DE69334187T2

DE69334187T2 - Stabil transfizierte Zelllinien welche Humane GABA-A Rezeptoren mit der Untereinheitskombination Alpha-2, Beta-3 und Gamma-2 exprimieren

Info

Publication number: DE69334187T2
Application number: DE69334187T
Authority: DE
Inventors: Karen L. Neuroscience Harlow Essex Hadingham; Paul J. Neuroscience Whiting
Original assignee: Merck Sharp and Dohme Ltd
Current assignee: Organon Pharma UK Ltd
Priority date: 1992-12-10
Filing date: 1993-12-07
Publication date: 2008-10-09
Anticipated expiration: 2013-12-08
Also published as: ES2296064T3; EP0673419B1; DE69320985D1; AU5655494A; EP0856581B1; WO1994013799A1; DE69333923T2; EP0856581A3; DE69320985T2; EP0856581A2; DE69334187D1; ATE170921T1; JP3464672B2; AU680852B2; EP1605046B1; JPH08504330A; ATE311449T1; EP1605046A1; DK0856581T3; ES2251011T3

Description

Diese Erfindung betrifft eine Zellinie, und sie betrifft insbesondere eine stabile Zellinie, die menschliche GABA_A'-Rezeptoren exprimieren kann, die die α₁β₁γ_2S-Untereinheitenkombination umfassen. Die Erfindung betrifft außerdem das Klonen von neuen cDNA-Sequenzen die diese bestimmte Untereinheit der menschlichen GABA_A-Untereinheit codieren. Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung der Zellinie bei einem Screening-Verfahren für die Ausarbeitung und Entwicklung subtypspezifischer Medikamente.
Gammaaminobuttersäure (GABA) ist ein hauptsächlicher inhibitorischer Neurotransmitter im Zentralnervensystem. Sie vermittelt die schnelle synaptische Hemmung, indem sie den intrinsischen Chloridkanal des GABA_A-Rezeptors öffnet. Dieser Rezeptor umfaßt ein multimeres Protein mit einer Molekülgröße von 230–270 kDa und spezifischen Bindungsstellen für eine Vielzahl von Arzneimitteln, einschließlich Benzodiazepinen, Barbituraten und β-Carbolinen, und außerdem Stellen für den agonistischen Liganden GABA (für Übersichten siehe Stephenson, Biochem. J., 1988, 249, 21; Olsen und Tobin, Faseb J., 1990, 4, 1469; sowie Sieghart, Trends in Pharmacol. Sci., 1989, 10, 407).
Molekularbiologische Untersuchungen zeigen, daß der Rezeptor aus mehreren unterschiedlichen Typen von Untereinheiten besteht, die auf der Basis ihrer Sequenzähnlichkeiten in vier Klassen (α, β, γ und δ) eingeteilt werden. Heute sind sechs Typen von α-(Schofield et al., Nature (London), 1987, 328, 221; Levitan et al., Nature (London), 1988, 335, 76; Ymer et al., EMBO J., 1989, 8, 1665; Pritchett & Seeberg, J. Neurochem., 1990, 54, 802; Luddens et al., Nature (London), 1990, 346, 648; sowie Khrestchatisky et al., Neuron, 1989, 3, 745), drei Typen von β-(Ymer et al., EMBO J., 1989, 8, 1665), zwei Typen von γ-Untereinheiten (Ymer et al., EMBO J., 1990, 9, 3261; sowie Shivers et al., Neuron, 1989, 3, 327) und eine δ-Untereinheit (Shivers et al., Neuron, 1989, 3, 327) identifiziert worden.
Die unterschiedliche Verteilung vieler dieser Untereinheiten wurde durch in situ-Hybridisierung charakterisiert (Sequier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 7815; Malherbe et al., J. Neurosci., 1990, 10, 2330; sowie Shivers et al., Neuron, 1989, 3, 327), und dies ermöglichte die Spekulation darüber, welche Untereinheiten aufgrund ihrer Co-Lokalisierung theoretisch im selben Rezeptorkomplex vorkommen könnten.
Verschiedene Untereinheitenkombinationen wurden in Zellen Co-transfiziert, um synthetische Untereinheitenkombinationen zu identifizieren, deren Pharmakologie derjenigen echter GABA_A-Rezeptoren in vivo ähnelt (Pritchett et al., Science, 1989, 245, 1389; Malherbe et al., J. Neurosci., 1990, 10, 2330; Pritchett und Seeberg, J. Neurochem., 1990, 54, 1802; sowie Luddens et al., Nature (London), 1990, 346, 648). Dieser Ansatz ergab, daß zusätzlich zu einer α- und β-Untereinheit gewöhnlich auch entweder γ₁ oder γ₂ (Pritchett et al., Nature (London), 1989, 338, 582; Ymer et al., EMBO J., 1990, 9, 3261; sowie Malherbe et al., J. Neurosci., 1990, 10, 2330) oder γ₃ (Herb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 1433; Knoflach et al., FEBS Lett., 1991, 293, 191; sowie Wilson-Shaw et al., FEBS Lett., 1991, 284 211) erforderlich ist, um eine Benzodiazepin-Empfindlichkeit zu erzeugen, und daß die Benzodiazepin-Pharmakologie des exprimierten Rezeptors zu einem großen Teil von der Identität der vorhandenen α- und γ-Untereinheiten abhängt. Rezeptoren, die eine δ-Untereinheit enthalten (d. h. αβδ), binden anscheinend keine Benzodiazepine (Shivers et al., Neuron, 1989, 3, 327). Es wurden Untereinheitenkombinationen identifiziert, die das pharmakologische Profil eines Rezeptors vom BZ₁-Typ (α₁β₁γ₂) und eines Rezeptors vom BZ₂-Typ (α₂β₁γ₂ oder α₃β₁γ₂) aufweisen (Pritchett et al., Nature (London), 1989, 338, 582), sowie zwei GABA_A-Rezeptoren mit neuer Pharmakologie, α₅β₂γ₂ (Prittchett und Seeberg, J. Neurochem., 1990, 54, 1802) und α₆β₂γ₂ (Luddens et al., Nature (London), 1990, 346, 648). Obwohl die Pharmakologie dieser exprimierten Rezeptoren ähnlich derjenigen zu sein scheint, die durch Bindung radioaktiv markierter Liganden in Gehirngewebe identifiziert wurden, wurde trotzdem nicht gezeigt, daß diese Rezeptoruntereinheiten-Kombinationen in vivo existieren.
US Patent N°5166066 beschreibt eine stabile umgewandelte HEK293-Zelle, die einen eine αβγ-Untereinheit enthaltenden funktionellen GABA_A-Rezeptor umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung permanent transfizierter Zellen, die den GABA_A-Rezeptor enthalten, der die α₂β₃γ₂-Untereinheitenkombination umfasst, und die sich für das Screening nach Arzneimitteln eignen, die auf diesen Rezeptor wirken. Der GABA_A-Rezeptor wurde zuvor in Xenopus-Oozyten (Sigel et al., Neuron, 1990, 5, 703–711) und in transient transfizierten Säugerzellen exprimiert (Pritchett et al., Science, 1989, 245, 1389–1392). Diese beiden Systeme beinhalten jedoch die transiente Expression und sind für Screeningzwecke ungeeignet.
Wir haben jetzt die stabile Expression des Rezeptors erreicht.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung eine stabile Co-transfizierte eukaryotische Zellinie bereit, die einen menschlichen GABA_A-Rezeptor exprimieren kann, der die α₂β₃γ₂-Untereinheitkombination umfasst.
Dies wurde erzielt, indem Zellen mit drei Expressionsvektoren Co-transfiziert wurden, von denen jeder cDNAs enthielt, die eine α-, β- oder γ₂-GABA_A-Rezeptoruntereinheit codierten. Unter einem weiteren Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung daher ein Verfahren zur Herstellung einer eukaryotischen Zellinie bereit, die den GABA_A-Rezeptor exprimieren kann, umfassend das stabile Co-Transfizieren einer eukaryotischen Wirtszelle mit mindestens drei Expressionsvektoren, wobei einer dieser Vektoren die cDNA-Sequenz, die eine alpha₂-, ein anderer Vektor die cDNA-Sequenz, die eine beta₃- und ein dritter Vektor die cDNA-Sequenz enthält, die eine gamma₂-GABA_A-Rezeptoruntereinheit codiert. Die stabile Zellinie, die etabliert wurde, exprimiert diesen α₂β₃γ₂-GABA_A-Rezeptor. Jeder dadurch exprimierte Rezeptor, der die einzigartige Kombination von α, β und γ-Untereinheiten umfaßt, wird nachstehend als eine GABA_A-Rezeptor-"Untereinheitenkombination" bezeichnet. Pharmakologische und elektrophysiologische Daten bestätigen, daß der von den erfindungsgemäßen Zellen exprimierte α₂β₃γ₂-Rezeptor die Eigenschaften besitzt, die von einem nativen GABA_A-Rezeptor erwartet werden.
Die Expression des GABA_A-Rezeptors kann durch eine Vielzahl verschiedener Promotor Expressionssysteme in einer Vielzahl unterschiedlicher Wirtszellen durchgeführt werden. Zu den eukaryotischen Wirtszellen gehören geeigneterweise Hefe-, Insekten- und Säugerzellen. Vorzugsweise sind Säugerzellen die eukaryotischen Zellen, die den Wirt zur Expression des Rezeptors bereitstellen können. Geeignete Wirtszellen sind u. a. Nagetier-Fibroblastenlinien, beispielsweise Maus-Ltk^–-Zellen, Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) und Babyhamster-Nierenzellen (BHK); HeLa- sowie HEK293-Zellen. Es ist notwendig, zumindest eine α, eine β und eine γ-Untereinheit in die Zellinie einzubringen, damit der gewünschte Rezeptor hergestellt wird. Innerhalb dieser Einschränkung erfolgt die Wahl der Rezeptoruntereinheiten-Kombination nach dem Typ der Aktivität oder Selektivität, nach dem gesucht wird. Beispielsweise stellen Benzodiazepine (als BZ bezeichnet) eine Klasse von Arzneimitteln dar, die auf den GABA_A-Rezeptor wirken. Die Anwesenheit einer α₁-Untereinheit ist spezifisch für eine Klasse von Benzodiazepinen mit der als BZ₁ bezeichneten Pharmakologie, wogegen α₂ bis α₅ unterschiedliche pharmakologische Profile festlegen, die weitgefaßt als BZ₂ bezeichnet werden. Der Typ der β-Untereinheit ist für die Festlegung der Benzodiazepinklasse nicht entscheidend, obwohl eine β-Untereinheit erforderlich ist. Die γ-Untereinheit ist ebenfalls wichtig für die Festlegung der BZ-Selektivität. Es ist wahrscheinlich, daß die Unterscheidung zwischen der Selektivität der α-Untereinheit durch die Identität der besonderen vorhandenen γ-Untereinheit vermittelt wird.
Um diese Erfindung am wirksamsten für Screening-Zwecke einsetzen zu können, ist es bevorzugt, daß eine Bank von Zellinien mit jeweils einer unterschiedlichen Untereinheitenkombination aufgebaut wird. Üblicherweise ist eine Bank aus 5 oder 6 Zellinien-Typen für diesen Zweck geeignet.
Die vorliegende Erfindung stellt stabil Co-transfizierte eukaryotische Zellinien bereit, die menschliche GABA_A-Rezeptoren exprimieren können, die die α₂β₃γ₂-Untereinheitenkombination umfassen.

Die DNAs für die Rezeptoruntereinheiten können aus bekannten Quellen erhalten werden und werden gewöhnlich als spezifische Nukleotidsequenzen erhalten, die in einem Standardklonierungsvektor, wie beispielsweise den von Maniatis et al. in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Press, New York, 2. Auflage, 1989, beschriebenen, enthalten sind. Vorzugsweise stammen die cDNA-Sequenzen vom menschlichen Gen. Für Screening-Zwecke sind aber auch cDNAs von anderen Spezies geeignet, wie Rinder- oder Ratten-DNA. Bekannte Quellen für die cDNAs für GABA_A-Rezeptoruntereinheiten sind die folgenden:

α₁ Rind	)	Schofield et al., Nature, 1987, 328
β₁ Rind	)	221–227.

α₁ Mensch	)	Schofield et al., FEBS Lett., 1989, 244
β₁ Mensch	)	361–364.

α₂ Ratte		Khrestchatisky et al., J. Neurochem., 1991, 56, 1717.

α₂ Rind	)	Levitan et al., Nature, 1988, 335
α₃ Rind	)	76–79.

α₄ Ratte		Wisden et al., FEBS Lett., 1991, 298, 227.

α₄ Rind		Ymer et al., FEBS Lett., 1989. 258. 119–122.

α₅ Ratte		Pritchett und Seeburg, J. Neurochem., 1990, 54, 1802–1804.

α₆ Ratte	)	Luddens et al., Nature, 1990, 346
α₆ Rind	)	648–651.

β₂ Rind	)	Ymer et al., EMBO J., 1989, 8, 1665–1670.
β₂ Ratte	)
β₃ Rind	)
β₃ Ratte	)
β₃ Mensch		Wagstaff et al., Am. J. Hum. Genet., 1991, 49. 330.

γ₁ Mensch	)	Ymer et al., EMBO J., 1990, 9, 3261–3267.
γ₁ Ratte	)
γ₁ Rind	)
γ₂ Mensch		Pritchett et al., Nature, 1989, 338, 582–585.

γ₂ Rind		Whiting et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 57, 9966–9970.

γ₃ Ratte		Herb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 1433 und
		Knoflach et al., FEBS Lett., 1991, 293, 191.

γ₃ Maus		Wilson-Shaw et al., FEBS Lett., 1991, 284, 211.

δ Ratte		Shivers et al., Neuron, 1998, 3, 327.

Bestimmte cDNA-Sequenzen, die verschiedene Untereinheiten des menschlichen GABA_A-Rezeptors codieren, sind bis heute nicht verfügbar. Dazu gehören insbesondere die Sequenzen, die die α₂-, α₃-, α₅-, α₆- und β₂-Untereinheiten codieren. Diese Nuldeotidsequenzen sind folglich neuartig. Wir haben jetzt die cDA-Sequenz der α₂-Untereinheit des menschlichen GABA_A-Rezeptors bestimmt. Diese Nukleotidsequenz ist, zusammen mit den ihr entsprechenden abgeleiteten Aminosäuresequenzen, in 2 der beigefügten Zeichnungen dargestellt. Also stellt die vorliegende Erfindung unter verschiedenen weiteren Gesichtspunkten DNA-Moleküle bereit, die die α₂-Untereinheit des menschlichen GABA_A-Rezeptors codieren und die die gesamte oder einen Teil der in 2 dargestellten Sequenz oder im wesentlichen ähnliche Sequenzen umfassen.
Die Sequenzierung der erfindungsgemäßen neuartigen DNA-Moleküle kann leicht durch ein Standardverfahren durchgeführt werden, daß im beigefügten Beispiel 3 beschrieben ist, oder kann durch alternative molekulare Klonierungstechniken durchgeführt werden, die im Fachgebiet wohlbekannt sind, wie die von Maniatis et al. in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 2. Auflage, 1989, beschriebenen.
Unter einem anderen Gesichtspunkt stellt die Erfindung einen rekombinanten Expressions-Vektor bereit, der die Nukleotidsequenz einer GABA_A-Rezeptoruntereinheit zusammen mit weiteren Sequenzen umfaßt, die die Synthese der GABA_A-Rezeptoruntereinheit in Kulturen stabil co-transfizierter eukaryotischer Zellen steuern können.
Der Ausdruck "Expressionsvektoren", wie hier verwendet, betrifft DNA-Sequenzen, die für die Transkription klonierter Kopien rekombinanter DNA-Sequenzen oder Gene und die Translation ihrer mRNAs in einem geeigneten Wirt notwendig sind. Diese Vektoren können zur Expression eukaryotischer Gene in einer Vielzahl von Wirten verwendet werden, wie Bakterien, Blaugrünalgen, Hefezellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen und tierische Zellen. Speziell ausgearbeitete Vekoren ermöglichen das Shuttling von DNA zwischen Bakterien- und Hefe-, Bakterien- und Pflanzen- oder Bakterien- und tierischen Zellen. Ein geeignet konstruierter Expressionsvektor sollte enthalten: einen Replikationsursprung für die autonome Replikation in Wirtszellen, Selektionsmarker, eine begrenzte Zahl geeigneter Restriktionsenzymstellen, eine hohe Kopienzahl sowie starke Promotoren. Ein Promotor ist definiert als eine DNA-Sequenz, die bewirkt, daß die RNA-Polymerase an die DNA bindet und die RNA-Synthese einleitet. Ein starker Promotor ist einer, der die Initiation der mRNAs mit hoher Frequenz steuert. Expressionsvektoren können Klonierungsvektoren, modifizierte Klonierungsvektoren, speziell entworfene Plasmide oder Viren beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt.
Der Ausdruck "Klonierungsvektor", wie hier verwendet, betrifft ein DNA-Molekül, gewöhnlich eine kleine Plasmid- oder Bakteriophagen-DNA, das in einem Wirtsorganismus zur Selbstreplikation befähigt ist und das zur Einbringung eines Fragmentes fremder DNA in eine Wirtszelle verwendet wird. Die mit der Vektor-DNA kombinierte Fremd-DNA stellt ein rekombinantes DNA-Molekül dar, das der Rekombinationstechnologie entstammt. Klonierungsvektoren können Plasmide, Bakteriophagen, Viren und Cosmide beinhalten.
Der erfindungsgemäße rekombinante Expressionsvektor kann hergestellt werden, indem die Nukleotidsequenz der gewählten GABA_A-Untereinheit in einen geeigneten Vorläufer-Expressions-Vektor (nachstehend als der "Vorläufervektor" bezeichnet) unter Verwendung herkömmlicher, im Fachgebiet bekannter rekombinanter DNA-Methodologie eingebracht wird. Der Vorläufervektor kann kommerziell erhalten werden oder durch Standardtechniken aus bekannten Expressionsvektoren konstruiert werden. Der Vorläufervektor enthält geeigneterweise einen Selektionsmarker, gewöhnlich ein Antibiotikaresistenzgen, wie das Neomycin- oder Ampicillinresistenzgen. Der Vorläufervektor enthält vorzugsweise ein Neomycinresistenzgen in Nachbarschaft zum frühen Spleiß- und Polyadenylierungsbereich des SV40; ein Ampicillinresistenzgen sowie einen Replikationsursprung, z. B. den pBR322 ori. Der Vektor enthält vorzugsweise auch einen induzierbaren Promotor, wie den MMTV-LTR-(induzierbar mit Dexamethason) oder den Metallothionin-Promotor (induzierbar mit Zink), so daß die Transkription in der erfindungsgemäßen Zellinie kontrolliert werden kann. Dies verringert oder vermeidet jegliches Toxizitätsproblem in den Zellen aufgrund des intrinsischen Chloridkanals des GABA_A-Rezeptors.
Ein geeigneter Vorläufervektor ist pMAMneo, der von Clontech Laboratories Inc. Erhältlich ist (Lee et al., Nature, 1981, 294, 228; und Sardet et al., Cell, 1989, 56, 271). Alternativ kann der Vorläufervektor pMSGneo aus den Vektoren pMSG und pSV2neo, wie hier in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt werden.
Der erfindngsgemäße rekombinante Expressionsvektor wird dann hergestellt, indem die cDNA der GABA_A-Rezeptoruntereinheit in den vorstehenden Vorläufervektor kloniert wird. Die erforderliche cDNA der Rezeptoruntereinheit wird aus dem Vektor, in dem sie enthalten ist, subkloniert und in eine Restriktionsenzymstelle, z. B. die HindIII-Stelle, im Polylinker des Vorläufer-Vektors, beispielsweise pMAMneo oder pMSGneo, durch im Fachgebiet bekannte Standardklonierungsmethodologie und insbesondere durch Techniken, analog den hier in Beispiel 1, Schritt (b), beschriebenen, ligiert. Vor dieser Subklonierung ist es oft vorteilhaft, zur Verbesserung der Expression die Enden einer cDNA für die Untereinheit mit zusätzlichen 5'-untranslatierten Sequenzen zu verändern, beispielsweise durch Modifikation des 5'-Endes der DNA der γ_2L-Untereinheit durch Hinzufügen von Sequenzen des 5'-untranslatierten Bereiches aus der DNA der α₁-Untereinheit.
Ein geeigneter erfindungsgemäßer Expressionsvektor ist in der 1 der beigefügten Zeichnungen dargestellt, worin R die Nukleotidsequenz einer gegebenen alpha-, beta- oder gamma-Untereinheit des GABA_A-Rezeptors darstellt und der übrige, dort dargestellte Expressionsvektor von dem Vorläufervektor pMSGneo stammt und, wie im beigefügten Beispiel 1, Schritte (a) und (b) beschrieben, konstruiert worden ist.
Für die erfindungsgemäße Zellinie sind drei dieser Vektoren notwendig, von denen einer eine α₂-Untereinheit, einer eine β₃-Untereinheit und der dritte eine γ₂-Untereinheit enthält.
Die Zellen werden dann mit der gewünschten Kombination von drei Expressionsvektoren Co-transfiziert. Es gibt mehrere üblicherweise verwendete Techniken zur Transfektion eukaryotischer Zellen in vitro. Die Calciumphosphatfällung von DNA wird am häufigsten verwendet (Bachetti et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74, 1590–1594; Maitland et al., Cell, 1977, 14, 133–141) und stellt eine bevorzugte Technik im erfindungsgemäßen Zusammenhang dar.
Ein kleiner Prozentsatz der Wirtszellen nimmt die rekombinante DNA auf. In einem kleinen Prozentsatz von diesen integriert die DNA in das Wirtszellchromosom. Da das Neomycinresistenzgen in diese Wirtszellen eingebracht wurde, können sie durch Isolation der Einzelklone selektiert werden, die in Anwesenheit von Neomycin wachsen. Jeder dieser Klone wird dann getestet, um diejenigen zu identifizieren, die den Rezeptor erzeugen. Dies wird erreicht, indem die Produktion beispielsweise mit Dexamethason induziert und dann die Anwesenheit des Rezeptors mittels Bindung des radioaktiv markierten Liganden nachgewiesen wird.
Unter einem weiteren Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung die α₂β₃γ₂-Untereinheit enthaltenden Proteinpräparationen von menschlichen GABA_A-Rezeptoruntereinheiten-Kombinationen bereit, die aus Kulturen stabil transfizierter eukaryotischer Zellen stammen. Die Erfindung stellt auch Membranpräparationen bereit, die die α₂β₃γ₂-Untereinheitenkombinationen des menschlichen GABA_A-Rezeptors enthalten, die aus Kulturen stabil transfizierter eukaryotischer Zellen stammen. Insbesondere werden die Proteinpräparationen und Membranpräparationen erfindungsgemäss geeigneterweise die α₂β₃γ₂-Untereinheitkombination des menschlichen GABA_A-Rezeptors enthalten und sie werden vorzugsweise einen die α₂β₃γ₂-Untereinheitkombination umfassenden meschlichen GABA_A-Rezeptor enthalten. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung einen GABA_A-Rezeptor enthaltende Zellmembran bereit, die aus der α₂β₃γ₂-Untereinheitkombination besteht, welche aus stabil transfizierten Ltk^–-Mausfibroblastenzellen isoliert wurde.
Die erfindungsgemäße Zellinie und die Membranpräparationen davon eignen sich zum Screening nach und Ausarbeiten von Arzneimitteln, die auf den GABA_A-Rezeptor wirken, z. B. Benzodiazepine, Barbiturate, β-Carboline und Neurosteroide. Folglich stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung der oben beschriebenen Zellinie und der davon stammenden Membranpräparationen beim Screening nach und Ausarbeiten von Medikamenten bereit, die auf den GABA_A-Rezeptor wirken. In diesem Zusammenhang sind Moleküle von besonderem Interesse, die selektiv mit GABA_A-Rezeptoren Wechselwirken, die aus verschiedenen Untereinheitenkombinationen bestehen. Es ist leicht ersichtlich, daß die erfindungsgemäße Zellinie und die davon stammenden Membranpräparationen ideale Systeme für die Untersuchung der Struktur, Pharmakologie und Funktion der verschiedenen GABA_A-Rezeptorsubtypen bereitstellen.
Die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfidung.
BEISPIEL 1
HERSTELLUNG VON α₁β₁γ_2L-TRANSFIZIERTEN ZELLEN
a) Konstruktion des eukaryotischen Expressionsvektors pMSGneo
Das etwa 2500 Basenpaare große HindIII-EcoRI-Fragment des Vektors pMSG (erworben von Pharmacia Biosystems Limited Milton Keynes, Großbritannien), das das gpt-Strukturgen und die SV40-Polyadenylierungssignale enthält, wurde durch das etwa 2800 Basenpaare große HindIII-EcoRI-Fragment des pSV2neo (Southern, P. J. und Berg, P. J., Molecular and Applied Genetics, 1, 327–341, 1982) ersetzt, das das Neomycinresistenzgen Neo^r und die SV40-Polyadenylierungssignale enthält. Die EcoRI- und die HindIII-Stelle wurden dann durch Restriktionsspaltung, Herstellung glatter Enden mit Klenow-Polymerase und erneute Ligierung entfernt. Die EcoRI- und die HindIII-Klonierungsstelle wurden dann an der XhoI- und der SmaI-Stelle des Polylinkers mittels herkömmlicher Techniken unter Verwendung von EcoRI- und HindIII-Linkern eingefügt.
b) Klonierung der cDNAs für die Untereinheiten in pMSGneo
Die α₁- und β₁-GABA_A-Rezeptor-cDNAs aus Rind wurden von der Molecular Neurobiology Unit, MRC Centre, Hills Road, Cambridge erhalten, (Scholfield, P., et al., Nature. 328, 221–227, 1987). Die γ₂-cDNA aus Rind wurde durch das Verfahren von Whiting, P., et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 9966–9970, 1990) kloniert. Rinder-α₁ wurde aus pbGRαsense durch Spaltung mit EcoRI, Herstellung glatter Enden mit Klenow-Polymerase, Hinzufügen von HindIII-Linkern durch Ligation, Spaltung mit HindIII und Ligation in die HindIII-Stelle von pMSGneo subkloniert. Rinder-β₁, wurde aus pbGRβsense durch Restriktionsspaltung mit EcoRI (partielle Spaltung), Herstellung glatter Enden mit Klenow-Polymerase, Ligation von HindIII-Linkern, Restriktionsspaltung mit HindIII und Ligation in die HindIII-Stelle von pMSGneo subkloniert. Vor dem Subklonieren in pMSGneo wurde die Rinder-γ₂-cDNA von der veröffentlichten Sequenz wie folgt abgeändert. Der 5'-untranslatierte Bereich der Rinder-α₁-cDNA (Basen 60–200 der veröffentlichten Sequenz) wurde an das 5'-Ende der veröffentlichten γ₂-Sequenz gefügt, indem der untranslatierte Bereich von α₁ unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion vervielfältigt und das Produkt dann in die 5'-BamHI-Stelle (Stelle im Polylinker des Bluescript-SK^–-Klonierungsvektors; der Bluescript-Vektor wurde von Stratagene, San Diego, U.S.A., erworben) und die HindIII-Stelle der γ₂-cDNA subkloniert wurde. Die veränderte γ₂-cDNA wurde dann durch Spaltung mit XbaI (Stelle im Polylinker des Klonierungsvektors), Herstellen glatter Enden mit Klenow-Polymerase, Spaltung mit XhoI (Stelle im Polylinker des Klonierungsvektors) und Ligation in die XhoI-Stelle von pMSGneo subkloniert.
c) Co-Transfektion von Maus-Ltk^–-Zellen
Ltk^–-Zellen wurden vom Salk Institute for Biological Studies, San Diego, Kalifornien, erhalten. Die Zellen wurden bei 37°C, 5–8% CO₂, in modifiziertem Eagles-Medium gezüchtet, das Penicillin, Streptomycin und 10% fötales Kälberserum enthielt. Der Expressionsvektor für die Co-Transfektion, der die DNAs für die GABA_A-Rezeptoruntereinheiten enthielt, wurde durch ein Standardprotokoll (Chen, C., und Okayama, H., BioTechniques, 6, 632–638, 1988) hergestellt. Für die Co-Transfektion wurden die Ltk^–-Zellen in Schalen plattiert (etwa 2 ×10⁵ Zellen/Schale) und über Nacht gezüchtet. Die Transfektion wurde durch Calciumphosphatfällung unter Verwendung eines Kits (gekauft von 5 Prime → 3 Prime Products, Westchester, Pennsylvania) durchgeführt. Die Co-Transfektion wurde nach den Anleitungen des Herstellers unter Verwendung von 5 μg jedes Untereinheiten-DNA-Konstruktes pro 10-cm-Schale mit Zellen durchgeführt. Nach zwei Tagen in Kultur wurden die Zellen 1:8 in Kulturmedium aufgeteilt, das 1 mg/ml Neomycin [Geneticin (erhältlich von Gibco BRL, Paisley, Schottland, GB)] enthielt. Nach einer weiteren Woche wurde die Konzentration auf 1,5 mg/ml und dann eine Woche danach auf 2 mg/ml erhöht. Resistente Zellklone wurden isoliert und unter Verwendung von Klonierungszylindern subkloniert. Die Subklone wurden unter Verwendung der Bindung radioaktiv markierter Liganden analysiert: Die Subklone wurden in 10-cm-Kulturschalen gezüchtet und, als sie konfluent waren, in Kulturmedium mit 1 μM Dexamethason (erhältlich von Sigma Chemical Company, Poole, Dorset, Großbritannien) überführt. 3–5 Tage später wurden die Zellen geerntet, die Membranen präpariert und für die Bindung des radioaktiv markierten Liganden eingesetzt (siehe Beispiel 2, Schritt (a) unten), wobei der Benzodiazepin-Antagonist ³H-Ro15-1788 (erhalten von New England Nuclear, Du Pont (GB), Ltd., Stevenage, Großbritannien) eingesetzt wurde. Der Klon, der die größte Menge an ³H-Ro15-1788-Bindung exprimierte wurde aus einer Einzelzelle mittels Grenzwert-Verdünnung subkloniert. Die nachstehend beschriebene erhaltene Klonpopulation von Zellen wird als Population A bezeichnet.
BEISPIEL 3
ISOLATION AUND SEQUENZIERUNG DER DIE UNTEREINHEIT α₂ DES MENSCHLICHEN GABA_A-REZEPTORS CODIERENDEN cDNAs
a) cDNA-Banken
Es wurden die die α₂-Untereinheit des menschlichen GABA_A-Rezeptors codierenden cDNAs von menschlichem, fötalen Hirn-lambda-Bakteriophagen-cDNA-Banken kloniert. In dem lambda-ZAP-Vektor wurden alle cDNA-Banken konstruiert und erworben von Stratagene (San Diego, Californien). Zum Screening wurden die cDNA-Banken nach den Anweisungen des Herstellers mit 40000 pfu pro 137 mm Platte auf Platten gezogen. Unter Verwendung von Hybond N-Filter (Amersham) wurden nach den Herstelleranweisungen Filterabhebungen genommen.
b) Isolation von menschlicher α₂-Untereinheit codierender cDNA
Es wurde eine Rinder-α₂-cDNA (erhalten von E. Barnard, Molecular Neurobiology, University of Cambridge, Hills Road, Cambridge; Levitan et al., Nature, 1988, 335, 76) auf hohe spezifische Aktivität (> 1,10⁹ cpm/μg) mit ³²P durch Random-Priming markiert und als Sonde verwendet. Bankenfilter (8 Replikafilter) wurden vorhybridisiert für 3 bis 6 Stunden bei 42°C und 5 × SSPE (1 × SSPE sind 0,18 Mol NaCl, 0,01 Mol Na₃PO₄ [pH 7,4], 1 mMol EDTA), 5 × Denhardts-Lösung, 100 μg/ml Lachssperma-DNA, 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 30% Formamid. Die Hybridisierung wurde in dem gleichen Puffer für 18 Stunden bei 42°C einschließlich 0,5 bis 1,10⁶ cpm ³²P-markierter Sonde pro ml Hybridisierungspuffer ausgeführt. Die Filter wurden bei 55°C in 5 × SSPE (2 × 15 Minuten) und 1 × SSPE (2 × 15 Minuten) gewaschen und für 1 bis 3 Tage auf einem Kodak XAR-Film exponiert. Positive Klone wurden einer Plaque-Reinigung unter Anwendung von Standardmethoden und der „Bluescript"-Plasmid (Stratagene), nach Herstelleranweisungen „gerettet" unterzogen. Die cDNA-Klone wurden auf beiden Strängen mit Hilfe von Standardmethoden unter Anwendung des Sequenase II-Enzyms (United States Biochemicals) kloniert. Die Nucleotidsequenz der die α₂-Untereinheit des menschlichen GABA_A-Rezeptor codierenden cDNA wird zusammen mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz, die dieser entsprach, in 2 der beigefügten Zeichnungen gezeigt.
BEISPIEL 4
HERSTELLUNG STABILER TRANSFIZIERTER ZELLEN, DIE α₂β₃γ_2S-UNTEREINHEITENKOMBINATIONEN DES MENSCHLICHEN GABA_A-REZEPTORS EXPRIMIEREN
Die Isolation und Sequenz von menschlichen α₂-cDNAs sind in Beispiel 3 beschrieben worden. Die Sequenz von menschlichem ₇₂ ist zuvor von Pritchett et al., Nature, 1989, 338, 582, veröffentlicht worden. Eine menschliche γ₂-cDNA wurde isoliert mit Hilfe der PCR unter Anwendung der anderswo beschriebenen Bedingungen (Whiting et al., Proc. Natl. Acad, Sci, USA, 1990, 87, 9966–9970), indem als Matrix eine menschliche Hippocampus-cDNA-Bank und Oligonucleotid-Primer verwendet wurden, die deriviert wurden von 5' und 3' untranslatierten Bereichen der veröffentlichten γ₂-Sequenz, in die eine HindIII-Restriktionsstelle eingebaut ist:
5'GGGAGGGAAGCTTCTGCAACCAAGAGGC3',
5'ACCACATAGAAGCTTATTTAAGTGGAC3'. Das Sequenzieren zeigt, dass die Form von 72. die zur Anwendung gelangt, die kurze Form, γ_2S ist, welcher das 24 bp-Insert in dem vermutlichen cytoplasmischen Schleifenbereich fehlt (Whiting et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 9966–9970). Die Sequenz von menschlichem β₃ ist veröffentlicht worden von Wagstaff et al., Am. J. Hum. Genet., 1991, 41, 330–337. Eine menschliche β₃-cDNA wurde isoliert durch Screening einer menschlichen, fötalen Hirn-cDNA-Bank (siehe Beispiel 3) mit einer kurzen menschlichen β₃-cDNA-Sonde, die die vermutliche cytoplasmische Schleifendomäne codiert, die unter Anwendung der PCR erhalten worden ist.
Menschliche α₁-, β₃- und γ_2S-cDNAs wurden in dem eukaryotischen Expressionsvektor pMSGneo (siehe Beispiel 1) unter Anwendung von Standardmethoden (siehe Maniatis et al., in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 2. Ausg., 1989) subkloniert und stabile Zelllinien, die menschliche α₂β₃γ_2S-GABA_A-Rezeptoren exprimieren entsprechend der Beschreibung in Beispiel 1 zusammengestellt. SEQUENZLISTE

Claims

Stabil Co-transfizierte eukaryotische Zelllinie, die in der Lage ist, einen menschlichen GABA_A-Rezeptor, welcher die α₂β₃γ₂-Untereinheitskombination umfasst, zu exprimieren.
Membranpräparation, enthaltend Untereinheitskombinationen des menschlichen GABA_A-Rezeptors, welche aus einer Kultur der stabil Co-transfizierten eukaryotischen Zellen nach Anspruch 1 erhalten wurde.
Präparation nach Anspruch 2, enthaltend einen menschlichen GABA_A-Rezeptor, der aus der α₂β₃γ₂-Untereinheitskombination besteht, welche aus stabil Co-transfizierten Ltk^–-Mausfibroblastenzellen isoliert wurde.
Verwendung der Zelllinie nach Anspruch 1 und von daraus erhaltenen Membranpräparationen zum Screening hinsichtlich von und Entwickeln von Medikamenten, welche auf den menschlichen GABA_A-Rezeptor einwirken.