JP3361591B2 - Ｅａａ３族のカイネート結合ヒトｃｎｓレセプター - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は神経生物学の分野におけ
る組換えＤＮＡ技術の応用に関する。さらに本発明は興
奮性アミノ酸（ＥＡＡ）系レセプター、特にヒトＥＡＡ
レセプターをコードするＤＮＡのクローニング及び発現
に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】哺乳類
中枢神経系（ＣＮＳ）においては、神経インパルスの伝
達は、「送信」ニューロンにより放出され、次いで”受
信”ニューロンの表面レセプターと結合してその興奮を
引き起こす神経伝達物質間の相互作用により制御され
る。Ｌ−グルタメートはＣＮＳにおける最多量神経伝達
物質であって、脊椎動物の主要興奮経路を媒介する。し
たがってグルタメートは興奮性アミノ酸（ＥＡＡ）と呼
称され、これに応答するレセプターはグルタメートレセ
プターまたはより一般的にはＥＡＡレセプターなどと種
々に呼称される。

【０００３】哺乳類の脳から単離した組織及び種々の合
成ＥＡＡレセプター作動薬を用いて、ＥＡＡレセプター
薬理学の認識は多少改善された。ＥＡＡレセプター族の
構成員は現在、このような作動薬との示差的結合に基づ
いて主に３つの型に分類されている。グルタメートの他
に作動薬ＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート）
にも結合する型のＥＡＡレセプターはＮＭＤＡ型のＥＡ
Ａレセプターと呼ばれる。ＮＭＤＡと結合しない他の２
種のグルタメート結合型のＥＡＡレセプターは、他のＥ
ＡＡレセプター作動薬との結合選択性に従って、ＡＭＰ
Ａ（α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−イソキ
サゾール−４−プロピオネート）及びカイネート（２−
カルボキシ−４−（１−メチルエテニル）−３−ピロリ
ジンアセテート）と呼称される。特に、グルタメートと
は結合するがＮＭＤＡとは結合せず、ＡＭＰＡよりもカ
イネートに対して高親和性で結合するレセプターは、カ
イネート型ＥＡＡレセプターと呼称される。同様に、グ
ルタメートとは結合するがＮＭＤＡとは結合せず、カイ
ネートよりも高親和性でＡＭＰＡと結合するＥＡＡレセ
プターは、ＡＭＰＡ型ＥＡＡレセプターと呼称される。

【０００４】グルタメート結合ＥＡＡレセプター族は、
生理学的及び医学的に重要である。グルタメートは長期
増強作用（学習及び記憶）の多数の局面、シナプス可塑
性の発達、癲癇性発作、発作または他の低酸素性症状後
の虚血により引き起こされるニューロン損傷、及び他の
形態の神経変性過程に関与する。しかしながら、これら
の過程を変調する治療薬の開発は、ＥＡＡレセプターの
界面で特異的に相互作用する薬剤分子を見いだすために
該薬剤分子が選択的に結合する同種源のレセプター物質
が欠如していることから非常に困難であった。候補薬を
スクリーニングするために一般に用いられる脳由来組織
は異種レセプター源であって、問題のＥＡＡレセプター
／リガンド界面の研究を妨げる多数のレセプター型をそ
の表面に有する。ヒト治療薬の研究は、ヒト起源の脳組
織の入手可能性が制限されているためにさらに込み入っ
ている。したがって、問題のレセプターのみを産生する
ように遺伝子組換えされた細胞を得るのが望ましい。ク
ローン化レセプター遺伝子を発現する細胞株を用いる
と、所望のレセプターに関して同種であり、薬剤スクリ
ーニングプログラムに有用な物質が提供される。

【０００５】カイネート結合型のＥＡＡレセプターをコ
ードすると思われる非ヒトｃＤＮＡが報告されている。
Ｅｇｅｂｊｅｒｇら（Ｎａｔｕｒｅ ３５１： ７４
５，１９９１）及びＷＯ９１／０６６４８は、各々Ｇｌ
ｕＲ６と呼称されるラットからのｃＤＮＡ単離物につい
て記載しているが、この単離物はＡＭＰＡレセプター遺
伝子に関連する配列を有するものの、ＡＭＰＡによって
活性化されるのではなく、むしろグルタメート、キスカ
レート及び優先的にはカイネートにより活性化されるレ
セプターを形成する。ホモマーとして発現された場合に
イオンチャネル特性を容易に示さない他のカイネート結
合タンパク質もカエル（Ｗａｄａら，Ｎａｔｕｒｅ ３
４２： ６８４， １９８９）、ニワトリ（Ｇｒｅｔｏ
ｒら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２： ６８９， １９８９；
Ｅｓｈａｒら， ＦＥＢＳＬｅｔｔ． ２９７： ２
５７， １９９２）、マウス（Ｓａｋｉｍｕｒａら，
Ｎｅｕｒｏｎ ８： ２６７， １９９２）及びラット
（Ｗｅｒｎｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ３５１： ７４２，
１９９１； Ｂｅｔｔｌｅｒら， Ｎｅｕｒｏｎ
８： ２５７， １９９２； Ｈｅｒｂら， Ｎｅｕｒ
ｏｎ ８：７７５， １９９２）からクローニングされ
ている。

【０００６】これらの分子クローニングの進展により、
ＥＡＡレセプター及びそのサブユニットの構造特徴はラ
ット脳に存在する場合と同様に詳しく解明されるように
なった。ＥＡＡレセプター構造の一般モデルによれば、
各々は個々の膜固定サブユニットから構成されるヘテロ
マー構造であり、各々４つのトランスメンブラン領域
と、リガンド結合特性をある程度まで指令し、レセプタ
ー複合体により提供されるイオン−ゲーティング機能に
寄与する細胞外ドメインとを有する。

【０００７】ヒトのＣＮＳ疾患を治療するのに有用な治
療薬の研究においては、ヒトＥＡＡレセプターについて
の知識を得るのが非常に望ましい。これらのヒトレセプ
ターを特別に解明することにより、該レセプターと反応
する化合物をスクリーニングする手段、即ちレセプター
活性を刺激または抑制するための手段を提供し、したが
ってヒトにおける有力な治療効用を有する化合物を同定
するための手段を提供することができる。非ヒト哺乳動
物モデルは、レセプター配列相同度が高いにもかかわら
ず、異種からの同一レセプターの種同族体間の僅かな配
列の不一致により劇的な薬理学的変異を生じるのでこの
目的には適していない（Ｏｋｓｅｎｂｅｒｇら， Ｎａ
ｔｕｒｅ，３６０：１６０，１９９２）。したがって、
ヒトにおいて治療的に有用な化合物の適正なスクリーニ
ング法を開発するためには、ヒトＥＡＡレセプターをコ
ードするクローン化ｃＤＮＡ、及び均質にこれらのレセ
プターを発現する細胞系を提供するのが特に望ましい。
したがって、これらが本発明の目的である。

【０００８】本発明の別の目的は、ヒトＥＡＡレセプタ
ーをコードするＤＮＡ分子を単離形態で提供することで
ある。

【０００９】本発明の別の目的は、カイネート結合ヒト
ＥＡＡレセプターを産生するように遺伝子組換えされた
細胞を提供することである。

【００１０】本発明の他の目的は以下の説明に明示され
る。

【００１１】

【課題を解決するための手段】ＥＡＡレセプターに特徴
的な親和性でグルタメートに結合する以外にもカイネー
ト型ＥＡＡレセプターに特徴的なリガンド結合特性をも
示すＥＡＡレセプター族をコードするポリヌクレチドが
ここに同定及び特徴付けされた。このヒトＥＡＡレセプ
ター族の代表的な構成員を本明細書ではヒトＥＡＡ３ａ
と呼称する。ヒトＥＡＡ３ａレセプターの変異体をコー
ドする配列的に関連するポリヌクレチドも同定され、こ
のようなポリヌクレオチドは、本明細書中でヒトＥＡＡ
３レセプター族と呼称するこのレセプター族の別の構成
員を構成する。

【００１２】従って、本発明は１態様によると、ヒトＥ
ＡＡ３レセプター又はヒトＥＡＡ３レセプターのカイネ
ート結合フラグメントをコードするＤＮＡ又はＲＮＡか
ら構成される単離ポリヌクレチドを提供する。

【００１３】別の態様によると本発明は、本明細書中で
定義するＥＡＡ３族に属するカイネート結合ヒトＥＡＡ
レセプターを産生するように遺伝子組換えされた細胞を
提供する。本発明の関連する態様によると、組換えＤＮ
Ａ構築物及びこのような細胞を作成するために有用な関
連方法が提供される。

【００１４】本発明の別の態様によると、テストリガン
ドとヒトＥＡＡレセプターとの間の相互作用を評価する
ための方法が提供され、該方法は、本発明の遺伝子組換
え細胞又は該細胞から誘導される膜調製物と共にテスト
リガンドをインキュベートする段階と、その後、レセプ
ター／リガンド結合を測定することにより前記相互作用
を評価する段階とを含む。

【００１５】本明細書中に記載する知見の種々の応用を
含む本発明の他の態様は、以下の詳細な説明及び添付図
面に明示される。

【００１６】本発明は、ヒト起源の興奮性アミノ酸（Ｅ
ＡＡ）レセプター、より特定的には本明細書中でヒトＥ
ＡＡ３レセプター族と呼称する新規カイネート型ヒトＥ
ＡＡレセプター族に係る。本明細書中で使用する「ヒト
ＥＡＡ３レセプター」なる用語は、ヒトＥＡＡ３ａレセ
プター及び該レセプターに構造的に関連し、従って少な
くとも９７％のアミノ酸相同度を有するＥＡＡ３ａレセ
プターのカイネート結合変異体を意味し、該変異体はＥ
ＡＡ３ａレセプターの天然に存在する変異体と合成によ
り誘導された変異体とを含む。ヒトＥＡＡ３ａレセプタ
ーの天然に存在する変異体は、特に本明細書中でＥＡＡ
３ｂ、ＥＡＡ３ｃ及びＥＡＡ３ｄと呼称するレセプター
を含む。ヒトＥＡＡ３ａレセプターの合成により誘導さ
れる変異体は、ＥＡＡ３ａレセプターに対して１以上、
例えば１〜５６のアミノ酸欠失もしくは付加、又はＥＡ
Ａ３ａレセプターに対して１以上のアミノ酸置換、例え
ば１〜３２のアミノ酸置換を含むカイネート結合変異体
を含む。

【００１７】ＥＡＡ３レセプター並びにその変異体及び
フラグメントに関して本明細書中で使用する「カイネー
ト結合」なる用語は、本明細書中に記載するアッセイの
ような従来設計のアッセイで決定した場合にグルタメー
ト、ＡＭＰＡ又はＮＭＤＡよりもカイネートに対して高
い結合親和性を示すレセプター、変異体及びフラグメン
トを意味する。

【００１８】ＥＡＡ３レセプター族の天然に存在する構
成員の各々は、細胞外アミノ（Ｎ−）及びカルボキシ末
端（Ｃ−末端）領域、並びに細胞表面膜内のレセプター
を固定するのに役立つ４つの内部疎水性ドメインを含
む、ＥＡＡレセプターの一般特徴である構造特徴を有す
る。ＥＡＡ３ａと呼称される特定のヒトＥＡＡレセプタ
ーは、３０残基Ｎ−末端シグナルペプチドを有する前駆
体形態で最初に産生され、シグナルペプチドを欠き且つ
図１に単一文字コードで示す配列に配置された８７５個
のアミノ酸から構成される成熟形態で細胞表面に輸送さ
れる単一ポリペプチド鎖として構造的に特徴付けられる
タンパク質である。別記しない限り、“ＥＡＡ３レセプ
ター”なる用語は、成熟形態のレセプタータンパク質を
意味し、従って、ＥＡＡ３レセプターのアミノ酸残基は
成熟タンパク質配列に関して番号付けされている。レセ
プターの構造ドメインに関しては、ヒドロパシー（ｈｙ
ｄｒｏｐａｔｈｙ）分析の結果、残基５３３〜５５２に
わたる第１のドメイン（ＴＭ−１）、残基５７４〜５９
４にわたる第２のドメイン（ＴＭ−２）、残基６０５〜
６２３にわたる第３のドメイン（ＴＭ−３）及び残基７
９０〜８１０にわたる第４のドメイン（ＴＭ−４）から
なる４つの推定トランスメンブランドメインが明示され
た。この割当てに基づいて、ヒトＥＡＡ３ａレセプター
構造は、その天然膜結合形態において５３２アミノ酸Ｎ
末端細胞外ドメインと、その後の４つのトランスメンブ
ランドメイン及び細胞外の６５アミノ酸Ｃ末端ドメイン
を含む疎水性領域とから構成されると考えられる。

【００１９】図４Ａ〜Ｃに示すように、ヒト脳組織中に
天然に存在するＥＡＡ３ａレセプターの３種の構造的に
関連する変異体も同定され、本明細書中ではＥＡＡ３
ｂ、ＥＡＡ３ｃ及びＥＡＡ３ｄレセプターと呼称する。
これらのレセプターをコードする遺伝子のヌクレオチド
配列から推定すると、ＥＡＡ３ｂ変異体はＥＡＡ３ａと
９９％以上のアミノ酸相同度を共有しており、６３９位
のただ１個のアミノ酸のみが異なり、ＥＡＡ３ａレセプ
ターではアスパラギン酸残基であり、ＥＡＡ３ｂレセプ
ターではアスパラギン残基である（図４Ａ）。他方、Ｅ
ＡＡ３ｃレセプターはＥＡＡ３ａの截頭形であり、４０
個のアミノ酸がＣ末端から除去されている。更に、ＥＡ
Ａ３ｃのＣ末端の最後の１１個のアミノ酸残基、即ち８
２６位〜８３６位のアミノ酸は図４Ｂに示すようにＥＡ
Ａ３ａの対応領域のアミノ酸残基と異なる。ＥＡＡ３ａ
と比較すると、ＥＡＡ３ｄレセプターはＮ末端に５６個
のアミノ酸欠失があり、即ちＥＡＡ３ａの１０〜６５位
のアミノ酸がＥＡＡ３ｄから欠失している（図４Ｃ）。

【００２０】ヒトＥＡＡ３レセプター族の他の構成員と
同様に、ＥＡＡ３ａは薬理学的プロフィール、即ちＮＭ
ＤＡやＡＭＰＡのような他の興奮性アミノ酸レセプター
型とは異なり、カイネート型薬理性を強く示すリガンド
結合「特性」により特徴付けられる。さらに、カイネー
ト結合レセプターが薬理学的意味で機能するためにマル
チマー及びおそらくヘテロマーサブユニット構造を必要
とすると理解されるにもかかわらず、単一ＥＡＡ３ａレ
セプターを産生する細胞が、他のレセプターサブユニッ
トとの関連とは無関係に、興奮性アミノ酸結合の確かな
指標を提供することが判明した。したがって、本発明の
鍵となる態様においては、ヒトＥＡＡ３ａレセプター
は、本発明のレセプターと相互作用する能力、及び／又
はＥＡＡレセプター相互作用のために内因性ＥＡＡレセ
プターリガンド及びその公知の合成類似体と競合する能
力に関して候補化合物をスクリーニングするために利用
される。

【００２１】レセプターとテストリガンドとの間の相互
作用の評価に用いるためには、遺伝子工学技術の応用に
より、異種産物として機能的形態でヒトＥＡＡ３レセプ
ターを産生する細胞を構築するのが望ましい。このよう
な細胞系の構築は、選択宿主細胞に組換えＤＮＡ構築物
を導入することにより達成するが、この場合、分泌形態
のヒトＥＡＡ３レセプター、即ちその天然シグナルペプ
チド又はその機能的異種等価物を有する形態をコードす
るＤＮＡは、レセプターをコードするＤＮＡを発現さ
せ、したがって所望のＥＡＡ３レセプタータンパク質を
生成するために、選択宿主中で機能的である発現制御要
素と結合される。このような細胞は本明細書中では、レ
セプターをコードするＤＮＡを「発現可能に」組込まれ
たと表現される。レセプターをコードするＤＮＡは、こ
のようなＤＮＡが特定の宿主中に天然には見いだされな
い場合、特定の細胞宿主に関して「異種」であると呼称
される。

【００２２】本発明のヒトＥＡＡ３レセプターが哺乳類
起源のため、ＥＡＡ３レセプターを産生させるためには
哺乳動物細胞宿主を用いるのが最も望ましい。しかしな
がら、他の好適に処理された真核及び原核細胞宿主を用
いてＥＡＡ３レセプターを産生させることもできる。し
たがって、大腸菌及び枯草菌のような細菌宿主、アスペ
ルギルス属及び酵母菌のような真菌宿主、並びにＳｐｏ
ｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのような昆虫細
胞宿主が、本発明のＥＡＡ３レセプターを産生させるた
めに使用可能な非哺乳動物宿主の例である。

【００２３】ヒトＥＡＡ３レセプターの産生のための宿
主として使用するために選択される特定の細胞型は、当
業界で一般に入手可能な数種の細胞型のいずれでもよい
が、当然のことながら、興奮性アミノ酸と結合し、組換
え細胞系から求められるアッセイ結果を混乱させる恐れ
のある表面レセプターを自然状態で生成するような細胞
型を使用すべきではない。一般に、このような問題は宿
主として非ニューロン細胞型を選択することにより避け
ることができるし、常法通りに非ヒト細胞系を用いても
避けることができる。もっとも、テストリガンドとの
「バックグラウンド」結合がアッセイ結果で説明される
ならば、ニューロン及びヒト型細胞を発現宿主として使
用してもよいことが理解されよう。

【００２４】本発明のある態様によれば、ＥＡＡ３レセ
プター産生のための宿主として使用するために選択され
る細胞系は哺乳動物細胞である。数種のこのような細胞
系が遺伝子工学的研究に一般に利用可能であり、このよ
うな細胞系の例としては、チャイニーズハムスター卵巣
（ＣＨＯ）細胞、例えばＰｒｏ５変異株（ＡＴＣＣＣＲ
Ｌ １２８１）を含めたＫ１系（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６
１）；ＣＶ−１系（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ
−１系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）及びＣＯＳ−７
系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）のＳＶ４０−形質転
換アフリカミドリザル腎臓由来の繊維芽細胞様細胞；マ
ウスＬ−細胞、マウス３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６５８）、マウスＣ１２７細胞；２９３系（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １５７３）のヒト胎児腎臓細胞、Ｈｅｌａ系
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）の細胞を含めたヒト癌細胞、
並びにＩＭＲ−３２系（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １２７）、
ＳＫ−Ｎ−ＭＣ系（ＡＴＣＣ ＨＴＢ １０）及びＳＫ
−Ｎ−ＳＨ系（ＡＴＣＣＨＴＢ １１）株の神経芽細胞
腫細胞が挙げられる。

【００２５】種々の遺伝子発現系がこれらの宿主ととも
に使用するために改造され、現在市販されており、これ
らの系のいずれかを利用して、ＥＡＡ３レセプターをコ
ードするＤＮＡを発現させることができる。一般にプラ
スミドベクターの形態で入手可能なこれらの系は、発現
カセットを組み込んでおり、その機能的成分は、５’と
結合すると宿主により認識され、レセプターコーディン
グＤＮＡを発現させる発現制御配列を構成するＤＮＡを
含む。系は、レセプターコーディング領域の３’と結合
すると発現を終止するＤＮＡ配列をさらに組み込んでい
る。したがって、選択された哺乳動物細胞宿主中で発現
させるためには、分泌形のレセプターをコードするＤＮ
Ａが宿主により認識される発現制御ＤＮＡ配列に結合さ
れており、発現を開始させるためのレセプターコーディ
ングＤＮＡの５’領域と、発現を終止するための３’領
域とを含む組換えＤＮＡ発現構築物を作成する。発現構
築物を保有するプラスミドベクターは典型的には、発現
宿主中でプラスミドを複製するため、望ましくは大腸菌
のような細菌宿主中でプラスミドを増幅するために、通
常はウイルス由来の複製起点のような他の機能的成分を
組み込んでいる。安定的に形質転換された組換細胞の選
択を可能にするマーカーを提供するために、ベクターは
さらに形質転換体に何らかの生存利益を付与する遺伝
子、例えばネオマイシン耐性をコードする遺伝子を組み
込むが、後者の場合、形質転換体をネオマイシンを補充
した培地で平板培養する。

【００２６】レセプターコーディングＤＮＡの哺乳動物
細胞発現を達成するために用い得る種々の組換ＤＮＡ発
現系としては、哺乳動物細胞を感染させるウイルスのプ
ロモーター、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、
ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、サルウイルス（ＳＶ４
０）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）等のプロモータ
ーを利用するものが挙げられる。さらに発現を実行する
のに有用なのは、レトロウイルスのＬＴＲのようなプロ
モーター、温度により調節され、ショウジョウバエＤｒ
ｏｓｏｐｈｉｌａから単離されるもののような昆虫細胞
プロモーター、並びにステロイド誘導性プロモーター及
び重金属により調節されるもの、即ちメタロチオネイン
遺伝子プロモーターのような哺乳動物遺伝子プロモータ
ーである。

【００２７】組換ＤＮＡ発現ベクターに組み込むために
は、所望のＥＡＡ３レセプター、例えばＥＡＡ３ａレセ
プター又はそのカイネート結合変異体をコードするＤＮ
Ａは、遺伝子単離又は遺伝子合成の選択技術を用いて得
られる。本明細書の実施例にさらに詳細に説明するよう
に、ＥＡＡ３ａレセプター並びにそのＥＡＡ３ｂ、ＥＡ
Ａ３ｃ及びＥＡＡ３ｄ変異体はヒト脳組織のゲノム内で
コードされ、したがって慣用的遺伝子単離及びクローニ
ング技術を注意して応用することにより得られる。これ
は一般に、ヒト脳組織、例えば小脳組織又は海馬組織、
好ましくは胎児脳組織の新鮮供給源から全メッセンジャ
ーＲＮＡを抽出した後、メッセージをｃＤＮＡに変換
し、例えば細菌プラスミド、より典型的にはバクテリオ
ファージにおけるライブラリーを形成することにより行
われる。ヒトＤＮＡのフラグメントを保有するバクテリ
オファージは一般に、個々のファージプラーク又はコロ
ニーを単離できるように、感受性大腸菌ローン上で平板
培養することにより増殖させる。次にファージコロニー
に担持されるＤＮＡを一般にニトロセルロース又はナイ
ロンベースのハイブリダイゼーション膜上に固定し、次
いで注意深く制御した条件下で、レセプターコーディン
グＤＮＡ又はそのフラグメントを担持する特定のファー
ジコロニーを同定するために適切な配列の放射性（又は
別の手段で）標識したオリゴヌクレオチドプローブとハ
イブリダイズする。一般に、こうして同定された遺伝子
又はその一部を核酸配列分析のためにプラスミドベクタ
ー中にサブクローニングする。

【００２８】以上、種々のヒトＥＡＡ３レセプターのヌ
クレオチド配列について記載したが、これらのレセプタ
ーをコードするＤＮＡを作成するためには遺伝子合成及
び／又は増幅の自動化技術を実施できることが理解され
よう。ＥＡＡ３レセプターコーディングＤＮＡの長さに
より、自動合成法を適用するには段階的遺伝子構築が必
要であり、約３００ヌクレオチド長までの遺伝子の領域
を別々に合成し、次いで最終アセンブリのために正しい
順序に連結する必要がある。別々に合成した遺伝子領域
をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によりアセンブリ
前に増幅することができる。

【００２９】自動遺伝子合成技術を適用することによ
り、ＥＡＡ３遺伝子ファミリーの天然構成員の配列変異
体を生成する機会が提供される。本明細書に記載のＥＡ
Ａ３レセプターをコードするポリヌクレオチドは、本明
細書に記載の天然に存在するポリヌクレオチド配列中に
示すコドンを等価のコドンに置換することにより作成で
きることが理解されよう。さらに、例えば１以上の単一
アミノ酸の置換、欠失又は付加を組込むことにより、本
明細書に記載のＥＡＡ３レセプターの合成変異体をコー
ドするポリヌクレオチドを生成することができる。ほと
んどの部分に関してはスクリーニングのためにレセプタ
ーの天然リガンド結合プロフィールを保持するのが望ま
しいので、アミノ酸置換は例えば同様の電荷のアミノ酸
を置換する所謂保存的置換に限定することが望ましく、
レセプタードメイン地図で明らかなように、レセプター
活性に余り重要でない部位、例えば成熟レセプターの最
初の２０個のＮ末端残基や、レセプタードメインマッピ
ングにより明示されるような他の領域内に置換を限定す
るのが望ましい。

【００３０】手持ちの適切な鋳型ＤＮＡと共にＰＣＲ増
幅技術を用いて最終遺伝子の全部又は一部を直接生成す
ることもできる。この場合、１片又は相互に連結可能な
数片として最終産物のＰＣＲ増幅をプライムするプライ
マーを合成する。これは平滑末端増幅ＤＮＡフラグメン
トの逐次連結により、又は好ましくは天然に存在する制
限エンドヌクレアーゼ部位を含むフラグメントの逐次連
結により実施することができる。この適用では、ＰＣＲ
増幅のための鋳型としてｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを使
用することが可能である。前者の場合、ｃＤＮＡ鋳型は
市販品でもよいし、海馬及び小脳を含む種々のヒト脳組
織の自家構築ｃＤＮＡライブラリーからも得られる。

【００３１】一旦入手したら、レセプターコーディング
ＤＮＡを任意の適切な発現ベクター中に組み込んで発現
させ、例えばＤＮＡ媒介形質転換、エレクトロポレーシ
ョン、マイクロインジェクション又は粒子ガン形質転換
のような慣用手順を用いて宿主細胞を前記ベクターで形
質転換する。発現ベクターは、一時的又は安定的にレセ
プターコーディングＤＮＡを発現する形質転換哺乳動物
細胞系を提供するように選択され得る。一時的発現のた
めには、一般に哺乳動物細胞中で機能する複製起点を有
する発現ベクターで宿主細胞を形質転換する。安定的発
現のためにはこのような複製起点は不要であるが、ベク
ターは一般に形質転換体にその選択を可能にするために
生存利益を付与する物質をコードする遺伝子を保有す
る。このような選択マーカーをコードする遺伝子として
は、ミコフェノール酸耐性を付与する大腸菌ｇｐｔ遺伝
子、抗生物質Ｇ４１８及びネオマイシン耐性を付与する
トランスポゾンＴｎ５からのｎｅｏ遺伝子、ＤＨＦＲ−
細胞の表現型をＤＨＦＲ＋細胞に変えるマウス細胞又は
大腸菌からのｄｈｆｒ配列、並びにＴＫ−細胞の表現型
をＴＫ＋細胞にする単純疱疹ウイルスのｔｋ遺伝子が挙
げられる。一時的発現も安定発現もともにリガンドスク
リーニング検定に用いるための形質転換細胞系及び該細
胞系から誘導される膜調製物を提供し得る。

【００３２】スクリーニングアッセイに用いるために
は、レセプターコーディングＤＮＡを一時的に発現する
細胞は事後使用のために凍結保存してもよいが、急速な
プラスミド複製は通常数日間で細胞を最終的に死に至ら
しめるため、形質転換細胞をできるだけ早く使用すべき
である。このようなアッセイは無傷細胞を用いて実施し
てもよいし、又はこのような細胞由来の膜調製物を用い
て実施してもよい。膜調製物は一般に、より便利なリガ
ンド結合実験用基質を提供するので、結合基質として好
適である。スクリーニング用、即ちリガンド結合実験用
の膜調製物を調製するには、凍結無傷細胞を氷水中に懸
濁しながら均質化し、膜ペレットを遠心分離後に収集す
る。その後、ペレットを冷水で洗い、透析し、除去しな
いとアッセイでの結合に競合する虞れのあるグルタメー
トのような内因性ＥＡＡリガンドを除去する。透析した
膜をリガンド結合アッセイでそのまま使用してもよい
し、凍結乾燥形態で保存後に使用してもよい。あるい
は、一時的トランスフェクションから約２日後又は安定
形質転換細胞の新鮮平板培養後同一期間後に採取した無
傷の新鮮な細胞を、膜調製物に使用したと同じ方法によ
りリガンド結合アッセイに用いてもよい。細胞を用いる
場合、細胞は損傷しないようにより温和な遠心分離によ
り採取しなければならず、全洗浄は、細胞が浸透圧によ
り衝撃を受けたり破裂したりしないように、例えばリン
酸塩緩衝食塩水のような緩衝媒質中で実施しなければな
らない。

【００３３】本発明のＥＡＡ３レセプターはそれ自体電
気生理学的に機能的であり、従って、テストリガンドが
イオンチャンネル活性を調節する能力をスクリーニング
するのに有用である。従って、本発明は更にリガンドス
クリーニング法としてテストリガンドとヒトＣＮＳレセ
プターとの間の相互作用の検出方法を提供し、該方法
は、テストリガンドをヒトＥＡＡ３レセプター産生細胞
又は該細胞から誘導される膜調製物と共にインキュベー
トする段階と、その後、該細胞又は膜を流れるリガンド
誘導電流を測定する段階とを含む。

【００３４】レセプターをコードするＤＮＡを発現する
細胞を使用する代わりに、ＥＡＡ３レセプターをコード
するメッセンジャーＲＮＡの導入後に機能的膜結合レセ
プターをもたらす細胞（例えばアフリカツメガエル卵母
細胞）を使用してリガンド特徴付けを実施してもよい。
この場合、典型的にはプラスミドベクター（例えばＴ３
又はＴ７バクテリオファージプロモーター）により供給
される隣接ＲＮＡ転写プロモーターを介して導入遺伝子
をＲＮＡに容易に転写できるようなプラスミドベクター
に本発明のＥＡＡ３レセプター遺伝子をサブクローニン
グする。次にＲＮＡを挿入遺伝子からｉｎ ｖｉｔｒｏ
転写し、アフリカツメガエル卵母細胞に注入すればよ
い。ｎＬ容量のＲＮＡ溶液を注入後、卵母細胞を数日間
までインキュベートし、その後、浸漬溶液中に供給され
る特定のリガンド分子と結合する能力を無傷の形態又は
膜調製物として試験する。機能的ＥＡＡレセプターはイ
オンを選択的に通過させ得る膜チャンネルを操作するこ
とにより部分的に作用するので、浸漬溶液中の特定のリ
ガンドに応答するレセプターの作用は典型的には、細胞
に挿入されるか又は「パッチ−クランプ」法を使用して
細胞誘導膜調製物の両側に配置された微細電極を使用し
て電流として測定され得る。

【００３５】候補リガンドと本発明の選択されたヒトＥ
ＡＡ３レセプターとの結合は、（例えばタンパク質定量
により測定された）予め決定された量、一般には約２５
μｇ〜１００μｇの細胞由来膜を用いて評価するのが一
般的である。一般に、競合的結合アッセイは、カイネー
トに対する試験化合物の親和性を評価するのに有用であ
る。この競合的結合アッセイは、種々の濃度で添加した
非標識化試験化合物の存在下で放射性標識カイネート、
例えば［³Ｈ］−カイネートと共に膜調製物をインキュ
ベートすることにより実施することができる。インキュ
ベーション後、置換又は結合した放射性標識カイネート
を回収及び測定し、基質として用いた特定のレセプター
に対する試験化合物及びカイネートの相対的結合親和性
を確定する。こうして、カイネート型ヒトＥＡＡレセプ
ターに対する種々の化合物の親和性を測定することがで
きる。

【００３６】リガンドスクリーニングに有用な細胞系を
構築するためにレセプターコーディングＤＮＡを用いる
以外に、本発明の別の態様によると、構造研究、抗体産
生及び他の実験目的で可溶性形態でレセプターのフラグ
メントを作成するためにＤＮＡを発現させることができ
る。カイネート結合フラグメント、即ちリガンド分子と
の結合に関与するＥＡＡ３レセプターの部分は細胞の外
側に位置し、即ち細胞外であると予測される。したがっ
て、このようなカイネート結合フラグメントを単離形
態、即ちレセプターの残部を含まない形態で大量に提供
することにより、レセプター−リガンド相互作用の特徴
付けを助長するのが先ず第１に望ましい。このために
は、全長ＥＡＡ３レセプターコーディングＤＮＡを特定
部位の突然変異誘発により改変し、第１のトランスメン
ブランドメイン（ＴＭ１）の細胞外Ｎ末端領域であって
その５’に隣接する領域、即ち図１に示す酸残基５３３
コドンの前に翻訳停止コドンを導入すればよい。レセプ
ターを膜に「固定」するためのトランスメンブランドメ
インはもはや生成されないので、改変遺伝子を発現させ
ると、細胞外リガンド結合ドメインのみが可溶性形態で
分泌される。次に、標準リガンド結合アッセイを実施
し、候補化合物とこうして生成された細胞外ドメインと
の結合度を確認する。リガンド結合ドメインを正確にマ
ッピングするためには、特定部位の突然変異誘発を用い
て、別種の細胞外領域を生成することが当然必要であり
得る。さらに、フラグメントの長さは、完全な５３３ア
ミノ酸細胞外Ｎ末端ドメイン未満の長さに変更してもよ
い。

【００３７】本発明のリガンド結合アッセイで使用する
ためには、まず最初に種々の方法のいずれか１種を使用
してレセプターのカイネート結合フラグメントを固体支
持体に固定する。例えば、レセプターペプチドフラグメ
ントのＣ末端を誘導体化不溶性ポリマー支持体、例えば
架橋結合ポリスチレン又はポリアミド樹脂に結合すれば
よい。固体支持体に一旦固定すると、フラグメントは候
補リガンドのレセプター結合親和性をスクリーニングす
るために有用である。この目的のためには、全長レセプ
ターを使用する上述のような競合型リガンド結合アッセ
イが一般に使用される。固体支持体に固定されたフラグ
メントを候補リガンドの存在下で天然リガンド、即ちカ
イネートと結合する。カイネート又は候補リガンドの一
方を例えば放射性標識し、適切なインキュベーション期
間後、結合又は非結合ラベルの量を測定することにより
カイネート置換度を決定する。

【００３８】あるいは、成熟タンパク質のＮ末端でなく
Ｃ末端から誘導されるレセプターの細胞外ドメイン、例
えば図１に示すようなアミノ酸残基８１１〜８７５の間
に位置する第４のトランスメンブランドメイン（ＴＭ
４）の直後のドメインを生成することが望ましい場合も
ある。この場合には、特定部位の突然変異誘発及び／又
はＰＣＲ−ベースの増幅法を用いて、問題のレセプター
ドメインをコードする遺伝子の規定したフラグメントを
容易に提供することができる。直接ペプチド合成を用い
て所望のＣ末端フラグメント又は上記のような所望のＮ
末端フラグメントを作成することもできる。遺伝子フラ
グメントをコードするＤＮＡを発現ベクターにより提供
される翻訳開始コドンに隣接して挿入し、必要な翻訳読
み取り枠を注意して保存するのであれば、このようなＤ
ＮＡ配列を使用して細胞内又は分泌様式で所望のレセプ
ターフラグメントを発現させることができる。

【００３９】このような細胞外リガンド結合ドメインの
生成は種々の宿主細胞において達成し得ると考えられ
る。この目的のためにＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞
を使用することができ、その場合、発現は一般に高レベ
ル発現が可能な発現プロモーター、例えばＣＭＶ（サイ
トメガロウイルス）プロモーターにより起動される。あ
るいは、非哺乳動物細胞、例えば昆虫Ｓｆ９（Ｓｐｏｄ
ｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）のような非哺乳
動物細胞を用いてもよく、その場合、発現は一般にバキ
ュロウイルスの発現プロモーター、例えば強力な後期多
面体タンパク質プロモーターにより起動される。糸状菌
発現系を用いてＥＡＡ３レセプターのこのような細胞外
ドメインを多量に分泌させてもよい。例えば発現がａｌ
ｃＡプロモーターにより起動されるＡｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓは、このような許容可能な系を
構成する。このような発現宿主の他に、細胞内であるか
細胞外であるかにかかわらず、異種遺伝子又は遺伝子フ
ラグメントを発現することが可能なものであればどのよ
うな原核細胞又は他の真核細胞発現系も同様に許容可能
であるも理解されよう。特に、例えば脳組織におけるＥ
ＡＡ３レセプターの存在及び／又は位置を検出するのに
用いるために、本発明は更に別の態様においてヒトＥＡ
Ａ３レセプターに対する標識化抗体を提供する。このよ
うな抗体を産生させるためには、上記方法又は標準ペプ
チド合成法により微生物又は哺乳動物細胞宿主で産生さ
れる無傷の可溶性レセプター又はその免疫原性フラグメ
ントを免疫原として使用すればよい。免疫原性フラグメ
ントとして用いるのに特に適したＥＡＡ３ａレセプター
の領域としては、レセプターの細胞外領域に対応する配
列を有する領域又は細胞外領域の一部、例えば残基１〜
５３２から構成されるペプチド又は特に残基１８６〜２
０１もしくは４８５〜５２８を含むそのフラグメント、
及びトランスメンブランドメインＴＭ−２及びＴＭ−３
間の領域に対応するペプチド、例えば残基５９５〜６０
４から構成されるペプチドが挙げられる。Ｃ末端ドメイ
ン（残基８１１〜８７５）又はそのフラグメントから構
成されるペプチドを抗体産生に用いてもよい。ヒトＥＡ
Ａ３ｂ，ＥＡＡ３ｃ及びＥＡＡ３ｄレセプターの実質的
に同一領域も、このレセプターに対する抗体を産生させ
るために使用することができる。

【００４０】所望のＥＡＡ３レセプター又は免疫原性フ
ラグメントに対する抗体の産生は、ポリクローナル抗体
を産生させるには、慣用設計の免疫化プロトコルと、ヒ
ツジ、ヤギ及びウサギのような種々の哺乳動物宿主のい
ずれかとを使用すればよい。また、モノクローナル抗体
産生のためには、脾細胞のような免疫細胞を免疫化動物
から回収し、ハイブリドーマ技術を用いて骨髄腫細胞と
融合することができる。次に、融合産物即ちハイブリド
ーマ細胞を選択培地中で培養することによりスクリーニ
ングし、抗体を産生する細胞を回収して連続増殖し、抗
体を回収する。次に、この目的のために確立されたリン
カー法を用いて回収抗体をレセプター分子、即ち例えば
放射能ラベル、酵素ラベル、蛍光ラベル等のような検出
可能なラベルと共有結合させ、ＥＡＡ３レセプターに対
する特異的プローブを形成する。

【００４１】本発明の別の態様によると、例えばヒトも
しくは他の哺乳動物ゲノム（又はｃＤＮＡライブラリ
ー）中に存在する配列関連遺伝子を同定するため又は脳
組織のような試料中のＥＡＡ３コーディングＤＮＡを位
置確認するためのハイブリダイゼーションプローブとし
て、検出可能標識化形態、例えば放射性標識化形態でヒ
トＥＡＡ３レセプター及びその選択領域をコードするＤ
ＮＡ又はＲＮＡを更に使用することもできる。これは、
無傷コーディング領域又はそのフラグメントに例えば³²
Ｐで放射性標識したヌクレオチドを取り込むことにより
実施され得る。試料中のＥＡＡ３コーディングＤＮＡを
同定するためには、ＥＡＡ３をコードする全長ｃＤＮＡ
又は固有のフラグメントを用いるのが望ましい。図１及
び同図中のヌクレオチド番号を参照すると、このような
ヌクレオチドフラグメントは少なくとも約１７の核酸を
含み、そうでなければレセプターのＮ末端もしくはＣ末
端をコードする領域に対応する配列を有するか、又はそ
の５’非翻訳もしくは３’非翻訳領域を表すフラグメン
トを含む。この目的に適切なヌクレオチドフラグメント
の例としては、ＥＡＡ３ａのヌクレオチド４２６〜４４
６及びヌクレオチド１２５１〜１２７１が挙げられる。
当然のことながら、特にこれらの配列及び無傷の遺伝子
それ自体を使用して標準ハイブリダイゼーション技術に
よりＥＡＡ３関連ヒト遺伝子、特にそのｃＤＮＡ等価物
をクローニングすることもできる。

【００４２】以下、非限定的な実施例により本発明を詳
細に説明する。

【００４３】

【実施例】実施例１−ヒトＥＡＡ３ａレセプターをコードするＤＮ
Ａの単離 Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ
ｓ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，
Ｕ．Ｓ．Ａ．）からＥｃｏＲＩ−ベースλファージライ
ブラリー（λＺＡＰ）として入手したヒト胎児脳ｃＤＮ
Ａをプローブすることにより、ヒトＥＡＡ３ａレセプタ
ーをコードするｃＤＮＡを同定した。以下の特異配列：
５’−ＡＴＣＧＧＣＧＧＣＡＴＣＴＴＣＡＴＴＧＴＴＣ
ＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＣＴＣＧＴＧＣ−３’を有する
オリゴヌクレオチドプローブを使用してｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングした。

【００４４】６×ＳＳＣ、２５％ホルムアミド、５×Ｄ
ｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄緩衝液、
０．５％ピロリン酸ナトリウム、０．５％ ＳＤＳ、１
００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、４２℃のハイブリ
ダイゼーション条件下で胎児脳ｃＤＮＡライブラリーを
スクリーニングした。０．５％ＳＤＳを含有する６×Ｓ
ＳＣで２５℃で５分間、次いで０．５％ＳＤＳを含有す
る２×ＳＳＣで４２℃で１５分間フィルターを洗った。
最後に０．５％ＳＤＳを含有する１×ＳＳＣで５０℃で
１５分間洗った。フィルターをＸ線フィルム（Ｋｏｄａ
ｋ）に一晩露光した。スクリーニングした１０⁶個のク
ローンのうちで２個のみのｃＤＮＡインサートを同定
し、一方の約０．９ｋｂのインサートをＲＫＣＳＦＧ７
２、他方の約２．７ｋｂのインサートをＲＫＣＳ５Ｆ８
１と命名した。配列決定するために、’７２及び’８１
ファージをプラーク精製し、その後、製造業者の仕様書
に従ってファージミドとして切り出し、ファージミドベ
クターのインサート担持Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ変
異体を作成した。’７２クローンを配列全体から配列決
定した処、Ｃ末端領域を示すが、推定終結コドンは示さ
ないオープンリーディングフレームが確認された。’８
１インサートを配列決定した処、’７２クローンとの間
に約８０％の相同度を有するＤＮＡ配列が確認され
た。’８１クローンは’７２クローンとの間に顕著なオ
ーバーラップを示し、付加的な５’配列を含んでいた。

【００４５】’７２配列中には開始及び終結コドンが認
められなかったので、’７２クローンの５’及び３’領
域を探した。この目的で’８１クローンの２．０ｋｂ
ＥｃｏＲＩフラグメントと’７２クローンの０．９ｋｂ
ＥｃｏＲＩフラグメントとを単離し、³²Ｐで標識した
後、６×ＳＳＣ、２５％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔ溶液、０．５％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性
サケ精子ＤＮＡ、３０℃のハイブリダイゼーション条件
下で同一の胎児脳ｃＤＮＡライブラリーを再スクリーニ
ングするために使用した。０．５％ＳＤＳを含有する２
×ＳＳＣで２５℃で５分間、次いで０．５％ＳＤＳを含
有する２×ＳＳＣで最終的に４２℃で１５分間フィルタ
ーを洗った。フィルターをＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ）
に一晩露光した。スクリーニングした１０⁶個のクロー
ンのうちで２個のみのｃＤＮＡを同定し、一方の約１．
５ｋｂのフラグメントをＲＫＣＳ２２１、他方の約１．
８ｋｂのフラグメントをＲＫＣ４１と命名した。完全
な’２２１インサートを配列決定した処、’７２クロー
ンの５’配列と終結コドン及び３’非コーディング領域
の約２５０塩基とが確認された。完全な’４１インサー
トを配列決定した処、５’配列は確認されたが、開始コ
ドンは認められなかった。

【００４６】そこで、’４１配列の５’領域にアニール
することが可能な（’４１配列に基づく）オリゴヌクレ
オチドプローブを使用して同一の胎児脳ｃＤＮＡライブ
ラリーをスクリーニングした。³²Ｐ標識プローブの特異
配列は、５’−ＣＣＡＴＣＡＴＴＧＡＧＡＡＧＴＧＧＴ
ＣＣ−３’であった。

【００４７】このプローブを³²Ｐ標識した後、６×ＳＳ
Ｃ、５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、
０．５％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮ
Ａ、３０℃のハイブリダイゼーション条件下で同一胎児
脳ｃＤＮＡライブラリーを再スクリーニングするために
使用した。０．５％ＳＤＳを含有する２×ＳＳＣで２５
℃で５分間、次いで０．５％ＳＤＳを含有する２×ＳＳ
Ｃで最終的に４２℃で１５分間フィルターを洗った。フ
ィルターをＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ）に一晩露光し
た。スクリーニングした１０⁶個のクローンのうちただ
１個の約１．７ＫｂのｃＤＮＡインサートのみを同定
し、ＲＫＳ７１と命名した。’７１を配列決定した処、
開始コドンと５’非コーディング領域の約４１７塩基
と’４１インサートとの顕著なオーバーラップ部分とが
判明した。

【００４８】次にレセプターの完全なコーディング領域
を提供するために、図２に示す手法を使用して３．０ｋ
ｂ ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミドバックグラウ
ンド中に３．３ｋｂ ＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩインサ
ートとして無傷のＥＡＡ３ａレセプターコーディングＤ
ＮＡを担持する６．３ｋｂファージミドｐＢＳ／ｈｕｍ
ＥＡＡ３ａを作成した。ブダペスト条約に従ってファー
ジミドｐＢＳ／ｈｕｍＥＡＡ３ａを１９９２年１１月１
２日付けでＲｏｃｋｖｉｌｌ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ＵＳ
Ａに所在のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託し、受託番号ＡＴＣＣ
７５３５０を付与された。

【００４９】実施例２−ヒトＥＡＡ３ａレセプターを産
生する遺伝子組換え細胞の構築 哺乳動物細胞中で一時的に発現させるために、図３に示
すようにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，
ＵＳＡ； カタログ番号Ｖ４９０−２０）から市販され
ている哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（ｐ
ｃＤＮＡＩＡ）にＥＡＡ３ａレセプターをコードするｃ
ＤＮＡを組み込んだ。ｐｃＤＮＡＩＡは真核系における
ｃＤＮＡ発現及び原核細胞におけるｃＤＮＡ分析用とし
て設計された多機能４．８ｋｂプラスミドベクターであ
る。ベクター上には、ＣＭＶプロモーター及びエンハン
サー、スプライスセグメント及びポリアデニル化シグナ
ル、ＳＶ４０及びポリオーマウイルス複製起点、配列決
定及び突然変異誘発のために一本鎖ＤＮＡを救済するた
めのＭ１３起点、センス及びアンチセンスＲＮＡ転写物
生成のためのＳｐ６及びＴ７ ＲＮＡプロモーター、並
びにＣｏｌ Ｅ１様高コピープラスミド起点が組み込ま
れている。ＣＭＶプロモーターの下流でＴ７プロモータ
ーの３’にポリリンカーが適当に配置されている。

【００５０】要約すると、インサートの３’末端にＨｉ
ｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩアダプターを挿入後に３．３ｋｂ
ＮｏｔＩ／ＮｏｔＩフラグメントとしてＥＡＡ３ａコ
ーディングｃＤＮＡインサートをｐＢＳ／ｈｕｍＥＡＡ
３ａから放出した。次にｐｃＤＮＡＩＡベクターのＮｏ
ｔＩ部位に３．３ｋｂフラグメントを組み込み、発現ベ
クターｐｃＤＮＡＩＡ／ｈｕｍＥＡＡ３ａを形成した。

【００５１】ヒトＥＡＡ３ａをコードするＤＮＡを一時
的に発現させるために、ＤＥＡＥ媒介ＤＮＡトランスフ
ェクションによりＣＯＳ−１系（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒ
ｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭａｒｙｌａｎｄからＡＴＣＣ
ＣＲＬ １６５０として入手）のサル由来の繊維芽細胞
様細胞を約８ｕｇ／１０⁶ＣＯＳ細胞のＤＮＡ（ｐｃＤ
ＮＡＩＡ／ｈｕｍＥＡＡ３ａとして）でトランスフェク
トし、慣用手順に従ってクロロキンで処理した。要約す
ると、ＣＯＳ−１細胞を５×１０⁶細胞／皿の密度で平
板培養し、次いでＦＢＳ補充ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で２
４時間増殖させた。次に培地を除去し、細胞をＰＢＳ、
次いで培地で洗浄した。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中にＤＥ
ＡＥデキストラン（０．４ｍｇ／ｍｌ）、１００μＭク
ロロキン、１０％ ＮｕＳｅｒｕｍ、ＤＮＡ（０．４ｍ
ｇ／ｍｌ）を含有する１０ｍｌのトランスフェクション
溶液を細胞に適用した。３７℃で３時間インキュベーシ
ョン後、細胞を前記と同様にＰＢＳ及び培地で洗浄し、
次いでＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中１０％ＤＭＳＯで１分間
ショックを与えた。細胞を１０％ＦＢＳ補充培地で２〜
３日間増殖させて、インキュベーション終了時に皿を氷
上に置き、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、次いでこそげ落
して取り出した。次いで細胞を１０００ｒｐｍで１０分
間遠心分離して収集し、細胞ペレットを次のリガンド結
合アッセイで用いるために液体窒素中で凍結した。凍結
細胞の融解アリコートのノーザンブロット分析により、
保存細胞中にレセプターコーディングｃＤＮＡが発現さ
れていることを確認した。

【００５２】同様の方法で、宿主として２種の異なる細
胞型、即ちＣＨＯ Ｋ１及びＣＨＯＰｒｏ５を用いて安
定にトランスフェクトした細胞系を調製することもでき
る。これらの細胞系を構築するためには、ヒトＥＡＡ３
ａをコードするｃＤＮＡを安定発現を可能にする哺乳動
物発現ベクターｐＲＣ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）中に組み込む。この部位に挿入することにより、ｃ
ＤＮＡはサイトメガロウイルスプロモーターの発現制御
下でポリアデニル化部位及びウシ成長ホルモン遺伝子の
タミネーターの上流に、選択マーカーとして（ＳＶ４０
初期プロモーターにより起動される）ネオマイシン耐性
遺伝子を含むベクターバックグラウンドに組み込まれ
る。

【００５３】上記のように構築したプラスミドを導入す
るために、宿主ＣＨＯ細胞を先ず１０％ＦＢＳ補充αＭ
ＥＭ培地中５×１０⁵の密度で播種した。２４時間増殖
後、新鮮な培地をプレートに加えて３時間後、慣用のリ
ン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈法を用いて細胞をトランス
フェクトした。要約すると、ＤＮＡ ３μｇを混合し、
カルシウム緩衝液と共に室温で１０分間インキュベート
した。等量のリン酸緩衝液を加え、懸濁液を室温で１５
分間インキュベートした。次に、インキュベートした懸
濁液を細胞に４時間適用し、細胞を取り出して１５％グ
リセロールを含有する培地でショックを与えた。３分
後、細胞を培地で洗浄し、通常の増殖条件で２４時間イ
ンキュベートした。Ｇ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）を含有す
る１０％ＦＢＳ補充α−ＭＥＭ培地中でネオマイシン耐
性細胞を選択した。Ｇ４１８耐性細胞の個々のコロニー
を約２〜３週間後に単離し、クローン選択して、アッセ
イ用に増殖させた。

【００５４】実施例３：リガンド結合アッセイ トランスフェクトした凍結状態の細胞をハンドホモジナ
イザーにより氷冷蒸留水中に再懸濁し、５０，０００ｇ
で２０分間遠心分離した。上清を廃棄し、膜ペレットを
−７０℃で凍結保存した。

【００５５】ＣＯＳ細胞膜ペレットを氷冷５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５５，５℃）に懸濁し、結合
に競合する虞れのある内因性グルタメートを除去するた
めに、再び５０，０００ｇで１０分間遠心分離した。ペ
レットを氷冷５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５
５）緩衝液に再懸濁し、形成された膜調製物を組織源と
して下記結合実験に使用した。標準としてＰｉｅｒｃｅ
試薬及びＢＳＡを用いてタンパク質を定量した。

【００５６】次に、タンパク質定量により判断される２
５〜１００μｇの量のＣＯＳ由来膜等価物と、選択され
た放射性標識リガンドを用いて結合アッセイを行った。
特に、カイネート結合アッセイの場合、最終容量１ｍｌ
の冷インキュベーション緩衝液中、組織タンパク質２５
〜１００μｇ及び［ビニリデン−３Ｈ］カイニン酸（５
８Ｃｉ／ｍｍｏｌ， 最終８０ｎＭ）からインキュベー
ション混合物を構成した。非特異的結合は、１ｍＭ Ｌ
−グルタメートの存在下で測定した。サンプルを氷上で
６０分間インキュベートした後、ＰＨＤ細胞ハーベスタ
ー及び氷冷０．３％ポリエチレンイミンに予め浸漬して
おいたＧＦ／Ｂフィルターを使用して迅速濾過すること
により、結合したリガンドと遊離しているリガンドとを
分離した。フィルターを冷インキュベーション緩衝液４
ｍｌで２回洗った後、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｒｅａｄｙ−Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｐｌｕｓシンチレーションカクテル５ｍ
ｌと共にシンチレーションバイアルに入れ、計数した。

【００５７】ＡＭＰＡ結合アッセイでは、組織タンパク
質２５〜１００μｇ及びＤ，Ｌ−α−［５−メチル−３
Ｈ］アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチルイソキサゾー
ル−４−プロピオン酸（３Ｈ−ＡＭＰＡ，２７．６Ｃｉ
／ｍｍｏｌｅ， 最終１０ｎＭ）に０．１Ｍ ＫＳＣＮ
及び２．５ｍＭ ＣａＣｌ₂を加えて最終容量１ｍｌと
することによりインキュベーション混合物を構成した。
非特異的結合を１ｍＭＬ−グルタメートの存在下で測定
した。サンプルをプラスチックミニバイアル中で６０分
間氷上でインキュベートし、３０分間５０，０００ｇで
遠心分離することにより、結合したリガンドと遊離して
いるリガンドとを分離した。ペレットを冷インキュベー
ション緩衝液４ｍｌで２回洗った後、Ｂｅｃｋｍａｎ
Ｒｅａｄｙ−Ｐｒｏｔｅｎ Ｐｌｕｓシンチレーション
カクテル５ｍｌを加えて計数した。

【００５８】スキャッチャード分析の結果、組み換えに
より発現されたヒトＥＡＡ３ａレセプターは約１２９．
３±１５．０ｎＭ（図５）の解離定数（Ｋｄ）を有する
単一類の［³Ｈ］標識カイネート結合部位を含むことが
判明した。更に、ＣＯＳ細胞中で発現される場合にＥＡ
Ａ３ａレセプターの最大カイネート結合は１４６９±９
０９ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質であることが判明した。

【００５９】更にＣＯＳ細胞中のＥＡＡ３ａレセプター
について［³Ｈ］−カイネート置換アッセイを実施し、
選択されたリガンドの相対結合親和性を決定した。その
結果、図６に示すようにＥＡＡ３ａレセプターに結合す
る³Ｈ−カイネートの置換におけるリガンドの力価の順
位は、ドモエート＞カイネート＞Ｌ−グルタメート＝キ
スカレート＞ＤＮＱＸ＝ＣＮＱＸ＞ＡＭＰＡ＞ジヒドロ
カイネート＞ＮＭＤＡであることが判明した。

【００６０】この方法でＥＡＡ３ａ産生ＣＯＳ細胞由来
の膜調製物を用いて実施したアッセイによると、８０ｎ
Ｍ 標識化リガンドで１６７ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質
の特異的［³Ｈ］−カイネート結合が明らかになった
（図４）。モック（Ｍｏｃｋ）トランスフェクトした細
胞は試験したどのリガンドとも特異的結合を示さなかっ
た。これらの結果、ヒトＥＡＡ３ａレセプターはカイネ
ートに特異的に結合していることが明らかである。この
活性は、ＡＭＰＡ又はＮＭＤＡでは実証可能な結合がほ
とんど又は全く得られないという事実と相俟って、ＥＡ
Ａ３ａレセプターがカイネート型ＥＡＡレセプターであ
ることを明示している。さらに、この結合プロフィール
はレセプターが正規に機能していることを示し、したが
って無傷ヒト脳からの対応する非組換え体のリガンド結
合「特性」を確実に予測することができる。これらの特
徴により、組換え体レセプターは、レセプターに結合す
るリガンド化合物を選択及び特徴付けるため、及び／又
はレセプターから他のリガンドを置換することにより作
用し得る化合物を選択及び特徴付けるために特に有用で
ある。単一の均質なレセプター種として発現可能な純粋
形態でＥＡＡ３ａレセプター遺伝子を単離する結果、こ
のような特徴付けを行うためにヒト及び非ヒト脳からの
複雑で不均質なレセプター調製物を用いる場合に生じた
精度の欠如という問題なしにリガンド結合アッセイを実
施することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】この図は、本発明の興奮性アミノ酸レセプタ
ーをコードするＤＮＡを含むｃＤＮＡインサートのヌク
レオチド配列及びその推定アミノ酸配列を示す。

【図１Ｂ】図１Ａの続きである。

【図１Ｃ】図１Ｂの続きである。

【図１Ｄ】図１Ｃの続きである。

【図１Ｅ】図１Ｄの続きである。

【図２】この図は、図１に示す全長ＤＮＡ配列を生息さ
せるベクターを構築するために使用される手法をプラス
ミド地図により示す。

【図３】この図は、図１に示すＤＮＡ配列を有するベク
ターを構築するために使用される手法をプラスミド地図
により示す。

【図４】この図のＡ〜Ｃは、図１に関連して、天然に存
在する変異体のＤＮＡ及びアミノ酸配列と、図１に示す
ＥＡＡレセプターのＤＮＡ配列とを比較したものであ
る。

【図５】この図は図１に示すコーディング領域から発現
されるＥＡＡレセプターのリガンド結合特性を示す。

【図６】この図は図１に示すコーディング領域から発現
されるＥＡＡレセプターのリガンド結合特性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｒ 1:91 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 カンダス・イー・エリオツト カナダ国、オンタリオ・エム・８・ブ イ・２・エル・２、エトビコーク、バー リントン・ストリート・74、アパートメ ント・ナンバー・１ (72)発明者 ステイーブン・エル・ナツト カナダ国、オンタリオ・エム・８・ブ イ・２・エル・２、エトビコーク、バー リントン・ストリート・74、アパートメ ント・ナンバー・１ (56)参考文献 Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．351，Ｐ．745 −748（1991) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA C07K 14/705 C07K 16/28 C12N 5/10 C12P 21/02 G01N 33/53 G01N 33/566

Claims (16)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記アミノ酸配列を有するヒトEAA3aレ
   セプター、下記配列と少なくとも９７％の相同性を有す
   るヒトEAA３aレセプターのカイネート結合誘導体、また
   はヒトEAA３aレセプター若しくはその誘導体のカイネー
   ト結合フラグメントをコードする単離ポリヌクレオチ
   ド。 【化１】
2. 【請求項２】 カイネート結合誘導体のアミノ酸置換
   が、全て保存的アミノ酸置換であることを特徴とする請
   求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 下記アミノ酸配列を有するヒトEAA３aレ
   セプターをコードする請求項１に記載の単離ポリヌクレ
   オチド。 【化２】
4. 【請求項４】 下記アミノ酸配列を有するヒトEAA３b
   レセプターをコードする請求項１に記載の単離ポリヌク
   レオチド。 【化３】
5. 【請求項５】 下記アミノ酸配列を有するヒトEAA３c
   レセプターをコードする請求項１に記載の単離ポリヌク
   レオチド。 【化４】
6. 【請求項６】 請求項１から５のいずれか一項に記載の
   ポリヌクレオチドを組込んだ組換えDNA構築物。
7. 【請求項７】 前記ポリヌクレオチドが前記レセプター
   を細胞宿主中で発現及び分泌できるようにDNAと作動的
   に結合していることを特徴とする請求項６に記載の組換
   えDNA構築物。
8. 【請求項８】 カイネート結合ヒトEAAレセプターを産
   生するように遺伝子組換えされ、請求項１から５のいず
   れか一項に記載の異種ポリヌクレオチドを発現可能に組
   込んだ細胞。
9. 【請求項９】 哺乳動物細胞であることを特徴とする請
   求項８に記載の細胞。
10. 【請求項１０】 請求項８に記載の細胞から誘導される
    膜調製物。
11. 【請求項１１】 請求項１から５のいずれか一項に記載
    のヒトEAA３レセプターをコードするポリヌクレオチド
    を発現可能に組込んだ細胞を培養する段階と、その後、
    培養細胞を回収する段階とを含む、実質的に均質なヒト
    EAAレセプター源の取得方法。
12. 【請求項１２】 培養細胞から膜調製物を得る後続段階
    を含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 適当な条件下で請求項8に記載のヒトE
    AA３レセプター産生細胞又は該細胞から誘導される膜調
    製物と共にテストリガンドをインキュベートする段階
    と、その後、ヒトEAA３レセプターとテストリガンドと
    の間の結合度又は該細胞もしくは膜を流れるリガンド誘
    導電流のいずれか一方を測定する段階とを含む、ヒトCN
    Sレセプターとの相互作用についてテストリガンドをア
    ッセイする方法。
14. 【請求項１４】 ヒト起源の他のタンパク質を本質的に
    含まない形態の下記アミノ酸配列を有するヒトEAA３aレ
    セプターまたは下記配列と少なくも９７％の相同性を有
    するヒトEAA３aレセプターのカイネート結合誘導体。 【化５】
15. 【請求項１５】 下記アミノ酸配列を有するヒトEAA３a
    レセプターまたは下記配列と少なくとも９７％の相同性
    を有するヒトEAA３aレセプターのカイネート結合誘導体
    のカイネート結合フラグメント。 【化６】
16. 【請求項１６】 下記アミノ酸配列を有するヒトEAA３a
    レセプターまたは下記配列と少なくとも９７％の相同性
    を有するヒトEAA３aレセプターのカイネート結合誘導体
    の免疫原性フラグメント。 【化７】