ES2251011T3

ES2251011T3 - Lineas celulares trasnfectadas estables que expresan receptores gaba-a con una combinacion de subunidades alfa-3, beta-3 y gamma-2.

Info

Publication number: ES2251011T3
Application number: ES97203995T
Authority: ES
Inventors: Karen L. Neuroscience Research Centre Hadingham; Paul J. Neuroscience Research Centre Whiting
Original assignee: Merck Sharp and Dohme Ltd
Current assignee: Organon Pharma UK Ltd
Priority date: 1992-12-10
Filing date: 1993-12-07
Publication date: 2006-04-16
Anticipated expiration: 2013-12-07
Also published as: ES2296064T3; EP0856581A3; DK0856581T3; US5652100A; JPH08504330A; WO1994013799A1; EP0673419A1; DE69334187T2; DE69333923T2; DE69334187D1; DE69320985D1; EP1605046A1; AU680852B2; EP0673419B1; JP3464672B2; EP0856581A2; EP1605046B1; DE69333923D1; EP0856581B1; DE69320985T2

Abstract

LA PRESENTE INVENCION TRATA DE UNA LINEA CELULAR EUCARIOTA CO TRANSFECTADA DE FORMA ESTABLE, CAPAZ DE EXPRESAR UN RECEPTOR GABA A HUMANO, INCLUYENDO DICHO RECEPTOR LA COMBINACION DE SUBUNIDADES AL 1 BE 3 GA 2 , AL 2 BE 3 GA 2 , AL 5 BE 3 GA 2 , AL 1 BE 1 GA 2S , AL 1 BE 2 GA SUB,2 , AL 3 BE 3 GA 2 O AL 6 BE 3 GA 2 ; DE PREPARACIONES DE MEMBRANAS DERIVADAS DE CULTIVOS DE LA MISMA; Y DEL USO DE LA LINEA CELULAR PARA DISEÑAR Y DESARROLLAR MEDICAMENTOS SELECTIVOS PARA SUBTIPOS DEL RECEPTOR GABA A .

Description

Líneas celulares transfectadas estables que expresan receptores GABA_{A} con una combinación de subunidades \alpha_{3}, \beta_{3} y \gamma_{2}.

Esta invención se refiere a una línea celular, y en particular se refiere a una línea celular estable capaz de expresar receptores de GABA_{A} humanos que comprenden la combinación de subunidades \alpha_{3}\beta_{3}\gamma_{2}. La invención se refiere adicionalmente a la clonación de secuencias novedosas de cDNA que codifican subunidades particulares del receptor de GABA_{A} humano. Además, la invención se refiere al uso de la línea celular en una técnica de rastreo para el diseño y desarrollo de medicamentos de un subtipo específico.

El ácido gamma-aminobutírico (GABA) es un neurotransmisor inhibidor principal en el sistema nervioso central. Media la inhibición sináptica rápida abriendo el canal de cloruro intrínseco al receptor de GABA_{A}. Este receptor comprende una proteína multimérica de peso molecular 230-270 kDa con sitios específicos de unión para una diversidad de fármacos que incluyen benzoadiazepinas, barbiturtatos, y \beta-carbolinas, además de sitios para el ligando agonista GABA (para revisiones véanse Stephenson, Biochem. J., 1988, 249, 21; Olsen y Tobin, Faseb J., 1990, 4, 1469; y Sieghart, Trends in Pharmacol. Sci., 1989, 10, 407).

Estudios biológicos moleculares demuestran que el receptor se compone de diversos tipos de subuniddades, las cuales se dividen en cuatro clases (\alpha, \beta, \gamma, y \delta) basadas en sus similitudes de secuencia. Hasta la fecha, se han identificado seis tipos de \alpha (Schofield y col., Nature (Londres), 1987, 328, 221; Levitan y col., Nature (Londres), 1988, 335, 76; Ymer y col., EMBO J., 1989, 8, 1665; Pritchett & Seeberg, J. Neurochem., 1990, 54, 802; Luddens y col., Nature (Londres), 1990, 346, 648; y Kherstchatisky y col., Neuron, 1989, 3, 745), tres tipos de \beta (Ymer y col., EMBO J., 1989, 8, 1665), dos tipos de \gamma (Ymer y col., EMBO J., 1990, 3261; y Shivers y col., Neuron, 1989, 3, 327) y una subunidad \delta (Shivers y col., Neuron, 1989, 3, 327).

La distribución diferencial de muchas de las subunidades se ha caracterizado mediante hibridación in situ (Sequier y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 7815; Malherbe y col., J. Neurosci., 1990, 10, 2330; y Shivers y col., Neuron, 1989, 3, 327) y esto ha permitido especular con cuales subunidades, por su colocalización, podrían existir teóricamente en el mismo complejo receptor.

Se han cotransfectado diversas combinaciones de subunidades dentro de células para identificar combinaciones sintéticas de subunidades cuya farmacología es análoga a aquella de los receptores de GABA_{A} de buena fe in vivo (Pritchett y col., Science, 1989, 245, 1389; Malherbe y col., J. Neurosci., 1990, 10, 2330, Pritchett y Seeberg, J. Neurochem., 1990, 54, 1802; y Luddens y col., Nature (Londres), 1990, 346, 648). Esta aproximación ha revelado que, además de una subunidad \alpha y \beta, bien \gamma_{1} o bien \gamma_{2} (Pritchett y col., Nature (Londres), 1989, 338, 582; Ymer y col., EMBO J., 1990, 9, 3261; y Malherbe y col., J. Neurosci., 1990, 10, 2330) o \gamma_{3} (Herb y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 1433; Knoflach y col., FEBS Lett., 1991, 293, 291; y Wilson-Shaw y col., FEBS Lett., 1991, 284, 211) también se requiere generalmente para conferir sensibilidad a benzodiacepinas, y que la farmacología de benzodiacepinas del receptor expresado es grandemente dependiente de la identidad de las subunidades \alpha y \gamma presentes. Los receptores que contienen una subunidad \delta (es decir, \alpha\beta\delta) no parecen unir benzodiacepinas (Shivers y col., Neuron, 1989, 3, 327). Se han identificado combinaciones de subunidades las cuales presentan el perfil farmacológico de un receptor tipo BZ_{1} (\alpha_{1}\beta_{1}\gamma_{2}) y un receptor de tipo BZ_{2} (\alpha_{2}\beta_{1}\gamma_{2} o \alpha_{3}\beta_{1}\gamma_{2}, Pritchett y col., Nature (Londres), 1989, 338, 582), igual que dos receptores de GABA_{A} con una farmacología novedosa, \alpha_{5}\beta_{2}\gamma_{2} (Pritchett y Seeberg, J. Neurochem., 1990, 54, 1802) y \alpha_{6}\beta_{2}\gamma_{2} (Luddens y col., Nature (Londres), 1990, 346, 648). Aunque la farmacología de los receptores expresados parece similar a aquella de aquellos identificados en el tejido cerebral mediante unión a radioligando, no obstante no se ha mostrado que estas combinaciones de subunidades del receptor existan in vivo.

La presente invención se refiere a la producción de células permanantemente transfectadas que contienen el receptor de GABA_{A} que comprende la combinación de subunidades \alpha_{3}\beta_{3}\gamma_{2}, la cual será útil para rastreo para fármacos los cuales actúan sobre este receptor. El receptor de GABA_{A} se ha expresado previamentre en oocitos de Xenopus (Sigel y col., Neuron, 1990, 5, 703-711) y en células de mamíferos transfectadas transitoriamente (Pritchett y col., Science, 1989, 245, 1389-1392). Sin embargo, ambos de aquellos sistemas implican expresión transitoria y son inadecuados para propósitos de rastreo).

Hemos logrado ahora la expresión estable del receptor.

De acuerdo con ello, la presente invención proporciona una línea celular eucariótica cotransfectada de forma estable capaz de expresar un receptor de GABA_{A}, receptor el cual comprende al menos una subunidad alfa, una beta y una gamma.

Esto se ha logrado cotransfectando células con tres vectores de expresión, cada uno de ellos albergando cDNA que codifican para una subunidad del receptor de GABA_{A} \alpha_{3}, \beta_{3} o \gamma_{2}. En un aspecto adicional, por lo tanto, la presente invención proporciona un procedimiento para la preparación de una línea celular eucariota capaz de expresar dicho receptor de GABA_{A}, el cual comprende cotransfectar de forma estable una célula hospedadora eucariota con al menos tres vectores de expresión, un vector tal que alberga la secuencia de cDNA que codifica para una subunidad alfa_{3} del receptor de GABA_{A}, otro de tales vectores que alberga la secuencia de cDNA que codifica para una subunidad beta_{3} del receptor de GABA_{A} y un tercero de tales vectores que alberga la secuencia de cDNA que codifica para una subunidad gamma_{2} del receptor de GABA_{A}. La línea celular estable en la cual está establecido expresa este este receptor de GABA_{A} \alpha_{3}\beta_{3}\gamma_{2}. Cada receptor expresado de este modo, que comprende esta combinación de subunidades \alpha, \beta o \gamma del receptor de GABA_{A} se referirá de ahora en adelante como "combinación de subunidades" del receptor de GABA_{A}. Los datos farmacológicos y electrofisiológicos confirman que el receptor \alpha_{3}\beta_{3}\gamma_{2} recombinante expresado por las células de la presente invención tiene las propiedades esperadas de un receptor de GABA_{A} nativo.

La expresión del receptor de GABA_{A} se puede llevar a cabo mediante una diversidad de diferentes sistemas de expresión de promotores en una diversidad de diferentes células hosperadoras. Las células hospedadoras eucariotas incluyen adecuadamente levadura, células de insecto y células de mamífero. Preferiblemente las células eucariotas las cuales pueden proporcionar el hospedador para la expresión del receptor son células de mamífero. Las células huésped adecuadas incluyen líneas fibroblásticas de roedores, por ejemplo Ltk^{-} de ratón, ovario de hámster chino (CHO) y riñón de cría de hámster (BHK); HeLa; y células HEK293. Es necesario incorporar al menos una subunidad \alpha, una subunidad \beta, y una subunidad \gamma dentro de la línea celular con el fin de producir el receptor requerido. Dentro de esta limitación, la elección de la combinación de subunidades del receptor se hace de acuerdo con el tipo de actividad o selectividad las cuales están siendo rastreadas. Por ejemplo, las benzodiacepinas (designadas BZ) representan una clase de fármacos los cuales actúan sobre el receptor de GABA_{A}. La presencia de una subunidad \alpha_{1} es específica de una clase de benzodiacepinas que tienen la farmacología designada BZ_{1}; mientras que de \alpha_{2} a \alpha_{5} definen perfilees farmacológicos diferentes, designados en términos generales como BZ_{2}. El tipo de subunidad \beta no es crítico en definir la clase de benzodiacepina, aunque se requiere una subunidad \beta. Es probable que la diferenciación entre la selectividad de subunidad \alpha se confiera mediante la identifidad de la subunidad \gamma presente en particular.

Con el fin de emplear esta invención lo más efectivamente para fines de rastreo, es preferible desarrollar una biblioteca de líneas celulares, cada una con una combinación diferente de subunidades. Típicamente una biblioteca de 5 ó 6 tipos de líneas celulares es conveniente para este propósito.

La presente invención proporciona líneas de células eucariotas capaces de expresar receptores de GABA_{A} humanos que comprenden la combinación de subunidades \alpha_{3}\beta_{3}\gamma_{2}.

Los DNA para las subunidades del receptor se pueden obtener a partir de fuentes conocidas, y se obtienen generalmente como secuencias nucleotídicas específicas albergadas por un vector de clonación estándar tal como aquellos descritos, por ejemplo, por Maniatis y col. en Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Nueva York, 2ª edición, 1989. Preferiblemente las secuencias de cDNA se derivan del genoma humano. Sin embargo, para propósitos de rastreo, los cDNA de otras especies son también adecuados, tales como DNA bovino o de rata. Las fuentes conocidas de los DNA de las subunidades del receptor de GABA_{A} son como sigue:

\alpha_{1} bovina): Schofield y col., Nature, 1987, 328, 221-227.

\beta_{1} bovina)

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\alpha_{1} humana): Schofield y col., FEBS Lett., 1989, 244, 361-364.

\beta_{1}humana)

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\alpha_{2} de rata: Kherstchatisky y col., J. Neurochem., 1991, 56, 1717.

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\alpha_{2} bovina): Levitan y col., Nature, 1988, 335, 76-79.

\alpha_{3} bovina)

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\alpha_{4} de rata: Wisden y col., FEBS Lett., 1991, 289, 227.

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\alpha_{4} bovina: Ymer y col., FEBS Lett., 1989, 258, 119-122.

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\alpha_{5} de rata: Pritchett y Seeburg, J. Neurochem., 1990, 54, 1802-1804.

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\alpha_{6} de rata): Luddens y col., Nature, 1990, 346, 648-651.

\alpha_{6} bovina)

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\beta_{2} bovina): Ymer y col., EMBO J., 1989, 8, 1665-1670.

\beta_{2} de rata)

\beta_{3} bovina)

\beta_{3} de rata)

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\beta_{3} humana: Wagstaff y col., Am. J. Hum. Genet., 1991, 49, 330.

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\gamma_{1} humana): Ymer y col., EMBO J., 1990, 9, 3261-3267.

\gamma_{1} de rata)

\gamma_{1} bovina)

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\gamma_{2} humana: Pritchett y col., Nature, 1989, 338, 582-585.

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\gamma_{2} bovina: Whiting y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 57, 9966-9970.

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\gamma_{3} de rata: Herb y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 1433; y Knoflach y col., FEBS Lett., 1991, 293, 191.

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\gamma_{3} murina: Wilson-Shaw y col., FEBS Lett., 1991, 284, 211.

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\delta_{3} de rata: Shivers y col., Neuron, 1989, 3, 327.

Ciertas secuencias de cDNA codifican diversas subunidades del receptor de GABA_{A} humano que hasta el momento han estado indisponibles. Estas incluyen en particular las secuencias que codifican las subunidades \alpha_{2}, \alpha_{3}, \alpha_{5}, \alpha_{6}, y \beta_{2}. Los inventores han averiguado la secuencia de cDNA de la subunidad del receptor de GABA_{A} humano. Esta secuencia nucleotídica, conjuntamente con la secuencia de aminoácidos deducida correspondiente a ella, se representa en la figura 2 de los dibujos acompañantes. La presente invención de acuerdo con ello proporciona en varios aspectos adicionales moléculas de DNA que codifican la subunidad del receptor de GABA_{A} humano que comprende toda o una parte de la secuencia en figura 2 o secuencias sustancialmente similares.

La secuenciación de las moléculas de cDNA novedosas de acuerdo con la invención se puede llevar a cabo convenientemente mediante el procedimiento estándar descrito en el ejemplo 3 acompañante; o se puede llevar a cabo mediante técnicas de clonación molecular alternativas las cuales son bien conocidas en la técnica, tales como aquellas descritas por Maniatis y col. en Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Nueva York, 2ª edición, 1989.

En otro aspecto, la invención proporciona un vector de expresión recombinante que comprende la secuencia de nucleótidos de una subunidad del receptor de GABA_{A} con secuencias adicionales capaces de dirigir la síntesis de dicha subunidad del receptor de GABA_{A} en cultivos de células eucariotas cotransfectadas de forma estable.

El término "vectores de expresión" como se usa en el presente documento se refiere a secuencias de DNA que se requieren para la transcripción de copias clonadas de secuencias de DNA recombinantes o genes recombinantes y la traducción de sus mRNA en un huésped adecuado. Tales vectores se pueden usar para expresar genes eucariotas en una diversidad de huéspedes tales como bacterias, algas verdeazuladas, células de levaduras, células de insecto, células vegetales y células animales. Los vectores específicamente diseñados permiten el traslado del DNA entre células de bacterias-células de levaduras, células de bacterias-células vegetales, y células de bacterias-células animales. Un vector de expresión adecuadamente construido contendría: un origen de replicación para replicación autónoma en células huésped, marcadores selectivos, un número limitado de sitios de enzimas de restricción útiles, un alto número de copias, y promotores fuertes. Un promotor se define como una secuencia de DNA que dirige a la RNA polimerasa para unir a DNA y para iniciar síntesis de RNA. Un promotor fuerte es uno el cual causa que los mRNA se inicien a alta frecuencia. Los vectores de expresión se pueden incluir, pero no se limitan a, vectores de clonación, vectores de clonación modificados, plásmidos o virus específicamente diseñados.

El término "vector de clonación" como se usa en el presente docuemento se refiere a una molécula de DNA, usualmente un pequeño plásmido o bacteriófago de DNA capaz de autorreplicación en un organismo huésped, y se usa para introducir un fragmento de DNA extraño en una célula hospedadora. El DNA extraño combinado con el vector de DNA constituye una molécula de DNA recombinante la cual se deriva de tecnología recombinante. Los vectores de clonación pueden incluir plásmidos, bacteriófagos, virus y cósmidos.

El vector de expresión recombinante de acuerdo con la invención se puede preparar insertando la secuencia de nucleótidos de la subunidad de GABA_{A} elegida dentro de un vector de expresión precursor adecuado (de aquí en adelante referido como el "vector precursor") usando metodología de DNA recombinante convencional conocida de la técnica. El vector precursor se puede obtener comercialmente, o se puede construir mediante técnicas estándar de vectores de expresión conocidos. El vector de expresión conocido contiene adecuadamente un marcador de selección, típicamente un gen de resistencia a antibióticos, tal como el gen de resistencia a neomicina o ampicilina. El vector precursor contiene preferiblemente un gen de resistencia a neomicina, adyacente a la región que sufre "splicing" pronto y la región de poliadenilación de SV40; un gen de resistencia a ampicilina; y un origen de replicación, por ejemplo ori pBR332. El vector también contiene preferiblemente un promotor inducible, tal como MMTV-LTR (inducible con dexametasona) o metalotionina (inducible con cinc), de tal forma que la transcripción se pueda controlar en la línea celular de esta invención. Esto reduce o evita cualquier problema de toxicidad en las células debido al canal de cloruro intrínseco al receptor de GABA_{A}.

Un vector precursor adecuado es pMAMneo disponible a partir de Clontech Laboratories Inc. (Lee y col., Nature, 1981, 294, 228; y Sardet y col., Cell, 1989, 56, 271). Alternativamente el vector precursor pMSGneo se puede construir a partir de los vectores pMSG y pSV2neo como se describe en el ejemplo 1 en el presente documento.

El vector de expresión recombinante de la presente invención se produce después clonando el cDNA de la subunidad del receptor de GABA_{A} dentro del vector precursor anterior. El cDNA de la subunidad del receptor requerido se subclona a partir del vector en el cual está albergado, y se liga dentro de un sitio de enzima de restricción, por ejemplo el sitio HindIII, en el poliligando del vector precursor, por ejemplo mMAMneo o pMSGneo, mediante metodología de clonación estándar conocida a partir de la técnica, y en particular mediante técnicas análogas a aquellas descritas en el ejemplo 1, etapa (b) en el presente documento. Antes de esta subclonación, es a menudo ventajoso, con el fin de incrementar la expresión, modificar el final de un cDNA de subunidad con secuencias 5' no traducidas adicionales, por ejemplo modificando el extremo 5' de la subunidad \gamma_{2L} mediante la adición de las secuencias de la región 5' no traducidas a partir del DNA de la subunidad \alpha1.

Un vector de expresión adecuado de la presente invención se ilustra en la figura 1 de las figuras acompañantes, en las cuales R representa la secuencia nucleotídica de una subunidad dada alfa, beta o gamma del receptor de GABA_{A}, y el resto del vector de expresión representado en éste se deriva del vector precursor pMSGneo y se construye como se describe en el ejemplo 1 acompañante, etapas (a) y (b).

Para la línea celular de la presente invención, se necesitarán tres de tales vectores, uno que contenga la subunidad \alpha_{3}, otro que contenga la subunidad \beta_{3}, y el tercero que contenga la subunidad \gamma_{2}.

Las células se cotransfectan después con las combinaciones deseadas de los tres vectores de expresión. Hay varias técnicas usadas comúnmente para transfección de células eucariotas in vitro. La precipitación de DNA con fosfato de calcio de DNA se usa muy comúmente (Bachetti y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74, 1590-1594; Maitland y col., Cell, 1977, 14, 133-141), y representa una técnica favorable en el contexto de la presente inven-
ción.

Un pequeño porcentaje de las células huésped aceptan el DNA recombinante. En un pequeño porcentaje de aquellas, el DNA se integra dentro del cromosoma de la célula huésped. Debido a que el gen de resistencia a neomicina se habrá incorporado en estas células huésped, se pueden seleccionar aislando los clones individuales los cuales crecerán en presencia de neomicina. Cada uno de tales clones se prueba después para identificar aquellos los cuales producirán el receptor. Esto se logra induciendo la producción, por ejemplo con dexametasona, y después detectando la presencia de receptor por medio de unión a radioligando.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona preparaciones de proteína de dicha combinación de subunidades del receptor de GABA_{A} humano, derivadas de cultivos de células eucariotas transfectadas de forma estable. La invención también proporciona preparaciones de membranas que contienen la combinación de subunidades \alpha_{3}\beta_{3}\gamma_{2} del citado receptor de GABA_{A}, especialmente combinación de subunidades del receptor de GABA_{A}, derivados de cultivos de células eucariotas transfectadas establemente. Así las preparaciones de proteína y preparaciones de membrana de acuerdo con la invención contendrán adecuadamente combinación de subunidades \alpha_{3}\beta_{3}\gamma_{2} del receptor de GABA_{A} humano. En una realización preferida, la invención proporciona membranas celulares que contienen un receptor de GABA_{A} humano que consta de la combinación de subunidades \alpha_{3}\beta_{3}\gamma_{2} aisladas de células fibroblásticas de ratón Ltk^{-} transfectado de forma estable.

La línea celular y las preparaciones de membrana de la misma, de acuerdo con la presente invención tienen utilidad de acuerdo con la presente invención en rastreo y diseño de fármacos los cuales actúan bajo el receptor de GABA_{A}, por ejemplo benzodiacepinas, barbituratos, \beta-carbolinas y neurosteroides. La presente invención proporciona de acuerdo con ello el uso de la línea celular descrita anteriormente, y las preparaciones de membrana derivadas de la misma, en escaneo en busca de y diseño de medicamentos los cuales actúan sobre el receptor de GABA_{A}. De interés particular en este contexto son moléculas capaces de interaccionar selectivamente con receptores de GABA_{A} compuestas por combinaciones de subunidades que varían. Como será fácilmente patente, la línea celular de acuerdo con la presente invención, y las preparaciones de membrana derivadas de la misma, proporcionan sistemas ideales para el estudio de estructura, farmacología y función de los diversos subtipos del receptores de GABA_{A}.

Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran la presente invención.

Ejemplo 1

Preparación de células transfectadas con \alpha_{1}\beta_{1}\gamma_{2L} a) Construcción de vector de expresión en eucariotas pMSGneo

El fragmento de HindIII-EcoRI de aproximadamente 2500 pares de bases del vector pMSG (obtenido de Pharmacia Biosystems Limited, Milton Keynes, Reino Unido), que contienen el gen estructural gtp y las señales de poliadenilación de SV40 se reemplazó por el fragmento de HindIII-EcoRI de aproximadamente 2800 pares de bases de pSV2neo (Southern, P.J. y Berg, P.J., Molecular and Applied Genetics, 1, 327-341, 1982) que contiene las señales de poliadenilación del gen de resistencia a neomicina Neo^{r} y SV40. Los sitios EcoRI y HindIII se eliminaron después mediante digestión de restricción, haciendo romos los extremos con polimerasa klenow, y religando. Los sitios clonados de EcoRIO y HindIII se insertaron después en los sitios XhoI y SmaI del ligando mediante técnicas convencionales usando ligandos de EcoRI y HindIII.

b) Clonación de cDNA de subunidades dentro de pMSGneo

Los cDNA de los receptores de GABA_{A} \alpha_{1} y \beta_{1} bovinos se obtuvieron a partir de la Unidad de Neurobiología Molecular, MRC Centre, Hills Road, Cambridge (Scholfield, P. y col., Nature, 328, 221-227, 1987). El cDNA \gamma_{2} bovino se clonó mediante el procedimiento de Whiting, P. y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 9966-9970, 1990). \alpha_{1} bovina se subclonó a partir de pbGR\alpha en sentido correcto mediante digestión con EcoRI, haciendo romos los extremos con polimerasa klenow, adición de ligandos HindIII mediante ligazón, digestión con HindIII y ligazón dentro de sitio HindIII de pMSGneo. \beta_{1} bovina se subclonó a partir de pbGR\beta en sentido correcto mediante digestión de restricción con EcoRI (digestión parcial), haciendo romos los extremos con polimerasa klenow, adición de ligandos HindIII mediante ligazón, digestión de restricción con HindIII y ligazón dentro de sitio HindIII de pMSGneo. Antes de subclonar en pMSGneo, el cDNA \gamma_{2} bovino se modificó a partir de la secuencia publicada como sigue. La región no traducida 5' del cDNA de \alpha_{1} bovino (bases 60-200 de la secuencia publicada) se añadió al extremo 5' de la región \gamma_{2} publicada amplificando la región no traducida de \alpha_{1} usando reacción en cadena de la polimerasa, y después subclonando el producto en sitios HindIII del BamHI 5' (sitio en el poliligando del vector de clonación Bluescript Sk^{-}; vector Bluescript comprado de Stratagene, San Diego, U.S.A.) del cDNA de \gamma_{2}. El cDNA de \gamma_{2} modificado se subclonó después en pMSGneo mediante digestión con XbaI (sitio en el poliligando del vector de clonación), haciendo romos los extremos con polimerasa klenow, ligazón de ligandos XhoI, digestión con XhoI (sitio en el poliligando del vector de clonación), y ligazón dentro del sitio XhoI de pMSGneo.

c) Cotransfección de las células Ltk^{-} de ratón

Las células Ltk^{-} se obtuvieron del Salk Institute for Biologial Studies, Sna Diego, California. Las células se cultivaron a 37ºC, con CO_{2} al 5-8%, en Medio de Eagle Modificado que contenía penicilina, estreptomicina y suero de ternera fetal al 10%. El vector de expresión que alberga los DNA de la subunidad del receptor de GABA_{A} para cotrasnfección se preparó mediante un protocolo estándar (Chen, C. y Okayama, H., BioTechniques, 6, 632-638, 1988). Para co-transfección, las células Ltk^{-} se plaquearon en placas (aproximadamente 2 x 10^{5} células/placa) y se cultivaron durante toda una noche. La transfección se llevó a cabo mediante precipitación con fosfato de calcio usando un kit (comprado de 5 Prime \rightarrow 3 Prime Products, Westchester, Pensilvania). La cotransfección se llevó a cabo de acuerdo a las instrucciones del fabricante, usando 5 \mug de cada construcción de DNA de subunidades por placa de 10 cm de células. Después de 2 días en cultivo las células se dividieron 1:8 dentro del medio de cultivo que contiene neomicina 1 mg/ml [Geneticina (obtenible a partir de Gibco BRL, Paisley, Escocia, Reino Unido)]. Después de una semana adicional la concentración se incrementó a 1,5 mg/ml, y después 2 mg/ml una semana después de aquello. Los clones resistentes de células se aislaron y subclonaron usando cilindros de clonación. Los subclones se analizaron usando unión a radioligando; los subclones se cultivaron en placas de cultivo de 10 cm, y cuando fueron confluyentes se cambiaron en medio de cultivo que contenía dexametasona 1 \muM (obtenible a partir de Sigma Chemical Company, Poole, Dorset, Reino Unido). 3-5 días más tarde las células se recogieron, las membranas se separaron y usaron para unión a radioligando (véase ejemplo 2, etapa (a) más adelante) usando el ^{3}H Ro15-1788 antagonista de benzodiacepina (obtenido a partir de New England Nuclear, Du Pont (Reino Unido) Ltd, Stevenage, Reino Unido). El clon que expresa la cantidad más alta de ^{3}H Ro15-1788 se subclonó a partir de una célula individual mediante dilución limitante. La población clonal resultante de células descritas más adelante se refiere como
población A.

Ejemplo 2 Caracterización de células transfectadas \alpha_{1}\beta_{1}\gamma_{2L} a) Unión a radioligando

La naturaleza de los receptores de GABA_{A} \alpha_{1}\beta_{1}\gamma_{2L} recombinantes preparados como se describe en el ejemplo 1 se dirigió mediante caracterización de la farmacología de unión a benzodiacepina (BZ), usando el antagonista de BZ ^{3}H Ro15-1788. Para ensayos de unión a radioligando, las células que se han inducido mediante cultivo en dexametasona que contiene medio durante 3-5 días se desprendieron en Tris 50 mM, a pH 7,5, NaCl 100 mM en forma de disolución salina tamponada de Tris (TBS) y se sedimentaron (20.000 rpm, centrífuga Sorvall RC5C). El sedimento celular se resuspendió en Tris 50 mM, a pH 7,5, se homogeneizó usando un homogeneizador Ultra-Turrax y después se sedimentó como anteriormente. Esto se repitió una vez más, y las células se resuspendieron después en TBS (0,4 ml por placa de 10 cm original de células). La unión a radioligando se llevo a cabo en TBS de volumen final 0,1 ml, que contenía 5-15 fmols de sitios de unión de ^{3}H Ro15-1788. Después de una hora de incubación en hielo las membranas se recogieron en filtros usando un recogedor de células Brandel, se lavaron con TBS frío, y la radiactividad unida se determinó mediante contaje de centelleo. Los receptores \alpha_{1}\beta_{1}\gamma_{2L} recombinantes unieron a ^{3}H Ro15-1788 con alta afinidad (K_{D} 0,4 nM) a niveles de hasta 200 fmoles/placa de 10 cm de células. No se vio unión bien a celulas Ltk^{-} sin transfectar, o bien a células de la población A las cuales no se habían inducido mediante adición de dexametasona al medio de cultivo, confirmando que el ^{3}H Ro15-1788 se unió a los receptores de GABA_{A} \alpha_{1}\beta_{1}\gamma_{2L}recombinantes. La unión de ^{3}H Ro15-1788 se inhibió con flunitrazepam, CL218872, FG8205, \betaCCM, zolpidem, y ^{3}H Ro15-1788, confirmando la farmacología de Bz del receptor recombinante. Dado que está establecido que sólo los receptores de GABA_{A} que contienen una subunidad \alpha, una \beta, y una \gamma muestran unión a BZ (Pritchett, D., y col., Nature, 338, 582-585, 1989) estos datos confirman la naturaleza de los receptores de GABA_{A} \alpha_{1}\beta_{1}\gamma_{2L} recombinantes expresados mediante células de la población A.

b) Electrofisiología

La naturaleza del receptor de GABA_{A} expresado por células de población A se ha caracterizado extensivamente mediante técnicas electrofisiológicas usando pinzamiento zonal de membrana de toda la célula. Sólo las células inducidas mediante cultivo en presencia de dexametasona mostraron respuestras a GABA. Las curvas de respuesta de concentración a GABA proporcionaron un log CE_{50} de 5,2, y un coeficiente de Hill de 1,9. La respuesta a GABA se potenció mediante las BZ funitrazepam y CL218872, mediante el barbiturato fenobarbitona, y mediante el esteroide alfaxalona. La respuesta a GABA se antagonizó tanto mediante biculina como mediante picrotoxina. Todos estos datos electrofisiológicos confirman que el receptor de GABA_{A} recombinante expresado por células de la población A tiene todas las propiedades esperadas de un receptor GABA_{A} de buena fe.

Ejemplo 3 Aislamiento y secuenciación de los cDNA que codifican subunidad de receptor GABA_{A} humano a) Bibliotecas de cDNA

Los cDNAs para \alpha_{3} se clonaron a partir de bibliotecas de cDNA de bacteriófagos lambda de cerebro fetal humano. Todas las bibliotecas de cDNA se construyeron en el vector lambdaZAP, y se compraron de Stratagene (San Diego, California). Rastreando, las bibliotecas de cDNA se plaquearon de acuerdo con las instrucciones del fabricante, a 40.000 de pfu por placa de 137 mm. Las capas de filtro se tomaron usando filtros N Hybond (Amersham) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

c) Aislamiento de cDNA que codifica subunidad \alpha_{3} humana

Un cDNA de \alpha_{3} bovina (obtenido de E. Barnard, Molecular Neurobiology, University of Cambridge, Hills Road, Cambridge; Levitan y col., Nature, 1988, 335, 76) se marcó a alta actividad específica con ^{32}P mediante cebado aleatorio y se usó como una sonda. Los filtros de la biblioteca se prehibridaron durante 3-6 horas a 55ºC en SSPE 5x, disolución de Denhart 5x, SDS al 0,1%, 100 \mug/ml de esperma de salmón, y se hibridaron durante 18 horas, a 55ºC en el mismo tampón, que contenía 0,5-1 x 10^{6} cpm/ml de cDNA de \alpha_{3} bovina marcado con ^{32}P como sonda. Los filtros se lavaron y se expusieron a película de rayos X como se describe anteriormente; los clones de cDNA se rescataron y secuenciaron como se describe anteriormente. El clon más largo de cDNA de \alpha_{3} se pierde en aproximadamente 100 pares de bases del extremo 5' de la región codificante. Esto se obtuvo mediante PCR usando como cebadores un cebador de "ancla" oligonucleotídico derivado de la secuencia cebadora T7 del vector Buescript (5' AGCGCGCGTAATAC
GACTCACTATAAGGGCGAA 3') y un oligonucleótido derivado de secuencia cerca del extremo 5' del cDNA de \alpha_{3} truncado, que contiene un sitio Hpa1 interno (5' CAGCATGAATTGTTAACCTCATTGTA 3'). Los oligonucleótidos se sintetizaron en un sintetizador 380B de Applied Biosystems. PCR se llevó a cabo como se describe anteriormente y se obtuvo un producto de 300 pb el cual se digirió el doble con Hpa1 y Kpn1 y se subclonó dentro del cDNA de \alpha_{3} truncado cortado de forma similar produciendo un cDNA de \alpha_{3} humano de longitud completa. El cDNA se secuenció sobre ambas hebras de DNA como se describe anteriormente. La secuencia nucleotídica del cDNA que codifica la subunidad \alpha_{3} del receptor de GABA_{A}, conjuntamente con la secuencia de aminoácidos deducida de la misma, se muestra en la figura 2 de los dibujos acompañantes.

Ejemplo 4 Aislamiento de los cDNA que codifican subunidades \gamma_{2} Y \beta_{3} del receptor de GABA_{A} humano

La secuencia de \gamma_{2} humana se había publicado previamente por Pritchett y col., Nature, 1989, 338, 582. Se aisló un cDNA de \gamma_{2} humana mediante PCR usando condiciones descritas en otro lugar (Whiting y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 9966-9970), usando biblioteca de cDNA del hipocampo humano como plantilla y cebadores oligonucleotídicos derivados de las regiones no traducidas 5' y 3' de la secuencia publicada de \gamma_{2}, incorporando un sitio de restricción de HindIII: 5' GGGAGGGAAGCTTCTGCAACCAAGAGGC 3', 5' ACCACATAGAAGCT
TATTTAAGTGGAC 3'. La secuenciación indicó que la forma de \gamma_{2} usada es la forma corta, \gamma_{2S}, que carece del inserto de 24 pares de bases en la región del bucle citoplásmico teórico (Whiting y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 9966-9970). La secuencia de \beta_{3} se ha publicado por Wagstaff y col., Am. J. Hum. Genet., 1991, 41, 330-337. Un cDNA de \beta_{3} humano se aisló escaneando una biblioteca de cDNA de cerebro fetal humano (véase ejemplo 3) con una sonda de cDNA de \beta_{3} humana corta que codifica el dominio en lazo citoplásmico teórico el cual se ha obtenido usando PCR.

Los cDNA de \beta_{3} y \gamma_{2S} humanas se subclonaron dentro del vector de expresión en eucariotas pMSGneo (véase ejemplo 1) usando técnicas estándar (cf. Maniatis y col. en Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Nueva York, 2ª edición, 1989).

Ejemplo 5 Preparación de células transfectadas de forma estable que expresan combinación de subunidades \alpha_{3}\beta_{3}\gamma_{2S} del receptor de GABA_{A} humano

El aislamiento de cDNA de \alpha_{3} es como se describe en el ejemplo 3, y el aislamiento de cDNA de \beta_{3} y \gamma_{2S} es como se describe en el ejemplo 4.

Los cDNA de \alpha_{3}, \beta_{3} y \gamma_{2S} humanos se subclonaron dentro del vector de expresión en eucariotas pMSGneo (véase ejemplo 1) usando técnicas estándar (cf. Maniatis y col. en Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Nueva York, 2ª edición, 1989) y líneas celulares estables que expresan receptores de GABA_{A} \alpha_{3}\beta_{3}\gamma_{2S} humanos se establecieron como se describe en el ejemplo 1.

Claims

1. Una línea celular eucariota cotransfectada de forma estable capaz de expresar un receptor de GABA_{A} humano que comprende la combinación de subunidades \alpha_{3}\beta_{3}\gamma_{2}.

2. Una preparación de membrana que contiene combinaciones de subunidades del receptor de GABA_{A} humano derivada del cultivo de células eucariotas cotransfectadas de forma estable como se reivindica en la reivindicación 1.

3. Una preparación como se reivindica en la reivindicación 2 que contiene un receptor de GABA_{A} humano que consta de la combinación de subunidades \alpha_{3}\beta_{3}\gamma_{2S} aislada de las células fibroblásticas Ltk^{-} de ratón cotransfectadas de forma estable.

4. El uso de la línea celular como se reivindica en la reivindicación 1 y preparaciones de membrana derivadas de ella, en rastrear en busca de y diseñar medicamentos que actúan sobre el receptor humano de GABA_{A}.