JP2004357713A - フェロモン系タンパク質代用物を産生するように操作された酵母細胞、ならびにその利用法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 さまざまな手段により、上記のスクリーニング及び選択の系のシグナル・ノイズ率を改良する。
【選択図】 図1
Description
新らしい分子中に生物学的活性を同定することは、歴史的にインビトロ分析あるいは動物の個体を使って行われてきた。未だ何も操作されていない[intact]生物学的存在は、それが細胞であるか全体的な組織であるかを問わず、インビトロでの抗菌剤、抗カビ剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤を選択するものとして使われてきた。培養された哺乳動物細胞も潜在的な治療用化合物を検出するよう設計したスクリーニングに使われている。細胞の成長刺激や識別、細胞運動における変化、特定の代謝産物の生成、細胞内での特定タンパク質の発現、改変させたタンパク質機能、改変させた伝導特性など、さまざまな生物学的定量法上の終点が哺乳動物細胞スクリーニングにおいて開発されている。ガンの化学療法に使われる細胞障害化合物が、これらの能力を介して、インビトロおよびインビボで腫瘍細胞の成長を阻害することが同定されている。分散細胞の培養のほかに全体組織も、筋肉の収縮に起因するもののように、生物学的定量法に役立っている。
Cell,1991, Vol.65, p.691-699 Cell, 1991,Vol.66, p2327-2338
cerevisiae]突然変異株の利用法につき記載している。
PolIIを有する。より高次の真核細胞においてと同様、TATAボックスは酵母プロモーター中で必須の制御配列である。酵母TATAボックス結合タンパク質(TBP)は、その哺乳動物TFIIDの機能的代用物としての能力により同定されている[Buratowskiら、
Nature 334, 37 (1988); Cavalliniら、 Nature 334, 77 (1988)]。僅かな数の明らかな例外を除いて[ある種の解糖酵素遺伝子の転写、Struhl、
Mol. Cell. Biol. 6, 3847 (1986)およびOgdenら、 Mol. Cell Biol. 6, 4335 (1986)参照]、酵母遺伝子の転写は転写開始のために最も近いTATAボックスのエレメントおよびTFIID結合を必要とする。また効率的な転写にとって必要とされるものは、遺伝子特異的な活性化物質(アクティベーター)タンパク質である。こうした遺伝子特異的な調節タンパク質が転写に影響するメカニズムについては未だ完全に解明されていない。
activation sequence (UAS)]に結合することによってa特異的遺伝子の転写を活性化する。Matα1pとMCM1pとは相互反応して特異的UAS結合部位に相互が結合することを促進し、α細胞中におけるα細胞特異的遺伝子の転写を活性化する。Matα2pはMCM1pと連合してα細胞中におけるa特異的遺伝子の転写を抑制する。Matα1p/Matα2p調節体は二倍体細胞にだけ発見されている。
165 aa 前駆体タンパク質をコードする。リーダーは19 aa シグナル配列と、3つのオリゴ糖側鎖を付加するための部位を有する66 aa とを有する(KurjanとHerskowitz、
Cell 39, 933 (1982); Singhら、 Nuc. Acids Res. 11, 4049 (1983); Juliusら、 Cell 36,
309 (1984)。13 aa α因子の4つのタンデムなコピーが前駆体のC末端部分に存在する。6-8 aa スペーサーペプチドがα因子配列に先行する(第2図)。
Biochem. Biophys. Res. Commun. 116, 822 (1983); Juliusら、 Cell 36, 309 (1984);
Juliusら、 Cell 37、 1075 (1984)。KEX2エンドペプチターゼによるプロα因子の開裂の前にゴルジで付加的なグリコシル化が行われる。この酵素はスペーサーリピート各々の中で切断し、α因子ペプチドのC末端に付くLys−Arg配列を残す(Juliusら、
Cell 37、 1075 (1984)。Lys−Arg配列はKEX−1プロテアーゼの作用によって切除される(Dmochowskaら、 Cell 50,
573 (1987)。α因子ペプチドのN末端に付加されたスペーサー残基はSTE13でコードされたジペプチジルアミノペプチダーゼによって切除される(Juliusら、
Cell 32, 839 (1983)。上述のタンパク分解過程を経由して各前駆体タンパク質から4つのα因子ペプチドが放出され、成熟α因子が細胞から分泌される。
aaと38 aa残基である(MFa1遺伝子の概略については第5図参照)。前駆体はa因子の1コピーを有しており2つの遺伝子の産物はアミノ酸1個につき配列が異なっている。a因子の2つの形はa細胞によって等量産生される(Manneyら、
in Sexual interactions in eukaryotic microbes, p21, Academic Pess. New york
(1981)。a因子のプロセッシングはα因子プロセッシングとは細かいあらゆる点で異なる工程を踏む。a因子のプロセッシングは細胞質ゾル中で開始され、ファルネシルトランスフェラーゼによりカルボキシ末端(−CVIA)近くのC末端システイン残基のファルネシル化[farnesylation]を経由する(Schaferら、
Science 245, 379 (1989); Schaferら、 Science 249, 1133 (1990)。ファルネシルトランスフェラーゼのα、βサブユニットは各々、RAM2遺伝子とRAM1遺伝子によってコードされる(Heら、
Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 11373 (1991)。ファルネシル化をした後、膜結合エンドプロテアーゼによって修飾システインに対しC末端をなす3つのアミノ酸をタンパク分解で切除する。次にカルボキシ末端ファルネシル化システイン残基をさらに修飾する。カルボキシ基をSTE14遺伝子の産物でメチル化する。STE14pは膜結合S−ファルネシル−システインカルボキシルメチルトランスフェラーゼである(Hrycynaら、
EMBO. J. 10, 1699 (1991)。a因子のN末端加工のメカニズムはまだ解明されていない。前駆体のプロセッシングが完了したら、成熟a因子がSTE6遺伝子の産物、ATP結合カセット(ABC)輸送体によって細胞外の空間に移動させられる(Kuchlerら、
EMBO. J. 8, 3973 (1989)。
pombe]においては、M因子がMAP3受容体に結合するか、P因子がMAM2受容体に結合する。G-タンパク質の解離はキナーゼカスケード(BYR2,BYR1,SPK1)を活性化し、キナーゼカスケードの活性化は転写因子(STE11)を刺激する。しかしS.
pombeでは、Gαサブユニットがシグナルを伝送するのであって、言うまでもなく詳細にはこれ以外にさまざまな相違点がある。
Mol. Cell. Biol. 8:1309 (1988) 参照、 フェロモン受容体(STE2及びSTE3)遺伝子、MackayとManny、
Genetics, 76:273 (1974)、 Hartwell、 J. Cell. Biol., 85:811 (1980)、 Hagenら、
P.N.A.S. (USA), 83:1418 (1986)参照; FAR1遺伝子、ChangとHerskowitz、 Cell, 63:999 (1990)参照;
およびSST2遺伝子、 ChanとOtte、 Mol. Cell. Biol., 2:11 (1982)参照、 がある。
Eur. J. Biochem. 198, 651 (1991)、インフルエンザウイルス赤血球凝集素(Jabbarら、 Proc. Natl. Acad.
Sci. 82, 2019 (1985)、ラット肝臓シトクロムP−450(Oedaら、 DNA 4、 202 (1985)および機能的な哺乳動物抗体(Woodら、
Nature 314, 446 (1985)がある。酵母分泌経路の利用は、外来タンパク質の忠実な折り畳み[folding],グリコシル化および安定化をもたらす可能性を向上させるので、好ましいことである。このように酵母中に異種タンパク質を発現させることは、酵母分泌タンパク質の遺伝子(例えばα因子フェロモン、またはSUC2[インベルターゼ]遺伝子)中にコードされたシグナル配列と外来タンパク質遺伝子との融合を伴うことが多い。
Meth. in Enzymol. 194, 491 (1991)。
Cell 68, 721 (1992)]。また哺乳動物ステロイドホルモン受容体[Metzgerら、 (1988); SchenaとYamamoto (1988)]およびヒトp53[SchrerとIggo、
Acids Res. 20, 1539 (1992)]が酵母中で転写を活性化することが確かめられた。
Science 231,1580 (1986)。
Science 256, 232 (1992)があり、また、ヒトCFTR[cystic fibrosis transmembrane conductance
regulator](ヒトのう胞性繊維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレータ)および酵母STE2配列があるキメラタンパク質がa因子フェロモンを酵母中に輸送することが確認されている(Teemら、
Cell 73, 335 (1993)。
EMBO J., 6:249-54 (1987); BenderとSprague, Jr.、 Genetics 121: 463-76 (1989)
cerevisiae中に機能的に発現されている。MarshとHershkowitz、 Cold Spring Harbor Symp., Quant.
Biol., 53: 557-65 (1988)はS. cerevisiae STE2をS. Kluyvenから得たその相同体と交換している。ドラマチックなことに、哺乳動物のアドレナリン性β受容体とGαサブユニットとが酵母中に発現され、その酵母の交配シグナル経路を制御していることが見い出されている。Kingら、
Science, 250: 121-123 (1990)
1993年)。
drug resistance-relating gene-comprises P-glycoprotein accumulated in cell
membrane part of transformed yeast])。その薬物は問題の酵母細胞によって産生されなかった。
Biol., 8;4370 (1988)参照。HIS3(イミダゾルグリセロールリン酸デヒドラターゼ)遺伝子が、酵母中における選択的マーカーとして使われている。SikorskiとHeiter、
Genetics, 122:19 (1989); Struhlら、 P.N.A.S. 76:1025 (1979)参照。またFUS1−HIS3融合につき
Stevensonら、 Genes Dev., 6:1293 (1992)参照。
USP `409)、プラスミド(Cull)あるいはファージ(Scott, Devlin, Cwirla, Felici, Ladner `409)の形で提供される。これらシステムの多くはペプチドの最大長さとかペプチドの構成(例、Cysの排除)などによって限定されている。担体が近接しているなどの立体因子は結合にとって障害となるおそれがある。通常、スクリーニングは人為的に提供されたターゲットにインビトロで結合させるためのものであって、生きている細胞中に細胞のシグナル伝達経路を活性化したり阻害することではない。細胞表面受容体はターゲットとして使われるが、スクリーニングはペプチド結合が受容体のコンフォメーションにおけるアロステリック変化を引き起こしたかを明らかにしない。
312 (1987), respectively)。
removal]を経由する。成熟a因子がSTE6p経由で細胞から排出されると、α細胞の表面に発現したSTE3pに結合し、それらの成長を阻止する。
酵母のα因子フェロモンをコードする合成オリゴヌクレオチドが、Mata細胞中に発現された。これらの細胞は正常時はa因子フェロモンを発現するのであるが、内因性a因子コード遺伝子が切除されてこの発現が阻止された。これらの細胞によるα因子の発現と放出はフェロモンシグナルの発信に関して、それらに「オートクリン」を付与する。成熟α因子を有するペプチドが酵母の分泌経路経由で細胞外環境に輸送するため、これらの細胞中でプロセッシングを受けた。フェロモンシグナル発信はα因子がMata細胞中に発現されたSte2受容体に結合することによって開始された。これらの実験に使用された株を背景にフェロモンによるシグナル発信をすることは、ヒスチジンを欠く培地で応答細胞を成長させることになる。α因子を発現しない対照細胞のバックグラウンドの成長はHIS3インヒビター、アミノトリアゾールの濃度を高めることによって防止される。
Mata細胞中の合成フェロモンをコードするオリゴヌクレオチドを含有するプラスミドから酵母a因子が発現された。これらの実験に使われたこの酵母は正常時に発現されるSte2タンパク質をa因子Ste3の受容体と交換することによって「オートクリン」された。これらの細胞中でa因子ペプチドをプロセッシングを受け、内因性Ste6タンパク質のATP依存性トランスメンブラン輸送体によって細胞外環境に輸送された。Ste3に結合したときにこれらの細胞によって放出されたa因子により開始されるフェロモンのシグナル発信は、ヒスチジンを欠く培地における細胞の成長によって示される。a因子を発現することができない対照細胞のバックグラウンドの成長(これらのα細胞はフェロモンをコードするプラスミドを欠いている)は、HIS3インヒビターのアミノトリアゾール濃度を高めることによって防止される。
Kuchlerにより構築されたもので、突然変異体ヒトMdr1タンパク質と酵母a因子フェロモン前駆体の両方を同時に過発現することができる(KuchlerとThorner、
Proc. Natil. Acad. Sci. 89, 2302 (1992)。
表2の受容体は、G-タンパク質結合受容体ではあるがたとえ酵母フェロモンに応答せず、未修飾の内因性G-タンパク質に結合しないかもしれないとしても、酵母フェロモン受容体と機能的に相同であると考えられる。これは「類似機能」と考えられる。
1.小さな脂肪族の、無極性または微極性の残基:
Ala,Ser,Thr (Pro,Gly)
2.極性、負電荷の残基:およびそれらのアミド
Asp,Asn,Glu,Gln
3.極性、正電荷の残基:
His,Arg,Lys
4.大きい脂肪族の、無極性残基:
Met,Leu,Ile,Val (Cys)
5.大きい芳香族の残基:
Phe,Tyr,Trp
Rら、 Biochem. J. 289:25-31, 1993; Kohl NEら、 J. Biol. Chem. 266:18884-8, 1991)。配列相同性が酵母ファルネシルトランスフェラーゼ(各々、RAM2,RAM1)のαサブユニット、βサブユニットをコードする遺伝子と、哺乳動物のファルネシルトランスフェラーゼのαサブユニット、βサブユニットをコードする遺伝子との間に存在する(Kohl
NEら、 J. Biol. Chem. 266:18884-8, 19991; Chen WJら、 Cell 66:327-34, 1991)。哺乳動物ファルネシルトランスフェラーゼのβサブユニットとRam1pはアミノ酸配列が37%同一であることが観察されている(Chen
WJら、 Cell 66:327-34, 1991)。
Science 260, 1934 (1993)。ファルネシルトランスフェラーゼの2つのサブユニットのうちβサブユニットは、ファルネシル化を促進することが明確に分かっているので、インヒビターにとって一層魅力的なターゲットである。これと対蹠的にαサブユニットは、Rho/RacファミリーのヘテロトリメリックG-タンパク質と小分子量G-タンパク質とのGγサブユニットの修飾に関与する酵素であるゲラニルゲラニルトランスフェラーゼIと共有されている。βサブユニットはファルネシル化に貢献するが、哺乳動物ファルネシルトランスフェラーゼはp21rasのほかにもさまざまな代替物を有している。これら他の代替物、例えばラミンタンパク質、トランスデューシンγ[transducin-γ]、ロドプシンキナーゼのファルネシル化に対するβサブユニットのインヒビター効果は、潜在的なファルネシルトランスフェラーゼインヒビターの設計法および使用法に関して考察される。
RAM1の代わりに哺乳動物ファルネシルトランスフェラーゼのβサブユニットのために遺伝子を運ぶ、(2) cAMPの存在下で、菌株にRas機能の喪失に対する抵抗性を与えるcam突然変異を行う、(3)
Ste3pの異種発現によってそれらが排出するa因子に応答する、(4) それらがガラクトース含有培地で成長できないようにオートクリンa因子に応答する。後者の特徴は、フェロモン応答プロモーターの制御下でのGAL1の発現、および突然変異されたGAL7またはGAL10遺伝子を含むように操作された細胞を要求する。GAL1の発現は、GAL7またはGAL10遺伝子のいずれかにおける突然変異を含む株にガラクトースが存在するとき有毒である。フェロモン応答経路経由でのシグナル発信は、細胞をそのように操作されたガラクトース感受性にする。ファルネシルトランスフェラーゼのβサブユニットを阻害する化合物に上記株をさらすことは、これらの細胞にガラクトースおよびcAMP含有の培地に成長する能力をそれら細胞に付与するであろう。
それらがガラクトース含有培地に成長することができないようにオートクリンa因子に応答する。ファルネシルトランスフェラーゼのβサブユニットを阻害する化合物にこのような株をさらすと、ガラクトースおよびcAMP含有培地に成長する能力をそれらの細胞に付与する。
Bら、 Proc Natl Acad Sci 88:11373-7, 1991)。テスター細胞(上記の)はガラクトース含有培地±cAMP上に候補インヒビターの存在下で成長することができる。テスト化合物がファルネシルトランスフェラーゼを阻害するのであれば、ガラクトース±cAMP上に成長可能であるがcAMP非存在下でのガラクトース上には成長不能である。この差は37℃のときに最も顕著であろう。逆にテスト化合物がa因子産生に関与するその他のタンパク質を阻害するのであれば、細胞はcAMPの存否に拘わらずにガラクトース含有培地に成長するであろう。
Bら、 Proc Natl Acad Sci 88:11373-7, 1991)。
上記のネガティブGAL1選択スキームにおけるようにガラクトースを含む培地にそれらが成長できないようにオートクリンa因子に応答する。このような株がメチルトランスフェラーゼ阻害化合物にさらされていることは、それらの細胞にガラクトースを含む培地に成長する能力を付与することになる。
cerevisiaeの古典的分泌経路を経てゴルジに輸送される。プレプロ-α-因子のシグナル配列はシグナルペプチダーゼによるERへの移動中に切断され、アスパラギンと結合したオリゴ糖が加えられ(ER中で)、分泌経路を移動するときに前駆体のプロセグメント上に(ゴルジ中で)修飾される。ゴルジに到着すると、タンパク質分解の3つの歴然としたプロセスが起こる。第1に、Kex2プロテアーゼが各α因子リピートのアミノ末端近くの二塩基残基(−KR−)で切断する。Kex2は哺乳動物細胞におけるフェロモンプロセシングに関与するズブチリシン様のエンドプロテアーゼPC2及びPC1/PC3に相同である(SmeekensとSteiner、
1990年; Nakayamaら、 1991年)。その他の哺乳動物Kex2様プロセシングをするエンドプロテアーゼとしては、ヒト肝細胞ガン[hepatoma]から単離されるPACE、睾丸性生殖細胞中に発現されるPC4、消化管ペプチドのプロセシングのための候補プロテアーゼのPC6がある(Barrら、
1991年; Nakaykamaら、 1992年; Nakagawaら、 1993年)。Kex2様タンパク質は哺乳動物細胞内の組織特異性エンドプロテアーゼの大きなファミリーをなすものと考えられる。
1990)。また、酵母Kex1とKex2ならびにそれらの哺乳動物対応物間には、天然[native]酵素を欠く哺乳動物細胞中に発現するときは、両方の酵母酵素はタンパク質分解により内因性前駆体を開裂するという点で機能的に類似していると考えられることが証明されている(Thomasら、
1988年、 1990年)。それなら酵母プロテアーゼKex1、Kex2およびSte13pの哺乳動物同族体が酵母中に発現するとき、それらは適当な開裂部位のある合成α因子フェロモン前駆体をプロセシングするように機能する可能性があるように考えられる。酵母中でそのように機能すると考えられるヒトプロテアーゼにはPC2およびPC1/PC3(その他のKex2同族体),カルボキシペプチダーゼBおよびE(Kex1同族体)、そしてIV型ジペプチジルアミノペプチダーゼ(Ste13p同族体)がある。
1988年)。コラゲナーゼもまた慢性関節リウマチのような炎症性プロセシングを伴う結合組織の破壊に関係している。
convertase]PC1の調節因子を求めてスクリーニングする利用法については第8図に記載してある。
1986年、 Hydeら、 1990年)。これらの内在膜タンパク質は、そのヌクレオチドの加水分解からエネルギーを得て分子を輸送するATPアーゼである。このファミリーは、アミノ酸、糖、オリゴ糖、イオン、重金属、ペプチドの輸送体である50以上の原核および真核のタンパク質、またはこのスーパーファミリー[superfamily]に属する他のタンパク質を含む。代表的なトランシングメンブラン輸送体は表1(1−1,1−2,1−3)に示してある。典型的にはABC輸送体がATP加水分解のエネルギーを使って濃度勾配により細胞膜を通して基質をポンプする。いくつかは基質を取り込み、他はそれを排出する。Higgins、
Ann. Rev. Cell, Biol., 8:67-113 (1992)参照。
histocompatibility complex](MHC)ペプチド輸送体は、Tap1、Tap2という2つのポリペプチドからなる。各タンパク質のN末端は疎水性の膜スパニングドメインを有するが、C末端はATP結合配列を有している。Tap1とTap2は一緒になって機能的複合体を形成する。分裂酵母シゾサッカロマイセス・ポンベ[Schizosaccharomyces
pombe]中に発現された耐重金属タンパク質のHMT1は、1個の疎水性ドメインとC末端ATP結合配列を有するポリペプチドからなる(Ortizら、 1992年)。HMT1輸送体はホモダイマーとして機能するものと考えられる。サッカロマイセス・セレビシエ[Saccharomyces
cerevisiae] Ste6のa因子輸送体が、2つの膜スパニングドメインと2つのヌクレオチド結合ドメインを有する1個のポリペプチドとして発現される。Ste6が2つの半分子[half-molecule]として発現するとき、明らかに形成されるタンパク質複合体は、野生型のポリペプチド1個の機能より50%大きいレベルを保持する(BerkowerとMichaels、
1991年)。Mdr1,CFTR、MRPなどその他の真核ABC輸送体でも、4つのドメインがポリペプチド1個の中に含まれている。こうしてABC輸送体はたった1個のマルチドメインポリペプチドであるのか、あるいは各々が1つまたは2つのドメインを有する2つまたはそれ以上のポリペプチドからなるのかもしれない。
Nature 298, 723-727 (1982)。E. coliマルトース輸送体のMalFタンパク質は、2つの追加のトランスメンブランセグメントでこの疎水性ドメインにつき全体で8つのトランスメンブランセグメントを有する疎水性配列のN末端延長体を有している(Overduinら、
1988年)。しかし、このN末端延長体はこの輸送体の機能を失うことなく切除することもできる(Ehrmannら、 1990年)。機能トランスロケーターの形成に必要なセグメント数はこうした研究によって示唆されてはいるが、トランスメンブランセグメント自体の正確な構造に関するデータは存在しない。これらの配列はαらせん形をもっていると推定されているが、まだ証明されたわけではなく、形質膜内のトランスロケーション複合体の全体構造はまだ解明されていない。
1982年; Englemanら、 1986年)。こうした値は実験データ(種々の溶剤中でのアミノ酸の溶解度測定、可溶性タンパク質中での側鎖の分析)および理論上の考察に基づくもので、合理的な精度で新規の配列中の2次構造を予想することを可能にしている。疎水性測定を使った分析は、トランスメンブランらせんと一致している疎水的特性を有するタンパク質配列のストレッチがあることを示す。
(1986); McGrathとVarchavsky, Nature 340, 400 (1989); Kuchlerら、 EMBO J. 8, 3973
(1989)]。その他の配列類似性は、げっし類動物P−糖タンパク質のトランスメンブランドメインの場合のように、遺伝子重複で説明することができる(Endicottら、
1991年)。S. typhimuriumのヒスチジン輸送体のトランスメンブランドメインはアグロバクテリウム・ツメファシエンス[Agrobacterium
tumefaciens]のオクトピン取込系のそれと相同性を有している。後者の2つの輸送体は化学的に類似の基質を移送(トランスロケート)する(Valdivaら、
1991年)。
1986年)。MDRのトランスメンブランセグメント11における突然変異はその輸送体の基質特異性を変化させること、またCFTRのトランスメンブランドメインにおける荷電残基の突然変異は、そのイオン選択性を変化させることが確認されている(Andersonら、
1991年)。
1989年)。実際、細胞質ループにおける突然変異は所与の輸送体の基質特異性を変えることが知られている。トランスメンブランセグメント2と3の間のループにあるヒトMDRのG185V突然変異は、その輸送体のビンブラスチンおよびコルヒチンとの相互反応を変える(Choiら、
1988年)。
モチーフ」[Walker motifs]を有している。Walkerら、 EMBO J. 1:945-951 (1982)。 配列保存はATP結合ドメインの長さを超えて伸び、ウォーカーモチーフに限定されない。また1輸送体のATP結合ドメインどうしは、2つの別の輸送体からのドメインよりも大きい配列同一性を示す。しかし保存されたATP結合ドメインを有するタンパク質の全部が輸送に関与するものではない。細胞質酵素UvrAはDNA修復において機能し、酵母のEF−3タンパク質は延長因子である。それでもこれらタンパク質双方は配列比較によって同定可能なATP結合カセットを有している。
1992年; KuchlerとThorner、 1992年)。STE6のために切除された酵母株は、外因性ABC輸送体の機能をモジュレートする化合物を捜し出すスクリーニング設計の開始点となる。
・ アゴニスト(リガンド)が特定のタンパク質(受容体)の細胞表面に結合する。
・ リガンド結合の結果、受容体はその細胞膜中における伝達タンパク質を活性化させるアロステリック変化を呈する。
・ 細胞内で形質導入タンパク質が所謂「二次メッセンジャー分子」の生成を活性化する。
・ この二次メッセンジャー分子が、特定の遺伝子を「スイッチオン」または「オフ」する力がある細胞内で一定の調節タンパク質を活性化するか、ある代謝過程を変更する。
receptor](STR)と呼ばれることが多い。同一リガンドに結合する多数の全く異なった受容体など百種以上のさまざまなSTRが発見されており、さらに多数の別種のSTRが発見されようとしている。
321, 173 (1993); Birkenbachら、 J. Virol. 67, 2209 (1993) によりクローニングされた受容体などがある。
Mol. Cell. Biol., 7:2914-24 (1987); Sharpら、 14:5125-43 (1986) 参照。
表2に関する参考文献は図10−1ないし図10−9を参照されたい。図11−1ないし図11−11は本発明に関連する一般文献の一覧である。
Ann. Rev. Biochem., 60:653-88 (1991) に論述がある。STRを比較すると、相同性のはっきりした空間的パターンが判別できる。トランスメンブランドメインは、しばしば最も類似しているが、N末端領域とC末端領域ならびにトランスメンブランセグメントVとVIを接続している細胞質ループは、より多様である。
Cell, 50:1001 (1987) はラットGαが酵母Gβγ複合体に機能的に結合されることを証明した。しかしラットGαi2は、かなり過剰発現しているときしか相補せず、Gα0は全く相補しなかった。Kangら、
Mol. Cell. Biol., 102582 (1990)。したがってある種の外来Gαサブユニットでは、酵母Gαを簡単に置き換えることはできそうもない。
cerevisiae中に同定されている。この経路が妨害されると、酵母細胞は低い浸透圧によって成長能を失う。その成分は交配経路カスケードの成分と同程度にまで性格付けされていないが、配列分析はBCK1pがMEKKであること、MKK1p/MKK2pはMEKであること、そしてMPK1pはMAPKであることを同定している。
pombe)の産物との間に見られる。また哺乳動物MEKはSTE7(S. cerevisiae)とByr1(S. pombe)の産物に相同であることが発見されている([Crewsら、
Science 258, 478 (1992)])。ある種のキナーゼ間の機能的な相同性は、酵母キナーゼ欠失突然変異体で異種キナーゼ遺伝子を置き換えることによって確認されている。このようにXenopus
MAPキナーゼはS. cerevisiae中でのmpk1△突然変異体を相補する(しかしこのキナーゼは同じ生物中におけるFus3pまたはKss1p機能を代替しない)([Leeら、
Mol. Cell. Biol. 13, 3067 (1993)]。哺乳動物およびXenopus MAPキナーゼはS. pombe中におけるSpk1機能を代替する([Neimanら、
Molec. Biol. Cell. 4, 107 (1993); Gotohら、 Molec. Cell. Biol. 13, 6427 (1993)]。ウサギMAPキナーゼキナーゼはS.
pombe中のbry1欠陥を相補するが、それはRaf1キナーゼと共に発現したときだけである。したがって後者はMEKの直接のアクティベータと思われる(Hughesら、
Nature 364, 349 (1993)。
pombe)およびp34cdc28(S. cerevisiae)のヒト相同体が、S. pombeにおけるcdc2突然変異の相補によって同定されている([LeeとNurse、
Nature 327, 31-35 (1987)]。第2のヒトp34相同体のCDK2が、S. cerevisiaeにおけるp34cdc28突然変異の機能相補によって同定されている([ElledgeとSpottswood、
EMBO J. 102653 (1991)]。p34の活性化は、サイクリンと呼ばれる調節サブユニットとそれとの会合によって決まる。サイクリン発現の厳格な制御、および一旦発現されたこれらタンパク質に固有の不安定性は、p34キナーゼの活性化と細胞周期の進行を調節することに貢献している。
cerevisiae中でG1サイクリンとして機能する([Lewら、 Cell 66, 1197 (1991)]。
cerevisiae中のSTARTを介する進行に操作すると考えられる(Hadwigerら、 1989年; Cross、 1988年; Nash、 1988年)。CLNタンパク質の配列は、哺乳動物A-およびB-型サイクリンの配列にある程度相同である。これらのタンパク質は哺乳動物細胞周期のS相(DNA合成)およびM相(有糸分裂)を調節すると考えられている。
destruction]モチーフ」(Glotzerら、 1991年)経由でシグナルされる。
1991年)。
1991年)。D1サイクリンの発現はきわめて成長因子依存性であるから、内部的細胞周期制御メカニズムの一部をなすものではなく、外部的シグナルに対する応答によってだけ発生するものであろう(Scherr
1993年)。ある種の副甲状腺アデノーマに過剰発現するPRAD1遺伝子は、D1遺伝子と同一のものである(Motokuraら、 1991年)。D1は多形性神経膠細胞系統中に過剰発現され(Xiongら、
1991年)、遺伝子増幅による脱制御[deregulation]に委ねられることが知られている(Lammieら、 1991年; KeyomarsiとPardee、
1993年)。D1の脱制御は、ある種のリンパ腫、扁平上皮癌および乳癌に見られる未解明のメカニズムにより生起される(Bianchiら、 1993年)。このタンパク質は細胞成長の活性化に関与するものであるから、この遺伝子の脱制御された発現は癌的な事態と思われる。E-型サイクリンがヒト細胞におけるG1からSへの遷移に機能することに関していくつかの証明がある。このサイクリンはG1中のヒトリンパ球の抽出物中にあるp34cdc2タンパク質に結合し活性化するもので、このタンパク質はHeLa細胞中のヒストンH1キナーゼ活性と会合し、サイクリンE mRNAがHeLa細胞中の後期のG1に特異的に発現される(Lewら、
1991年)。
1993年)。TGF-βはミンク肺の上皮細胞中でG1からS相への進行を阻止することが証明されている(Howeら、 1991年)。TGF-βは、たぶんキナーゼがサイクリンEと共に形成する複合体の安定性を減殺することによって、キナーゼの活性化に干渉するものと思われる(Koff
1993年)。
340245 (1989))による記載の2つのハイブリッド系は、酵母中のタンパク質−タンパク質の相互反応を検出することができる。GAL4タンパク質はガラクトースで生育する酵母中での転写に係る有力なアクティベータである。GAL4の転写活性化能力は、特異的DNA配列(UASG)に結合することができるN末端配列、および転写アクティベータを有するC末端ドメインの存在に左右される。タンパク質「A」をコードする配列は、GAL4タンパク質のDNA結合ドメインをコードする配列に融合される。第2のハイブリッドタンパク質は、GAL4トランスアクチベーションドメインをコードする配列をタンパク質「B」をコードする配列に融合することによって生成することができる。タンパク質「A」とタンパク質「B」が相互反応すると、この相互反応はUASG含有遺伝子の転写を活性化するのに必要なGAL4の2つのドメインの一体化に役立つ。両方のハイブリッドタンパク質をコードするプラスミドを同時発現するほかに、この2ハイブリッド系を使ったタンパク質−タンパク質相互反応の検出にとって適切な酵母株は、UASG配列からの転写を検出可能なGAL1−lacZ融合を有する。これらの株も内因性GAL4およびGAL4の陰性レギュレータであるGAL80を欠失させるべきである。
maydis]; サッカロマイセス・セレビシエ[Saccharomyces
cerevisiae]が好ましい。GαまたはGβγのいずれも「エフェクター」のアクティベータとなる。種によってはGαで活性化されたエフェクターもGβγで活性化されたエフェクターも共に存在すると考えられる)。ここで「酵母」とは、厳格な分類学上の意味における酵母(即ち、単細胞生物)だけでなく、交配経路に媒介されるフェロモン応答のある酵母様の多細胞真菌も含む意である。
(a) 内因性FAR1遺伝子が不活性化されている。
(b) 内因性SST2遺伝子及び/又はその他の脱感作に関与する遺伝子が不活性化されている。
(c) 内因性フェロモン(a因子またはα因子)受容体遺伝子が不活性化されている。
(d) 内因性フェロモン遺伝子が不活性化されている。
α因子およびa因子の受容体、(c) FAR1遺伝子、(d) SST2遺伝子、そして(e) FUS1プロモーター、のDNA配列については、以下に掲げる参考文献中に報告されている。
Laybourn、 とJ Merryweather。 タンパク質輸送および分泌におけるフェロモンa因子を交配する酵母ペプチドの前駆体をコードする遺伝子の構造。
Gething M-J, ed. Cold Spring Harbor Lab, New York, 1985.
RA Hitzemanら、 1983年。 サッカロマイセス・セレビシエはαフェロモンをコードする全く異なる2遺伝子を有している。Nucleic Acids
Res. 11:4049; J KurfanとI Herskowitz、 1982年。酵母フェロモン遺伝子(MF)の構造:推定上のα因子前駆体は成熟α因子の4つのタンデムコピーを有している。Cell
30:933。
Acids Res. 13:8463; N
Nakayama、 A
MiyajimaとK Arai、 1985年。 サッカロマイセス・セレビシエからの細胞型特異的な無菌遺伝子、STE2およびSTE3のヌクレオチド配列。EMBO
J. 4:2643; DC Hagen、 G McCaffreyとGF Sprague, Jr.、 1986年。 酵母STE3遺伝子がペプチドフェロモンa因子の受容体をコードすることを証明する。遺伝子配列と予想される受容体の構造を示唆する。Proc
Natl Acad Sci 83:1418。
63:999。
Kurjan、 1987年。 サッカロマイセス・セレビシエSST2遺伝子:フェロモン減感作のモデル、の配列とフェロモン調節。Mol Cell Biol 7:
4169。
Cell Biol 7:2316。
J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968);とHollandら、 Biochemistry 17, 4902 (1978)のためのプロモーターがある。即ち、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−6−リン酸イソメラーゼ、3−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、そしてグルコキナーゼである。酵母での発現に使うのに適切なベクターおよびプロモーターについてはR.
Hitzemanら、 EPO Publn. No. 73,657に詳しい。生育条件によってコントロールされる転写という別の長所をもっているその他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソシトクロムC、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関係する分解酵素、および上記のメタロチオネインとグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、それにマルトースとガラクトースの利用に関与する酵素のプロモーター領域である。最後に、2つの半数体交配型の1つにだけ活性なプロモーターは、ある条件下では適切なものである。これら半数体特異的プロモーターの中でフェロモンプロモーターMFa1とMFα1が特に興味深い。
(1) STE3の転写を正常に指示する転写制御因子の下流にSTE2のコード領域を置く。これはS.
cerevisiaeのゲノムSTE3を、STE3転写制御エレメントによってSTE2のコード配列が駆動される配列と置き換えることを可能にするプラスミド中で行われる。
(2) STE2の転写を正常に指示する転写制御因子の下流にSTE3のコード領域を置く。これはS.
cerevisiaeのゲノムSTE3を、STE2転写制御因子によってSTE3のコード配列が駆動される配列と置き換えることを可能にするプラスミド中で行われる。
L.H.、 1985年、 STE2、 Nuc. Acids Res. 13, 8463; Nakayama N.、 Miyajima A.、 Arai K.、
1985年、STE2 STE3 EMBO J. 4, 2643 参照
and Applications Guide, 1991, Promega Corporation, Madison, WI)中にクローニングする。STE2の−鎖(マイナス鎖)を鋳型として使って、SpeI部位をSTE2のATGの7ヌクレオチド(nts)上流に配列番号1の突然変異誘発性オリゴヌクレオチドで導入した(突然変異の塩基は塩基番号15番目のA、17番目および20番目のTであり、開始コドンは塩基番号28〜30番目のATGである)。
1096)を次に、酵母組み込みベクターYIp19にサブクローニングしてCadus 1143を得た。STE3配列も公知である。Nakayama N.、
Miyajima A.、 Arai K.、 1985年、 STE2 STE3 EMBO J. 4, 2643; Hagen D.C.、 McCaffrey
G.、 Sprague G.F.、 1986年 STE3 Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 1418。STE3はpBLUESCRIPT−KS II中に3.1
kb フラグメントとしてクローニングされたものがDr. J. Broachから入手可能である(Stratagene, 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92027)。STE3をM13mp18 RF(Cadus 1105を生成)およびpUC19(Cadus
1107を生成)両方の中にKpnI−XbaIフラグメントとしてサブクローニングした。Cadus 1107中の2つのSpeI部位をDNAポリメラーゼIクレノウフラグメントでうめたSpeIで消化して取り除き、ブラントエンド連結反応で再び環状化した。STE3のマイナス鎖を含む1本鎖DNAをCadus 1105を使って得、SpeI部位をSTE3の開始コドンの9nts上流、および終結コドンの3nts下流に、配列番号3,4の突然変異誘発性オリゴヌクレオチドと共に、各々、導入した。
Vitro Mutagenesis Kit, Descriptions and Protocols, 1991, United States
Biochemical, P.O. Box 22402, Cleveland, Ohio 44122)。その結果得たCadus 1141の複製型をAflIIおよびKpnIで消化し、2つの新しく導入されたSpeI部位にはさまれたSTE3の全コード領域を含む約2
kbのフラグメントを単離し、AflII−およびKpnI−で消化されたCadus 1107の約3.7 kbのベクターフラグメントと連結反応させてCadus
1138を産生した。Cadus 1138をXbaIおよびKpnIで消化し、STE3含有の2.8 kbフラグメントを酵母組込型XbaI-およびKpnI消化のプラスミドpRS406に連結反応させた(Sikorski,
R.S.とHieter, P. 1989年 「サッカロマイセス・セレビシエ中のDNAの効率的操作のために設計されたシャトルベクターと酵母宿主株との系」 Genetics
122:19-27 to yield Cadus 1145)。
1143のSpeIフラグメントをCadus 1145のSpeIフラグメントと置き換えて、STE3をコードする配列がSTE2発現エレメントの制御下に置かれているCadus
1147を産生した。同様にしてCadus 1145のSpeIフラグメントをCadus 1143のSpeIフラグメントと置き換えて、STE2をコードする配列がSTE3発現エレメントの制御下に置かれているCadus
1148を産生した。ポップイン/ポップアウト置換法(Rothstein, R.、 1991年[19]DNA、Methods in Enzymology,
194:281-301)を使ってMATa細胞中でゲノムSTE2をste2−STE3ハイブリッドと置き換えるためCadus 1147を使い、MATα細胞中でゲノムSTE3をste3−STE2ハイブリッドと置き換えるためCadus
1148を使った。Cadus 1147、 1148は選択可能なマーカーURA3を有している。 フェロモン誘発性のFUS1プロモーターの制御下にHIS3を発現するように操作されている交配型aの半数体酵母をCADUS
1147で形質転換し、URA3を発現する形質転換体を選択した。これら形質転換体はSte2pおよびSte3pの両方を発現するが、それらを5−フルオロオロチン酸上にプレートし、そこに異種起源の組み込まれたSTE3を残して内因性STE2を失ったクローンを選択できるようにした。こうした細胞はヒスチジンを欠く培地に生育する能力を示し、フェロモン応答経路のオートクリン刺激のあることを示している。
(1) 成熟α因子をコードするMFα1領域を、AflIIおよびBglII端を有するオリゴヌクレオチドを受けることができる制限部位で、1本鎖の突然変異生成を介して置き換える。AflIIおよびBglII端を有するオリゴヌクレオチドを挿入すると、MFα1シグナルおよびオリゴヌクレオチドによってコードされた配列の上流にリーダー配列を有するタンパク質をコードするプラスミドを産生する。このMFα1シグナルとリーダー配列は、成熟α因子の輸送に正常時に使われる経路を介して、これらの前駆体タンパク質のプロセッシングを指示する。
Thorner, カリフォルニア大学)から1.8 kb EcoRIフラグメントとして得たMFα1遺伝子を、AflIIおよびBglII端のあるオリゴヌクレオチドを受け止める部位を構築して、成熟α因子をコードする領域を除去するオリゴヌクレオチド誘発突然変異生成を行う準備として、pALTER(第2図参照)中にクローニングする。この突然変異生成は、鋳型としてマイナス株および配列番号5の突然変異誘発性のオリゴヌクレオチドを使って行われた。
1214の1.5 kb HindIIIフラグメントは、酵母中に発現され、内因性α因子によって正常時に移動される経路から分泌されるオリゴヌクレオチドのクローニング部位を提供する。
1983年 [11] ADCI Academic Press, Inc., Meth. Enzymol. 101, 192-201)、高コピーの酵母プラスミドpRS426中に連結反応させた(Christianson,
T.Wら、 1992年、 Gene 110:119-122)。(第3図) 得たプラスミド中の単一のXhoI部位を除去してCadus 1186を得た。Cadus
1214の1.5 kb HindIIIフラグメントをHindIII消化したCadus 1186中に挿入した。このカセット中にクローニングされる配列の発現はADH1プロモーターから開始する。得られたCadus
1215と命名されたプラスミドは、AflIIとBclIで消化することにより、これらの制限エンドヌクレアーゼ末端を有するオリゴヌクレオチドを受容するように調製することができる。オリゴヌクレオチドがMFα1シグナルおよびリーダーペプチドのコンテキスト中に発現される(第4図)。
これらのMFA1配列は21アミノ酸リーダーペプチドのC末端の5つのアミノ酸を終結コドンまでコードする。
1172の1.6 kb HindIIIフラグメントをHindIII消化Cadus 1186(上記)に連結反応させ、このカセット中にクローニングされた配列の発現をADH1プロモーターの制御下に整える。ポリリンカー中のSacI部位をベクター中にある第2のSacI部位を除去することによって特殊なものにした。得られたCadus
1239と命名されたプラスミドは、MFa1リーダーペプチドのコンテキスト中に発現されるので、XhoIとAflIIとで消化することにより、これらの制限エンドヌクレアーゼ末端を有するオリゴヌクレオチドを受容するように調製することができる(第6図)。
bar1 far1−1 fus1−HIS3 ste14::TRP1 ura3 trp1 leu2 his3である。bar1突然変異は、α因子を消化し、クローニングされたオリゴヌクレオチドによってコードされるペプチドを消化できるプロテアーゼを産生するこの株の能力を除去する。far1突然変異は、正常時にフェロモン応答経路の刺激に続く生育阻止を無効にする。組み込まれたFUS1−HIS3ハイブリッド遺伝子はフェロモン応答経路の活性化の選択可能なシグナルを供給する。そして最後にste14突然変異はFUS1−HIS3読み出しのバックグラウンドを低下させる。MFα細胞中のMFα1前駆体のプロセッシングに関与する酵素もまたMATa細胞中に発現されるのであるから(SpragueとThorner、
in The Molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces: Gene
_Expression、 1992年、 Cold Spring Harbor Press)、CY588細胞はプラスミドCadus 1215から発現されたオリゴヌクレオチドによってコードされるペプチドを分泌することができるにちがいない。
1215(上記)中にクローニングされるオリゴヌクレオチドの縮重配列(NNN)nをこのフェロモンをコードするように特定した(n=13)。CY588を得られたプラスミド(Cadus
1219)で形質転換し、ウラシルを欠く培地で選択された形質転換体を、一定の濃度幅のアミノトリアゾールで補足したヒスチジン欠損培地に移した(バックグラウンド生育を減少させるのに助けとなるHIS3遺伝子産物のインヒビター)。第7図に示される結果は、Cadus
1215によるMFα1のコンテキストに発現された合成オリゴヌクレオチドは、CY588にアミノトリアゾールで補足されたヒスチジン欠損培地に生育する能力を付与したことを示している。総合すると、これらのデータは次のことを示している。即ち、1.CY588はCadus
1215にクローニングされCadus 1215から発現された合成オリゴヌクレオチドの(NNN)n配列によってコードされるペプチドの分泌にとって適格である;また、2.CY588はオートクリンにおいて、そのフェロモン応答経路を刺激する分泌ペプチドに、この場合STE2に結合するα因子によって、応答することができる。
1147(上記)を使った。このハイブリッド遺伝子は、STE3をコードする領域が正常時にSTE2の発現を生起する発現エレメントの制御下にある。その結果、a因子受容体はα因子受容体に置き換わる。a因子をコードする遺伝子はこの株から除去される。far1突然変異は生育停止を無効にし、この無効は正常時にフェロモン応答経路の刺激に続く。そしてFUS1−HIS3ハイブリッド遺伝子(HIS3座で組み込まれた)は、フェロモン応答経路の活性化に関する選択可能シグナルを供給する。CY599細胞は、内因性酵母輸送体Ste6の発現によってCadus
1239から発現されたオリゴヌクレオチドでコードされたa因子ペプチドまたはa因子様ペプチドを輸送することができるものと期待された。
1239(上記)中にクローニングされるオリゴヌクレオチドの縮重配列(NNN)nがa因子フェロモンのペプチド成分をコードする(n=12)。CY599を得られたプラスミド(Cadus
1220)で形質転換し、ウラシルを欠く培地で選択された形質転換体を、一定の濃度幅のアミノトリアゾールで補足したヒスチジン欠損培地に移した。第8図に示される結果は、Cadus
1220によるMFA1のコンテキストに発現された合成オリゴヌクレオチドは、CY599にヒスチジン欠損培地における向上されたアミノトリアゾール耐性成長を付与したことを証明している。総合すると、これらのデータは次のことを示している。即ち、1.Cadus
1220および設計されたオリゴヌクレオチドは、その合成オリゴヌクレオチドの(NNN)n配列によってコードされるファルネシル化、カルボキシメチル化ペプチドの発現および排出を指示することにおいて適格である;また、2.CY599はオートクリンにおいて、そのフェロモン応答経路を刺激するファルネシル化、カルボキシメチル化ペプチドに応答することができる。この場合STE3にa因子が結合しシグナルが発生する。
strain]中にトランスフェクションされる。こうした実験が成功裡に完了したら、フェロモン応答経路に結合する膜受容体を活性化することができるペプチドを発見するための系の可能性について証明することになろう。
virtual repeat]は、コードされたアミノ酸を変更することなく変えられる。上記のランダムオリゴヌクレオチドは実際には配列番号14,15の2つのオリゴから構築されるであろう。
(1) pYMA177(Cadus
1067である)。第9図参照。
(2) YEp351中にMFa1をコードする配列を含むpKK1;a因子は増加されたプラスミドコピー数のためこのプラスミドから過剰発現される。
(3) pHaMDR1(wt)はレトロウイルスベクター中の野生型Mdr1 cDNAを供給する(当初はMichael
Gottesman, NIHから入手した)。
MFa1配列を有する1.5
kb BamHI−BglIIフラグメントをpYMA177から取り出し、BamHI消化したpYMA177に連結反応させてCadus 1079を産生した。野生型ヒトMdr1(G185)配列を含有する965
bpフラグメントを単離するため、Cadus 1079をBglIIで消化した。965 bp BglIIフラグメントをBglII消化したCadus 1093に挿入してCadus
1097を産生した。Cadus 1097構築物の存在をジデオキシヌクレオチドを使って配列決定することにより立証した。Cadus 1164を産生するため、pYMA177をBamHIで消化しMFa1コード配列を除去するため再環化させた。pYMA177から得た702
bp BglII−BamHIフラグメントをpYMA177の大きいBamHI−BglIIフラグメントに連結反応させることによってCadus 1165を構築した。これは1.6
kb MFaBamHIフラグメントとヒトMdr1(G185V)をコードする965 bp Bglフラグメントの両方を除去する結果をもたらす。得られるプラスミドはCadus
1165である。
1165に連結反応させてCadus 1176を得た。
1019)はURA3コントロールプラスミドとして機能する。 これらの実験に使われる最終プラスミド列は次の通りである。
1079、 及び1097が酵母のura3-,ste6-株に形質転換された(WKK6=CY20=MATa ura3−1 leu2−3,112 his3−11,15 trp1−1 ade2−1 can1−102 ste6::HIS3、Karl
Kuchlerから入手)。個々の形質転換体はSD−URA培地で一晩のうちに成長し、約5×106の細胞を含む菌層を3mlのYPD重層寒天中にあるYPDプレート上に注いだ。寒天の上面が固化後に殺菌フィルターディスクをプレート上に被せ5mlのDMSOまたは5mMのDMSOに溶かしたバリノマイシンをフィルターディスク上に垂らした。この分析によってWKK6細胞中のプラスミド1079から得た突然変異Mdr1の発現はバリノマイシンに対する弱い耐性を付与したが、プラスミド1097から得た野生型Mdr1の発現は完全な耐性を付与した。
fibrosis](CF)突然変異を含有するCFTRタンパク質の輸送機能を増大する化合物を同定するのに使われるスクリーニングの設計の基礎として役立てられる。Ste6/CFTRキメラを使ったTeemら(1993)による研究に基づき、突然変異CFTRはa因子類似体を効率的に輸送するものとは期待できない。Teemら(1993)は、ヒトCFTRの第一のヌクレオチド結合ドメインをコードする配列のさまざまな部分を酵母STE6の類似配列で置換してキメラタンパクを作製している。キメラタンパク質は酵母中に発現されると生酵母a因子を輸送する。しかしCF突然変異(△F508)の導入はこれらのタンパク質が酵母フェロモンを輸送する能力を減殺する。Teemらはまた、酵母中に復帰変異株、つまりa因子を輸送するCF突然変異を有するキメラの能力を保持する第2位の突然変異を有するタンパク質を同定した。復帰変異株突然変異を哺乳動物細胞中に発現された欠陥あるCFTRタンパク質中に導入することは、△F508タンパク質のプロセッシングとチャネルの欠陥を一部分減少させた。
と Smith 1993)。これらの突然変異はまたCFTRの最も一般的な変形例の一つに位置付けられる。CFTRによる輸送のための基質として機能するペプチドを同定することができない場合には、キメラSte6/CFTRタンパク質と変形されなかったa因子が酵母のオートクリン株に基づくスクリーニングに利用することができる。これらの株はスクリーニングの実際においてはっきりと利点を提供する、即ち、大規模オートメーションのための容易な適用性、フェロモンのシグナル発信に関する従来の酵母交配細胞の分析に比較して簡単で向上された感度、活性ペプチド構造を同定する今日の技術を採用できる可能性などである。
[prohormone convertase] PC1の代用物の予言的例
S.ら、 1991年、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3564-3568; Seideh N.G.ら、 1992年、 FEBS
Lett. 310235-239)。例えば、哺乳動物PC1がキメラプレ-プロ-POMC/α因子ペプチドをプロセスし、成熟α因子の分泌およびオートクリン方式でのヒスチジンのプロトトロフィー(原栄養性)にスクリーニングする株を刺激することを可能にする酵母株について記載する。オートクリン株は次のようにして構築される。即ち、1.酵母KEX2が破壊される。2.酵母KEX2活性が哺乳動物PC1の活性と置き換えられる。3.PC1によって認識される二塩基分割部位を有する新規のMFα構築物が発現する。4.成熟α因子の産生にPC1活性が要求される。5.株の生育が成熟α因子の産生によって刺激される。以上である。
1219(URA3 2mu−ori REP3 AmpR f1−ori α因子)から発現したプレ-プロ-POMC/α因子キメラのプロセッシングはKEX2活性を要求するので、Cadus
1219でひとたびトランスフェクションされるとヒスチジン欠損培地でオートクリン式で生育することができない。
1289)中にクローニングされる。このプラスミドで形質転換された酵母細胞はロイシン欠損培地に生育する能力を得て、PGKプロモーターが存在するためハイレベルなPC1タンパク質を発現する。
1219からBbsI部位の5’端とBglII部位の3’端で配列番号22,23のプライマーを使って増幅される。配列番号22の第4〜9番目の配列はBbsI部位である。配列番号23の第4〜9番目の配列はBglII部位であり、塩基番号第10〜12番目の配列は終止コドンである。
1215がBglIIと部分的にHindIIIで切断され、pAlterポリリンカー配列を有するHindIII−BglII制限ベクターがゲル精製される。2つのPCR産物とHindIII−BglIIで消化されたCadus
1215との3部連結反応は、最初の104アミノ酸残基がPOMCからで残りの17はα因子からのハイブリッドPOMC/α因子遺伝子を産生する。PC1開裂部位周辺のこのハイブリッド遺伝子は、配列番号24である。ここでPOMCから与えられた残基には下線が引いてある、また二塩基開裂部位は下線付の太字、成熟α因子の配列はイタリックで表してある。二塩基開裂部位と成熟α因子のアミノ末端トリプトファンとの間に並列しているテトラペプチド−EAEA−は、ste13pのジペプチジルアミノペプチダーゼ活性によって除去される。
Claims (75)
- (a)酵母細胞のフェロモン系において、相当する酵母フェロモン系タンパク質が自然に行う機能を行う酵母フェロモン系タンパク質の異種起源代用物をコードする第1の異種遺伝子と、(b)異種起源のペプチドをコードする第2の異種遺伝子と、を含む、フェロモン系を有する酵母細胞であって、上記ペプチドが酵母細胞において上記代用物の上記フェロモン系との相互反応を調節し、その調節が選択可能またはスクリーニング可能であり、上記異種起源のペプチドの長さが2〜200アミノ酸であることを特徴とする酵母細胞。
- 内因性フェロモン系タンパク質が機能を有する形態で生成されるものでないことを特徴とする請求項1に記載の酵母細胞。
- ペプチドが細胞によってペリプラズム空間中に分泌され、そこからそれが上記代用物と相互反応することを特徴とする請求項1に記載の酵母細胞。
- 前記異種起源ペプチドが、開裂可能な酵母リーダーペプチドと成熟ペプチドからなる前駆体ペプチドの形で発現し、該リーダーペプチドが該異種起源ペプチドの分泌を制御することを特徴とする請求項3に記載の酵母細胞。
- 前記リーダーペプチドがサッカロマイセス・セレビシエα因子またはa因子のリーダーペプチドに相当するリーダーペプチドである請求項4に記載の酵母細胞。
- 酵母フェロモン系の野生型フェロモンが分泌されないことを特徴とする請求項4に記載の酵母細胞。
- 前記異種起源ペプチドが非分泌型でも発現されることを特徴とする請求項3に記載の酵母細胞。
- 細胞が野生型株に比較してそのフェロモンシグナル経路を反復または引伸ばされた刺激を通して非感受性にする傾向が減少した突然変異株であることを特徴とする請求項1に記載の酵母細胞。
- SST2遺伝子が機能的に発現されないことを特徴とする請求項8に記載の酵母細胞。
- 内在性FAR1遺伝子が機能的に発現されないことを特徴とする請求項1に記載の酵母細胞。
- フェロモンシグナル経路によって活性化される選択可能なマーカーをさらに有することを特徴とする請求項1に記載の酵母細胞。
- 上記選択可能なマーカーが、外来の選択可能な遣伝子に制御可能に連結されたフェロモン応答プロモーターを含むレポーター遺伝子を含むマーカーである、請求項11に記載の酵母細胞。
- 選択可能な遺伝子がIGPデヒドラターゼ遺伝子であることを特徴とする請求項12に記載の酵母細胞。
- 前記フェロモン応答プロモーターがFUS1プロモーターであることを特徴とする請求項12に記載の酵母細胞。
- 細胞がサッカロマイセス・セレビシエ種に属するものであることを特徴とする請求項1に記載の酵母細胞。
- フェロモン系タンパク質がファルネシルトランスフェラーゼであることを特徴とする請求項1に記載の酵母細胞。
- フェロモン系タンパク質がカルボキシメチルトランスフェラーゼであることを特徴とする請求項1に記載の酵母細胞。
- フェロモン系タンパク質がキナーゼであることを特徴とする請求項1に記載の酵母細胞。
- 酵母フェロモン系タンパク質が、前駆体タンパク質の開裂によって酵母フェロモンの成熟型の生成に関与するプロテアーゼで、その代用物もまたプロテアーゼであることを特徴とする請求項1に記載の酵母細胞。
- 細胞中に生成された前駆体タンパク質がそれ自身酵母フェロモン前駆体タンパク質の代用物であり、該代用物前駆体タンパク質が前記代用物プロテアーゼによって認識されるが、酵母フェロモン系プロテアーゼによって認識されない部位を有するアミノ酸配列を有し、上記代用物前駆体タンパク質は前記代用物プロテアーゼによって開裂され、酵母フェロモンの成熟型を生成するものであることを特徴とする請求項19に記載の酵母細胞。
- 野生型酵母フェロモン前駆体タンパク質が生成されないことを特徴とする請求項20に記載の酵母細胞。
- 酵母フェロモン系タンパク質が酵母フェロモンの膜輸送に関与するABC輸送体で、その代用物もABC輸送体であることを特徴とする請求項1に記載の酵母細胞。
- 前記代用物が、前記ペプチドが輸送を阻害しない限り、酵母フェロモンを輸送するものであることを特徴とする請求項22に記載の酵母細胞。
- 前記代用物が、上記ペプチドの助けがあったときだけ酵母フェロモンを輸送するものであることを特徴とする請求項22に記載の酵母細胞。
- 酵母フェロモン系タンパク質が酵母フェロモン受容体であることを特徴とする請求項1に記載の酵母細胞。
- 前記酵母細胞の少なくとも1個において、前記ペプチドが前記代用物受容体のアゴニストであることを特徴とする請求項25に記載の酵母細胞。
- 前記酵母細胞の少なくとも1個において、ペプチドが代用物受容体のアンタゴニストであることを特徴とする請求項25に記載の酵母細胞。
- 前記酵母フェロモン受容体がGタンパク質であり、該Gタンパク質のGαサブユニットがキメラであることを特徴とする請求項25に記載の酵母細胞。
- Gαサブユニットのアミノ末端部分が酵母Gタンパク質のGαサブユニットであり、その残部が異種起源のGタンパク質のGαサブユニットの一部である請求項28に記載の酵母細胞。
- フェロモン系タンパク質がサイクリンであることを特徴とする請求項1に記載の酵母細胞。
- 前記酵母細胞が前記ペプチドとは異なる非フェロモン応答性のスクリーニング可能なマーカーを有していることを特徴とする請求項30に記載の酵母細胞。
- 前記ペプチドが前記代用物のアゴニスト又はアンタゴニストである、請求項1〜31のいずれか一項に記載の酵母細胞。
- 前記異種起源ペプチドの長さが5〜50アミノ酸である、請求項1〜32のいずれか一項に記載の酵母細胞。
- フェロモン系タンパク質の非酵母代用物の活性の調節についてペプチドを分析する方法であって、上記代用物および上記異種起源ペプチドを機能的に発現する請求項1〜33のいずれか一項に記載の酵母細胞を供給し、前記スクリーニングにおける変化を検出することによって、該代用物と該ペプチドとの相互作用によってフェロモンシグナル経路が活性化されたのか阻害されたのかを決定するステップを含むことを特徴とする方法。
- 前記細胞がフェロモン応答性選択可能マーカーを有し、該細胞は所望の活性効果または阻害効果を有するペプチドの発現について選択されるものであることを特徴とする請求項34に記載のペプチド分析方法。
- 前記細胞がフェロモン応答性スクリーニング可能マーカーを有し、該細胞は所望の活性効果または阻害効果を有するペプチドの発現についてスクリーニングされるものであることを特徴とする請求項34に記載のペプチド分析方法。
- 代用物がヒトMdr1であって、前記細胞は、該代用物がα因子を輸送するときだけヒスチジンのない培地で生育し、かつ、代用物がα因子を輸送するときだけガラクトース感受性で、さらに、内因性の多面発現性薬物耐性(Pleiotropic drug resistance)の遺伝子が不活性化されていることを特徴とする請求項35に記載の方法。
- 複数の酵母細胞を含む酵母培養物であって、前記酵母細胞が、
(a)酵母細胞のフェロモン系において、相当する酵母フェロモン系タンパク質が自然に行う機能を行うことのできる酵母フェロモン系タンパク質の異種起源代用物をコードする第1の異種遺伝子と、(b)異種起源のペプチドをコードする第2の異種遺伝子とを含み、かつ、異種起源のペプチドのライブラリーを集合的に発現する酵母細胞であり、前記ライブラリー中の異種起源のペプチドと前記代用物との相互作用が該代用物と前記フェロモン系との相互作用を調節し、該調節が選択又はスクリーニング可能であることを特徴とする酵母培養物。 - 内因性フェロモン系タンパク質が機能を有する形態で生成されるものでないことを特徴とする請求項38に記載の培養物。
- ペプチドが細胞によってペリプラズム空間中に分泌され、そこからそれが上記代用物と相互反応することを特徴とする請求項38に記載の培養物。
- 前記異種起源ペプチドが、開裂可能な酵母リーダーペプチドと成熟ペプチドからなる前駆体ペプチドの形で発現し、該リーダーペプチドが該異種起源ペプチドの分泌を制御することを特徴とする請求項40に記載の培養物。
- 前記リーダーペプチドがサッカロマイセス・セレビシエα因子またはa因子のリーダーペプチドに相当するリーダーペプチドである請求項41に記載の培養物。
- 酵母フェロモン系の野生型フェロモンが分泌されないことを特徴とする請求項41に記載の培養物。
- 前記異種起源ペプチドが非分泌型でも発現されることを特徴とする請求項40に記載の培養物。
- 細胞が野生型株に比較してそのフェロモンシグナル経路を反復または引伸ばされた刺激を通して非感受性にする傾向が減少した突然変異株であることを特徴とする請求項38に記載の培養物。
- SST2遺伝子が機能的に発現されないことを特徴とする請求項45に記載の酵母細胞。
- 内在性FAR1遺伝子が機能的に発現されないことを特徴とする請求項38に記載の培養物。
- フェロモンシグナル経路によって活性化される選択可能なマーカーをさらに有することを特徴とする請求項38に記載の培養物。
- 上記選択可能なマーカーが外来の選択可能な遣伝子に制御可能に連結されたフェロモン応答プロモーターを含むレポーター遺伝子を含むマーカーである、請求項48に記載の培養物。
- 選択可能な遺伝子がIGPデヒドラターゼ遺伝子であることを特徴とする請求項49に記載の培養物。
- 前記フェロモン応答プロモーターがFUS1プロモーターであることを特徴とする請求項49に記載の培養物。
- 細胞がサッカロマイセス・セレビシエ種に属するものであることを特徴とする請求項38に記載の培養物。
- フェロモン系タンパク質がファルネシルトランスフェラーゼであることを特徴とする請求項38に記載の培養物。
- フェロモン系タンパク質がカルボキシメチルトランスフェラーゼであることを特徴とする請求項38に記載の培養物。
- フェロモン系タンパク質がキナーゼであることを特徴とする請求項38に記載の培養物。
- 酵母フェロモン系タンパク質が、前駆体タンパク質の開裂によって酵母フェロモンの成熟型の生成に関与するプロテアーゼで、その代用物もまたプロテアーゼであることを特徴とする請求項38に記載の培養物。
- 細胞中に生成された前駆体タンパク質がそれ自身酵母フェロモン前駆体タンパク質の代用物であり、該代用物前駆体タンパク質が前記代用物プロテアーゼによって認識されるが、酵母フェロモン系プロテアーゼによって認識されない部位を有するアミノ酸配列を有し、上記代用物前駆体タンパク質は前記代用物プロテアーゼによって開裂され、酵母フェロモンの成熟型を生成するものであることを特徴とする請求項56に記載の酵母細胞。
- 野生型酵母フェロモン前駆体タンパク質が生成されないことを特徴とする請求項57に記載の培養物。
- 酵母フェロモン系タンパク質が酵母フェロモンの膜輸送に関与するABC輸送体で、その代用物もABC輸送体であることを特徴とする請求項38に記載の培養物。
- 前記代用物が、前記ペプチドが輸送を阻害しない限り、酵母フェロモンを輸送するものであることを特徴とする請求項59に記載の培養物。
- 前記代用物が、上記ペプチドの助けがあったときだけ酵母フェロモンを輸送するものであることを特徴とする請求項59に記載の培養物。
- 酵母フェロモン系タンパク質が酵母フェロモン受容体であることを特徴とする請求項38に記載の培養物。
- 前記酵母細胞の少なくとも1個において、前記ペプチドが前記代用物受容体のアゴニストであることを特徴とする請求項62に記載の培養物
- 前記酵母細胞の少なくとも1個において、前記ペプチドが前記代用物受容体のアンタゴニストであることを特徴とする請求項62に記載の培養物。
- 前記酵母フェロモン受容体がGタンパク質であり、Gタンパク質のGαサブユニットがキメラであることを特徴とする請求項62に記載の培養物。
- 前記Gαサブユニットのアミノ末端部分が酵母Gタンパク質のGαサブユニットであり、その残部が異種起源のGタンパク質のGαサブユニットの一部である請求項65に記載の培養物。
- フェロモン系タンパク質がサイクリンであることを特徴とする請求項38に記載の培養物。
- 前記酵母細胞が、前記ペプチドとは異なる非フェロモン応答性のスクリーニング可能なマーカーを有していることを特徴とする請求項67に記載の培養物。
- 前記ペプチドが前記代用物のアゴニスト又はアンタゴニストである、請求項38〜68のいずれか一項に記載の培養物。
- 前記異種起源ペプチドの長さが5〜50アミノ酸である、請求項38〜69のいずれか一項に記載の培養物。
- 非酵母フェロモン系タンパク質代用物の活性についてペプチドライブラリーを分析する方法であって、上記ライブラリーのペプチドおよび上記代用物を機能的に発現し、ペプチドライブラリーを集合的に発現する請求項38に記載の酵母培養物を供給し、該培養体の各細胞中で上記ペプチドによってフェロモンシグナル経路が活性化されたのか阻害されたのかをスクリーニングにおける前記代用物と前記ペプチドとの相互作用により決定するステップを含むことを特徴とする方法。
- フェロモン系タンパク質の非酵母代用物の活性の調節についてペプチドを分析する方法であって、上記代用物および上記異種起源ペプチドを機能的に発現する請求項38〜70のいずれか一項に記載の酵母培養物を供給し、前記スクリーニングにおける変化を検出することによって、該代用物と該ペプチドとの相互作用によってフェロモンシグナル経路が活性化されたのか阻害されたのかを決定するステップを含むことを特徴とする方法。
- 前記細胞がフェロモン応答性選択可能マーカーを有し、該細胞は所望の活性効果または阻害効果を有するペプチドの発現について選択されるものであることを特徴とする請求項72に記載のペプチド分析方法。
- 前記細胞がフェロモン応答性スクリーニング可能マーカーを有し、該細胞は所望の活性効果または阻害効果を有するペプチドの発現についてスクリーニングされるものであることを特徴とする請求項72に記載のペプチド分析方法。
- 代用物がヒトMdr1であって、前記細胞は、該代用物がα因子を輸送するときだけヒスチジンのない培地で生育し、かつ、代用物がα因子を輸送するときだけガラクトース感受性で、さらに、内因性の多面発現性薬物耐性(Pleiotropic drug resistance)の遺伝子が不活性化されていることを特徴とする請求項73に記載の方法。
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