JP3464672B2

JP3464672B2 - Ｇａｂａ‐ａレセプターを発現させる、安定にトランスフェクトされた細胞系

Info

Publication number: JP3464672B2
Application number: JP51392894A
Authority: JP
Inventors: ハデインガム，カレン・ルイーズ; ホワイテイング，ポール・ジヨン
Original assignee: メルクシヤープエンドドームリミテツド
Priority date: 1992-12-10
Filing date: 1993-12-07
Publication date: 2003-11-10
Anticipated expiration: 2018-11-10
Also published as: DE69333923T2; DE69320985T2; ES2251011T3; US5652100A; DE69334187T2; AU680852B2; ATE170921T1; EP0673419A1; WO1994013799A1; DK0856581T3; EP0673419B1; EP1605046A1; ES2296064T3; EP1605046B1; JPH08504330A; EP0856581B1; ATE311449T1; AU5655494A; DE69333923D1; EP0856581A3

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は細胞系に係わり、特にヒトまたは動物のGABA
_Aレセプターを発現させ得る安定な細胞系に係わる。本
発明はまた、ヒトGABA_Aレセプターの特定のサブユニッ
トをコードする新規なcDNA配列のクローニングにも係わ
る。加えて本発明は、サブタイプ特異的な薬物の設計及
び開発のためのスクリーニング技術における上記細胞系
の使用にも係わる。 γ−アミノ酪酸（GABA）は、中枢神経系において主要
な抑制性神経伝達物質である。この物質は、GABA_Aレセ
プターに固有の塩素（chloride）チャンネルを開くこと
によって急速なシナプス抑制を媒介する。GABA_Aレセプ
ターは分子量230〜270kDaのマルチマータンパク質を含
み、作用物質リガンドGABAの結合部位に加えて、ベンゾ
ジアゼピン、バルビツール酸及びβ−カルボリン（β−
carbolines）を含めた様々な薬物の特異的結合部位を有
する（総説についてはStephenson,Biochem.J.249,p.21,
1988;Olsen及びTobin,Faseb J.４,p.1469,1990;並びにS
ieghart,Trends in Pharmacol.Sci.10,p.407,1989参
照）。分子生物学的研究が明かすところによれば、上記レセ
プターは幾つかの異なる種類のサブユニットによって構
成され、それらのサブユニットは配列類似性に基づいて
４群（α、β、γ及びδ）に分類される。これまでに、
６種のαサブユニット（Schofield等,Nature（London）
328,p.221,1987;Levitan等,Nature（London）335,p.76,
1988;Ymer等,EMBO J.８,p.1665,1989;Pritchett及びSee
berg,J.Neurochem.54,p.802,1990;Luddens等,Nature（L
ondon）346,p.648,1990;及びKhrestchatisky等,Neuron
３,p.745,1989）と、３種のβサブユニット（Ymer等,EM
BO J.８,p.1665,1989）と、２種のγサブユニット（Yme
r等,EMBO J.９,p.3261,1990;及びShivers等,Neuron ３,
p.327,1989）と、１種のδサブユニット（Shivers等,Ne
uron ３,p.327,1989）とが同定されている。これらのサブユニットのうちの多くはその分布が異な
ることがin situハイブリダイゼーションによって解明
され（Sequier等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,p.7815,1
988;Malherbe等,J.Neurosci.10,p.2330,1990;及びShive
rs等,Neuron ３,p.327,1989）、それによって、論理上
いずれのサブユニット同士もその同時配置（co−lo−ca
lisation）により同じレセプター複合体中に存在し得る
旨の推論が可能となった。サブユニットの様々な組み合わせに関して細胞の同時
トランスフェクションを行なうことにより、in vivoの
真正GABA_Aレセプターのものに匹敵する薬理特性を示す
合成のサブユニットの組み合わせが同定されている（Pr
itchett等,Science 245,p.1389,1989;Malherbe等,J.Neu
rosci.10,p.2330,1990;Pritchett及びSeeberg,J.Neuroc
hem.54,p.1802,1990;及びLuddens等,Nature（London）3
46,p.648,1990）。このようなアプローチから、ベンゾ
ジアゼピン感受性の付与には通常α及びβサブユニット
に加えてγ_１もしくはγ_２（Pritchett等,Nature（Lond
on）338,p.582,1989;Ymer等,EMBO J.９,p.3261,1990;及
びMalherbe等,J.Neurosci.10,p.2330,1990）、またはγ
_３（Herb等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,p.1433,1992;K
noflach等,FEBS Lett.293,p.191,1991;及びWilson−Sha
w等,FEBS Lett.284,p.211,1991）も必要であること、及
び発現されるレセプターのベンゾジアゼピンに関する薬
理特性は存在するα及びγサブユニットの同等性に大い
に依存することが判明した。δサブユニットを有するレ
セプター（即ちαβδ）にベンゾジアゼピンが結合する
とは考えられない（Shivers等,Neuron ３,p.327,198
9）。BZ₁型レセプター（α_１β_１γ_２）及びBZ₂型レセ
プター［α_２β_１γ_２またはα_３β_１γ_２（Pritchett
等,Nature（London）338,p.582,1989）］、並びに新規
な薬理特性を有する２種のGABA_Aレセプター［α_５β_２
γ_２（Pritchett及びSeeberg,J.Neurochem.54,p.1802,1
990）及びα_６β_２γ_２（Luddens等,Nature（London）3
46,p.648,1990）］の薬理プロフィールを示すサブユニ
ットの組み合わせが同定されている。発現される上記レ
セプターの薬理特性は、放射性リガンド結合によって脳
組織中に同定されるレセプターのものに類似すると考え
られてはいるが、それにもかかわらず上記レセプターサ
ブユニットの組み合わせがin vivoに存在することは示
されていない。本発明は、GABA_Aレセプターを含む恒常的にトランス
フェクトされた細胞であって、前記レセプターに作用す
る薬物のスクリーニングに有用な細胞の製造に係わる。
GABA_Aレセプターは以前、アフリカツメガエル卵母細胞
（Sigel等,Neuron ５,pp.703−711,1990）及び一時的に
トランスフェクトされた哺乳動物細胞（Pritchett等,Sc
ience 245,pp.1389−1392,1989）において発現された。
しかし、上記系は両方とも一時的な発現しか実現せず、
スクリーニング用としては不適当である。本発明者は今や、上記レセプターの安定な発現を達成
した。従って本発明は、少なくとも１種のαサブユニット
と、少なくとも１種のβサブユニットと、少なくとも１
種のγサブユニットとを含むGABA_Aレセプターを発現さ
せ得る、安定に同時トランスフェクトされた真核細胞系
を提供する。この課題は、GABA_Aレセプターのα、βまたはγサブ
ユニットをコードするcDNAをそれぞれ含む、３個の発現
ベクターで細胞を同時トランスフェクトすることにより
達成された。従って本発明は、更に別の構成において、
GABA_Aレセプターを発現させ得る真核細胞系を調製する
方法も提供し、この方法は真核宿主細胞を少なくとも３
個の発現ベクターで同時トランスフェクトすることを含
み、前記ベクターのうち１個はGABA_Aレセプターのαサ
ブユニットをコードするcDNA配列を含み、別の１個はβ
サブユニットをコードするcDNA配列を含み、更に別の１
個はγサブユニットをコードするcDNA配列を含む。上記
方法で確立した安定な細胞系では、αβγ型GABA_Aレセ
プターが発現される。このように発現される、α、β及
びγサブユニットの独特な組み合わせを含む各レセプタ
ーを、以後“サブユニット組み合わせ型"GABA_Aレセプタ
ーと呼称する。薬理的及び電気生理的データから、本発
明の細胞が発現させるαβγ型組み換えレセプターは天
然型GABA_Aレセプターに期待される諸特性を有すること
が確認された。 GABA_Aレセプターの発現は、様々に異なる宿主細胞に
おいて様々に異なるプロモーター発現系により実現可能
である。真核宿主細胞は、酵母、昆虫細胞及び哺乳動物
細胞を適宜包含する。好ましくは、レセプター発現のた
めの宿主を提供し得る真核細胞は哺乳動物細胞である。
適当な宿主細胞には、齧歯類線維芽細胞系、例えばマウ
スLtk^-、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）及びハム
スター乳児腎臓（BHK）細胞;HeLa細胞；並びにHEK293細
胞が含まれる。必要なレセプターの産生のためには、細
胞系内に少なくとも１種のαサブユニットと、少なくと
も１種のβサブユニットと、少なくとも１種のγサブユ
ニットとを導入しなければならない。このような制限内
でレセプターサブユニットの組み合わせを、スクリーニ
ングの目的とする活性または選択性の種類に従って選択
する。例えば、ベンゾジアゼピン（“BZ"と呼称）はGAB
A_Aレセプターに作用する薬物の１種である。α_１サブユ
ニットの存在がBZ₁型と呼称される薬理特性を有するベ
ンゾジアゼピン類に特異的である一方、α_２〜α_５サブ
ユニットは、まとめてBZ₂型と呼称される異なる薬理プ
ロフィールを規定する。ベンゾジアゼピンの分類におい
てβサブユニットの種類は重要でないが、いずれかのβ
サブユニットは必要である。BZの選択性の規定ではγサ
ブユニットも重要となる。αサブユニットの選択性は存
在する特定のγサブユニットの同等性次第で異なると考
えられる。本発明を最も有効にスクリーニングに用いるために
は、それぞれ異なる組み合わせのサブユニットを保有す
る複数の細胞系のライブラリーを作製することが好まし
い。典型的には５または６種類の細胞系のライブラリー
が上記目的に適う。サブユニットの好ましい組み合わせ
には、α_１β_１γ₂;α_１β_２γ₂;α_２β_１γ₁;α_２β_１
γ₂;α_２β_１γ₃;α_３β_１γ₂;α_３β_１γ₃;α_４β_１γ
₂;α_５β_１γ₂;及びα_６β_１γ_２、特にα_１β_１γ_2Lが
含まれる。特定の一具体例において本発明は、α_１β_３γ_２のサ
ブユニットの組み合わせを含むヒトGABA_Aレセプターを
発現させ得る、安定に同時トランスフェクトされた真核
細胞系を提供する。別の具体例において本発明は、α_２β_３γ_２のサブユ
ニットの組み合わせを含むヒトGABA_Aレセプターを発現
させ得る、安定に同時トランスフェクトされた真核細胞
系を提供する。更に別の具体例では本発明は、α_５β_３γ_２のサブユ
ニットの組み合わせを含むヒトGABA_Aレセプターを発現
させ得る、安定に同時トランスフェクトされた真核細胞
系を提供する。本発明は、α_１β_１γ_2S、α_１β_２γ_２、α_３β_３γ
_２及びα_６β_３γ_２のサブユニットの組み合わせを含む
ヒトGABA_Aレセプターを発現させ得る、安定に同時トラ
ンスフェクトされた真核細胞系も提供する。レセプターサブユニットをコードするDNAは公知のソ
ースから取得可能であり、通常、例えばManiatis等が
“Molecular Cloning:A Laboratory Manual,"Cold Spri
ng Harbor Press,New York,2nd edition,1989に述べて
いるような標準的なクローニングベクターに組み込まれ
た特異的ヌクレオチド配列として得られる。好ましく
は、上記cDNA配列はヒト遺伝子に由来する。しかし、ス
クリーニング用にはウシまたはラットDNAといった、他
の種に由来するcDNAも適当である。公知のGABA_Aレセプ
ターサブユニットcDNAソースは次のとおりである。・ウシα_１、ウシβ₁: Schofield等,Nature 328,pp.211−227,1987 ・ヒトα_１、ヒトβ₁: Schofield等,FEBS Lett.244,pp.361−364,1989 ・ラットα₂: Khrestchatisky等,J.Neurochem.56,p.1717,1991 ・ウシα_２、ウシα₃: Levitan等,Nature 335,pp.76−79,1988 ・ラットα₄: Wisden等,FEBS Lett.289,p.227,1991 ・ウシα₄: Ymer等,FEBS Lett.258,pp.119−122,1989 ・ラットα₅: Pritchett及びSeeberg,J.Neurochem.54,pp.1802−180
4,1990 ・ラットα_６、ウシα₆: Luddens等,Nature 346,pp.648−651,1990 ・ウシβ_２及びβ_３、ラットβ_２及びβ₃: Ymer等,EMBO J.８,pp.1665−1670,1989 ・ヒトβ₃: Wagstaff等,Am.J.Hum.Genet.49,p.330,1991 ・ヒトγ_１、ラットγ_１、ウシγ₁: Ymer等,EMBO J.９,pp.3261−3267,1990 ・ヒトγ₂: Pritchett等,Nature 338,pp.582−585,1989 ・ウシγ₂: Whiting等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 57,pp.9966−997
0,1990 ・ラットγ₃: Herb等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,p.1433,1992;及
びKnoflach等,FEBS Lett.293,p.191,1991 ・マウスγ₃: Wilson−Shaw等,FEBS Lett.284,p.211,1991 ・ラットδ： Shivers等,Neuron ３,p.327,1989 ヒトGABA_Aレセプターの様々なサブユニットをコード
するcDNA配列のうちの幾つかはこれまで入手可能でなか
った。そのようなcDNA配列には特に、α_２、α_３、
α_５、α_６及びβ_２サブユニットをコードする配列が含
まれ、これらのヌクレオチド配列は従って新規である。
本発明者は今や、ヒトGABA_Aレセプターのα_２、α_３、
α_５、α_６及びβ_２サブユニットのcDNA配列を確認し
た。これらのヌクレオチド配列を対応する推定アミノ酸
配列と共に、添付図面の第２図〜第６図に示す。従って
本発明は、幾つかの付加的な構成において、第２図〜第
６図にそれぞれ示した配列または実質的に同様の配列の
全部もしくは一部を含む、ヒトGABA_Aレセプターの
α_２、α_３、α_５、α_６及びβ_２サブユニットをコード
するDNA分子を提供する。本発明による新規なcDNA分子の配列決定は、本明細書
中の実施例３に述べた標準的操作によって好ましく行な
い得、あるいはまたManiatis等が“Molecular Cloning:
A Laboratory Manual,"Cold Spring Harbor Press,New
York,2nd edition,1989に述べているような、当業者に
公知の上記以外の分子クローニング技術によっても可能
である。更に別の構成において、本発明は組み換え発現ベクタ
ーも提供し、このベクターはGABA_Aレセプターサブユニ
ットのヌクレオチド配列を、安定に同時トランスフェク
トされた真核細胞の培養物中で前記GABA_Aレセプターサ
ブユニットの合成を導き得る付加的な配列と共に含む。本明細書中に用いた“発現ベクター”という語は、適
当な宿主内での組み換えDNA配列もしくは遺伝子のクロ
ーン化コピーの転写、及びそのmRNAの翻訳に必要なDNA
配列を意味する。このようなベクターは、真核生物遺伝
子を細菌、藍藻、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞及び動
物細胞などの様々な宿主において発現させるのに用い得
る。ベクターに特定の設計を施せば、DNAを細菌と酵母
細胞、植物細胞または動物細胞との間で移動させること
が可能となる。適当に構築された発現ベクターは、宿主
細胞内での自律複製のための複製起点；選択マーカー；
限られた数の有用な制限酵素部位；大きいコピー数；及
び強いプロモーターを有するべきである。プロモーター
は、RNAポリメラーゼをDNAに結合させてRNA合成を開始
させるDNA配列と定義される。強いプロモーターとは、m
RNAの合成開始を高頻度で惹起するプロモーターのこと
である。発現ベクターには、クローニングベクター、改
変クローニングベクター、特定的に設計したプラスミド
やウイルスが非限定的に含まれる。本明細書中に用いた“クローニングベクター”という
語は、宿主細胞への異種DNA断片の導入に用いられる、
宿主生物において自律複製可能なDNA分子を意味し、こ
のDNA分子は普通小型のプラスミドまたはバクテリオフ
ァージDNAである。ベクターDNAに結び付いた異種DNA
は、組み換え技術によって得られる組み換えDNA分子を
構成する。クローニングベクターにはプラスミド、バク
テリオファージ、ウイルス及びコスミドが含まれ得る。本発明による組み換え発現ベクターは、選択したGABA
_Aレセプターサブユニットのヌクレオチド配列を適当な
前駆体発現ベクター（以後“前駆体ベクター”と呼称）
に、当業者に公知である通常の組み換えDNA法を用いて
挿入することにより作製し得る。前駆体ベクターは市販
のものを入手しても、また公知の発現ベクターから標準
的な技術によって構築してもよい。前駆体ベクターは選
択マーカー、典型的にはネオマイシンまたはアンピシリ
ン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子を適宜有する。
前駆体ベクターは好ましくは、SV40初期スプライシング
及びポリアデニル化領域の近傍に位置するネオマイシン
耐性遺伝子；アンピシリン耐性遺伝子；及び複製起点、
例えばpBR322 oriを含む。ベクターはまた、本発明の細
胞系において転写が制御可能であるように、MMTV−LTR
（デキサメタゾンで誘導可能）やメタロチオニン（亜鉛
で誘導可能）といった誘導性プロモーターも好ましく含
む。このようにすれば、塩素チャンネルがGABA_Aレセプ
ターに内在するために、細胞の毒性の問題が軽減または
回避される。適当な前駆体ベクターの一つに、Clontech Laborator
ies Inc.から入手可能なpMAMneoが有る（Lee等,Nature
294,p.228,1981;及びSardet等,Cell 56,p.271,1989）。
あるいはまた、本明細書中の実施例１に述べたように、
ベクターpMSG及びpSV2neoから前駆体ベクターpMSGneoを
構築することも可能である。そこで、上記前駆体ベクターにGABA_Aレセプターサブ
ユニットcDNAを挿入してクローニングすることにより、
本発明の組み換え発現ベクターを作製する。必要なレセ
プターサブユニットcDNAを、該cDNAを含むベクターから
サブクローン化し、かつ当業者に公知の標準的なクロー
ニング法、特に本明細書中の実施例１、ステップ（ｂ）
に述べたものに類似の技術によって前駆体ベクター、例
えばpMAMneoまたはpMSGneoのポリリンカーの制限酵素部
位、例えばHind III部位に連結する。発現を促進するべ
く上記サブクローニングの前に、サブユニットcDNAの付
加的な５′側非翻訳配列が存在する末端部を改変するこ
とがしばしば有利であり、例えばγ_2LサブユニットDNA
の５′末端部をα_１サブユニットDNA由来の５′側非翻
訳領域の付加によって改変する。本発明の発現ベクターの適当な一例を添付図面の第１
図に示す。図中、記号ＲはGABA_Aレセプターの所与の
α、βまたはγサブユニットのヌクレオチド配列を表わ
しており、図示した発現ベクターのその他の部分は前駆
体ベクターpMSGneoに由来し、本明細書中の実施例１、
ステップ（ａ）及び（ｂ）に述べたように構築されてい
る。本発明の各細胞系には上記のようなベクターが３個必
要となる。それらのベクターのうちの１個はαサブユニ
ットを、別の１個はβサブユニット、更に別の１個はγ
サブユニットをそれぞれ含む。次に、所望のように組み合わせた３個の発現ベクター
で細胞を同時トランスフェクトする。真核細胞のin vit
roトランスフェクションに通常用いられる技術は幾つか
存在する。最も普通に用いられるのはDNAのリン酸カル
シウム沈澱であり（Bachetti等,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 74,pp.1590−1594,1977;Maitland等,Cell 14,pp.133
−141,1977）、本発明の場合にもこの技術が好ましい。組み換えDNAは低いパーセンテージでしか宿主細胞に
取り込まれない。その低率の宿主細胞では、前記DNAは
宿主細胞染色体に組み込まれる。前記組み込みの起こっ
た宿主細胞は、ネオマイシン耐性遺伝子を導入されたこ
とになるので、ネオマイシンの存在下でも増殖する個々
のクローンを単離することにより選択することができ
る。その後、単離したクローンをそれぞれ試験して、レ
セプターを産生するものを同定する。この試験は、例え
ばデキサメタゾンで産生を誘導し、その後レセプターの
存在を放射性リガンド結合によって検出することにより
実施する。更に別の構成において本発明は、安定にトランスフェ
クトされた真核細胞の培養物に由来するGABA_Aレセプタ
ーサブユニットの組み合わせ、特にヒトGABA_Aレセプタ
ーサブユニットの組み合わせから成るタンパク質調製物
を提供する。本発明はまた、安定にトランスフェクトさ
れた真核細胞の培養物に由来するGABA_Aレセプターのサ
ブユニットの組み合わせ、特にヒトGABA_Aレセプターサ
ブユニットの組み合わせを含有する膜調製物も提供す
る。本発明によるタンパク質調製物及び膜調製物は特
に、ヒトGABA_Aレセプターのサブユニットをα_１β_１γ
_2L、α_１β_３γ_２、α_２β_３γ_２、α_５β_３γ_２、α_１
β_１γ_2S、α_１β_２γ_２、α_３β_３γ_２またはα_６β_３
γ_２の組み合わせで適宜含有し、好ましくはα_１β_１γ
_2L、α_１β_３γ_2S、α_２β_３γ_2S、α_５β_３γ_2S、α_１
β_１γ_2S、α_１β_２γ_2S、α_３β_３γ_2Sまたはα_６β_３
γ_2Sのサブユニットの組み合わせから成るヒトGABA_Aレ
セプターを含有する。特に好ましい一具体例において、
本発明は、安定にトランスフェクトされたマウスLtk^-線
維芽細胞から単離された、α_１β_１γ_2L、α_１β
_３γ_2S、α_２β_３γ_2S、α_５β_３γ_2S、α_１β_１γ_2S、
α_１β_２γ_2S、α_３β_３γ_2Sまたはα_６β_３γ_2Sのサブ
ユニットの組み合わせから成るヒトGABA_Aレセプターを
含有する細胞膜を提供する。本発明による細胞系及び該細胞系由来の膜調製物は、
GABA_Aレセプターに作用する薬物、例えばベンゾジアゼ
ピン、バルビツール酸、β−カルボリン及びニューロス
テロイドのスクリーニング及び設計に有用である。従っ
て本発明は、先に述べた細胞系及び該細胞系に由来する
膜調製物の、GABA_Aレセプターに作用する薬物のスクリ
ーニング及び設計への使用を提供する。これに関連して
特に重要であるのは、サブユニットの組み合わせを変化
させた時、GABA_Aレセプターと選択的に相互作用し得る
分子である。直ちに明らかであろうが、本発明による細
胞系及び該細胞系に由来する膜調製物は、様々なGABA_A
レセプターサブタイプの構造、薬理特性及び機能の研究
にとって理想的な系をもたらす。本発明を、以下の非限定的実施例によって詳述する。実施例１ α_１β_１γ_2Lトランスフェクト細胞の調製ａ）真核発現ベクターpMSGneoの構築ベクターpMSG（Pharmacia Biosystems Limited,Milto
n Keynes,United Kingdomから購入）のgpt構造遺伝子及
びSV40ポリアデニル化シグナルを含む約2500塩基対のHi
nd III−EcoR I断片を、pSV2neo（P.J.Southern及びP.
J.Berg,Molecular and Applied Genetics １,pp.327−3
41,1982）のネオマイシン耐性遺伝子Neo^r及びSV40ポリ
アデニル化シグナルを含む約2800塩基対のHind III−Ec
oR I断片によって置き換えた。次に、EcoR I及びHind I
II部位を制限消化、Klenowポリメラーゼでのブラント末
端形成及び再結合によって取り除いた。その後、EcoR I
及びHind IIIクローン化部位をポリリンカーのXho I及
びSma I部位に、EcoR I及びHind IIIリンカーを用いる
通常の技術によって挿入した。ｂ）pMSGneo中へのサブユニットcDNAのクローニングウシGABA_Aレセプターα_１及びβ₁cDNAをMolecular Ne
urobiology Unit,MRC Center,Hills Road,Cambridgeか
ら得た（P.Scholfield等,Nature 328,pp.221−227,198
7）。ウシγ₂cDNAをP.Whiting等の方法（Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 87,pp.9966−9970,1990）によってクローン
化した。ウシα₁cDNAはpbGRαsenseから、EcoR Iで消化
し、Klenowポリメラーゼで前記DNAにブラント末端を形
成し、結合によってHind IIIリンカーを付加し、Hind I
IIで消化し、かつpMSGneoのHind III部位に結合させる
ことによってサブクローン化した。ウシβ₁cDNAはpbGR
βsenseから、EcoR Iで制限消化し（部分消化）、Kleno
wポリメラーゼでブラント末端を形成し、Hind IIIリン
カーを結合させ、Hind IIIで制限消化し、かつpMSGneo
のHind III部位に結合させることによってサブクローン
化した。ウシγ₂cDNAはpMSGneo中へのサブクローニング
に際し、公表されている配列から次のようにして改変し
た。公表されているγ₂cDNA配列の５′末端にウシα₁cD
NAの５′側非翻訳領域（公表されている配列の塩基番号
60〜200）を、該領域をポリメラーゼ連鎖反応を用いて
増幅し、得られた生成物をγ₂cDNAの５′BamH I部位（S
tratagene,San Diego,U.S.A.から購入したBluescript S
k^-クローニングベクターのポリリンカー中の部位）及び
Hind III部位に挿入してサブクローン化することにより
付加した。次に、改変したγ₂cDNAを、Xba Iで消化し
（クローニングベクターのポリリンカー中の部位）、Kl
enowポリメラーゼでブラント末端を形成し、Xho Iリン
カーを結合させ、Xho Iで消化し（クローニングベクタ
ーのポリリンカー中の部位）、かつpMSGneoのXho I部位
に結合させることによりpMSGneo中へサブクローン化し
た。ｃ）マウスLtk^-細胞の同時トランスフェクション Salk Institute for Biological Studies,San Diego,
CaliforniaからLtk^-細胞を入手した。この細胞を、ペニ
シリン、ストレプトマイシン及び10％ウシ胎児血清を含
有する改変イーグル培地中で５〜８％のCO₂の存在下に3
7℃で増殖させた。同時トランスフェクションに用い
る、GABA_AレセプターサブユニットDNAを含む発現ベクタ
ーを標準的な手順（C.Chen及びH.Okayama,BioTechnique
s ６,pp.632−638,1988）で調製した。同時トランスフ
ェクションのためにLtk^-細胞を、培養皿に植え込んで
（約２×10⁵細胞／皿）一晩増殖させた。トランスフェ
クションは、キット（5 Prime→3 Prime Products,West
chester,Pennsylvaniaから市販）を用いるリン酸カルシ
ウム沈澱法で実施した。製造者の指示に従い、各サブユ
ニットDNA構築物を10cm培養皿１枚の細胞に５μｇずつ
用いて同時トランスフェクションを行なった。２日間培
養後、細胞を、1mg/mのネオマイシンを含有する培地
［Geneticin（Gibco BRL,Paisley,Scotland,U.K.から入
手可能）］に1:8の量で分割した。その１週間後に濃度
を1.5mg/mに高め、更にその１週間後2mg/mに高め
た。細胞の耐性クローンを単離し、クローニングシリン
ダーを用いてサブクローン化した。サブクローンを、放
射性リガンド結合法を用いて分析した。即ち、サブクロ
ーンを10cm培養皿内で増殖させ、集密状態となったとこ
ろで１μＭのデキサメタゾンを含有する培地（Sigma Ch
emical Company,Poole,Dorset,United Kingdomから入手
可能）に移した。３〜５日後に細胞を回収し、膜を調製
してこの膜を、ベンゾジアゼピン拮抗物質³H Ro15−178
8［New England Nuclear,Du Pont（U.K.）Ltd.,Stevena
ge,United Kingdomから入手］を用いる放射性リガンド
結合法（下記実施例２、ステップ（ａ）参照）に用い
た。³H Ro15−1788結合が最も多く生起したクローン
を、限界稀釈によって単一細胞からサブクローン化し
た。得られた細胞クローン集団を、後述の際には“集団
A"と呼称する。実施例２ α_１β_１γ_2Lトランスフェクト細胞の特性解明ａ）放射性リガンド結合法実施例１に述べたように調製した組み換えα_１β_１γ
_2L型GABA_Aレセプターの性質を、ベンゾジアゼピン（B
Z）拮抗物質³H Ro15−1788を用いてBZ結合の薬理特性を
解明することにより確認した。放射性リガンド結合アッ
セイのために、デキサメタゾン含有培地中での３〜５日
間の培養によって生じた細胞を掻き取ってpH7.5の50mM
Tris、Trisで緩衝された生理的食塩水（TBS）の形態の1
00mM NaCl中に投じ、かつペレット化した（Sorvall RC5
C遠心機;20,000rpm）。細胞ペレットをpH7.5の50mM Tri
s中に再懸濁させ、Ultra−Turraxホモジナイザーを用い
てホモジネート化し、その後上記と同様にしてペレット
化した。前記操作を再度繰り返した後、細胞を（元の10
cm培養皿１枚の細胞につき0.4mの）TBS中に再懸濁さ
せた。放射性リガンド結合は、５〜15fmolの³H Ro15−1
788結合部位を含有する最終量0.1mのTBS中で実現させ
た。氷上で１時間インキュベーション後、膜を、Brande
l細胞回収装置を用いてフィルター上に回収し、かつ低
温のTBSで洗浄し、結合した放射能をシンチレーション
計数によって測定した。α_１β_１γ_2L型組み換えレセプ
ターは³H Ro15−1788を高い親和性（K_D0.4nM）で結合さ
せ、結合レベルは10cm培養皿１枚の細胞当たり200fmol
に達した。トランスフェクトしなかったLtk^-細胞や、培
地にデキサメタゾンを添加せずに生じさせた集団Ａの細
胞では結合がみられず、この事実によって³H Ro15−178
8はα_１β_１γ_2L型の組み換えGABA_Aレセプターに結合す
ることが確証された。³H Ro15−1788結合がフルニトラ
ゼパム、CL218872、FG8205、βCCM、ゾルピデム（zolpi
dem）及びRo15−4513によって阻害されたことから、上
記組み換えレセプターのBZに関する薬理特性を確認し
た。α、β及びγサブユニットを有するGABA_Aレセプタ
ーのみがBZを結合させることが確定している（D.Pritch
ett等,Nature 338,pp.582−585,1989）ので、集団Ａの
細胞が発現させるα_１β_１γ_2L型組み換えGABA_Aレセプ
ターの性質は上記諸データから確認される。ｂ）電気生理的特性集団Ａの細胞が発現させたGABA_Aレセプターの性質
を、全細胞パッチクランプを用いる電気生理技術によっ
て広範に解明した。デキサメタゾンの存在下での培養に
よって生じた細胞のみがGABAへの応答を示した。GABAに
対する濃度応答の曲線からは、5.2のlogEC₅₀値と1.9の
ヒル係数とが得られた。GABAへの応答をBZのフルニトラ
ゼパム及びCL218872によって、バルビツール酸のペント
バルビトンによって、並びにステロイドのアルファキサ
ロン（alphaxalone）によって増強した。GABAへの応答
をビククリン（bicuculline）とピクロトキシンとの両
方によって拮抗させた。これらの電気生理データは総
て、集団Ａの細胞が発現させた組み換えGABA_Aレセプタ
ーが真正のGABA_Aレセプターに期待される全特性を有す
ることを確証している。実施例３ヒトGABA_Aレセプターのα_２、α_３、α_５、α_６及びβ
_２サブユニットをコードするcDNAの単離及び配列決定ａ）cDNAライブラリーヒト胎児大脳（α_２、α_３）、海馬（α_５、β_２）及
び小脳（α_６）λバクテリオファージcDNAライブラリー
からcDNAをクローン化した。上記cDNAライブラリーはい
ずれもλZAPベクターにおいて構築されたもので、Strat
agene（San Diego,California）から購入した。スクリ
ーニングのためにcDNAライブラリーを、製造者の指示に
従い137mm径プレート１枚当たり40,000pfuで平板培養し
た。プラーク（filter lifts）を、製造者の指示に従い
Hybond Nフィルター（Amersham）を用いて採取した。ｂ）ヒトα_２サブユニットをコードするcDNAの単離ウシα₂cDNA（E.Barnard,“Molecular Neurobiolog
y,"University of Cambridge,Hills Road,Cambridge;Le
vitan等,Nature 335,p.76,1988から取得）をランダムプ
ライミングにより³²Pで高特異活性（＞１×10⁹cpm/μ
ｇ）に標識し、プローブとして用いた。ライブラリーフ
ィルター（８レプリカフィルター）を、５倍SSPE［１倍
SSPEは0.18M NaCl、0.01M Na₃PO₄（pH7.4）、1mM EDT
A］、５倍Denhardt溶液、100μg/mサケ精子DNA、0.1
％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、30％ホルムアミド
中で42℃において３〜６時間プレハイブリダイズした。
ハイブリダイゼーション緩衝液1m当たり0.5×10⁶〜１
×10⁶cpmの³²P標識プローブを含有させた上記と同じ緩
衝液中で42℃において18時間、ハイブリダイゼーション
を行なった。フィルターを55℃において５倍SSPE（15分
ずつ２回）及び１倍SSPE（15分ずつ２回）で洗浄し、こ
のフィルターをKodak XARフィルムに１〜３日間露出し
た。陽性クローンを標準的な技術でプラーク精製し、Bl
uescriptプラスミド（Stratagene）を製造者の指示に従
って“回収（rescue）”した。cDNAクローンをその両鎖
に関して、Sequenase II酵素（United States Biochemi
cals）を用いる標準的技術によって配列決定した。ヒト
GABA_Aレセプターのα_２サブユニットをコードするcDNA
のヌクレオチド配列を該配列に対応する推定アミノ酸配
列と共に、添付の図面の第２図に示す。ｃ）ヒトα_３サブユニットをコードするcDNAの単離ウシα₃cDNA（E.Barnard,“Molecular Neurobiolog
y,"University of Cambridge,Hills Road,Cambridge;Le
vitan等,Nature 335,p.76,1988から取得）をランダムプ
ライミングにより³²Pで高特異活性に標識し、プローブ
として用いた。ライブラリーフィルターを５倍SSPE、５
倍Denhardt溶液、0.1％SDS、100μg/mサケ精子DNA中
で55℃において３〜６時間プレハイブリダイズし、か
つ、プローブとして0.5×10⁶〜１×10⁶cpm/mの³²P標
識ウシα₃cDNAを含有させた前記と同じ緩衝液中で55℃
において18時間ハイブリダイズした。フィルターを先に
述べたのと同様に洗浄し、Ｘ線フィルムに露出した。cD
NAクローンを先に述べたのと同様に回収し、かつ配列決
定した。最長のα₃cDNAクローンはコーディング領域の
５′末端部の約100bpを欠いていた。この欠失部は、プ
ライマーとしてBluescripベクターのT7プライマー配列
に由来するオリゴヌクレオチド“アンカー”プライマー
（５′AGCGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAA3′）と、截
頭（truncated）α₃cDNAの５′末端近傍の配列に由来す
る、内部にHpa I部位を有するオリゴヌクレオチド
（５′CAGCATGAATTGTTAACCTCATTGTA3′）とを用いるPCR
によって獲得した。上記オリゴヌクレオチドはApplied
Biosystems 380B合成装置で合成した。上記のようなPCR
を行なって300bpのPCR生成物を得、これをHpa I及びKpn
Iで二重消化し、かつ同様に切断した截頭α₃cDNAに挿
入してサブクローン化することにより、完全長のヒトα
₃cDNAを得た。このcDNAを両鎖に関して、先に述べたの
と同様に配列決定した。ヒトGABA_Aレセプターのα_３サ
ブユニットをコードするcDNAのヌクレオチド配列を該配
列に対応する推定アミノ酸配列と共に、添付図面の第３
図に示す。ｄ）ヒトα_５サブユニットをコードするcDNAの単離ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって得たラットα₅
cDNAをプローブとして用いて、cDNAライブラリーをスク
リーニングした。PCRのためのオリゴヌクレオチドプラ
イマーの配列として、公表されているα₅cDNA配列（Khr
estchatisky等,Neuron ３,p.745,1989）から、サブクロ
ーニングのためのHind III部位を有する５′ATTATTCAAG
CTTGCCATGGACAATGGAATGCTC3′（bp114〜148）及び５′G
GTTTCCAGCTTACTTTGGGAGAGGTAGC3′（bp1507〜1535）を
得た。PCRと、分析目的でのPCR生成物のBluescript SK^-
ベクター（Stratagene）中へのサブクローニングとは、
鋳型としてラット大脳cDNAを用いた以外は他の文献（Wh
iting等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,p.9966,1990）に
述べられているのと同様に行なった。ラットα₅cDNAを
³²Pで標識し、これを用いてヒト海馬cDNAライブラリー
をスクリーニングし、陽性のα₅cDNAクローンを先にα₂
cDNAに関して述べたのと同様に回収し、かつ配列決定し
た。ヒトGABA_Aレセプターのα_５サブユニットをコード
するcDNAのヌクレオチド配列を該配列に対応する推定ア
ミノ酸配列と共に、添付図面の第４図に示す。ｅ）ヒトα_６サブユニットをコードするcDNAの単離 PCRによって得たラットα₆cDNAをプローブとして用い
て、cDNAライブラリーをスクリーニングした。PCRは、
公表されているラットα₆cDNA配列（Luddens等,Nature
346,p.648,1990）に由来する、サブクローニングのため
のEcoR I部位を有するオリゴヌクレオチドプライマー
５′GAGGAAGAATTCAGGAGGGTGACCT3′（bp48〜72）及び
５′GAAAATAACGAATTCCAGTGTCCAGCTTT3′（bp1376〜140
4）を用いて、先にα₅cDNAに関して述べたのと同様に行
なった。PCRによって単離したラットα₆cDNAクローンを
³²Pで標識し、これを用いてヒト小脳cDNAライブラリー
を、先にα₂cDNAに関して述べたのと同様にスクリーニ
ングした。陽性のα₆cDNAクローンを先に述べたのと同
様に精製し、回収し、かつ配列決定した。いずれのcDNA
も完全なコーディング領域は有しなかった。完全長のcD
NAを得るべく、好ましい制限部位を用いて３個のクロー
ンを一つに結合した。ヒトGABA_Aレセプターのα_６サブ
ユニットをコードするcDNAのヌクレオチド配列を該配列
に対応する推定アミノ酸配列と共に、添付図面の第５図
に示す。ｆ）ヒトβ_２サブユニットをコードするcDNAの単離ヒトβ₂cDNAを、PCRによって得た短小型ヒトβ₂cDNA
をプローブとして用いて単離した。PCRは、公表されて
いるラットβ₂cDNA配列（Ymer等,EMBO J.８,p.1665,198
9）に由来する、サブクローニングのためのEcoR I部位
を有するオリゴヌクレオチドプライマー５′CAAAAGAATT
CAGCTGAGAAAGCTGCTAATGC3′（bp1088〜1119）及び５′T
CAGGCGAATTCTCTTTTGTGCCACATGTCGTTC3′（bp1331〜136
4）を用いて、（鋳型としてヒト小脳cDNAライブラリー
を用いた以外は）先に述べたのと同様に行なった。PCR
によって得たヒトβ₂cDNAクローンを³²Pで放射性標識
し、これを用いてヒト海馬cDNAライブラリーを、先にα
₂cDNAに関して述べたのと同様にスクリーニングした。
得られた最長のcDNAクローンはβ_２サブユニットコーデ
ィング領域の５′末端部の500bpを欠いていた。この欠
失部は、プライマーとしてBluescriptベクターのT7プラ
イマー配列に由来するオリゴヌクレオチド“アンカー”
プライマー（５′AGCGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAA
3′）と、截頭β₂cDNAの５′末端近傍の配列に由来す
る、Kpn I部位を有するオリゴヌクレオチド（５′CATCC
AGTGGGTACCTCCTTAGGT3′）とを用いるPCRによって獲得
した。上記のようなPCRを行なって700bpのPCR生成物を
得、これをKpn Iで消化し、かつ（やはりKpn Iで消化し
た）截頭cDNAクローンに挿入してサブクローン化するこ
とにより、完全長のヒトβ₂cDNAを得た。ヒトGABA_Aレセ
プターのβ_２サブユニットをコードするcDNAのヌクレオ
チド配列を該配列に対応する推定アミノ酸配列と共に、
添付図面の第６図に示す。実施例４ヒトGABA_Aレセプターのα_１β_３γ_2S、α_２β_３γ_2S及
びα_５β_３γ_2Sのサブユニットの組み合わせを発現させ
る、安定にトランスフェクトされた細胞の調製ヒトα_２及びα₅cDNAの単離法及び配列については実
施例３に述べた。ヒトα₁cDNAの配列は以前、Schofield
等によってFEBS Lett.244,p.361,1989に公表された。こ
の配列はウシの配列と、１個のアミノ酸の位置でしか相
違しない（ウシα_１の95位のTrpがヒトα_１ではArg）。
ヒトα₁cDNAを創出するべく、他の文献（K.Wafford及び
P.Whiting,FEBS Lett.313,pp.113−117,1992）に述べら
れている方法を用いてウシの配列を、オリゴヌクレオチ
ド５′GCAATGAAAATCCGGACTGGCAT3′による95位アミノ酸
対応配列の部位特異的突然変異誘発処理（site directe
d mutagenesis）によってヒトの配列に変換した。ヒトγ₂cDNAの配列は、以前にPritchett等がNature 3
38,p.582,1989に公表している。ヒトγ₂cDNAは、他の文
献（Whiting等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,pp.9966−9
970,1990）に述べられている条件の下に鋳型としてのヒ
ト海馬cDNAライブラリーと、公表されているγ₂cDNA配
列の５′側及び３′側非翻訳領域に由来する、Hind III
制限部位を有するオリゴヌクレオチドプライマー５′GG
GAGGGAAGCTTCTGCAACCAAGAGGC3′及び５′ACCACATAGAAGC
TTATTTAAGTGGAC3′とを用いるPCRによって単離した。配
列決定によって、用いたγ_２の形態は推定細胞質ループ
領域内の24bpの挿入配列を欠く短小形態（γ_2S）（Whit
ing等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,pp.9966−9970,199
0）であることが判明した。ヒトβ₃cDNAの配列はWagsta
ff等によって、Am.J.Hum.Genet.41,pp.330−337,1991に
公表されている。ヒトβ₃cDNAは、PCRを用いて得た、推
定細胞質ループドメインをコードする短小型ヒトβ₃cDN
Aプローブでヒト胎児大脳cDNAライブラリー（実施例３
参照）をスクリーニングすることによって単離した。ヒトα_１、α_２、α_５、β_３及びγ_2ScDNAを、標準的
な技術（Maniatis等の“Molecular Cloning:A Laborato
ry Manual,"Cold Spring Harbor Press,New York,2nd e
dition,1989参照）を用いて真核発現ベクターpMSGneo
（実施例１参照）に挿入してサブクローン化し、ヒトα
_１β_３γ_2S型、α_２β_３γ_2S型及びα_５β_３γ_2S型GABA
_Aレセプターを発現させる安定な細胞系を実施例１に述
べたようにして確立した。実施例５ヒトGABA_Aレセプターのα_１β_１γ_2S、α_１β_２γ_2S、
α_３β_３γ_2S及びα_６β_３γ_2Sのサブユニットの組み合
わせを発現させる、安定にトランスフェクトされた細胞
の調製 α_３及びα₆cDNAを実施例３に述べたように単離し、
またα_１、β_３及びγ_2ScDNAを実施例４に述べたように
単離した。ヒトβ_１サブユニットcDNAは、先に述べたヒ
ト大脳cDNAからPCRによって単離した。PCRに用いたオリ
ゴヌクレオチドプライマーは公表されているヒトβ₁cDN
A配列（Schofield等,FEBS Lett.244,pp.361−364,198
9）の、サブクローニングのためのHind III制限酵素部
位を有する５′側及び３′側非翻訳領域５′TAATCAAGCT
TAGTAATGTGGACAGTACAAAAT3′及び５′AAATGGAAGCTTTAGA
ACAGACCTCAGTGTACA3′に由来した。ヒトα_１、α_３、α
_６、β_１、β_２、β_３及びγ_2ScDNAを、標準的な技術
（Maniatis等の“Molecular Cloning:A Laboratory Man
ual,"Cold Spring Harbor Press,New York,2nd editio
n,1989参照）を用いて真核発現ベクターpMSGneo（実施
例１参照）に挿入してサブクローン化し、ヒトα_１β_１
γ_2S型、α_１β_２γ_2S型、α_３β_３γ_2S型及びα_６β_３
γ_2S型GABA_Aレセプターを発現させる安定な細胞系を実
施例１に述べたようにして確立した。

【配列表】

配列番号:1 配列の長さ:2310 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:cDNA 配列の特徴特徴を表わす記号:CDS 存在位置:298..1683 配列配列番号:2 配列の長さ:462 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号:3 配列の長さ:1408 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:cDNA 配列の特徴特徴を表わす記号:CDS 存在位置:27..1385 配列配列番号:4 配列の長さ:453 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号:5 配列の長さ:1866 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:cDNA 配列の特徴特徴を表わす記号:CDS 存在位置:225..1646 配列配列番号:6 配列の長さ:474 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号:7 配列の長さ:2189 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:cDNA 配列の特徴特徴を表わす記号:CDS 存在位置:214..1566 配列配列番号:8 配列の長さ:451 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号:9 配列の長さ:1638 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:cDNA 配列の特徴特徴を表わす記号:CDS 存在位置:87..1562 配列配列番号:10 配列の長さ:492 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｒ 1:91 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 ＢＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ホワイテイング，ポール・ジヨンイギリス国、エセツクス・シー・エム・ 20・２・キユー・アール、ハーロウ、イーストウイツク・ロード、ターリングス・パーク、ニユーロサイエンス・リサーチ・センター（番地なし) (56)参考文献特表平３−503598（ＪＰ，Ａ) 特表平４−504123（ＪＰ，Ａ) 米国特許5166066（ＵＳ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ，1987年，Ｖｏｌ．328, ｐ．221−227 Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，1990年, Ｖｏｌ．54，Ｎｏ．５，ｐ．1802−1804 Ｎａｔｕｒｅ，1990年，Ｖｏｌ．346, ｐ．648−651 ＥＭＢＯＪ．，1989年，Ｖｏｌ. ８，Ｎｏ．６，ｐ．1665−1670 Ｎａｔｕｒｅ，1989年，Ｖｏｌ．338, ｐ．582−585 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/00 - 16/46 C12N 5/00 - 5/28 G01N 33/00 - 33/98 C12Q 1/00 - 1/70 A61K 31/00 - 48/00 A61P 1/00 - 43/00 C12P 21/00 - 21/08 ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】α_１β_３γ_２、α_２β_３γ_２、α_５β_３γ
_２、α_１β_１γ_2S、α_１β_２γ_２、α_３β_３γ_２および
α_６β_３γ_２から成る群より選択されるサブユニットの
組み合わせを含むヒトGABA_Aレセプターを発現するDNAで
安定に同時トランスフェクトされた齧歯類繊維芽細胞
株。
【請求項２】マウス繊維芽細胞Ltk−細胞株である請求
項１に記載の細胞株。
【請求項３】ヒトGABA_Aレセプターを発現するDNAで安定
に同時トランスフェクトされた齧歯類繊維芽細胞株に由
来する膜調製物であって、ヒトGABA_Aレセプターが、α
_１β_３γ_２、α_２β_３γ_２およびα_５β_３γ_２から成る
群より選択されるサブユニットの組合わせから成る前記
膜調製物。
【請求項４】ヒトGABA_Aレセプターを発現するDNAで安定
に同時トランスフェクトされた齧歯類繊維芽細胞株に由
来する膜調製物であって、ヒトGABA_Aレセプターが、α
_１β_１γ_2S、α_１β_２γ_２および、α_３β_３γ_２α_６β
_３γ_２から成る群より選択されるサブユニットの組合わ
せから成る前記膜調製物。
【請求項５】マウスLtk−線維芽細胞株由来の請求項３
または４に記載の膜調製物。
【請求項６】ヒトGABA_Aレセプターに対して活性な医薬
のスクリーニング方法であって、請求項１または２に記
載の細胞株または該細胞株由来の膜調製物を使用する前
記方法。
【請求項７】ヒトGABA_Aレセプターに対して活性な医薬
を設計する方法であって、請求項１または２に記載の細
胞株または該細胞株由来の膜調製物を使用する前記方
法。