JP2001507201A

JP2001507201A - 酵母での機能的脊椎動物ホスホリパーゼの発現

Info

Publication number: JP2001507201A
Application number: JP50214497A
Authority: JP
Inventors: ポール，ジエレミー・アイ; ブローチ，ジエイムズ・アール
Original assignee: カダス・フアーマシユーチカル・コーポレーシヨン
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 2001-06-05
Also published as: CA2220459A1; EP0832248A2; WO1996040939A3; WO1996040939A2; AU6110896A

Abstract

(57)【要約】異種ホスホリパーゼＣタンパク質を含む酵母細胞、および、ホスホリパーゼＣのモジュレーター（すなわちアゴニストもしくはアンタゴニスト）を同定する薬物スクリーニングアッセイでのそれらの使用の方法が記述される。

Description

【発明の詳細な説明】酵母での機能的脊椎動物ホスホリパーゼの発現関連出願の交差引用本発明は1995年６月７日に提出されたU.S.S.N 08/431,632号の一部継続出願である。発明の分野本発明は、酵母での異種ホスホリパーゼの機能的発現、組み換え酵母細胞、ならびに、とりわけ、ホスホリパーゼを必要とするシグナル伝達経路のアゴニストおよびアンタゴニストの同定を包含する工作された細胞を使用する方法に関する。発明の背景真核生物のホスホリパーゼは、多数の細胞タイプでの細胞の成長、分化および分泌の事象の調節で重要な、細胞のシグナル伝達過程に関与することが知られている。ある細胞表面レセプターへのアゴニストの結合は、リン脂質由来のセカンドメッセンジャーを包含する多様なシグナル発生(signaling)分子の産生につながる。リン脂質由来のセカンドメッセンジャーは、一過性のおよび持続性の双方の応答を媒介し、また、成長の調節、免疫の調整および神経伝達を包含する幅広く多様な生理学的応答に関係している。過去20年にわたる研究は、膜脂質が、リン脂質由来のセカンドメッセンジャーの産生の原因である多種多様なホスホリパーゼの基質としてはたらくことを指摘する。これらは、ホスファチジルイノシトール(ホスホリパーゼＣ酵素の基質、下を参照)、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴリピド（例えば、スフィンゴミエリン、スフィンゴシン、リン酸スフィンゴシンおよびスフィンゴシンホスホコリン）を包含する。最近の総説についてはディシェヴァ(Dicheva)とアーヴィン(Irvine)（1995）Cell 80:269-278を参照。リン脂質のセカンドメッセンジャーの産生の原因であることが知られている、最低５種の異なるタイプのホスホリパーゼ活性、すなわちホスホリパーゼＡ（ホスホリパーゼＡ₁およびＡ₂を包含する）、ホスホリパーゼＢ、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＤおよびスフィンゴミエリナーゼが存在する。これらのホスホリパーゼのそれぞれの識別する特徴は、切断される基質結合、そしてこれ故に与えられたリン脂質基質から得られるセカンドメッセンジャーである。ＰＬＡ₁およびＰＬＡ₂（E.C.3.1.1.4）は、１,２-ジアシルグリセロール-３- ホスホコリンのｓｎ１およびｓｎ２の位置からの脂肪酸、とりわけアラキドン酸（ＡＡ）の放出を触媒し、それぞれ、ＡＡおよびリゾホスホリルコリン（リゾ- ＰＣ）を生じる。ＡＡは、順に、最低４種の既知の代謝の予定運命、すなわち、前炎症エイコサノイド（ロイコトリエンおよびプロスタグランジン）の産生、存在する膜リン脂質への再取り込み、可溶性リン脂質代謝経路への再取り込み、ならびに細胞からの直接の分泌を有する。加えて、リゾ-ＰＣは、血小板活性化因子（ＰＡＦ）のような脂質のセカンドメッセンジャーの産生の前駆体としてはたらく。膵の形態のＰＬＡ₂をコードするｃＤＮＡおよびゲノムのクローンは、ウシ（タナカ(Tanaka)ら1987）、ラット（オハラ(Ohara，O.)ら1986および1990；ならびにクスノキ(Kusunoki)ら1990）、イヌ（ケルフェレク(Kerfelec)ら1986）、ならびにブタ（ザイルハマー(Seilhamer)ら1986）を包含する多様な真核生物起源から単離されている。膵のＰＬＡ₂アイソフォームに加え、多様な細胞性ＰＬＡ₂（ｃＰＬＡ₂）アイソフォームが、脳（グレイ(Gray)とストリックランド(Strickland)、1982）、肝（デヴィンター(DeWinter)ら1982）、膵（テラモト(Teramoto)ら1983）、マクロファージ（トロッター(Trotter)とスミス(Smith)（1986）Neurochem．Res．11:349-361 ）、白血球（トレイナー(Traynor)とアウティ(Authi)1981）、および他のもの（総説についてはバン・デン・ボシュ(Ban Den Bosch)、1980を参照）を包含する幅広く多様な哺乳類の組織および細胞のタイプから単離されている。ヒト（クラーク(Clark)ら1991；シャープ(Sharp)ら1991）およびマウス（クラーク(Clark) ら1991）のｃＰＬＡ₂遺伝子産物のクローンが単離されそして特徴づけられている。これらのｃＤＮＡによりコードされる85kDaの遺伝子産物は、炎症応答に関与する細胞タイプ（好中球、血小板、単球およびマクロファージ）で発現され、また、その発現は、例えば、腫瘍壊死因子、ＩＬ-１、ＴＧＦ-β、ＭＣＳＦおよびグルココルチコイドにより調節される。ホスホリパーゼＢ（ＰＬＢ）は、真菌から哺乳類までの幅広い真核生物種で記述されている。ＰＬＢのアイソフォームは、リン脂質のｓｎ１およびｓｎ２の位置からの脂肪酸の遊離（ＰＬＡ₁およびＰＬＡ₂でのように）、リゾホリピド(lys opholipid)からの脂肪酸の遊離、ならびに、酵母サッカロミセスセレビシエ(S accharomyces cerevisiae)においては、リゾリン脂質からのリン脂質の合成を触媒するアシルトランスフェラーゼ活性（クワバラ(Kuwabara)ら1989；ガサマーディアーニ(Gassama-Diagne)1989；およびリー(Lee)ら1994）を包含するいくつかの触媒特性を有する。ＰＬＢ様酵素のゲノムのクローンは、Ｓ．セレビシエ(S. cerevisiae)（リー(Lee)ら1994）およびペニシリウムノナツム(Penicillium n onatum)（マスダ(Masuda)ら1991）を包含するいくつかの起源から単離されている。ＰＬＣ-α、-β、-γおよび-δとして知られるその最低４種のサブファミリーが存在するホスホリパーゼＣ酵素（ＰＬＣ；E.C.3.1.4.3）（総説についてはリー(Rhee)ら1989、およびクック(Cook)とウェイクラム(Wakelam)1992bを参照）は、ホスファチジルイノシトール(４,５)ビスリン酸（ＰＩＰ₂）の加水分解を触媒して、２種のセカンドメッセンジャー、すなわち、カルシウムの細胞内貯蔵の動員に関与するイノシトール-１,４,５-トリリン酸（ＩＰ₃）およびプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ；E.C.2.7.1.37）の選択されたアイソフォームに結合し、そして活性化するジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を形成する。このクラスの酵素、およびそれらにより産生されたセカンドメッセンジャーは、レセプターチロシンキナーゼ、Ｇタンパク質が結合されたレセプターに、ならびにＴ細胞抗原レセプター、Ｂ細胞抗原レセプターおよび免疫グロブリンＦｃレセプターのようなＭＩＲＲに結合されることが立証されている。ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ；E.C.3.1.4.4）は、ホスファチジルコリンの加水分解を触媒してホスファチジル酸（ＰＡ）および遊離のコリンを生じる（ビショップ(Bishop)、パクター(Pachter)とパイ(Pai)1992；およびクック(Cook)とウェイクラム(Wakelam)、1992aを参照）。ＰＡも遊離のコリンのどちらもセカンドメッセンジャーとして直接機能することが示されていない一方、ＰＡもしくはそのリゾ誘導体リゾＰＡは、ポリホスファチジルイノシトールの加水分解、ＰＫＣの活性化、アデニリルシクラーゼの阻害およびＤＮＡ合成の刺激を促進し（モーレナー(M oolenaar)ら、1986；ムラヤマ(Murayama)とウイ(Ui)、1987、ヴァン・コルヴェン(Van Corven)ら、1989；およびプレヴィン(Plevin)ら、1991b。クック(Cook) とウェイクラム(Wakelam)、1992bの引用文献）、ならびに、ＤＡＧに類似の様式でキナーゼを直接活性化する（エパンド(Eppand)とスタフォード(Stafford)、19 90、およびボッキナ(Bocckina)とエクストン(Exton)、1990、クック(Cook)とウェイクラム(Wakelam)、1992bの引用文献）よう機能しうることが最近報告されている。加えて、ＰＬＤの作用により形成されるホスファチジン酸は、ホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ（E.C.3.1.3.4）の作用によりＤＡＧに変換され得、そしてかようにＰＬＣ非依存性のメカニズムによるＤＡＧの産生のための二次的な貯蔵体(reservior)としてはたらき得る（ディヴェキア(Divechia)とアーヴィン(Irvine)1995、論評、に引用されるボンサー(Bonser)ら、1989；およびクック (Cook)とウェイクラム(Wakelam)、1992b）。ホスホリパーゼＤのｃＤＮＡクローンは、アルカノバクテリウムヘモリチクム(Arcanobacterium haemolyticum)（クエヴァス(Cuevas，W.A.)、とソンガー(J.G.L．Songer)、1993）、コリネバクテリウムシュードチューベルクロシス(Corynebacterium pseudotuberculosis) （未発表、ジェンバンク(Genbank)受託番号第L16586号、第L16587号）、ビブリオダムセラ(Vibrio damsela)（未発表、ジェンバンク(Genbank)受託番号第L16 584号）およびヒト（ツァング(Tsang)ら1993）を包含する多数の異なる種から単離されている。ホスホリパーゼＣ酵素ホスホリパーゼＣ酵素（ＰＬＣ；E.C.3.1.4.3）は、細胞外の刺激に対する多種多様な細胞の応答の細胞内の酵素メディエイターである。ホルモン、成長因子、神経伝達物質、および他のアゴニストの、特定の細胞表面レセプターへの結合が、ＰＬＣイソ酵素の活性化を開始し、これは、順に、少なくとも２種の十分に特徴づけられた活性のセカンドメッセンジャー、すなわちイノシトール-１,４,５-トリリン酸（１,４,５-ＩＰ₃）およびｓｎ-１,２-ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の産生をもたらす。１,４,５-ＩＰ₃は、細胞内カルシウムチャンネルのリアノジンレセプターファミリーに相同性をもつ小胞体の改変された部分に配置される細胞内レセプターの特定のファミリー（ＩＰ₃レセプターファミリー、ベリッジ(Berridge)、1993で論評される）に結合する。ＩＰ₃レセプターとして機能することに加え、これらのレセプターはまた、ＩＰ₃とのリガンド形成に際してカルシウムの細胞内貯蔵の放出を引き起こすＩＰ₃感受性カルシウムチャンネルとしても機能する。細胞内カルシウムの増加は、順に、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）アイソフォームの活性化、有糸分裂促進剤で活性化されるタンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）およびＪｕｎキナーゼ（ＪＮＫ）の経路を通じての転写活性化、ならびに有糸分裂誘発を包含するがこれらに制限されない、多様な細胞性シグナリング経路の一過性もしくは持続性の活性化をもたらす。ＤＡＧは、他方、ホルファチジルセリンおよびカルシウムと複合体を形成し、そしてプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）イソ酵素を活性化する。これは順に、アデニリルシクラーゼおよびＲＡＦ-１を包含する多様な基質の直接のリン酸化によりシグナリング経路を活性化する（パーカー(P.J．Parker)ら、1986；クーセン(Coussens)ら1986a、およびコルク(K olch)ら1993）。４個のクラスα、β、γ、δへのＰＬＣの分割は、当初、ウシ脳（ＰＬＣ-β、-γおよび-δ）ならびに肝、精嚢もしくは子宮（ＰＬＣ-α）を包含する他の組織から精製された、56kDa、150kDa、145kDaおよび85kDaの免疫学的に別個のタンパク質に対応した。（スー(Suh)ら1986に記述される；そしてモリス(A. J．Morris)ら1990に要約される）。これらの酵素の全ては類似の触媒特性を有し、そこでそれらはカルシウム依存性の様式でホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトール-４-モノリン酸（ＰＩＰ）およびホスファチジルイノシトール-４,５,ビスリン酸（ＰＩＰ2）を加水分解するが、しかし、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンもしくはホスファチジルエタノールアミンはしない。しかしながら、これらの免疫学的に別個のイソ酵素はいくつかの点で区別でき、それらの最少でないもの(not the least of)は、それらは全て、下により詳細に論考されるように、異なる遺伝子によりコードされる独特の遺伝子産物であるということである。酵素のレベルでは、これらの酵素はそれらの触媒特性およびそれらの調節の様式の双方に関して異なる。活性のための二価の陽イオンの要求に関しては、例えば、ポリホスファチジルイノシトールは、低いもしくは生理学的な細胞内カルシウム濃度でＰＬＣ-βおよび-δのクラスに好ましい基質である一方、ＰＬＣ-γイソ酵素は生理学的な細胞内カルシウム濃度でＰＩおよびＰＩＰ₂を好む。ＰＬＣイソ酵素の調節の様式もまた相互に関してかなり異なる。ＰＬＣ-βイソ酵素は、Ｇタンパク質が結合されたレセプターへのリガンド結合に応答して活性化され、そして、ヘテロ三量体のＧタンパク質のＧα およびＧβγ成分により直接刺激される。ＰＬＣ-γイソ酵素は、他方、レセプターおよび非レセプターのチロシンキナーゼを介するリン酸化により直接活性化される。インビボもしくはインビトロのＰＬＣ-αの活性の調節についてはほとんど知られていない一方、ＰＬＣ-δの調節の最近の研究は、それが、ｂｃｒのＧＴＰアーゼ活性化タンパク質相同領域への類似性を示し、ＲｈｏＡへのＧＡＰ活性を表し、そしてＰＬＣ -δ１に結合しかつ直接刺激する、新規のクラスの調節タンパク質（ｐ１２２− ＲｈｏＧＡＰ）により調節されうることを示唆する（ホンマ(Homma，Y.)、とエモリ(Y．Emori)、1995）。ＰＬＣイソ酵素のクローニング分子クローニング研究は、別個のＰＬＣイソ酵素をコードする最低10個の遺伝子の同定をもたらした。いくつかのＰＬＣ-αのｃＤＮＡクローンが、ラット好塩基球白血病細胞（ベネット(Bennett)ら1988）、マウスリンパ球（ヘンペル(He mpel)とデフランコ(DeFranco)、1991）およびウシ組織（ヒラノ(Hirano)ら、ジェンバンク(Genbank)受託番号第D16235号）を包含する多様な起源から単離されている。サブタイプ-β１-４をコードする４種のＰＬＣ-βコードｃＤＮＡ（スー(Suh)ら1988；バーク(Bahk)ら1994；パーク(Park)ら1992；リー(Lee)ら1993；およびキム(Kim)ら1993）が報告されている。２種のＰＬＣ-γコードｃＤＮＡが報告されており、これはＰＬＣ-γ１および-γ２のサブタイプに対応した（エモリ(Emori)ら1989；スー(Suh)ら、1988；およびバーゲス(Burgess)ら1990）。サブタイプＰＬＣ-δ１−３をコードする３種のＰＬＣ-δコードｃＤＮＡが公表されている（クック(Cook)とウェイクラム(Wakelam)、1992bおよびボイヤー(Boyer )ら、1994に総説がある）。ＰＬＣの配列比較ＰＬＣ-βアイソフォームの間の全体的な一次構造の同一性は極めて低く（同一性＜30％）、異なるイソ酵素間での大きさの差異、ならびに、多様な精製されたイソ酵素に対して発生された抗血清およびモノクローナル抗体で観察される免疫学的交差反応性の欠如を部分的に説明する。ＰＬＣ-β、-γおよび- δのイソ酵素はかなりの配列相同性を共有するが、しかしながら、２個の領域で、Ｘ領域およびＹ領域（リー(Rhee)ら、1989）もしくは領域ＩおよびII（メルドラム(Meldrum)ら1991）と様々に称される。Ｘ領域は長さおよそ150アミノ酸残基である一方、Ｙ領域は長さおよそ260残基である。クラス間で、Ｘ領域は、ＰＬＣ-β、-γおよび-δのイソ酵素間の対合様式の(pairwise)比較でおよそ50％の同一性を共有する一方、Ｙ領域はおよそ40％の同一性を共有する。ＰＬＣ-β、- γおよび-δのイソ酵素間のこれら２ドメインの保存の高程度に基づき、これらの領域がこれらの酵素の触媒活性に寄与することが議論されている。Ｘ領域とＹ領域との間のスペーサー領域の付加的な特徴は、ＰＬＣ-βおよび-δのクラスではこれらの領域が既知の調節モチーフと特定の相同性のない、セリン、スレオニンおよび酸性残基の豊富な50−100残基により分離される一方、ＰＬＣ-γのクラスではＸ領域およびＹ領域が400残基より多くにより分離されるということである。ＰＬＣ-γアイソフォームのこの領域は、２個のｓｒｃ相同(src homology) ２（ＳＨ２）ドメインおよび１個のｓｒｃ相同３（ＳＨ３）ドメインをコードする。これらはＰＬＣ-βもしくは-δの酵素のいずれかに存在しない。下で論考されるように、ＳＨ２ドメインは、レセプターおよび非レセプターのチロシンキナーゼによるＰＬＣ-γの活性化の調節に関与する。ラット好塩基球白血病細胞系統からのＰＬＣ-αのｃＤＮＡクローンの配列分析は、このクラスのホスホリパーゼＣイソ酵素のＰＬＣ-β、- γおよび-δのイソ酵素からのかなりの配列の逸脱を示す。ＰＬＣ-αは、全ての他のＰＬＣアイソフォームに見出される高度に保存されたＸ領域もしくはＹ領域も、ＰＬＣ-γアイソフォームに見出されるＳＨ２もしくはＳＨ３ドメインのいずれもコードしない。酵母のＰＬＣ先行するセクションで論考された哺乳類のＰＬＣ-βアイソフォームに加え、多様なＰＬＣがいくつかの他の生物体から単離されている。この点についてかなり重要なのは、酵母サッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)からのＰＬＣクラスのホスホリパーゼへの相同性をもつタンパク質をコードする遺伝子（ＰＬＣＩ）の分子クローニングである（ヨコオ(Yoko-O)ら1993；ペイン(P ayne)とフィッツジェラルド-ヘイズ(Fitzgerald-Hayes)、1993；およびフリック (Flick)とトーナー(Thorner)、1993）。独立に同定されたクローンの配列分析は、まず、全３個のクローンが同じ遺伝子座からであること、また、この遺伝子によりコードされるタンパク質は、それによりコードされる酵素の大きさに関して、ならびに、ＸドメインとＹドメインとの間の相対的距離、Ｙドメインを越えるカルボキシル末端の伸長ならびにＸモチーフとＹモチーフとの間のＳＨ２およびＳＨ３ドメインの非存在（この最後の点は、酵母が生化学的分析によりホスホチロシンの改変の証拠を示さないため、期待されるはずである）のような構造的特徴に関しての双方で、哺乳類のＰＬＣ-δイソ酵素に最も似ていることを示す。フリック(Flick)とトーナー(Thorner)(1993)は、酵母からこの酵素を過剰発現しかつ精製し、そして、哺乳類のＰＬＣ-δイソ酵素のものと似ている二価の陽イオンの要求および基質の好みをもつ付随されたホスホリパーゼＣ活性を立証した。最後に、ＰＬＣ１遺伝子座に欠失をもつ（ｐｌｃ１Δ）Ｓ．セレビシエ(S . cerevisiae)株の遺伝子分析は、高浸透度に対する感受性、グルコース以外の炭素源（すなわちガラクトース、ラフィノース、グリセロール／エタノール）での不十分な成長、上昇された温度（＞35℃）での温度感受性の成長、および最終的に染色体の誤った分離(missegregation)のような、ｐｌｃ１Δ遺伝子型に関連する条件付きで致死的な多様な表現型を示す（フリック(Flick)とトーナー(Thor ner)、1993、およびペイン(Payne)とフィッツジェラルド-ヘイズ(Fitzgerald-Ha yes)、1993）。酵母細胞での外来性タンパク質の発現幅広く多様な外来性タンパク質がＳ．セレビシエ(S. cerevisiae)で産生されており、これらは酵母の細胞質中に存続するか、もしくは酵母の分泌経路により支配される（キングズマン(Kingsman)らTIBTECH 5,53(1987)）。これらのタンパク質は、例として、インスリン様成長因子レセプター（シュトイベ(Steube)らEu r．J．Biochem．198、651(1991)）、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ヤバー(Jabbar)らProc．Natl．Acad．Sci．82、2019(1985)）ラット肝チトクロームＰ-450（オエダ(Oeda)らDNA 4、203(1985)）および機能的哺乳類抗体（ウッド(Wood)らNature 314、446(1985)）を包含する。酵母の分泌経路の使用が好まれる。なぜなら、それは、外来性タンパク質の正確なフォールディング、糖化および安定性を達成する見込みを増大させるからである。かように、酵母での異種タンパク質の発現は、しばしば、酵母の分泌タンパク質の遺伝子（例えばα因子フェロモンもしくはＳＵＣ２［インベルターゼ］遺伝子）でコードされるシグナル配列の、外来性タンパク質遺伝子のコーディング領域への融合を必要とする。多数の酵母発現ベクターが、外来性タンパク質の構成的なもしくは調節された発現を許すようデザインされている。構成プロモーターは、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）もしくはアルコールデヒドロゲナーゼＩ（ＡＤＨ１）のような解糖酵素をコードするもののような高度に発現される遺伝子由来であり、また、調節可能なプロモーターはガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）遺伝子を包含する多数の遺伝子由来である。加えて、過度に分泌する(supersecreting)酵母の突然変異体が生じ得る。これらの株は哺乳類のタンパク質をより効率的に分泌し、そして、酵母で大量の生物学的に活性の哺乳類のタンパク質を生じさせるための「産生」株として使用される（モア(Moir)とダヴィドウ(Davidow)、Meth．in Enzy mol．194、491(1991)）。当該分野の以下の２個の論評は、そっくそのまま引用により本明細書に組み込まれる。すなわち、”The Molecular and Cellular Bio logy of the Yeast．Saccharomyces，Genome dynamics，Protein Synthesis，an d Energetics.”1991。Ｊ．Ｒ．ブローチ(J.R．Broach)、ジョン・プリングル(J ohn Pringle)とエリザベス・ジョーンズ(Elizabeth Jones)により編。コールドスプリングハーバーラボラトリープレス(Cold Spring Harbor Laborato ry Press)；"Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology"1991。Methods in Enzymology vol.194。クリステイン・ガスリー(Christine Guthrie)とジェラルド・Ｒ．フィンク(Gerald R．Fink)により編。アカデミックプレス(Academi c Press)。いくつかのグループが酵母でホスホリパーゼを発現することを試みている。ヨコオ(Yoko-O)ら（(1993)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:180 4）は、結合していない(uncoupled)ラットＰＬＣδ１で酵母のＰＬＣ欠損の相補を達成することを主張する。ヨコオ(Yoko-o)らは、哺乳類のＰＬＣ酵素のＸ領域で見出された２個の保存されたアミノ酸配列から配列を取り込むようデザインされたプライマーを使用するＰＣＲの方法論によるＳ．セレビシエ(S. cerevisiae )からのＰＬＣのクローニングを報告する。この遺伝子をクローニングした後、彼らはＰＬＣ１遺伝子座で遺伝子の分裂を作成することに取りかかった。ヘテロ接合性の二倍体の形質転換体（ＰＬＣ１／ｐｌｃ１：：ＨＩＳ３）が胞子形成され、そして四分子染色体分析が実行された。ＴＹ１バックグラウンドで、全４個のスポアが、18℃、30℃および37℃を包含する温度範囲で生存能力のあることが見出された。ＴＹ４バックグラウンドで、ヨコオ(Yoko-o)らは、四分子染色体分析で30℃で致死性を観察した。これらの表現型は、本明細書に記述されるもの、および、37℃で条件付きの致死性が観察された、当該技術分野でフリック(Flick )とトーナー(Thorner)により報告されたものと正反対である。これは重要である。なぜなら、ヨコオ(Yoko-o)らの実験の非選択的条件下で増殖欠損の相補を測定することは可能でないからである。かように、ヨコオ(Yoko-o)らは、酵母細胞へのラットＰＬＣγの機能的組込みを観察しない。アルキンストール(Arkinstall)ら（(1995)Mol．Cell．Biol．15:1431）は、スキゾサッカロミセスポンベ(Schizosaccharomyces pombe)で、哺乳類の血小板由来増殖因子βレセプターおよびＰＬＣγ２を発現した。アルキンストール(Ark install)らは、マウスＰＤＧＦβレセプターおよびＰＬＣγ２を共発現する細胞では、放射活性的にラベルされた酵母細胞での[3Ｈ]イノシトールリン酸のレベルが増大したことを見出した。ｃ-ｓｒｃの共発現もまた、リン脂質の加水分解をもたらすことが見出された。これらの実験はホスホリパーゼＣγ刺激の即時の生化学的結果を測定するのみであるため、この研究もまた、酵母細胞への哺乳類のＰＬＣγの機能的組込みを教示できない。図面の簡単な説明第１図は、高塩培地でのｐｌｃ１成長欠損のヒトホスホリパーゼおよびＧα１６の相補を示す図解的表示である。すなわち、本文中に記述されるような以下のそれぞれをもつプラスミドで形質転換されたＳ．セレビシエ(S. cerevisiae)株ＣＹ１６３０（ＭＡＴα ｐｌｃ１Δ１：：Ｈｉｓ３ａｄｅ２-１０１ｈｉｓ３Δ２００ｌｅｕ２Δ１ｌｙｓ２-８０１ｔｒｐ１Δ１ｕｒａ３-５２）を、区分１−６、すなわち（１）Ｇａｌ１ｐ-ラットＰＬＣ-β１およびＧＰＡ１ｐ-Ｇα１６；（２）ＣＵＰ１-ヒトＰＬＣ-β２およびＧタンパク質なし；（３）ＣＵＰ１-ヒトＰＬＣ-β２およびＧＰＡ１ｐ-Ｇαｉ２-Ｑ２０５Ｌ：（４）ＣＵＰ１-ヒトＰＬＣ-β２およびＧＰＡ１ｐ-ＧαＳ-Ｑ２２７Ｌ；（５）ＣＵＰ１-ヒトＰＬＣ-β２およびＧＰＡ１ｐ-Ｇα１６；（６）ＰＬＣおよびＧＰＡ１-Ｇα１６なし、に、すじ状にした(streak out)。図で、記号（＋）は成長を表しそして（−）は成長なしを表す。発明の要約本発明は酵母細胞での哺乳類のホスホリパーゼの機能的発現に関する。哺乳類のホスホリパーゼの、もしくはホスホリパーゼのシグナル伝達経路に属する他のタンパク質、すなわち工作された酵母細胞中の哺乳類のホスホリパーゼに天然でもしくは人工的に「結合された」タンパク質の、潜在的な阻害剤もしくは活性化剤の同定における工作された酵母細胞の使用もまた本発明の範囲内にある。「結合された」という用語は、ここでは、結合されたタンパク質の阻害もしくは不活性化がホスホリパーゼの阻害もしくは不活性化（必ずしもそれぞれでない）をもたらすことを意味する。結合されたという用語は、酵母のシグナル伝達経路への異種のシグナリング分子の「天然の」結合、および、酵母細胞中で通常は影響を及ぼさない様式での酵母の経路への異種のシグナル発生分子の「人工的な」結合の双方を包含することを意図される。ヒトホスホリパーゼの機能的発現がとりわけ望ましい。一般に、主題の発明の酵母細胞は、異種ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）、例えばホスホリパーゼＣ活性を有するポリペプチドをコードする異種遺伝子を包含するよう特徴づけられる。好ましい態様において、ＰＬＣはヒトＰＬＣのような哺乳類のＰＬＣである。例えば、ＰＬＣは、ＰＬＣα、ＰＬＣβ、ＰＬＣδ、およびＰＬＣγから成る群から選択されるホスホリパーゼであり得る。好ましいＰＬＣは、ＰＬＣβ１、ＰＬＣβ２、ＰＬＣβ３およびＰＬＣβ４のようなβサブタイプのものである。ある態様において、異種ホスホリパーゼＣは構成的に活性化され得る。これは、ＰＬＣに対するシグナリングの非存在下で、野生型タンパク質に関してより高いレベルの活性をもたらすＰＬＣそれ自身に対する突然変異により発生しうる。他の態様において、ＰＬＣの構成的活性化は、レセプター、Ｇタンパク質などのようなＰＬＣの上流の調節物の共発現および／もしくはそれに対し構成的に活性化する突然変異により発生し得る。ある態様において、組み換え細胞は、ホスファチジールイノシトール４,５-ビスリン酸を加水分解する異種ＰＬＣの能力により特徴づけられる。他の態様において、酵母細胞は、内因性ホスホリパーゼ遺伝子に対する機能喪失突然変異を有し、第一の検出可能な表現型をそれに与え、そして、異種ＰＬＣは、機能喪失突然変異を補足しかつ細胞に第二の検出可能な表現型を分け与える。好ましい態様において、異種ＰＬＣは、細胞のホスホリパーゼ依存性のシグナル経路に機能的に組み込まれる。例えば、異種ＰＬＣは、酵母細胞の内因性ホスホリパーゼ遺伝子の機能喪失突然変異を補足しうる。例えば、異種ＰＬＣはｐｌｃ１Δ突然変異を補足しうる。異種ＰＬＣの発現は、異種ＰＬＣタンパク質の非存在下に、宿主細胞の表現型と検出可能に異なる表現型を宿主細胞に分け与えうる。例えば、ｐｌｃ１Δ突然変異のような機能喪失突然変異の、異種ＰＬＣによる相補は、温度感受性および／もしくは塩感受性のような表現型をレスキュー／克服し得る。ある態様において、異種ＰＬＣは、ホスホリパーゼ依存性のシグナル経路を介し、カルシウムの可動化(mobilization)および／もしくはＰＫＣ活性のような下流のエフェクターを調整し得る。さらに、ホスホリパーゼ依存性のシグナル経路が遺伝子発現を調整する態様において、組み換え細胞はまた、ホスホリパーゼ依存性のシグナル経路に応答する１個もしくはそれ以上の転写調節要素との影響を及ぼす結合に、レポーター遺伝子を含有するレポーター遺伝子構築物を包含するようにも工作されることができ、このレポーター遺伝子の発現は検出可能なシグナルを提供する。例証的なレポーター遺伝子は、色、蛍光、発光、細胞の栄養要求の細胞の生存能力の救援、細胞の成長、もしくは薬物耐性のような検出可能なシグナルを生じさせる遺伝子産物をコードする。好ましい態様において、レポーター遺伝子は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質およびアルカリホスファターゼから成る群から選択される遺伝子産物をコードする。他の態様において、レポーター遺伝子は、選択する作用物質例えばカナバニンの存在下で成長する能力を分け与える遺伝子産物をコードする。別の態様において、酵母細胞はさらに、ホスホリパーゼのシグナリング経路に結合される異種調節タンパク質を含む。例えば、この調節タンパク質は、異種ＰＬＣの活性を調整するか、もしくはＰＬＣ活性により調整される。例証的な調節タンパク質は、例えば、Ｇタンパク質ヘテロ三量体、Ｇαサブユニット、Ｇβγ サブユニット、ＰＬＣの基質と機能的に相互作用することが知られているタンパク質（例えばプロフィリン、ゲルソリン、コフィリンおよびα-アクチニン）、ならびにその活性がＰＬＣ活性に依存する他のエフェクター（すなわち、ＰＩ₃ レセプター／カルシウムチャンネル、およびＰＫＣもしくはカルシウム／カルモジュリンキナーゼ（ＣａＭキナーゼ）のようなＩＰ₃もしくはカルシウムに感受性の酵素活性））を包含する。別の態様において、酵母細胞は、異種レセプターもしくはイオンチャンネル、または、例えば直接もしくは調節タンパク質を介してのいずれかでＰＬＣ活性に協力する(couple)ことが知られている、ホスホリパーゼ依存性のシグナル経路を介してシグナルを伝達することが可能な他の表面タンパク質を含む。本発明のこの局面は、ホスホリパーゼＣの活性化を遂げる多様な異なる細胞のシグナリング成分の活性の調整をアッセイする、より一般的な読み出しシステムを提供する。好ましい態様において、宿主細胞はさらに、異種Ｇタンパク質が結合されたレセプターをコードする異種遺伝子を含む。好ましいＧタンパク質が結合されたレセプターは、化学誘引物質ペプチドレセプター、ニューロペプチドレセプター、サイトカイン、光レセプター、神経伝達物質レセプター、環状ＡＭＰレセプター、およびポリペプチドホルモンレセプターを包含する。例えば、レセプターは、α １Ａ-アドレナリン作動性レセプター、α１Ｂ-アドレナリン作動性レセプター、 α１Ｃ-アドレナリン作動性レセプター、Ｍ₁ＡＣｈＲレセプター、Ｍ₃ＡＣｈＲレセプター、Ｍ₅ＡＣｈＲレセプター、Ｄ₂ドーパミンレセプター、Ｄ₃ドーパミンレセプター、Ａ１アデノシンレセプター、５ＨＴ１様レセプター、５ＨＴ１ｄ様レセプター、５ＨＴ１ｄβレセプター、サブスタンスＫ（ニューロキニンＡ）レセプター、f-Met-Leu-Phe（ＦＭＬＰ）レセプター、アンジオテンシンIIタイプ１レセプター、ｍａｓ癌原遺伝子レセプター、エンドセリンＥＴＡレセプター、エンドセリンＥＴＢレセプター、トロンビンレセプター、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）レセプター、血管作用性腸ペプチドレセプター、オキシトシンレセプター、ＳＳＴＲ３レセプター、黄体形成ホルモン／絨毛膜ゴナドトロピン（ＬＨ／ＣＧ）レセプター、トロンボキサンＡ２レセプター、血小板活性化因子（ＰＡＦ）レセプター、Ｃ５ａアナフィラトキシンレセプター、インターロイキン８（ＩＬ-８）ＩＬ-８ＲＡレセプター、ＩＬ-８ＲＢレセプター、ｍｉｐ-１／ＲＡＮＴＥＳレセプター、代謝型グルタミン酸ｍＧｌｕＲ１−５レセプター、ＡＴＰレセプター、アミロイドタンパク質前駆体レセプター、ブラジキニンレセプター、ゴナドトロピン放出ホルモンレセプター、コレシストキニンレセプター、抗利尿ホルモンレセプター、副腎皮質刺激ホルモンIIレセプター、ＬＴＢ４、ＬＴＤ４タキキニンレセプター、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンレセプターおよびオキシトシンレセプターのいずれかひとつでありうる。他の態様において、レセプタータンパク質はレセプターチロシンキナーゼである。さらに別の態様において、組み換え細胞はさらに、異種の試験ポリペプチドをコードする発現可能な組み換え遺伝子を包含するよう工作される。好ましい態様において、こうした細胞は、試験ポリペプチドの多彩な集団を集合的に発現する混合培養系として提供される。本発明はまた、ホスホリパーゼ活性と特異的に相互作用しかつ調整する、製薬学的に有効な化合物をスクリーニングしかつ同定するための迅速で信頼性のあるそして有効なアッセイにも関する。主題のアッセイは、ホスホリパーゼの生物活性を調整する例えば作動するもしくは拮抗する化合物を同定するための多数の試験化合物の迅速なスクリーニングを可能にする。一般に、このアッセイは、工作された細胞で検出シグナルを生じる異種ホスホリパーゼ活性を発現するよう工作されたような、本明細書に記述される組み換え細胞の使用により特徴づけられる。本発明の細胞と接触された特定の試験化合物の、ホスホリパーゼ活性を調整する能力は、検出シグナルのアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションを検出することにより評価され得る。例えば、異種ホスホリパーゼ活性を介するセカンドメッセンジャーの産生が直接測定され得る。あるいは、レポーター遺伝子の使用が便宜的な読み出しを提供し得る。少なくとも、検出シグナルでの統計学的に有意の変化が、ホスホリパーゼの伝達活性のエフェクターである化合物の同定を促進するのに使用され得る。一態様において、（ｉ）請求の範囲１の細胞を、ホスホリパーゼ依存性のシグナル経路を介して伝達される細胞内シグナルを検出するのに適切な条件下で試験化合物と接触させること、そして（ii）試験化合物の存在下でホスホリパーゼ依存性のシグナル経路により伝達されるシグナルのレベルを測定すること、の段階を含む、ホスホリパーゼＣ活性のモジュレーターを同定するアッセイが提供される。試験化合物の存在下でのシグナルのレベルの統計学的に有意の差異、例えば試験化合物の非存在に関しての増大もしくは減少は、試験化合物が異種ホスホリパーゼＣ活性のモジュレーターであることを指摘する。細胞内シグナルは、例えば、ホスホリパーゼ依存性のシグナル経路に感受性の転写調節要素に実施可能に結合されたレポーター遺伝子の発現により検出され得る。他の態様において、細胞内シグナルは、ホスファチジルイノシトール４,５-ビスリン酸の加水分解産物を測定することにより、カルシウムイオンの動員を測定することにより、および／もしくはＰＫＣのようなプロテインキナーゼの活性化を測定することにより検出される。さらに他の態様において、細胞内シグナルは、温度感受性もしくは塩化ナトリウム感受性での変化のような、異種ホスホリパーゼにより分け与えられる表現型での変化を測定することにより検出され得る。好ましい態様において、アッセイは、内因性ホスホリパーゼ活性に対する機能喪失突然変異を補足する異種ＰＬＣの能力を利用する。主題のアッセイのこの態様は、一般に、（ｉ）細胞を、機能喪失突然変異の表現型もしくは補足された表現型の一方もしくは双方を検出するのに適切な条件下で試験化合物と接触させること、そして（ii）その試験化合物の存在下でのこれらの表現型の一方もしくは双方のレベルもしくは程度を測定すること、の段階を包含する。この測定を、試験化合物の非存在もしくは異種ホスホリパーゼＣの非存在下になされた類似の測定と比較することにより、試験化合物もしくはホスホリパーゼＣの非存在に関して表現型を変えるその試験化合物の能力が、異種ホスホリパーゼＣ活性のモジュレーターである試験化合物を同定するのに使用され得る。さらに別の態様において、アッセイは、異種ＰＬＣ活性からのホスホリパーゼ依存性のシグナル経路に感受性であるレポーター遺伝子構築物とともにさらに工作される細胞を利用する。こうしたアッセイの形式は、一般に、（ｉ）細胞を、レポーター遺伝子の発現に適切な条件下に試験化合物と接触させること、（ii）試験化合物の存在下にレポーター遺伝子の発現を検出すること、そして（iii）試験化合物の存在下のレポーター遺伝子発現のレベルを、試験化合物の非存在もしくは異種ホスホリパーゼＣの非存在下でのレポーター遺伝子発現のレベルと比較すること、の段階を包含する。試験化合物もしくはホスホリパーゼＣの非存在に関する、試験化合物の存在下のレポーター遺伝子発現のレベルでの統計学的に有意の差異は、その試験化合物が異種ホスホリパーゼＣ活性のモジュレーターであることを指摘する。アッセイのさらに別の態様は、哺乳類のホスホリパーゼに関して非哺乳類のホスホリパーゼＣを選択的に阻害する作用物質を同定するための差異に基づくスクリーニング形式を提供する。こうしたアッセイの形式は、（ｉ）非哺乳類のホスホリパーゼ遺伝子を含有する第一の酵母細胞を提供すること、（ii）哺乳類のホスホリパーゼ遺伝子を発現する第二の酵母細胞を提供すること、（iii）第一および第二の酵母細胞のそれぞれを試験化合物と接触させること、そして（iv）試験化合物の存在下の第一および第二の細胞のホスホリパーゼ活性を検出もしくは定量すること、の段階を包含し得る。第二の細胞に関する第一の細胞のホスホリパーゼ活性での統計学的により大きな低下は、その試験化合物が非哺乳類のホスホリパーゼＣを選択的に阻害することを指摘する。差異に基づくこうしたスクリーニング形式は、宿主哺乳類のホスホリパーゼに関して哺乳類の病原体のホスホリパーゼに選択的である阻害剤を同定するのに使用され得る。例えば、哺乳類のＰＬＣはヒトＰＬＣであり得、そして、非哺乳類のＰＬＣは、ヒトの真菌病原体、例えばカンジダ症、アスペルギルス症、ムコール菌症、ブラストミセス症、ゲオトリクム症、クリプトコックス症、クロモブラストミコーシス、ペニシリウム菌症、分生胞子症(conidiosporosis)、ノカルジア症、コクシジオイデス真菌症、ヒストプラスマ症、菌腫、リノスポリジウム症、monoliasis、偽放線菌症およびスポロトリクス症から成る群から選択される真菌症を引き起こす病原体に由来し得る。好ましい態様において、第一の細胞のホスホリパーゼは、カンジダアルビカンス(Candida albicans)、カンジダステラトイデア(Candida stellatoi dea )、カンジダトロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダパラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダクルセイ(Candida krusei)、カンジダシュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)、カンジダキレルモンジイ (Candida quillermondii)、カンジダルゴサ(Candida rugosa)、アスペルギルスフミガツス(Aspergillus fumigatus)、黄色アスペルギルス(Aspergillus fl avus )、アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルスニズランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルステレウス(Aspergillus terreus )、リゾプスアリズス(Rhizopus arrhizus)、リゾプスオリザエ(Rhizopus or yzae )、アブシジアコリムビフェラ(Absidia corymbifera)、アブシジアラモサ(Absidia ramosa)、およびムコールプシルス(Mucor pusillus)から成る群から選択されるヒトの病原体からクローニングされ得る。本明細書に記述された主題の薬物スクリーニングアッセイのいずれにおいても、アッセイは、最低100個の異なる試験化合物、にもかかわらずより好ましくは最低10³、10⁴、10⁵、10⁶もしくは10⁷個の異なる（多彩な）化合物のライブラリーについて実施、例えば反復され得る。試験化合物は、例証するためには、ペプチド、核酸、炭水化物、小さな有機分子、天然の生成物の抽出物、合成化合物、もしくは組み合わせの化合物の混合物であり得る。本発明の実施は、別に指摘されない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、および免疫学の慣習的技術を採用することができ、これらは当該技術分野の技術内である。こうした技術は文献中に完全に説明される。例えば、Molecular Cloning A Laboratory M anual、第２版、サンブルック(Sambrook)、フリッチュ(Fritsch)とマニアティス (Maniatis)により編（コールドスプリングハーバーラボラトリープレス (Cold Spring Harbor Laboratory Press)：1989）；DNA Cloning、第ＩおよびII 巻（グローヴァー(D.N．Glover)編、1985）；Oligonucleotide Synthesis（ゲイト(M.J．Gait)編、1984）；マリス(Mullis)ら米国特許第4,683,195号；Nucleic Acid Hybridization（ヘイムズ(B.D．Hames)とヒギンズ(S.J．Higgins)編1984）；Transcription And Translation（ヘイムズ(B.D．Hames)とヒギンズ(S.J．Hig gins)編1984）；Immobilized Cells And Enzymes（ＩＲＬプレス(IRL Press) 、1986）；パーバル(B．Perbal)、A Practical Guide To Molecular Cloning(19 84)；学術論文、Methods In Enzymology（アカデミックプレスインク(Academic Press，Inc.)、ニューヨーク）；Methods In Enzymology、第154および155巻（ウ(Wu)ら編）、Immun ochemical Methods In Cell And Molecular Biology（メイヤー(Mayer)とウォーカー(Walker)、編、アカデミックプレス(Academic Press)、ロンドン、1987）；Handbook Of Experimental Immunology、第Ｉ−IV巻（ワイヤ(D.M．Weir)とブラックウェル(C.C．Blackwell)、編、1986）を参照。発明の詳細な説明ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）は、ジアシルグリセロールおよびリン酸化された極性の先端基を産生する、膜リン脂質中のｓｎ-３ホスホジエステル結合を加水分解する酵素のファミリーである。哺乳類のＰＬＣ酵素は、加水分解される極性の先端基、すなわちホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトールなどに特異性を表す。特定のＰＬＣ酵素によるホスファチジルイノシトール４,５-ビスリン酸［ｐｔｄＩｎｓ(４,５)Ｐ₂］の加水分解は、２種のセカンドメッセンジャー分子、すなわち、プロテインキナーゼＣの活性化に必要とされる共因子ジアシルグリセロール、および細胞内貯蔵からのカルシウムイオンの放出を促進する可溶性のセカンドメッセンジャー分子イノシトール１,４,５-トリリン酸（ＩＰ₃）を生じる（ベリッジ(Berridge)、（1987）Ann．Rev．Biochem 56:156-193）。細胞増殖におけるＰＬＣ活性化の重要性は、ＰｔｄＩｎｓ(４,５)Ｐ₂の加水分解が、多くの成長因子および有糸分裂促進剤のそれらのそれぞれのレセプターとの相互作用の後に続く初期の事象のひとつであるという事実から明らかである。しかしながら、ＰＬＣ活性化の重要性は増殖に制限されない。それは、分化、代謝、分泌、萎縮、および知覚認識を包含する多くの他の細胞過程を調節するレセプターにより顕在化される、最も普遍的な経膜的シグナリング事象のひとつである。こうしたＰＬＣ媒介性の経膜的シグナリング事象は、例えば、レセプターチロシンキナーゼおよびＧタンパク質が結合されたレセプターを介するシグナリングを包含する。さらに、放出されるジアシルグリセロールは、ジグリセロールリパーゼおよびモノグリセロールリパーゼの連続的作用により遊離のアラキドン酸にさらに代謝されうる。かように、ホスホリパーゼＣは、セカンドメッセンジャー分子の産生で重要な酵素であるのみならず、選んだ組織でのエイコサノイド生合成に利用できるアラキドン酸を作ることにおいても重要な役割をつとめうる。本発明は、機能的異種ホスホリパーゼを発現し、そして、異種ホスホリパーゼと特異的に相互作用しかつその活性を調整する製薬学的に有効な化合物をスクリーニングしかつ同定するための迅速で有効なアッセイを利用できるようにするための酵母株の開発に基づく。本明細書に記述されるように、本発明は、細胞の機能を調整するのに、ならびに、ホスホリパーゼと特異的に相互作用する化合物の薬理学を理解するのに有用であり得る薬物を発見するための便宜的な形式を提供する。本発明のさらなる記述の前に、明細書、実施例および付録としてつけられた請求の範囲で採用されるある用語が、便宜性のためここに収集される。「シグナル伝達」は、それにより化学的シグナルが細胞膜を介して細胞の環境から細胞の標的に中継される過程であり、また、リン酸化、イオンチャンネルの活性化、グアニンヌクレオチド結合タンパク質中間体を介するエフェクター酵素の活性化、ホスホリパーゼの活性化、および／もしくは転写因子の直接の活性化（もしくは阻害）のような１種もしくはそれ以上のメカニズムを通して発生しうる。「哺乳類のホスホリパーゼ」は、哺乳類に天然に存在するホスホリパーゼと同一であるか、もしくはそうした哺乳類のホスホリパーゼと本質的に相同で、そして配列において酵母のホスホリパーゼによりもそれにより類似の突然変異体であるかのいずれかのタンパク質である。「霊長類のホスホリパーゼ」もしくは「ヒトのホスホリパーゼ」のような関連する用語は類似して定義される。哺乳類のホスホリパーゼは、それが、単独で、もしくは他の外因性タンパク質と協力して、または薬物により改変された後に、のいずれかで、工作された酵母細胞内でホスホリパーゼ活性を提供することが可能である場合、酵母のタンパク質に「機能的に相同」である。それは酵母のタンパク質と同じくらい有効である必要はないが、しかしながら、それが類似の酵母のタンパク質の活性の最低10％を有することが望ましい。ホスホリパーゼの「アクチベーター」もしくは「アゴニスト」は、ホスホリパーゼがより酵素的に活性になることを引き起こす、例えば、リン脂質の加水分解が特定の条件下で起こる速度を上昇させる物質である。アクチベーターの作用様式は、直接、例えばホスホリパーゼに結合することによる、もしくは間接、例えばそうでなければホスホリパーゼと相互作用する別の分子に結合することによる、でありうる。逆に、ホスホリパーゼの「阻害剤もしくはアンタゴニスト」は、この酵素をより小さく活性にすることを引き起こし、そしてそれにより検出可能な程度までの加水分解のセカンドメッセンジャーの割合もしくは産生を低下させる物質である。この低下は完全もしくは部分的で、かっ、直接もしくは間接の効果によることができる。本明細書で使用されるような「ホスホリパーゼ媒介性のシグナル経路」という用語は、細胞内シグナルの伝達での１段階としてホスホリパーゼ活性を包含するシグナル伝達経路を指す。こうしたシグナル伝達経路は、それらの活性が直接ホスホリパーゼにより調整されるにしろ、ホスホリパーゼもしくはそのセカンドメッセンジャーにより間接的に調整されるにしろ、その活性がホスホリパーゼにより調整される経路の成分を包含することを意味される。この用語はまた、ホスホリパーゼ活性を調節するホスホリパーゼの「上流」である経路の成分も包含する。本明細書で使用されるような「機能的組込み」という用語は、ホスホリパーゼ活性の遠位の効果が決定される得ようにホスホリパーゼ依存性のシグナル伝達経路で機能する外因性ホスホリパーゼの能力、すなわち、ホスホリパーゼ依存性のリン脂質加水分解から産生される生成物により調節される活性を指す。こうした遠位のシグナリング効果は、機能的なもしくは突然変異のいずれかのホスホリパーゼを発現する酵母で観察され得る。機能的組込みの別の例は、ホスホリパーゼの機能喪失酵母株でみられる効果の多面発現性のひとつ（例えば低下された成長もしくは塩化ナトリウム感受性）の異種ホスホリパーゼＣによる相補である。機能的相補の別のアッセイは、遺伝子転写を調整する異種ホスホリパーゼの能力である。機能的組込みのさらに別のアッセイは、調節されたホスホリパーゼ活性の再構成、すなわち刺激を必要とするホスホリパーゼ活性、例えばレセプター−リガンドの活性化に際しての、もしくはＧタンパク質サブユニット（１種もしくは複数）による活性化に際してのホスホリパーゼ活性である。この用語はまた、内因性の酵母の経路もしくは酵母細胞で天然に見出されない成分を包含するキメラの経路へのホスホリパーゼの機能的組込みも包含し得る。本明細書で使用されるような、その多様な文法上の形態の「ホスホリパーゼ活性の調整」という用語は、ホスホリパーゼを必要とする１種もしくはそれ以上のシグナル伝達経路の誘導および／もしくは増強ならびに阻害を意味する。こうした調整は、直接ホスホリパーゼに対する、または、ホスホリパーゼを必要とするシグナル伝達経路の成分例えば上流の調節要素もしくは基質を包含する下流の要素に対する化合物の効果を必要としうる。アミノ酸配列に関して使用される場合の「本質的に相同」という用語は、コンホメーションでの相同性、および従って類似の生物学的活性を生じさせる、配列において本質的に同一もしくは類似である配列を指す。この用語は配列の共通の進化を含意することを意図されない。典型的には、「本質的に相同な」配列は、少なくとも所望の活性に関与することが知られているいかなる領域にわたっても、配列において最低50％、より好ましくは最低80％同一である。最も好ましくは、末端でのほかはわずか５残基が異なる。好ましくは、少なくとも前述の領域での配列の逸脱は「保存的改変」の形態にある。「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、本明細書で交換できるように使用される。本明細書で使用されるような「組み換え細胞」は、異種ＤＮＡの導入により改変されているいかなる細胞も包含する。コントロール細胞は、組み換え細胞に本質的に同一であるが、しかし異種ＤＮＡによりコードされるタンパク質の１種もしくはそれ以上を発現しない、例えば、外因性のホスホリパーゼ、調節タンパク質、試験ポリペプチド、もしくはレポーター遺伝子構築物の１種もしくはそれ以上を包含もしくは発現しない細胞を包含する。本明細書で使用されるような「異種ＤＮＡ」もしくは「異種核酸」という用語は、それが存在するゲノム、またはそれが天然に存在する場所と異なるゲノム中の場所（１個所もしくは複数）で見出されるＤＮＡの一部として天然に存在しないＤＮＡを包含することを意味される。異種ＤＮＡは、それが導入される細胞にとって内因性でないが、しかし別の細胞から得られている、すなわち細胞にとって外因性である。一般に、とは言え必然的にでなく、こうしたＤＮＡはそれが発現される細胞により通常は産生されないＲＮＡおよびタンパク質をコードする。異種ＤＮＡはまた外来性ＤＮＡとも称されうる。当業者が、発現される細胞にとって異種もしくは外来性と認識もしくは考慮するであろういかなるＤＮＡも、本明細書では異種ＤＮＡという用語により包含される。異種ＤＮＡの例は、ホスホリパーゼ、試験ポリペプチド、調節タンパク質、レポーター遺伝子、転写および翻訳の調節配列、または薬物耐性を分け与えるタンパク質のような、選択可能なもしくは追跡可能なマーカータンパク質をコードするＤＮＡを包含するがしかしこれらに制限されない。「組み換えタンパク質」、「異種タンパク質」および「外因性タンパク質」という用語は、明細書全体で交換できるように使用され、そして、組み換えＤＮＡ技術により産生されるポリペプチドを指す。ここで、一般に、ポリペプチドをコードするＤＮＡは、異種タンパク質を産生するよう宿主細胞を形質転換するのに順に使用される適する発現ベクターに挿入される。すなわち、このポリペプチドは異種核酸から発現される。「異種ホスホリパーゼ」は、ホスホリパーゼ活性を有する非酵母のホスホリパーゼ酵素を指す。例えば、ホスホリパーゼＣは、カルシウムの存在下で、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトール４-モノリン酸（ＰＩＰ）もしくはホスファチジルイノシトール(４,５)ビスリン酸（ＰＩＰ₂）を、少なくともイノシトール-１,４,５-トリリン酸（ＩＰ₃）およびジアシルグリセロール（ＤＡＧ）に変換し得る。本明細書で使用されるような「内因性の突然変異ホスホリパーゼ遺伝子」は、内因性の突然変異のもしくは損なわれた酵母のホスホリパーゼタンパク質をコードする酵母のホスホリパーゼ遺伝子を指す。例えば、内因性の突然変異のホスホリパーゼは、欠失、挿入、点突然変異もしくは条件付きの減損(impairment)もしくは構成的な減損をもたらす他の突然変異を有することができ、それらを選択もしくは相補の研究に理想的とする。内因性の突然変異のホスホリパーゼ遺伝子の一例は、Ｓ．セレビシエ(S. cerevisiae)のＰＬＣ１遺伝子座（ｐｌｃ１）での欠失突然変異体である。これらの突然変異体は野生型ＰＬＣ１株とのいくつかの表現型の差異を有する。ｐｌｃ１株は30℃で高浸透度（0.5M塩化ナトリウムもしくは1.2Mソルビトール）に感受性であり、また、グルコース以外の炭素源（すなわちグリセロール／エタノール、ラフィノース、およびガラクトース）の存在下で十分に成長しない。最終的に、ｐｌｃ１株は温度感受性の表現型を有し、35℃ より上の温度ではｐｌｃ１株は成長しない一方、35℃より下の温度ではそれらは野生型の株より遅くはあるが成長する。「機能喪失」突然変異は、ホスホリパーゼ遺伝子の活性の変化につながるものである。こうした突然変異は、内因性の酵母のホスホリパーゼのコーディング配列、転写、もしくは翻訳の１種もしくはそれ以上を変えうる。こうした突然変異は、酵母ホスホリパーゼの発現の欠如、または、不活性の酵母ホスホリパーゼもしくは低下された活性のホスホリパーゼの発現につながることができる。本明細書で使用されるような「レポーター遺伝子構築物」は、転写調節配列に影響を及ぼすように結合された「レポーター遺伝子」を包含する核酸である。レポーター遺伝子の転写はこれらの配列により制御される。これらの制御配列の最低１種もしくはそれ以上の活性は、ホスホリパーゼを必要とするシグナル伝達経路により直接もしくは間接的に調節される、例えば、ホスホリパーゼ活性により産生されるセカンドメッセンジャーにより直接もしくは間接的に調節される。転写調節配列は、プロモーター、および、プロモーター活性を調整するエンハンサー配列のような他の調節領域、あるいは、プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼの活性もしくは効率を調整する調節配列、またはホスホリパーゼの活性化に際して特異的に誘導されるものを包含するエフェクター分子により認識される調節配列を包含し得る。例えば、プロモーター活性の調整は、プロモーター領域へのＲＮＡポリメラーゼの結合を変えることによるか、もしくは、あるいは、転写の開始もしくはｍＲＮＡの伸長を妨害することにより遂げられうる。こうした配列は、本明細書では、転写調節要素もしくは配列と集合的に称される。加えて、この構築物は、ＰＬＣのセカンドメッセンジャーに応答して生じるｍＲＮＡの安定性もしくは転写速度を変え、それによりレポーター遺伝子産物の量を変えるヌクレオチド配列を包含しうる。本明細書で使用されるような「異種調節タンパク質」は、異種ホスホリパーゼを調節するもしくはこれに結合されるタンパク質を指す。こうした調節タンパク質はホスホリパーゼの上流もしくは下流にあることができ、また、ホスホリパーゼ活性を調整するもしくはホスホリパーゼにより調整されることが可能である。好ましい調節タンパク質はＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質）であり、本明細書で使用されるようなこれは、ヘテロ三量体のＧタンパク質、そのＧタンパク質サブユニット例えばα、βおよびγサブユニット、もしくは機能的ヘテロ二量体（例えばβγ）を指す。本明細書で使用されるような調節タンパク質はまた、ホスホリパーゼを必要とするシグナル伝達経路を調整するレセプターでもありうる。好ましい調節レセプターの例は、Ｇタンパク質が結合されたレセプター、レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、ｓｒｃキナーゼなどを介してシグナルを発するもののような非レセプターキナーゼの活性化を介してホスホリパーゼを活性化するレセプターのようなホスホリパーゼを直接活性化するものである。他の調節タンパク質は、ホンマ(Homma)とエモリ(Emori)、1995およびその中の引用文献で論考されるような多くのＰＬＣイソ酵素の好ましい基質であるＰＩＰ₂に結合し得る（例えばプロフィリン、コフィリン、ゲルソリンおよびα-アクチニン）。調節タンパク質は下にさらに詳細に論考される。本明細書で使用されるような「細胞表面レセプター」は、細胞表面に存在し、細胞外環境と相互作用し、そして、特定のプロモーターの転写を最終的に調整する様式で環境に関する情報を細胞内に伝播させもしくは伝達して特定の遺伝子の転写をもたらす分子を指す。本明細書で使用されるような「細胞外シグナル」は、シグナルと直接もしくは間接的に相互作用する細胞表面タンパク質を介して細胞内に伝達される分子もしくは環境の変化を包含する。細胞外のシグナルもしくはエフェクター分子は、細胞表面タンパク質の活性をいくぶんか特異的に変えるいかなる化合物もしくは物質も包含する。こうしたシグナルの例は、細胞表面および／もしくは細胞内レセプターならびにイオンチャンネルに結合しそしてそうしたレセプターおよびチャンネルの活性を調整する、イオン、アセチルコリン、成長因子およびホルモンのような分子を包含するがしかしこれらに制限されない。細胞外シグナルはまた、ホスホリパーゼを必要とするシグナル伝達経路を調整しそしてそれにより細胞内の機能に影響を与える、これまでのところ同定されない物質も包含する。こうした細胞外シグナルは、ホスホリパーゼ活性を調整することにより特定の疾患を治療するのに使用されうる、潜在的な薬理学的作用物質である。Ｉ．アッセイの概観インビトロ試験は、その中でそれが高処理量のスクリーニングのデザインを可能にする好ましい方法論である。すなわち、少量の多数の化合物が短い時間の期間内および低い出費で試験され得る。至適には、動物は化合物評価の後の段階に残しておかれ、そして発見相で使用されない。動物全体の使用は大きな労働力を要し、また、極めて高価である。微生物は、哺乳類の細胞および組織よりずっと大きな程度、迅速な薬物スクリーニングでの使用に容易に活用され得る。酵母はとりわけ魅力的な試験系を提供する。この生物体の広範囲の分析は、酵母および高等の真核生物の双方での基本的な細胞過程で活性の、多様なタンパク質の構造および機能の保存を示している。上に述べられたように、本発明は、異種ホスホリパーゼを発現する組み換え酵母細胞、およびそうしたホスホリパーゼのシグナル伝達活性を調整することが可能な化合物を同定するのにこれらの細胞を使用する方法に関する。一般に、主題のアッセイは、そのシグナル伝達活性が検出可能なシグナルを生じるように組み換え細胞中で調整され得る異種ホスホリパーゼタンパク質を発現する組み換え細胞の使用により特徴づけられる。下に記述されるように、これらの細胞は（場合によっては）また、（ｉ）ポリペプチドライブラリーからの外因性の試験ポリペプチドをコードする発現可能な組み換え遺伝子、（ii）ホスホリパーゼ活性と結びつけられる調節タンパク質、および（iii）レポーター構築物、のひとつもしくはそれ以上も発現しうる。酵母での哺乳類のホスホリパーゼの機能的発現は、この酵素のモジュレーターの同定で有用な、安価なスクリーニングのデザインを提供し、その活性は哺乳類の細胞で中心的なシグナリング分子の産生に必要とされる。天然であれ合成であれ、いかなる化学的存在物もしくは化学的存在物の組み合わせが、哺乳類のホスホリパーゼを調整する能力についてスクリーニングされうる。これらのモジュレーターはこの酵素に直接作用して酵素の活性を変えうる。例えば、それらは、酵素の活性を、競合的に、非競合的に、および／もしくはアロステリックに増強または阻害し得るか、あるいは、ホスホリパーゼ活性を変える調節タンパク質の能力に影響を与えうる。一態様において、工作された細胞は、Ｇαもしくはいくつかの場合ではＧβγのように、ホスホリパーゼを直接活性化し得るかもしくは部分的に活性化されたホスホリパーゼの活性を増大させ得る薬物について、スクリーニングするのに使用される。ある態様において、キメラのＧαもしくはＧβγがこの目的のために発現されうる。第二の態様において、工作された細胞は、哺乳類のホスホリパーゼを阻害する薬物についてスクリーニングするのに使用される。この状況ではホスホリパーゼが最初に活性化されなくてはならない。これは、細胞を、ＧαもしくはＧβγを適切なように発現するよう工作することによりなされ得る。あるいは、細胞は、Ｇタンパク質およびＧタンパク質が結合されたレセプターの双方、もしくはホスホリパーゼ活性を制御するいかなる他のタンパク質、ならびに、外的に添加されるリガンドによるかもしくは共発現されるリガンドによるかのいずれかで刺激されるレセプターを共発現するよう工作されうる。どちらの場合にも、リガンドは単にホスホリパーゼの活性化を刺激するのにのみ使用される既知のアクチベーターであり、そして、薬物がこのホスホリパーゼの阻害についてスクリーニングされる。第三の態様において、工作された細胞は、例えば、調節タンパク質例えばＧタンパク質が結合されたレセプターへのそれらの作用により間接的にホスホリパーゼを阻害もしくは活性化する薬物についてスクリーニングするのに使用される。このレセプターはホスホリパーゼに作用するＧタンパク質サブユニットを活性化する。この場合には、適合するＧタンパク質が結合されたレセプターおよび適合するＧタンパク質が、同じ酵母細胞で哺乳類のホスホリパーゼを提供されるであろう。標的のホスホリパーゼのシグナル伝達活性を調整する、特定の試験化合物の能力は、検出シグナルのアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションを検出することにより評価され得る。例えば、ホスホリパーゼ依存性のシグナル経路を介するセカンドメッセンジャーの産生（例えばリン脂質の加水分解、カルシウムイオンの動員、もしくはＰＫＣの活性化）が直接測定され得る。あるいは、レポーター遺伝子の使用が便宜的な読み出しを提供し得る。ともかく、検出シグナルでの統計学的に有意の変化が、標的のホスホリパーゼのエフェクターである化合物の同定を促進するのに使用され得る。この方法により、ホスホリパーゼのシグナリングを調整する試験化合物がスクリーニングされ得る。試験化合物がホスホリパーゼの活性を誘導するようでない場合は、このアッセイは、反復されることができ、そして、組み換え細胞がまずホスホリパーゼの既知のアクチベーターと接触される段階の導入により改変されることができ、そして、試験化合物が、ホスホリパーゼの活性を阻害する、例えばホスホリパーゼのアンタゴニストを同定するその能力についてアッセイされ得る。あるいは、細胞は活性化されたホスホリパーゼとともに工作され得る。さらに他の態様において、試験化合物は、ホスホリパーゼの既知のアクチベーターへの応答を増強するメンバーについてスクリーニングされ得る。さらに別の態様において、ホスホリパーゼもしくはホスホリパーゼ調節タンパク質は、活性化されたホスホリパーゼの阻害剤のスクリーニングを促進するのに構成的に活性でありうる。例えば、Ｇ１１およびＧ１６のようなヘテロ三量体のＧｑファミリーのメンバーの、Ｇα ｑＱ２０９ＬおよびＧα １６Ｑ２１２Ｌのような構成的に活性の形態が記述されている。過剰発現のこれらのＧＴＡアーゼ欠損活性化Ｇα対立遺伝子は、基礎のホスホリパーゼＣ活性を構成的に上昇させることが見出され、ｃＪｕｎＮＨ₂ 末端キナーゼの持続する活性化につながった（ヒースレイ(Heasley)ら1996 Mol ．Cell．Biol．16:648；ヒースレイ(Heasley)ら1996 J．Biol．Chem．271:349；キアン(Qian)ら1994 J．Biol．Chem．1994．269:17417）。なおさらなる態様において、それを構成的に活性にするように突然変異されているα１β-アドレナリン作動性レセプターのようなホスホリパーゼ活性化レセプターの構成的に活性化された形態（ペレツ(Perez)ら1996．Mol．Pharmacol．49:112）、もしくはホルミルメチオニルロイシルフェニルアラニンレセプターの変えられた形態（アマトルーダ(Amatruda)ら1995．J．Biol．Chem．270:28010）が発現されうる。他の態様において、ホスホリパーゼそれ自身が構成的に活性化された形態で発現されうる。さらなる態様において、主題の被験細胞は、差異に基づくスクリーニングアッセイを実行するのに使用され得、例えばこれは非哺乳類の（例えば非ヒトの）ホスホリパーゼを選択的にもたらす化合物を同定するのに使用され得る。こうした化合物は、選択的阻害により、哺乳動物（例えばヒト）での病原体の感染（例えば、ウイルスの、真菌の、細菌のもしくは原生動物の）を治療もしくは予防するために使用され得る。哺乳類のホスホリパーゼに対する、差異に基づくスクリーニングアッセイを実行するのに好ましい異種ホスホリパーゼ酵素は、ウイルスの、真菌の、もしくは原生動物の病原体からのホスホリパーゼを包含する。真菌の病原体の例は、カンジダ症、アスペルギルス症、ムコール菌症、ブラストミセス症、ゲオトリクム症、クリプトコックス症、クロモブラストミコーシス、コクシジオイデス真菌症、分生胞子症(Conidiosporosis)、ヒストプラスマ症、菌腫、リノスポリジウム症、ノカルジア症、偽放線菌症、ペニシリン菌症、モノリアシス（Monoliasis）およびスポロトリクス症を引き起こす真菌を包含する。差異に基づくスクリーニングのさらなる態様において、ひとつのホスホリパーゼのかつ別のホスホリパーゼのでない活性を調整する、化合物の能力が測定されうる。例えば、ＰＬＣβのでかつＰＬＣγのでないアゴニストもしくはアンタゴニスト、または、ＰＬＣβ２を調整することが可能でかつＰＬＣβ３は可能でない化合物が選択されうる。さらに別の態様において、異種ホスホリパーゼを調整することが可能である一方でホスホリパーゼ経路のメンバーであることができるもしくはできない、ＰＫＣのような、シグナル伝達タンパク質の別のメンバーに影響を与えることが可能でない化合物が試験されうる。組み換え細胞のアッセイの開発において、ホスホリパーゼのシグナリング経路の活性化のよくある結果は、特定の遺伝子の転写の活性化もしくは不活性化、すなわち遺伝子の転写もしくは翻訳での迅速かつ検出可能な変化にしばしば最終的につながるホスホリパーゼの活性化であったことが認識された。かように、ホスホリパーゼ応答性の転写要素により制御される遺伝子の転写は、しばしば、細胞内シグナルの伝達による表面タンパク質の活性を反映する。例証するために、伝達される細胞内シグナルは、細胞外シグナル、とりわけリガンドのホスホリパーゼと結合される細胞表面レセプターとの特定の相互作用により開始され得る。この相互作用は細胞内の事象のカスケードを動き出させ、その最終的な結果は遺伝子の転写もしくは翻訳での迅速かつ検出可能な変化である。ホスホリパーゼ依存性の細胞内シグナルに応答性である転写調節配列を選択すること、および、選択されたプロモーターをその転写、翻訳もしくは最終的な活性が容易に検出可能かつ測定可能であるレポーター遺伝子に影響を及ぼして結合することにより、転写に基づくアッセイは、特定の試験化合物が細胞内伝達に影響を与えるかどうかの迅速な指摘を提供する。レポーター遺伝子の発現は、かように、ホスホリパーゼ活性のアゴニストもしくはアンタゴニストとして作用する化合物の開発のための価値のあるスクリーニング手段を提供する。本発明のレポーター遺伝子に基づくアッセイは、上に記述された事象のカスケードの最終段階、例えば転写の調整を測定し、そして、かように、異種ホスホリパーゼがシグナル伝達経路に機能的に組込まれるアッセイに理想的である。従って、アッセイの一態様の実行において、レポーター遺伝子構築物は、ホスホリパーゼ活性により産生されるセカンドメッセンジャーに依存する検出シグナルを生じさせるために被験細胞に挿入される。典型的には、レポーター遺伝子構築物は、ホスホリパーゼ依存性の検出シグナルを提供するレポーター遺伝子の発現のレベルで標的のホスホリパーゼのシグナル伝達活性に応答する、１種もしくはそれ以上の転写調節要素との影響を及ぼす結合にレポーター遺伝子を包含することができる。レポーター遺伝子からの転写量は、適することが当業者に知られているいずれかの方法を使用して測定されうる。例えば、特定のｍＲＮＡの発現はノーザンブロットを使用して検出されうるか、または、特定のタンパク質生成物は特徴的な染色もしくは固有の活性により同定されうる。レポーター遺伝子からの発現量は、その後、試験化合物の非存在下の同じ細胞での発現量と比較されるか、もしくは、それが標的のホスホリパーゼを欠く本質的に同一の細胞での転写量と比較されうるかのどちらかである。転写量でのいかなる統計学的もしくは別の有意の差異は、試験化合物が標的のホスホリパーゼの活性をいくぶんか変えていることを指摘する。下にさらに詳細に記述されるように、好ましい態様において、レポーター遺伝子産物はその産物に関連する固有の活性により検出される。例えば、レポーター遺伝子は、酵素活性により、色、蛍光、もしくは発光に基づく検出シグナルを生じさせる遺伝子産物をコードしうる。他の好ましい態様において、レポーターもしくはマーカーの遺伝子は、選択的な成長の利点を提供する。例えば、レポーター遺伝子は、細胞の生存能力を高め、細胞の栄養要求を救助し、および／もしくは薬物に対する耐性を提供することができる。他の態様において、セカンドメッセンジャーの産生は、細胞内カルシウムの動員のように検出段階で直接測定され得、もしくは、リン脂質の代謝が定量され、例えばリン脂質の加水分解生成物ＩＰ₃もしくはＤＡＧが測定され得るとみられる。例えば、哺乳類細胞でのＰＬＣ活性化の下流の効果のひとつはカルシウムイオンの動員である。本発明の教示は哺乳類のホスホリパーゼが酵母細胞に機能的に組込まれ得ることを立証するため、この効果が機能的な組み換えＰＬＣを発現する酵母細胞で期待されうることがありそうである。同様に、哺乳類のＰＬＣはそのセカンドメッセンジャー産物（ＤＡＧを包含する）を介してＰＫＣを調整することが知られているため、酵母での哺乳類のＰＬＣの機能的発現は、ＩＰ₃-レセプター、ＣａＭキナーゼ、カルモジュリン、ＰＫＡおよびＰＫＣ、もしくはホスホリパーゼと相互作用する他のタンパク質を包含する、シグナル経路の他のエフェクターと結合することが期待されうる。 II．宿主細胞本発明の宿主の酵母細胞は、培養可能でありかつその中で外因性のホスホリパーゼが調整され得るいずれかの種のものでありうる。適する種は、クルイベレイラクチス(Kluyverei lactis)、スキゾサッカロミセスポンベ(Schizosacchar omyces pombe)、およびウスチラコマイジス(Ustilaqo maydis)を包含し、サッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)が好ましい。本発明の実行において使用され得る他の酵母は、ニューロスポラクラッサ(Neurospora cras sa )、アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルスニズランス(Aspergillus nidulans)、ピキアパストリス(Pichia pastoris)、カンジダトロピカリス(Candida tropicalis)、およびハンセヌラポリモルファ(Hanse nula polymorpha)である。本明細書で使用されるような「酵母」という用語は、厳密な分類学的意味での酵母すなわち単細胞生物体のみならず、酵母様の多細胞真菌もしくは繊維状真菌も包含する。適切な宿主細胞の選択はまた、検出シグナルの選択によっても影響されることができる。例えば、レポーター構築物は、下に記述されるように、標的レセプターに結合されるシグナル伝達経路に応答する転写活性化（もしくは不活性化）に際して選択可能なもしくはスクリーニング可能な特性を提供し得る。レポーター遺伝子は、酵母での成長停止の原因の遺伝子のような、すでに宿主細胞の経路で改変されない遺伝子でありうる。それは「ホスホリパーゼ応答性」プロモーターに操作可能に結合されている宿主細胞遺伝子でありうる。あるいは、それは、そのように結合されている異種遺伝子でありうる。適する遺伝子およびプロモーターが以下に論考される。従って、選択もしくはスクリーニングを達成するためには宿主細胞が適切な表現型を有しなければならないことが理解されることができる。例えば、野生型のＨＩＳ３遺伝子を有する酵母にフェロモン応答性のキメラのＨＩＳ３遺伝子を導入することは遺伝子の選択を失敗させるとみられる。かように、栄養の選択を達成するには栄養要求性の株が望ましいことができる。宿主細胞の遺伝子に関する「不活性化」は、機能的遺伝子産物の産生が防止もしくは阻害されることを意味する。不活性化は、遺伝子の欠失、発現が起こらないようなプロモーターの突然変異、もしくは遺伝子産物が不活性であるようなコーディング配列の突然変異により達成されうる。不活性化は部分的もしくは全体的でありうる。従って、ある態様において、異種ホスホリパーゼ活性のスクリーニングを促進するのに内因性の酵母のホスホリパーゼを混乱させることが望ましいことができる。酵母の遺伝子学の分野は進んでおり、また、酵母遺伝子を混乱させる技術は当該技術分野で既知である。例えば、転位が、技術でフリック(Flick)とトーナー(Thorner)により記述されるように、改変された形態をもつ内因性の酵母のホスホリパーゼ遺伝子を置き換えるのに使用されうる。酵母のＰＬＣ１の場合は、ｐｌｃΔ１：：ＨＩＳ３突然変異が、以下のようにＰＬＣ１の内部のPvuII断片（ヌクレオチド＋1069ないし＋1482）をＨＩＳ３で置き換えることにより創製され得る。ＰＬＣ１の大部分を含有する3.7kbのEco RV断片が、EcoRVで切断されたＹＣｐ５０（ローズ(Rose)ら1987．Gene．60:237）中に挿入されてｐＪＦ１０を生じ得る。これはPvuIIで切断され得、そしてＨＩＳ３を含有するｐＪＪ２１５の2.1kbのPvuII断片と連結され得る（ジョーンズ(Jones)とプラカシュ(Prakash)。1990 Yeast 6:363）。生じるプラスミド（ｐＪＦ１８）では、ＨＩＳ３はＰｌｃ１ｐの残基357ないし494を置き換えている。ｐｌｃ１Δ１：：ＨＩＳ３対立遺伝子は、EcoRVで切断されたｐＪＦ１８を使用しかつヒスチジン原栄養体性について選択して、２種の異なるｈｉｓ３／ｈｉｓ３二倍体株、ＹＰＨ５０１（シコルスキ(Sikorski)とハイター(Heiter)。1989 G enetics 122:19）およびＷ３０３（トーマス(Thomas)とロトシュタイン(Rothste in)1989．Cell 56:619）のＤＮＡ媒介性の形質転換（ロトシュタイン(Rothstein )。1983．Methods Enzymol．101:202）により酵母細胞中に導入され得る。ｐｌｃ１Δ２：：ＬＥＵ２突然変異は、以下のようにＰＬＣ１のHpaI-ClaI区分（ヌクレオチド＋277ないし＋2333）をＬＥＵ２で置き換えることにより創製され得る。ｐＵＣ１９中に挿入されたＰＬＣ１を含有する4.3kbのHindIII断片から成るｐＪＦ５８がHpaIおよびClaIで切断され得、そして、大腸菌(E．coli)ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ(Klenow)断片とともにインキュベーションされ得る。生じる5.4kbの直鎖状にされたベクターは、ゲル精製され得、そして、ｐＪＪ２８３（ジョーンズ(Jones)とプラカシュ(Prakash)、上を参照）から削り取られ得そしてクレノウ酵素での処理により端のそろった末端に変換され得るＬＥＵ２を含有する2.2kbのSaII-XhoI断片と連結され得、ｐＪＦ９６を生じる。ＰＬＣ１遺伝子のほとんど完全な欠失であるｐｌｃ１Δ２：：ＬＥＵ２対立遺伝子は、 HindIIIで切断されたｐＪＦ９６を使用しかつロイシン原栄養体性について選択して、ｌｅｕ２／ｌｅｕ２二倍体株ＹＰＨ５０１のＤＮＡ媒介性の形質転換により、Ｓ．セレビシエ(S. cerevisiae)中に導入され得る。二倍体の形質転換体のそれぞれでのただ１個の相同物上の突然変異対立遺伝子による固有のＰＬＣ１遺伝子座の転位は、制限酵素切断およびサザンブロットハイブリダイゼーション分析により確認され得る（サンブルック(Sambrook)ら1989 ．Molecular cloning:a laboratory manual、第２版。コールドスプリングハーバーラボラトリープレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）。ヘテロ接合性のｐｌｃΔ１／ＰＬＣ１二倍体の胞子形成された培養系からの子嚢の表現型は、当該技術分野でのように決定されうる。理想的には、生じられたいかなる突然変異体も、例えば、37℃での成長の停止もしくは特定の炭素源での成長の不足のような選択可能な表現型を有することができ、高張性ストレスに対する（例えば塩もしくはソルビトールに対する）感受性を表すことができ、または窒素源を欠く培地上で成長できないことができる。好ましい態様において、内因性の突然変異ＰＬＣを発現する酵母細胞は、一組の実験条件下での成長が可能であることができ、また、第二の一組の実験条件下で成長できないもしくは成長の減損を表すことができる、すなわち条件付きで致死的であるとみられる。宿主細胞の遺伝子に関する「相補」は、宿主細胞の不活性化された遺伝子の少なくとも部分的な機能が外因性の核酸により補充されることを意味する。例えば、酵母細胞は、レセプターおよびシグナル伝達タンパク質の、哺乳類の相同物での相補により「哺乳類に適合される」および「ヒトに適合され」さえ得る。例証するために、酵母のホスホリパーゼ遺伝子の不活性化は、付録としてつけられる実施例で記述されるように、ヒトのホスホリパーゼ遺伝子の発現により補足され得る。ヒトのＰＬＣ-β２およびＧαｑファミリーメンバーで観察されるｐｌｃ１Δ ｔｓ表現型の相補は、これらの機能的に相互作用するタンパク質に向けられた多様なアゴニストおよびアンタゴニストを同定するスクリーニング形式で使用され得る。ＰＬＣ-βのアゴニストは、非許容性の成長条件下でＰＬＣ-β２を発現するがしかしいかなるＧαｑファミリーのＧαサブユニットも発現しないｐｌｃ１ Δ酵母株の成長を刺激する化合物についてのスクリーニングで同定され得る。野生型の酵母ＰＬＣ１を発現するｐｌｃ１Δ株は、適切な対向スクリーニング株としてはたらき得るとみられる。ＰＬＣ-βのアンタゴニストは２種の形式でスクリーニングされ得るとみられる。第一の形式では、非許容性条件下でのその成長がＧαｑサブユニットの共発現に依存しないｐｌｃ１Δ酵母株（すなわち哺乳類のＰＬＣ-β１、-β２もしくは-β３を高コピープラスミド上で発現する株）が、37℃でもしくは30℃で0.5M塩化ナトリウムで成長を阻害するがしかし30℃でしない化合物についてスクリーニングされ得るとみられる。この形式についての付加的な逆スクリーニングは、非許容性条件下でｐｌｃ１Δ株の成長を阻害するがしかしＰＬＣ１株の成長は阻害しない化合物についてスクリーニングすることであるとみられる。この逆スクリーニングは、一方もしくは他方または双方に作用するものと対照的に、真菌と哺乳類のＰＬＣアイソフォームに作用する化合物を区別するようはたらくとみられる。第二の形式では、非許容性条件下でのその成長がＧαｑサブユニットの共発現に依存するｐｌｃ１Δ酵母株（すなわちＰＬＣ -β２を低コピープラスミド上で発現する株）が、化合物と接触される場合に相補の損失についてスクリーニングされ得るとみられる。このスクリーニングは、理論上、ＰＬＣアイソフォームを直接阻害することによるか、またはＰＬＣ-βアイソフォームとＧαｑサブユニットとの間の相互作用を阻害することによるか、もしくはＧαｑサブユニットの活性化を阻害することによるかのいずれかで作用する化合物を検出し得るとみられる。スクリーニングでの機能の相補の使用の最後の例として、その中でＰＬＣ -βの下流のシグナリング成分の活性化もしくは阻害が形成された株を適切に評価され得る酵母株を構築することが可能でありうる。例えば、哺乳類のＰＬＣ- βアイソフォームおよびＰＫＣの双方を発現する株が、ＰＬＣ-βアイソフォーム、ＰＫＣアイソフォームもしくは双方のいずれかの活性を調整する化合物についてスクリーニングするのに使用されうる。主題のアッセイでの使用のための他の相補はいかなる過度の実験なしに構築され得る。実際、哺乳類のシグナル伝達タンパク質での酵母遺伝子の相補の多数の例が当該技術分野で記述されている。例えば、以下の表は、酵母の遺伝子を相補することが見出されているヒトの遺伝子のいくつかの一覧を包含する。真核生物細胞に異種ＤＮＡを導入する方法は当該技術分野でよく知られており、そしていかなるそうした方法も使用されうる。加えて、多様なホスホリパーゼおよび本明細書に記述される組み換えタンパク質の他のものは、当業者に既知であるか、もしくは当業者に既知のいずれかの方法によりクローニングされうる。一般に、発現ベクターのような遺伝子構築物にポリヌクレオチドコーディング配列を連結すること、および、真核生物（酵母、鳥類、昆虫もしくは哺乳類）または原核生物（細菌の細胞）のいずれかの宿主中に形質転換もしくはトランスフェクションすることは、配列をコードする外因性のレセプターおよびペプチドライブラリーを包含する他のよく知られたタンパク質の産生において使用される標準的処置である。類似の処置、もしくはそれらの改変が、主題の発明に従って組織培養技術により本発明の組み換え被験細胞を調製するのに採用され得る。一般に、ベクターは宿主細胞で複製が可能であることが望ましいことができる。それは、宿主ゲノム中に組込まれ、そしてその後に染色体ＤＮＡの一部として複製されるＤＮＡでありうるか、もしくは、それはプラスミドの場合でのように自律的に複製するＤＮＡでありうる。後者の場合には、ベクターは宿主中で機能性である複製開始点を包含することができる。組込みベクターの場合は、そのベクターは組込みを促進する配列、例えば宿主の配列に相同なもしくはインテグラーゼをコードする配列を包含しうる。多数のベクターが酵母での組み換えタンパク質の発現のために存在する。例えば、ＹＥＰ２４、ＹＩＰ５、ＹＥＰ５１、ＹＥＰ５２、ｐＹＥＳ２およびＹＲＰ１７は、Ｓ．セレビシエ(S. cerevisiae)への遺伝子構築物の導入で有用なクローニングおよび発現のベヒクルである（例えば、Expe rimental Manipulation of Gene Expression、イノウエ(M．Inouye)編アカデミックプレス(AcademicPress)、p.83中のブローチ(Broach)ら(1983)を参照、引用により本明細書に組み込まれる）。これらのベクターはｐＢＲ３２２ｏｒｉの存在により大腸菌(E．coli)中で、また、酵母の２μプラスミドの複製決定物によりＳ．セレビシエ(S.cerevisiae)中で複製し得る。加えて、アンピシリンのような薬剤耐性マーカーも使用され得る。さらに、酵母細胞での遺伝子発現は酵母中で機能性であるプロモーターを必要とすることが理解されることができる。適するプロモーターは、メタロチオネイン、３-ホスホグリセリン酸キナーゼ（ヒッツェマン(Hitzeman)ら、J．Biol．Ch em．255、2073(1980)）、もしくは、エノラーゼ、グリセルアルデヒド３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのような他の解糖酵素（ヘス(Hess)ら、J ．Adv．Enzyme Req．7、149(1968)；およびホランド(Holland)らBiochemistry 1 7、4900(1978)）のプロモーターを包含する。酵母の発現での使用に適するベクターおよびプロモーターは、ヒッツェマン(R．Hitzeman)ら、EPO公開第73,657号にさらに記述される。成長条件により制御される転写の付加的な利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、ならびに前述のメタロチオネインおよびグリセロアルデヒド３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびに、マルトースおよびガラクトースの利用の原因である酵素のプロモーター領域である。最後に、２個の半数体交配タイプの１個のみで活性であるプロモーターがある環境で適切でありうる。これらの半数体特異的プロモーターのうち、フェロモンプロモーターＭＦａｌおよびＭＦα１がとりわけ興味深い。 III．ホスホリパーゼ上に述べられたように、本発明の一局面は酵母細胞での異種ホスホリパーゼの機能的発現を包含する。好ましいホスホリパーゼはホスホリパーゼＣである。主題のスクリーニングアッセイを実施するのに好ましいＰＬＣは、ホスホリパーゼＣの４クラスのいずれかのいかなるイソタイプ（例えばα、β_1-4、γ₁および₂ 、もしくはδ_1-3）も包含する。ホスホリパーゼは、脊椎動物（例えば、ウシ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ネコ、イヌ、げっ歯類、ヒトもしくはヒトでない霊長類のような哺乳類）、無脊椎動物（例えば昆虫）、細菌、非細菌もしくはウイルスのホスホリパーゼの組み換えの形態でありうる。本発明の好ましいホスホリパーゼは哺乳類のであり、とりわけ好ましいホスホリパーゼはヒト起源のものである。いくつかのヒトＰＬＣもまたクローニングされている。例えば、ＰＬＣ（ジェンバンク(Genbank)受託番号第X14034号）、ＰＬＣ１（ジェンバンク受託番号第M37 238号）、ＰＬＣβ２（ジェンバンク受託番号第M95678号；パーク(Park)らJ．Bi ol．Chem．1992．267:16048もまた参照）、およびＰＬＣβ３（ジェンバンク受託番号第Z37566号、オオタ(Ohta)、マツイ(Matsui)、ナザワ(Nazawa)、ラガークランツ(Lagercrantz)ら（Genomics（1995）20:467:472）もまた参照）；ＰＬＣ β４（ジェンバンク受託番号第L41349号、アルヴァレズ(Alvarez)ら（1995）(Ge nomi cs 29:53)もまた参照）；ＰＬＣγ１（ジェンバンク受託番号第U09117号、チェン(Cheng)ら（1995）(J．Biol．Chem 270:5495)もまた参照）；ＰＬＣγ（ジェンバンク受託番号第M34667号、バージェス(Burgess)ら（1990）(Mol Cell Biol ．10:4770)もまた参照）、ならびにＰＬＣα（ジェンバンク受託番号第D16234号、ヒラノ(Hirano)ら（1994）Biochem Biophys Res．Commun 204:375もまた参照）。さらに、異種ホスホリパーゼは天然に存在するタンパク質である必要はなく、むしろ、それはホスホリパーゼの突然変異の形態でありうる。好ましくは、この突然変異体は、天然に存在するホスホリパーゼに本質的に相同、もしくは機能性であることが既知の突然変異体である。さらに、ホスホリパーゼをコードする構造遺伝子は、野生型の哺乳類の遺伝子もしくは改変された遺伝子でありうる。「隠れた」改変が、例えば、（１）対応するｍＲＮＡでの二次構造を排除すること、もしくは（２）それほど好まれないコドンを酵母により好まれるコドンで代えること、により発現を向上させるために、または、例えば制限酵素切断部位を導入すること、欠失させること、もしくは改変することによりクローニングを促進するためになされうる。遺伝子はまた、突然変異のホスホリパーゼがコードされるようにも改変されうる。酵母のコドン使用頻度の分析は、酵母に存在する最も豊富なイソ受容ｔＲＮＡから成る好ましいコドンの組が存在すること、および、この好ましい組（61個の可能なコーディングトリプレットのうち25個）は全ての酵母タンパク質について同じであること（ベネッツェン(Bennetzen)とホール(Hall)（1981）J．Biol．Ch em．257、3026-3031）を指摘する。豊富なタンパク質に必要とされる迅速な転写速度は、コドンの好ましい組の存在に選択圧力を提供すると考えられる。特定の遺伝子での偏らされたコドン使用頻度の程度が遺伝子発現のレベルと直接相関するため（ヘクマ(Hoekma)ら（1987）Mol．Cell．Biol．7、2914-2924）、酵母での異種遺伝子の発現を目指された実験戦略は、その生物体について記述されているコドンの偏りを活用する（シャープ(Sharp)ら（1986）Nuc．Acids Res．14、5125-5143）。例えば、典型的具体例で詳細に記述されるように、ＰＬＣ-β１のアミノ末端の７残基およびヒトＰＬＣ-β２のアミノ末端の21残基は、これらの変化を遂げるために合成オリゴヌクレオチドを使用して突然変異され得る。各構築物のヌクレオチド配列はその後、双方のＤＮＡ鎖上でのジデオキシヌクレオチド配列決定法により確認されうる。ここでとりわけ引用されない他の所望の保存性のアミノ酸の代用が、野生型タンパク質の活性のいかなる減少なしにホスホリパーゼの配列に対しなされうる。IV ．他の調節タンパク質特定の態様では、本発明の酵母細胞は、外因性（または外来性ともいう）のホスホリパーゼを調節する１つ以上の調節タンパク質を発現するようにさらに操作できる。好適な調節タンパク質は、Ｇ-タンパク質共役受容体、Ｇ-タンパク質、受容体チロシンキナーゼおよび／または非−受容体キナーゼである。他の調節タンパク質の例は、ホスホリパーゼ基質に結合し、そしてプロフィリンのようなホスホリパーゼの活性に影響を及ぼすタンパク質である。ホスホリパーゼ調節タンパク質を、以下に詳細に記載する。Ａ．Ｇ−タンパク質−共役受容体真核細胞中に見られるシグナル伝達カスケードの１ファミリーは、ヘテロ三量体型“Ｇタンパク質”を利用する。Ｇ-タンパク質−共役受容体による成長シグナルの伝達は、ホスホリパーゼ−依存的経路を含むことが示された。例えばβ- 型PLCアイソホームは、ヘテロ三量体型Ｇタンパク質のサブファミリーであるＧｑにより活性化される。さらに説明すると、このＧｑ_/11/16のα-サブユニットは、特異的にPLC-β１およびPLC-β３を調節し、そしてＧｉサブファミリーのβ ／γサブユニットはPLC-β２と相互作用する。特別なＧタンパク質−共役受容体とのアゴニスト作用で、Ｇｑタンパク質のＧαおよびＧβ/γサブユニットへの解離、ならびにＧαと結合しているＧＤＰのＧＴＰとの交換が生じる。生成したＧＴＰ−結合Ｇαサブユニットは、次にPLCβのアイソホームのような特定のPLC アイソホームを、酵素に結合することにより活性化する。Ｇタンパク質シグナル伝達系は、３成分を含む：受容体、ＧＴＰ-結合タンパク質(Ｇタンパク質)、および細胞内標的タンパク質。それらの休止期に、アルファ(α)、ベータ(β)およびガンマ(γ)サブユニットから成るＧタンパク質は、ヌクレオチドであるグアノシン二リン酸(ＧＤＰ)と複合体を形成し、そして受容体と接触する。リガンドが受容体に結合する時、この受容体は立体配置が変化し、そしてＧタンパク質との相互作用を変化させる。これはα-サブユニットにＧＤＰを放出させ、そしてより多くの豊富なヌクレオチドであるグアノシン三リン酸(ＧＴＰ)がそれに変わり、これによりＧタンパク質を活性化する。次にこのＧタンパク質は、解離して未だに複合化しているβおよびγサブユニットからαサブユニットを分離する。活性化された状態は、ＧＴＰがＧＤＰに、α-サブユニットに固有なGTPaseにより加水分解されるまで続く。ＧαサブユニットまたはＧβγ複合体のいずれかが、経路に応じて、ホスホリパーゼのようなエフェクターと相互作用する。ホスホリパーゼの場合には、この酵素は次に不活性な前駆体分子を、活性な細胞質中に拡散できる“第二メッセンジャー”に転換し、代謝カスケードの引き金を引く。時間が経過すると、ＧαはＧＴＰをＧＤＰに転換し、これによりそれ自体を不活性化する。不活性化されたＧαは、次に再度Ｇβγ複合体と会合する。数千とまではいかなくても数百の受容体がヘテロ三量体型Ｇタンパク質を通してシグナルを伝達し、その中で少なくとも明らかな17個の型が単離された。αサブユニットには大変な多様性が見られたが、数種の異なるβおよびγ構造が報告された。さらに数種の異なるＧタンパク質-依存的エフェクターがある。ほとんどのＧタンパク質結合受容体は、形質膜を７回通る単一のタンパク質鎖から成る。そのような受容体は、セブントランスメンブラン受容体(seven trans membrane receptor:STR)と呼ばれることが多い。以下は、細胞中でホスホイノシチド代謝に共役すると文献で報告され、したがって主題の試薬細胞を作成するために適する一部のセブントランスメンブランドメイン受容体のリストである：α 1A-アドレナリン性受容体、α1B-アドレナリン性受容体、α1C−アドレナリン性受容体、Ｍ₁ACh受容体、Ｍ₃ACh受容体、Ｍ₅ACh受容体、Ｄ₂ドーパミン受容体、Ｄ₃ドーパミン受容体、A1アデノシン受容体、5HT1-様受容体、5HT1d-様受容体、 5HT1dベーター受容体、サブスタンスＫ（ニューロキニンＡ）受容体、f-Met-Leu -Phe(FMLP)受容体、アンギオテンシンII型１受容体、masプロト-オンコジーン受容体、エンドセリンETA受容体、エンドセリンETB受容体、トロンビン受容体、成長ホルモン−放出ホルモン（GHRH）受容体、バソアクティブインスティナルペプチド受容体、オキシトシン受容体、SST3受容体、黄体形成ホルモン／絨毛性性腺刺激ホルモン(LH/CG)受容体、トロンボキサンA2受容体、血小板-活性化因子(PAF)受容体、C5aアナフィラトキシン受容体、インターロイキン８(IL-8)、IL-8A受容体、IL-8B受容体、mip-1/RANTES受容体、代謝型グルタミン酸mGlu1-５受容体、ATP受容体、アミロイドタンパク質前駆体受容体、ブラジキニン受容体、性腺刺激ホルモン-放出ホルモン受容体、コレシトキニン受容体、抗利尿ホルモン受容体、副腎皮質刺激ホルモンII受容体、LT B4受容体、LTD4受容体、タキキニン受容体、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体、バソプレッシン受容体およびオキシトシン受容体。例示したＧタンパク質共役受容体のクローニングに関する引用文献は、表１に与えられる。遺伝子が単離され、そして発現ベクターを構築できる特別なヒトＧタンパク質 -共役受容体は、本発明に掲げられた受容体、および当該技術分野で周知な他の受容体を含む。したがって、遺伝子は操作される細胞中で機能するプロモーター、およびまた細胞中で機能するシグナル配列に操作できるように連結される。例えば酵母の場合は、適当なプロモーターにはSte2、Ste3およびgall遺伝子に由来するプロモーターを含む。適当なシグナル配列には、このようなSte2、Ste3、ならびに酵母細胞により分泌されるタンパク質をコードする他の遺伝子のシグナル配列を含む。適当に、組換え受容体の酵母類似体を機能的状態で生産することができないように、酵母ゲノムを好ましく修飾する。Ｂ．Ｇタンパク質サブユニット PLC-β酵素は、ホルモン、神経伝達物質、小分子および他のアゴニストにより、リガンドがＧ-タンパク質共役受容体に結合することに反応して活性化される。これはＧαサブユニットのＧｑファミリーの員により媒介される百日咳毒素非感受性メカニズムを介して、ならびにＧｉまたはＧｏファミリーのＧαサブユニットを含むＧ-タンパク質複合体により媒介される百日咳毒素感受性メカニズムを介して起こる。Ｇｑファミリーの員によるPLC-β酵素の活性化に関して、すべてのＧｑファミリーの員(ｑ、11、14、15および16)がインビトロおよび細胞培養系の両方で、PLC-β１、-β２および-β３の触媒活性および-β４酵素を直接刺激することが示された(A.J.Morrisら、1990およびその中に記載されている文献；SternweisおよびSmrka 1992；Wuら、1992；およびLeeら、1992)。一方、他のＧαサブユニットの員（Ｇｉ、Ｇｏ、Ｇｔ、Ｇｚ）は、PLC-β活性を直接刺激しない。幾つかの細胞型では、PLC-β酵素の刺激が百日咳毒素処理に感受性であるという観察は、現在ではＧβγサブユニットの PLC-βアイソザイムに対する直接的効果によると考えられている(Boyerら、1994 ；ならびにClaphamおよびNeer,1993)。多くの研究室からの最近の研究は、PLC- βのアイソホーム(特にPLC-β２および-β３）が、Ｇβγサブユニットによる直接的な刺激に対して感受性であることを示した。このようにＧαｉまたはＧαＯ -含有ヘテロ三量体に由来するＧβγサブユニットは、過去の全細胞系で観察されたPLC-β刺激の百日咳毒素感受性に貢献できた。ＧαまたはＧβγサブユニットによる活性に必要なPLC-βアイソザイムの特定領域が、特性決定された。例えば欠失突然変異体は、PLC-β１のカルボキシル末端の残基(Wuら、1993)が、Ｇα サブユニットとの相互作用に決定的であり、一方、アミノ末端の残基はおそらくＧβγサブユニットが、PLC-β２のアミノ末端の150残基に存在する推定上のプレクストリンホモロジーと結合することを通して、Ｇβγサブユニットとの相互作用に必須であると思われることを示した（Ingleseら、1995、およびそこに引用されている文献）。本発明の特定の態様では、ホスポリパーゼおよび１つ以上の外因性Ｇタンパク質サブュニット（例えば、Ｇタンパク質αサブユニット）の両方を発現することが望ましいかもしれない。外因性Ｇαサブュニットが、内因性の酵母ＧβγまたはＧタンパク質共役受容体と十分に共役しなければ、Ｇαサブユニットは共役を向上させるために修飾することができる。これらの修飾は突然変異体の形を取ることが多く、これは受容体またはＧβγ複合体との相互作用に比べて、Ｇαサブユニットの酵母Ｇαとの類似性を増すが、受容体-会合Ｇαとの類似性を減じる。例えば、対応する酵母Ｇα残基と同一となるように、または少なくともその残基と同じ交換基群に属するように残基を変化させることができる。修飾した後、修飾したＧαサブユニットは、外来および／または酵母のＧαサブユニットと“実質的に相同的”であるか、または相同的でない。この修飾は好ましくは、受容体結合およびＧβγ結合の１つ、または両方に関与すると思われるＧαの領域に集中している。幾つかの態様ではこの修飾は、受容体−会合Ｇαの１つ以上のセグメントを、対応する酵母Ｇαセグメント（１つまたは複数）と置き換えた形を取り、これによりキメラＧαサブユニットを形成する。（添付の請求の範囲のために、用語“セグメント”は、３つ以上の連続するアミノ酸を言う）他の態様では、点突然変異で十分である。このキメラＧαサブユニットは、内因性受容体および酵母Ｇβγ複合体と相互作用し、これによりシグナル伝達がヘテロロガスなホスホリパーゼを含む経路を介して起こるようにすることができる。内因性の酵母Ｇβγの使用が好ましいが、外来またはキメラＧβγがシグナルを組換えホスホリパーゼに伝達できるならば、代わりに使用することができる。Ｃ．チロシンキナーゼ PLC-γ酵素のような特定のホスホリパーゼは、受容体型および非−受容体型チロシンキナーゼの両方による、鍵となるチロシン残基のリン酸化に反応して直接活性化される(CookおよびWakelam、1992bによりまとめられている)。PLCγ活性化を媒介する受容体の例には、固有のチロシンキナーゼ活性を有する上皮増殖因子（EGF）、血小板由来増殖因子(PDGF)、繊維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子（PDGF）、繊維芽細胞増殖因子(FGF)、神経成長因子(NGF)およびerbB2を含む(Kumjianら、(1991)J.Biol.Chem.266:3973;Margolsisら、1989,Cell 57:1101; Meisenhe lderら、1989.Cell 57:1109;Mohammadiら、1991,Mol.Cell.Biol.11:5068;Stephe nsら、1994.Neuron 12:691)。固有の酵素活性を欠く他の受容体系も、PLCに関連する。これらには一連のサイトカインの受容体を含む(Boultonら、1994,J.Biol. Chem .269:11648)、エリトロポエチン(Resら、1994.J.Biol.Chem.269:19633)、およびトロンビン(Guinebaultら、1993,Biochem J.292:851)、ならびに膜免疫グロブリンＭおよびＢリンパ球中のＣＤ40のようなマルチサブユニット免疫認識受容体（MIRR）(Coggeshallら、1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5660;Renら、1994 ,J.Exp.Med.179:673)、Ｔ-細胞抗原受容体(Parkら、1991,Proc.Natl.Acad.Sci.U SA 88:5453;WeissおよびLittman.1994,Cell 76:253)、好塩基性白血病細胞中の高−親和性免疫グロブリンＥ受容体(Liら、1992,Mol.Cell,Biol.12:3176;Parkら、1991 J.Biol.Chem,266:24237)および単球性細胞中の免疫グロブリンＧ受容体( Liaoら、1993,Biochem,Biophys.Res.Commun.191:1028)を含む。受容体が固有のチロシンキナーゼ活性を持たない時、受容体に共役する非−受容体タンパク質チロシンキナーゼ(lyn、sykおよびfynを含む、例えばSrcおよびSyk/ZAP70ファミリーの員)が、反応を媒介する(Liaoら、同上;Rheeら、1992,Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res .26:35-61;WeissおよびLittman、同上)。 PLC-γアイソザイムは、これらPTKのキナーゼドメイン内の自己リン酸化チロシン残基に、PLC ＸとＹ領域の間のスペーサー中に存在するSH２ドメインを介して特異的に結合し、そしてPLC自体はチロシンリン酸化の基質となる。受容体会合チロシンキナーゼ活性による特別なチロシン残基(PLC-γ１上のTyr783およびT yr1254、ならびにPLC-γ２上のTyr753およびTyr759)のリン酸化は、次に1,4,5-I P₃およびsn-1,2-ジアシルグリセロール(DAG)の生産増加をもたらすPLC-γアイソザイムの触媒活性を増大させる。Ｄ．他の調節タンパク質さらに他の調節タンパク質を、酵母細胞中でヘテロロガスなホスホリパーゼとともに同時発現させることができる。最近の研究も、細胞骨格要素とポリホスホイノシチドとの間の相互作用に集中している。例えばPtdIns(4,5)P₂は、プロフィリンに結合することが見いだされた。(Vojtekら、（1991）Cell 6:497)。PIP₂ -結合タンパク質はアクチンに結合し、そしてそのアッセンブリーをインビボで調節することが知られており、細胞骨格組織化の調節、容量調節および細胞骨格アッセンブリーの状態に関連する他の細胞性の機能におけるPLC酵素によるPIP₂ 加水分解の役割の可能性を示唆している。さらに、Goldschmidt-Clermontら(199 1)Science 251:1231は、インビボのPI代謝回転を調節するプロフィリンの役割を、PLC-γ１がチロシンリン酸化により活性化された時を除いて、プロフィリン- 結合PIP₂がPLC-γ11による開裂に対して耐性であることを示すことにより証明した。ホスホリパーゼを調節できる他の分子の例示としては、プロフィリン、ゲルゾリン、コフィリン、アルファ-アクチンおよびビリンを含む。PtdIns(4,5)P2のゲルゾリンおよびビリン上への結合部位が、最近、同定された(Janmeyら、(1992 )J.Biol.Chem 267:11818)。 PLC-δ調節の最近の研究では、bcrのGTPase活性化タンパク質相同領域への類似を示し、RhoAに対してGAP活性を表し、そしてPLC-δ１へ結合して直接刺激することを示す、新たな種類の調節タンパク質(p122-PhoGAP)によりPLC-δが調節され得ることを示唆している(Homma,YおよびY.Emori,1995)。他の報告は、rhoがPtdIns(4,5)P₂レベルを調節できることを示唆している(Chongら、（1994）Cell 79:507)。またPLCの中にはPLCβ1のように(BernsteinおよびRoss)、特定のＧｑファミリーの員にGAP-様活性を有するものもある。この活性は、ＧｑおよびＰＬＣ自体の活性の両方を下方調節するために役立つ。他の調節タンパク質の例には：IP3受容体、カルシウムチャンネル、DAGプロテインキナーゼＣ(PKC)、PKA3(cAMP依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニット) 、SOK1（PKA過剰発現のサプレッサー）、CMD1（カルモジュリン、CMK1(カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ)、およびCMK2（カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ）を含む。Ｖ．ドラッグスクリーニング特定の態様では、このアッセイは、ホスホリパーゼアゴニストおよび／またはアンタゴニストの多種の化合物ライブラリーを試すために、組換え細胞を使用することが特徴である。好適な態様では、試薬細胞は、検出できるシグナルを試薬細胞中に生産することができる哺乳類ホスホリパーゼを発現する。特定の態様では、試薬細胞は、スクリーニングされる試験化合物も生産する。例えば、試薬細胞は哺乳類のホスホリパーゼ活性をモジュレートするための能力についてスクリーニングされる試験ポリペプチド、試験核酸および／または試験炭水化物を生産することができる。そのような態様では、そのような試薬細胞の培養物は有力なホスホリパーゼエフェクターの多種ライブラリーを集合的に提供し、そしてホスホリパーゼ機能を作用させるか、または拮抗させる、いずれかのそのライブラリーの員を選択し、そして同定することができる。さらに試薬細胞は、哺乳類のホスホリパーゼ活性を直接変化させるか、または哺乳類のホスホリパーゼの幾つかの標的上流または下流に作用する薬剤を検出するために使用できることが明らかである。別の態様では、試験化合物を外部から加える。そのような態様では、試験化合物は試薬細胞と接触させられる。活性をスクリーニングできる化合物の例には、ペプチド、核酸、炭水化物、小有機分子および天然産物抽出物ライブラリーを含む。そのような態様では、ホスホリパーゼ機能を作用させる、または拮抗させる両方の化合物を選択し、そして同定することができる。さらに、試薬細胞は哺乳類ホスホリパーゼの活性を直接変化させる、または哺乳類のホスホリパーゼの幾つかの標的上流または下流に作用する薬剤を検出するために使用できることが明らかである。さらに他の態様では、試験化合物は、哺乳類ホスホリパーゼを発現する試薬細胞と一緒に同時培養される細胞により生産される。Ａ．スクリーニングおよび選択：第二メッセンジャー生産のアッセイペプチドの生物活性をスクリーニングする時、細胞内の第二メッセンジャー生産を直接測定することができる。第二メッセンジャーにより生成されたホスホリパーゼを直接測定するためのアッセイの例は、以下に与えられる：ホスホリパーゼが関与するシグナル伝達経路中で生産される第二メッセンジャーの測定用の他のアッセイは、当業者には明らかであり、そして以下に記載のアッセイに代えることができる。１つの態様では、ホスホリパーゼ酵素活性は、酵母細胞抽出物中で測定できる。他の態様では、ホスホリパーゼ活性検出の測定は、インタクトな酵母細胞を使用して行われる。特定の受容体は、ホスファチジルイノシトール4,5ビスホスフェートの1,4,5-I P₃(これは、細胞内Ｃａ++に移動性をもたせる）およびジアシルジクセロール(DA G)(これはプロテインキナーゼＣを活性化する)への分解を刺激するホスホリパーゼＣの活性を刺激する。イノシトール脂質を抽出し、そして標準的な脂質抽出法を使用して分析することができる。またDAGは、薄層クロマトグラフィーを使用して測定できる。すべての３種のイノシトール脂質の水溶性の誘導体(IP₁、IP₂ 、IP₃)も、放射標識法またはHPLCを使用して定量することができる。細胞内カルシウムの流通または細胞外部からのカルシウムの流入は、標準的な方法を使用して測定できる。適当なカルシウムインディケーター、蛍光性、生物発光性、メタロクロミック性またはＣａ⁺⁺-感受性の微小電極の選択は、細胞型ならびに実験中に起こる事象の規模および時間定数に依存する(Borleら、（1990 ）Environ Health Perspect 84:45-56)。Ｃａ⁺⁺検出法の例として、細胞は標準的な手法を使用して、Ｃａ⁺⁺-感受性の蛍光色素であるfura-2またはindo-1と投入され、そしてＣａ⁺⁺の任意の変化をフルオロメーターを使用して測定する。 PIP₂分解の他の産物、DAGもホスファチジルコリンから生成できる。受容体− 媒介シグナル発信に反応するこのリン脂質の分解も、種々の放射標識化法を使用して測定できる。ホスホリパーゼＡ２の活性化は、例えば細胞中のアラカドネート生成を含む周知技法を使用して、容易に定量できる。アッセイの特定の態様では、細胞性のリン酸化における変化をスクリーニングすることが望ましいかもしれない。ホスホリパーゼ活性をモジュレートする化合物の能力は、抗−ホスホチロシンを使用するコロニーイムノブロッティングを使用してスクリーニングすることができた(LyonsおよびNelson(198 4)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:7426-7430)。そのようなアッセイを行うための試薬は市販されており、例えばチロシンリン酸化の増加を測定するホスホチロシン特異的抗体およびホスホー特異的抗体を購入することができる（ニューイングランドバイオラボズ:New England Biolabs、ビバリー、マサチューセッツ州）。リン酸化のための試験は、ホスホリパーゼ活性のモジュレーションに反応してタンパク質のリン酸化を測定するために有用となることができ：タンパク質のリン酸化がホスホリパーゼ活性のモジュレーションにより直接影響を受ける必要はなく、むしろホスホリパーゼにより生成されるシグナルを増幅できることが注目される。マルチ−キナーゼカスケードは、シグナル増幅だけでなく、しばしば細胞型に特異的な多数のエフェクターにシグナルを拡散するこができ、増殖因子が１つの細胞の有糸分裂を刺激し、そして別の細胞の分化を刺激することを可能とする。そのようなカスケードの１つは、有糸分裂、分化およびストレス反応の両方を異なる細胞中で媒介するMAPキナーゼ経路である。増殖因子受容体の刺激は、Ras 活性化、続いてc-Raf、MEKおよびp44およびp42 MAPキナーゼ(ERK1およびERK2)の連続的な活性化をもたらす。活性化されたMAPキナーゼは、次にMAPキナーゼが核に位置を変えた時にリン酸化される多数の鍵となる調節タンパク質（p90RSKおよびElk-1を含む）をリン酸化する。相同的な経路が哺乳類および酵母細胞中に存在する。例えば、エス．セルビシエのフェロモン発信経路の本質的部分は、STE1 1、STE7およびFUS3/KSS1遺伝子(後者の対は明らかに異なり、そして機能的には重複する)の産物から成るプロテインキナーゼカスケードから成る。したがって、このキナーゼカスケードの員のリン酸化および／または活性化を検出し、そしてホスホリパーゼモジュレーションをアッセイするために使用できる。Ｂ．相補性突然変異体の内因性酵母遺伝子の相補性をアッセイするための方法は、当該技術分野で周知である；栄養要求性株の選択について、多数のアッセイが存在する。例えば、本明細書に詳細に記載するように、条件的PLC1突然変異体は、非許容的条件下で、酵母中で多面表現型を導き、そして哺乳類のPLCの機能的発現により相補された。本アッセイの１つの態様では、機能的に組み込まれた、外因性のホスホリパーゼのアゴニストおよび／またはアンタゴニストに関して試験することが、元の突然変異体表現型への逆戻りを観察することにより可能である。例えば酵母は、哺乳類PLCの発現時に温度またはNaCl感受性の表現型を表すことを止め、そして外因性のPLCのアンタゴニストを用いて処理すると、温度またはNaCl 感受性の表現型に戻ることができる。Ｃ．レポーター遺伝子構築物を使用するスクリーニングおよび選択本発明のレポーター遺伝子に基づくアッセイは、例えば転写的モジュレーションのような、上記のカスケードの出来事の最終段階を測定する。したがって、アッセイの１つの態様の実施では、ホスホリパーゼシグナル発信に依存する検出シグナルを生成するために、レポーター遺伝子構築物を試薬細胞に挿入する。典型的にはレポーター遺伝子構築物は、レポーター遺伝子をホスホリパーゼシグナルモジュレーションに関する１つ以上の転写調節要素を操作可能に連結して含み、レポーター遺伝子の発現レベルで、受容体−依存性の検出シグナルを提供する。もし唯一の転写調節要素が含まれるならば、これは調節可能なプロモーターでなければならない。少なくとも１つの選択された転写調節要素が、ヘテロロガスなホスホリパーゼの活性により間接的に、または直接調節されなければならず、これによりホスホリパーゼ活性はレポーター遺伝子の転写を介して監視することができる。多数のレポーター遺伝子および転写調節要素は、当業者には周知であり、そして他は当業者に周知な方法により同定または合成されることができる。レポーター遺伝子は、検出できる遺伝子産物を発現する任意の遺伝子を含み、これはRNAまたはタンパク質でもよい。好適なレポーター遺伝子は、容易に検出できるものである。このレポーター遺伝子は、望ましい転写調節配列を含む、または他の望ましい特性を表す遺伝子との融合遺伝子状態の構築物に含まれることもできる。レポーター遺伝子の例には、限定するわけではないがCAT(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)(AltonおよびVapnek(1979),Nature 282:864-869 )ルシフェラーゼ、および他の酵素検出系、例えばベーターガラクトシダーゼ：ホタルルシフェラーゼ(deWetら、(1987),Mol.Cell.Biol．7:725-737)；細菌ルシフェラーゼ(EngebrechtおよびSilverman(1984),PNAS 1:4154-4158;Baldwinら、(1984),Biochemistry 23:3663-3667)；アルカリホスファターゼ(Tohら、（198 9）Eur.J.Biochem.182:231-238,Hallら(1983)J.Mol.Appl.Gen.2:101)、ヒト胎盤分泌アルカリホスファターゼ(CullenおよびMalim(1992)Methods in Enzymol.216 :362-368)。レポーター遺伝子構築物に含むことができる転写制御要素には、限定するわけではないが、プロモーター、エンハンサーならびにリプレッサーおよびアクチベーター結合部位が含まれる。適当な転写制御要素は、ホスホリパーゼのモジュレーションの後に、遺伝子の発現が迅速に誘導される（一般的には数分内）、遺伝子の転写調節領域に由来するものであることができる。そのような遺伝子の例には、Ｃａ⁺⁺、cAMPおよび他のようなホスホリパーゼ活性化に際して生成される第二メッセンジャーに反応するものを含む。そのような遺伝子の１つは、c-fos、前初期遺伝子(Shengら、(1990),Neuron 4:477-485を参照にされたい)である。前初期遺伝子は、リガンドが細胞表面タンパク質に結合すると迅速に誘導される遺伝子である。転写制御要素が由来する好適な遺伝子の特徴は、限定するわけではないが、静止細胞中での低または非検出性発現、細胞外刺激の数分内に転写レベルでの迅速な誘導、一時的であり、そして新しいタンパク質合成とは無関係な誘導、続く転写の遮断に新たなタンパク質の合成を必要とし、そしてこれらの遺伝子から転写されるmRNAは短い半減期を有する、ということを含む。これらすべての特徴が存在する必要はない。レポーター遺伝子からの転写量は、当業者が適当であるとする周知の方法を使用して測定できる。例えば特異的なmRNA発現は、ノーザンブロットを使用して検出でき、または特異的なタンパク質生成物は、特徴的な染色または固有の活性により同定できる。好適な態様では、レポーターの遺伝子産物は、その生成物に付随する固有の活性により検出される。例えばレポーター遺伝子は、酵素活性により、色、蛍光または発光に基づく検出シグナルを生じる遺伝子産物をコードすることができる。レポーター遺伝子からの発現量は、次に試験化合物の不在下で同細胞中での発現量と比較するか、またはホスホリパーゼのようなヘテロロガスなDNAを欠く実質的に同一の細胞中での転写量と比較される。統計的に、またはそうではなく有意な転写量の差異は、試験化合物が幾つかの様式で、ホスホリパーゼの活性を変化させたことを示している。他の好適な態様では、レポーターまたはマーカー遺伝子は、中のペプチドが受容体のリガンドである、細胞の成長に有利となるような選択法を提供する。例えば、受容体は細胞の生存能力を強化することができる（例えば細胞の栄養要求性を解除することにより、かつ／または薬剤に対する耐性を提供することにより）。例えばレポーター遺伝子は、例えばカナバニンのような選択薬剤の存在下で成長する能力を付与する遺伝子prod ctをコードすることができる。例えば内因性の突然変異体ホスホリパーゼＣ遺伝子として、エス．セルビシエのplclΔ対立遺伝子の使用は、読み出し系を提供し、これにより機能的相補性（すなわち、第一の検出可能な表現型よりはむしろ、第二の検出可能な表現型の検出）を、細胞の成長により検出または定量することができる。しかし成長系は、それらの“定量的“性質に難点がある。内因性の突然変異体ホスホリパーゼＣがヘテロロガスなホスホリパーゼＣの発現により相補される時、異なる検出可能な表現型を提供する他の読み出し系は、所定の範囲でより感受性が高いか、または自動化でより便利となることができる。例えば転写に基づく読み出しは、迅速であり(すなわち日ではなく時間)、しかも読み出しの種類および読み出しの動的範囲という両方の意味においてより大きな柔軟性を提供するので、好適である。例えばlacZをコードする細菌遺伝子を、ホスホリパーゼの活性化に際して生成されるシグナルに感受性のプロモーターの制御下に置くことにより、経路は透化された酵母が発色性基質から色を生成する能力を監視することにより、１時間以内で検出できる。そのような読み出しの素早さは、それ自体有利である。しかもそのような読み出しは、酵母が成長しない条件下でホスホリパーゼ活性を監視するために必要である。転写の読み出しは、PLC1座により正または負に調節される遺伝子／プロモーターを同定することにより開発できる(すなわち、PLC1 vs.plclΔ株、またはヒトP LC-β２に加えてＧα16を発現するplclΔ株を、上方または下方調節するプロモーター)。次にこれらのプロモーターを、レポーター遺伝子に連結する。あるいはレポーター遺伝子を、IP3、DAG、細胞内カルシウムレベルの上昇またはPKC活性の増大のような、下流のホスホリパーゼＣシグナル分子に反応して発現させることができる。例えば、転写に基づく読み出しは、哺乳類のPLC酵素を以下のように発現する酵母を使用して構成することができる。CREBは、活性が特定のセリン(S133)でのリン酸化により調節される転写因子である。このセリン残基がリン酸化されると、“ホスホ−CREB”が、cAMPレベルの上昇に反応性であると知られているプロモーターの５'に見いだされるCRE(cAMP反応性要素)として知られている認識配列に結合する。リン酸化CREBがCREに結合すると、このプロモーターからの転写が増加する。CREBのリン酸化は、cAMPレベルの上昇および細胞内カルシウムレベルの上昇の両方に反応すると思われる。cAMPレベルの上昇は、プロテインキナーゼＡの活性化をもたらし、これは次にCREBをリン酸化し、そしてCREへの結合および転写の活性化を導く。細胞内カルシウムレベルの上昇は、カルシウム／カルモジュリン反応性キナーゼ（CaMキナーゼ）の活性化をもたらす。CaMキナーゼIVによるCREBのリン酸化は、PKAによるCREBのリン酸化と効果的に同様であり、そしてCRE含有プロモーターの転写活性化をもたらす。したがって転写に基づく読み出しは、哺乳類PLC酵素、調節タンパク質(Ｇαおよび／またはＧβγ)、必要ならば、かつ／またはレポーター遺伝子(すなわちla cZ)(その発現は、１つ以上のCREを以下の様式で含有する基本的プロモーターにより駆動される)を発現する、plclΔ酵母株に構築することができる。細胞内Ｃａ⁺⁺の濃度変化（組換えPLC活性の変化の結果）は、もしａ）CREBも細胞中で同時に発現され、そしてｂ）内因性の酵母CaMキナーゼがカルシウムの上昇に反応してCREBをリン酸化するか、または外で発現されたCaMキナーゼIVが同細胞中に存在するかのいずれかであるならば、CREBレポーター遺伝子の発現レベルに変化をもたらすだろう。換言すると、PLC活性の刺激はCREBのリン酸化およびCRE-lac Z構築物からの転写の増加をもたらすが、一方、PLC活性の阻害は、CRE-lacZ構築物からの転写の減少をもたらす。１つの態様では、プロモーターはホスホリパーゼの活性化に際して活性化され、この場合は、選択についてはマーカー遺伝子の発現が細胞に利益をもたらすべきである。好適なマーカー遺伝子は、イミダゾールグリセロールホスフェートデヒドラターゼ遺伝子(HIS3)である。ホスホリパーゼ反応性プロモーターが、有益な遺伝子に操作可能に連結されるならば、細胞はホスホリパーゼアクチベーターのスクリーニングまたは選択に有用となるだろう。もしホスホリパーゼ反応性プロモーターが、有害な遺伝子に連結されたならば、細胞はインヒビターのスクリーニングまたは選択に有用となるだろう。あるいは、プロモーターはホスホリパーゼにより抑制されるものでもよく、これにより細胞に有害な産物の発現を防止する。ホスホリパーゼー抑制プロモーターを用いて、プロモーターを有害な遺伝子に連結することによりアゴニストを、そして有益な遺伝子に連結することによりアンタゴニストをスクリーニングする。抑制は、mRNAの翻訳を阻害するように、ホスホリパーゼー誘導プロモーターを、マーカー遺伝子（コーディングまたはフランキング領域）によりコードされる mRNAの、少なくとも一部に対してアンチセンスであるmRNAをコードする遺伝子に操作できるように連結することにより成される。また抑制は、ホスホリパーゼ誘導プロモーターを、DNA-結合リプレッサータンパク質をコードする遺伝子に連結し、そして適当なオペレーター部位をプロモーターまたはマーカー遺伝子の他の適当な領域に包含することによっても得られる。酵母において、適当な陽性に選択できる（有益な）遺伝子は以下のものを含む：URA3、LYS2、HIS3、LEU2、TRP1；ADE1、2、3、4、5、7、8；ARG1、3、4、5、6 、8；HIS1、4、5：ILV1、2、5；THR1、4；TRP2、3、4、5；LEU1、4；MET2、3、4 、8、9、14、16、19；URA1、2、4、5、10；HOM3、6；ASP3；CH01；AR02、7；CYS 3 ；OLE1；INO1、2、4；PRO1、3。数え切れない他の遺伝子は、有力な選択的なマーカーである。上記は、よく特性が明らかにされている生合成経路に関与している。イミダゾールグリセロールホスフェートデヒドラターゼ（IGPデヒドラターゼ）遺伝子(HIS3)は、大変感受性が高く、しかも広い発現レベルにわたって選択できるという両点から好適である。単純な場合では、この細胞は活性化の不在では、ヒスチジンについて栄養要求性株（成長にヒスチジンが必要）である。活性化により酵素の合成が導かれると、細胞はヒスチジンについて原栄養株である（ヒスチジンの要求性はない）。すなわち選択は、ヒスチジンの不在下での成長に関する。細胞あたりわずか２−３分子のIGPデヒドラターゼがヒスチジンの原要求性には必要であるので、アッセイは大変感度が高い。適切なアッセイでは、いわゆる対向選択可能な（counterselectable）または負の選択が可能な遺伝子を使用できる。適当な遺伝子には；URA3(オロチジン-5' -ホスフェートデカルボキシラーゼ；5-フルオロオロト酸での成長を阻害する) 、LYS2(2-アミノアジペートレダクターゼ；唯一の窒素源としてα-アミノアジペートでの成長を阻害する)；CYH2（リボソームタンパク質L29をコードする；耐性対立遺伝子に対して優勢なシクロヘキシミド−感受性の対立遺伝子）、CAN1( アルギニン透過酵素をコードする；アルギンの類似体であるカナバニンに対して耐性を付与するヌル対立遺伝子)、ならびに他の劣性薬剤-耐性マーカーを含む。マーカー遺伝子はまた、スクリーニング可能な遺伝子でもよい。スクリーニングされる特性は、細胞形態、代謝または他のスクリーニング可能な特徴の変化であることができる。適当なマーカーには、ベーターガラクトシダーゼ(Xgal、C₁₂ FDG、Salmon-ゲル、Magenta-ゲル(後者の２つはBiosynth Agから))、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、エキソーグルカナーゼ（酵母exb1 遺伝子の産物；非必須、分泌型）；ルシフェラーゼ；細菌のグリーン蛍光タンパク質；（ヒト胎盤）分泌アルカリホスファターゼ(SEAP)；およびクロラムフェニコールトランスフェラーゼ(CAT)を含む。上記の中には、分泌されるように操作できるものもある(しかしβ-ガラクトシダーゼではない)。好適なスクリーニング可能なマーカー遺伝子は、ベータガラクトシダーゼ；無色の基質Xgalを青色色素に転換する酵素を発現する酵母細胞である。ここでも、プロモーターは受容体に誘導または受容体に阻害されることができる。Ｄ．ホスホリパーゼ以外のタンパク質の阻害または活性化の検出本発明はまた、酵母細胞が目的タンパク質をホスホリパーゼに直接的または間接的に機能的に“共役”する様式で発現するか、または発現するように操作されるならば、ホスホリパーゼ以外のタンパク質のインヒビターまたはアクチベーターの検出も容易にする。例えば酵母細胞は、ホスホリパーゼと直接的(例えばPDGF受容体)に、または調節タンパク質（例えばＧ-タンパク質共役受容体またはチロシンキナーゼ共役受容体）；Ｇ-タンパク質ヘテロ三量体；Ｇαサブユニット；Ｇβγサブユニット；既知のホスホリパーゼ基質と機能的に相互作用することが知られている他のタンパク質（例えばプロフィリン、ゲルゾリン、コフィリンおよびアルファ-アクチン）；ならびに活性がホスホリパーゼＣ活性に依存している他のエフェクター (すなわち、IP3受容体／カルシウムチャンネル、および他の有力なIP3感受性カルシウムチャンネル、ならびにPKCまたはCaMキナーゼのような他のカルシウム感受性酵素活性)を介して共役することが知られている、受容体のようなホスホリパーゼ活性を調節する、異なる細胞発信成分の種々の活性のモジュレーションについて、より汎用的な読み出し系に使用することもできる。好適な態様では、本発明の酵母細胞は、哺乳類のＧタンパク質-共役受容体の活性をモジュレートする薬剤を同定するために使用できる。この態様では、酵母細胞は、哺乳類Ｇタンパク質-共役受容体を発現するように操作される。Ｅ．試験化合物活性についてスクリーニングできる化合物の例には、ペプチド、核酸、炭水化物、小有機分子および天然産物抽出物ライブラリーである。１つの特に関心のある有力なモジュレーターの種類は、ペプチドクラスである。用語“ペプチド”は、本明細書では、ペプチド(-NHCO-)結合により隣接するアミノ酸を連結している２つ以上のアミノ酸の鎖を言う。したがって本発明のペプチドには、オリゴペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を含む。好ましくは本発明のペプチドは、長さが２−200、より好ましくは５−50のアミノ酸である。最小のペプチド長は、主にアクチベーターまたはインヒビターとして十分な能力を得るための必要性により示される。最大のペプチド長は、いったん活性なペプチドが同定されれば、合成の都合だけが相関的要因である。合成ペプチドも興味深い化合物である。例として、カルモジュリン−依存的ホスホリパーゼのカルモジュリン−結合ドメインに基づくペプチドは、ホスホリパーゼ活性のモジュレーターとして役立つ。さらに、ホスホリパーゼとホスホリパーゼ活性の既知の内因性モジュレーターとの間相互作用を阻害する、任意の構造のペプチドまたは分子は、興味深い。既知の内因性のホスホリパーゼモジュレーターには、Ｃａ2＋、Ｃａ2＋／カルモジュリン、プロテインキナーゼＣ、プロテインキナーゼＡ、Ｇαｓ、Ｇαｉ、Ｇβγおよびアデノシンを含む。ペプチド薬剤がアッセイされる時、酵母細胞はペプチドを単に培地に加えることによりペプチドに暴露されるというよりはむしろ、ペプチドを発現するように操作することができる。ペプチドライブラリーとは、標的との相互作用を可能にする状態で、ペプチドの高度に多様な、かつ多数の集合を同時に示す系である。これらのペプチドは、溶液中で(Houghten 1991)、またはビーズ上に(Lam 1991) 、チップ(Fodor 1991)、細菌（Ladner米国特許第5,223,409号明細書）、胞子（L adner米国特許第'409号明細書）、プラスミド(Cull 1992)またはファージ上(Sco tt,Devlin,Cwirla,Felici Ladner米国特許第'409号明細書)に存在することができる。これらの系の多くは、ペプチドの最大長またはペプチド組成(例えばCysは排除される)という意味で限定されている。支持体への近位というような立体的因子は、結合を妨害する。通常、スクリーニングはインビトロで人工的に与えられる標的への結合に関するものであり、生きている細胞中の細胞性のシグナル伝達経路の活性化または阻害に関するものではない。細胞表面受容体は標的として使用することができるが、このスクリーニングではペプチドの結合が受容体の配置にアロステリックな変化を引き起こすかどうかを明らかにはしないだろう。 Ladnerの米国特許第5,096,815号明細書は、望ましいDNA結合活性を持つ新規タンパク質またはポリペプチドの同定法を記載する。多数の異なる有力な結合タンパク質をコードする半−ランダム(“多様な(variegated)”)DNAを、発現可能な状態で適当な宿主細胞に導入する。標的DNA配列は、タンパク質またはポリペプチドの結合が、選択的な条件下で細胞に有害な遺伝子産物を発現することを妨げるように、遺伝子操作されたオペロンに組み込まれる。選択条件で生存する細胞は、したがって標的DNAに結合するタンパク質を発現する細胞である。酵母細胞を試験のために使用できると教示されているが、細菌細胞が好適である。タンパク質と標的ＤＮＡとの間の相互作用は、ペリプラスムではなく細胞中でのみ起こり、そしてこの標的はタンパク質ではなく核酸である。ランダムなペプチド配列を、細胞性タンパク質の機能的ドメインに置換すると、機能を達成するために必要な特別な配列の幾つかを決定することができる。細胞中でのタンパク質の配置を操作する認識現象の詳細はほとんど未知のままであるが、ミトコンドリア標的配列の配列多様性およびタンパク質分泌シグナル配列に関する拘束が、ランダムペプチドを使用して明らかになった(それぞれLemire ら、J.Biol.Chem.264,20206(1989)およびKaiserら、Science 235,312(1987))。酵母は、哺乳類の受容体の有力なアンタゴニストとして試験される外来のポリペプチド変異体を発現するように操作された。突然変異体グルカゴン分子をコードするライブラリーは、哺乳類グルカゴンのコーディング配列を含むオリゴヌクレオチドの合成中に、ヌクレオチドのランダムな誤取り込みを通して作成した。これらのライブラリーは酵母中で発現し、そして形質転換した細胞からの培養ブロスを、ラットの肝細胞膜に存在するグルカゴン受容体に関するアンタゴニスト活性を試験するために使用した(Smithら、1993)。１つの態様では、酵母細胞をペプチドライブラリーを発現するように操作する。“ペプチドライブラリー”は、多数の異なる配列(典型的には1000種以上の配列)のペプチドの集合であり、これはもし幾つかの活性について同時に試験するならば、“陽性”のペプチドを特性決定することが可能となるように、本質的にシムグロースラタナスリー(simgrow thulataneously)に調製される。本発明のペプチドライブラリーは、酵母細胞培養物の状態をとり、ここで本質的に各細胞はライブラリーの１つ、そして通常は唯一のペプチドを発現する。各細胞が異なる配列のペプチドを生産すれば、ライブラリーの多様性は最大になるが、通常、そのようにライブラリーを構築することは幾らか重複するので慎重になる。さらに各配列は、アッセイ可能なレベルで生産されるべきである。ライブラリーのペプチドは、異なる配列のDNA分子の混合物によりコードされている。各ペプチドをコードするDNA分子は、ベクターDNA分子に連結され、そして生成した組換えDNA分子は酵母細胞に導入される。どのペプチドをコードするD NA分子が特定の細胞に導入されるかは運の問題であるので、細胞が生産するペプチドを予想することはできない。しかし混合物を調製する様式に関する知識に基づき、ペプチドライブラリー中のペプチド混合物について、ある種の統計的予測をすることはできる。ライブラリーのペプチドが定常および可変残基から成ると言うことは便利である。もし第ｎ番目の残基が、ライブラリー中のすべてのペプチドで同じならば、定常である。もし第ｎ番目の残基が、問題のペプチドに依存して可変であるならば、この残基は可変である。ライブラリーのペプチドは、少なくとも１つ、そして通常は１つ以上の可変残基を有する。可変残基は、遺伝的にコードされているアミノ酸の任意の２個からすべての20個の間にわたり変動でき；可能性の範囲は異なるが、所望により、ペプチドの可変残基の各々である。さらに、特定の残基位置に許されるアミノ酸の発生頻度は、同じか、または異なる。またこのペプチドは、１つ以上の定常残基を有することもできる。必要なDNA混合物を調製するためには、主に２つの方法がある。１つの方法では、DNAを一度に１塩基づつ合成する。変異が望まれるならば、遺伝子コードにより示される塩基位置で、適当なヌクレオチド混合物を従来のポリヌクレオチド合成の純粋な試薬ではなく、新生DNAと反応させる。第二の方法は、アミノ酸の変化についてより精密な制御を提供する。第一に、トリヌクレオチド試薬を調製し、各トリヌクレオチドは、ペプチドライブラリー中で特徴となるアミノ酸の１つ（および唯一）のコドンである。特別な可変残基が合成されると、混合物が適切なトリヌクレオチドから作られ、そして新生DNA と反応させられる。いったん必要な“縮重”DNAが完成すれば、これはいたるところで詳細に検討しているペプチドの発現を確実にするために必要なDNA配列と連結されなければならず、そして完全なDNA構築物が酵母細胞中に導入されなければならない。IV ．ペリプラズム分泌酵母細胞の細胞質は、形質膜と呼ばれる脂質二重層により結合している。この形質膜と細胞壁の間は、細胞周辺腔である。酵母細胞により分泌されるペプチドは、種々のメカニズムを介して形質膜を横切り、そしてこれにより細胞周辺腔に入る。次に分泌されたペプチドは、ペリプラズムに存在する、または形質膜の外側上に現れる他の分子と自由に相互作用する。次にこのペプチドは細胞による再取り込みを受るか、細胞壁を通って培地に拡散するか、または細胞周辺腔内で分解されるようになる。ペプチドライブラリーは、それらが関連している発現系の性質に依存して、２つの明らかなメカニズムの１つによりペリプラズム中に分泌されることができる。１つの系でペプチドは、小胞体およびゴルジ装置を通って分泌を支配するα-因子前駆体に存在するような、酵母シグナル配列に構造的に連結することができる。これは受容体タンパク質が形質膜へ行く行程に従う同じ路であるので、受容体およびペプチドライブラリーの両方を発現する酵母細胞には、分泌経路通って移動する間に、受容体と相互作用する特別なペプチドの可能性が存在する。これは自己分泌活性化を表す哺乳類細胞中で起こると仮定された。そのような相互作用は、関連したフェロモン応答経路を移動中に活性化し、これはさらにペプチドアゴニストを発現するような細胞の同定を可能にする。ペプチドを細胞周辺腔に運ぶ別のメカニズムは、STE6/MDR1クラスのATP-依存的輸送を使用することである。この輸送経路およびタンパク質またはペプチドをこの経路に向けるシグナルは、小胞体に基づく分泌経路ほどよく特徴が解明されていない。それにもかかわらず、これらの輸送体は、ペプチドをER/ゴルジ経路で輸送させることなく、明らかに効果的に特定のペプチドを形質膜を直接通すことができる。本出願人は、少なくともペプチドのサブセットが、ａ-因子プロ配列および末端テトラペプチドに関連するライブラリーを発現することにより、この経路を通って分泌されることができると仮定する。この系の利点の可能性は、受容体およびペプチドが両方とも細胞の外面に運ばれるまで接触しないことである。したがってこの系は、通常は細胞の外側に運ばれるアゴニストまたはアンタゴニストの状況を厳密に模する。記載した経路のいずれかを使用することは、本発明の範囲内である。本発明はペリプラズム分泌を必要としないか、またはそのような分泌が提供されるならば、任意の特定の分泌シグナルまたは輸送経路である。VII ．同定された薬剤の医薬組成物標的ホスホリパーゼ活性の有力なモジュレーターとして、特定の試験化合物を同定した後、本アッセイを実施する者は、選択した化合物の効力および特異性を、インビトロおよびインビボの両方で試験し続ける。後のインビボ試験のため、または認可される薬剤として動物に投与するためのいずれにせよ、本アッセイで同定した薬剤は、動物、特にヒトにインビボ投与するための医薬組成物に調製することができる。主題で選択された本化合物、またはそれらの医薬的に許容できる塩は、したがって水、緩衝化塩水、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等)の生物的に許容できる媒質またはそれらの適当な混合物を用いて投与のために調製することができる。選択した媒質中の有効成分(１つ、または複数)の最適濃度は、医薬化学で周知の方法に従い経験的に決定することができる。本明細書で使用するように、“生物的に許容できる媒質 ”とは、医薬組成物投与の望ましい経路に適当であり得る、任意およびすべての溶媒、分散媒質等を含む。医薬的に活性な物質用に、そのような媒質を使用することは、当該技術分野では周知である。通常の媒質または薬剤が、化合物の活性と適合しない場合を除く限り、本発明の医薬組成物中に通常の媒質または薬剤を使用することは意図するところである。他のタンパク質を含む適当な賦形剤およびその組成物は、例えばレミングトンの薬科学(Remington's Pharmaceutical Sc ience)、マック出版社、イーストン、ペンシルバニア州、米国、1985)に記載されている。これらの賦形剤には、注射可能な“デポジット組成物”を含む。上記に基づき、そのような医薬組成物は、限定するわけではないが、１つ以上の医薬的に許容できる賦形剤または希釈剤と混合し、そして適当なｐＨの、かつ生理学的流体を用いて等張性の緩衝化媒質中に含まれた、化合物の溶剤または凍結乾燥した粉剤を含む。好適な態様では、化合物は局所的および／または全身性の投与に、滅菌調製物中に配分することができる。凍結乾燥した調製物の場合には、限定するわけではないがマンニトールまたはグリシンのような支持賦形剤を使用することができ、そして望ましい容量の適当な緩衝液が、所望のｐＨの十分な等張性の緩衝液が得られるように提供されるだろう。また同様の溶液が、化合物の医薬組成物のために望ましい容量の等張性溶液中で使用でき、それらには限定するわけではないが、望むｐＨで（例えば中性ｐＨ）、いつでも等張性の医薬組成物が得られるような適当濃度のリン酸塩またはクエン酸塩を用いた緩衝塩溶液の使用を含む。本発明は、以下の実施例でさらに説明するが、これはいかなるようにも限定されることを意図していない。引用したすべての文献（学術文献、発効された特許明細書、公開された特許出願明細書、および同時係属出願の明細書）は、本明細書に編入する。実施例実施例１．酵母株および相補アッセイの開発方法Ａ．Ｇタンパク質を発現する酵母プラスミド発現プラスミドすべての発現プラスミドは、SikorskiおよびHieter(R.S.SikorskiおよびP.Hie ter(1989)、サッカロミセスセルビシエ中でDNAの効率的操作を行うために設計されたシャトルベクターシステムおよび酵母宿主株(A syste m of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manip ulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.),Genetics 122:19-27)に初め記載されたシャトルベクターに基づく。GPA1プロモーター(Cadus 1127)、PGKプロモーター(Cadus 1447)およびCUP1プロモーター(Cadus 1725および1728)を用いた発現プラスミドは、至るところに記載されている（“フェロモン系タンパク質サロゲートを生産するために操作された酵母細胞およびそれらの使用(Yeast cells engineered to produce pheromone system protein surrogates,and uses ther efor)と言う名称のCadusの公開された国際公開第94/23025号明細書）。Ｇα-サブユニット−低コピー発現プラスミドの構築以下の完全長Ｇ-タンパク質コーディング挿入物：ＧαＳ、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、Ｇαｑ、Ｇα11、Ｇα16、ＧαＯＡ、ＧαＯＢ、Ｇα12、ＧＮＡＺ、およびＧαＳ、Ｇαｉ２、ＧαｑおよびＧα16の活性化された対立遺伝子（GTPase−欠失）(Wuら、(1992);Wuら、(1993);Parkら、(1992)、ならびにその中の引用文献) は、コーディング領域の5'および3'末端に加えたクローニング部位を用いて、VE NTポリメラーゼを使用してポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。すべての場合で、遺伝子の5'に加えた制限部位は新規NcoＩ適合突出部をコードし、一方、遺伝子の3'に加えた制限部位は新規XhoＩ適合突出部をコードした。PCR生成物は、ゲル精製し、適当なエンドヌクレアーゼを用いて制限処理し、そしてNocl/Xhol 切断Cadus 1127(このプラスミドの構築は、Cadusの公開された国際公開第94/230 25号明細書に記載されている)にクローン化した。Ca dus 1127は低コピープラスミド(CEN6 ARS4)であり、中のヘテロロガスな遺伝子発現はGPA1プロモーター(天然のGPA1座の-1400から+1)により駆動される。新規N coI部位は、イニシエーターであるメチオニンが（＋１位の）この部位(CCATGG) に埋め込まれるように、このベクター中に入れられる。すべてのＧ-タンパク質発現カセットは、Ｇα16について以下に記載するように構築した。完全長ヒトＧα16をCadusプラスミド1127から、Ventポリメラーゼ( ニューイングランドバイオラボズ:New England Biolabs)を用いて、（中にNcoI突出部(CATG)をコードするBsmB1部位が導入され、そして下線を付している）および（中のXhoI部位は末端コドンの次に導入された(下線を付した)を使用して増幅した。鋳型(100ng)およびプライマー(終濃度１μM)を、2mM MgS04を含む10x反応緩衝液の存在下に加えた。鋳型を94℃で30秒間、プライマーの存在下で変性させ、続いて100μlの反応容量あたり１μlのVENTポリメラーゼを加えた。DNAは２段階の増幅工程で増幅させた：第１段階＝94℃/30秒、続いて55℃/30秒、続いて72℃ /60秒を２サイクル；第２段階＝94℃/30秒、続いて60℃/30秒、続いて72℃/60秒を25サイクル。増幅した生成物をゲル電気泳動で精製し、BsmBIおよびXhoIで切断し、そしてNcoI/XhoIで切断し、そしてホスファターゼ処理したCadus1127ベクターDNAに連結した。組換えクローンは、挿入したＧα16配列を挟むプライマーを使用して、コロニーPCRにより同定し、制限消化で確認し、そしてPCR生成物のジデオキシヌクレオチドシークエンシングにより確認した。ＧαｑおよびＧα11発現プラスミドを、増幅に以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、同様な様式で調製した：Ｇαｑ (Esp3IまたはBsmBIを用いた開裂の後に、NcoI突出部を残すEsp3I部位で5'末端にコードする)および (Esp3IまたはBsmIを用いた開裂の後に、XhoI適合突出部を残すEsp3I部位を3'末端でコードする)。 (BsaIを用いた開裂の後に、NcoI適合突出部を作るBsaＩ部位をコードする)および (XhoI部位をコードする)。Ｇα−サブュニット−高コピー発現プラスミド挿入物をコードする完全長のＧ-タンパク質を、VENTポリメラーゼを使用して上記のように、コーディング領域の5'および3'末端に付加したクローニング部位を用いて増幅した。すべての場合で、遺伝子の5'末端に加えた制限部位は新規Nc oI適合突出部をコードする一方、遺伝子の3'末端に加えた制限部位は新規XhoI適合突出部をコードした。PCR生成物をゲル精製し、適切なエンドヌクレアーゼで制限処理し、そしてNcoI/XhoI切断Cadus1447中にクローン化した。Cadus1447は、高コピープラスミド（２ミクロンの複製起点）であり、ここでヘテロロガスな遺伝子発現はホスホグリセロールキナーゼ(PGK)プロモーターにより駆動される。新規NcoI部位は、イニシエーターであるメチオニンに存在し、そして独特をXhoＩ部位はその下流にある。このようにクローン化されたＧ-タンパク質には、ＧαＳ、Ｇαｑ、Ｇα11、Ｇα16、ＧαＯＡ、ＧαＯＢ、Ｇα12、ＧＮＡＺ、およびＧαＳ、Ｇαｉ２、ＧαｑおよびＧα16の活性化された対立遺伝子（GT Pase−欠失）を含む。ホスホリパーゼＣ遺伝子を発現する酵母プラスミド PLC- β1 ラットのPLC-β1(Suhら、(1988))を、Cadus 1725(CUPp LEU2 CEN ARS AmpR)およびCadus 1728(CUPp LEU2 ２ミクロン起点AmpR)中にクローン化した。これらの発現ベクターでは、最小CUP1プロモーターが、NcoI部位中にはめ込まれているイニシエーターであるメチオニンコドン(ATG)を含むように操作されているので、N coI切断ベクター中へのクローニングは、枠内の目的遺伝子をNcoI部位に導入する。生成したプラスミド、Cadus 1642(Rat PLC-β1)は、ApaLIを用いて開裂し、そして酵母コドンに傾いたラットPLC-β1のアミノ末端７残基をコードする二本鎖アダプターに連結した。これらのオリゴヌクレオチドの配列は：オリゴＢはアニーリングおよびライゲーションの前にポリヌクレオチドキナーゼを用いてキナーゼ処理した。ApaLI切断Cadusプラスミド1642にライゲーションした後、ライゲーション混合物を、ポリヌクレオチドキナーゼで処理し、そしてBa mHＩで開裂し、そして3.8kbの断片(ラットPLC-β1の全コーディング領域を含む) を、ゲル電気泳動により単離した。この3.8kbのPLC-β1断片を、次にNcoI−BamH Ｉ切断Cadus 1725およびCadus 1728に連結した。正しい方向の挿入物を含むプラスミドを、コロニー PCRにより同定し、そして制限分析およびSequenase V2.0(米国バイオケミカルズ :Biochemicals)を使用して二重−鎖DNAシークエンシングにより確認した。 PLC- β2 ヒトPLC-β2(Parkら、(1992))を、Cadusプラスミド1725(CUPp LEU2 CEN ARS A mpR)およびCadus 1728(CUPp LEU2 ２ミクロン起点AmpR)にクローン化した。生成したプラスミドCadus 1680(ヒトPLC-β2)を、Eco47IIIおよびEcoRIで完全に制限処理し、そして次にＴ４ポリメラーゼでＥcoRI突出部を満たした。このEcoRI-平滑/Eco47III切断プラスミドを、酵母コドンに傾いたヒトPLC-β2のアミノ末端21 残基をコードする二本鎖アダプターに連結した。これらの配列は：オリゴＤは、オリゴＣへアニーリングする前にポリヌクレオチドキナーゼで処理し、そしてEcoRI-平滑/Eco47III切断Cadus 1680にライゲーションした。ライゲーションの後、ライゲーション混合物を、ポリヌクレオチドキナーゼで処理して、遺伝子の5'末端でNcoI突出部をリン酸化し、そして3.8kbの断片（ヒトPLC-β2 の全コーディング領域を含む)を、ゲル電気泳動により単離した。この3.8kb断片は、両末端にNcoI適合突出部を有し、そしてNcoI切断／エビジャコアルカリホスファターゼ処理Cadus 1725および1728に連結した。正しい方向の挿入物を含むプラスミドを、コロニーPCRにより同定し、そして制限分析およびSequenase V2.0を使用して二重−鎖ＤＮＡシークエンシングにより確認した。生物寄託エス．セルビシエCY 2964株(plcl※1::HIS3 ade2-101 his3※200 leu2※1 lys 2-801 trp1※1 ura3-52[LEU2 CEN6 ARS4 AmpR CUP-PLC-ベータ2]、[GPA1pヒトアルファ 16 TRP1 CEN6 ARS4 AmpR]は、1995年6月5日に、ATCC寄託番号74345でアメリカンタイプカルチャーコレクション(ロックビル、メリーランド州)に寄託し；そしてエス．セルビシエCY 2954株(plcl※1::HIS3 ade2-101 his3※200 leu2※1 lys 2-801 trp1※l ura3-52[CUP RAT PLCbetal LEU2 2mu-ori REP3 AmpR]、GPA1p TR P1 CEN6 ARS4 AmpR]は、1995年6月5日に、ATCC寄託番号74343でアメリカンタイプカルチャーコレクション(ロックビル、メリーランド州)に寄託した。 PLC1 Δ酵母株および相補アッセイ酵母形質転換 PLC1Δ株を用いたすべての酵母の形質転換(FlickおよびThorner(1993))は、酢酸リチウムを基本とした手法およびYeastmaker形質転換キット(クローンテック：Clontech)を使用して、製造元の仕様に従い行った。一般的に、株を一晩、30 ℃で後期対数期まで成長させ、そして翌朝、OD600＝0.2−0.3に希釈した。30℃ で５時間成長させた後、細胞を１回、水中で洗浄し、そして酢酸リチウム/TE中に、細胞が30−50倍に濃縮されるように再懸濁した。この100μlの細胞懸濁液に、キャリアーDNA(100μg)およびプラスミドDNA(0.1−0.5μg)を加えた。細胞およびDNAを次にボルテックス混合し、PEG/酢酸リチウム/TEを加え、懸濁液を再度ボルテックス混合し、そして懸濁液を30℃で30分間インキューベーションした。次にDMSOを終濃度10％となるように加え、そして細胞を42℃で15分間、ヒートショックさせた。氷上で冷却した後、細胞を遠心し、PEG含有上清をデカントし、細胞を滅菌TEに再懸濁し、そして選択的プレートにまいた。成長アッセイおよび代替読み出し酵母細胞の培養に標準的な培地を使用し、そして確立された手順を遺伝子操作に使用した(Rose、M.D.Winston,F.およびP.Heiter(1990)酵母の遺伝学に関する方法：アラボラトリーコースマニュアル(Methods in Yeast Genetics:A Labo ratory Course Manual)、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版(Cold S pring Harbor Laboratory Press)、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州)。すべての酵母株を、選択的な条件下で合成培地（挿入した突然変異およびプラスミドの選択および維持に必要な栄養を補充した）で成長させた（Guthrie, C.およびG.R.Fink(1991)、Methods in Enzymology第194巻。酵母遺伝学および分子生物学のガイド(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology)、アカデミック出版社）。plc1 Δ条件致死表現型の抑制に関して試験する株を、選択的合成完全(Synthetic Complete:SC)プレートから単一コロニーから取り出し、そして次にSCプレート上に単一コロニーを画線し、そして48から72時間、以下の条件で成長させた：許容成長条件 SC／２％グルコース／30℃非許容成長条件 SC／２％グルコース／1.2Mソルビトール／30℃ SC／２％グルコース／0.5M NaCl／30℃ SC／２％グルコース／37℃ SC／２％グルコース／12Mソルビトール／37℃ SC／２％グルコース／0.5M NaCl／37℃ 上記の非許容状態は、最小の緊縮から最大の緊縮である。細胞の成長は、ニコンの位相差顕微鏡を使用して光学顕微鏡により視覚的に監視し、そしてUVPデジタル画像処理システムを使用して写真を取った。結果 CAL1 プロモーター駆動PLC-β1は、plc1突然変異体を相補しない表現型 plc1 tsおよび浸透圧感受性の表現型を相補するために、哺乳類PLC-βアイソザイムを用いた最初の試みは、ラットGAL1プロモーターで駆動されるPLC-β1構築物（この構築物の配列は、ジデオキシヌクレオチドシークエンシングにより確認した）を用いて、Cadus酵母株CY1630(plcΔ1::HIS3 ade2-101(Oc)his3-d100 l eu2-dl lys2-801(Am)trp1-dl)およびCY1633(plcΔ2::HIS3 ade2-101(Oc)his3-d100 1eu2-dl lys2-801(Am)trp1-d l)中で行った。これらの実験で、GAL1プロモーターが抑制されるか(グルコースの存在下で)または低グルコースで脱抑制され、そしてガラクトースの存在下で活性化される時のいずれかの条件下では、相補は観察されなかった。同じ株の骨格(CY1630およびCY1633)中に形質転換したGAL1プロモーター駆動PLC1カセット（ Cadusプラスミド1639）を使用する対照実験では、温度感受性および浸透圧感受性表現型の両方が相補された。ラットPLC-β1を用いたこれらの陰性の結果は、p lc1 表現型の機能的相補にはラットPLC-β1遺伝子単独のGAL1プロモーターからの発現以上を必要とすることを示している。Ｇαサブユニットを用いた相補分析イノシトール1,4,5トリスホスフェート(IP₃)およびジアシルグリセロール(DAG )を形成するための、ホスファチジルイノシトール4.5-ビスホスフェート(PIP₂) のホスホリパーゼ-Cβ依存的加水分解は、ヘテロ三量体型Ｇ-タンパク質のＧα およびＧβγサブユニットの両方により刺激される。ＧαサブユニットによるPL C-β活性の刺激は、Ｇｑ、-11、-14、-15および-16を含むＧｑファミリーの員に限定されている。他のファミリー(-s、-iおよび-12/13)に属するＧαサブユニットは、PIP₂のPLC-β依存的加水分解を刺激しない。数種の細胞型では、アゴニスト依存的IP₃刺激およびカルシウム流通化は、百日咳毒素に対して部分的に感受性であることが示された。この考察は最初に、ＧｉまたはＧｏがPLC-β活性を刺激できるという推測を導いた。より最近では、アゴニスト依存的IP₃生産の百日咳毒素に感受性の成分は、ＧβγサブユニットがPLC-βアイソフォームを直接刺激する能力によることを示した。酵母中でPLC-βアイソフォームのＧ-タンパク質依存的調節を再現するための試みにおいて、一連のCY1630誘導体を、哺乳類Ｇ-タンパク質をコードする発現ベクターを用いて形質転換し、そしてplc1突然変異体の表現型の相補性を評点した。Cadus酵母CY1901、CY1903およびCY1904株(plc1Δ1::HIS3対立遺伝子を含む、すべてCY1630誘導体)は、それぞれCadusプラスミド1443(PLC無し)、1637(GAL 1p-ラットPLC-β1)または1639(GAL1p-PLC1)を含む(表２の株のリストを参照にされたい)。すべての３つの株が30℃で、合成完全培地およびリッチ培地の両方で成長するが、２ミクロンプラスミド上にGAL1p-PLC1発現カセットを持つCY1904は、CY1901(空ベクター)またはCY1903(２ミクロンプラスミド上にGAL1p-ラットPLC -β1発現カセットを持つ)よりもよりよく成長した。非許容温度（＞35℃）で、C Y1901およびCY1903は培養中、３日後にコロニーを形成できないが、CY1904は大きなコロニーを形成する。 CY1901、CY1903およびCY1904(すべて半数体株)を、酢酸リチウム形質転換法（クローンテック、製造元の推薦に従う）により、以下の遺伝子をGPA1上流プロモーターの転写制御下にコードする、低コピー数(CEN ARS)Ｇαサブユニット発現プラスミドのパネルを用いて形質転換した：Cadusプラスミド1127(空ベクター) 、1179(GPA1)、1181(ＧαＳ)、1606(Ｇαi2)、1617(Ｇα16)、1753(Ｇα16-Q209 L GTPase^-活性化対立遺伝子)、1685(Ｇαｑ)および1749(Ｇαq-Q209L GTPase^-活性化対立遺伝子)(表１の株のリストを参照にされたい)。上記の株への形質転換後、単離したコロニーを選択的プレート(-Ura、-Trp+グルコース)に画線し、そして30℃または37℃で、96時間までインキューベーションした。すべてのPLC発現ベクター(1443、1637および1639)の組み合わせ、ならびにＧ- タンパク質発現ベクターを含むすべての株は、許容条件下（30℃）で成長し、GA L1プロモーターの制御下に酵母PLC1遺伝子を発現する株だけが37℃で成長した。低グルコース／高ガラクトースプレート上の成長によるGAL1プロモーターの誘導は、CY1901またはCY1903誘導体のいずれのts表現型も助けなかった。プレートにまいてから96時間後でも、GAL1プロモーターからラットPLC-β１を発現するベクターを宿す株については、非許容条件下での成長の証拠はなかった。これらの結果は、GAL1プロモーターにより駆動されるラットPLC-β1をコードするプラスミドが、酵母のplc1株のts欠失を相補できないことを示している。 CUP-PLC- β発現ベクター前述の章に記載した陰性の結果を説明する１つの可能性は、GAL1プロモーターからのラットPLC-β1の発現の欠失または不適切な発現レベルである。GAL1プロモーターにより与えられる困難さの第二の可能性は、plc1株が炭素源としてガラクトースを利用できないことに関連する。もしガラクトース利用がこれらの株で許されるならば、GAL1pおよびGAL10pのようなガラクトース感受性プロモーターの誘導も許されるだろう。これらの可能性のある問題を両方回避するために、哺乳類PLC-βアイソザイムを、活性がグルコース以外の炭素源に依存しない誘導プロモーターから発現させた。他の高レベルの構成的プロモーター(すなわち、PGK またはADH1)とは異なり、細胞毒性を伴わなかった。この種の毒性は、ガラクトースの存在下でのGAL1プロモーターからの酵母PLC1遺伝子の過剰発現に関して、実際にFlickおよびThorener(1993)により文献に報告された。FlickおよびThoren erは、GAL1プロモーターの制御下にPLC1遺伝子を含む酵母の野生株の成長が、GA LIプロモーターがガラクトースでは誘導される時には許され、グルコース−含有培地で抑制される時には許されないことを報告している。４つの新規PLC-β構築物を作成した：２つはラットPLC-β1遺伝子をコードし、そして２つはヒトPLC-β2遺伝子を、各々、CUP１プロモーターの制御下にコードする。これらの構築物では、ラットPLC-β1およびヒトPLC-β2のアミノ末端領域のヌクレオチド配列を、哺乳類のコドン使用の代わりに酵母のコドン使用に対する傾きを反映するように変化させた。PLC-β1のアミノ末端７残基およびヒトP LC-β2のアミノ末端21残基を、合成オリゴヌクレオチドを使用して突然変異させてこれらに変化を起こした。各構築物のヌクレオチド配列は、両方のDNA鎖についてジデオシキヌクレオチドシークエンシング法により配列的に確認した。酵母CY1630株を、これらの各プラスミドおよび他のPLC構築物（ここでPLCアイソザイムは、GAL1pまたはADH1プロモーターにより駆動される）を用いて、種々のＧαサブユニットを発現するプラスミドの存在または不在下で形質転換した。最初の実験は、酵母GPA1サブユニットのアミノ末端60％およびヒトＧα16サブユニット(Ｇα16-Bam)のカルボキシル末端40％からなるハイブリッドＧαサブユニットの存在下で、ヒトPLC-β2およびラットPLC-β1による、plc1遺伝型に付随する温度感受性(ts)表現型の相補について試験した。このハイブリッド構築物は、２つの理由で、他の種々のヒトＧαサブユニットの中から選択した。第一に、独立した実験で、この特別なハイブリッドサブユニットは、酵母中で機能的に発現する(すなわち、これは酵母Ｇβγサブュニットと共役し、そしてgpa1-株のフェロモン応答経路の活性化を抑制する)。第二に、Ｇαサブユニットにより活性化されるエフェクターに含まれる構造決定基は、その残基がＧαサブユニットのカルボキシル末端部分にマップされると考えられているからである(BerlotおよびBourne(1992);Rarickら、(1992)；Artemeyerら、(1993))。哺乳類PLC-βアイソザイムおよびＧαサブユニットの組み合わせを宿すY1630( plc1)誘導体(表２の株のリストを参照にされたい)を、最初にコロニー精製し、そして次に各同時−形質転換の二重のシブ(sib)を、100μMのCuSO4の存在下で、 30℃および37℃での成長についてアッセイした。プレートにまいてから48時間後、ラットPLC-β1をコードするプラスミドを含むすべてのplc1株は、30℃で成長し、そしてCY1633(PLC1)またはCY1904(plc1Δ1::HIS3[GAL1p-PLC1])株よりもよく働らかなかった。非−許容的温度で、哺乳類PLC-βアイソザイムを宿す株と空ベクターを宿す株の間で、幾つかの差異が、プレートにまいた48時間後に観察された。第一に、ラット-PLC-β1の高コピーの変更体(２ミクロンに基づく)を含む株は、プロモーターがPLC-βアイソザイムの発現を駆動するにもかかわらず、37 ℃で成長し、一方、空ベクターを含む株は成長しなかった。Cadusプラスミド164 0(ADH1p-ラットPLC-β1)またはCadusプラスミド1922(CUP-ヒトPLC-β1)を含むCY 1630誘導体は、37℃で48時間内に小さいコロニーを形成し、一方、Cadus 1443( 空ベクター)を含むCY1630誘導体は、形成しなかった。第二に、CUP-ヒトPLC-β2をコードする低コピー(CEN ARS)プラスミドおよびＧ α16-Bam対立遺伝子をコードする低コピー(CEN ARS)プラスミドを用いて同時-形質転換したCY 1630誘導体は、30℃および37℃の両方で成長した。第三に、Ｇα サブユニット変異体のみを含む株は、ラットまたはヒトPLC-βアイソザイムの不在では37℃の成長を支持しないので、このアッセイで37℃におけるCY 1630誘導体の成長は、Ｇα16-Bam対立遺伝子単独の発現によるものではない。最後に、哺乳類PLCアイソザイムを発現するCY1630誘導体の成長は、30℃で100 μM CuSO₄の添加により影響を受けなかったが、銅の存在下における37℃での成長は銅の不在よりも小さかった。非−許容温度で、この銅の存在下における明らかな成長阻害は、FlickおよびThornerによりPLC1の過剰発現でなされた考察に準じることによる、ホスホリパーゼＣ酵素活性の過剰発現による毒性を反映しているのかもしれない。これらのデータは、出願人の知識に対して、哺乳類のPLC-β アイソザイムの酵母中での発現が、エス．セルビシエのPLC１対立遺伝子中の欠失を機能的に相補できる、という証明を最初に表す。またこれらのデータは、ホスホリパーゼＣ酵素のＧ-タンパク質調節PLC-βファミリーの員が、酵母中でPLC -デルタファミリーの員を機能的に置き換えることができることを証明している。これらの最初の考察を広げるために、一連のCY1630誘導体を構築し、ここで、哺乳類PLC-βアイソザイムおよび哺乳類Ｇαサブユニットの異なる組み合わせを同時発現させた。酵母株の表（表２）は、成長相補アッセイで試験した組み合わせを掲げる。任意のＧｑファミリーの員の任意の組み合わせを含む株（ｑ、11、 16の野生型対立遺伝子、ならびにｑおよび16のGTPase−欠失対立遺伝子）および PLC-β２は、非許容条件下で成長を支持した。一方、ＧαＳおよびＧαｉファミリーに由来するＧαサブユニットは、制限的条件下でplc1Δ株の成長を支持しなかった。図は各々のデータを示す。CUPプロモーターの制御下にPLC-β1を発現するplc1Δ株は、Ｇαの存在の有無にかかわらず、制限的な条件下で成長した。 plc1遺伝型に付随する温度感受性およびNaCl-感受性の表現型の相補は、２組の状況で観察された。ラットのPLC-β1(プラスミド1922)またはヒトPLC-β2(プラスミド1964)のいずれかをコードする高コピープラスミドを含むPLCΔ株では、 37℃の成長に哺乳類Ｇα-サブユニットの同時-発現を必要としなかった。したがってこれらの株は、ts欠失のＧ-タンパク質非依存的相補を表す。ヒトPLC-β2対立遺伝子(プラスミド1961)をコードする低コピープラスミドを含む株では、37℃ の成長にＧｑファミリーに由来するＧα-サブユニットの同時-発現を必要とした。ヒトPLC-β2およびＧｑ、−11、または−16を低または高コピープラスミド上に含むplc1株は、すべて37℃で成長した。さらにヒトPLC-β2およびＧαq(Q209L )またはＧα16(Q212L)の活性化形態を発現する株は、30℃および37℃の両方で力強く成長したが、ヒトPLC-β2およびＧαＳ(Q227L)の活性化形を宿す株は、37℃ で成長を支持できなかった。３実施例２．ヒトPLC-β3による酵母plc1突然変異体の相補ヒトPLC-β3は、Ｇ-タンパク質に非依存的な様式で、酵母中のplc1遺伝型に付随する温度感受性およびNaCl-感受性の表現型を相補することが見いだされた。これらの結論は、高または低コピープラスミドのいずれか上のCUPプロモーターの制御下に、plc1骨格を持つ酵母株において、ヒトPLC-β3の発現が、Ｇｑファミリー（すなわち、ｑ、11、14、15または16のＧαサブユニットの同時-発現に非依存的に、0.5M NaClまたは高温で成長をもたらした、という知見に基づく。これに関して、酵母中で発現されるヒトPLC-β3アイソホームの特徴は、ヒトPLC -β2アイソホームのＧ-タンパク質依存的な成長の表現型とは異なり、非許容条件下でＧ-タンパク質非依存的成長を表す点で、ラットPLC-β1と似ている。本明細書で引用したすべての文献および明細書は、引用により本明細書に編入する。均等物当業者は、本明細書に記載された本発明の特別な態様に関して多くの均等物を認識するか、あるいは日常的な経験からだけでも確認することができる。そのような均等物は、以下の請求の範囲に本願されることを意とする。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成９年７月１６日（１９９７．７．１６）【補正内容】請求の範囲１．異種ホスホリパーゼＣβをコードする異種遺伝子を含む酵母細胞であって、異種ホスホリパーゼＣβが前記細胞により発現され、そして前記細胞のシグナル経路に機能的に組込まれている細胞。２．異種ホスホリパーゼＣβがその細胞の内因性ホスホリパーゼ遺伝子の機能喪失突然変異を補足する、請求の範囲１の細胞。３．機能喪失突然変異がｐｌｃ１Δである、請求の範囲２もしくは２８のいずれかの細胞。４．異種ホスホリパーゼＣβが、その活性がヘテロ三量体のＧタンパク質またはその１個もしくはそれ以上のサブユニットにより調整され得るホスホリパーゼである、請求の範囲１の細胞。５．異種ホスホリパーゼＣβがＰＬＣβ１、ＰＬＣβ２、ＰＬＣβ３およびＰＬＣβ４から成る群から選択されるホスホリパーゼである、請求の範囲１の細胞。６．異種ホスホリパーゼＣβが哺乳類のホスホリパーゼである、請求の範囲２もしくは２７のいずれかの細胞。７．異種ホスホリパーゼＣβがヒトホスホリパーゼである、請求の範囲６の細胞。８．細胞が調節タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含み、その調節タンパク質が異種ホスホリパーゼＣβの活性を調整する、請求の範囲１もしくは２７のいずれかの細胞。９．調節タンパク質が、プロフィリン、コフィリン、ゲルゾリン、α-アクチニン、Ｇタンパク質およびＧタンパク質サブユニットもしくはその複合体から成る群から選択される、請求の範囲８の細胞。１０．調節タンパク質がＧαもしくはＧβγである、請求の範囲９の細胞。１１．細胞が、シグナル経路を介してシグナルを伝達することが可能である異種レセプターをコードする異種遺伝子をさらに含む、請求の範囲１もしくは２９のいずれかの細胞。１２．レセプターが、異種ホスホリパーゼにシグナルを伝達することが可能なＧタンパク質が結合されたレセプターである、請求の範囲１１の細胞。１３．Ｇタンパク質が結合されたレセプターが、化学誘因物質ペプチドレセプター、サイトカインレセプター、ニューロペプチドレセプター、光レセプター、神経伝達物質レセプター、環状ＡＭＰレセプターおよびポリペプチドホルモンレセプターからなる群から選択される、請求の範囲１２の細胞。１４．レセプターが、α１Ａ-アドレナリン作動性レセプター、α１Ｂ-アドレナリン作動性レセプター、α１Ｃ-アドレナリン作動性レセプター、Ｍ₁ＡＣｈレセプター、Ｍ₃ＡＣｈレセプター、Ｍ₅ＡＣｈレセプター、Ｄ₂ドーパミンレセプター、Ｄ₃ドーパミンレセプター、Ａ１アデノシンレセプター、５ＨＴ１様レセプター、５ＨＴ１ｄ様レセプター、５ＨＴ１ｄβレセプター、サブスタンスＫ（ニューロキニンＡ）レセプター、f-Met-Leu-Phe（ＦＭＬＰ）レセプター、アンジオテンシンIIタイプ１レセプター、ｍａｓ癌原遺伝子レセプター、エンドセリンＥＴＡレセプター、エンドセリンＥＴＢレセプター、トロンビンレセプター、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）レセプター、血管作用性腸ペプチドレセプター、オキシトシンレセプター、ＳＳＴ３レセプター、黄体形成ホルモン／絨毛膜ゴナドトロピン（ＬＨ／ＣＧ）レセプター、トロンボキサンＡ２レセプター、血小板活性化因子（ＰＡＦ）レセプター、Ｃ５ａアナフィラトキシンレセプター、インターロイキン８（ＩＬ-８）、ＩＬ-８Ａレセプター、ＩＬ-８Ｂレセプター、ｍｉｐ-１／ＲＡＮＴＥＳレセプター、代謝刺激性グルタミン酸ｍＧｌｕＲ１−５レセプター、ＡＴＰレセプター、アミロイドタンパク質前駆体レセプター、ブラジキニンレセプター、ゴナドトロピン放出ホルモンレセプター、コレシストキニンレセプター、抗利尿ホルモンレセプター、副腎皮質刺激ホルモンIIレセプター、ＬＴＢ４レセプター、ＬＴＤ４レセプター、タキキニンレセプター、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンレセプター、バソプレシンレセプターおよびオキシトシンレセプターから成る群から選択される、請求の範囲１３の細胞。１５．シグナル経路が遺伝子発現を調整する、請求の範囲１もしくは２９のいずれかの細胞。１６．細胞が、シグナル経路に応答する１個もしくはそれ以上の転写調節要素との影響を及ぼす結合にレポーター遺伝子を含有するレポーター遺伝子構築物をさらに含み、レポーター遺伝子の発現が検出可能なシグナルを提供する、請求の範囲１もしくは２９のいずれかの細胞。１７．レポーター遺伝子が、色、蛍光、発光、細胞の栄養要求の細胞の生存能力の救援、細胞の成長および薬物耐性から成る群から選択される検出可能なシグナルを生じさせる遺伝子産物をコードする、請求の範囲１６の細胞。１８．レポーター遺伝子が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β-ラクタマーゼ、ルシフェラーゼおよびグリーン蛍光タンパク質から成る群から選択される遺伝子産物をコードする、請求の範囲１７の細胞。１９．レポーター遺伝子が成長の利点を分け与える遺伝子産物をコードする、請求の範囲１７の細胞。２０．レポーター遺伝子が、カナバニンもしくは類似の選択的作用物質を含有する培地中で成長する能力を細胞に分け与える遺伝子産物をコードする、請求の範囲１７の細胞。２１．シグナル経路がカルシウムの動員を調整する、請求の範囲１もしくは２９のいずれかの細胞。２２．シグナル経路がＰＫＣ活性を調整する、請求の範囲１もしくは２９のいずれかの細胞。２３．シグナル経路が細胞の成長の温度感受性を調整する、請求の範囲１もしくは２９のいずれかの細胞。２４．異種ホスホリパーゼＣβが構成的に活性化される、請求の範囲１もしくは２７のいずれかの細胞。２５．前述のホスホリパーゼＣβがホスファチジルイノシトール４,５-ビスリン酸を加水分解することが可能である、請求の範囲１もしくは２７のいずれかの酵母細胞。２６．ホスホリパーゼＣβがＰＬＣβ１、ＰＬＣβ２、ＰＬＣβ３およびＰＬＣ β４から成る群から選択される、請求の範囲２７の細胞。２７．ｉ）細胞に第一の検出可能な表現型を分け与える突然変異を有するホスホリパーゼ遺伝子、および、 ii）ホスホリパーゼＣβ活性を有するポリペプチドをコードする第一の異種遺伝子であって、その異種ホスホリパーゼＣβ活性が突然変異を調整しかつ細胞に第二の検出可能な表現型を分け与える遺伝子、を含む酵母細胞。２８．突然変異が機能喪失突然変異であり、また、異種ホスホリパーゼＣβが機能喪失を補足する、請求の範囲２７の細胞。２９．異種ホスホリパーゼＣβ活性が細胞のシグナル経路に機能的に組込まれる、請求の範囲２７の細胞。３０．第一の検出可能な表現型が、温度感受性の成長および塩化ナトリウム感受性から成る群から選択される、請求の範囲２７の細胞。３１．細胞がサッカロミセス属(Saccharomyces)の細胞である、請求の範囲１もしくは２７のいずれかの細胞。３２．細胞が、異種の試験ポリペプチドをコードする発現可能な組み換え遺伝子をさらに含み、そして培養系の細胞の混合物が試験ポリペプチドの多彩な集団を集合的に発現する、請求の範囲１もしくは２７のいずれかの細胞を含む多彩な培養系。３３．ｉ）請求の範囲１の細胞を、シグナル経路を介して伝達される細胞内シグナルを検出するのに適切な条件下で試験化合物と接触させること、および、 ii）試験化合物の存在下にシグナル経路により伝達されるシグナルのレベルを測定すること、の段階を含む、ホスホリパーゼＣ活性のモジュレーターを同定するアッセイであって、試験化合物の非存在に関する試験化合物の存在下のシグナルのレベルでの統計学的に有意の差違が、その試験化合物が異種ホスホリパーゼＣ活性のモジュレーターであることを指摘するアッセイ。３４．細胞内シグナルが、シグナル経路に感受性の転写調節要素に操作可能に結合されたレポーター遺伝子の発現により検出される、請求の範囲３３のアッセイ。３５．細胞内シグナルが、フォスファチジルイノシトール４,５-ビスリン酸の加水分解生成物を測定することにより検出される、請求の範囲３３のアッセイ。３６．細胞内シグナルが、カルシウムイオンの可動性およびプロテインキナーゼの活性化の程度の１個もしくはそれ以上を測定することにより検出される、請求の範囲３３のアッセイ。３７．細胞内シグナルが成長での変化を測定することにより検出される、請求の範囲３３のアッセイ。３８．ｉ）請求の範囲２７の細胞を、第一のおよび第二の表現型の１個もしくは双方を検出するのに適切な条件下で試験化合物と接触させること、 ii）試験化合物の存在下での第一のおよび／もしくは第二の表現型のレベルまたは程度を測定すること、ならびに、 iii）段階ii）の測定を、試験化合物の非存在もしくは異種ホスホリパーゼＣの非存在下での類似の測定と比較すること、の段階を含む、ホスホリパーゼＣ活性のモジュレーターを同定するアッセイであって、試験化合物もしくはホスホリパーゼＣの非存在に関する試験化合物の存在下の測定された表現型での統計学的に有意の変化が、その試験化合物が異種ホスホリパーゼＣ活性のモジュレーターであることを指摘するアッセイ。３９．ｉ）請求の範囲１９の細胞を、レポーター遺伝子の発現に適切な条件下で試験化合物と接触させること、 ii）試験化合物の存在下にレポーター遺伝子の発現を検出すること、および、 iii）試験化合物の存在下でのレポーター遺伝子発現のレベルを、試験化合物の非存在もしくは異種ホスホリパーゼＣの非存在下でのレポーター遺伝子発現のレベルと比較すること、の段階を含む、ホスホリパーゼＣ活性のモジュレーターを同定するアッセイであって、試験化合物もしくはホスホリパーゼＣの非存在に関する試験化合物の存在下でのレポーター遺伝子発現のレベルでの統計学的に有意の差違が、その試験化合物が異種ホスホリパーゼＣ活性のモジュレーターであることを指摘するアッセイ。４０．ｉ）非哺乳類のホスホリパーゼＣ遺伝子を含有する第一の酵母細胞を提供すること、 ii）哺乳類のホスホリパーゼＣ遺伝子を発現する第二の酵母細胞を提供すること、 iii）第一のおよび第二の酵母細胞のそれぞれを試験化合物と接触させること、 iv）試験化合物の存在下での第一のおよび第二の細胞のホスホリパーゼ活性を検出もしくは定量すること、の段階を含む、非哺乳類のホスホリパーゼＣを選択的に阻害する作用物質を同定する差異に基づくスクリーニングアッセイであって、第二の細胞に関する第一の細胞のホスホリパーゼ活性での統計学的により大きな低下が、その試験化合物が非哺乳類のホスホリパーゼＣを選択的に阻害することを指摘するアッセイ。４１．第一の酵母細胞のホスホリパーゼＣが脊椎動物のホスホリパーゼＣであり、また、第二の酵母細胞のホスホリパーゼＣが脊椎動物の病原体からのホスホリパーゼＣである、請求の範囲４０のアッセイ。４２．脊椎動物がヒトである、請求の範囲４０のアッセイ。４３．ヒトの病原体が、真菌、ウイルス、細菌および原生動物から成る群から選択される、請求の範囲４０のアッセイ。４４．ヒトの病原体がヒトの真菌の病原体である、請求の範囲４０のアッセイ。４５．アッセイが、最低100種の異なる試験化合物のライブリーについて反復される、請求の範囲３３、３８、３９もしくは４０のいずれかのアッセイ。４６．試験化合物が、小さな有機分子および天然の生成物の抽出物から成る群から選択される、請求の範囲３３、３８、３９もしくは４０のいずれかのアッセイ。４７．最低２種の異なる酵母細胞の収集物であって、各細胞が異なるホスホリパーゼをコードする遺伝子を含む収集物。４８．それぞれの異なる酵母細胞が、同じ生物体から得られたホスホリパーゼの異なるアイソタイプまたは異なる生物体から得られた同じもしくは異なるアイソタイプをコードする、請求の範囲４７の収集物。４９．哺乳類のホスホリパーゼＣ遺伝子が、ＰＬＣβ１、ＰＬＣβ２、ＰＬＣβ ３およびＰＬＣβ４から成る群から選択される、請求の範囲３３、３８、３９もしくは４０のいずれかのアッセイ。５０．異種ホスホリパーゼＣをコードする異種遺伝子を含む酵母細胞であって、その異種ホスホリパーゼＣがその細胞により発現されかつ細胞のシグナル経路に機能的に組込まれ、その異種遺伝子がＣＵＰ１プロモーターに影響を及ぼして結合される細胞。５１．異種ホスホリパーゼＣが、細胞の内因性ホスホリパーゼ遺伝子の機能喪失突然変異を補足する、請求の範囲５０の細胞。５２．異種ホスホリパーゼＣが、ＰＬＣα、ＰＬＣβ、ＰＬＣδおよびＰＬＣγ から成る群から選択されるホスホリパーゼである、請求の範囲５０の細胞。５３．異種ホスホリパーゼＣが哺乳類のホスホリパーゼである、請求の範囲５０の細胞。５４．細胞が、調節タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含み、その調節タンパク質が異種ホスホリパーゼＣの活性を調整する、請求の範囲５０の細胞。５５．細胞が、シグナル経路を介してシグナルを伝達することが可能である異種レセプターをコードする異種遺伝子をさらに含む、請求の範囲５０の細胞。５６．細胞が、調節タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含み、その調節タンパク質が異種ホスホリパーゼＣの活性を調整する、請求の範囲５０の細胞。５７．細胞が、シグナル経路に応答する１個もしくはそれ以上の転写調節要素との影響を及ぼす結合にレポーター遺伝子を含有するレポーター遺伝子構築物をさらに含み、レポーター遺伝子の発現が検出可能なシグナルを提供する、請求の範囲５０の細胞。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．異種ホスホリパーゼＣをコードする異種遺伝子を含む酵母細胞であって、異種ホスホリパーゼＣが前記細胞により発現され、そして前記細胞のシグナル経路に機能的に組込まれている前記細胞。２．異種ホスホリパーゼＣが前記細胞の内因性ホスホリパーゼ遺伝子の機能喪失突然変異を補足する、請求の範囲１の細胞。３．機能喪失突然変異がｐｌｃ１Δである、請求の範囲２もしくは３０のいずれかの細胞。４．異種ホスホリパーゼＣが、ＰＬＣα、ＰＬＣβ、ＰＬＣδおよびＰＬＣγから成る群から選択されたホスホリパーゼである、請求の範囲１もしくは２９のいずれかの細胞。５．異種ホスホリパーゼＣが、その活性がヘテロ三量体性Ｇタンパク質またはそれらの１個もしくはそれ以上のサブユニットにより調整され得るホスホリパーゼである、請求の範囲１の細胞。６．異種ホスホリパーゼＣがＰＬＣβ１、ＰＬＣβ２、ＰＬＣβ３およびＰＬＣ β４から成る群から選択されるホスホリパーゼである、請求の範囲１の細胞。７．異種ホスホリパーゼＣが哺乳類のホスホリパーゼである、請求の範囲２もしくは２９のいずれかの細胞。８．異種ホスホリパーゼＣがヒトホスホリパーゼである、請求の範囲７の細胞。９．細胞が調節タンパク質をコードする異種遺伝子をさらに含み、その調節タンパク質が異種ホスホリパーゼＣの活性を調整する、請求の範囲１、２７もしくは２９のいずれかの細胞。１０．調節タンパク質が、プロフィリン、コフィリン、ゲルゾリン、α-アクチニン、Ｇタンパク質およびＧタンパク質サブユニットもしくはその複合体から成る群から選択される、請求の範囲９の細胞。１１．調節タンパク質がＧαもしくはＧβγである、請求の範囲１０の細胞。１２．細胞が、シグナル経路を介してシグナルを伝達することが可能である異種レセプターをコードする異種遺伝子をさらに含む、請求の範囲１もしくは３１のいずれかの細胞。１３．レセプターが、異種ホスホリパーゼにシグナルを伝達することが可能なＧタンパク質が結合されたレセプターである、請求の範囲１２の細胞。１４．Ｇタンパク質が結合されたレセプターが、化学誘因物質ペプチドレセプター、サイトカインレセプター、ニューロペプチドレセプター、光レセプター、神経伝達物質レセプター、環状ＡＭＰレセプターおよびポリペプチドホルモンレセプターからなる群から選択される、請求の範囲１３の細胞。１５．レセプターが、α１Ａ-アドレナリン作動性レセプター、α１Ｂ-アドレナリン作動性レセプター、α１Ｃ-アドレナリン作動性レセプター、Ｍ₁ＡＣｈレセプター、Ｍ₃Ａｃｈレセプター、Ｍ₅ＡＣｈレセプター、Ｄ₂ドーパミンレセプター、Ｄ₃ドーパミンレセプター、Ａ１アデノシンレセプター、５ＨＴ１様レセプター、５ＨＴ１ｄ様レセプター、５ＨＴ１ｄβレセプター、サブスタンスＫ（ニューロキニンＡ）レセプター、f-Met-Leu-Phe（ＦＭＬＰ）レセプター、アンジオテンシンIIタイプ１レセプター、ｍａｓ癌原遺伝子レセプター、エンドセリンＥＴＡレセプター、エンドセリンＥＴＢレセプター、トロンビンレセプター、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）レセプター、血管作用性腸ペプチドレセプター、オキシトシンレセプター、ＳＳＴ３レセプター、黄体形成ホルモン／絨毛膜ゴナドトロピン（ＬＨ／ＣＧ）レセプター、トロンボキサンＡ２レセプター、血小板活性化因子（ＰＡＦ）レセプター、Ｃ５ａアナフィラトキシンレセプター、インターロイキン８（ＩＬ-８）、ＩＬ-８Ａレセプター、ＩＬ-８Ｂレセプター、ｍｉｐ-１／ＲＡＮＴＥＳレセプター、代謝刺激性グルタミン酸ｍＧｌｕＲ１−５レセプター、ＡＴＰレセプター、アミロイドタンパク質前駆体レセプター、ブラジキニンレセプター、ゴナドトロピン放出ホルモンレセプター、コレシストキニンレセプター、抗利尿ホルモンレセプター、副腎皮質刺激ホルモンIIレセプター、ＬＴＢ４レセプター、ＬＴＤ４レセプター、タキキニンレセプター、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンレセプター、バソプレシンレセプターおよびオキシトシンレセプターから成る群から選択される、請求の範囲１４の細胞。１６．レセプタータンパク質がレセプターチロシンキナーゼである、請求の範囲１２の細胞。１７．シグナル経路が遺伝子発現を調整する、請求の範囲１もしくは３１のいずれかの細胞。１８．細胞が、シグナル経路に応答する１個もしくはそれ以上の転写調節要素との影響を及ぼす結合にレポーター遺伝子を含有するレポーター遺伝子構築物をさらに含み、レポーター遺伝子の発現が検出可能なシグナルを提供する、請求の範囲１もしくは３１のいずれかの細胞。１９．レポーター遺伝子が、色、蛍光、発光、細胞の栄養要求の細胞の生存能力の救援、細胞の成長および薬物耐性から成る群から選択される検出可能なシグナルを生じさせる遺伝子産物をコードする、請求の範囲１８の細胞。２０．レポーター遺伝子が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β-ラクタマーゼ、ルシフェラーゼおよびグリーン蛍光タンパク質から成る群から選択される遺伝子産物をコードする、請求の範囲１９の細胞。２１．レポーター遺伝子が成長の利点を分け与える遺伝子産物をコードする、請求の範囲１９の細胞。２２．レポーター遺伝子が、カナバニンもしくは類似の選択的作用物質を含有する培地中で成長する能力を細胞に分け与える遺伝子産物をコードする、請求の範囲１９の細胞。２４．シグナル経路がカルシウムの動員を調整する、請求の範囲１もしくは３１のいずれかの細胞。２４．シグナル経路がＰＫＣ活性を調整する、請求の範囲１もしくは３１のいずれかの細胞。２５．シグナル経路が細胞の成長の温度感受性を調整する、請求の範囲１もしくは３１のいずれかの細胞。２６．異種ホスホリパーゼＣが構成的に活性化される、請求の範囲１もしくは２９のいずれかの細胞。２７．哺乳類のβタイプのホスホリパーゼＣをコードする第一の異種遺伝子を含む酵母細胞であって、そのホスホリパーゼＣがその細胞により発現されかつホスファチジルイノシトール４,５−ビスリン酸を加水分解することが可能である細胞。２８．ホスホリパーゼＣがＰＬＣβ１、ＰＬＣβ２、ＰＬＣβ３およびＰＬＣβ ４から成る群から選択される、請求の範囲２７の細胞。２９．ｉ）細胞に第一の検出可能な表現型を分け与える突然変異を有するホスホリパーゼ遺伝子、および、 ii）ホスホリパーゼＣ活性を有するポリペプチドをコードする第一の異種遺伝子であって、その異種ホスホリパーゼＣ活性が突然変異を調整しかつ細胞に第二の検出可能な表現型を分け与える遺伝子、を含む酵母細胞。３０．突然変異が機能喪失突然変異であり、また、異種ホスホリパーゼＣが機能喪失を補足する、請求の範囲２９の細胞。３１．異種ホスホリパーゼＣ活性が細胞のシグナル経路に機能的に組込まれる、請求の範囲２９の細胞。３２．第一の検出可能な表現型が、温度感受性の成長および塩化ナトリウム感受性から成る群から選択される、請求の範囲２９の細胞。３３．細胞がサッカロミセス属(Saccharomyces)の細胞である、請求の範囲１、２７もしくは２９のいずれかの細胞。３４．細胞が、異種の試験ポリペプチドをコードする発現可能な組み換え遺伝子をさらに含み、そして培養系の細胞の混合物が試験ポリペプチドの多彩な集団を集合的に発現する、請求の範囲１、２７もしくは２９のいずれかの細胞を含む多彩な培養系。３５．ｉ）請求の範囲１の細胞を、シグナル経路を介して伝達される細胞内シグナルを検出するのに適切な条件下で試験化合物と接触させること、および、 ii）試験化合物の存在下にシグナル経路により伝達されるシグナルのレベルを測定すること、の段階を含む、ホスホリパーゼＣ活性のモジュレーターを同定するアッセイであって、試験化合物の非存在に関する試験化合物の存在下でのシグナルのレベルでの統計学的に有意の差違が、その試験化合物が異種ホスホリパーゼＣ活性のモジュレーターであることを指摘するアッセイ。３６．細胞内シグナルが、シグナル経路に感受性の転写調節要素に操作可能に結合されたレポーター遺伝子の発現により検出される、請求の範囲３５のアッセイ。３７．細胞内シグナルが、フォスファチジルイノシトール４,５-ビスリン酸の加水分解生成物を測定することにより検出される、請求の範囲３５のアッセイ。３８．細胞内シグナルが、カルシウムイオンの動員およびプロテインキナーゼの活性化の程度の１個もしくはそれ以上を測定することにより検出される、請求の範囲３５のアッセイ。３９．細胞内シグナルが成長での変化を測定することにより検出される、請求の範囲３５のアッセイ。４０．ｉ）請求の範囲29の細胞を、第一のおよび第二の表現型の１個もしくは双方を検出するのに適切な条件下で試験化合物と接触させること、 ii）試験化合物の存在下での第一のおよび／もしくは第二の表現型のレベルまたは程度を測定すること、ならびに、 iii）段階ii）の測定を、試験化合物の非存在もしくは異種ホスホリパーゼＣの非存在下での類似の測定と比較すること、の段階を含む、ホスホリパーゼＣ活性のモジュレーターを同定するアッセイであって、試験化合物もしくはホスホリパーゼＣの非存在に関する試験化合物の存在下で測定された表現型での統計学的に有意の変化が、その試験化合物が異種ホスホリパーゼＣ活性のモジュレーターであることを指摘するアッセイ。４１．ｉ）請求の範囲１８の細胞を、レポーター遺伝子の発現に適切な条件下で試験化合物と接触させること、 ii）試験化合物の存在下にレポーター遺伝子の発現を検出すること、および、 iii）試験化合物の存在下でのレポーター遺伝子発現のレベルを、試験化合物の非存在もしくは異種ホスホリパーゼＣの非存在下でのレポーター遺伝子発現のレベルと比較すること、の段階を含む、ホスホリパーゼＣ活性のモジュレーターを同定するアッセイであって、試験化合物もしくはホスホリパーゼＣの非存在に関する試験化合物の存在下のレポーター遺伝子発現のレベルでの統計学的に有意の差違が、その試験化合物が異種ホスホリパーゼＣ活性のモジュレーターであることを指摘するアッセイ。４２．ｉ）非哺乳類のホスホリパーゼＣ遺伝子を含有する第一の酵母細胞を提供すること、 ii）哺乳類のホスホリパーゼＣ遺伝子を発現する第二の酵母細胞を提供すること、 iii）第一のおよび第二の酵母細胞のそれぞれを試験化合物と接触させること、 iv）試験化合物の存在下の第一のおよび第二の細胞のホスホリパーゼ活性を検出もしくは定量すること、の段階を含む、非哺乳類のホスホリパーゼＣを選択的に阻害する作用物質を同定する差異に基づくスクリーニングアッセイであって、第二の細胞に関する第一の細胞のホスホリパーゼ活性での統計学的により大きな低下が、その試験化合物が非哺乳類のホスホリパーゼＣを選択的に阻害することを指摘するアッセイ。４３．第一の酵母細胞のホスホリパーゼＣが脊椎動物のホスホリパーゼＣであり、また、第二の酵母細胞のホスホリパーゼＣが脊椎動物の病原体からのホスホリパーゼＣである、請求の範囲４２のアッセイ。４４．脊椎動物がヒトである、請求の範囲４３のアッセイ。４５．ヒトの病原体が、真菌、ウイルス、細菌および原生動物から成る群から選択される、請求の範囲４３のアッセイ。４６．ヒトの病原体がヒトの真菌の病原体である、請求の範囲４３のアッセイ。４７．アッセイが、最低100種の異なる試験化合物のライブリーについて反復される、請求の範囲３５、４０、４１もしくは４２のいずれかのアッセイ。４８．試験化合物が、小さな有機分子および天然の生成物の抽出物から成る群から選択される、請求の範囲３５、４０、４１もしくは４２のいずれかのアッセイ。４９．最低２種の異なる酵母細胞の収集物であって、各細胞が異なるホスホリパーゼをコードする遺伝子を含む収集物。５０．それぞれの異なる酵母細胞が、同じ生物体から得られたホスホリパーゼの異なるアイソタイプまたは異なる生物体から得られた同じもしくは異なるアイソタイプをコードする、請求の範囲４９の収集物。