DE69813476T2

DE69813476T2 - G-protein-gekoppelter rezeptor mit selektiver affinität für atp

Info

Publication number: DE69813476T2
Application number: DE69813476T
Authority: DE
Inventors: Didier Communi; Jean-Marie Boeynaems
Original assignee: Euroscreen SA
Current assignee: Ogeda SA
Priority date: 1997-07-09
Filing date: 1998-07-09
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2018-07-10
Also published as: JP2001500389A; EP0923644B1; US20050203282A1; US7045345B2; DE69833988T2; ATE321789T1; US7288631B2; EP0923644A1; ES2260573T3; DE69813476D1; DK0923644T3; US20020035734A1; US20020142988A1; DE69833988D1; EP1342729A3; EP1342729A2; CA2263798A1; US7264940B2; WO1999002675A1; EP1342729B1

Description

Ziel der vorliegenden Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen neuen G-Protein-gekoppelten Rezeptor mit einer selektiven Affinität für ATP sowie auf das Molekül der Nukleinsäure, das diesen Rezeptor codiert, auf Vektoren, die dieses Molekül der Nukleinsäure umfassen, auf Zellen, die durch diesen Vektor transformiert werden, auf Antikörper, die gegen diesen Rezeptor gerichtet sind, auf Sonden von Nukleinsäure, die gegen dieses Molekül der Nukleinsäure gerichtet sind, auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die jene Produkte enthalten, und auf nicht menschliche transgene Tiere, die den Rezeptor gemäß der Erfindung oder das Molekül der Nukleinsäure gemäß dem Rezeptor exprimieren.
Hintergrund der Erfindung
Eine eindrucksvolle Anzahl von Untertypen der P2 Rezeptoren sind seit 1993 kloniert worden. Eine neue molekulare Nomenklatur ist dann geschaffen worden, in welcher G-Protein-gekoppelte P2 Rezeptoren als P2Y bezeichnet worden sind, während P2 Rezeptoren mit einer intrinsischen Ionenkanalaktivität als P2X bezeichnet worden sind. Die P2Y Familie umfasst selektive Purinozeptoren (die durch ATP und ADP aktivierten P2Y₁ Rezeptoren), Nukleotidrezeptoren, die sowohl auf Adenin als auch auf Uracilnucleotide (P2Y₂ Rezeptor: gleichmäßig aktiviert durch ATP und UTP) ansprechen und Pyrimidinozeptoren (die P2Y₃ und P2Y₆ Rezeptoren, durch UDP aktiviert; der P2Y₄ Rezeptor, durch UTP aktiviert). Die P2Y₅ und P2Y₇ Rezeptoren zeigen begrenzte Homologien mit den anderen Mitgliedern der P2Y Familie. Sie sind in diese Familie mit eingeschlossen worden insbesondere auf der Grundlage von Untersuchungen der Bindung durch Radioliganden, welche Affinitäten für Adeninnukleotide zeigen (1–18).
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft den Rezeptor mit einer selektiven Affinität für ATP, so wie er in den Ansprüchen 1 bis 5 definiert worden ist. Eine erste industrielle Anwendung dieses Rezeptors ist ein Screening von Agonisten und Antagonisten des besagten Rezeptors, welche vorteilhafte pharmazeutische oder diagnostische Eigenschaften aufweisen können. Die zweite industrielle Anwendung des Rezeptors gemäß der Erfindung oder von seinen Abschnitten oder von aktiven Teilen seiner Abschnitte ist die Identifizierung von Patienten, die genetische Störungen aufweisen können, ausgelöst durch einen nicht aktiven Rezeptor oder durch einen nicht aktiven Abschnitt dieses Rezeptors.
Gemäß einer bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung ist jener Rezeptor ein menschlicher Rezeptor.
ATP scheint der bevorzugte natürliche Agonist dieses Rezeptors zu sein: UTP, UDP, AP₄A, AP₆A, AMP und Adenosin scheinen nicht fähig zu sein, den Stoffwechselweg des Phosphoinositids anzuregen, oder sie waren viel weniger potent als ATP.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch einen neuen G-gekoppelten Rezeptor, seine Abschnitte oder aktive Teile seiner Abschnitte mit einer selektiven Affinität für ATP. „Eine selektive Affinität für ATP" bedeutet, dass ATP in der Lage ist, die Bildung einer funktionalen Antwort (vorzugsweise die Akkumulation von Inositoltriphosphat IP₃ und eine Erhöhung der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration) in einer kurzen Zeit der Inkubation mit dem besagten Agonisten auszulösen (vorzugsweise in weniger als fünf Minuten, und noch lieber in weniger als einer Minute), während die anderen bekannten Agonisten von P2Y (UTP, UDP, AP₄A, AP₆A, AMP und Adenosin) unfähig waren, jenen Rezeptor anzuregen oder viel weniger potent als ATP waren, sowie eine nachweisbare funktionale Antwort durch jenen Rezeptor auszulösen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Molekül einer Nukleinsäure, wie etwa ein DNA Molekül oder ein RNA Molekül, das den Rezeptor seine Abschnitte oder aktiven Teile seiner Abschnitte gemäß der Erfindung kodiert.
Vorzugsweise ist das DNA Molekül ein cDNA Molekül oder ein genomisches DNA Molekül.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch den Vektor, der das Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung enthält. Vorzugsweise ist dieser Vektor für die Expression in einer Zelle angepasst und umfasst die regulatorischen Elemente, die notwendig sind, um das Aminosäuremolekül in jener Zelle zu exprimieren, in operativer Verknüpfung mit der Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung, um die Expression derselben zu erlauben.
Vorzugsweise wird die Zelle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bakterienzellen, Hefezellen, Insektenzellen oder Säugetierzellen. Der Vektor gemäß der Erfindung ist ein Plasmid oder ein Virus, vorzugsweise ein Baculovirus, ein Adenovirus oder ein Semliki-Forest-Virus.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Zelle, die durch den Vektor gemäß der Erfindung transformiert worden ist, wobei die Zelle vorzugsweise einen nicht neuronalen Ursprung hat und ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einer COS-7 Zelle, einer CHO Zelle, einer LM(tk-) Zelle, einer NIH-3T3 Zelle oder einer 1321N1 Astrozytomzelle.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren um zu bestimmen, ob ein Ligand als ein Agonist oder als ein Antagonist des Rezeptors gemäß der Erfindung spezifisch an den Rezeptor gebunden werden kann; wobei dieses Verfahren die Schritte umfasst, eine Zelle oder einen Zellextrakt aus Zellen, welche mit einem Vektor gemäß der Erfindung transfiziert worden sind, in Kontakt zu bringen, das Nukleinsäuremolekül zu exprimieren, welches den Rezeptor kodiert, möglicherweise eine Membranfraktion aus dem Zellextrakt zu isolieren, den Liganden mit der Membranfraktion oder mit der Zelle unter Bedingungen in Kontakt zu bringen, welche die Bindung des Liganden an den Rezeptor erlauben, und ein Ansteigen der Rezeptoraktivität, möglicherweise mit Hilfe eines biologischen Testes, wie etwa einer Veränderung der sekundären Messenger- bzw. Botenkonzentration oder einer Veränderung des zellulären Metabolismus (vorzugsweise durch die Geschwindigkeit der Azidifizierung des Kulturmediums bestimmt) nach zuweisen, wodurch bestimmt wird, ob der Ligand an den Rezeptor bindet, möglicherweise als ein Agonist oder als ein Antagonist dieses Rezeptors.
Vorzugsweise enthält der sekundäre Messengertest (Botenstofftest) eine Messung von intrazellulärem cAMP, von intrazellulärem Inositolphosphat (IP3), der Konzentration von intrazellulärem Diacylglycerin (DAG) oder der Mobilisierung von intrazellulärem Kalzium.
Vorzugsweise ist die in jenem Verfahren verwendete Zelle eine Säugetierzelle von einem nicht neuronalen Ursprung, wie etwa eine COS-7 Zelle, eine CHO Zelle, eine LM(tk-) Zelle, eine NIH-3T3 Zelle oder eine 1321N1 Zelle. In dem Verfahren ist der Ligand vorher nicht bekannt.
Die Erfindung betrifft auch den Liganden, der durch irgendeines der vorhergehenden Verfahren isoliert und nachgewiesen worden ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die pharmazeutische Zusammensetzung, welche eine wirksame Menge eines Agonisten oder eines Antagonisten des Rezeptors gemäß der Erfindung enthält, welche eine Wirkung bei der Verringerung der Aktivität des Rezeptors zeigt und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält.
Die P2Y11 Transkripte (gewonnen aus der Nukleotidsequenz, beginnend bei (⧫) in 1) sind in menschlichen HL-60 Leukämiezellen nachweisbar. Die Expression der P2Y11 Rezeptor mRNA wird durch Substanzen (Retinsäure, DMSO) erhöht, die dafür bekannt sind, die granulozytären Differenzierungen von HL-60 Zellen auszulösen. Die P2Y11 Transkripte konnten jedoch nicht in reifen neutrophilen Zellen nachgewiesen werden. Daher besteht eine erste industrielle Anwendung des Produktes gemäß der Erfindung in der Diagnose von Leukämie, vorzugsweise durch eine Northern Blot-Analyse, welche die Nukleotidsequenz verwendet, die den P2Y11 Rezeptor gemäß der Erfindung codiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein diagnostisches Gerät oder ein Kit mit den Elementen für die Diagnose von spezifischer Leukämie, vorzugsweise von HL-60 Leukämie des Menschen, welche umfassen: (i) den Rezeptor gemäß der Erfindung, (ii) die diesen Rezeptor kodierende Nukleinsäuresequenz, (iii) eine Nukleinsäure-Sonde umfassend das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül von mindestens 15 Nukleotiden wie etwa ein Antisense-Oligonukleotid, welches befähigt ist, spezifisch mit einer einzigen (unique) Sequenz, welche enthalten ist in der den Rezeptor gemäß der Erfindung kodierenden Sequenz des Nukleinsäuremoleküls zu hybridisieren, oder (iv) einen Liganden wie einen Antikörper, vorzugsweise einen monoklonalen Antikörper, der in der Lage ist, einen Liganden zu binden oder die Bindung eines Liganden an den Rezeptor gemäß der Erfindung kompetitiv zu inhibieren. Solch ein diagnostisches Gerät oder Kit könnte für die spezifische Diagnose oder für die Überwachung der Entwicklung von Tumorzellen, insbesondere von HL-60 leukämie Zellen eingesetzt werden.
Daher können die vorher beschriebenen Verfahren verwendet werden für das Screening von Wirkstoffen (die vorteilhafter Weise Antitumoreigenschaften aufweisen), welche spezifisch an den Rezeptor gemäß der Erfindung binden.
Eine andere industrielle Anwendung der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von solchen Wirkstoffen, vorzugsweise Liganden oder Antiliganden gemäß der Erfindung, für die Verhinderung und/oder die Behandlung spezifischer Krankheiten, wie Neutropenie, agranulozytische Infektionen oder Krebs.
Die Erfindung betrifft auch Wirkstoffe, die mit irgendeinem dieser Verfahren isoliert und nachgewiesen worden sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche diese Wirkstoffe und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt das Nukleotid und die abgeleitete Aminosäuresequenz des neuen menschlichen P2Y Rezeptors dar. Die mutmaßlichen Phosphorylationsstellen für Proteinkinase C oder die calmodulinabhängige Proteinkinasen werden jeweils angezeigt durch einen schwarzen Kreis
oder durch einen schwarzen Rhombus (⧫). Der mögliche N-Glykosylierungsplatz ist durch ein schwarzes Quadrat
gekennzeichnet.
2 stellt ein Dendrogramm der Strukturbeziehung des P2Y₁₁ Rezeptors mit den anderen P2Y Subtypen dar. Die Darstellung wurde konstruiert unter Verwendung des ,Multiple Sequence Alignment Program Pileup' (Programm zum Anhäufen von multiplen Sequenzausrichtungen) aus dem GCG Paket. Die P2Y₅-ähnliche veröffentlichte Sequenz (18) ist identisch mit der P2Y₉ Sequenz, welche bei der GenBank/EMBL Datenbank hinterlegt worden ist.
3 stellt eine Northern Blot-Analyse der P2Y₁₁ Messenger-Expression dar. Jede Spur des MTN Blots enthält 2 μg der polyA⁺ RNA von mehreren menschlichen Geweben. Jede Spur des HL-60 Blots enthält 10 μg der Gesamt-RNA aus differenzierten oder undifferenzierten HL-60 Zellen. Eine Hybridisierung mit der Sonde wurde durchgeführt wie unter, Materialien und Verfahren' beschrieben wird. Die Bilder des MTNII Blots und des HL-60 Blots wurden mittels Autoradiographie bzw. mittels PhosphorImager SI (Molecular Dynamics) erhalten. Die 2 kb langen P2Y₁₁ Transkripte sind durch einen schwarzen Pfeil gekennzeichnet.
4 zeigt Konzentrations-/Wirkungs- Kurven für einige Nukleotide begl. der Akkumulation von IP₃ und cAMP in Zellen, welche mit dem P2Y₁₁ Rezeptor transfiziert worden sind. Mit 1321N1 und CHO-K1 transfizierte Zellen wurden getestet hinsichtlich der Akkumulation von IP₃ (A) bzw. cAMP (B) als Antwort auf verschiedene Konzentrationen der folgenden Nukleotide: ATP, 2MeSATP, ADP und 2MeSADP. Die Inkubationszeiten betrugen 30 s für IP₃ Messungen und 15 min. für cAMP Tests. Die Daten stellen das Mittel ± S. D. (Standardabweichung) von dreifach experimentell aufgenommenen Punkten dar und sie sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente.
Beschreibung einer bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung
Experimentelle Verfahren Materialien
Trypsin stammt von Flow Laboratories (Bioggio, Switzerland). Kulturmedien, G418, fötales Kalbsserum (FCS), Restriktionsenzyme und Taq Polymerase wurden bei GIBCO BRL (Grand Island, NY) gekauft. Die radioaktiven Produkte Myo-D[2-³H] Inositol (17,7 Ci/mmol) und [αP³²]ATP (800 Ci/mmol) kamen von Amersham (Ghent, Belgien). Dowex AG1X8 (Formiatform) kam von Bio-Rad Laboratories (Richmond, Calif .). ATP, ADP, AMP, Adenosin, UTP, UDP, APA₄, APA₆, alltrans Retinsäuren (RA) und 12-O-Tetradecanoylphorbol-l3-Azetat (TPA) wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhalten. 2-Methylthio-ATP (2MeSATP), 2-Methylthio-ADP (2MeSADP) und 8 (p-Sulfophenyl)-Theopyllin kamen von Research Biochemicals International (Natrick, MA). Forskolin wurde bei Calbiochem (Bierges, Belgien) gekauft. Indomethacin und Dimethylsulfoxid (DMSO) kamen von Merck (Niederlande). Rolipram wurde erhalten von Laboratories Jacques Logeais (Trappes, France). Die menschliche Zelllinie HL-60 wurde erhalten von der American Type Culture Collection (Rockville, USA). Die genomische Bibliothek des Menschen kam von Stratagene (La Jolla, CA). pEFIN3 ist ein Expressionsvektor, erhalten von Euroscreen (Brüssel, Belgien). Der Multiple Human Tissues Northern Blot (MTN) kam von Clontech (Palo Alto, CA).
Klonieren und Sequenzieren
Eine cDNA Bibliothek von menschlicher Plazenta wurde unter mäßiger Stringenz gescreent mit einer mit [αP³²]dATP markierten P2Y₄ Rezeptorsonde entsprechend einer partiellen Sequenz, die das dritte bis siebte Transmembransegment abdeckt. Drei überlappende Klone, die einen neuen G-Proteingekoppelten Rezeptor kodieren, wurden isoliert, aber sie enthielten nicht das 3'Ende der kodierenden Region. Eine genomische Bibliothek des Menschen wurde dann mit dieser partiellen Sequenz gescreent, um die vollständige Sequenz dieses neuen Rezeptors zu gewinnen. Die Hybridisierungsbedingungen für das Screening der zwei Bibliotheken waren 6 X SSC (1 X SSC: 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat) und 40% Formamid bei 42°C während 14 Stunden und die abschließenden Waschbedingungen waren 0,5 X SSC, 0,1% SDS bei 60°C. Vier genomische Klone wurden gereinigt und es wurde gezeigt, dass sie das 3'Ende des offenen Leserasters enthalten, das in den cDNA Klonen fehlt. Die Sequenz wurde von beiden Strängen erhalten nach der Subklonierung von überlappenden Restriktionsfragmenten in M13mp18 und M13mp19 unter Verwendung der Didesoxynucleotidkettenbeendigungsmethode von Sanger.
Northern Blot-Analyse
Zwei Blots von menschlichen Organen (MTN I und MTN II: 2 μg polyA⁺ RNA/Spur) und ein Blot, welcher Gesamt-RNA aus differenzierten und undifferenzierten HL-60 Zellen enthält (10 μg an Gesamt-RNA/Spur), wurden mit einer Sonde hybridisiert, welche dem neuen Rezeptor entspricht, um dessen Gewebeverteilung zu bestimmen. Die HL-60 Zellen wurden in RPMI 1640, ergänzt mit 10% FCS, 5 mM L-Glutamin, 50 U/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin bei 37°C und 5% CO₂ kultiviert. Die HL-60 Zellen wurden sechs Tage mit oder ohne 1 μM Retinsäure oder 1,25% DMSO oder acht Stunden mit 25 nM TPA inkubiert. Die RNA aus den differenzierten oder undifferenzierten HL-60 Zellen wurde mit dem RNeasy Kit (Quiagen) präpariert. Die Blots wurden acht Stunden bei 42°C in einer Lösung aus 50% Formamid und 2% SDS vorhybridisiert und 18 Stunden in derselben Lösung, ergänzt mit der mit [αP³²] markierten Sonde hybridisiert. Die abschließenden Waschbedingungen waren 0,1 X SSC und 0,1% SDS bei 55°C. Die Blots wurden 12 Tage exponiert und sichtbar gemacht als eine Autoradiographie oder unter Verwendung des PhosphorImager SI (Molecular Dynamics).
Zellenkultur und Transfektion
Die vollständige Sequenz des neuen Rezeptors gemäß der Erfindung wurde subkloniert zwischen den Hind III und den Nhe I Stellen des bizistronischen pEFIN3 Expressionsvektors. 1321N1 und CHO-K1 Zellen wurden mit dem rekombinanten pEFIN3 Plasmid oder mit dem Plasmid allein unter Einsatz des Calciumphosphat-Präzipitationsverfahrens wie in (19) beschrieben transfiziert. Auf die transfizierten Zellen wurde mit 400 μg/ml G418 in komplettem Medium (10% FCS, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 2,5 μg/ml Amphotericin B in Dulbecco's modifiziertem Eagle Medium (DMEM)) zwei Tage nach der Transfektion selektioniert. Die tranfizierten Zellen wurden in demselben Medium gehalten (10).
Inositolphosphat (IP)- Messung
1321N1 Zellen wurden während 24 Stunden mit 10 mCi/ml [³H] Inositol in inositolfreiem DMEM markiert, das 5% FCS, Antibiotika, Amphotericin, Natriumpyruvat und 400 μg/ml G418 enthält. Die Zellen wurden zweimal mit Krebs-Ringer Hepes (KRH) Puffer der folgenden Zusammensetzung (124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1, 25 mM MgSO₄, 1, 45 mM CaCl₂, 1, 25 mM KHP₂O4, 25 mM Hepes (pH: 7,4) und 8 mM Glukose) gewaschen und in demselben Medium 30 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden dann den verschiedenen Nukleotiden während 30 s ausgesetzt. Die Inkubation wurde gestoppt durch das Hinzufügen einer eiskalten 3% Perchlorsäurelösung. IP wurde extrahiert und auf Dowex Säulen getrennt, so wie dies vorher beschrieben worden ist (20) .
cAMP Messungen
Stabil transfizierte CHO-K1 oder 1321N1 Zell-Linien wurden auf Petrischalen ausgebracht (150.000 Zellen pro Schale) und in Ham's F12 oder DMEM Medium, das 10% FCS, Antibiotika, Amphotericin, Natriumpyruvat und 400 μg/ml G418 enthält, kultiviert. Die Zellen wurden 30 Minuten vorinkubiert in KRH Puffer mit Rolipram (25 μM) und dann verschieden lang in Gegenwart der Agonisten (15 Minuten bei den meisten Experimenten) inkubiert. Die Inkubation wurde gestoppt durch das Hinzufügen von 1 ml HCl 0,1 M. Das Inkubationsmedium wurde ausgetrocknet, erneut in Wasser suspendiert und verdünnt, so wie dies erfordert ist. Zyklisches AMP wurde mittels Radioimmun-Assay nach Acetylierung quantifiziert, wie dies ehedem beschrieben worden ist (21).
Ergebnisse
Klonieren und Sequenzierung
Eine cDNA Bibliothek von menschlicher Plazenta wurde bei einer mäßigen Stringenz mit einer menschlichen P2Y₄ Sonde gescreent. Neun Klone, welche schwach mit der P2Y₄ Sonde hybridisierten, wurden gewonnen, gereinigt und analysiert. Sechs von ihnen entsprechen der Sequenz des P2Y₆ Rezeptors (10), während drei überlappende Klone einer partiellen Sequenz entsprachen, die einen neuen G-Proteingekoppelten Rezeptor kodiert, welcher etwa 30% Identität mit den anderen P2Y Rezeptoren aufzeigte. Das teilweise offene Leseraster begann mit einem ATG-Kodon in einem Kozak Konsensus, aber das 3'Ende fehlte in allen drei cDNA Klonen. Die Erfinder screenten eine genomische Bibliothek des Menschen unter Verwendung dieser partiellen Sequenz als Sonde. Vier überlappende genomische Klone wurden erhalten. Die Kartierung der kodierenden Region und die partielle Sequenzierung erlaubten es zu bestimmen, dass das Gen, das den neuen Rezeptor kodiert, ein Intron enthält, das die kodierende Region an dem 5'Ende des Gens unterbricht. Dieses Intron trennt die drei ersten Kodons von dem Rest der kodierenden Region. Neben diesen ersten Kodons enthielten die vier genomische Klone das vollständig offene Leseraster einschließlich des 3' Endes, das in den cDNA Klonen fehlt. Das vollständig offene Leseraster erschien als 1113 Basenpaare (bp) lang, und es kodierte ein Protein von 371 Aminosäuren, welches eine möglichen Stelle für eine Ngebundene Glykosylierung und zwei mögliche Stellen für eine Phosphorylierung durch Proteinkinase C oder durch eine von Calmodulin abhängige Proteinkinase enthält (1). Der neue Rezeptor, provisorisch als P2Y₁₁ bezeichnet, zeigt signifikante Homologien mit den anderen P2Y Rezeptoren ( 2). Insbesondere wurden eine 33% bzw. eine 28%-Identität auf Aminosäure-Ebene beobachtet mit den menschlichen P2Y₁ und P2Y₂ Rezeptoren.
Gewebeverteilung des neuen Rezeptors
Die Gewebeverteilung der Transkripte des neuen Rezeptors wurden mittels Northern Blot (3) untersucht, indem man eine Sonde verwendete, die einer partiellen die Transmembransegmente 3 bis 7 kodierenden Sequenz entsprach. Das stärkste Signal wurde für menschliche Milz beobachtet und entsprach einer 2 Kilobasen (kb) langen Messenger RNA (MTN II). Ein schwächeres Signal wurde im Dünndarm (MTN II) beobachtet. Alle Spuren in MTN I (Herz, Gehirn, Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere, Bauchspeicheldrüse) waren negativ. Die Erfinder wiesen auch spezifische 2 kb lange Transkripte in HL-60 Zellen nach. Das Signal war sehr schwach in den undifferenzierten HL-60 Zellen, aber es stieg an, wenn die Zellen mit Retinsäure oder DMSO behandelt wurden. Kein Anstieg wurde beobachtet, wenn die HL-60 Zellen mit TPA stimuliert wurden. Eine schwache, nicht spezifische Hybridisierung mit 18S rRNA wurde beobachtet. Diese Daten wurden mit einer nicht überlappenden Sonde bestätigt, die den ersten 300 bp der kodierenden Region entspricht, welche begrenzte Homologien mit den anderen P2Y Subtypen darstellen.
Funktionale Expression des neuen Rezeptors in 1321N1 Astrozytomzellen
Die vollständige Sequenz des neuen Rezeptors wurde in den pEFIN3 Expressionsvektor eingeführt, um die 1321N1 Astrozytomazelllinie zu transfizieren, welche vorher verwendet worden ist, um einige P2Y Subtypen (6, 10, 12) zu charakterisieren. Der Pool der G418-resistenten Klone wurde getestet im Hinblick auf ihre funktionale Antwort auf mehrere Nukleotide. ATP (100 μM) löste eine starke Inositoltriphosphat (IP₃) Akkumulation in Zellen aus, welche mit dem rekombinanten Plasmid transfiziert worden sind, während ADP, AMP, Adenosin, UTP, APA₄ und APA₆ bei der gleichen Konzentration inaktiv waren. Alle Nukleotide waren völlig inaktiv auf den Zellen, welche mit dem Vektor allein transfiziert wurden. Wir testeten dann ATP, 2MeSATP, ADP und 2MeSADP in einem weiten Konzentrationsbereich. Wie in 4A gezeigt, war ATP der am stärksten potente Agonist (EC₅₀ ATP = 38 ± 7 μM; EC₅₀ 2MeSATP = 118 ± 15 μM; Mittel ± Bereich von zwei unabhängigen Experimenten). Die Wirkung von ADP und 2MeSADP war minimal. Das Pertussistoxin (Keuchhustentoxin) (50 ng/ml; 24 Stunden Vorbehandlung) hatte keine Wirkung auf die ATP Antwort, während früher nachgewiesen worden ist, dass bei einer geringeren Konzentration des Pertussistoxins die Antwort auf UTP in mit P2Y₄ transfizierten 1321N1 Astrozytomzellen aufgehoben wird (22). Eine Antwort auf ATP (10 μM) wurde auch erhalten nach [Ca²⁺]_i Messungen, die an transfizierten 1321N1 Zellen durchgeführt wurden, während ADP bei dieser Konzentration inaktiv war.
Funktionaler Expression des neuen Rezeptors in CHO-K1 Zellen
Die 1321N1 Zellen, die mit dem neuen Rezeptor transfiziert worden waren, zeigten einen starken CAMP Anstieg als Antwort auf ATP. Eine viel geringere, aber signifikante endogene Antwort auf Grund des Abbaus von Adeninnukleotiden in Adenosin wurde auch in den 1321N1 Zellen erzielt, welche mit dem Vektor allein transfiziert worden sind. Die CHO-K1 Zellen exprimieren einen endogenen P2Y₂ Rezeptor, der an den Stoffwechsel-Weg des Phosphoinositids gekoppelt ist (23), aber sie besitzen keine Adenosinrezeptoren, welche an Adenylatcyclase gekoppelt sind. Wir verwendeten daher CHO-K1 Zellen, um die Kopplung des neuen Rezeptors an den cAMP Stoffwechsel-Weg zu charakterisieren. Ein Pool von G418-resistenten CHO-K1 Klonen wurde zuerst getestet im Hinblick auf deren Antwort auf mehrere Nukleotide bei einer Konzentration von 100 μM. ATP war in der Lage, einen starken Anstieg des cAMP Gehalts auszulösen, während es inaktiv war bei Zellen, die mit dem Vektor allein transfiziert waren. ADP, AMP, Adenosin, UTP und UDP waren vollständig inaktiv. Konzentrations/Wirkungskurven wurden aufgestellt für ATP, 2MeSATP, ADP und 2MeSADP (4B). Die Rangordnung der Potenz war die gleiche wie bei der Untersuchung der Wirkung von Inositolphosphat auf 1321N1 Zellen. Die Kurven wurden nach 15 Minuten der Stimulation durch die Agonisten erhalben; jedoch wurde eine signifikante cAMP Antwort auf ATP schon nach 2 Minuten der Stimulation erhalten. Die Antwort auf ATP (30 μM) wurde weder durch Indomethacin (10 μg/ml, vorhanden ab 30 Minuten vor der Stimulation und erneut zu dem Stimulationsmedium hinzugefügt), noch durch 8 (p-Sulfophenyl)-Theophyllin (100 μM) inhibiert.
Der Rezeptor gemäß der Erfindung weist einige strukturelle Besonderheiten auf, welche ihn von einigen anderen P2Y Subtypen unterscheiden. Was seine Genstruktur anbetrifft, so wird die kodierende Sequenz durch ein Intron unterbrochen. Ein Vergleich zwischen den cDNA- und den Genom-DNA-Sequenzen hat die Abwesenheit eines Introns in der kodierende Region des menschlichen P2Y₁ Rezeptors (24, 25), des P2Y₂ Rezeptors der Ratte (26) und des P2Y₆ Rezeptors der Ratte (11) klar gezeigt. Auf die Proteinstruktur bezogen sind die zweite und dritte extrazelluläre Schleife wesentlich länger als jene der anderen P2Y Rezeptoren. Die Homologie mit den anderen Subtypen ist relativ schwach (etwa 30%). Der höchste G-gekoppelte Rezeptor ist der menschliche P2Y₁ Rezeptor (33%) , welcher auch ein Rezeptor ist, der auf Adeninnukleotide anspricht (3, 4). Mutagenese-Experimente mit dem P2Y₂ Rezeptor haben drei positiv geladene Aminosäuren in den sechsten und siebten Transmembranbereich (His²⁶², Arg²⁶⁵ und Arg²⁹²) identifiziert, welche eine entscheidende Rolle bei der Nukleotidbindung spielen (vermutlich durch Neutralisierung der negativen Ladung der Phosphatgruppen) (27). Diese drei Reste sind in diesem neuen Rezeptor konserviert.
Bisher sind in der Literatur acht Subtypen des P2Y Rezeptors beschrieben worden (P2Y₁–P2Y₈). Zusätzlich sind kürzlich zwei Sequenzen, welche mit dem P2Y₅ Rezeptor in Beziehung stehen und mit P2Y₉ und P2Y₁₀ bezeichnet worden sind, der GenBank/EMBL Datenbank unterbreitet worden. Die P2Y₉ Sequenz ist identisch zu der kürzlich unter dem Namen „P2Y₅-like" veröffentlichten Sequenz (18). Daher könnte der neue Rezeptor, der in dieser Abhandlung beschrieben worden ist, P2Y₁₁ genannt werden. Es ist jedoch schon klar, dass die Nomenklatur eine Überarbeitung notwendig hat. Jüngst wurde gezeigt, dass der P2Y, Rezeptor tatsächlich ein Rezeptor für Leukotrien B₄ (16) ist und dass es keinen funktionalen Beweis dafür gibt, dass der P2Y₅ Rezeptor und verwandte Rezeptoren (P2Y₅-like oder P2Y₉, P2Y₁₀) Nukleotidrezeptoren sind (17, 18).
Von den sechzehn menschlichen Organen, welche mittels Northern Blot getestet worden sind, waren die P2Y₁₁ Transkripte von 2 kb Größe nur in der Milz nachweisbar, und mit einer geringeren Intensität in dem Dünndarm. Die Verteilung erinnert an die der menschlichen P2Y₆ 1,7 kb Messenger RNA. Die Beobachtung der Expression des P2Y₁₁ Rezeptors in der Linie HL-60 zeigt, dass diese Expression stark erhöht war im Anschluß an die Behandlung mit DMSO oder Retinsäure, zwei Substanzen, die dafür bekannt sind, dass sie die Differenzierung dieser Zellen in Granulozyten auslösen (28). Im Gegensatz dazu stimulierte TPA, welches dafür bekannt ist, dass es die monozytische Differenzierung der HL-60 Zellen auslöst (29), die Expression des P2Y₁₁ Rezeptors nicht. Die Bestätigung dieser Daten mit einer zweiten Sonde der P2Y₁₁ cDNA, welche wenig Ähnlichkeit mit anderen P2Y Sequenzen teilt, schließt eine mögliche Überkreuz-Hybridisierung mit einem anderen P2Y Rezeptortranskript aus. Angesichts der Ergebnisse der Northern Blots ist man versucht zu spekulieren, dass der P2Y₁₁ Rezeptor verwickelt ist in die kürzlich beschriebene Akkumulation von cAMP in ATP-stimulierten HL-60 Zellen (30).
Unter den P2Y Rezeptoren hat der P2Y₁₁ Subtyp die einzigartige Eigenschaft, sowohl den Phosphoinositid- als auch den cAMP Stoffwechsel-Weg zu aktivieren. Andere geklonte P2Y Rezeptoren sind ausschließlich an die Phospholipase C gekoppelt. Die Rangordnung der Potenz von Agonisten war dieselbe für die zwei Stoffwechel-Wege. ATP war deutlich stärker potent als ADP. Dieser Unterschied kann sogar einer Unterschätzung unterliegen als Folge einer geringen Verunreinigung der ADP Zubereitung mit ATP oder in Folge einder Umwandlung von ADP in ATP während der Versuche (4, 11). Andererseits hatte 2MeSATP denselben maximalen Effekt wie ATP, aber es zeigte eine geringere Potenz, während 2MeSADP, ein potenter Aktivator der Subtypen P2Y₁ und P_2T (4), fast inaktiv war. Die EC₅₀ Werte waren vergleichbar mit denjenigen, die in der Untersuchung gewonnen worden waren, welche die Wirkungen von extrazellulären Nukleotiden auf die cAMP Akkumulation in den HL-60 Zellen betraf (30).
Stimulierende Wirkungen von Adeninnukleotiden auf den cAMP Stoffwechsel-Weg sind für verschiedenen Zelltypen beschrieben worden (31, 32). In den meisten Fällen wurde der Stimulationseffekt von Nukleotiden durch Xanthine inhibiert. Diese Daten leiden unter der Tatsache, dass es schwierig ist auszuschließen, dass die Wirkung von Adeninnukleotiden durch deren Abbau zu Adenosin auf Grund der ubiquitären Anwesenheit von Ectonukleotidasen, exprimiert auf der Zellenoberfläche, vermittelt wird. Die cAMP Untersuchung ist durchgeführt worden mit CHO-K1 Zellen, um die endogene cAMP Antwort auf Adenosin in der Astrozytomzelllinie zu vermeiden. Weder in nicht transfizierten CHO-K1 Zellen noch in P2Y₁₁-transfizierten CHO-K1 Zellen erhöhte Adenosin die cAMP Akkumulation. Weiterhin war die cAMP Antwort auf ATP unempfindlich gegenüber einer Hemmung durch Xanthin. Sie war auch unempfindlich gegenüber Indomethacin, was darauf hindeutet, dass sie nicht durch die Freisetzung von Prostaglandinen vermittelt wird. Es ist unwahrscheinlich, dass die cAMP Antwort eine indirekte Folge der Kalziumantwort ist, da die Verwendung von ATP, welche den Stoffwechsel-Weg des Phosphoinositids durch die Aktivierung der P2Y₂ endogenen Rezeptoren aktiviert, oder die Verwendung von Kalziumionophoren in den CHO-K1 Zellen daran scheiterte, eine _CAMP Akkumulation zu stimulieren (33). Daher stellen diese Daten den ersten strengen Beweis dafür dar, dass ein P₂ Rezeptor an die Stimulation von Adenylatcyclase gekoppelt werden kann.
REFERENZEN

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Claims

Rezeptor, der eine selektive Affinität für ATP aufweist, und der durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert wird, das mehr als 50% Homologie mit einer verkürzten DNA-Sequenz aufweist, welche eine Aminosäuresequenz kodiert, beginnend mit der Aminosäure 424 und reichend bis zur Aminosäure 795 der vollständigen Sequenz, die in 1 gezeigt wird.
Rezeptor gemäss Anspruch 1, der durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert wird, das mehr als 70% Homologie mit einer verkürzten DNA-Sequenz aufweist, welche eine Aminosäuresequenz kodiert, beginnend mit der Aminosäure 424 und reichend bis Aminosäure 795 der vollständigen Sequenz, die in 1 gezeigt wird.
Rezeptor gemäss Anspruch 1 oder 2, der durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert wird, das mehr als 85% Homologie mit einer verkürzten DNA-Sequenz aufweist, welche eine Aminosäuresequenz kodiert, beginnend mit der Aminosäure 424 und reichend bis zur Aminosäure 795 der vollständigen Sequenz, die in 1 gezeigt wird.
Rezeptor gemäss irgendeinem der vorherstehenden Ansprüche 1 bis 3, der durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert wird, das mehr als 95% Homologie mit einer verkürzten DNA-Sequenz aufweist, welche eine Aminosäuresequenz kodiert, beginnend mit der Aminosäure 424 und reichend bis zur Aminosäure 795 der vollständigen Sequenz, die in 1 gezeigt wird.
Rezeptor gemäss irgendeinem der vorherstehenden Ansprüche 1 bis 4, der durch Nukleinsäuremoleküle kodiert wird, welche die Aminosäuresequenz kodieren, beginnend mit der Aminosäure 424 und reichend bis zur Aminosäure 795 der vollständigen Sequenz, die in 1 gezeigt wird.
Nukeinsäuremolekül, welches den Rezeptor gemäss irgendeinem der vorherstehenden Ansprüche 1 bis 5 kodiert.
Vektor, der das Nukleinsäuremolekül gemäss Anspruch 6 enthält.
Zelle, die den Vektor gemäss Anspruch 7 enthält.
Verfahren für die Bestimmung, ob ein Ligand spezifisch and den Rezeptor gemäss irgendeinem der vorherstehenden Ansprüche 1 bis 5 binden kann, wobei das besagte Verfahren die Schritte umfasst, eine Zelle oder einen Zellextrakt aus Zellen, welche mit einem Vektor transfiziert sind, der das Nukleinsäuremolekül exprimiert, welches den besagten Rezeptor kodiert mit dem Liganden unter Bedingungen, welche die Bindung des besagten Liganden an den besagten Rezeptor erlauben in Kontakt zu bringen und das Vorliegen von irgendeinem solchen spezifisch an den besagten Rezeptor gebundenen Liganden nachzuweisen, wodurch bestimmt wird, ob der Ligand spezifisch an den besagten Rezeptor bindet.
Verfahren gemäss Anspruch 9, wobei der besagte Ligand möglicherweise ein Agonist oder ein Antagonist des besagten Rezeptors ist.
Verfahren gemäss den Ansprüchen 9 oder 10, wobei die Bindung des Liganden an den besagten Rezeptor zu der Aktivierung einer funktionalen Antwort führt, die mittels eines Biotests nachgewiesen wird.
Verfahren gemäss Anspruch 11, wobei die Aktivierung einer funktionalen Antwort, die mittels eines Biotests nachgewiesen wird, eine Messung eines sekundären Messengers ist, die aus der Gruppe bestehend aus einer Messung der intrazellulären cAMP-Konzentration, einer Messung der intrazellulären Konzentration an Inositolphosphat, einer Messung der intrazellulären Konzentration an Diacylglycerin, einer Messung der intrazellulären Mobilisierung von Kalzium und einer Messung einer Zunahme der Rezeptoraktivität ausgewählt wird.