DE69920681T2

DE69920681T2 - Humaner k+ ionenkanal und therapeutische verwendungen davon

Info

Publication number: DE69920681T2
Application number: DE69920681T
Authority: DE
Inventors: Luis Angel Pardo-Fernandez; Walter STÜHMER; Synnöve BECKH; Andrea BRÜGGEMANN; Donato Neurobiology Dept. Boston DEL CAMINO FERNANDEZ-MIRANDA; Araceli Sanchez Perez; Rüdiger WESELOH
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1998-04-21
Filing date: 1999-04-21
Publication date: 2005-09-08
Anticipated expiration: 2019-04-22
Also published as: US20030087378A1; US20080020406A1; US6638736B1; US7364730B2; WO1999054463A3; ATE278017T1; PT1073738E; US20030087377A1; EP1073738A2; WO1999054463A2; US20030092120A1; US7129207B2; CA2323571A1; US7314914B2; EP1073738B1; ES2230852T3; JP2009235091A; JP2002512029A; US20100021467A1; DK1073738T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuartigen K⁺-Ionenkanal, Nucleinsäuremoleküle, die ihn codieren, und Vektoren, die diese Nucleinsäuremoleküle enthalten. Die Erfindung betrifft zusätzlich Antikörper, die für den neuartigen K⁺-Ionenkanal spezifisch sind, und Arzneimittel und Diagnose-Kits, die mindestens einen der vorstehend genannten Bestandteile enthalten. Weitere Ausführungsformen der Erfindung sind aus den anliegenden Ansprüchen ersichtlich. Kaliumkanäle sind ein wesentlicher Faktor bei der Regulierung des Ruhepotentials von Zellen, und dies ist als ihre Hauptrolle in erregbaren und nicht erregbaren Geweben angesehen worden. Andererseits bleibt ihr allgegenwärtiges Vorkommen und die eindrucksvolle Variabilität in ihren Eigenschaften schwierig zu erklären. Eine vernünftige Hypothese besagt, dass Kaliumkanäle in allen Zelltypen vorkommen, weil sie zusätzlich eine Rolle bei der „Haushaltsführung" spielen, zum Beispiel bei der Zellproliferation (1). Ihre Beteiligung am Zyklus der Zellteilung ist wiederholt untersucht worden, und einige experimentelle Ergebnisse sind vorgelegt worden (2, 3). Es gibt jedoch, besonders da berichtet worden ist, dass sowohl Depolarisation als auch Hyperpolarisation des Membranpotentials während des Zellzyklus vom Zelltyp abhängig ist, kein generelles Modell, um die Funktion von Kaliumkanälen in Zellzyklen zu erklären. Zwei Mechanismen werden angenommen, um die Rolle von K⁺-Kanälen zu erklären: sie beeinflussen die intrazelluläre Ca²⁺-Konzentration oder kontrollieren das Zellvolumen (17, 18). Beide Mechanismen würden die Zellproliferation indirekt beeinflussen. Es wurde auch vorgeschlagen, dass ein Mitglied der eag-Familie bevorzugt in Krebszellen exprimiert wird (19). Zahlreiche Kaliumkanal-Blocker sind auf ihre Fähigkeit untersucht worden, Krebszellproliferation zu blockieren, und einige von ihnen sind sogar als Coadjuvans in der Tumor-Chemotherapie eingesetzt worden, besonders bei Tumoren mit Multiresistenzen gegen Arzneimittel. Trotzdem hat die Tatsache, dass Identifizierung eines bestimmten Kaliumkanals, der direkt an der Kontrolle der Zellproliferation beteiligt ist, nicht gelungen ist, bis heute die Beschreibung von spezifischeren und wirksamen Behandlungsprotokollen verhindert.
Ludwig et al. (1994) EMBO J. 13, 4451–4458 beschreibt die funktionale Expression und elektrophysiologische Charakterisierung eines Ratten-Homologs von einem eag-Kaliumkanal von Drosophila, der im Vergleich mit dem Kanal der vorliegenden Erfindung signifikant andere Eigenschaften aufweist.
Das technische Problem, dem die vorliegende Erfindung zugrunde liegt, bestand daher darin, eine biologische Komponente innerhalb des Konglomerats von Kaliumkanälen mit ihren verschiedenen Einflüssen auf der Zellteilungszyklus zu identifizieren, das eine unzweideutige Zuordnung zu zellulärer Proliferation, mit einem besonderen Blick auf menschliche zelluläre Proliferation, erlaubt. Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Bereitstellung der Ausführungsformen erreicht, die in den Ansprüchen dargestellt sind.
Dem zufolge betrifft die vorliegende Erfindung ein Nucleinsäuremolekül, das ein Nucleinsäuremolekül umfasst, welches ein (Poly-)Peptid codiert, das eine Funktion des menschlichen eag-K⁺-Ionenkanals hat, der eine Einzelkanalleitfähigkeit in asymmetrischem Kalium bei 0 mV von etwa 6 pS aufweist, welches

(a) ein Nucleinsäuremolekül ist, umfassend ein Nucleinsäuremolekül, das das Polypeptid codiert, welches die Aminosäuresequenz der SEQ ID: Nr. 3 oder 4 aufweist;
(b) ein Nucleinsäuremolekül ist, umfassend das Nucleinsäuremolekül, welches die DNA-Sequenz der SEQ ID: Nr. 13 oder 14 aufweist;
(c) ein Nucleinsäuremolekül ist, das mit dem komplementären Strang eines Nucleinsäuremoleküls von (a) oder (b) hybridisiert; oder
(d) ein Nucleinsäuremolekül ist, das gegenüber der Sequenz des Nucleinsäuremoleküls von (c) degeneriert ist.

Das Nucleinsäuremolekül der Erfindung codiert ein (Poly-)Peptid, das das menschliche Homolog des eag-Kanals der Ratte ist oder dieses umfasst. In dieser Hinsicht kann der Ausdruck „ein Nucleinsäuremolekül, umfassend ein Nucleinsäuremolekül, das ein (Poly-)Peptid codiert, welches eine Funktion des menschlichen eag-K⁺-Ionenkanal aufweist" bedeuten, dass das zuerst genannte Nucleinsäuremolekül das genannte (Poly-)Peptid allein codiert. Es kann daher mit dem zweiten genannten Nucleinsäuremolekül identisch sein. Alternativ kann es Regulatorregionen oder andere Regionen, die nicht translatiert werden, enthalten. In einer weiteren Ausführungsform kann das zuerst genannte Nucleinsäuremolekül heterologe Nucleinsäure enthalten, die heterologes Proteinmaterial codieren kann, und auf diese Weise z.B. Fusionsproteine entstehen lässt. Es ist weiterhin festzuhalten, dass die DNA-Sequenzen von SEQ ID Nr: 13 und 14 Spleißvarianten der Nucleinsäuresequenz sind, die das (Poly-)Peptid der Erfindung codiert. Die zugehörigen Aminosäuresequenzen werden in SEQ ID Nr: 3 und 4 dargestellt.
Der in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendete Ausdruck „hat eine Funktion eines menschlichen eag-K⁺-Ionenkanals" hat die folgende Bedeutung: Der Kanal hat eine Einzelkanalleitfähigkeit in asymmetrischem Kalium bei 0 mV von etwa 6 pS. Dieser Wert unterscheidet den menschlichen Kanal deutlich vom Kanal der Ratte, für den ein Wert von etwa 7 pS gemessen wurde. Zusätzlich oder als Alternative kann der vorstehend genannte Ausdruck die folgende Bedeutung haben: Der Kanal hat einen IC50 von etwa 1 mM auf Chinidin im Vergleich zu 400 μm für reag, wenn er in Oocyten von Xenopus laevis exprimiert wird. Darüber hinaus wurde bei der Messung der Spannungsabhängigkeit der Aktivierung bei hohen extrazellulären Kaliumwerten mit Hilfe einer Zwei-Elektroden-Spannungsklemme herausgefunden, dass in einer Aufzeichnung Leitfähigkeit gegen Spannung beim heag-Kanal die Spannung für Halbaktivierung im Vergleich zum reag-Kanal um etwa 40 mV oder mehr nach rechts verschoben ist (vgl. 13). Auf der Basis der vorstehend genannten Eigenschaften, entweder für sich allein oder in Kombination, ist Fachleuten auf dem Gebiet eine auf der Funktion basierende Unterscheidung zwischen dem menschlichen Ionenkanal der Erfindung und den zuvor verwendeten Kanälen, besonders dem Ionenkanal der Ratte, ohne weitere Umstände möglich. Bevorzugt besitzt der Kanal alle genannten Funktionen. Die vorstehend genannten Werte betreffen Werte, die mit der in dieser Beschreibung angeführten experimentellen Anordnung zu erhalten sind. Änderungen experimenteller Parameter, wie etwa die Verwendung eines anderen Expressionssystems, können, was Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt ist, auch die vorstehend genannten Werte verändern. Diese Ausführungsformen werden daher gleichfalls vom Schutzumfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Der im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendete Ausdruck „hybridisieren" betrifft stringente oder nicht stringente Hybridisierungsbedingungen. Bevorzugt betrifft er stringente Bedingungen. Diese Hybridisierungsbedingungen können nach herkömmlichen Protokollen geschaffen werden, wie sie zum Beispiel bei Sambrook, „Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y., Ausübel, „Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates und Wiley Interscience, N.Y. (1989), oder Higgins und Hames (Hrsg.) „Nucleic acid hybridization, a practical approach" IRL Press Oxford, Washington DC, (1985) beschrieben werden. Hybridisierende Moleküle oder Moleküle, die unter die Alternative (d), vorstehend, fallen, enthalten ebenfalls Fragmente der Moleküle, die in (a) oder (b) identifiziert wurden, bei denen die Nucleotidsequenz nicht mit ihrem Gegenstück aus SEQ ID Nr. 13 oder 14 identisch sein muss, wobei die Fragmente eine Funktion wie vorstehend angegeben haben.
Ein Beispiel für eine solche stringente Hybridisierungsbedingung ist die Hybridisierung bei 4XSSC bei 65°C, gefolgt von einer Waschung in 0,1XSSC bei 65°C über eine Stunde. Eine alternative, beispielhafte stringente Hybridisierungsbedingung ist in 50% Formamid, 4XSSC bei 42°C gegeben. Beispiele für solche nicht stringenten Hybridisierungsbedingungen sind 4XSSC bei 50°C oder Hybridisierung mit 30–40% Formamid bei 42°C. Komplementäre Stränge hybridisierender Moleküle umfassen jene, die Fragmente, Analoga oder Derivate des Polypeptids der Erfindung codieren und unterscheiden sich zum Beispiel durch Deletion(en), Insertion(en), Substitution(en), Addition(en) und/oder Rekombination(en) oder jeder(allen) anderen auf dem Fachgebiet bekannten Modifikation(en) an Aminosäure(n) und/oder Nucleotid(en), entweder allein oder in Kombination von den vorstehend genannten Aminosäuresequenzen oder der (den) ihnen zugrunde liegenden Nucleotidsequenz(en). Mit Verwendung des PESTFIND-Programms (Rogers, Science 234 (1986), 3 64–368), können PEST-Sequenzen (reich an Prolin, Glutaminsäure, Serin und Threonin) identifiziert werden, die kennzeichnenderweise in instabilen Proteinen vorhanden sind. Solche Sequenzen können vom Polypeptid der Erfindung entfernt werden, um die Stabilität zu erhöhen und die Aktivität der Proteine zu optimieren. Verfahren zur Einbringung solcher Veränderungen in die Nucleinsäuremoleküle der Erfindung sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Die Erfindung betrifft auch Nucleinsäuremoleküle, deren Sequenz sich von der Nucleotidsequenz jedes der vorstehend beschriebenen Nucleinsäuremoleküle aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet. Alle diese Fragmente, Analoga und Derivate, die das Protein der Erfindung codieren, werden vom Schutzumfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, solange die wesentlichen charakteristischen immunologischen und/oder biologischen Eigenschaften, wie vorstehend definiert, in der Weise unbetroffen bleiben, dass die neuartigen Nucleinsäuremoleküle der Erfindung alle Nucleotidsequenzen umschließen, die Proteine oder Peptide codieren, welche mindestens einen Teil der Primärstruktur für ein oder mehrere Epitope besitzen, die in der Lage sind, mit Antikörpern gegen das betreffende Polypeptid zu reagieren, die von einem Nucleinsäuremolekül, wie vorstehend beschrieben, codiert werden, und die vergleichbare oder identische Kennzeichen in Bezug auf die biologische Aktivität haben. Ein Teil der Erfindung betrifft daher auch Nucleinsäuremoleküle, die ein Polypeptid codieren, das mindestens einen funktionalen Teil des vorstehend identifizierten Polypeptids enthält, das von einer in einem Nucleinsäuremolekül der Erfindung enthaltenen Nucleinsäuresequenz codiert wird.
Die Erfinder haben kürzlich einen Kaliumkanal (reag) beschrieben, der direkt nach der Aktivierung der Cyclin-abhängigen Kinasen (Schlüsselmoleküle für die Regulation des Zellkreislaufes) stark herabreguliert wird, sowohl bei G1-S – als auch bei G2-M – Übergängen (5). Der K⁺-Strom wird nach der Aktivierung der Cyclinabhängigen Kinasen auf Grund eines spannungsabhängigen Natrium-Blocks, der nicht in allen Phasen des Zellzyklus auftritt, verhindert. Die hier gezeigten Experimente haben zum Ziel, zu bestimmen, ob eag, zusätzlich zu seiner Regulierung durch den Zellzyklus, auch in der Lage ist, Zellproliferation und Wachstum direkt zu beeinflussen (20). In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung und mit Blick auf die Entwicklung eines geeigneten Systems zur Abschätzung (krankheitsbezogener) Proliferation in menschlichen Zellen wurde darüber hinaus versucht, zu untersuchen, ob die Bedeutung des Kanals im Zellzyklus in beide Richtungen geht, in der Weise, dass er nicht nur beim Ablauf des Zellzyklus reguliert wird, sondern auch Regulator ist.
Die mit diesem von der Ratte stammenden Ionenkanalsystem erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass in drei unterschiedlichen Zelllinien, die von verschiedenen Arten stammten (Chinesischer Hamster -CHO-, menschliche -HEK293- und Maus -NIH-3T3-), die Proliferationsrate erhöht ist, wenn der Kanal nach Transfektion der Zellen mit einem Plasmid, das die DNA des Kanals unter der Kontrolle eines Cytomegalievirus-Promotors enthält, überexprimiert wird. 1 und 18a zeigen den Anstieg der metabolischen Aktivität in Kulturen von CHO-Zellen bei Anwesenheit normaler Konzentrationen von fötalem Kälberserum (19% FCS). Unter diesen Normalbedingungen wachsen reag-transfizierte Zellen mehrfach schneller als nicht transfizierte Zellen (WT).
2 zeigt ein vergleichbares Experiment mit sehr geringen Konzentrationen an fötalem Kälberserum (0,5% FCS). Diese geringen Serumkonzentrationen erlauben Zellen des Wildtyps nicht, zu wachsen; nach wenigen Stunden beginnen die Zellen zu sterben. Die reag-transfizierten Zellen sind jedoch in der Lage, unter den gleichen Bedingungen zu proliferieren. Die Fähigkeit, die durch das Fehlen von Wachstumsfaktoren induzierte Wachstumssperre zu überwinden, ist eine der typischen Eigenschaften von malignen Transformationen (vgl. 18).
Nicht nur die metabolische Aktivität kann verwendet werden, die Proliferation in Kultur zu verfolgen. Die Messung von DNA-Synthese ist eine direktere Bestimmung der Zellwachstumsrate, da nur Zellen, die in die S-Phase eintreten (sich in Teilung befinden), DNA synthetisieren. DNA-Synthese wird in reag-transfizierten Zellen auch unabhängig vom Serum, d.h. das Wachstum wird bei Abwesenheit von Wachstumsfaktoren beibehalten (während dies den programmierten Tod bei nicht transfizierten Zellen induziert). Dies wird in 3 dargestellt, wobei die Einlagerung von 5-Brom-2'-desoxyuridin (BrdU) (7–10) verwendet wurde, um DNA-Synthese in Anwesenheit von 10 oder 0,5% FCS in CHO-Zellen zu überwachen. Im Gegensatz zu Zellen des Wildtyps oder Zellen, die mit einem inaktivierenden spannungsabhängigen Kaliumkanal aus Rattenhirn (Kv1.4) transfiziert sind, gibt es in reag-exprimierenden Zellen keine signifikanten Unterschiede in der Menge der in Anwesenheit von normalen oder geringen FCS-Konzentrationen synthetisierten DNA. Ähnliche Untersuchungen wurden unter Verwendung des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) in HEK-293-Zellen oder des aus Plättchen stammenden Wachstumsfaktors (PDGF) in CHO-Zellen mit im wesentlichen dem gleichen Ergebnis durchgeführt. Die reinen Wachstumsfaktoren wurden verwendet, um die Komplexität zu vermeiden, die sich bei der Verwendung von vollständigem Serum ergeben würde.
Um die Wirkungen von eag auf Zellproliferation genauer zu untersuchen, wurde DNA-Synthese durch die Einlagerung von 5-Brom-desoxyuridin (BrdU) (7–10) in Zellen gemessen, die in der S-Phase des Zellzyklus mit Hilfe von Thymidin-Arretierung synchronisiert worden waren (23). In Übereinstimmung mit den vorstehend genannten Befunden zeigten die reag-exprimierenden CHO-Zellen (CHOrEAG) höhere metabolische Aktivität (18B) und erhöhte BrdU-Einlagerung (18C), sobald man die S-Phase des Zellzyklus fortlaufen ließ. Diese Ergebnisse legen nahe, dass mehr eag-transfizierte Zellen während des arretierten Zeitraumes in die S-Phase eintraten und/oder die DNA-Synthese erhöht war, was in jedem Fall auf eine schnellere Proliferationsrate in CHOrEAG-Zellen hinwies. Bei Anwesenheit von wenig Serum war die BrdU-Einlagerung in CHOrEAG-Zellen signifikant höher als in denen des Wildtyps (18C).
Noch eine andere Zelllinie, NIH-3T3 ist häufig für Untersuchungen zur Tumortransformation verwendet worden, da diese Zellen sehr stark kontaktgehemmt sind, (d.h. ihr Wachstum wird gestoppt, wenn die Kultur Konfluenz erreicht). Dies führt zu einer homogenen einzelligen Schicht der Wildtyp-Zellen. Die maligne Transformation der Linie (durch Onkogen-Expression) verursacht normalerweise den Verlust dieser Eigenschaft, und NIH-3T3-Zellen beginnen, Kolonien zu bilden, die aus mehreren Zelllagen bestehen. Dies kann nach der Transfektion mit reag-DNA beobachtet werden, welche die Bildung solcher foci in zahlreichen unabhängigen Clonen induzierte (4A und 4B). Eine andere Standarduntersuchung zur Transformierungsaktivität ist die Fähigkeit von NIH-3T3-Zellen, in Kolonien zu wachsen, wenn kein Substrat zur Anheftung verfügbar ist. Um dieses zu prüfen, werden die Zellen in einem Agar enthaltenden Kulturmedium plattiert, in dem der Agar Kontakte zwischen den Zellen und der Oberfläche der Platte verhindert. Unter diesen Bedingungen waren NIH-3T3-Zellen des Wildtyps nicht in der Lage zu wachsen, während reag-exprimierende Zellen große Kolonien bildeten, die selbst durch einfache visuelle Prüfung der Platte zu erkennen waren. Tabelle I zeigt, dass reag- (aber nicht rKv1.4-) transfizierte Zellen, unabhängig von dem zur Transfektion verwendeten Vektor, Kolonien in einem halbfesten Kulturmedium bildeten, das 0,3% Agar enthielt (24, 25) (14). Alle diese vorstehenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass eag ein Potential zur Transformation besitzt.
Zusammen genommen weisen die von transfizierten Zellen gewonnenen Ergebnisse darauf hin, dass reag, zumindest unter bestimmten Bedingungen, onkogene Eigenschaften haben kann.
Nachdem die transformierende Fähigkeit von reag in Übereinstimmung mit der Erfindung bestimmt worden war, wurde die Expression des entsprechenden Kanals in menschlichen Krebszellen untersucht. Für diese Untersuchung wurde die Zelllinie MCF-7 verwendet, die ursprünglich aus einem pleuralen Erguss eines Brust-Adenokarzinoms erhalten worden war. Diese Linie ist sowohl Östrogenrezeptorpositiv als auch Östrogen-sensitiv und relativ gut differenziert. Die verfolgte Strategie war, zunächst elektrophysiologisch und pharmakologisch nach der Anwesenheit eines funktionalen, eag ähnlichen Stroms zu suchen, und dann eine Identifizierung des zugehörigen Kanals auf der molekularen Ebene zu versuchen. Herkömmliche Ansätze für eine solche Identifizierung schlugen jedoch fehl.
Denn in den meisten Zellen war die Stromdichte zu gering, um verlässliche Messungen des gesamten Zellstroms zu erlauben. Geringe Stromdichte schloss eine genaue Messung der Kanaleigenschaften unter Verwendung einer Ganz-Zell-Anordnung für das Patch-Clamp-Verfahren aus. Deshalb wurde aufgrund jener auftretenden geringen Stromdichten ein anderer Ansatz gewählt. Wegen einer so geringen Anzahl von Kanälen pro Zelle ist es nur mit einem speziellen Patch champ- Verfahren möglich, die funktionalen Eigenschaften eines Kanals zu charakterisieren, bei dem Teile von Membranen, die einen (oder wenige) Kanäle enthalten, ausgeschnitten werden, und das Charakterisierung auf einer Ebene einzelner Moleküle erlaubt. Dieser Ansatz basierte auf Einzelkanal-Messungen, um ebenfalls Eigenschaften auf der Ebene einzelner Moleküle zu vergleichen, wie etwa Leitfähigkeit des einzelnen Kanals, pharmakologische Eigenschaften, Spannungsabhängigkeit, und Hauptöffnungszeiten. Tatsächlich konnte ein Kanal mit mehreren Eigenschaften, die mit reag im Bereich der Kinetik, Spannungsabhängigkeit und Pharmakologie vergleichbar waren, auf diese Weise in den meisten Membranstücken nachgewiesen werden. 5 zeigt die Ströme der ganzen Zelle, die aus einer MCF-7-Zelle unter Nystatin-Patch-Bedingungen erhalten worden waren, und Einzelkanalströme zusammen mit ihrer Strom-Spannungsrelation. Abgesehen von Unterschieden in der Kinetik bei sehr depolarisierten Spannungen ist die Spannungsabhängigkeit des Kanals in menschlichen Zellen der Spannungsabhängigkeit des reag-Kanals sehr ähnlich. Darüber hinaus sind die Eigenschaften des Einzelkanals des mutmaßlichen menschlichen eag ebenfalls denen von reag sehr ähnlich.
Darüber hinaus waren Standardansätze zur Isolierung dieses Kanals auf einer molekularen Ebene gleichfalls nicht erfolgreich. Mehrere andere Gruppen haben versucht und/oder versuchen noch immer ohne Erfolg, das Gen, das ein menschliches eag codiert, zu isolieren, und dies trotz der Tatsache, dass der eag-Kanal der Ratte schon 1994 veröffentlicht worden ist. Zum Beispiel bemühten sich Warmke und Ganetzky (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 3428–3442) besonders darum, das menschliche eag-Gen mit Hilfe von herkömmlicher Technik zu clonieren. Sie waren jedoch nicht erfolgreich und clonierten ein neuartiges, mit eag verwandtes Gen, das sie h-erg nannten (auch als HERG bezeichnet). Weiter berichteten Wymore et al., Circulation Res. 80 (1997), 261–268, dass in einer c-DNA-Bibliothek aus dem menschlichen Herzen keine eag-spezifischen Clone nachgewiesen werden konnten, trotz der Tatsache, dass Primer zur Amplifikation verwendet worden waren, die durch die gesamte eag/erg-Superfamilie hindurch erhalten waren. Daher erwies sich der Standardansatz mit degenerierten Oligonucleotiden, die auf der Sequenz von Mitgliedern der Familie beruhten, als nicht erfolgreich, obwohl HERG systematisch von anderen Forschern auf dem Gebiet nachgewiesen wurde. Kennzeichnenderweise wurden die meisten dieser Ansätze, das menschliche eag-Gen zu clonieren, mit Gehirn-Bibliotheken durchgeführt. Die Folgerung aus diesen kombinierten schon vorliegenden Daten war, dass das menschlichen eag-Gen mit herkömmlicher Technik unter Verwendung der wahrscheinlichsten Quelle, besonders von Gehirngewebe, nicht cloniert werden konnte. Die wiederholte Isolierung von HERG-Clonen dagegen beruht höchst wahrscheinlich auf der relativen Häufigkeit von HERG-Transkripten in Gehirn-Bibliotheken und auch auf der hohen Homologie zwischen den beiden Kanälen. Folglich musste eine andere Strategie entworfen werden, um die Durchmusterung spezifischer auf eag-Kanäle zu richten. Zunächst wurde, wie vorstehend beschrieben, eine Zelllinie identifiziert, die einen Kanal exprimierte, der reag funktional ähnlich war. Dann wurden degenerierte Oligonucleotide entworfen, die auf konservierten Sequenzen zwischen eag von Ratte, Rind und Maus beruhten, sich aber von HERG unterschieden. Unter Verwendung dieser Primer wurde die aus MCF-7-Zellen mittels PCR gewonnene cDNA amplifiziert, und eine Bande mit der erwarteten Größe wurde in einen geeigneten Vektor cloniert und sequenziert. Das amplifizierte Fragment entsprach etwa 400 Bp innerhalb der Kernregion des Kanalproteins und teilte 90% der Identität mit der reag-Sequenz auf der DNA-Ebene und 99% auf der Ebene der Aminosäuren. Auf dieser Stufe war jedoch noch recht unklar, womit der auf diese Weise identifizierte Clon überein stimmte. Zum Beispiel war es durchaus möglich, das ein weiteres Mitglied der eag-Familie identifiziert worden war. Dies trifft zum Teil im Hinblick auf die Tatsache zu, dass trotz einer Reihe von Versuchen mit Gehirn-Bibliotheken niemand in der Lage gewesen war, ein menschliches eag-Gen zu clonieren und dass die MCF-7-Linie eine von Brustkrebs abstammende Linie ist.
Da MCF-7-Zellen unsterbliche Zellen sind, nimmt man an, dass eine Reihe von Genen mutiert ist. Von vornherein konnte erwartet werden, dass der menschliche eag-Kanal, falls er überhaupt in dieser Zelllinie exprimiert wird, mutiert sein würde. Unter dieser Annahme war es ziemlich ungewiss, ob diese Zelllinie überhaupt für die Isolierung des gewünschten Gens verwendet werden konnte.
Auf Grund der voraus gegangenen Fehlschläge, das menschliche eag-Gen aus Gehirn-Bibliotheken zu clonieren und den vorstehend genannten Ungewissheiten mit unsterblichen Zelllinien wurde nach einer anderen Quelle für eine Bibliothek gesucht. Das 400 Bp-Fragment wurde daher verwendet, eine normale cDNA-Bibliothek der menschlichen Brust zu durchmustern. Aufgrund der Anwesenheit von eag in Brustkrebszellen wurde erwartet, dass eine solche Bibliothek heag-Clone enthielt. Überraschend konnten jedoch nach Durchmusterung von 2 × 10⁶ Phagen keinen menschlichen eag-Clone in dieser Bibliothek gefunden werden. Dies eröffnet die Möglichkeit, dass der Kanal nur in Tumorzellen und nicht in normalem Gewebe exprimiert wird. Spezifische Oligonucleotide, namentlich
5'-CCAAACACACACACCAGC, 5'-CGTGGATGTTATCTTTTTGG
wurden entworfen, um in der vorstehend genannten Bibliothek direkt durch PCR-Amplifikation nach heag-Fragmenten zu suchen, aber nicht ein Anzeichen für die Anwesenheit von heag-Clonen in dieser Bibliothek wurde gefunden. Im Hinblick auf die vorstehend diskutierten Ergebnisse vorheriger Arbeiten stellte sich als weitere Überraschung heraus, dass die gleichen Primer heag in einer normalen cDNA-Bibliothek von menschlichem Gehirn entdeckten, die daraufhin durchmustert wurde. Zuerst wurde die aus MCF-7-Zellen gewonnene Sonde verwendet, um 10⁶ Phagen zu prüfen. Dieses Vorgehen gestattete, ein 1,6 kBp großes Fragment des menschlichen eag zu isolieren. Dieses Fragment wurde dann als eine Sonde für die Durchmusterung von 2 × 10⁶ Phagen aus der selben Bibliothek verwendet. Zahlreiche unabhängige Clone wurden isoliert, aber keiner von ihnen war ein Clon mit voller Länge. Darüber hinaus enthielt nur ein Clon das 5'-Ende der Sequenz, während zwei von ihnen das 3'-Ende und einen Teil der nicht codierenden 3'-Region enthielten. Es ist wahrscheinlich, dass die große Menge an Restriktionsstellen in der Nucleinsäuresequenz, die den Kanal codiert, diese umfangreiche Fragmentierung der cDNA induziert hat. Wenn zum Beispiel EcoRl verwendet wurde, um die Insertionen aus der Bibliothek, die in den Phagen λ-gt10 an der EcoRl-Stelle cloniert worden war, zu extrahieren, schlug dieser herkömmliche Ansatz, um das 5'-Ende des Moleküls zu finden (es gibt eine EcoRl-Stelle an Position 400 des Clons), systematisch fehl. Die zusammengegebenen positiven Clone wurden daher noch einmal mittels PCR durchmustert, womit versucht wurde, das Startcodon zu amplifizieren, und nur auf diese Weise war es möglich, einen Phagen zu isolieren, die dieses ATG enthielt. Zwei Spleißvarianten von heag wurden cloniert, beide wurden in Gehirngewebe exprimiert. Die für heag 1 und heag 2 erhaltene Sequenz und ihre abgeleitete Aminosäurensequenz werden in den 10 und 11 dargestellt und mit anderen Mitgliedern der Familie verglichen.
Die abgeleitete Aminosäuresequenz ist mit der Sequenz identisch, die nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Erfindung von Occhidoro (27) veröffentlicht wurde, und sie ist zu 97,7% identisch mit reag. Wie vorstehend genannt, wurde eine zweite (81 Bp längere) Spleißvariante (heag 2) ebenfalls isoliert, analog zu jenen für Rind und Maus gefundenen eag-Kanälen (28), wobei die Spleißinsertion für alle drei Arten identisch ist. Die chromosomale Lokalisation von heag wurde mittels FISH-Nachweis (29) auf Chromosom lg32.1–32.3 liegend ermittelt (vgl. auch Ref. 26).
Um darüber hinaus die Möglichkeit zu prüfen, dass heag, im Gegensatz zu MCF-7 Krebszellen, nicht in einer normalen Brustdrüse exprimiert wird, führten wir Einzelröhrchen-RT-PCR-Untersuchungen durch, für die wir vollständige RNA aus menschlichem Gehirn, menschlicher Brustdrüse und MCF-7-Zellen verwendeten (12), und als Primer zwei Oligonucleotide einsetzten, die so entworfen worden waren, dass sie die beiden Spleißvarianten von heag unterscheiden konnten. Im menschlichen Gehirn wurden zwei Spleißvarianten nachgewiesen, während in MCF-7-Zellen nur die kurze Variante exprimiert wurde (dies, zusammen mit dem Fehlen der Amplifikation in Abwesenheit von reverser Transkriptase, schließt eine mögliche Verunreinigung der RNA-Präparation durch genomische DNA aus). In normaler Brustdrüsen-RNA wurde mit dieser hochempfindlichen Technik kein heag-Signal nachgewiesen. Dieses Ergebnis war vollkommen unerwartet, denn vorhergehende Ergebnisse hatten vermuten lassen, dass Expression in Tumorzellen des selben Organs stattfand. Darüber hinaus wurde nach Southern-Blot-Analyse der RT-PCR-Produkte eine schwache Bande identifiziert, die mit einer heag-Sonde in Brustdrüsengewebe hybridisierte. Demzufolge ist es im Hinblick auf diese widersprüchlichen experimentellen Daten recht schwierig, eine klare Aussage für das vollständige Fehlen der heag-Botschaft in Brustgewebe zu treffen.
Darüber hinaus wurden elektrophysiologische Eigenschaften (21, 30) von heag in Xenopus-Oocyten untersucht. Wie vorstehend beschrieben, unterschieden sie sich nicht signifikant von jenen von reag, abgesehen von den vorstehend angeführten Ausnahmen, z. B. einer Verschiebung der Aktivierung von 40 mV zu mehr depolarisierten Potentialen, wenn beide Kanäle unter identischen Bedingungen gemessen wurden. Die elektrophysiologischen Beobachtungen für heag-Kanäle, die in Xenopus-Oocyten exprimiert wurden, stimmen gut mit jenen überein, die von Bijlenga et al. (31) berichtet worden sind.
Ein Nucleinsäuremolekül, das spezifisch mit dem Nucleinsäuremolekül der Erfindung hybridisiert, das die Sequenz 5'-GGGAGGATGACCATGGCT umfasst, ist besonders nützlich für spezifische Antisense-Therapien zur Hemmung von Zellproliferation, wie nachstehend hierin genauer beschrieben wird (z.B. in Beispiel 5). Zusätzlich kann diese Ausführungsform des Nucleinsäuremoleküls der Erfindung natürlich auch als Sonde zum spezifischen Nachweis von heag-mRNA in Geweben verwendet werden, z.B. durch Verwendung der Northern-Blot-Technik. Die Analyse der Expression von heag-mRNA in verschiedenen Geweben durch das Northern-Blot-Verfahren ergab ein starkes Hybridisierungssignal von etwa 9,2 kB in Gehirngewebe und ein schwaches Signal für ähnliche Größe in Plazentagewebe. Herz, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere und Bauchspeicheldrüse waren negativ, selbst nach langen Expositionen. Zusätzlich wurden vollständige RNA aus menschlichem Gehirn, Herz, Luftröhre, Nebenniere, Leber, Niere, Skelettmuskel, und Brustdrüse als auch Poly(A)⁺-RNA aus dem Rückenmark und vollständige RNA aus der Adenovirus-transformierten Linie 293 (eine menschliche nicht tumoröse Linie) mittels Einzelröhrchen-RT-PCR und Southern-Blot-Verfahren untersucht. Unter diesen experimentellen Bedingungen wurde heag nur in Gehirngewebe nachgewiesen, in dem beide Spleißvarianten identifiziert wurden (15; Beispiel 3).
Die bevorzugte Expression von heag in Gehirngewebe war verblüffend, da die erste cDNA aus einer Epitheltumor-Zellline (MCF-7) isoliert worden war und nicht aus Gehirngewebe (vgl. vorstehend). Um die Anwesenheit von heag in anderen Tumor-Zelllinien zu erhellen, wurde vollständige RNA aus HeLa (Gebärmutterhals- Karzinom), SHSY-5Y (Neuroblastom) und Linien von Brustdrüsentumoren: COLO-824 (Karzinom), EFM-19 (Karzinom) und BT-474 (Ductalkarzinom) hergestellt. Vollständige RNA aus Gehirngewebe, MCF-7-Zellen, 293-Zellen und RNA aus Kulturen von Brusttdrüsen-Epithelzellen (eingeschlossen, um die gemischten Zellpopulationen vollständiger Brustdrüsen zu umgehen) dienten als Kontrollen. Alle Zelllinien wurden von der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) bezogen und nach den Richtlinien des DSMZ-Katalogs gehalten. Normale menschliche Brustepithelzellen wurden von BioWhittaker bezogen. Die Primer wurden so entworfen, dass sie unterschiedliche Banden für heag 1 und heag 2 amplifizierten, und uns auf diese Weise erlaubten, Falsch-Positive auf Grund von Verunreinigung mit genomischer DNA auszusortieren (Kontrollen bei Abwesenheit von reverser Transkriptase wurden gleichfalls durchgeführt). HeLa-, SHSY-5Y-, EFM-19- und MCF-7-RNA zeigte eine heag-Bande, während Signale von COLO-824 und BT-474 nicht vom Hintergrund zu unterscheiden waren (15B). Kultivierte Epithelzellen und 293-Zellen (15A) waren negativ. Wie vorstehend diskutiert, konnte in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung gezeigt werden, dass reag-transfizierte Zellen onkogene Eigenschaften entwickeln können. Daher wurden, um zu bestimmen, ob die Expression von heag für Tumorzellen in vivo vorteilhaft ist, subkutane Implantate von CHO-Zellen, die den Kanal exprimierten (CHOhEAG-Zellen), in die Flanken von weiblichen scid (severe combined inimunodeficiency, schwere kombinierte Immunschwäche, (32))-Mäusen eingesetzt, und es konnte gezeigt werden, dass Expression von heag einen Vorteil für die Proliferation von Tumorzellen in vivo darstellt, da CHOhEAG-Tumore schneller wachsen und aggressiver sind als CHOKv-Tumore. Daher kann die Ausführungsform des Nucleinsäuremoleküls zur quantitativen und qualitativen Analyse des Expressionsspiegels von menschlichem eag verwendet werden, der in einem Gewebe in verschiedenen Erkrankungsstadien nachweisbar ist und zum Beispiel auf Krebserkrankung (besonders Brustkrebs und Neuroblastom), Psoriasis, neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer-Erkrankung, Parkinson-Erkrankung, amyotrophische Lateralsklerose oder Multiple Sklerose hinweisend sein kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Nucleinsäuremoleküls der Erfindung ist dieses Nucleinsäuremolekül DNA, wie etwa genomische DNA. Die vorliegende Erfindung enthält hingegen auch synthetische oder semisynthetische DNA-Moleküle oder Derivate hiervon, wie etwa Peptid-Nucleinsäure, das am meisten bevorzugte DNA-Molekül der Erfindung ist cDNA.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist jenes Nucleinsäuremolekül RNA, bevorzugt mRNA.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform des Nucleinsäuremoleküls der Erfindung codiert ein Fusionsprotein. Zum Beispiel kann das Nucleinsäuremolekül der Erfindung im Rahmen mit einem nachweisbaren Marker, wie etwa FLAG oder GFP, fusioniert sein.
Die Erfindung betrifft darüber hinaus einen Vektor, besonders ein Plasmid, Cosmid, Virus und einen Bakteriophagen, die das Nucleinsäuremolekül der Erfindung enthalten. Solche Vektoren können weitere Gene enthalten, wie etwa Markergene, die die Selektion des betreffenden Vektors in einer geeigneten Wirtszelle und unter geeigneten Bedingungen erlauben. Daher kann das Polynucleotid der Erfindung im betreffenden Vektor funktionell mit Expressionskontrollsequenzen verbunden sein, die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen erlauben. Expression des betreffenden Polynucleotids umfasst Transkription des Polynucleotids in eine translatierbare mRNA. Regulatorische Elemente, die Expression in eukaryontischen Zellen, bevorzugt Säugerzellen, sicherstellen, sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Sie enthalten gewöhnlich regulatorische Sequenzen, die den Beginn der Transkription sicherstellen und gegebenenfalls Poly-A-Signale, die die Beendigung der Transkription und Stabilisierung des Transkriptes sicherstellen. Zusätzliche regulatorische Elemente können sowohl transkriptionale als auch translationale Enhancer umschließen. Mögliche regulatorische Elemente, die Expression in prokaryontischen Wirtszellen erlauben, enthalten z.B. den lac-, trp- oder tac-Promotor in E. coli, und Beispiele für regulatorische Elemente, die Expression in eukaryontischen Wirtszellen erlauben, sind der AOX1- oder GAL1-Promotor in Hefe oder der CMV-, S40-, RSV-Promotor (Rous-Sarkomvirus), CMV-Enhancer, SV40-Enhancer oder ein Globin-Intron in Säuger- und anderen Tierzellen. Neben Elementen, die für den Beginn der Transkription verantwortlich sind, können solche regulatorischen Elemente auch Signale zur Beendung der Transkription enthalten, wie etwa die SV40-Poly-A-Stelle oder die tk-Poly-A-Stelle, stromabwärts zum Polynucleotid gerichtet. In diesem Zusammenhang sind geeignete Expressionsvektoren auf dem Fachgebiet bekannt, etwa der Okayama-Berg-cDNA-Expressionsvektor pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogene), pSPORT1 (GIBCO BRL).
Bevorzugt ist der betreffende Vektor ein Expressionsvektor und/oder ein Gentransfer- oder Zielvektor. Expressionsvektoren und Genziel- oder Transfervektoren sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und können von Fachleuten auf dem Gebiet für die spezifischen Zwecke der Erfindung angepasst werden. Daher können Expressionsvektoren, die von Viren, wie etwa Retroviren, Vaccinia-Virus, Adeno-assoziiertem Virus, Herpesviren oder Papillomvirus vom Rind stammen, zur Übertragung der Polynucleotide oder Vektoren der Erfindung in die ausgewählten Zellpopulationen verwendet werden. Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt sind, können verwendet werden, um rekombinante virale Vektoren zu konstruieren; vgl. zum Beispiel die Techniken, die von Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. und Ausübel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates und Wiley Interscience, N.Y. (1989) beschrieben wurden. Alternativ können die Polynucleotide und Vektoren der Erfindung zur Übertragung auf Zielzellen in Liposomen rekonstituiert werden.
Die Erfindung betrifft darüber hinaus eine Wirtszelle, die mit dem Vektor der Erfindung transformiert ist. Die betreffende Wirtszelle kann eine prokaryontische oder eine eukaryontische Zelle sein, vgl. vorstehend. Das Polynucleotid oder der Vektor der Erfindung, welches in der Wirtszelle anwesend ist, kann entweder in das Genom der Wirtszelle integriert sein, oder es kann extrachromosomal gehalten werden. In dieser Hinsicht ist es auch zu verstehen, dass das rekombinante DNA-Molekül der Erfindung zur „Gensuche" und/oder zum „Genersatz", zum Ersetzen eines mutanten Gens oder zur Erzeugung eines mutanten Gens mittels homologer Rekombination verwendet werden kann; vgl. zum Beispiel Mouellic, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 (1990), 4712–4716; Joyner, Gene Targeting, A Practical Approach, Oxford University Press. Bevorzugt ist die Wirtszelle eine Säugerzelle, eine Pilzzelle, eine Pflanzenzelle eine Insektenzelle oder eine Bakterienzelle. Bevorzugte Pilzzellen sind zum Beispiel jene der Gattung Saccharomyces, besonders jene der Art S. cerevisiae. Der Ausdruck „prokaryontisch" soll alle Bakterien einschließen, die mit einem Polynucleotid zur Expression des Proteins der vorliegenden Erfindung transformiert oder transfiziert werden können. Prokaryontische Wirtszellen können sowohl gramnegative als auch grampositive Bakterien, wie etwa zum Beispiel E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens und Bacillus subtilis einschließen. Verfahren zur Herstellung fusionierter, funktionell verbundener Gene und ihrer Expression in Bakterien oder Tierzellen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Die hierin beschriebenen genetischen Konstrukte und Verfahren können zur Expression des Proteins der vorliegenden Erfindung in prokaryontischen Wirtszellen verwendet werden. Allgemein werden Expressionsvektoren, die Promotorsequenzen enthalten, die die wirksame Transkription des inserierten Polynucleotids erleichtern, in Verbindung mit der Wirtszelle verwendet. Der Expressionsvektor enthält typischerweise sowohl eine Quelle für Replikation, einen Promotor und einen Terminator als auch spezifische Gene, die in der Lage sind, phänotypische Selektion der transformierten Zellen zu gewährleisten. Die transformierten prokaryontischen Wirtszellen können in Fermentern gezüchtet und nach den auf dem Fachgebiet bekannten Techniken kultiviert werden, um optimales Zellwachstum zu erreichen. Die Polypeptide der Erfindung können dann aus dem Kulturmedium, Zelllysaten oder Zellmembranfraktionen isoliert werden. Die Isolierung und Reinigung der mikrobiologisch oder auf andere Weise exprimierten Polypeptide der Erfindung kann durch jede herkömmliche Weise erfolgen, wie etwa zum Beispiel durch präparative chromatographische Trennungen und immunologische Trennungen, wie jene, die die Verwendung von monoclonalen oder polyclonalen Antikörpern beinhalten. In Bezug auf Säugerzellen werden HEK 293-, CHO-, HeLa- und NIH-3T3-Zellen bevorzugt. In Bezug auf Insektenzellen wird am meisten bevorzugt, Zellen von Spodoptera frugiperda zu verwenden, während die am meisten bevorzugten Bakterienzellen E. coli-Zellen sind.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung des (Poly-)Peptids, das von dem Nucleinsäuremolekül der Erfindung codiert wird, welches die Kultivierung der Wirtszelle der Erfindung und die Isolierung des produzierten (Poly-)Peptids umfasst.
Abhängig von der verwendeten Vektorherstellung kann das (Poly-)Peptid der Erfindung in das Kulturmedium exportiert werden oder innerhalb der Wirtszelle bleiben. Geeignete Protokolle zum Erhalt des produzierten (Poly-)Peptids sind auf dem Fachgebiet für beide Wege der (Poly-)Peptidproduktion gut bekannt.
Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus ein (Poly-)Peptid, das von dem Nucleinsäuremolekül der Erfindung codiert oder von dem Verfahren der Erfindung produziert wird. Man stellt sich den neuen Kanal so vor, dass er eine Struktur mit einer kurzen Amino-terminalen Region, vermutlich intrazellulär, aufweist, fünf die Membran überspannende Segmente, eine hydrophobe Haarnadelstruktur, die in die Membran eintritt, ein sechstes transmembranes Segment und einen langen C-terminalen cytoplasmatischen Teil hat, der eine zyklische Consensus-Sequenz zur Nucleotidbindung, eine Consensus-Sequenz zur Kernlokalisation und eine hydrophobe Domäne umfasst, die vermutlich eine aufgewickelte Spiralstruktur bildet. Das Polypeptid der Erfindung kann auch ein funktionelles Fragment des menschlichen K⁺-Ionenkanals sein. Mit „funktionellem Fragment" sind Polypeptide gemeint, die eine der Aktivitäten von heag, wie vorstehend beschrieben, zeigen. Unter Verwendung rekombinanter DNA-Technik können Fragmente des (Poly-) Peptids der Erfindung hergestellt werden. Diese Fragmente können auf ihre gewünschte Funktion, zum Beispiel wie vorstehend beschrieben, geprüft werden, indem eine Reihe von Untersuchungsverfahren, wie etwa jene, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben werden, verwendet werden. Bevorzugt enthalten die betreffenden Fragmente den C-terminalen Abschnitt des neuartigen Ionenkanals.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Antikörper, der spezifisch für das (Poly)-Peptid der Erfindung ist. Der Antikörper der Erfindung unterscheidet spezifisch zwischen dem menschlichen eag-Kanal und den bereits bekannten Kanälen, wie etwa eag von Maus und Ratte, und bindet bevorzugt an Epitope im C-terminalen Abschnitt des Ionenkanals. Der im Zusammenhang mit der Erfindung verwendete Ausdruck „Antikörper" betrifft auch Antikörperfragmente oder Derivate, wie etwa F(ab)₂-, Fab'-, Fv- oder scFv-Fragmente; vgl. zum Beispiel Harlow und Lane, „Antibodies, A Laboratory Manual" CSH Press 1988, Cold Spring Harbor, NY. Bevorzugt ist der Antikörper der Erfindung ein monoclonaler Antikörper.
Die Erfindung betrifft auch ein Arzneimittel, das den Vektor der Erfindung, das Polypeptid der Erfindung und/oder den Antikörper der Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel und/oder Exzipienten umfasst.
Beispiele sowohl für geeignete pharmazeutische Träger und Verdünnungsmittel als auch für Exzipienten sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und umfassen Phosphatgepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, wie etwa Öl/Wasser-Emulsionen, verschiedene Arten von Benetzungsmitteln, sterile Lösungen etc. Zusammensetzungen, die solche Träger enthalten, können durch gut bekannte, herkömmliche Verfahren formuliert werden. Diese Arzneimittel können dem bedürftigen Patienten in einer geeigneten Dosis verabreicht werden. Verabreichung der geeigneten Zusammensetzungen können über verschiedene Wege ausgeführt werden, z.B. durch orale, intravenöse, intraperitoneale, subkutane, intramuskuläre, topische oder intradermale Verabreichung. Das Dosierungsprotokoll wird durch den zuständigen Arzt und klinische Faktoren bestimmt werden. Wie auf den medizinischen Fachgebieten gut bekannt ist, hängen Dosierungen für jeden einzelnen Patienten von vielen Faktoren ab, einschließlich der Größe des Patienten, Gebiet der Körperoberfläche, Alter, der jeweiligen zu verabreichenden Verbindung, Geschlecht, Zeit und Art der Verabreichung, allgemeinen Gesundheitszustand, und anderer Arzneistoffe, die gleichzeitig verabreicht werden. Allgemein sollte das Dosierungsprotokoll als eine regelmäßige Verabreichung des Arzneimittels im Bereich von Einheiten von 1 μg bis 10 mg pro Tag erfolgen. Soll das Dosierungsprotokoll eine kontinuierliche Infusion sein, sollte die Dosis ebenfalls entsprechend im Bereich von Einheiten von 1 μg bis 10 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Minute liegen. Fortschritt kann durch periodische Untersuchung überwacht werden. Die Dosierungen werden variieren, eine bevorzugte Dosis für intravenöse Verabreichung von DNA beträgt von etwa 10⁶ bis 10¹² Kopien des DNA- Moleküls. Die Zusammensetzungen der Erfindung können lokal oder systemisch verabreicht werden. Die Verabreichung wird allgemein parenteral, z.B. intravenös sein; DNA kann auch direkt in den Zielort verabreicht werden, z.B. durch biolistische Lieferung an einen internen oder externen Zielort oder durch einen Katheter an einen Ort in einer Arterie.
Es wird mit der vorliegenden Erfindung ins Auge gefasst, dass die verschiedenen Polynucleotide und Vektoren der Erfindung entweder allein oder in Kombination unter Verwendung von Standardvektoren und/oder Gen-Auslieferungssystemen und gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch vertraglichen Träger oder Exzipienten verabreicht wird. Nach der Verabreichung können die betreffenden Polynucleotide oder Vektoren stabil in das Genom des Patienten integriert werden. Auf der anderen Seite können virale Vektoren verwendet werden, die spezifisch für bestimmte Zellen oder Gewebe sind, und in den betreffenden Zellen oder Geweben bestehen bleiben. Geeignete pharmazeutische Träger und Exzipienten sind, wie vorstehend erwähnt, auf dem Fachgebiet gut bekannt. Die gemäß der Erfindung hergestellten Arzneimittel können zur Vorbeugung oder zur Behandlung oder Verzögerung von verschiedenen Arten von Erkrankungen verwendet werden, die mit der unerwünschten (Über)Expression der vorstehend identifizierten Nucleinsäuremoleküle der Erfindung in Zusammenhang stehen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Arzneimittel Antisense-Oligodesoxynucleotide, wie zum Beispiel in Beispiel 5 beschrieben, die in der Lage sind, starke Expression zu regulieren, bevorzugt zu senken.
Darüber hinaus ist es möglich, ein Arzneimittel der Erfindung, das das Polynucleotid oder den Vektor der Erfindung enthält, in der Gentherapie zu verwenden. Geeignete Gen-Übertragungssysteme können Liposomen, Rezeptor-vermittelte Übertragungssysteme, nackte DNA und virale Vektoren, wie etwa unter anderen Herpesviren, Retroviren, Adenoviren und Adeno-assoziierte Viren einschließen. Gentherapie, die auf Einführung therapeutischer Gene beruht, zum Beispiel zur Impfung in Zellen durch ex-vivo- oder in-vivo-Techniken, ist eine der wichtigsten Anwendungen des Gentransfers. Geeignete Vektoren, Verfahren oder Gen-Übertragungssysteme für die in-vitro- oder in-vivo-Gentherapie sind in der Literatur beschrieben und Fachleuten auf dem Gebiet bekannt; vgl. z.B. Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534–539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911–919; Anderson, Science 256 (1992), 808–813; Isner, Lancet 348 (1996), 370–374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077–1086; Onodera, Blood 91 (1998), 30–36; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243–2251; Verma, Nature 389 (1997), 239–242; Anderson, Nature 392 (Supp. 1998), 25–30; Wang, Gene Therapy 4 (1997), 393–400; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714–716; WO 94/29469; WO 97/00957; US 5,580,859 ; US 5,589,466 ; US 4,394,448 oder Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635–640 und hierin zitierte Referenzen. Die Nucleinsäuremoleküle und Vektoren der Erfindung können zur direkten Übertragung in die Zelle oder Übertragung mittels Liposomen oder viraler Vektoren (z.B. adenoviral oder retroviral) hergestellt werden. Zusätzlich kann ein Baculovirus-System als eukaryontisches Expressionssystem für die Nucleinsäuremoleküle der Erfindung verwendet werden. Lieferung von Nucleinsäuren zur Gentherapie an eine spezifische Stelle im Körper kann ebenfalls durchgeführt werden, indem ein biolistisches System, wie etwa jenes, das von Williams (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 2726–2729) beschrieben wurde, verwendet wird.
Standardverfahren zur Transfizierung von Zellen mit rekombinanter DNA sind Fachleuten auf dem Gebiet der Molekularbiologie gut bekannt, vgl. z.B. WO 94/29469. Gentherapie kann durchgeführt werden, indem das rekombinante DNA-Molekül oder der Vektor der Erfindung einem Patienten direkt verabreicht wird oder indem Zellen mit den Polynucleotid oder Vektor der Erfindung ex vivo transfiziert werden, und die transfizierten Zellen dem Patienten mittels Infusion verabreicht werden. Darüber hinaus ist die Forschung, die sich mit Gentransfer in Keimzellen hinein befasst, eines der am schnellsten wachsenden Gebiete der Reproduktionsbiologie. Gentherapie, die darauf beruht, dass therapeutische Gene durch ex vivo- oder in vivo-Techniken in Zellen eingeführt werden, ist eine der wichtigsten Anwendungen des Gentransfers. Geeignete Vektoren und Verfahren zur in vitro- oder in vivo-Gentherapie sind in der Literatur beschrieben und Fachleuten des Gebietes bekannt; vgl. z.B. WO 94/29469; WO 97/00957 oder Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635–640) und vorstehend zitierte Referenzen. Die Polynucleotide und Vektoren, die in dem Arzneimittel der Erfindung enthalten sind, können für direkte Einführung in die Zelle oder für Einführung mittels Liposomen oder viraler Vektoren (z.B. Adenoviral, retroviral), die das betreffende rekombinante DNA-Molekül enthalten, hergestellt werden.
Es muss deutlich sein, dass die eingeführten Polynucleotide und Vektoren der Erfindung das (Poly-)Peptid der Erfindung nach der Einführung in der betreffenden Zelle exprimieren und bevorzugt während der Lebenszeit der betreffenden Zelle in diesem Status bleiben. Zum Beispiel können Zelllinien, die das Polynucleotid unter der Kontrolle von geeigneten Regulierungssequenzen stabil exprimieren, nach Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt sind, hergestellt werden. Statt Expressionvektoren, die virale Quellen für die Replikation enthalten, zu verwenden, können Wirtszellen mit dem Polynucleotid oder Vektor der Erfindung und einer selektierbaren Markierung transformiert werden, entweder auf dem selben oder auf verschiedenen Vektoren. Nach der Einführung fremder DNA kann man den gentechnisch behandelten Zellen gestatten, für 1–2 Tage in angereicherten Kulturmedien zu wachsen, bevor auf ein selektives Medium gewechselt wird. Die selektierbare Markierung im rekombinanten Plasmid zeigt Resistenz gegen die Selektion und erlaubt die Selektion von Zellen, die das Plasmid stabil in ihre Chromosomen eingebaut haben und Herde bilden, die wiederum cloniert und zu Zelllinien ausgeweitet werden können. Besonders nützlich sind solche gentechnisch behandelten Zelllinien für Durchmusterungsverfahren oder Verfahren zur Identifizierung eines Inhibitors des Polypeptids der vorliegenden Erfindung, wie nachstehend beschrieben.
Eine Reihe von Selektionssystemen kann verwendet werden, einschließlich, aber nicht hierauf begrenzt, der Thymindin-Kinase des Herpes simplex-Virus (Wigler, Cell 11(1977), 223), Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (Szybalska, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48 (1962), 2026) und Adenin-Phosphoribosyltransferase (Lowy, Cell 22 (1980), 817) in tk-, hgprt- oder aprt-Zellen. Auch Antimetabolit-Resistenz kann als die Basis für Selektion von dhfr verwendet werden, das Resistenz gegen Methotrexat verleiht (Wigler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 3567; O'Hare, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1527), gpt, das Resistenz gegen Mycophenolsäure verleiht (Mulligan, Proc. Natl. Acad Sci. USA 78 (1981), 2072), neo, das Resistenz gegen das Aminoglycosid G-418 verleiht (Colberre-Garapin, J. Mol. Biol. 150 (1981), 1), hygro, das Resistenz gegen Hygromycin verleiht (Santerre, Gene 30 (1984), 147), Shble, das Resistenz gegen Zeocin^® verleiht (Mulsant, Somat. Cell. Mol. Genet. 14 (1988), 243–252) oder Puromycin (pat, Puromycin-N-acetyltransferase). Zusätzlich selektierbare Gene sind beschrieben worden, zum Beispiel trpB, das Zellen gestattet, Indol an Stelle von Tryptophan zu verwenden; hisD, das Zellen gestattet, Histinol an Stelle von Histidin zu verwenden (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047); und ODC (Ornithin-Decarboxylase), welche Resistenz gegen den Ornithindecarboxylase-Inhibitor, 2-(Difluormethyl)-DL-ornithin, DFMO aufweist (McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Hrsg.). Zellen, die für die ex vivo-Gentherapie verwendet werden, sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Solche Zellen schließen zum Beispiel Krebszellen ein, die in Blut oder in einem Gewebe vorkommen.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein diagnostisches Mittel, das das Nucleinsäuremolekül der Erfindung, den Vektor der Erfindung, das Polypeptid der Erfindung und/oder den Antikörper der Erfindung umfasst.
Das diagnostische Mittel der Erfindung ist für den Nachweis des Beginns oder Fortschreitens von Erkrankungen nützlich, die die unerwünschte Expression oder Überexpression des Nucleinsäuremoleküls der Erfindung betreffen. Wie vorstehend hierin erläutert, stehen solche Erkrankungen im Zusammenhang mit oder werden verursacht durch eine erhöhte oder fortlaufende zelluläre Proliferation. Demzufolge kann das diagnostische Mittel der Erfindung dazu verwendet werden, den Beginn oder den Krankheitsstatus einer Krebserkrankung zu untersuchen. Auf diese Weise verfügt man über ein frühes Kriterium für Tumoraktivität, sodass geeignete Gegenmaßnahmen sofort eingeleitet werden können. Eine solche sofortige Aktion wird natürlich die Prognose für den Patienten signifikant verbessern. Diese Überlegungen gelten in gleicher Weise für die Diagnose von Metastasen und wiederkehrenden Tumoren.
Auf der anderen Seite sind möglicherweise nicht alle Tumore durch eine unerwünschte Expression oder Überexpression des Nucleinsäuremoleküls der Erfindung gekennzeichnet. Alternativ tritt die betreffende (Über)expession möglicherweise nur in bestimmten Stadien, wie etwa frühen Stadien, der Tumorentwicklung auf. Daher kann das diagnostische Mittel der Erfindung auch oder alternativ als ein Mittel zur Klassifizierung von Tumoren oder des Entwicklungsstatus eines Tumors eingesetzt werden. Natürlich sind diese oder die meisten der Anwendungen der Erfindung, die hier für Tumore beschrieben werden, auch auf andere Erkrankungen anwendbar, die mit der unerwünschten (Über)expression des Nucleinsäuremoleküls der Erfindung in Zusammenhang stehen oder von ihr verursacht werden.
Darüber hinaus könnte eine Erkrankung, wie sie in dieser Beschreibung angesprochen wird, auch durch eine Fehlfunktion des Polypeptids der vorliegenden Erfindung verursacht sein. Die betreffende Erkrankung könnte in Zusammenhang stehen mit oder verursacht werden durch zum Beispiel eine erhöhte oder reduzierte Gendosis des Polypeptids der vorliegenden Erfindung, eine erhöhte oder reduzierte Aktivität des betreffenden Polypeptids auf Grund z.B. von einer Modifikation in der primären Aminosäuresequenz im Vergleich zum entsprechenden Polypeptid des Wildtyps in einer Zelle oder einem Gewebe oder einem Verlust der Regulierung der Aktivität des betreffenden Polypeptids. Die betreffende Erkrankung kann darüber hinaus durch eine nicht korrekte Expression des Polypeptids während der Progression des Zellzyklus oder der Zellentwicklung verursacht werden. Zum Beispiel könnten mutierte Bindungsstellen für intrazelluläre oder extrazelluläre Verbindungen, z.B. Ionen oder sekundäre Botenstoffe oder Regulatorproteine, zu einer Fehlfunktion des Polypeptids der vorliegenden Erfindung führen, indem es etwa die Bindungseigenschaften für die betreffenden Verbindungen, die die Aktivität des betreffenden Polypeptids regulieren, verändert. Fehlfunktion könnte auch durch fehlerhafte Modifikationsstellen, zum Beispiel Phosphorylierungs- oder Glycosylierungsstellen, verursacht werden. Sie könnte auch durch nicht korrekte Spleißvorgänge und auf diese Weise durch Expression eines verkürzten oder verlängerten Polypeptids verursacht werden, zum Beispiel, wenn heag 1 an Stelle von heagh 2 oder umgekehrt exprimiert wird.
Daher könnte in einer weiteren Ausführungsform das vorstehend beschriebene diagnostische Mittel auch dazu verwendet werden, eine Fehlfunktion des Polypeptids der vorliegenden Erfindung nachzuweisen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Inhibitors der Expression des Nucleinsäuremoleküls der Erfindung oder eines Inhibitor der Funktion des Polypeptids der Erfindung für die Herstellung eines Arzneimittels zur Verhinderung oder Behandlung von Krebs, Psoriasis oder einer neurodegenerativen Krankheit, wobei der Inhibitor ein Antisense-Oligonucleotid ist, das mit dem Nucleinsäuremolekül der Erfindung, dem Antikörper der Erfindung oder einem Blocker offener Kanäle oder einem Histamin-Rezeptor-H1-Inhibitor, bevorzugt Astemizol oder Terfenadin, hybridisiert. In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung auch die Verwendung eines Inhibitors der Expression des Nucleinsäuremoleküls der Erfindung oder eines Inhibitors oder eines modifizierten Agens der Fehlfunktion des (Poly-)Peptids der vorliegenden Erfindung oder eines Nucleinsäuremoleküls, das heag codiert, oder eines Polypeptids, das heag-Aktivität besitzt für die Herstellung eines Arzneimittels zur Verhinderung oder Behandlung einer Krankheit, die durch die Fehlfunktion des Polypeptids der Erfindung verursacht wird, wobei die Krankheit Krebs, Psoriasis oder eine neurodegenerative Krankheit ist, wobei der Inhibitor ein Antisense-Oligonucleotid, der Antikörper der Erfindung oder ein Blocker offener Kanäle oder ein Histamin-Rezeptor-H1-Inhibitor, bevorzugt Astemizol oder Terfenadin, ist. Das Arzneimittel soll einem Säuger verabreicht werden, der von der betreffenden Krankheit betroffen ist oder bei dem der Verdacht besteht, empfänglich für die betreffenden Krankheit zu sein. Sowohl Verfahren zur Einführung eines heag-codierenden Nucleinsäuremoleküls der vorliegenden Erfindung in eine Zelle oder ein Lebewesen, d.h. zur Gentherapie, als auch Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren der Expression eines Nucleinsäuremoleküls der vorliegenden Erfindung werden innerhalb dieser Beschreibung gegeben. Darüber hinaus können Inhibitoren oder modifizierende Agenzien für die Fehlfunktion des Polypeptids der vorliegenden Erfindung mittels Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren des Polypeptids der vorliegenden Erfindung, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind (vgl. nachstehend) identifiziert werden. Zum Beispiel führen einige genetische Änderungen, die eine Fehlfunktion des Polypeptids der vorliegenden Erfindung verursachen, zu veränderten Konformationen im Protein. Mutierte Proteine könnten eine tertiäre Struktur besitzen, die sie in weit geringerem Maße in die Lage versetzen, den Ionentransport zu erleichtern. Wiederherstellung der normalen oder regulierten Konformation von mutierten Proteinen ist die eleganteste und spezifischste Weise, diese molekularen Defekte zu korrigieren. Pharmakologische Manipulationen können daher anstreben, die Wildtyp-Konformation des Proteins wieder herzustellen. Daher können die Polynucleotide und codierten Proteine der vorliegenden Erfindung auch dazu verwendet werden, Moleküle zu entwerten und/oder zu identifizieren, die in der Lage sind, bei einem Derivat des Polypeptids der vorliegenden Erfindung, das die betreffende Fehlfunktion aufweist, die Wildtyp-Funktion zu aktivieren.
Die Dosen und Wege zur Verabreichung für die Behandlung eines bedürftigen Patienten sind bereits vorstehend im Zusammenhang mit dem Arzneimittel der Erfindung diskutiert worden. Krankheiten, die unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, umschließen alle Krankheiten, die mit zellulärer Proliferation in Zusammenhang stehen. Bevorzugte Krankheiten, die in diese Kategorie fallen, sind Tumorerkrankungen, wie Krebs (Brustkrebs, Neuroblastom etc.) Psoriasis und degenerative Krankheiten, besonders jene des Nervensystems, wie Alzheimer-Erkrankung, Multiple Sklerose, amyotrophische Lateralsklerose und Parkinson-Erkrankung.
Der betreffende Inhibitor der Expression oder Überexpression des betreffenden Nucleinsäuremoleküls kann das Nucleinsäuremolekül der Erfindung sein, welches an das Nucleinsäuremolekül hybridisiert, das den Ionenkanal der Erfindung oder ein Fragment hiervon codiert. Zum Beispiel kann dieses Nucleinsäuremolekül ein Anitsense-Oligodesoxynucleotid (ODN) sein. Die Erfinder konnten zeigen, dass Behandlung mit Antisense-ODNs DNA-Synthese von mehreren Tumorzellen z.B. EFM-Zellen, SHSY-5Y-Zellen und HeLa-Zellen signifikant reduziert (Beispiel 5). Daher umfasst das Nucleinsäuremolekül in einer bevorzugten Ausführungsform Antisense-ODNs.
Wie vorstehend genannt, kann der Inhibitor der Polypeptidfunktion der Antikörper der Erfindung oder ein Arzneistoff sein. Der Arzneistoff kann der Histamin-Rezeptor-H1-Inhibitor sein. Bevorzugt hemmt der betreffende Arzneistoff aktives heag, agiert zum Beispiel als verwendungsabhängiger, vermutlicher Blocker offener Kanäle, bevorzugt ist der betreffende Arzneistoff Astemizol oder Terfenadin. Weitere geeignete Arzneistoffe können von Fachleuten auf dem Gebiet auf der Basis der Lehren aus der vorliegenden Erfindung entworfen oder identifiziert werden. Bevorzugt wird der Arzneistoff eine Affinität zum heag-Kanal im mM-Bereich aufweisen, noch bevorzugter im nM-Bereich oder darunter. Bevorzugt hat der Arzneistoff keine Auswirkungen auf andere Kanäle, zum Beispiel auf Herz-Kanäle.
Die Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zum Entwerfen eines Arzneistoffes für die Behandlung einer Krankheit, die durch unerwünschte Expression oder Überexpression des Nucleinsäuremoleküls der Erfindung verursacht wird, und umfasst:

(a) Identifizierung eines spezifischen und wirksamen Arzneistoffes;
(b) Identifizierung der Bindungsstelle des betreffenden Arzneistoffes durch Zielstellen-gerichtete Mutagenese und Studien chimärer Proteine;
(c) molekulare Modellierung sowohl der Bindungsstelle im (Poly-)Peptid als auch der Struktur des betreffenden Arzneistoffes; und
(d) Modifikationen des Arzneistoffes, um seine Bindungsspezifität für das (Poly-) Peptid zu verbessern.

Der hierin verwendete Ausdruck „spezifischer und wirksamer Arzneistoff" betrifft einen Arzneistoff, der wirksam und spezifisch die heag-Funktion blockiert.
Alle in den verschiedenen Schritten des Verfahrens der Erfindung eingesetzten Techniken sind herkömmlicher Art oder können von Fachleuten von herkömmlichen Techniken ohne weitere Umstände abgeleitet werden. Auf diese Weise können biologische Tests, die auf den hierin identifizierten Eigenschaften des Ionenkanals der Erfindung basieren, eingesetzt werden, um die Spezifität oder Wirksamkeit der Arzneistoffe zu untersuchen, während die Abnahme einer oder mehrerer Aktivitäten des Ionenkanals verwendet werden kann, um die betreffende Spezifität oder Wirksamkeit zu kontrollieren. Die Schritte (b) und (d) können nach herkömmlichen Protokollen durchgeführt werden, die zum Beispiel von K.L. Choi, C. Mossman, J. Aubé & G. Yellen, The International Quaternary Ammonium Receptor Site of Shaker Potassium Channels; Neuron 10, 533-541 (1993), C.-C. Shieh & G.E. Kirsch, Mutational Analysis of Ion Conduction and Drug Binding Sites in the Inner Mouth of Voltage-Gated K⁺-Channels, Biophys. J. 67, 2316–2325 (1994), oder C. Miller, The Charybdotoxin Family of K⁺-Channel-Blocking Peptide, Neuron 15, 5–10 (1995) beschrieben wurden.
Zum Beispiel kann die Identifizierung der Bindungsstelle des betreffenden Arzneistoffes durch Zielstellen-gerichtete Mutagenese und Studien chimärer Proteine durch Modifikationen in der Primärsequenz des (Poly-)Peptids, die die Affinität des Arzneistoffes beeinflussen, erreicht werden; dies erlaubt gewöhnlich, die Bindungstasche für den Arzneistoff genau zu kartieren.
In Bezug auf Schritt (c) kann man sich die folgenden Protokolle vorstellen: sobald die Effektor-Stelle für Arzneistoffe kartiert worden ist, können die einzelnen Reste, die mit verschiedenen Teilen des Arzneistoffes in Wechselwirkung treten, identifiziert werden, indem die Information, die aus Studien zur Mutagenese (Schritt (b)) und Computersimulationen der Struktur der Bindungsstelle kombiniert wird (seit kürzlich ein Kaliumkanal auf dem Fachgebiet kristallisiert worden ist, kann dies jetzt durch den Fachmann auf dem Gebiet ohne weiteren Aufwand durchgeführt werden), vorausgesetzt, dass die genaue dreidimensionale Struktur des Arzneistoffes bekannt ist (falls nicht, kann sie durch Computersimulation vorausgesagt werden). Falls der betreffende Arzneistoff selbst ein Peptid ist, kann es ebenfalls mutiert werden, um zu bestimmen, welche Reste mit anderen im heag-Molekül in Wechselwirkung treten.
Schließlich kann der Arzneistoff in Schritt (d) verändert werden, um seine Bindungsaffinität oder seine Wirksamkeit und Spezifität zu verbessern. Wenn es zum Beispiel elektrostatische Wechselwirkungen zwischen einem bestimmten Rest von heag und einer Region des Moleküls des Arzneistoffes gibt, kann die Gesamtladung in dieser Region verändert werden, um diese bestimmte Wechselwirkung zu verstärken; wenn jene Wechselwirkungen mit einer Region von heag auftreten, die nicht in anderen Kanalproteinen konserviert ist, ist es zusätzlich vorstellbar, dass, während andere Bindungsfaktoren geschwächt werden, eine Verstärkung dieser Wechselwirkung die Spezifität des Arzneistoffes verbessert.
Die Identifizierung von Bindungsstellen kann durch Computerprogramme unterstützt werden. So können geeignete Computerprogramme verwendet werden, um die interaktiven Stellen eines vermutlichen Inhibitors und dem Polypeptid der Erfindung durch Computer-gestützte Suche nach komplementären Strukturmotiven zu identifizieren (Fassina, Immunomethods 5 (1994), 114–120). Darüber hinaus sind geeignete Computersysteme zum Computer-unterstützten Entwurf von Proteinen und Peptiden auf dem Fachgebiet beschrieben worden, zum Beispiel von Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033–1036; Wodak, Ann. N. Y. Acad. Sci. 501 (1987), 1–13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987–5991. Modifikationen des Arzneistoffes können zum Beispiel durch Peptidomimetika hergestellt werden, und andere Inhibitoren können ebenfalls durch die Synthese von peptidomimetischen, kombinatorischen Bibliotheken durch sukzessive chemische Modifikation und Überprüfen der resultierenden Verbindungen identifiziert werden. Verfahren zur Erzeugung und Verwendung von peptidomimetischen kombinatorischen Bibliotheken sind auf dem Fachgebiet beschrieben worden, zum Beispiel von Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220–234 und Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709–715. Darüber hinaus kann die dreidimensionale und/oder kristallographische Struktur von Inhibitoren des Polypeptids der Erfindung für den Entwurf von peptidomimetischen Inhibitoren verwendet werden, z.B. in Kombination mit dem (Poly-)Peptid der Erfindung (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933–12944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545–1558).
Eine exemplarische Strategie zur Identifizierung eines spezifischen Inhibitors, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, wird in den anhängenden Beispielen gegeben.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Identifizierung eines Inhibitors der Expression der Nucleinsäure der Erfindung oder einer Funktion des (Poly-)Peptids der Erfindung, umfasst:

(a) Testen einer Verbindung auf die Hemmung oder Reduktion von Translation, wobei die betreffende Verbindung aus Antisense-Oligonucleotiden und Ribozymen ausgewählt ist; oder
(b) Testen einer Verbindung auf die Hemmung der Transkription, wobei die betreffende Verbindung an die Promotor-Region des Gens bindet, das das (Poly-)Peptid der Erfindung codiert, und zwar bevorzugt mit dem Transkriptionsfaktor entsprechenden Elementen hiervon; oder
(c) Testen von Peptiden oder Antikörpern, die im Verdacht stehen, die proliferative Aktivität des (Poly-)Peptids der Erfindung zu blockieren, auf die betreffende Blockierungsaktivität.

In Bezug auf vorstehend genannte Alternative (b) kann es vorteilhaft sein, zuerst die Promotor-Region zu charakterisieren und die dem Transkriptionsfaktor entsprechenden Sequenzen darin zu lokalisieren. Dann würde es möglich sein, den Promotor genetisch zu verändern, um ihn empfindlicher auf Repressoren und weniger empfindlich auf Verstärker zu machen. Im Bezug auf die Alternative (c) kann es vorteilhaft sein, zuerst den Teil oder die Teile des Ionenkanals der Erfindung zu lokalisieren, der an der Erzeugung der proliferativen Fehlfunktionen beteiligt ist. Verbindungen, die in einem der Testsysteme positiv waren, sind prima facie als Inhibitoren nützlich.
Peptidomimetika-, Phagen-Display-Techniken und Techniken kombinatorischer Bibliotheken sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und können von Fachleuten auf dem Gebiet ohne weiteren Aufwand für die Verbesserung des Arzneistoffes oder Inhibitors, der durch das hierin vorstehend genannte Basisverfahren identifiziert worden ist, eingesetzt werden.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Hemmung von Zellproliferation, das die Verwendung eines Inhibitors der Expression der Nucleinsäure der Erfindung oder des (Poly-)Peptids der Erfindung umfasst. Das Verfahren der Erfindung kann in vitro oder ex vivo durchgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Prognose einer Krebserkrankung und/oder neurodegenerativer Krankheiten und/oder Psoriasis, das die Bestimmung der Expression des betreffenden Nucleinsäuremoleküls der Erfindung oder die Bestimmung der quantitativen Präsenz des (Poly-)Peptids der Erfindung umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die betreffende Krebserkrankung ein Brustkrebs oder Neuroblastom, in einer noch weiter bevorzugten Ausführungsform ist die betreffende Krebserkrankung Brust-Adenokarzinom, Brustkarzinom duktalen Typs oder Gebärmutterhalskarzinom. In einer weiteren Ausführungsform sind die betreffenden neurodegenerativen Krankheiten Alzheimer-Erkrankung, Parkinson-Erkrankung, amyotrophe Lateralsklerose oder Multiple Sklerose.
Das Verfahren der Erfindung kann in vitro oder ex vivo durchgeführt werden. Geeignete Protokolle zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und umfassen im Hinblick auf in vitro-Techniken das Northern-Blot-Verfahren zur Bestimmung des mRNA-Spiegels oder die Analyse von Geweben durch mikroskopische Techniken, zum Beispiel unter Verwendung von Antikörpern, die das (Poly-)Peptid der Erfindung spezifisch erkennen. Eine oder mehrere dieser Techniken können mit Techniken kombiniert werden, die auf PCR beruhen, die auch oder in Kombination mit weiteren (herkömmlichen) Techniken für die vorstehend genannte Bestimmung verwendet werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorstehend genannten Verfahren der Erfindung ist der betreffende Säuger ein Mensch, eine Ratte oder eine Maus.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter die Verwendung des Nucleinsäuremoleküls der Erfindung für die Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung in der Gentherapie. Wie hierin vorstehend erklärt, kann Gentherapie entworfen werden, um Zellproliferation zu hemmen und auf diese Weise jede Krankheit in einer spezifischen Weise zu behandeln, die hiervon betroffen ist, wie etwa Krebserkrankung oder Psoriasis. Die Erfindung eröffnet besonders zwei voneinander unabhängige Linien zur Durchführung solcher Gentherapie-Protokolle:

(a) Mutagenese des Kanals zusammen mit chemischer Herstellung von H1-Antagonisten (bevorzugt Astemizol), um einen für menschliches eag spezifischen Arzneistoff zu erhalten;
(b) quantitative und qualitative Analyse der Expressionsspiegel von eag in Krebsgewebe, um ein diagnostisches und/oder prognostisches Verfahren zu entwerten. Dies würde auch den Entwurf von Gentherapien gegen spezifische Tumore erlauben.

Der Kit der Erfindung kann unter anderem in einer Reihe von vorstehend genannten diagnostischen Verfahren verwendet werden. Der Kit der Erfindung kann weitere Bestandteile enthalten, wie etwa Selektionsmarker und Komponenten für selektive Medien, die zur Erzeugung von transformierten Wirtszellen und transgenen Pflanzenzellen, Pflanzengewebe oder Pflanzen geeignet sind. Darüber hinaus kann der Kit Pufferlösungen und Substrate für Reportergene enthalten, die in dem rekombinanten Gen oder Vektor der Erfindung vorhanden sein können. Der Kit der Erfindung kann vorteilhaft verwendet werden, um das Verfahren der Erfindung durchzuführen und kann unter anderem in einer Reihe von hierin genannten Anwendungen eingesetzt werden, z.B. im diagnostischen Bereich oder als Werkzeug zur Forschung. Die Teile des Kits der Erfindung können individuell in Ampullen oder in Kombination in Packungs- oder Mehrfachpackungseinheiten abgepackt werden. Die Herstellung des Kits folgt bevorzugt Standardverfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind.
Die Figuren zeigen:
1. Proliferation von Wildtyp- (Kreise) und reag-exprimierenden CHO-Zellen als eine Funktion der Zeit. Die Zellen wurden auf Platten mit 96 Vertiefungen plattiert, und zu den angegebenen Zeitpunkten wurde das Tetrazoliumsalz MTT⁶ (50 μg/ml) zu den Platten zugegeben. Nach vier Stunden Inkubation in feuchter Atmosphäre (37°C, 5% CO₂) wurde die Reaktion durch Zugabe von 2 Volumenteilen 10% SDS in 1 M HCl gestoppt. Die in lebenden Zellen gebildeten blauen Formazan-Kristalle wurden über Nacht solubilisiert, und die resultierende Farbe wurde als optische Dichte bei der angegebenen Wellenlänge gemessen. Mögliche nicht-spezifische Auswirkungen der Transfektion auf die Zellproliferation können vernachlässigt werden, da a) die Ergebnisse in drei unabhängigen Zelllinien von verschiedenen Arten (Ratte, Hamster und Mensch) vergleichbar waren; b) Transfektion mit verschiedenen unabhängigen Clonen die gleichen Ergebnisse lieferten und c) Transfektion mit einem anderen Kaliumkanal (Kv1.4) in dem gleichen Vektor (daher mit der Tendenz, an der gleichen Stelle zu rekombinieren) Ergebnisse brachte, die mit WT vergleichbar waren und die Auswirkungen der reag-Transfektion nicht reproduzierte.
2. Proliferation von Wildtyp- (Kreise) und reag-exprimierenden (Dreiecke) CHO-Zellen in Anwesenheit von 0,5% FCS. Die Serumkonzentration ist nicht in der Lage, Wachstum von normalen Zellen aufrechtzuerhalten, aber transfizierte Zellen vollenden nahezu drei Zyklen. Verfahren wir bei 1.
3. DNA-Synthese in CHO-Zellen, die unterschiedliche Kaliumkanäle exprimieren, in Anwesenheit von normalen (10%) oder niedrigen (0,5%) Konzentrationen von FCS. In Kontrollzellen, WT- oder mit Kv1.4 transfizierten Zellen, sinken die Spiegel der DNA-Synthese signifikant in Anwesenheit von geringer Serumkonzentration, reag-exprimierende Zellen hingegen behalten die gleichen Replikationsspiegel wie bei hohen Serumkonzentrationen.
4. (A) Fotografien von Platten mit Wildtyp-, Kv1.4-transfizierten oder reag-transfizierten NIH-3T3-Zellen. Die Zellen wurden in geringer Dichte ausgesät, und man ließ sie unter Standardbedingungen wachsen, bis die Zellen des Wildtyps den Konfluenzzustand erreicht hatten. Die Zellen wurden dann mit Methanol fixiert und mit Giemsa-Blau angefärbt. Unter diesen Bedingungen wuchsen sowohl Wildtyp- als auch Kv1.4-exprimierende Zellen in einer einzelligen Schicht, reag-exprimierende Zellen hingegen bildeten Zellhaufen.
(B) Bildung von Zellhaufen der reag-transfizierten NIH3T3-Zellen im Vergleich zu Zellen, die mit rKv1.4 transfiziert waren und zu Zellen des Wildtyps (nicht dargestellt). Vorübergehende Transfektion wurde unter Verwendung von Calciumphosphat durchgeführt (33). Die Zellen wurden in reichem Kulturmedium gehalten, bis Kontrollzellen Konfluenz erreicht hatten, dann mit Methanol fixiert und mit Giemsa-Blau angefärbt.
5. Durch Depolarisation ausgelöste Ströme in MCF-7-Zellen unter Spannungsklemmen-Bedingungen. Die linken Aufzeichnungen sind Ströme der ganzen Zelle, die rechten Aufzeichnungen wurden in einem ausgeschnittenen Außenseite-außen-Abgriff erhalten. Sowohl die makroskopischen Ströme als auch die I-V-Beziehungen (C und D) erinnern an reag-Ströme.
6. Aktivität eines Einzelkanals in einem Außenseite-außen Membranstück-Spannungsabgriff bei 0 mV, in Anwesenheit oder in Abwesenheit von 5 μM Astemizol. Die Pipettenlösung enthielt 140 mM KCl, 10 mM BAPTA, 10 mM HEPES, pH 7,2; die Badelösung enthielt 140 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 2,5 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,2.
7A DNA-Synthese in MCF-7-Zellen unter verschiedenen eag-Blockern. B. Spiegel der DNA-Synthese bei HEK293-Zellen in Anwesenheit von Astemizol, Glibenclamid und Terfenadin.
8. Dosis-Antwort-Kurve für die Wirkung von zwei H1-Antagonisten auf DNA-Synthese in MCF-7-Zellen (IC50 7 und 10 mM für LY 91241 beziehungsweise Astemizol).
9. Fluoreszenzabbildungen von Kontrollen (unbehandelt, A) und mit Astemizol behandelten (B) MCF-7-Zellen, angefärbt mit Hoechst 33342-Farbstoff. Beachte in B die kleinere Oberfläche der Kerne und eine wesentlich geringere Zelldichte (auf Grund von Zelltod).
10. Nucleotidsequenz menschlicher eag-cDNA aus menschlichem Gehirn im Vergleich zu den Sequenzen von Ratte und Rind. Jene Positionen, die in einer der Sequenzen ein unterschiedliches Nucleotid aufweisen, sind schattiert.
11. Aminosäuresequenzen beider Spleißvarianten, erhalten aus menschlicher eag-cDNA-Translation, im Vergleich zu den entsprechenden Sequenzen von Rind, Maus und Ratte. Die schwarzen Kästchen kennzeichnen einen unterschiedlichen Rest in einer der Sequenzen.
12. RT-PCR der Gesamt-RNA aus menschlichem Gehirn, menschlicher Brustdrüse und MCF-7-Zellen. Die Amplikation erzeugte zwei spezifische Fragmente, die den erwarteten Größen für heag 1 und 2 im Gehirn entsprachen und die Bande, die heag 1 in MCF-7-Zellen entsprach, während keine Amplifikation in normaler Brust-RNA nachgewiesen wurde.
13. Spannungsabhängigkeit der Aktivierung bei hohem extrazellulärem Kalium, Zwei-Elektroden-Spannungsabgrift: In dem Leitfähigkeits-Spannungs-Auftrag ist die Spannung für Halbaktivierung im heag-Kanal in Bezug zum reag-Kanal um 40 mV nach rechts versetzt.
14. Koloniebildung von NIH-3T3-Zellen, die mit den angegebenen DNAs transfiziert worden waren, in halbfestem Kulturmedium. Die Zellen wurden in regulärem Kulturmedium, das 0,3% Agar enthielt, auf eine Schicht aus 0,55% Agar-Kulturmedium plattiert. Kolonien, die größer als 0,1 mm im Durchmesser waren, wurden 14 Tage nach der Transfektion bewertet. Die durchschnittliche Anzahl von Kolonien in mindestens 10 ausgezählten mikroskopischen Feldern wird pro μg bei der Transfektion verwendeter DNA ausgedrückt (mit Ausnahme der Zeilen „Transfektionspufferlösung" und „keine Behandlung", bei denen die Zahlen absolute Werte sind). reag und Kv1.4 wurden unter Verwendung von entweder pcDNA3 oder pTracer-CMV-Vektoren transfiziert.
15. (A) Southern-Blot-Analyse von RT-PCR-Produkten von RNAs aus verschiedenen menschlichen Geweben und 293-Zellen. Signale vom Transferrin-Rezeptor (TFR) werden am unteren Rand dargestellt. (B) Southern-Blot-Analyse von RT-PCR-Produkten von Gesamt-RNAs aus verschiedenen menschlichen Zelllinien und Brustdrüsen-Epithelzellen in Primärkultur (Epith.-Zellen). TRF-Signale werden am unteren Rand dargestellt.
16. (A) Behandlung von heag-exprimierenden Tumorzelllinien mit Antisense-ODNs. (B) heag-Strom in SHSY-5Y-Neuroblastomzellen. (C) Stromdichte in SHSY-5Y-Zellen, behandelt mit Antisense-ODNs. (D) Hemmung von DNA-Synthese in menschlichen Krebszellen (EFM-19, HeLa und SHSY-5Y durch Antisense-ODNs, die gegen heag gerichtet sind.
17. (A) Subkutane Implantation von CHOhEAG-Zellen induzierte aggressive Tumoren, die schnell wuchsen und bald die Haut der Trägermaus durchbrachen. Die Fotografie wurde in der dritten Woche nach Implantation von 2 × 10⁶ Zellen aufgenommen. (B, C) Die durchschnittliche Masse von CHOhEAG-Tumoren war signifikant größer als die von den CHOKv-Tumoren, beide zwei Wochen (B; Mittelwert ± S.E.M.; p = 0,002) oder drei Wochen nach Implantation (C; Mittelwert ± S.E.M.; p = 0,03). (D) CHOhEAG- und (E) CHOKv-Tumore fotografiert in situ. Die wesentlichen makroskopischen Unterschiede bestehen in der dunkleren Farbe und der Fixierung des CHOhEAG-Tumors auf der Haut. (F, G) CHOhEAG- (F) und CHOKv- (G) Tumore wurden aufgeschnitten, um das große Ausmaß der Nekrose (Pfeilspitzen) in ersterem zu zeigen. (H, I) Der größere Grad an Nekrose und die Fixierung auf der Haut sind nach Paraffineinbettung und Anfärbung mit Hämatoxylin-Eosin auch mikroskopisch sichtbar. Die Histologie ist in beiden Mikrographen vergleichbar, aber in (H) wird eine viel größerer nekrotischer Bereich beobachtet (Pfeilspitzen), und es gibt keine Grenze zwischen dem subkutanen Fett und dem Tumor. (Maßstab: 100 μm). (J) Als eine quantitative Messung für diese Abbildungen war die durchschnittliche Breite des vitalen Bereichs in CHOKV-Tumoren signifikant größer als jene von CHOhEAG-Tumoren (Mittelwert ± S.E.M.; p < 0,0005).
18. Untersuchungen zur Proliferation von rEAG-transfizierten CHO-Zellen (A–C). Wachstumskurven von CHO-Zellen, die mit rEAG (Kreise) transfiziert waren, im Vergleich zu ursprünglichen Zellen (Dreiecke) in 10% (ausgefüllte Symbole) oder 0,5% (offene Symbole) fötalem Kälberserum. Die Werte werden auf jene bezogen, die nach 12 Stunden in Kultur gemessen worden sind (Zeitpunkt 0 in der Grafik) und stellen den Mittelwert ± S.E.M. von acht Vertiefungen auf der gleichen Platte dar. Zelllinien wurden mittels Selektion durch die in dem pcDNA3-Vektor codierte G-418-Resistenz aufgebaut. MTT-Hydrolyse (22) wurde verwendet, um metabolische Aktivität lebensfähiger Zellen zu messen. Das Serum wurde vorsichtig 12 Stunden nach der Plattierung verdünnt. (B) Anstieg der Aktivität während der ersten 12 Stunden nach Entfernung der S-Phasen-Blockierung. Zur Zellsynchronisation wurde dem Kulturmedium 2 mM Thymidin über 12 Stunden zugegeben. Thymidin wurde für weitere 12 Stunden aus dem Medium entfernt und dann wurde ein zweiter Arretierungsimpuls für 12 Stunden gegeben. Die Zellen wurden dann trypsinisiert und zur Bestimmung der metabolischen Aktivität und DNA-Synthese plattiert. (C) BrdU-Einlagerung' während der ersten 12 Stunden nach Entfernung der S-Phasen-Blockierung über 12 h Inkubation in 10% FCS oder in Anwesenheit von 0,5% FCS (24 h Inkubation). BrdU-Einlagerung wurde unter Verwendung des „BrdU labeling and detection kit" von Boehringer-Mannheim nach Angaben des Herstellers gemessen. Die Balken stellen den Mittelwert ± S.D. für CHO-Zellen des Wildtyps (offene Balken), Kv1.4-transfizierte (schattierte Balken) und eag-transfizierte (gefüllte Balken) Zellen dar. Die Einlagerung von BrdU wird als optische Dichte bei 405 nm (Referenz 490 nm) quantifiziert, hergestellt auf ABTS^TM-Substrat durch an den anti-BrdU-Antikörper gebundene Peroxidase.
Die Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
Beispiel 1: Clonierung des K⁺-Ionenkanals
mRNA wurde aus Gesamt-RNA gereinigt, die aus MCF-7-Zellen nach Standardverfahren gewonnen wurde. Dann wurde durch reverse Transkription mit Superscript II reverser Transkriptase cDNA hergestellt; diese cDNA wurde als eine Matrize für PCR-Amplifikation verwendet, wobei degenerierte Oligonucleotide verwendet wurden, die so entworfen worden waren, dass sie an stark konservierte eag-Sequenzen passen. Nach der Amplifikation wurde ein Sacll/Sacll-Fragment vom eag der Ratte als Sonde für die Southern-Blot-Analyse der Ergebnisse verwendet. Jene Banden, die positive Hybridisierung zeigten, wurden anschließend in den pGEM-T-Vektor (Promega) cloniert und sequenziert. Sie alle zeigten Sequenzen, die mit HERG in Einklang standen.
Dann wurden spezifische Oligonucleotide unter Berücksichtigung von Ratten-, Maus- und Rind-eag erzeugt, um Amplifikation von HERG-cDNA zu vermeiden. Wir suchten nach Sequenzen, die eine hohe Homologie zwischen den verschiedenen eag-Clonen aufwiesen, aber maximale Divergenz mit der HERG-Sequenz hatten.
Die Sequenzen der Oligonucleotide waren wie folgt:
5'-CAGAA(T,C)AA(T,C)GTGGC(A,C,T,G,)TGGCT
5'-TCACT(G,A)AAGATCTATA(A,G)TC
Nach PCR-Amplifikation wurde die Bande mit der erwarteten Größe in pGEMT cloniert und sequenziert. Die erhaltene Sequenz zeigte hohe Homologie zu eag der Ratte (Nucleotide 942–1108).
Diese Bande wurde markiert und als Sonde verwendet, um eine cDNA-Bibliothek aus Brustdrüsengewebe zu durchmustern. Nach Durchmusterung von 2 × 10⁶ Phagen sind keine positiven Clone gefunden worden.
Wir verwendeten dann spezifische Oligonucleotide, um mittels PCR cDNA aus menschlichem Herz und menschlichen Gehirn (erhalten aus vollständiger RNA, bezogen von Clontech) zu analysieren. Zwei PCR-Produkte aus dem Gehirn wurden sequenziert, und die Sequenz entsprach zwei alternativ gespleißten Varianten von eag. Um darüber hinaus die Möglichkeit der Clonierung des Moleküls aus dem menschlichen Gehirn in voller Länge zu untersuchen, führten wir PCR-Analysen einer menschlichen cDNA-Bibliothek durch und verglichen dieses Ergebnis mit dem gleichen Experiment mit der Bibliothek aus der menschlichen Brustdrüse (beide von Clontech). Lediglich die Bibliothek aus dem Gehirn zeigte positive Ergebnisse.
Im Anschluss wurde das amplifizierte Fragment verwendet, um die Bibliothek aus dem menschlichen Gehirn (2 Durchgänge, 10⁶ Phagen) zu durchmustern, und mehrere Clone, die in den pBSK-Vektor cloniert wurden, wurden gefunden und sequenziert. Sie stimmten alle mit dem zentralen Teil des Moleküls überein, jedoch die 5'- und 3'-Enden fehlten ihnen. Der längste dieser positiven Clone wurde verwendet, um eine Sonde herzustellen und die Bibliothek erneut zu durchmustern (wieder zwei Runden, 2 × 10⁶ Clone).
Die in diesem Fall erhaltenen Sequenzen stimmten mit einem Teil der Codierungssequenz (etwa 400 Bp vom 5'-Ende bis zum Initiationscodon fehlten) und einer langen, nicht translatierten Sequenz überein. Weil das Fragment in der Nähe des 5'-Endes des Moleküls in allen Fällen mit einer EcoRl-Bindungsstelle begann, wurde vermutet, dass die Bindungsstelle ursprünglich in der heag-Sequenz vorhanden war, und dass sie bei der Subclonierung der Fragmente in Vektoren zur Sequenzierung verloren gegangen war.
Um die Sequenz in voller Länge zu erhalten, gaben wir jene Phagen zusammen, die die Fragmente aus der Nähe des 5'-Endes trugen, und analysierten sie durch PCR-Amplifikation unter Verwendung der Sequenz, die auf der 3'-Seite der genannten EcoRl-Bindungsstelle lag, und einer Sequenz von λ-gt10 als Primer für die PCR. Nach anschließender Fraktionierung der Pools wurden zwei Phagen erhalten, die das 5'-Ende der Codierungssequenz trugen, und eine von ihnen enthielt einen Teil der nicht translatierten Region des 5'-Endes.
Sobald wir die vollständige Sequenz kannten, stellten wir den vollständigen Clon von zwei Phagen ausgehend zusammen, einer enthielt die 3'-UTR und den größten Teil der Codierungssequenz, und der andere enthielt das 5'-Ende. Das erste Fragment wurde aus dem Phagen durch Spaltung mit SphI/HindIII extrahiert und in pBKS subcloniert, um pBKSheag 1 zu erzeugen. Hierbei wurde ein 1,2 kBp großes SphI-SphI-Fragment gleichfalls vom Clon entfernt, und es war notwendig, es nachträglich wieder einzusetzen. Das Fragment, das das 5'-Ende enthielt, wurde durch Spaltung mit HindIII/MunI extrahiert. Dieses Fragment wurde mit einem Spaltprodukt von pBKSheag 1 mit HindII/MunI ligiert. Unter Verwendung von nur diesem Verfahren waren wir in der Lage, den Clon in vollständiger Länge in einem einzigen Plasmid zu erhalten. Es war dann notwendig, das Sphl-Sphl-Fragment wieder einzusetzen, da wir eine der SphI-Stellen deletiert hatten. Im Anschluss wurde ein EagI/NotI-Fragment in die NotI-Stelle des pCDNA3-Vektors subcloniert, um die verunreinigenden Phagen-Sequenzen zu eliminieren und um einen Vektor zu erhalten, der für die funktionelle Expression des Kanals geeignet ist. Die schließlich erhaltenen Sequenzen sind im Sequenzprotokoll als SEO ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 dargestellt.
Beispiel 2: Identifizierung von Inhibitoren, die spezifisch die Aktivität von menschlichem eag blockieren.
Ein anderes Mitglied der eag-Familie, HERG (11–16), ist mit einer bekannten Form des langen QT-Syndroms (LQT) in Verbindung gebracht worden. Dies gestattete, mehrere HERG-Blocker auf der Basis ihrer Fähigkeit, Arrythmien des LQT-Typs auszulösen, zu identifizieren. Daher sind sowohl bestimmte Blocker des Histamin H1-Rezeptors, wie etwa Astemizol und Terfenadin, als auch anti-arrythmische Arzneistoffe der Klasse III (Dofetilid, E-4031) wirksame und spezifische HERG-Blocker (15, 17). Für eag-Kanäle sind spezifische Blocker jedoch noch nicht beschrieben worden. Auf Grund der Ähnlichkeit der Sequenzen von HERG- und eag-Kanälen wurden beide Arzneistoffgruppen für reag im Einklang mit der vorliegenden Erfindung geprüft. Die H1-Blocker beeinträchtigen auch reag, hingegen ist der Kanal für Antiarrythmika (Dofetilid) ziemlich unempfindlich. Dies bietet ein hilfreiches Instrument, selektiv Kanäle des eag-Typs zu blockieren und mögliche Auswirkungen auf HERG-Kanäle (die in MCF-7-Zellen ebenfalls anwesend sind) auszuschließen. Die Wirkung einer dieser Arzneistoffe (Astemizol 5 μM) auf einzelne mutmaßliche menschliche eag-Kanäle wird in 6 dargestellt.
Es wurde darüber hinaus untersucht, ob einige reag- und andere Kaliumkanal-Blocker in der Lage sind, das Wachstum von MCF-7-Zellen zu hemmen. Als eine „positive" Kontrolle wurde Glibenclamid, ein Blocker des ATP-sensitiven Kaliumkanals, ebenfalls eingeschlossen, da seine hemmende Wirkung auf die Proliferation dieser Zellline beschrieben worden ist (2). Um die Rate der DNA-Synthese zu bestimmen, wurden die Zellen auf Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit einer Dichte von ~10⁵ Zellen/ml und in Abwesenheit von Wachstumsfaktoren plattiert. Nach 24-stündiger Hungerperiode wurden die Zellen durch Zugabe von 10% FCS in Anwesenheit von BrdU stimuliert. Die Menge an in die neu synthetisierte DNA eingelagertem BrdU wurde unter Verwendung eines kommerziellen Antikörpers (Boehringer, Mannheim) bestimmt. Die untersuchten Arzneistoffe wurden entweder zur gleichen Zeit oder 12 Stunden vor der Stimulation zugegeben. In einer anderen menschlichen Zelllinie, HEK293, wurde die DNA-Synthese durch die Zugabe von Astemizol oder 100 μM Glibenclamid nicht signifikant reduziert, während Terfenadin (10 μM) eine starke Hemmung verursachte. Aus diesem Grund wurden nur die Wirkungen von Astemizol (und seinem eng verwandten Analogon LY91241) berücksichtigt und jene, die von Terfenadin erzeugt wurden, verworfen (obwohl MCF-7-Zellen signifikant empfindlicher auf Wachstumshemmung durch Terfenadin als die Kontrollzellen sind). In MCF-7-Zellen reduzierten 5 μM Astemizol die DNA-Synthese um 40%, während die selbe Konzentration des HERG-spezifischen Blockers Dofetilid keine signifikanten Wirkungen erzeugte. Zehnmal höhere Konzentrationen (50 μM) anderer Kaliumkanal-Blocker (Chinidin und Glibenclamid) waren erforderlich, um eine ähnliche Wirkung hervorzurufen. Eine Dosis-Antwort-Kurve für die Wirkungen von Astemizol auf die DNA-Synthese in MCF-7-Zellen wird in 8 dargestellt. Die halbmaximale Wirkung wurde mit 10 μM Astemiziol erhalten.
In einem Versuch, den Mechanismus aufzuklären, der der Hemmung der Proliferation in MCF-7-Zellen zu Grunde liegt, wurde die Kern-Morphologie von Zellen, die mit 5 μM Astemizol behandelt worden waren, unter Verwendung des supravitalen Kernfarbstoffs Hoechst 33342 untersucht. Nach 24-stündiger Behandlung zeigten die meisten Zellen Kondensation und Fragmentierung des Kerns, typische Erscheinungen für den apoptotischen Zelltod (9).
Daraus folgt, dass menschliche Gegenstücke zu den reag-Kanälen in menschlichen Krebszellen vorhanden sind, und dass sie die Fähigkeit haben, maligne Transformation in mehreren verschiedenen Zelltypen auszulösen.
Beispiel 3: Expression von heag in verschiedenen menschlichen Geweben
500 ng Gesamt-RNA aus verschiedenen menschlichen Geweben (oder 5 ng polyA⁺-RNA für Rückenmark) wurden revers transkribiert und amplifiziert, indem ein Oligonucleotid-Paar mit den Sequenzen
5'-CGCATGAACTACCTGAAGACG (vorwärts) und
5'-TCTGTGGATGGGGCGATGTTC (revers) verwendet wurden. Die amplifizierte DNA wurde mit dem Southern-Blot-Verfahren unter Verwendung einer spezifischen menschlichen eag-Sonde (ein 1,5 kB großes EcoRI-Fragment aus dem Kern des Kanals) analysiert. Von den untersuchten RNAs ergab nur Gesamt-RNA aus dem Gehirn positive Signale. RNAs aus Rückenmark, Nebenniere, Skelettmuskel, Herz, Luftröhre, Leber, Niere und Brustdrüse waren negativ. Die Unversehrtheit der RNA wurde durch Transferrin-Amplifikation überprüft. Unter Verwendung des gleichen Ansatzes wurde die Expression von heag in verschiedenen tumorösen menschlichen Zelllinen überprüft, in: MCF-7 (Brust-Adenokarzinom), BT-474 (Brust-Duktalkarzinom, aus einem soliden Tumor), EFM-19 (Brustkarzinom, duktaler Typ, aus Pleuralflüssigkeit) COLO-824 (Brustkarzinom, aus Pleuralflüssigkeit), SHSY5Y (Neuroblastom).
Im Gegensatz zu normalen Geweben war der Befund für alle untersuchten Krebs-Zelllinien für die heag-Expression positiv.
Darüber hinaus zeigte die Southern-Blot-Analyse von RT-PCR-Produkten von RNAs aus unterschiedlichen menschlichen Geweben und 293-Zellen, dass nur in RNA vom Gehirn die beiden zu heag A und B gehörenden Banden amplifiziert und identifiziert werden konnten. Signale des Transferrin-Rezeptors (TFR) sind am unteren Rand dargestellt (15A). Darüber hinaus eine Southern-Blot-Analyse von RT-PCR-Produkten von Gesamt-RNAs aus verschiedenen menschlichen Zelllinien und Brustdrüsen-Epithelzellen in Primärkultur (Epith. Zellen). TFR-Signale sind am unteren Rand dargestellt. RNAs aus unterschiedlichen Zelllinien (34) und kommerzielle RNAs aus menschlichen Geweben (Clontech) wurden der Einzelröhrchen-RT-PCR unterworfen (35). Mit Ausnahme des Rückenmarks, für das Poly(A)⁺-RNA verwendet wurde, wurde vollständige RNA verwendet. (Primer Sequenzen waren: vorwärts: 5'-CGCATGAACTACTGAAGACG und revers:
5'-TCTGTGGATGGGGCGATGTTC. 5,-TCAGCCCAGCAGAAGCATTAT und revers:
5'-CTGGCAGCGTGTGAGAGC wurden verwendet, um RNA und PCR-Ablauf zu kontrollieren). Spezifische Primer wurden für TFR verwendet, um RNA und PCR-Ablauf zu kontrollieren. Diese ODNs wurden entsprechend der veröffentlichten TFR-Sequenz (36) entworfen, beginnend bei Exon 11 und bis zu Exon 19 reichend (37). Dies, zusammen mit der Amplifikation von zwei Spleiß-Fragmenten von heag und Kontrollen in Abwesenheit von reverser Transkriptase, schließt ein falsch positives Produkt aufgrund von Verunreinigung durch genomische DNA aus. 50 μl (heag) oder 15 μl (TFR) der PCR-Reaktionen wurden auf 2% Agarose-Gelen analysiert. DNA wurde auf Membranen transferiert und nachfolgend mit hoher Stringenz mit [³²P]-dCTP-markierten Zufalls-Sonden hybridisiert, die aus einem 980 Bp umfassenden heag-Fragment und dem TFR-Fragment, amplifizert aus Gehirn-RNA, bestanden.
Beispiel 4: Expresion von heag in vivo
Um zu bestimmen, ob die Expression von heag für Tumorzellen in vivo von Vorteil ist, setzten die Erfinder Implantate von CHO-Zellen, die den Kanal (CHOhEAG-Zellen) exprimierten, subkutan in die Flanken von weiblichen scid (severe combined immunodeficiency, schwere kombinierte Abwehrschwäche,33) -Mäusen ein. CHOKv-Zellen wurden als eine Kontrolle verwendet. Dazu wurden 2 × 10⁶ CHOhEAG- oder CHO-Kv-1.4-Zellen, suspendiert in 100 μl PBS, subkutan in die Flanke von 6–8 Wochen alten weiblichen Fox-Chase-scid-Mäusen (C.B-17/Icr sicd/scid) implantiert, die aus Bomholtgard, Ry, Dänemark bezogen wurden. Die Anwesenheit von Tumoren wurde jeden zweiten Tag durch Tastuntersuchung jeder Maus überprüft. Nach zwei oder drei Wochen wurden die Tiere durch Genickbruch getötet und die Tumore entnommen und für den anschließenden Einschluss in Paraffin und Anfärbung in Paraformaldehyd fixiert. Die Identität der CHOhEAG-Zellen wurde durch UV-Bestrahlung der Tumoren nachgewiesen, um Fluoreszenz des grünen Fluoreszenzproteins, das im pTracer-Vektor (Invitrogen) codiert war, anzuregen. Eine Woche nach der Implantation trugen alle mit CHOhEAG injizierten Mäuse Tumore, die tastbar waren, während keine Masse größer als 1 mm bei den Kontrollen beobachtet wurde. Während der zweiten Woche nach der Implantation erreichten die heag exprimierenden Tumore maximal 5 mm im Durchmesser und durchdrangen in den meisten Fällen die Haut sichtbar (17A); die Mäuse wurden nach zwei (N=6) oder drei Wochen (N=7) getötet. Nur eine der 11 verwendeten Kontrollmäuse war frei von sichtbaren Tumoren; alle 13 mit CHOhEAG injizierten Tiere zeigten Tumore. Die mittlere Masse (17B, 17C) der heag exprimierenden Tumoren war signifikant größer als die der Kontrollen, besonders zwei Wochen nach der Implantation (17B). Bei makroskopischer Beobachtung hatten die Tumore eine bröckelige und hämorrhagische Beschaffenheit; die CHOhEAG-Tumore waren dunkler als die Kontrollen und hafteten nach zwei Wochen bei allen mit CHOhEAG injizierten Mäusen an der Haut (17D, 17E). Sechs von sieben Mäusen zeigten nach drei Wochen ähnliche Merkmale. Im Gegensatz dazu konnte der Tumor bei allen Kontrollmäusen nach zwei Wochen leicht von der Haut entfernt werden, und bei fünf von sechs Mäusen nach drei Wochen. Das Gewebe unterhalb des Tumors erschien in allen Fällen nicht betroffen. Die dunkle Farbe war auf das große Ausmaß intratumoraler Nekrose (17F, 17G, Pfeile), bestätigt durch die Histologie (17H, 17I, Pfeilspitzen) zurückzuführen, was auf ein schnelleres Wachstum der CHOhEAG-Tumore hinwies. Die Dicke des vitalen Bereichs in den EAG exprimierenden Tumoren war signifikant geringer als in den Kontrollen (17J). Das schnelle Wachstum des Tumors kann für die massive intratumorale Nekrose in der CHOhEAG-Gruppe verantwortlich gemacht werden. Dies könnte auch den verstärkten Unterschied, der zwischen den Massen der Tumore zwei Wochen nach der Implantation beobachtet wurde, erklären, da CHOhEAG-Tumore aufgrund massiver Nekrose das Wachstum einstellen könnten. Diese Daten lassen stark vermuten, dass mit Expression von heag Tumore schneller wachsen und aggressiver sind als CHOKv-Tumore.
Beispiel 5: Hemmung von heag
Es wird angenommen, dass die Expression von heag in einigen Tumorzellen nicht die Folge ihres abnormalen Wachstums ist, aber das dieser K⁺-Kanal notwendig für ihre Proliferation ist. Daher sollte die Hemmung von heag-Expression mit Antisense-Oligodesoxynucleotiden (ODNs) die Proliferationsrate in diesen Tumorzellen senken. Daher wurde ein 19-mer-Antisense-Phosphorthioat-ODN (5'-CAGCCATGGTCATCCTCCC), das das vermutliche Initiationscodon von heag umfasste, verwendet, um die Hemmung der Proliferation zu untersuchen. Das Sense-ODN und eine ungeordnete Sequenz (gtcggtaccagtaggaggg) wurden als Kontrollen verwendet. Die in 16A gezeigten Daten bestätigen die Wirksamkeit der Behandlung mit Antisense-ODN zur Reduzierung des Gehalts an heag-mRNA in EFM-Zellen. Eine Reduktion von heag-vermittelten K⁺-Strömen in SHSY-5Y-Zellen durch Behandlung mit Antisense-ODN wird in 16B und 16C dargestellt.

Behandlung von heag-exprimierenden Tumorzelllinien mit Antisense-ODNs reduzierte die Ausbeute von amplifizierten PCR-Produkten signifikant. EFM-19-Zellen wurden mit 10 μg/ml DAC30 (Reihen „C") oder 10 μg/ml DAC30 (Eurogentec) plus 1 μM Antisense-ODN (Reihen „AS") über Nacht behandelt, vollständige RNA wurde extrahiert und unter den gleichen Bedingungen, wie in Beispiel 3 beschrieben, mit ODNs untersucht, die entworfen worden waren, um entweder heag oder den Transferrin-Rezeptor zu amplifizieren. Die Pfeile in 16A markieren die erwarteten Größen der amplifizierten Fragmente. Um den heag-Strom in SHSY-5Y-Neuroblastom-Zellen zu unterbrechen, nutzten die Erfinder darüber hinaus die Spannungsabhängigkeit der Aktivierung von eag (30) in Anwesenheit von extrazellulärem Mg²⁺. Der Strom wurde nach einer Depolarisation auf +60 mV von –120 mV (16B, graue Linien) gemessen. Der erste Teil Differenzkurve (16B, schwarze Linie) entspricht dem eag-Strom, der noch nicht aktiviert worden ist, wenn das Haltepotential sehr negativ ist (–120 mV), aber deutlich wird, wenn das Haltepotential –60 mV beträgt. Der mittlere Strom zwischen 19 und 21 ms wurde ausgewählt, um die Stromdichte zu bestimmen. Die Stromdichte in SHSY-5Y-Zellen, die mit Antisense-ODNs behandelt worden waren, war im Vergleich zu Kontrollzellen signifikant reduziert. (Die elektrophysiologischen Messungen wurden nach Standardprotokollen der Patch-Clamp-Technik in ganzen Zellen (Hamill, O.P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F.J., Pflügers Arch- Eur. J. Physiol 391, 85 (1981)), mit einer extrazellulären Lösung durchgeführt, die (mM) 140 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl₂, 2 MgCl₂, 10 Hepes/NaOH, pH 7,2, 10 Glucose enthielt. Die Pipettenlösung bestand aus (mM) 140 KCl, 10 BAPTA, 10 Hepes/KOH, pH 7,2). Die Zellen wurden über Nacht mit Antisense-ODN, 1 μM, behandelt, das Fluorescein-markiertes ODN enthielt. Die Ströme wurden 1 bis 3 Tage später in Zellen gemessen, die Fluoreszenz in ihren Kernen zeigten. Die Balken in 16C stellen den Mittelwert ±S.E.M. für 9 Zellen (Kontrolle) oder 25 Zellen (Antisense) dar. Nur die Ausströme wurden in der Analyse bewertet. Darüber hinaus wurde die Hemmung von DNA-Synthese in menschlichen Krebszellen (EFM19, HeLa und SHSY-5Y) durch Antisense-ODNs, die gegen heag gerichtet waren, erforscht. DNA-Synthese wird relativ zu BrdU-Einlagerung in Abwesenheit von ODNs ausgedrückt. Die Aufnahmebedingungen in Zellen unter Verwendung von Fluorescein-markiertem Antisense-ODN wurden optimiert. Zellen wurden in einer Dichte von 105 Zellen/ml auf Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät. Einen Tag nach der Plattierung wurden die Zellen mit Kulturmedium gewaschen, und das ODN wurde zugegeben (Endkonzentration 10 μM). Das ODN war zuvor mit 20 μg/ml des Transfektionsreagenz DAC-30 (Eurogentec) in Serum-freiem Medium gemischt worden, und man ließ es bei Zimmertemperatur über 20 bis 30 Minuten inkubieren. Das Gemisch wurde dann in einer 1:1-Verdünnung in das Kulturmedium zugegeben und über Nacht mit den Zellen in Kontakt gehalten. Nach dieser Inkubation wurden die Zellen gewaschen und mit BrdU (100 μM) über 2 h markiert. Die Einlagerung wurde unter Verwendung des Kits von Boehringer Mannheim nachgewiesen und als OD-Einheiten bei 405 nm (Referenz 490 nm) nach Subtraktion der nicht spezifischen Hintergrund-Einlagerung gemessen (16D). Die Balken kennzeichnen den Mittelwert ± S.D. für acht Vertiefungen pro Bedingung in einem repräsentativen Experiment. Zelllinien: Glossar und Liste der Abkürzungen

CHO	CHO-K1 (ATCC CCL 61) Ovar des chinesischen Hamsters Cricetulus griseus
HEK293	293 (ATCC CRL. 1573) transformierte primäre menschliche Niere
NIH3T3	(ATCC CRL 1658) embryonale Fibroblasten der Swiss-Maus
MCF-7	(ATCC HTB 22) Adenokarzinom der menschlichen Brust
WT	Zellen des Wildtyps

Gene und Genprodukte

eag	Ether-á-go-go Kaliumkanal
HERG	(Human Eag-Related Gene), menschliches Eag-bezogenes Gen. Codiert einen einwärts gerichteten, gleichrichtenden Kaliumkanal, überwiegend im Herz exprimiert.
Kv1.4	inaktivierender spannungsabhängiger Kaliumkanal. Anfänglich aus Gehirn der Ratte cloniert, kommt er in vielen anderen Geweben vor.

Andere

EGF	epidermaler Wachstumsfaktor
PDGF	Von Thrombocyten stammender Wachstumsfaktor

FCS	fötales Kälberserum
I-V-Relation	Strom-Spannungsrelation
LQT	Langes Q-T (Intervall zwischen Q- und T-Wellen im Elektrokardiogramm). Verursacht schwere Arrythmien auf Grund von Repolarisationsdefekten.
BrdU	5-Brom-2'-desoxyuridin. Struktur ist analog zu Thymidin
IC50	Konzentration, die 50% Hemmung hervorruft
RT-PCR	Polymerase-Kettenreaktion von cDNA, erzeugt durch reverse Transkription im selben Gefäß.

Literatur

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15. Trudeau, M. C., Warmke, J. W., Ganetzky, B. und Robertson, G. A. (1995). HERG, a human inward rectifier in the voltage-gated potassium channel family. Science 269, 92–5.
16. Suessbrich, H., Waldegger, 5., Lang, F. und Busch, A. E. (1996). Blockade of HERG channels expressed in Xenopus oocytes by the histamine receptor antagonists terfenadine and astemizole. FEBS Lett 385, 77–80.
17. Als Beispiel vgl.: DeCoursey, T. E., Chandy, K.G., Gupta, S., Cahalan, M.D. Nature 307, 465 (1984); Mauro, T., Dixon, D.B., Komuves, L., Hanley, K., Pappone, P.A. J. Invest. Dermat. 108, 864 (1997).
18. Rouzaire-Dubois, B. und Dubois, J. M. J. Physiol 510, 93 (1998).
19. Arcangeli, A., L. Bianchi, et al., J. Physiol. 489, 455–471 (1995). Bianchi, L. et al., Cancer Res. 58, 815–822 (1998).
20. Brüggemann, A., Stühmer, W., Pardo, L.A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 537 (1997). Pardo, L.A., Brüggemann, A., Camacho, J., Stühmer, W. J. Cell. Biol. 143, 767 (1998).
21. Ludwig, J. et al, EMBO J. 13, 4451 (1994).
22. Mosmann, T. J. Immunol. Meth. 65, 55 (1983). Zellen wurden mit 50 μg/ml MTT (Thiazolyl-Blau) über 4h inkubiert, und die Formazan-Kristalle wurden in 10% SDS, 10 mM HCl über 12–14 h solubilisiert. Die optische Dichte bei 570 nm wurde unter Verwendung eines ELISA-Lesers mit einer Referenzwellenlänge von 650 nm gemessen.
23. Stein, G.S. et al., in Cell Growth and Apoptosis. A Practical Approach, G.P. Studzinski, Hrsg. (IRL Press, Oxford, 1995) pp. 193–203.
24. Jainchill, J.L., Aaronson, S.A., Todaro, G.J. J. Virol. 4, 549 (1969).
25. Hermouet, S., Merendino, J.J., Jr., Gutkind, S., Spiegel, A. M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10455 (1991).
26. GenBank-Zugangsnummern für die in dieser Beschreibung angegebenen Sequenzen sind AF078741 (heag A) und AF078742 (heag B).
27. Occhiodoro, T. et al., FEBS Lett. 434, 177 (1998).
28. Warmke, J.W. und Ganetzki, B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 3438 (1994). Frings, S., et al., J. Gen. Physiol. 111, 583 (1998).
29. Heng, H.H,Q., Squire, J., Tsui, L.-C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 9509 (1992); Heng, H.H.Q. und Tsui, L.-C. Chromosoma, 102, 325 (1993). Wir danken Dr. Henry Heng (See DNA Biotech, Downsview, Ontario, Canada) für die FISH-Analyse.
30. Terlau, H. et al., Pflügers Arch. – Eur. J. Physiol., 432, 301 (1966). Terlau, H., Heinemann, S.H., Stühmer, W., Pongs, O., Ludwig, J. J. Physiol., 502, 537–543 (1997). Meyer, R. und Heinemann, S.H., J. Physiol. 508, 49 (1998).
31. Bijlenga, P., et al. J. Physiol. 512, 317 (1998).
32. Bosma, G.C., et al. Nature 301, 527–530 (1987).
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35. Soto, E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 3684 (1996).
36. McClelland, A., Kuhn, L.C., Ruddle, F.H. Cell 39, 267 (1984). Schneider, C., Owen, M.J., Banville, D., Williams, J.G. Nature 311, 675 (1984).
37. Evans, P. und Kemp, J. Gene 199, 123 (1997).

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nucleinsäuremolekül, umfassend ein Nucleinsäuremolekül, welches ein (Poly-)Peptid codiert, das eine Funktion des humanen K⁺-Ionen-Kanals eag hat, der eine Einzelkanalleitfähigkeit in asymmetrischem Kalium bei 0 mV von etwa 6 pS besitzt, welches (a) ein Nucleinsäuremolekül ist, umfassend ein Nucleinsäuremolekül, das das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 3 oder 4 codiert; (b) ein Nucleinsäuremolekül ist, umfassend das Nucleinsäuremolekül mit der DNA-Sequenz von SEQ ID Nr. 13 oder 14; (c) ein an den komplementären Strang eines Nucleinsäuremoleküls nach (a) oder (b) hybridisierendes Nucleinsäuremolekül ist; oder (d) ein gegenüber der Sequenz des Nucleinsäuremoleküls von (c) degeneriertes Nucleinsäuremolekül ist.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, welches DNA ist.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, welches RNA ist.
Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das ein Fusionsprotein codiert.
Vektor, umfassend das Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
Vektor nach Anspruch 5, welcher ein Expressionsvektor und/oder ein Generkennungsvektor oder Gentransfervektor ist.
Wirt, der mit einem Vektor nach Anspruch 5 oder 6 transformiert ist.
Wirt nach Anspruch 7, welcher eine Säugerzelle, eine Pilzzelle, eine Pflanzenzelle, eine Insektenzelle oder eine Bakterienzelle ist.
Verfahren zur Erzeugung des (Poly-)Peptids, das von der Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird, umfassend die Anzucht des Wirts nach Anspruch 7 oder 8 und die Gewinnung des erzeugten (Poly-)Peptids.
(Poly-)Peptid, das von der Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert oder durch das Verfahren nach Anspruch 9 erzeugt wird.
Antikörper, der spezifisch gegen das (Poly-)Peptid nach Anspruch 10 gerichtet ist.
Antikörper nach Anspruch 11, welcher ein monoclonaler Antikörper ist.
Arzneimittel, umfassend den Vektor nach Anspruch 5, das (Poly-)Peptid nach Anspruch 10 und/oder den Antikörper nach Anspruch 11 oder 12 und einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff und/oder ein Verdünnungsmittel und/oder einen Excipienten.
Diagnosemittel, umfassend das Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, den Vektor nach Anspruch 5, das (Poly-)Peptid nach Anspruch 10 und/oder den Antikörper nach Anspruch 11 oder 12.
Verwendung eines Inhibitors der Expression oder Überexpression der Nucleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Prävention oder Behandlung von Krebs, Psoriasis oder einer neurodegenerativen Krankheit, wobei der Inhibitor ein Antisense-Oligodesoxynucleotid ist.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei das Antisense-Oligodesoxynucleotid ein spezifisch an das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 hybridisierendes Nucleinsäuremolekül ist, welches die Sequenz 5'-GGGAGGATGACCATGGCT umfasst.
Verwendung eines Inhibitors der Funktion des (Poly-)Peptids nach Anspruch 10 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Prävention oder Behandlung von Krebs, Psoriasis oder einer neurodegenerativen Krankheit, wobei der Inhibitor der (Poly-)Peptid-Funktion der Antikörper nach Anspruch 11 oder 12 oder ein Blocker offener Kanäle oder ein Histamin-Rezeptor-H1-Inhibitor, vorzugsweise Astemizol oder Terfenadin, ist.
Verwendung eines Inhibitors oder modifizierenden Wirkstoffs der Fehlfunktion des (Poly-)Peptids nach Anspruch 10 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Prävention oder Behandlung von Psoriasis, Krebs oder einer neurodegenerativen Krankheit, wobei der Inhibitor oder modifizierende Wirkstoff der Antikörper nach Anspruch 11 oder 12 oder ein Blocker offener Kanäle oder ein Histamin-Rezeptor-H1-Inhibitor, vorzugsweise Astemizol oder Terfenadin, ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei die neurodegenerative Krankheit die Alzheimer-Erkrankung, Multiple Sklerose, amyotrophische Lateralsklerose oder die Parkinson-Erkrankung ist.
Verfahren zum Entwurf eines Arzneistoffs für die Behandlung einer Krankheit, welche durch die unerwünschte Expression oder Überexpression des Nucleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 4 verursacht ist, umfassend: (a) Identifizierung von spezifischen und leistungsfähigen Arzneistoffen; (b) Identifizierung der Bindestelle des Arzneistoffs durch Zielstellen gerichtete Mutagenese und Studien chimärer Proteine; (c) molekulares Modellieren von sowohl der Bindestelle in dem (Poly-)Peptid als auch der Struktur des Arzneistoffs; und (d) Modifikationen des Arzneistoffs, um die Bindungsspezifität für das (Poly-)Peptid zu verbessern.
Verfahren zur Identifizierung eines Inhibitors der Expression des Nucleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eines Inhibitors der Funktion des (Poly-)Peptids nach Anspruch 10, umfassend: (a) Testen einer Verbindung auf die Hemmung oder Reduzierung der Translation, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus Antisense-Oligonucleotiden und/oder Ribozymen; oder (b) Testen einer Verbindung auf die Hemmung der Transkription, wobei die Verbindung an die Promotorregion des Genes, welches das (Poly-)Peptid nach Anspruch 10 codiert, und vorzugsweise an Transkriptionsfaktor-Erkennungselemente davon bindet; oder (c) Testen von Peptiden oder Antikörpern, von denen vermutet wird, dass sie die proliferative Aktivität des (Poly-)Peptids nach Anspruch 10 blockieren, auf die blockierende Aktivität.
Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, zusätzlich umfassend den Schritt der Verbesserung des Arzneistoffs oder Inhibitors durch Peptidomimetika oder durch die Anwendung von Phagen-Display- oder kombinatorischen Bibliotheks-Techniken.
In-vitro- oder ex-vivo-Verfahren zur Prognose von Krebs und/oder neurodegenerativen Krankheiten und/oder Psoriasis, umfassend die Bestimmung der Expression des Nucleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder die Bestimmung der quantitativen Anwesenheit des (Poly-)Peptids nach Anspruch 10 in Zellen eines Säugers.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei der Krebs Brustkrebs oder ein Neuroblastom oder Gebärmutterhalskrebs ist.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei der Brustkrebs ein Brust-Adenokarzinom, ein Brustkrebs des duktalen Typs, ist.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die neurodegenerative Krankheit die Alzheimer-Erkrankung, Parkinson-Erkrankung, amyotrophische Lateralsklerose oder Multiple Sklerose ist.
Verwendung eines spezifisch an das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 hybridisierenden Nucleinsäuremoleküls, welches die Sequenz 5'-GGGAGGATGACCATGGCT umfasst, für die Herstellung eines Diagnosemittels zur Diagnose von Krebs, Psoriasis oder einer neurodegenerativen Krankheit.
Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 19 und 27 oder Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 26, wobei der durch die Krankheit betroffene Säuger ein Mensch, eine Ratte oder eine Maus ist.
Verwendung des Nucleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eines spezifisch an das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 hybridisierenden Nucleinsäuremoleküls, welches die Sequenz 5'-GGGAGGATGACCATGGCT umfasst, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung in der Gentherapie für die Behandlung von Krebs oder Psoriasis.
Kit, umfassend den Vektor nach Anspruch 5, das (Poly-)Peptid nach Anspruch 10 und/oder den Antikörper nach Anspruch 11 oder 12.
Verwendung eines spezifisch gegen das (Poly-)Peptid nach Anspruch 10 gerichteten Antikörpers zum in-vitro-Nachweis des Beginns oder Verlaufs von Krankheiten, welche mit der unerwünschten Expression oder Überexpression des Nucleinsäuremoleküls nach Anspruch 1 in Verbindung stehen.
Verwendung nach Anspruch 31, wobei die unerwünschte Expression oder Überexpression auf Krebs hindeutet.
Oligonucleotid, welches die Nucleotidsequenz CAGCCATGGTCATCCTCCC hat.