DE60024231T2

DE60024231T2 - Polymorphismus im gen für die menschliche gaba a rezeptor alpha 6 untereinheit

Info

Publication number: DE60024231T2
Application number: DE60024231T
Authority: DE
Inventors: David Goldman; Nakao Iwata; Mark Shuckit
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1999-02-19
Filing date: 2000-02-18
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2020-02-19
Also published as: EP1153130B1; WO2000049151A3; ATE310820T1; AU3495900A; WO2000049151A2; ES2254157T3; DE60024231D1; EP1153130A2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf das Gebiet der Molekulargenetik. Spezifischer gesehen bezieht sich die Erfindung auf eine Polynukleotidsequenz, welche eine Variante der Untereinheit α6 des menschlichen GABA_A Neurotransmitterrezeptors kodiert, wobei die Sequenzvariante die Empfindlichkeit sowohl gegenüber von Benzodiazepinarzneimitteln als auch von Ethanol voraussagt.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Menschliche Vererbungsstudien, welche Zwillinge und adoptierte Personen verwenden, weisen darauf hin, dass Alkoholismus eine komplexe, krankhafte Störung mit einer genetischen Komponente darstellt. (Hesselbrock, "The Genetic Epidemiology of Alcoholism" in The Genetics of Alcoholism, herausgegeben von Begleiter H, Kissin B. New York, Oxford University Press, S. 17–39 (1995)). Die Söhne von Alkoholikern (SOAs = Sons of Alcoholics) stellen eine Gruppe mit einem hohen Risiko für die Entwicklung von Alkoholismus dar (Cloninger et al., Arch Gen Psychiatry 38: 861 (1981)), und so ist der Schwerpunkt zahlreicher Studien auf die subjektiven, psychomotorischen, physiologischen und biochemischen Antwortreaktionen auf Ethanol gelegt worden. (Schuckit, Alcohol Clin Exp Res 12: 465 (1988); Newlin et al., Psycho Bull 108: 383 (1990); Am J Psychiatry 149: 1534 (1992)). Diese Studien haben mehrere Unterschiede zwischen den SOAs und den männlichen Kontrollpersonen identifiziert, welche Anhaltspunkte liefern können zu der Grundlage eines erhöhten Risikos für einen sich entwickelnden Alkoholismus.
Einer der Unterschiede zwischen den SOAs und den männlichen Kontrollpersonen bezieht sich auf die unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber Benzodiazepinarzneimitteln (BZD = Benzodiazepine Drugs) als auch gegenüber von Ethanol. Spezifischer gesehen, hat sich bei den SOAs gezeigt, dass sie deutlich weniger empfindlich gegenüber BZD (Ciraulo et al., Am J Psychiatry 146: 1333 (1989); Cowley et al., Alcohol Clin Exp Res 16: 1057 (1992); Cowley et al., Alcohol Clin Exp Res 18: 324 (1994)) und gegenüber Ethanol (Schuckit et al., Arch Gen Psychiatry 53: 202 (1996)) sind, wenn man sie mit den männlichen Kontrollpersonen vergleicht. Die genetischen und neurobiologischen Mechanismen, auf denen diese verminderte Empfindlichkeit beruht, sind unklar, weil diese Arzneimittel vielfache Neurotransmittersysteme in dem zentralen Nervensystem beeinflussen. (CNS = Central Nervous System) (Deitrich et al, Pharmacol Rev 41: 489 (1989)).
γ-Aminobuttersäure (GABA) ist ein Neurotransmitterschlüsselinhibitor in dem CNS von Säugetieren. Die GABA Rezeptoren vom Untertyp A (GABA_A) sind Chloridkanäle, welche die Benzodiazepinarzneimittel spezifisch mit einer hohen Affinität binden (Luddens et al., Neuropharmacology 34: 245 (1995)), um einen Chloridionenzufluss zu ergeben. Die Molekularanalyse hat aufgedeckt, dass die GABA_A Rezeptorkanäle aus heterooligomeren Strukturen bestehen, welche aus mehreren unterschiedlichen Polypeptiduntereinheiten (α1–6, β1–3, γ1–3 und δ) zusammengesetzt sind. (Burt et al., FASEB J 5: 2916 (1991)).
Zwei Beweislinien haben den GABA_A Rezeptor in Verbindung gebracht mit einer differenzierten Empfindlichkeit gegenüber von Alkohol. Erstens zeigen die zerebellaren Membranen von "ANT" und "AT" Ratten eine differenzierte Affinität für BZD. (Uusi – Oukari et al., J. Neurochem 54: 1980 (1990)). Die gegenüber von Alkohol sensitiven d. h. empfindlichen ANT (Alcohol Non Tolerant) und die gegenüber von Alkohol nicht sensitiven d. h. unempfindlichen AT (Alcohol Tolerant) Linien von Ratten sind selektiv gezüchtet worden, um Unterschiede in der Empfindlichkeit gegenüber einer durch Ethanol induzierten motorischen Beeinträchtigung zu zeigen. Man glaubt, dass eine Aminosäuresubstitution Arg100Glu in dem GABA_A α6 Rezeptor zumindest teilweise für den Unterschied in der Alkoholempfindlichkeit verantwortlich ist, welcher diese zwei Rattenlinien kennzeichnet. Die gegenüber von Alkohol unempfindliche AT Linie trägt die Arg100 Form des Rezeptors und ist gegenüber Diazepam unempfindlich, wenn man sie mit dem Glu100 GABA_A α6 Rezeptor vergleicht. (Korpi et al., Nature 361: 356 (1993)).
In einer zweiten Beweislinie wird die GABA_A γ2 Untereinheit in Verbindung gebracht mit einer differenzierten Empfindlichkeit gegenüber einem akut verabreichten Alkohol bei den Linien von Mäusen mit einem langen Schlaf (LS = long sleep) und denjenigen mit einem kurzen Schlaf (SS = short sleep). (Wafford et al., Science 249: 291 (1990)). Eine in vitro Mutagenese und ein Expressionssystem, welches Xenopus Oocyten anwendet, wird eingesetzt, um zu beweisen, dass ein alternatives RNA Spleißen eines Bereiches in der GABA_A γ2L Untereinheit, welche eine Phosphorylierungsstelle der Consensus-Proteinkinase C (PKC) kodiert, kritisch ist für eine Modulation durch Ethanol. (Wafford et al., Neuron 7: 27 (1991); Wafford et al., FEBS Lett 313: 113 (192)). Es verbleibt ein deutlicher Bedarf nach einem besseren Verständnis der genetischen Grundlage für die differenzierte Empfindlichkeit der Menschen gegenüber von Benzodiazepinarzneimitteln und gegenüber von Alkohol.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Zusammensetzungen und Verfahren, welche auf einem Polymorphismus in demjenigen Gen beruhen, welches die α6 Untereinheit des GABA_A Neurotransmitterrezeptors des Menschen kodiert, werden offenbart. Dieser Polymorphismus resultiert in der Substitution eines Serinrestes für einen Prolinrest (d.h. Substitution eines Prolinrestes durch einen Serinrest), welcher normalerweise an der Aminosäureposition 385 der GABA_A α6 Polypeptidsequenz vorhanden ist. In einem ersten Satz von Experimenten zeigen wir, dass Patienten mit dem Pro385Ser Polymorphismus eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Diazepam zeigen, ein nach dem Stand der Technik bekanntes Benzodiazepinarzneimittel, um die Antwortreaktion einer Person auf Ethanol nachzuahmen, wenn man sie mit Patienten vergleicht, welche den Prolinrest an der Aminosäureposition 385 aufweisen. Man hat herausgefunden, dass der Pro385Ser Polymorphismus mit einer geringeren Veränderung der Augenbewegungszunahme bei kontinuierlicher Folgebewegung verbunden ist, nachdem intravenös Diazepam den Kindern von Alkoholikern (COAs = children of alcoholics) verabreicht worden ist. In einem zweiten Satz von Experimenten zeigen wir, dass Patienten mit dem Pro385Ser Polymorphismus eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Ethanol zeigen, wenn man sie mit Patienten vergleicht, welche den Prolinrest an der Aminosäureposition 385 aufweisen. Daher ist der Polymorphismus mit einer verminderten Empfindlichkeit gegenüber Ethanol und gegenüber Benzodiazepinarzneimitteln verbunden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wir haben in diesem Rahmen zwei genetische Unterschiede oder "Polymorphismen" entdeckt, welche in der Gensequenz auftreten, welche die α6 Untereinheit des menschlichen GABA_A Neurotransmitterrezeptors kodiert. In der am stärksten vorherrschenden Form der α6 Untereinheit des menschlichen GABA_A Neurotransmitterrezeptors ist ein Prolinrest an der Aminosäureposition 385 vorhanden, welcher durch die von Hadingham et al., Mol Pharmacol 49(2): 253–259 (1996) gelieferte Sequenz gegeben ist. Diese Form des Proteins der α6 Rezeptoruntereinheit oder die Form des das Protein der α6 Rezeptoruntereinheit kodierenden Polynukleotids mit einem Prolinrest an der Aminosäureposition 385 wird durchgehend durch diese Offenbarung hindurch als "Pro385" bezeichnet.
Im Rahmen dieser Erfindung haben wir einen ersten Polymorphismus entdeckt, welcher als "Pro385Ser" oder "Ser385" bezeichnet wird, in der α6 Untereinheit des menschlichen GABA_A Neurotransmitterrezeptors. Diese Form der α6 Untereinheit des menschlichen GABA_A Neurotransmitterrezeptors ist durch eine Substitution eines Serinrestes anstelle des Prolinrestes gekennzeichnet, welcher unter normalen Umständen an der Aminosäureposition 385 vorhanden ist. In einigen Zusammenhängen bezieht sich der Ausdruck "Pro385Ser" oder "Ser385" auf einen Polymorphismus in einem Polynukleotid, welches ein α6 Protein kodiert (in welchem Fall der Polymorphismus den Codon für die Aminosäureposition 385 des α6 kodierenden Polynukleotids betrifft) oder auf das α6 Protein selbst (in welchem Fall der Polymorphismus die Aminosäureposition 385 der α6 Polypeptidsequenz betrifft, die durch Hadingham et al., Mol Pharmacol 49(2): 253–259 (1996) angegeben worden ist). In anderen Zusammenhängen bezieht sich der Ausdruck Pro385Ser oder Ser385 auf einen Polymorphismus in einem Polynukleotid, welches ein Fragment eines α6 Proteins kodiert (in welchem Fall der Polymorphismus den Codon für die Aminosäureposition 385 des das α6 Fragment kodierenden Polynukleotids betrifft) oder auf ein Fragment des α6 Proteins selbst (in welchem Fall der Polymorphismus die Aminosäureposition 385 der α6 Polypeptidsequenz betrifft, die durch Hadingham et al., Mol Pharmacol 49(2): 253–259 (1996) angegeben worden ist). Der Pro385Ser Polymorphismus kann auch bezeichnet werden als GABRA6 12360>T, um die einzige Nukleotidveränderung an der Position 1236 anzuzeigen, welche sich auf die Substitution des Serinaminosäurerestes anstelle des Prolinaminosäurerestes an der Aminosäureposition 385 bezieht.
Wir haben auch einen zweiten Polymorphismus entdeckt, welcher G1031C genannt wird, aber diese Nukleotidveränderung hat die die Aminosäuresequenz des α6 Rezeptors nicht verändert. Der G1031C Polymorphismus kann auch als GABRA6 1031G>C bezeichnet werden.
Der Pro385Ser Polymorphismus tritt innerhalb eines Abschnitts der α6 Untereinheit des menschlichen GABA_A Neurotransmitterrezeptors auf, welcher dem zweiten intrazellularen Bereich des Rezeptors in der Nähe einer mutmaßlichen Proteinkinase C Phosphorylierungsstelle entspricht. Unter dem Ausdruck "ein Abschnitt der α6 Untereinheit des menschlichen GABA_A Neurotransmitterrezeptors" ist ein Segment der α6 Polypeptidsequenz gemeint, welches mindestens 50–100 Aminosäuren aufweist, stärker bevorzugt mindestens 20 aneinander angrenzende Aminosäuren und sogar noch stärker bevorzugt mindestens 3, 6 oder 10 aneinander angrenzende Aminosäuren. Der Pro385Ser Polymorphismus zeigt eine seltene Allelfrequenz von 0,08, wohingegen der G1031C Polymorphismus eine seltene Allelfrequenz von 0,47 zeigt. Unter "Allel" oder "allelischer Variante" sind die natürlichen Polynukleotidsequenzen gemeint, welche den bei den Menschen vorhandenen Polymorphismen entsprechen.
In der folgenden Offenbarung zeigen wir zuerst, dass Patienten mit dem Pro385Ser Polymorphismus eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Diazepam zeigen, ein nach dem Stand der Technik bekanntes Benzodiazepinarzneimittel zum Nachahmen der Antwortreaktion einer Person auf Ethanol, wenn man dieselbe mit Patienten vergleicht, welche den Prolinrest an der Aminosäureposition 385 aufweisen. Man hat herausgefunden, dass der Pro385Ser Polymorphismus mit einer geringeren Veränderung bei der gleichmäßigen Steigerung der Folgebewegung des Auges verbunden ist, nachdem den Kindern von Alkoholikern (COAs = children of alcoholics) Diazepam intravenös verabreicht worden ist. Im Gegensatz dazu steht der G1031C Polymorphismus nicht in einer Korrelation mit der Empfindlichkeit gegenüber Diazepam. Zweitens zeigen wir, dass Patienten mit dem Pro385Ser Polymorphismus eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Ethanol zeigen, wenn man sie mit Patienten vergleicht, welche den Prolinrest an der Aminosäureposition 385 aufweisen.
Biologische Werkzeuge, Therapien und Verfahren für die Anwendung des eben gesagten werden geliefert. Weiterhin werden Ausführungsformen bereitgestellt, welche Diagnosen oder diagnostische Testausrüstungen zum Einsatz bringen, welche besonders nützlich für die schnelle Identifizierung des Pro385Ser Polymorphismus sind und daher für die Bestimmung der relativen Empfindlichkeit gegenüber einem BZD Arzneimittel oder gegenüber Ethanol bei einer Einzelperson mit einem besonderen Genotyp. In dem unten stehenden Abschnitt werden wir die Entdeckung des Pro385Ser Polymorphismus bis in weiter reichende Einzelheiten diskutieren.
Genetische Polymorphismen bei der GABA_A-Rezeptor-α6-Untereinheit
Diejenigen, welche Experten auf diesem Gebiet sind, werden erkennen, dass die unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber Benzodiazepinarzneimitteln einen nützlichen Indikator darstellt für Unterschiede in dem Gehirn, welche mit einer Veränderung des Verhaltens in Korrelation stehen, einschließlich einer Empfänglichkeit gegenüber Alkoholismus. Bei Ratten zum Beispiel hat eine Veränderung der Empfindlichkeit gegenüber Alkohol und gegenüber Benzodiazepin mit einer vererbbaren Variante des GABA_A α6 Rezeptors korreliert. In deutlicher Weise haben Antwortreaktionen auf die Aufgaben bezüglich der Folgebewegung der Augen, welche als Sakkadesteigerung, als Spitzengeschwindigkeit der Sakkade, als gleichmäßige Steigerung der Folgebewegung gemessen werden können, dann auch gezeigt, dass sie innerhalb und zwischen den Testsitzungen zuverlässig und reproduzierbar sind und dass sie objektive, quantifizierbare Messungen darstellen, welche von einem BZD in einer von der Dosis abhängigen Art und Weise beeinflusst werden. (Roy – Byrne et al., Psychopharmacology 110: 85–91 (1993); Roy – Byrne et al., Biol Psychiatry 38: 92 (1995)). Dementsprechend stellt in den unten beschriebenen Verfahren das Testen der Augenbewegung ein geeignetes Mittel dar zur Überwachung der Empfindlichkeit gegenüber BZD und Ethanol bei menschlichen Personen.
Auf der Grundlage der Erkenntnis, dass die SOAs eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber BZD zeigen, und auf Grund der Tatsache, dass bei jüngeren genetischen Studien die GABA_A Rezeptoren mit in die Antwortreaktionen auf die BZD und auf den Alkoholismus hineingezogen werden, haben wir zuerst untersucht, ob Polymorphismen bei der GABA_A α6 Untereinheit des Gens mit Unterschieden bei der Empfindlichkeit gegenüber BZD bei Kindern von Alkoholikern in Verbindung stehen. Die während der Entwicklung der Erfindung angewandten Verfahren bestehen darin, eine Korrelation zwischen der BZD Empfindlichkeit und dem Genotyp zu erstellen. Spezifischer gesehen implizieren die Verfahren eine Bewertung der Empfindlichkeit gegenüber Diazepam bei den COAs, und zwar unter Einsatz von Aufgaben mit Bewegung der zwei Augen: die Spitzengeschwindigkeit der Sakkade und die durchschnittliche, gleichmäßige Steigerung der Folgebewegung. Eine genetische Variation innerhalb des das GABA_A α6 Rezeptorgen kodierenden Bereiches wird bei 56 Kindern bewertet, die nicht miteinander verwandte COAs sind, und zwar über den Weg des Verfahrens des Einzelstrang Konformationspolymorphismus. Eine Assoziationsanalyse unter Verwendung einer Ser385 Substitution, die synonyme Variante G1031C und GABA_A α6 Haplotyp wird durchgeführt, wobei die gleichmäßige Steigerung der Folgebewegung und die Spitzengeschwindigkeit der Sakkade als abhängige Variablen fungieren. Wie unten angegeben wird, korreliert der Ser385 Genotyp mit der kleineren durch Diazepam induzierten Beeinträchtigung bei der durchschnittlichen, gleichmäßigen Steigerung der Folgebewegung (t = 1.954, df = 53, p = 0,04), aber nicht mit der Spitzengeschwindigkeit der Sakkade. Der synonyme G1031C Polymorphismus steht nicht in Verbindung mit den veränderten Diazepamwirkungen bei den Bewegungsaufgaben der beiden Augen.
Die in den hierin beschriebenen Studien implizierten Personen sind 26 nicht miteinander verwandte Söhne und 30 Töchter von unter Alkoholismus leidenden Vätern. Alle Personen sind Kaukasier. Das Alter der Personen reicht von 18–25 Jahre. Psychiatrische Störungen werden durch die DSM-III-R Kriterien diagnostiziert und zwar unter Verwendung des Strukturierten Klinischen Interviews für DSM-III-R (SCID = Structural Clinical Interview for DSM-III-R). (Spitzer et al., Structural Clinical Interview for DSM-III-R Patients Edition (SCID-P, 9/1/89 Version), New York, Biometrics Research Departement New York Psychiatric Institute, (1989)). Der Proband und mindestens ein Verwandter des ersten Grades werden interviewt mit dem sog. Family Informant Schedule and Criteria (Erfassungsbogen und Kriterien für die Familieninformation). (Manuzza et al., Family Informant Schedule and Criteria (FISC) Anxiety Disorders Clinic, New York, New York Psychiatric Institute, (1985), eine erweiterte Version der Family History – Research Diagnostic Criteria (Andreasen et al., Arch Gen Psychiatry 43: 421 (1986)) und mit dem Family History Assessment Module von der SSAGA, ein strukturiertes diagnostisches Interview, welches in der Collaborative Study on the Genetics of Alcoholism verwendet wird. (Buchholz et al., J Stud Alcohol 55: 149 (1994)).
Die oben beschriebenen Modalitäten versetzen uns in die Lage eine Diagnose zu bestätigen bezüglich der Abhängigkeit vom Alkohol des Vaters, wie viele andere Verwandte vom ersten und vom zweiten Grad betroffen sind, und des Aufbaus einer Familiengeschichte über andere psychiatrische Störungen. Die COAs sind im Verlauf ihres ganzen Lebens frei geblieben von DSM-III-R AxisI oder AxisII psychiatrischen Störungen oder aus dem Verzehr von Drogen resultierenden Störungen, mit Ausnahme von Anpassungsstörungen und sie haben keine Geschichte einer antisozialen Persönlichkeitsstörung aufzuweisen. Alle COAs sind medizinisch gesund und entsprechend ihrem Bericht haben sie während einer Zeitdauer von mindestens einem Monat kein Medikament zu sich genommen, noch haben nicht mehr als einmal Benzodiazepin zu sich genommen. Bei allen Personen blieben die Urintestdurchsuchungen nach Drogen negativ, genauso wie eine normale Glutamyltransferase und ein normales mittleres Korpuskularvolumen. Das Beispiel 1 beschreibt die Verfahren, welche verwendet werden, um die BZD Empfindlichkeit bei menschlichen Subjekten in größeren Einzelheiten zu messen. In dem unten stehenden Abschnitt beschreiben wir die Beziehung der Empfindlichkeit gegenüber Diazepam bei den Pro385 und Ser385 Polymorphismen.
Empfindlichkeit gegenüber Diazepam und der Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Genotyp
Anfänglich werden die Sakkadengeschwindigkeit der Augenbewegung und die gleichmäßige Steigerung der Folgebewegung des Auges bei den 56 getesteten COAs gemessen. Zwei Messungen von Grundbezugslinien werden für eine jede Variable aufgenommen und es wird daraus der Durchschnitt gebildet. Die Unterschiede bei dieser Grundbezugslinie werden dann bewertet zu festgesetzten Zeitpunkten nach einer jeden von vier Diazepamdosen. Die Datenpunkte werden dazu verwendet, um durch eine trapezförmige Technik die integrierte Fläche unter der resultierenden Kurve zu bestimmen. Die Fläche unter der Kurve für die abhängige Variable wird dann durch die Fläche unter der Kurve für die Plasmadiazepamgrade geteilt, um eine Korrektur für eine individuelle Variabilität bei den Diazepamgraden vorzunehmen. Die Verhältnisse der Flächen unter den Kurven für die COAs mit dem Ser385 homozygoten Genotypen und mit dem Pro/Ser heterozygoten Genotypen werden dann durch einen t-Test miteinander verglichen. Es gibt keine Ser/Ser Homozygoten bei der Testpopulation der COAs. Für den G1031C Genotyp wird ein Einweg ANOVA für die Bewertung der Beziehung verwendet.
Die Genotypen an einer jeden Stelle werden auch hinsichtlich des Hardy – Weinberg Gleichgewichtes mit Hilfe des ,Fisher's Exact Test' getestet. Eine Methode der maximalen Wahrscheinlichkeit (maximum likelihood) wird verwendet, um die Haplotypfrequenzen bei den Doppelheterozygoten abzuschätzen. (Hill, Heredity 33: 229 (1974); Weir, Genetic data analysis II, Sunderland, MA, Sinauer Associates (1996)). Die Haplotypfrequenzen von einzelnen Heterozygoten werden durch ein direktes Zählen bestimmt. Das normalisierte Verbindungsungleichgewicht (Δ) und das Verbindungsungleichgewicht (D) werden unter Verwendung dieser Haplotypfrequenzen berechnet.
Die polymorphe Variation in dem GABA_A α6 Kodierungsbereich von den 56, nicht miteinander verwandten COAs wird dann bestätigt, unter Verwendung von SSCP, gefolgt von einer DNA Sequenzierung. (Siehe Beispiel 2). Die zwei relativ reichlich vorhandenen Polymorphismen, welche in dem α6 Kodierungsbereich identifiziert werden, sind in der Tabelle 2 dargestellt (Tabelle 2 kann weiter unten in dem Beispiel 2 gefunden werden). Ein Übergang von Thymidin zu Cytosin an dem Nukleotid 1236 der Kodierungssequenz wird identifiziert und der Übergang führt zu einer Substitution eines Prolinrestes durch einen Serinrest am Codon 385. Der Polymorphismus wird bezeichnet mit "Pro385Ser" oder "GABRA6 1236C>T". Der zweite identifizierte Polymorphismus ist eine stumme G zu C Substitution am Nukleotid 1031 und sie wird mit "G1031C" oder "GABRA6 1031G>C" bezeichnet. So wie in der angehängten Sequenzauflistung dargestellt, ist die Pro385 Sequenz gegeben durch SEQ ID No: 11 und die Ser385 Sequenz ist gegeben durch SEQ ID No: 12. Die G1031C GABA_A α6 Sequenz ist durch SEQ ID No: 13 gegeben, während die C1031C Sequenz durch SEQ ID No: 14 gegeben ist.
PCR-RFLP Versuchstests werden auch verwendet, um eine schnelle Bestimmung des Genotyps auf der Grundlage der GABA_A α6 Polymorphismen zu erleichtern. (Siehe Beispiel 2). Alle Personen, für welche der Genotyp durch die SSCP Analyse und durch PCR-ΡFLP bestimmt worden ist, haben identische Ergebnisse ausgewiesen. Die Frequenzen der selteneren Pro385Ser und 1031C Allele bei den COAs betragen jeweils 0,08 und 0,47. Die Verteilungen beider Genotypen sind konsistent mit den Erwartungen, welche auf den Schätzungen des Hardy – Weinberg Gleichgewichtes beruhen. Der Grad des Verbindungsungleichgewichts zwischen Pro385Ser und G1031C ist deutlich (Δ = 1,00, D = 0,0401, χ² = 10,8, d.f. = 1, p < 0,0005).
Eine Beziehung zwischen dem Ser385 Genotyp und einer durchschnittlichen, gleichmäßigen Steigerung der Folgebewegung der Augen infolge einer intravenösen Verabreichung von Diazepam wird beobachtet (t = 1,952, df = 53, p = 0,04). (Siehe Tabelle 3). Die COAs mit dem Pro385Ser Allel zeigen eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Diazepam relativ zu einer Gruppe, die aus COAs mit dem Pro385 Genotyp besteht. Unter "verminderter Empfindlichkeit" ist ein Grad der Empfindlichkeit gemeint, welcher niedriger liegt als der Grad der Empfindlichkeit, welcher Einzelpersonen kennzeichnet, die den Pro385 Genotyp aufweisen. Das Pro385Ser Allel steht jedoch nicht in Beziehung mit der Spitzengeschwindigkeit der Sakkade der Augenbewegung (t = 0,171, df = 52, p = 0,865). Weiterhin hat man keine Beziehung gefunden zwischen dem synonymen G1031C Polymorphismus und irgendeiner von den zwei Aufgaben der Augenbewegung. Die Anzahl der bei den zwei Analysen verwendeten Versuchspersonen ist unterschiedlich, weil eine Einzelperson so empfindlich gegenüber Diazepam gewesen ist, dass Daten für eine Sakkadengeschwindigkeit nicht bei der höchsten Dosierung von Diazepam aufgenommen werden konnten. Tabelle 3 Beziehung zwischen der Empfindlichkeit gegenüber Diazepam und den Ser385 und G1031C Genotypen bei den COAs

^a t-Test t-Wert = 1,952, df = 53, p = 0,04 * multipliziert mit dem Faktor 1000

Als Nächstes versuchen wir, die polymorphen Varianten des GABA_A α6 Rezeptors bei den COAs, spezifisch bei dem Ser385 Genotyp, mit den Unterschieden bei der Sakkadengeschwindigkeit der Augenbewegung und bei der gleichmäßige Steigerung der Folgebewegung der Augen bei den COAs in Korrelation zu versetzen, vor und nach der Verabreichung von Diazepam, wie in dem nachfolgenden Abschnitt dargelegt wird.
Pro385Ser Polymorphismus und Unempfindlichkeit gegenüber Benzodiazepin/Ethanol
Unter den 13 Untereinheiten, welche die GABA_A/BZD Rezeptorkomplexe bei Säugetieren umfassen, ist die α6 Untereinheit einzigartig in ihrer Pharmakologie der Unempfindlichkeit gegen den Benzodiazepinagonist und in ihrer beschränkten Verteilung. (Burt et al., FASEB J 5: 2916 (1991)). Die GABA_A α6 Expression zum Beispiel ist auf zerebellare Körnerzellen beschränkt. (Luddens et al., Neuropharmacology 34: 245 (1995); Luddens et al., Nature 346: 648 (1990)). Bei dem oben diskutierten Verfahren zur Bestimmung des Genotyps haben wir gefunden, dass der Grad der Antwortreaktion auf Alkohol bei den Menschen mit dem GABA_A α6 Genotyp korreliert. Diese Entdeckung ist der erste Hinweis darauf, dass ein Unterschied bei der menschlichen Diazepamantwort und damit bei der Ethanolantwort von einer natürlich auftretenden Variante bei einer Untereinheit des GABA_A Rezeptors herrühren kann. Obwohl wir nicht auf irgendeinen besonderen Mechanismus begrenzt werden möchten und obwohl wir das Folgende nur zum Zwecke der Erklärung anbieten, so glauben wir, dass die Diazepambindung an den α6 Ser385 Rezeptor die GABA_A Ströme moduliert, was zu Unterschieden bei der gleichmäßigen Steigerung der Folgebewegung des Auges führt, welche man zwischen Personen mit dem Pro385 Genotyp beobachtet.
Wir beobachten keine Beziehung zwischen dem Ser385 Genotyp und der sakkadischen Augenbewegung. Sakkadische Augenbewegungen betreffen sowohl den Parietalcortex, den Frontcortex und die mit den Basalganglien in Beziehung stehenden Verbindungen als auch den oberen Colliculus und schließlich die vormotorischen Flächen im Pons. (Henn et al., Rev Neurol 145: 540 (1989)). Die Folgebewegungen der Augen, welche mit dem Pro385Ser im Zusammenhang stehen, werden vorwiegend durch vielfache Kortikalbereiche und durch das Cerebellum vermittelt. (Leigh et al., The Neurology of Eye Movement, 2 ed. Philadelphia, F. A. Davis Co., 1991). Daher liefert die Sakkadengeschwindigkeit und die gleichmäßige Steigerung der Folgebewegung ein Maß für die BZD Wirkungen in dem Gehirnstamm bzw. in dem Cortex/Cerebellum. Es ist beachtenswert, dass die Beziehung der Pro385Ser zu den Folgebewegungen der Augen, aber nicht zu den Sakkadenbewegungen, der beschränkten Expression der GABA_A α6 zu dem Cerebellum entspricht.
Wir haben auch keine Beziehung zwischen G1031C und der Diazepamempfindlichkeit herausgefunden und dies trotz der Tatsache, dass Pro385Ser und G1031C sich in einem starken Verbindungsungleichgewicht befinden. Obwohl das Verbindungsungleichgewicht zwischen den zwei Stellen stark ist, können die Unterschiede in den Allelfrequenzen zwischen den zwei Stellen den Mangel einer Beziehung mit der reichlicher vorhandenen G1031C synonymen Variante erklären.
Pro385Ser wird in den GABA_A α6 Rezeptoren von Ratten und Mäusen aufbewahrt (Luddens et al., Nature 346: 648 (1990)) (Kato, J Mol Biol 214: 619 (1990)). Der Ser385 Aminosäurerest befindet sich in dem zweiten intrazellularen Bereich des Rezeptors und in einem Bereich werden 10 Aminosäurereste von einer Consensus Phosphorylierungsstelle für PKC entfernt. (Luddens et al., Nature 346: 648 (1990)). Einige glauben, dass der Bereich zu der Spezifizierung des Untertyps und zu den intrazellularen Regulationsmechanismen beitragen kann. (Olsen et al., FASEB J 4: 1469 (1990)). Bis zu der vorliegenden Offenbarung ist eine Funktion für diese Aminosäure und für diesen Bereich nicht bestätigt worden.
Unter Bezugnahme auf die GABA_A γ2L Untereinheit ist es von Interesse, dass eine alternativ gespleißte Variante von γ2, welche zusätzliche noch acht Aminosäuren enthält, eine Consensus Stelle bzw. Anordnung für eine Phosphorylierung durch PKC trägt. (Whiting et al., Proc Natl Acad Sci USA 87: 9966 (1990). Eine anordnungsspezifische Mutagenese der alternativ gespleißten Sequenz weist darauf hin, dass die γ2L Untereinheit phosphoryliert werden muss, um eine Empfindlichkeit gegenüber Ethanol zu verleihen. (Wafford et al., Neuron 7: 27 (1991); Wafford et al., FEBS Lett 313: 113 (1992)). Obwohl wir uns auf irgendeinen besonderen Mechanismus begrenzen möchten und obwohl wir das was nun folgt lediglich zum Zwecke der Erklärung anbieten, so geht unsere Spekulation doch dahin, dass eine ähnliche Rolle für diesen Bereich der α6 Untereinheit die Pro385Ser Variante dazu befähigen könnte, die Empfindlichkeit des Rezeptors gegenüber Ethanol und BZD zu verändern.
Nachdem bestimmt worden ist, dass Individuen mit dem Pro385Ser Polymorphismus eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Benzodiazepinarzneimitteln zeigen, wenn man sie mit Patienten mit dem Pro385 Polymorphismus vergleicht, haben wir verifiziert, dass Individuen mit dem Pro385Ser Polymorphismus auch eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Ethanol zeigen, wenn man sie mit Patienten mit dem Polymorphismus vom Wildtyp vergleicht. Diese Ergebnisse werden in dem folgenden Abschnitt beschrieben.
Individuen mit dem Pro385Ser Polymorphismus zeigen eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Ethanol
Alkoholmissbrauch und Abhängigkeit (Alkoholismus) sind komplexe Störungen, welche den Anschein erwecken, dass sie mehrere genetische Einflüsse widerspiegeln, welche zusammen 40% bis 60% der Risikovarianz erklären könnten. (Kendler et al., Arch Gen Psychiatry 54: 178–184 (1997); Pickins et al., Arch Gen Psychiatry 48: 19–28 (1991)). Ein niedriges Niveau der Antwortreaktion (level of response = LR) gegenüber Alkohol erscheint ein Weg zu sein, durch welchen eine Verletzbarkeit vermittelt wird. Sogar nach der Kontrolle nach anderen Einflüssen erscheint es so zu sein, dass das Antwortniveau LR offenbar sowohl genetisch beeinflusst wird als auch mit einem erhöhten Risiko für eine Alkoholabhängigkeit in Verbindung steht. Schuckit und Smith, Arch Gen Psychiatry 53: 202–210 (1996)). Man hat herausgefunden, dass bei den Menschen das LR bei jungen, trinkenden, aber nicht alkoholischen, nach der Familiengeschichte positiven (family history positive = FHP) Individuen mit einer höheren Häufigkeit auftritt (Pollock Arch J Psychiatry 149: 1534–1538 (1991); Schuckit und Smith 1996; Newlin und Thomson Psycho Bull 108: 383–402 (1990)), während identische bzw. eineiige Zwillinge hinsichtlich des LR Wertes ähnlicher sind als dizygote bzw. zweieiige Zwillinge. Drei nachfolgende Beobachtungen von Personen mit Alkoholherausforderungen haben höhere Raten von Alkoholismus, Alkoholaufnahme oder Problemen für Individuen mit einem niedrigen LR Wert hervor gebracht. (Rodriguez et al., Alcohol Clin Exp Res 17: 155–161 (1993); Schuckit und Smith (1996); Volovka et al Arch Gen Psychiatry 53: 258–263 (1996)). Zusätzlich hat unsere Gruppe berichtet über eine Korrelation für LR von einem Niveau 0,3 bei einem sich über zwei Generationen hinweg erstreckenden Personenkreis. Tierstudien unterstützen die Behauptung, dass genetische Einflüsse sich auf das LR auswirken (Crabble et al. J. Pharmacol Exp Ther 277: 624–632 (1996)), und in einigen Studien hat man bemerkt, dass Nagetiere mit einem niedrigen LR höhere Mengen an Alkohol verzehren (Gill et al., Alcohol Clin Exp Res 21: 106A (1997); Li et al., Behavior Genetics 23: 163–170 (1993)).
Als ein Teil einer größeren Studie werden 41 Männer, etwa 39 Jahre alt, ausgewählt unter den ersten 113, die eine 15 Jahre dauernde Folgestudie (follow-ups) abgeschlossen haben, für eine Aufschluss gebende Prospektionsstudie. Die Bestimmung des Genotyps wird selektiv durchgeführt aus der ersten Gruppe von nacheinander festgestellten Söhnen von Alkoholikern und Kontrollen aus einer Population heraus, die eventuell einen größeren Populationsbestand als einen Teil aus einer fortlaufenden Studie darstellt. Siebzehn Personen, deren niedriges Antwortniveau gegenüber Ethanol (LR) im Alter von 20 Jahren in dem unteren Drittel liegt, werden hinsichtlich von fünf Polymorphismen von vier Genen mit 24 Menschen verglichen, deren Reaktionen gegenüber dem Alkohol über dem Mittelwert liegen. Man hat vierzehn Männer mit dem LL Genotyp des Serotonin Transporter (5-HTT) Polymorphismus und sieben Männer mit dem Ser385 Genotyp des GABA_A (α6) Polymorphismus gefunden, welche niedrigere LR Ergebnisse in einem Alter von etwa 20 Jahren gezeigt haben und welche deutlich einem größeren Risiko von Alkoholismus ausgesetzt sind als die anderen Genotypen für diese Stellen. Alle vier Personen mit kombinierten LL und Ser385 Genotypen haben Alkoholismus entwickelt und zeigen gesamt gesehen die geringsten LR Ergebnisse. Es gibt keinen Beweis dafür, dass zwei Polymorphismen des 5-HT_2A Rezeptorgens und einer des 5-HT_2C Rezeptorgens bei dieser Auswahl zu dem LR oder zu dem Alkoholismus in Beziehung stehen.
Für diese Pilotstudie werden Blutproben genommen von den ersten 41 geeigneten aufeinander folgenden Männern unter den ersten 113, die eine 15 Jahre dauernde Follow-up-Studie abgeschlossen haben. Um Personen zu identifizieren, welche einen deutlich niedrigen LR Wert aufweisen, werden die Männer ausgewählt, um die zwei Pole von dem LR darzustellen. Diese Männer umfassen die ersten 17 Personen, die nach ihrer ursprünglichen Alkoholherausforderung im Alter von etwa 20 Jahren einen LR Wert von insgesamt in dem untersten Drittel zeigen, und die 24 Personen, deren Intensitäten der Reaktion auf Alkohol über dem Mittelwert liegen (hoher LR Wert). Die Alkoholherausforderungen bewerten Veränderungen von der Grundnormallinie bezüglich eines subjektiven Gefühls einer Intoxikation, der Standsicherheit und der Hormone nach dem Trinken von 0,75 ml/kg von Ethanol. (Schuckit und Gold, Arch Gen Psychiatry 45: 211–216 (1986)). Der gesamte LR Wert wird bewertet als die Veränderung von der Grundnormallinie (vor dem Alkohol) bis zu dem Zeitpunkt eines Spitzenwertes bei der Blutalkoholkonzentration (BAC = blood alcohol concentration) (60 Minutenwerte), welche auf den Konsum von Alkohol folgt.
Vorher, etwa 10 Jahre nach dem anfänglichen Testen, sind alle 453 ursprünglichen Personen ausfindig gemacht worden und 450 (99,3%) sind erfolgreich bewertet worden (Schuckit und Smith 1996). Die laufenden Pilotdaten sind als Teil der fortlaufenden 15 Jahre dauernden Folgestudie derselben Auswahl gesammelt worden. Zur Bestimmung des Genotyps ist Blut zum Zeitpunkt des Interviews bei 15 Jahren entnommen worden und Analysen sind blind durchgeführt worden gegenüber der Klassifikation des Phänotyps der Personen. Fünf Polymorphismen werden nach ihrem Genotyp aus der Genom DNA bestimmt, welche aus den lymphoblastoiden Zellenlinien wie folgt hergestellt worden sind. Für 5HT_2A T102C und His452Tyr werden unter Verwendung von anderswo beschriebenen Verfahren Polymorphismen bestimmt durch PCR und Restriktionsenzymtests (Ozaki et al., Biol Psychiatry 40: 1267–1272 (1996)). 5HT2c Cys23Ser wird nach dem Genotyp bestimmt, indem man eine künstliche Restriktionsstelle erzeugt unter Verwendung eines PCR Primers, welcher eine Basissubstitution in der Nähe zu dem Codon von Interesse einführt (Haliassos et al., Nucleic Acids Res. 17: 3606 (1989)), und für 5HTTLPR wird eine DNA Amplifikation d. h. Vermehrung durchgeführt unter Verwendung der zwei flankierenden Primer, welche von Heils et al. verwendet worden sind (J. Neurochem 66: 2621–2624 (1996)). Dieser Satz von Primern amplifiziert ein 484 oder 528 bp (bp = base pairs = Basenpaare) Fragment entsprechend zu dem 5HTTLPR kurzen oder langen Allel. Der Ser385 Polymorphismus wird nach dem Genotyp bestimmt unter Verwendung der Primer GABA_A α6 9f und GABA_A α6 9b: 5'CTG ACT CCA AAT ATC ATC TG3' (SEQ ID NO. 9) und 5'GAG AAG CAT CTA CAC AAG TG3' (SEQ ID NO. 10). Eine Amplifikation mit diesem Satz von Primern führt zu einem 367 bp PCR Produkt, welches eine FokI Restriktionsstelle enthält.
Die Genotypen für einen jeden der fünf Polymorphismen werden bewertet gegenüber den drei abhängigen Variablen, welche in der Tabelle 4 geliefert werden, mit Diagnosen, welche auf den Kriterien des Third Revised Diagnostic and Statistical Manual (DSM-III-R) der American Psychiatric Association (1987) beruhen. Die Unterschiede über zwei oder drei Genotypen hinweg, welche an einer jeden Stelle verfügbar sind, werden bewertet entweder durch ANOVA oder den Student's t-Test für kontinuierliche Variablen und durch den chi-Quadrat (χ²) Test mit der Yaters' Berichtigung für kategorielle Daten.
Die 41 für einen niedrigen und einen hohen LR Wert ausgewählten Männer sind ähnlich in ihrem Alter (etwa 39 Jahre), in ihrem ehelichen Status (etwa 73% verheiratet) und in ihrer Erziehung (nur 5% verfügten über keine Collegeausbildung). Konsistent mit vorherigen Berichten (Schuckit und Smith 1996) ist es bei den Personen mit dem niedrigen LR deutlich wahrscheinlicher, während der 15 Jahre dauernden Folgestudie als alkoholabhängig diagnostiziert zu werden (64,7% gegenüber 8,3%, χ² = 14,6, df = 1, p < 0,002). Es gibt keine deutlichen Unterschiede bei der nach eigenem Bericht bestehenden Abstammung von einer ethnischen Gruppe (χ² = 7,16, df = 5, p = 0,21) und alle Personen sind Kaukasier.
Die Tabelle 4 stellt den Genotyp dar nach Merkmalanalysen für den Genlocus eines jeden Kandidaten. Für den 5-HTT Polymorphismus werden deutlich niedrigere LR Punktwerte beobachtet bei dem Alter von 20 Jahren für die 14 Personen mit dem LL Genotyp (p = 0,04). Konsistent mit diesen Beobachtungen ist es bei den Personen mit dem LL Genotyp deutlich wahrscheinlicher, dass sie die Kriterien für Alkoholmissbrauch oder für Alkoholabhängigkeit irgendwann während der 15 Jahre der Folgestudie erfüllen (p = 0,4), aber es gibt keine Unterschiede quer über die Gruppen hinweg hinsichtlich des Anteils von Alkoholikern im Verwandtenkreis. Wegen einer Wahrscheinlichkeit dafür, dass das 5-HTT S Allel in einer dominanten Art und Weise wirken könnte (Heils et al J Neurochem 66: 2621–2624 (1996)), werden die kombinierten SL und SS Genotypgruppen mit der LL Gruppe verglichen, wobei die Ergebnisse einen erhöhten und statistisch signifikativen Unterschied von dem Mittelwert LR (0,89 ± 1,00 gegenüber 0,16 ± 0,75, t = 2,64, df = 39, p = 0,01) und von dem Anteil mit einer Alkoholdiagnose (57,1% gegenüber 18,5%, χ² = 6,35, df = 1, p = 0,02) unterstützen. Obwohl es in der Tabelle nicht gezeigt ist, auf Grund der Überlappung mit dem mittleren LR Punktwert, so haben wir den Anteil der Personen bewertet, deren LR Wert in das unterste Drittel fällt, für die Vergleichbarkeit mit früheren Publikationen. Dieser Anteil ist auch deutlich höher für die LL Gruppe (71,4% LL, 31,6% SL und 12,5% SS; χ² = 8,7, df = 2, p = 0,02).
Es werden Beziehungen des GABA_Aα6 Genotyps sowohl zu LR als auch zum Alkoholismus beobachtet. Hier ist es für Pro/Ser ungleicherbige (heterozygote) Individuen wahrscheinlicher als für Pro385 gleicherbige (homozygote) Individuen, ein Alkoholiker zu sein (p = 0,02) und sie zeigen auch Tendenzen für einen niedrigeren LR Punktwert (p = 0,06) und einen höheren Anteil an FHPs (p = 0,07). Obwohl es in der Tabelle 4 nicht gezeigt wird, ist es für diejenigen mit Ser385 wahrscheinlicher, bei einer Antwortreaktion auf den Alkohol in dem untersten Drittel zu sein (71,4% gegenüber 35,3%, χ² = 3,12, df = 1, p = 0,08). Vergleiche quer über die Genotypen hinweg für die 5-HT_T102C, 5-HT_2Atyr His452tyr und 5-HT_2C Cys23Ser Polymorphismen zeigen weder eine Beziehung der Genotypen zu LR Punktwerten noch zu Alkoholismusdiagnosen.
Es wird auch eine Analyse durchgeführt, welche die Information kombiniert, welche die 5-HTT und GABA_Aα6 Polymorphismen berücksichtigt. Die vier Männer mit einer Kombination beider Genotypen, sowohl von dem LL 5-HTT als auch von dem Ser385 GABA_A α6 Genotyp (diejenigen zwei, welche am engsten mit einem niedrigen LR und mit Alkoholismus verbunden sind), haben das niedrigste LR im Alter von 20 Jahren (1,29 ± 0,53 gegenüber 0,74 ± 1,13 für LL/PP, 0,59 ± 1,11 für SL/PS, 0,13 ± 0,88 für SL/PP und 0,03 ± 0,45 für SS/PP – Test für den linearen Trend t = 2,86, df = 4, p < 0,007). Alle diese vier Personen fallen in das unterste Drittel von dem LR, alle sind Alkoholiker und alle haben eine FHP. Auf dem anderen Extrem weisen die acht Männer, welche sowohl den SS 5-HTT als auch den Pro385 GABA_A Rezeptor Genotyp tragen (die zwei Genotypen, welche mit den höchsten LR Punktwerten und mit einem nicht alkoholischen Zustand verbunden sind) den höchsten LR Punktwert insgesamt auf, und sie sind diejenigen mit der geringsten Wahrscheinlichkeit, ein Alkoholiker zu sein. Es gibt keinen Beweis für eine Wechselwirkung zwischen dem 5-HTT und dem GABA_Aα6 Genotyp (F(1,36) = 0,01, p = 0,92). So wie es bei der Einzelstellenanalyse wahr ist, so erreichen diese Zweistellenergebnisse sogar höhere Niveaus an statistischer Signifikanz, wenn alle Personen mit mindestens einer Kopie des dominanten S Allels in einer Gruppe kombiniert werden.
Die obige Analyse zeigt den deutlichen Beziehungszusammenhang zu LR und zu dem Alkoholismus an zwei Stellen, bei der Variante des 5-HTTLPR Serotonin Transporters und bei der GABA_A α6 Aminosäuresubstitution Ser385. Die Beweiskraft, welche die Bedeutung des GABA_A Rezeptorsystems in Bezug auf die Wirkungen des Alkohols und auf die Entwicklung von Alkoholismus unterstützt, ist spärlich. Die obigen Ergebnisse verifizieren, dass der Pro385 Polymorphismus ein Indikator für LR und für einen zukünftigen Alkoholismus ist. Weiterhin weist die obige Offenbarung deutlich daraufhin, dass die Bestimmung des Genotyps der menschlichen α6 Untereinheit des GABA_A Rezeptorgens nützlich für die Vorhersage ist, ob ein Individuum eine besondere Empfindlichkeit gegenüber Ethanol und/oder gegenüber Benzodiazepinarzneimitteln zeigen wird.
Vorhandensein von weiteren Polymorphismen, die mit BZD und einer Ethanol-Unempfindlichkeit assoziiert sind
Die Experten auf diesem Gebiet werden erkennen, dass eine direkte Genanalyse unter Verwendung der SSCP Technik nicht empfindlich genug sein kann, um alle möglichen Sequenzvarianten des GABA_A α6 Rezeptorgens nachzuweisen. Angesichts der Tatsache, dass 40% der Kodierungssequenz des GABA_A α6 Rezeptorgens in dieser Studie nicht abgesucht worden sind, ist es möglich, dass unbekannte Varianten entweder in der Kodierungssequenz oder in dem Promotergebiet des α6 Gens sich in einem Verbindungsungleichgewicht mit den hierin beschriebenen Pro385Ser und G1031C Varianten befinden. Im Lichte dessen, was herausgefunden und oben dargestellt worden ist und der Offenbarung, die noch folgt, würde die Entdeckung von weiteren GABA_Aα6 Rezeptor Polymorphismen, welche mit einer Empfindlichkeit gegenüber Ethanol und Benzodiazepinarzneimitteln verbunden sind, eine Routine darstellen. Ohne Berücksichtigung des besonderen Polymorphismus, welcher als eine Markierung einer genetisch bestimmten Empfindlichkeit gegenüber von Ethanol und den Benzodiazepinarzneimitteln verwendet wird, weisen die gefundenen Untersuchungsergebnisse darauf hin, dass die Verfahren, welche auf der α6 Genotypbestimmung beim Menschen beruhen, eine Veranlagung einer Empfindlichkeit gegenüber Benzodiazepin/Ethanol bestimmen können. Der Abschnitt unten beschreibt viele Ansätze, welche dazu verwendet werden können, mehr von den Polymorphismen in dem GABA_A α6 Rezeptorgen zu identifizieren, welche zu einer Unempfindlichkeit gegenüber BZD und Ethanol führen.
Kennzeichnung von Pro385Ser durch eine Computeranalyse
Eine vorläufige Computeranalyse deckt auf, dass der Pro385Ser Polymorphismus in dem zweiten intrazellularen Bereich des Rezeptors in der Nähe einer vermeintlichen Phosphorylierungsstelle der Proteinkinase C auftritt. Homologierecherchen von Nukleinsäure- und Proteindatenbanken unter Verwendung einer Software, die den Experten auf diesem Gebiet bekannt ist, können andere Transmembranproteine mit einem ähnlichen Motiv aufdecken und sie können ein größeres Verständnis dafür liefern, wie der Pro385Ser Polymorphismus sich auf die Unempfindlichkeit gegenüber BZD/Ethanol bezieht. Weiterhin können durch den Einsatz herkömmlicher Ansätze der Proteinmodellierung und durch Verfahren eines vernünftigen Entwurfs von Arzneimitteln Modelle der dreidimensionalen Struktur von Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 erzielt werden und es können Stoffe identifiziert werden, welche mit Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 in Wechselwirkung treten oder Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 umgehen. Die Beispiele 3–6 offenbaren einige Ausführungen von Software und Hardware und sie liefern Computerrechenverfahren, welche dazu verwendet werden können, um die Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Nukleinsäure- und Polypeptidsequenzen noch deutlicher zu kennzeichnen und um Arzneimittel zu entwickeln, welche mit Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Rezeptoren in Wechselwirkung treten.
Aspekte der Erfindung enthalten auch rekombinante Vektoren, Sonden und Primer, welche die Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Sequenz umfassen. Die unten stehende Diskussion beschreibt Ausführungsformen mit Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Nukleinsäuren.
Verwendung von Nukleinsäuren, welche Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 oder Teile derselben kodieren
Die Sequenz des Pro385 und des Ser385 GABA_A α6 wird geliefert in der Sequenzauflistung (SEQ. ID No. 11 und 12). Sequenzen von dem Wildtyp und/oder der Mutante Pro385 oder den Ser385 GABA_A α6 Sequenzen, ihre funktionalen Äquivalente oder Fragmente von diesen Sequenzen von mindestens sechs Nukleotiden in der Länge, welche Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 kodieren, können gemäß den Ausführungen der Erfindung verwendet werden. Vorzugsweise enthalten die Ausführungsformen der Nukleinsäuren mindestens 12, 15 oder 17 aufeinander folgende Nukleotide von der erweiterten cDNA (oder des Genom DNAs, die man daraus erhalten kann). Stärker bevorzugt enthalten die Ausführungsformen der Nukleinsäuren mindestens 20–30 aufeinander folgende Nukleotide von der erweiterten cDNA (oder den Genom DNAs, die man daraus erhalten kann). In einigen Fällen enthalten die Ausführungsformen der Nukleinsäuren mehr als 30 Nukleotide von den Nukleinsäuren, welche Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 oder Teile derselben kodieren. In anderen Fällen enthalten die Nukleinsäureausführungen mindestens 40, mindestens 50, mindestens 75, mindestens 100, mindestens 150 oder mindestens 200 aufeinander folgende Nukleotide von den Nukleinsäuren, welche Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 oder Teile derselben kodieren. Die Nukleinsäuren, welche in SEQ. ID No. 9–10 gelistet sind, sind zum Beispiel wünschenswerte Ausführungen. Untersequenzen, welche hybridisierbare Teile der Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Sequenz enthalten, finden zum Beispiel Verwendung bei Versuchen der Nukleotidsäurehybridisierung, Southern und Northern Blot Analyse usw., so wie dies unten beschrieben wird.
Einige Ausführungen umfassen rekombinante Nukleinsäuren mit allen oder mit einem Teil der Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Gene. Eine rekombinante Bauart kann zu einer autonomen Replikation in einer Wirtszelle in der Lage sein. Alternativ kann eine rekombinante Bauart in die chromosomale DNA der Wirtszelle integriert werden. Solch ein rekombinantes Polynukleotid umfasst ein Polynukleotid eines Genoms oder cDNA, von halbsynthetischem oder von synthetischem Ursprung, dies auf Grund einer menschlichen Manipulation. Daher werden durch die Ausführungen dieser Erfindung rekombinante Nukleinsäuren geliefert, welche Sequenzen enthalten, welche anderweitig sonst auf natürliche Weise nicht vorkommen. Obwohl Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 so eingesetzt werden kann wie es in der Natur erscheint, wird es oft verändert werden, z.B. durch Deletion, Substitution oder Insertion und es wird durch eine Sequenz begleitet werden, die in dem Menschen nicht vorhanden ist.
Die Nukleotidsäuresequenz, welche in der Sequenzliste (SEQ. ID No. 12) dargestellt worden ist, kann durch Mutation geändert werden, etwa durch Substitution, Addition oder Deletion, was Sequenzen liefert, die funktional äquivalente Moleküle kodieren. Gemäß einer Ausführung ist ein Molekül funktional äquivalent oder aktiv, verglichen mit einem Molekül, das die in der SEQ. ID No: 11 oder 12 dargestellte Sequenz aufweist, wenn es über die Fähigkeit verfügt, eine Unempfindlichkeit gegenüber Ethanol/BZD zu verleihen. Auf Grund der Entartung der die Nukleotide kodierenden Sequenzen können bei einigen Ausführungen der vorliegenden Erfindung andere DNA Sequenzen verwendet werden, welche im Wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz kodieren, wie diejenige die aus der Sequenzliste (SEQ. ID No. 11 oder 12) abgeleitet wird. Diese enthalten, sind aber nicht darauf beschränkt, Nukleinsäuresequenzen, welche alle oder Teile der Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Gene enthalten, welche verändert worden sind durch die Substitution von verschiedenen Codons, welche einen funktional äquivalenten Aminosäurerest innerhalb der Sequenz kodieren und damit eine stille Veränderung erzeugen.
Zusätzlich können rekombinante, Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 kodierende Nukleinsäuresequenzen gemäß der Erfindung technisch so gebaut werden, um die Verarbeitung oder die Expression von Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 zu modifizieren. Zum Beispiel, und dies nicht als Begrenzung, kann das Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Gen kombiniert werden mit einer Promotersequenz und/oder einer Ribosomenbindungsstelle, oder eine Signalsequenz kann aufwärts von den Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 kodierenden Sequenzen eingefügt werden, um eine Sekretion von Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 zu ermöglichen und dadurch ein Ernten oder eine Bioverfügbarkeit zu ermöglichen. Zusätzlich kann eine gegebene Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Nukleinsäure in vitro oder in vivo mutiert werden, um Translations-, Initiations- und/oder Terminalsequenzen zu erzeugen und/oder zu zerstören, oder um Variationen in den Kodierungsbereichen zu erzeugen und/oder neue Restriktionsstellen zu bilden oder um vorher bereits bestehende zu zerstören, oder um eine weitere in vitro Modifikation zu erleichtern. Jede nach dem Stand der Technik auf diesem Gebiet bekannte Technik der Mutagenese kann verwendet werden, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, die in vitro ortsspezifische Mutagenese (Hutchinson et al., J. Biol. Chem. 253: 6551 (1978)).
Unter Verwendung der in der Sequenzliste (SEQ. ID No. 12) offenbarten Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Nukleinsäuresequenzen können Sonden entworfen und durch eine Oligonukleotidsynthese hergestellt werden und es können cDNA oder Genombibliotheken durchsucht werden, um so natürliche Quellen der Nukleinsäureausführungen und Homologe derselben zu isolieren. Alternativ können solche Nukleinsäuren durch eine Amplifikation von Sequenzen, welche sich in der genomischen DNA oder in anderen natürlichen Quellen befinden, mittels PCR geliefert werden. Das Beispiel 7 beschreibt die Herstellung von PCR Primern und die Amplifikation von Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 DNA.
Die Nukleinsäuren der Erfindung können auch als Reagenzien in Isolationsverfahren und als diagnostische Tests verwendet werden. Zum Beispiel können die Sequenzen aus den Nukleinsäuren, welche Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 oder Teile derselben kodieren, nachweisbar gekennzeichnet und als Sonden verwendet werden, um andere Sequenzen zu isolieren, welche zu einer Hybridisierung gegenüber denselben fähig sind. Zusätzlich können Sequenzen aus den Nukleinsäuren, welche Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 oder Teile derselben kodieren, verwendet werden, um PCR Primer durch herkömmliche Methoden der Oligonukleotidsynthese herzustellen für die Verwendung in Isolationsverfahren und bei diagnostischen Verfahren. Die folgende Diskussion beschreibt einige der Expressionskonstrukte und der Proteinausführungen gemäß der Erfindung.
Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Peptide und ihre Expression
Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Proteine oder Fragmente oder Derivate derselben enthalten, ohne aber darauf beschränkt zu sein, diejenigen, welche als eine primäre Aminosäuresequenz die Gesamtheit oder einen Teil der Aminosäuresequenz enthalten, im Wesentlichen so wie sie aus der Sequenz abgeleitet ist, welche in SEQ. ID No. 11 oder 12 aufgelistet ist, einschließlich veränderter Sequenzen, in denen funktional äquivalente Aminosäurereste substituiert sind für Reste innerhalb der Sequenz, was zu einer stillen Veränderung führt. Dementsprechend können eine oder mehrere Aminosäurereste innerhalb der Sequenz durch eine andere Aminosäure einer ähnlichen Polarität substituiert werden, welche als ein funktionales Äquivalent wirkt, was zu einer stillen Veränderung führt. Die Substitute für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz können ausgewählt werden aus anderen Mitgliedern der Klasse, zu welcher die Aminosäure gehört. Zum Beispiel enthalten die nicht polaren (hydrophoben) Aminosäuren so Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Die polaren, neutralen Aminosäuren umfassen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren umfassen Arginin, Lysin und Histidin. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren umfassen Asparaginsäure und Glutaminsäure. Unter anderen Gesichtspunkten der Erfindung werden Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Proteine oder Fragmente oder Derivate derselben in Betracht gezogen, welche differenziert während oder nach einer Translation modifiziert werden, z.B. durch eine Phosphorylierung, Glykosylierung, Vernetzung, Acylation, proteolytische Spaltung, Verbindung zu einem Antikörpermolekül, Membranmolekül oder zu einem anderen Liganden. (Ferguson et al., Ann. Rev. Biochem. 57: 285–320 (1988)).
Bei einer Ausführungsform betrachten die Erfinder Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 oder einen Teil derselben in einer Zellenlinie. Weiterhin visieren die Erfinder eine Isolierung oder eine Reinigung eines Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Proteins an. Beispiel 8 liefert mehrere Ansätze, um das Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Protein oder Fragmente desselben zu synthetisieren, zu exprimieren und zu isolieren oder zu reinigen. Der Ausdruck "isoliert" erfordert, dass das Material von seiner ursprünglichen Umgebung (z.B. die natürliche Umgebung und Umwelt, wenn es in der Natur vorkommt) entfernt wird. Zum Beispiel ist eine natürlich vorkommende Nukleinsäure oder ein natürlich vorkommendes Protein, innerhalb einer lebenden Zelle vorkommend, nicht isoliert, aber dieselbe Nukleinsäure oder dasselbe Protein wird dann, wenn es von einigen oder von den gesamten koexistierenden Materialien in dem natürlichen System getrennt ist, isoliert sein. Gemäß dieser Definition sind Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Nukleinsäure oder Protein oder die Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Nukleinsäure- oder Polypeptidfragmente, welche in einem Zellenlysat vorhanden sind, "isoliert". Der Ausdruck "gereinigt" erfordert keine absolute Reinheit; der Begriff dient eher dem Zweck einer relativen Definition. Zum Beispiel werden rekombinante Nukleinsäuren und Proteine routinemäßig bis auf eine elektrophoretische Homogenität gereinigt, so wie man dies durch eine Ethidiumbromidfärbung oder durch eine Coomassiefärbung feststellt, und sie sind bei mehreren Tests geeignet, obwohl Verunreinigungen vorhanden sind. Das Beispiel 8 liefert mehrere Ansätze, um das Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Protein oder Fragmente desselben zu synthetisieren, zu exprimieren und zu isolieren oder zu reinigen. Im Anschluss an die Synthese oder Expression und Reinigung der Proteine, die durch die Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Nukleinsäure oder ein Teil derselben kodiert sind, können die gereinigten Proteine verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, so wie dies in dem folgenden Abschnitt beschrieben wird.
Herstellung eines Antikörpers zu einem Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Polypeptid
Die betrachteten Antikörper haben viele Verwendungen, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, biotechnologische Anwendungen, therapeutische/prophylaktische Anwendungen und diagnostische Anwendungen. Während Antikörper, die dazu fähig sind, das Protein von Interesse spezifisch zu erkennen, erzeugt werden können, indem synthetische 15-mer Peptide mit einer Sequenz, welche durch das Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Gen oder einen Teil desselben kodiert ist, verwendet werden durch ein Einspritzen der synthetischen Peptide in Mäuse, um einen Antikörper zu erzeugen, kann ein vielfältigerer Satz von Antikörpern erzeugt werden, indem ein rekombinantes oder gereinigtes Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Protein oder Fragmente desselben verwendet werden, wie dies in dem Beispiel 9 beschrieben wird. Die folgende Diskussion beschreibt mehrere diagnostische Ausführungen der Erfindung.
Diagnostische Ausführungsformen
Im Allgemeinen können die Diagnostik und die Verfahren der Verwendung derselben entsprechend danach klassifiziert werden, ob die Diagnostik das Vorhandensein einer Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Nukleinsäure in einer Probe oder ein Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Protein in einer Probe nachweist. Entsprechend gibt der Nachweis der Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Nukleinsäure und/oder des Proteins in einer biologischen Probe einen Hinweis auf eine Prädilektion zu einer Unempfindlichkeit gegenüber BZD/Ethanol. Zusätzlich wird die Herstellung von Testausrüstungen in Betracht gezogen, welche die in den folgenden Ausführungen beschriebenen Reagenzien und Verfahren enthalten, um so den schnellen Nachweis des Pro385 Polymorphismus zu ermöglichen. Die diagnostischen Testausrüstungen können eine Nukleinsäuresonde oder einen Antikörper enthalten, welcher zum Beispiel den Pro385 Polymorphismus spezifisch nachweist, oder der beides nachweisen kann, sowohl den Wildtyp als auch eine Mutante. Die Nachweiskomponente wird typischerweise in Kombination mit einem oder mit mehreren der folgenden Reagenzien geliefert. Oft wird ein Substrat geliefert, welches in der Lage ist DNA, RNA oder ein Protein zu absorbieren oder anderweitig zu binden. Verfügbare Substrate für diesen Zweck enthalten Membranen aus Nitrozellulose, Nylon oder aus derivatisiertem Nylon, welche dadurch gekennzeichnet werden können, dass sie eine Anordnung von positiv geladenen Substituenten tragen. Die Testausrüstung kann mit einem oder mit mehreren Restriktionsenzymen ausgestattet sein, etwa mit FokI, genau so wie mit nicht menschlichen Polynukleotide wie die DNA von Kalbsthymus oder von Lachssperma.
Auf Nukleinsäuren beruhende diagnostische Techniken enthalten, ohne aber darauf beschränkt zu sein, eine fluoreszente in situ Hybridisierung (FISH), eine direkte DNA Sequenzierung, eine PFGE Analyse, eine Southern Blot Analyse, eine Einzelstrang Konformationsanalyse (SSCA = single strand conformation analysis), einen RNase Schutzversuch, eine Dot Blot Analyse und PCR. Der Ausgangspunkt für diese Analysen ist eine isolierte oder gereinigte DNA aus einem biologischen Muster. Am einfachsten wird Blut aus der Person entnommen, die getestet werden soll, und dann wird DNA aus den nukleierten Zellen in dem Blut extrahiert. In einigen Fällen können Primer, welche den Bereichen des Pro385Ser entsprechen, mit PCR verwendet werden, um diese DNA zu amplifizieren, so dass sie leichter in diagnostischen Anwendungen nachgewiesen werden kann.
Mehrere Verfahren können verwendet werden, um den Pro385Ser Polymorphismus in einer biologischen Probe nachzuweisen. Eine direkte DNA Sequenzierung, entweder ein manuelles Sequenzieren oder ein automatisiertes Fluoreszenz Sequenzieren, kann eine Sequenzvariation nachweisen. Ein anderer Ansatz ist der auf einem einzelnen Strang beruhende Test des Konformationspolymorphismus (SSCPA = single strand conformation polymorphismus assay) (Orita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2776–2770 (1989)), wie oben dargelegt. Dieses Verfahren macht jedoch nicht alle Sequenzveränderungen ausfindig, insbesondere dann nicht, wenn die DNA Fragmentgröße größer als 200 Basenpaare ist, aber das Verfahren kann optimiert werden, um den größten Teil der DNA Sequenzvariation nachzuweisen. Die verminderte Nachweisempfindlichkeit ist ein Nachteil, aber der erhöhte Durchsatz, welcher mit SSCPA möglich ist, macht den Versuch zu einer attraktiven, lebensfähigen Alternative zu der direkten Sequenzierung beim Nachweis einer Mutation. Die Fragmente, welche auf SSCPA Gelen eine veränderte Beweglichkeit aufweisen, werden dann sequenziert, um die exakte Natur der DNA Sequenzvariation zu bestimmen. Andere Ansätze, welche auf dem Nachweis von Fehlpaarungen zwischen den zwei komplementären DNA Strängen beruhen, umfassen die eingespannte denaturierende Gelelektrophorese (CDGE) (Sheffield et al., Am. J. Hum. Gener. 49: 699–706 (1991)), die Heteroduplexanalyse (HA) (White et al., Genomics 12: 301–306 (1992)), und die chemische Fehlpassspaltung (CMC = chemical mismatch cleavage) (Grompe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5855–5892 (1989)). Eine Übersicht über die gegenwärtig verfügbaren Verfahren zum Nachweisen einer DNA Sequenzvariation können in einem kürzlich erschienenen Übersichtsartikel von Grompe gefunden werden, Nature Genetics 5: 111–117 (1993).
Eine schnelle vorläufige Analyse zum Nachweisen von Polymorphismus und DNA Sequenzen, kann durchgeführt werden, indem man sich eine Reihe von Southern Blots eines DNA Schnitts mit einem oder mit mehreren Restriktionsenzymen anschaut, vorzugsweise mit einer großen Anzahl von Restriktionsenzymen. Jeder Block enthält Pfade von DNA von nicht infizierten Individuen und diejenige DNA, welche getestet werden soll. Southern Blots, welche hybridisierende Fragmente zeigen, wenn sie mit Sequenzen sondiert werden, welche dem Pro385Ser entsprechen, weisen auf das Vorhandensein des Genotyps hin, der mit der Unempfindlichkeit gegenüber BZD/Ethanol assoziiert ist. Ein Nachweis von Punktmutationen kann ebenfalls durchgeführt werden durch eine Amplifikation der DNA direkt aus der Probe, indem man Primer, welche den Bereichen des Pro385Ser entsprechen, mit Hilfe von standardisierten PCR Techniken verwendet. Die DANN Sequenz der amplifizierten Sequenzen kann dann bestimmt werden.
Es gibt sechs gut bekannte Verfahren zur Bestätigung des Vorhandenseins von Pro385Ser: 1) die Einzelstrang – Konformationsanalyse (SSCA) (Orita etal.); 2) die denaturierende Gradienten Gelelektrophorese (DGGE) (Wartell et al., Nucl. Acids Res. 18: 2699–2705 (1990), Sheffield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 232–236 (1989)), 3) die RNase – Schutzversuche (Finkelnstein et al., Genomics 7: 167–172 (1990), Kinszler et al., Science 251: 1366–1370 (1991)); 4) die Verwendung von Proteinen, welche Fehlpaarungen von Nukleotiden erkennen, wie etwa das E. Coli mutS Protein (Modrich, Ann. Rev. Gener. 25: 229–253 (1991); und das Allel – spezifische PCR Verfahren (Rano und Kidd, Nucl. Acids Res. 17: 8392 (1989)). Für das Allel – spezifische PCR Verfahren werden Primer verwendet, welche an ihren 3' Enden zu der Ser385 GABA_A α6 Mutation hybridisieren. Wenn die besondere Ser385 Mutation nicht vorhanden ist, dann kann ein Amplifikationsprodukt nicht beobachtet werden. Das System der amplifizierungsresistenten Mutation (ARMS) kann ebenfalls verwendet werden, so wie dies in der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung Nr. 0332435 und von Newton et al., Nucl. Acids Res. 17: 2503–2516 (1989)) offenbart worden ist.
Bei den ersten Verfahren (SSCA, DGGE und RNase Schutzversuch) erscheint ein neues Elektrophoreseband. SSCA weist ein Band nach, welches unterschiedlich wandert, weil der Sequenzwechsel einen Unterschied in der intramolekularen Basenpaarung des Einzelstranges verursacht. Der RNase Schutzversuch impliziert eine Spaltung der Mutante des Polynukleotids in zwei oder mehr kleinere Fragmente mit ein. DGGE macht Unterschiede ausfindig in den Wanderungsgeschwindigkeiten der Sequenzen, im Vergleich zu denjenigen der Sequenzen vom Wildtyp, indem ein denaturierendes Gradientengel eingesetzt wird. In einem Allel – spezifischen Oligonukleotidversuch (ASOs) (Conner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 278–282 (1983)) wird ein Oligonukleotid entworfen, welches eine spezifische Sequenz nachweist, und ein Versuch wird durchgeführt durch den Nachweis des Vorhandenseins oder der Abwesenheit eines Hybridisierungssignals. In dem mutS Versuch bindet das Protein nur an die Sequenzen, welche eine Nukleotidfehlpaarung in einem Heteroduplex zwischen der Mutante und den Sequenzen vom Wildtyp enthalten.
Fehlpaarungen sind, gemäß der vorliegenden Erfindung, hybridisierte Nukleinsäureduplexe, in denen die zwei Stränge nicht 100% komplementär sind. Ein Mangel an totaler Homologie kann zurückzuführen sein auf Deletionen, Insertionen, Inversionen oder Substitutionen. Ein Nachweis der Fehlpaarung kann dazu verwendet werden, um Punktmutationen in dem Gen oder in dessen mRNA Produkt nachzuweisen. Obwohl diese Techniken weniger empfindlich sind als das Sequenzieren, so sind sie doch bei einer großen Anzahl von biologischen Proben einfacher durchzuführen.
Ein Beispiel einer Technik zur Spaltung einer Fehlpaarung ist das RNase Schutzverfahren. In der Praxis impliziert das Verfahren die Verwendung einer gekennzeichneten Ribosonde bzw. RNA-Sonde, welche komplementär zu der das Ser385 Gen kodierenden Sequenz ist. Die Ribosonde und entweder die aus dem biologischen Muster isolierte mRNA oder DNA werden zusammen erwärmt (hybridisiert) und nachfolgend zersetzt mit Hilfe des Enzyms RNase A, welches in der Lage ist, einige Fehlpaarungen in einer Duplexstruktur von RNase nachzuweisen. Wenn eine Fehlpaarung durch RNase A nachgewiesen wird, dann spaltet sie sich an der Stelle der Fehlpaarung. Daher, wenn die erwärmte RNA auf einer Matrix eines Elektrophoresegels getrennt wird und wenn eine Fehlpaarung durch RNase A nachgewiesen und gespalten worden ist, dann wird ein RNA Produkt zu sehen sein, welches viel kleiner ist als die vollständige Länge der Duplex RNA für die Ribosonde und die mRNA oder die DNA. Die Ribosonde braucht nicht die vollständige Länge von Pro385 oder von Ser385 GABA_A α6 mRNA oder des Gens zu haben, es wird wünschenswert sein, eine gewisse Anzahl von diesen Sonden zu verwenden, um die gesamte mRNA Sequenz auf Fehlpaarungen abzusuchen. Auf eine ähnliche Art können DNA Sonden verwendet werden, um Fehlpaarungen durch eine enzymatische oder eine chemische Spaltung nachzuweisen. Siehe z.B. Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397 (1988)), Shenk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 989 (1975)), Novack et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 586 (1986)).
Alternativ können Fehlpaarungen durch Verschiebungen bei der elektrophoretischen Fähigkeit bei fehlgepaarten Duplexen in Bezug auf die gepaarten Duplexe nachgewiesen werden. (Siehe z.B. Cariello, Human Genetics 42: 726 (1988)). Die zellulare mRNA oder die DNA, welche das Ser385 Gen enthalten könnte, kann vor der Hybridisierung mit Hilfe von PCR entweder mit Ribosonden oder mit DNA-Sonden amplifiziert werden. Die aus biologischen Proben isolierten DNA Sequenzen, die durch die Verwendung von PCR amplifiziert wurden, können unter Verwendung von Allel – spezifischen Sonden heraus gesondert werden. Diese Sonden sind Nukleinsäureoligomere, von denen ein jedes einen Bereich einer Ser385 Sequenz enthält. Zum Beispiel kann ein Oligomer etwa 30 Nukleotide lang sein und einem Teil der Ser385 Sequenz entsprechen, welche in SEQ ID No. 12 angegeben ist. Durch die Verwendung einer ganzen Batterieanordnung solcher Allel – spezifischer Sonden können die PCR Vervielfältigungsprodukte durchsucht werden, um das Vorhandensein des Pro385Ser Polymorphismus zu identifizieren. Eine Hybridisierung von Al1el – spezifischen Sonden mit den vervielfältigten Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Sequenzen kann zum Beispiel auf einem Nylonfilter durchgeführt werden.
Der bei weitem eindeutigste Test zum Nachweis des Vorhandenseins des Pro385Ser Polymorphismus besteht darin, die aus einer biologischen Probe isolierten Nukleotid- oder Proteinsequenzen direkt mit denen einer Kontrollpopulation zu vergleichen. Zum Beispiel kann die Kontrollpopulation DNA-, RNA-, cDNA- Nukleinsäureproben enthalten, welche repräsentativ für die Sequenz von dem Wildtyp sind, wie sie in SEQ ID No. 11 (experimentell ist es der Pro385Ser Polymorphismus, wie er in SEQ ID No. 12 aufgelistet ist) aufgelistet wird. Alternativ könnte man Messenger Bzw. Boten RNA nach der Amplifikation, z.B. durch PCR, sequenzieren. Die Beispiele 10–13 beschreiben die auf Nukleinsäuren beruhenden diagnostischen Verfahren der Erfindung.
Zusätzlich zu der Diagnostik und zu den Verfahren, die ihre Basis haben bei dem Nachweis einer Nukleinsäure, die Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 kodiert, werden ebenfalls diagnostische Systeme und Verfahren ins Auge gefasst, welche auf dem Nachweis von Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Proteinen beruhen. Die folgende Diskussion vertieft einige der Ausführungsformen nach diesem Aspekt der Erfindung bis hin in weitere Einzelheiten.
Diagnostische Ausführungsformen, welche auf Protein beruhen
Das Vorhandensein eines Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Proteins kann nachgewiesen werden durch das Abtasten nach dem Vorhandensein des Proteins unter Verwendung herkömmlicher Testuntersuchungen. Zum Beispiel können monoklonale Antikörper, welche immunreaktiv mit dem Pro385 GABA_A α6 Protein sind, dazu verwendet werden, um biologische Proben nach dem Vorhandensein des Pro385 Polymorphismus abzusuchen. In ähnlicher Weise können Antikörper, welche gegenüber dem Ser385 GABA_A α6 Protein spezifisch sind, dazu verwendet werden, um nach dem Vorhandensein des Pro385Ser Polymorphismus zu suchen. Solche immunologischen Untersuchungen können in der Form von vielen geeigneten Formaten durchgeführt werden.
Bei einer bevorzugten Ausführung werden Antikörper aus einer Lösung heraus sowohl spezifisch an dem Ser385 GABA_A α6 Protein (z.B. wird es mit dem Pro385 Protein nicht über Kreuz reagieren) eine Immunpräzipitation vollziehen als auch spezifisch mit dem Ser385 Protein auf Western- oder Immunoblots eines Polyacrylamidgels reagieren. Bei einer anderen bevorzugten Ausführung werden die Antikörper Ser385 in Paraffin oder in gefrorenen Abschnitten nachweisen unter Verwendung immunocytochemischer Techniken. Bevorzugte Ausführungen, welche sich auf Verfahren zum Nachweis des Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Proteins beziehen, umfassen enzymgebundene Immunosorbensversuche (ELISA = enzyme-linked immunosorbant assays), Radioimmunoassays bzw. -versuche (RIA), immunoradiometrische Assays (IRMA) und immunoenzymatische Assays (IEMA) einschließlich von Sandwichuntersuchungen unter Verwendung monoklonaler und/oder polyklonaler Antikörper. Beispielhafte Sandwichuntersuchungen sind von David et al. in den U.S. Patenten No. 4,376,110 und 4,486,530 beschrieben worden.
Wir ziehen auch die Herstellung von diagnostischen Testausrüstungen ins Auge, welche Antikörpern enthalten, die spezifisch gegenüber dem Ser385 Protein und nicht kreuzreaktiv mit dem Pro385 Protein sind. Solche Testausrüstungen können auch Nitrozellulose oder Nylonmembranen für ein Immobilisieren von Protein aus einer zu testenden biologischen Probe heraus enthalten. Ergebnisse aus den Tests mit Hilfe solcher Testausrüstungen können von einem Gesundheitsdienstversorger oder von einem Diagnoselaboratorium interpretiert werden. Alternativ können diagnostische Testsätze für private Individuen zur Selbstdiagnose hergestellt und verkauft werden. Zusätzlich ziehen wir den Entwurf und die Herstellung von Trägern mit Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Polypeptiden ins Auge, so wie unten beschrieben, und zwar zur Nutzung bei Verfahren zur Identifizierung von Stoffen, welche mit den Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Polypeptiden in Wechselwirkung treten.
Bau eines multimeren Trägers mit Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 oder Polypeptidfragmenten derselben
Ein biotechnologisches Werkzeug, welches nützlich ist für die Entdeckung von Hilfsmitteln, welche mit den Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 in Wechselwirkung treten oder zur Umgehung von Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 dienen (z.B. hoher Durchsatz beim Durchsuchen), liefert in wünschenswerter Weise Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 in solch einer Form oder auf solch eine Weise, dass eine ausreichende Affinität für das Hilfsmittels erreicht wird. Während zum Beispiel monomeres Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 (d.h. was als eine diskrete Einheit des Proteins auf einem Träger erscheint) ausreichend aktiv ist, um die Verbindung mit einem Hilfsmittel zu vermitteln, kann multimeres Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 (d.h. was als vielfache Einheiten des Proteins auf einem Träger erscheint) eine weit aus größere Affinität für das Hilfsmittel aufweisen und es würde ausreichend Bindungsereignisse liefern, um mit Hilfe herkömmlicher Verfahren nachweisbar zu sein. Das Beispiel 14 liefert mehrere Ansätze, welche verwendet werden können, um einen multimeren Träger mit Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 oder Polypeptidfragmenten derselben zu erzeugen. Die multimeren Träger können bei Verfahren mit einem hohen Durchsatz an Durchsuchung eingesetzt werden, von denen einige in dem folgenden Abschnitt beschrieben werden.
Durchsuchungen mit hohem Durchsatz (high throughput screening) für Hilfsmittel, die mit Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Protein oder mit Polypeptidfragmenten derselben in Wechselwirkung treten
Die Durchsuchungen unter einem hohen Durchsatz stellen einen Ansatz zum Ausfindigmachen von Arzneimitteln dar, welcher nach einem Protein, einem Peptid, einer peptidomimetischen Verbindung oder einer Chemikalie sucht, welche mit einem definierten Zielobjekt wie etwa mit dem Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Protein oder einem Polypeptidfragmenten derselben in Wechselwirkung tritt. Im Allgemeinen wird eine Bibliothek von Proteinen, Polypeptiden, Peptiden, Peptidomimetika oder Chemikalien, welche gemeinsam als "Hilfsmittel" bezeichnet werden, im Vergleich zu dem Zielobjekt durch biologische Tests abgesucht (gescreent), und es werden die Hilfsmittel, die mit dem Zielobjekt in Wechselwirkung treten, identifiziert und direkt als therapeutische Mittel oder als Grundlage dafür verwendet, um neue Therapeutika unter Verwendung der kombinatorischen Chemie und der Proteinmodellierung zu entwickeln. Das Beispiel 15 liefert mehrere Durchsuchungsverfahren (Screeningverfahren) mit einem hohen Durchsatz, welche dafür verwendet werden, Hilfsmittel zu identifizieren, welche mit Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Protein oder Polypeptidfragmenten derselben in Wechselwirkung treten.
Beispiel 1 beschreibt die Verfahren, welche verwendet werden, um die Empfindlichkeit gegenüber BZD bei menschlichen Personen zu messen.
BEISPIEL 1
COAs, d. h. Söhne von Alkoholikern, werden an zwei Tagen im Abstand von etwa einer Woche getestet. Intravenöse Katheter werden in einem jeden der Arme der Versuchspersonen in die Ellenbeugenvenen eingesetzt. Eine intravenöse Leitung wird für die Entnahme von Blut verwendet, während die andere für die Verabreichung entweder von Diazepam oder eines Placebos verwendet wird. Infusionen werden nach der Art und Weise des Doppelblindverfahrens und in einer zufälligen Reihenfolge verabreicht. An dem Tag, an dem Diazepam verabreicht wird, wird das Arzneimittel in Intervallen von 15 Minuten in vier Dosierungen von 25, 25, 50 und 100 μg/kg verabreicht (die Resultate ergeben logarithmisch aufsteigende kumulative Dosierungen von 25, 50, 100 und 200 μg/kg). Eine jede Dosis wird über die Zeitdauer von 60 Sekunden injiziert. An dem Tag, an dem das Placebo verabreicht wird, wird eine Salzlösung in einem ähnlichen Volumen und zu denselben Zeiten injiziert.
An einem jeden Testtag werden die Antwortreaktionen zu 12 getrennten Zeitpunkten gemessen: zweimal an der Basislinie, einmal nach einer jeden der vier Dosierungen und bei einem jeden der sechs 30 minutigen Intervalle nach der letzten Dosierung während einer Zeitdauer, die drei Stunden überspannt. Die Augenbewegungen werden zu einem jeden der Zeitpunkte ausgewertet. Blut wird für die Niveaus des Plasmadiazepams zu einem jeden der Zeitpunkte aus dem Arm entnommen, welcher kontralateral zu dem ist, welcher für die Arzneimittelinjektion benutzt worden ist. Die Konzentrationen an Plasmadiazepam werden gemessen durch eine Gas/Flüssigkeits – Chromatographie gemäß dem Verfahren, welches von Greenblatt et al. in Psycopharmacology 70: 89 (1980) beschrieben worden ist. Die Niveaus des primären Diazepammetaboliten, des Desmethyldiazepams, werden ebenfalls quantifiziert, aber in allen Fällen sind die Niveaus des Desmethyldiazepams viel niedriger als die Niveaus des Ausgangsarzneimittels.
Die Spitzengeschwindigkeit der Sakkade der Augenbewegung und die durchschnittliche, gleichmäßige Steigerung der Folgebewegung der Augen werden aufgezeichnet, so wie dies von Cowley et al. in Alcohol Clin Exp Res 18: 324 (1994) beschrieben worden ist, dies unter Verwendung einer nicht invasiven, infraroten, okulographischen Aufzeichnungsvorrichtung (Eye Trac model 210, ASL Laboratories, Waltham, MA) mit einer Genauigkeit von 0,25 Grad. Bei der Aufgabe der Sakkadenaugenbewegung verfolgen die Versuchspersonen einer Serie von 27 aufblitzenden Zielen, wobei ein jedes während einer Zeitdauer von 2 Sekunden dargestellt wird. Die Zielstufen variieren zufällig von 3 bis 27 Grad in der Amplitude. Da die Sakkadengeschwindigkeit in einer kurvenförmigen Verlaufsweise als eine Funktion der Amplitude ansteigt (eine Beziehung, welche als "Hauptsequenz" bekannt ist), werden die Geschwindigkeiten bei verschiedenen Amplituden an eine exponentielle Gleichung der folgenden Form angepasst: Spitzengeschwindigkeit = a – b^–x/c, wobei man hat: x = Sakkadenamplitude, während a, b und c Konstanten sind. (Bahill et al., Math Biosci 24: 191 (1975)). Die Hauptsequenz wird verwendet, um die Spitzengeschwindigkeit für eine idealisierte 20 Grad Sakkade an einem jeden Zeitpunkt für eine jede Versuchsperson zu berechnen.
Während der Aufgabe gleichmäßigen Folgebewegung bewegt sich das Ziel nach einem trapezförmigen Muster zwischen 15 Grad nach links und 15 Grad nach rechts von dem Zentrum, dies mit einer konstanten Geschwindigkeit von 10 Grad pro Sekunde. Nach zwei praktischen Versuchsreihen werden Daten aus 14 Reihen eingesammelt, wobei ein jede Reihe 3 Sekunden lang dauert. Nach der Identifikation der Sakkaden und Artefakte werden die übrig bleibende Abschnitte der Verfolgungssegmente dazu verwendet, um eine zeitgewichtete, durchschnittliche Steigerung zu berechnen (Augengeschwindigkeit/Zielgeschwindigkeit, so wie es von Abel et al. in Biol Psychiatry 29: 1063 (1991)) beschrieben ist. Das Beispiel 2 beschreibt Verfahren, welche dazu verwendet werden, um genetische Polymorphismen in den Polynukleotidsequenzen zu identifizieren, welche die GABA_A α6 Untereinheit kodieren.
BEISPIEL 2
Die Amplifikation von genomischer DNA, welche aus Epstein-Barr immortalisierten, lymphoblastoiden Zellenlinien isoliert worden ist, wird durchgeführt unter Verwendung von fünf Primerpaaren, die in der Tabelle 1 aufgelistet sind. Diese Primerpaare amplifizieren fünf sich nicht überlappende Bereiche, welche 60,3% der Sequenz abdecken, die das menschliche GABA_A α6 Rezeptorgen kodiert. (Hadingham et al., Mol Pharmacol 49: 253 (1996)). Da die Polynukleotidsequenzen der menschlichen GABA_A α6 Rezeptorintrone unbekannt sind, werden alle Primer so entworfen, dass sie komplementär zu den Exonsequenzen sind, die benachbart zu den Exon-Introngrenzen liegen. Positionen der Grenzen werden vorhergesagt auf der Grundlage der Sequenz, welche die α-6 Untereinheit der Maus kodiert. (Jones et al., J Neurochem 67: 907 (1996)). Die Identität der Amplifikationsprodukte wird durch eine DNA-Sequenzierung bestätigt. Das Amplifikationsprodukt aus dem GABA_A α6-1f und dem GABA_A α6-2b Primerpaar enthält 202 bp des ersten Introns. Die Polynukleotidsequenz dieses Intronabschnittes wird in einer GenBank hinterlegt und es wird ihr die Zugangsnummer AF053072 zugeordnet, so wird ein nützlicher Bereich geliefert, aus dem Primer entworfen werden können. Ein Experte auf diesem Gebiet wird jedoch erkennen, dass viele Primer, welche den Pro385Ser Polymorphismus überspannen, entworfen werden können.
Die DNA Amplifikation wird durchgeführt über die Polymerasekettenreaktion (PCR = Polymerase Chain Reaction) unter Verwendung eines GENEAMP PCR Systems 9600 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) mit den folgenden Bedingungen: 95°C während einer Zeitdauer von 3 Minuten; 30 Umläufe von: 94°C während einer Zeitdauer von 15 Sekunden; 60°C während einer Zeitdauer von 20 Sekunden; 72°C während einer Zeitdauer von 30 Sekunden; gefolgt von 72°C während einer Zeitdauer von 10 Minuten. Die Reaktionsmischung befindet sich in einem 5 μl Volumen, welches 50 ng der DNA Probe, 50 nM eines jeden Primers, 50 μM von jedem dNTP, 1 × Perkin Elmer Puffer I, sowie 0,125 Einheiten der Taq DNA Polymerase enthält. 0,033 μl [α-³²P]dCTP (3.000 Ci/mmol) ist in der PCR Reaktion enthalten. Bei dem Abschluss der Amplifikationsreaktion wird eine Lösung, welche 95% Formamid, 10 mM NaOH, 0,05% Xylolcyanol und 0,05% Bromphenol enthält, zu einer jeden Probe hinzugegeben, um ein gesamtes Volumen von 50 μl zu ergeben.
Sequenzvarianten werden anfänglich nachgewiesen unter Verwendung des Verfahrens nach dem Einzelstrang-Konformationspolymorphismus (SSCP), welches von Orita et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2776 (1989) beschrieben worden ist. Nach dem Denaturieren der DNA bei 80°C während einer Zeitdauer von 5 Minuten werden 1 μl der Mischung auf ein MDE^TM Gel (FMC BioProducts, Rockland, ME) geladen und durch eine Elektrophorese bei 4°C unter 9 Watt getrennt. Im Anschluss an die Elektrophorese wird das Gel getrocknet und einem Kodak XAR Film während einer Zeitdauer von 0,5–8 Stunden bei Raumtemperatur ausgesetzt, um die Positionen der radioaktiv markierten Polynukleotide zu visualisieren.
Tabelle 1 Primer zum Amplifizieren der den GABA_A α6 Rezeptor kodierenden Sequenz
DNA Bande bzw. Linien, welche eine veränderte Mobilität im Vergleich zu einem Kontrolltest vom Wildtyp in dem SSCP Test zeigen, werden aus dem Gel herausgeschnitten, in 20 μl Wasser eingetaucht und dann während einer Zeitdauer von 5 Minuten auf 80°C erhitzt. Eine 1 μl Probe des mit Wasser extrahierten Polynukleotids wird einer direkten Sequenzierung unterworfen (Suzuki et al., Anal Biochem 192: 82 (1991)) unter Verwendung eines sog. ,dye terminator cycle sequencing kit' der Marke ABI PRISM^TM mit einem 373 DNA-Sequenzierungssystem (Perkin-Elmer).
Die Tabelle 2 stellt die für die PCR-RFLP Versuche verwendeten Primersequenzen und Restriktionsenzyme dar, welche für eine schnelle Genotypbestimmung der zwei GABA_A α6 Polymorphismen bei 56 Kindern von Alkoholikern verwendet worden sind. Die PCR Bedingungen sind dieselben wie diejenigen, welche bei dem SSCP Versuch verwendet worden sind, mit der Ausnahme, dass die Reaktionsmischung ein Volumen von 10 μl aufweist, welches 100 ng DNA, 250 nM eines jeden Primers, 200 μM von jedem dNTP und 0,25 Einheiten von Taq DNA Polymerase enthält. wie in der Tabelle 2 gezeigt, werden die FokI und HaeIII Restriktionsenzyme zum Nachweisen des Pro385Ser bzw. des G1031C Polymorphismus verwendet. Die Restriktionsendonukleasedigestionen werden durchgeführt, indem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms in einem Gesamtvolumen von 20 μl während einer Zeitdauer von 2 Stunden bei 37°C verwendet werden, dies unter Einsatz von Pufferbedingungen, die für ein jedes Enzym geeignet sind. DNA-Fragmente werden durch Elektrophorese auf einem 5% Polyacrylamidgel aufgelöst.
Tabelle 2 Zwei Polymorphismen in der α6 kodierenden Sequenz
Das Beispiel 3 beschreibt mehrere auf den Computer bezogene Ausführungen, welche dazu verwendet werden können, um mehr Polymorphismen in der GABA_A α6 Sequenz und in den Molekülen zu identifizieren, welche mit der Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Sequenz in Wechselwirkung treten.
BEISPIEL 3
Die Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Sequenz wird auf ein computerlesbares Medium zum Aufzeichnen und zur Manipulation aufgebracht. Experten auf diesem Gebiet werden erkennen, dass ein computerlesbares Medium mit der Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Sequenz nützlich ist für die Bestimmung von homologen Sequenzen, von strukturellen und funktionalen Bereichen und für den Bau von Proteinmodellen für einen vernünftigen Arzneimittelentwurf. Die Funktionalität eines computerlesbaren Mediums mit der Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Sequenz umfasst zum Beispiel die Fähigkeit, die Sequenz zu vergleichen unter Verwendung von aus dem Stand der Technik bekannten Computerprogrammen, um so homologe Suchen durchzuführen, um ähnliche Ionentransporter zu identifizieren, um Proteinmodelle zu entwickeln und um einen vernünftigen Arzneimittelentwurf durchzuführen.
Die Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Sequenz kann gespeichert, aufgezeichnet und manipuliert werden, und zwar auf einem jeden Medium, das von einem Computer gelesen und auf das von einem Computer zugegriffen werden kann. So wie hierin verwendet, beziehen sich die Wörter "aufgezeichnet" und "gespeichert" auf ein Verfahren zur Speicherung von Informationen auf einem computerlesbaren Medium. Ein Experte auf diesem Gebiet wird leicht irgendeines der gegenwärtig bekannten Verfahren zur Aufzeichnung von Information auf ein computerlesbares Medium anpassen können, um Erzeugnisse zu produzieren, welche die Nukleotid- oder die Polypeptidsequenzinformation gemäß dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beinhalten.
Eine Vielfalt von Datenspeicherstrukturen steht für einen Experten auf diesem Gebiet zur Verfügung zur Erzeugung eines computerlesbaren Mediums, welches darauf eine Nukleotid- oder Polypeptidsequenz aufweist. Die Wahl der Datenspeicherstrukturen wird im Allgemeinen auf der Komponente beruhen, welche man gewählt hat, um auf die gespeicherte Information zuzugreifen. Computerlesbare Medien umfassen magnetisch lesbare Medien, optisch lesbare Medien oder elektronisch lesbare Medien. Zum Beispiel können die computerlesbaren Medien sowohl eine Festplatte, eine Magnetdiskette, ein Magnetband, eine CD-ROM, RAM oder ROM sein als auch können sie andere Typen von anderen Medien sein, die den Experten auf diesem Gebiet bekannt sind. Die computerlesbaren Medien, auf denen die Sequenzinformation gespeichert ist, können ein Personal Computer sein, ein Netzwerk, ein Server oder andere Computersysteme, die den Experten auf diesem Gebiet bekannt sind.
Ausführungen der Erfindung können sich auf Systeme erstrecken, insbesondere auf computerbasierte Systeme, welche die hierin beschriebene Sequenzinformation enthalten. So wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "ein computerbasiertes System" auf die Hardware, Software und auf die Datenbank, welche verwendet werden, um die Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Nukleotidsequenz und die Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Proteinsequenz oder Fragmente derselben zu analysieren. Das computerbasierte System enthält vorzugsweise die oben beschriebenen Speichermedien und einen Prozessor zum Zugreifen auf und zur Manipulation der Sequenzdaten. Die Hardware des computerbasierten Systems dieser Ausführung umfasst eine zentrale Prozessoreinheit (CPU = central processing unit) und eine oder mehrere Datenbanken. Ein Experte kann leicht erkennen, dass ein jedes der gegenwärtig verfügbaren computerbasierten Systeme geeignet ist.
Gemäß einer besonderen Ausführung umfasst das Computersystem einen Prozessor, welcher mit einem Bus verbunden ist, welcher mit einem Hauptspeicher (vorzugsweise als RAM implementiert) und mit einer Vielfalt von sekundären Speichergeräten verbunden ist, wie etwa mit einem Festplattenlaufwerk und mit einer Vorrichtung eines auswechselbaren Speichermediums. Die Vorrichtung eines auswechselbaren Speichermediums kann zum Beispiel ein Magnetdiskettenlaufwerk, eine Kompaktdiskettenlaufwerk oder ein Magnetbandlaufwerk usw. darstellen. Ein auswechselbares Speichermedium, wie etwa eine Magnetdiskette, eine Kompaktdiskette, ein Magnetband usw., welches eine Steuerlogik und/oder darauf aufgezeichnete Daten (z.B. die Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Nukleotidsequenz oder die Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Polypeptidsequenz) enthält, kann in die auswechselbare Speichervorrichtung eingesetzt werden. Das Computersystem enthält eine geeignete Software zum Lesen der Steuerlogik und/oder der Daten aus der Vorrichtung des auswechselbaren Speichermediums, wenn die Daten und die Steuerinformationen erst einmal in die Vorrichtung des auswechselbaren Speichermediums eingefügt worden sind.
Die Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Nukleotidsequenz oder die Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Polypeptidsequenz kann in einer gut bekannten Art und Weise in dem Hauptspeicher, in irgendeinem der sekundären Speichervorrichtungen und/oder in einem auswechselbaren Speichermedium gespeichert werden. Software für den Zugriff und für die Verarbeitung der Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Nukleotidsequenz oder der Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Polypeptidsequenz (wie etwa Suchwerkzeuge, Vergleichswerkzeuge und Softwarewerkzeuge zur Modellierung usw.) befinden sich während der Programmausführung in dem Hauptspeicher.
So wie er hierin verwendet wird, bezieht sich der Ausdruck "Datenbank" auf einen Speicher, welcher Nukleotid- oder Polypeptidsequenzinformation, Proteinmodellinformation und Information über andere Peptide, Chemikalien, Peptidomimetika und andere Mittel speichern kann, welche mit Proteinen in Wechselwirkung treten. Zusätzlich bezieht sich eine "Datenbank" auf eine Speicherzugriffskomponente, welche auf Erzeugnisse zugreifen kann mit darauf aufgezeichneter Nukleotid- oder Polypeptidsequenzinformation, Proteinmodellinformation und Information über andere Peptide, Chemikalien, Peptidomimetika und andere Mittel, welche mit Proteinen in Wechselwirkung treten. Viele Datenbanken sind den Experten auf diesem Gebiet bekannt und mehrere davon werden unten diskutiert werden.
Die Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Sequenzdaten können in einer Vielfalt von Datenverarbeitungsprogrammen in einer Vielfalt von Formaten gespeichert und manipuliert werden. Zum Beispiel können die Sequenzdaten als Text in einer Textverarbeitungsdatei gespeichert sein, wie etwa unter MicrosoftWORD oder WORDPERFECT, oder als eine ASCII Datei in einer Vielfalt von Datenbankprogrammen, welche den Experten auf diesem Gebiet vertraut sind, wie etwa DB2, SYBASE oder ORACLE.
Ein "Suchprogramm" bezieht sich auf ein oder auf mehrere Programme, welche auf dem computerbasierten System implementiert sind, um eine Nukleotid- oder Polypeptidsequenz mit anderen Nukleotid- oder Polypeptidsequenzen und Verbindungen zu vergleichen, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, von Peptiden, Peptidomimetika und von Chemikalien, welche innerhalb der Datenbank gespeichert sind. Ein Suchprogramm bezieht sich auch auf ein oder auf mehrere Programme, welche ein oder mehrere Proteinmodelle mit mehreren Proteinmodellen vergleichen, welche in einer Datenbank vorhanden sind, und ein oder mehrere Proteinmodelle mit mehreren Peptiden, Peptidomimetika und Chemikalien, welche in einer Datenbank vorhanden sind. Ein Suchprogramm wird zum Beispiel eingesetzt, um die Bereiche des Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Gens oder des Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Proteins zu vergleichen, welche beim Abgleich mit Sequenzen in Nukleinsäure- und Proteindatenbanken passend übereinstimmen, um so Homologien und strukturelle oder funktionale oder funktionale Motive zu identifizieren. Ein "Retrieval Programm" ("Programm zum Wiederfinden und zur Wiedergewinnung von Daten") bezieht sich auf ein oder auf mehrere Programme, welche auf dem computerbasierten System implementiert sind, um eine homologe Nukleinsäuresequenz, eine homologe Proteinsequenz oder ein homologes Proteinmodell zu identifizieren. Weiterhin wird ein Retrieval Programm auch verwendet, um Peptide, Peptidomimetika und Chemikalien zu identifizieren, welche mit einer Nukleinsäuresequenz, einer Proteinsequenz oder mit einem Proteinmodell in Wechselwirkung treten.
Nach einem Ansatz kann der Prozentsatz an Sequenzidentität durch Standard Verfahren bestimmt werden, welche gewöhnlich verwendet werden, um die Ähnlichkeit und die Position der Aminosäure von zwei Polypeptiden zu vergleichen. Unter Verwendung eines Computerprogramms wie etwa BLAST oder FASTA werden zwei Polypeptide für eine optimalen Übereinstimmung ihrer jeweiligen Aminosäuren ausgerichtet (entweder entlang der vollen Länge von einer oder von beiden Sequenzen oder entlang einem vorherbestimmten Teil von einer oder von beiden Sequenzen). Solche Programme liefern eine "Default opening penalty" (eine "vorgegebene Öffnungsstrafe") und eine "Default gap penalty" (eine vorgegebene Lückenstrafe"), und eine Punktematrix, wie etwa PAM 250 (eine standard Punktematrix; siehe Dayhoff et al., in: Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol. 5, Supp. 3 (1978)), kann in Verbindung mit dem Computerprogramm verwendet werden. Der Prozentsatz an Sequenzidentität kann wie folgt berechnet werden:
Polypeptide, welche zu mindestens 70% identisch sind, werden typischerweise eine oder mehrere Substitutionen, Deletionen und Insertionen von Aminosäure aufweisen. Gewöhnlich werden die Substitutionen konservativ sein, um so eine kleine oder keine Wirkung auf die gesamte Nettoladung, Polarität oder Hydrophobie des Proteins zu haben, aber wahlweise können sie die Aktivität des GABA_A α6 Rezeptors erhöhen. Das Beispiel 4 liefert Verfahren, um das Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Gen oder das Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Protein mit bekannten Datenbanken mit Nukleotid- und Proteinsequenzen zu vergleichen, um so Homologien und strukturelle oder funktionale Motive zu identifizieren.
BEISPIEL 4
Die Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Gensequenz oder die Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Proteinsequenz kann mit bekannten Sequenzen auf einer Nukleotid- oder Proteinbasis verglichen werden. Die Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Gensequenz oder die entsprechende vollständige Länge der cDNA kann mit den folgenden bekannten Nukleinsäuresequenzen verglichen werden: Wirbeltiersequenzen, EST Sequenzen, patentierte Sequenzen und jüngst identifizierte Sequenzen (tägliche Verlautbarungen der Genbank). Die Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Gensequenz oder die entsprechende vollständige Länge der cDNA wird mit mehr als 70% Homologie über 30 Nukleotide unter Verwendung entweder von BLASTIN oder BLAST2N identifiziert und das Abgleichen der Wirbeltiersequenzen wird nachfolgend untersucht unter Verwendung von FASTA. Ionentransporter, welche homolog zu Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 sind, insbesondere Ionentransporter mit Punktmutationen in Transmembranbereichen, können auf diese Weise identifiziert werden. Zum Beispiel können andere Mitglieder der durch den GABA_A α6 Liganden aktivierten Familie des Chloridkanals durch den obigen Ansatz identifiziert werden.
ORFs, welche durch die Sequenzen des Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Gens oder der entsprechenden vollständigen Länge der cDNAs kodiert sind, werden auch mit bekannten Aminosäuresequenzen verglichen, welche man in den öffentlichen Datenbanken findet, siehe Swissprot Ausgabe 35, PIR Ausgabe 53 und der Genpept Ausgabe 108, unter Verwendung von BLASTP mit dem Parameter W = 8, wobei ein Maximum von 10 Abgleichen ermöglicht wird. Zusätzlich werden die drei konzeptuellen Strukturen der Translationsprodukte des oberen Stranges der Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Gensequenz oder der entsprechenden vollständigen Länge der cDNA verglichen mit öffentlich bekannten Aminosäuresequenzen von Swissprot unter Verwendung von BLASTX mit dem Parameter E = 0,001.
Zusätzlich wird ein Suchprogramm dazu verwendet, um Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 mit anderen bekannten Sequenzen zu vergleichen, um so Proteinmodelle zu erzeugen. Das Beispiel 5 unten beschreibt Verfahren, um Proteinmodelle von Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 aufzubauen.
BEISPIEL 5
In der Vergangenheit ist die drei-dimensionale Struktur von Proteinen nach einer gewissen Anzahl von Methoden bestimmt worden. Der wahrscheinlich am besten bekannte Weg zur Bestimmung der Proteinstruktur impliziert den Einsatz kristallographischer Untersuchungen mit Hilfe von Röntgenstrahlen. Einen allgemeinen Überblick über diese Technik kann man in Van Holde, K. E. Physical Biochemistry, Prentice-Hall, N.J. pp. 221–239 (1971) finden. Unter Verwendung dieser Technik ist es möglich, die dreidimensionale Struktur mit einer guten Genauigkeit aufzuhellen. Zusätzlich kann die Proteinstruktur durch die Verwendung von Techniken der Neutronenbeugung oder durch nuklear magnetische Resonanz (NMR) bestimmt werden. (Siehe z.B. Moore, W. J., Physical Chemistry, 4th Edition, Prentice-Hall, N.J. (1972)).
Alternativ werden die Proteinmodellausführungen gemäß der vorliegenden Erfindung aufgebaut unter Verwendung computerbasierter Techniken der Proteinmodellierung. Nach einem Ansatz wird das Problem der Proteinfaltung dadurch gelöst, dass man Zielsequenzen findet, welche am meisten kompatibel sind mit Profilen, welche die strukturellen Umgebungen der Reste in bekannten drei-dimensionalen Proteinstrukturen darstellen. (Siehe z.B. Eisenberg et al., U.S. Patent No. 5,436,850, ausgegeben am 25. Juli 1995). Gemäß einer anderen Technik werden die drei-dimensionalen Proteinstrukturen in einer gegebenen Familie übereinander gelegt, um die strukturell erhaltenen und bewahrten Bereiche in dieser Familie festzulegen. Diese Technik der Proteinmodellierung verwendet auch die bekannte dreidimensionale Struktur eines homologen Proteins, um sich der Struktur von Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 anzunähern. (Siehe z.B. Srinivasan et al., U.S. Patent No. 5,557,535, ausgegeben am 17. September 1996). Herkömmliche Techniken der Homologiemodellierung sind routinemäßig verwendet worden, um Modelle von Proteasen und Antikörpern zu bauen. (Sowdhamini et al., Protein Engineering 10: 207, 215 (1997)). Vergleichende Ansätze können auch verwendet werden, um dreidimensionale Proteinmodelle zu entwickeln, wenn das Protein von Interesse eine schlechte Sequenzidentität aufweist, um Proteine nach einer Schablonenvorlage zu erstellen. In einigen Fällen falten Proteine in ähnliche drei-dimensionale Strukturen, obwohl sie sehr schwache Sequenzidentitäten aufweisen. Zum Beispiel falten die drei-dimensionalen Strukturen einer Anzahl von schraubenförmigen Cytokinen in einer ähnlichen drei-dimensionalen Topologie trotz einer schwachen Sequenzhomologie.
Die jüngere Entwicklung der Verfahren der Fadenbildung und der "Fuzzy"-Ansätze ermöglichen jetzt die Identifizierung von wahrscheinlichen Faltmustern und funktionalen Proteinbereichen in einer Anzahl von Situationen, in denen die strukturelle Beziehung zwischen dem Ziel und der oder den Schablonen auf dem Sequenzniveau nicht nachweisbar ist. Nach einem Verfahren wird die Erkennung der Faltung unter Verwendung der mehrfachen Sequenzfadenbildung (MST = Multiple Sequence Threading) durchgeführt und strukturelle Äquivalenzen werden von der Fadenbildungsausbeute abgeleitet unter Verwendung des Geometrie – Entfernungsprogramms (DRAGON = distance geometry program). Eine vollständige Darstellung mit allen Atomen wird dann erstellt unter Verwendung eines molekularen Modellierungspaketes wie etwa 9QUANTA.
Gemäß diesem dreistufigen Ansatz werden zuerst Kandidaten für die Schablonen identifiziert unter Verwendung des neuen Faltenerkennungsalgorithmus MST, welcher in der Lage ist, eine gleichzeitig eine Fadenbildung von mehreren ausgerichteten Sequenzen auf einer oder auf mehreren 3-D Strukturen durchzuführen. In einem zweiten Schritt werden die von der MST Ausbeute erzielten strukturellen Äquivalenzen in interresiduelle Entfernungsbeschränkungen umgewandelt und dann in das Geometrie – Entfernungsprogramm DRAGON eingegeben, zusammen mit Hilfsinformationen, welche man aus Vorhersagen über die Sekundärstruktur gewonnen hat. Das Programm kombiniert die Beschränkungen in einer unverfälschten Art und Weise und erzeugt schnell eine große Anzahl von Modellbestätigungen von geringer Auflösung. In einem dritten Schritt werden die Modellbestätigungen mit geringer Auflösung umgewandelt in Modelle mit allen vollständigen Atomen und dann einer Energieminimierung unterworfen unter Verwendung des molekularen Modellierungspaketes QUANTA. (Siehe z.B. Aszodi et al., Proteins: Structure, Function, and Genetics, Supplement 1: 38–42 (1997)).
Alternativ wird das Paradigma der „Sequenz-zu-Struktur-zu-Funktion" dadurch benutzt, dass man zuerst die Struktur eines Proteins aus dessen Sequenz identifiziert unter Verwendung eines Fadenbildungsalgorithmus, welcher die Sequenzen zu der am besten passenden Struktur in einer Strukturdatenbank anpasst, indem man dann die aktive Stelle des Proteins aus der Anpassung identifiziert unter Verwendung einer "Fuzzy Funktional Form" (FFF), welche ein dreidimensionaler Deskriptor der aktiven Stelle eines Proteins ist. (Siehe z.B. Fetrow et al., J. Mol. Biol. 282: 703–711 (1998) und Fetrow und Skolnick, J. Mol. Biol. 281: 949–969 (1998)). Die FFFs werden aufgebaut, indem man die Proteingeometrien aus einer Reihe von funktional in Beziehung zueinander stehender Proteine mit bekannten Strukturen in einer iterativen Vorgehensweise übereinander lagert. Die FFFs sind jedoch nicht spezifisch hinsichtlich einer Überlagerung und der Grad, bis zu dem die Deskriptoren gelockert werden können, wird erforscht. Im Wesentlichen werden zurückbehaltene und funktional wichtige Reste identifiziert und es wird ein Satz von geometrischen und konformationalen Beschränkungen für eine spezifische Funktion in der Form eines Computeralgorithmus definiert. Das Programm sucht dann experimentell bestimmte Proteinstrukturen aus einer Proteinstrukturdatenbank für einen Satz von Resten, welche die spezifizierten Beschränkungen erfüllen.
Indem man dieses rechnerbasierte Protokoll zum Einsatz bringt, können die Genomsequenzdatenbanken schnell gescreent werden, die von verschiedenen Organisationen bereit gehalten werden, einschließlich von: http://www.tigr.org/tdb; http://www.genetics.wisc.edu; http://genome-www.stanford.edu/ball; http://hiv-web.lanl.gov; http://wwwncbi.nlm.nih.gov; http://www.ebi.ac.uk; http://pasteur.fr/other/biology; http://www-genome.wi.mit.edu, wobei gesucht wird nach spezifischen proteinaktiven Stellen und nach der Identifizierung der Reste an diese aktiven Stellen, welche Pro385 oder Ser385 ähnlich sind. Mehrere andere Gruppen haben Datenbanken von kurzen Sequenzmustern entwickelt oder Motive entworfen, um eine gegebene Funktion oder Aktivität eines Proteins zu identifizieren. Diese Datenbanken, besonders Prosite (http://expasy.hcuge.ch/sprot/prosite.html); Blocks (http://www.blocks.fhcrc.org); und Prints (http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/PRINTS/PRINTS.ht ml), verwenden kurze Längen von Sequenzinformationen, um Sequenzmuster zu identifizieren, welche für eine gegebene Funktion spezifisch sind; damit vermeiden sie die Probleme, welche sich aus der Notwendigkeit eines passenden Abgleichs ganzer, vollständiger Sequenzen ergeben.
Wenn ein Proteinmodell von Pro385 oder Ser385 erst einmal durch kristallographische Untersuchungen mittels Röntgenstrahlen, durch NMR, Neutronenbeugung oder durch eine auf Computerrechenverfahren beruhende Modellierung erzeugt worden ist, dann können Verfahren für ein vernünftiges Entwickeln von Arzneimitteln eingesetzt werden, um so Hilfsmittel zu beleuchten, welche mit Pro385 oder Ser385 in Wechselwirkung treten oder Pro385 oder Ser385 umgehen und damit eine Empfindlichkeit gegenüber BZD/Ethanol wiederherstellen. Eine standard Molekularmodellierung kann verwendet werden, um die Strukturen der Pro385 oder Ser385 Proteine zu vergleichen, und interaktive Bereiche mit Diazepam (und/oder Homologe oder Derivate) und Ethanol können identifiziert werden und dazu verwendet werden, um neue therapeutische Mittel zu entdecken. Eine Standard Molekularmodellierung kann auch verwendet werden, um synthetische Verbindungen zu entwerfen (z.B. Peptide oder kleine organische Molekülverbindungen), welche den Chloridtransport, die Ligandenbindung oder die über einen Liganden vermittelte Modulation oder Aktivierung des Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Proteins blockieren oder stören. Das Beispiele 6 stellt mehrere Verfahren des vernünftigen Arzneimittelentwurfes in ihren Einzelheiten dar.
BEISPIEL 6
Bei einigen Ausführungen werden Suchprogramme eingesetzt, um Bereiche des Pro385 oder Ser385 Gens oder des Pro385 oder Ser385 Proteins mit Molekülen zu vergleichen, welche bekannte Ligandenwechselwirkungen aufweisen wie etwa Peptide, Peptidomimetika und Chemikalien, so dass therapeutische Wechselwirkungen der Moleküle vorhergesagt werden können. (Schneider, Genetic Engineering News December: Seite 20 (1998), Tempczyk et al., Molecular Simulations Inc. Solutions April (1997), und Butenhof, Molecular Simulations Inc. Case Notes (August 1998)). Dieses Verfahren wird als "vernünftiger Arzneimittelentwurf" bezeichnet.
Ein Ziel des vernünftigen Arzneimittelentwurfs besteht darin, strukturelle Analogien herzustellen von biologisch aktiven, ein Interesse aufweisenden Polypeptiden oder von kleinen Molekülen, mit denen sie in Wechselwirkung treten (z.B. Agonisten, Antagonisten, Inhibitoren), um Arzneimittel zu bilden, welche zum Beispiel aktivere oder stabilere Formen des Polypeptids sind oder welche die Funktion eines Polypeptids in vivo vergrößern oder beeinträchtigen. (Siehe z.B. Hodgson, Bio. Technology 9: 19–21 (1991)). Die natürlich vorkommenden Aminosäuren, die bei der biologischen Herstellung von Peptiden eingesetzt werden, weisen alle die L-Konfiguration auf. Synthetische Peptide können hergestellt werden, indem herkömmliche synthetische Verfahren eingesetzt werden und indem L-Aminosäuren, D-Aminosäuren oder verschiedene Kombinationen von Aminosäuren der zwei verschiedenen Konfigurationen genutzt werden. Synthetische Verbindungen, welche die Konformation und die wünschenswerten Merkmale eines bestimmten Peptids, z.B. eines Oligopeptids, nachahmen, wenn solch ein Peptid erst einmal gefunden worden ist, welche aber die unerwünschten Merkmale, z.B. die Flexibilität (Verlust an Konformation) und den Zusammenbruch einer Bindung vermeiden, solche synthetischen Verbindungen sind als "Peptidomimetika" bekannt. (Siehe z.B. Spatola, A. F. Chemistry and Biochemistry of Amino Acids. Peptides and Proteins (Weistein, B, Ed.), Vol. 7, S. 267–357, Marcel Dekker, New York (1983). Hier wird der Gebrauch des Methylenthiobioisosters [CH₂S] als ein Amidersatz in den Analogen von Enkephalin beschrieben; und Szelke et al. beschreiben in Peptides: Structure and Function, Proceedings of the Eighth American Peptide Symposium, (Hruby and Rich, Eds.); S. 579–582, Pierce Chemical Co., Rockford, III. (1983), Renininhibitoren, welche beide Bioisostere aufweisen, sowohl die Methylenamino [CH₂NH] Bioisostere als auch die Hydroxyethylen [CHOHCH₂] Bioisostere an der Leu-Val Amidbindung in dem 6–13 Octapeptid, das aus dem Angiotensinogen abgeleitet ist).
Im Allgemeinen umfassen der Entwurf und die Synthese einer peptidomimetischen Verbindung das Starten mit der Sequenz des Peptids und den Konformationsdaten (z.B. Geometriedaten wie etwa Bindungslänge und -winkel) eines gewünschten Peptids (z.B. das am wahrscheinlichsten simulierte Peptid) und die Verwendung solcher Daten, um die Geometrien zu bestimmen, welche in der peptidomimetischen Verbindung entworfen werden sollten. Nach dem Stand der Technik sind zahlreiche Verfahren und Techniken für die Durchführung dieses Schrittes bekannt, von denen ein jedes Verfahren und eine jede Technik verwendet werden könnte. (Siehe z.B. Farmer, P. S., Drug Design, (Ariens, E. J. ed.), Vol. 10, S. 119–143 (Academic Press, New York, London, Toronto, Sydney und San Francisco) (1980); Farmer et al., in TIPS, 9/82, S. 362–365; Verber et al., in TINS, 9/85, S. 392–396; Kaltenbronn et al., in J. Med. Chem. 33: 838–845 (1990); und Spatola, A. F., Chemistry and Biochemistry of Amino Acids. Peptides and Proteins, Vol. 7, S. 267–357, Kapitel 5, "Peptide Backbone Modifications: A Structure Activity Analysis of Peptides Containing Amide Bond Surrogates. Conformational Constraints, and Relations" (B. Weistein ed.; Marcel Dekker: New York, pub.) (1983); Kemp, D. S., "Peptidomimetics and the Template Approach to Nucleation of β-sheets and α-helices in Peptides," Tibech, Vol. 8, S. 249–255 (1990). Zusätzliche Lehren können in den U.S. Patenten No. 5,288,707; 5,552,534; 5,811,515; 5,817,626; 5,817,879; 5,821,231 und 5,874,529 gefunden werden.
In einem Ansatz wird eine drei-dimensionale Struktur eines Proteins von Interesse (z.B. das Pro385 oder Ser385 Polypeptid oder ein Fragment desselben) durch Röntgenstrahlen – Kristallographie, NMR oder durch Neutronenbeugung und durch Computer-Modellierung bestimmt. Nützliche Proteinmodelle von Pro385 oder Ser385 können auch alleine durch eine Computermodellierung gewonnen werden, so wie es in den Beispielen 3,4, und 5 erklärt wird. Diese Modelle werden mit Peptid- und Chemiebibliotheken verglichen unter Verwendung einer Computersoftware, welche es einem erlaubt, Wechselwirkungen zwischen dem modellierten Rezeptor und dem Kandidaten für einen Liganden zu analysieren. Eine Anzahl von Artikeln gibt einen Überblick über Computermodellierung von mit spezifischen Proteinen interaktiven Arzneimitteln, wie etwa Rotivinen, et al., 1988, Acta Pharmaceutical Fennica 97: 159–166; Ripka, New Scientist 54–57 (Jun. 16, 1988); McKinaly and Rossmann, 1989, Annu. Rev. Pharmacol. Toxiciol. 29: 111–122; Perry and Davies, OSAR: Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design S. 189–193 (Alan R. Liss, Inc. 1989); Lewis and Dean, 1989 Proc. R. Soc. Lond. 236: 125–140 und 141–162; und, im Hinblick auf einen Modellrezeptor für Nukleinsäurekomponenten, Askew et al., 1989, J. Am. Chem. Soc. 111: 1082–1090. Andere Computerprogramme, welche Chemikalien durchsuchen und grafisch darstellen, sind erhältlich von Unternehmen wie etwa BioDesign, Inc. (Pasadena, Calif.), Allelix, Inc. (Mississauga, Ontario, Canada), und Hypercube, Inc. (Cambridge, Ontario).
Zusätzlich kann das Peptid von Interesse (z.B. Pro385 oder Ser385 GABA_A α6) analysiert werden durch einen Alanin – Scan (Wells, Methods in Enzymol. 202: 390–411 (1991). Bei dieser Technik wird ein Aminosäurerest durch Alanin ersetzt und dessen Wirkung auf die Aktivität des Peptids wird durch einen funktionalen Test gemessen, so wie es in dem Beispiel 15 beschrieben worden ist. Ein jeder der Aminosäurereste des Peptids wird auf diese Weise analysiert und die wichtigen Bereiche des Peptids werden identifiziert. Danach wird dieser funktional wichtige Bereich auf einem computerlesbaren Medium aufgezeichnet, in einer ersten Datenbank in einem Computersystem gespeichert und ein Suchprogramm wird eingesetzt, so wie dies in den Beispielen 3, 4, 5 und unten beschrieben wird, um ein Proteinmodell des funktional wichtigen Bereiches zu erzeugen. Wenn erst einmal ein Proteinmodell erzeugt worden ist, dann wird mittels eines Suchprogramms auf eine zweite Datenbank zugegriffen, welche eine oder mehrere Bibliotheken mit Peptiden, Chemikalien, Peptidomimetika und anderen Mitteln enthält, welche mit Proteinen in Wechselwirkung treten, und dann werden einzelne Mittel mit dem Proteinmodell verglichen, um Mittel zu identifizieren, welche mit dem funktional wichtigen Bereich des Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Proteins in Wechselwirkung treten. Die Mittel, welche in Wechselwirkung treten und durch den obigen Ansatz identifiziert werden, werden dann in Tests getestet, welche den Ionentransport überwachen, so wie dies in dem Beispiel 15 beschrieben wird.
Es ist auch möglich, einen durch einen funktionalen Test ausgewählten, zielspezifischen Antikörper zu isolieren, und dann dessen Kristallstruktur zu lösen. Im Prinzip ergibt dieser Ansatz einen Pharmakern, auf dem nachfolgend ein Arzneimittelentwurf aufgebaut werden kann. Durch diesen Ansatz wird eine Protein – Kristallographie von den Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 gänzlich umgangen, indem man Antiidiotypenantikörper (Anti-Ids) zu einem funktionalen, pharmakologisch aktiven Antikörper erzeugt. Wie bei einem Spiegelbild eines Spiegelbildes, so würde man erwarten, dass die Bindungsstelle der Anti-Ids ein Analogon eines Bereiches des Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Proteins darstellt. Der Anti-Id könnte dann verwendet werden, um Peptide, Peptidomimetika und Chemikalien aus Bibliotheken von solchen Verbindungen zu identifizieren und zu isolieren, welche den Experten auf diesem Gebiet bekannt sind. Ausgewählte Peptide, Peptidomimetika und Chemikalien würden dann als der Pharmakern wirken. Man kann daher Arzneimittel entwerfen, welche eine Hemmung der Transportaktivität aufweisen, welche unterschiedlich bei Pro385 und Ser385 in Wechselwirkung treten oder welche das Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Protein gänzlich umgehen.
Viele Computerprogramme und Datenbanken können im Zusammenhang mit den Ausführungen der Erfindung verwendet werden. Die folgende Liste dient nicht dazu, die Erfindung zu begrenzen, sondern allein dazu einen Wegweiser zu liefern hin zu Programmen und Datenbanken, welche nützlich sind im Rahmen der Ausführungen der Nukleinsäure- und Proteinsequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung. Die Programme und Datenbanken, welche verwendet werden können, enthalten, ohne aber darauf beschränkt zu sein: MacPattern (EMBL), DiscoveryBase (Molecular Applications Group), GeneMine (Molecular Applications Group), Look (Molecular Applications Group), MacLook (Molecular Applications Group), BLAST und BLAST2 (NCBI), BLASTN und BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)), FASTA (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)), Catalyst (Molecular Simulations Inc.), Catalyst/SHAPE (Molecular Simulations Inc.), Cerius².DBAccess (Molecular Simulations Inc.), CHARMm (Molecular Simulations Inc.), Felix (Molecular Simulations Inc.), Modeler (Molecular Simulations Inc.), Modeller 4 (Sali and Blundell J. Mol. Biol. 234: 217–241 (1997)), ISIS (Molecular Simulations Inc.), Quanta/Protein Design (Molecular Simulations Inc.), WebLab (Molecular Simulations Inc.), WebLab Diversity Explorer (Molecular Simulations Inc.), Gene Explorer (Molecular Simulations Inc.), SegFold (Molecular Simulations Inc.), die EMBL/Swissprotein Datenbank, die MDL Available Chemicals Directory Datenbank, die MDL Drug Data Report Datenbank, die Comprehensive Medicinal Chemistry Datenbank „ Derwent's World Drug Index Datenbank, und die BioByteMasterFile Datenbank. Viele andere Programme und Datenbanken würden einem Experten auf diesem Gebiet aufgrund der vorliegenden Offenbarung offensichtlich werden.
BEISPIEL 7
Die Sonden gemäß der Erfindung können irgendeinem Bereich von Pro385 oder Ser385 so lange entsprechen, wie das Codon vorhanden ist, welches den Prolin- oder Serinrest an der Position 385 kodiert. Die Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Sonden sind im Allgemeinen mindestens 10 Basen lang und vorzugsweise mindestens 12, 15 oder 17 Basen lang. Stärker bevorzugt sind die Pro385Ser Sonden mindestens 20–30 Basen lang. In einigen Ausführungen können die Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Sonden mehr als 30 Basen lang sein.
Sonden, welche aus Nukleinsäuren abgeleitet sind, die Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 oder Teile derselben kodieren, können mit nachweisbaren Signalen gekennzeichnet sein, die den Experten auf diesem Gebiet geläufig sind, einschließlich von Radioisotopen und nicht radioaktiven Markierungen, um eine nachweisbare Sonde zu liefern. Die nachweisbare Sonde kann ein Einzelstrang oder ein Doppelstrang sein und sie kann hergestellt werden unter Verwendung von Techniken, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, einschließlich der in vitro Transkription, Nick Translation oder der Kinasereaktionen. Eine Nukleinsäureprobe mit einer Sequenz, die in der Lage ist, zu einer markierten Sonde zu hybridisieren, wird mit der markierten Sonde in Kontakt gebracht. Wenn die Nukleinsäure in der Probe aus einem Doppelstrang besteht, dann kann sie denaturiert werden, bevor sie mit der Sonde in Kontakt kommt. In einigen Anwendungen kann die Nukleinsäureprobe auf einer Oberfläche immobilisiert sein wie etwa auf einer Membran aus Nitrozellulose oder aus Nylon. Die Nukleinsäureprobe kann Nukleinsäuren enthalten, welche aus einer Vielfalt von Quellen erhalten worden sind, einschließlich aus genomischen DNA, cDNA Bibliotheken, RNA oder biologischen Proben. Unter einer biologischen Probe ist zu verstehen, dass sie eine Probe darstellt, die von einem Menschen erhalten werden kann, und dass sie nukleierte Zellen aufweist, die eine Nukleinsäure enthält. Eine biologische Probe in dem Zusammenhang der Erfindung kann zum Beispiel eine Probe sein, welche durch eine Venenpunktion einer Fingerspitze entnommen worden ist, oder ein Tupfer, welcher mit der inneren Wange eines Menschen in Berührung gebracht worden ist, womit Epithelialzellen gesammelt werden.
Verfahren, die verwendet werden, um das Vorhandensein von Nukleinsäuren nachzuweisen, die in der Lage sind, zu der nachweisbaren Sonde zu hybridisieren, umfassen gut bekannte Techniken wie Southern Blotting, Northern Blotting, Punkt-Blotting, Koloniehybridisierung und Plaquehybridisierung. In einigen Anwendungen kann die Nukleinsäure, die in der Lage ist, zu der markierten Sonde zu hybridisieren, in Vektoren geklont werden, etwa in Expressionsvektoren, oder in vitro Transkriptionsvektoren, um die Eigenschaft und Expression der hybridisierenden Nukleinsäuren in der Probe zu ermöglichen. Zum Beispiel können solche Techniken verwendet werden, um Sequenzen in einer genomischen Bibliothek oder cDNA Bibliothek zu isolieren und zu klonen, welche in der Lage sind, zu der nachweisbaren Sonde zu hybridisieren. Alternativ werden die Nukleinsäuren, welche Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 kodieren, unter Verwendung herkömmlicher Techniken aus der Molekularbiologie manipuliert, um rekombinante Konstrukte zu erzeugen, welche das Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Polypeptid exprimieren. Das Beispiel 8 liefert mehrere Ansätze, um das Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Protein oder Fragmente desselben zu synthetisieren, zu exprimieren und zu isolieren oder zu reinigen.
BEISPIEL 8
Um die durch Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 kodierten Proteine oder einen Teil derselben zu exprimieren, werden Nukleinsäuren, welche die Kodierungssequenz für die Proteine oder Teile derselben enthalten, erhalten und so in einen geeigneten Expressionsvektor kloniert, dass der Kodierungsbereich in einer arbeitsfähigen Weise mit einem heterologen Promotor verbunden ist. Die Nukleinsäure kann zum Beispiel ein Polypeptid kodieren, welches mindestens 3, 6, oder 10 aufeinander folgende Aminosäuren von der Sequenz enthält, die abgeleitet ist aus SEQ ID No: 11 oder 12. In einigen Ausführungen kann die Nukleinsäure ein Polypeptid kodieren, welches mindestens 15 aufeinander folgende Aminosäuren von der Sequenz enthält, die abgeleitet ist aus SEQ ID No: 11 oder 12. In anderen Ausführungen kann die Nukleinsäure ein Polypeptid kodieren, welches mindestens 25 aufeinander folgende Aminosäuren von der Sequenz von SEQ ID No: 11 oder 12 enthält. In anderen Ausführungen kann die Nukleinsäure ein Polypeptid kodieren, welches mindestens 60, mindestens 75, mindestens 100 oder mehr als 100 aufeinander folgende Aminosäuren von der Sequenz enthält, die abgeleitet ist aus SEQ ID No: 11 oder 12. In noch weiteren anderen Ausführungen kann die Nukleinsäure den gesamten Kodierungsbereich von Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 kodieren und sie weist ein Molekulargewicht von etwa 50 kD in 10% SDS PAGE auf.
Die Nukleinsäure, welche das Protein oder das Polypeptid kodiert, welches exprimiert werden soll, wird in einer arbeitsfähigen Weise mit einem Promotor in einem Expressionsvektor verbunden unter Einsatz der herkömmlichen Klonierungstechnologie. Der Expressionsvektor kann irgendeiner sein von den Säugetieren, von Hefe, von Insekten, von Parasiten oder von bakteriellen Expressionssystemen, welche nach dem Stand der Technik auf diesem Gebiet bekannt sind. Kommerziell erhältliche Vektoren und Expressionssysteme sind von einer Vielfalt von Lieferanten erhältlich, einschließlich von Genetics Institute (Cambridge, MA), Stratagene (La Jolla, California), Promega (Madison, Wisconsin) und Invitrogen (San Diego, California). Wenn es erwünscht ist, die Expression zu vergrößern und eine geeignete Proteinfaltung zu ermöglichen, dann kann der Codonzusammenhang und die Codonpaarung der Sequenz optimiert werden für den besonderen Expressionsorganismus, in den der Expressionsvektor eingeführt wird, wie dies von Hatfield et al. im U.S. Patent No. 5,082,767 erklärt wird. Weiterhin kann eine sekretorische Führungssequenz mit eingebunden werden, um so eine Reinigung des Proteins zu ermöglichen. Viele Vektorprodukte oder rekombinante Produkte mit einer Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Nukleinsäuresequenz (vollständige Länge oder ein Teil derselben), welche eine Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Proteinexpression ermöglichen, werden in Betracht gezogen.
Das Folgende wird als ein mögliches Verfahren geliefert, um die durch die oben beschriebenen Nukleinsäuren kodierten Proteine zu exprimieren. Zuerst wird das Methionin Startcodon für das Gen und das Poly A-Signal des Gens identifiziert. Wenn es der Nukleinsäure, welche das zu exprimierende Polypeptid kodiert, an Methionin mangelt, um als Startstelle zu dienen, dann kann ein initiierendes Methionin nahe an dem ersten Codon der Nukleinsäure eingeführt werden unter Verwendung herkömmlicher Techniken. In ähnlicher Weise kann dann, wenn es der Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 cDNA an einem Poly A-Signal mangelt, diese Sequenz zu dem Konstrukt hinzugefügt werden, zum Beispiel, indem man das Poly A-Signal aus pSG5 (Stratagene) ausspleißt unter Verwendung von BgII und SaII Restriktionsendonuklease Enzymen und indem man es in den Säugetier Expressionsvektor pXT1 (Stratagene) einbindet. pXT1 enthält LTRs und einen Teil des gag Gens von dem Moloney Murine Leukemia Virus. Die Position der LTRs in dem Konstrukt ermöglicht eine wirkungsvolle, stabile Transfektion. Der Vektor enthält den Herpes Simplex Thymidin Kinase Promoter und das auswählbare Neomycin Gen.
Die Nukleinsäure, welche das zu exprimierende Polypeptid kodiert, kann aus dem bakteriellen Vektor durch PCR erhalten werden unter Verwendung von Oligonukleotidprimern, welche komplementär zu der Nukleinsäure sind und welche Restriktionsendonukleasesequenzen für PstI enthalten, die in den 5' Primer und den BgIII an dem 5' Ende des entsprechenden cDNA 3' Primers eingebunden sind, wobei darauf zu achten ist, dass die Nukleinsäure in dem Raster mit dem Poly A-Signal positioniert ist. Das gereinigte Fragment, welches man aus der resultierenden PCR Reaktion erhält, wird mit PstI digeriert, mit einer Exonuklease als bündiges Ende abgeschlossen, digeriert mit BgIII, gereinigt und ligiert an pXT1, wobei es jetzt ein Poly A-Signal enthält und mit BgIII digeriert ist. Das ligierte Produkt wird in eine geeignete Zellenlinie transfektiert, z.B. NIH 3T3 Mäusezellen, unter Verwendung von Lipofectin (Life Technologies, Inc., Grand Island, New York) unter Bedingungen, welche in der Produktspezifikation dargelegt sind. Positive Transfektanten werden ausgewählt nach einem Wachsen und einer Aufzucht der transfizierten Zellen in 600 μg/ml 6418 (Sigma, St. Louis, Missouri). Vorzugsweise wird das exprimierte Protein in das Kulturmedium freigesetzt, wodurch eine Reinigung ermöglicht wird.
Alternativ kann die Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Nukleinsäure oder ein Teil derselben in pED6dpc2 kloniert werden, so wie es oben beschrieben worden ist. Die resultierenden pED6dpc2 Konstrukte können in eine Wirtszelle, wie etwa in COS1 Zellen, transfektiert werden. Gegenüber Methotrexat widerstandsfähige Zellen werden ausgewählt und vermehrt. Vorzugsweise wird das von der verlängerten cDNA exprimierte Protein in das Kulturmedium freigesetzt, wodurch eine Reinigung ermöglicht wird.
Eine andere durch die vorliegenden Erfinder betrachtete Ausführung verwendet das "Xpress System for expression and purification" (Invitrogen, San Diego, CA). Das Xpress System ist entworfen worden für eine auf hohem Niveau laufende Herstellung und Reinigung von rekombinanten Proteinen aus bakteriellen Zellen, Säugetier- und Insektenzellen. Die Xpress Vektoren erzeugen rekombinante Proteine, welche mit einem kurzen N-endständigen Führungspeptid verschmolzen sind, welches eine hohe Affinität für zweiwertige Kationen aufweist. Unter Verwendung eines Nickel chelatisierenden Harzes (Invitrogen) kann das rekombinante Protein in einem Schritt gereinigt werden und das Führungspeptid kann nachfolgend durch Spaltung mit einer Enterokinase entfernt werden.
Ein Vektor für die Expression des Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Polypeptids ist der pBlueBacHis2 Xpress. Der pBlueBacHis2 Xpress Vektor ist ein Baculovirus Expressionsvektor, welcher eine mehrfache Klonierungsstelle, ein gegenüber Ampicillin widerstandsfähiges Gen und ein lac-z Gen enthält. Nach einem Ansatz wird die Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Nukleinsäure oder ein Teil derselben in den pBlueBacHis2 Xpress Vektor kloniert und SF9 Zellen werden infiziert. Das Expressionsprotein wird dann isoliert und gereinigt gemäß den Anweisungen des Herstellers. Mehrere andere kultivierte Zellenlinien mit rekombinanten Konstrukten oder Vektoren, welche die Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Sequenz oder Teile derselben enthalten, sind Ausführungen der vorliegenden Erfindung und ihre Herstellung wird nach der gegebenen Darstellung der vorliegenden Offenbarung eine Routine sein.
Proteine in dem Kulturmedium werden auch durch Gelelektrophorese getrennt. Die getrennten Proteine werden dann unter Verwendung von Techniken nachgewiesen wie etwa Coomassie- oder Silbereinfärbung oder unter Verwendung von Antikörpern gegen das Protein. Coomassie- oder Silbereinfärbung sind den Experten auf diesem Gebiet vertraut.
Wenn erwünscht, dann können die Proteine durch Ammoniumsulfat ausgefällt werden oder auf der Grundlage der Größe oder der Ladung getrennt werden vor der Ektrophorese. Das Protein, welches durch das Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Gen, Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 cDNA oder einen Teil derselben kodiert wird, kann auch unter Verwendung von standard Techniken der Immunochromatographie gereinigt werden. Bei solchen Verfahren wird eine Lösung, welche das Protein enthält, wie etwa das Kulturmedium oder ein Zellenextrakt, auf eine Säule mit Antikörpern gegen das sekretierte Protein aufgetragen, welches an der Chromatographiematrix befestigt ist. Dem sekretierten Protein wird es ermöglicht, sich an die Immunochromatographiesäule zu binden. Danach wird die Säule gewaschen, um die nicht spezifisch gebundenen Proteine zu entfernen. Das spezifisch gebundene, sekretierte Protein wird dann von der Säule freigesetzt und unter Verwendung von Standard Techniken zurückgewonnen.
Wenn eine Antikörperproduktion nicht erwünscht ist, dann können die Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Nukleinsäure oder ein Teil derselben in die Expressionsvektoren mit eingebunden werden, welche für die Verwendung in Reinigungsschemata entworfen sind, die schimäre Polypeptide einsetzen. In solchen Strategien wird die Kodierungssequenz der Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Nukleinsäure oder eines Teiles derselben eingefügt in das Raster mit dem Gen, welches die andere Hälfte der Schimäre erfüllt. Die andere Hälfte der Schimäre kann eine Sequenz sein, welche ein β-Globin oder ein Nickel bindendes Polypeptid kodiert. Eine Chromatographiematrix mit einem daran befestigten Antikörper gegen β-Globin oder Nickel wird dann dazu verwendet, um das schimäre Protein zu reinigen. Proteasespaltungsstellen können hergestellt werden zwischen dem β-Globin Gen oder dem Nickel bindenden Polypeptid und der Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 cDNA wie etwa Enterokinase. Daher können zwei Polypeptide der Schimäre voneinander durch eine Proteasedigestion getrennt werden.
Ein nützlicher Expressionsvektor für die Erzeugung von -Globin Schimären ist pSG5 (Stratagene), welcher das Kaninchen β-Globin kodiert. Ein Intron II des Kaninchen -Globin Gens ermöglicht das Spleißen des exprimierten Transkriptes, und das Polyadenylations Signal, welches in das Konstrukt mit eingebunden ist, erhöht den Grad der Expression. Diese Techniken sind so, wie sie beschrieben sind, den Experten auf dem Gebiet der Molekularbiologie gut bekannt. Standard Verfahren sind in Texten über Verfahrensweisen veröffentlicht worden, etwa von Davis et al., (Basic Methods in Molecular Biology, L. G. Davis, M. D. Dibner, and J. F. Battey, ed., Elsevier Press, NY, 1996) und viele der Verfahren sind erhältlich von Stratagene, Life Technologies, Inc., oder Promega. Polypeptide können zusätzlich hergestellt werden aus dem Konstrukt unter Verwendung von in vitro Translationssystemen wie etwa dem In Vitro Express^TM Translation Kit (Stratagene).
Zusätzlich zu der Herstellung und Reinigung des Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Polypeptids unter Verwendung rekombinanter DNA Techniken können die Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Polypeptide, Fragmente und/oder Derivate derselben durch Verfahren der chemischen Synthese hergestellt werden (wie etwa Festphasen-Peptidsynthese) unter Verwendung von Verfahren, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, etwa diejenigen, die bekannt gemacht worden sind von Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1964), Houghten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 51: 32 (1985), und Stewart und Young (solid phase peptide synthesis, Pierce Chem Co., Rockford, IL (1984). Solche Polypeptide können mit oder ohne Methionin auf dem Aminoendstück synthetisiert werden. Chemisch synthetisierte Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Polypeptide oder Fragmente können unter Verwendung der in diesen Referenzen bekannt gemachten Verfahren oxidiert werden, um Disulfidbrücken zu bilden. Die Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Polypeptide oder Fragmente können eingesetzt werden als biologisch aktive oder immunologische Substitute für natürliche, gereinigte Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Polypeptide in therapeutischen und immunologischen Verfahren. Im Anschluss an die Synthese oder Expression und Reinigung der Proteine, welche durch die Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Nukleinsäure oder einen Teil derselben kodiert worden sind, können die gereinigten Proteine dazu verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, so wie dies in dem Beispiel 9 beschrieben wird.
BEISPIEL 9
Nach einem Ansatz wird ein im Wesentlichen reines Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Protein oder Polypeptid aus einer transfektierten oder transformierten Zelle isoliert. Die Proteinkonzentration in der abschließenden Herstellung wird angepasst, zum Beispiel durch eine Konzentration auf einem Amicon Filtergerät, an das Niveau von ein paar Mikrogramm/ml. Ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper zu dem Protein kann dann wie folgt hergestellt werden:
Ein monoklonaler Antikörper zu Epitopen von irgendeinem der, wie beschrieben, identifizierten und isolierten Peptide kann aus Murinhybridomas gemäß dem klassischen Verfahren von Kohler, G. und Milstein, C., Nature 256: 495 (1975) oder davon abgeleiteten Methoden hergestellt werden. Kurz gesagt, einer Maus werden wiederholt ein paar Mikrogramm des ausgewählten Proteins oder der davon abgeleiteten Peptide über eine Zeitdauer von einigen Wochen eingeimpft. Die Maus wird dann geopfert und die den Antikörper produzierenden Zellen der Milz werden isoliert. Die Milzzellen werden in der Gegenwart von Polyethylenglykol mit Myelomazellen der Maus verschmolzen und der Überschuss nicht verschmolzener Zellen wird zerstört durch das Wachstum des Systems auf einem selektiven Medium, welches Aminopterin (HAT Medium) enthält. Die erfolgreich verschmolzenen Zellen werden verdünnt und Aliquote der Verdünnung werden in die Vertiefungen einer Titrationsplatte gegeben, wo das Wachstum der Kultur fortgesetzt wird. Die Antikörper produzierenden Klone werden identifiziert durch den Nachweis eines Antikörpers in dem obenstehenden Fluid der Vertiefungen durch Immunoassay Verfahrensweisen, wie etwa ELISA, wie dasselbe ursprünglich von Engvall, E., Meth. Enzymol. 70: 419 (1980) beschrieben worden ist, und abgeleitete Verfahren derselben. Ausgewählte positive Klone können gedehnt werden und ihr monoklonales Antikörperprodukt für den Gebrauch geerntet werden. Detaillierte Verfahren für die monoklonale Antikörperproduktion sind von Davis, L. et al. Basic Methods in Molecular Biology Elsevier, New York, Section 21-2, beschrieben worden.
Polyklonales Antiserum, welches Antikörper zu heterogenen Epitopen eines einzelnen Proteins enthält, kann hergestellt werden, indem man geeignete Tiere mit dem exprimierten Protein oder mit davon abgeleiteten Peptiden, wie oben beschrieben, immunisiert, welche unmodifiziert oder modifiziert sein können, um die Immunogenität zu vergrößern. Eine wirksame polyklonale Antikörperproduktion wird durch viele Faktoren beeinflusst, welche sowohl mit dem Antigen als auch mit der Wirtsart zusammenhängen. Zum Beispiel neigen kleine Moleküle dazu, weniger immunogetisch zu sein als andere, und sie können die Verwendung von Trägern und Adjuvanzien erfordern. Auch variieren Wirtstiere in ihrer Antwortreaktion auf die Stelle der Einimpfungen und auf die Dosierung, in beiderlei Hinsicht bei inadäquaten oder übermäßigen Dosierungen eines Antigens, was zu einem geringen Titer an Antisera führt. Kleine Dosierungen (ng Niveau) eines Antigens, welche an mehrfachen intradermalen Stellen verabreicht werden, erscheinen am zuverlässigsten zu sein. Ein wirksames Immunisierungsprotokoll für Kaninchen kann man bei Vaitukaitis, J. et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 33: 988–991 (1971) finden.
Auffrischinjektionen können in regelmäßigen Zeitabständen gegeben werden und das Antiserum geerntet werden, wenn der Antikörpertiter desselben, wenn halb quantitativ bestimmt, zum Beispiel durch eine doppelte Immunodiffusion in Agar gegen bekannte Konzentrationen des Antigens zu fallen beginnt. Siehe zum Beispiel Ouchterlony, O. et al., Chap. 19 in: Handbook of Experimental Immunology D. Wier (ed) Blackwell (1973). Eine Plateaukonzentration des Antikörpers liegt gewöhnlich in dem Bereich von 0,1 bis 0,2 mg/ml eines Serums (etwa 12 M). Die Affinität der Antisera für das Antigen wird bestimmt, indem man konkurrierende Bindungskurven herstellt, wie dies beschrieben wird zum Beispiel durch Fisher, D., Chapter 42 in: Manual of Clinical Immunology, 2d Ed. (Rose and Friedman, Eds.) Amer. Soc. For. Microbiol, Washington, D.C. (1980).
Antikörperproduktionen, welche gemäß irgendeinem der beiden Protokolle hergestellt werden, sind nützlich in quantitativen Immunoassays, welche die Konzentrationen von den ein Antigen tragenden Substanzen in biologischen Proben bestimmen; sie werden auch halb quantitativ oder qualitativ verwendet (z.B. in diagnostischen Ausführungen, welche das Vorhandensein von Pro385Ser in biologischen Proben identifizieren). Das Beispiel 10 beschreibt ein auf einer Nukleinsäure beruhendes diagnostisches Verfahren gemäß der Erfindung.
BEISPIEL 10
In einer Ausführungsform wird eine DNA "Probe" aus einer biologischen Quelle wie etwa aus Blut von Versuchspersonen isoliert, welche einer BZD Therapie bedürfen. Ein Panel von PCR Primern, welche auf Bereichen von einer oder von mehreren Nukleinsäuren beruhen, die Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 kodieren, wir dann dazu verwendet, um DNA von annähernd 100–700 Basen in der Länge von den DNA Spezimen zu amplifizieren. Vorzugsweise überspannen die PCR Primer die Bereiche, in denen die polymorphen Varianten identifiziert worden sind. Als Kontrolle werden Sequenzen vom Wildtyp aus Personen einer Kontrollgruppe amplifiziert. Eine jede der Proben DNAs wird dann sequenziert unter Verwendung von standard Techniken, und ein einfacher Vergleich würde das Vorhandensein der Ser385 Allele und damit die Veranlagung und Prädisposition der Person gegenüber einer BZD Unempfindlichkeit identifizieren. Die PCR Primer, welche dazu verwendet werden, um das Vorhandensein von Pro385Ser in der Probe zu identifizieren, können auch in PCR Röhrchen gegeben werden und als diagnostische Testausrüstung verpackt werden. Obwohl man PCR bevorzugt, können andere Verfahren der Vervielfältigung wie etwa das Transcription Mediated Amplification Verfahren, welches in dem U.S. Patent 5,399,491 beschrieben ist, auch für die Praxis der Erfindung nützlich sein. Indem man die oben vorgestellten Diagnosen und das oben vorgestellte Verfahren verwendet, kann eine akurate Identifikation der Aminosäure an der Position 385 in der α6 Untereinheit des GABA_A Neurotransmitterrezeptors in einer Person schnell bestimmt werden und die Veranlagung der Person gegenüber einer BZD/Ethanol Unempfindlichkeit identifiziert werden. Das Beispiel 11 offenbart Hybridisierungsverfahren, welche dazu verwendet werden können, um das Vorhandensein von Pro385Ser in einer biologischen Probe zu identifizieren.
BEISPIEL 11
Bei einer anderen Ausführung wird das Verfahren des Beispiels 10 wiederholt, um ein Panel von vervielfältigten Sequenzen aus einem Spezimen zu erhalten. Die durch PCR erzeugte DNA wird dann mit einem oder mit einer Kombination von Restriktionsenzymen digeriert. Vorzugsweise wird die durch PCR erzeugte DNA mit Restriktionsenzymen digeriert. Solche Enzyme sind kommerziell erhältlich und den Experten auf dem Gebiet bekannt. Alternativ kann die aus Blut isolierte DNA, vorausgesetzt dass eine ausreichende Menge einer biologischen Probe erhalten werden kann, direkt mit Restriktionsenzymen digeriert werden und gemäß dem folgenden Verfahren getestet werden.
Nach der Digestion werden die resultierenden Genfragmente nach der Größe auf einem Gel aus Polyacrylamid getrennt und zu Nitrozellulose übertragen unter Verwendung von Elektroblotting Techniken, welche den Experten auf dem Gebiet gut bekannt sind. Alternativ können eine Agarosegel Elektrophorese und ein herkömmliches Southern Blotting angewandt werden. Für einen Überblick über Southern Blotting siehe Davis et al. (Basic Methods in Molecular Biology, 1986, Elsevier Press, S. 62–65).
Ein Panel von Sonden, welche auf der Sequenz der Nukleinsäure beruhen, welche Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 oder Teile derselben (mit mindestens 10 Basen) kodiert, wird radioaktiv oder kolorimetrisch unter Verwendung von Verfahren markiert, welche nach dem Stand der Technik bekannt sind, wie etwa die Nick Translation oder Endmarkierung, und hybridisiert zu dem Southern Blot unter Verwendung von Techniken, die nach dem Stand der Technik bekannt sind (Davis et al., supra). Vorzugsweise umfasst die Sonde mindestens 12, 15 oder 17 aufeinander folgende Nukleotide von der verlängerten cDNA (oder genomische DNAs, welche daraus gewonnen werden). Stärker bevorzugt umfasst die Sonde mindestens 20–30 aufeinander folgende Nukleotide von der verlängerten cDNA (oder genomische DNAs, welche daraus gewonnen werden). In einigen Ausführungen umfasst die Sonde mehr als 30 Nukleotide von den Nukleinsäuren, welche Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 oder Teile derselben kodieren. In anderen Ausführungen umfasst die Sonde mindestens 40, mindestens 50, mindestens 75, mindestens 100, mindestens 150 oder mindestens 200 aufeinander folgende Nukleotide von den Nukleinsäuren, welche Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 oder Teile derselben kodieren.
Viele Hybridisierungs- und Waschbedingungen sind den Experten auf dem Gebiet gut bekannt. Nach einem Ansatz wird die Nukleinsäuresonde hybridisiert zu der immobilisierten Nukleinsäure unter den folgenden Bedingungen: 7% Natriumdodecylsulfat (SDS = sodium dodecyl sulfate); 0,5 M NaPO₄ mit pH-Wert 7,0; 1 mM EDTA bei 50°C; und Waschen mit 1% SDS bei 42°C. Spezifischer gesehen wird das in dem Beispiel 12 beschriebene Verfahren dazu verwendet, um einen α6 Polymorphismus zu identifizieren.
BEISPIEL 12
Zwei Patienten, welche einer Behandlung mit Benzodiazepinarzneimittel bedürfen, werden identifiziert unter Verwendung diagnostischer Verfahren, welche den Experten auf dem Gebiet vertraut sind. Eine biologische Probe wird dann gewonnen, zum Beispiel Blutproben werden von den zwei Patienten entnommen, Populationen von nukleierten Blutzellen werden durch Zentrifugation erhalten und genomische DNA wird aus den resultierenden Zellenproben isoliert unter Verwendung von standard Laboratoriumsverfahren.
Teile der zwei Proben DNA werden dann als Quellen von Vorlagen in einer standard PCR Reaktion verwendet, welche Primer mit Polynukleotidsequenzen einsetzt, die durch SEQ ID No: 9 und SEQ ID No: 10 gegeben sind. Die sich daraus ergebenden Vervielfältigungsprodukte werden mit einer FokI Restriktionsendonuklease digeriert, die Digestionsprodukte werden auf einem Gel aus Polyacrylamid getrennt und das resultierende Gel wird mit Ethidiumbromid gefärbt, wobei alles gemäß den Standard Laboratoriumstechniken abläuft, welche den Experten auf dem Gebiet vertraut sind.
Die Ergebnisse aus der Elektrophoresetrennung weisen darauf hin, dass die zwei Patienten unterschiedliche α6 Polymorphismen aufweisen. Die vervielfältigte DNA von dem ersten Patienten ist 365 bp lang und durch die FokI Restriktionsendonuklease nicht gespalten, womit der Hinweis geliefert wird, dass der erste Patient durch ein gewöhnlicheres Pro385 α6 Allel gekennzeichnet ist. Umgekehrt wird die vervielfältigte DNA von dem zweiten Patienten in zwei Fragmente mit Längen von 261 bzw. 104 bp gespalten. Das letztere Ergebnis zeigt, dass der zweite Patient über den Pro385Ser Polymorphismus oder das Ser 385 Allel verfügt. Diese Ergebnisse weisen auch darauf hin, dass die zwei Patienten unterschiedlich empfindlich gegenüber Benzodiazepinarzneimitteln und Ethanol sein werden. Der Patient mit dem Pro385 α6 Allel wird mit Diazepam behandelt. Dieser Patient ist empfindlich gegenüber dem Arzneimittel und zeigt eine Verbesserung der Symptome, die durch eine Benzodiazepinarzneimitteltherapie behandelbar sind. Dass man herausgefunden hat, dass der zweite Patient das Ser 385 Allel trägt, weist darauf hin, dass der Patient weniger empfindlich gegenüber einer Therapie mit dem Benzodiazepinarzneimittel sein wird. Dementsprechend wird eine andere Medikamentation als ein Benzodiazepinarzneimittel für den zweiten Patienten verordnet. Eine schnelle Methode, um die Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Nukleinsäuresequenz in einer DNA-Probe nachzuweisen, wird in dem Beispiel 13 geliefert.
BEISPIEL 13
Eine andere Technik zur Identifizierung des Vorhandenseins von Ser385 und Pro385 oder von Teilen derselben verwendet eine Dot-Blot Hybridisierungstechnik. So wie oben wird die DNA isoliert, gereinigt oder vervielfältigt von der biologischen Probe, bevorzugt von Blut. Oligonukleotidsonden von annähernd 10–30 bp Länge werden synthetisiert, welche die Nukleinsäuren ergänzen, welche Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 oder Teile derselben kodieren. Diese Sonden werden dazu verwendet, um die genomische DNA durch Bedingungen zu hybridisieren, welche den Experten auf dem Gebiet bekannt sind, aber vorzugsweise in 7% Natriumdodecylsulfat (SDS); 0,5 M NaPO₄ mit pH-Wert 7,0; 1 mM EDTA bei 50°C; und Waschen mit 1% SDS bei 42°C. Die Oligonukleotide sind endmarkiert mit P³² unter Verwendung einer Polynukleotidkinase (Pharmacial) und die Dot-Blots werden erzeugt durch ein Auftragen der DNA aus der Probe auf der Nitrozellulose oder dergleichen unter Verwendung eines Dot-Blot-Manifolds unter Vakuum (BioRad, Richmond California). Der Nitrozellulosefilter, welcher die Genomsequenzen enthält, wird gebacken oder UV wird mit dem Filter verbunden, vorhybridisiert und hybridisiert mit einer markierten Sonde unter Verwendung von Techniken, die nach dem Stand der Technik bekannt sind (Davis et al., supra). Die ³²P markierten Fragmente DNA können sequentiell hybridisiert werden mit nachfolgend strengen Bedingungen, um minimale Unterschiede zwischen der 30 bp Sequenz und der DNA nachzuweisen. Das Erscheinen von radioaktiven Punkten auf der Membran stellt eine positive Hybridisierung und Identifikation des Vorhandenseins einer Nukleinsäure dar, welche Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 kodiert. Das Beispiel 14 liefert mehrere Ansätze, welche dazu verwendet werden können, um eine multimere Unterlage mit Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 oder Polypeptidfragmenten derselben zu erzeugen.
BEISPIEL 14
Eine multimerer Unterlage, welche Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 oder Polypeptide derselben umfasst, kann erhalten werden, indem man das Protein oder ein Polypeptidfragment an eine makromolekulare Unterlage koppelt. Eine "Unterlage" kann auch als ein Träger bezeichnet werden, die Unterlage oder der Träger kann ein Harz oder irgendeine makromolekulare Struktur sein, welche dazu verwendet wird, ein Protein oder Polypeptidfragment zu befestigen oder zu immobilisieren. In vielen Ausführungen wird eine Liposom- oder Lipiddoppelschicht (natürlich oder synthetisch) als ein Träger betrachtet. Der makromolekulare Träger kann eine hydrophobe Oberfläche aufweisen, welche mit den hydrophoben Bereichen des Proteins oder des Polypeptidfragments in Wechselwirkung tritt durch eine hydrophobe, nicht kovalente Wechselwirkung. Die hydrophobe Oberfläche des Trägers kann auch ein Polymer sein, wie etwa Plastik oder irgendein anderes Polymer, in welchem hydrophobe Gruppen verbunden worden sind wie etwa Polystyrol, Polethylen oder Polyvinyl. Alternativ kann ein Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Protein oder Polypeptidfragment desselben kovalent an Träger gebunden werden, einschließlich an Proteine und Oligo/Polysaccharide (z.B. Zellulose, Stärke, Glykogen, Chitisan oder aminierte Sepharose). In diesen letzteren Ausführungen kann eine reaktive Gruppe auf dem Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Protein oder Polypeptidfragment desselben, wie etwa ein Hydroxy oder Amino, verwendet werden, um zu einer reaktiven Gruppe auf dem Träger zu verbinden, um so die kovalente Bindung zu erzeugen. Weiterhin kann die Unterlage einen anorganischen Träger umfassen wie etwa Siliziumoxidmaterial (z.B. Silikatgel, Zeolith, Diatomeenerde oder animiertes Glas), mit dem das Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 oder die Polypeptidfragmente desselben kovalent verbunden sind durch eine Hydroxy-, Carboxyl- oder Aminogruppe und eine reaktive Gruppe auf dem Träger.
Wir ziehen ferner in Erwägung, dass die Einbindung von Linkern oder Zwischensequenzen, wie etwa Lambda Linker, zwischen dem Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Protein oder Polypeptidfragment und dem Träger, vorteilhaft sein kann. Die Einfügung von Lambda Linkern von einer geeigneten Länge kann eine größere Flexibilität in dem Molekül ermutigen und eine sterische Hinderung überwinden, welche auftreten kann, wenn das Protein an den Träger gebunden ist. Die Bestimmung einer geeigneten Länge eines Linkers, welche die optimale Bindung eines Liganden an das multimere Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Protein oder Polypeptidfragmente desselben ermöglicht, kann bestimmt werden, ohne dass es eines übermäßigen Experimentierens bedarf. Das Beispiel 15 liefert mehrere Screening Verfahren mit einem hohen Durchsatz, welche verwendet werden, um Mittel zu identifizieren, welche mit Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Protein oder Polypeptidfragmenten desselben in Wechselwirkung treten.
BEISPIEL 15
Ein Ansatz, welcher für die Markierung funktionaler Ionenkanäle entwickelt worden ist, basiert auf dem physikalischen Fluss leitender Ionen durch den Kanal von Interesse. Für ein Picoampere eines Ionenstromes können grob 10⁶ Ionen/s durch einen Ionenkanal hindurchwandern. Unter Ausnutzung der Eigenschaft von einwertigen Thallium (T (I⁺)) Ionen, bei einer sehr geringen Konzentration mit Halidionen zu kristallisieren, wie etwa Br^–, können funktionale Ionenkanäle markiert werden. Im Arbeitszustand werden die Thaliumionen, wenn sie erst einmal an einer Seite der Membran aufgetragen worden sind, durch die Kanalporen hindurchwandern, einen lokalen Anstieg der Thalliumkonzentration erzeugen und eventuell mit Br^– Ionen kristallisieren, welche auf der anderen Seite der Membran vorhanden sind. Die Kristalle wachsen auf eine sichtbare Größe und sie markieren damit den Ort von Ionenkanälen auf der Membran (siehe z.B. Lopatin et al., Biophysical Journal 74: 2159–2170 (1998)).
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird eine erste Gruppe von Xenopus Oocyten mit ungefähr 5 ng von Ser385 GABA_A α6 cRNA in die (dunkle) Tierhemisphäre (Pol) injiziert und eine Messung des Stroms an Oocyten und des Membranpotentials werden aufgezeichnet, um so einen Wert einer Basisbezugslinie zu liefern. Zur Kontrolle werden der Strom und das Membranpotential einer zweiten Gruppe von Xenopus Oocyten, welche mit ungefähr 5 ng Pro385 cRNA injiziert worden sind, gemessen. Die zwei Gruppen von Oocyten werden dann mit grob 50 nl von 30 mM KBr injiziert, um so die intrazellulare Konzentration von KBr auf grob 3 mM zu bringen, und die Spannung wird mit einer 2-Mikroelektroden Spannungsklemme in einer Thallium enthaltenden Lösung angelegt. Alsdann werden 40 × 410 ms lineare Spannungsrampen von –80 mV bis +50 mV bei einer Frequenz von 0,75 Hz angelegt, um den Eingangsfluss von Thalliumionen anzutreiben und die Ionenströme werden aufgezeichnet. Die zwei Gruppen von Oocyten werden dann fotografiert. Vielfache weiße Kristalle werden dann mit einem Lichtmikroskop auf der Tierhemisphäre sichtbar sein, wenn die den Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 exprimierenden Oocyten einen Ionentransport ermöglichen. Indem man die relativen Fähigkeiten der zwei Gruppen von Oocyten dahingehend miteinander vergleicht, Thallium zu kristallisieren, kann ein Experte auf diesem Gebiet leicht das Ausmaß bestimmen, bis zu dem das Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Protein als ein Ionentransporter fungiert. Zusätzlich kann der oben beschriebene Kristallisationsversuch in einer Titrationsplatte durchgeführt werden und Bibliotheken von Zusatzmitteln wie etwa Peptide, Peptidomimetika und Chemikalien können auf ihre Fähigkeit hin durchgescreent werden bezüglich ihrer Fähigkeit mit dem Grad des Ionentransportpotentials durch das Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Protein zu interferieren. Auf diese Art und Weise können Mittel, insbesondere BZD Arzneimittel und verwandte Verbindungen, schnell auf ihre Fähigkeit hin durchgescreent werden, mit dem Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Protein in Wechselwirkung zu treten und den Ionentransport zu modulieren.
Bei einem alternativen Verfahren werden Liposomen mit dem Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Protein mit Bromionen (Br) beladen. Nachfolgend werden die Liposomen, welche das Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Protein aufweisen, mit Thalliumionen in Kontakt gebracht und ein elektrischer Strom wird angelegt. Der lokale Anstieg an Thalliumkonzentration innerhalb des Liposoms wird durch eine mikroskopische Beobachtung von Kristallen nachgewiesen, welche sich an dem Ort der Ionenkanäle bilden. Durch den Vergleich der relativen Fähigkeiten der Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 tragenden Liposomen, Thallium zu kristallisieren, kann ein Experte auf diesem Gebiet leicht das Ausmaß bestimmen, bis zu dem Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 als ein Ionentransporter funktioniert. Zusätzlich kann der oben beschriebene Kristallisationsversuch in einer Titrationsplatte durchgeführt werden und Bibliotheken von Zusatzmitteln wie etwa Peptide, Peptidomimetika und Chemikalien können auf ihre Fähigkeit hin durchgescreent werden, den durch das Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Protein ermöglichten Ionentransport zu modulieren.
Um den Ionentransport direkt zu messen, wird eine Agarose Halbklemmtechnik verwendet, welche auf der Fähigkeit von Agarose beruht, sowohl Ionen als auch eine freie Lösung elektrisch zu leiten, während der Massenfluss von Ionen behindert wird. (Siehe z.B. Lopatin etal.) Nach diesem Ansatz werden die Oocyten, welche das Ser385 GABA_A α6 Protein exprimieren, und die Oocyten, welche das Pro385 Protein exprimieren, in ihrer Spannung in einer TICI Badlösung unter Spannung gesetzt und 2 Mikroelektroden werden verwendet, um die Ströme der Ionen aufzuzeichnen. Anschließend wird der Klemmstromkreis abgeschaltet, die Elektroden werden entfernt und die Zelle wird vollständig eingebettet in 1% Agar in der TICI Lösung. Nachdem sich das Agar gesetzt und auf Raumtemperatur abgekühlt hat, wird das Gelstück, welches die Zelle enthält, herausgeschnitten und die Spannung wird wieder an die Zelle angelegt. Durch den Vergleich der relativen Fähigkeiten der Oocyten, welche Pro385 GABA_A α6 exprimieren, und der Oocyten, welche Ser385 GABA_A α6 exprimieren, Elektrizität zu leiten, kann ein Experte auf diesem Gebiet leicht das Ausmaß bestimmen, bis zu dem Pro385 und Ser385 GABA_A α6 als ein Ionentransporter funktionieren. Zusätzlich kann die oben beschriebene Agarose Halbklemmtechnik in einer Titrationsplatte durchgeführt werden und Bibliotheken von Zusatzmitteln wie etwa Peptide, Peptidomimetika und Chemikalien können auf ihre Fähigkeit hin durchgescreent werden, den durch das Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Protein ermöglichten Ionentransport zu modulieren.
Nach einem alternativen Ansatz werden multimere Träger, an welchen das Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Protein oder Polypeptidfragmente derselben befestigt sind, eingesetzt werden und es kann eine Impedanzanalyse des Ionentransportes durch das immobilisierte Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Protein hindurch bestimmt werden. (Steinem et al., Bioelectro Chemistry and Bioenergetics, 42: 213–220, (1997)).
Bei dieser Ausführung werden zwei Typen von multimeren Trägern aufgebaut, indem man die Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Proteine vom Wildtyp in große unilamellare Vesikel (LW = Zarge unilamellar vesicles) von Dimethyldioctadecylammoniumbromid (DODAB) rekonstituiert, welche dann auf eine negativ geladene einlagige Schicht von 3-Mercaptopropionsäure (MPA) geschmolzen werden. Eine anfängliche Bestimmung der Impedanz in der Gegenwart verschiedener, einwertiger Kationen bei verschiedenen Konzentrationen wird dann durchgeführt für die zwei Typen der multimeren Träger. Eine A.C. Impedanzspektroskopie als ein integrales, elektrochemisches Verfahren wird verwendet, weil es die Möglichkeit bietet, die elektrischen Parameter dünner Filme, etwa von Biomembranen, ohne redoxaktive Markierungsionen zu bestimmen. Somit zeigen Ionen, welche die Membran durchdringen, einen Widerstand parallel zu der Membrankapazität und in Reihe mit der Kapazität des Substrats.
Eine A.C. Impedanzanalyse wird durchgeführt unter Verwendung eines SI 1260 Impedanzzunahme-/Phasen-Analysators von Solartron Instruments (Great Britain), gesteuert von einem Personal Computer. Experten auf diesem Gebiet würden aber in der Lage sein, andere A.C. Impedanzanalysatoren zu verwenden. Um den Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 multimeren Träger herzustellen, werden Goldelektroden während einer Zeitdauer von 10 Minuten einer 10 mM Lösung von der MPA ausgesetzt, um so eine hochgradig orientierte, selbst zusammengebaute, einlagige Schicht herzustellen. Danach werden die Elektroden extensiv mit einer Tris Pufferlösung von pH 8,6 ausgespült, um irgendwelche verbleibenden physisch absorbierten Moleküle zu entfernen. Um die Oberflächenbedeckung und damit die Qualität des Films zu steuern, wird ein jeder Schritt durch eine Impedanzspektroskopie überwacht. Eine Kapazität von etwa 9 mM F/cm² ist ein Referenzwert für eine erfolgreich aufgetragene einlagige Schicht.
Große unilamellare Vesikel (LUV) von DODAB (1,5 mg/ml) mit 1 mol% Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 werden durch ein Extrusionsverfahren in derselben Pufferlösung hergestellt, wie dies den Experten auf diesem Gebiet bekannt ist. (Steinem et al., Biochim. Biophys. Acta 1279: 169–180 (1996)). Die LUV Vesikel werden zu der hergestellten, einlagigen MPA Schicht in der elektrochemischen Zelle hinzugefügt. Eine zweilagige Schicht wird bei Raumtemperatur ohne Umrühren der Lösung hergestellt. Nach einer Stunde ist das Verfahren zu Ende und die Vesikelsuspension wird durch einen reinen Puffer ersetzt.
Die Bildung der festen, zweilagigen Trägerschicht wird dann durch Impedanzspektroskopie beobachtet und Messungen werden in der Abwesenheit von Ionen aufgenommen. Nachfolgend werden Impedanzmessungen in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen an LiCl, NaCl, KCl und CsCl aufgenommen. Nach der Zugabe von verschiedenen Konzentrationen von einer Art eines Ions zu der zweilagigen DODAB Schicht wird die Lösung ersetzt durch einen reinen Puffer und ein Impedanzspektrum wird aufgezeichnet, um zu gewährleisten, dass die feste, zweilagige Trägerschicht nicht auseinander gerissen wird. Das Ausmaß, bis zu dem das Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Protein die Fähigkeit aufweist, ein besonderes Ion zu transportieren, wird nachweisbar dadurch gegeben sein, dass die Impedanz des elektrochemischen Systems deutlich abnimmt, wenn die Konzentration des Ions zunimmt.
Ähnlich wie bei den oben beschriebenen Verfahren kann ein System mit einem hohen Durchsatz entworfen werden, um Bibliotheken von Verbindungen oder Mitteln daraufhin durchzuscreenen, welche mit dem Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 in Wechselwirkung treten würden und den Ionentransport modulieren würden. Im Wesentlichen wird der obige Ansatz nach oben skaliert und die Impedanzspektroskopie wird auf mehrfachen Messkammern durchgeführt, von denen eine jede über einen Satz von Arbeitselektroden verfügt. Impedanzmessungen werden vor der Zugabe des Mittels aus der Bibliothek von Peptiden, Peptidomimetika und Chemikalien vorgenommen, so dass ein Lesen einer Grundbezugslinie für ein besonderes Ion bestimmt wird. Wenn die Grundbezugslinie erst einmal aufgezeichnet ist, dann werden verschiedene Mittel zu einer jeden Messkammer hinzugetan und die Impedanzmessungen werden wieder aufgezeichnet. Mittel, welche mit dem Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Protein in Wechselwirkung treten und einen Ionentransport bewirken, werden dann identifiziert gemäß der relativen Änderung in der Impedanz bei dem Vorhandensein des Mittels. Das heißt, ein Anstieg der Impedanz des elektrischen Systems, wenn das Mittel vorhanden ist, verglichen mit dem Nichtvorhandensein des Mittels, wird zum Beispiel einen Hinweis darauf liefern, dass die Verbindung die Fähigkeit des Pro385 oder Ser385 GABA_A α6 Proteins beeinträchtigt, das Ion zu transportieren.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Polynukleotid, welches die α-6 Untereinheit des menschlichen GABA_A Neurotransmitterrezeptors kodiert, wobei das besagte Polynukleotid ein Codon für die Aminosäureposition 385 der besagten α-6 Polypeptidsequenz aufweist, wobei das besagte Codon einen Serinrest kodiert.
Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 1, bei welchem das besagte Polynukleotid die SEQ ID No: 12 mit enthält.
Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 1, bei welchem das besagte Polynukleotid mindestens 10 aufeinander folgende Basen von SEQ ID No: 12 enthält.
Isoliertes Polynukleotid gemäß Anspruch 1, bei welchem das besagte Polynukleotid mindestens 10 aufeinander folgende Basen umfasst, welche zu SEQ ID No: 12 hybridisieren oder zu einer dazu komplementären Sequenz unter den folgenden Bedingungen: 7% Natriumdodecylsulfat (SDS = sodium dodecyl sulfate); 0,5 M NaPO₄ pH-Wert 7,0; 1 mM EDTA bei 50°C; und Waschen mit 1% SDS bei 42°C.
Isolierte α-6 Untereinheit des menschlichen GABA_A Neurotransmitterrezeptors, welche einem Serinrest an der Aminosäureposition 385 aufweist.
Isolierte α-6 Untereinheit gemäß Anspruch 5, bei welcher ein oder mehrere Aminosäurereste durch eine andere Aminosäure ersetzt werden, was zu einer stillen Veränderung führt.
Isolierte α-6 Untereinheit gemäß Anspruch 6, bei welcher die besagte Untereinheit mindestens 3 aufeinander folgende Aminosäuren umfasst, welche von SEQ ID No: 12 abgeleitet sind.
Isolierter Antikörper, welcher spezifisch anbindet an die α-6 Untereinheit des menschlichen GABA_A Neurotransmitterrezeptors mit einem Serinrest an der Aminosäureposition 385 und welcher die besagte Untereinheit mit einem Serinrest an der Aminosäureposition 385 von einer Untereinheit mit einem Prolinrest an der Aminosäureposition 385 differenziert.
Antikörper gemäß Anspruch 8, bei welchem der besagte Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Verfahren zum Nachweis eines Polymorphismus in einem Gen, welches die α-6 Untereinheit des GABA_A Neurotransmitterrezeptors eines Menschen kodiert, welches die folgenden Verfahrensschritte umfasst: – ein Analysieren einer biologischen Probe auf das Vorhandensein eines diagnostischen Polynukleotids, wobei das besagte diagnostische Polynukleotid die α-6 Untereinheit des GABA_A Neurotransmitterrezeptors mit einem Serinrest an der Aminosäureposition 385 der α-6 Polypeptidsequenz kodiert; und – ein Feststellen, dass das besagte Gen den besagten Polymorphismus aufweist, wenn das Vorhandensein des besagten diagnostischen Polynukleotids in der besagten biologischen Probe nachgewiesen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 10, bei welchem das besagte Analysieren der besagten biologischen Probe weiterhin ein Durchführen einer Polymerasekettenreaktion (PCR = Polymerase Chain Reaction) umfasst, dies mit Oligonukleotidprimern, welche die Sequenzen von SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10 aufweisen.
Verfahren gemäß Anspruch 10, bei welchem das besagte Analysieren der besagten biologischen Probe weiterhin ein Durchführen einer FokI Restriktionsendonukleasedigestion umfasst.
Verfahren zum Feststellen, ob ein Mensch eine Empfindlichkeit gegenüber einem Benzodiazepinarzneimittel oder gegenüber Ethanol aufweist oder nicht, welches Verfahren die folgenden Schritte umfasst: – ein Analysieren einer biologischen Probe auf das Vorhandensein eines diagnostischen Polynukleotids, wobei das besagte diagnostische Polynukleotid die α-6 Untereinheit des GABA_A Neurotransmitterrezeptors mit einem Serinrest an der Aminosäureposition 385 der α-6 Polypeptidsequenz kodiert, oder wobei das besagte diagnostische Polynukleotid die α-6 Untereinheit des GABA_A Neurotransmitterrezeptors mit einem Prolinrest an der Aminosäureposition 385 der α-6 Polypeptidsequenz kodiert; und – ein Feststellen, dass der besagte Mensch keine Empfindlichkeit gegenüber einem Benzodiazepinarzneimittel oder gegenüber Ethanol aufweist, wenn das Vorhandensein eines Serinrestes an der Position 385 der α-6 Polypeptidsequenz nachgewiesen ist, und ein Feststellen, dass der Mensch eine Empfindlichkeit gegenüber einem Benzodiazepinarzneimittel oder gegenüber Ethanol aufweist, wenn das Vorhandensein eines Prolinrestes an der Position 385 der α-6 Polypeptidsequenz nachgewiesen ist
Verfahren gemäß Anspruch 13, bei welchem das besagte Benzodiazepinarzneimittel Diazepam ist.
Verfahren gemäß Anspruch 13, bei welchem das besagte Analysieren der besagten biologischen Probe weiterhin ein Durchführen einer Polymerasekettenreaktion (PCR) umfasst, dies mit Oligonukleotidprimern, welche die Sequenzen von SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10 aufweisen.
Verfahren gemäß Anspruch 13, bei welchem das besagte Analysieren der besagten biologischen Probe weiterhin ein Durchführen einer FokI Restriktionsendonukleasedigestion umfasst.
Verfahren zum Identifizieren eines Polymorphismus in dem Gen, welches die α-6 Untereinheit des menschlichen GABA_A Neurotransmitterrezeptors in einer biologischen Probe kodiert, welches den Schritt umfasst, eine erste Sequenz aus der besagten biologischen Probe, wobei die erste Sequenz ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem die α-6 Untereinheit von GABA_A kodierenden Gen, aus einer die α-6 Untereinheit von GABA_A kodierenden RNA, aus einer die α-6 Untereinheit von GABA_A kodierenden cDNA und aus einem der α-6 Untereinheit von GABA_A entsprechenden Polypeptid, mit einer zweiten Sequenz zu vergleichen, welche ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem Gen, welches die α-6 Untereinheit von GABA_A mit einem Prolin- oder Serinrest an der Aminosäureposition 385 kodiert, aus einer RNA, das die α-6 Untereinheit von GABA_A mit einem Prolin- oder Serinrest an der Aminosäureposition 385 kodiert, aus einer cDNA, das die α-6 Untereinheit von GABA_A mit einem Prolin- oder Serinrest an der Aminosäureposition 385 kodiert, und aus einem Polypeptid, das der α-6 Untereinheit von GABA_A mit einem Prolin- oder Serinrest an der Aminosäureposition 385 entspricht.
Verfahren gemäß Anspruch 17, bei welchem die besagte zweite Sequenz SEQ ID NO: 11 oder 12 ist.