ES2227672T3 - C-c ckr-5, receptor de quimiocinas cc, derivados del mismo ysus usos. - Google Patents

C-c ckr-5, receptor de quimiocinas cc, derivados del mismo ysus usos.

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ES2227672T3 ES97904948T ES97904948T ES2227672T3 ES 2227672 T3 ES2227672 T3 ES 2227672T3 ES 97904948 T ES97904948 T ES 97904948T ES 97904948 T ES97904948 T ES 97904948T ES 2227672 T3 ES2227672 T3 ES 2227672T3
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION TRATA DE NUEVOS PEPTIDOS Y DE MOLECULAS DE ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN DICHOS PEPTIDOS. LA PRESENTE INVENCION TAMBIEN TRATA DEL VECTOR QUE INCLUYE DICHAS MOLECULAS DE ACIDOS NUCLEICOS, DE CELULAS TRANSFORMADAS POR DICHO VECTOR, DE INHIBIDORES DIRIGIDOS CONTRA DICHOS PEPTIDOS O DICHAS MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO, DE UNA COMPOSICION FARMACEUTICA Y DE UN DISPOSITIVO DE DIAGNOSTICO Y/O DE DOSIFICACION QUE INCLUYE DICHOS PRODUCTOS, Y DE ANIMALES TRANSGENICOS NO HUMANOS QUE EXPRESAN LOS PEPTIDOS SEGUN LA INVENCION O LAS MOLECULAS DE ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN DICHOS PEPTIDOS.

Description

C-C CKR-5, receptor de quimiocinas CC, derivados del mismo y sus usos.
Campo de la invención
La presente invención proporciona métodos para determinar anti-ligandos que puedan inhibir la unión de ligandos a péptidos de un nuevo receptor de quimiocina. La invención también se refiere a la selección de fármacos que se unen específicamente a dichos péptidos y a los tratamientos que incluyen dichos péptidos o las moléculas de ácido nucleico que codifican para dichos péptidos.
Antecedentes tecnológicos y estado de la técnica
Las citocinas quimiotácticas, o quimiocinas, son pequeñas proteínas de señalización que pueden dividirse en dos subfamilias (quimiocinas CC y CXC) dependiendo de la posición relativa de las dos primeras cisteínas conservadas. La interleucina 8 (IL-8) es la más estudiada de estas proteínas, pero ahora se ha descrito un gran número de quimiocinas (regulada por activación, expresada y secretada por linfocitos T normales (RANTES), proteína 1 quimioatrayente de monocitos (MCP-1), proteína 2 quimioatrayente de monocitos (MCP-2), proteína 3 quimioatrayente de monocitos (MCP-3), producto génico \alpha relacionado con el crecimiento (GRO\alpha), producto génico \beta relacionado con el crecimiento (GRO\beta), producto génico \gamma relacionado con el crecimiento (GRO\gamma), proteína 1 \alpha inflamatoria de macrófagos (MIP-1 \alpha) y \beta, etc.) [4]. Las quimiocinas desempeñan papeles fundamentales en la fisiología de procesos inflamatorios agudos y crónicos así como en las desregulaciones patológicas de estos procesos, atrayendo y simulando subconjuntos específicos de leucocitos [32]. RANTES, por ejemplo, es un quimioatrayente para los monocitos, células T de memoria y eosinófilos, e induce la liberación de histamina por los basófilos. MCP-1, liberada por las células del músculo liso en lesiones arterioscleróticas, se considera como el factor (o uno de los factores) responsable de la atracción de macrófagos y, por tanto, del empeoramiento progresivo de las lesiones [4].
Las quimiocinas MIP-1\alpha, MIP-1\beta y RANTES se han descrito recientemente como factores supresores del VIH principales producidos por células T CD8^{+} [9]. Las quimiocinas CC también están implicadas en la regulación de la proliferación de células progenitoras mieloides humanas [6, 7].
Recientes estudios han demostrado que las acciones de las quimiocinas CC y CXC están mediadas por subfamilias de receptores acoplados a proteínas G. Hasta la fecha, a pesar de las numerosas funciones atribuidas a las quimiocinas y al número creciente de ligandos biológicamente activos, sólo se han identificado seis receptores funcionales en el ser humano. Se han descrito dos receptores para la interleucina-8 (IL-8) [20, 29]. Uno (IL-8RA) une IL-8 específicamente, mientras que el otro (IL-8RB) une IL-8 y otras quimiocinas CXC, como GRO. Entre los receptores que unen quimiocinas CC, un receptor, designado como receptor 1 de quimiocinas CC (CCR-1) une tanto RANTES como
MIP-1\alpha [31] y el receptor 2 de quimiocinas CC (CCR2) une MCP-1 y MCP-3 [8, 44, 15]. Recientemente, se clonaron dos receptores de quimiocinas CC adicionales: se encontró que el receptor 3 de quimiocinas CC (CCR3) era activado por RANTES, MIP-1\alpha y MIP-1\beta [10]; el receptor 4 de quimiocinas CC (CCR4) responde a MIP-1, RANTES, y MCP-1 [37]. Además de estos seis receptores funcionales, se han clonado varios receptores huérfanos de seres humanos y otras especies, que están estructuralmente relacionados con los receptores de quimiocinas CC o CXC. Éstos incluyen los receptores humanos BLR1 [13], EBI1 [5], LCR1 [21], los de ratón MIP-1 RL1 y MIP-1 RL2 [17] y los bovinos PPR1 [25]. Su(s) respectivo(s) ligando(s) y función(es) es(son) desconocido(s) actualmente.
Sumario de la invención
En una realización, la presente invención se refiere a un método para determinar si un anti-ligando puede inhibir la unión de un ligando, siendo dicho ligando un virus VIH o una parte del mismo, a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que presenta más del 80% de homología con la SEQ ID Nº 2 mostrada en la figura 1, comprendiendo dicho método las etapas de poner en contacto una célula transfectada con un vector que expresa la molécula de ácido nucleico que codifica para dicho péptido, con el anti-ligando en condiciones que permitan una unión del anti-ligando a dicho péptido y determinar si dicho anti-ligando inhibe la unión de dicho ligando a dicho péptido.
En una segunda realización, la presente invención se refiere a un método para determinar si un anti-ligando puede inhibir la unión de un ligando, siendo dicho ligando un virus VIH o una parte del mismo, a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que presenta más del 80% de homología con la SEQ ID Nº 2 mostrada en la figura 1, comprendiendo dicho método las etapas de:
-
preparar un extracto celular a partir de células transfectadas con un vector que expresa la molécula de ácido nucleico que codifica para dicho péptido,
-
aislar una fracción de membrana del extracto celular,
-
poner en contacto el anti-ligando con la fracción de membrana en condiciones que permitan la unión del anti-ligando a dicho péptido, y
-
determinar si dicho anti-ligando inhibe la unión de dicho ligando a dicho péptido.
En una realización preferida, el método de la presente invención comprende las etapas de:
-
preparar una célula o extracto celular, estando dicha célula transfectada con la molécula de ácido nucleico que codifica para un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que presenta más del 80% de homología con la SEQ ID Nº 2 mostrada en la figura 1,
-
posiblemente aislar una fracción de membrana del extracto celular,
-
poner en contacto la célula o fracción de membrana con dicho anti-ligando, en presencia de dicho ligando de dicho péptido, en condiciones que permitan la activación de una respuesta peptídica funcional, y
-
detectar por medio de un bioensayo una modificación en la actividad del péptido, determinando así si dicho anti-ligando inhibe la unión de dicho ligando a dicho péptido.
Según la presente invención, la modificación en la actividad del péptido puede detectarse mediante un bioensayo basado en la modificación de la producción de un segundo mensajero. Dicho bioensayo puede basarse en la medición de la concentración de iones calcio o fosfatos de inositol (tales como IP_{3}).
En una tercera realización, la presente invención se refiere a un método de selección de fármacos para identificar fármacos que se unan específicamente al péptido que comprende la secuencia de aminoácidos que presenta más del 80% de homología con la SEQ ID Nº 2 mostrada en la figura 1, o una parte de la misma, y puedan utilizarse en el tratamiento y/o prevención de la infección por el virus VIH, comprendiendo dicho método poner en contacto una célula transfectada con un vector que expresa la molécula de ácido nucleico que codifica para dicho péptido, con un fármaco en condiciones que permitan la unión de dicho fármaco a dicho péptido y determinar si dicho fármaco se une específicamente a la célula transfectada, identificando así un fármaco que se une específicamente a dicho péptido y que puede utilizarse en el tratamiento y/o prevención de la infección por el virus VIH.
En una cuarta realización, la invención se refiere a un método de selección de fármacos para identificar fármacos que se unan específicamente al péptido que comprende la secuencia de aminoácidos que presenta más del 80% de homología con la SEQ ID Nº 2 mostrada en la figura 1, o una parte de la misma, y puedan utilizarse en el tratamiento y/o prevención de la infección por el virus VIH, comprendiendo dicho método preparar un extracto celular a partir de células transfectadas con un vector que expresa la molécula de ácido nucleico que codifica para dicho péptido, aislar una fracción de membrana del extracto celular, poner en contacto la fracción de membrana con un fármaco en condiciones que permitan la unión de dicho fármaco a dicho péptido y determinar si dicho fármaco se une específicamente a la célula transfectada, identificando así un fármaco que se une específicamente a dicho péptido y que puede utilizarse en el tratamiento y/o prevención de la infección por el virus VIH.
En una quinta realización, la invención se refiere a un método para determinar si un agonista o antagonista que se une a un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos que presenta más del 80% de homología con la SEQ ID Nº 2 mostrada en la figura 1, o una parte de la misma, puede utilizarse en el tratamiento y/o prevención de la infección por el virus VIH, comprendiendo dicho método poner en contacto una célula transfectada con un vector que expresa la molécula de ácido nucleico que codifica para dicho péptido, con el agonista o antagonista en condiciones que permitan la unión del agonista o antagonista a dicho péptido y determinar si dicho agonista o antagonista inhibe la unión del virus VIH a dicho péptido.
En una sexta realización, la presente invención se refiere a un método para determinar si un agonista o antagonista que se une a un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos que presenta más del 80% de homología con la SEQ ID Nº 2 mostrada en la figura 1, o una parte de la misma, puede utilizarse en el tratamiento y/o prevención de la infección por el virus VIH, comprendiendo dicho método preparar un extracto celular a partir de células transfectadas con un vector que expresa la molécula de ácido nucleico que codifica para dicho péptido, aislar una fracción de membrana del extracto celular, poner en contacto la fracción de membrana con el agonista o antagonista en condiciones que permitan la unión del agonista o antagonista a dicho péptido y determinar si dicho agonista o antagonista inhibe la unión del virus VIH a dicho péptido.
La presente invención se refiere a métodos que utilizan un péptido que tiene al menos una secuencia de aminoácidos que presenta más del 80%, ventajosamente más del 90%, preferiblemente más del 95%, de homología con la secuencia de aminoácidos representada en la SEQ ID Nº 2, mostrada en la figura 1.
La presente invención también se refiere a métodos que utilizan la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº 2, o una parte de la misma (representada en la figura 1).
Una "parte de la secuencia de aminoácidos" significa uno o más segmentos de aminoácidos que tienen las mismas propiedades de unión o mejoradas del péptido completo según la invención. Dicha parte podría ser un epítopo que se une específicamente mediante un ligando del péptido, que podría ser un "ligando natural" conocido de dicho péptido, un agonista o un análogo de dicho ligando o un inhibidor que pueda inhibir de manera competitiva la unión de dicho ligando al péptido (incluyendo los antagonistas de dicho ligando con respecto al péptido).
Ejemplos específicos de dichas partes de la secuencia de aminoácidos y sus procedimientos de preparación se describen en la publicación de Pucker J. et al. (Cell, Vol. 87, págs. 437-446 (1996)).
Según la invención, dicha parte de la secuencia de aminoácidos del péptido que se va a utilizar en los métodos según la invención comprende el segmento N-terminal y el primer bucle extracelular del péptido.
El péptido que se va a utilizar en los métodos según la invención, o una parte del mismo, es un receptor de quimiocinas CC activo.
El receptor de quimiocinas CC que se va a utilizar en los métodos según la invención se estimula mediante la quimiocina MIP-1\beta a una concentración inferior o igual a 10 nm y también se estimula ventajosamente mediante las quimiocinas MIP-1\alpha o RANTES. Sin embargo, dicho receptor de quimiocinas no se estimula por las quimiocinas MCP-1, MCP-2, MCP-3, IL-8 y GRO\alpha.
Además, el péptido que se va a utilizar en los métodos según la invención, o una parte del mismo, es también un receptor de virus VIH o una parte de dichos virus VIH.
Se entiende por los "virus VIH", VIH-1 o VIH-2 y todas las diversas cepas de virus VIH que están implicadas en el desarrollo de SIDA. Se entiende por "una parte de los virus VIH", cualquier epítopo de dichos virus que sea capaz de interaccionar específicamente con dicho receptor. Entre dichas partes de los virus que pueden estar implicadas en la interacción con el péptido según se define en la invención, están los péptidos codificados por los genes víricos ENV y GAG.
Según los métodos de la presente invención tal como se definieron anteriormente, dichos virus VIH pueden seleccionarse del grupo que consiste en el virus 1 de la inmunodeficiencia humana (VIH 1), el virus 2 de la inmunodeficiencia humana (VIH 2) o una parte de dichos virus VIH.
Preferiblemente, dicha parte de los virus VIH es el glucopéptido gp120/160 (gp 160 unido a la membrana o el gp libre derivado del mismo) o una parte del mismo.
Se entiende por "una parte del glucopéptido gp120/160" cualquier epítopo, preferiblemente un epítopo inmunodominante, de dicho glucopéptido que puede interaccionar específicamente con el péptido según se define en la invención, tal como por ejemplo el bucle V3 (tercer dominio hipervariable).
Los métodos de la presente invención tal como se definieron anteriormente pueden comprender además la etapa de medir la infectividad de la célula por una cepa de VIH, en la que dicho anti-ligando, fármaco, agonista o antagonista disminuye la infectividad por dicha cepa de VIH. En dicho método, la célula puede ser una célula linfocítica. Además, según la presente invención, la cepa de VIH puede ser el virus 1 de la inmunodeficiencia humana (VIH-1) o el virus 2 de la inmunodeficiencia humana (VIH-2). La invención especifica adicionalmente que la disminución de la infectividad por VIH puede medirse mediante la dosis de una proteína del VIH. Preferiblemente, dicha proteína del VIH es el antígeno P24 del VIH.
Ventajosamente, el péptido que se va a utilizar en los métodos según la invención es un receptor humano.
La presente invención se refiere también a métodos que implican el uso de una molécula de ácido nucleico que tiene más del 80%, preferiblemente más del 90%, de homología con la secuencia del ácido nucleico de la SEQ ID Nº 2, mostrada en la figura 1.
Preferiblemente, dicha molécula de ácido nucleico tiene al menos la secuencia del ácido nucleico mostrada en la SEQ ID Nº 2 de la figura 1 o una parte de la misma.
Se entiende por "una parte de dicha molécula de ácido nucleico" cualquier secuencia del ácido nucleico de más de 15 nucleótidos que pudiera utilizarse con el fin de detectar y/o reconstituir dicha molécula de ácido nucleico o su hebra complementaria. Tal parte podría ser una sonda o un cebador que pudiera utilizarse en amplificación genética, utilizando las técnicas PCR, LCR, NASBA o CPR, por ejemplo.
La presente invención se refiere más específicamente a métodos que implican el uso de moléculas de ácido nucleico que codifican para el péptido que se va a utilizar según la invención. Dichas moléculas de ácido nucleico son moléculas de ARN o ADN, tales como una molécula de ADNc o una molécula de ADN genómico.
La presente invención también se refiere a métodos que utilizan un vector que comprenden la molécula de ácido nucleico según se definió anteriormente. Preferiblemente, dicho vector está adaptado para la expresión en una célula y comprende elementos reguladores necesarios para expresar la molécula de aminoácidos en dicha célula, unido operativamente a la secuencia del ácido nucleico según la invención, para permitir la expresión de la misma.
Preferiblemente, dicha célula se elige de entre el grupo que consiste en células bacterianas, células de levaduras, células de insectos o células de mamíferos. El vector según la invención es un plásmido, preferiblemente un plásmido pcDNA3, o un virus, preferiblemente un baculovirus, un adenovirus o un virus del bosque Semliki.
La presente invención se refiere también a métodos que implican el uso de una célula, preferiblemente una célula de mamífero, tal como una célula CHO-K1 o HEK293, transformada mediante el vector definido anteriormente. Ventajosamente, dicha célula no es de origen neuronal y se elige de entre el grupo que consiste en células CHO-K1, HEK293, BHK21, COS-7.
La presente invención también se refiere al uso de una célula (preferiblemente, una célula de mamífero tal como una célula CHO-K1) transformada por el vector definido anteriormente y por otro vector que codifica para una proteína que potencia la respuesta funcional en dicha célula. Ventajosamente, dicha proteína es la G\alpha15 o G\alpha16 (proteína G, subunidad \alpha). Ventajosamente, dicha célula es la célula CHO-K1-pEFIN hCCR5-1/16.
La invención se refiere también al uso de un oligonucleótido antisentido que tiene una secuencia que puede hibridarse específicamente a una molécula de ARNm que codifica para el péptido, según se definió anteriormente, de modo que evita la traducción de dicha molécula de ARNm o un oligonucleótido antisentido que tiene una secuencia que puede hibridarse específicamente a la molécula de ADNc que codifica para el péptido según la invención.
Dicho oligonucleótido antisentido puede comprender análogos químicos de nucleótido o sustancias que inactiven el ARNm, o pueden incluirse en una molécula de ARN dotada de actividad ribozima.
Así, la presente invención se refiere al uso de un oligonucleótido antisentido, que comprende una secuencia que se híbrida específicamente a una molécula de ácido nucleico que tiene más del 80% de homología con la secuencia de ácido nucleico SEQ ID Nº 2, mostrada en la figura 1, para la fabricación de un medicamento en la prevención y/o el tratamiento de una infección por el virus 1 de la inmunodeficiencia humana (VIH-1) y/o el virus 2 de la inmunodeficiencia humana (VIH-2) (SIDA).
La presente invención también se refiere al uso de un oligonucleótido antisentido, que comprende una secuencia que se híbrida específicamente a una molécula de ácido nucleico que tiene al menos la secuencia de ácido nucleico SEQ ID Nº 2 mostrada en la figura 1, o una parte de la misma, para la fabricación de un medicamento en la prevención y/o el tratamiento de una infección por el virus 1 de la inmunodeficiencia humana (VIH-1) y/o el virus 2 de la inmunodeficiencia humana (VIH-2) (SIDA).
Preferiblemente, dicha molécula de ácido nucleico codifica para un péptido según se defino anteriormente. Además, dicha molécula de ácido nucleico puede ser una molécula de ADNc o una molécula de ADN genómico. Además, según la presente invención dicho oligonucleótido antisentido puede comprender análogos químicos de nucleótidos.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método según se definió anteriormente, que utiliza un ligando o un anti-ligando (preferiblemente, un anticuerpo) distinto a los "ligandos naturales" conocidos, que se eligen de entre el grupo que consiste en las quimiocinas MIP-1\beta, MIP-1\alpha o RANTES, virus VIH o una parte de dichos virus VIH, en el que dicho ligando puede unirse al receptor según la invención y en el que dicho anti-ligando puede inhibir (preferiblemente, de manera competitiva) la unión de dicho "ligando natural" conocido o el ligando según la invención al péptido según la invención.
La presente invención especifica adicionalmente un método según la invención, en el que el anti-ligando, el fármaco, el agonista o el antagonista pueden ser un anticuerpo.
La exclusión en la definición identificada anteriormente de quimiocinas conocidas, virus VIH o una parte de dichos virus VIH, no incluye variantes de dichos virus "naturales" o dicha parte "natural" que pueden obtenerse, por ejemplo, mediante ingeniería genética y que pueden imitar la interacción de dichos virus y parte de dichos virus con el péptido según la invención.
Ventajosamente, dicho anticuerpo que se va a utilizar en un método de la invención es un anticuerpo monoclonal, que se dirige preferiblemente a un epítopo del péptido según la invención y está presente sobre la superficie de una célula que expresa dicho péptido.
Preferiblemente, dicho anticuerpo se produce por la célula de hibridoma AchCCR5-SAB1A7.
En una realización adicional, la presente invención se refiere a un anticuerpo que inhibe o reduce la unión del virus 1 de la inmunodeficiencia humana (VIH-1) o el virus 2 de la inmunodeficiencia humana (VIH-2) a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que presenta más del 80%, 90% o 95% de homología con la SEQ ID Nº 2, mostrada en la figura 1, identificada según un método de la presente invención. Alternativamente, los aminoácidos del péptido pueden tener una secuencia de aminoácidos como la presentada en la SEQ ID Nº 2 de la figura 1. Dicho anticuerpo según la invención puede ser un anticuerpo monoclonal, preferiblemente un anticuerpo monoclonal dirigido a un epítopo de dicho péptido, presente sobre la superficie de una célula que expresa dicho péptido.
Según la invención, el anticuerpo descrito anteriormente puede disminuir la infectividad de una célula por una cepa de VIH. Según una realización preferida, dicha célula es una célula linfocítica. La cepa de VIH reconocida por el anticuerpo de la presente invención puede ser un virus 1 de la inmunodeficiencia humana (cepa VIH-1) o un virus 2 de la inmunodeficiencia humana (cepa VIH-2).
La invención se refiere también a la composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz del anticuerpo identificado anteriormente. La composición farmacéutica comprende también un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente que pueda pasar a través de la membrana de dicha célula.
Preferiblemente, el vehículo farmacéuticamente aceptable comprende una estructura que se une a un receptor en una célula que pueda fijarse por la célula tras la unión a la estructura. La estructura del vehículo farmacéuticamente aceptable en dicha composición farmacéutica puede unirse a un receptor que sea específico para un tipo de célula seleccionado.
Dicha composición farmacéutica según la invención puede utilizarse para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una infección por el virus 1 de la inmunodeficiencia humana (VIH-1) y/o el virus 2 de la inmunodeficiencia humana (VIH-2) (SIDA).
La invención se refiere a un método según se definió anteriormente, en el que la detección por medio de un bioensayo, es por medio de una modificación en la concentración de un segundo mensajero (preferiblemente, iones calcio o fosfatos de inositol tales como IP_{3}) o una modificación el metabolismo celular (preferiblemente, determinado por la tasa de acidificación del medio de cultivo).
Preferiblemente, el ensayo del segundo mensajero que se va a utilizar según la invención comprende la medición de los iones calcio o fosfatos de inositol tales como IP_{3}.
Preferiblemente, la célula utilizada en los métodos según la invención es una célula de mamífero de origen no neuronal, tal como células CHO-K1, HEK293, BHK21, COS-7.
La presente invención se refiere también a la composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo contra el péptido según la invención, eficaz para reducir la actividad de dicho péptido y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Se entiende por "un agonista o un antagonista del péptido que se va a utilizar según la invención", todos los agonistas o antagonistas del "ligando natural" conocido del péptido, según se describió anteriormente.
Por tanto, los métodos descritos previamente pueden utilizarse para la selección de fármacos, para identificar fármacos que se unan específicamente al péptido que se va a utilizar según la invención.
La presente invención se refiere también al uso de la composición farmacéutica según la invención para el tratamiento y/o la prevención de infecciones víricas de los virus 1 y 2 de la inmunodeficiencia humana (VIH-1 y VIH-2).
Los depósitos de microorganismos AchCCR5-SAB1A7 y CHO-K1-pEFIN hCCR5-1/16 se realizaron según el Tratado de Budapest en la Colección Coordinada Belga de Microorganismos (BCCM), Laboratorium voor Moleculaire Biologie (LMBP), Universiteit Gent, K. L. Ledeganckstraat 35, 3-9000 GENT, BÉLGICA.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 representa la estructura primaria de los péptidos según la invención.
La figura 2 representa la secuencia de aminoácidos del receptor CCR5 de quimiocinas, humano y activo según la invención, alineada con la de los receptores CCR1, CCR2b, CCR3 y CCR4 humanos. Se recuadran los aminoácidos idénticos a los de la secuencia del CCR5 activo.
La figura 3 muestra la organización cromosómica de los genes de los receptores CCR2 y CCR5 de quimiocinas humanos.
La figura 4 muestra la expresión funcional del receptor CCR5 humano activo en una línea celular CHO-K1.
La figura 5 representa la distribución del ARNm que codifica para el receptor CCR5 en un panel de líneas celulares humanas de origen hematopoyético.
La figura 6 representa la estructura de la forma mutante del receptor CCR5 humano.
La figura 7 representa la cuantificación de la fusión mediada por proteínas ENV mediante ensayos de luciferasa.
La figura 8 representa la obtención del genotipo de los individuos mediante PCR y segregación de los alelos CCR5 en familias del CEPH (Centro de Estudios del Polimorfismo Humano, en París).
La figura 9 representa el análisis por FACS (citometría de flujo activada por fluorescencia) de los anti-CCR5 séricos en una línea celular CCR5-CHO según la invención.
La figura 10 representa la inhibición de la infectividad por VIH con anticuerpos anti-CCR5.
Descripción detallada de la invención 1. Experimentos Materiales
Se obtuvieron quimiocinas humanas recombinantes, incluyendo MCP-1, MIP-1\alpha, MIP-1\beta, RANTES, IL-8 y GRO\alpha de R & D Systems (Londres, RU). Se obtuvo [^{125}]MIP-1\alpha (actividad específica, 2200 Ci/mmol) de Dupont NEN (Bruselas, Bélgica). Se notificó por el proveedor que las quimiocinas obtenidas de R & D Systems eran > 97% puras en SDS-PAGE (electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico-poliacrilamida) y biológicamente activas en un bioensayo específico para cada ligando. Las quimiocinas liofilizadas se disolvieron como una disolución 100 \mug/ml en una solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril y esta disolución madre se almacenó a -20ºC en alícuotas. Las quimiocinas se diluyeron hasta la concentración de trabajo inmediatamente antes de su uso. Todas las líneas celulares utilizadas en el presente estudio se obtuvieron de la ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, MD, EE.UU.).
Clonación y secuenciación
Se obtuvo el clon MOP020 de ratón mediante reacción en cadena de la polimerasa de baja rigurosidad, según se describió previamente [24, 34], utilizando ADN genómico como molde. Se rastreó una librería de ADN genómico humano (Stratagene, La Jolla, CA) construida en el vector DASH de lambda, con baja rigurosidad [39], con la sonda MOP020 (511 pb). Los clones positivos se purificaron hasta homogeneidad y se analizaron mediante transferencia de tipo Southern blotting. Se determinó el mapa de restricción del locus y se subclonó un fragmento XbaI pertinente de 4.400 pb en el vector pBlueScript SK+ (Stratagene). La secuenciación se realizó en ambas hebras tras la subclonación en derivados M13mp, utilizando cebadores fluorescentes y un secuenciador automático de ADN (Applied Biosystem 370 A). El manejo de la secuencia y análisis de los datos se llevó a cabo utilizando el software DNASIS/PROSIS (Hitachi) y el paquete de software GCG (Genetics Computer Group, Wisconsin).
Expresión en líneas celulares
Se amplificó la región codificante completa mediante PCR como un fragmento de 1056 pb, utilizando cebadores que incluyen, respectivamente, las secuencias de reconocimiento BamHI y XbaI y se clonaron tras restricción en los sitios correspondientes del vector pcDNA3 de expresión eucariota (Invitrogen, San Diego, CA). El constructo resultante se verificó mediante secuenciación y se transfectó en células CHO-K1, tal como se describe [35]. Dos días después de la transfección, se inició la selección de líneas celulares transfectadas de manera estable mediante la adición de G418 400 \mug/ml (Gibco) y se aislaron los clones resistentes en el día 10. Las células CHO-K1 se cultivaron utilizando medio F12 de Ham, tal como se describió previamente [35, 11]. La expresión del receptor CCR5 activo en los diversos clones celulares se evaluó midiendo el nivel específico de transcrito mediante Northern blot (inmunotransferencia), sobre el total de ARN preparado a partir de estas células (véase más adelante).
Ensayos de unión
Se hicieron crecer células CHO-K1 transfectadas de manera estable, que expresan el receptor CCR5, hasta confluencia y se separaron de las placas de cultivo mediante incubación en solución salina tamponada con fosfato (PBS) complementada con EDTA 1 mM. Se recogieron las células mediante centrifugación a baja velocidad y se contaron en una cámara de Neubauer. Los ensayos de unión se realizaron en tubos Minisorp (superficie de polietileno con baja afinidad por las proteínas) (Nunc) de polietileno, en un volumen final de 200 \mul de PBS que contiene un 0,2% de albúmina sérica bovina (BSA) y 10^{6} células, en presencia de [^{125}]-MIP-1\alpha. Se determinó la unión no específica mediante la adición de MIP-1\alpha no marcado 10 nM. La concentración del ligando marcado era de 0,4 nM (aproximadamente 100.000 cpm por tubo). La incubación se llevó a cabo durante 2 horas a 4ºC y se detuvo mediante la adición rápida de 4 ml de tampón enfriado en hielo y la inmediata recogida de las células mediante filtración a vacío a través de filtros de fibra de vidrio GF/B (Whatmann) empapados previamente con polietilenimina al 0,5% (Sigma). Los filtros se lavaron tres veces con 4 ml de tampón enfriado en hielo y se contaron en un contador gamma.
Actividad biológica
Las líneas celulares CHO-K1 transfectadas de manera estable con el constructo pcDNA3/CCR5 o las células CHO-K1 de tipo natural ("wild type", WT) (utilizadas como controles) se sembraron en placa sobre la membrana de cápsulas celulares Transwell (Molecular Devices), a una densidad de 2,5 10^{5} células/pocillo en medio F12 de Ham. Al día siguiente, las cápsulas se transfirieron a un microfisiómetro (Cytosensor, Molecular Devices) y se permitió que las células se equilibraran durante aproximadamente dos horas mediante la perfusión de medio RPMI-1640 tamponado con fosfato 1 mM (pH 7,4) que contenía un 0,2% de BSA. Las células se expusieron entonces a diversas quimiocinas diluidas en el mismo medio, con una duración de 2 minutos. Se midieron las tasas de acidificación a intervalos de un minuto.
Northern blotting
Se aisló el ARN total de las líneas celulares CHO-K1 transfectadas, a partir de un panel de líneas celulares humanas de origen hematopoyético y a partir de un panel de tejidos de perro, utilizando el kit RNeasy (Qiagen). Las muestras de ARN (10 \mug por carril) se desnaturalizaron en presencia de glioxal [26], se fraccionaron en gel de agarosa al 1% en un tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) y se transfirieron a membranas de nylon (Pall Biodyne A, Glen Cove, NY) según se describió [42]. Tras secado en estufa, los bloques se prehibridaron durante 4 h a 42ºC en una disolución que consistía en 50% de formamida, disolución Denhardt 5x (Denhardt 1x: 0,02% de Ficoll, 0,02% de polivinilpirrolidona, 0,02% de BSA), SSPE 5x (SSPE 1x: NaCl 0,18 M, fosfato de Na 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8,3), 0,3% de dodecilsufato sódico (SDS), 250 \mug por ml de ADN desnaturalizado procedente de testículos de arenque. Las sondas de ADN se marcaron con (\alpha^{32}P) mediante cebado aleatorio [14]. Las hibridaciones se llevaron a cabo durante 12 h a 42ºC en la misma disolución, que contenía un 10% (peso/volumen) de sulfato de dextrano y la sonda desnaturalizada con calor. Los filtros se lavaron con SSC 1x (SSC 1x: NaCl 150 mM, citrato de Na 15 mM, pH 7,0), 0,1% de SDS a 60ºC y se sometieron a autorradiografía a -70ºC, utilizando películas \beta-max de Amersham.
2. Resultados y discusión Clonación y análisis estructural
La homología de la secuencia que caracteriza a los genes que codifican para los receptores acoplados a la proteína G ha permitido la clonación, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de baja rigurosidad, de nuevos miembros de esta familia de genes [24, 34]. Uno de estos clones amplificado a partir de ADN genómico de ratón, denominado MOP020, presentaba fuertes similitudes con los receptores de quimiocinas caracterizados, compartiendo el 80% de identidad con el receptor de MCP-1 (CCR2) [8], el 65% de identidad con el receptor de MIP-1\alpha-RANTES (CCR1) [31] y el 51% de identidad con los receptores de IL-8 [20, 30]. El clon se utilizó como una sonda para rastrear una librería genómica humana. Se aislaron un total de 16 clones de fago lambda. Se dedujo a partir del patrón de restricción de cada clon y a partir de los datos de secuencia parcial que todos los clones pertenecían a una única secuencia contigua ("contig"), en la que se incluyeron dos secuencias codificantes diferentes. Una de las secuencias codificantes era idéntica al ADNc notificado que codifica para el receptor CCR2 [8, 44]. Se subclonó un fragmento XbaI de 4.400 pb de un clon representativo que contenía la segunda región de hibridación en pBluescript SK+. La secuenciación reveló un gen novedoso, provisionalmente denominado CCR5, que compartía el 84% de identidad con la sonda MOP020, lo que sugiere que MOP020 es el ortólogo de ratón de CCR5. MOP020 no corresponde a ninguno de los tres genes del receptor de quimiocinas de ratón clonados recientemente [16], lo que demuestra la existencia de un cuarto receptor de quimiocinas murino.
La secuencia de CCR5 reveló un único marco de lectura abierto de 352 codones que codifican para una proteína de 40.600 Da. La secuencia que rodea el codón de iniciación propuesto está de acuerdo con el consenso según describió Kozak [22], puesto que el nucleótido -3 es una purina. El perfil de hidropatía de la secuencia de aminoácidos deducida concuerda con la existencia de 7 segmentos transmembrana. La alineación de la secuencia de aminoácidos de CCR5 con la de otros receptores de quimiocinas CC humanos, caracterizados funcionalmente, se representa en la figura 2. Se encontró la mayor similitud con el receptor CCR2 [8] que comparte un 75,8% de residuos idénticos. Existe también un 56,3% de identidad con el receptor CCR1 [31], un 58,4% con el CCR3 [10] y un 49,1% con el CCR4 [37]. Por tanto, CCR5 representa un nuevo miembro del grupo de receptores de quimiocinas CC [30]. Como los receptores relacionados CCR1 y de IL-8 [20, 29, 31, 16], la región codificante de CCR5 aparece sin intrones. A partir de los datos de secuenciación parcial, el gen CCR2 también carece de intrón en los primeros dos tercios de su secuencia codificante.
Las similitudes de secuencia dentro de la familia de receptores de quimiocinas son mayores en los dominios que abarcan la transmembrana y en bucles intracelulares. Como ejemplo, la puntuación de identidad entre CCR5 y CCR2 va hasta el 92% cuando se consideran sólo los segmentos transmembrana. Se encuentran similitudes menores en el dominio extracelular N-terminal y en los bucles extracelulares. El dominio N-terminal de los receptores de IL-8 y CCR2 ha demostrado ser esencial para la interacción con el ligando [19, 18]. La variabilidad de esta región entre los receptores de quimiocinas CC se supone que contribuye a la especificidad hacia los diversos ligandos de la familia.
Se identificó un único sitio potencial para la glicosilación de unión a N en el tercer bucle extracelular de CCR5 (figura 1). No se encontró ningún sitio de glicosilación en el dominio N-terminal del receptor, en el que se glicosilan la mayoría de los receptores acoplados a la proteína G. Los otros receptores de quimiocinas CCR1 y CCR2 presentan tal sitio de glicosilación de unión a N en su dominio N-terminal [31, 8]. Por el contrario, el receptor CCR3 [10] no muestra sitios de glicosilación ni en el extremo N-terminal ni en bucles extracelulares. El receptor CCR5 activo tiene cuatro cisteínas en sus segmentos extracelulares y las cuatro se conservan en los demás receptores de quimiocinas CC y CXC (figura 2). Las cisteínas situadas en el primer y segundo bucles extracelulares están presentes en la mayoría de los receptores acoplados a la proteína G y se cree que forman un puente disulfuro que estabiliza la estructura del receptor [41]. Las otras dos cisteínas, en el segmento N-terminal y en el tercer bucle extracelular podrían formar de manera similar un puente estabilizador específico de la familia de receptores de quimiocinas. Los dominios intracelulares de CCR5 no incluyen sitios potenciales para la fosforilación por la proteína cinasa C (PKC) o proteína cinasa A. Los sitios de PKC implicados en la desensibilización heteróloga son frecuentes en el tercer bucle intracelular y el extremo C-terminal de los receptores acoplados a la proteína G. CCR1 también carece de sitios de PKC. Por el contrario, todos los receptores de quimiocinas CC son ricos en residuos de serina y treonina en el dominio C-terminal. Estos residuos representan sitios de fosforilación potenciales por la familia de cinasas de receptor acoplado a proteína G, y probablemente están implicados en la desensibilización homóloga [41]. Cinco de estos residuos S/T se alinean perfectamente en los cinco receptores (figura 2).
Ligamiento físico de los genes CCR5 y CCR2
Tal como se estableció anteriormente, los 16 clones aislados con la sonda MOP020 correspondían a una única secuencia contigua que contenía los genes CCR5 y CCR2. La organización de esta secuencia contigua se investigó con el fin de caracterizar el ligamiento físico de los dos genes de los receptores en el genoma humano. Una combinación del mapa de restricción, transferencia Southern, subclonación de fragmentos y secuenciación parcial permitió determinar los límites y solapamientos respectivos de todos los clones. De los 16 clones, 9 resultaron estar caracterizados por un mapa de restricción específico y su organización se representa en la figura 3. Cuatro de estos clones (nº 11, 18, 21, 22) contenían el gen CCR2 solo, cuatro clones (nº 7, 13, 15, 16) contenían el gen ChemR13 solo y un clon (nº 9) contiene parte de ambas secuencias codificantes. Los genes CCR2 y CCR5 se organizan en tándem, estando situado CCR5 hacia 3' ("downstream") desde CCR2. La distancia que separa los marcos de lectura abiertos de CCR2 y CCR5 es de 17,5 kb. La localización cromosómica del tándem es desconocida actualmente. Sin embargo, se han localizado otros receptores de quimiocinas en el genoma humano: el gen CCR1 se localizó mediante hibridación in situ con fluorescencia a la región p21 del cromosoma 3 humano [16]. Se ha demostrado que los dos genes de receptores de IL-8 y su pseudogen se agrupan en la región 2q34-q35 humana [1].
Expresión funcional y farmacología del receptor CCR5 activo
Se establecieron líneas celulares CHO-K1 estables que expresan el receptor CCR5 activo y se rastrearon basándose en el nivel de transcritos de CCR5 determinados mediante Northern blotting. Se seleccionaron tres clones y se probaron para determinar las respuestas biológicas en un microfisiómetro, utilizando diversas quimiocinas CC y CXC como agonistas potenciales. Se utilizaron células CHO-K1 de tipo natural como control para garantizar que las respuestas observadas eran específicas del receptor transfectado, y que no eran el resultado de la activación de receptores endógenos. El microfisiómetro permite la detección en tiempo real de la activación del receptor, midiendo las modificaciones del metabolismo celular que resultan de la estimulación de cascadas intracelulares [33]. Varios estudios han demostrado el potencial del microfisiómetro en el campo de los receptores de quimiocinas. Se monitorizaron las modificaciones de la actividad metabólica en monocitos humanos, en respuesta a quimiocinas CC, utilizando este sistema [43]. De manera similar, se han medido los cambios en la tasa de acidificación de células THP-1 (una línea celular monocítica humana) en respuesta a MCP-1 y MCP-3 [36]. La estimación de CE_{50} para ambas proteínas, utilizando este procedimiento, estuvo de acuerdo con los valores obtenidos monitorizando el calcio intracelular en otros estudios [8, 15].
Los ligandos que pertenecen a las clases de quimiocinas CC y CXC se probaron en las células CHO-K1 transfectadas con CCR5. Mientras que se encontró que MIP-1\alpha, MIP-1\beta y RANTES eran potentes activadores del nuevo receptor (figura 4), las quimiocinas CC, MCP-1, MCP-2 y MCP-3, y las quimiocinas CXC, GRO\alpha e IL-8, no tuvieron efecto sobre la actividad metabólica, ni siquiera en las mayores concentraciones probadas (30 nM). La actividad metabólica de una de las quimiocinas que no induce respuesta sobre CCR5 (IL-8) podría demostrarse en una línea celular CHO-K1 transfectada con el receptor de interleucina IL-8A (Mollereau et al., 1993): IL-8 produjo un aumento del 160% en la actividad metabólica, tal como se determinó utilizando el microfisiómetro. La actividad biológica de las preparaciones de MCP-2 y MCP-3 proporcionadas por J. Van Damme se ha documentado ampliamente [2, 40]. Se probaron MIP-1\alpha, MIP-1\beta y RANTES en las células CHO-K1 de tipo natural, con una concentración de 30 nM, y ninguna de ellas indujo una respuesta metabólica. En la línea celular CHO-K1 transfectada con CCR5, los tres ligandos activos (MIP-1\alpha, MIP-1\beta y RANTES) produjeron un rápido aumento en la tasa de acidificación, que alcanzó un máximo en el segundo o tercer minuto tras la perfusión del ligando. La tasa de acidificación volvió al nivel basal en un plazo de diez minutos. El momento de la respuesta celular es similar al de la observada para las quimiocinas en sus receptores naturales en monocitos humanos [43]. Cuando se aplicaron agonistas repetidamente a las mismas células, la respuesta se redujo considerablemente comparado con la primera estimulación, lo que sugiere la desensibilización del receptor. Por tanto, todas las medidas se obtuvieron en la primera estimulación de cada cápsula.
La relación concentración-efecto se evaluó para los tres ligandos activos en el intervalo de 0,3 a 30 nM (figuras 3B y C). El orden de rango de potencia fue MIP-1\alpha > MIP-1\beta = RANTES. A concentraciones de 30 nM, el efecto de MIP-1\alpha pareció saturarse (al 155% del nivel inicial), mientras que MIP-1\beta y RANTES estaban todavía en la fase ascendente. Sin embargo, no pudieron utilizarse concentraciones superiores de quimiocinas. Se estimó que la CE50 era de aproximadamente 3 nM para MIP-1\alpha. Las concentraciones necesarias para obtener una respuesta biológica, determinadas utilizando el microfisiómetro, están en el mismo intervalo que las medidas mediante la movilización de calcio intracelular para los receptores CCR1 [31], los CCR2 y B [8] y el CCR3 [10]. La especificidad por el ligando de CCR5 es similar a la notificada para CCR3 [10]. CCR3 se definió como el primer receptor clonado que respondía a MIP-1\beta. Sin embargo, MIP-1\beta a 10 nM provoca un efecto significativo sobre CCR5, mientras que la misma concentración no tiene efecto sobre las células transfectadas con CCR3 [10]. Estos datos sugieren que CCR5 podría ser un receptor fisiológico para MIP-1\beta.
Los experimentos de unión que utilizan [^{125}]-MIP-1\alpha humana como ligando no permitieron demostrar la unión específica a células CHO-K1 que expresan CCR53, utilizando como mucho radioligando 0,4 nM y 1 millón de células transfectadas por tubo. El fracaso en la obtención de datos de unión podría atribuirse a una afinidad relativamente baja del receptor por MIP-1\alpha.
Análisis de Northern blotting
El Northern blotting realizado en un panel de tejidos de perro no permitió detectar los transcritos para CCR5. Dado el papel de la familia de receptores de quimiocinas en la mediación de la quimioatracción y la activación de diversas clases de células implicada en las respuestas inflamatorias e inmunes, la sonda también se utilizó para detectar transcritos específicos en un panel de líneas celulares humanas de origen hematopoyético (figura 5). El panel incluía líneas celulares linfoblásticas (Raji) y de linfoblastos T (Jurkat), líneas celulares promieloblásticas (KG-1A) y promielocíticas (HL-60), una línea celular monocítica (THP-1) y una línea celular eritroleucémica (HEL 92.1.7), una línea celular megacarioblástica (MEG-01) y una línea celular de leucemia mielógena (K-562). También se probaron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC), incluyendo monocitos y linfocitos maduros. Los transcritos de CCR5 (4,4 kb) sólo pudieron detectarse en la línea celular promieloblástica KG-1A, pero no se encontraron en la línea celular promielocítica HL-60, en PBMC, ni en ninguna de las demás líneas celulares probadas. Estos resultados sugieren que el receptor CCR5 activo podría expresarse en precursores del linaje granulocítico. Se ha notificado que las quimiocinas CC estimulan los granulocitos maduros [27, 38, 23, 2]. Sin embargo, datos recientes han demostrado también un papel de las quimiocinas CC y CXC en la regulación de la proliferación de células progenitoras mieloides de ratón y ser humano [6, 7].
Se demostró que CCR5 responde a MIP-1\alpha, MIP-1\beta y RANTES, las tres quimiocinas identificadas como los factores supresores del VIH principales producidos por las células T CD8^{+} [9] y liberadas en cantidades superiores por los linfocitos T CD4^{+} de individuos no infectados pero expuestos múltiples veces [51]. CCR5 representa un correceptor principal para las cepas y aislados primarios de VIH-1 macrofagotrópico (M-trópico) [45, 50]. Las cepas M-trópicas predominan durante la fase asintomática de la enfermedad en los individuos infectados y se consideran responsables de la transmisión del VIH-1. Las cepas adaptadas para el crecimiento en líneas de células T transformadas (cepas T-trópicas) usan como correceptor LESTR (o fusina) [50], un receptor huérfano que también pertenece a la familia de receptores de quimiocinas, pero todavía no caracterizado funcionalmente [21, 52, 53]. Los virus dual-trópicos, que pueden representar formas transicionales del virus en las fases tardías de la infección [54] han demostrado que usan tanto CCR5 como LESTR como correceptores, así como los receptores CCR2b y CCR3 de quimiocinas CC [47]. El amplio espectro de uso de correceptores de los virus dual-trópicos sugiere que dentro de individuos infectados, el virus puede evolucionar al menos en parte a partir de la selección de una variedad de correceptores expresados en diferentes tipos celulares.
Identificación de un receptor \DeltaCCR5 inactivo
Se sabe que algunos individuos permanecen sin infectarse a pesar de la exposición repetida al VIH-1 [55, 56, 51]. Una proporción de estos individuos expuestos y no infectados resulta del riesgo relativamente bajo de contaminación tras un único contacto con el virus, pero se ha postulado que no existen individuos verdaderamente resistentes. De hecho, los linfocitos CD4^{+} aislados de individuos expuestos y no infectados son sumamente resistentes a la infección por cepas primarias de VIH M-trópico, pero no a T-trópico. Además, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de diferentes donantes no se infectan de la misma manera con diversas cepas de VIH-1 [57-59]. Dado el papel clave desempeñado por CCR5 en el acontecimiento de fusión que media la infección por virus M-trópicos, se postula que variantes de CCR5 podrían ser responsables de la resistencia relativa o absoluta frente a la infección por VIH-1 mostrada por algunos individuos y, posiblemente, de la variabilidad de progresión de la enfermedad en pacientes infectados [66]. Los inventores seleccionaron tres pacientes infectados por VIH-1 que se sabía que eran progresores lentos y cuatro individuos seronegativos como controles; se amplificó la región codificante completa de su gen CCR5 mediante PCR y se secuenció. De manera inesperada, uno de los progresores lentos, pero también dos de los controles no infectados, mostraron heterocigosidad en el locus CCR5 para un polimorfismo bialélico. El alelo frecuente correspondió a la secuencia de CCR5 publicada, mientras que el minoritario mostró una deleción de 32 pb dentro de la secuencia codificante, en una región correspondiente al segundo bucle extracelular del receptor (figura 6). La figura 6 es la estructura de la forma mutante del receptor 5 de quimiocinas CC humano. a, Se representa la secuencia de aminoácidos de la proteína \Deltaccr5 no funcional. Se facilita la organización transmembrana por analogía con la estructura transmembrana pronosticada de CCR5 de tipo natural. Los aminoácidos representados en negro corresponden a los residuos no naturales que resultan del desplazamiento del marco producido por la deleción. La proteína mutante carece de los tres últimos segmentos transmembrana de CCR5, así como de las regiones implicadas en el acoplamiento con la proteína G. b, Se representa en cursiva la secuencia de nucleótidos del gen CCR5 que rodea la región con deleción y la traducción para dar el receptor normal (parte superior) o el mutante truncado (ccr5, parte inferior). La repetición directa de 10 pb se representa en cursiva. La región codificante de tamaño completo del gen CCR5 se amplificó mediante PCR, utilizando 5'-TCGAGGATCCAAGATGGATTATCAAGT-3' y 5'-CTGATCTAGAGCCATGTGCACAACTCT-3' como cebadores directo e inverso, respectivamente. Los productos de PCR se secuenciaron en ambas hebras utilizando los mismos oligonucleótidos como cebadores, así como cebadores internos, y didesoxinucleótidos marcados con un fluorocromo como terminadores. Los productos de secuenciación se aplicaron a un secuenciador de Applied Biosystem y se buscaron posiciones ambiguas a lo largo de la secuencia codificante. Cuando se sospechaba de la presencia de una deleción de la secuenciación directa, se clonaron los productos de PCR tras restricción con las endonucleasas BamHI y XbaI en pcDNA3. Se secuenciaron varios clones par confirmar la deleción. La deleción fue idéntica en tres individuos no relacionados entre sí investigados mediante secuenciación.
La clonación del producto de PCR y la secuenciación de varios clones confirmó la deleción. La deleción produce un desplazamiento del marco, que se espera que dé como resultado una terminación prematura de la traducción. La proteína codificada por este alelo mutante (\Deltaccr5) carece, por tanto, de los tres últimos segmentos transmembrana del receptor. Se espera que una repetición directa de 10 pb que flanquea la región con deleción (figura 6b) en ambos lados, haya promovido el acontecimiento de recombinación que conduce a la deleción. Numerosos estudios de mutagénesis realizados con diversas clases de receptores acoplados a la proteína G, incluyendo receptores de quimiocinas, dejan claro que tal proteína truncada es desde luego no funcional en cuanto a la transducción de la señal inducida por quimiocinas: carece del tercer bucle intracelular y los dominios citoplásmicos del extremo C-teminal, las dos regiones implicadas principalmente en el acoplamiento a proteína G [41]. Con el fin de probar si la proteína truncada podía funcionar como un correceptor de VIH-1, los inventores probaron su capacidad para soportar la fusión de membrana por proteínas ENV de virus tanto primarios M-trópicos como dual-trópicos. La proteína recombinante se expresó en células QT6 de codorniz junto con CD4 humanas. Las células QT6 se mezclaron entonces con células HeLa, que expresan la proteína ENV vírica indicada y se midió el grado de fusión célula-célula utilizando un ensayo de gen-indicador sensible y cuantitativo. Al contrario que CCR5 de tipo natural, el receptor truncado no permitió la fusión con las células que expresan la proteína ENV de los virus M-trópicos o dual-trópicos (figura 7). La figura 7 representa la cuantificación de la fusión mediada por la proteína ENV mediante el ensayo de luciferasa. Para cuantificar los acontecimientos de fusión célula-célula, se transfectaron o se contransfectaron células de fibrosarcoma QT6 de codorniz japonesa, tal como se indicó con el vector pcDNA3 (Invitrogen) que contenía la secuencia codificante para CCR5 de tipo natural, el mutante ccr5 truncado, los receptores CCR2 o de quimiocinas Duffy, o con el vector pCDNA3 solo. Las células diana también se transfectaron con CD4 humanas expresadas desde el promotor CMV y el gen de la luciferasa bajo el control del promotor T7. Las células efectoras HeLa se infectaron (MOI (multiplicidad de infección) = 10) con vectores del virus de la viruela que expresan T7-polimerasa (vTF1.1) y, o bien proteínas de la envoltura JR-FL (vCB28) o bien 89.6 (vBD3). La actividad luciferasa que resulta de la fusión celular se expresa como el porcentaje de la actividad (en unidades luminosas relativas) obtenida para CCR5 de tipo natural. Todas las transfecciones se realizaron con una cantidad idéntica de ADN del plásmido, utilizando pcDNA3 como portador, cuando sea necesario. Para iniciar la fusión, se mezclaron las células diana y efectoras en placas de 24 pocillos a 37ºC, en presencia de ara-C (arabinósido de citosina) y rifampicina y se permitió que se fusionaran durante 8 horas. Las células se lisaron en 150 \mul de tampón de lisis indicador (Promega) y se sometieron a ensayo para determinar la actividad luciferasa según las instrucciones del fabricante (Promega).
La coexpresión de \Deltaccr5 con CCR5 de tipo natural redujo sistemáticamente la eficacia de fusión para ambas envolturas JR-FL y 89.6, comparado con CCR5 solo. No se sabe actualmente si este efecto inhibidor in vitro (no compartido por el receptor Duffy de quimiocinas, utilizado como control) también se produce in vivo. La coexpresión con el receptor CCR2b [31], que es el receptor de quimiocinas CC más estrechamente relacionado con CCR5 pero que no promueve la fusión por cepas de virus VIH-1 M-trópico [48], no salvó la mutación mediante la formación de una molécula híbrida (figura 7).
La figura 8 representa la obtención del genotipo de los individuos mediante PCR y la segregación de alelos CCR5 en familias del CEPH. a, Autorradiografía que ilustra el patrón resultante de la amplificación por PCR y la escisión con EcoRI para los individuos homocigóticos para el alelo CCR5 de tipo natural (CCR5/CCR5), el alelo \Deltaccr5 nulo (\Deltaccr5/\Deltaccr5) y para los heterocigotos (CCR5/\Deltaccr5). Un producto de PCR de 735 pb se escinde en una banda común de 332 pb para ambos alelos y en bandas de 403 y 371 pb para los alelos de tipo natural y mutante, respectivamente. b, Segregación de los alelos CCR5 en dos familias informativas del CEPH. Los símbolos mitad negros y mitad blancos representan heterocigotos y homocigotos de tipo natural, respectivamente. Para unos cuantos individuos de los historiales, no había ADN disponible (ND: no determinado). Se realizaron las PCR con muestras de ADN genómico, utilizando 5'-CCTGGCTGTCGTCCATGCTG-3' y 5'-CTGATCTAGAGCCATGTGCACAACTCT-3' como cebadores directo e inverso, respectivamente. Las mezclas de reacción consistieron en 30 \mul de tampón Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, que contenía KCl 50 mM, MgCl_{2} 0,75 mM, dCTP, dGTP y dTTP 0,2 mM, dATP 0,1 mM, 0,5 \mui de 
\hbox{[ \alpha - ^{32} }
P]-dATP, 0,01% de gelatina, 5% de DMSO, 200 ng de ADN diana, 60 ng de cada uno de los cebadores y 1,5 U de Taq polimerasa. Las condiciones de PCR fueron: 93ºC durante 2 min 30; 93ºC durante 1 min; 60ºC durante 1 min, 72ºC durante 1 min, 30 ciclos; 72ºC durante 6 min. Tras la reacción de PCR, las muestras se incubaron durante 60 min a 37ºC con 10 U de EcoRI y se aplicaron 2 \mul de la mezcla de reacción desnaturalizada sobre un gel desnaturalizante de poliacrilamida al 5% que contenía un 35% de formamida y urea 5,6 M. se detectaron bandas mediante autorradiografía.
Basándose en los 14 cromosomas probados en el primer experimento, el alelo \Deltaccr5 con deleción pareció ser bastante frecuente en la población blanca. La frecuencia exacta se estimó adicionalmente probando (figura 8) una gran cohorte de individuos blancos, incluyendo miembros no relacionados entre sí de las familias del CEPH (Centre d'Etudes des Polymorphismes Humains), parte del personal del IRIBHN (Instituto de Investigación Multidisciplinar en Biología Humana Y Molecular, de Bruselas) y un banco de muestras de ADN anónimas procedentes de individuos sanos recogidas por el Departamento de Genética del Hospital Erasme de Bruselas. A partir de un total de más de 700 individuos sanos, se encontró que las frecuencias alélicas eran de 0,908 para el alelo de tipo natural y 0,092 para el alelo mutante (tabla I). Las frecuencias genotípicas observadas en la población no eran diferentes significativamente a la distribución de Hardy-Weinberg esperada (CCR5/CCR5: 0,827 frente a 0,824; CCR5/\Deltaccr5: 0,162 frente a 0,167; \Deltaccr5/\Deltaccr5: 0,011 frente a 0,008, p > 0,999), lo que sugiere que el alelo nulo no tuvo un efecto drástico sobre el estado físico. Utilizando dos familias informativas del CEPH, se confirmó que el gen CCR5 de tipo natural y su variante \Deltaccr5 eran alélicos y se segregaban de una forma mendeliana normal (figura 8b). De manera interesante, una cohorte de 124 muestras de ADN procedentes de África central (recogidas en Zaire, Burkina Faso, Camerún, Senegal y Benin) y Japón no reveló un solo alelo mutante \Deltaccr5, lo que sugiere que este alelo está ausente o es muy raro en las poblaciones negra africana y asiática (tabla I).
Las consecuencias de la existencia de un alelo nulo de CCR5 en la población blanca normal se consideraron entonces en cuanto a la susceptibilidad a la infección por VIH-1. si, tal como se pronostica, CCR5 desempeña un papel principal (no redundante) en la entrada de la mayoría de las cepas primarias de virus al interior de las células, entonces los individuos \Deltaccr5/\Deltaccr5 deben ser particularmente resistentes a la exposición con VIH-1, tanto in vitro como in vivo. La frecuencia del genotipo \Deltaccr5/\Deltaccr5 debe ser, por tanto, significativamente inferior en los pacientes infectados por VIH-1 y aumentar en los individuos expuestos y no infectados. También, si los heterocigotos tienen una ventaja estadística debido al menor número de receptores funcionales en glóbulos blancos, o a las posibles propiedades negativas dominantes del alelo mutante, la frecuencia de heterocigotos (y alelos mutantes) debe disminuir en las poblaciones infectadas por VIH. Se probaron estas hipótesis obteniendo el genotipo de un gran número de individuos blancos seropositivos (n = 645) que pertenecían a cohortes procedentes de diversos hospitales de Bruselas, Lieja y París (tabla I). De hecho, se encontró que dentro de esta gran serie, la frecuencia del alelo nulo \Deltaccr5 se redujo significativamente desde 0,092 hasta 0,053 (p < 10^{-5}). La frecuencia de heterocigotos también se redujo desde 0,162 hasta 0,106 (p < 0,001) y no pudo encontrarse un solo individuo \Deltaccr5/\Deltaccr5 (p < 0,01).
En total, los datos estadísticos y funcionales sugieren que CCR5 es efectivamente el principal correceptor responsable de la infección natural por cepas de VIH-1 M-trópico. Los individuos homocigóticos para el alelo \Deltaccr5 nulo (aproximadamente el 1% de la población blanca) tienen aparentemente una fuerte resistencia a la infección. No está claro en ese punto si la resistencia al VIH-1 es absoluta o relativa y si la resistencia variará dependiendo del modo de contaminación vírica. Habrán de probarse cohortes más grandes de individuos seropositivos con el fin de clarificar este punto. Los heterocigotos tienen una ventaja más leve aunque significativa: suponiendo una igual probabilidad de contacto con VIH, puede deducirse de la tabla I que los heterocigotos tienen una reducción del 39% en su posibilidad de ser seropositivos, comparado con los individuos homocigóticos para el alelo CCR5 de tipo natural. Tanto una disminución en el número de receptores CCR5 funcionales como un efecto negativo dominante de \Deltaccr5 in vivo, comparable al que se observa en los experimentos in vitro (figura 7) son posibles explicaciones de esta protección relativa. El alelo mutante, que puede considerarse como una deficiencia natural en el ser humano, no va acompañado por un fenotipo obvio en los individuos homocigóticos. Sin embargo, la falta de fenotipo manifiesto, tomado junto con la protección relativa que caracteriza a los sujetos heterocigóticos, sugiere que los agentes farmacológicos que bloquean selectivamente la capacidad del VIH-1 para utilizar CCR5 como un cofactor, serían eficaces en la prevención de la infección por VIH-1 y se pronosticaría que no estarán asociados con efectos secundarios importantes resultantes de la inactivación de CCR5. Estos agentes farmacéuticos podrían utilizarse, con otros compuestos que pueden bloquear otros receptores de quimiocinas utilizados como correceptores, por algunos aislados primarios de VIH con el fin de infectar otras células [47]. La prevalencia del alelo nulo en la población blanca plantea la pregunta de si la pandemia de VIH (o virus relacionados que utilizan el mismo correceptor) ha contribuido durante la evolución de la humanidad a estabilizarse mediante la selección del alelo ccr5 mutante a una frecuencia tan elevada.
Producción de anticuerpos anti-CCR5
Los anticuerpos se produjeron mediante inmunización genética. Se utilizaron ratones balb/c hembra de seis semanas. Se insertó el ADN que codifica para el receptor CCR5 humano en el vector de expresión pcDNA3 bajo el control del promotor CMV y se inyectaron 100 \mug de ADN en el músculo tibial anterior, cinco días después del pretratamiento de este músculo con cardiotoxina (del veneno de Naja Nigriculis). Las inyecciones se repitieron dos veces a intervalos de tres semanas. Quince días después de la última inyección, se extrajo sangre de cada animal y se probaron los sueros para determinar la presencia de anticuerpos anti-CCR5.
Prueba de los sueros utilizando citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS)
Los sueros se probaron mediante citometría de flujo activada por fluorescencia, utilizando células CHO recombinantes que expresan el receptor CCR5. En resumen, se separaron las células utilizando una disolución de PBS-EDTA-EGTA y se incubaron en medio PBS-BSA durante 30 minutos a temperatura ambiente con 5 \mul de suero, sobre la base de 100.000 células por tubo. Entonces, las células se lavaron y se incubaron durante 30 minutos en hielo junto con anticuerpo anti-ratón marcado con fluoresceína. Las células se lavaron, se llevaron a 200 \mul de una disolución de PBS-BSA y se analizó la fluorescencia mediante FACS (FACSCAN, Becton-Dickinson). Se contaron 10.000 células. Se utilizaron células CHO de tipo natural o CHO recombinantes que expresan el receptor CCR2 humano como controles.
Cuando se probaron mediante análisis por FACS 2 semanas después de la última inyección (figura 9), todos los sueros procedentes de ratones inmunizados con ADNc para CCR5, reconocieron claramente el receptor nativo expresado en las células CHO (media de fluorescencia = 200), sin una reacción cruzada significativa con las células control que expresan CCR2b (media de fluorescencia = 20).
Los sueros se probaron en una línea celular CHO que expresa un nivel elevado de receptor CCR5 (histograma negro) o una línea celular CHO que expresa el receptor CCR2b (histograma blanco) como control negativo. Cada suero se probó individualmente.
Anticuerpos anti-CCR5 e infectividad por VIH
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un donante homocigótico del gen CCR5 de tipo natural y se cultivaron 3 días en presencia de PHA (fitohemaglutinina).
En el día 4, se incubaron 800 \mul de células (10^{5} células/ml) con 8 \mul de sueros procedentes de ratones inmunizados con ADNc para CCR5, 30 minutos a 37ºC. Luego, se añadió 1 ml de disolución vírica (cepa de VIH JRCSF) y se incubó durante 2 horas. Después, se lavaron las células dos veces y se cultivaron durante 15 días.
Se toma una alícuota del medio en los días 0, 4, 7, 10 y 14 y se realiza la determinación de la dosis del antígeno p24.
14 días después del comienzo del experimento, un suero (suero B0) bloquea totalmente la producción de p24, lo que indica su capacidad para bloquear la infección de los linfocitos por esta cepa de VIH (figura 10). Otros sueros también muestran un efecto parcial o total sobre esta infección (suero A2 y B1). Todos los demás sueros no mostraron ningún efecto sobre esta infección.
Producción de anticuerpos monoclonales
Se seleccionaron los ratones con el mayor título de anticuerpos CCR5 para la producción de anticuerpos monoclonales y se inyectaron por vía intravenosa con 10^{7} células CHO-K1 recombinantes, que expresan receptores CCR5 humanos. Tres días después, se sacrificaron los animales y se realizó la fusión de células esplénicas o células de los ganglios linfáticos próximas al sitio de la inyección con células de mieloma SP2/0. El protocolo de fusión utilizado fue el de Galfre et al. (Nature 266, 550 (1977)). Se utiliza un medio selectivo HAT (hipoxantina / aminopterina / timidina) para seleccionar hibridomas y sus sobrenadantes se probaron mediante FACS utilizando células CHO recombinantes, que expresan el receptor CCR5 humano, tal como se hizo para los sueros. Entonces, se clonaron los hibridomas positivos mediante dilución limitada. Los clones que se muestran positivos mediante FACS se expandieron después y produjeron en ascitis en ratones balb/c.
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Claims (41)

1. Método para determinar si un anti-ligando puede inhibir la unión de un ligando, siendo dicho ligando un virus VIH o una parte del mismo, a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que presenta más del 80% de homología con la SEQ ID Nº 2, mostrada en la figura 1, comprendiendo dicho método las etapas de poner en contacto una célula transfectada con un vector que expresa la molécula de ácido nucleico que codifica para dicho péptido, con el anti-ligando en condiciones que permitan una unión del anti-ligando a dicho péptido y determinar si dicho anti-ligando inhibe la unión de dicho ligando a dicho péptido.
2. Método para determinar si un anti-ligando puede inhibir la unión de un ligando, siendo dicho ligando un virus VIH o una parte del mismo, a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que presenta más del 80% de homología con la SEQ ID Nº 2 mostrada en la figura 1, comprendiendo dicho método las etapas de:
-
preparar un extracto celular a partir de células transfectadas con un vector que expresa la molécula de ácido nucleico que codifica para dicho péptido,
-
aislar una fracción de membrana del extracto celular,
-
poner en contacto el anti-ligando con la fracción de membrana en condiciones que permitan la unión del anti-ligando a dicho péptido, y
-
determinar si dicho anti-ligando inhibe la unión de dicho ligando a dicho péptido.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el método comprende las etapas de:
- preparar una célula o extracto celular, estando dicha célula transfectada con la molécula de ácido nucleico que codifica para un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que presenta más del 80% de homología con la SEQ ID Nº 2 mostrada en la figura 1,
- posiblemente aislar una fracción de membrana del extracto celular,
- poner en contacto la célula o fracción de membrana con dicho anti-ligando, en presencia de dicho ligando de dicho péptido, en condiciones que permitan la activación de una respuesta peptídica funcional, y
- detectar por medio de un bioensayo una modificación en la actividad del péptido, determinando así si dicho anti-ligando inhibe la unión de dicho ligando a dicho péptido.
4. Método de selección de fármacos para identificar fármacos que se unan específicamente al péptido que comprende la secuencia de aminoácidos que presenta más del 80% de homología con la SEQ ID Nº 2 mostrada en la figura 1, o una parte de la misma, y puedan utilizarse en el tratamiento y/o prevención de la infección por el virus VIH, comprendiendo dicho método poner en contacto una célula transfectada con un vector que expresa la molécula de ácido nucleico que codifica para dicho péptido, con un fármaco en condiciones que permitan la unión de dicho fármaco a dicho péptido y determinar si dicho fármaco se une específicamente a la célula transfectada, identificando así un fármaco que se une específicamente a dicho péptido y que puede utilizarse en el tratamiento y/o prevención de la infección por el virus VIH.
5. Método de selección de fármacos para identificar fármacos que se unan específicamente al péptido que comprende la secuencia de aminoácidos que presenta más del 80% de homología con la SEQ ID Nº 2 mostrada en la figura 1, o una parte de la misma, y puedan utilizarse en el tratamiento y/o prevención de la infección por el virus VIH, comprendiendo dicho método preparar un extracto celular a partir de células transfectadas con un vector que expresa la molécula de ácido nucleico que codifica para dicho péptido, aislar una fracción de membrana del extracto celular, poner en contacto la fracción de membrana con un fármaco en condiciones que permitan la unión de dicho fármaco a dicho péptido y determinar si dicho fármaco se une específicamente a la célula transfectada, identificando así un fármaco que se une específicamente a dicho péptido y que puede utilizarse en el tratamiento y/o prevención de la infección por el virus VIH.
6. Método para determinar si un agonista o antagonista que se une a un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos que presenta más del 80% de homología con la SEQ ID Nº 2 mostrada en la figura 1, o una parte de la misma, puede utilizarse en el tratamiento y/o prevención de una infección por el virus VIH, comprendiendo dicho método poner en contacto una célula transfectada con un vector que expresa la molécula de ácido nucleico que codifica para dicho péptido, con el agonista o antagonista en condiciones que permitan la unión del agonista o antagonista a dicho péptido y determinar si dicho agonista o antagonista inhibe la unión del virus VIH a dicho péptido.
7. Método para determinar si un agonista o antagonista que se une a un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos que presenta más del 80% de homología con la SEQ ID Nº 2 mostrada en la figura 1, o una parte de la misma, puede utilizarse en el tratamiento y/o prevención de una infección por el virus VIH, comprendiendo dicho método preparar un extracto celular a partir de células transfectadas con un vector que expresa la molécula de ácido nucleico que codifica para dicho péptido, aislar una fracción de membrana del extracto celular, poner en contacto la fracción de membrana con el agonista o antagonista en condiciones que permitan la unión del agonista o antagonista a dicho péptido y determinar si dicho agonista o antagonista inhibe la unión del virus VIH a dicho péptido.
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho virus VIH se selecciona del grupo que consiste en el virus 1 de inmunodeficiencia humana (VIH-1), el virus 2 de inmunodeficiencia humana (VIH-2) o una parte de dichos virus VIH.
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la parte de dicho virus VIH es la glucoproteína GP120/GP160 o una parte de la misma.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende además la etapa de medir la infectividad de la célula por una cepa de VIH, en el que dicho anti-ligando, fármaco, agonista o antagonista disminuye la infectividad por dicha cepa de VIH.
11. Método según la reivindicación 10, en el que la célula es una célula linfocítica.
12. Método según la reivindicación 10 u 11, en el que la cepa de VIH es el virus 1 de inmunodeficiencia humana (VIH-1).
13. Método según la reivindicación 10 u 11, en el que la cepa de VIH es el virus 2 de inmunodeficiencia humana (VIH-2).
14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que la disminución de la infectividad por VIH se mide mediante la dosis de una proteína de VIH.
15. Método según la reivindicación 14, en el que dicha proteína de VIH es el antígeno P24 de VIH.
16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la secuencia de aminoácidos del péptido presenta más del 90% de homología con la SEQ ID Nº 2 mostrada en la figura 1.
17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la secuencia de aminoácidos del péptido presenta más del 95% de homología con la SEQ ID Nº 2 mostrada en la figura 1.
18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la secuencia de aminoácidos del péptido es la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº 2 mostrada en la figura 1, o una parte de la misma, que comprende al menos el segmento N-terminal y el primer bucle extracelular de la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº 2 mostrada en la figura 1.
19. Método según la reivindicación 3, en el que la modificación en la actividad peptídica se detecta mediante un bioensayo basado en la modificación en una producción de un segundo mensajero.
20. Método según la reivindicación 19, en el que el bioensayo se basa en la medición de la concentración de iones calcio o fosfatos de inositol (tales como IP_{3}).
21. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que la célula es una célula de mamífero de origen no neuronal, preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en células CHO-K1, HEK293, BHK21 y COS-7.
22. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que el anti-ligando, el fármaco, el agonista o el antagonista es un anticuerpo.
23. Método según la reivindicación 22, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
24. Método según la reivindicación 23, en el que el anticuerpo monoclonal se dirige a un epítopo de dicho péptido, presente sobre la superficie de una célula.
25. Anticuerpo que inhibe o reduce la unión del virus 1 de inmunodeficiencia humana (VIH-1) o el virus 2 de inmunodeficiencia humana (VIH-2) a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que presenta más del 80% de homología con la SEQ ID Nº 2 mostrada en la figura 1, identificado según el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24.
26. Anticuerpo según la reivindicación 25, en el que la secuencia de aminoácidos del péptido presenta más del 90% de homología con la SEQ ID Nº 2 mostrada en la figura 1.
27. Anticuerpo según la reivindicación 25, en el que la secuencia de aminoácidos del péptido presenta más del 95% de homología con la SEQ ID Nº 2 mostrada en la figura 1.
28. Anticuerpo según la reivindicación 25, en el que la secuencia de aminoácidos del péptido es la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº 2 mostrada en la figura 1.
29. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, que es un anticuerpo monoclonal.
30. Anticuerpo según la reivindicación 29, que es un anticuerpo monoclonal dirigido a un epítopo de dicho péptido, presente sobre la superficie de una célula que expresa dicho péptido.
31. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 30, que disminuye la infectividad de una célula por una cepa de VIH.
32. Anticuerpo según la reivindicación 31, en el que la célula es una célula linfocítica.
33. Anticuerpo según la reivindicación 31 ó 32, en el que la cepa de VIH es un virus 1 de inmunodeficiencia humana (cepa de VIH-1).
34. Anticuerpo según la reivindicación 31 ó 32, en el que la cepa de VIH es un virus 2 de inmunodeficiencia humana (cepa de VIH-2).
35. Composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéutico adecuado y una cantidad suficiente del anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 34.
36. Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 35, para la fabricación de un medicamento en la prevención y/o el tratamiento de una infección por el del virus 1 de inmunodeficiencia humana (VIH-1) y/o el virus 2 de inmunodeficiencia humana (VIH-2) (SIDA).
37. Uso de un oligonucleótido antisentido, que comprende una secuencia que se híbrida específicamente a una molécula de ácido nucleico que tiene más del 80% de homología con la secuencia de ácido nucleico SEQ ID Nº 2 mostrada en la figura 1, para la fabricación de un medicamento en la prevención y/o el tratamiento de una infección por el del virus 1 de inmunodeficiencia humana (VIH-1) y/o el virus 2 de inmunodeficiencia humana (VIH-2) (SIDA).
38. Uso de un oligonucleótido antisentido, que comprende una secuencia que se híbrida específicamente a una molécula de ácido nucleico que tiene al menos la secuencia de ácido nucleico SEQ ID Nº 2 mostrada en la figura 1, o una parte de la misma, para la fabricación de un medicamento en la prevención y/o el tratamiento de una infección por el del virus 1 de inmunodeficiencia humana (VIH-1) y/o el virus 2 de inmunodeficiencia humana (VIH-2) (SIDA).
39. Uso según la reivindicación 37 ó 38, en el que dicha molécula de ácido nucleico codifica para un péptido según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y 16 a 18.
40. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 37 a 39, en el que dicha molécula de ácido nucleico es una molécula de ADNc o una molécula de ADN genómico.
41. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 37 a 40, en el que dicho oligonucleótido antisentido comprende análogos químicos de nucleótidos.
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