JP2004510789A - 選択的抗不安治療薬 - Google Patents
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Abstract
本発明は、あまり重症の副作用（例えば、鎮静作用と記憶消失作用、特に依存性傾向）の無い、不安関連障害の治療を可能にする選択的抗不安治療薬に関する。これらの選択的治療薬は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合する。あるいはこれらの選択的物質は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を選択的または優先的に活性化する。本発明はまた、かかる選択的抗不安治療薬の同定方法に関する。本発明はまた、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体へのベンゾジアゼピンの結合を低下させるが、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合を実質的に低下させない、分子の同定方法に関する。
Description
【０００１】
１． 発明の分野
本発明は、あまり重症の副作用（例えば、鎮静作用と記憶消失作用、特に依存性傾向）の無い、不安関連障害の治療を可能にする選択的抗不安治療薬に関する。これらの選択的治療薬は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合する。あるいはこれらの選択的物質は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を選択的または優先的に活性化する。本発明はまた、かかる選択的抗不安治療薬の同定方法に関する。本発明はまた、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体へのベンゾジアゼピンの結合を低下させるが、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合を実質的に低下させない、分子の同定方法に関する。
【０００２】
２． 発明の背景
不安関連障害はよくある医学的症状であり、一般的不安障害、パニック不安症、心的外傷後ストレス障害、恐怖症、不安抑うつ、精神分裂病関連不安症、情動不安、および一般的興奮状態を含む。現在使用されている主要な抗不安薬は、ベンゾジアゼピンである。その精神安定作用以外に、ベンゾジアゼピンはまた種々の好ましくない副作用を示し、例えば鎮静作用、先行性健忘症、およびエタノール増強作用がある。しかしベンゾジアゼピンの治療的使用を制限する主要な要因は、その長期使用後の後遺症、特に依存性傾向である。ベンゾジアゼピンと不安関連障害の治療におけるその使用についての総説は、例えばＳｃｈａｄｅｒとＧｒｅｅｎｂｌａｔｔ， １９９３， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２８（１９）：１３９８−１４０５を参照されたい。
【０００３】
ベンゾジアゼピン薬の分子標的は、ベンゾジアゼピンに特異的な結合部位を含有する神経伝達物質ＧＡＢＡの受容体（ＧＡＢＡＡ 受容体）である。さらに、ＧＡＢＡＡ 受容体上には他の結合部位（バルビツレートおよび神経ステロイド結合部位を含む）がある。ＧＡＢＡＡ 受容体は種々のアイソフォームで存在し、主にα−サブユニットのタイプで区別され、α１、α２、α３、およびα５ ＧＡＢＡＡ 受容体サブタイプと呼ばれる。ジアゼパムのような古典的なベンゾジアゼピンは、すべてのベンゾジアゼピン感受性ＧＡＢＡＡ 受容体と、同等の親和性と効率で相互作用する。ベンゾジアゼピン以外に、化学的に無関係のリガンドが、この部位に同様に作用することができる。
【０００４】
すなわち、当該分野には、依存性傾向や鎮静作用のような副作用の無い、またはその重症度が低下した、不安関連障害を治療することができる物質に対するニーズがある。
【０００５】
第２節または本出願の他の節の文献の引用は、そのような文献が本発明の先行技術として入手できることを認めるものではない。
【０００６】
３． 発明の要約
本発明は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合する、不安関連障害の治療を可能にする一方でα１−ＧＡＢＡＡ 受容体を介するそのような治療の好ましくない副作用を最小にする、選択的抗不安治療薬の同定方法に関する。本方法は、候補分子（試験物質）にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体とα１−ＧＡＢＡＡ 受容体とを接触させ、候補分子が、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合するかどうかを測定することを含む。本発明はまた、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合する選択的抗不安治療薬に関する。本発明はまた、治療の必要な被験体に、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合する選択的抗不安治療薬の治療上有効量を投与することを含む、不安関連障害の治療法に関する。本発明の選択的物質はまた、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較して、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体またはα５−ＧＡＢＡＡ 受容体に対して、より小さいかまたはより大きい結合親和性を有する。
【０００７】
選択的物質は、受容体の神経ステロイド、バルビツレートまたはベンゾジアゼピン結合部位を含む、受容体上の任意の結合部位で、ＧＡＢＡＡ 受容体に結合することができる。選択的抗不安物質が、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体、α３−ＧＡＢＡＡ受容体、またはα５−ＧＡＢＡＡ受容体に比較して、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合するかまたはこれを活性化する限り、選択的物質が結合する受容体の結合部位は、本発明にとって重要ではないと考えられる。
【０００８】
本発明はまた一部は、ベンゾジアゼピンのような抗不安治療薬の抗不安作用は、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体により仲介され、そのような物質の副作用（例えば、鎮静作用および依存性傾向）は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体により仲介されるという事実に基づく。
【０００９】
本発明において、選択的抗不安治療薬は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に優先的または選択的に結合する物質である。例えば、ベンゾジアゼピンであるジアゼパムは、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体とα１−ＧＡＢＡＡ 受容体に等しく（非特異的に）結合し、従って選択的物質ではない。しかし選択的治療薬は、非選択的物質と比較して、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に対する結合親和性が小さいか、またはα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に対する結合親和性が大きい。本発明のある実施形態において、選択的または優先的結合とは、この物質が、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に対する親和性より少なくとも１０％大きいレベルで、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する（親和性を有する）ことを示す。別の実施形態においてこの物質は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも２倍強くα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する。別の実施態様においてこの物質は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも１０倍強くα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する。さらに別の実施態様においてこの物質は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも１００倍強くα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する。さらに別の実施態様においてこの物質は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも１０００倍強くα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する。本発明の選択的物質はまた、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体と比較して、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体またはα５−ＧＡＢＡＡ 受容体に対して、より小さいかまたはより大きい結合親和性を有する。
【００１０】
本発明の別の実施形態において、選択的抗不安治療薬は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体と比較して、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に非選択的に結合する物質であるが、受容体活性化の効率は異なる。例えばこの物質の結合親和性は、２つの受容体のサブタイプの間で異ならないが、この物質がα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化する能力は、この物質がα１−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化する能力より大きく、従ってこの物質は選択的物質として作用する。この実施形態の１つの態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも１０％強く活性化される。この実施態様の別の態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも２５％強く活性化される。この実施態様の好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも１０％強く活性化される。この実施態様のさらに好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも５０％強く活性化される。すなわち本発明はまた、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体またはα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に対する結合親和性とは無関係に、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を選択的または優先的に活性化する選択的抗不安治療薬の同定法に関し、この治療薬は、不安関連障害の治療を可能にする一方でα１−ＧＡＢＡＡ 受容体を介するそのような治療の好ましくない副作用を最小にする。本法は、候補分子（試験物質）にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体とα１−ＧＡＢＡＡ 受容体とを接触させ、候補分子が、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を選択的または優先的に活性化するかどうかを測定することを含む。本発明はまた、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を選択的または優先的に活性化する選択的抗不安治療薬に関する。本発明はまた、治療の必要な被験体に、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を選択的または優先的に活性化する選択的抗不安治療薬の治療上有効量を投与することを含む、不安関連障害の治療法に関する。本発明の選択的物質はまた、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較して、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体またはα５−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化するより小さいかまたはより大きい能力を有する。
【００１１】
本発明はまた、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する非選択的ベンゾジアゼピンの能力を低下させるが、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する非選択的ベンゾジアゼピンの能力を実質的に低下させない分子の同定法に関する。そのような分子は、ベンゾジアゼピンを用いて、しかし小さい副作用で不安関連障害の治療を可能にする。この方法は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体とα２−ＧＡＢＡＡ 受容体とに、ベンゾジアゼピンと候補分子（試験物質）とを接触させて、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合するベンゾジアゼピンの能力を低下させるが、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合するベンゾジアゼピンの能力を実質的に低下させない、候補分子の能力を検出することを含む。この実施形態のある態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は７５％以下低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は少なくとも２５％低下する。この実施形態の好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は５０％以下低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は少なくとも５０％低下する。この実施形態の別の好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は２５％以下低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は少なくとも７５％低下する。
【００１２】
本発明はまた、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体、またはα５−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化する非選択的ベンゾジアゼピンの能力を、低下させるが、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化する非選択的ベンゾジアゼピンの能力を実質的に低下させない、分子の同定法に関する。そのような分子は、ベンゾジアゼピンを用いて、小さい副作用で不安関連障害の治療を可能にする。この方法は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体とα２−ＧＡＢＡＡ 受容体とに、ベンゾジアゼピンと候補分子（試験物質）とを接触させて、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体、またはα５−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化するベンゾジアゼピンの能力を低下させるが、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化するベンゾジアゼピンの能力を実質的に低下させない、候補分子の能力を検出することを含む。この実施形態のある態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は７５％以下だけ低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体、またはα５−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は少なくとも２５％だけ低下する。この実施形態の好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は５０％以下低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体、またはα５−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は少なくとも５０％低下する。この実施形態の別の好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は、２５％以下低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体、またはα５−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は少なくとも７５％低下する。
【００１３】
本発明の選択的抗不安治療薬および／または分子は、ｉｎ ｖｉｖｏで代謝されて生物活性物質すなわち選択的抗不安物質または結合のモジュレーターになるプロドラッグを含む。
【００１４】
４． 図面の簡単な説明
図面の簡単な説明については下記参照。
【００１５】
５． 発明の詳細な説明
本発明は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体により介在されるかかる治療の好ましくない副作用を最小にする一方で不安関連障害の治療を可能にする、選択的抗不安治療薬の同定法に関する。本方法は、候補分子（試験物質）にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体とα１−ＧＡＢＡＡ 受容体とを接触させ、候補分子が、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合するかどうかを測定することを含む。本発明はまた、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合する選択的抗不安治療薬に関する。本発明はまた、治療の必要な被験者に、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合する選択的抗不安治療薬の治療上有効量を投与することを含む、不安関連障害の治療法に関する。本発明の選択的物質はまた、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較して、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体またはα５−ＧＡＢＡＡ 受容体に対して、より小さいかまたはより大きい結合親和性を有してもよい。
【００１６】
選択的物質は、受容体の神経ステロイド、バルビツレートまたはベンゾジアゼピン結合部位を含む、受容体上の任意の結合部位で、ＧＡＢＡＡ 受容体に結合することができる。選択的抗不安物質が、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体またはα５−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合するかまたはこれを活性化する限り、選択的物質が結合する受容体の結合部位は、本発明にとって重要ではない。
【００１７】
本発明は、一部には、ベンゾジアゼピンのような抗不安治療薬の抗不安作用は、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体により介在され、一方そのような物質の副作用（例えば、鎮静および依存性傾向）は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体により介在されるという事実に基づく。
【００１８】
本発明に従えば、選択的抗不安治療薬は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に優先的または選択的に結合する物質である。例えば、ベンゾジアゼピンであるジアゼパムは、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体とα１−ＧＡＢＡＡ 受容体に等しく（非特異的に）結合し、従って選択的物質ではない。しかし選択的治療薬は、非選択的物質と比較してα１−ＧＡＢＡＡ 受容体に対する結合親和性がより小さいか、またはα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に対してより大きな結合親和性を有する。本発明のある実施形態において、選択的または優先的結合とは、この物質が、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に対する親和性より少なくとも１０％大きいレベルで、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する（に対する親和性を有する）ことを示す。別の実施形態においてこの物質は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも２倍良好にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する。別の実施態様においてこの物質は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも１０倍良好にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する。さらに別の実施態様においてこの物質は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも１００倍良好にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する。さらに別の実施態様においてこの物質は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも１０００倍良好にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する。本発明の選択的物質はまた、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体と比較して、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体またはα５−ＧＡＢＡＡ 受容体に対して、より小さいかまたはより強力な結合親和性を有しうる。
【００１９】
本発明の別の実施形態において、選択的抗不安治療薬は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体と比較して、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に非選択的に結合するが、受容体活性化の効率が異なる物質である。例えばこの物質の結合親和性は、２つの受容体のサブタイプの間で異ならないが、この物質がα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化する能力は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化する能力より大きく、従ってこの物質は選択的物質として作用する。この実施形態の１つの態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも１０％大きく活性化される。この実施態様の別の態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも２５％大きく活性化される。この実施態様の好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも１０％大きく活性化される。この実施態様のさらに好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも５０％大きく活性化される。すなわち本発明はまた、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体またはα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に対する結合親和性とは無関係に、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を選択的または優先的に活性化し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体により介在されるかかる治療の好ましくない副作用を最小にする一方で不安関連障害の治療を可能にする、選択的抗不安治療薬の同定法に関する。本方法は、候補分子（試験物質）にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体とα１−ＧＡＢＡＡ 受容体とを接触させ、候補分子が、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を選択的または優先的に活性化するかどうかを測定することを含む。本発明はまた、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を選択的または優先的に活性化する選択的抗不安治療薬に関する。本発明はまた、治療の必要な被験者に、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を選択的または優先的に活性化する選択的抗不安治療薬の治療上有効量を投与することを含む、不安関連障害の治療法に関する。本発明の選択的物質はまた、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較して、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体またはα５−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化する能力が、より大きいかまたはより小さくありうる。
【００２０】
本発明はまた、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する非選択的ベンゾジアゼピンの能力を低下させるが、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する非選択的ベンゾジアゼピンの能力を実質的に低下させない分子の同定法に関する。そのような分子は、ベンゾジアゼピンを用いて、低下した副作用で不安関連障害の治療を可能にする。この方法は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体とα２−ＧＡＢＡＡ 受容体とに、ベンゾジアゼピンと候補分子（試験物質）とを接触させて、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合するベンゾジアゼピンの能力を低下させるがα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合するベンゾジアゼピンの能力を実質的に低下させない、候補分子の能力を検出することを含む。この実施形態の１つの態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は、７５％以下だけ低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は少なくとも２５％だけ低下する。この実施形態の好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は、５０％以下だけ低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は少なくとも５０％だけ低下する。この実施形態の別の好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は、２５％以下だけ低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は少なくとも７５％だけ低下する。
【００２１】
本発明はまた、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化する非選択的ベンゾジアゼピンの能力を低下させるが、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化する非選択的ベンゾジアゼピンの能力を実質的に低下させない分子の同定法に関する。そのような分子は、ベンゾジアゼピンを用いて、低下した副作用で不安関連障害の治療を可能にする。この方法は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体とα２−ＧＡＢＡＡ 受容体とに、ベンゾジアゼピンと候補分子（試験物質）とを接触させて、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化するベンゾジアゼピンの能力を低下させるが、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化するベンゾジアゼピンの能力を実質的に低下させない、候補分子の能力を検出することを含む。この実施形態の１つの態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は、７５％以下だけ低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は少なくとも２５％だけ低下する。この実施形態の好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は、５０％以下だけ低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は少なくとも５０％だけ低下する。この実施形態の別の好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は、２５％以下だけ低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は少なくとも７５％だけ低下する。
【００２２】
５．１ 優先的結合物質のスクリーニング
本発明は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体により介在されるかかる治療の副作用を最小にする一方で不安関連障害の治療を可能にする選択的抗不安治療薬の同定法に関する。本方法は、候補分子にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体とα１−ＧＡＢＡＡ 受容体とを接触させ、候補分子が、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合するかどうかを測定することを含む。本発明の１つの実施形態において、この物質は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に対する親和性より少なくとも１０％大きいレベルで、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する（に対して親和性を有する）。別の実施形態においてこの物質は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも２倍良好にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する。別の実施態様においてこの物質は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも１０倍良好にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する。さらに別の実施態様においてこの物質は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも１００倍良好にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する。さらに別の実施態様においてこの物質は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも１０００倍良好にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する。
【００２３】
前記を実施するのに使用することができるスクリーニング法は、当技術分野で一般的に知られている。例えば、ペプチドライブラリーのスクリーニングを開示する以下の参考文献を参照されたい：ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ， １９８９， Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ２５１：２１５−２１８；ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｆｏｗｌｋｅｓら， １９９２， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４２２−４２７；Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：５３９３−５３９７；Ｙｕら， １９９４， Ｃｅｌｌ ７６：９３３−９４５；Ｓｔａｕｄｔら， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５７７−５８０；Ｂｏｃｋら， １９９２， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：５６４−５６６；Ｔｕｅｒｋら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：６９８８−６９９２；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎら， １９９２， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：８５０−８５２；米国特許第５，０９６，８１５号；米国特許第５，２２３，４０９号；米国特許第５，１９８，３４６号；ＲｅｂａｒおよびＰａｂｏ， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：６７１−６７３；および国際特許公報第ＷＯ９４／１８３１８号。
【００２４】
特定の実施形態において、スクリーニングは、ライブラリーのメンバーに、固相に固定化したα１−ＧＡＢＡＡ 受容体および／またはα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を接触させ、受容体に結合するライブラリーメンバーを採取することにより行われうる。そのようなスクリーニング法の例（「パニング（ｐａｎｎｉｎｇ）」技法と呼ぶ）は、例えばＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ， １９８８， Ｇｅｎｅ ７３：３０５−３１８；Ｆｏｗｌｋｅｓら， １９９２， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４２２−４２７；国際特許公報第ＷＯ９４／１８３１８号；および上記で引用した参考文献に記載されている。
【００２５】
好適な実施形態において、両方のタイプの受容体が細胞表面に発現され、細胞は、スクリーニングアッセイで使用される。
【００２６】
別の特定の実施形態において、候補分子は、競合的または非競合的受容体リガンドとしてスクリーニングされる。さらに別の特定の実施形態において、使用される結合アッセイは、後述の第６節に記載の結合アッセイである。
【００２７】
スクリーニング法は、放射性リガンド（例えば、１２５Ｉまたは３Ｈ）、磁性リガンド（例えば、フォトビオチンアセテートに共有結合した常磁性ビーズ）、蛍光性リガンド（例えば、フルオレセインまたはローダミン）、または酵素リガンド（例えば、ルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼ）を用いて受容体を標識することを含み得る。次に、溶液中で結合する反応物を、当技術分野で公知の多くの技法（限定されないが、非標識リガンド（または、標識部分で使用されるものから区別可能なマーカーで標識したリガンド）に対する抗血清を使用する標識部分の共免疫沈降、免疫親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および濃度勾配遠心分離法を含む）の１つを使用して単離することができる。
【００２８】
受容体または候補分子を標識するのに、当技術分野で一般的に知られている方法が使用される。好適な標識には、限定されないが、放射能標識アミノ酸（例えば、３Ｈ−ロイシンまたは３５Ｓ−メチオニン）の取り込みによる放射能標識、クロラミンＴ法、Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬などを使用する１２５Ｉまたは１３１Ｉによる翻訳後ヨウ素化による放射能標識、キナーゼおよび無機放射能標識リンを使用する３２Ｐによる標識、フォトビオチン−アセテートと太陽灯露光を用いるビオチン標識などが含まれる。受容体の１つが固定化されている場合、リガンドが標識される。受容体も候補分子も固定化されていない場合、それぞれを区別可能なマーカーで標識し、両方の部分を単離して、続いてより正確に定量し、結合複合体の形成を区別するようにすることができる。
【００２９】
典型的な結合条件は、例えば、限定されるものではないが、１０〜２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５〜５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ５〜８）、および０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、または相互作用の特異性を改良する他の界面活性剤の塩水溶液である。金属キレート剤および／または２価陽イオンを加えて、結合を改良するかおよび／またはタンパク質分解を低下させてもよい。反応温度としては、４、１０、１５、２２、２５、３５、または４２℃を挙げることができ、インキュベーション時間は、典型的には少なくとも１５秒であるが、結合平衡を起こすには、より長時間が好ましい。
【００３０】
複合体形成の物理的パラメーターは、使用される標識に特異的なアッセイ方法（例えば放射活性検出には液体シンチレーション分光法、酵素標識には酵素活性測定など）を用いて複合体形成を定量することにより分析されうる。次に反応結果は、スキャッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）分析、Ｈｉｌｌ分析、および当技術分野で一般的に知られる他の方法を使用して分析される（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ， ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、第２版（１９９３）、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、を参照）。
【００３１】
結合アッセイへの第２の一般的なアプローチにおいて、結合分子種（ｓｐｅｃｉｅｓ）の１つ（すなわち、受容体またはリガンド）は、フィルター上、マイクロタイタープレートウェル、試験管、クロマトグラフィーマトリックスなどに、共有結合または非共有結合で固定化される。当技術分野で周知の方法を使用して、タンパク質を共有結合的に固定化することができ、例えば限定されないが、ＫａｄｏｎａｇａとＴｊｉａｎの方法（１９８６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：５８８９−５８９３， １９８６）、すなわちＣＮＢｒ−セファロース４Ｂのような臭化シアン誘導体化基質への結合がある。必要であれば、スペーサーを使用して、基質による立体障害を低下させることができる。基質へのタンパク質の非共有結合には、限定されないが、荷電表面へのタンパク質の結合、特異的抗体を用いる結合、第３の無関係の相互作用タンパク質への結合が含まれる。
【００３２】
特定の実施形態において、他のタンパク質成分への試薬の非特異的結合、プラスチック、固定化マトリックスなどへの試薬の吸収性喪失を阻害するブロッキング剤が、アッセイ混合物中に含まれる。ブロッキング剤としては、限定されないが、ウシ血清アルブミン、β−カゼイン、脱脂乾燥ミルク、Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ試薬、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、ポリビニルピロリジン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｏｌｉｄｉｎｅ）、非イオン性界面活性剤（ＮＰ４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０など）、イオン性界面活性剤（例えば、ＳＤＳ、ＬＤＳなど）、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。
【００３３】
結合が行われた後、未結合の標識受容体は上清とともに除去され、結合した標識リガンドを有する固定化受容体は、充分に洗浄される。次に、結合した標識の量は、標識を検出するための当技術分野で公知の標準的方法を使用して定量される。
【００３４】
５．２ 優先的アクチベーターのスクリーニング
本発明はまた、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体またはα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に対する結合親和性とは無関係に、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を選択的または優先的に活性化し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体により介在される、かかる治療の好ましくない副作用を最小にする一方で、不安関連障害の治療を可能にする、選択的抗不安治療薬の同定法に関する。本方法は、候補分子（試験物質）にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体とα１−ＧＡＢＡＡ 受容体とを接触させ、候補分子が、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を選択的または優先的に活性化するかどうかを測定することを含む。１つの実施形態において、この物質は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも１０％大きくα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化する。別の実施態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも２５％大きく活性化される。好適な実施態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも１０％大きく活性化される。より好適な実施形態において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも５０％大きく活性化される。
【００３５】
前記を実施することができるスクリーニング法は、当技術分野で一般的に知られている。例えば、限定されるものではないが、特定の受容体を活性化する物質の能力は、受容体が発現される細胞を使用して試験することができる。例示すると、ＧＡＢＡによる活性化後にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体活性化が測定され、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体を発現する細胞をＧＡＢＡと候補分子またはＧＡＢＡ単独と接触させ、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体活性化の量が、種々の方法により測定される。そのような方法には、限定されないが、膜電位または電流の電気生理学的変化の測定；放射活性塩化物イオンを使用するフロー塩化物イオンの生化学的変化の測定（塩化物フラックスアッセイ）；細胞膜を使用する放射性リガンド結合による、ＧＡＢＡと受容体および／または候補分子との間のアロステリック相互作用の変化の測定（ＧＡＢＡシフトアッセイ）が含まれる。
【００３６】
５．３ 結合モジュレーターのスクリーニング
本発明はまた、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する非選択的ベンゾジアゼピンの能力を低下させるが、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する非選択的ベンゾジアゼピンの能力は実質的に低下させない分子の同定法に関する。そのような分子は、ベンゾジアゼピンを用いて、低下した副作用で不安関連障害の治療を可能にする。この方法は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体とα２−ＧＡＢＡＡ 受容体とに、ベンゾジアゼピンと候補分子（試験物質）とを接触させて、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合するベンゾジアゼピンの能力を低下させるが、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合するベンゾジアゼピンの能力を実質的に低下させない、候補分子の能力を検出することを含む。この実施形態の１つの態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は、７５％以下だけ低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は少なくとも２５％だけ低下する。この実施形態の好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は、５０％以下だけ低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は少なくとも５０％だけ低下する。この実施形態の別の好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は、２５％以下だけ低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は少なくとも７５％だけ低下する。
【００３７】
本発明はまた、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化する非選択的ベンゾジアゼピンの能力を低下させるが、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化する非選択的ベンゾジアゼピンの能力を実質的に低下させない、分子の同定法に関する。そのような分子は、ベンゾジアゼピンを用いて、低下した副作用で不安関連障害の治療を可能にする。この方法は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体とα２−ＧＡＢＡＡ 受容体とに、ベンゾジアゼピンと候補分子（試験物質）とを接触させて、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化するベンゾジアゼピンの能力を低下させるが、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化するベンゾジアゼピンの能力を実質的に低下させない、候補分子の能力を検出することを含む。この実施形態の１つの態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は、７５％以下だけ低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は少なくとも２５％だけ低下する。この実施形態の好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は、５０％以下だけ低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は少なくとも５０％だけ低下する。この実施形態の別の好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は、２５％以下だけ低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は少なくとも７５％だけ低下する。
【００３８】
そのような候補分子のスクリーニングを実施するのに使用することができる方法は、当技術分野で一般的に知られているか、および／または前記第５．１節と第５．２節および後述の第６節において使用する方法である。
【００３９】
５．４ 候補分子
当技術分野で公知の分子は、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に優先的もしくは選択的に結合するかまたはこれを活性化する能力、あるいはα１−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合するベンゾジアゼピンまたはその化学的誘導体の能力をモジュレートする能力について、試験することができる。例えば、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体とα１−ＧＡＢＡＡ 受容体への候補分子の結合を測定し、分子がα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に優先的または選択的に結合するかどうかを測定することにより、結合を検出することができる。さらに別の例において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体とα１−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化する候補分子の能力を測定し、分子がα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を優先的または選択的に活性化するかどうかを測定することにより、受容体活性化を検出することができる。ある特定の実施形態において候補分子は、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体およびα１−ＧＡＢＡＡ 受容体を発現する細胞に直接提供することができるか、または核酸が組換え的に発現され、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体およびα１−ＧＡＢＡＡ 受容体を発現する細胞内に候補タンパク質を産生する条件下で、そのコードする核酸を提供することにより、提供することができる。
【００４０】
本発明のこの実施形態は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に優先的または選択的に結合する分子の化学ライブラリーをスクリーニングするのに、よく適している。化学ライブラリーは、ペプチドライブラリー、ペプチドミメティック（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）ライブラリー、化学合成ライブラリー、組換え（例えば、ファージディスプレイライブラリー、およびｉｎ ｖｉｔｒｏの翻訳に基づくライブラリー、他の非ペプチド合成有機ライブラリーなどでもよい。
【００４１】
典型的なライブラリーは、いくつかの製造業者（ＡｒＱｕｌｅ， Ｔｒｉｐｏｓ／ＰａｎＬａｂｓ， ＣｈｅｍＤｅｓｉｇｎ， Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）から市販されている。いくつかの場合には、これらの化学ライブラリーは、メンバー化合物が結合している基質上のライブラリーの各メンバーの本体をコードするコンビナトリアルストラテジーを使用して作製され、こうして有効なモジュレーターである分子の、直接的かつ即時同定を可能にする。すなわち、多くのコンビナトリアルアプローチにおいて、化合物のプレート上の位置が、その化合物の組成を特定する。また、１つの例において単一のプレート位置は、１〜２０の化学物質を有し、これは、目的の相互作用を含有するウェルへの投与によりスクリーニングすることができる。すなわち、モジュレーションを検出する場合、相互作用対のより小さいプールを、モジュレーション活性についてアッセイすることができる。そのような方法により、多くの候補分子をスクリーニングすることができる。
【００４２】
使用に好適な多くの多様性ライブラリーが当技術分野で公知であり、本発明に従って試験すべき化合物を提供するために使用できる。あるいは、標準的方法を使用してライブラリーを構築することができる。化学（合成）ライブラリー、組換え発現ライブラリー、またはポリソームに基づくライブラリーは、使用可能なライブラリーの典型的なタイプである。
【００４３】
ライブラリーは、拘束されても、もしくは半剛性（ある程度の構造的剛性を有する）でも、または線状化でももしくは拘束されていなくてもよい。ライブラリーは、ｃＤＮＡもしくはゲノム発現ライブラリー、ランダムペプチド発現ライブラリー、または化学合成ランダムペプチドライブラリー、または非ペプチドライブラリーでもよい。発現ライブラリーは細胞に導入され、ここで、アッセイが行われ、ライブラリーの核酸が発現されて、それらのコードタンパク質が産生される。
【００４４】
１つの実施形態において、本発明で使用可能なペプチドライブラリーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで化学合成されるライブラリーでもよい。そのようなライブラリーの例は、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８６（これは、各ペプチド中の第１のまたは第２の残基が個々にかつ特異的に規定される、遊離のヘキサペプチドの混合物を記載する）；Ｌａｍら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４（これは、「１ビーズ、１ペプチド」アプローチを記載し、ここでは、固相スプリット合成スキームがペプチドのライブラリーを生産し、このコレクション中の各ビーズは、その上にアミノ酸残基の単一のランダム配列を固定化している）；Ｍｅｄｙｎｓｋｉ， １９９４， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：７０９−７１０（これは、スプリット合成とＴバッグ（Ｔ−ｂａｇ）合成法を記載する）；およびＧａｌｌｏｐら， １９９４， Ｊ． Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７（９）：１２３３−１２５１に記載されている。ただ他の例示のために述べると、コンビナトリアルライブラリーは、Ｏｈｌｍｅｙｅｒら， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１０９２２−１０９２６；Ｅｒｂら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１１４２２−１１４２６；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら， １９９２， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２；Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１６１４−１６１８；またはＳａｌｍｏｎら， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１１７０８−１１７１２の方法に従って、使用のために調製することができる。ＰＣＴ公報第ＷＯ９３／２０２４２号ならびにＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：５３８１−５３８３は、「コードされたコンビナトリアル化学ライブラリー（ｅｎｃｏｄｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）」を記載し、これは、各化学ポリマーライブラリーのメンバーのためのオリゴヌクレオチド識別子を含有する。
【００４５】
好適な実施形態において、スクリーニングされるライブラリーは、ランダムペプチドファージディスプレイライブラリーである生物学的発現ライブラリーであり、ここで、ランダムペプチドは拘束されている（例えば、ジスルフィド結合を有するため）。
【００４６】
さらに、より一般的な、構造的に拘束された有機多様性（例えば、非ペプチド）ライブラリーも使用可能である。例えば、ベンゾジアゼピンライブラリー（例えば、Ｂｕｎｉｎら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：４７０８−４７１２を参照）を使用できる。
【００４７】
使用可能なコンフォメーション的に拘束されたライブラリーには、限定されないが、酸化環境で、ジスルフィド結合により架橋して、シスチン、修飾ペプチド（例えば、フッ素、金属、アイソトープ標識物を取り込んでいる、リン酸化されているなど）、１つ以上の天然に存在しないアミノ酸を含有するペプチド、非ペプチド構造、およびかなりの割合のγ−カルボキシグルタミン酸を含有するペプチドを形成する、不変のシステイン残基を含有するものが含まれる。
【００４８】
非ペプチド、例えばペプチド誘導体（例えば、１つ以上の天然に存在しないアミノ酸を含有するもの）のライブラリーを使用することもできる。これらの１つの例は、ペプトイドライブラリーである（Ｓｉｍｏｎら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：９３６７−９３７１）。ペプトイドは、天然に存在する側鎖がα炭素ではなく、骨格アミノ窒素に結合した非天然のアミノ酸のポリマーである。ペプトイドは、ヒトの消化酵素により容易に分解されないため、薬剤としての使用により容易に適応でき有利である。使用可能なライブラリーの他の例（ペプチド中のアミド官能基性が過メチル化されていて、化学的に変換されたコンビナトリアルライブラリーが作製される）が、Ｏｓｔｒｅｓｈら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１１１３８−１１１４２により記載されている。非ペプチドライブラリーの別の実例は、ベンゾジアゼピンライブラリーである。例えば、Ｂｕｎｉｎら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：４７０８−４７１２を参照されたい。
【００４９】
本発明によりスクリーニングできるペプチドライブラリーのメンバーは、２０個の天然に存在するアミノ酸を含有することに限定されない。特に、化学合成したライブラリーとポリソームに基づくライブラリーは、２０個の天然に存在するアミノ酸以外のアミノ酸の使用を可能にする（ライブラリー生産で使用されるアミノ酸の前駆体プール中に含めることにより）。特定の実施形態ではライブラリーメンバーは、１つ以上の非天然のもしくは非古典的アミノ酸または環状ペプチドを含有する。非古典的アミノ酸には、限定されないが、通常のアミノ酸のＤ−異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸；γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸；Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸；３−アミノプロピオン酸；オルニチン；ノルロイシン；ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、デザイナー（ｄｅｓｉｇｎｅｒ）アミノ酸（例えば、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸、フルオロアミノ酸）、および一般的なアミノ酸類似体が含まれる。さらにアミノ酸は、Ｄ（右旋性）またはＬ（左旋性）でもよい。
【００５０】
特定の実施形態において、ベンゾジアゼピンの誘導体、断片および／または類似体、特にペプチドミメティックは、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性優先的または選択的結合体（ｂｉｎｄｅｒ）についてスクリーニングされる。
【００５１】
本発明の別の実施形態において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に優先的または選択的に結合する物質を同定するために、コンビナトリアル化学を使用することができる。コンビナトリアル化学は、数十万の化合物（その多くは構造的に類似しうる）を含有するライブラリーを作製することが可能である。ハイスループットスクリーニングプログラムは、既知の標的に対する親和性について、これらの大きなライブラリーをスクリーニングすることができるが、大きさはより小さいが最大の化学的多様性を提供するライブラリーを達成する新しいアプローチが開発されている（例えば、Ｍａｔｔｅｒ， １９９７， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０：１２１９−１２２９を参照）。
【００５２】
コンビナトリアル化学の１つの方法である親和性フィンガープリンティングは、規定のタンパク質パネルに対する結合親和性について、小分子の別個のライブラリーを試験するのにすでに使用されている。スクリーンにより得られるフィンガープリントは、他のタンパク質または目的の受容体（本発明においては、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体またはα２−ＧＡＢＡＡ 受容体）について個々のライブラリーメンバーの親和性を予測するのに使用される。このフィンガープリントは、ライブラリー化合物が同様に反応するかどうかを予測するために、目的のタンパク質と反応することが知られている他の化合物から得られるフィンガープリントと比較される。例えば、大きなライブラリー中のすべてのリガンドを、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体との相互作用について試験するより、その活性を有することが知られている他の化合物と類似のフィンガープリントを有するリガンドのみを試験することができる（例えば、Ｋａｕｖａｒら， １９９５， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：１０７−１１８；Ｋａｕｖａｒ， １９９５， Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ． ８：２５−２８；およびＫａｕｖａｒ， Ｔｏｘｉｃ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｗ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， Ｄ． Ｋｕｒｔｚ． Ｌ． ＳｔａｎｋｅｒおよびＪ．Ｈ． Ｓｋｅｒｒｉｔｔ．編集者， １９９５， ＡＯＡＣ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．， ３０５−３１２を参照）。
【００５３】
Ｋａｙら， １９９３， Ｇｅｎｅ １２８：５９−６５ （Ｋａｙ） は、先行の従来のライブラリーの配列より長い完全にランダムな配列のペプチドをコードするペプチドライブラリーを構築する方法を開示する。Ｋａｙに開示されるライブラリーは、長さ約２０アミノ酸より大きい完全に合成のランダムペプチドをコードする。そのようなライブラリーは、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体モジュレーターを同定するために有利にスクリーニングすることができる（また、１９９６年３月１２日付けの米国特許第５，４９８，５３８号；および１９９４年８月１８日付けのＰＣＴ公報第ＷＯ９４／１８３１８号を参照）。
【００５４】
ペプチドライブラリーの種々のタイプの包括的総説は、Ｇａｌｌｏｐら， １９９４， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：１２３３−１２５１に見出すことができる。
【００５５】
５．５ 治療薬
本発明は、選択的抗不安物質またはα１−ＧＡＢＡＡ 受容体結合のモジュレーターを含み、依存性障害のような好ましくない副作用が最小化されている本発明の治療薬を、有効量にて被験体に投与することによる、抗不安性障害の治療法を提供する。好適な態様において、治療薬は実質的に精製されたものである。被験体は、好ましくは動物であり、特に限定されないが、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物を含み、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。特定の実施形態においては、非ヒト哺乳動物が被験体である。別の実施形態においては、本発明の治療薬は、プロドラッグであり、これはｉｎ ｖｉｖｏで代謝されて、選択的抗不安物質または結合のモジュレーターとなる。さらに治療薬は、プロドラッグの活性代謝物であるかまたはその機能性誘導体もしくは類似体である。
【００５６】
治療用選択的薬剤は、ＧＡＢＡＡ 受容体上の任意の結合部位（該受容体の神経ステロイド結合部位、バルビツレート結合部位、またはベンゾジアゼピン結合部位を含む）で、ＧＡＢＡＡ 受容体に結合することができる。選択的抗不安物質が、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体、またはα５−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較して、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合するかまたはこれを活性化する限り、選択的薬剤が結合する受容体の結合部位は、本発明にとって重要ではない。
【００５７】
種々の送達システムが公知であり、本発明の治療薬を投与するのに使用することができ、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルへの封入、治療薬を発現することができる組換え細胞、受容体介在エンドサイトーシス（例えば、ＷｕおよびＷｕ， １９８７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：４４２９−４４３２）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての治療用核酸の構築などがある。導入法には、特に限定されないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、および経口経路がある。化合物は、任意の好都合な経路により、例えば注入またはボーラス注射により、上皮または皮膚粘膜内層（例えば、経口粘膜、直腸および小腸粘膜など）からの吸収により、投与すればよく、また他の生物活性物質とともに投与してもよい。投与は、全身性または局所的でもよい。さらに、本発明の医薬組成物を、任意の適当な経路（脳室内およびくも膜下注入；脳室内注入は、例えばＯｍｍａｙａリザーバーなどのリザーバーに接続した、脳室内カテーテルにより促進される）により、中枢神経系に導入することが好ましい場合がある。肺投与もまた用いることができ、吸入器またはネブライザーの使用により、およびエアロゾル化剤とともに製剤化することにより、実施される。
【００５８】
特定の実施形態においては、治療の必要な部位に本発明の医薬組成物を局所的に投与することが好ましい場合がある。これは例えば、特に限定されないが、手術の際の局所的注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯と一緒に）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラント（このインプラントは、多孔性、無孔性、またはゼラチン質材料であり、シラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜等の膜、または繊維である）により、実施することができる。ある実施形態において、投与は、悪性腫瘍または新生物もしくは前新生物組織の部位（またはかつての対応部位）への直接注射によるものでもよい。
【００５９】
別の実施形態において治療薬は、小胞中、特にリポソーム中に入れて送達される（Ｌａｎｇｅｒ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３、Ｔｒｅａｔら， １９８９， 「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ」、Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編）， Ｌｉｓｓ， ニューヨーク， ３５３−３６５頁、Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ， 前掲書， ３１７−３２７頁、全体として前掲書を参照）。
【００６０】
さらに別の実施形態において、治療薬は、制御放出系に入れて送達される。ある実施形態において、ポンプが使用され得る（Ｌａｎｇｅｒ， 前述、Ｓｅｆｔｏｎ， １９８７， ＣＲＣ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｆ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｅｎｇ． １４：２０１、Ｂｕｃｈｗａｌｄら， １９８０， Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７、Ｓａｕｄｅｋら， １９８９， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２１：５７４を参照）。別の実施形態において、ポリマー材料を使用することができる（ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編）， １９７９， Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， フロリダ州、「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｔｙ， Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ」， ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編）， １９８４， Ｗｉｌｅｙ， ニューヨーク、ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ， １９８３， Ｊ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｓｃｉ． Ｒｅｖ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２３：６１を参照、またＬｅｖｙら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０、Ｄｕｒｉｎｇら， １９８９， Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． ２５：３５１、Ｈｏｗａｒｄら， １９８９， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． ７１：１０５を参照）。さらに別の実施形態において、治療標的の近傍（すなわち、脳）に制御放出系を配置することができ、従って全身性用量のほんの一部しか必要ではない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ， １９８４， 「Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ」、前述、第２巻、１１５−１３８頁を参照）。他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３の総説で説明されている。
【００６１】
治療薬が、タンパク質治療薬をコードする核酸である、特定の実施形態においては、その核酸をｉｎ ｖｉｖｏで投与してそれにコードされるタンパク質の発現を促進することができるが、これは、その核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構築しそれを投与して細胞内に導入することによって、例えば、レトロウイルスベクター（米国特許第４，９８０，２８６号）の使用により、または直接注入により、微粒子銃（例えば、遺伝子銃、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質または細胞表面受容体またはトランスフェクション剤で被覆することにより、あるいは、それを核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチド（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら、１９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：１８６４−１８６８）に連結して投与することなどにより、実施することができる。あるいは、核酸治療薬を細胞内に導入し、相同的組換えにより発現用に宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。
【００６２】
本発明はまた、医薬組成物を提供する。そのような組成物は、治療上有効量の治療薬と薬剤学的に許容される担体とを含む。特定の実施形態において用語「薬剤学的に許容される」とは、米連邦政府または州政府の規制当局により認可されているか、または米国薬局方、または動物および特にはヒトでの使用に対する他の一般的に認識されている薬局方に、収載されていることを意味する。用語「担体」は、治療薬が一緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを意味する。このような医薬担体は、水や油（ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などの、石油、動物、植物または合成起源の油を含む）等の、無菌液体でもよい。医薬組成物が静脈内投与される場合は、水が好適な担体である。生理食塩水溶液およびブドウ糖水溶液およびグリセロール溶液もまた、液体担体として、特に注射溶液用のものとして、使用することができる。適当な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどがある。所望であれば、この組成物はまた、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有してもよい。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、除放性製剤などの形態を取ることができる。この組成物は、従来の結合剤および担体（例えば、トリグリセリド）を有する坐剤として製剤化することができる。経口製剤は、製薬等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的担体を含有することができる。適当な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ． Ｍａｒｔｉｎの「レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」に記載されている。このような組成物は、治療上有効量の治療薬を、好ましくは精製形態で、適当量の担体とともに含有し、患者に適切な投与のための剤形を提供するものである。製剤は、投与方法に適合するものでなければならない。
【００６３】
好適な実施形態において、本組成物は、ヒトへの静脈内投与用に適合させた医薬組成物として、ルーチン法に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与用の組成物は、無菌等張緩衝水溶液中の溶液である。必要な場合、本組成物はまた、可溶化剤と、注射部位の疼痛緩和のための局所麻酔剤（例えば、リグノカイン）を含んでよい。一般にその成分は、別々に供給されるか、または混合されて単位剤形として（例えば、活性物質の量を表示した密封容器（例えば、アンプルまたはサッシェ）中に入れた、乾燥した凍結乾燥粉末としてまたは水分を含まない濃縮物として）、供給される。本組成物が注入により投与される場合、これは、無菌の製薬等級の水または生理食塩水を含有する注入ビンで投薬することができる。本組成物が注射により投与される場合、成分が投与前に混合されるように、注射用の無菌水または生理食塩水のアンプルを提供してもよい。
【００６４】
本発明の治療薬は、中性形態または塩の形態で製剤化することができる。薬学的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから得られるような、遊離アミノ基と形成される塩、および水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから得られるような遊離カルボキシル基と形成される塩が挙げられる。
【００６５】
特定の障害または病的状態（すなわち、不安関連障害）の治療に有効な本発明の治療薬の量は、障害または病的状態の性質に依存し、標準的な臨床手法により決定することができる。さらに、最適な用量範囲を特定するのを助けるために、随時ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用してもよい。製剤中で使用される正確な用量はまた、投与経路、疾患または障害の重症度に依存し、医師の判断と各患者の状況に従って決定されるべきである。しかし、静脈内投与のための適当な用量範囲は一般に、体重１ｋｇ当たり活性化合物が約２０〜５００マイクログラムである。鼻内投与のための適当な用量は、一般に約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重〜約１ｍｇ／ｋｇ体重である。有効な用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から得られる用量応答曲線から外挿される。
【００６６】
坐剤は一般に、約０．５〜約１０重量％の範囲の活性成分を含有し、経口製剤は、好ましくは約１０〜約９５重量％の活性成分を含有する。
【００６７】
本発明はまた、本発明の医薬組成物の１つ以上の成分を充填した１つ以上の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。そのような容器には、場合により、医薬品もしくは生物製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関により規定された書式の注意書を付記することがある。この注意書は、当該機関による、ヒトへの投与のための製造、使用または販売の認可を踏まえたものである。
【００６８】
５．６ トランスジェニック動物
本発明はまた、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に不活化突然変異を有するか、またはα１−ＧＡＢＡＡ 受容体、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体またはα５−ＧＡＢＡＡ 受容体に不活化突然変異を有する、非ヒトトランスジェニック動物モデルおよび非トランスジェニック動物モデルを提供する。ある実施形態においては、ＧＡＢＡＡ 受容体のα２サブユニットが、アミノ酸１０１位で突然変異しており、ＨｉｓがＡｒｇで置換されている。別の実施形態においては、ＧＡＢＡＡ 受容体のα１サブユニットが、アミノ酸１０１位で突然変異しており、ＨｉｓがＡｒｇで置換されている。別の実施形態においては、ＧＡＢＡＡ 受容体のα３サブユニットが、アミノ酸１２６位で突然変異しており、ＨｉｓがＡｒｇで置換されている。別の実施形態においては、ＧＡＢＡＡ 受容体のα５サブユニットが、アミノ酸１０５位で突然変異しており、ＨｉｓがＡｒｇで置換されている。さらに別の実施形態においては、ＧＡＢＡＡ 受容体のα３サブユニットが、遺伝子ターゲティングにより不活化されている（「遺伝子ノックアウト」）。このような動物は、当該分野で一般的に公知の方法（後述のセクション６に記載の方法を含む）により作製することができる。他の方法は、米国特許第６，２７１，３６０号に記載の組換え作製オリゴヌクレオチドの使用を含む。
【００６９】
以下の一連の実施例は、説明のために示すものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００７０】
６． 実施例：不安の選択的緩和のための分子基質および神経基質の測定
過度のまたは不適切な不安は、臨床的に有効なベンゾジアゼピン薬剤を使用して、ＧＡＢＡ作動性の抑制性神経伝達を増強することにより制御することができる（ＳｈａｄｅｒおよびＧｒｅｅｎｂｌａｔｔ， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２８（１９）：１３９８−１４０５）。しかし、不安の緩和を仲介するＧＡＢＡＡ 受容体サブタイプを特定することは、今日まで実現していない。４つの型のジアゼパム感受性ＧＡＢＡＡ 受容体を、α１、α２、α３、またはα５サブユニットの存在に基づいて区別することができる。以下の実験は、α２サブユニットを有する受容体が、不安の緩和を仲介することを立証するものである。
【００７１】
６．１ 材料と方法
６．１．１ α ２（Ｈ１０１Ｒ） とα ３（Ｈ１２６Ｒ） マウスの作製
ラムダファージライブラリーからＧＡＢＡＡ 受容体α２サブユニット遺伝子（ＧＡＢＲＡ２）のエキソン４と５を含有するゲノムクローンを得て、６．０ ｋｂのゲノムＰｓｔＩ／Ｎｃｏｌ断片を選択し、これを置換ターゲティングベクター中に相同ＤＮＡとして組み込んだ。このベクターは、エキソン４に所望の点突然変異を含有し、イントロン３にｌｏｘＰ隣接ネオマイシン耐性カセット（ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル）を含有している。このカセットは、イントロン３中に遺伝子工学的に作製したＳａｌＩ部位中に挿入されたものである。アミノ酸ＦＨＮ（１００〜１０２位）をコードするエキソン４中の配列ＴＴＴＣＡＣＡＡＴは、アミノ酸ＦＲＮをコードするＴＴＣＣＧＧＡＡＴに変異していた。置換ベクターを胚幹細胞（Ｅ１４株）中にエレクトロポレーション導入し、正しくターゲティングされたクローンをＣ５７ＢＬ６／Ｊ胚盤胞中に注入した。突然変異対立遺伝子を有するマウスを、１２９／ＳｖＪバックグランドを有するＥｌｌａ−ｃｒｅマウスと交配して、ｃｒｅ／ｌｏｘＰ介在切断により生殖細胞系からネオマイシン耐性カセットを除去した。Ｌａｋｓｏら、１９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：５８６０。次に、交配によりｃｒｅ導入遺伝子を除去した。
【００７２】
キメラから出発して、マウスを１２９／ＳｖＪバックグランドで６世代交配した。ヘテロ接合性交配種を作製して、ホモ接合性突然変異体マウス、ヘテロ接合性マウスおよび野生型マウスを得た。典型的には、ホモ接合性変異体マウスと野生型マウスの両方について２０〜２５の繁殖ペアにより、実験動物を作製し、これらは約８〜１２週齢で使用した。各マウスに、１回のみジアゼパムを注入した。
【００７３】
ＧＡＢＡＡ 受容体α３サブユニット遺伝子（ＧＡＢＲＡ３）のエキソン３と４とを含む１６．８ ｋｂのインサートを含有するマウスゲノムクローンを、ラムダファージライブラリーから得た。エキソン４を含む４．３ ｋｂのＨｉｎｃＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片を、ターゲティングベクター用の相同ＤＮＡとして選択した。ｌｏｘＰ−隣接ネオマイシン耐性（ｎｅｏ）マーカー（ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル）を、エキソン４の下流のＮｃｏＩ部位に配置した。アミノ酸ＦＨＮ（１２５〜１２７位）をコードするエキソン４中の配列ＴＴＣＧＡＯＡＡＴを、アミノ酸ＦＲＮをコードするＴＴＣＣＧＧＭＴに変異させた。さらに、制限断片長多型分析で使用するためのサイレント変異を導入した：ＧＧＧ（１５０位のスレオニン）を、ＧＧＴで置換して、新規Ｋｐｎｌ部位（ＧＧＴＡＣＣ）を作製した。最終的なターゲティングベクターＲＫ−１は、突然変異の５’側の約１．３ ｋｂの相同性、突然変異とｎｅｏマーカーとの間の約０．２ ｌｓｔの相同性、ｎｅｏマーカーの３’側の約２．８ ｋｂの相同性を有した。相同な５’側に、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）カセットを、陰性選択のために含めた。フランキングプローブを用いるサザンブロッティングにより分析した数千のＥＳ細胞クローンのうち、胚幹細胞株ｍＥＭＳ３２から得られた１つのクローンのみが、正しいターゲティングを示した。Ｓｉｍｐｓｏｎら、１９９７， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． １６：１９。このクローンを、胚盤胞中に注入し、得られたマウスを、１２９／ＳｖＪバックグランドを有するＥｌｌａ−ｃｒｅマウスと交配して、ネオマイシン耐性カセットを排除した。Ｌａｋｓｏら、１９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：５８６０。次に、交配によりｃｒｅ導入遺伝子を除去した。キメラから出発して、このマウスを１２９／ＳｖＪバックグランドで５世代交配した。繁殖および実験計画は、α２（Ｈ１０１Ｒ）マウスについて記載したものと同様であり、但し、α３サブユニットの遺伝子がＸ染色体上に位置することを考慮した。
【００７４】
６．１．２ 明／暗選択試験
相互に連結した暗い箱と照明（５００ルクス）箱を有するチャンバー中で、暗いコンパートメントに最初に入れてから５分間の、野生型マウスと突然変異マウスの行動を試験した。試験の３０分前に、マウスをビヒクルまたはジアゼパム（０．５、１および２ｍｇ／ｋｇ経口）で処理した。照明箱で過ごした時間を記録した。
【００７５】
６．１．３． 高所＋迷路
薄暗い間接照明の下で、壁で囲った２つのアームと２つの開放アームを備えた高所にある横木の上に、マウスを置いた。野生型マウスと突然変異マウスを、試験の３０分前にビヒクルまたはジアゼパム（２ｍｇ／ｋｇ経口）で処理した。開放アームで過ごした時間と開放アームに入った回数を５分間記録した。
【００７６】
６．１．４． 行動試験
メスの野生型マウスと突然変異マウスを試験室で飼育し、１２時間の明／暗サイクルの暗い期間に行動を試験した。０．３％ Ｔｗｅｅｎ８０を含有する生理食塩水に懸濁したジアゼパムを経口投与し（４〜５ｍｇ／ｋｇ）、一方、ペンチレンテトラゾールを生理食塩水に溶解し、腹腔内投与した。
【００７７】
６．１．５ 統計
一元配置または二元配置ＡＮＯＶＡ後に、それぞれダネット試験または多重ｔ検定を用いる事後平均比較を使用して、データを解析した。分散の均一性についてのバートレット検定が有意であった場合には、各遺伝子型のデータを、クルスカル−ワリスとマンウィットニー検定を使用して、別々に解析した。二項変量を、カイ二乗検定とフィッシャーの正確確率検定により解析した。群内比較については、ウィルコクソンの符号付き順位検定を使用した。
【００７８】
６．１．６． 自発運動
一般的な自動化２チャンバー装置内で３０分間、ビヒクルまたはジアゼパム（３、１０および３０ｍｇ／ｋｇ経口）の投与の３０分後の自発運動を記録した。
【００７９】
６．ｌ．７． ペンチレンテトラゾール試験
ペンチレンテトラゾール処理（１２０ｍｇ／ｋｇ 腹腔内）後に、強直発作の発生および／または潜伏を、野生型マウスと突然変異マウスで最大１０分間記録した。ビヒクルまたはジアゼパム（３、１０および３０ｍｇ／ｋｇ 経口）による処理を、ペンチレンテトラゾールの３０分前に行った。この試験は、依存性障害を評価するのに使用される。
【００８０】
６．１．８ ロータロッド
運動障害を評価するために、マウスを、２ｒｐｍの固定速度で回転する回転棒の上に少なくとも１２０秒間とどまるように訓練した。Ｂｏｎｅｔｔｉら、１９８８， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｅｈａｖ． ３１：７３３。ビヒクルまたはジアゼパム（３、１０および３０ｍｇ／ｋｇ 経口）による処理の前の６０秒までと、該処理の３０分後に、棒から落ちるまでの持続時間を記録した。
【００８１】
６．２ 結果
α２とα３受容体サブタイプの薬理学を区別するために、α２サブユニット遺伝子［α２（Ｈ１０１Ｒ）］（図１）とα３サブユニット遺伝子［α３（Ｈ１２６Ｒ）］の相同位置に点突然変異を導入して、各受容体をジアゼパム非感受性とした、２つのマウス株を作製した。変異体は、明らかで顕著な表現型を示さず、正常に繁殖し、試験したすべてのサブユニット（α１、α２、α３、β２／３、γ２）を正常レベル（図２Ａ）で変化のない分布で発現した。ジアゼパム非感受性［３Ｈ］Ｒｏ１５−４５１３（ＮＥＮ、ボストン、マサチューセッツ州）結合部位の数は、野生型マウスの５％からα２（Ｈ１０１Ｒ）マウスの１７％まで上昇し、α３（Ｈ１２６Ｒ）マウスでは１１％まで上昇した［α２野生型対照：Ｂｍａｘ＝０．０８±０．０２ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質、ＫＤ＝４．３±０．８ｎＭ（ｎ＝３）；α２（Ｈ１０１Ｒ）マウス：Ｂｍａｘ＝０．２６±０．０１ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質、ＫＤ＝８．０±１．３ｎＭ（ｎ＝３）；α３野生型対照：Ｂｍａｘ＝０．０６±０．０１ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質、ＫＤ＝４．９±２．１ｎＭ（ｎ＝３）；α３（Ｈ１２６Ｒ）マウス：Ｂｍａｘ＝０．１１±０．０２ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質、ＫＤ＝６．５±１．６ｎＭ（ｎ＝３）］。α２サブユニットの既知の分布（ＦｒｉｔｓｃｈｙおよびＭｏｅｈｌｅｒ、１９９５， Ｊ． Ｃｏｍｐ． Ｎｅｕｒｏ． ３５９：１５４）に一致して、ジアゼパム非感受性部位α２（Ｈ１０１Ｒ）マウスは、１００μＭジアゼパムの存在下で１０ｎＭ［３Ｈ］Ｒｏ１５−４５１３を使用して、側矢状脳切片でオートラジオグラフィーにより証明されるように、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体を発現するすべての領域について視覚化された（図２Ｂ）。同様に、α３（Ｈ１２６Ｒ）マウスでは、新規なジアゼパム非感受性［３Ｈ］Ｒｏ１５−４５１３結合部位は、α３サブユニットの分布に対応する分布を示した（図２Ｂ）（ＦｒｉｔｓｃｈｙおよびＭｏｅｈｌｅｒ、１９９５， Ｊ． Ｃｏｍｐ． Ｎｅｕｒｏ． ３５９：１５４）。α２またはα３サブユニット特異的抗血清を用いる免疫沈降後に、［３Ｈ］Ｒｏ１５−４５１３結合により、各突然変異マウスからα２およびα３サブユニットへの、ジアゼパムに対する親和性の１，０００倍を超える低下が明らかになった。
【００８２】
ＧＡＢＡ（３μＭ）に対する電気生理学的応答は、野生型マウスとα２（Ｈ１０１Ｒ）マウスの培養海馬錐体細胞で区別できなかった（図２Ｃ）。しかし、ジアゼパム（１μＭ）による増強は、野生型マウスからの細胞と比較すると、α２（Ｈ１０１Ｒ）マウスからの細胞で低下し［１７．６±４．５％（ｎ＝２９）対 ４８．１±７．９％（ｎ＝１８）、Ｐ＝０．００１］（図２Ｃ）、残りの増強は、おそらくα２以外のＧＡＢＡＡ 受容体によるものと思われた。野生型細胞中のＲｏ１５−４５１３（１μＭ）の逆アゴニスト作用は、α２（Ｈ１０１Ｒ）マウスから得られた細胞中でアゴニスト応答に変換された［−３９±５．２％（ｎ＝１３）対 １１．７±７．５％（ｎ＝２３）、Ｐ＝０．００３］（図２Ｃ）。これは、逆アゴニスト作用から、ＨＥＫ−２９３細胞で発現される組換えα２（Ｈ１０１Ｒ）β３γ２受容体について証明されたアゴニスト作用への、Ｒｏ１５−４５１３の作用の切り換えと一致する（Ｂｅｎｓｏｎら、１９９８， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４３１：４００）。
【００８３】
α２（Ｈ１０１Ｒ）マウスとα３（Ｈ１２６Ｒ）マウスのジアゼパム誘導行動を野生型マウスのそれと比較することにより、突然変異α２およびα３ ＧＡＢＡＡ 受容体の薬理学的意義を評価した。用量依存的に試験すると、ジアゼパムの鎮静作用、運動障害および抗けいれん作用（Ｂｏｎｅｔｔｉら、１９８８， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｅｈａｖ． ３１：７３３）は、野生型マウスと比較してα２（Ｈ１０１Ｒ）マウスまたはα３（Ｈ１２６Ｒ）マウスで損なわれなかった（図３）。
【００８４】
α２（Ｈ１０１Ｒ）マウスとα３（Ｈ１２６Ｒ）マウスのジアゼパムの抗不安様作用を、明／暗選択試験（Ｍｉｓｓｌｉｎら、１９８９， Ｂｅｈａｖ． Ｐｒｏｃ． １８：１１９）と高所＋迷路試験（Ｌｉｓｔｅｒ， １９８７， Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ９２：１８０）で試験した。明／暗選択試験において、α２（Ｈ１０１Ｒ）マウスは、ジアゼパムによる行動脱抑制を示さなかったが、この行動脱抑制は野生型マウスでは明らかであった。２ｍｇ／ｋｇまでのジアゼパムは、照明領域で過ごした時間を、野生型マウスと比較してα２（Ｈ１０１Ｒ）マウスで増加させなかった（Ｐ＜０．０５ 対 ビヒクル）（図４Ａ）。ビヒクルまたはジアゼパム処理下で、野生型マウスとα２（Ｈ１０１Ｒ）マウスの間で、暗い場所で行動の差は観察されなかったため、この効果は、α２（Ｈ１０１Ｒ）マウスの運動欠陥が原因ではなかった。さらに、α２（Ｈ１０１Ｒ）マウスは、ベンゾジアゼピン部位ではなくＧＡＢＡＡ 受容体部位に作用するリガンドに対する抗不安様応答を示す能力を保持していた。フェノバルビタールナトリウム（１５ｍｇ／ｋｇ 皮下）は、野生型マウスで見られたものと同様に、α２（Ｈ１０１Ｒ）マウスで明／暗選択試験で行動脱抑制を誘導した［照明領域での時間、野生型（ｗｔ）ビヒクル：７０．５±１０．５秒；ｗｔフェノバルビタール；１１１．７５±１０．０秒；α２（Ｈ１０１Ｒ）ビヒクル：７５．３±１１．５秒、およびα２（Ｈ１０１Ｒ）フェノバルビタール：１１０．９±９．６秒；Ｆ（１，２４）＝１３．４４、Ｐ＜０．０２、ｎ＝６〜８］。α２（Ｈ１０１Ｒ）マウスでジアゼパムの抗不安様作用が存在しないことは、高所＋迷路試験で確認された。野生型マウスでは、ジアゼパムは、開放アームで過ごした時間の長さ［Ｐ＜０．０１ 対 ビヒクル］と開放アームに入った回数［Ｐ＜０．０５］の両方を増加させることにより、探索行動を促進した。これに対して、α２（Ｈ１０１Ｒ）マウスでは、ジアゼパムは探索行動の両方のパラメータを増加させなかった（図４Ｂ， Ｃ）。同様に、閉鎖アーム中での運動活性は、処理に無関係にα２（Ｈ１０１Ｒ）マウスと野生型マウスで同様であったため、この不成功の原因は、運動障害ではなかった。
【００８５】
ジアゼパムの抗不安様活性に対するα３ ＧＡＢＡＡ 受容体の寄与の可能性を、α３（Ｈ１２６Ｒ）マウスで調べた。α３（Ｈ１２６Ｒ）マウスと野生型マウスの両方とも、明／暗選択試験［Ｐ＜０．０１ 対 ビヒクル］（図４Ｄ）と高所＋迷路［Ｐ＜０．００１ 対 ビヒクル］（図４Ｅ、Ｆ）とで、ジアゼパムに対して、同様の用量依存的抗不安様応答を示した。これらの結果は、野生型マウスでのジアゼパムの抗不安作用には、α３ ＧＡＢＡＡ 受容体との相互作用が関与しないことを示す。
【００８６】
ジアゼパムの抗不安様作用は、α２ ＧＡＢＡＡ 受容体を発現するニューロン集団におけるＧＡＢＡ作動性伝達の増強により、選択的に仲介されるが、α２ ＧＡＢＡＡ 受容体はすべてのジアゼパム感受性ＧＡＢＡＡ 受容体のわずかに１５％である（Ｍａｒｋｓｉｔｚｅｒら、１９９３， Ｊ． Ｒｅｃｅｐｔ． Ｒｅｓ． １３：４６７）。脳皮質と海馬中のα２ ＧＡＢＡＡ 受容体発現細胞は、主要なニューロンの出力を制御すると考えられる軸索初期セグメント上の、α２ ＧＡＢＡＡ 受容体を非常に高い密度で示す錐体細胞を含む（Ｎｕｓｓｅｒら、１９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１１９３９；Ｆｒｉｔｓｃｈｙら、１９９８， Ｊ． Ｃａｍｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． ３９０：１９４）。
【００８７】
長期の治療で観察される副作用が低下することに関しては、ジアゼパムで長期処置した野生型マウスは、フルマゼニル（ベンゾジアゼピンアンタゴニスト）を投与すると禁断症状を示した。ベンゾジアゼピンに非感受性の変異α１−ＧＡＢＡＡ 受容体（Ｈ１０１Ｒ）を有するマウスを同じプロトコール（ジアゼパムによる長期処置とフルマゼニルの投与）に付すと、自発運動で測定される禁断症状は大幅に低下した。
【００８８】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態の範囲に限定されない。実際、前記説明と添付の図面から当業者には、本明細書に記載のもの以外に本発明の種々の改変が明らかであろう。そのような改変は、特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【００８９】
種々の刊行物および特許出願が本明細書で引用されているが、これらの開示内容は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａ〜Ｄ。α２サブユニットＧＡＢＡＡ 受容体遺伝子のターゲティング。図１Ａ：野生型と変異対立遺伝子の構造。変異対立遺伝子１は、マウスＥＳ細胞中で遺伝子ターゲティング後に得られ、マウス生殖細胞系に導入される；これらのマウスをＥｌｌａ−ｃｒｅマウスに交配させると、ネオマイシン耐性カセット（変異対立遺伝子２）が切断される。ターゲティングベクターの両側に位置する５’と３’プローブを、実線の棒で示す。ＨｉｓとＡｒｇは、それぞれエキソン４の１０１位のヒスチジンとアルギニンのコドンを示す。図１Ｂ：胚幹細胞中の野生型（ｗｔ）対立遺伝子と変異対立遺伝子１（Ｍｕｔ１）のサザンブロット解析。図１Ｃ：Ｅｌｌａ−ｃｒｅトランス遺伝子にヘミ接合性のキメラとマウスの交配から得られる子孫の遺伝子タイピング。上のパネル：ＰＣＲプライマーＰ１、Ｐ２、Ｐ３は、各対立遺伝子の特異的な増幅産物を与える。下のパネル：ＰＣＲプライマーＵＲ２６とＵＲ３６は、ｃｒｅトランス遺伝子を増幅する。図１Ｄ：自動ＤＮＡ配列決定によるα２（Ｈ１０１Ｒ）点突然変異の証明。
【図２】図２Ａ〜Ｃ。α２（Ｈ１０１Ｒ）とα３（Ｈ１２６Ｒ）マウスのＧＡＢＡＡ 受容体の分子特性。図２Ａ：α１、α２、α３、β２／３およびγ２サブユニットを認識する抗血清を使用する野生型マウスとα２（Ｈ１０１Ｒ）およびα３（Ｈ１２６Ｒ）マウスからの、脳膜全体のウェスタンブロット。図２Ｂ：野生型、α２（Ｈ１０１Ｒ）（上のパネル）およびα３（Ｈ１２６Ｒ）（下のパネル）脳中の、ジアゼパム非感受性部位の受容体オートラジオグラフィー。傍矢状切片を、１００μＭのジアゼパムの存在下で１０ｎＭの［３Ｈ］Ｒｏ１５−４５１３とインキュベートして、ジアゼパム非感受性［３Ｈ］Ｒｏ１５−４５１３結合部位を明らかにした。野生型マウスでは、ジアゼパム非感受性［３Ｈ］Ｒｏ１５−４５１３結合は、α４とα６ＧＡＢＡＡ 受容体による。図２Ｃ：α２（Ｈ１０１Ｒ）マウスからの培養海馬錐体細胞のＧＡＢＡ応答。パッチ−クランプ分析の保持電位は−６０ｍＶであり、塩素濃度は対称であった。ＧＡＢＡを５秒間適用した。Ｅ１６．５胚からの海馬ニューロンを、１０〜１４日間培養した。２重の星印は、Ｐ＜０．００１（スチューデントｔ検定）。
【図３】図３Ａ〜Ｆ。野生型マウスと比較したα２（Ｈ１０１Ｒ）マウス（図３Ａ〜Ｃ）とα３（Ｈ１２６Ｒ）マウス（図３Ｄ〜Ｆ）における、ジアゼパムの鎮静、運動障害、および抗けいれん性の行動評価。図３Ａ：野生型マウスとα２（Ｈ１０１Ｒ）マウスにおける自発運動の用量依存性阻害［Ｆ（３， ７１） １９．３１， Ｐ＜０．００１， ｎ＝９〜１０匹マウス／群］。図３Ｂ：野生型マウスとα２（Ｈ１０１Ｒ）マウスにおける回転棒（固定２ｒｐｍ）から落ちるまでの持続時間の用量依存性低下［Ｆ（３， １５３）＝７１．０１， Ｐ＜０．００１， ｎ＝２０〜２１匹マウス／群］。図３Ｃ：野生型マウス［χ２＝３２．２８， Ｐ＜０．００１， ｎ＝１０匹マウス／群］とα２（Ｈ１０１Ｒ）マウス［χ２＝２８．１３， Ｐ＜０．００１， ｎ＝１０匹マウス／群］の、強直性けいれんを示すマウスの割合の用量依存性低下。図３Ｄ：野生型マウスとα３（Ｈ１２６Ｒ）マウスにおける自発運動の用量依存性阻害［Ｆ（３， ６４）＝１４．７０， Ｐ＜０．００１， １７＝８〜１０匹マウス／群］。図３Ｅ：野生型マウスとα３（Ｈ１２６Ｒ）マウスにおける回転棒（固定２ｒｐｍ）から落ちるまでの持続時間の用量依存性低下［Ｆ（３， ６４）＝３６．７８， Ｆ＜０．００１， ｎ ８〜１０匹マウス／群］。図３Ｆ：野生型マウス［χ２＝３２．３８， Ｐ＜０．００１， ｎ＝１０匹マウス／群］とα３（Ｈ１２６Ｒ）マウス［χ２＝２８．６０， Ｐ＜０．００１， ｎ＝１０匹マウス／群］の、強直性けいれんを示すマウスの割合の用量依存性低下。結果は、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示す。＋ Ｐ＜０．０５、＋＋ Ｐ＜０．０１、＋＋＋ Ｐ＜０．００１（ダネットの事後比較またはフィッシャーの正確度検定）。Ｖ、ビヒクル。ロタロッド（ｒｏｔａｒｏｄ）とペンチレンテトラゾールケイレン試験を、Ｂｏｎｅｔｔｉら、１９８８， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｅｈａｖ． ３１：７３３に従って行った。自発運動を３０分間自動的に記録した。試験前に３０分間、マウスをビヒクルまたはジアゼパム（３、１０および３０ｍｇ／ｋｇ経口）で処理した。
【図４】図４Ａ〜Ｆ。野生型マウスと比較したα２（Ｈ１０１Ｒ）マウス（図４Ａ〜Ｃ）とα３（Ｈ１２６Ｒ）マウス（図４Ｄ〜Ｆ）における、ジアゼパムの抗不安様作用の行動評価。図４Ａ：明／暗選択試験。ジアゼパムは、野生型マウス［Ｆ（３， ３６）＝３．１４， Ｐ＜０．０５］が明るい場所で費やした時間を用量依存性に増加させたが、α２（Ｈ１０１Ｒ）マウス［Ｆ（３， ３６）＝０．３２， 有意差無し］では増加させなかった、ｎ＝１０匹マウス／群。図４Ｂ〜Ｃ：高所＋迷路（Ｅｌｅｖａｔｅｄ ｐｌｕｓ−ｍａｚｅ）。ジアゼパム（２ｍｇ／ｋｇ）は、野生型マウスで、開放アームで費やした時間の割合とエントリーを上昇させた［Ｐ＜０．０１とＰ＜０．０５対ビヒクル］が、α２（Ｈ１０１Ｒ）マウスでは上昇させなかった［それぞれ、Ｆ（１， ３２）＝４．３１とＦ（１， ３２）＝４．７６， Ｐ＜０．０５， ｎ＝８〜１０匹マウス／群］。図４Ｄ：明／暗選択試験。野生型マウスとα３（Ｈ１２６Ｒ）マウスにおける、明るい場所で費やした時間の用量依存性増加［それぞれ、Ｆ（１， ７０）＝１４．７４， Ｐ＜０．００１， ｎ ９−１０匹マウス／群］。図４Ｅ〜Ｆ：高所＋迷路（Ｅｌｅｖａｔｅｄ ｐｌｕｓ−ｍａｚｅ）。ジアゼパム（２ｍｇ／ｋｇ）は、開放アームで費やした時間の割合とエントリーを、野生型マウスとα３（Ｈ１２６Ｒ）マウスで同程度に上昇させた［それぞれ、Ｆ（１， ３６）＝２６．５２とＦ（１， ３６）＝３７．３１， Ｐ＜０．００１， ｎ＝１０匹マウス／群］。結果は、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示す。＋ Ｐ＜０．０５、＋＋ Ｐ＜０．０１、＋＋＋ Ｐ＜０．００１（ダネットまたはフィッシャーの対になった事後比較またはフィッシャーの正確度検定）。Ｖ、ビヒクル、Ｄｚ、ジアゼパム。明−暗選択試験は、後述のような、５００ ルクスの照射で行った。マウスに、ビヒクルまたは増加する用量のジアゼパム（０．５、１および２ｍｇ／ｋｇ経口）を投与した。高所＋迷路（ｅｌｅｖａｔｅｄ ｐｌｕｓ−ｍａｚｅ）を、後述のように暗い光の照射（＜１０ルクス）下で行った。試験の３０分前に、ビヒクルまたはジアゼパムを投与した。
１． 発明の分野
本発明は、あまり重症の副作用（例えば、鎮静作用と記憶消失作用、特に依存性傾向）の無い、不安関連障害の治療を可能にする選択的抗不安治療薬に関する。これらの選択的治療薬は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合する。あるいはこれらの選択的物質は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を選択的または優先的に活性化する。本発明はまた、かかる選択的抗不安治療薬の同定方法に関する。本発明はまた、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体へのベンゾジアゼピンの結合を低下させるが、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合を実質的に低下させない、分子の同定方法に関する。
【０００２】
２． 発明の背景
不安関連障害はよくある医学的症状であり、一般的不安障害、パニック不安症、心的外傷後ストレス障害、恐怖症、不安抑うつ、精神分裂病関連不安症、情動不安、および一般的興奮状態を含む。現在使用されている主要な抗不安薬は、ベンゾジアゼピンである。その精神安定作用以外に、ベンゾジアゼピンはまた種々の好ましくない副作用を示し、例えば鎮静作用、先行性健忘症、およびエタノール増強作用がある。しかしベンゾジアゼピンの治療的使用を制限する主要な要因は、その長期使用後の後遺症、特に依存性傾向である。ベンゾジアゼピンと不安関連障害の治療におけるその使用についての総説は、例えばＳｃｈａｄｅｒとＧｒｅｅｎｂｌａｔｔ， １９９３， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２８（１９）：１３９８−１４０５を参照されたい。
【０００３】
ベンゾジアゼピン薬の分子標的は、ベンゾジアゼピンに特異的な結合部位を含有する神経伝達物質ＧＡＢＡの受容体（ＧＡＢＡＡ 受容体）である。さらに、ＧＡＢＡＡ 受容体上には他の結合部位（バルビツレートおよび神経ステロイド結合部位を含む）がある。ＧＡＢＡＡ 受容体は種々のアイソフォームで存在し、主にα−サブユニットのタイプで区別され、α１、α２、α３、およびα５ ＧＡＢＡＡ 受容体サブタイプと呼ばれる。ジアゼパムのような古典的なベンゾジアゼピンは、すべてのベンゾジアゼピン感受性ＧＡＢＡＡ 受容体と、同等の親和性と効率で相互作用する。ベンゾジアゼピン以外に、化学的に無関係のリガンドが、この部位に同様に作用することができる。
【０００４】
すなわち、当該分野には、依存性傾向や鎮静作用のような副作用の無い、またはその重症度が低下した、不安関連障害を治療することができる物質に対するニーズがある。
【０００５】
第２節または本出願の他の節の文献の引用は、そのような文献が本発明の先行技術として入手できることを認めるものではない。
【０００６】
３． 発明の要約
本発明は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合する、不安関連障害の治療を可能にする一方でα１−ＧＡＢＡＡ 受容体を介するそのような治療の好ましくない副作用を最小にする、選択的抗不安治療薬の同定方法に関する。本方法は、候補分子（試験物質）にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体とα１−ＧＡＢＡＡ 受容体とを接触させ、候補分子が、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合するかどうかを測定することを含む。本発明はまた、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合する選択的抗不安治療薬に関する。本発明はまた、治療の必要な被験体に、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合する選択的抗不安治療薬の治療上有効量を投与することを含む、不安関連障害の治療法に関する。本発明の選択的物質はまた、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較して、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体またはα５−ＧＡＢＡＡ 受容体に対して、より小さいかまたはより大きい結合親和性を有する。
【０００７】
選択的物質は、受容体の神経ステロイド、バルビツレートまたはベンゾジアゼピン結合部位を含む、受容体上の任意の結合部位で、ＧＡＢＡＡ 受容体に結合することができる。選択的抗不安物質が、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体、α３−ＧＡＢＡＡ受容体、またはα５−ＧＡＢＡＡ受容体に比較して、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合するかまたはこれを活性化する限り、選択的物質が結合する受容体の結合部位は、本発明にとって重要ではないと考えられる。
【０００８】
本発明はまた一部は、ベンゾジアゼピンのような抗不安治療薬の抗不安作用は、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体により仲介され、そのような物質の副作用（例えば、鎮静作用および依存性傾向）は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体により仲介されるという事実に基づく。
【０００９】
本発明において、選択的抗不安治療薬は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に優先的または選択的に結合する物質である。例えば、ベンゾジアゼピンであるジアゼパムは、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体とα１−ＧＡＢＡＡ 受容体に等しく（非特異的に）結合し、従って選択的物質ではない。しかし選択的治療薬は、非選択的物質と比較して、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に対する結合親和性が小さいか、またはα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に対する結合親和性が大きい。本発明のある実施形態において、選択的または優先的結合とは、この物質が、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に対する親和性より少なくとも１０％大きいレベルで、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する（親和性を有する）ことを示す。別の実施形態においてこの物質は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも２倍強くα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する。別の実施態様においてこの物質は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも１０倍強くα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する。さらに別の実施態様においてこの物質は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも１００倍強くα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する。さらに別の実施態様においてこの物質は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも１０００倍強くα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する。本発明の選択的物質はまた、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体と比較して、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体またはα５−ＧＡＢＡＡ 受容体に対して、より小さいかまたはより大きい結合親和性を有する。
【００１０】
本発明の別の実施形態において、選択的抗不安治療薬は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体と比較して、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に非選択的に結合する物質であるが、受容体活性化の効率は異なる。例えばこの物質の結合親和性は、２つの受容体のサブタイプの間で異ならないが、この物質がα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化する能力は、この物質がα１−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化する能力より大きく、従ってこの物質は選択的物質として作用する。この実施形態の１つの態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも１０％強く活性化される。この実施態様の別の態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも２５％強く活性化される。この実施態様の好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも１０％強く活性化される。この実施態様のさらに好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも５０％強く活性化される。すなわち本発明はまた、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体またはα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に対する結合親和性とは無関係に、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を選択的または優先的に活性化する選択的抗不安治療薬の同定法に関し、この治療薬は、不安関連障害の治療を可能にする一方でα１−ＧＡＢＡＡ 受容体を介するそのような治療の好ましくない副作用を最小にする。本法は、候補分子（試験物質）にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体とα１−ＧＡＢＡＡ 受容体とを接触させ、候補分子が、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を選択的または優先的に活性化するかどうかを測定することを含む。本発明はまた、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を選択的または優先的に活性化する選択的抗不安治療薬に関する。本発明はまた、治療の必要な被験体に、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を選択的または優先的に活性化する選択的抗不安治療薬の治療上有効量を投与することを含む、不安関連障害の治療法に関する。本発明の選択的物質はまた、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較して、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体またはα５−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化するより小さいかまたはより大きい能力を有する。
【００１１】
本発明はまた、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する非選択的ベンゾジアゼピンの能力を低下させるが、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する非選択的ベンゾジアゼピンの能力を実質的に低下させない分子の同定法に関する。そのような分子は、ベンゾジアゼピンを用いて、しかし小さい副作用で不安関連障害の治療を可能にする。この方法は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体とα２−ＧＡＢＡＡ 受容体とに、ベンゾジアゼピンと候補分子（試験物質）とを接触させて、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合するベンゾジアゼピンの能力を低下させるが、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合するベンゾジアゼピンの能力を実質的に低下させない、候補分子の能力を検出することを含む。この実施形態のある態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は７５％以下低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は少なくとも２５％低下する。この実施形態の好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は５０％以下低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は少なくとも５０％低下する。この実施形態の別の好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は２５％以下低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は少なくとも７５％低下する。
【００１２】
本発明はまた、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体、またはα５−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化する非選択的ベンゾジアゼピンの能力を、低下させるが、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化する非選択的ベンゾジアゼピンの能力を実質的に低下させない、分子の同定法に関する。そのような分子は、ベンゾジアゼピンを用いて、小さい副作用で不安関連障害の治療を可能にする。この方法は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体とα２−ＧＡＢＡＡ 受容体とに、ベンゾジアゼピンと候補分子（試験物質）とを接触させて、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体、またはα５−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化するベンゾジアゼピンの能力を低下させるが、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化するベンゾジアゼピンの能力を実質的に低下させない、候補分子の能力を検出することを含む。この実施形態のある態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は７５％以下だけ低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体、またはα５−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は少なくとも２５％だけ低下する。この実施形態の好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は５０％以下低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体、またはα５−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は少なくとも５０％低下する。この実施形態の別の好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は、２５％以下低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体、またはα５−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は少なくとも７５％低下する。
【００１３】
本発明の選択的抗不安治療薬および／または分子は、ｉｎ ｖｉｖｏで代謝されて生物活性物質すなわち選択的抗不安物質または結合のモジュレーターになるプロドラッグを含む。
【００１４】
４． 図面の簡単な説明
図面の簡単な説明については下記参照。
【００１５】
５． 発明の詳細な説明
本発明は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体により介在されるかかる治療の好ましくない副作用を最小にする一方で不安関連障害の治療を可能にする、選択的抗不安治療薬の同定法に関する。本方法は、候補分子（試験物質）にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体とα１−ＧＡＢＡＡ 受容体とを接触させ、候補分子が、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合するかどうかを測定することを含む。本発明はまた、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合する選択的抗不安治療薬に関する。本発明はまた、治療の必要な被験者に、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合する選択的抗不安治療薬の治療上有効量を投与することを含む、不安関連障害の治療法に関する。本発明の選択的物質はまた、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較して、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体またはα５−ＧＡＢＡＡ 受容体に対して、より小さいかまたはより大きい結合親和性を有してもよい。
【００１６】
選択的物質は、受容体の神経ステロイド、バルビツレートまたはベンゾジアゼピン結合部位を含む、受容体上の任意の結合部位で、ＧＡＢＡＡ 受容体に結合することができる。選択的抗不安物質が、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体またはα５−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合するかまたはこれを活性化する限り、選択的物質が結合する受容体の結合部位は、本発明にとって重要ではない。
【００１７】
本発明は、一部には、ベンゾジアゼピンのような抗不安治療薬の抗不安作用は、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体により介在され、一方そのような物質の副作用（例えば、鎮静および依存性傾向）は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体により介在されるという事実に基づく。
【００１８】
本発明に従えば、選択的抗不安治療薬は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に優先的または選択的に結合する物質である。例えば、ベンゾジアゼピンであるジアゼパムは、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体とα１−ＧＡＢＡＡ 受容体に等しく（非特異的に）結合し、従って選択的物質ではない。しかし選択的治療薬は、非選択的物質と比較してα１−ＧＡＢＡＡ 受容体に対する結合親和性がより小さいか、またはα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に対してより大きな結合親和性を有する。本発明のある実施形態において、選択的または優先的結合とは、この物質が、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に対する親和性より少なくとも１０％大きいレベルで、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する（に対する親和性を有する）ことを示す。別の実施形態においてこの物質は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも２倍良好にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する。別の実施態様においてこの物質は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも１０倍良好にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する。さらに別の実施態様においてこの物質は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも１００倍良好にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する。さらに別の実施態様においてこの物質は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも１０００倍良好にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する。本発明の選択的物質はまた、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体と比較して、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体またはα５−ＧＡＢＡＡ 受容体に対して、より小さいかまたはより強力な結合親和性を有しうる。
【００１９】
本発明の別の実施形態において、選択的抗不安治療薬は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体と比較して、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に非選択的に結合するが、受容体活性化の効率が異なる物質である。例えばこの物質の結合親和性は、２つの受容体のサブタイプの間で異ならないが、この物質がα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化する能力は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化する能力より大きく、従ってこの物質は選択的物質として作用する。この実施形態の１つの態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも１０％大きく活性化される。この実施態様の別の態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも２５％大きく活性化される。この実施態様の好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも１０％大きく活性化される。この実施態様のさらに好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも５０％大きく活性化される。すなわち本発明はまた、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体またはα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に対する結合親和性とは無関係に、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を選択的または優先的に活性化し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体により介在されるかかる治療の好ましくない副作用を最小にする一方で不安関連障害の治療を可能にする、選択的抗不安治療薬の同定法に関する。本方法は、候補分子（試験物質）にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体とα１−ＧＡＢＡＡ 受容体とを接触させ、候補分子が、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を選択的または優先的に活性化するかどうかを測定することを含む。本発明はまた、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を選択的または優先的に活性化する選択的抗不安治療薬に関する。本発明はまた、治療の必要な被験者に、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を選択的または優先的に活性化する選択的抗不安治療薬の治療上有効量を投与することを含む、不安関連障害の治療法に関する。本発明の選択的物質はまた、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較して、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体またはα５−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化する能力が、より大きいかまたはより小さくありうる。
【００２０】
本発明はまた、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する非選択的ベンゾジアゼピンの能力を低下させるが、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する非選択的ベンゾジアゼピンの能力を実質的に低下させない分子の同定法に関する。そのような分子は、ベンゾジアゼピンを用いて、低下した副作用で不安関連障害の治療を可能にする。この方法は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体とα２−ＧＡＢＡＡ 受容体とに、ベンゾジアゼピンと候補分子（試験物質）とを接触させて、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合するベンゾジアゼピンの能力を低下させるがα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合するベンゾジアゼピンの能力を実質的に低下させない、候補分子の能力を検出することを含む。この実施形態の１つの態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は、７５％以下だけ低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は少なくとも２５％だけ低下する。この実施形態の好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は、５０％以下だけ低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は少なくとも５０％だけ低下する。この実施形態の別の好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は、２５％以下だけ低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は少なくとも７５％だけ低下する。
【００２１】
本発明はまた、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化する非選択的ベンゾジアゼピンの能力を低下させるが、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化する非選択的ベンゾジアゼピンの能力を実質的に低下させない分子の同定法に関する。そのような分子は、ベンゾジアゼピンを用いて、低下した副作用で不安関連障害の治療を可能にする。この方法は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体とα２−ＧＡＢＡＡ 受容体とに、ベンゾジアゼピンと候補分子（試験物質）とを接触させて、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化するベンゾジアゼピンの能力を低下させるが、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化するベンゾジアゼピンの能力を実質的に低下させない、候補分子の能力を検出することを含む。この実施形態の１つの態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は、７５％以下だけ低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は少なくとも２５％だけ低下する。この実施形態の好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は、５０％以下だけ低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は少なくとも５０％だけ低下する。この実施形態の別の好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は、２５％以下だけ低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は少なくとも７５％だけ低下する。
【００２２】
５．１ 優先的結合物質のスクリーニング
本発明は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体により介在されるかかる治療の副作用を最小にする一方で不安関連障害の治療を可能にする選択的抗不安治療薬の同定法に関する。本方法は、候補分子にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体とα１−ＧＡＢＡＡ 受容体とを接触させ、候補分子が、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合するかどうかを測定することを含む。本発明の１つの実施形態において、この物質は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に対する親和性より少なくとも１０％大きいレベルで、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する（に対して親和性を有する）。別の実施形態においてこの物質は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも２倍良好にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する。別の実施態様においてこの物質は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも１０倍良好にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する。さらに別の実施態様においてこの物質は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも１００倍良好にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する。さらに別の実施態様においてこの物質は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも１０００倍良好にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する。
【００２３】
前記を実施するのに使用することができるスクリーニング法は、当技術分野で一般的に知られている。例えば、ペプチドライブラリーのスクリーニングを開示する以下の参考文献を参照されたい：ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ， １９８９， Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ２５１：２１５−２１８；ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｆｏｗｌｋｅｓら， １９９２， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４２２−４２７；Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：５３９３−５３９７；Ｙｕら， １９９４， Ｃｅｌｌ ７６：９３３−９４５；Ｓｔａｕｄｔら， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５７７−５８０；Ｂｏｃｋら， １９９２， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：５６４−５６６；Ｔｕｅｒｋら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：６９８８−６９９２；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎら， １９９２， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：８５０−８５２；米国特許第５，０９６，８１５号；米国特許第５，２２３，４０９号；米国特許第５，１９８，３４６号；ＲｅｂａｒおよびＰａｂｏ， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：６７１−６７３；および国際特許公報第ＷＯ９４／１８３１８号。
【００２４】
特定の実施形態において、スクリーニングは、ライブラリーのメンバーに、固相に固定化したα１−ＧＡＢＡＡ 受容体および／またはα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を接触させ、受容体に結合するライブラリーメンバーを採取することにより行われうる。そのようなスクリーニング法の例（「パニング（ｐａｎｎｉｎｇ）」技法と呼ぶ）は、例えばＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ， １９８８， Ｇｅｎｅ ７３：３０５−３１８；Ｆｏｗｌｋｅｓら， １９９２， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４２２−４２７；国際特許公報第ＷＯ９４／１８３１８号；および上記で引用した参考文献に記載されている。
【００２５】
好適な実施形態において、両方のタイプの受容体が細胞表面に発現され、細胞は、スクリーニングアッセイで使用される。
【００２６】
別の特定の実施形態において、候補分子は、競合的または非競合的受容体リガンドとしてスクリーニングされる。さらに別の特定の実施形態において、使用される結合アッセイは、後述の第６節に記載の結合アッセイである。
【００２７】
スクリーニング法は、放射性リガンド（例えば、１２５Ｉまたは３Ｈ）、磁性リガンド（例えば、フォトビオチンアセテートに共有結合した常磁性ビーズ）、蛍光性リガンド（例えば、フルオレセインまたはローダミン）、または酵素リガンド（例えば、ルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼ）を用いて受容体を標識することを含み得る。次に、溶液中で結合する反応物を、当技術分野で公知の多くの技法（限定されないが、非標識リガンド（または、標識部分で使用されるものから区別可能なマーカーで標識したリガンド）に対する抗血清を使用する標識部分の共免疫沈降、免疫親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および濃度勾配遠心分離法を含む）の１つを使用して単離することができる。
【００２８】
受容体または候補分子を標識するのに、当技術分野で一般的に知られている方法が使用される。好適な標識には、限定されないが、放射能標識アミノ酸（例えば、３Ｈ−ロイシンまたは３５Ｓ−メチオニン）の取り込みによる放射能標識、クロラミンＴ法、Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬などを使用する１２５Ｉまたは１３１Ｉによる翻訳後ヨウ素化による放射能標識、キナーゼおよび無機放射能標識リンを使用する３２Ｐによる標識、フォトビオチン−アセテートと太陽灯露光を用いるビオチン標識などが含まれる。受容体の１つが固定化されている場合、リガンドが標識される。受容体も候補分子も固定化されていない場合、それぞれを区別可能なマーカーで標識し、両方の部分を単離して、続いてより正確に定量し、結合複合体の形成を区別するようにすることができる。
【００２９】
典型的な結合条件は、例えば、限定されるものではないが、１０〜２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５〜５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ５〜８）、および０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、または相互作用の特異性を改良する他の界面活性剤の塩水溶液である。金属キレート剤および／または２価陽イオンを加えて、結合を改良するかおよび／またはタンパク質分解を低下させてもよい。反応温度としては、４、１０、１５、２２、２５、３５、または４２℃を挙げることができ、インキュベーション時間は、典型的には少なくとも１５秒であるが、結合平衡を起こすには、より長時間が好ましい。
【００３０】
複合体形成の物理的パラメーターは、使用される標識に特異的なアッセイ方法（例えば放射活性検出には液体シンチレーション分光法、酵素標識には酵素活性測定など）を用いて複合体形成を定量することにより分析されうる。次に反応結果は、スキャッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）分析、Ｈｉｌｌ分析、および当技術分野で一般的に知られる他の方法を使用して分析される（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ， ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、第２版（１９９３）、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、を参照）。
【００３１】
結合アッセイへの第２の一般的なアプローチにおいて、結合分子種（ｓｐｅｃｉｅｓ）の１つ（すなわち、受容体またはリガンド）は、フィルター上、マイクロタイタープレートウェル、試験管、クロマトグラフィーマトリックスなどに、共有結合または非共有結合で固定化される。当技術分野で周知の方法を使用して、タンパク質を共有結合的に固定化することができ、例えば限定されないが、ＫａｄｏｎａｇａとＴｊｉａｎの方法（１９８６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：５８８９−５８９３， １９８６）、すなわちＣＮＢｒ−セファロース４Ｂのような臭化シアン誘導体化基質への結合がある。必要であれば、スペーサーを使用して、基質による立体障害を低下させることができる。基質へのタンパク質の非共有結合には、限定されないが、荷電表面へのタンパク質の結合、特異的抗体を用いる結合、第３の無関係の相互作用タンパク質への結合が含まれる。
【００３２】
特定の実施形態において、他のタンパク質成分への試薬の非特異的結合、プラスチック、固定化マトリックスなどへの試薬の吸収性喪失を阻害するブロッキング剤が、アッセイ混合物中に含まれる。ブロッキング剤としては、限定されないが、ウシ血清アルブミン、β−カゼイン、脱脂乾燥ミルク、Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ試薬、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、ポリビニルピロリジン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｏｌｉｄｉｎｅ）、非イオン性界面活性剤（ＮＰ４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０など）、イオン性界面活性剤（例えば、ＳＤＳ、ＬＤＳなど）、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。
【００３３】
結合が行われた後、未結合の標識受容体は上清とともに除去され、結合した標識リガンドを有する固定化受容体は、充分に洗浄される。次に、結合した標識の量は、標識を検出するための当技術分野で公知の標準的方法を使用して定量される。
【００３４】
５．２ 優先的アクチベーターのスクリーニング
本発明はまた、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体またはα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に対する結合親和性とは無関係に、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を選択的または優先的に活性化し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体により介在される、かかる治療の好ましくない副作用を最小にする一方で、不安関連障害の治療を可能にする、選択的抗不安治療薬の同定法に関する。本方法は、候補分子（試験物質）にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体とα１−ＧＡＢＡＡ 受容体とを接触させ、候補分子が、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を選択的または優先的に活性化するかどうかを測定することを含む。１つの実施形態において、この物質は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも１０％大きくα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化する。別の実施態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも２５％大きく活性化される。好適な実施態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも１０％大きく活性化される。より好適な実施形態において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体より少なくとも５０％大きく活性化される。
【００３５】
前記を実施することができるスクリーニング法は、当技術分野で一般的に知られている。例えば、限定されるものではないが、特定の受容体を活性化する物質の能力は、受容体が発現される細胞を使用して試験することができる。例示すると、ＧＡＢＡによる活性化後にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体活性化が測定され、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体を発現する細胞をＧＡＢＡと候補分子またはＧＡＢＡ単独と接触させ、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体活性化の量が、種々の方法により測定される。そのような方法には、限定されないが、膜電位または電流の電気生理学的変化の測定；放射活性塩化物イオンを使用するフロー塩化物イオンの生化学的変化の測定（塩化物フラックスアッセイ）；細胞膜を使用する放射性リガンド結合による、ＧＡＢＡと受容体および／または候補分子との間のアロステリック相互作用の変化の測定（ＧＡＢＡシフトアッセイ）が含まれる。
【００３６】
５．３ 結合モジュレーターのスクリーニング
本発明はまた、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する非選択的ベンゾジアゼピンの能力を低下させるが、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する非選択的ベンゾジアゼピンの能力は実質的に低下させない分子の同定法に関する。そのような分子は、ベンゾジアゼピンを用いて、低下した副作用で不安関連障害の治療を可能にする。この方法は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体とα２−ＧＡＢＡＡ 受容体とに、ベンゾジアゼピンと候補分子（試験物質）とを接触させて、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合するベンゾジアゼピンの能力を低下させるが、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合するベンゾジアゼピンの能力を実質的に低下させない、候補分子の能力を検出することを含む。この実施形態の１つの態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は、７５％以下だけ低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は少なくとも２５％だけ低下する。この実施形態の好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は、５０％以下だけ低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は少なくとも５０％だけ低下する。この実施形態の別の好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は、２５％以下だけ低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体への結合は少なくとも７５％だけ低下する。
【００３７】
本発明はまた、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化する非選択的ベンゾジアゼピンの能力を低下させるが、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化する非選択的ベンゾジアゼピンの能力を実質的に低下させない、分子の同定法に関する。そのような分子は、ベンゾジアゼピンを用いて、低下した副作用で不安関連障害の治療を可能にする。この方法は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体とα２−ＧＡＢＡＡ 受容体とに、ベンゾジアゼピンと候補分子（試験物質）とを接触させて、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化するベンゾジアゼピンの能力を低下させるが、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化するベンゾジアゼピンの能力を実質的に低下させない、候補分子の能力を検出することを含む。この実施形態の１つの態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は、７５％以下だけ低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は少なくとも２５％だけ低下する。この実施形態の好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は、５０％以下だけ低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は少なくとも５０％だけ低下する。この実施形態の別の好適な態様において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は、２５％以下だけ低下し、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性化は少なくとも７５％だけ低下する。
【００３８】
そのような候補分子のスクリーニングを実施するのに使用することができる方法は、当技術分野で一般的に知られているか、および／または前記第５．１節と第５．２節および後述の第６節において使用する方法である。
【００３９】
５．４ 候補分子
当技術分野で公知の分子は、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に優先的もしくは選択的に結合するかまたはこれを活性化する能力、あるいはα１−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合するベンゾジアゼピンまたはその化学的誘導体の能力をモジュレートする能力について、試験することができる。例えば、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体とα１−ＧＡＢＡＡ 受容体への候補分子の結合を測定し、分子がα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に優先的または選択的に結合するかどうかを測定することにより、結合を検出することができる。さらに別の例において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体とα１−ＧＡＢＡＡ 受容体を活性化する候補分子の能力を測定し、分子がα２−ＧＡＢＡＡ 受容体を優先的または選択的に活性化するかどうかを測定することにより、受容体活性化を検出することができる。ある特定の実施形態において候補分子は、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体およびα１−ＧＡＢＡＡ 受容体を発現する細胞に直接提供することができるか、または核酸が組換え的に発現され、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体およびα１−ＧＡＢＡＡ 受容体を発現する細胞内に候補タンパク質を産生する条件下で、そのコードする核酸を提供することにより、提供することができる。
【００４０】
本発明のこの実施形態は、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に優先的または選択的に結合する分子の化学ライブラリーをスクリーニングするのに、よく適している。化学ライブラリーは、ペプチドライブラリー、ペプチドミメティック（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）ライブラリー、化学合成ライブラリー、組換え（例えば、ファージディスプレイライブラリー、およびｉｎ ｖｉｔｒｏの翻訳に基づくライブラリー、他の非ペプチド合成有機ライブラリーなどでもよい。
【００４１】
典型的なライブラリーは、いくつかの製造業者（ＡｒＱｕｌｅ， Ｔｒｉｐｏｓ／ＰａｎＬａｂｓ， ＣｈｅｍＤｅｓｉｇｎ， Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）から市販されている。いくつかの場合には、これらの化学ライブラリーは、メンバー化合物が結合している基質上のライブラリーの各メンバーの本体をコードするコンビナトリアルストラテジーを使用して作製され、こうして有効なモジュレーターである分子の、直接的かつ即時同定を可能にする。すなわち、多くのコンビナトリアルアプローチにおいて、化合物のプレート上の位置が、その化合物の組成を特定する。また、１つの例において単一のプレート位置は、１〜２０の化学物質を有し、これは、目的の相互作用を含有するウェルへの投与によりスクリーニングすることができる。すなわち、モジュレーションを検出する場合、相互作用対のより小さいプールを、モジュレーション活性についてアッセイすることができる。そのような方法により、多くの候補分子をスクリーニングすることができる。
【００４２】
使用に好適な多くの多様性ライブラリーが当技術分野で公知であり、本発明に従って試験すべき化合物を提供するために使用できる。あるいは、標準的方法を使用してライブラリーを構築することができる。化学（合成）ライブラリー、組換え発現ライブラリー、またはポリソームに基づくライブラリーは、使用可能なライブラリーの典型的なタイプである。
【００４３】
ライブラリーは、拘束されても、もしくは半剛性（ある程度の構造的剛性を有する）でも、または線状化でももしくは拘束されていなくてもよい。ライブラリーは、ｃＤＮＡもしくはゲノム発現ライブラリー、ランダムペプチド発現ライブラリー、または化学合成ランダムペプチドライブラリー、または非ペプチドライブラリーでもよい。発現ライブラリーは細胞に導入され、ここで、アッセイが行われ、ライブラリーの核酸が発現されて、それらのコードタンパク質が産生される。
【００４４】
１つの実施形態において、本発明で使用可能なペプチドライブラリーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで化学合成されるライブラリーでもよい。そのようなライブラリーの例は、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８６（これは、各ペプチド中の第１のまたは第２の残基が個々にかつ特異的に規定される、遊離のヘキサペプチドの混合物を記載する）；Ｌａｍら， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４（これは、「１ビーズ、１ペプチド」アプローチを記載し、ここでは、固相スプリット合成スキームがペプチドのライブラリーを生産し、このコレクション中の各ビーズは、その上にアミノ酸残基の単一のランダム配列を固定化している）；Ｍｅｄｙｎｓｋｉ， １９９４， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：７０９−７１０（これは、スプリット合成とＴバッグ（Ｔ−ｂａｇ）合成法を記載する）；およびＧａｌｌｏｐら， １９９４， Ｊ． Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７（９）：１２３３−１２５１に記載されている。ただ他の例示のために述べると、コンビナトリアルライブラリーは、Ｏｈｌｍｅｙｅｒら， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１０９２２−１０９２６；Ｅｒｂら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１１４２２−１１４２６；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら， １９９２， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２；Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１６１４−１６１８；またはＳａｌｍｏｎら， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１１７０８−１１７１２の方法に従って、使用のために調製することができる。ＰＣＴ公報第ＷＯ９３／２０２４２号ならびにＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：５３８１−５３８３は、「コードされたコンビナトリアル化学ライブラリー（ｅｎｃｏｄｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）」を記載し、これは、各化学ポリマーライブラリーのメンバーのためのオリゴヌクレオチド識別子を含有する。
【００４５】
好適な実施形態において、スクリーニングされるライブラリーは、ランダムペプチドファージディスプレイライブラリーである生物学的発現ライブラリーであり、ここで、ランダムペプチドは拘束されている（例えば、ジスルフィド結合を有するため）。
【００４６】
さらに、より一般的な、構造的に拘束された有機多様性（例えば、非ペプチド）ライブラリーも使用可能である。例えば、ベンゾジアゼピンライブラリー（例えば、Ｂｕｎｉｎら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：４７０８−４７１２を参照）を使用できる。
【００４７】
使用可能なコンフォメーション的に拘束されたライブラリーには、限定されないが、酸化環境で、ジスルフィド結合により架橋して、シスチン、修飾ペプチド（例えば、フッ素、金属、アイソトープ標識物を取り込んでいる、リン酸化されているなど）、１つ以上の天然に存在しないアミノ酸を含有するペプチド、非ペプチド構造、およびかなりの割合のγ−カルボキシグルタミン酸を含有するペプチドを形成する、不変のシステイン残基を含有するものが含まれる。
【００４８】
非ペプチド、例えばペプチド誘導体（例えば、１つ以上の天然に存在しないアミノ酸を含有するもの）のライブラリーを使用することもできる。これらの１つの例は、ペプトイドライブラリーである（Ｓｉｍｏｎら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：９３６７−９３７１）。ペプトイドは、天然に存在する側鎖がα炭素ではなく、骨格アミノ窒素に結合した非天然のアミノ酸のポリマーである。ペプトイドは、ヒトの消化酵素により容易に分解されないため、薬剤としての使用により容易に適応でき有利である。使用可能なライブラリーの他の例（ペプチド中のアミド官能基性が過メチル化されていて、化学的に変換されたコンビナトリアルライブラリーが作製される）が、Ｏｓｔｒｅｓｈら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１１１３８−１１１４２により記載されている。非ペプチドライブラリーの別の実例は、ベンゾジアゼピンライブラリーである。例えば、Ｂｕｎｉｎら， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：４７０８−４７１２を参照されたい。
【００４９】
本発明によりスクリーニングできるペプチドライブラリーのメンバーは、２０個の天然に存在するアミノ酸を含有することに限定されない。特に、化学合成したライブラリーとポリソームに基づくライブラリーは、２０個の天然に存在するアミノ酸以外のアミノ酸の使用を可能にする（ライブラリー生産で使用されるアミノ酸の前駆体プール中に含めることにより）。特定の実施形態ではライブラリーメンバーは、１つ以上の非天然のもしくは非古典的アミノ酸または環状ペプチドを含有する。非古典的アミノ酸には、限定されないが、通常のアミノ酸のＤ−異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸；γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸；Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸；３−アミノプロピオン酸；オルニチン；ノルロイシン；ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、デザイナー（ｄｅｓｉｇｎｅｒ）アミノ酸（例えば、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸、フルオロアミノ酸）、および一般的なアミノ酸類似体が含まれる。さらにアミノ酸は、Ｄ（右旋性）またはＬ（左旋性）でもよい。
【００５０】
特定の実施形態において、ベンゾジアゼピンの誘導体、断片および／または類似体、特にペプチドミメティックは、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体の活性優先的または選択的結合体（ｂｉｎｄｅｒ）についてスクリーニングされる。
【００５１】
本発明の別の実施形態において、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に優先的または選択的に結合する物質を同定するために、コンビナトリアル化学を使用することができる。コンビナトリアル化学は、数十万の化合物（その多くは構造的に類似しうる）を含有するライブラリーを作製することが可能である。ハイスループットスクリーニングプログラムは、既知の標的に対する親和性について、これらの大きなライブラリーをスクリーニングすることができるが、大きさはより小さいが最大の化学的多様性を提供するライブラリーを達成する新しいアプローチが開発されている（例えば、Ｍａｔｔｅｒ， １９９７， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０：１２１９−１２２９を参照）。
【００５２】
コンビナトリアル化学の１つの方法である親和性フィンガープリンティングは、規定のタンパク質パネルに対する結合親和性について、小分子の別個のライブラリーを試験するのにすでに使用されている。スクリーンにより得られるフィンガープリントは、他のタンパク質または目的の受容体（本発明においては、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体またはα２−ＧＡＢＡＡ 受容体）について個々のライブラリーメンバーの親和性を予測するのに使用される。このフィンガープリントは、ライブラリー化合物が同様に反応するかどうかを予測するために、目的のタンパク質と反応することが知られている他の化合物から得られるフィンガープリントと比較される。例えば、大きなライブラリー中のすべてのリガンドを、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体との相互作用について試験するより、その活性を有することが知られている他の化合物と類似のフィンガープリントを有するリガンドのみを試験することができる（例えば、Ｋａｕｖａｒら， １９９５， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：１０７−１１８；Ｋａｕｖａｒ， １９９５， Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ． ８：２５−２８；およびＫａｕｖａｒ， Ｔｏｘｉｃ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｗ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， Ｄ． Ｋｕｒｔｚ． Ｌ． ＳｔａｎｋｅｒおよびＪ．Ｈ． Ｓｋｅｒｒｉｔｔ．編集者， １９９５， ＡＯＡＣ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．， ３０５−３１２を参照）。
【００５３】
Ｋａｙら， １９９３， Ｇｅｎｅ １２８：５９−６５ （Ｋａｙ） は、先行の従来のライブラリーの配列より長い完全にランダムな配列のペプチドをコードするペプチドライブラリーを構築する方法を開示する。Ｋａｙに開示されるライブラリーは、長さ約２０アミノ酸より大きい完全に合成のランダムペプチドをコードする。そのようなライブラリーは、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体モジュレーターを同定するために有利にスクリーニングすることができる（また、１９９６年３月１２日付けの米国特許第５，４９８，５３８号；および１９９４年８月１８日付けのＰＣＴ公報第ＷＯ９４／１８３１８号を参照）。
【００５４】
ペプチドライブラリーの種々のタイプの包括的総説は、Ｇａｌｌｏｐら， １９９４， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：１２３３−１２５１に見出すことができる。
【００５５】
５．５ 治療薬
本発明は、選択的抗不安物質またはα１−ＧＡＢＡＡ 受容体結合のモジュレーターを含み、依存性障害のような好ましくない副作用が最小化されている本発明の治療薬を、有効量にて被験体に投与することによる、抗不安性障害の治療法を提供する。好適な態様において、治療薬は実質的に精製されたものである。被験体は、好ましくは動物であり、特に限定されないが、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物を含み、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。特定の実施形態においては、非ヒト哺乳動物が被験体である。別の実施形態においては、本発明の治療薬は、プロドラッグであり、これはｉｎ ｖｉｖｏで代謝されて、選択的抗不安物質または結合のモジュレーターとなる。さらに治療薬は、プロドラッグの活性代謝物であるかまたはその機能性誘導体もしくは類似体である。
【００５６】
治療用選択的薬剤は、ＧＡＢＡＡ 受容体上の任意の結合部位（該受容体の神経ステロイド結合部位、バルビツレート結合部位、またはベンゾジアゼピン結合部位を含む）で、ＧＡＢＡＡ 受容体に結合することができる。選択的抗不安物質が、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体、またはα５−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較して、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合するかまたはこれを活性化する限り、選択的薬剤が結合する受容体の結合部位は、本発明にとって重要ではない。
【００５７】
種々の送達システムが公知であり、本発明の治療薬を投与するのに使用することができ、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルへの封入、治療薬を発現することができる組換え細胞、受容体介在エンドサイトーシス（例えば、ＷｕおよびＷｕ， １９８７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：４４２９−４４３２）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての治療用核酸の構築などがある。導入法には、特に限定されないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、および経口経路がある。化合物は、任意の好都合な経路により、例えば注入またはボーラス注射により、上皮または皮膚粘膜内層（例えば、経口粘膜、直腸および小腸粘膜など）からの吸収により、投与すればよく、また他の生物活性物質とともに投与してもよい。投与は、全身性または局所的でもよい。さらに、本発明の医薬組成物を、任意の適当な経路（脳室内およびくも膜下注入；脳室内注入は、例えばＯｍｍａｙａリザーバーなどのリザーバーに接続した、脳室内カテーテルにより促進される）により、中枢神経系に導入することが好ましい場合がある。肺投与もまた用いることができ、吸入器またはネブライザーの使用により、およびエアロゾル化剤とともに製剤化することにより、実施される。
【００５８】
特定の実施形態においては、治療の必要な部位に本発明の医薬組成物を局所的に投与することが好ましい場合がある。これは例えば、特に限定されないが、手術の際の局所的注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯と一緒に）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラント（このインプラントは、多孔性、無孔性、またはゼラチン質材料であり、シラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜等の膜、または繊維である）により、実施することができる。ある実施形態において、投与は、悪性腫瘍または新生物もしくは前新生物組織の部位（またはかつての対応部位）への直接注射によるものでもよい。
【００５９】
別の実施形態において治療薬は、小胞中、特にリポソーム中に入れて送達される（Ｌａｎｇｅｒ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３、Ｔｒｅａｔら， １９８９， 「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ」、Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編）， Ｌｉｓｓ， ニューヨーク， ３５３−３６５頁、Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ， 前掲書， ３１７−３２７頁、全体として前掲書を参照）。
【００６０】
さらに別の実施形態において、治療薬は、制御放出系に入れて送達される。ある実施形態において、ポンプが使用され得る（Ｌａｎｇｅｒ， 前述、Ｓｅｆｔｏｎ， １９８７， ＣＲＣ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｆ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｅｎｇ． １４：２０１、Ｂｕｃｈｗａｌｄら， １９８０， Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７、Ｓａｕｄｅｋら， １９８９， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２１：５７４を参照）。別の実施形態において、ポリマー材料を使用することができる（ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編）， １９７９， Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， フロリダ州、「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｔｙ， Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ」， ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編）， １９８４， Ｗｉｌｅｙ， ニューヨーク、ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ， １９８３， Ｊ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｓｃｉ． Ｒｅｖ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２３：６１を参照、またＬｅｖｙら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０、Ｄｕｒｉｎｇら， １９８９， Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． ２５：３５１、Ｈｏｗａｒｄら， １９８９， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． ７１：１０５を参照）。さらに別の実施形態において、治療標的の近傍（すなわち、脳）に制御放出系を配置することができ、従って全身性用量のほんの一部しか必要ではない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ， １９８４， 「Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ」、前述、第２巻、１１５−１３８頁を参照）。他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３の総説で説明されている。
【００６１】
治療薬が、タンパク質治療薬をコードする核酸である、特定の実施形態においては、その核酸をｉｎ ｖｉｖｏで投与してそれにコードされるタンパク質の発現を促進することができるが、これは、その核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構築しそれを投与して細胞内に導入することによって、例えば、レトロウイルスベクター（米国特許第４，９８０，２８６号）の使用により、または直接注入により、微粒子銃（例えば、遺伝子銃、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質または細胞表面受容体またはトランスフェクション剤で被覆することにより、あるいは、それを核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチド（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら、１９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：１８６４−１８６８）に連結して投与することなどにより、実施することができる。あるいは、核酸治療薬を細胞内に導入し、相同的組換えにより発現用に宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。
【００６２】
本発明はまた、医薬組成物を提供する。そのような組成物は、治療上有効量の治療薬と薬剤学的に許容される担体とを含む。特定の実施形態において用語「薬剤学的に許容される」とは、米連邦政府または州政府の規制当局により認可されているか、または米国薬局方、または動物および特にはヒトでの使用に対する他の一般的に認識されている薬局方に、収載されていることを意味する。用語「担体」は、治療薬が一緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを意味する。このような医薬担体は、水や油（ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などの、石油、動物、植物または合成起源の油を含む）等の、無菌液体でもよい。医薬組成物が静脈内投与される場合は、水が好適な担体である。生理食塩水溶液およびブドウ糖水溶液およびグリセロール溶液もまた、液体担体として、特に注射溶液用のものとして、使用することができる。適当な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどがある。所望であれば、この組成物はまた、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有してもよい。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、除放性製剤などの形態を取ることができる。この組成物は、従来の結合剤および担体（例えば、トリグリセリド）を有する坐剤として製剤化することができる。経口製剤は、製薬等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的担体を含有することができる。適当な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ． Ｍａｒｔｉｎの「レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」に記載されている。このような組成物は、治療上有効量の治療薬を、好ましくは精製形態で、適当量の担体とともに含有し、患者に適切な投与のための剤形を提供するものである。製剤は、投与方法に適合するものでなければならない。
【００６３】
好適な実施形態において、本組成物は、ヒトへの静脈内投与用に適合させた医薬組成物として、ルーチン法に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与用の組成物は、無菌等張緩衝水溶液中の溶液である。必要な場合、本組成物はまた、可溶化剤と、注射部位の疼痛緩和のための局所麻酔剤（例えば、リグノカイン）を含んでよい。一般にその成分は、別々に供給されるか、または混合されて単位剤形として（例えば、活性物質の量を表示した密封容器（例えば、アンプルまたはサッシェ）中に入れた、乾燥した凍結乾燥粉末としてまたは水分を含まない濃縮物として）、供給される。本組成物が注入により投与される場合、これは、無菌の製薬等級の水または生理食塩水を含有する注入ビンで投薬することができる。本組成物が注射により投与される場合、成分が投与前に混合されるように、注射用の無菌水または生理食塩水のアンプルを提供してもよい。
【００６４】
本発明の治療薬は、中性形態または塩の形態で製剤化することができる。薬学的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから得られるような、遊離アミノ基と形成される塩、および水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから得られるような遊離カルボキシル基と形成される塩が挙げられる。
【００６５】
特定の障害または病的状態（すなわち、不安関連障害）の治療に有効な本発明の治療薬の量は、障害または病的状態の性質に依存し、標準的な臨床手法により決定することができる。さらに、最適な用量範囲を特定するのを助けるために、随時ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用してもよい。製剤中で使用される正確な用量はまた、投与経路、疾患または障害の重症度に依存し、医師の判断と各患者の状況に従って決定されるべきである。しかし、静脈内投与のための適当な用量範囲は一般に、体重１ｋｇ当たり活性化合物が約２０〜５００マイクログラムである。鼻内投与のための適当な用量は、一般に約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重〜約１ｍｇ／ｋｇ体重である。有効な用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から得られる用量応答曲線から外挿される。
【００６６】
坐剤は一般に、約０．５〜約１０重量％の範囲の活性成分を含有し、経口製剤は、好ましくは約１０〜約９５重量％の活性成分を含有する。
【００６７】
本発明はまた、本発明の医薬組成物の１つ以上の成分を充填した１つ以上の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。そのような容器には、場合により、医薬品もしくは生物製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関により規定された書式の注意書を付記することがある。この注意書は、当該機関による、ヒトへの投与のための製造、使用または販売の認可を踏まえたものである。
【００６８】
５．６ トランスジェニック動物
本発明はまた、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に不活化突然変異を有するか、またはα１−ＧＡＢＡＡ 受容体、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体またはα５−ＧＡＢＡＡ 受容体に不活化突然変異を有する、非ヒトトランスジェニック動物モデルおよび非トランスジェニック動物モデルを提供する。ある実施形態においては、ＧＡＢＡＡ 受容体のα２サブユニットが、アミノ酸１０１位で突然変異しており、ＨｉｓがＡｒｇで置換されている。別の実施形態においては、ＧＡＢＡＡ 受容体のα１サブユニットが、アミノ酸１０１位で突然変異しており、ＨｉｓがＡｒｇで置換されている。別の実施形態においては、ＧＡＢＡＡ 受容体のα３サブユニットが、アミノ酸１２６位で突然変異しており、ＨｉｓがＡｒｇで置換されている。別の実施形態においては、ＧＡＢＡＡ 受容体のα５サブユニットが、アミノ酸１０５位で突然変異しており、ＨｉｓがＡｒｇで置換されている。さらに別の実施形態においては、ＧＡＢＡＡ 受容体のα３サブユニットが、遺伝子ターゲティングにより不活化されている（「遺伝子ノックアウト」）。このような動物は、当該分野で一般的に公知の方法（後述のセクション６に記載の方法を含む）により作製することができる。他の方法は、米国特許第６，２７１，３６０号に記載の組換え作製オリゴヌクレオチドの使用を含む。
【００６９】
以下の一連の実施例は、説明のために示すものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００７０】
６． 実施例：不安の選択的緩和のための分子基質および神経基質の測定
過度のまたは不適切な不安は、臨床的に有効なベンゾジアゼピン薬剤を使用して、ＧＡＢＡ作動性の抑制性神経伝達を増強することにより制御することができる（ＳｈａｄｅｒおよびＧｒｅｅｎｂｌａｔｔ， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２８（１９）：１３９８−１４０５）。しかし、不安の緩和を仲介するＧＡＢＡＡ 受容体サブタイプを特定することは、今日まで実現していない。４つの型のジアゼパム感受性ＧＡＢＡＡ 受容体を、α１、α２、α３、またはα５サブユニットの存在に基づいて区別することができる。以下の実験は、α２サブユニットを有する受容体が、不安の緩和を仲介することを立証するものである。
【００７１】
６．１ 材料と方法
６．１．１ α ２（Ｈ１０１Ｒ） とα ３（Ｈ１２６Ｒ） マウスの作製
ラムダファージライブラリーからＧＡＢＡＡ 受容体α２サブユニット遺伝子（ＧＡＢＲＡ２）のエキソン４と５を含有するゲノムクローンを得て、６．０ ｋｂのゲノムＰｓｔＩ／Ｎｃｏｌ断片を選択し、これを置換ターゲティングベクター中に相同ＤＮＡとして組み込んだ。このベクターは、エキソン４に所望の点突然変異を含有し、イントロン３にｌｏｘＰ隣接ネオマイシン耐性カセット（ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル）を含有している。このカセットは、イントロン３中に遺伝子工学的に作製したＳａｌＩ部位中に挿入されたものである。アミノ酸ＦＨＮ（１００〜１０２位）をコードするエキソン４中の配列ＴＴＴＣＡＣＡＡＴは、アミノ酸ＦＲＮをコードするＴＴＣＣＧＧＡＡＴに変異していた。置換ベクターを胚幹細胞（Ｅ１４株）中にエレクトロポレーション導入し、正しくターゲティングされたクローンをＣ５７ＢＬ６／Ｊ胚盤胞中に注入した。突然変異対立遺伝子を有するマウスを、１２９／ＳｖＪバックグランドを有するＥｌｌａ−ｃｒｅマウスと交配して、ｃｒｅ／ｌｏｘＰ介在切断により生殖細胞系からネオマイシン耐性カセットを除去した。Ｌａｋｓｏら、１９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：５８６０。次に、交配によりｃｒｅ導入遺伝子を除去した。
【００７２】
キメラから出発して、マウスを１２９／ＳｖＪバックグランドで６世代交配した。ヘテロ接合性交配種を作製して、ホモ接合性突然変異体マウス、ヘテロ接合性マウスおよび野生型マウスを得た。典型的には、ホモ接合性変異体マウスと野生型マウスの両方について２０〜２５の繁殖ペアにより、実験動物を作製し、これらは約８〜１２週齢で使用した。各マウスに、１回のみジアゼパムを注入した。
【００７３】
ＧＡＢＡＡ 受容体α３サブユニット遺伝子（ＧＡＢＲＡ３）のエキソン３と４とを含む１６．８ ｋｂのインサートを含有するマウスゲノムクローンを、ラムダファージライブラリーから得た。エキソン４を含む４．３ ｋｂのＨｉｎｃＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片を、ターゲティングベクター用の相同ＤＮＡとして選択した。ｌｏｘＰ−隣接ネオマイシン耐性（ｎｅｏ）マーカー（ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル）を、エキソン４の下流のＮｃｏＩ部位に配置した。アミノ酸ＦＨＮ（１２５〜１２７位）をコードするエキソン４中の配列ＴＴＣＧＡＯＡＡＴを、アミノ酸ＦＲＮをコードするＴＴＣＣＧＧＭＴに変異させた。さらに、制限断片長多型分析で使用するためのサイレント変異を導入した：ＧＧＧ（１５０位のスレオニン）を、ＧＧＴで置換して、新規Ｋｐｎｌ部位（ＧＧＴＡＣＣ）を作製した。最終的なターゲティングベクターＲＫ−１は、突然変異の５’側の約１．３ ｋｂの相同性、突然変異とｎｅｏマーカーとの間の約０．２ ｌｓｔの相同性、ｎｅｏマーカーの３’側の約２．８ ｋｂの相同性を有した。相同な５’側に、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）カセットを、陰性選択のために含めた。フランキングプローブを用いるサザンブロッティングにより分析した数千のＥＳ細胞クローンのうち、胚幹細胞株ｍＥＭＳ３２から得られた１つのクローンのみが、正しいターゲティングを示した。Ｓｉｍｐｓｏｎら、１９９７， Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． １６：１９。このクローンを、胚盤胞中に注入し、得られたマウスを、１２９／ＳｖＪバックグランドを有するＥｌｌａ−ｃｒｅマウスと交配して、ネオマイシン耐性カセットを排除した。Ｌａｋｓｏら、１９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：５８６０。次に、交配によりｃｒｅ導入遺伝子を除去した。キメラから出発して、このマウスを１２９／ＳｖＪバックグランドで５世代交配した。繁殖および実験計画は、α２（Ｈ１０１Ｒ）マウスについて記載したものと同様であり、但し、α３サブユニットの遺伝子がＸ染色体上に位置することを考慮した。
【００７４】
６．１．２ 明／暗選択試験
相互に連結した暗い箱と照明（５００ルクス）箱を有するチャンバー中で、暗いコンパートメントに最初に入れてから５分間の、野生型マウスと突然変異マウスの行動を試験した。試験の３０分前に、マウスをビヒクルまたはジアゼパム（０．５、１および２ｍｇ／ｋｇ経口）で処理した。照明箱で過ごした時間を記録した。
【００７５】
６．１．３． 高所＋迷路
薄暗い間接照明の下で、壁で囲った２つのアームと２つの開放アームを備えた高所にある横木の上に、マウスを置いた。野生型マウスと突然変異マウスを、試験の３０分前にビヒクルまたはジアゼパム（２ｍｇ／ｋｇ経口）で処理した。開放アームで過ごした時間と開放アームに入った回数を５分間記録した。
【００７６】
６．１．４． 行動試験
メスの野生型マウスと突然変異マウスを試験室で飼育し、１２時間の明／暗サイクルの暗い期間に行動を試験した。０．３％ Ｔｗｅｅｎ８０を含有する生理食塩水に懸濁したジアゼパムを経口投与し（４〜５ｍｇ／ｋｇ）、一方、ペンチレンテトラゾールを生理食塩水に溶解し、腹腔内投与した。
【００７７】
６．１．５ 統計
一元配置または二元配置ＡＮＯＶＡ後に、それぞれダネット試験または多重ｔ検定を用いる事後平均比較を使用して、データを解析した。分散の均一性についてのバートレット検定が有意であった場合には、各遺伝子型のデータを、クルスカル−ワリスとマンウィットニー検定を使用して、別々に解析した。二項変量を、カイ二乗検定とフィッシャーの正確確率検定により解析した。群内比較については、ウィルコクソンの符号付き順位検定を使用した。
【００７８】
６．１．６． 自発運動
一般的な自動化２チャンバー装置内で３０分間、ビヒクルまたはジアゼパム（３、１０および３０ｍｇ／ｋｇ経口）の投与の３０分後の自発運動を記録した。
【００７９】
６．ｌ．７． ペンチレンテトラゾール試験
ペンチレンテトラゾール処理（１２０ｍｇ／ｋｇ 腹腔内）後に、強直発作の発生および／または潜伏を、野生型マウスと突然変異マウスで最大１０分間記録した。ビヒクルまたはジアゼパム（３、１０および３０ｍｇ／ｋｇ 経口）による処理を、ペンチレンテトラゾールの３０分前に行った。この試験は、依存性障害を評価するのに使用される。
【００８０】
６．１．８ ロータロッド
運動障害を評価するために、マウスを、２ｒｐｍの固定速度で回転する回転棒の上に少なくとも１２０秒間とどまるように訓練した。Ｂｏｎｅｔｔｉら、１９８８， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｅｈａｖ． ３１：７３３。ビヒクルまたはジアゼパム（３、１０および３０ｍｇ／ｋｇ 経口）による処理の前の６０秒までと、該処理の３０分後に、棒から落ちるまでの持続時間を記録した。
【００８１】
６．２ 結果
α２とα３受容体サブタイプの薬理学を区別するために、α２サブユニット遺伝子［α２（Ｈ１０１Ｒ）］（図１）とα３サブユニット遺伝子［α３（Ｈ１２６Ｒ）］の相同位置に点突然変異を導入して、各受容体をジアゼパム非感受性とした、２つのマウス株を作製した。変異体は、明らかで顕著な表現型を示さず、正常に繁殖し、試験したすべてのサブユニット（α１、α２、α３、β２／３、γ２）を正常レベル（図２Ａ）で変化のない分布で発現した。ジアゼパム非感受性［３Ｈ］Ｒｏ１５−４５１３（ＮＥＮ、ボストン、マサチューセッツ州）結合部位の数は、野生型マウスの５％からα２（Ｈ１０１Ｒ）マウスの１７％まで上昇し、α３（Ｈ１２６Ｒ）マウスでは１１％まで上昇した［α２野生型対照：Ｂｍａｘ＝０．０８±０．０２ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質、ＫＤ＝４．３±０．８ｎＭ（ｎ＝３）；α２（Ｈ１０１Ｒ）マウス：Ｂｍａｘ＝０．２６±０．０１ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質、ＫＤ＝８．０±１．３ｎＭ（ｎ＝３）；α３野生型対照：Ｂｍａｘ＝０．０６±０．０１ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質、ＫＤ＝４．９±２．１ｎＭ（ｎ＝３）；α３（Ｈ１２６Ｒ）マウス：Ｂｍａｘ＝０．１１±０．０２ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質、ＫＤ＝６．５±１．６ｎＭ（ｎ＝３）］。α２サブユニットの既知の分布（ＦｒｉｔｓｃｈｙおよびＭｏｅｈｌｅｒ、１９９５， Ｊ． Ｃｏｍｐ． Ｎｅｕｒｏ． ３５９：１５４）に一致して、ジアゼパム非感受性部位α２（Ｈ１０１Ｒ）マウスは、１００μＭジアゼパムの存在下で１０ｎＭ［３Ｈ］Ｒｏ１５−４５１３を使用して、側矢状脳切片でオートラジオグラフィーにより証明されるように、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体を発現するすべての領域について視覚化された（図２Ｂ）。同様に、α３（Ｈ１２６Ｒ）マウスでは、新規なジアゼパム非感受性［３Ｈ］Ｒｏ１５−４５１３結合部位は、α３サブユニットの分布に対応する分布を示した（図２Ｂ）（ＦｒｉｔｓｃｈｙおよびＭｏｅｈｌｅｒ、１９９５， Ｊ． Ｃｏｍｐ． Ｎｅｕｒｏ． ３５９：１５４）。α２またはα３サブユニット特異的抗血清を用いる免疫沈降後に、［３Ｈ］Ｒｏ１５−４５１３結合により、各突然変異マウスからα２およびα３サブユニットへの、ジアゼパムに対する親和性の１，０００倍を超える低下が明らかになった。
【００８２】
ＧＡＢＡ（３μＭ）に対する電気生理学的応答は、野生型マウスとα２（Ｈ１０１Ｒ）マウスの培養海馬錐体細胞で区別できなかった（図２Ｃ）。しかし、ジアゼパム（１μＭ）による増強は、野生型マウスからの細胞と比較すると、α２（Ｈ１０１Ｒ）マウスからの細胞で低下し［１７．６±４．５％（ｎ＝２９）対 ４８．１±７．９％（ｎ＝１８）、Ｐ＝０．００１］（図２Ｃ）、残りの増強は、おそらくα２以外のＧＡＢＡＡ 受容体によるものと思われた。野生型細胞中のＲｏ１５−４５１３（１μＭ）の逆アゴニスト作用は、α２（Ｈ１０１Ｒ）マウスから得られた細胞中でアゴニスト応答に変換された［−３９±５．２％（ｎ＝１３）対 １１．７±７．５％（ｎ＝２３）、Ｐ＝０．００３］（図２Ｃ）。これは、逆アゴニスト作用から、ＨＥＫ−２９３細胞で発現される組換えα２（Ｈ１０１Ｒ）β３γ２受容体について証明されたアゴニスト作用への、Ｒｏ１５−４５１３の作用の切り換えと一致する（Ｂｅｎｓｏｎら、１９９８， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４３１：４００）。
【００８３】
α２（Ｈ１０１Ｒ）マウスとα３（Ｈ１２６Ｒ）マウスのジアゼパム誘導行動を野生型マウスのそれと比較することにより、突然変異α２およびα３ ＧＡＢＡＡ 受容体の薬理学的意義を評価した。用量依存的に試験すると、ジアゼパムの鎮静作用、運動障害および抗けいれん作用（Ｂｏｎｅｔｔｉら、１９８８， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｅｈａｖ． ３１：７３３）は、野生型マウスと比較してα２（Ｈ１０１Ｒ）マウスまたはα３（Ｈ１２６Ｒ）マウスで損なわれなかった（図３）。
【００８４】
α２（Ｈ１０１Ｒ）マウスとα３（Ｈ１２６Ｒ）マウスのジアゼパムの抗不安様作用を、明／暗選択試験（Ｍｉｓｓｌｉｎら、１９８９， Ｂｅｈａｖ． Ｐｒｏｃ． １８：１１９）と高所＋迷路試験（Ｌｉｓｔｅｒ， １９８７， Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ９２：１８０）で試験した。明／暗選択試験において、α２（Ｈ１０１Ｒ）マウスは、ジアゼパムによる行動脱抑制を示さなかったが、この行動脱抑制は野生型マウスでは明らかであった。２ｍｇ／ｋｇまでのジアゼパムは、照明領域で過ごした時間を、野生型マウスと比較してα２（Ｈ１０１Ｒ）マウスで増加させなかった（Ｐ＜０．０５ 対 ビヒクル）（図４Ａ）。ビヒクルまたはジアゼパム処理下で、野生型マウスとα２（Ｈ１０１Ｒ）マウスの間で、暗い場所で行動の差は観察されなかったため、この効果は、α２（Ｈ１０１Ｒ）マウスの運動欠陥が原因ではなかった。さらに、α２（Ｈ１０１Ｒ）マウスは、ベンゾジアゼピン部位ではなくＧＡＢＡＡ 受容体部位に作用するリガンドに対する抗不安様応答を示す能力を保持していた。フェノバルビタールナトリウム（１５ｍｇ／ｋｇ 皮下）は、野生型マウスで見られたものと同様に、α２（Ｈ１０１Ｒ）マウスで明／暗選択試験で行動脱抑制を誘導した［照明領域での時間、野生型（ｗｔ）ビヒクル：７０．５±１０．５秒；ｗｔフェノバルビタール；１１１．７５±１０．０秒；α２（Ｈ１０１Ｒ）ビヒクル：７５．３±１１．５秒、およびα２（Ｈ１０１Ｒ）フェノバルビタール：１１０．９±９．６秒；Ｆ（１，２４）＝１３．４４、Ｐ＜０．０２、ｎ＝６〜８］。α２（Ｈ１０１Ｒ）マウスでジアゼパムの抗不安様作用が存在しないことは、高所＋迷路試験で確認された。野生型マウスでは、ジアゼパムは、開放アームで過ごした時間の長さ［Ｐ＜０．０１ 対 ビヒクル］と開放アームに入った回数［Ｐ＜０．０５］の両方を増加させることにより、探索行動を促進した。これに対して、α２（Ｈ１０１Ｒ）マウスでは、ジアゼパムは探索行動の両方のパラメータを増加させなかった（図４Ｂ， Ｃ）。同様に、閉鎖アーム中での運動活性は、処理に無関係にα２（Ｈ１０１Ｒ）マウスと野生型マウスで同様であったため、この不成功の原因は、運動障害ではなかった。
【００８５】
ジアゼパムの抗不安様活性に対するα３ ＧＡＢＡＡ 受容体の寄与の可能性を、α３（Ｈ１２６Ｒ）マウスで調べた。α３（Ｈ１２６Ｒ）マウスと野生型マウスの両方とも、明／暗選択試験［Ｐ＜０．０１ 対 ビヒクル］（図４Ｄ）と高所＋迷路［Ｐ＜０．００１ 対 ビヒクル］（図４Ｅ、Ｆ）とで、ジアゼパムに対して、同様の用量依存的抗不安様応答を示した。これらの結果は、野生型マウスでのジアゼパムの抗不安作用には、α３ ＧＡＢＡＡ 受容体との相互作用が関与しないことを示す。
【００８６】
ジアゼパムの抗不安様作用は、α２ ＧＡＢＡＡ 受容体を発現するニューロン集団におけるＧＡＢＡ作動性伝達の増強により、選択的に仲介されるが、α２ ＧＡＢＡＡ 受容体はすべてのジアゼパム感受性ＧＡＢＡＡ 受容体のわずかに１５％である（Ｍａｒｋｓｉｔｚｅｒら、１９９３， Ｊ． Ｒｅｃｅｐｔ． Ｒｅｓ． １３：４６７）。脳皮質と海馬中のα２ ＧＡＢＡＡ 受容体発現細胞は、主要なニューロンの出力を制御すると考えられる軸索初期セグメント上の、α２ ＧＡＢＡＡ 受容体を非常に高い密度で示す錐体細胞を含む（Ｎｕｓｓｅｒら、１９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１１９３９；Ｆｒｉｔｓｃｈｙら、１９９８， Ｊ． Ｃａｍｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． ３９０：１９４）。
【００８７】
長期の治療で観察される副作用が低下することに関しては、ジアゼパムで長期処置した野生型マウスは、フルマゼニル（ベンゾジアゼピンアンタゴニスト）を投与すると禁断症状を示した。ベンゾジアゼピンに非感受性の変異α１−ＧＡＢＡＡ 受容体（Ｈ１０１Ｒ）を有するマウスを同じプロトコール（ジアゼパムによる長期処置とフルマゼニルの投与）に付すと、自発運動で測定される禁断症状は大幅に低下した。
【００８８】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態の範囲に限定されない。実際、前記説明と添付の図面から当業者には、本明細書に記載のもの以外に本発明の種々の改変が明らかであろう。そのような改変は、特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【００８９】
種々の刊行物および特許出願が本明細書で引用されているが、これらの開示内容は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａ〜Ｄ。α２サブユニットＧＡＢＡＡ 受容体遺伝子のターゲティング。図１Ａ：野生型と変異対立遺伝子の構造。変異対立遺伝子１は、マウスＥＳ細胞中で遺伝子ターゲティング後に得られ、マウス生殖細胞系に導入される；これらのマウスをＥｌｌａ−ｃｒｅマウスに交配させると、ネオマイシン耐性カセット（変異対立遺伝子２）が切断される。ターゲティングベクターの両側に位置する５’と３’プローブを、実線の棒で示す。ＨｉｓとＡｒｇは、それぞれエキソン４の１０１位のヒスチジンとアルギニンのコドンを示す。図１Ｂ：胚幹細胞中の野生型（ｗｔ）対立遺伝子と変異対立遺伝子１（Ｍｕｔ１）のサザンブロット解析。図１Ｃ：Ｅｌｌａ−ｃｒｅトランス遺伝子にヘミ接合性のキメラとマウスの交配から得られる子孫の遺伝子タイピング。上のパネル：ＰＣＲプライマーＰ１、Ｐ２、Ｐ３は、各対立遺伝子の特異的な増幅産物を与える。下のパネル：ＰＣＲプライマーＵＲ２６とＵＲ３６は、ｃｒｅトランス遺伝子を増幅する。図１Ｄ：自動ＤＮＡ配列決定によるα２（Ｈ１０１Ｒ）点突然変異の証明。
【図２】図２Ａ〜Ｃ。α２（Ｈ１０１Ｒ）とα３（Ｈ１２６Ｒ）マウスのＧＡＢＡＡ 受容体の分子特性。図２Ａ：α１、α２、α３、β２／３およびγ２サブユニットを認識する抗血清を使用する野生型マウスとα２（Ｈ１０１Ｒ）およびα３（Ｈ１２６Ｒ）マウスからの、脳膜全体のウェスタンブロット。図２Ｂ：野生型、α２（Ｈ１０１Ｒ）（上のパネル）およびα３（Ｈ１２６Ｒ）（下のパネル）脳中の、ジアゼパム非感受性部位の受容体オートラジオグラフィー。傍矢状切片を、１００μＭのジアゼパムの存在下で１０ｎＭの［３Ｈ］Ｒｏ１５−４５１３とインキュベートして、ジアゼパム非感受性［３Ｈ］Ｒｏ１５−４５１３結合部位を明らかにした。野生型マウスでは、ジアゼパム非感受性［３Ｈ］Ｒｏ１５−４５１３結合は、α４とα６ＧＡＢＡＡ 受容体による。図２Ｃ：α２（Ｈ１０１Ｒ）マウスからの培養海馬錐体細胞のＧＡＢＡ応答。パッチ−クランプ分析の保持電位は−６０ｍＶであり、塩素濃度は対称であった。ＧＡＢＡを５秒間適用した。Ｅ１６．５胚からの海馬ニューロンを、１０〜１４日間培養した。２重の星印は、Ｐ＜０．００１（スチューデントｔ検定）。
【図３】図３Ａ〜Ｆ。野生型マウスと比較したα２（Ｈ１０１Ｒ）マウス（図３Ａ〜Ｃ）とα３（Ｈ１２６Ｒ）マウス（図３Ｄ〜Ｆ）における、ジアゼパムの鎮静、運動障害、および抗けいれん性の行動評価。図３Ａ：野生型マウスとα２（Ｈ１０１Ｒ）マウスにおける自発運動の用量依存性阻害［Ｆ（３， ７１） １９．３１， Ｐ＜０．００１， ｎ＝９〜１０匹マウス／群］。図３Ｂ：野生型マウスとα２（Ｈ１０１Ｒ）マウスにおける回転棒（固定２ｒｐｍ）から落ちるまでの持続時間の用量依存性低下［Ｆ（３， １５３）＝７１．０１， Ｐ＜０．００１， ｎ＝２０〜２１匹マウス／群］。図３Ｃ：野生型マウス［χ２＝３２．２８， Ｐ＜０．００１， ｎ＝１０匹マウス／群］とα２（Ｈ１０１Ｒ）マウス［χ２＝２８．１３， Ｐ＜０．００１， ｎ＝１０匹マウス／群］の、強直性けいれんを示すマウスの割合の用量依存性低下。図３Ｄ：野生型マウスとα３（Ｈ１２６Ｒ）マウスにおける自発運動の用量依存性阻害［Ｆ（３， ６４）＝１４．７０， Ｐ＜０．００１， １７＝８〜１０匹マウス／群］。図３Ｅ：野生型マウスとα３（Ｈ１２６Ｒ）マウスにおける回転棒（固定２ｒｐｍ）から落ちるまでの持続時間の用量依存性低下［Ｆ（３， ６４）＝３６．７８， Ｆ＜０．００１， ｎ ８〜１０匹マウス／群］。図３Ｆ：野生型マウス［χ２＝３２．３８， Ｐ＜０．００１， ｎ＝１０匹マウス／群］とα３（Ｈ１２６Ｒ）マウス［χ２＝２８．６０， Ｐ＜０．００１， ｎ＝１０匹マウス／群］の、強直性けいれんを示すマウスの割合の用量依存性低下。結果は、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示す。＋ Ｐ＜０．０５、＋＋ Ｐ＜０．０１、＋＋＋ Ｐ＜０．００１（ダネットの事後比較またはフィッシャーの正確度検定）。Ｖ、ビヒクル。ロタロッド（ｒｏｔａｒｏｄ）とペンチレンテトラゾールケイレン試験を、Ｂｏｎｅｔｔｉら、１９８８， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｅｈａｖ． ３１：７３３に従って行った。自発運動を３０分間自動的に記録した。試験前に３０分間、マウスをビヒクルまたはジアゼパム（３、１０および３０ｍｇ／ｋｇ経口）で処理した。
【図４】図４Ａ〜Ｆ。野生型マウスと比較したα２（Ｈ１０１Ｒ）マウス（図４Ａ〜Ｃ）とα３（Ｈ１２６Ｒ）マウス（図４Ｄ〜Ｆ）における、ジアゼパムの抗不安様作用の行動評価。図４Ａ：明／暗選択試験。ジアゼパムは、野生型マウス［Ｆ（３， ３６）＝３．１４， Ｐ＜０．０５］が明るい場所で費やした時間を用量依存性に増加させたが、α２（Ｈ１０１Ｒ）マウス［Ｆ（３， ３６）＝０．３２， 有意差無し］では増加させなかった、ｎ＝１０匹マウス／群。図４Ｂ〜Ｃ：高所＋迷路（Ｅｌｅｖａｔｅｄ ｐｌｕｓ−ｍａｚｅ）。ジアゼパム（２ｍｇ／ｋｇ）は、野生型マウスで、開放アームで費やした時間の割合とエントリーを上昇させた［Ｐ＜０．０１とＰ＜０．０５対ビヒクル］が、α２（Ｈ１０１Ｒ）マウスでは上昇させなかった［それぞれ、Ｆ（１， ３２）＝４．３１とＦ（１， ３２）＝４．７６， Ｐ＜０．０５， ｎ＝８〜１０匹マウス／群］。図４Ｄ：明／暗選択試験。野生型マウスとα３（Ｈ１２６Ｒ）マウスにおける、明るい場所で費やした時間の用量依存性増加［それぞれ、Ｆ（１， ７０）＝１４．７４， Ｐ＜０．００１， ｎ ９−１０匹マウス／群］。図４Ｅ〜Ｆ：高所＋迷路（Ｅｌｅｖａｔｅｄ ｐｌｕｓ−ｍａｚｅ）。ジアゼパム（２ｍｇ／ｋｇ）は、開放アームで費やした時間の割合とエントリーを、野生型マウスとα３（Ｈ１２６Ｒ）マウスで同程度に上昇させた［それぞれ、Ｆ（１， ３６）＝２６．５２とＦ（１， ３６）＝３７．３１， Ｐ＜０．００１， ｎ＝１０匹マウス／群］。結果は、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示す。＋ Ｐ＜０．０５、＋＋ Ｐ＜０．０１、＋＋＋ Ｐ＜０．００１（ダネットまたはフィッシャーの対になった事後比較またはフィッシャーの正確度検定）。Ｖ、ビヒクル、Ｄｚ、ジアゼパム。明−暗選択試験は、後述のような、５００ ルクスの照射で行った。マウスに、ビヒクルまたは増加する用量のジアゼパム（０．５、１および２ｍｇ／ｋｇ経口）を投与した。高所＋迷路（ｅｌｅｖａｔｅｄ ｐｌｕｓ−ｍａｚｅ）を、後述のように暗い光の照射（＜１０ルクス）下で行った。試験の３０分前に、ビヒクルまたはジアゼパムを投与した。
Claims (18)
- 候補分子にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体とα１−ＧＡＢＡＡ 受容体とを接触させ、候補分子が、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合するかまたはこれを活性化するかどうかを測定することを含む、選択的抗不安物質を同定するためのスクリーニング方法であって、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合するかまたはこれを活性化する分子は、選択的抗不安物質である、上記方法。
- 候補分子にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体とα３−ＧＡＢＡＡ 受容体とを接触させ、候補分子が、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合するかまたはこれを活性化するかどうかを測定することを含む、選択的抗不安物質を同定するためのスクリーニング方法であって、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合するかまたはこれを活性化する分子は、選択的抗不安物質である、上記方法。
- 候補分子にα２−ＧＡＢＡＡ 受容体とα５−ＧＡＢＡＡ 受容体とを接触させ、候補分子が、α５−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合するかまたはこれを活性化するかどうかを測定することを含む、選択的抗不安物質を同定するためのスクリーニング方法であって、α５−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合するかまたはこれを活性化する分子は、選択的抗不安物質である、上記方法。
- α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合するかまたはこれを活性化する選択的抗不安物質。
- α３−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合するかまたはこれを活性化する選択的抗不安物質。
- α５−ＧＡＢＡＡ 受容体に比較してα２−ＧＡＢＡＡ 受容体に選択的または優先的に結合するかまたはこれを活性化する選択的抗不安物質。
- 受容体のベンゾジアゼピン結合部位に結合する、請求項４、５または６に記載の選択的抗不安物質。
- 受容体の神経ステロイド結合部位に結合する、請求項４、５または６に記載の選択的抗不安物質。
- 受容体のバルビツレート結合部位に結合する、請求項４、５または６の選択的抗不安物質。
- 治療の必要な患者に、治療上有効量の選択的抗不安物質と薬剤学的に許容される担体とを投与することを含む、不安関連障害の治療方法。
- 選択的抗不安物質は、請求項１、２または３の方法により同定される、請求項１０の方法。
- 選択的抗不安物質は、受容体のベンゾジアゼピン結合部位に結合する、請求項１０の方法。
- 選択的抗不安物質は、受容体の神経ステロイド結合部位に結合する、請求項１０の方法。
- 選択的抗不安物質は、受容体のバルビツレート結合部位に結合する、請求項１０の方法。
- 選択的抗不安物質はプロドラッグである、請求項１０の方法。
- α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する非選択的ベンゾジアゼピンの能力を低下させるが、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する非選択的ベンゾジアゼピンの能力を実質的に低下させない分子の同定法であって、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体とα２−ＧＡＢＡＡ 受容体とに、ベンゾジアゼピンと候補分子とを接触させて、α１−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合するベンゾジアゼピンの能力を低下させるが、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合するベンゾジアゼピンの能力を実質的に低下させない、候補分子の能力を検出することを含む、上記方法。
- α３−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する非選択的ベンゾジアゼピンの能力を低下させるが、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する非選択的ベンゾジアゼピンの能力を実質的に低下させない分子の同定法であって、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体とα２−ＧＡＢＡＡ 受容体とに、ベンゾジアゼピンと候補分子とを接触させて、α３−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合するベンゾジアゼピンの能力を低下させるが、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合するベンゾジアゼピンの能力を実質的に低下させない、候補分子の能力を検出することを含む、上記方法。
- α５−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する非選択的ベンゾジアゼピンの能力を低下させるが、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合する非選択的ベンゾジアゼピンの能力を実質的に低下させない分子の同定法であって、α５−ＧＡＢＡＡ 受容体とα２−ＧＡＢＡＡ 受容体とに、ベンゾジアゼピンと候補分子とを接触させて、α５−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合するベンゾジアゼピンの能力を低下させるが、α２−ＧＡＢＡＡ 受容体に結合するベンゾジアゼピンの能力を実質的に低下させない、候補分子の能力を検出することを含む、上記方法。
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