JPH08504330A - Ｇａｂａ‐ａレセプターを発現させる、安定にトランスフェクトされた細胞系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、α₁β₃γ₂、α₂β₃γ₂、α₅β₃γ₂、α₁β₁γ_2S、α₁β₂γ₂、α₃β₃γ₂またはα₆β₃γ₂のサブユニットの組み合わせを含むヒトGABA_Aレセプターを発現させ得る、安定に同時トランスフェクトされた真核細胞系；該細胞系の培養物に由来する膜調製物；及び該細胞系の、GABA_Aレセプターサブタイプ選択型薬物の設計及び開発への使用に係わる。

Description

【発明の詳細な説明】GABA-Aレセプターを発現させる、安定にトランスフェクトされた細胞系 本発明は細胞系に係わり、特にヒトまたは動物のGABA_Aレセプターを発現させ 得る安定な細胞系に係わる。本発明はまた、ヒトGABA_Aレセプターの特定のサブ ユニットをコードする新規なcDNA配列のクローニングにも係わる。加えて本発明 は、サブタイプ特異的な薬物の設計及び開発のためのスクリーニング技術におけ る上記細胞系の使用にも係わる。 γ−アミノ酪酸（GABA）は、中枢神経系において主要な抑制性神経伝達物質で ある。この物質は、GABA_Aレセプターに固有の塩素（chloride）チャンネルを開 くことによって急速なシナプス抑制を媒介する。GABA_Aレセプターは分子量230〜 270kDaのマルチマータンパク質を含み、作用物質リガンドGABAの結合部位に加え て、ベンゾジアゼピン、バルビツール酸及びβ−カルボリン（β-carbolines） を含めた様々な薬物の特異的結合部位を有する（総説についてはStephenson，Bi ochem．J．249 ，p．21，1988；01sen及びTobin，Faseb J．4，p．1469，1990； 並びにSieghart，Trends in Pharmacol．Sci．10，p．407，1989参照）。 分子生物学的研究が明かすところによれば、上記レセプターは幾つかの異なる 種類のサブユニットによって構成され、それらのサブユニットは配列類似性に基 づいて４群（α、β、γ及びδ）に分類される。これまでに、６種のαサブユニ ット（Schofield等，Nature（London）328，p．221，1987；Levitan等，Nature （London）335 ，p．76，1988；Ymer等，EMBO J．8，p．1665，1989；Pritchett 及びSee-berg，J．Neurochem．54，p．802，1990；Luddens等，Na-ture（London ）346 ，p．648，1990；及びKhrestchatisky等，Neuron 3，p．745，1989）と、 ３種のβサブユニット（Ymer等，EMBO J．8，p．1665，1989）と、２種のγサブ ユニット（Ymer等，EMBO J．9，p．3261，1990；及びShivers等，Neuron 3，p． 327，1989）と、１種のδサブユニット（Shivers等，Neuron 3，p．327，1989) とが同定されている。 これらのサブユニットのうちの多くはその分布が異なることがin situハイブ リダイゼーションによって解明され（Sequier等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85 ，p．7815，1988；Malherbe等，J．Neurosci．10，p．2330，1990；及びShive rs等，Neuron 3，p．327，1989）、それによって、 理論上いずれのサブユニット同士もその同時配置（co-lo-calisation）により同 じレセプター複合体中に存在し得る旨の推論が可能となった。 サブユニットの様々な組み合わせに関して細胞の同時トランスフェクションを 行なうことにより、in vivoの真正GABA_Aレセプターのものに匹敵する薬理特性を 示す合成のサブユニットの組み合わせが同定されている（Pritchett等，Science 245 ，p．1389，1989；Malherbe等，J．Neurosci．10，p．2330，1990；Pritche tt及びSeeberg，J．Neuro-chem．54，p．1802，1990；及びLuddens等，Nature（ Lon-don）346 ，p．648，1990）。このようなアプローチから、ベンゾジアゼピン 感受性の付与には通常α及びβサブユニットに加えてγ₁もしくはγ₂（Pritchet t等，Nature（London）338，p．582，1989；Ymer等，EMBO J．9，p．3261，1990 ；及びMalherbe等，J．Neurosci．10，p．2330，1990）、またはγ₃（Herb等，P roc．Natl．Acad．Sci．USA89 ，p．1433，1992；Knoflach等，FEBS Lett．293， p．191，1991；及びWilson-Shaw等，FEBS Lett．284，p．211，1991）も必要で あること、及び発現されるレセプターのベンゾジアゼピンに関する薬理特性は存 在するα及びγサブ ユニットの同等性に大いに依存することが判明した。δサブユニットを有するレ セプター（即ちαβδ）にベンゾジアゼピンが結合するとは考えられない（Shiv ers等，Neuron 3，p．327，1989）。BZ₁型レセプター（α₁β₁γ₂）及びBZ₂型レ セプター［α₂β₁γ₂またはα₃β₁γ₂（Pritchett等，Nature（London）338，p ．582，1989）］、並びに新規な薬理特性を有する２種のGABA_Aレセプター［α₅ β₂γ₂（Pritchett及びSeeberg，J．Neurochem．54，p．1802，1990）及びα₆ β₂γ₂（Luddens等，Nature（London）346，p．648，1990）］の薬理プロフィー ルを示すサブユニットの組み合わせが同定されている。発現される上記レセプタ ーの薬理特性は、放射性リガンド結合によって脳組織中に同定されるレセプター のものに類似すると考えられてはいるが、それにもかかわらず上記レセプターサ ブユニットの組み合わせがin vivoに存在することは示されていない。 本発明は、GABA_Aレセプターを含む恒常的にトランスフェクトされた細胞であ って、前記レセプターに作用する薬物のスクリーニングに有用な細胞の製造に係 わる。GABA_Aレセプターは以前、アフリカツメガエル卵母細胞（Sigel等，Neuron 5 ，pp．703-711，1990）及び一時的にトランスフェ クトされた哺乳動物細胞（Pritchett等，Science 245，pp．1389-1392，1989） において発現された。しかし、上記系は両方とも一時的な発現しか実現せず、ス クリーニング用としては不適当である。 本発明者は今や、上記レセプターの安定な発現を達成した。 従って本発明は、少なくとも１種のαサブユニットと、少なくとも１種のβサ ブユニットと、少なくとも１種のγサブユニットとを含むGABA_Aレセプターを発 現させ得る、安定に同時トランスフェクトされた真核細胞系を提供する。 この課題は、GABA_Aレセプターのα、βまたはγサブユニットをコードするcDN Aをそれぞれ含む、３個の発現ベクターで細胞を同時トランスフェクトすること により達成された。従って本発明は、更に別の構成において、GABA_Aレセプター を発現させ得る真核細胞系を調製する方法も提供し、この方法は真核宿主細胞を 少なくとも３個の発現ベクターで同時トランスフェクトすることを含み、前記ベ クターのうち１個はGABA_AレセプターのαサブユニットをコードするcDNA配列を 含み、別の１個はβサブユニットをコードするcDNA配列を含み、更に別の１個は γサブユニットをコ ードするcDNA配列を含む。上記方法で確立した安定な細胞系ではαβγ型GABA_A レセプターが発現される。このように発現される、α、β及びγサブユニットの 独特な組み合わせを含む各レセプターを、以後“サブユニット組み合わせ型”GA BA_Aレセプターと呼称する。薬理的及び電気生理的データから、本発明の細胞が 発現させるαβγ型組み換えレセプターは天然型GABA_Aレセプターに期待される 諸特性を有することが確認された。 GABA_Aレセプターの発現は、様々に異なる宿主細胞において様々に異なるプロ モーター発現系により実現可能である。真核宿主細胞は、酵母、昆虫細胞及び哺 乳動物細胞を適宜包含する。好ましくは、レセプター発現のための宿主を提供し 得る真核細胞は哺乳動物細胞である。適当な宿主細胞には、齧歯類線維芽細胞系 、例えばマウスLtk^-、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）及びハムスター乳児 腎臓（BHK）細胞；HeLa細胞；並びにHEK293細胞が含まれる。必要なレセプター の産生のためには、細胞系内に少なくとも１種のαサブユニットと、少なくとも １種のβサブユニットと、少なくとも１種のγサブユニットとを導入しなければ ならない。このような制限内でレセプターサブユニットの 組み合わせを、スクリーニングの目的とする活性または選択性の種類に従って選 択する。例えば、ベンゾジアゼピン（“BZ”と呼称）はGABA_Aレセプターに作用 する薬物の１種である。α₁サブユニットの存在がBZ₁型と呼称される薬理特性を 有するベンゾジアゼピン類に特異的である一方、α₂〜α₅サブユニットは、まと めてBZ₂型と呼称される異なる薬理プロフィールを規定する。ベンゾジアゼピン の分類においてβサブユニットの種類は重要でないが、いずれかのβサブユニッ トは必要である。BZの選択性の規定ではγサブユニットも重要となる。αサブユ ニットの選択性は存在する特定のγサブユニットの同等性次第で異なると考えら れる。 本発明を最も有効にスクリーニングに用いるためには、それぞれ異なる組み合 わせのサブユニットを保有する複数の細胞系のライブラリーを作製することが好 ましい。典型的には５または６種類の細胞系のライブラリーが上記目的に適う。 サブユニットの好ましい組み合わせには、α₁β₁γ₂；α₁β₂γ₂；α₂β₁γ₁； α₂β₁γ₂；α₂β₁γ₃；α₃β₁γ₂；α₃β₁γ₃；α₄β₁γ₂；α₅β₁γ₂；及びα₆ β₁γ₂、特にα₁β₁γ_2Lが含まれる。 特定の一具体例において本発明は、α₁β₃γ₂のサブユニットの組み合わせを 含むヒトGABA_Aレセプターを発現させ得る、安定に同時トランスフェクトされた 真核細胞系を提供する。 別の具体例において本発明は、α₂β₃γ₂のサブユニットの組み合わせを含む ヒトGABA_Aレセプターを発現させ得る、安定に同時トランスフェクトされた真核 細胞系を提供する。 更に別の具体例では本発明は、α₅β₃γ₂のサブユニットの組み合わせを含む ヒトGABA_Aレセプターを発現させ得る、安定に同時トランスフェクトされた真核 細胞系を提供する。 本発明は、α₁β₁γ_2S、α₁β₂γ₂、α₃β₃γ₂及びα₆β₃γ₂のサブユニット の組み合わせを含むヒトGABA_Aレセプターを発現させ得る、安定に同時トランス フェクトされた真核細胞系も提供する。 レセプターサブユニットをコードするDNAは公知のソースから取得可能であり 、通常、例えばManiatis等が“Mo-lecular Cloning：A Laboratory Manual，”C old Spring Harbor Press，New York，2nd edition，1989に述べてい るような標準的なクローニングベクターに組み込まれた特異的ヌクレオチド配列 として得られる。好ましくは、上記cDNA配列はヒト遺伝子に由来する。しかし、 スクリーニング用にはウシまたはラットDNAといった、他の種に由来するcDNAも 適当である。公知のGABA_AレセプターサブユニットcDNAソースは次のとおりであ る。 ・ウシα₁、ウシβ₁： Schofield等，Nature 328，pp．221-227，1987 ・ヒトα₁、ヒトβ₁： Schofield等，FEBS Lett．244，pp．361-364，1989 ・ラットα₂： Khrestchatisky等，J．Neurochem．56，p．1717，1991 ・ウシα₂、ウシα₃： Levitan等，Nature 335，pp．76-79，1988 ・ラットα₄： Wisden等，FEBS Lett．289，p．227，1991 ・ウシα₄： Ymer等，FEBS Lett．258，pp．119-122，1989 ・ラツトα₅： Pritchett及びSeeberg，J．Neurochem．54，pp．1802-1804，1990 ・ラットα₆、ウシα₆： Luddens等，Nature 346，pp．648-651，1990 ・ウシβ₂及びβ₃、ラットβ₂及びβ₃： Ymer等，EMBO J．8，pp．1665-1670，1989 ・ヒトβ₃： Wagstaff等，Am．J．Hum．Genet．49，p．330，1991 ・ヒトγ₁、ラットγ₁、ウシγ₁： Ymer等，EMBO J．9，pp．3261-3267，1990 ・ヒトγ₂： Pritchett等，Nature 338，pp．582-585，1989 ・ウシγ₂： Whiting等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 57，pp．9966-9970，1990 ・ラットγ₃： Herb等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89，p．1433，1992；及び Knoflach等，FEBS Lett．293，p．191，1991 ・マウスγ₃： Wilson-Shaw等，FEBS Lett．284，p．211，1991 ・ラットδ： Shivers等，Neuron 3，p．327，1989 ヒトGABA_Aレセプターの様々なサブユニットをコードするcDNA配列のうちの幾 つかはこれまで入手可能でなかった。そのようなcDNA配列には特に、α₂、α₃、 α₅、α₆及びβ₂サブユニットをコードする配列が含まれ、これらのヌクレオチ ド配列は従って新規である。本発明者は今や、ヒトGABA_Aレセプターのα₂、α₃ 、α₅、α₆及びβ₂サブユニットのcDNA配列を確認した。これらのヌクレオチド 配列を対応する推定アミノ酸配列と共に、添付図面の第２図〜第６図に示す。従 って本発明は、幾つかの付加的な構成において、第２図〜第６図にそれぞれ示し た配列または実質的に同様の配列の全部もしくは一部を含む、ヒトGABA_Aレセプ ターのα₂、α₃、α₅、α₆及びβ₂サブユニットをコードするDNA分子を提供する 。 本発明による新規なcDNA分子の配列決定は、本明細書中の実施例３に述べた標 準的操作によって好ましく行ない得、あるいはまたManiatis等が“Molecular Cl oning：A La- boratory Manual,”Cold Spring Harbor Press，New York，2nd edition，1989 に述べているような、当業者に公知の上記以外の分子クローニング技術によって も可能である。 更に別の構成において、本発明は組み換え発現ベクターも提供し、このベクタ ーはGABA_Aレセプターサブユニットのヌクレオチド配列を、安定に同時トランス フェクトされた真核細胞の培養物中で前記GABA_Aレセプターサブユニットの合成 を導き得る付加的な配列と共に含む。 本明細書中に用いた“発現ベクター”という語は、適当な宿主内での組み換え DNA配列もしくは遺伝子のクローン化コピーの転写、及びそのmRNAの翻訳に必要 なDNA配列を意味する。このようなベクターは、真核生物遺伝子を細菌、藍藻、 酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞及び動物細胞などの様々な宿主において発現させ るのに用い得る。ベクターに特定の設計を施せば、DNAを細菌と酵母細胞、植物 細胞または動物細胞との間で移動させることが可能となる。適当に構築された発 現ベクターは、宿主細胞内での自律複製のための複製起点；選択マーカー；限ら れた数の有用な制限酵素部位；大きいコピー数；及び強いプロモーターを有する べきである。プロモーターは、RNAポリメラーゼをDNAに 結合させてRNA合成を開始させるDNA配列と定義される。強いプロモーターとは、 mRNAの合成開始を高頻度で惹起するプロモーターのことである。発現ベクターに は、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特定的に設計したプラ スミドやウイルスが非限定的に含まれる。 本明細書中に用いた“クローニングベクター”という語は、宿主細胞への異種 DNA断片の導入に用いられる、宿主生物において自律複製可能なDNA分子を意味し 、このDNA分子は普通小型のプラスミドまたはバクテリオファージDNAである。ベ クターDNAに結び付いた異種DNAは、組み換え技術によって得られる組み換えDNA 分子を構成する。クローニングベクターにはプラスミド、バクテリオファージ、 ウイルス及びコスミドが含まれ得る。 本発明による組み換え発現ベクターは、選択したGABA_Aレセプターサブユニッ トのヌクレオチド配列を適当な前駆体発現ベクター（以後“前駆体ベクター”と 呼称）に、当業者に公知である通常の組み換えDNA法を用いて挿入することによ り作製し得る。前駆体ベクターは市販のものを入手しても、また公知の発現ベク ターから標準的な技術によって構築してもよい。前駆体ベクターは選択マーカー 、典型 的にはネオマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子を 適宜有する。前駆体ベクターは好ましくは、SV40初期スプライシング及びポリア デニル化領域の近傍に位置するネオマイシン耐性遺伝子；アンピシリン耐性遺伝 子；及び複製起点、例えばpBR322 oriを含む。ベクターはまた、本発明の細胞系 において転写が制御可能であるように、MMTV-LTR（デキサメタゾンで誘導可能） やメタロチオニン（亜鉛で誘導可能）といった誘導性プロモーターも好ましく含 む。このようにすれば、塩素チャンネルがGABA_Aレセプターに内在するために、 細胞の毒性の問題が軽減または回避される。 適当な前駆体ベクターの一に、Clontech Laborato-ries Inc.から入手可能なp MAMneoが有る（Lee等，Nature 294，p．228，1981；及びSardet等，Cell 56，p ．271，1989）。あるいはまた、本明細書中の実施例１に述べたように、ベクク ーpMSG及びpSV2neoから前駆体ベクターpMSGneoを構築することも可能である。 そこで、上記前駆体ベクターにGABA_AレセプターサブユニットcDNAを挿入して クローニングすることにより、本発明の組み換え発現ベクターを作製する。必要 なレセプター サブユニットcDNAを、該cDNAを含むベクターからサブクローン化し、かつ当業者 に公知の標準的なクローニング法、特に本明細書中の実施例１、ステップ（b） に述べたものに類似の技術によって前駆体ベクター、例えばpMAMneoまたはpMSGn eoのポリリンカーの制限酵素部位、例えばHindIII部位に連結する。発現を促進 するべく上記サブクローニングの前に、サブユニットcDNAの付加的な5′側非翻 訳配列が存在する末端部を改変することがしばしば有利であり、例えばγ_2Lサブ ユニットDNAの5′末端部をα₁サブユニットDNA由来の5′側非翻訳領域の付加に よって改変する。 本発明の発現ベクターの適当な一例を添付図面の第１図に示す。図中、記号Ｒ はGABA_Aレセプターの所与のα、βまたはγサブユニットのヌクレオチド配列を 表わしており、図示した発現ベクターのその他の部分は前駆体ベクターpMSGneo に由来し、本明細書中の実施例１、ステップ（a）及び（b）に述べたように構築 されている。 本発明の各細胞系には上記のようなベクターが３個必要となる。それらのベク ターのうちの１個はαサブユニットを、別の１個はβサブユニット、更に別の１ 個はγサブユニットをそれぞれ含む。 次に、所望のように組み合わせた３個の発現ベクターで細胞を同時トランスフ ェクトする。真核細胞のin vitroトランスフェクションに通常用いられる技術は 幾つか存在する。最も普通に用いられるのはDNAのリン酸カルシウム沈澱であり （Bachetti等,Proc．Natl．Acad．Sci．USA 74，pp．1590-1594，1977；Maitlan d等，Cell 14，pp．133-141，1977）、本発明の場合にもこの技術が好ましい。 組み換えDNAは低いパーセンテージでしか宿主細胞に取り込まれない。その低 率の宿主細胞では、前記DNAは宿主細胞染色体に組み込まれる。前記組み込みの 起こった宿主細胞は、ネオマイシン耐性遺伝子を導入されたことになるので、ネ オマイシンの存在下でも増殖する個々のクローンを単離することにより選択する ことができる。その後、単離したクローンをそれぞれ試験して、レセプターを産 生するものを同定する。この試験は、例えばデキサメタゾンで産生を誘導し、そ の後レセプターの存在を放射性リガンド結合によって検出することにより実施す る。 更に別の構成において本発明は、安定にトランスフェクトされた真核細胞の培 養物に由来するGABA_Aレセプターサブユニットの組み合わせ、特にヒトGABA_Aレセ プターサブ ユニットの組み合わせから成るタンパク質調製物を提供する。本発明はまた、安 定にトランスフェクトされた真核細胞の培養物に由来するGABA_Aレセプターのサ ブユニットの組み合わせ、特にヒトGABA_Aレセプターサブユニットの組み合わせ を含有する膜調製物も提供する。本発明によるタンパク質調製物及び膜調製物は 特に、ヒトGABA_Aレセプターのサブユニツトをα₁β₁γ_2L、α₁β₃γ₂、α₂β₃γ₂ 、α₅β₃γ₂、α₁β₁γ_2S、α₁β₂γ₂、α₃β₃γ₂またはα₆β₃γ₂の組み合わ せで適宜含有し、好ましくはα₁β₁γ_2L、α₁β₃γ_2S、α₂β₃γ_2S、α₅β₃γ_2S 、α₁βγ_2S、α₁β₂γ_2S、α₃β₃γ_2Sまたはα₆β₃γ_2Sのサブユニットの組み 合わせから成るヒトGABA_Aレセプターを含有する。特に好ましい一具体例におい て、本発明は、安定にトランスフェクトされたマウスLtk^-線維芽細胞から単離さ れた、α₁β₁γ_2L、α₁β₃γ_2S、α₂β₃γ_2S、α₅β₃γ_2S、α₁β₁γ_2S、α₁β₂ γ_2S、α₃β₃γ_2Sまたはα₆β₃γ_2Sのサブユニットの組み合わせから成るヒトGA BA_Aレセプターを含有する細胞膜を提供する。 本発明による細胞系及び該細胞系由来の膜調製物は、GABA_Aレセプターに作用 する薬物、例えばベンゾジアゼピ ン、バルビツール酸、β−カルボリン及びニューロステロイドのスクリーニング 及び設計に有用である。従って本発明は、先に述べた細胞系及び該細胞系に由来 する膜調製物の、GABA_Aレセプターに作用する薬物のスクリーニング及び設計へ の使用を提供する。これに関連して特に重要であるのは、サブユニットの組み合 わせを変化させた時、GABA_Aレセプターと選択的に相互作用し得る分子である。 直ちに明らかであろうが、本発明による細胞系及び該細胞系に由来する膜調製物 は、様々なGABA_Aレセプターサブタイプの構造、薬理特性及び機能の研究にとっ て理想的な系をもたらす。 本発明を、以下の非限定的実施例によって詳述する。実施例１ α₁β₁γ_2Lトランスフェクト細胞の調製 ａ）真核発現ベクターpMSGneoの構築 ベクターpMSG（Pharmacia Biosystems Limited，Milton Keynes，United King domから購入）のgpt構造遺伝子及びSV40ポリアデニル化シグナルを含む約2500塩 基対のHindIII−EcoRI断片を、pSV2neo（P．J．Southern及びP．J．Berg，Molec ular and Applied Genetics 1 ，pp．327-341，1982） のネオマイシン耐性遺伝子Neo^r及びSV40ポリアデニル化シグナルを含む約2800塩 基対のHindIII−EcoRＩ断片によって置き換えた。次に、EcoRＩ及びHindIII部位 を制限消化、Klenowポリメラーゼでのブラント末端形成及び再結合によって取り 除いた。その後、EcoRＩ及びHindIIIクローン化部位をポリリンカーのXhoＩ及びSma Ｉ部位に、EcoRＩ及びHindIIIリンカーを用いる通常の技術によって挿入した 。 ｂ）pMSGneo中へのサブユニットcDNAのクローニング ウシGABA_Aレセプターα₁及びβ₁cDNAをMolecular Neu-robiology Unit，MRC C entre，Hills Road，Cambridgeから得た（P．Scholfield等，Nature 328，pp．2 21-227，1987）。ウシγ₂ｃDNAをP．Whiting等の方法（Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 87 ，pp．9966-9970，1990）によってクローン化した。ウシα₁ｃDNAはpbG Rαsenseから、EcoRＩで消化し、Klenowポリメラーゼで前記DNAにブラント末端 を形成し、結合によってHindIIIリンカーを付加し、HindIIIで消化し、かつpMSG neoのHindIII部位に結合させることによってサブクローン化した。ウシβ₁cDNA はpbGRβsenseから、EcoRＩで制限消化し（部分消化）、Klenowポリメラーゼで ブラント末端を形成し、HindIIIリンカーを結合させ、HindIII で制限消化し、かつpMSGneoのHindIII部位に結合させることによってサブクロー ン化した。ウシγ₂cDNAはpMSGneo中へのサブクローニングに際し、公表されてい る配列から次のようにして改変した。公表されているγ₂cDNA配列の5′末端にウ シα₁cDNAの5′側非翻訳領域（公表されている配列の塩基番号60〜200）を、該 領域をポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅し、得られた生成物をγ₂cDNAの5′Ba m HＩ部位（Stratagene，San Diego，U.S.A.から購入したBluescript Sk^-クロー ニングベクターのポリリンカー中の部位）及びHindIII部位に挿入してサブクロ ーン化することにより付加した。次に、改変したγ₂cDNAを、XbaＩで消化し（ク ローニングベクターのポリリンカー中の部位）、Klenowポリメラーゼでブラント 末端を形成し、XhoＩリンカーを結合させ、XhoＩで消化し（クローニングベクタ ーのポリリンカー中の部位）、かつpMSGneoのXhoＩ部位に結合させることにより pMSGneo中へサブクローン化した。 ｃ）マウスLtk^-細胞の同時トランスフェクション Salk Institute for Biological Studies，San Diego，CaliforniaからLtk^-細 胞を入手した。この細胞を、ペニシリン、ストレプトマイシン及び10％ウシ胎児 血清を含有 する改変イーグル培地中で５〜８％のCO₂の存在下に37℃で増殖させた。同時ト ランスフェクションに用いる、GABA_AレセプターサブユニットDNAを含む発現ベク ターを標準的な手順（C．Chen及びH．Okayama，BioTechniques 6，pp．632-638 ，1988）で調製した。同時トランスフェクションのためにLtk^-細胞を、培養皿に 植え込んで（約２×10⁵細胞／皿）一晩増殖させた。トランスフェクションは、 キット（５Prime→３ Prime Products，Westchester，Pennsylvaniaから市販） を用いるリン酸カルシウム沈澱法で実施した。製造者の指示に従い、各サブユニ ットDNA構築物を10cm培養皿１枚の細胞に５μｇずつ用いて同時トランスフェク ションを行なった。２日間培養後、細胞を、１mg/mlのネオマイシンを含有する 培地［Geneticin（Gibco BRL，Paisley，Scotland，U.K.から入手可能）］に１ ：８の量で分割した。その１週間後に濃度を1.5mg/mlに高め、更にその１週間後 ２mg/mlに高めた。細胞の耐性クローンを単離し、クローニングシリンダーを用 いてサブクローン化した。サブクローンを、放射性リガンド結合法を用いて分析 した。即ち、サブクローンを10cm培養皿内で増殖させ、集密状態となったところ で１μMのデキサメタゾンを含有する培地（Sigma Chemical Company，Poole，Dorset，United Kingdomから入手可能）に移した。 ３〜５日後に細胞を回収し、膜を調製してこの膜を、ベンゾジアゼピン拮抗物質³ H Ro15-1788［New England Nuclear，Du Pont（U.K.）Ltd.，Stevenage，Unite d Kingdomから入手］を用いる放射性リガンド結合法（下記実施例２、ステップ （a）参照）に用いた。³H Ro15-1788結合が最も多く生起したクローンを、限界 稀釈によって単一細胞からサブクローン化した。得られた細胞クローン集団を、 後述の際には“集団A”と呼称する。実施例２ α₁β₁γ_2Lトランスフェクト細胞の特性解明 ａ）放射性リガンド結合法 実施例１に述べたように調製した組み換えα₁β₁γ_2L型GABA_Aレセプターの性 質を、ベンゾジアゼピン（BZ）拮抗物質³HRo15-1788を用いてBZ結合の薬理特性 を解明することにより確認した。放射性リガンド結合アッセイのために、デキサ メタゾン含有培地中での３〜５日間の培養によって生じた細胞を掻き取ってpH7. 5の50mM Tris、Trisで緩衝された生理的食塩水（TBS）の形態の100mM NaCl中に 投じ、かつペレット化した（Sorva11 RC5C遠心機；20,000rpm）。細胞 ペレットをpH7.5の50mM Tris中に再懸濁させ、Ultra-Tur-raxホモジナイザーを 用いてホモジネート化し、その後上記と同様にしてペレット化した。前記操作を 再度繰り返した後、細胞を（元の10cm培養皿１枚の細胞につき0.4mlの）TBS中に 再懸濁させた。放射性リガンド結合は、5〜15fmolの³H Rol5-1788結合部位を含 有する最終量0.1mlのTBS中で実現させた。氷上で１時間インキュベーション後、 膜を、Brandel細胞回収装置を用いてフィルター上に回収し、かつ低温のTBSで洗 浄し、結合した放射能をシンチレーション計数によって測定した。α₁β₁γ_2L型 組み換えレセプターは³HRo15-1788を高い親和性（Ｋ_D0.4nM）で結合させ、結合 レベルは10cm培養皿１枚の細胞当たり200fmolに達した。トランスフエクトしな かったLtk^-細胞や、培地にデキサメタゾンを添加せずに生じさせた集団Aの細胞 では結合がみられず、この事実によって³HRo15-1788はα₁β₁γ_2L型の組み換えG ABA_Aレセプターに結合することが確証された。³H Ro15-1788結合がフルニトラゼ パム、CL218872、FG8205、βCCM、ゾルピデム（zolpidem）及びRo15-4513によっ て阻害されたことから、上記組み換えレセプターのBZに関する薬理特性を確認し た。α、β及びγサブユニット を有するGABA_AレセプターのみがBZを結合させることが確定している（D．Pritch ett等，Nature 338，pp．582-585，1989）ので、集団Aの細胞が発現させるα₁β₁ γ_2L型組み換えGABA_Aレセプターの性質は上記諸データから確認される。 ｂ）電気生理的特性 集団Aの細胞が発現させたGABA_Aレセプターの性質を、全細胞パッチクランプを 用いる電気生理技術によって広範に解明した。デキサメタゾンの存在下での培養 によって生じた細胞のみがGABAへの応答を示した。GABAに対する濃度応答の曲線 からは、5.2のlogEC₅₀値と1.9のヒル係数とが得られた。GABAへの応答をBZのフ ルニトラゼパム及びCL218872によって、バルビツール酸のペントバルビトンによ って、並びにステロイドのアルファキサロン（alphaxa-lone）によって増強した 。GABAへの応答をビククリン（bi-cuculline）とピクロトキシンとの両方によっ て拮抗させた。これらの電気生理データは総て、集団Aの細胞が発現させた組み 換えGABA_Aレセプターが真正のGABA_Aレセプターに期待される全特性を有すること を確証している。実施例３ ヒトGABA_Aレセプターのα₂、α₃、α₅、α₆及びβ₂サブユ ニットをコードするcDNAの単離及び配列決定 ａ）cDNAライブラリー ヒト胎児大脳（α₂、α₃）、海馬（α₅、β₂）及び小脳（α₆）λバクテリオ ファージcDNAライブラリーからcDNAをクローン化した。上記cDNAライブラリーは いずれもλZAPベクターにおいて構築されたもので、Stratagene（San Diego，Ca lifornia）から購入した。スクリーニングのためにcDNAライブラリーを、製造者 の指示に従い137mm径プレート１枚当たり40,000pfuで平板培養した。プラーク（ filter lifts）を、製造者の指示に従いHybond Nフィルター（Amersham）を用い て採取した。 ｂ）ヒトα₂サブユニットをコードするcDNAの単離 ウシα₂cDNA（E．Barnard，“Molecular Neurobiology，”University of Cam bridge，Hills Road，Cambridge；Le-vitan等，Nature 335，p．76，1988から取 得）をランダムプライミングにより³²Pで高特異活性（＞１×10⁹cpm/μｇ）に標 識し、プローブとして用いた。ライブラリーフィルター（８レプリカフィルター ）を、５倍SSPE［１倍SSPEは0.18M NaCl、0.01M Na₃PO₄（pH7.4）、1mM EDTA］ 、５倍Denhardt溶液、100μg/mlサケ精子DNA、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（S DS）、 30％ホルムアミド中で42℃において３〜６時間プレハイブリダイズした。ハイブ リダイゼーション緩衝液１ml当たり0.5×10⁶〜１×10⁶cpmの³²P標識プローブを 含有させた上記と同じ緩衝液中で42℃において18時間、ハイブリダイゼーション を行なった。フィルターを55℃において５倍SSPE（15分ずつ２回）及び１倍SSPE （15分ずつ２回）で洗浄し、このフィルターをKodak XARフィルムに１〜３日間 露出した。陽性クローンを標準的な技術でプラーク精製し、Bluescriptプラスミ ド（Stratagene）を製造者の指示に従って“回収（rescue）”した。cDNAクロー ンをその両鎖に関して、Sequenase II酵素（United States Biochemicals）を用 いる標準的技術によって配列決定した。ヒトGABA_Aレセプターのα₂サブユニット をコードするcDNAのヌクレオチド配列を該配列に対応する推定アミノ酸配列と共 に、添付図面の第２図に示す。 ｃ）ヒトα₃サブユニットをコードするcDNAの単離 ウシα₃cDNA（E．Barnard，“Molecular Neurobiology，”University of Cam bridge，Hills Road，Cambridge；Le-vitan等，Nature 335，p．76，1988から取 得）をランダムプライミングにより³²Pで高特異活性に標識し、プローブとして 用いた。ライブラリーフィルターを５倍SSPE、５倍 Denhardt溶液、0.1％ SDS、100μg/mlサケ精子DNA中で55℃において３〜６時間 プレハイブリダイズし、かつ、プローブとして0.5×10⁶〜１×10⁶cpm/mlの³²P標 識ウシα₃cDNAを含有させた前記と同じ緩衝液中で55℃において18時間ハイブリ ダイズした。フィルターを先に述べたのと同様に洗浄し、X線フィルムに露出し た。cDNAクローンを先に述べたのと同様に回収し、かつ配列決定した。最長のα₃ cDNAクローンはコーディング領域の5′末端部の約100bpを欠いていた。この欠 失部は、プライマーとしてBluescriptベクターのT7プライマー配列に由来するオ リゴヌクレオチド“アンカー”プライマー （5′AGCGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAA3′）と、截頭（trun-cated）α₃cDNA の5′末端近傍の配列に由来する、内部にHpaＩ部位を有するオリゴヌクレオチド （5′CAGCATGAATTGTTAACCTCATTGTA3′）とを用いるPCRによって獲得した。上記 オリゴヌクレオチドはApplied Biosys-tems 380B合成装置で合成した。上記のよ うなPCRを行なって300bpのPCR生成物を得、これをHpaＩ及びKpnＩで二重消化し 、かつ同様に切断した截頭α₃cDNAに挿入してサブクローン化することにより、 完全長のヒトα₃cDNAを得た。 このcDNAを両鎖に関して、先に述べたのと同様に配列決定した。ヒトGABA_Aレセ プターのα₃サブユニットをコードするcDNAのヌクレオチド配列を該配列に対応 する推定アミノ酸配列と共に、添付図面の第３図に示す。 ｄ）ヒトα₅サブユニットをコードするcDNAの単離 ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって得たラットα₅cDNAをプローブとして用 いて、cDNAライブラリーをスクリーニングした。PCRのためのオリゴヌクレオチ ドプライマーの配列として、公表されているα₅cDNA配列（Khrestchatis-ky等，Neuron 3 ，p．745，1989）から、サブクローニングのためのHindIII部位を有す る 5′ATTATTCAAGCTTGCCATGGACAATGGAATGCTC3′（bp114〜148）及び 5′GGTTTCCAGCTTACTTTGGAGAGGTAGC3′（bp1507〜1535） を得た。PCRと、分析目的でのPCR生成物のBluescript SK^-ベクター（Stratagene ）中へのサブクローニングとは、鋳型としてラット大脳cDNAを用いた以外は他の 文献(Whiting等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87，p．9966，1990）に述べられ ているのと同様に行なった。ラットα₅cDNAを³²Pで標識し、これを用いてヒト海 馬cDNAライブラリーをスクリ ーニングし、陽性のα₅cDNAクローンを先にα₂cDNAに関して述べたのと同様に回 収し、かつ配列決定した。ヒトGABA_Aレセプターのα₅サブユニットをコードする cDNAのヌクレオチド配列を該配列に対応する推定アミノ酸配列と共に、添付図面 の第４図に示す。 ｅ）ヒトα₆サブユニットをコードするcDNAの単離 PCRによって得たラットα₆cDNAをプローブとして用いて、cDNAライブラリーを スクリーニングした。PCRは、公表されているラットα₆cDNA配列（Luddens等，N ature 346 ，p.648，1990）に由来する、サブクローニングのためのEcoRＩ部位を 有するオリゴヌクレオチドプライマー 5′GAGGAAGAATTCAGGAGGGTGACCT3′（bp48〜72）及び 5′GAAAATAACGAATTCCAGTGTCCAGCTTT3′（bp1376〜1404） を用いて、先にα₅cDNAに関して述べたのと同様に行なった。PCRによって単離し たラットα₆cDNAクローンを³²Pで標識し、これを用いてヒト小脳cDNAライブラリ ーを、先にα₂cDNAに関して述べたのと同様にスクリーニングした。陽性のα₆cD NAクローンを先に述べたのと同様に精製し、回収し、かつ配列決定した。いずれ のcDNAも完全なコーディング領域は有しなかった。完全長のcDNAを得るべく、好 ま しい制限部位を用いて３個のクローンを一つに結合した。ヒトGABA_Aレセプター のα₆サブユニットをコードするcDNAのヌクレオチド配列を該配列に対応する推 定アミノ酸配列と共に、添付図面の第５図に示す。 ｆ）ヒトβ₂サブユニットをコードするcDNAの単離 ヒトβ₂cDNAを、PCRによって得た短小型ヒトβ₂cDNAをプローブとして用いて 単離した。PCRは、公表されているラットβ₂cDNA配列（Ymer等，EMBO J．8，p． 1665，1989）に由来する、サブクローニングのためのEcoRＩ部位を有するオリゴ ヌクレオチドプライマー 5′CAAAAGAATTCAGCTGAGAAAGCTGCTAATGC3′（bp1088〜1119）及び 5′TCAGGCGAATTCTCTTTTGTGCCACATGTCGTTC3′（bp1331〜1364） を用いて、（鋳型としてヒト小脳cDNAライブラリーを用いた以外は）先に述べた のと同様に行なった。PCRによって得たヒトβ₂cDNAクローンを³²Pで放射性標識 し、これを用いてヒト海馬cDNAライブラリーを、先にα₂cDNAに関して述べたの と同様にスクリーニングした。得られた最長のcDNAクローンはβ₂サブユニット コーディング領域の5′末端部の500bpを欠いていた。この欠失部は、プライマー と してBluescriptベクターのT7プライマー配列に由来するオリゴヌクレオチド“ア ンカー”プライマー （5′AGCGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAA3′）と、截頭β₂cDNAの5′末端近傍の 配列に由来する、KpnＩ部位を有するオリゴヌクレオチド （5′CATCCAGTGGGTACCTCCTTAGGT3′）とを用いるPCRによって獲得した。上記の ようなPCRを行なって700bpのPCR生成物を得、これをKpnＩで消化し、かつ（やは りKpnＩで消化した）截頭cDNAクローンに挿入してサブクローン化することによ り、完全長のヒトβ₂cDNAを得た。ヒトGABA_Aレセプターのβ₂サブユニットをコ ードするcDNAのヌクレオチド配列を該配列に対応する推定アミノ酸配列と共に、 添付図面の第６図に示す。実施例４ ヒトGABA_Aレセプターのα₁β₃γ_2S、α₂β₃γ_2S及びα₅β₃γ_2Sのサブユニット の組み合わせを発現させる、安定にトランスフェクトされた細胞の調製 ヒトα₂及びα₅cDNAの単離法及び配列については実施例３に述べた。ヒトα₁c DNAの配列は以前、Schofield等によってFEBS Lett．244，p．361，1989に公表さ れた。この 配列はウシの配列と、１個のアミノ酸の位置でしか相違しない（ウシα₁の95位 のTrpがヒトα₁ではArg）。ヒトα₁cDNAを創出するべく、他の文献（K．Wafford 及びP．Whi-ting，FEBS Lett．313，pp．113-117，1992）に述べられている方法 を用いてウシの配列を、オリゴヌクレオチド 5′GCAATGAAAATCCGGACTGGCAT3′ による95位アミノ酸対応配列の部位特異的突然変異誘発処理（site directed mu tagenesis）によってヒトの配列に変換した。 ヒトγ₂cDNAの配列は、以前にPritchett等がNature 338，p．582，1989に公表 している。ヒトγ₂cDNAは、他の文献（Whiting等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87 ，pp．9966-9970，1990）に述べられている条件の下に鋳型としてのヒト海馬 cDNAライブラリーと、公表されているγ₂cDNA配列の5′側及び3′側非翻訳領域 に由来する、HindIII制限部位を有するオリゴヌクレオチドプライマー 5′GGGAGGGAAGCTTCTGCAACCAAGAGGC3′及び 5′ACCACATAGAAGCTTATTTAAGTGGAC3′ とを用いるPCRによって単離した。配列決定によって、用いたγ₂の形態は推定細 胞質ループ領域内の24bpの挿入配 列を欠く短小形態（γ_2S）（Whiting等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87，pp． 9966-9970，1990）であることが判明した。ヒトβ₃cDNAの配列はWagstaff等によ って、Am．J．Hum．Genet．41，pp．330-337，1991に公表されている。ヒトβ₃c DNAは、PCRを用いて得た、推定細胞質ループドメインをコードする短小型ヒトβ₃ cDNAプローブでヒト胎児大脳cDNAライブラリー（実施例３参照）をスクリーニ ングすることによって単離した。 ヒトα₁、α₂、α₅、β₃及びγ_2ScDNAを、標準的な技術（Maniatis等の“Mole cular Cloning：A Laboratory Manual，”Cold Spring Harbor Press，New York ，2nd edition，1989参照）を用いて真核発現ベクターpMSGneo（実施例１参照） に挿入してサブクローン化し、ヒトα₁β₃γ_2S型、α₂β₃γ_2S型及びα₅β₃γ_2S 型GABA_Aレセプターを発現させる安定な細胞系を実施例１に述べたようにして確 立した。実施例５ ヒトGABA_Aレセプターのα₁β₁γ_2S、α₁β₂γ_2S、α₃β₃γ_2S及びα₆β₆γ_2Sの サブユニットの組み合わせを発現させる、安定にトランスフェクトされた細胞の 調製 α₃及びα₆cDNAを実施例3に述べたように単離し、またα₁、β₃及びγ_2ScDNA を実施例4に述べたように単離した。ヒトβ₁サブユニットcDNAは、先に述べたヒ ト大脳cDNAからPCRによって単離した。PCRに用いたオリゴヌクレオチドプライマ ーは公表されているヒトβ₁cDNA配列（Schofield等，FEBS Lett．244，pp．361- 364，1989）の、サブクローニングのためのHindIII制限酵素部位を有する5′側 及び3′側非翻訳領域 5′TAATCAAGCTTAGTAATGTGGACAGTACAAAAT3′及び 5′AAATGGAAGCTTTAGAACAGACCTCAGTGTACA3′ に由来した。ヒトα₁、α₃、α₆、β₁、β₂、β₃及びγ_2ScDNAを、標準的な技術 （Maniatis等の“Molecular Clo-ning：A Laboratory Manual，”Cold Spring H arbor Press，New York，2nd edition，1989参照）を用いて真核発現ベクターpM SGneo（実施例１参照）に挿入してサブクローン化し、ヒトα₁β₁γ_2S型、α₁β₂ γ_2S型、α₃β₃γ_2S型及びα₆β₃γ_2S型GABA_Aレセプターを発現させる安定な細 胞系を実施例１に述べたようにして確立した。 【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：2310 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：298..1683 配列 配列番号：２ 配列の長さ：462 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号：３ 配列の長さ：1408 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：27..1385 配列 配列番号：４ 配列の長さ：453 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号：５ 配列の長さ：1866 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：225..1646 配列 配列番号：６ 配列の長さ：474 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号：７ 配列の長さ：2189 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：214..1566 配列 配列番号：８ 配列の長さ：451 配列の型：アミノ酸 卜ポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号：９ 配列の長さ：1638 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：87..1562 配列 配列番号：10 配列の長さ：492 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/566 8310−2Ｊ // Ｃ０７Ｋ 14/72 8318−4Ｈ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者 ホワイテイング，ポール・ジヨン イギリス国、エセツクス・シー・エム・ 20・２・キユー・アール、ハーロウ、イー ストウイツク・ロード、ターリングス・パ ーク、ニユーロサイエンス・リサーチ・セ ンター（番地なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．α₁β₃γ₂のサブユニットの組み合わせを含むヒトGABA_Aレセプターを発現さ せ得る、安定に同時トランスフェクトされた真核細胞系。 ２．α₂β₃γ₂のサブユニットの組み合わせを含むヒトGABA_Aレセプターを発現さ せ得る、安定に同時トランスフェクトされた真核細胞系。 ３．α₅β₃γ₂のサブユニットの組み合わせを含むヒトGABA_Aレセプターを発現さ せ得る、安定に同時トランスフェクトされた真核細胞系。 ４．α₁β₁γ_2Sのサブユニットの組み合わせを含むヒトGABA_Aレセプターを発現 させ得る、安定に同時トランスフェクトされた真核細胞系。 ５．α₁β₂γ₂のサブユニットの組み合わせを含むヒトGABA_Aレセプターを発現さ せ得る、安定に同時トランスフェクトされた真核細胞系。 ６．α₃β₃γ₂のサブユニットの組み合わせを含むヒトGABA_Aレセプターを発現さ せ得る、安定に同時トランスフェクトされた真核細胞系。 ７．α₆β₃γ₂のサブユニットの組み合わせを含むヒト GABA_Aレセプターを発現させ得る、安定に同時トランスフェクトされた真核細胞 系。 ８．請求項１から３のいずれか１項に記載の安定に同時トランスフェクトされた 真核細胞の培養物に由来するヒトGABA_Aレセプターのサブユニットの組み合わせ を含有する膜調製物。 ９．請求項４から７のいずれか１項に記載の安定に同時トランスフェクトされた 真核細胞の培養物に由来するヒトGABA_Aレセプターのサブユニットの組み合わせ を含有する膜調製物。 10．安定に同時トランスフェクトされたマウスLtk^-線維芽細胞から単離された、 α₁β₃γ_2S、α₂β₃γ_2Sまたはα₅β₃γ_2Sのサブユニットの組み合わせから成る ヒトGABA_Aレセプターを含有することを特徴とする請求項８に記載の調製物。 11．安定に同時トランスフェクトされたマウスLtk^-線維芽細胞から単離された、 α₁β₁γ_2S、α₁β₂γ_2S、α₃β₃γ_2Sまたはα₆β₃γ_2Sのサブユニットの組み合 わせから成るヒトGABA_Aレセプターを含有することを特徴とする請求項９に記載 の調製物。 12．請求項１から３のいずれか１項に記載の細胞系及び該細胞系に由来する膜調 製物の、ヒトGABA_Aレセプターに作用する薬物のスクリーニング及び設計での使 用。 13．請求項４から７のいずれか１項に記載の細胞系及び該細胞系に由来する膜調 製物の、ヒトGABA_Aレセプターに作用する薬物のスクリーニング及び設計での使 用。