (He B et al., Proc Natl Acad Sci 88:11373-7, 1991), was vielleicht auf die Tatsache zurückzuführen ist, das Ram2p ebenfalls als ein Bestandteil der Geranylgeranyltransferase I dient.

Carboxymethyltransferasen

In der Hefe wird die Methylierung der C-terminalen Aminosäure von a-Faktor, der Ras-Proteine und vermutlich der Rho/Rac- Proteine durch Ste14p katalysiert. Obwohl MATa ste14 Mutanten nicht dazu in der Lage sind zu paaren, was das Erfordernis der Carboxymethylierung für die Aktivität des a-Faktors widerspiegelt, sind die ste14-Störungen nicht lethal und beeinflussen die Geschwindigkeit der Zellproliferation nicht. Die Carboxymethylierung scheint für die Funktion der Ras-Proteine und von Ste18p (das Hefe-Homolog der Gγ-Untereinheit) entbehrlich zu sein. Obwohl die Ras-Funktion in der Hefe offensichtlich das Fehlen einer Carboxymethyl-Modifikation tolerieren kann, ist es nichtsdestoweniger möglich, daß Inhibitoren der Säugetiermethyltransferasen die Aktivität von Säugetier p21ras verändern könnte.
Es könnte bestimmt werden, ob ste14-Mutationen durch das homolge Säugetier-Gen oder einer modifizierten Version hiervon komplementiert werden können. Man würde einen episomalen Vektor dazu verwenden, das Säugetiergen zu exprimieren, das die Methyltransferase in Hefe kodiert, die genotypisch ste14 sind. Der Stamm würde ein modifizierter MATa-Stamm sein, der den a-Faktorrezeptor anstatt des normalen a-Faktorrezeptors exprimiert, und der ein integriertes fus1-HIS3-Konstrukt enthält, so daß der a-Faktor, der von der Zelle sezerniert wird, ein autokrines Wachstum auf Histidin-defizienten Medien verleiht. Wenn die Säugetiermethyltransferase an Stelle von Ste14p funktionieren kann, werden die Testerzellen zur Paarung in der Lage sein. Das heißt, die Säugetier- Methyltransferase ermöglicht die Synthese eines aktiven a- Faktors in ste14-Mutanten.
Wenn das Säugetiergen, das die Methyltransferase kodiert ste14 komplementieren wird, können die Testerstämme so konstruiert werden, daß sie auf potentielle Inhibitoren der Säugetier-Methyltransferase testen. Bei einer Ausführungsform tragen Tester MATa-Hefestämme das Folgende: 1. Sie tragen ein Säugetier-Carboxymethyltransferasegen an Stelle von STE14; 2. Sie reagieren auf einen a-Faktor, den sie mittels heterologer Expression von Ste3p exportieren. 3. Sie reagieren auf autokrinen a-Faktor derartig, daß sie auf Medien, die Galaktose enthalten, nicht wachsen können, wie im negativen GAL1- Selektionsschema oben beschrieben ist. Die Exposition derartiger Stämme gegenüber Verbindungen, die Methyltransferase hemmen, wird diesen Zellen die Fähigkeit verleihen, auf Medien zu wachsen, die Galaktose enthalten.
Es ist wünschenswert, Inhibitoren der Carboxymethyltransferaseaktivität von Verbindungen zu unterscheiden, die entweder die negative Reaktion auf den a-Faktor direkt blockieren, beispielsweise durch Stören der Interaktion des Ste4-Ste18- Komplexes mit dessen Effektor, oder die Produktion von a- Faktor durch einen Mechanismus blockieren, der Methyltransferase nicht einschließt. Die folgenden Kontrollexperimente werden derartige falschpositive Ergebnisse identifizieren. Kandidaten-Inhibitoren werden auf einem MATa-Stamm getestet, der so gentechnisch verändert wurde, daß er a-Faktor sezerniert und so auf den sezernierten a-Faktor reagiert, daß er nicht mehr auf Galaktose-haltigen Medien wächst. Jedes Mittel, das diesen Zellen ermöglicht, auf galaktosehaltigen Medien zu wachsen wird nicht als Inhibitor der Carboxymethyltransferase dienen. Kandidatenverbindungen, die den vorhergehenden Test bestehen, können die Carboxymethyltransferase, Farnesyltransferase, Ste6p oder andere Proteine ins Ziel fassen (Targeting), die in die Reifung und den Export des a-Faktors involviert sind. Um das Ziel der Verbindungen zu unterscheiden kann eine Kombination von biochemischen in vitro und genetischen in vivo-Assays angewendet werden: sowohl die Carboxymethyltransferase als auch die Farnesyltransferase kann in vitro untersucht werden, um die Wirkung des Testmittels zu untersuchen. Wenn das Ziel Ste14p ist, sollte darüber hinaus dessen Überexpression auf high-copy Plasmiden eine Resistenz gegenüber der Wirkung der Verbindung in vivo verleihen.

Proteasen

Der reife Hefe-a-Faktor ist ein dreizehn Aminosäure-Peptid, das von einem Polyprotein-Vorläufer in weitestgehend derselben Weise abgeleitet ist, wie reifes Säugetier Melanozyten- stimulierendes Hormon (melanocyte-stimulating hormone = MSH = Melanotropin) oder Calcitonin von Vorläufer-Polyproteinen abgeleitet sind. Zwei Gene im Hefe-Genom kodieren den Präproa-Faktor MFα1 und MFα2. MFα1 kodiert ein Vorläufer- Polypeptid, das vier Kopien des reifen a-Faktors eingebettet in einem Polypeptid der nachfolgenden Struktur enthält: Hydrophobe Prä-Sequenz/hydrophile Pro-Sequenz/α-Faktor/α- Faktor/α-Faktor/α-Faktor. MFα2 kodiert einen Polyprotein Vorläufer einer ähnlichen Struktur, der nur zwei Kopien eines reifen α-Faktors enthält.
Der Präpro-α-Faktor wird in Cytoplasma synthetisiert und wird dann aus dem Cytoplasma an das endoplasmatische Reticulum und dann an den Golgi-Apparat entlang des klassischen sekretorischen Weges von S. cerevisiae transportiert. Die Signalsequenz des Präpro-α-Faktors wird während des Übergangs in das ER durch Signalpeptidase abgespalten und Asparagin-gebundene Oligosaccharide werden hinzugefügt (im ER) und auf dem Pro-Segment des Vorläufers modifiziert (im Golgi- Apparat), wenn er den sekretorischen Weg beziehungsweise Stoffwechselweg durchläuft. Wenn er sich einmal im Golgi- Apparat befindet treten drei unterschieldiche proteolytische Verarbeitungsereignisse auf. Zuerst spaltet die Kex2-Protease an zweibasigen Resten (-KR-) nahe des Aminoterminus jeder α- Faktor-Wiederholung. Kex2 ist zu den subtilisin-artigen Endoproteasen PC2 und PC1/PC3 homolog, die in die Prohormon- Verarbeitung in Säugetierzellen involviert sind (Smeekens und Steiner 1990; Nakayama et al. 1991). Zusätzliche Säugetier- Kex2-artige Verarbeitungsendoproteasen schließen PACE ein, das aus einem menschlichen Hepatom isoliert wurde, exprimiert in testikulären Keimzellen und PC6, eine Kandidaten-Protease zur Verarbeitung von gastrointestinalen Peptiden (Barr et al., 1991; Nakayama et al. 1992; Nakagawa et al. 1993). Es scheint, daß Kex2-artige Proteine eine große Familie von gewebsspezifischen Endoproteasen in Säugetierzellen umfassen.
Wenn einmal Kex2 die unreifen α-Faktor-Peptide freigesetzt hat dienen zwei zusätzliche Proteasen dazu, die Verarbeitung abzuschließen. Kex1 ist eine spezifische Carboxypeptidase, die das Carboxy-terminale KR entfernt, das nach Spaltung durch Kex2 zurückbleibt. Wie dessen Säugetier-Gegenstücke, die Carboxypeptidasen B und E, ist Kex1 für Peptidsubstrate mit Carboxy-terminalen basischen Resten hochspezifisch. Das endgültige proteolytische Verarbeitungs-Ereignis, das eintritt, ist die Entfernung der Spacer-Dipeptide am Aminoterminus des Pro-α-Faktorpeptids. Dies wird durch das Produkt des STE13-Gens erreicht, nämlich die Dipeptidylaminopeptidase A. Dieses Enzym ist eine Typ IV Dipeptidylaminopeptidase: sie ist dazu in der Lage, an der Carboxyl-Seite entweder der -x-A- oder -x-P- Stellen in vitro zu spalten.
Es wird angenommen, daß andere Typ IV-dipeptidylaminopeptidasen bei der Verarbeitung einer Vielzahl von Prä- Peptiden in Tierzellen wirksam sind (Kreil 1990). Zusätzlich wurde eine funktionelle Ähnlichkeit zwischen Hefe Kex1 und Kex2 und anderen Säugetier-Gegenstücken bewiesen, insofern als beide Hefe-Enzyme endogene Vorläufer proteolytisch spalten, wenn sie in Säugetierzellen exprimiert werden, denen natives Enzym fehlt (Thomas et al. 1988, 1990). Es erscheint dann wahrscheinlich, daß Säugetierhomologe der Hefeproteasen Kex1, Kex2 und Ste13p, wenn sie in der Hefe exprimiert werden, dazu dienen, einen synthetischen α-Faktorpheromon- Vorläufer zu verarbeiten, der geeignete Spaltstellen trägt. Menschliche Proteasen, die so in Hefe funktionieren können, schließen PC2 und PC1/PC3 (oder andere Kex2-Homologe), die Carboxypeptidasen 8 und E (Kex1 Homologe) und Typ IV Dipeptidylaminopeptidasen (Ste13p Homologe), ein.
Hefe würde ein einfaches Assay-System zur Entdeckung von Inhibitoren der Proteasen bereitstellen, die zur Verarbeitung von synthetischem α-Faktor in der Lage sind. Hefe könnte gentechnisch verändert werden, so daß sie sowohl den potentiellen Inhibitor als auch die exogene Protease exprimiert und vorzugsweise nicht den Hefe-Verwandten des Letzteren.
Darüber hinaus kann dieses Mittel zur Ausnutzung der Hefe- Pheromonverarbeitung zum Identifizieren von Protease- Inhibitoren so ausgedehnt werden, daß jede Protease umfaßt ist, die so exprimiert werden kann, daß sie in Hefe funktioniert, vorausgesetzt, daß eine geeignete Spalt-Erkennungsstelle in einem synthetischen α-Faktorvorläufer eingeschlossen wird. Im letzteren Ansatz werden der Hefe neue proteolytische Aktivitäten zugefügt. Diese Enzyme werden Proteasen im α-Faktorreifungs-Weg substituieren, werden jedoch keine "katalytischen Homologe" von Kex1, Kex2 oder Ste13p sein. Die Erzeugung von reifem α-Faktor werden von der Aktivität der neuen Protease durch Entfernung der Erkennungsstelle(n) für ein ausgewähltes Hefe-Enzym aus einem synthetischen MFα-Gen und Einfügung der Erkennungssequenz für die neue Protease(n) abhängen.
Enzyme, für die Inhibitoren über diese Strategie identifiziert werden können, schließen als Beispiel HIV-1 Protease oder andere viral kodierte Proteasen ein, die in die Reifung infektiöser Partikel involviert sind; neutrophile Elastase, von der angenommen wird, daß sie in Lungenkrankheit und entzündliche Darmerkrankung involviert ist; Faktor Xa, der in die Ihrombinverarbeitung und Blutgerinnungsstörungen involviert ist; und CD26, eine Dipeptidylpeptidase IV und vermutlich der zweite Rezeptor für HIV-1 auf CD4&spplus;-Zellen. Zusätzlich würden Metalloproteinasen (beispielsweise Collagenase) und Serin-Proteasen, die in die Gewebsinvasion durch Tumorzellen und in die Metastase involviert sind, geeignete therapeutische Ziele sein. Um dies zu unterstützen wurde dargestellt, daß die Verabreichung von Gewebs-abgeleiteten Inhibitoren der Metalloproteinasen eine verminderte Metastase in Tiermodellen zur Folge hat (Schulz et al. 1988). Collagenasen sind ebenfalls in die Zerstörung von Bindegeweben verwickelt, die entzündliche Prozesse wie rheumatoide Arthritis begleitet.
Die Anwendung der vorliigenden Erfindung zum Screenen nach Modulatoren der Prohormonconvertase PC1 ist in Beispiel 8 beschrieben.

Exogene ABC-Transporter

Die Mehrzahl der Proteine, die für den Transport zur extrazellulären Umgebung bestimmt ist, durchlaufen einen sekretorischen Weg, der den Translationsstart im Cytoplasma, den Transport an das Lumen des endoplasmatischen Reticulums, die Passage durch den Golgi-Apparat zu den sekretorischen Vesiklen und den anschließenden Austritt aus den Zellen einschließt. Andere Proteine verlassen die Zelle durch einen alternativen Mechanismus, der die Vermittlung durch einen "ABC- Transporter" einschließt. Die ABC-Transporter bilden eine Familie von evolutionär konservierten Proteinen, teilen eine ähnliche Gesamtstruktur und funktionieren beim Transport von großen und kleinen Molekülen durch die Zellmembranen (Higgins 1992). Der charakteristische Bestandteil der Mitglieder dieser Proteinfamilie ist eine hochkonservierte Sequenz, die ATP bindet (Higgins et al., 1986, Hyde et al. 1990); diese intrinsischen Membranproteine sind ATPasen, die Energie aus der Hydrolyse dieses Nukleotids gewinnen, um den Transport von Molekülen zu bewirken. Diese Familie schließt über 50 prokaryotische und eukaryotische Proteine ein: Transporter von Aminosäuren, Zucker, Oligosacchariden, Ionen, Schwermetallen, Peptide oder anderen Proteinen gehören zu dieser Superfamilie. Repräsentative Transmembran-Transporter sind in Tabelle 1 enthalten. Typischerweise benutzen ABC-Transporter die Energie der ATP-Hydrolyse, um Substrat durch ein Zellmembran hindurch gegen eine Konzentrations-Gradienten zu pumpen. Einige importieren Substrat, andere exportieren dies. Siehe Higgins, Ann. Rev. Cell. Biol., 8:67-113 (1992).
Die prototypische Struktur eines ABC-Transporters schließt vier membrangebundene Domänen ein: zwei hydrophobe, mutmassliche membrandurchdringende Sequenzen, die jeweils dazu vorgesehen sind, die Membran sechs Mal zu durchdringen und zwei Nukleotid Bindungs-Domänen, die die ATP-Hydrolyse an den Transport koppeln. In Prokaryoten sind die Domänen eines ABC- Transporters oftmals auf getrennten Polypeptiden vorhanden. Verschiedene Permutationen von Domänen-Fusionen wurden beschrieben: der E. coli Eisenhydroxamat-Transporter enthält die beiden Membran-durchdringenden Domänen in einem einzigen Polypeptid und der Ribose-Transporter desselben Organismus trägt zwei Nukleotid-bindende Domänen auf einem Molekül. Der Haupthistokompatibilitätskomplex- (major histocompatibility complex = MHC) Peptid-Transporter ist aus zwei Polypeptiden zusammengesetzt, nämlich Tap1 und Tap2. Der N-terminus jedes Proteins enthält eine hydrophobe, Membrandurchdringende Domäne, wohingegen der C-Terminus eine ATP-bindende Sequenz enthält. Zusammen bilden Tap1 und Tap2 einen funktionellen Komplex. Das Schwermetall Toleranz-Protein HMT1, das in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe exprimiert wird, besteht aus einem Polypeptid, das eine einzige hydrophobe Domäne und eine C-Terminale ATP-bindende Sequenz enthält (Ortiz et al. 1992). Es kann sein, daß der HMT1-Transporter als ein Homodimer funktioniert. Der Saccharomyces cerevisiae Ste6 a- Faktortransporter wird als ein einziges Polypeptid exprimiert, das zwei membrandurchdringende Domänen und zwei nukleotid-bindende Domänen enthält. Wenn Ste6 als zwei Halb- Moleküle exprimiert wird, erhält der protein-Komplex, der sich offensichtlich bildet, eine Funktion auf einem Niveau von mehr als 50% derjenigen des Wildtyp-, Einfach-Polypeptids (Berkower und Michaels 1991). In anderen eukaryotischen ABC- Transportern, einschließlich Mdr1, CFTR und MRP sind die vier Domänen ebenfalls innerhalb eines einzigen Polypeptids enthalten. Somit kann der ABC-Transporter ein einziges Multidomänen-Polypeptid sein oder es kann zwanzig oder mehrere Polypeptide umfassen, die jeweils eine oder mehrere Domänen bereitstellen.
Im allgemeinen enthalten Transporter sechs Transmembran- Segmente pro jeder hydrophoben Domäne für insgesamt zwölf Segmente. Die minimale Anzahl von Transmembran-Segmenten, die zur Bildung eines Translokationskomplexes erforderlich sind, scheint zehn zu sein. Somit fehlt dem Histidintransporter von S. typhimurium ein N-terminales Transmembran-Segment von jeder seiner hydrophoben Domänen und enthält deswegen fünf Transmembransegmente pro Domäne (Higgins et al., Nature 298, 723- 727 (1982). Das MalF-Protein des E. coli maltose Transporters enthält eine N-terminale Verlängerung einer hydrophoben Sequenz, die zwei zusätzliche Transmembran-Segmente trägt, wodurch die Gesamtheit der hydrophoben Domänen auf 8 gebracht wird (Overduin et al. 1988). Die N-terminale Verlängerung kann jedoch ohne Funktionsverlust dieses Transporters deletiert werden (Ehrmann et al. 1990). Obwohl die zur Bildung des funktionellen Translokators erforderliche Anzahl an Sequenzen durch diese Studien nahe gelegt wird, existieren keine Daten über die präzise Struktur der Transmembransegmente selbst. Es wird angenommen, daß diese Sequenzen eine α- helikale Form aufweisen, dies wurde jedoch nicht bewiesen und die Struktur des gesamten Translokationskomplexes innerhalb der Plasmamembran muß erst noch ans Licht gebracht werden.
Um die Lipid-Bilayer zu durchdringen, ist ein Minimum von 20 Aminosäuren erforderlich und Sequenzen, von denen angenommen wird, daß sie Transmembran-Segmente bilden wurden unter Verwendung von Hydrophobizitäts-Skalen identifiziert. Hydrophobizitäts-Skalen ordnen den einzelnen Aminosäure-Resten Werte zu, die den Grad der Hydrophobizität jedes Moleküls anzeigen (Kyte und Doolittle 1982; Englemann et al. 1986). Diese Werte basieren auf experimentellen Daten (Löslichkeits-Maßnahmen von Aminosäuren in verschiedenen Lösungsmitteln, Untersuchung der Seitenketten mit löslichen Proteinen) und basieren auf theoretischen Erwägungen und ermöglichen die Vorhersage der Sekundärstruktur einer neuen Sequenz mit vernünftiger Genauigkeit. Eine Analyse unter Verwendung von Hydrophobizitäts- Messungen zeigt diejenigen Abschnitte einer Proteinsequenz an, die die hydrophoben Eigenschaften aufweisen, die mit einer Transmembran-Helix konsistent sind.
Mit einigen Ausnahmen existiert nur eine geringe oder keine signifikante Aminosäure-Sequenzähnlichkeit zwischen den Transmembran-Domänen von zwei unterschiedlichen Transportern. Dieses Fehlen einer Sequenzähnlichkeit ist nicht mit der offensichtlichen Funktion dieser hydrophoben Domänen inkonsistent. Während diese Reste dazu in der Lage sein müssen, die hydrophoben α-Helikalstrukturen zu bilden, von denen angenommen wird, daß sie die Plasmamembran durchqueren, sind viele Aminosäurereste hydrophob und können zur Bildung einer α- Helix beitragen.
Als bis jetzt nicht nachweisbar wurde eine beträchtliche Sequenzähnlichkeit in Vergleichen der Transmembran-Domänen der Hefe-STE6, menschlichen MDR und E. coli HlyB Hämolysin- Transporter nachgewiesen [Gros et al., Cell 47, 371 (1986); McGrath und Varchavsky, Nature 340, 400 (1989); Kuchler et al., EMBO J. 8, 3973 (1989)]. Andere Sequenzähnlichkeiten können durch Gen-Duplikation erklärt werden, wie im Fall der Transmembran-Domänen von Nagetier P-glycoproteinen (Endicott et al. 1991). Die Transmembrandomäne des Histidin- Transporters von S. typhimurium trägt eine Homologie zu derjenigen des Oktopin Aufnahmesystems von Agrobacterium tumefaciens, wobei die beiden letzten Transporter chemisch ähnliche Substrate translozieren (Valdiva et al. 1991).
Die Untersuchung von mutierten Transportproteinen hat auf eine Rolle der Transmembran-Sequenzen in der Erkennung von Substraten hingewiesen. Somit tragen Maltose-Transporter in E. coli, die die Fähigkeit gewinnen, p-Nitrophenyl-α-maltoside zu translozieren, Mutationen in der Transmembran-Domäne (Reyes et al., 1986). Es hat sich herausgestellt, daß eine Mutation des Transmembransegments 11 von MDR die Substratspezifität dieses Transporters verändert (Gros et al. 1991) und eine Mutation von geladenen Resten in der Transmembrandomäne von CFTR verändert dessen Ionenselektivität (Anderson et al. 1991).
Einige Grundgedanken der Einbeziehung von Extramembran- Loop- beziehungsweise Schleifen-Sequenzen in die Transportfunktion wurden erklärt. In einer Anzahl von Bakterien-Transportern ist ein kurzes konserviertes Motiv auf der cytoplasmatischen Loop vorhanden, die die Transmembransegmente 4 und 5 verbindet [Dassa und Hofnung (1985)]. Es wurde die Hypothese aufgestellt, daß diese Sequenz mit den ATP-bindenden Domänen dieser Transport-Proteine interagiert; eine Mutation dieser konservierten Sequenz wird die Transport-Funktion aufheben (Dassa 1990). Cytoplasmatische Loops können ebenfalls in die Substraterkennung involviert sein. So ähneln die Sequenzen, die den Transmembransegmenten 7 und 12 des Hefe a-Faktor- Transporters folgen, Sequenzen im a-Faktorrezeptor, Ste3p, und können mit dem Pheromon-Substrat interagieren (Kuchler et al. 1989). Tatsächlich ist bekannt, daß Mutationen in den cytoplasmatischen Loops die Substratspezifität eines gegebenen Transporters ändern. Die G185V-Mutation von menschlichem MDR, die sich in dem Loop zwischen Transmembransegmenten 2 und 3 befindet, verändert die Interaktion des Transporters mit Vinblastin und Colchicin (Choi et al. 1988).
Die ATP-bindenden Domänen sind ungefähr 200 Aminosäuren lang und Domänen aus unterschiedlichen Transportern weisen typischerweise eine Sequenzidentität von 30-50% auf. Die konservierten Sequenzen schließen die "Walker Motive" ein, die mit vielen Nukleotid-bindenden Proteinen assoziiert sind. Walker et al., EMBO J. 1:945-951 (1982). Die Sequenzkonservierung erstreckt sich über die Länge der ATP-Bindungsdomäne, und ist nicht auf die Walker-Motive beschränkt. Darüber hinaus zeigen die ATP-bindenden Domänen eines einzigen Transporters eine größere Sequenzidentität zu einander als zu den Domänen von zwei unterschiedlichen Transportern. Nicht alle Proteine, die eine konservierte ATP-bindende Domäne enthalten, sind jedoch in den Transport involviert. Das cytoplasmatische Enzym UvrA funktioniert bei der DNA-Reparatur und das EF-3 Protein der Hefe ist ein Elongationsfaktor. Noch enthalten beide Proteine ATP-Bindungskassetten, die durch Sequenzvergleich identifizierbar sind.
ATP-bindende Domänen sind in hohem Masse hydrophil und im Falle von Transportern scheinen sie an der cytoplasmatischen Fläche der Membran zu sitzen und sind dort über eine Bindung mit der Membran-durchdringenden Domäne dieser Proteine verankert. Die Interaktionspunkte zwischen den Transmembran- und ATP-Bindungsdomänen wurden experimentell nicht bestimmt. Modelle der Struktur der Nukleotidbindungsdomäne zeigen an, daß Loop-Sequenzen sich vom Kern der Struktur zur Grenzfläche mit den hydrophilen Sequenzen erstrecken können, die die Membran durchdringen beziehungsweise durchqueren (Hyde et al. 1990; Mimura et al. 1991). Die beiden strukturellen Modelle, eines auf Grundlage der Adenylatcyclase und das andere auf Grundlage einer ras p21-Struktur, sagen eine Kern-Nukleotid- Bindungs-Faltung voraus, die aus fünf β-Blättern bzw. Faltblättern mit dem Walker A-Motiv zusammengesetzt sind (ein Glycin-reicher Loop), angeordnet, um mit ATP während der Hydrolyse zu interagieren. Zusätzlich sind Loop-Strukturen (zwei Loops in einem Modell, ein größerer Loop in dem anderen) vorhergesagt, die sich vom Kern erstrecken, um die ATP-bindende Domäne an andere Domänen des Transporters zu binden. Die Bindungs-Sequenzen übertragen am wahrscheinlichsten durch Konformationsänderung die Energie der ATP-Hydrolyse auf diejenigen Anteile des Moleküls, die in den Transport involviert sind.
Die Ste6-Funktion ist für die Paarung erforderlich, jedoch ist das Protein nicht für das Überleben der Hefen notwendig (Wilson und Herskowiz 1984; Kuchler et al. 1989; McGrath und Varshavsky 1989). Ste6 ist strukturell zu den Säugetier MDRs homolog. Es wurde darüber hinaus demonstriert, daß zwei Säugetier-MDR Proteine, nämlich murines Mdr3 und humanes Mdr1 den Hefe-Transporter in Zellen, die bezüglich STEG deletiert wurden, funktionell ersetzen werden (Raymond et al. 1992; Kuchler und Thorner 1992). Hefestämme, die bezüglich STEG deletiert wurden, dienen als Startpunkt für die Entwicklung von Screenings zur Entdeckung von Verbindungen, die die Funktion von exogenen ABC-Transportern modulieren.
Zwei unterschiedliche Hefe-Screenings können verwendet werden, um Modulatoren der ABC-Transporterfunktion zu identifizieren. Im ersten Fall dient ein Säugetierprotein, das den a- Faktor transportiert, als ein Ziel für potentielle Inhibitoren der Transporterfunktion. Somit wird ein Hefestamm gentechnisch verändert, so daß er einen funktionellen Transporter, beispielsweise Säugetier MDR1, exprimiert, der das Hefe Ste6-Protein beim Transport des a-Faktors ersetzt. Darüber hinaus wird dieser Stamm so gentechnisch verändert werden, daß er in einer autokrinen Weisse auf den a-Faktor reagiert: beispielsweise so, daß die Zellen nicht mehr dazu in der Lage sein werden, auf Medien, die Galaktose enthalten, zu wachsen. Diese negative Selektion hängt von der Expression des GAL1- Gens unter der Kontrolle eines Pheromon-responsiven Promotors in einem Stamm-Hintergrund ab, der mutierte Versionen der GAL7 oder GAL10-Gene einschließt. Die Expression von GAL1 in Gegenwart von Galaktose in einem derartigen Stamm-Hintergrund ist für Zellen toxisch. Bei Fehlen eines a-Faktortransportes würde die Signalgebung den Pheromonreaktions-Stoffwechselweg hinab enden, wie es auch die anschließende Expression des toxischen Genes tun würde. Das Zellwachstum in Gegenwart einer Testverbindung oder nach Expression eines spezifischen Zufallspeptides würde die Hemmung einer Transportfunktion und die Identifikation eines potentiellen Therapeutikums signalisieren.
Zusätzlich zu Inhibitoren von MDR können Verbindungen identifiziert werden, die die Interaktion eines a-Faktors mit dem a-Faktorrezeptor stören. Derartige Verbindungen können durch ihre Hemmung eines a-Faktor induzierten Wachstumsstopps in einem Wildtyp Matα-Stamm unterschieden werden. Verbindungen können ebenfalls auf andere Punkte entlang des Pheromonreaktions-Weges einwirken, um die Signalgebung zu hemmen und diese Verbindungen werden die Signalübertragung in einem Wildtyp Matα-Stamm verhindern.
In einem zweiten Screening kann ein mutierter heterologer Transporter (beispielsweise mutierter CFTR), der anfänglich nicht dazu in der Lage ist, den a-Faktor oder ein a-Faktor ähnliches Peptid zu transportieren, in einer autokrinen Hefe exprimiert werden, die bezüglich endogenen Ste6 deletiert wurde. Die Zellen werden zu einer autokrinen Reaktion auf den a-Faktor in der Lage sein, den diese Zellen erzeugen. Somit wird ein Pheromon-responsiver Promotor die Expression eines Genes kontrollieren, das eine Fähigkeit zum Wachstum auf selektiven Medien überträgt. Derartige Zellen erlauben die Identifizierung von Verbindungen, die Mängel im Transport korrigieren und ermöglichen ihm beim Export von Pheromon- Analoga an den extrazirkulären Raum zu funktionieren. Auf diese Weise können therapeutische Peptide oder andere Klassen chemischer Verbindugen identifiziert werden, die ein mutiertes Protein stabilisieren und eine normale Verarbeitung, Transport, Lokalisation an die Plasmamembran und Funktion ermöglichen. Diese Strategie kann, falls sie erfolgreich ist, die Notwendigkeit, einige mutierte Gene mit normalen Sequenzen "zu ersetzen" beseitigen, wie es in der Gentherapie ins Auge gefaßt wird, indem die Funktion mutierter Proteine durch Korrektur von Verarbeitungs-und/oder Lokalisations-Mengen wieder erhalten wird.
Zusätzlich zu den "Aktivatoren" der mutierten Transporter können Verbindungen ebenfalls identifiziert werden, die zum Starten der Signalgebung von dem a-Faktorrezeptor bei Fehlen des Transportes durch das endogen exprimierte Pheromon in der Lage sind. Diese Verbindungen werden durch ihr Vermögen, einen Wachstumsstillstand in einem Wildtyp Matα-Stamm zu verursachen, unterschieden. Verbindungen können sich ebenfalls an anderen Punkten entlang des Pheromon-Weges stark auswirken und können über eine Fähigkeit, eine Signalgebung in einem Wildtyp Matα-Stamm bei Fehlen eines a-Faktors zu starten, unterschieden werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das exogene Protein, das durch die Hefezellen erzeugt wird, einer der exogenen ABC-Transporter, die in Tabelle 1 aufgelistet sind.

Exogene G-Protein-gebundene Rezeptoren

In einigen Fällen muß ein Arzneistoff, damit er eine Krankheit heilen oder Symptome lindern kann, an geeignete Zellen geliefert werden und die geigneten "Schalter" auslösen. Die zellulären Schalter sind als "Rezeptoren" bekannt. Hormone, Wachstumsfaktoren, Neurotransmitter und viele andere Biomoleküle fungieren normalerweise durch Interaktion mit spezifischen zellulären Rezeptoren. Arzneistoffe können spezielle Rezeptoren aktivieren oder blockieren, um eine erwünschte pharmazeutische Wirkung zu erreichen. Zelloberflächen- Rezeptoren vermittteln die Transduktion eines "externen" Signals (die Bindung eines Liganden an den Rezeptor) in ein "internes" Signal (die Modulation eines cytoplasmatischen Stoffwechselweges).
In vielen Fällen wird die Übertragung durch die nachfolgende Signalkaskade erreicht:
Ein Agonist (der Ligand) bindet ein spezifisches Protein (den Rezeptor auf der Zelloberfläche).
Als Folge der Liganden-Bindung macht der Rezeptor eine allosterische Veränderung durch, die ein Übertragungsprotein in der Zellmembran aktiviert.
Das Übertragungsprotein aktiviert innerhalb der Zelle die Produktion der sogenannten "second messenger- Moleküle".
Die second messenger-Moleküle aktivieren bestimmte regulatorische Proteine innerhalb der Zelle, die die Fähigkeit aufweisen, spezielle Gene "anzuschalten" oder "auszuschalten" oder einige Stoffwechselprozesse zu verändern.
Diese Reihe von Ereignissen ist in einer spezifischen Weise für jede mögliche zelluläre Reaktion verbunden. Die Reaktion auf einen spezifischen Liganden kann davon abhängen, welchen Rezeptor eine Zelle exprimiert. Beispielsweise kann die Reaktion auf Adrenalin in Zellen, die α-adrenerge Rezeptoren exprimieren, das Gegenteil derjenigen Reaktion in Zellen sein, die β-adrenerge Rezeptoren exprimieren.
Die oben genannte "Kaskade" ist idealisiert und Variationen von diesem Thema können auftreten. Beispielsweise kann ein Rezeptor als sein eigenes Übertragungs-Protein dienen oder ein Übertragungsprotein kann direkt auf ein intrazelluläres Ziel ohne Vermittlung durch einen "second messenger" fungieren.
Eine Familie von Signalübertraguns-Kaskaden, die in eukaryotischen Zellen zu finden ist, verwendet heterotrimere "G Proteine". Es ist bekannt, daß viele unterschiedliche G Proteine mit Rezeptoren interagieren. G Protein Signalgebungs-Systeme schließen drei Bestandteile ein: den Rezeptor selbst, ein GTP-Bindungsprotein (G Protein) und ein intrazelluläres Zielprotein.
Die Zellmembran dient als Zentrale beziehungsweise Vermittlung. Botschaften, die durch unterschiedliche Rezeptoren ankommen, können eine einzige Wirkung produzieren, wenn die Rezeptoren auf denselben Typ eines G-Proteins einwirken. Andererseits können Signale, die einen einzelnen Rerzeptor aktivieren, mehr als eine Wirkung erzeugen, wenn der Rezeptor auf unterschiedliche Arten von G-Proteinen einwirkt oder, wenn die G-Proteine auf unterschiedliche Effektoren einwirken.
In ihrem Ruhezustand werden die G-Proteine, die aus alpha (α), beta (β) und gamma (γ) Untereinheiten bestehen mit dem Nukleotid Guanosindiphosphat (GDP) komplexiert und stehen in Kontakt mit Rezeptoren. Wenn ein Hormon oder ein anderer erster Botenstoff (first messenger) an den Rezeptor bindet, verändert der Rezeptor seine Konformation und dies verändert seine Wechselwirkung mit dem G Protein. Dies spornt die α- Untereinheit an, GDP frei zu setzen und das häufigere Nukleotid Guanosintriphosphat (GTP) ersetzt es, unter Aktivierung des G-Proteins. Das G Protein dissoziiert dann, so daß sich die α-Untereinheit von den noch komplexierten beta- und gamma-Untereinheiten trennt. Entweder die Gα-Untereinheit oder der Gβγ-Komplex interagiert, abhängig vom Weg, mit einem Effektor. Der Effektor (der oftmals ein Enzym ist), wandelt wiederum ein inaktives Vorläufermolekül in einen aktiven "second messenger" (zweiten Botenstoff) um, der durch das Cytoplasma diffundieren und eine Stoffwechselkaskade auslösen kann. Nach einigen Sekunden wandelt das Gα das GTP zu GDP um, wodurch es sich selbst inaktiviert. Das inaktivierte Gα kann dann mit dem Gβγ-Komplex reassoziiert werden.
Hunderte, wenn nicht tausende Rezptoren befördern Botschaften durch heterotrimere Gen-Proteine von denen zumindest 17 unterschiedliche Formen isoliert worden sind. Obwohl die größte Variabilität in der α-Untereinheit zu sehen ist wurde von mehreren unterschiedlichen β- und γ-Strukturen berichtet. Es existieren zusätzlich mehrere unterschiedliche G proteinabhängige Effektoren.
Die meisten G Protetin-gebundenen Rezeptoren umfassen eine einzige Proteinkette, die sieben Mal durch die Plasmamembran gefädelt ist. Derartige Rezeptorren werden oftmals als Sieben-Transmembranrezeptoren (seven-transmembrane receptors = STRs) bezeichnet. Mehr als hundert unterschiedliche STRs wurden herausgefunden, einschließlich vieler unterschiedlicher Rezeptoren, die denselben Liganden binden und es existieren wahrscheinlich viel mehr STRs, die auf ihre Entdeckung warten.
Zusätzlich wurden STRs identifiziert, für die natürliche Liganden unbekannt sind diese Rezeptoren werden "orphan" G Protein-gebundene Rezeptoren genannt. Beispiele schließen Rezeptoren ein, die von Neote et al. Cell 72, 415 (1993); Kouba et al. FEBS Lett. 321, 173 (1993); Birkenbach et al. J. Virol. 67, 2209 (1993) kloniert wurden.
Die "exogenen G Protein-gebundenen Rezeptoren" der vorliegenden Erfindung können irgendein G Protein-gebundener Rezeptor sein, der zur Wildtyp Hefezelle exogen ist, die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung gentechnisch verändert werden soll. Dieser Rezeptor kann ein Pflanzen- oder ein Tierzellenrezeptor sein. Ein Screening für die Bindung an Pflanzenzellrezeptoren kann bei der Entwicklung von beispielsweise Herbiziden nützlich sein. Im Falle eines Tierrezeptors kann dieser von Wirbellosen oder von Wirbeltieren abstammen. Wenn ein Rezeptor eines wirbellosen Tieres verwendet wird, wird ein Insektenrezeptor bevorzugt und würde die Entwicklung von Insektiziden erleichtern. Der Rezeptor kann ebenfalls ein Wirbeltierrezeptor sein, bevorzugter ein Säugetier und noch bevorzugter ein menschlicher Rezeptor. Der exogene Rezeptor ist ebenfalls vorzugsweise ein Sieben Transmembransegment- Rezeptor.
Geeignete Rezeptoren schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, dopaminerge, muskarinartige cholinerge, α- adrenerge, β-adrenerge, opioid- (einschließlich delta und mu), cannabinoide, serotoninerge, und GABAerge Rezeptoren. Andere geeignete Rezeptoren sind in Tabelle 2 aufgelistet. Der Begriff "Rezeptor", wie er hierin verwendet wird, umfaßt sowohl natürlich vorkommende als auch mutierte Rezeptoren.
Viele dieser G Protein-gebundenen Rezeptoren, wie die Hefe a- und α-Faktor-Rezeptoren enthalten sieben hydrophobe aminosäure-reiche Regionen, von denen angenommen wird, daß sie innerhalb der Plasmamembran liegen. Spezielle menschliche G- Protein-gebundene STRs, für die Gene isoliert wurden und für die Expressionsvektoren konstruiert werden konnten, schließen diejenigen ein, die in Tabelle 2 aufgelistet sind. Somit würde das Gen an einen Promotor betriebsfähig beziehungsweise funktionell gebunden werden, der in Hefe funktionell ist und an eine Signalsequenz, die in Hefe funktionell ist. Geeignete Promotoren schließen Ste2, Ste3 und gal10 ein, die von Hefe- Zellen sezernierte Proteine kodieren. Vorzugsweise würden die Codons des Gens zur Expression in Hefe optimiert werden. Siehe Hoekema et al., Mol. Cell. Biol., 7:2914-24 (1987); Sharp et al., 14:5125-43 (1986).
Die Homologie der STRs wird in Dohlman et al., Ann. Rev. Biochem., 60:653-88 (1991) diskutiert. Wenn STRs verglichen werden, ist ein getrenntes räumliches Muster der Homologie unterscheidbar. Die Transmembran-Domänen sind oftmals die ähnlichsten, wohingegen die N- und C-terminalen Regionen und die cytoplasmatische Schleife, die die Transmembran-Segmente V und VI verbinden unterschiedlicher sind.
Die funktionelle Signifikanz unterschiedlicher STR-Regionen wurde untersucht, indem Punktmutationen (sowohl Substitutionen als auch Deletionen) eingeführt wurden und indem Chimären unterschiedlicher, jedoch verwandter STRs konstruiert wurden. Synthetische Peptide, die individuellen Segmente entsprechen, wurden ebenfalls auf ihre Aktivität beziehungsweise Wirksamkeit getestet. Eine Affinitätsmarkierung wurde dazu verwendet, Ligandenbindungsstellen zu identifizieren beziehungsweise zu erkennen.
Es ist vorstellbar, daß ein Fremdrezeptor, der in Hefe exprimiert wird, sich funktionell in die Hefemembran integrieren wird und dort mit dem endogenen Hefe G-Protein interagieren wird. Wahrscheinlicher wird entweder der Rezeptor modifiziert werden müssen (beispielsweise durch Ersetzen seiner V-VI- Schleife mit derjenigen von Hefe STE2- oder STE3-Rezeptor) oder ein kompatibles G-Protein sollte bereit gestellt werden.
Wenn der Wildtyp-exogene G Protein-gebundene Rezeptor in Hefe nicht funktionell gemacht werden kann, kann er zu diesem Zweck mutiert werden. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen des exogenen Rezeptors und der Heferezeptoren würde vorgenommen werden und Regionen mit hoher und niedriger Homologie würden identifiziert werden. Versuchsmutationen würden dann durchgeführt werden, um Regionen, die in die Liganden- oder G-Proteinbindung involviert sind von denjenigen zu unterscheiden, die für die funktionelle Integration in die Membran notwendig sind. Der exogene Rezeptor wird dann in der letzteren Region mutiert werden, so daß er dem Heferezeptor mehr ähnelt, bis eine funktionelle Integration erreicht wurde. Wenn dies ausreichend war, um eine Funktionalität zu erreichen, wurden Mutationen als nächstes in den Regionen vorgenommen werden, die in die G Protein-Bindung involviert sind. Mutationen in Regionen, die in die Ligandenbindung involviert sind, würden nur als letzte Möglichkeit vorgenommen werden und dann würde eine Anstrengung unternommen werden, die Ligandenbindung zu konservieren, indem konservative Substitutionen durchgeführt werden, wann immer dies möglich ist.
Vorzugsweise wird das Hefegenom so modifiziert, daß es nicht dazu in der Lage ist, die endogenen a- und α-Rezeptoren in funktioneller Form zu produzieren. Anderenfalls könnte ein positiver Assay-Score die Fähigkeit eines Peptid wiederspiegeln, den endogenen G Protein-gebundenen Rezeptor zu aktivieren, und nicht den Rezeptor von Interesse.

G Protein

Wenn das PSP Surrogat ein exogener G Protein-gebundener Rezeptor ist muß die Hefezelle dazu in der Lage sein, ein G- Protein zu erzeugen, das durch den exogenen Rezeptor aktiviert wird und das wiederum den Hefeeffektor (die Hefeeffektoren) aktivieren kann. Es ist möglich, daß das endogene Hefe- G-Protein zu dem "verwandten" G-Protein ausreichend homolog ist, das natürlicherweise beziehungsweise nativ mit dem exogenen Rezeptor verbunden ist, so daß eine Bindung auftreten kann. Es wird wahrscheinlicher notwendiger sein, die Hefezelle gentechnisch zu verändern, um eine fremde Gα Untereinheit zu produzieren, die in geeigneter Weise mit dem exogenen Rezeptor in Wechselwirkung treten kann. Beispielsweise kann die Gα Untereinheit des Hefe G-Proteins durch die Gα Untereinheit ersetzt werden, die natürlicherweise mit dem exogenen Rezeptor verbunden ist (oder durch ein Protein, das im wesentlichen mit der verwandten Gα Untereinheit homolog ist).
Dietzel und Kurjan, Cell, 50:1001 (1987) demonstrierten, daß Ratten- Gαs sich funktionell an den Gβγ-Komplex banden. Jedoch komplementierte Ratten Gβi2 nur, wenn es im wesentlichen überexprimiert wurde, wohingegen Gα0 überhaupt nicht komplementierte. Kang et al., Mol. Cell. Biol. 10:2582 (1990). Folglich ist es bei einigen fremden Gα- Untereinheiten nicht durchführbar, einfach das Hefe Gα zu ersetzen.
Vorzugsweise wird die Hefe Gα-Untereinheit durch eine chimäre Gα-Untereinheit ersetzt, bei der ein Teil, beispielsweise zumindest ungefähr 20, bevorzugter zumindest ungefähr 40 Aminosäuren, die im wesentlichen mit den entsprechenden Resten des Amino-Terminus der Hefe Gα homolog sind, an eine Sequenz fusioniert, die im wesentlichen mit dem Hauptkörper eines Säugetier (oder anderen exogenen) Gα homolog ist. Während 40 Aminosäuren der angenommene Startpunkt sind, können kürzere oder längere Abschnitte getestet werden, um die minimale Länge zu bestimmen, die zur Bindung an Hefe Gβγ erforderlich ist und die maximale Menge zu bestimmen, die unter Beibehaltung der Bindung an den exogenen Rezeptor kompatibel ist. Es wird gegenwärtig angenommen, daß nur die letzten 10 oder 20 Aminosäuren am Carboxyterminus der Gα-Untereinheit zur Interaktion mit dem Rezeptor erforderlich sind.
Die chimäre Gα-Untereinheit interagiert mit dem exogenen Rezeptor und dem Hefe- Gβγ-Komplex, wodurch eine Signalübertragung ermöglicht wird. Während die Verwendung der endogenen Hefe Gβγ bevorzugt wird, kann, wenn ein fremdes oder chimäres Gβγ zur Übertragung des Signals an den Hefe-Effektor in der Lage ist, es statt dessen verwendet werden.

Proteinkinasen

Es wird angenommen, daß die mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAP Kinase) und deren Aktivator, die MAP-Kinase oder MEK Schlüssel-Moleküle in der Übertragung beziehungsweise Weiterleitung von intrazellulären Signalen in Säugetierzellen sind. Es wurde gezeigt, daß die Aktivität von MAPK, einer Serien/Threonin Proteinkinase von ihrer Phosphorylierung durch das zweifachspezifische MEK an Tyrosin und Threonin-Resten abhängt. Die MEK Ativität wiederum hängt von deren Phosphorylierung an Serin und Threonin durch eine dritte Kinase, MAP Kinase-Kinase-Kinase oder MEKK ab, deren Funktion in einigen Systemen durch das Protooncogen Produkt Raf1p erfüllt wird.
Ein essentieller Teil des S. cerevisiae Pheromon-Signalstoff- Stoffwechselweges umfaßt eine Proteinkinase-Kaskade, die aus den Produkten der STE11, STE7 und FUS3/KSS1-Gene zusammengesetzt ist (die letzteren beiden sind getrennt und funktionell redundant). Funktionelle Studien haben die Abhängigkeit der FUS3p-Aktivität von der Tyrosin und Threonin-Phosphorylierung durch STE7p etabliert, deren Aktivität durch ihre Phosphorylierung durch STE11p reguliert wird. Eine zweite Proteinkinase-Kaskade, die auf Proteinkinase C reagiert, wurde in S. cerevisiae identifiziert. Wenn dieser Weg unterbrochen wird, verlieren Hefezellen ihre Fähigkeit, in Medien mit geringer osmotischer Stärke zu wachsen. Obwohl dessen Bestandteile nicht bis zum selben Umfang charakterisiert wurden wie diejenigen der Paarungs-Wegskaskade identifiziert eine Sequenzanalyse BCK1p als ein MEKK, MKK1p/MKK2p als MEKs und MPK1p als ein MAPK.
Der Kinasesignalstoff-Stoffwechselweg erscheint unter den Eukaryoten konserviert zu sein. Somit ist eine signifikante Sequenz-Homologie zwischen Xenopus MAP-Kinase und den Produkten der nachfolgenden Hefekinase-Gene zu finden: FUS3, KSS1, MPK1 (S. cerevisiae) und Spk1 (Schizosaccharomyces pombe). Zusätzlich hat sich herausgestellt, daß Säugetier MEK zu den Produkten von STE7 (S. cerevisiae) und Byr1 (S. pombe) homolog ist [Crew et al. Science 258, 478 (1992)]. Funktionelle Homologie zwischen einigen Kinasen wurde durch Substitution heterologer Kinase-Gene in Hefekinase-Deletionsmutanten gezeigt. Somit komplementiert Xenopus MAP-Kinase eine mpk1Δ-Mutante in S. cerevisiae (diese Kinase jedoch ersetzt die Fus3p-oder Kssip-Funktion im selben Organismus nicht) [Lee et al. Mol. Cell. Biol. 13, 3067 (1993)]. Sowohl Säugetier- als auch Xenopus MAP-Kinase ersetzten die Spk1-Funktionen in S. pombe [Neiman et al. Molec. Biol. Cell 4, 107 (1993); Gotoh et al. Molec Cell. Biol. 13, 6427 (1993)]. Kaninchen MAP-Kinase- Kinase komplementiert einen byr1-Defekt in S. pombe, jedoch nur, wenn sie mit Raf1-Kinase coexprimiert wird; die letztere scheint somit ein direkter Aktivator von MEK (Hughes et. Al. Nature 364, 349 (1993) zu sein.
Die Verwendung der vorliegenden Erfindung zum Screenen nach Modulatoren von menschlichem MEK ist in Beispiel 9 beschrieben.

Cycline

Die Mitglieder einer anderen Säugetierproteinkinase-Familie, einer, die in der Weiterentwicklung beziehungsweise Progression durch den Zellzyklus aktiv ist, wurden durch Komplementation von Zellzyklus-Kinase-Mutanten in der Hefe identifiziert. Das menschliche Homolog der p34cdc2 (S. pombe) und p34cdc28 (S. cerevisiae)-Proteine, die die Progression zur DNA-Synthese und Mitose in der Hefe steuern, wurde durch Komplementation einer cdc2-Mutation in S. pombe identifiziert [Lee and Nurse, Nature 327, 31-35 (1987)]. CDK2, ein zweites menschliches p34-Homolog wurde durch funktionelle Komplementierung von p34cdc28 Mutationen in S. cerevisiae identifiziert [Elledge and Spottswood, EMBO J. 10, 2653 (1991)]. Die Aktivierung von p34 hängt von dessen Bindung mit regulatorischen Untereinheiten ab, die Cycline genannt werden. Eine genaue Kontrolle der Cyclin-Expression ebenso wie diesen Proteinen eigene Instabilität, wenn sie einmal exprimiert wurden, steuern zu einer regulierten Aktivierung der p34 Kinase und einer Progression durch den Zellzyklus bei.
Eine Anzahl vermeintlicher menschlicher G1-Cykline wurde durch deren Fähigkeit identifiziert, die Hefe G1-Cykline, nämlich CLN1, CLN2 und CLN3 im Pheromonsignalstoff- Stoffwechselweg zu ersetzen. Somit wurden die menschlichen Cycline C, D und E durch ihre Fähigkeit identifiziert, cln&supmin; - Hefe vom Wachstumsstopp zu regenerieren. [Lew et al., Cell 66, 1197 (1991)]. Es wurde ebenfalls demonstriert, daß andere Klassen von menschlichen Cyclinen die CLN-Proteine in der Hefe funktionell ersetzen. Die menschlichen Cycline A, B1 und B2 (Cycline, die normalerweise mit der Steuerung der Mitose assoziiert sind) funktionieren ebenfalls als G1-Cycline in S. cerevisiae [Lew et al., Cell 66, 1197 (1991)].
Bestimmte Cycline sind periodisch akkumulierende Regulatoren der p34 Kinase (p34cdc2 in Menschen und p34cdc28 in S. cerevisiae). Die p34 Kinase ist von der Hefe bis zu den Menschen funktionell konserviert und die Aktivität dieser Threonin/Serin-spezifischen Proteinkinase ist erforderlich, wenn Zellen durch mehrere checkpoints im Zellzyklus fortschreiten, einschließlich eines, der START genannt wird. START tritt spät in der G1-Phase auf und ist der Schaltpunkt für Zellen zwischen dem Ruhezustand und der Proliferation. Die Kinase wird an getrennten Punkten im Zellzyklus durch dessen Verbindung mit spezifischen Cyclinen aktiviert, regulatorische Untereinheiten, die ebenfalls unter den Eukaryoten funktionell konserviert sind. Drei Cycline scheinen in der Progression durch START in S. cerevisiae zu arbeiten, nämlich CLN1, CLN2 und CLN3 (Hadwiger et al. 1989; Cross 1988; Nash 1988). Die Sequenzen der CLN-Proteine tragen eine gewisse Homologie zu denjenigen der Säugetier A- und B-Typ Cyclinen; es wird angenommen, daß diese Proteine die S (DNA Synthese) und M (mitotische) Phasen des Säugetierzyklus regulieren.
Sequenzvergleiche unter den Cyclin-Proteinen, die in unterschiedlichen Spezies identifiziert wurden, zeigen an, daß eine Region einer hohen Sequenz-Konservierung innerhalb einer ungefähr 87-Restedomäne enthalten ist, die im Allgemeinen eine zentrale Cyclin-Sequenz umfaßt, die sich jedoch nahe des Amino-Terminus des Hefe G1-Cyclins befindet. Diese konservierte Domäne wird als die "Cyclinbox" bezeichnet. Eine zweite Homologieregion, die von den meisten der Cycline geteilt wird, ist eine C-terminale Sequenz, die reich an Cholin, Glutamat, Serin, Threonin und Aspartat-Resten ist, und die durch basische Aminosäuren flankiert werden, die ein PEST-Motiv genannt werden (Rogers et al. 1986). PEST-Motive sind in unstabilen Proteinen zu finden und es wird angenommen, daß sie für einen konstitutiven Ubiquitin-vermittelten Abbau das Signal liefern. Der Bau der Cycline A und B wird über eine unterschiedliche Sequenz signalisiert, nämlich ein "mitotisches Zerstörungsmotiv" (Glotzer et al 1991) das von anderen Säugetiercyclinen nicht geteilt wird.
Sequenzvergleiche wurden zwischen den Hefe CLN-Proteinen und den menschlichen A, B, C, D und E-Cyclinen vorgenommen und weisen auf die Existenz von bemerkenswerten Homologien hin (Lew et al. 1991). Über die meisten konservierten Regionen hinweg, einschließlich der Cyclinbox, trägt menschliches Cyclin C ein 18%ige Sequenzidentität sowohl mit menschlichen Cyclinen D und E als auch mit den Hefe CLN-Proteinen. Die menschlichen Cycline D und E scheinen mit den menschlichen A- und B-Typ Cyclinen (33% identisch) näher verwandt zu sein, als mit den Hefe-CLNs (24% identisch).
Alle menschlichen Cycline, die bis jetzt identifiziert wurden, ersetzen Hefe-Cycline funktionell. Tatsächlich wurden die Säugetier-Cycline C, D1 und E durch ihre Fähigkeit identifiziert, eine mangelhafte CLN-Funktion in der Hefe zu komplementieren (Lew et al. 1991). Säugetier A- und B-Typ Cycline ersetzen CLN-Proteine in der Hefe ebenfalls funktionell und diese Fähigkeit kann deswegen ein Säugetier-Cyclin nicht definitiv als ein solches markieren, das in G1 arbeiten würde. Es wurde jedoch gezeigt, daß diese Cycline C, D1 und E in G1 in Säugetierzellen exprimiert werden und das Expressionsmuster von Cyclin E während des Zellzyklus läuft zu den Expressionsmustern, die für die Hefe G1-Cycline beobachtet wurden, am parallelsten (Lew et al. 1991; Koff et al. 1991).
In Säugetierzellen akkumuliert Cyclin C mRNA früh in G1, wohingegen Cyclin E spät in dieser Phase akkumuliert. Die D Cyclin mRNA-Spiegel sind nicht ausreichend, um die Expressionsmuster in menschlichen Zellen zu verfolgen und die Rolle dieses Cyclins ist deswegen nicht klar (Lew et al. 1991). In Mauszellen wird das D1 Gen, nämlich CYL1 in der G1- Phase exprimiert und das D1-Gen scheint durch den Kolonie- stimulierenden Faktor (colony-stimulating factor) 1 reguliert zu werden (Matsushime et al. 1991). Die Expression von D1- Cyclin ist in hohem Masse Wachstumsfaktor abhängig und kann deswegen kein integraler Bestandteil des inneren Zellzyklu- Kontroll-Mechanismus sein, sondern kann lediglich in Reaktion auf eine externe Signalgebung eintreten (Scherr 1993). Das PRAD1-Gen, das in einigen parathyroiden Adenomen als überexprimiert vorgefunden wurde, ist zum D1-Gen identisch (Motokura et al. 1991). Es hat sich ebenfalls herausgestellt, daß D1 in einer Glioblastomzelle überexprimiert wird (Xiong et al. 1991) und Gegenstand einer Deregulation durch Genamplifikation ist (Lammie et al. 1991; Keyomarsi und Pardee 1993). Die Deregulation von D1 tritt durch unbekannte Mechanismen in einigen Lymphomen, Schuppenzell-Tumoren und Brustkarzinomen auf (Bianchi et al. 1993). Dieses Protein ist in die Aktivierung des Wachstums von Zellen involviert und deswegen erscheint die deregulierte Expression dieses Gens ein onkogenes Ereignis zu sein. Es besteht ein gewisser Hinweis beziehungsweise Beweis dafür, daß das E-Typ Cyclin im G1 zu S-Übergang in menschlichen Zellen funktionieren kann: Dieses Cyclin bindet an und aktiviert das p34cdc2-Protein in Extrakten von menschlichen lymphoiden Zellen in Gl, das Protein ist mit der Histon H1-Kinase-Aktivität in HeLa-Zellen assoziiert (Koff et al. 1991) und Cyclin E mRNA wird spezifisch in der späten G1-Phase in HeLa-Zellen exprimiert (Lew et al. 1991).
Es wurde weiterhin die Hypothese aufgestellt, daß p34cdc2 als getrennte Übergangspunkte im Zellzyklus durch Phosphorylieren variierender Substrate fungiert. Die Phosphorylierungsaktivität zeigt sich nach der Assoziation der Kinase mit Cyclinen, die während des Zyklus der Zelle differentiell exprimiert werden. Diese unterschiedlichen Cycline können die Substratspezifität der Kinase verändern oder können ihre katalytische Wirksamkeit verändern (Pines und Hunter 1990). Offensichtlich potentielle Substrate für die cdc2-Kinase sind Transkriptionsfaktoren, die die Zellzyklus-Stadium- spezifische Gentranskription steuern.
Die Zerstörung beziehungsweise der Bruch irgend einer der drei CLN-Gene in der Hefe beeinträchtigt das Zellwachstum nicht nennenswert, jedoch stoppen die Zellen in G1 nach einer Zerstörung aller CLN-Gene. Zusätzlich werden die CLN-Proteine in Reaktion auf Paarungs-Pheromon gehemmt und das Hefezellwachstum wird angehalten. Zwei Gene, deren Produkte die Cyclin-Aktivität hemmen, wurden in S. cerevisiae identifiziert. Die Produkte der FAR1 und FUS3-Gene hemmen die CLN2 beziehungsweise CLN3-Funktion. Bei der Pheromon-Signalgebung steigen die Spiegel von Far1p und Fus3p, die G1-Cycline akkumulieren jedoch nicht, die CDC28p-Kinase bleibt inaktiv und das Zellwachstum wird in G1 angehalten. Diese Beobachtungen legen nahe, daß die Inhibitoren der Cyclin-Proteine die Inhibitoren einer produktiven Assoziation zwischen den Cyclinen und der Kinase oder die Inaktivatoren der Kinase den zellulären Wachstumsstopp nähren können.
Im Gegensatz hierzu scheinen Cycline, die nicht hemmbar sind, als unkontrollierte positive Wachstums-Regulatoren zu funktionieren. Eine Expression der CLN-Proteine auf hohem Niveau ist in Hefezellen ein letaler Zustand. Daten zeigen an, daß der Verlust der kontrollierten Expression von Cyclin D1 durch Chromosomen-Bruch, Chromosomen-Translokation oder Genamplifikation die Onkogenität in Säugetierzellen fördern kann (Xiong et al. 1991; Lammie et al. 1991; Bianchi et al. 1993). Es erscheint zusätzlich, daß Ereignisse, die die Steuerung beziehungsweise Kontrolle der Cyclin-Expression und die Steuerung der Cyclin-Funktion stören, in einer Umgebung des G1- Checkpoints und in einer Dysregulation des zellulären Wachstums resultieren kann. Die Cyclin-Proteine, die in G1 zur Förderung der zellulären Proliferation arbeiten, wären ideale Ziele für Therapeutika, die die Steuerung des Zellwachstums anvisieren. Test-Surrogat-Proteine zur Substitution in den Hefe-Stoffwechselweg zur Identifikation derartiger Therapeutika schließen menschliche Cycline C, D und E ein. Alle drei Proteine werden normalerweise während der G1-Phase des menschlichen Zellzyklus exprimiert und sind somit Kandidaten- Mediatoren der Verpflichtung der Zellen zu proliferieren.
Beispiele von Verbindungen, von denen bekannt ist, daß sie in G1 zur Verhinderung des Eintritts in die S-Phase dienen, sind der transforming growth factor β (TGF-β) und Rapamycin. Rapamycin, ein Immunsuppressivum, hemmt die Wirkung von Cyclin E- gebundener Kinase. Dieses Makrolid dient in G1 dazu, die Proliferation von IL-2-stimulierten T-Lymphozyten zu verhindern (Scherr 1993). Es hat sich gezeigt, daß TGF-β das Fortschreiten von G1 zur S-Phase in Nerzlungenepithelzellen verhindert (How et al. 1991). TGF-β scheint die Aktivierung der Kinase zu stören, vielleicht durch reduktionelle Stabilität des Komplexes, den die Kinase mit Cyclin E bildet (Koff 1993).
Ein Stamm von Hefezellen, der inaktive CLN1, CLN2 und CLN3- Gene und ein integriertes chimäres Gen trägt, das eine Gal1- Promotor getriebene menschliche CLN2-Sequenz kodiert (siehe DL1-Zellen, Lew et al. Cell 66, 1197, (1991)) werden als Teststamm dienen. Der Gal1-Promotor ermöglicht eine Expression auf hohem Niveau, wenn Zellen in Gegenwart von Galaktose gezüchtet werden, jedoch wird dieser Promotor unterdrückt, wenn die Zellen auf Glukose gezüchtet werden. Hefezellen, die so gentechnisch verändert sind, sind auf Glukose wegen des Fehlens der Expression von funktionellem Cyclin nicht lebensfähig. Diese Hefen jedoch proliferieren auf galaktosehaltigem Medium auf Grund der Expression der menschlichen Cyclin-Sequenz. Die Exposition dieses Stammes gegenüber einem Inhibitor der Cyclin-Funktion würde die Zellen wachstumsunfähig machen, sogar auf Galaktosemedium, das heißt, die Zellen würden in Gegenwart oder Fehlen von Glukose in ihrem Wachstum angehalten werden. Dieser Phänotyp könnte als ein Hinweis auf die Gegenwart eines exogen aufgebrachten Cyclin-Inhibitors dienen, wäre jedoch als ein Screening für die Identifizierung von Kandidaten-Inhibitoren von Mitgliedern einer Bank ungeordneter bzw. zufälliger Peptide nicht brauchbar. Der Wachstumsstopp einer Untergruppe von Zellen in einer ansonsten wachsenden Population ist als ein Indikatorsystem unbrauchbar. Deswegen wird, um zufällige beziehungsweise ungeordnete Peptid-Inhibitoren von Säugetier- Cyclinen zu identifizieren, ein zweistufiges Screening ins Auge gefaßt.
i. Ein zwei-Hybrid System, beschrieben von Fields und Song (Nature 340, 245 (1989) erlaubt den Nachweis von Protein-Proteininteraktionen in der Hefe. Das GAL4-Protein ist ein potenter Aktivator der Transkription in Hefe, die auf Galaktose gezüchtet wurde. Die Fähigkeit von GAL4, die Transkription zu aktivieren hängt von der Gegenwart einer N-terminalen Sequenz ab, die zur Bindung an eine spezifische DNA-Sequenz in der Lage ist (UASG) und einer C-terminalen Domäne, die einen Transkriptionsaktivator enthält. Eine Sequenz, die ein Protein "A" kodiert, kann an diejenige, die die DNA-Bindungsdomäne des GAL4-Proteins kodiert, fusioniert werden. Ein zweites Hybridprotein kann durch Fusionieren einer Sequenz, die die GAL4-Transaktivierungs-Domäne enthält, an eine Sequenz, die ein Protein "B" kodiert, erzeugt werden. Wenn Protein "A" und Protein "B" interagieren, dient diese Interaktion dazu, die beiden Domänen von GAL4 zusammen zu bringen, die zur Aktivierung der Transkription eines UASG-haltigen Genes notwendig sind. Zusätzlich zu Co-exprimierenden Plasmiden, die beide Hebrid-Proteine kodieren, würden Hefestämme, die zum Nachweis von Protein-Proteininteraktionen unter Verwendung dieses Zwei- Hybrid-Systemes geeignet sind, eine GAL1-lacZ-Fusion enthalten, um den Nachweis der Transkription aus einer UASG-Sequenz zu ermöglichen. Die Stämme sollten ebenfalls für endogenes GAL4 und für GAL80, einem negativen Regulator von GAL4 deletiert werden.
In einer Variation des gerade beschriebenen Zwei-Hybrid- Systems würde die GAL4-DNA-Bindungsdomäne an eine menschliche Cyclin-Sequenz fusioniert werden. Zusätzlich würden Oligonukleotide, die Zufallspeptide kodieren, an die Sequenz ligiert werden, die die GAL4 Transaktivierungs-Domäne kodiert. Eine Kotransformation von geeigneten Hefestämmen mit Plasmiden, die diese beiden Hybrid- Proteine kodieren und ein Screening auf Hefe, die β- Galaktosidase exprimiert, würde die Identifizierung von Hefe ermöglichen, die eine Zufallspeptid-Sequenz exprimiert, und die zum Interagieren mit einem menschlichen Cyclin in der Lage ist. Die Identifizierung von Peptiden mit dieser Fähigkeit wäre das Ziel des ersten Stadiums des Screenens.
ii. Wenn einmal Zufallspeptide, die zur Interaktion mit einem menschlichen Cyclin von Interesse in der Lage sind, identifiziert wurden, könnte eine zweites Stadium- Screenen beginnen. Das zweite Screenen würde die Identifizierung von Peptiden erlauben, die nicht nur an menschliches Cyclin gebunden sind, jedoch, durch die Interaktion, die Cyclinaktivierung der Zellzyklusabhängigen Kinase hemmten und somit die zelluläre Proliferation hemmten. Somit würden in Hefe, der CLN1, CLN2 und CLN3 fehlt, die jedoch eine menschliche CLN-Sequenz exprimiert, wie oben beschrieben, Kandidaten-Peptide individuell exprimiert werden. Diejenigen Peptide, deren Expression ein Wachstum des Teststammes auf Galaktose nicht erlaubt, würden als Cyclin-Inhibitoren eingeschätzt werden.
Ein Vorteil dieses zweistufigen Ansatzes zur Identifikation von potentiellen Cyclin-Inhibitoren ist die hohe Wahrscheinlichkeit, daß Zufallspeptid-Sequenzen, die in Stadium I ausgewählt wurden, mit menschlichen Cyclin- Proteinen interagieren. Eine anschließend bestimmte Fähigkeit dieser Sequenz, ein Wachstumsstopp der Testerhefe auf Galaktose zu verursachen, wäre ein starker Hinweis, daß der Wachstumsstopp auf eine direkte Wirkung des Peptids auf das Cyclin und nicht auf ein anderes Protein, beispielsweise die zellzyklusabhängige Kinase, zurückzuführen ist. Obwohl dies ein starker Hinweis ist, wäre ein derartiges Ergebnis kein absoluter Hinweis beziehungsweise Beweis und die Verifikation der Hemmwirkung auf die Cyclin-Funktion könnte in vitro durch biochemische Untersuchungen erzielt werden.

Screening und Selektion

Ein Markergen ist ein Gen, dessen Expression eine phänotypische Veränderung verursacht, die screenbar oder selektierbar ist. Wenn die Veränderung selektierbar ist, erzeugt die phänotypische Veränderung einen Unterschied in der Wachstums- oder Überlebensrate zwischen Zellen, die das Markergen exprimieren und denjenigen, die es nicht exprimieren. Wenn die Veränderung screenbar ist, erzeugt die Veränderung des Phänotyps einen Unterschied in einigen nachweisbaren Eigenschaften der Zelle, durch die Zellen, die den Marker exprimieren, von denjenigen, die diesen nicht exprimieren, unterschieden werden könne. Die Selektion wird gegenüber dem Screenen bevorzugt.
Das Markergen kann an den Hefe-Pheromonweg gekoppelt werden, so daß die Expression des Markergens von der Aktivierung des G-Proteins abhängig ist. Diese Bindung kann erreicht werden, indem das Markergen an einen Pheromon-responsiven Promotor operabel gebunden wird. Der Begriff "Pheromon-responsiver Promotor" zeigt einen Promotor an, der durch ein bestimmtes Produkt des Hefepheromonsignalübertragungs-Weges reguliert wird, nicht notwendigerweise durch Pheromon per se. Bei einer Ausführungsform wird der Promotor durch den Pheromon-Weg aktiviert, in welchem Fall, zur Selektion, die Expression des Markergens einen Vorteil für die Zelle zur Folge haben sollte. Ein bevorzugtes Markergen ist das Imidazolglyzerolphosphatdehydratase-Gen (HIS3). Wenn ein Pheromon- responsiver Promotor an ein vorteilhaftes Gen operabel gebunden wird, werden die Zellen zum Screenen oder Selektieren nach Agonisten brauchbar sein. Wenn es an ein schädliches Gen gebunden ist werden die Zellen beim Screenen oder Selektieren von Antagonisten brauchbar sein.
Alternativ kann der Promotor einer sein, der durch den Pheromon-Weg unterdrückt wird, wodurch die Expression eines Produktes, das für die Zelle schädlich ist, vermieden wird. Mit einem Pheromon-unterdrückten Promotor screent man nach Agonsiten, indem der Promotor an ein schädliches Gen gebunden wird, und nach Antagonisten indem er an ein vorteilhaftes Gen gebunden wird.
Eine Unterdrückung kann erreicht werden, indem ein Pheromon- induzierter Promotor an ein Gen operabel gebunden wird, das mRNA kodiert, die zu zumindest einem Teil der mRNA, die durch das Markergen kodiert wird, antisense ist (gleichgültig ob in den codierenden oder flankierenden Regionen) so daß die Translation dieser mRNA gehemmt wird. Die Unterdrückung kann ebenfalls erzielt werden, indem ein Pheromon-induzierter Promotor an ein Gen gebunden wird, das ein DNA-bindendes Repressor-Protein kodiert und indem eine geeignete Operatorstelle in den Promotor oder in eine andere geeignete Region des Markergens eingebaut wird.
Geeignete, positiv selektierbare (vorteilhafte) Gene schließen die folgenden ein: URA3, LYS2, HIS3, LEU2, TRP1; ADE1,2,3,4,5,7,8; ARG1,3,4,5,6,8; HIS1,4,5; ILV1,2,5; THR1,4; LEU1,4; MET2,3,4,8,9,14,16,19; URA1,2,4,5,10; HOM3,4; ASP3; CHO1; ARO2,7; CYS3; OLE1; INO1,2,4; PRO1,3. Zahllose andere Gene sind potentiell selektive Marker. Die vorstehenden sind in gut charakterisierte Biosynthesewege involviert.
Das Imidazolglyzerolphosphatdehydratase (IGP Dehydratase) Gen (HIS3) wird bevorzugt, weil es sowohl ziemlich empfindlich ist als auch über einen breiten Bereich an Expressionsspiegeln selektiert werden kann. Im einfachsten Fall ist die Zelle auxotroph für Histidin (erfordert Histidin zum Wachstum) bei Fehlen einer Aktivierung. Die Aktivierung führt zur Synthese des Enzyms und die Zelle wird für Histidin prototroph (erfordert kein Histidin). Somit erfolgt die Selektion nach Wachstum bei Fehlen von Histidin. Weil nur einige Moleküle IGP Dehydratase pro Zelle für eine Histidin-Prototrophie erforderlich sind, ist der Assay sehr empfindlich.
In einer komplexeren Version des Assays können Zellen bezüglich ihrer Resistenz gegenüber Aminotriazol (AT) selektiert werden, einen Arzneistoff der die Aktivität der IGP- Dehydratase hemmt. Zellen mit einem niedrigen, fixierten Niveau der HIS3-Expression sind gegenüber dem Arzneistoff empfindlich, wohingegen Zellen mit höheren Niveaus resistent sind. Die Menge an AT kann selektiert werden, so daß Zellen mit einem Grundniveau der HIS3-Expression (was auch immer dieses Niveau ist) gehemmt werden, jedoch das Wachstum der Zellen mit einem induzierten Expressionsniveau ermöglicht wird. In diesem Fall erfolgt die Selektion nach dem Wachstum bei Fehlen von Histidin und in Gegenwart eines geeigneten Niveaus von AT.
In geeigneten Assays können sogenannte gegenselektierbare oder negativ selektierbare Gene verwendet werden. Geeignete Gene schließen ein: URA3 (Orotidin-5'-phosphatdecarboxylase; hemmt das Wachstum auf 5-Fluoroorotsäure), LYS2 (2- aminoadipatreduktase; hemmt das Wachstum auf α-aminoadipat als einziger Stickstoffquelle), CYH2 (kodiert das ribosomale Protein L29; das Cycloheximid-empfindliche Allel ist gegenüber dem resistenten Allel dominant), CAN1 (kodiert Argininpermease; kein Allel verleiht eine Resistenz gegenüber dem Arginin-analog Canavanin) und andere rezessive Arzneistoffresistenz-Marker.
Die natürliche Reaktion auf die Induktion des Hefepheromon- Reaktionsweges ist es, für Zellen einen Wachstumsstopp mitzumachen. Dies ist der bevorzugte Weg, nach Antagonisten zu einem Liganden/Rezeptorenpaar zu selektieren, das den Weg induziert. Ein autokriner Peptidantagonist würde die Aktivierung des Weges hemmen; daher wäre die Zelle zum Wachstum in der Lage. Das FAR1-Gen kann somit als endogener gegenselektierbarer Marker angesehen werden. Das FAR1-Gen wird vorzugsweise inaktiviert, wenn auf eine Agonisten-Aktivität gescreent wird.
Das Markergen kann ebenfalls ein screenbares Gen sein. Die gescreente Eigenschaft kann eine Veränderung der Zell- Morphologie, des Stoffwechsels oder anderer screenbarer Merkmale sein. Geeignete Marker schließen beta-galaktosidase (Xgal, C&sub1;&sub2; FDG, Salmon-gal, Magenta-Gal (die beiden letzteren von Biosynth Ag)), alkalische Phosphatase, Meerrettichperoxidase, Exo-Glukanase (Produkt der Hefe exb1-Gens; nichtessentiell, sezerniert); Luziferase und Chloramphenicoltransferase ein. Einiges des vorstehenden kann gentechnisch verändert werden, so daß es sezerniert werden kann (obwohl es nicht β- Galaktosidase ist). Das bevorzugte screenbare Markergen ist Beta-galaktosidase; Hefezellen, die das Enzym exprimieren, wandeln das farbige Substrat Xgal in ein blaues Pigment um. Wiederum kann der Promotor Pheromon-induziert oder Pheromon gehemmt sein.

Hefezellen

Die Hefe kann von irgend einer Spezies sein, die einen G Proteinvermittelten Signalübertragungsweg aufweist und die kultivierbar sind. Geeignete Spezies schließen Kluyverei lactis, Schizosaccharomyces pombe und Ustialgo maydis ein; Saccharomyces cerevisiae wird bevorzugt. Entweder Gα oder Gβγ kann der Aktivator des Effektors sein. (Es wird angenommen, daß in einigen Spezies sowohl Gα-aktivierte als auch Gβγ-aktivierte Effektoren existieren). Der Begriff "Hefe", wie er hierin verwendet wird, schließt nicht nur Hefe in einer strikt taxonomischen Bedeutung ein, (das heißt einzellige Organismen), jedoch auch hefeartige multizelluläre Pilze mit Pheromon- Reaktionen, die durch den Paarungs-Weg vermittelt werden.
Die Hefezellen der vorliegenden Erfindung können dazu verwendet werden, Peptide bezüglich ihrer Fähigkeit zu testen, mit einem exogenen G Protein-gebundenen Rezeptor oder anderem PSP-Surrogat zu interagieren, Die Hefezellen müssen sowohl den exogenen G Protein-gebundenen Rezeptor (oder ein anderes PSP-Surrogat) als auch ein komplementäres G-Protein exprimieren (oder andere PSPs, die für das PSP notwendig sind, so daß es im Pheromon-System funktioniert, wenn die Notwendigkeit nach der Aktivierung durch einen Arzneistoff besteht) und diese Moleküle müssen in einer derartigen Weise präsentiert werden, daß eine "Ablesung" mittels des Pheromon- Reaktionsweges erreicht werden kann (der zur Verbesserung der Ablesung modifiziert werden kann).
Damit eine Ablesung möglich ist, muß ein Gen, das ein selektierbares oder screenbares Merkmal kodiert, an den G Proteinvermittelten Signalübertragungsweg gekoppelt sein, so daß das Expressionsniveau des Genes gegenüber dem Vorhandensein oder der Abwesenheit eines Signals empfindlich ist, das heißt der Bindung an den gebundenen exogenen Rezeptor. Dieses Gen kann ein unmodifiziertes Gen sein, das bereits in dem Weg vorliegt, wie beispielsweise die Gene, die für den Wachstumsstopp verantwortlich sind. Es kann ein Hefe-Gen sein, das normalerweise nicht Teil des Weges ist, das an einen "Pheromon responsiven" Promotor operabel gebunden ist. Oder es kann ein heterologes Gen sein, das so gebunden wurde. Geeignete Gene und Promotoren wurden oben diskutiert.
Es wird verständlich sein, daß zur Erreichung einer Selektion oder eines Screenens die Hefe einen geeigneten Phänotyp aufweisen muß. Beispielsweise würde die Einführung eines Pheromon-responsiven chimären HIS3-Genes in eine Hefe, die ein Wildtyp HIS3-Gen aufweist, die genetische Selektion vereiteln. Somit ist ein auxotropher Stamm erwünscht, um eine Nahrungs-Selektion zu erreichen.
Die Hefezellen der vorliegenden Erfindung besitzen optional eine oder mehrere der nachfolgenden Eigenschaften:
(a) das endogene FAR1-Gen wurde inaktiviert;
(b) das endogene SST2-Gen und/oder andere Gene, die in die Desensibilisierung involviert sind, wurde inaktiviert;
(c) das endogene Pheromon (a- oder α-Faktor) Rezeptorgen wurde inaktiviert; und
(d) die endogenen Pheromon-Gene wurden inaktiviert.
"Inaktivierung" bedeutet, daß die Produktion eines funktionellen Genproduktes verhindert oder gehemmt wird. Eine Inaktivierung kann durch Deletion des Genes, Mutation des Promotors, so daß eine Expression nicht mehr eintritt oder Mutation der kodierenden Sequenz erreicht werden, so daß das Genprodukt inaktiv wird. Eine Inaktivierung kann teilweise oder vollständig erfolgen.
Die Mutanten mit inaktivierten Überempfindlichkeits-bezogenen Genen können durch herkömmliches genetisches Screening- Verfahren identifiziert werden. Das far1-Gen wurde als eine α-Faktor resistente Mutante idenifiziert, die auf α- Faktor/Xgal blau blieb (mit fus1-lacZ). Far2 ist, wie sich herausstellt, dasselbe wie fus3. Überempfindliche Mutanten konnten als konstitutive schwachblaue Kolonien identifiziert werden, die FUS1-lacZ auf Xgal exprimieren oder als Stämme, die sich besser mit einem schlechten Pheromon-Sezernierer paaren können.
Die DNA-Sequenzen von (a) den α- und a-Faktorgenen (b) der α- und a-Faktorrezeptoren (c) des FAR1-Genes (d) des SST2- Gens und (e) des FUS1-Promotors werden in den nachfolgenden Bezugnahmen beschrieben:
MFa1 und MFa2: AJ Brake, C Brenner, R Najarian, P Layboum, and J Merryweather. Structure of Genes Encoding Precursors of the Yeast Peptide Mating Pheromone a-Factor. In Protein Transport and Secretion. Gething M-J, Herausg. Cold Spring Harbor Lab, New York, 1985.
MFα1 und MFα2: Singh, A. EY Chen, JM Lugovoy, CN Chang, RA Hitzeman et al. 1983. Saccharomyces cerevisiae contains two discrete genes coding for the α-pheromone. Nucleic Acids Res. 11:4049; J Kurjan and I Herskowitz. 1982. Structure of a yeast pheromone gene (MF): A putative α- factor precursor contains four tandern copies of mature α- factor. Cell 30:933.
STE2 and STE3: AC Burkholder and LH Hartwell. 1985 The yeast α-factor receptor: Structural properties deduced from the sequence of the STE2 gene. Nucleic Acids Res. 13:8463 N Nakayama, A Miyajima, and K Arai. 1985. Nukleotide sequences of STE2 and STE3, cell type-specific sterile genes from Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 4:2643 DC Hagen, G McCaffrey, and GF Sprague, Jr. 1986. Evidence the yeast STE3 Gene encodes a receptor for the peptide pheromone a-factor: Gene sequence and implications for the structure of the presumed receptor. Proc. Natl Acad Sci 83:1418.
FAR1: F Chang and I Herskowitz. 1990. Identification of a gene necessary for cell cycle arrest by a negatvie growth factor of yeast: FAR1 is an inhibitor of a G1 cyclin. CLN2. Cell 63:999.
SST2: C Dietzel and J Kurjan. 1987. Pheromonal regulation and sequence of the Saccharomyces cerevisiae SST2 gene: A model for desensitization to pheromone. Mol Cell Biol 7: 4169.
FUS1: J Trueheart, JD Boeke, and GR Fink. 1987. Two genes required for cell fusion during yeast conjugation: Evidence for a pheromone-induced surface protein. Mol Cell Biol 7:2316.
Die verschiedenen essentiellen und optionalen beziehungsweise wahlweisen Merkmale können Hefezellen beispielsweise durch eine oder mehrere der nachfolgenden Mittel verliehen werden: Isolierung von Spontanmutanten mit einem oder mehreren erwünschten Merkmale; Mutation von Hefe durch chemische oder Strahlungs-Behandlung gefolgt von Selektion; und gentechnische Veränderung von Hefezellen, um ein Gen einzuführen, zu modifizieren oder zu deletieren.
Weitere explizite Eigenschaften, die in Hefestämmen erwünscht sind, die zur Verwendung als Screening-Vorrichtungen nach Inhibitoren/Aktivatoren von PSP-Surrogaten entwickelt wurden, werden in Unterabschnitten diskutiert, die sich speziell mit jedem molekularen Ziel befassen.

Peptid

Der Begriff "Peptid" wird hierin verwendet, um eine Kette von zwei oder mehreren Aminosäuren zu bezeichnen, wobei benachbarte Aminosäuren durch Peptid (-NHCO-)-Bindungen verbunden sind. Somit schließen die Peptide der vorliegenden Erfindung Oligopeptide, Polypeptide und Proteine ein. Vorzugsweise sind die Peptide der vorliegenden Erfindung 2 bis 200, bevorzugter 5 bis 50 Aminosäuren lang. Die minimale Peptid-Länge wird hauptsächlich durch die Notwendigkeit diktiert, eine ausreichende Wirksamkeit als Aktivator oder Inhibitor zu erzielen. Die maximale Peptidlänge ist nur eine Funktion der Synthese- Zweckmäßigkeit, wenn einmal ein aktives Peptid identifiziert wurde.
Für anfängliche Studien, in denen das verwandte PSP eine Hefepheromon-Rezeptor war, wurde ein 13-Aminosäure-Peptid besonders bevorzugt, weil dies die Länge des reifen Hefe α- Faktors ist.

Peptidbanken

Eine "Peptidbank" ist eine Sammlung von Peptiden vieler unterschiedlicher Sequenzen (typischerweise mehr als 1000 unterschiedliche Sequenzen), die im wesentlichen gleichzeitig hergestellt werden und zwar in einer derartigen Weise, daß, wenn sie simultan beziehungsweise gleichzeitig für eine bestimmte Aktivität getestet werden, es möglich ist, die "positiven" Peptide zu charakterisieren.
Die Peptidbank der vorliegenden Erfindung nimmt die Form einer Hefezell-Kultur ein, in die im wesentlichen jede Zelle ein, und üblicherweise nur 1 Peptid, der Bank exprimiert. Während die Diversität der Bank maximiert wird, wenn jede Zelle ein Peptid einer unterschiedlichen Sequenz produziert, ist es üblicherweise klug, die Bank so zu konstruieren, daß ein gewisses Übermaß vorliegt.
In der vorliegenden Erfindung sind die Peptide der Bank durch ein Gemisch an DNA-Molekülen unterschiedlicher Sequenz kodiert. Jedes Peptid kodierende DNA-Molekül ist mit einem Vektor DNA-Molekül ligiert und das sich ergebende rekombinante DNA-Molekül wird in eine Hefezelle eingeführt. Weil es eine Frage der Wahrscheinlichkeit ist, welches peptidkodierende DNA-Molekül in eine spezielle Zelle eingebracht wird, ist es nicht vorhersehbar, welches Peptid diese Zelle erzeugen wird. Jedoch kann man auf Grundlage des Wissens der Art und Weise, in der das Gemisch hergestellt wurde, bestimmte statistische Vorhersagen über das Gemisch der Peptide in der Peptidbank vornehmen.
Es ist zweckmäßig, von den Peptiden der Bank als aus konstanten und variablen Resten zusammengesetzt zu sprechen. Wenn der n-te Rest für alle Peptide der Bank derselbe ist wird er als Konstant bezeichnet. Wenn der n-te Rest sich verändert, abhängig von dem fraglichen Peptid, ist der Rest ein variabler Rest. Die Peptide der Bank werden zumindest einen, üblicherweise mehr als einen variablen Rest aufweisen. Ein variabler Rest kann unter jedem von zwei oder allen zwanzig der genetisch kodierten Aminosäuren variieren; die variablen Reste des Peptides können in derselben oder unterschiedlichen Weise variieren. Darüber hinaus kann die Häufigkeit des Auftretens der erlaubten Aminosäuren an einer speziellen Rest- Position die gleiche oder unterschiedlich sein. Das Peptid kann ebenfalls eine oder mehrere konstante Reste aufweisen.
Es existieren zwei Hauptwege, auf denen das erforderliche DNA-Gemisch hergestellt wird. Bei einem Verfahren werden die DNAs zu einer Base pro Zeitpunkt synthetisiert. Wenn eine Variation erwünscht ist, wird ein geeignetes Gemisch an Nukleotiden an einer durch den genetischen Code diktierten Basenposition mit der naszierenden DNA zur Reaktion gebracht, eher als mit dem reinen Nukleotid-Reagens der herkömmlichen Polynukleotid-Synthese.
Das zweite Verfahren stellt eine exaktere Kontrolle über die Aminosäure-Variation bereit. Zuerst werden Trinukleotid- Reagenzien hergestellt, wobei jedes Trinukleotid ein Kodon einer (und nur einer) der Aminosäuren ist, die in der Peptid- Bank charakterisiert werden sollen. Wenn ein spezieller variabler Rest synthetisiert werden soll, wird ein Gemisch der geeigneten Trinukleotide hergestellt und mit der naszierenden DNA zur Reaktion gebracht.
Wenn einmal die notwendige "degenerierte" DNA vollständig ist, muß sie mit den DNA-Sequenzen verbunden werden, die dazu notwendig sind, die Expression des Peptids, wie unten ausführlicher diskutiert wird, sicher zu stellen und das vollständige DNA-Konstrukt muß in die Hefe-Zelle eingebracht werden.

Expression

Die Expression eines Peptid-kodierenden Gens in einer Hefezelle erfordert einen Promotor, der in der Hefe funktionell ist. Geeignete Promotoren schließen die Promotoren für Metallothionein, 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); und Holland et al. Biochemistry 17, 4900 (1978)), wie beispielsweise Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphorfructokinase, Glucose-6- phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase ein. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung in der Hefe-Expression werden weiterhin bei R. Hitzemann et al., EPO Veröffentlichungsnummer. 73, 657 beschrieben. Weitere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil aufweisen, daß die Transkription durch die Wachstums-Bedingungen kontrolliert wird, sind die Promotor-Reaktionen für die Alkohol- Dehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatasen, Abbauenzyme, die mit dem Stickstoff-Metabolismus assoziiert sind, und die vorher erwähnte Metallothionein- und Glyceraldehyd-3- phosphatdehydrogenase ebenso wie Enzyme, die für die Maltose- und Galactose-Verwertung verantwortlich sind. Zuletzt können Promotoren, die in nur einem der beiden Haploid-Paarungstypen aktiv sind, unter bestimmten Umständen geeignet sein. Unter diesen Haploid-spezifischen Promotoren sind die Pheromon- Promotoren MFa1 und MFα1 von speziellem Interesse.
In Screenings, die für eine Untergruppe von PSP-Surrogaten (beispielsweise Kinasen, Cyclinen) gedacht sind, müssen zufällige Peptid-Sequenzen im Kontext des Hefe-Pheromons nicht exprimiert werden und müssen ebenfalls nicht zur Sekretion oder zum Transport an den extrazellulären Raum gentechnisch verändert werden. Banken von zufälligen Peptiden können in einer Vielzahl von Wegen exprimiert werden, einschließlich als Anteile von chimären Proteinen, wie in einem Zwei- Hybridproteinsystem, das so konstruiert ist, daß Protein- Proteinwechselwirkungen signalisiert werden. Zufällige Peptide müssen nicht notwendigerweise Hefe-Pheromone ersetzen, sondern können auf dem Pheromon-Weg stromabwärts der Interaktion zwischen Pheromon und Pheromon-Rezeptor zusammenstoßen (wie bei zufälligen Peptid-Inhibitoren der Kinasen oder der Cycline).
Bei der Konstruktion geeigneter Expressionsplasmide können die Terminationssequenzen, die mit diesen Genen verbunden sind, oder bei anderen Genen, die effizient in Hefe exprimiert werden, ebenfalls in den Expressionsvektor 3' von den heterologen kodierenden Sequenzen ligiert werden, um eine Polyadenylierung und Termination der mRNA bereit zu stellen.

Vektoren

Der Vektor muß dazu in der Lage sein, sich in einer Hefezelle zu replizieren. Er kann eine DNA sein, die in das Wirtsgenom integriert wird und danach als Teil der chromosomalen DNA repliziert wird oder kann DNA sein, die sich autonom repliziert wie im Falle eines Plasmids. Im letzteren Fall muß der Vektor einen Replikationsstartpunkt einschließen, der im Wirt funktionell ist. Im Fall eines Integrationsvektors kann der Vektor Sequenzen einschließen, die die Integration erleichtern, beispielsweise Sequenzen, die zu Wirtsequenzen homolog sind oder die Integrasen kodieren.
Außer daß er zur Replikation in Hefezellen in der Lage ist, ist es zweckmäßig, wenn der Vektor sich ebenfalls in bakteriellen Zellen replizieren kann, weil viele genetische Manipulationen dort bequemer ausgeführt werden. Shuttle Vektoren, die zur Replikation sowohl in Hefe als auch in bakteriellen Zellen in der Lage sind, schließen YEps, YIps und die pRS- Serie ein.

Periplasmatische Sekretion

Das Cytoplasma der Hefezelle ist durch eine Lipid-Bilayer begrenzt, die Plasmamembran genannt wird. Zwischen dieser Plasmamembran und der Zellwand befindet sich der periplasmatische Raum. Peptide, die von Hefezellen sezerniert werden, durchqueren die Plasmamembran durch eine Vielzahl von Mechanismen und treten dadurch in den periplasmatischen Raum über. Die sezernierten Peptide sind dann frei, so daß sie mit anderen Molekülen, die im Periplasma vorliegen, interagieren können oder die auf der Außenoberfläche der Plasmamembran präsentiert werden. Die Peptide machen dann entweder eine Wiederaufnahme in die Zelle durch, diffundieren durch die Zellwand in das Medium oder werden im periplasmatischen Raum abgebaut.
Die Peptidbank kann dann durch einen von zwei unterschiedlichen Mechanismen in das Periplasma sezerniert werden, abhängig von der Art des Expressionssystems, an das sie gebunden sind. Bei einem System kann das Peptid strukturell an eine Hefesignal-Sequenz wie beispielsweise diejenige gebunden sein, die im α-Faktor Vorläufer vorliegt, der die Sekretion durch das endoplasmatische Reticulum und den Golgi-Apparat leitet. Weil dies derselbe Weg ist, dem das Rezeptorprotein in seiner Reise zur Plasmamembran folgt, existiert die Möglichkeit, in Zellen, die sowohl den Rezeptor als auch die Peptid-Bank exprimieren, daß ein spezielles Peptid während des Übergangs durch den sekretorischen Weg mit dem Rezeptor interagiert. Es wurde postuliert, daß dies in Säugetierzellen auftritt, die eine autokrine Aktivierung zeigen. Eine derartige Interaktion würde wahrscheinlich eine Aktivierung des gebundenen Pheromon-Reaktionsweges während des Überganges zur Folge haben, die noch die Identifizierung derjenigen Zellen ermöglicht, die einen Peptid-Agonisten exprimieren. Für Situationen, in denen die Peptid-Antagonisten für einen extern aufgebrachten Rezeptor-Agonisten gesucht werden ist dieses System noch wirkungsvoll, weil sowohl der Peptid-Antagonist als auch der Rezeptor zusammen an die Außenseite der Zelle abgegeben werden würde. Somit wären diejenigen Zellen, die einen Antagonisten produzieren, selektierbar, weil der Peptidantagonist in geeigneter Weise und rechtzeitig gelegen sein würde, um zu verhindern, daß der Rezeptor durch den extern aufgebrachten Agonisten stimuliert wird.
Ein alternativer Mechanismus zur Abgabe von Peptiden an den periplasmatischen Raum besteht darin, die ATP-abhängigen Transporter der STE6/MDR1-Klasse zu verwenden. Dieser Transportweg und die Signale, die ein Protein oder Peptid zu diesem Weg lenken, sind nicht so gut charakterisiert wie im sekretorischen Weg, der auf dem endoplasmatischen Reticulum basiert. Nichtsdestoweniger können diese Transporter offensichtlich bestimmte Peptide wirkungsvoll direkt durch die Plasmamembran hindurch exportieren, ohne daß die Peptide den ER/Golgi-Weg durchlaufen müssen. Wir nehmen an, daß zumindest eine Untergruppe von Peptiden durch diesen Weg sezerniert werden kann, indem die Bank im Kontext der a-Faktor Prosequenz und des terminalen Tetrapeptides exprimiert wird. Der mögliche Vorteil dieses Systems besteht darin, daß der Rezeptor und das Peptid nicht in Berührung kommen, bis beide an die externe Oberfläche der Zelle abgegeben werden. Somit ahmt dieses System genau die Situation eines Agonisten oder Antagonisten nach, der normalerweise von der Außenseite der Zelle geliefert wird. Die Verwendung jedes der beschriebenen Wege liegt innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung erfordert keine periplasmatische Sekretion, oder, wenn eine derartige Sekretion vorgesehen ist, irgendein spezielles Sekretionssignal oder Transport- Weg.

Beispiel 1: Entwicklung von autokrinen Hefestämmen

In diesem Beispiel beschreiben wir ein Pilotexperiment, in dem haploide Zellen gentechnisch verändert wurden, so daß sie gegenüber ihren eigenen Pheromonen reagierend wurden beziehungsweise responsiv wurden (siehe Fig. 1). (Es sei erwähnt, daß in den Beispielen funktionelle Gene in Großbuchstaben angegeben sind und inaktivierte Gene in Kleinbuchstaben geschrieben sind). Zu diesem Zweck konstruierten wir rekombinante DNA-Moleküle, die zu Forgendem vorgesehen sind:
i. Die kodierende Region von STE2 unter der Transkriptionskontrolle von Elementen anzuordnen, die normalerweise die Transkription von STE3 steuern. Dies wird in einem Plasmid durchgeführt, das das Ersetzen genomischer STE3 von S. cerevisiae mit Sequenzen ermöglicht, wobei die codierende Sequenz von STE2 durch STE3 Transkriptionssteuer- Elemente angetrieben wird.
ii. Die kodierende Region von STE3 wird unter der Transkriptionskontrolle von Elementen angeordnet, die normalerweise die Transkription von STE2 lenken. Dies wird in einem Plasmid durchgeführt, das das Ersetzen der genomischen STE2 Sequenz von S. cerevisiae mit Sequenzen ermöglicht, wobei die kodierende Sequenz von STE3 durch licht, wobei die kodierende Sequenz von STE3 durch STE2 Transkriptionssteuerelemente angetrieben wird.
Die Sequenz des STE2 Gens ist bekannt siehe Burkholder A. C. und Hartwell L. H. (1985), "The yeast a-Faktor receptor: Structural properties deduced from the sequence of the STE2 gene," Nuc. Acids Res. 13, 8463; Nakayama N., Miyajima A., Arai K. (1985) "Nukleotide sequences of STE2 and STE3, cell type-specific sterile genes from Saccharomyces cerevisiae," EMBO J. 4, 2643.
Ein 4,3 kb BamHI-Fragment, das das gesamte STE2-Gen enthält, wurde aus Plasmid YEp24-STE2 (bezogen von J. Thormer, Univ. of California) ausgeschnitten und in pALTER kloniert (Protocols and Applications Guide, 1991, Promega Corporation, Madison, W). Eine SpeI-Stelle wurde 7 Nukleotide (nts) stromaufwärts des ATG von STE2 mit dem folgenden mutagenen Oligonukleotid eingeführt, unter Verwendung des STE2 minus Stranges als Matrize (mutierte Basen sind unterstrichen und das Startkodon ist fettgedruckt)
Eine zweite SpeI-Stelle wurde gleichzeitig gerade stromabwärts des STE2-Stoppkodons mit dem folgenden mutagenen Oligonukleotid eingeführt (mutierte Basen sind unterstrichen und das Stoppkodon ist fettgedruckt):
Das BamHI-Bruchstück des sich ergebenden Plasmids (Cadus 1096), das STE2 mit SpeI-Stelle enthielt, die die kodierende Region unmittelbar flankierten, wurde dann in den Hefeintegrationsvektor YIp19 subkloniert, um Cadus 1143 zu gewinnen.
Die STE3 Sequenz ist ebenfalls bekannt. Nakayama N., Miyajima A., Arai K. (1985), "Nukleotide sequences of STE2 und STE3, cell type-specific sterile genes from Saccharomyces cervisiae," EMBO J. 4, 2643 Hagen D. C., McCaffrey G., Sprague G. F. (1986), "Evidence the yeast STE3 gene encodes a receptor for the peptide pheromone a-factor: gene sequence and implications for the structure of the presumed receptor," Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 1418. STE3 wurde von Dr. J. Broach als ein 3,1 kb Bruchstück verfügbar gemacht, das in pBLUESC- RIPT-KS II kloniert wurde (Stratagene, 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037). STE3 wurde als ein KpnI-XbaI- Bruchstück sowohl in M13mp18 RF (um Cadus 1105 zu gewinnen) als auch pUC19 (um Cadus 1107 zu gewinnen) subkloniert. Die beiden SpeI-Stellen in Cadus 1107 wurden durch Digestion mit SpeI entfernt, ein Klenow-Fragment wurde mit DNA Polymerase I eingebracht und eine Rezirkularisierung erfolgte durch Ligation stumpfer Enden. Einsträngige DNA, die den Minusstrang von STE3 enthielt wurde unter Verwendung von Cadus 1105 gewonnen und SpeI-Stellen wurden 9 nts stromaufwärts des Startkodons und 3 nts stromabwärts des Stoppkodons von STE3 mit den nachfolgenden mutagenen Oligonukleotiden jeweils eingebracht:
Die Mutagenese wurde unter Verwendung der T7-GEB-Vorschrift von United States Biochemical (T7-GEN In Vitro Mutagenese- Kit, Beschreibungen und Vorschriften 1991, United States Biochemical, P. O. Box 22400, Cleveland, Ohio 44122) erreicht. Die replikative Form des sich ergebenden Cadus 1141 wurde mit AflII und KpnI digeriert beziehungsweise verdaut und das ungefähr 2 kb-Fragment, das die gesamte kodierende Region von STE3 enthielt, flankiert von zwei neu eingeführten SpeI- Stellen, wurde isoliert und mit dem ungefähr 3,7 kb Vektorfragment von AflII- und KpnI-digerierten Cadus 1107 ligiert, um Cadus 1138 zu gewinnen. Cadus 1138 wurde dann mit XbaI und KpnI digeriert und das STE3-haltige 2,8 kb-Bruchstück wurde in das XbaI- und KpnI-digerierte Hefeintegrationsplasmid pRS406 (Sikorski, R. S. and Hieter, P. (1989) "A System of Shuttle Vectors and Yeast Host Strains Designed for Efficient Manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae", Genetics 122:19-27), um Cadus 1145 zu gewinnen.
Das SpeI-Fragment von Cadus 1143 wurde mit dem SpeI-Fragment von Cadus 1145 ersetzt, um Cadus 1147 zu gewinnen, bei dem die kodierenden Sequenzen von STE3 unter der Kontrolle von STE2 Expressionselementen stehen. In ähnlicher Weise wurde das SpeI-Fragment von Cadus 1145 durch das SpeI-Fragment von Cadus 1143 ersetzt, um Cadus 1148 zu erhalten, bei dem die kodierenden Sequenzen von STE2 unter der Kontrolle von STE3 Expressionselementen stehen. Unter Verwendung des Verfahrens des pop-in/pop-out replacement (Rothstein, R. (1991) "[19] Targetin, Disruption, Replacement, and Allele Rescue: Integrative DNA Transformation in Yeast", Methods in Enzymology, 194:281-301), wurde Cadus 1147 dazu verwendet, genomisches STE2 mit dem ste2-STE3-Hybrid in einer MATa-Zelle zu ersetzen und Cadus 1148 wurde dazu verwendet, genomisches STE3 mit dem ste3-STE2-Hybrid in einer MAT α-Zelle zu ersetzen. Cadus 1147 und 1148 enthalten den selektierbaren Marker URA3.
Haploide Hefe vom Paarungstyp a, die gentechnisch verändert wurde, so daß sie HIS3 unter der Kontrolle des Pheromon- induzierbaren FUS1-Promotors exprimieren, wurden mit CADUS 1147 transformiert und Transformanten, die URA3 exprimieren, wurden selektiert. Diese Transformanten, die sowohl Ste2p als auch Ste3p exprimieren wurden auf 5-Fluororotsäure plattiert, um die Selektion von Klonen zu ermöglichen, die endogenes STE2 verloren hatten, und an Stelle dessen das heterologe integrierte STE3 an diesem Ort aufwiesen. Derartige Zellen zeigten die Fähigkeit, auf Medien zu wachsen, die Histidin- defizient waren, was auf eine autokrine Stimulation des Pheromon-Reaktionsweges hinweist.
In ähnlicher Weise wurden Haploide vom Paarungstyp α, die HIS3 unter der Kontrolle des Pheromon-induzierbaren FUS1- Promotors exprimieren, mit CADUS 1148 transformiert und zum Ersetzen ihres endogenen STE3s mit dem integrierten STE2 selektiert. Derartige Zellen zeigten durch ihre Fähigkeit, auf Histidin-defizienten Medien zu wachsen, eine autokrine Stimulation des Pheromon-Reaktionsweges.

Beispiel 2: Stammentwicklung

In diesem Beispiel wurden Stämme konstruiert, die die Selektion von Klonen erleichtern, die eine autokrine Aktivierung des Pheromonreaktions-Weges zeigen. Um geeignete Hefestämme zu konstruieren, werden wir folgendes verwenden: die YIp-STE3 und pRS-STE2 knockout Plasmide, die oben beschrieben sind, Plasmide, die für den knockout von FAR1, SST2 und HIS3 erhältlich sind, und mutierte Stämme, die üblicherweise in der Forschungsgemeinschaft erhältlich sind. Die nachfolgenden haploiden Stämme werden konstruiert, indem ein Schritt oder zwei Schritt knockout-Vorschriften verwendet werden, die in Meth. Enzymol 194:281-301, 1991, beschrieben wurden:
1. MATα ste3::STE2::Ste3 far1 sst2 FUS1::HIS3
2. MATa ste2:STE3::Ste2 far1 sst2 FUS1::HIS3
3. MATα ste3::STE2:Ste3 far1 sst2 mfα1 mfα2 FUS1::HIS3
4. MATa ste2::STE3::Ste2 far1 sst2 mfa1 mfa2 FUS1::HIS3
5. MATa bar1 far1-1 fus1-HIS3 ste14::TRP1 ura3 trp1 leu2 his3
6. MATa mfa1 mfa2 far1-1 his3::fus1-HIS3 ste2-STE3 ura3 met1 ade1 leu2
Die Stämme 1 und 2 werden auf ihre Fähigkeit getestet, auf Histidin-defizienten Medien als Folge einer autokrinen Stimulation ihres Pheromon-Reaktionsweges durch die Pheromone, die sie absondern beziehungsweise sezernieren, zu wachsen. Wenn sich diese Tests als erfolgreich herausstellen, wird Stamm 1 modifiziert werden, um endogenes MFα1 und MFα2 zu inaktivieren. Der resultierende Stamm 3, MATα far1 sst2 ste3::STE2::ste3 FUS1::HIS3 mfa1 mfa2 sollte den selektierbaren Phänotyp nicht mehr länger zeigen (das heißt der Stamm sollte auxotroph für Histidin sein). In ähnlicher Weise wird Stamm 2 modifiziert werden, so daß endogenes MFa1 und MFa2 inaktiviert wird. Der sich ergebende Stamm 4, MATa far1 sst2 ste2::STE3::ste2 FUS1::HIS3 mfa1 mfa2 sollte für Histidin auxotroph sein. Die Verwendungen der Stämme 5 und 6 sind in den Beispielen 3 und 4 nachstehend beschrieben.

Beispiel 3: Peptidbank

In diesem Beispiel wird ein synthetisches Oligonukleotid, das ein Peptid kodiert, so exprimiert, daß das Peptid in das Periplasma sezerniert oder transportiert wird.
i. Die Region von MFα1, die den reifen α-Faktor kodiert wurde über eine einsträngige Mutagenese mit Restriktionsstellen durchgeführt, die Oligonukleotide mit AflII und BglII-Enden akzeptieren können. Die Insertion von Oligonukleotiden mit AflII und BglII-Enden wird Plasmide zur Folge haben, die Proteine kodieren, die das MFα1 Signal und die Leader-Sequenzen stromaufwärts der Sequenz enthalten, die durch die Oligonukleotide kodiert wird. Das MFα1-Signal und die Leader-Sequenzen sollten die Verarbeitung dieser Vorläufer-Proteine durch den Weg leiten, der normalerweise für den Transport von reifem α-Faktor verwendet wird.
Das MFα1-Gen, das als 1,8 kb EcoRI-Bruchstück von pDA6300 (J. Thorner Univ. of California) gewonnen wurde, wurde in pALTER kloniert (siehe Fig. 2) in Vorbereitung für die Oligonukleotid gerichtete Mutagenese, um die kodierende Region des reifen α-Faktors zu entfernen, während Stellen für die Aufnahme von Nukleotiden mit AflII und BglII-Enden konstruiert wurden. Die Mutagenese wurde erreicht, indem der Minusstrang als Matrize und das nachfolgende mutagene Oligonukleotid verwendet wurde:
5'CTAAAGAAGAAGGGGTATCTTTGCTTAAGCTCGAGATCTCGACTGAT AACAACAGTGTAG
3'
Ein HindIII-Ort wurde gleichzeitig 7 nts stromaufwärts des MFα1 Startkodons mit dem Oligonukleotid eingeführt:
5'CATACACAATATAAAGCTTTAAAAGAATGAG 3'.
Das sich ergebende Plasmid, Cadus 1214 enthält eine HindIII-Stelle stromaufwärts des MFα1 Startkodons, eine AflII-Stelle an den Positionen, die die KEX2- Verarbeitungsstelle im MFα1 Leaderpeptid kodieren und XhoI und BglII-Stellen beziehungsweise -Orte anstatt aller Sequenzen von den Leader-kodierenden Sequenzen bis zu und einschließend das normale Stoppkodon. Das 1,5 kb HindIII-Fragment von Cadus 1214 stellt deswegen eine Klonierungsstelle für Oligonukleotide bereit, die in Hefe exprimiert werden sollen und die durch den Weg, der normalerweise vom endogenen α-Faktor durchschritten wird, sezerniert werden soll.
Eine Sequenz, die den ADH1-Promotor und die 5'- flankierende Sequenz umfaßt, wurde als ein 1,5 kb BamHI- HindIII-Fragment von pAAH5 (Ammerer, G. (1983) "[11] Expression of Genes in Yeast Using the ADCI Promoter", Academic Press, Inc., Meth. Enzymol. 101, 192-201) gewonnen und in das high copy Hefeplasmid pRS426 (Christianson, T. W. et al. (1992) "Multifunctional yeast highcopy-number shuttle vectors", Gene 110:119-122) (siehe Fig. 3) ligiert. Die einzigartige XhoI-Stelle im sich ergebenden Plasmid wurde eliminiert, um Cadus 1186 zu erhalten. Das 1,5 kb HindIII-Fragment von Cadus 1214 wurde in HindIII-digeriertes Cadus 1186 eingefüllt; Die Expression von Sequenzen, die in diese Kassette kloniert wurden, startet vom ADH1-Promotor. Das sich ergebende Plasmid, das als Cadus 1215 bezeichnet wird, kann so hergestellt werden, daß es Oligonukleotide mit AflII und BcII-Enden durch Digestion mit diesen Restriktionsendonukleasen akzeptiert. Die Oligonukleotide werden im Kontext eines MFα1-Signals und der Leader-Peptide exprimiert (Fig. 4).
Die zweisträngigen Oligonukleotidsequenzen (siehe unten) wurden synthetisiert, reassoziieren gelassen und repetitiv eingeführt, denaturiert und wiederum sich assoziieren gelassen, um doppelsträngige Oligonukleotide zu bilden, die, wenn sie mit AflII und BclI digeriert wurden, in den Polylinker des Expressionsvektors, nämlich Cadus 1215 ligiert werden können. Die beiden zweisträngigen Oligonukleotide weisen die nachfolgenden Sequenzen auf:
wobei N irgendein gewähltes Nukleoria und n irgendeine gewählte ganze Zahl ist. Hefe, die mit den sich ergebenden Plasmiden transformiert wurde, wird durch den α- Faktor Sekretionsweg Peptide sezernieren, deren Aminosäuresequenz durch die spezielle Wahl von N und n bestimmt ist (Fig. 4).
ii. Die Region von MFα1, die den reifen a-Faktor kodiert wird über eine Einzelstrangmutagenese mit Restriktionsstellen ersetzt, die Oligonukleotide mit XhoI und AflII- Enden akzeptieren. Eine Insertion von Oligonukleotiden mit Xhol und AflII-Enden wird Plasmide zur Folge haben, die Proteine kodieren, die die MFa1-Leadersequenzen stromaufwärts der Sequenz enthalten, die durch die Oligonukleotide kodiert wird. Die Mfal-Leadersequenzen sollten die Verarbeitung dieser Vorläuferproteine durch den Weg leiten, der normalerweise für den Transport eines reifen a-Faktors verwendet wird.
MFA1, gewonnen als ein BamHI-Fragment von pKK1 (bereitgestellt von J. Thorner und K. Kuchler) wurde in die BamHI Stelle von pALTER (Promega) ligiert (Fig. 5). Unter Verwendung des Minusstrangs von MFA1 als Matrize wurde eine HindIII-Stelle durch Oligonukleotid gerichtete Mutagenese genau 5' zum MFA1 Startkodon unter Verwendung des folgenden Oligonukleotids eingefügt:
5' CCAAAATAAGTACAAAGCTTTCGAATAGPJAATGCAACCATC.
Ein zweites Oligonukleotid wurde gleichzeitig verwendet, um einen kurzen Polylinker für das spätere Klonieren von synthetischen Oligonukleotiden an Stelle der MFA1-Sequenzen einzuführen. Diese MFA1-Sequenzen kodieren C-terminale 5- Aminosäuren des 21 Aminosäureleaderpeptids hindurch bis zum Stoppkodon:
5'GCCGCTCCAAAAGAAAAGACCTCGAGCTCGCTTAAGTTCTGCGTACA AAAACGTTGTTC 3'.
Das 1,6 kb HindIII Fragment des sich ergebenden Plasmids Cadus 1172 enthält Sequenzen, die das MFA1 Startkodon kodieren und die N-terminalen 16 Aminosäuren des Leaderpeptids gefolgt von einem kurzen Polylinker, der XhoI, SacI und AflII-Stellen zur Insertion von Oligonukleotiden enthält. Das 1,6 kb HindIII-Fragment von Cadus 1172 wurde in HindIII-digeriertes Cadus 1186 ligiert (siehe oben), um die Expression von Sequenzen, die in diese Kassette kloniert waren, unter die Kontrolle des ADH1-Promotors zu stellen. Die SacI-Stelle im Polylinker wurde einzigartig gemacht, in dem eine zweite SacI- Stelle, die in dem Vektor vorlag, eleminiert wurde. Das sich ergebende Plasmid, das Cadus 1239 bezeichnet wurde, kann präpariert werden, um Oligonukleotide mit XhoI und AflTI-Enden zu akzeptieren, durch Digestion mit den Restriktionsendonukleasen zur Expression im Kontext von MFa1 Leader Peptiden (Fig. 6).
Zwei zweisträngige Oligonukleotidsequenzen (siehe unten) wurden synthetisiert, reasoziieren gelassen und repetitiv eingefüllt, denaturiert und wieder assoziieren gelassen um doppelsträngige Oligonukleotide zu bilden, die, wenn sie mit AflII und BglII digeriert werden, in den Polylinker des Expressionsvektors, nämlich Cadus 1239 kloniert werden können. Die zweisträngigen Oligonukleotide, die zum Klonieren verwendet werden, weisen die folgenden Sequenzen auf:
wobei N irgend ein ausgewähltes Nukleotid ist und n irgend eine gewählte ganze Zahl ist. Hefe, die mit den sich ergebenden Plasmiden transformiert ist, wird, durch den Weg, der normalerweise für den Transport eines a-Faktors verwendet wird, farnesylierte, carboxymethylierte Peptide transportieren, deren Aminosäuresequenz durch die spezielle Auswahl von N und n bestimmt wird (Fig. 6).

Beispiel 4. Peptidsekretion/Transport.

Dieses Beispiel demonstriert die Fähigkeit, Hefe derartig gentechnisch zu verändern, daß sie Oligonukleotid kodierte Peptide sezerniert oder transportiert (in diesem Falle ihre Pheromone) und zwar durch die Wege, die normalerweise für die Sekretion oder den Transport endogener Pheromone verwendet werden.

Der autokrine MATa-Stamm CY588:

Ein MATa-Stamm, der entwickelt wurde, um Peptide im Kontext von MFα1 zu exprimieren (das heißt unter Verwendung des MFα1-Expressionsvektors, Cadus 1215) wurde konstruiert. Der Genotyp dieses Stamms, den wir als CY588 bezeichneten, ist MATa bar 1 far1-1 fus1-HIS3 ste14::TRP1 ura3 trp1 leu2 his3. Die bar1-Mutation eliminiert die Fähigkeit des Stammes, eine Protease zu produzieren, die den α-Faktor abbaut und dies mag einige Peptide, die durch die klonierten Oligonukleotide kodiert werden, abbauen. Die far1-Mutation beseitigt den Wachstumsstopp, der normalerweise die Stimulation des Pheromon-Reaktionsweges folgt; ein integriertes FUS1-HIS3- Hybridgen stellt ein selektierbares Signal der Aktivierung des Pheromonreaktionsweges bereit; und zuletzt senkt die ste14-Mutation den Hintergrund der FUS1-HIS3-Ablesung. Die Enzyme, die zur Verarbeitung des MFα1-Vorläufers in MATα- Zellen verantwrotlich sind, werden ebenfalls in MATa-Zellen exprimiert (Sprague and Thorner, in The Molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces: Gene Expression, 1992, Cold Spring Harbor Press) und deswegen sollten CY588- Zellen dazu in der Lage sein, Peptide zu sezernieren, die von Oligonukleotiden kodiert werden, die vom Plasmid Cadus 1215 exprimiert werden.

Sekretion von Peptiden im Kontext des Hefe α-Faktors:

Experimente wurden durchgeführt um folgendes zu testen: die Fähigkeit von Cadus 1215, als ein Vektor für die Expression von Peptiden zu fungieren, die von synthetischen Oligonukleotiden kodiert werden; 2. Die Geignetheit der Oligonukleotide, wie konstruiert, die Sekretion der Peptide durch den α-Faktor Sekretionsweg zu steuern; 3. Die Fähigkeit von CY588, diese Peptide zu sezernieren; und 4. Die Fähigkeit von CY588, auf diejenigen Peptide zu reagieren, die den Pheromonreaktionsweg stimulieren, indem sie auf selektiven Medien gezüchtet werden. Diese Experimente wurden unter Verwendung eines Oligonukleotids durchgeführt, das die 13 Aminosäuren des α-Faktors kodiert, das heißt, die degenerierte Sequenz (NNN)n im Oligonukleotid, die im Cadus 1215 (siehe oben) kloniert wurde, wurde spezifiziert (n = 13), um dieses Pheromon zu kodieren. CY588 wurde mit dem sich ergebenden Plasmid (Cadus 1219) transformiert und Transformanten, die auf Uracil- defizientem Medium selektiert wurden, wurden auf Histidin- defizientem Medium, das mit einem Bereich an Konzentrationen von Aminotriazol ergänzt wurde, übertragen (ein Hemmstoff des HIS3-Gen Produktes, das zur Reduktion des Hintergrund- Wachstums dient). Die Ergebnisse, dargestellt in Fig. 7 zeigen, daß das synthetische Oligonukleotid, exprimiert im Kontext von MFα1 von Cadus 1215, auf CY588 eine Fähigkeit übertrug, auf Histidin-defizienten Medien, die mit einem Aminotriazol ergänzt waren, zu wachsen. Diese Daten zeigen in Zusammenfassung folgendes an: 1. CY588 ist für die Sekretion eines Peptids kompetent, das durch die (NNN)n Sequenz des synthetischen Oligonukleotids, das in Cadus 1215 kloniert und von diesem exprimiert wurde, kodiert wird; und 2. CY588 kann in einer autokrinen Weise auf ein sezerniertes Peptid reagieren, das dessen Pheromonreaktionsweg stimuliert, in diesem Fall durch α-Faktor, der an STE2 bindet.

Autokriner Mata Stamm CY599:

Ein MATa-Stamm, der zur Expression von Peptiden im Kontext von MFA1 entwickelt wurde (das heißt unter Verwendung des MFA1-Expressionsvektors, Cadus 1239) wurde konstruiert. Der Genotyp dieses Stammes, der als CY599 bezeichnet wurde, ist MATa mfa1 mfa2 far1-1 his3::fus1-HIS3 ste2-STE3 ura3 met1 ade1 leu2. In diesem Stamm wurde Cadus 1147 (siehe oben) dazu verwendet, STE2 mit einem Hybridgen zu ersetzen, bei dem die STE3 kodierende Region unter der Kontrolle von Expressionselementen steht, die normalerweise die Expression von STE2 antreiben. Als Folge ersetzt der a-Faktor den α- Faktorrezeptor. Die Gene, die einen a-Faktor kodieren, werden von diesem Stamm deletiert; Die far1-Mutation eliminiert den Wachstumsstopp, der normalerweise einer Stimulation des Pheromonreaktionsweges folgt; und das FUS1-HIS3-Hybridgen (integriert an der HIS3-Stelle beziehungsweise -Ort) stellt ein selektierbares Signal der Aktivierung des Pheromonreaktionsweges bereit. Es wurde erwartet, das CY599 Zellen dazu in der Lage sind, a-Faktor oder a-Faktor-artige Peptide, die von Oligonukleotiden kodiert wurden, die von Cadus 1239 mittels Expression des endogenen Hefe-Transporters Ste6 exprimiert wurden, zu transportieren.

Transport der Peptide durch den Befe a-Faktor Weg:

Es wurden Experimente durchgeführt um folgendes zu testen: 1. Die Fähigkeit von Cadus 1239, als ein Vektor für die Expression von Peptiden zu funktionieren, die durch synthetische Oligonukleotide kodiert werden; 2. Die Geeignetheit der Oligonukleotide, wie sie entwickelt wurden, den Export von farnesylierten, carboxymethylierten Peptiden durch den Weg zu steuern, der normalerweise durch a-Faktor verwendet wird; 3. Die Fähigkeit von CY599, diese Peptide zu exportieren; und 4. Die Fähigkeit von CY599, auf diejenigen Peptide zu reagieren, die den Pheromon-Reaktionsweg stimulieren, durch Wachstum auf selektiven Medien. Diese Tests wurden durchgeführt, indem ein Oligonukleotid verwendet wurde, das die 12 Aminosäuren des a- Faktors kodiert; insbesondere kodiert die degenerierte Sequenz (NNN)n im Oligonukleotid, das in Cadus 1239 (sie oben) kodiert wurde (mit n = 12) den Peptidbestandteil eines a- Faktor Pheromons. CY599 wurde mit dem sich ergebenden Plasmid transformiert (Cadus 1220) und Transformanten, die auf Urazil-defizientem Medium selektiert wurden, wurden auf Histidin-defizientes Medium übertragen, das mit einem Bereich an Konzentrationen von Aminotriazol ergänzt war. Die Ergebnisse, dargestellt in Fig. 8 demonstrieren, daß das synthetische Oligonukleotid, das im Kontext von MFA1 von Cadus 1220 exprimiert wurde, übertragen auf CY599, das Aminotriazol resistente Wachstum auf Histidin-defizienten Medien steigerte. In Zusammenfassung zeigen diese Daten folgendes an: 1. Cadus 1220 und das entwickelte Oligonukleotid sind kompetent, um die Expression und den Export eines farnesylierten, carboxymethylierten Peptids, das durch die (NNN)n-Sequenz des synthetischen Oligonukleotids kodiert wird, zu steuern; und 2. CY599 kann in einer autogenen Weise auf ein farnesyliertes carboxmethyliertes Peptid reagieren, das dessen Pheromonreaktionsweg stimuliert, in diesem Falle startet das Signaling, wenn der a-Faktor an STE3 bindet.

Beispiel 5. Beweis des Konzepts

Dieses Beispiel wird die Nützlichkeit des autokrinen Systems zur Entdeckung von Peptiden demonstrieren, die sich als funktionelle Pheromon-Analoga verhalten. Auf dem Wege der Analogie kann dieses System dazu verwendet werden, Peptide zu entdecken, die produktiv mit irgendwelchen Pheromonrezeptor- Surrogaten interagieren.
CY588 (siehe Stamm 5, Beispiel 2 oben) wird mit CADUS 1215 transformiert werden, das Oligonukleotide enthält, die Zufalls-Tridecapeptide kodieren, zur Isolierung von funktionelen α-Faktor Analoga (Fig. 4). CY599 (siehe Stamm 6, Beispiel 2 oben) wird mit CADUS 1239 transformiert werden, das Oligos einer Zufallssequenz enthält, zur Isolierung von funktionellen a-Faktor Analoga (Fig. 6). Kolonien jedes Stammes, der auf Histidin-defizienten Medien im Anschluß an die Transformation wachsen kann, wird für die Herstellung von Plasmid- DNA expandiert werden und das Oligonukleotid, das in das Expressionsplasmid kloniert ist, wird sequenziert werden, um die Aminosäuresequenz des Peptids zu bestimmen, das vermutlich den Pheromon-Rezeptor aktiviert. Dieses Plasmid wird dann in einen isogenen Stamm transfiziert werden, um dessen Fähigkeit zu bestätigen, ein Peptid zu kodieren, das den Pheromonrezeptor aktiviert. Eine erfolgreiche Fertigstellung dieser Experimente wird das Potential des Systems für die Entdeckung von Peptiden demonstrieren, die Membran-Rezeptoren aktivieren können, die an den Pheromon Reaktions-Weg gekoppelt sind.
Zufalls-Oligonukleotide, die durch das Expressionsplasmid CA- DUS 1215 exprimiert werden sollen, werden Tridecapeptide kodieren, konstruiert als
wobei N irgendein Nukleotid ist, K entweder T oder G in einem Verhältnis von 40:60 ist (siehe Proc Natl Acad Sci 87:6378, 1990; ibid 89:5393, 1992) und die AflII und BcII-Stellen sind unterstrichen. Dieses Nukleotid ist derartig entwickelt, daß: die AflII und BclI-Stellen die Einfügung der Oligos in die AflII und BglII-Stelle von CADUS 1215 ermöglichen (siehe Fig. 4); die HindIII-Stelle, die sich 5' zur AflII im 5' Ende des Oligos befindet ermöglicht die zukünftige Flexibilität beim Klonieren der Oligos; die virtuelle Wiederholung GAGGCT und die GAGA-Wiederholungen, die in der Wildtyp Sequenz vorliegen und die Triple-helices bilden können, werden ohne Veränderung der kodierten Aminosäuren ausgetauscht. Die Zufallsoligonukleotide, die oben beschrieben sind, werden tatsächlich aus den nachfolgenden beiden Oligos konstruiert werden:
wobei M entweder A oder C in einem Verhältnis von 40:60 ist. Die Oligos werden miteinander reasoziieren gelassen und repetitiv eingefüllt, denaturiert und wiederum miteinader reassoziieren gelassen (Kay et al. Gene, 1993). Das doppelsträngige Produkt wird mit AflII und BclI ausgeschnitten und in das AflII und BglII-digerierte CADUS 1215 ligiert. Die BglII/BclI-Verbindung erzeugt ein TGA Stoppkodon zur Beendigung der Translation der Zufallsprodukte (Fig. 4). Wegen des TA-Gehaltes des Afl-Überhangs werden die Oligos bei 4ºC an das AflII- und BglII-digerierte pADC-MFα ligiert werden.
Zufalls-Oligonukleotide, die durch das Expressionsplasmid CA- DUS 1239 exprimiert werden sollen, werden Monodecapeptide kodieren, die wie folgt konstruiert sind:
wobei N irgendein Nukleotid ist, K entweder T oder G in einem Verhältnis 40:60 ist (siehe Proc Natl Acad set 87:6378, 1990; ibid 89:5393, 1992) und die XhoI und AflII-Stellen unterstrichen sind. Wenn sie in die XhoI und AflII-Stellen beziehungsweise -Orte von CADUS 1239 kloniert sind, werden die Propeptide, die unter der Kontrolle des ADH1-Promotors exprimiert werden, das gesamte Leader-Peptid von MFa1 enthalten, gefolgt von 11 zufälligen Aminosäuren, gefolgt von Triplets, die CVIA kodieren (das C-terminale Tetrapeptid des Wildtyp a-Faktors). Die Verarbeitung des Propeptids sollte die Sekretion von Dodecapeptiden zur Folge haben, die 11 zufällige Aminosäuren enthalten, gefolgt von einem C-terminalen, farnesylierten, carboxymethylierten Cystein.
Unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens werden die Oligonukleotide zur Expression in CADUS 1239 tatsächlich aus den folgenden beiden Oligos konstruiert werden:
wobei M entweder A oder C in einem Verhältnis 40 : 60 ist und die XhoI und AflII-Orte sind unterstrichen.

Beispiel 6

Arzneistoff-Screenings, die dazu vorgesehen sind, die Etndeckung von Molekülen zu ermöglichen, die die Funktion von ATP- abhängigen Transmembran-Transportern zu modulieren:

Die Verfügbarkeit von klonierter DNA, die die verwandten Proteine menschliches Mdr1, menschliches CFTR und menschliches MRP kodieren, wird die Konstruktion von Hefestämmen ermöglichen, die diese Moleküle exprimieren. Die sich ergebenden Stämme werden für die Entwicklung mikrobiologischer Assays essentiell sein, die dazu verwendet werden können, die Funktion dieser Proteine zu sondieren beziehungsweise auszuprobieren und um Moleküle zu entdecken, die dazu in der Lage sind, ihre Funktion in der zellulären Resistenz gegenüber Chemotherapeutika oder im Ionen-Transport zu hemmen oder zu steigern. Der vorliegende Assay macht Verwendung vom Transport des Hefepaarungs-Pheromon a-Faktors aus autokriner Hefe, die ein menschliches Protein exprimiert, das zum Ersetzen von Hefe Ste6 in der Lage ist.
A. MFa1- und Mdr1-haltige Plasmide, die von Karl Kuchler (Universität Wien) zur Verwendung in diesen Experimenten bezogen wurden:
(1) pYMA177 (bezeichnet als Cadus 1067) siehe Fig. 9.
(2) pKK1 schließt eine Sequenz ein, die MFa1 in YEp351 kodiert; der a-Faktor wird aus diesem Plasmid überexprimiert wegen der erhöhten Plasmidkopien-Anzahl
(3) pHaMDRI (wt) stellt Wildtyp Mdr1 cDNA in einem retroviralen Vektor bereit (ursprünglich von Michael Gottesman, NIH bezogen).
B. Plasmide, die bei Cadus zur Verwendung in diesen Experimenten konstruiert worden sind:
Ein 1,5 kb BamHI-BglII-Fragment, das eine MFa1-Sequenz einschließt, wurde von pYMA177 abgeleitet und an BamHI- digeriertes pYMA177 ligiert um Cadus 1079 zu gewinnen. Cadus 1079 wurde mit BglI digeriert und erneut zirkularisiert, um ein 950 bp-Fragment zu deletieren, das die Sequenz enthält, die die G185 V-Mutante von menschlichem Mdr1 kodiert; das sich ergebende Plasmid ist Cadus 1093. pHaMDR1 wurde mit BglII digeriert, um die Isolierung eines 965 bp-Fragmentes zu ermöglichen, das die menschliche Wildtyp Mdr1 (G185)-Sequenz enthält. Das 965 bp BglII-Fragment wurde in BglII-digeriertes Cadus 1093 eingefügt beziehungsweise inseriert, um Cadus 1097 zu gewinnen. Das Cadus 1097 Konstrukt wurde durch Sequenzieren unter Verwendung von Dideoxynukleotiden verifiziert. Um Cadus 1164 zu gewinnen, wurde pYMA177 mit BamHI digeriert und erneut zirkularisiert, um die Sequenz zu eleminieren, die MFa1 kodiert. Cadus 1165 wurde konstruiert, in dem ein 700 bp BglII-BamHI-Bruchstück von pYMA177 zum großen BamHIII zu BglII-Fragment von pYMA177 ligiert wurde.
Dies hat die Entfernung von sowohl dem 1,6 kb MFa BamHI- Fragment als auch des 965 bp BglII-Fragmentes zur Folge, das menschliches Mdr1 kodiert (G185V); das sich ergebende Plasmid ist Cadus 1165.
Cadus 1176 resultiert von der Ligation eines 965 bp BglII- Fragmentes von pHaMDR1, das eine Sequenz enthält, die menschliches Wildtyp Mdr1 kodiert, an BglII-digeriertes Cadus 1165. PRS426 (Cadus 1019) diente als ein URAJ Kontroll-Plasmid.
Das Endplasmidarray, das in diesen Experimenten verwendet wurde war wie folgt:

Beweis für die Expression von menschlichen Mdr1-Konstrukten in Hefe.

Die CADUS Plasmide 1065, 1079 und 1097 ebenso wie ein URA3 Kontrollplasmid (pRS426 = 1019) wurden in einem ura3&supmin; ste6&supmin; Stamm der Hefe (WKK6 = Cy20 = MATa ura3-1 leu2-3, 112 his3- 11, 15trp1-1 ade2-1 can1-100 ste6::HIS3, bezogen von Karl Kuchler) transformiert. Individuelle Transformanten wurden über Nacht in SD-URA-Medien gezüchtet und Rasen, die ungefähr 5 · 10&sup6; Zellen enthielten, wurden auf YPD-Platten in 3 ml YPD Top-Agar gegossen. Sterilfilterscheiben wurden auf den Platten angeordnet, nachdem sich der Top-Agar verfestigt hatte und 5 ml DMSO oder 5 mM Valinomycin in DMSO wurden auf die Filterscheiben getüpfelt. Durch diesen Assay verlieh die Expression von mutiertem Mdr1 aus Plasmid 1079 in WKK6-Zellen eine nur schwache Resistenz gegenüber Valinomycin, wohingegen die Expression von Wildtyp Mdr1 aus Plasmid 1097 eine vollständige Resistenz verlieh.

Versuche, die Mdr1-Aktivität durch a-Faktor Transport in einem zwei Zellsystem zu überprüfen.

Mehrere Ansätze, die Paarung von WKK6 zu demonstrieren, das mit den verschiedenen Mdr1-Konstrukten transformiert wurde, schlugen fehl. Dies im Gegensatz zu veröffentlichten Experimenten, die das Maus mdr3-Gen verwendeten, in dem eine Teilkomplementierung der Paarungsdefizienz ersichtlich war (Raymond et al., 1992).
Ein "halo" Assay wurde durchgeführt, indem WKK6 Zellen, die die verschiedenen Mdr1 Konstrukte enthielten (1019, 1065, 1079 und 1097) auf einen Rasen aus Matα-Zellen aufgebracht wurden, die gegenüber a-Faktor überempfindlich sind (CY32 = MATα leu2-3, 112trp1-289 ura3-52 his3*1 sst2*2 GAL+). Obwohl alle halos viel kleiner als die von STE6&spplus;-Zellen produzierten waren, wurde eine kleine Differenz in der halo-Größe in der relativen Größenordnung 1097 > 1079 ~ 1065 > 1019 beobachtet. Dies zeigt an, daß der a-Faktor durch das menschliche Wildtyp Mdr1-Protein, das in Hefe exprimiert wird, das bezüglich STE6 deletiert wird, transportiert werden kann, jedoch scheint der halo assay einem schnellen Arzneistoff-screening zugänglich zu sein.
Der halo assay weist einen a-Faktor nach, der von den ste6&supmin; Mdr1-Stellen sezerniert wird, durch Wachstumsstopp von Zellen, die im Indikator-Rasen vorliegen. Eine alternative und potentiell empfindlichere Methode macht Verwendung von der Transkriptionsreaktion auf die Pheromon-Signalgebung. Ein Stamm mit einem a-Faktor responsiven HIS3-Gen (CY104 = MATα ura3 leu2 trp1 his3 FUS1-HIS3 can1 ste14::TRP1) wurde mit STE6&spplus; (Cy19 = W303-1a = MATa ura3-1 leu2-3, 112 his3-11,15 trp1-1 ade2-1 can1-100) oder ste6&supmin; (WKK6 = CY20 = MATa ura3-1 leu2-3,112 his3-11,15 trp1-1 ade2-1 can 1-100 ste6::HIS3)- Stämmen, die verschiedene Plasmide enthielten, quergestreift. Die Querstreifung wurde auf einer Platte durchgeführt, der Histidin und Tryptophan fehlte, so daß nur der CY104 Indikatorstamm wachsen würde, wenn er durch einen a-Faktor stimuliert würde. Die Ordnung einer a-Faktor Sekretion, die durch dieses Verfahren ersichtlich war, war Cy58 > Cy61 Cy62 CY63 > CY60, wobei: CY58 = CY19 (STE6&spplus;, 1019), CY60 = CY20 (ste6, 1019), CY61 = CY20 (ste6&supmin;, 1065) CY62 = CY20 (ste6&supmin; 1079) und CY63 = CY20 (ste6&supmin;, 1097). Somit ist der Unterschied in der a-Faktor-Produktion zwischen STE6&spplus; und ste6 und zwischen einer a-Faktor Überproduktion in diesem System oder nicht nachweisbar, wohingegen die Aktivität von Mdr1 beim Sezernieren eines a-Faktors dies nicht ist. Es war aus diesen Experimenten nicht klar, ob das aus den ste6&supmin; a-Faktor überproduzierenden Stämmen erzeugte Signale auf einen alternativen Weg für eine a-Faktor Sekretion zurückzuführen war oder auf die Freisetzung von a-Faktor aus lysierten Zellen.

Assay der Mdr1-Aktivität durch einen a-Faktor Transport in einem autokrinen System.

Ein Einstammsystem für den Nachweis eines Mdr1-vermittelten a-Faktor Transports wurde konstruiert, um die Empfindlichkeit und Reduzierbarkeit zu verbessern und um das potentielle Falschsignal einer a-Faktor Freisetzung aus lysierten Zellen zu umgehen (ein zellkonzentration-abhängiges Phänomen). Ein Stamm wurde konstruiert (CY293 = Mata ura3 leu2 trp1 his3 fus1-HIS3 can1 ade2-1 ste2-STE3 ste6::TRP1), der auf a-Faktor reagieren konnte, indem er auf Medien wuchs, denen Histidin fehlte und bei dem das einzige Hindernis zur Sekretion von a- Faktor das Fehlen eines funktionellen STE6-Gens ist. In der Tat war der unmittelbare Vorläufer für diesen Stamm, der ein funktionelles STE6-Gen enthielt dazu in der Lage, kräftig auf -HIS-Medien zu wachsen, die 3 mM Aminotriazol enthielten, wohingegen CY293 überhaupt nicht wuchs. Der Zusatz von Aminotriazol, ein kompetitiver Hemmstoff des HIS3-Enzyms ist notwendig, um das Hintergrundswachstum dieser Stämme zu reduzieren.
Die Mdr1-haltigen Plasmide wurden in CY293 eingebracht und die Transformanten wurden auf -HIS-Platten gestreift, die entweder 0,1 oder 0,33 mH Aminotriazol enthielten. Das Wachstumsmuster das somit erzeugt wurde, war 1097 > 1067 > 1065 1176 > 1164 1019. Die STE6&spplus;-Mutterzelle von CY293 zeigte ein viel kräftigeres Wachstum als jede dieser Transformanten. Jedoch ist die vom menschlichen Mdr1 vermittelte a-Faktor Sekretion in diesem autokrinen System klar nachweisbar. CY293, transformiert mit 1097 kann dazu verwendet werden, nach Arzneistoffen zu screenen, die die Aktivität des Mdr1- Proteins steigern (erhöhtes Wachstum auf -HIS-Aminotriazol) ebenso wie auf Arzneistoffe, die eine Mdr1-Aktivität hemmen (abgenommenes Wachstum an -HIS-Aminotriazol). Im letzteren Falle müssen Kontrollen entwickelt werden, um Verbindungen zu identifizieren, die das Hefewachstum in einer Mdr1-abhängigen Weise hemmen.

Verbesserungen der autokrinen Hefe, die Mdr1 exprimiert.

Die vorstehend beschriebenen Ergebnisse zeigen an, daß das menschliche Mdr1-Protein einen a-Faktor weniger effizient transportiert, als dies das Hefe STE6-Protein tut. Es werden Versuche unternommen werden mutierte a-Faktor Moleküle zu isolieren, die effizienter durch menschliches Mdr1 transportiert werden und die noch eine Agonisten-Aktivität auf den a- Faktor Rezeptor aufrecht erhalten (STE3 Protein). Um dies durchzuführen werden a-Faktor kodierende Sequenzen chemisch unter Verwendung von "schmutzigen" Nukleotiden synthetisiert und in eine a-Faktor Expressionskassette eingefügt. Ein Beispiel einer "schmutzigen" Synthese würde dasjenige sein, Nukleotid aus einem Gemisch von 70% G und 10% von jeweils A, T und C an einer Position in die a-Faktor Sequenz einzubauen, in der G normalerweise erscheinen würde. Unter Verwendung von Oligonukleotiden, die auf diese Weise erzeugt wurden, kann eine verschiedenartige Bank an Peptiden in Hefe exprimiert und gescreent werden, um diejenigen Peptide zu identifizieren, die ihre Fähigkeit, an das STE3-Protein zu signalisieren, aufrechterhalten, die jedoch ebenfalls für einen Transport durch menschliches Mdr1 ein günstiges Substrat darstellen.
Eine zweite Verbesserung des Systems wird der Zusatz eines Pheromon-induzierbaren "negativen Selektionsmarkers" sein. Beispielsweise kann der FUS1-Promotor an GAL1-kodierende Sequenzen gebunden werden. Die Expression von GALl ist in Gegenwart von Galaktose in Stämmen toxisch, die Mutationen entweder in den GAL7 oder GAL10-Genen enthalten. Im Kontext eines autokrinen Mdr1-Stamms sollte dieses Selektionssystem die Zellen Galaktose-empfindlich machen. Der Zusatz einer Verbindung, die die Fähigkeit des Mdr1-Proteines hemmt, a-Faktor zu sezernieren, würde es diesem Stamm ermöglichen, auf Galaktose-haltigen Medien zu wachsen. Dieses Selektionssystem wurde ebenfalls falsch Positive eleminieren, die auf eine Letalität zurückzuführen sind. Die Kontrollen müssen noch so entwickelt werden, so daß Verbindungen identifiziert werden, die an anderen Punkten im Pheromonreaktions-Weg interferieren.
Die dritte Verbesserung im System involviert die Inaktivierung von Hefe-Genen, die äquivalent zu Säugetier MDR-Genen funktionieren.
Ein Netzwerk von Genen, die in die pleiotrope Arzneistoff- Resistenz (PDR) involviert sind, wurde in Hefe identifiziert. Diese Modifikation wird in jedem Hefe-Screenimg brauchbar sein, das entwickelt wurde, um die Interaktion von Verbindungen mit intrazellulären Targets zu überprüfen.
Der verbessserte autokrine Hefe-Stamm, der menschliches Mdr1 exprimiert, wird dazu verwendet werden, Verbindungs-Banken auf Moleküle zu screenen, die die Transportfunktion dieses Proteins hemmen. Zusätzlich werden Mfα Expressionskassetten, die Oligonukleotide enthalten, die Zufallspeptide kodieren, in dem autokrinen Mdr1-Stamm exprimiert werden, um Peptide zu identifizieren, die zur Hemmung des Transports eine a-Faktors oder eines a-Faktor-Analogs durch Mdr1 in der Lage sind.

Beispiel 7.

Identifizierung eines Analogs des Befe a-Faktors, der durch menschliches Wildtyp CFTR transportiert wird.

Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung von autokrinen Hefe-Stämmen zur Identifizierung von Molekülen, die zur Verbesserung des Transportes durch dysfunktionelle ATP-abhängige Transmembran-Transporter in der Lage sind, beispielsweise mutierte menschliche CFTR Proteine. Das menschliche Wildtyp- CFTR Protein wird die Ste6-Funktion in der Hefe nicht ersetzen, indem sie natives a-Faktor Pheromon transportiert (John Teem, nicht veröffentlichte Beobachtungen).
Um autokrine Hefestämmen maximal für die Entdeckung von Molekülen auszunutzen, die mutierte CFTR-Funktion steigern, wird ein a-Faktorartiges Peptid, das als ein Substrat für den Transport durch CFTR dienen kann, identifiziert werden. Ein a-Faktor Analog muß ebenfalls funktionell an den Pheromon- Rezeptor Ste3 binden, um eine Pheromon-Signalgebung zu initiieren. Das CFTR-Transportsubstrat wird identifiziert werden, in dem eine zufällig mutierte MFa Expressionskassette in der autokrinen Hefe exprimiert wird, die bezüglich Ste6- Expression deletiert wird, die jedoch das menschliche Wildtyp CFTR-Protein exprimiert.

Expression von menschlich mutierten CFTR-Proteinen in autokriner Hefe.

Der Transport eines a-Faktor-artigen Peptid-Pheromons durch CFTR dient als Grundlage für das Design von Screenings, die bei der Identifizierung von Verbindugnen verwendet werden sollen, die die Transportfunktion der CFTR-Proteine, die cystische Fibrose (CF)-Mutationen enthalten, unterstützt. Auf Grundlage der von Teem et al. (1993) durchgeführten Studien die Ste6/CFTR-chimären verwendeten wird nicht angenommen, daß mutiertes CFTR ein a-Faktor Analog effizient transportiert. Teem et al. (1993) haben chimäre Proteine hergestellt, indem eine analoge Sequenz in Hefe STE6 durch variierende Anteile der Sequenzen, die die erste Nukleotid-Bindungsdomäne von menschlichem CFTR kodiert, ersetzt wurden. Die chimären Proteine transportieren den nativen Hefe a-Faktor, wenn er in der Hefe exprimiert wird. Jedoch reduziert die Einführung einer CF-Mutation (ΔF508) die Fähigkeit dieser Proteine, das Hefe-Pheromon zu transportieren. Teem et al. haben weiterhin Revertanten in der Hefe identifiziert, das heißt Proteine die zweite Ort Mutationen enthielten, die die Fähigkeit der Chimären, die die CF-Mutation trugen, wieder herstellt, den α- Faktor zu transportieren. Die Einführung der revertanten Mutationen in ein defektives beziehungsweise Mangel-CFTR- Protein, das in Säugetierzellen exprimiert wird, senkte teilweise die Verarbeitungs- und Kanal-Defekte des ΔF508 Proteins.
Mit der Identifizierung eines Analogs des Hefe a-Faktors, der als ein Substrat zum Transport durch CFTR dient, können Mutationen direkt in das menschliche CFTR-Protein eingeführt werden, das in Hefe exprimiert wird, wodurch die Notwendigkeit beseitigt wird, chimäre, eine Ste6-Sequenz enthaltende Proteine zu erzeugen. Dies wird das Targeting potentieller CF- Therapeutika zum gesamten menschlichen CFTR-Molekül ermöglichen. Interessierende Mutationen schließen G551D, N1303K und ΔI507 zusätzlich zu ΔF508 ein; diese Mutationen kommen natürlicherweise vor, lassen in den befallenen Individuen cystische Fibrose entstehen und scheinen entweder den Transport oder das Verarbeiten von CFTR oder die Regulation der Funktion dieses Proteins zu beeinflussen (Welsh und Smith 1993). Diese Mutationen befinden sich unter den üblichsten Veränderungen von CFTR, die bis jetzt bei CF-Patienten identifiziert wurden.
Wenn ein Peptid, das als ein Substrat für den Transport durch CFTR dient nicht identifiziert werden kann, können chimäre Ste6/CFTR-Proteine und unveränderter ΔF508 in Screenings verwendet werden, die auf autokrinen Hefestämmen basieren. Diese Stämme bieten verschiedene Vorteile bei Screening Anwendungen: eine einfache Anpaßbarkeit an eine Automatisierung im großen Maßstab, Einfachheit und eine erhöhte Empfindlichkeit beziehungsweise Sensitivität, wenn sie mit traditionellen Hefe-Paarungszell-Assays der Pheromon-Signalgebung verglichen wird und das Potential, die vorliegende Technologie zur Identifizierung von aktiven Peptid-Strukturen zu verwenden.

Identifizierung von Verbindungen, die den Transport eines a- faktorartigen Peptids durch mutiertes CFTR steigern.

Autokrine Stämme, die mutiertes menschliches CFTR-Protein exprimieren, werden dazu in der Lage sein, auf reichen Medien zu wachsen, werden jedoch auf Grund des inadäquaten Transports von und der Signalgebung und durch ein a-Faktor-Analog nicht effizient auf selektiven (das heißt Histidin- defizienten) wachsen. Die Pheromon Signalgebung in diesen Stämmen startet die Expression von einer FUS1- Promotorsequenz, die die Transkription des His3-Enzyms steuert; die Expression von His3 ist zum Wachstum auf Medien, denen Histidin fehlt, erforderlich. Diese Stämme werden dazu verwendet, Verbindungs-Bibliotheken beziehungsweise Banken zu screenen, um Moleküle zu identifizieren, die die Unfähigkeit des mutierten CFTRs, ein a-Faktor-Analog zu transportieren umkehrt, um das Wachstum der Hefe auf Histidindefizientem Medium zu ermöglichen. Alternativ wären aktive Verbindungen zur Signalgebung an den a-Faktor-Rezeptor, nämlich Ste3 direkt in der Lage oder können mit dem Pheromonreaktionsweg an anderer Stelle interagieren. Geeignete Kontrollen würden zwischen diesen Möglichkeiten differenzieren.

Identifizierung von Zufallspeptiden, die den Transport durch mutiertes CFTR steigern.

Oligonukleotide enthaltende Plasmide, die Zufallspeptide kodieren, werden in einer autokrinen Hefe exprimiert, die mutiertes menschliches CFTR prägt. Diese Peptide die unter Verwendung von α-Faktor basierten Expressionskassetten exprimiert werden, werden an die extrazelluläre Umgebung über den Hefesekretionsweg transportiert. Die interessierenden Peptide werden mittels ihrer Fähigkeit identifiziert. Das Wachstum eines mutierten CFTR-enthaltenden Stammes auf Histidin- defizientem Medium zu ermöglichen.
Aktive Peptide würden den Transport eines a-Faktoranalogs durch mutiertes menschliches CFTR ermöglichen. Alternativ kann ein Peptid an anderen Punkten entlang des Pheromonreaktionsweges interagleren. Geeignete Kontrollen würden zwischen diesen möglichen outcomes differenzieren.

Beispiel 8

Hypothetisches Beispiel des Ersetzens von Hefe KEX2 durch Prohormonkonvertase PC1.

Die Säugetier Prohormon-Konvertasen PC1/PC3 und PC2 sind in die proteolytische Verarbeitung von Proopiomelanocortin (POMC) involviert, wobei PC1 vorzugsweise adrenocorticotrophes Hormon (ACTH) und β-Lipotropin freisetzt und PC2 vorzugsweise β-Endorphin freisetzt, wobei N- terminalverlängertes ACTH das Verbindungspeptid (jolning peptid = JP) enthält, und entweder α-Melanocyten- stimmulierendes Hormon (a-MSH) oder des-acetyl α-MSH (Benjannet, S., et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3564- 3568; Seideh N. G. et al. (1992) FEBS Lett. 310, 235-239) freisetzt. Als Beispiel wird ein Hefestamm beschrieben, in dem Säugetier PC1 ein chimäres Prä-pro-POMC/α-Faktor Peptid verarbeitet, wodurch die Sekretion des reifen α-Faktors und die Stimulation des Screening-Stammes in einer autokrinen Weise auf Histidin-Prototrophie ermöglicht wird. Autokrine Stämme werden konstruiert, wobei: 1. Hefe KEX2 zerstört ist; 2. die Hefe KEX2 Aktivität durch diejenige von Säugetier PC1 ersetzt wird; 3. Ein neuartiges MFα-Konstrukt, das die zweibasige Spaltstelle, die von PC1 erkannt wird (an Stelle der KEX2 Erkennungssequenz) exprimiert werden wird; 4. die Herstellung von reifen α-Faktor PC1 Aktivität erfordert und 5. das Wachstum des Stammes durch die Produktion von reifem α- Faktor stimuliert wird.
Der Genotyp des Elternstammes für dieses Beispiel ist MATa bar1::hisG far1-1 fus1-HIS3 ste14::TRP1 ura3 trp1 leu2 his3. Zu Beginn wird das KEX2-Allel dieses Stammes unter Verwendung eines Integrationspalsmides (pkex2Δ) zerstört werden, das die flankierenden Regionen des KEX2-Ortes kodiert, wobei die gesamten kodierenden Regionen vom Startkodon bis zum Termiatorkodon deletiert sind. Die Spaltung von pkex2Δ mit Bsu36I gefolgt von der Transfektion in den Elternstamm hat den Einbau des Plasmids in den KEX2-Locus zu Folge. Eine Transformation kann als Umwandlung zu Uracil-Prototrophie gescored werden. Ein anschließender Transfer von URA+-Transformanten auf Platten, die 5-Fluorotsäure enthalten, hat das Wachstum von Kolonien mit dem kex1Δ-Allel zur Folge. Der Einbau kann durch Southern blot-Analyse und durch Kolonie-PCR unter Verwendung von Oligonukleotid Primern bestätigt werden, die den KEX2-Ort flankieren. Dieser kex1Δ-Stamm wird dazu in der Lage sein, auf Histidin-defizienten Medien in Gegenwart von exogen zugesetztem α-Faktor zu wachsen, wird jedoch nicht dazu in der Lage sein, in einer autokrinen Weise auf Histidin- defizienten Medien zu wachsen, wenn er einmal mit Cadus 1219 transfiziert worden ist (URA3 2mu-ori REP3 AmpR f1-ori α- Faktor) weil die Verarbeitung der Prä-pro-POMC/α-Faktor Chimäre, die von Cadus 1219 exprimiert wird, eine KEX2-Aktivität erforderlich macht.
Beim Screening-Stamm wird die PC1 Aktivität die deletierte KEX2-Aktivität bei der Reifung des α-Faktor Peptids ersetzen. Es hat sich herausgestellt, daß PC1 cDNA (Zugangsnummer M69196), gewonnen von der Maus (Korner et al (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:6834-6838), ein Protein von 753 Aminosäuren Länge kodiert. Die Sequenzen, die PC1 kodieren, werden in ein sich in hoher Kopienzahl replizierendes Plasmid kloniert werden (Cadus 1289). Hefezellen, die mit diesem Plasmid transformiert sind, eignen sich die Fähigkeit an, auf Leucin- defizienten Medien zu wachsen und werden hohe Spiegel an PC1- Protein exprimieren, was auf das Vorliegen des PGK-Promotors zurückzuführen ist.
Ein Hybrid, das die Präpro-Region von menschlichem POMC (Zugangsnummer K02406; Takahashi, H., et al (1983) Nucleic Acids Research 11:6847-6858) kodieren und die kodierende Region einer einfachen Wiederholung eines reifen α-Faktors werden in der folgenden Weise konstruiert werden. Die Präpro-Region von menschlichem POMC wird mit einer HindIII-Stelle am 5' Ende und einer BbsI-Stelle am 3' Ende unter Verwendung der VENT- Polymerase und der folgenden Primer amplifiziert werden:
(der HindIII-Ort ist unterstrichen und das Startkodon ist fett gedruckt) und Antisense
(die BbsI Erkennung ist unterstrichen), wodurch die Aminosäuresequenzen - SSGAGQKR- am 3' Ende mit einer Bbs1-Stelle zurückgelassen werden, was einen Überhang an der -KR- zweibasigen Spaltsequenz zurückläßt. Die kodierende Region eines α-Faktors wird aus Cadus 1219 mit einem Bbs1-Ort am 5' Ende und einem BglII- Ort am 3' Ende unter Verwendung der Primer
(BbsI-Ort ist unterstrichen) und
(der BGlII-Ort ist unterstrichen, das Stoppkodon ist fett gedruckt). Das PCR- Fragment, das das präpro-Segment von PCMC kodiert, wird mit HindIII und BbsI geschnitten und Gel gereinigt, wobei das PCR-Fragment, das den α-Faktor kodiert mit BbsI und BglII geschnitten und Gel gereinigt wird und Cadus 1215 wird mit BglII und teilweise mit HindIII geschnitten und der HindIII- BglII restringierte beziehungsweise geschnittene Vektor, der die pAlter Polylinkersequenzen enthält, wird Gel gereinigt. Eine Dreiteil-Ligation der beiden PCR-Produkte mit HindIII und BglII digerierten Cadus 1215 hat ein Hybrid POMC/α- Faktor Gen zur Folge, bei dem die ersten 104 Aminosäurereste von POMC stammen und die verbleibenden 17 vom α-Faktor stammen. Die Struktur dieses Hybrid Gens um die PC1 Spaltstelle herum ist:
wobei die Reste, die von POMC abstammen unterstrichen sind und die zweibasige Spaltstelle ist fett gedruckt und die Sequenz des reifen α-Faktors ist kursiv gedruckt. Das Tetrapeptid- EAEA- das zwischen der zweibasigen Spaltstelle und dem Aminoterminalen Tryptophan des reifen α-Faktors aneinander gelagert ist, sollte durch die Dipeptidylaminopeptidase-Aktivität von ste13p entfernt werden.
Die Einführung des PC1-kodierenden Plasmids und des POMC/α- Faktorplasmids in einen kex2Δ-Stamm mit dem Genotyp MATa bar1::hisG far1-1 fus1-HIS3 ste14::TRP1 ura3 trp1 leu2 his3 sollte ein autokrines Wachstum zur Folge haben, das von der PC1-vermittelten Spaltung des zweibasigen Motivs an der amino-terminalen Seite der einfachen Kopie eines α-Faktors abhängig ist, der durch das POMC/α-Faktor-Plasmid kodiert wird. Das heißt, das autokrine Verhalten dieses Stammes sollte auf eine Expression von PC1 zurückzuführen sein. Eine geeignete Negativkontrolle wird durch Expression von Säugetier PC2 an Stelle von PC1 bereitgestellt; die Spaltstelle von POMC, die stromaufwärts des α-Faktor-Gens eingefügt wird, wird von PC2 nicht erkannt. Es sollte deswegen möglich sein, Stämme zu konstruieren, die für PC1, im Gegensatz zu PC2- abhängiger Verarbeitung durch vernünftige Auswahl von Spaltstellen von POMC, die am 5' Ende des α-Faktorgens angehängt werden, spezifisch sind. Verbindungen oder Zufallspeptide, die das autokrine Wachstum dieses Stammes unterbrechen, die jedoch keine Wachstumshemmwirkungen aufweisen, wenn dieser Stamm in Histidinhaltigen Medien gezüchtet wird, sind potentielle Inhibitoren der PC1-Aktivität.

Beispiel 9.

Hypotetisches Beispiel des Ersatzes von Hefe STE7 durch menschliches MEK (102 Rinase Kinase).

Um ein Screening nach Verbindungen zu entwickeln, die als Inhibtoren einer Säugetier-Kinase fungieren, könnte man einen Hefestamm konstruieren, der bezüglich der STE7-Aktivität defizient ist und der menschliches MEK in einem Hefeexpressionsvektor enthält. Zusätzlich würde der Stamm mit Reporterfähigkeiten ausgestattet sein, wie nachstehend beschrieben wird.
Um das Hefe STE7-Gen zu zerstören würde der folgende Ansatz gewählt werden: pBluescriptKS+, ein multicopy E. coli-Vektor wird gentechnisch verändert, so daß er die STE7-Sequenzen enthält, die bezüglich der 5' nichtkodierenden und Promotor- Sequenz und bezüglich eines beträchtlichen Anteils der kodierenden Region deletiert wurde. Die ste7-Sequenz wird dann in pRS406 ClaI, ein Plasmid auf Bluescript-Basis subkloniert, das das Hefe URAS-Gen enthält und das sich ergebene Plasmid, pRS406 claI ste7 wird dazu verwendet, daß Wildtyp STE7 Gen wie folgt zu zerstören. PRS406 ste7 wird mit ClaI digeriert und dazu verwendet, Hefestamm CY252 zu transformieren (Genotyp Mata ste14::TRP1 fus1-HIS3 far1-1 ura3 leu2 trp1 his3 ade2-1 met1) in Richtung auf eine Uracil-Prototrophie. Ein anschließendes Übertragen von Ura+-Transformanten auf Medien, die 5-Fluorotsäure enthalten, hat Kolonien zur Folge, die das ste7 Allel enthalten, was durch Southern-Analyse bestätigt wird und durch die Unfähigkeit des Stammes, bei Abwesenheit von Histidin zu wachsen, wenn es mit α-Pheromon stimuliert wird.
Um ein Plasmid zu konstruieren, das zum Exprimieren von menschlichem MEK in Hefezellen in der Lage ist, werden die nachfolgenden Oligonukleotide konstruiert: 5'- CCGCGTCTCACATGCCCAAGAAGAAGCCG-3' (vorwärts) und 5'-CCGTCTAGA TGCTGGCAGCGTGGG-3' (rückwärts). Wenn sie in einer Polymerase Kettenreaktion (polymerase chain reaction = PCR) mit menschlicher cDNA als Matrize verwendet werden, werden diese Primer die Amplifikation von DNA, die menschliches MEK kodiert, steuern. Um das menschliche MEK-Gen in einem Hefeexpressionsvektor einzufügen wird das PCR-Produkt mit Esp3I und XbalI (oben fett gedruckte Sequenzen) digeriert und an das Hefe-E. coli Shuttle-Plasmid Cadus 1289 ligiert, das vorher mit NcoI und XbaI digeriert wurde. Das sich ergebende Plasmid wird sich in Hefezellen autonom replizieren, eine Leucin- Prototrophie an eine Hefe leu2-Mutante verleihen und die Expression von MEK unter dem konstituiven PGK1-Promotor steuern.
Wenn das oben beschriebene PGK1-MEK-Plasmid in die CY252- ste7 -Zellen eingeführt wird, sollte es deren Fähigkeit wieder herstellen, in Abwesenheit von Histidin zu wachsen, wenn es mit α-Pheromon inkubiert wird, was auf die Fähigkeit von MEK zurückzuführen ist, STE7 im Pheromon-Reaktionsweg funktionell zu ersetzen und dadurch eine Stimulation der fus1-HIS3- Fusion, die sich im Chromosom befindet, zu bewirken. Man könnte danach Verbindungen screenen, die dazu in der Lage sind, ein α-Pheromon-abhängiges Wachstum bei Fehlen von Histidin umzukehren, die jedoch keine unspezifische toxische Wirkung in Gegenwart von Histidin aufweisen.
In einer autokrinen Ausführungsform sind Hefe-Zellen, die ste7 erzeugen, vom Genotyp MATa bar1::hisG far1-1 FUS1-HIS3 ste14::trp1::LYS2 ura3 trp1 leu2 his3 lys2 (Cy588trp). Das befolgte Verfahren ist exakt wie oben für CY252. Nach Konstruktion von CY588trpste werden die erzeugten Zellen mit dem Plasmid transformiert, das MEK exprimiert ebenso wie mit einem Plasmid, das zum Exprimieren von sezerniertem α- Pheromon in der Lage ist. Dieser transformierte Stamm (CY58Btrpste7 [MEK/MFα]) sollte dazu in der Lage sein, auf Medien zu wachsen, denen Histidin fehlt und die hohe (20 22222222222222mM) Mengen an 3-Aminotriazol enthalten. Das Wachstum dieses Stammes auf diesem Medium sollte strikt von der Gegenwart beider Plasmide abhängig sein (jedes notwendig, keines ausreichend). Verbindungen, die dieses Wachstum stören, könnten wie oben beschrieben getestet werden mit der Ausnahme, daß exogen zugesetzes α-Pheromon nicht notwendig ist.
Zusätzlich könnte CY58Btrpste [MEK/MFα] mit einer Plasmid- Bank transformiert werden, die cytoplasmatisch ins Ziel gefaßte Zufalls-Peptide exprimiert. Diejenigen, die mit der Funktion von MEK interferieren, würden durch Replika- Plattierung auf Medien, die Histidin-defizient sind (und potentiell 3-Aminotriazol enthalten) identifiziert werden; Zellen, die derartige inhibitorische Peptide exprimieren würden His sein. Ein derartiges Screening könnte mit dem Zusatz von Reporterkonstrukten mit dem Potential einer negativen Selektion optimiert werden, wie beispielsweise fus1-URA3 oder fus1-GAL1. In diesem Fall würden inhibitorische Peptide auf den Zielstamm die Fähigkeit übertragen, auf 5-FOA- (für Zellen, die fus1-URA3 verkürzten) oder auf Galaktose- (für Zellen mit verkürztem fus1-GAL1 in einem gal10&supmin; Hintergrund) haltigen Medien.
Bestätigende Tests würden biochemische Assays der Aktivität von MEK einschließen (entweder in vitro oder in vivo) in Gegenwart von Zufallspeptiden oder anderen Molekülen, die als potentielle MEK- Inhibitoren identifiziert wurden. TABELLE 1:
* adaptiert von Higgins, C.F. 1992. ABC-Transporters: From Microorganizmz to Man. Annu. Rev. Cell Biol. 8, 67-113. TABELLE 1: (Forts.)
* adaptiert von Higgins, C.F. 1992. ABC-Transporters: From Microorganizmz to Man. Annu. Rev. Cell Biol. 8, 67-113. TABELLE 1: (Forts.)
* adaptiert von Higgins, C.F. 1992. ABC-Transporters: From Microorganizmz to Man. Annu. Rev. Cell Biol. 8, 67-113.

TABELLE 2:

HUMANE G PROTEIN-GEBUNDENE SIEBEN-TRANSMEMBRAN-REZEPTOREN: REFEENZEN ZUM KLONIEREN

Rezeptor Referenz

α1A-adrenerger Rezeptor Bruno et al. (1991 )
α1B-adrenerger Rezeptor Ramarao et al. (1992)
α2-adrenerger Rezeptor Lomasney et al. (1990)
α2B-adrenerger Rezeptor Weinshank et al. (1990)
β1-adrenerger Rezeptor Frielle et al. (1987)
β2-adrenerger Rezeptor Kobilka et al. (1987)
β3-adrenerger Rezeptor Regan et al. (1988)
m&sub1;AChR, m2 AChR, m&sub3; AChR, m&sub4; AChR Bonner et al. (1987)
Peralta et al. (1987)
m5 AChR Bonner et al. (1988)
D&sub1; dopamin Dearry et al. (1990)
Zhou et al. (1990)
Sunahara et al. (1990)
Weinshank et al. (1991)
D&sub2; dopamin Grandy et al. (1989)
D&sub3; dopamin Sokoloff et al. (1990)
D&sub4; dopamin Van Tol et al. (1991)

TABELLE 2: (Forts.)

HUMANE G PROTEIN-GEBUNDENE SIEBEN TRANSMEMBRAN-REZEPTOREN: REFERENZEN ZUM KLONIEREN

Rezeptoren Referenz

D&sub5; dopamin M. Caron (unpub.)
Weinshank et al. (1991 )
A1 adenosin Libert et al. (1992)
adenosin A2b Pierce ei al. (1992)
5-HT1b Kobilka et al. (1987)
Fargin et al. (1988)
5-HT1b Hamblin et al. (1992)
Mochizuki et al. (1992)
5HT1 -artig Levy et al. (1992a)
5-HT1d Levy et al. (1992b)
5HT1d -artig Hamblin and Metcalf (1991)
5HT1d beta Demchyshyn et al. (1992)
Substanz K (neurokinin A) Gerard et al. (1990)
Substanz P (NK1) Gerard, et al. (1991);
Takeda et al. (1991)
f-Met-Leu-Phe Boulay et al. (1990)
Murphy & McDermott (1991)
DeNardin et al. (1992),
angiotensin II typ 1 Furuta et al. (1992)
mas proto-oncogen Young et al. (1986)
endothelin ETA Hayzer et al. (1992)
Hosoda et al. (1991)
endothelin ETB Nakamuta et al. (1991)
Ogawa et ai. (1991)
thrombin Vu et al. (1991)
Somatotropin-releasing-Faktor (GHRH) Mayo (1992)
vasoaktives intestinales Peptid (VIP) Sreedharan et al. (1991)
oxytocin Kimura et al., (1992)
somatostatin SSTR1 nd SSTR2 Yamada et al. (1992a)
SSTR3 Yamada et al. (1992b)
cannabinoid Gerard et al. (1991)
follikelstimulierendes Hormon (FSH) Minegish et al. (1991)
LH/CG Minegish et al. (1990)
thyroidstimulierendes Hormon (TSH) Nagayama et al. (1989)
Libert et al. (1989)
Misrahi et al. (1990)
thromboxan: A2 Hirata et al. (1991)
Plättchen-aktivierender Faktor (PAF) Kunz et al. (1992)
C5a anaphylatoxin Boulay et al. (1991)
Gerard and Gerard (1991)

TABELLE 2: (Forts.)

Rezeptor Referenz

Interleukin 8 (IL-8) IL-8RA Holmes et al. (1991)
IL-8RB Murphy and Tiffany (1991)
Delta Opioid Evans et al. (1992)
Kappa Opioid Xie et al. (1992)
mip-1/RANTES Neote et al. (1993)
Murphy et al., in press
Rhodopsin Nathans and Hogness (1984)
Red opsin, Green opsin, Blue opsin Nathans, et al. (1986)
metabotropic glutamate mGluR1-6 Tanabe et al. (1992)
histamin H2 Gantz et al. (1991)
ATP Julius, David (unpub.)
neuropeptid Y Herzog et al. (1992)
Larhammar et al. (1992)
amyloidprotein-Vorläufer Kang et al. (1987)
Mita, et al. (1988)
Lemaire et al. (1989)
insulin-ähnlicher Faktor II Kiess et al. (1988)
bradykinin Hess et al. (1992)
gonadotropin-releasing hormor Chi et al. (1993)
cholecystokinin Pisegna et al. (1992)
melanotropin Chhajlane et al. (1992)
Mountjoy et al. (1992)
antidiuretisches Hormon-Rezeptor Birnbaumer et at. (1992)
glukagon-Rezeptor Sprecher et al. (1993)
adrenocorticotropes Hormon Mounijoy et al. (1992)
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Claims

1. Hefezell-Kultur umfassend eine Vielzahl von Hefezellen, wobei jede Zelle von dieser folgendes umfaßt:

(a) ein erstes heterologes Gen, das ein heterologes Surrogat eines Proteins des Hefe-Pheromon-Systems kodiert, wobei das Surrogat dazu in der Lage ist, im Pheromon-System der Hefezelle eine Funktion durchzuführen, die natürlicherweise durch das entsprechende Protein des Hefe-Pheromon- Systems durchgeführt wird, und

(b) ein zweites heterologes Gen, das ein heterologes Peptid kodiert,

wobei die Hefe-Kultur eine Bibliothek heterologer Peptide exprimiert, wobei eine Interaktion eines heterologen Peptids innerhalb der Bibliothek mit dem Surrogat die Interaktion des Surrogats mit dem Pheromon-System moduliert und diese Modulierung ein selektierbares oder screenbares Ereignis ist.

2. Verfahren zur Herstellung einer Hefezelle, die ein Pheromon-System aufweist, wobei die Zelle folgendes umfaßt:

(a) ein erstes heterologes Gen, das ein heterologes Surrogat eines Proteins des Hefe-Pheromon-Systems kodiert, wobei das Surrogat im Pheromon-System der Hefezelle eine Funktion durchführt, die natürlicherweise durch das entsprechende Hefe-Pheromon-System-Protein durchgeführt wird, und

(b) ein zweites heterologes Gen, das ein heterologes Peptid kodiert, wobei das heterologe Peptid die Interaktion des Surrogats mit dem Pheromon-System in der Hefezelle moduliert und die Modulierung ein selektierbares oder screenbares Ereignis ist,

wobei das Verfahren den Schritt umfaßt, die Zelle aus der Hefe- Kultur nach Anspruch 1 zu screenen oder zu selektieren.

3. Hefezell-Kultur nach Anspruch 1 oder Verfahren nach Anspruch 2, bei dem das endogene Pheromon-System-Protein nicht in funktioneller Form erzeugt wird.

4. Hefezell-Kultur nach Anspruch 1 oder Verfahren nach Anspruch 2, bei dem das heterologe Peptid durch die Zelle in den periplasmatischen Raum sezerniert wird, von dem aus es mit dem Surrogat interagiert.

5. Hefezell-Kultur oder Verfahren nach Anspruch 4, bei dem das heterologe Peptid in Form eines Vorläufer-Peptids exprimiert wird, das ein spaltbares Hefe-Leader-Peptid und ein reifes Peptid umfaßt, wobei das Leader-Peptid die Sekretion des heterologen Peptids lenkt.

6. Hefezell-Kultur oder Verfahren nach Anspruch 5, bei dem das Leader-Peptid einem Leader-Peptid des Saccharomyces cerevisiae α-Faktor oder a-Faktor entspricht.

7. Hefezell-Kultur oder Verfahren nach Anspruch 5, bei dem ein Wild-Typ-Pheromon des Hefe-Pheromon-Systems nicht sezerniert wird.

8. Hefezell-Kultur oder Verfahren nach Anspruch 4, bei dem das heterologe Peptid ebenfalls in einer nicht-sekretorischen Form exprimiert wird.

9. Hefezell-Kultur nach Anspruch 1 oder Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Zelle ein mutierter Stamm ist, der weniger als der Wild-Typ-Stamm gegen eine Desensibilisierung seines Pheromon-Signalweges durch wiederholte oder verlängerte Stimulation hiervon empfindlich ist.

10. Hefezell-Kultur oder Verfahren nach Anspruch 9, bei dem das SST2-Gen nicht funktionell exprimiert wird.

11. Hefezell-Kultur nach Anspruch 1 oder Verfahren nach Anspruch 2, bei dem das endogene FAR1-Gen nicht funktionell exprimiert wird.

12. Hefezell-Kultur nach Anspruch 1 oder Verfahren nach Anspruch 2, weiterhin umfassend einen selektierbaren Marker, der durch den Pheromon-Signalweg aktiviert wird.

13. Hefezell-Kultur oder Verfahren nach Anspruch 12, wobei der selektierbare Marker ein Reportergen umfaßt, das einen Pheromon-responsiven Promotor einschließt, der funktionell an ein fremdes selektierbares Gen gebunden ist.

14. Hefezell-Kultur oder Verfahren nach Anspruch 13, bei dem das selektierbare Gen ein IGP-Dehydratase-Gen ist.

15. Hefezell-Kultur oder Verfahren nach Anspruch 13, bei dem der homologe Wild-Typ-Promotor der FUS1-Promotor ist.

16. Hefezell-Kultur nach Anspruch 1 oder Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Zelle(n) zur Spezies Saccharomyces cerevisiae gehören.

17. Hefezell-Kultur nach Anspruch 1 oder Verfahren nach Anspruch 2, bei dem das Protein des Pheromon-Systems eine Farnesyltransferase ist.

18. Hefezell-Kultur nach Anspruch 1 oder Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Protein des Pheromon-Systems eine Carboxymethyltransferase ist.

19. Hefezell-Kultur nach Anspruch 1 oder Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Protein des Pheromon-Systems eine Kinase ist.

20. Hefezell-Kultur nach Anspruch 1 oder Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Hefe-Pheromon-System-Protein eine Protease ist, die in die Erzeugung der reifen Form des Hefe-Pheromons durch die Spaltung eines Vorläufer-Proteins involviert ist, und das Surrogat ebenfalls eine Protease ist.

21. Hefezell-Kultur oder Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Vorläufer-Protein, das in der Zelle(n) erzeugt wird, selbst ein Surrogat des Hefe-Pheromon-Vorläufer-Proteins ist, und wobei das Surrogat-Vorläufer-Protein eine Aminosäuresequenz aufweist, die eine Erkennungsstelle umfaßt, die durch die Surrogat-Protease erkannt wird, wobei die Erkennungsstelle sich von derjenigen, die durch die Hefe-Pheromon-System-Protease erkannt wird, unterscheidet, wobei jedoch das Surrogat-Vorläufer- Protein durch die Surrogat-Protease zur Erzeugung der reifen Form des Hefe-Pheromons gespalten wird.

22. Hefezell-Kultur oder Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Pheromon-Vorläufer-Protein der Wild-Typ-Hefe nicht in der (den) Zelle(n) erzeugt wird.

23. Hefezell-Kultur nach Anspruch 1 oder Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Protein des Hefe-Pheromon-Systems ein ABC-Transporter ist, der in den Membrantransport des Hefe-Pheromons involviert ist, und das Surrogat ebenfalls ein ABC-Transporter ist.

24. Hefezell-Kultur oder Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Surrogat das Hefe-Pheromon transportiert, solange bis das Peptid einen derartigen Transport stört.

25. Hefezell-Kultur oder Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Surrogat das Hefe-Pheromon nur mit Hilfe des Peptids transportiert.

26. Hefezell-Kultur nach Anspruch 1 oder Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Protein des Hefe-Pheromon-Systems der Hefe-Pheromon- Rezeptor ist.

27. Hefezell-Kultur oder Verfahren nach Anspruch 26, wobei in zumindest einer Zelle das Peptid ein Agonist für den Surrogat-Rezeptor ist.

28. Hefezell-Kultur oder Verfahren nach Anspruch 26, bei der zumindest in einer Zelle das Peptid ein Antagonist des Surrogat-Rezeptors ist.

29. Hefezell-Kultur oder Verfahren nach Anspruch 26, bei dem die Hefe-Zelle(n) weiterhin eine chimäre Gα-Untereinheit eines G-Proteins umfaßt.

30. Hefezell-Kultur oder Verfahren nach Anspruch 29, bei der der amino-terminale Anteil der chimären Gα-Untereinheit mit der Gα-Untereinheit eines Hefe-G-Proteins homolog ist und der Rest mit dem entsprechenden Anteil einer Gα- Untereinheit eines heterologen G-Proteins homolog ist.

31. Hefezell-Kultur nach Anspruch 1 oder Verfahren nach Anspruch 2, bei dem das Protein des Pheromon-System ein Cyclin ist.

32. Hefezell-Kultur oder Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Hefe-Zelle weiterhin einen nicht-pheromon-responsiven screenbaren Marker exprimiert, der von dem Peptid verschieden ist.

33. Verfahren der Untersuchung eines Peptides zur Modulierung bezüglich der Aktivität des Nicht-Hefe-Surrogats für ein Protein des Pheromon-Systems, das ein Bereitstellen einer Kultur von Hefe-Zellen nach einem der Ansprüche 1 und 3 bis 32 umfaßt, wobei die Zellen das Surrogat und das heterologe Peptid funktionell exprimieren, und ein Bestimmen durch Nachweis einer Veränderung des selektierbaren oder screenbaren Ereignisses umfaßt, ob der Pheromon-Signalweg durch Interaktion mit dem Surrogat oder dem Peptid aktiviert oder gehemmt ist.

34. Verfahren nach Anspruch 33, bei dem die Zellen einen pheromon-responsiven, selektierbaren Marker umfassen, und wobei die Zellen zur Expression eines unterschiedlichen Peptides selektiert sind, das die erwünschte aktivierende oder hemmende Wirkung aufweist.

35. Verfahren nach Anspruch 33, bei dem die Zellen einen pheromon-responsiven, screenbaren Marker umfassen, und wobei die Zellen bezüglich einer Expression eines Peptids gescreent werden, das die gewünschte aktivierende oder hemmende Wirkung aufweist.

36. Verfahren der Untersuchung einer Peptid-Bibliothek bezüglich der Aktivität eines Protein-Surrogats des Nicht-Hefe- Pheromon-Systems, das ein Bereitstellen einer Hefe-Kultur nach Anspruch 1 oder einem der Ansprüche 3 bis 32 umfaßt, deren Zellen funktionell das Surrogat und ein heterologes Peptid der Bibliothek exprimieren, wobei die Kultur kollektiv die Peptid-Bibliothek exprimiert, und Bestimmen durch Nachweis einer Veränderung in dem selektierbaren oder screenbaren Ereignis, ob der Pheromon-Signalweg durch Interaktion des Surrogats und der Peptide in jeder der Zellen der Kultur aktiviert oder gehemmt wird.

37. Verfahren nach Anspruch 34, bei dem das Surrogat menschliches Mdr1 ist, die Zellen auf histidin-freien Medien nur wachsen, wenn das Surrogat einen α-Faktor transportiert, wobei die Zellen nur galactosesensitiv sind, wenn das Surrogat einen α-Faktor transportiert, und bei dem die endogenen pleiotropen Arzneistoff- Resistenzgene inaktiviert wurden.

38. Zellkultur oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1-32, bei dem das heterologe Peptid 5 bis 50 Aminosäuren lang ist.