ES2254157T3 - Subunidad alfa-6 del receptor poliformico humano gabaa. - Google Patents
Subunidad alfa-6 del receptor poliformico humano gabaa.Info
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Abstract
Polinucleótido aislado que codifica la subunidad 6 del receptor del neurotransmisor GABAA humano, en el que dicho polinucleótido tiene un codón para la posición 385 del aminoácido de dicha secuencia polipeptídica de 6, en el que dicho codón codifica un resto de serina.
Description
Subunidad \alpha-6 del receptor
polimórfico humano GABA_{A}.
La presente invención se refiere generalmente al
campo de la genética molecular. Más particularmente, la invención se
refiere a una secuencia polinucleotídica que codifica una subunidad
de la variante \alpha6 del receptor del neurotransmisor GABA_{A}
humano, prediciendo la secuencia de la variante sensibilidad tanto a
fármacos benzodiazepínicos como a etanol.
Estudios de herencia humana usando gemelos e
hijos adoptados han indicado que el alcoholismo es un trastorno
complejo que tiene un componente genético ("Hesselbrock, The
Genetic Epidemiology of Alcoholism" en The Genetics of
Alcoholism, Editado por Begleiter H, Kissin B. New York, Oxford
University Press, p. 17-39 (1995)). Los hijos de
alcohólicos (SOA) son un grupo con un riesgo elevado de desarrollar
alcoholismo (Cloninger et al., Arch Gen Psychiatry
36:861 (1981)), y así han sido el foco de numerosos estudios sobre
las respuestas subjetivas, psicomotoras, fisiológicas y bioquímicas
a etanol. (Schuckit, Alcohol Clin Exp Res 12:465 (1988);
Newlin et al., Psychol Bull 108:383 (1990); Pollock,
Am J Psychiatry 149:1534 (1992). Estos estudios han
identificado varias diferencias entre SOA y personas de control
masculinas, que pueden proporcionar pizcas a la base del riesgo
creciente de desarrollar alcoholismo.
Una de las distinciones entre SOA y personas de
control masculinas se refiere a la sensibilidad diferencial a
fármacos benzodiazepínicos (BZD) y a etanol. Más particularmente, se
ha demostrado que los SOA son significativamente menos sensibles a
BZD (Ciraulo et al., Am J Psychiatry 146:1333 (1989);
Cowley et al., Alcohol Clin Exp Res 16:1057 (1992);
Cowley et al., Alcohol Clin Exp Res 18:324 (1994)) y
al etanol (Schuckit et al., Arch Gen Psychiatry 53:202
(1996)) cuando se comparan con personas de control masculinas. Los
mecanismos genéticos y neurobiológicos que subyacen a esta
sensibilidad disminuida no están claros, debido a que estos fármacos
afectan a múltiples sistemas neurotransmisores en el sistema
nervioso central (SNC) (Deitrich et al., Pharmacol Rev
41:489 (1989)).
El ácido \gamma-aminobutírico
(GABA) es un neurotransmisor inhibidor clave en el SNC de los
mamíferos. Los receptores de GABA del subtipo A (GABA_{A}) son
canales de cloruro que se unen específicamente a fármacos
benzodiazepínicos con afinidad elevada (Luddens et al.,
Neuropharmacology 34:245 (1995)) para dar como resultado el
aflujo de iones cloruro. El análisis molecular ha revelado que los
canales del receptor de GABA_{A} son estructuras
heterooligoméricas compuestas de varias subunidades polipeptídicas
diferentes (\alpha1-6, \beta1-3,
\gamma1-3 y \delta) (Burt et al.,
FASEB J 5:2916 (1991)).
Dos líneas de hechos indicativos han implicado al
receptor de GABA_{A} en la sensibilidad diferencial al alcohol. En
primer lugar, las membranas cerebelosas de ratas "ANT" y
"AT" mostraron una afinidad diferencial por BZD.
(Uusi-Oukari et al., J Neurochem
54:1980 (1990)). Se han criado selectivamente las líneas de ratas
ANT sensible a alcohol (que no tolera el alcohol) y AT insensible al
alcohol (que tolera el alcohol), a fin de que muestren diferencias
en la sensibilidad a la disfunción motora inducida por el etanol. Se
cree que una sustitución Arg100Glu de aminoácidos en el receptor de
GABA_{A} \alpha6 es responsable al menos parcialmente de la
diferencia en la sensibilidad al alcohol que caracteriza a estas dos
líneas de ratas. La línea AT insensible al alcohol tiene la forma
Arg100 del receptor, y es insensible al diazepam cuando se compara
con el receptor Glu100 GABA_{A} \alpha6 (Korpi et al.,
Nature 361:356 (1993)).
En una segunda línea de hechos indicativos, se
implicó a la subunidad \gamma2 de GABA_{A} en la sensibilidad
diferencial de líneas de ratón de sueño largo (LS) y de sueño corto
(SS) al alcohol administrado una sola vez. (Wafford et al.,
Science 249:291 (1990)). Se usó un sistema de mutagénesis y
expresión in vitro, que emplea Xenopus oocytes, para
demostrar que el corte y empalme de ARN alternativo de una región de
la subunidad GABA_{A} \gamma2L, que codifica un sitio de
fosforilación de proteína quinasa C (PKC) de consenso, fueron
críticos para la modulación mediante etanol. (Wafford et al.,
Neuron 7:27 (1991); Wafford et al., FEBS Lett
313:113 (1992)). Claramente, existe la necesidad de comprender mejor
la base genética de la sensibilidad diferencial a fármacos
benzodiazepínicos y al alcohol en seres humanos.
Se describen composiciones y métodos basados en
un polimorfismo en el gen que codifica la subunidad \alpha6 del
receptor del neurotransmisor GABA_{A} humano. Este polimorfismo da
como resultado la sustitución de un resto de serina por un resto de
prolina, normalmente presente en la posición 385 de los aminoácidos
de la secuencia polipeptídica de GABA_{A} \alpha6. En un primer
conjunto de experimentos, se demuestra que los pacientes que tienen
el polimorfismo Pro385Ser exhiben una sensibilidad reducida a
diazepam, un fármaco benzodiazepínico conocido en la técnica por
imitar una respuesta del paciente a etanol, cuando se compara con
pacientes que tienen el resto de prolina en la posición 385 de
aminoácidos. Se encontró que el polimorfismo Pro385Ser está
asociado con un menor cambio en la ganancia del movimiento del ojo
de búsqueda suave, después de que se administró diazepam intravenoso
a niños de alcohólicos (COA). En un segundo conjunto de
experimentos, se demuestra que los pacientes que tienen el
polimorfismo Pro385Ser muestran una sensibilidad reducida a etanol,
cuando se comparan con pacientes que tienen el resto de prolina en
la posición 385 de aminoácidos. De este modo, el polimorfismo se
asoció con una menor sensibilidad al etanol y a fármacos
benzodiazepínicos.
En este documento, se han descubierto dos
diferencias genéticas, o "polimorfismos", que se producen en la
secuencia génica que codifica la subunidad \alpha6 del receptor
del neurotransmisor GABA_{A} humano. En la forma más predominante
de la subunidad \alpha6 del receptor del neurotransmisor
GABA_{A} humano, hay un resto de prolina en la posición 385 de
aminoácidos dada por la secuencia proporcionada por Hadingham et
al., Mol Pharmacol 49(2):253-259
(1996). Esta forma de la proteína de la subunidad \alpha6 del
receptor, o del polinucleótido que codifica la proteína de la
subunidad \alpha6 del receptor, que tiene un resto de prolina en
la posición 385 de aminoácidos, se denomina en esta memoria
descriptiva como "Pro385".
En esta invención, se ha descubierto un primer
polimorfismo, denominado "Pro385Ser" o "Ser385", en la
subunidad \alpha6 del receptor del neurotransmisor GABA_{A}
humano. Esta forma de la subunidad \alpha6 del receptor del
neurotransmisor GABA_{A} humano está caracterizada por una
sustitución de un resto de serina por el resto de prolina que
normalmente está presente en la posición 385 de los aminoácidos. En
algunos contextos, el término "Pro385Ser" o "Ser385" se
refiere a un polimorfismo en un polinucleótido que codifica la
proteína \alpha6 (en cuyo caso el polimorfismo es con referencia
al codón para la posición 385 de aminoácidos del polinucleótido que
codifica \alpha6), o a la propia proteína \alpha6 (en cuyo caso
el polimorfismo es con referencia a la posición 385 de aminoácidos
de la secuencia polipeptídica de \alpha6 dada por Hadingham et
al., Mol Pharmacol 49(2):253-259
(1996)). En otros contextos, el término Pro385Ser o Ser385 se
refiere a un polimorfismo en un polinucleótido que codifica un
fragmento de la proteína \alpha6 (en cuyo caso el polimorfismo es
con referencia al codón para la posición 385 de aminoácidos del
polinucleótido que codifica el fragmento de \alpha6), o a un
fragmento de la propia proteína de \alpha6, en cuyo caso el
polimorfismo es con referencia a la posición 385 de aminoácidos de
la secuencia de polipéptidos de \alpha6 dada por Hadingham et
al., Mol Pharmacol 49(2):253-259
(1996). El polimorfismo Pro385Ser también se puede denominar como
GABRA6 1236C > T para indicar el único cambio nucleotídico en la
posición 1236 que confiere la sustitución del resto de aminoácido de
prolina por el resto del aminoácido de serina en la posición 385 de
aminoácidos.
También se ha descubierto un segundo
polimorfismo, denominado G1031C, pero este cambio nucleotídico no
alteró la secuencia de aminoácidos del receptor de \alpha6. El
polimorfismo G1031C también se puede denominar como GABRA6
1031G>C.
El polimorfismo Pro385Ser se produce en una
porción de la subunidad \alpha6 del receptor del neurotransmisor
GABA_{A} humano que corresponde al segundo dominio intracelular
del receptor próximo a un sitio de fosforilación de proteína quinasa
C putativo. Mediante la frase "una porción de la subunidad
\alpha6 del receptor del neurotransmisor GABA_{A} humano" se
quiere decir un segmento de la secuencia polipeptídica de \alpha6
que incluye al menos 50-100 aminoácidos, más
preferiblemente al menos 20 aminoácidos contiguos, e incluso más
preferiblemente al menos 3, 6 ó 10 aminoácidos contiguos. El
polimorfismo Pro385Ser muestra una frecuencia alélica más rara de
0,08, mientras que el polimorfismo G1031C muestra una frecuencia
alélica más rara de 0,47. Por "alelo" o "variante alélica"
se quiere decir las secuencias polinucleotídicas naturales que
corresponden a los polimorfismos presentes en seres humanos.
En la siguiente descripción, primero se demuestra
que los pacientes que tienen el polimorfismo Pro385Ser muestran una
sensibilidad reducida a diazepam, un fármaco benzodiazepínico
conocido en la técnica por imitar la respuesta de una persona a
etanol, cuando se compara con pacientes que tienen el resto de
prolina en la posición 385 de los aminoácidos. Se encontró que el
polimorfismo Pro385Ser está asociado con menos cambio en la ganancia
de movimiento ocular de búsqueda suave después de que se administró
diazepam intravenoso a niños de alcohólicos (COA). Por el contrario,
el polimorfismo G1031C no se correlacionó con la sensibilidad al
diazepam. En segundo lugar, se demuestra que los pacientes que
tienen el polimorfismo Pro385Ser muestran una sensibilidad reducida
a etanol, en comparación con pacientes que tienen el resto de
prolina en la posición 385 de aminoácidos.
Se proporcionan herramientas biológicas, métodos
terapéuticos y métodos de uso de lo anterior. Además, se
proporcionan realizaciones que emplean diagnósticos o kits de
diagnóstico, que son particularmente útiles para la identificación
rápida del polimorfismo Pro385Ser y, de este modo, para la
determinación de la sensibilidad relativa a un fármaco de BZD o a
etanol en una persona que tiene un genotipo particular. En la
sección a continuación se expone el descubrimiento del polimorfismo
Pro385Ser con mayor detalle.
Aquellos que tienen una pericia normal en la
materia apreciarán que la sensibilidad diferencial a fármacos
benzodiazepínicos es un indicador útil de diferencias cerebrales que
se correlacionan con una variación del comportamiento, incluyendo la
susceptibilidad al alcoholismo. En ratas, por ejemplo, la variación
en la sensibilidad al alcohol y a benzodiazepinas se ha
correlacionado con una variante heredada del receptor GABA_{A}
\alpha6. Significativamente, se ha demostrado que las respuestas a
tareas del movimiento del ojo, que se pueden medir como ganancia de
sacudida ocular, velocidad pico de sacudida ocular, y ganancia de
búsqueda suave, son fiables y reproducibles en sesiones de ensayo, y
entre ellas, y, para ser objetivos, son medidas cuantificables
afectadas por BZD de una manera dependiente de la dosis.
(Roy-Byrne et al., Psychopharmacology
110:85-91 (1993); Roy-Byrne et
al., Biol Psychiatry 38:92 (1995)). En consecuencia, en
los procedimientos descritos a continuación, el ensayo del
movimiento del ojo proporcionó un medio conveniente para monitorizar
la sensibilidad al BZD y al etanol en pacientes humanos.
Basándose en el hallazgo de que los SOA muestran
una sensibilidad disminuida a BZD, y en el hecho de que estudios
genéticos de roedores implicaron a los receptores GABA_{A} en la
respuesta a BZD y al alcoholismo, se investigó en primer lugar si
los polimorfismos en el gen de la subunidad \alpha6 de GABA_{A}
estaban asociados con diferencias en la sensibilidad a BZD en niños
de alcohólicos. Los procedimientos empleados durante el desarrollo
de la investigación implicaron correlacionar la sensibilidad a BZD y
el genotipo. Más particularmente, los procedimientos implicaron
evaluar la sensibilidad a diazepam en COA usando dos tareas del
movimiento del ojo: la velocidad pico de la sacudida ocular y la
ganancia media de búsqueda suave. Se evaluó la variación genética en
la región codificante del gen del receptor GABA_{A} \alpha6 en
56 COA no relacionados, haciendo uso del método de polimorfismo
conformacional monocatenario. Se realizó el análisis de asociación
usando una sustitución Ser385, la variante G1031C sinónima, y el
haplotipo de GABA_{A} \alpha6, siendo las variables dependientes
la ganancia de búsqueda suave y la velocidad pico de sacudida
ocular. Como se indica más abajo, el genotipo de Ser385 se
correlacionó con una menor alteración, inducida por el diazepam, en
la ganancia media de búsqueda suave (t = 1,954, df = 53, p = 0,04),
pero no con la velocidad pico del movimiento ocular. El polimorfismo
G1031C sinónimo no se asoció con efectos alterados por diazepam
sobre la tarea del movimiento del ojo.
Las personas en los estudios descritos en este
documento fueron 26 hijos sin relación entre ellos, y 30 hijas, de
padres alcohólicos. Todos los sujetos eran caucásicos. Los sujetos
tenían entre 18 y 25 años de edad. Los trastornos psiquiátricos se
diagnosticaron mediante los criterios de
DSM-III-R, y usando la entrevista
clínica estructurada para DSM-III-R
(SCID). (Spitzer et al., Structured Clinical Interview for
DSM-III-R Patients Edition
(SCID-P, 911189 versión), New York, Biometrics
Research Department New York Psychiatric Institute, (1989)). Se
entrevistaron al probando y a al menos un familiar de primer grado,
con el programa y los criterios del Family Informant Schedule and
Criteria. (Mannuzza et al., Family Informant Schedule and
Criteria(FISC) Anxiety Disorders Clinic, New York, New York
Psychiatric Institute, 1985), una versión ampliada de los Criterios
de Diagnóstico de Investigación de Antecedentes Familiares
(Andreasen et al., Arch Gen Psychiatry 43:421 (1986)),
y con el Módulo de Evaluación de Antecedentes Familiares del SSAGA,
una entrevista de diagnóstico estructurada usada en el Estudio
Colectivo sobre la Genética del Alcoholismo. (Bucholz et al.,
J Stud Alcohol 55:149 (1994)).
Las modalidades descritas anteriormente nos
permiten confirmar el diagnóstico de dependencia del alcohol en el
padre, cómo muchos otros familiares de primer y segundo grado
estaban afectados, y nos permitieron determinar los antecedentes
familiares de otros trastornos psiquiátricos. Los COA estaban libres
de trastornos psiquiátricos según
DSM-III-R Eje I o Eje II, o
trastornos de uso de sustancias, durante todo el tiempo de vida,
excepto el trastorno de ajuste, y no tuvieron antecedentes de
trastorno de la personalidad antisocial. Todos los COA estaban
sanos, y según su informe no tomaron medicación durante al menos un
mes ni usaron una benzodiazepina más de una vez. Todos los pacientes
tuvieron identificaciones negativas fármacos en la orina, una
\gamma-glutamiltransferasa normal, y un volumen
corpuscular medio normal. El Ejemplo 1 describe los métodos que se
usaron para medir la sensibilidad a BZD en pacientes humanos, con
mayor detalle. En la sección a continuación se describe la
asociación de la sensibilidad a diazepam con los polimorfismos de
Pro385 y Ser385.
Inicialmente, en los 56 COA estudiados, se
midieron la velocidad de la sacudida ocular y la ganancia del
movimiento ocular de búsqueda suave. Se tomaron y se promediaron dos
medidas base para cada variable. Después se evaluaron las
diferencias a partir de esta línea base a puntos de tiempo
prefijados, después de cada una de cuatro dosis de diazepam. Los
puntos de los datos se usaron para determinar, mediante una técnica
trapezoidal, el área integrada bajo la curva resultante. El área
bajo la curva para la variable dependiente se dividió entonces entre
el área bajo la curva para los niveles plasmáticos de diazepam, para
corregir la variabilidad individual en los niveles de diazepam. Las
relaciones de las áreas bajo las curvas para los COA con el genotipo
homocigótico de Ser385 y el genotipo heterocigótico de Pro/Ser se
compararon entonces mediante la prueba de t. No hubo homocigotos
Ser/Ser en la población de ensayo de los COA. Para el genotipo
G1031C, se usó un ANOVA de una vía, para la asociación de
evaluación.
Los genotipos en cada lugar también se ensayaron
para determinar el equilibrio Hardy-Weinberg
mediante el Ensayo Exacto de Fisher. Se usó un método de
probabilidad máxima para estimar las frecuencias de haplotipo en
heterocigotos dobles. (Hill, Heredity 33:229 (1974); Weir,
Genetic data analysis II, Sunderland, MA, Sinauer Associates
(1996)). Las frecuencias de haplotipos de heterocigotos individuales
se determinaron mediante recuento directo. Usando estas frecuencias
de haplotipos, se calcularon el desequilibrio de unión normalizado
(A) y el desequilibrio de unión (D).
La variación polimórfica en la región codificante
de GABA_{A} \alpha6 de los 56 COA no relacionados se confirmó
entonces usando SSCP, seguido de una secuenciación de ADN. (Véase
Ejemplo 2). En la Tabla 2 se presentan los dos polimorfismos
relativamente abundantes que se identificaron en la región
codificante de \alpha6 (la Tabla 2 se puede encontrar en el
Ejemplo 2, infra). Se identificó una transición de timidina a
citosina en el nucleótido 1236 de la secuencia codificante, y la
transición da como resultado una sustitución de un resto de prolina
por un resto de serina en el codón 385. Este polimorfismo se
denominó "Pro385Ser" o "GABRA6 1236C > T". El segundo
polimorfismo identificado fue una sustitución silenciosa G a C en el
nucleótido 1031, y se denominó "G1031C" o GABRA6 1031G > C.
Como se presenta en el listado de secuencias anejo, la secuencia de
Pro385 se da mediante SEC ID nº 11, y la secuencia de Ser385 se da
mediante SEC ID nº 12. La secuencia de G1031C GABA_{A} \alpha6
se da mediante SEC ID nº 13, mientras que la secuencia de G1031C se
da mediante SEC ID nº 14.
También se usaron ensayos de
PCR-RFLP para facilitar la rápida genotipia
basándose en los dos polimorfismos de GABA_{A} \alpha6. (Véase
Ejemplo 2). Todos los sujetos genotipados mediante análisis de SSCP
y mediante PCR-RFLP produjeron resultados idénticos.
Las frecuencias de los alelos más raros de Pro385Ser y 1031C, en los
COA, fueron 0,08 y 0,47, respectivamente. Ambas distribuciones de
genotipos fueron consistentes con lo esperado, basándose en
estimados de equilibrio de Hardy-Weinberg. El nivel
de desequilibrio de unión entre Pro385Ser y G1031C fue significativo
(\Delta = 1,00, D = 0,0401, \chi^{2} = 10,8, d.f. = 1, p <
0,0005).
Se observó una asociación entre el genotipo de
Ser385 y una ganancia media del movimiento del ojo de búsqueda
suave, tras la administración intravenosa de diazepam (t = 1,952, df
= 53, P = 0,04). (Véase la Tabla 3). Los COA que tienen el alelo
Pro385Ser mostraron una sensibilidad reducida a diazepam, con
relación al grupo que consiste en COA que tienen el genotipo de
Pro385. Por "sensibilidad reducida" se quiere decir un nivel de
sensibilidad que es menor que el nivel de sensibilidad que
caracteriza a los individuos que tienen el genotipo de Pro385. Sin
embargo, el alelo Pro385Ser no se asoció con la velocidad pico del
movimiento de sacudida ocular (t = 0,171, df = 52, p = 0,865).
Además, no se encontró ninguna asociación entre el polimorfismo
G1031C sinónimo y ninguna de las dos tareas de movimiento ocular.
Los números de sujetos usados en los dos análisis varió debido a que
un individuo fue tan sensible a diazepam que los datos para la
velocidad de sacudida ocular no se pudieron recoger a la dosis más
elevada de diazepam.
| Genotipos en COA | ||||
| Ojo | Movimiento | Tarea | ||
| Genotipo | n | Velocidad pico de sacudida ocular | n | Ganancia de búsqueda suave* |
| (SD) | (SD) | |||
| Pro385Ser | ||||
| Pro/Pro | 45 | 0,3657 (0,1862) | 46 | 0,5280 (0,2461) |
| Pro/Ser | 9 | 0,3774 (0,1950) | 9 | 0,3602^{a} (0,1665) |
| Ser/Ser | 0 | 0 | ||
| G1031C | ||||
| G/G | 12 | 0,3691 (0,1544) | 12 | 0,5093 (0,2078) |
| G/C | 31 | 0,3688 (0,2036) | 32 | 0,5290 (0,2592) |
| C/C | 11 | 0,3629 (0,1802) | 11 | 0,4079 (0,2194) |
| ªValor t de la prueba de la t = 1,952, df = 53, p = 0,04; *multiplicado por 1000 |
Después, se intentó correlacionar variantes
polimórficas del receptor GABA_{A} \alpha6 en COA,
específicamente el genotipo de Ser385, con diferencias de la
velocidad del movimiento de sacudida ocular y de la ganancia del
movimiento ocular de búsqueda suave, en COA, antes y después de la
administración de diazepam, como se describe en la sección a
continuación.
Entre las 13 subunidades que comprenden los
complejos receptores de GABA_{A}/BZD, en mamíferos, la subunidad
\alpha6 es única en su farmacología insensible a agonistas
benzodiazepínicos, y en su distribución restringida. (Burt et
al., FASEB J 5:2916 (1991)). La expresión de GABA_{A}
\alpha6, por ejemplo, está limitada a granulocitos cerebelosos.
(Luddens et al., Neuropharmacology 34:245 (1995);
Luddens et al., Nature 346:648 (1990)). En el
procedimiento de genotipia expuesto anteriormente, se encontró que
el nivel de respuesta a alcohol en seres humanos se correlacionó con
el genotipo GABA_{A} \alpha6. Este descubrimiento es la primera
indicación de que se puede producir una diferencia en la respuesta
de seres humanos a diazepam, y de este modo en la respuesta a
etanol, a partir de una variante de origen natural en una subunidad
del receptor GABA_{A}. Sin desear estar limitados por ningún
mecanismo particular, y con fines sólo de explicación, se cree que
la unión de diazepam al receptor \alpha6 Ser385 modula corrientes
de GABA_{A}, lo que da como resultado las diferencias en la
ganancia del movimiento ocular de búsqueda suave observadas entre
sujetos que tienen el genotipo de Pro385.
No se observó ninguna asociación entre el
genotipo de Ser385 y el movimiento de sacudida ocular. Los
movimientos de sacudida ocular implican a la corteza parietal, a la
corteza frontal, y a conexiones asociadas con los ganglios basales,
así como al tubérculo cuadrigémino superior, y, finalmente, áreas
premotoras en la protuberancia. (Henn et al., Rev
Neurol 145:540 (1989)). Los movimientos de búsqueda ocular que
estuvieron asociados con Pro385Ser están mediados predominantemente
por múltiples áreas de la corteza y por el cerebelo. (Leigh et
al., The Neurology of Eye Movement. 2 ed. Philadelphia,
F.A. Davis Co., 1991). Por tanto, la ganancia de búsqueda suave y la
velocidad de sacudida ocular proporcionan una medida de los efectos
de BZD en el tronco encefálico y en la corteza/cerebelo,
respectivamente. Merece la pena señalar que la asociación de
Pro385Ser con los movimientos oculares de búsqueda, pero no con los
movimientos de sacudida ocular, corresponde a la expresión
restringida de GABA_{A} \alpha6 al cerebelo.
Tampoco se encontró ninguna asociación entre
G1031C y la sensibilidad a diazepam, a pesar del hecho de que
Pro385Ser y G1031C se encuentran en un fuerte desequilibrio de
unión. Aunque el desequilibrio de unión entre los dos lugares es
fuerte, las diferencias de frecuencias alélicas entre los dos
lugares pueden dar cuenta de la falta de asociación con la variante
sinónima G1031C más abundante.
Pro385 se conserva en los receptores de
GABA_{A} \alpha6 de ratas y ratones (Luddens et al.,
Nature 346:648 (1990)) (Kato, J Mol Biol 214:619
(1990)). El resto de aminoácido de Ser385 está localizado en el
segundo dominio intracelular del receptor, y en un sitio de diez
restos de aminoácidos eliminados de un sitio de fosforilación de
consenso para PKC. (Luddens et al., Nature 346:648
(1990)). Algunos creen que el dominio puede contribuir a la
especificidad del subtipo y a los mecanismos reguladores
intracelulares. (Olsen et al., FASEB J 4:1469 (1990)).
Sin embargo, hasta la actual memoria descriptiva, no se ha
confirmado ninguna función para este aminoácido ni para el
dominio.
Con respecto a la subunidad GABA_{A}
\gamma2L, es de interés que una variante de \gamma2
alternativamente cortada y empalmada, que contiene ocho aminoácidos
adicionales, tiene un sitio de consenso para la fosforilación
mediante PKC. (Whiting et al., Proc Natl Acad Sci USA
87:9966 (1990)). La mutagénesis dirigida al sitio de la secuencia
alternativamente cortada y empalmada indica que la subunidad
\gamma2L debe estar fosforilada para conferir sensibilidad al
etanol. (Wafford et al., Neuron 7:27 (1991); Wafford et
al., FEBS Lett 313:113 (1992)). Sin desear estar
limitados por ningún mecanismo particular, y con fines solamente de
explicación, se supone que un papel similar para este dominio de la
subunidad \alpha6 podría permitir a la variante Pro385Ser alterar
la sensibilidad del receptor a etanol y BZD.
Después de determinar que los individuos con el
polimorfismo Pro385Ser muestran una sensibilidad reducida a fármacos
benzodiazepínicos, en comparación con pacientes que tienen el
polimorfismo Pro385, se verificó que los individuos con el
polimorfismo Pro385Ser también muestran una sensibilidad reducida a
etanol, cuando se comparan con pacientes que tienen el polimorfismo
de tipo natural. Estos resultados se describen en la siguiente
sección.
El abuso y la dependencia del alcohol
(alcoholismo) son trastornos complejos que parece que reflejan
varias influencias genéticas que juntas pueden explicar el 40% al
60% de la varianza de riesgo. (Kendler et al., Arch Gen
Psychiatry 54:178-184 (1997); Pickins et
al., Arch Gen Psychiatry 48:19-28
(1991)). Un bajo nivel de respuesta (LR) al alcohol parece ser una
ruta mediante la cual está mediada la vulnerabilidad. Incluso
después de controlar otras influencias, el LR está aparentemente
tanto influido genéticamente como asociado con un riesgo mayor de
dependencia del alcohol. (Schuckit y Smith, Arch Gen
Psychiatry 53:202-210 (1996)). En seres
humanos, se ha encontrado que el LR se produce a una mayor
frecuencia entre hombres jóvenes bebedores, aunque no alcohólicos,
con antecedentes familiares positivos (FHP) (Pollock Am J
Psychiatry 149:1534-1538 (1991); Schuckit y
Smith 1996; Newlin y Thomson Psychol Bull
108:383-402 (1990)), aunque gemelos idénticos son
más similares en el LR que los gemelos bicigóticos. (Madden et
al., 1995; Rose et al., 1994). Tres seguimientos de
sujetos expuestos a alcohol han revelado tasas más altas de
alcoholismo, ingesta de alcohol, o problemas para individuos con un
bajo LR. (Rodríguez et al., Alcohol Clin Exp Res
17:155-161 (1993); Schuckit y Smith (1996); Volovka
et al., Arch Gen Psychiatry 53:258-263
(1996)). Además, se ha dado a conocer una correlación para LR de 0,3
a lo largo de dos generaciones de sujetos. Estudios de animales
apoyan la tesis de que las influencias genéticas impactan sobre el
LR (Crabbe et al., J Pharmacol Exp Ther
277:624-632 (1996)), y, en algunos estudios, se ha
señalado que los roedores con un bajo LR consumen cantidades mayores
de alcohol. (Gill et al., Alcohol Clin Exp Res
21:106A (1997); Li et al., Behavior Genetics
23:163-170 (1993)).
Como parte de un estudio más amplio, se
seleccionaron 41 hombres, de aproximadamente 39 años de edad, de
entre los primeros 113 seguimientos durante 15 años completados, en
un estudio en preparación. La genotipia se realizó selectivamente a
partir del primer grupo de hijos de alcohólicos descubiertos
consecutivamente y de los controles, de entre lo que será
eventualmente una población más grande como parte de un estudio en
curso. Diecisiete sujetos, cuyo bajo nivel de respuesta a etanol
(LR) a la edad de 20 años estaba en el tercio inferior, se
compararon, en cinco polimorfismos de cuatro genes, con 24 hombres
cuyas reacciones al alcohol han estado por encima de la mediana. Se
encontró que catorce hombres con el genotipo de LL del polimorfismo
del transportador de serotonina (5-HTT), y siete
hombres con el genotipo de Ser385 del polimorfismo GABA_{A}
(\alpha6), habían demostrado menores puntuaciones de LR a una edad
de aproximadamente 20 años, y tenían un riesgo significativamente
mayor de padecer alcoholismo que el de los otros genotipos para esos
lugares. Los cuatro sujetos con genotipos combinados de LL y Ser385
habían desarrollado alcoholismo, y demostraron en conjunto las
puntuaciones más bajas de LR. No hubo ningún indicio, en este
ejemplo, de que los dos polimorfismos del gen del receptor
5-HT_{2A} y uno del gen del receptor
5-HT_{2C} estuvieran relacionados con LR o con
alcoholismo.
Para este estudio piloto, se extrajeron muestras
de sangre de los primeros 41 hombres consecutivos apropiados entre
los primeros 113 que completaron los seguimientos durante 15 años en
un estudio en curso. A fin de identificar los sujetos que tienen
claramente un bajo LR, los hombres se seleccionaron para representar
los dos polos del LR. Estos incluyeron los primeros 17 sujetos que,
con una exposición original al alcohol, a la edad de aproximadamente
20 años, demostraron un LR global en el tercio más bajo, y los 24
cuyas intensidades de reacción al alcohol habían estado por encima
de la mediana (LR elevado). Las exposiciones a alcohol evaluaron
cambios a partir de la línea base para la sensación subjetiva de
intoxicación, equilibrio al estar de pie, y las hormonas después de
beber 0,75 ml/kg de etanol. (Schuckit y Gold, Arch Gen
Psychiatry 45:211-216 (1986)). El LR global se
evaluó como el cambio a partir de la línea base (prealcohol) hasta
el tiempo de la concentración de alcohol en sangre pico (BAG)
(valores de 60 minutos), después del consumo de alcohol.
Previamente, aproximadamente diez años antes del
ensayo inicial, se localizaron los 453 sujetos originales, y se
evaluaron con éxito 450 (99,3%) (Schuckit y Smith 1996). Los datos
piloto actuales se reunieron como parte del seguimiento de 15 años
en curso de la misma muestra. Para la genotipia, se extrajo sangre
en el momento de la entrevista hace 15 años, y los análisis se
realizaron de forma encubierta para la clasificación fenotípica de
los sujetos. Se genotiparon cinco polimorfismos a partir de ADN
genómico preparado a partir de líneas celulares de linfoblastoides,
según lo siguiente. Para 5HT2a T102C y His452Tyr, usando los métodos
descritos en cualquier otra parte, se tiparon los polimorfismos
mediante PCR y mediante ensayos de enzimas de restricción (Ozaki
et al., Biol Psychiatry 40:1267-1272
(1996)). 5HT2c Cys23Ser se genotipó creando un sitio de restricción
artificial usando un cebador de PCR que introduce una sustitución de
base próxima al codón de interés (Haliassos et al.,
Nucleic Acids Res. 17:3606 (1989)), y para 5HTTLPR, se logró
la amplificación de ADN usando los dos cebadores de flanqueo usados
por Heils et al. (J. Neurochem
66:2621-2624 (1996)). Este conjunto de cebadores
amplifica un fragmento de 484 ó 528 pb que corresponden al alelo
corto o largo de 5HTTLPR. El polimorfismo de Ser385 se genotipó
usando cebadores GABAa\alpha6 y GABAa\alpha6-9b:
5'CTG ACT CCA AAT ATC ATC TE3' (SEC ID nº 9) y 5'GAG AAG CAT CTA CAC
AAG TC3' (SEC ID nº 10). La amplificación con este conjunto de
cebadores dio como resultado un producto de PCR de 367 pb, que
contiene un sitio de restricción Fok I.
Los genotipos para cada uno de los cinco
polimorfismos se evaluaron frente a las tres variables dependientes
proporcionadas en la Tabla 4, basándose los diagnósticos en el
criterio del Manual de Diagnóstico y Estadístico, Tercera Revisión
(DSM-III-R), de la American
Psychiatric Association (1987). Las diferencias entre los dos o tres
genotipos disponibles en cada lugar se evaluaron mediante ANOVA o
mediante la prueba de la t de Student para variables continuas, y el
cuadrado de ji (\chi^{2}) con corrección de Yates, para datos
categóricos.
Los 41 hombres seleccionados para determinar el
LR bajo y alto fueron similares en edad (aproximadamente 39 años),
estado marital (aproximadamente el 73% estaba casado), y educación
(sólo el 5% carecía de educación universitaria). Consistente con los
informes anteriores (Schuckit y Smith 1996), los sujetos con bajo LR
tenían significativamente una mayor probabilidad de ser
diagnosticados como dependientes del alcohol durante el seguimiento
de 15 años (64,7% vs. 8,3%, \chi^{2} = 14,6, df - 1, p <
0,002). No hubo diferencias significativas en el grupo étnico de
origen informado (\chi^{2} = 7,16, df = 5, p = 0,21), y todos
los sujetos eran caucásicos.
La Tabla 4 presenta el genotipo mediante análisis
de rasgos para cada lugar de gen candidato. Para el polimorfismo
5-HTT, se observaron puntuaciones de LR
significativamente más bajas a la edad de 20 años para los 14
sujetos con el genotipo LL (p -0,04). Consistentes con estas
observaciones, los sujetos con el genotipo LL tuvieron
significativamente una mayor probabilidad de cumplir los criterios
de abuso o dependencia del alcohol en algún momento durante los 15
años del seguimiento (p = 0,04), pero no hubo diferencias entre los
grupos en la proporción con familiares alcohólicos. Debido a
indicios de que el alelo de 5-HTT S puede actuar de
manera dominante (Heils et al. J Neurochem
66:2621-2624 (1996)), se compararon los grupos de
genotipos SL y SS combinados con el grupo de LL, apoyando los
resultados una diferencia potenciada y estadísticamente
significativa en el LR medio (-0,89 \pm 1,00 vs. 0,16 \pm 0,75,
t = -2,64, df = 39, p = 0,1), y sólo en la proporción con un
diagnóstico de alcohólico (57,1% vs. 18,5%, \chi^{2} = 6,35, df
= 1, p -0,02). Aunque no se muestra en la Tabla, debido al
solapamiento con la puntuación media de LR, también se evaluó la
proporción de sujetos cuyo LR cayó en el tercio más bajo, para una
comparación con publicaciones anteriores. Esta proporción fue
también significativamente mayor para el grupo de LL (71,4% LL,
31,6% SL, y 125% SS; \chi^{2} = 8,7, df = 2, p = 0,02).
\newpage
También se observaron las asociaciones del
genotipo GABA_{A}_{\alpha}_{6} tanto con LR como con el
alcoholismo. Aquí, los individuos heterocigotos Pro/Ser tuvieron más
probabilidad de ser alcohólicos que los homocigotos Pro385 (p =
0,02), y también demostraron tendencias a una menor puntuación de LR
(p = 0,06) y a una mayor proporción de FHP (p = 0,07). Aunque no se
muestra en la Tabla 4, aquellos con Ser385 tuvieron más probabilidad
de estar en el tercio más bajo en respuesta al alcohol (71,4% vs.
35,3%, \chi^{2} = 3,12, df = 1, p = 0,08). Las comparaciones
entre los genotipos para los polimorfismos
5-HT_{T102C}, 5-HT_{2ATyr}
His452tyr, y 5-HT_{2C} Cys23Ser no demostraron
relación de genotipos con las puntuaciones de LR o con los
diagnósticos de alcoholismo.
También se llevó a cabo un análisis combinando la
información con relación al polimorfismo 5-HTT y
GABA_{A}_{\alpha}_{6}. Los cuatro hombres con una combinación
de ambos genotipos LL 5-HTT y Ser385 GABA_{A}
\alpha6 (los dos asociados de forma muy estrecha con un bajo LR y
con alcoholismo) tuvieron el LR más bajo a la edad de 20 años (-1,29
\pm 0,53 vs. -0,74 \pm 1,13 para LL/PP, -0,59 \pm 1,11 para
SL/PS, -0,13 \pm 0,88 para SUPP y 0,03 \pm 0,45 para SS/PP -
ensayo para la tendencia lineal t = 2,86, df = 4, p < 0,007). Los
cuatro sujetos cayeron en el tercio más bajo de LR, todos fueron
alcohólicos, y todos tuvieron FHP. En el otro extremo, los ocho
hombres que portan tanto los genotipos del receptor SS
5-HT como del receptor Pro385 GABA_{A} (los dos
genotipos asociados con las puntuaciones más elevadas de LR, y con
un estado no alcohólico) tuvieron la puntuación global de LR más
elevada, y fueron los menos tendentes a ser alcohólicos. No hubo
ningún indicio de una interacción entre los genotipos
5-HTT y GABA_{A}_{\alpha}_{6} (F(1,36)
= 0,01, p = 0,92). Como fue cierto en el análisis del lugar único,
estos resultados de dos lugares alcanzan incluso niveles más
elevados de significancia estadística si todos los sujetos con al
menos una copia del alelo S dominante se combinan en un grupo.
El análisis anterior demuestra la relación
significativa con LR y con el alcoholismo en dos lugares, la
variante del transportador de serotonina 5-HTTLPR y
la sustitución Ser385 de aminoácidos de GABA_{A} \alpha6. Los
indicios que apoyan la importancia del sistema del receptor
GABA_{A} en los efectos del alcohol y en el desarrollo del
alcoholismo son escasos. Los resultados anteriores verifican que el
polimorfismo Pro385Ser es indicativo de LR y de un futuro
alcoholismo. Además, la descripción anterior indica claramente que
el genotipaje de la subunidad \alpha6 humana del gen del receptor
GABA_{A} es útil para predecir si un individuo mostrará una
sensibilidad particular a etanol y/o a fármacos
benzodiazepínicos.
Aquellos que poseen una pericia normal en la
materia apreciarán que el análisis génico directo, usando la técnica
de SSCP, puede no ser suficientemente sensible para detectar todas
las posibles variantes de secuencias del gen del receptor GABA_{A}
\alpha6. En vista del hecho de que el 40% de la secuencia que
codifica el gen del receptor GABA_{A} \alpha6 no se identificó
en este estudio, es posible que variantes desconocidas en la
secuencia codificante o en la región promotora del gen de \alpha6
estén en desequilibrio de unión con las variantes Pro385Ser y G1031C
descritas en este documento. A la luz de los hallazgos presentados
anteriormente y de la descripción siguiente, sería normal el
descubrimiento de más polimorfismos del receptor GABA_{A}
\alpha6 que estén asociados con sensibilidad a etanol y a fármacos
benzodiazepínicos. Independientemente del polimorfismo particular
usado como marcador de sensibilidad genéticamente determinado a
etanol y a fármacos benzodiazepínicos, los hallazgos indican que los
métodos basados en el genotipaje de \alpha6 en seres humanos
pueden determinar una predisposición a sensibilidad a
benzodiazepinas/etanol. La sección a continuación describe muchos
enfoques que se pueden usar para identificar más polimorfismos en el
gen del receptor GABA_{A} \alpha6 que conduzcan a insensibilidad
a BZD y a etanol.
El análisis computacional preliminar reveló que
el polimorfismo Pro385Ser se produce en el segundo dominio
intracelular del receptor próximo a un sitio de fosforilación de
proteína quinasa C putativo. Las búsquedas de homología de bases de
datos de ácidos nucleicos y de proteínas, usando programas de
ordenador conocidos por los expertos en la materia, pueden revelar
otras proteínas transmembránicas con un motivo similar, y pueden
proporcionar una mayor comprensión de cómo el polimorfismo Pro385Ser
confiere insensibilidad a BZD/etanol. Además, empleando enfoques
convencionales en modelos de proteínas y métodos de diseño racional
de fármacos, se pueden obtener modelos de la estructura
tridimensional de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, y se pueden
identificar agentes que interaccionan u obvian el Pro385 o Ser385
GABA_{A} \alpha6. Los Ejemplos 3 a 6 describen varias
realizaciones de programas de ordenador y de equipos de ordenador, y
proporcionan métodos computacionales que se pueden usar para
caracterizar adicionalmente las secuencias de ácidos nucleicos y
polipeptídicas de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, y
desarrollar fármacos que interactúen con los receptores Pro385 o
Ser385 GABA_{A} \alpha6.
Aspectos de la invención también incluyen
vectores recombinantes, sondas, y cebadores que comprenden la
secuencia de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6. La exposición a
continuación describe realizaciones que tienen ácidos nucleicos de
Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6.
La secuencia del Pro385 y Ser385 GABA_{A}
\alpha6 se proporciona en el listado de secuencia (SEC ID nº 11 y
nº 12). Las secuencias de tipo natural y/o mutantes de Pro385 o
Ser385 GABA_{A} \alpha6, sus equivalentes funcionales, o
fragmentos de estas secuencias de al menos seis nucleótidos de
longitud que codifican Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, se
pueden usar según realizaciones de la invención. Preferiblemente,
las realizaciones de ácidos nucleicos comprenden al menos 12, 15 ó
17 nucleótidos consecutivos procedentes del ADNc extendido (o los
ADN genómicos obtenibles a partir del mismo). Más preferiblemente,
las realizaciones de ácidos nucleicos comprenden al menos
20-30 nucleótidos consecutivos procedentes del ADNc
extendido (o los ADN genómicos obtenibles a partir del mismo). En
algunos casos, las realizaciones de ácidos nucleicos comprenden más
de 30 nucleótidos procedentes de los ácidos nucleicos que codifican
Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, o porciones de los mismos. En
otros casos, las realizaciones de ácidos nucleicos comprenden al
menos 40, al menos 50, al menos 75, al menos 100, al menos 150, o al
menos 200 nucleótidos consecutivos a partir de los ácidos nucleicos
que codifican Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, o porciones de
los mismos. Los ácidos nucleicos enumerados en las SEC ID nº 9 a 10
son realizaciones deseables, por ejemplo. Las secuencias que
comprenden porciones hibridables de la secuencia de Pro385 o Ser385
GABA_{A} \alpha6 tienen uso, por ejemplo, en ensayos de
hibridación de ácidos nucleótidos, en análisis de transferencias
Southern y Northern, etc., como se describirá infra.
Algunas realizaciones comprenden ácidos nucleicos
recombinantes que tienen todo o parte del gen de Pro385 o Ser385
GABA_{A} \alpha6. Un constructo recombinante puede ser capaz de
replicarse autónomamente en una célula hospedante. Como alternativa,
el constructo recombinante se puede integrar en el ADN cromosómico
de la célula hospedante. Tal polinucleótido recombinante comprende
un polinucleótido de genómico o ADNc, de origen semisintético o
sintético en virtud de una manipulación por los seres humanos. Por
lo tanto, se proporcionan, mediante realizaciones de esta invención,
ácidos nucleicos recombinantes que comprenden secuencias de otro
modo no naturales. Aunque se pueden emplear Pro385 o Ser385
GABA_{A} \alpha6 como aparecen en la naturaleza, a menudo se
alterarán, por ejemplo, mediante supresión, sustitución o inserción,
y se acompañarán mediante una secuencia no presente en un ser
humano.
La secuencia de ácidos nucleicos representada en
el listado de secuencias (SEC ID nº 12) se puede alterar mediante
mutación, tal como sustituciones, adiciones, o supresiones, que
proporcionan secuencias que codifican moléculas funcionalmente
equivalentes. Según una realización, una molécula es funcionalmente
equivalente o activa, comparada con una molécula que tiene la
secuencia representada en SEC ID nº: 11 ó nº 12, si tiene la
capacidad de conferir insensibilidad al etanol o a BZD. Debido a la
degeneración de las secuencias codificantes de nucleótidos, en
algunas realizaciones de la presente invención se pueden usar otras
secuencias de ADN que codifiquen sustancialmente la misma secuencia
de aminoácidos que la derivada del listado de secuencias (SEC ID nº
11 ó 12). Éstas incluyen, pero no se limitan a, secuencias de ácidos
nucleicos que comprenden todo o porciones del gen de Pro385 o Ser385
GABA_{A} \alpha6 que se han alterado mediante la sustitución de
diferentes codones que codifican un resto de aminoácido
funcionalmente equivalente en la secuencia, produciendo de este modo
un cambio silencioso.
Además, las secuencias de ácidos nucleicos que
codifican Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6 recombinante de la
invención se pueden manipular mediante ingeniería para modificar el
procesamiento o expresión de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6.
Por ejemplo, y en modo alguno como limitación, el gen de Pro385 o
Ser385 GABA_{A} \alpha6 se puede combinar con una secuencia
promotora y/o con un sitio de unión a ribosoma, o se puede insertar
una secuencia señal en dirección corriente arriba de las secuencias
que codifican Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6 para permitir la
secreción de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, y facilitar de
ese modo la cosecha o la biodisponibilidad. Adicionalmente, un ácido
nucleico de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6 dado se puede mutar
in vitro o in vivo para crear y/o destruir las
secuencias de traducción, iniciación y/o terminación, o para crear
variaciones en regiones codificantes y/o formar nuevos sitios de
restricción o destruir los preexistentes, o para facilitar otra
modificación in vitro. Se puede usar cualquier técnica para
mutagénesis conocida en la materia, incluyendo pero sin limitarse a
mutagénesis dirigida al sitio in vitro (Hutchinson et
al., J. Biol. Chem. 253:6551 (1978)).
Usando las secuencias de ácidos nucleicos de
Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6 descritas en el listado de
secuencias (SEC ID nº 12), se pueden diseñar sondas y se pueden
fabricar mediante síntesis de oligonucleótidos, y se pueden
identificar librerías de ADNc o librerías genómicas para aislar
fuentes naturales de las realizaciones de ácidos nucleicos y de
homólogos de las mismas. Como alternativa, dichos ácidos nucleicos
se pueden proporcionar mediante amplificación de secuencias que
residen en el ADN genómico o de otras fuentes naturales mediante
PCR. El Ejemplo 7 describe la preparación de cebadores de PCR, y la
amplificación de ADN de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6.
Los ácidos nucleicos de la invención también se
pueden usar como reactivos en procedimientos de aislamiento y en
ensayos de diagnóstico. Por ejemplo, las secuencias procedentes de
ácidos nucleicos que codifican Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6,
o porciones de las mismas, se pueden marcar de forma detectable, y
se pueden usar como sondas para aislar otras secuencias capaces de
hibridarlas. Además, las secuencias procedentes de ácidos nucleicos
que codifican Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, o sus porciones,
se pueden usar para obtener cebadores de PCR mediante síntesis
oligonucleotídica convencional, para uso en procedimientos de
aislamiento y de diagnóstico. La exposición que sigue describe
algunos de los constructos de expresión y realizaciones de proteínas
de la invención.
Las proteínas de Pro385 o Ser385 GABA_{A}
\alpha6, o fragmentos, o derivados de las mismas, incluyen, pero
no se limitan a, aquellas que contienen como secuencia de
aminoácidos principal toda o parte de la secuencia de aminoácidos
sustancialmente como se deduce a partir de la secuencia enumerada en
SEC ID nº 11 ó 12, incluyendo secuencias alteradas en las que los
restos de aminoácidos funcionalmente equivalentes están sustituidos
por restos en la secuencia, dando como resultado un cambio
silencioso. En consecuencia, se puede sustituir uno o más restos de
aminoácidos dentro de la secuencia por otro aminoácido de una
polaridad similar que actúa como un equivalente funcional, dando
como resultado una alteración silenciosa. Los sustitutos de un
aminoácido dentro de la secuencia se pueden seleccionar de otros
miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo,
los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina,
isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano, y metionina.
Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina,
cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos
positivamente cargados (básicos) incluyen arginina, lisina, e
histidina. Los aminoácidos negativamente cargados (ácidos) incluyen
ácido aspártico y ácido glutámico. En otros aspectos de la
invención, se contemplan las proteínas de Pro385 o Ser385 GABA_{A}
\alpha6, o sus fragmentos o derivados, que se modifican
diferencialmente durante o después de la traducción, por ejemplo
mediante fosforilación, glicosilación, reticulación, acilación,
escisión proteolítica, enlace a una molécula de anticuerpo, molécula
de membrana, u otro ligando. (Ferguson et al., Ann. Rev.
Biochem. 57:285-320 (1988)).
En una realización, se contempla Pro385 o Ser385
GABA_{A} \alpha6, o una porción de la misma, en una línea
celular. Además, se preve el aislamiento o la purificación de la
proteína de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6. El Ejemplo 8
proporciona varios enfoques para sintetizar, expresar, y aislar o
purificar la proteína de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, o sus
fragmentos. El término "aislado" requiere que el material se
retire de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si es
de origen natural). Por ejemplo, un ácido nucleico o proteína de
origen natural presente en una célula viva no está aislado, pero el
mismo ácido nucleico o proteína, separado de parte o de todos los
materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Según
esta definición, la proteína o ácido nucleico de Pro385 o Ser385
GABA_{A} \alpha6, o los fragmentos de ácido nucleico o de
polipéptido de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, presentes en un
lisado celular, están "aislados". El término "purificado"
no requiere una pureza absoluta; más bien, está destinada a una
definición relativa. Por ejemplo, los ácidos nucleicos o proteínas
recombinantes se purifican de forma habitual hasta homogeneidad
electroforética, según se detecta mediante tinción con bromuro de
etidio o mediante tinción con Coomassie, y son adecuados en varios
ensayos a pesar de tener la presencia de contaminantes. El Ejemplo 8
proporciona varios enfoques para sintetizar, expresar, y aislar o
purificar la proteína de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, o sus
fragmentos. Tras la síntesis o expresión y purificación de las
proteínas codificadas por el ácido nucleico de Pro385 o Ser385
GABA_{A} \alpha6, o una porción del mismo, las proteínas
purificadas se pueden usar para generar anticuerpos como se describe
en la siguiente sección.
Los anticuerpos contemplados tienen muchos usos,
incluyendo, pero sin limitarse a, aplicaciones biotecnológicas,
aplicaciones terapéuticas/profilácticas, y aplicaciones de
diagnóstico. Aunque se pueden generar anticuerpos capaces de
reconocer específicamente la proteína de interés, usando péptidos
15-meros sintéticos que tienen una secuencia
codificada por el gen de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, o una
porción del mismo, inyectando los péptidos sintéticos en ratones,
para generar anticuerpos, se puede generar un conjunto más diverso
de anticuerpos usando una proteína de Pro385 o Ser385 GABA_{A}
\alpha6 recombinante o purificada, o sus fragmentos, como se
describe en el Ejemplo 9. La exposición que sigue describe varias
realizaciones de diagnóstico de la invención.
Generalmente, el diagnóstico y los métodos de uso
de los mismos se pueden clasificar según si el diagnóstico detecta
la presencia de ácido nucleico de Pro385 o Ser385 GABA_{A}
\alpha6 en una muestra, o la proteína de Pro385 o Ser385
GABA_{A} \alpha6 en una muestra. En consecuencia, la detección
del ácido nucleico y/o de la proteína de Pro385 o Ser385 GABA_{A}
\alpha6 en una muestra biológica indica una predilección a la
insensibilidad a BZD/etanol. Adicionalmente, se contempla la
fabricación de kits que incorporan los reactivos y métodos descritos
en las siguientes realizaciones, para permitir la detección rápida
del polimorfismo de Pro385Ser. Los kits de diagnóstico pueden
incluir una sonda de ácido nucleico o un anticuerpo, que detecta
específicamente el polimorfismo de Pro385Ser, por ejemplo, o que
puede detectar tanto el tipo natural como el mutante. El componente
de detección se suministrará típicamente en combinación con uno o
más de los siguientes reactivos. A menudo se suministrará un
sustrato capaz de absorber o de unirse de otro modo a ADN, ARN, o a
proteína. Los sustratos disponibles para este fin incluyen membranas
de nitrocelulosa, de nailon o de nailon derivatizado, que se pueden
caracterizar por poseer un conjunto de sustituyentes cargados
positivamente. Se pueden proporcionar en el kit una o más enzimas de
restricción, tales como Fok I, así como también polinucleótidos no
humanos como ADN del timo de ternero o de esperma de salmón.
Las técnicas de diagnóstico útiles basadas en
ácido nucleico incluyen, pero no se limitan a, hibridación
fluorescente in situ (FISH), secuenciación directa de ADN,
análisis de PFGE, análisis de transferencia Southern, análisis de
confirmación monocatenaria (SSCA), ensayo de protección de ARNasa,
análisis de transferencia de punto, y PCR. El punto de partida para
estos análisis es ADN aislado o purificado a partir de una muestra
biológica. De forma más simple, se extrae sangre del sujeto a
estudiar, y se extrae ADN de las células nucleadas en la sangre. En
algunos casos, se pueden usar cebadores, correspondientes a las
regiones de Pro385Ser, con PCR, para amplificar este ADN de forma
que se pueda detectar más fácilmente en las aplicaciones de
diagnóstico.
Para detectar el polimorfismo de Pro385Ser en una
muestra biológica, se pueden usar varios métodos. La secuenciación
directa de ADN, ya sea la secuenciación manual o la secuenciación
fluorescente automatizada, puede detectar una variación de
secuencias. Otro enfoque es el ensayo de polimorfismo de
confirmación monocatenario (SSCA) (Orita et al., Proc.
Natl. Acad Sci USA 86:2776-2770 (1989)),
expuesto anteriormente. Sin embargo, este método no detecta todos
los cambios de secuencias, especialmente si el tamaño del fragmento
de ADN es mayor que 200 pares de bases, pero se puede optimizar
para detectar la mayoría de la variación de secuencias de ADN. La
reducción de la sensibilidad de la detección es una desventaja, pero
el aumento del posible rendimiento con SSCA lo convierte en una
alternativa atractiva y viable para la secuenciación directa de la
detección de la mutación. Los fragmentos que tienen una movilidad
desplazada sobre geles de SSCA se secuencian entonces para
determinar la naturaleza exacta de la variación de la secuencia de
ADN. Otros enfoques basados en la detección de desemparejamientos
entre las dos cadenas de ADN complementarias incluyen la
electroforesis en gel desnaturalizante amordazada (CDGE) (Sheffield
et al., Am. J. Hum. Genet. 49:699-706
(1991)), el análisis de heterodúplex (HA) (White et al.,
Genomics 12:301-306 (1992)), y la escisión de
desemparejamiento químico (CMC) (Grompe et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86:5855-5892 (1989)). En un
repaso reciente por Grompe, Nature Genetics
5:111-117 (1993) se puede encontrar una revisión de
los métodos actualmente disponibles para detectar la variación de
secuencias de ADN.
Un análisis preliminar rápido, para detectar
polimorfismos y secuencias de ADN, se puede realizar observando una
serie de transferencias Southern de ADN cortado con una o más
enzimas de restricción, preferiblemente con un gran número de
enzimas de restricción. Cada bloque contiene líneas de ADN de
individuos no infectados, y el ADN a ensayar. Las transferencias
Southern que presentan fragmentos que se hibridan cuando se sondan
con secuencias que corresponden a Pro385Ser indican la presencia del
genotipo asociado con insensibilidad a BZD/etanol. La detección de
las mutaciones puntuales también se pueden lograr amplificando el
ADN directamente de la muestra, usando cebadores que corresponden a
las regiones de Pro385Ser mediante técnicas estándares de PCR.
Después se puede determinar la secuencia de ADN de las secuencias
amplificadas.
Hay seis métodos bien conocidos para confirmar la
presencia de Pro385Ser: 1) el análisis de confirmación monocatenario
(SSCA) (Drita et al.); 2) electroforesis en gel con gradiente
desnaturalizante (DGGE) (Wartell et al., Nucl. Acids Res.
18:2699-2705 (1990), Sheffield et al.,
Proc. Natl. Acad Sci USA 86:232-236 (1989),
3) ensayos de protección de ARNasa (Finkelstein et al.,
Genomics 7:167-172 (1990), Kinszler et
al., Science 251:1366-1370 (1991)); 4) el
uso de proteínas que reconocen desemparejamientos nucleotídicos,
tales como la proteína mutS de E.coli (Modrich, Ann. Rev.
Genet. 25:229-253 (1991); y la PCR específica de
alelo (Rano y Kidd, Nucl. Acids Res. 17:8392 (1989)). Para la
PCR específica de alelo, se usan cebadores que se hibridan en sus
extremos 3' a la mutación de Ser385 GABA_{A} \alpha6. Si la
mutación de Ser385 particular no está presente, no se observa un
producto de amplificación. También se puede usar el Sistema de
Mutación Refractaria a la Amplificación (ARMS), como se describe en
la Publicación de Solicitud de Patente Europea nº 0332435, y en
Newton et al., Nucl. Acids Res.
17:2503-2516 (1989).
En los primeros métodos (SSCA, DGGE, y en el
ensayo de protección de ARNasa), aparece una nueva banda
electroforética. El SSCA detecta una banda que migra
diferencialmente debido a que el cambio de secuencias provoca una
diferencia en el emparejamiento de bases intramolecular
monocatenario. La protección de ARNasa implica la ruptura del
polinucleótido mutante en dos o más fragmentos más pequeños. DGGE
detecta diferencias en las velocidades de migración de las
secuencias, en comparación con las secuencias de tipo natural,
usando un gel en gradiente desnaturalizante. En un ensayo
oligonucleotídico específico de alelo (ASO) (Conner et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:278-282
(1983)), se diseña un oligonucleótido que detecta una secuencia
específica, y se realiza un ensayo detectando la presencia o
ausencia de la señal de hibridación. En el ensayo de mutS, la
proteína se une sólo a las secuencias que contienen un
desemparejamiento nucleotídico en un heterodúplex, entre las
secuencias mutante y de tipo natural.
Los desemparejamientos según la presente
invención, son dúplex de ácidos nucleicos híbridos, en los que las
dos cadenas no son 100% complementarias. La falta de homología total
puede ser debida a supresiones, inserciones, inversiones o
sustituciones. La detección desemparejada se puede usar para
detectar mutaciones puntuales en el gen o en su producto de ARNm.
Aunque estas técnicas son menos sensibles que la secuenciación, son
más simples de realizar en un número grande de muestras
biológicas.
Un ejemplo de una técnica de ruptura de
desemparejamiento es el método de protección de ARNasa. En la
práctica, el método implica el uso de una ribosonda marcada que es
complementaria a la secuencia codificante del gen de Ser385. La
ribosonda y el ARNm o ADN aislado de la muestra biológica se
hibridan juntos y se digieren subsiguientemente con la enzima ARNasa
A, que es capaz de detectar algunos desemparejamientos en una
estructura de ARNasa de dúplex. Si se detecta un desemparejamiento
mediante ARNasa A, se produce la ruptura en el sitio de
desemparejamiento. De este modo, cuando el ARN hibridado se separa
en una matriz de gel electroforético, si se ha detectado y escindido
un desemparejamiento mediante ARNasa A, se observará un producto de
ARN que es mucho más pequeño que el ARN dúplex de longitud total
para la ribosonda y el ARNm o ADN. La ribosonda no necesita tener la
longitud completa de ARNm o del gen de Pro385 o Ser385 GABA_{A}
\alpha6. Será deseable usar un número de estas sondas para
identificar la totalidad de la secuencia de ARNm en busca de
desemparejamientos. De manera similar, se pueden usar sondas de ADN
para detectar desemparejamientos, mediante escisión enzimática o
química. Véase, por ejemplo, Cotton, et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85:4397 (1988), Shenk et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA Sci. USA 72:989 (1975), Novack et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:586 (1986).
Como alternativa, los desemparejamientos se
pueden detectar mediante desplazamientos en la capacidad
electroforética de los dúplex desemparejados con relación a los
dúplex emparejados (véase, por ejemplo, Cariello, Human
Genetics 42:726 (1988)). Ya sea con ribosondas o con sondas de
ADN, el ARNm o ADN celular que puede contener el gen de Ser385 se
puede amplificar mediante PCR antes de la hibridación. Las
secuencias de ADN aisladas de muestras biológicas, que se han
amplificado mediante uso de PCR, se pueden cribar usando sondas
específicas de alelo. Estas sondas son oligómeros de ácidos
nucleicos, cada uno de los cuales contiene una región de la
secuencia de Ser385. Por ejemplo, un oligómero puede tener
aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, y corresponde a una
porción de la secuencia de Ser385 citada en SEC ID nº 12. Mediante
el uso de una batería de dichas sondas específicas de alelo, se
pueden identificar productos de amplificación mediante PCR para
identificar la presencia del polimorfismo Pro385Ser. La hibridación
de las sondas específicas de alelo con secuencias de Pro385 o Ser385
GABA_{A} \alpha6 se puede realizar, por ejemplo, en un filtro de
nailon.
El ensayo más definitivo para determinar la
presencia del polimorfismo Pro385Ser es comparar directamente las
secuencias nucleotídicas o proteínicas aisladas de una muestra
biológica, con las de una población de control. La población de
control, por ejemplo, puede contener muestras de ácidos nucleicos de
ADN, ARN, ADNc, representativas de la secuencia de tipo natural,
como se enumera en SEC ID nº 11 (siendo experimental el polimorfismo
Pro385Ser, como se enumera en SEC ID nº 12). Como alternativa, se
podría secuenciar ARN mensajero después de la amplificación, por
ejemplo mediante PCR. Los Ejemplos 10-13 describen
métodos de diagnóstico de la invención basados en ácidos
nucleicos.
Además de los diagnósticos y de los métodos
basados en la detección de ácido nucleico que codifica Pro385 o
Ser385 GABA_{A} \alpha6, también se preven diagnósticos y
métodos basados en la detección de proteínas de Pro385 o Ser385
GABA_{A} \alpha6. La siguiente exposición detalla varias
realizaciones de este aspecto de la invención.
La presencia de la proteína de Pro385 o Ser385
GABA_{A} \alpha6 se puede detectar identificando la presencia de
la proteína usando ensayos convencionales. Por ejemplo, se pueden
usar anticuerpos monoclonales inmunorreactivos con la proteína de
Pro385 GABA_{A} \alpha6, para identificar muestras biológicas
para determinar la presencia del polimorfismo Pro385Ser. De forma
similar, se pueden usar anticuerpos específicos para la proteína de
Ser385 GABA_{A} \alpha6, para determinar la presencia del
polimorfismo Pro385Ser. Tales ensayos inmunológicos se pueden
realizar en muchos formatos convenientes.
En una realización preferida, los anticuerpos
inmunoprecipitarán específicamente la proteína de Ser385 GABA_{A}
\alpha6 (por ejemplo, no reaccionarán de forma cruzada con la
proteína de Pro385) a partir de la disolución, así como también
reaccionarán específicamente con la proteína de Ser385 en
transferencias Western o en inmunotransferencias de gel de
poliacrilamida. En otra realización preferida, los anticuerpos
detectarán Ser385 en parafina o secciones congeladas, usando
técnicas inmunocitoquímicas. Las realizaciones preferidas que se
refieren a los métodos para detectar la proteína Pro385 o Ser385
GABA_{A} \alpha6 incluyen ensayos de inmunoabsorbentes ligados a
enzimas (ELISA), radioinmunoensayos (RIA), ensayos
inmunorradiométricos (IRMA), y ensayos inmunoenzimáticos (IEMA),
incluyendo ensayos de sándwich que usan anticuerpos monoclonales y/o
policlonales. Los ensayos de sándwich ejemplares se describen por
David et al., en las patentes U.S. nº 4.376.110 y nº
4.486.530.
También se contempla la preparación de kits de
diagnóstico que comprenden anticuerpos específicos para la proteína
de Ser385, y que no son reactivos de forma cruzada con la proteína
de Pro385. Tales kits pueden incluir también membranas de
nitrocelulosa o de nailon para inmovilizar la proteína de una
muestra biológica a ensayar. Los resultados de los ensayos del kit
pueden ser interpretados por un profesional sanitario, o por un
laboratorio de diagnóstico. Como alternativa, los kits de
diagnóstico se fabrican y se venden a personas individuales para el
autodiagnóstico. Además, se contempla el diseño y la fabricación de
soportes que tienen polipéptidos de Pro385 o Ser385 GABA_{A}
\alpha6, como se describe más abajo, para uso en métodos para
identificar agentes que interaccionan con los polipéptidos de Pro385
o Ser385 GABA_{A} \alpha6.
Una herramienta biotecnológica útil para el
descubrimiento de agentes que interactúan con Pro385 o Ser385
GABA_{A} \alpha6, o que obvian Pro385 o Ser385 GABA_{A}
\alpha6 (por ejemplo, detección de elevado rendimiento),
proporciona deseablemente Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6 de
tal forma o de tal manera que se obtiene una suficiente afinidad
para el agente. Por ejemplo, aunque Pro385 o Ser385 GABA_{A}
\alpha6 monomérico (es decir, que aparece como una unidad discreta
de la proteína sobre un soporte) es suficientemente activo para
mediar la asociación con un agente, Pro385 o Ser385 GABA_{A}
\alpha6 multimérico (es decir, que aparece como múltiples unidades
de la proteína sobre un soporte) puede tener una afinidad mucho
mayor por el agente, y proporcionaría suficientes sucesos de unión
para ser detectable mediante métodos convencionales. El Ejemplo 14
proporciona varios enfoques que se pueden usar para crear un soporte
multimérico que tenga Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6 o sus
fragmentos polipeptídicos. Los soportes multiméricos se pueden usar
en métodos de detección de alto rendimiento, varios de los cuales se
describen en la siguiente sección.
La detección de elevado rendimiento es un enfoque
para el descubrimiento de fármacos que busca una proteína, péptido,
peptidomimético, o producto químico que interaccionará sobre una
diana definida, tal como la proteína de Pro385 o Ser385 GABA_{A}
\alpha6, o un fragmento polipeptídico de la misma. Generalmente,
se detecta una librería de proteínas, polipéptidos, péptidos,
peptidomiméticos, o productos químicos, denominados colectivamente
como "agentes", frente a la diana, en ensayos biológicos, y los
agentes que interaccionan con la diana se identifican y se usan
directamente como agentes terapéuticos o como una base para
desarrollar nuevos agentes terapéuticos usando química combinatoria
y modelado de proteínas. El Ejemplo 15 proporciona varios métodos de
identificación de elevado rendimiento que se usan para identificar
agentes que interaccionan con la proteína Pro385 o Ser385 GABA_{A}
\alpha6 o con fragmentos polipeptídicos de la misma.
El Ejemplo 1 describe los métodos que se usaron
para medir la sensibilidad a BZD en sujetos humanos.
Ejemplo
1
Se estudiaron COA en dos días separados una
semana entre ellos. Se insertaron catéteres intravenosos en las
venas anteriores del codo, en cada uno de los brazos de los
pacientes. Una vía intravenosa se usó para extraer sangre, mientras
que la otra se usó para la administración de diazepam o de placebo.
Se proporcionaron infusiones de forma doblemente enmascarada y en
orden aleatorio. En el día en el que se administró diazepam, el
fármaco se administró a intervalos de 15 minutos en cuatro dosis de
25, 25, 50 y 100 \mug/kg (produciendo dosis acumuladas
logarítmicamente crecientes de 25, 50, 100 y 200 \mug/kg). Cada
dosis se inyectó a lo largo de 60 segundos. En el día en el que se
administró el placebo, se inyectó disolución salina en volúmenes
similares y en los mismos tiempos.
En cada día de ensayo, se midieron las respuestas
en 12 puntos de tiempo separados: dos veces en la línea base, una
vez después de cada una de las cuatro dosis, y en cada uno de seis
intervalos de 30 minutos después de la última dosis, durante un
período que se prolonga tres horas. Se evaluaron los movimientos
oculares en cada punto de tiempo. Se extrajo sangre para la
determinación de los niveles plasmáticos de diazepam en cada punto
de tiempo, del brazo contralateral al usado para la inyección del
fármaco. Las concentraciones plasmáticas de diazepam se midieron
mediante cromatografía de gas-líquidos de captura de
electrones, según el método descrito por Greenblatt et al.,
en Psychopharmacology 70:89 (1989). También se cuantificaron
los niveles del metabolito principal diazepam, el desmetildiazepam,
pero en todos los casos los niveles de desmetildiazepam fueron mucho
menores que los niveles del fármaco progenitor.
La velocidad pico del movimiento de sacudida
ocular, y la ganancia media del movimiento ocular de búsqueda suave,
se registraron como se describe por Cowley et al., en
Alcohol Clin Exp Res 18:324 (1994), usando un dispositivo
oculográfico mediante infrarrojos no invasivo (Eye Trac modelo 210,
ASL Laboratories, Waltham, MA), con una precisión de 0,25 grados. En
la tarea del movimiento de sacudida ocular, los sujetos siguieron
una serie de 27 objetivos parpadeantes, presentados cada uno durante
2 segundos. Las etapas de los objetivos variaron al azar de 3 a 27
grados de amplitud. Puesto que la velocidad de sacudida ocular
aumenta de manera curvilínea como función de la amplitud (una
relación conocida como la "secuencia principal"), las
velocidades a diversas amplitudes se ajustaron a una ecuación
exponencial de la forma: velocidad pico =
a-b^{-x/c}, en la que x = a la amplitud de la
sacudida ocular, y a, b y c son constantes. (Bahill et al.,
Math Biosci 24:191 (1975)). La secuencia principal se usó
para calcular la velocidad pico para una sacudida ocular de 20
grados idealizada, en cada punto de tiempo para cada sujeto.
Durante la tarea de búsqueda suave, el objetivo
se movió de forma trapezoidal, entre 15 grados a la izquierda y 15
grados a la derecha del centro, a una velocidad constante de 10
grados por segundo. Después de dos pendientes de prácticas, los
datos se recogieron de 14 pendientes, cada una de 3 segundos de
duración. Después de la identificación de las sacudidas oculares y
de los artefactos, los segmentos de búsqueda que quedan se usaron
para calcular la ganancia media ponderada frente al tiempo
(velocidad ocular/velocidad del objetivo, como se describe por Abel
et al., en Biol Psychiatry 29:1063 (1991)). El Ejemplo
2 describe métodos que se usaron para identificar polimorfismos
genéticos en las secuencias polinucleotídicas que codifican la
subunidad de GABA_{A} \alpha6.
Ejemplo
2
La amplificación de ADN genómico, aislado de
líneas celulares linfoblastoides inmortalizadas de
Epstein-Barr, se llevó a cabo usando los cinco pares
de cebadores enumerados en la Tabla 1. Estos pares de cebadores
amplificaron cinco regiones que no solapan, que cubren el 60,3% de
la secuencia codificante del gen del receptor de GABA_{A}
\alpha6 humano. (Hadingham et al., Mol Pharmacol
49:253 (1996)). Puesto que las secuencias polinucleotídicas de los
intrones del receptor GABA_{A} \alpha6 humano eran desconocidas,
todos los cebadores se diseñaron para ser complementarios a las
secuencias exónicas adyacentes a las fronteras de
exón-intrón. Las posiciones de las fronteras se
predijeron basándose en la secuencia que codifica la subunidad
\alpha6 del ratón (Jones et al., J Neurochem 67:907
(1996)). La identidad de los productos de la amplificación se
confirmó mediante secuenciación de ADN. El producto de amplificación
del par de cebadores GABA_{A} \alpha6-11 y
GABA_{A} \alpha6-2b incluyó 202 pb del primer
intrón. La secuencia polinucleotídica de este segmento intrónico se
depositó con el número de acceso de GenBank y asignado AF053072, y
proporciona una región útil a partir de la cual se pueden diseñar
cebadores. Sin embargo, la persona experta en la materia observará
que se pueden diseñar muchos cebadores que extienden el polimorfismo
Pro385Ser.
La amplificación de ADN se realizó mediante
Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) usando un sistema GENEAMP PCR
System 9600 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT), con las
siguientes condiciones: 95ºC durante 3 minutos; 30 ciclos de: 94ºC
durante 15 segundos; 60ºC durante 20 segundos; 72ºC durante 30
segundos; seguido de 72ºC durante 10 minutos. La mezcla de reacción
estaba en un volumen de 5 \mul que contiene 50 ng de ADN de
muestra, 50 nM de cada cebador, 50 \muM de cada dNTP, tampón 1x
Perkin Elmer 1, y 0,125 unidades de ADN polimerasa de Taq. En la
reacción de PCR se incluyeron 0,033 \mul de
[\alpha-^{32}P]dCTP (3.000 Ci/mmoles). A
la terminación de la reacción de amplificación, se añadió a cada
muestra una disolución que contiene 95% de formamida, 10 mM de
NaOH, 0,05% de xilana cianol y 0,05% de azul de bromofenol, para dar
un volumen total de 50 \mul.
Las variantes de secuencias se detectaron
inicialmente usando el método de polimorfismo conformacional
monocatenario (SSCP) descrito por Orita et al., en Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86:2766 (1989). Después de desnaturalizar
el ADN a 80ºC durante 5 minutos, se cargó 1 \mul de la mezcla en
un gel MDE^{TM} (FMC BioProducts, Rockland, ME), y se separó
mediante electroforesis a 4ºC a 9 vatios. Después de la
electroforesis, el gel se secó y se expuso a una película Kodak XAR
durante 0,5-8 horas a temperatura ambiente, para
visualizar las posiciones de los polinucleótidos marcados
radioactivamente.
| Cebador | Secuencia del cebador | Posición del | Producto de la |
| nucleótido(5-3) | PCR(pb) | ||
| GABA_{A}\alpha6-1f | 5'ATGGCGTCATCTCTGCCCTG 3' (SEC ID Nº: 1) | 1 a 20 | 359 (intrón |
| de 202 pb) | |||
| GABA_{A}\alpha6-2b | 5'CTCCAAATCCCGGCCGCAGC 3' (SEC ID Nº: 2) | 138 a 157 | |
| GABA_{A}\alpha6-4f | 5'GGACTGATGAGAGGTTGAAG 3' (SEC ID Nº: 3) | 260 a 279 | 185 |
| GABA_{A}\alpha6-4b | 5'CATGGTGTATAAAATGGTTC 3' (SEC ID Nº: 4) | 444 a 425 | |
| GABA_{A}\alpha6-7f | 5'GTGAATACGTTATAATGACA 3' (SEC ID Nº: 5) | 674 a 693 | 153 |
| GABA_{A}\alpha6-7b | 5'CAAAAACAGTTCTTGCTG 3' (SEC ID Nº: 6) | 826 a 809 | |
| GABA_{A}\alpha6-8f | 5'GGATCACCACTGTTTTAACT 3' (SEC ID Nº: 7) | 827 a 846 | 233 |
| GABA_{A}\alpha6-8b | 5'AGTAGCTTTTGATATTGTCA 3' (SEC ID Nº: 8) | 1059 a 1040 | |
| GABA_{A}\alpha6-9f | 5'CTGACTCCAAATATCATCTG 3' (SEC ID Nº: 9) | 1091 a 1110 | 365 |
| GABA_{A}\alpha6-9b | 5'GAGAAGCATCTACACAAGTC 3' (SEC ID Nº: 10) | 1436 a 1455 |
Las bandas de ADN que muestran una movilidad
alterada en el ensayo de SSCP, en comparación con el control de tipo
natural, se cortaron del gel, se sumergieron en 20 \mul de agua, y
después se calentaron a 80ºC durante 5 minutos. Una muestra de 1
\mul del polinucleótido extraído con agua se sometió a
secuenciación directa (Suzuki et al., Anal Biochem 192:82
(1991)) usando un kit de secuenciación de ciclo terminador con
colorante ABI PRISM^{TM}, con un sistema de secuenciación de ADN
373 (Perkin-Elmer).
La Tabla 2 presenta las secuencias de cebadores y
las enzimas de restricción usadas para los ensayos de
PCR-RFLP que se usaron para el genotipaje rápido de
los dos polimorfismos de GABA_{A} \alpha6 en 58 niños de
alcohólicos. Las condiciones de la PCR fueron las mismas que las
usadas en el ensayo de SSCP, excepto que la mezcla de reacción tuvo
un volumen de 10 \mul, contenía 100 ng de ADN, 250 nM de cada
cebador, 200 \muM de cada uno de dNTP, y 0,25 unidades de ADN
polimerasa de Taq. Como se indica en la Tabla 2, se usaron enzimas
de restricción Fok I y Hae III para detectar los polimorfismos
Pro385Ser y G1031C, respectivamente. Las digestiones con
endonucleasas de restricción se realizaron usando 10 unidades de la
enzima de restricción en un volumen total de 20 \mul durante 2
horas a 37ºC, usando condiciones de tampón apropiadas para cada
enzima. Los fragmentos de ADN se resolvieron mediante electroforesis
en un gel de poliacrilamida al 5%.
| Dos polimorfismos en la secuencia que codifica \alpha6 | |||||||
| Nombre del | Cebadores | Posición de | Sustitución | Enzima | Alelos | Tamaños | Frecuencia |
| polimorfismo | SSCP y | nucleótidos | de RFLP | de los | de los | ||
| RFLP | fragmentos | alelos | |||||
| (pb) | |||||||
| G1031 C | GABA_{A}\alpha6-8f | + 1031 | Hae III | 10316 | 233 | 0,53 | |
| GABA_{A}\alpha6-8b | (ECG-GCC) | 1031C | 177+56 | 0,47 | |||
| Pro385Ser | GABA_{A}\alpha6-9f | + 1236 | Pro-Ser | Fok I | Pro385 | 365 | 0,92 |
| GABA_{A}\alpha6-9b | (CCC-TCC) | Pro385Ser | 261+104 | 0,08 |
El Ejemplo 3 describe varias realizaciones
relacionadas con ordenadores, que se pueden usar para identificar
más polimorfismos en la secuencia de GABA_{A} \alpha6, y
moléculas que interaccionan con la secuencia de Pro385 o Ser385
GABA_{A} \alpha6.
Ejemplo
3
La secuencia de Pro385 o Ser385 GABA_{A}
\alpha6 se introdujo en un medio legible por ordenador, para el
registro y la manipulación. Los expertos en la materia apreciarán
que un medio legible por ordenador, que tiene la secuencia de Pro385
o Ser385 GABA_{A} \alpha6, es útil para la determinación de
secuencias homólogas, dominios estructurales y funcionales, y para
la construcción de modelos proteínicos para el diseño racional de
fármacos. La funcionalidad de un medio legible por ordenador, que
tiene la secuencia de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, por
ejemplo, incluye la capacidad para comparar la secuencia, usando
programas de ordenador conocidos en la materia, para realizar
búsquedas de homología para identificar transportadores iónicos
similares, y para desarrollar modelos proteínicos y llevar a cabo un
diseño racional de fármacos.
La secuencia de Pro385 o Ser385 GABA_{A}
\alpha6 se puede almacenar, grabar, y manipular en cualquier medio
que se pueda leer y que se pueda acceder mediante un ordenador. Como
se usa aquí, las palabras "grabar" y "almacenar" se
refieren a un procedimiento para almacenar información en un medio
legible por el ordenador. La persona experta adoptará fácilmente
cualquiera de los métodos actualmente conocidos para grabar
información en un medio legible por ordenador, para generar
fabricaciones que comprenden la información de las secuencias
nucleotídicas o polipeptídicas de esta realización de la presente
invención.
Existe para el experto una variedad de
estructuras de almacenamiento de datos para crear un medio legible
por ordenador que tenga grabado en él una secuencia nucleotídica o
polipeptídica. La elección de la estructura de almacenamiento de
datos generalmente se basará en el componente elegido para acceder a
la información almacenada. Los medios legibles por ordenador
incluyen medios legibles magnéticamente, medios legibles
ópticamente, o medios legibles electrónicamente. Por ejemplo, los
medios legibles por ordenador pueden ser un disco duro, un disquete,
una cinta magnética, CD-ROM, RAM, o ROM, así como
otros tipos de otros medios conocidos por los expertos en la
materia. Los medios legibles por ordenador, en los que se almacena
la información de secuencias, pueden ser un ordenador personal, una
red de trabajo, un servidor, u otros sistemas de ordenador conocidos
por los expertos en la materia.
Las realizaciones de la invención incluyen
sistemas, particularmente sistemas basados en ordenador, que
contienen la información de secuencias descrita aquí. Como se usa
aquí, "un sistema a base de ordenador" se refiere al hardware,
programa de ordenador (software), y bases de datos usados para
analizar la secuencia nucleotídica de Pro385 o Ser385 GABA_{A}
\alpha6 y la secuencia proteínica de Pro385 o Ser385 GABA_{A}
\alpha6, o sus fragmentos. El sistema a base de ordenador incluye
preferiblemente los medios de almacenamiento descritos
anteriormente, y un procesador para acceder y manipular los datos de
la secuencia. El hardware de los sistemas basados en ordenador, de
esta realización, comprende una unidad de procesamiento central
(CPU), y una o más bases de datos. La persona experta apreciará
fácilmente que es adecuado cualquiera de los sistemas basados en
ordenador actualmente disponibles.
En una realización particular, el sistema de
ordenador incluye un procesador conectado a un bus, que se
conecta a una memoria principal (preferiblemente implementada como
RAM), y a una variedad de dispositivos de almacenamiento
secundarios, tales como un disco duro y un dispositivo de
almacenamiento de medio extraíble. El dispositivo de almacenamiento
de medio extraíble puede representar, por ejemplo, una unidad de
disquetera, una unidad de disco compacto, una unidad de cinta
magnética, etc. Se puede insertar un medio de almacenamiento
extraíble, tal como un disquete, un disco compacto, una cinta
magnética, etc., que contiene la sintaxis de control y/o los datos
grabados allí (por ejemplo, la secuencia nucleotídica de Pro385 o
Ser385 GABA_{A} \alpha6 o la secuencia polipeptídica de Pro385 o
Ser385 GABA_{A} \alpha6), en el dispositivo de almacenamiento
extraíble. El sistema de ordenador incluye un programa de ordenador
apropiado para leer la sintaxis de control y/o los datos del
dispositivo de almacenamiento del medio extraíble una vez se hayan
insertado en el dispositivo de almacenamiento del medio
extraíble.
La secuencia nucleotídica de Pro385 o Ser385
GABA_{A} \alpha6 o la secuencia polipeptídica de Pro385 o Ser385
GABA_{A} \alpha6 se puede almacenar de manera bien conocida en
la memoria principal, en cualquiera de los dispositivos de
almacenamiento secundarios, y/o en un medio de almacenamiento
extraíble. El programa de ordenador para acceder y procesar la
secuencia nucleotídica de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6 o la
secuencia polipeptídica de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6 (tal
como las herramientas de búsqueda, herramientas de comparación, y
herramientas de modelación, etc.) residen en la memoria principal
durante su ejecución.
Como se usa aquí, "una base de datos" se
refiere a la memoria que puede almacenar información de la secuencia
nucleotídica o polipeptídica, información sobre modelo proteínico, e
información de otros péptidos, productos químicos, peptidomiméticos,
y otros agentes que pueden interaccionar con las proteínas.
Adicionalmente, una "base de datos" se refiere a un componente
de acceso a memoria que puede acceder a fabricaciones que tienen
grabadas en ellas la información de la secuencia nucleotídica o
polipeptídica, la información del modelo proteínico y la información
de otros péptidos, productos químicos, peptidomiméticos, y otros
agentes que interactúan con las proteínas. Los expertos en la
técnica conocen muchas bases de datos, y más abajo se expondrán
varias de ellas.
Los datos de la secuencia de Pro385 o Ser385
GABA_{A} \alpha6 se pueden almacenar y manipular en una variedad
de programas procesadores de datos, en una variedad de formatos. Por
ejemplo, los datos de las secuencias se pueden almacenar como texto
en un archivo de procesamiento de texto, tal como MicrosoftWORD o
WORDPERFECT, o como un archivo ASCII, en una variedad de programas
de bases de datos familiares por los expertos en la materia, tales
como DB2, SYBASE u ORACLE.
Un "programa de búsqueda" se refiere a uno o
más programas que están implementados en el sistema basado en
ordenador, para comparar una secuencia nucleotídica o polipeptídica
con otras secuencias nucleotídicas o polipeptídicas y con otros
compuestos, incluyendo, pero sin limitarse a, péptidos,
peptidomiméticos, y productos químicos almacenados en la base de
datos. Un programa de búsqueda se usa, por ejemplo, para comparar
regiones del gen de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6 o la
proteína de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6 que coincide con
las secuencias en las bases de datos de ácidos nucleicos y
proteínas, para identificar homologías y motivos estructurales o
funcionales. Un "programa para la recuperación de datos" se
refiere a uno o más programas que están implementados en el sistema
a base de ordenador para identificar una secuencia homóloga de
ácidos nucleicos, una secuencia proteínica homóloga, o un modelo de
proteína homóloga. Además, un programa de recuperación de datos se
usa también para identificar péptidos, peptidomiméticos y productos
químicos que pueden interaccionar con una secuencia de ácidos
nucleicos, con una secuencia proteínica, o con un modelo de
proteínas.
Mediante un enfoque, se puede determinar el
porcentaje de identidad de secuencia mediante métodos estándares que
se usan habitualmente para comparar la similitud y la posición del
aminoácido de dos polipéptidos. Usando un programa de ordenador, tal
como BLAST o FASTA, se alinean dos polipéptidos para el
emparejamiento óptimo de sus aminoácidos respectivos (ya sea a lo
largo de la longitud total de una o de ambas secuencias, o a lo
largo de una porción predeterminada de una o ambas secuencias).
Tales programas proporcionan una penalización de abertura "por
defecto" y una penalización de salto "por defecto", y una
matriz de puntuación tal como PAM 250 (una matriz de puntuación
estándar; véase Dayhoff et al., en: Atlas of Protein Sequence
and Structure, Vol. 5, Sup. 3 (1978)), que se puede usar en
combinación con el programa de ordenador. El porcentaje de identidad
se puede calcular entonces como:
\vskip1.000000\baselineskip
| número total de coincidencias idénticas | |
| --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- | x 100 |
| [longitud de la secuencia más larga dentro de la extensión coincidente + número de saltos | |
| introducidos en la secuencia más larga a fin de alinear las dos secuencias] |
\vskip1.000000\baselineskip
Los polipéptidos que tienen al menos un 70% de
identidad tendrán típicamente una o más sustituciones, supresiones
y/o inserciones de aminoácidos. Habitualmente, las sustituciones
serán conservativas para que tengan poco o ningún efecto sobre el
cambio neto global, la polaridad, o la hidrofobia de la proteína,
pero opcionalmente puede aumentar la actividad del receptor de
GABA_{A} \alpha6. El Ejemplo 4 proporciona métodos para comparar
el gen de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6 o la proteína de
Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6 con bases de datos conocidas
que tienen secuencias nucleotídicas y proteínicas, para identificar
homologías y motivos estructurales o funcionales.
Ejemplo
4
La secuencia del gen de Pro385 o Ser385
GABA_{A} \alpha6 o la secuencia de la proteína de Pro385 o
Ser385 GABA_{A} \alpha6 se puede comparar con secuencias
conocidas basadas en nucleótidos o proteínas. La secuencia del gen
de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6 o el ADNc correspondiente de
longitud total se puede comparar con las siguientes secuencias de
aminoácidos conocidas: secuencias de vertebrados, secuencias de EST,
secuencias patentadas, y secuencias recientemente identificadas
(dadas a conocer diariamente por Genbank). La secuencia del gen de
Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, o el ADNc correspondiente de
longitud total, con más del 70% de homología a lo largo de 30
nucleótidos, usando BLASTN o BLAST2N, se identifican, y las
secuencias de vertebrados que coinciden se examinan
subsiguientemente usando FASTA. Los transportadores iónicos
homólogos a Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, particularmente
los transportadores iónicos que tienen mutaciones puntuales en
regiones transmembránicas, se pueden identificar de esta manera. Por
ejemplo, mediante el enfoque anterior, se pueden identificar otros
miembros de la familia del canal de cloruro activado por el ligando
de GABA_{A} \alpha.
También se comparan los ORF codificados por
secuencias del gen de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, o los
ADNc correspondientes de longitud total, con secuencias de
aminoácidos conocidas que se encuentran en las bases de datos
públicas de Swissprot release 35, PIR release 53 y Genpept release
108, usando BLASTP con el parámetro W = 8, y permitiendo un máximo
de 10 emparejamientos. Además, los productos de traducción
conceptuales de tres marcos de la cadena superior de la secuencia
del gen de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, o del ADNc
correspondiente de longitud total, se comparan con secuencias de
aminoácidos conocidas públicamente de Swissprot usando BLASTX con el
parámetro E = 0,001.
Adicionalmente, se usa un programa de búsqueda
para comparar el Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6 con otras
secuencias conocidas, para generar modelos de proteínas. El Ejemplo
5, a continuación, describe métodos para construir modelos de
proteínas de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6.
Ejemplo
5
En el pasado, la estructura tridimensional de las
proteínas se ha determinado de varias formas. Quizás la manera más
conocida para determinar la estructura proteínica implica el uso de
cristalografía de rayos X. En Van Holde, K.E. Physical Biochemistry,
Prentice-Hall, N.J. p. 221-239
(1971) se puede encontrar un repaso general de esta técnica. Usando
esta técnica, es posible elucidar la estructura tridimensional con
una buena precisión. Adicionalmente, la estructura proteínica se
puede determinar mediante el uso de técnicas de difracción de
neutrones, o mediante resonancia magnética nuclear (RMN). (Véase,
por ejemplo, Moore W.J., Physical Chemistry, 4ª Edición,
Prentice-Hall, N.J. (1972)).
Como alternativa, las realizaciones de modelo de
proteínas de la presente invención se construyen usando técnicas de
formación de modelos de proteínas a base de ordenador. Mediante un
enfoque, el problema del plegamiento de la proteína se resuelve
hallando secuencias diana que sean lo más compatible con los
perfiles que representan los entornos estructurales de los restos en
estructuras proteínicas tridimensionales conocidas (véase, por
ejemplo, Eisenberg et al., patente U.S. nº 5.436.850 expedida
el 25 de julio de 1995). En otra técnica, las estructuras
tridimensionales conocidas de las proteínas, en una familia dada, se
sobreponen para definir las regiones estructuralmente conservadas
en esa familia. Esta técnica de formación de modelos de proteínas
también usa la estructura tridimensional conocida de una proteína
homóloga para aproximarse a la estructura de Pro385 o Ser385
GABA_{A} \alpha6. (Véase, por ejemplo, Srinivasan, et
al., patente U.S. nº 5.557.535 expedida el 17 de septiembre de
1996). Las técnicas de formación de modelos de homología
convencionales se han usado habitualmente para construir modelos de
proteasas y anticuerpos (Sowdhamini et al., Protein
Engineering 10:207, 215 (1997)). También se pueden usar enfoques
comparativos para desarrollar modelos de proteínas tridimensionales
cuando la proteína de interés tiene una mala identidad de secuencias
con proteínas molde. En algunos casos, las proteínas se pliegan en
estructuras tridimensionales, a pesar de tener identidades de
secuencias muy débiles. Por ejemplo, las estructuras
tridimensionales de un número de citoquinas helicoidales se pliegan
en una topología tridimensional similar, a pesar de una débil
homología de secuencias.
El desarrollo reciente de métodos de enhebrado, y
de enfoques "de rizado", permite ahora la identificación de
patrones probables de plegamiento y dominios proteínicos funcionales
en un número de situaciones en las que la relación estructural entre
la diana y el molde o moldes no es detectable a nivel de las
secuencias. Mediante un método, se realiza el reconocimiento del
plegamiento usando el enhebrado de secuencia múltiple (MST), y las
equivalencias estructurales se deducen a partir del resultado del
enhebrado usando el programa de geometría de distancia DRAGON, que
construye un modelo de baja resolución. Después se construye una
representación de todos los átomos, usando un paquete de formación
de modelos moleculares, tal como QUANTA.
Según este enfoque de 3 etapas, los moldes
candidatos se identifican primero usando el nuevo algoritmo de
reconocimiento del plegamiento MST, que es capaz de realizar un
enhebrado simultáneo de múltiples secuencias alineadas sobre una o
más estructuras 3-D. En una segunda etapa, las
equivalencias estructurales obtenidas del resultado de MST, se
convierten en restricciones de distancias entre restos, y se
introducen en el programa de geometría de distancia DRAGON, junto
con una información auxiliar obtenida de predicción de estructura
secundaria. El programa combina las restricciones de manera no
sesgada, y genera rápidamente un gran número de confirmaciones de
modelos de baja resolución. En una tercera etapa, estas
confirmaciones de modelos de baja resolución se convierten en
modelos de átomos totales, y se someten a minimización de energía
usando el paquete de modelado molecular QUANTA. (Véase, por ejemplo,
Aszódi et al., Proteins: Structure, Function, and Genetics,
Supplement 1:38-42 (1997)).
Como alternativa, se explota el paradigma de
secuencia a estructura a función identificando en primer lugar la
estructura de una proteína a partir de su secuencia usando un
algoritmo de enhebrado, que alinea las secuencias a la estructura de
mejor emparejamiento en una base de datos estructurales,
identificando después el sitio activo de la proteína a partir del
alineamiento, usando una "forma funcional rizada" (FFF), que es
una descripción tridimensional del sitio activo de una proteína.
(Véase, por ejemplo, Fetrow et al., J. Mol. Biol.
282:703-711 (1998) y Fetrow y Skolnick, J. Mol.
Biol. 281: 949-968 (1998)). La FFF se construye
sobreimponiendo de forma reiterada las geometrías de la proteína a
partir de una serie de proteínas funcionalmente relacionadas con
estructuras conocidas. La FFF no son demasiado específicas, sin
embargo, y se explora el grado hasta el cual se pueden relajar las
descripciones. En esencia, se identifican restos conservados y
funcionalmente importantes, y se define un conjunto de restricciones
geométricas y conformacionales para una función específica, en forma
de un algoritmo de ordenador. El programa busca entonces estructuras
de proteínas determinadas experimentalmente a partir de una base de
datos estructural de proteínas para encontrar conjuntos de restos
que satisfagan las restricciones especificadas.
Mediante el uso de este protocolo computacional,
se pueden identificar bases de datos de secuencias genómicas, tales
como las mantenidas por diversas organizaciones, incluyendo:
http://www.tigr.org/tdb; http://www.genetics.wisc.
edu; http://genome.www.stanford.edu/\simball;
http://hiv-web.lanl.gov;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov; http://www.ebi.ac.
uk; http:pasteur.fr/other/biology; y
http://www-genome.wi.mit.edu, en busca de
sitios activos de proteínas específicos, y para la identificación de
restos en esos sitios activos que se asemejan a Pro385 o Ser385.
Otros grupos diversos han desarrollado bases de datos de patrones de
secuencia corta o motivos diseñados para identificar una función
dada o una actividad de una proteína. Estas bases de datos,
notablemente Prosite
http://expasy.hcuge.ch/sprot/prosite.html); Blocks
(http://www.blocks.fhcrc.org); y Prints
http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/PRINTSIPRINTS.
html), usan tramos cortos de la información de secuencia para
identificar patrones de secuencias que son específicos para una
función dada; de este modo, evitan los problemas que surgen de la
necesidad de hacer coincidir todas las secuencias.
Una vez que se ha generado un modelo de proteína
de Pro385 o Ser385 mediante cristalografía de rayos X, RMN,
difracción de neutrones, o formación de modelos computacional, se
pueden emplear métodos de diseño racional de fármacos para elucidar
los agentes que interactúan o que obvian Pro385 o Ser385 y, de este
modo, restaurar la sensibilidad a BZD/etanol. Se puede usar la
formación de modelos moleculares estándar para comparar las
estructuras de las proteínas de Pro385 o Ser385, y se pueden
identificar y usar las regiones interactivas con diazepam (y/u
homólogos o derivados) y etanol, para descubrir nuevos agentes
terapéuticos. También, la formación de modelos moleculares se puede
usar para diseñar compuestos sintéticos (por ejemplo, péptidos o
compuestos orgánicos de moléculas pequeñas) que bloquean o
interfieren con el transporte de cloruro, la unión a ligando, o la
modulación o activación, mediada por ligando, de la proteína Pro385
o Ser385 GABA_{A} \alpha6. El Ejemplo 6 detalla varios métodos
de diseño racional de fármacos.
Ejemplo
6
En algunas realizaciones, se emplean programas de
búsqueda para comparar regiones del gen de Pro385 o Ser385, o la
proteína de Pro385 o Ser385, con moléculas que tengan interacciones
de ligando conocidas, tales como péptidos, peptidomiméticos, y
productos químicos, de forma que se puedan predecir las
interacciones terapéuticas de las moléculas. (Schneider, Genetic
Engineering News diciembre: página 20 (1998), Tempczyk et
al., Molecular Simulations Inc. Solutions abril
(1997), y Butenhof, Molecular Simulations Inc. Case Notes
(agosto 1998)). Este proceso se denomina como "diseño racional de
fármacos".
Un objetivo del diseño racional de fármacos es
producir análogos estructurales de polipéptidos de interés
biológicamente activos o de pequeñas moléculas con las que
interaccionan (por ejemplo, agonistas, antagonistas, inhibidores), a
fin de crear fármacos que son, por ejemplo, formas más activas o
estables del polipéptido, o que potencian o interfieren con la
función de un polipéptido in vivo. (Véase, por ejemplo,
Hodgson, Bio. Technology 9:19-21 (1991)). Los
aminoácidos de origen natural empleados en la producción biológica
de péptidos tienen todos la configuración L. Los péptidos sintéticos
se pueden preparar empleando métodos sintéticos convencionales,
utilizando L-aminoácidos,
D-aminoácidos, o diversas combinaciones de
aminoácidos de las dos configuraciones diferentes. Los compuestos
sintéticos que imitan la conformación y características deseables de
un péptido particular, por ejemplo un oligopéptido, una vez que se
ha encontrado tal péptido, pero que evitan las características
indeseables, por ejemplo flexibilidad (pérdida de conformación) y
ruptura de enlace, son conocidos como "peptidomiméticos".
(Véase, por ejemplo, Spatola, A. F. Chemistry and Biochemistry of
Amino Acids. Peptides, and Proteins (Weistein, B. Ed.), Vol. 7, p.
267-357, Marcel Dekker, New York (1983), que
describe el uso del bioisóstero metilentio [CH_{2}S] como un
sustituto de amida en análogos de encefalina; y Szelke et
al., en Peptides: Structure and Function, Proceedings of the
Eighth American Peptide Symposium, (Hruby y Rich, Eds.); p.
579-582, Pierce Chemical Co., Rockford, III. (1983),
que describe inhibidores de renina que tienen tanto los
bioisoésteres metilenamino [CH_{2}NH] como hidroxietileno
[CHOHCH_{2}] en el enlace de amida de Leu-Val en
el 6-13 octapéptido derivado de
angiotensinógeno).
En general, el diseño y la síntesis de un
peptidomimético implica partir de la secuencia del péptido y de los
datos conformacionales (por ejemplo, datos geométricos tales como
longitudes de enlace y ángulos de enlace) de una proteína deseada
(por ejemplo, el péptido simulado más probable), y usar tales datos
para determinar las geometrías que se deben diseñar en el
peptidomimético. Se conocen en la técnica numerosos métodos y
técnicas para realizar esta etapa, de los cuales se puede usar
cualquiera. (Véase, por ejemplo, Farmer, P.S., Drug Design,
(Ariens, E. J. ed.), Vol. 10, p. 119-143 (Academic
Press, New York, London, Toronto, Sydney y San Francisco) (1980);
Farmer, et al., en TIPS, 9182, p.362-365;
Verber et al., en TINS, 9/85, p. 392-396;
Kaltenbronn et al., en J. Med. Chem.
33:838-845 (1990); y Spatola, A. F., en Chemistry
and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, Vol. 7,
p. 267-357, Capítulo 5, "Peptide Backbone
Modifications: A Structure-Activity Analysis of
Peptides Containing Amide Bond Surrogates. Conformational
Constraints, and Relations" (B. Weisten, ed.; Marcell Dekker: New
York, pub.) (1983); Kemp, D. S., "Peptidomimetics and the Template
Approach to Nucleation of \beta-sheets and
\alpha-helices in Peptides", Tibech, Vol. 8, p.
249-255 (1990). En las patentes U.S. nº 5.288.707;
nº 5.552.534; nº 5.811.515; nº5.817.626; nº 5.817.879; nº 5.821.231;
y nº 5.874.529 se pueden encontrar enseñanzas adicionales.
En un enfoque, una estructura tridimensional de
una proteína de interés (por ejemplo, el polipéptido de Pro385 o
Ser385, o su fragmento) se determina mediante cristalografía de
rayos X, RMN, o difracción de neutrones, y se modela por ordenador.
Los modelos útiles de proteínas de Pro385 o Ser385 también se pueden
obtener mediante formación de modelos por ordenador solo, como se
explica en los Ejemplos 3, 4, y 5. Estos modelos se comparan con
librerías de péptidos y de productos químicos, usando programa de
ordenador, que permite analizar interacciones entre el receptor
modelado y el ligando candidato. Un número de artículos repasan la
formación de modelos por ordenador de fármacos interactivos con
proteínas específicas, tales como Rotivinen, et al., 1988,
Acta Pharmaceutical Fennica 97:159-166; Ripka, New
Scientist 54-57 (16 de junio, 1988); McKinaly y
Rossmann, 1989, Annu. Rev. Pharmacol. Toxiciol.
29:111-122; Perry y Davies, OSAR: Quantitative
Structure-Activity Relationships in Drug Design p.
189-193 (Alan R. Liss, Inc. 1989); Lewis y Dean,
1989 Proc. R. Soc. Lond. 236:125-140 y
141-162; y con respecto a un receptor modelo para
componentes de ácidos nucleicos, Askew, et al., 1989, J. Am.
Chem. Soc. 111:1082-1090. Otros programas de
ordenador que identifican y representan gráficamente productos
químicos están disponibles de otras compañías tales como BioDesign,
Inc. (Pasadena, Calif.), Allelix, Inc. (Mississauga, Ontario,
Canadá), e Hypercube, Inc. (Cambridge, Ontario).
Además, el péptido de interés (por ejemplo,
Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6) se puede analizar mediante un
barrido de alanina (Wells, Methods in Enzymol.
202:390-411 (1991)). En esta técnica, se sustituye
un resto de aminoácido por alanina, y se mide su efecto sobre la
actividad del péptido, mediante ensayo funcional, tal como se
describe en el Ejemplo 15. Cada uno de los restos de aminoácidos del
péptido se analiza de esta manera, y se identifican las regiones
importantes del péptido. Subsiguientemente, esta región
funcionalmente importante se registra en un medio legible por
ordenador, se almacena en una primera base de datos en un sistema
de ordenador, y se emplea un programa de búsqueda, como se describe
en Ejemplos 3, 4, 5, y más abajo, para generar un modelo de proteína
de la región funcionalmente importante. Una vez que se ha generado
un modelo de proteína, se hace accesible una segunda base de datos
que comprende una o más librerías que tienen péptidos, productos
químicos, peptidomiméticos y otros agentes que interactúan con las
proteínas, mediante un programa de búsqueda, y se comparan los
agentes individuales con el modelo de proteína para identificar los
agentes que interaccionan con la región funcionalmente importante de
la proteína de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6. Los agentes
que interaccionan identificados mediante el enfoque anterior se
ensayan entonces en ensayos que monitorizan el transporte iónico,
como se describe en el Ejemplo 15.
También es posible aislar un anticuerpo
específico de una diana, seleccionado mediante un ensayo funcional,
y después resolver su estructura cristalina. En principio, este
enfoque produce un farmacoro sobre el que se puede basar el diseño
subsiguiente de fármacos. Mediante este enfoque, la cristalografía
proteínica de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6 se obvia
generando anticuerpos anti-idiotípicos
(anti-ids) a un anticuerpo funcional,
farmacológicamente activo. Como una imagen especular de una imagen
especular, es de esperar que el sitio de unión de los
anti-ids sea un análogo de una región de la proteína
de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6. El anti-id
se podría usar entonces para identificar y aislar péptidos,
peptidomiméticos y productos químicos a partir de librerías de tales
compuestos conocidos en la técnica. Los péptidos, peptidomiméticos y
productos químicos seleccionados actuarían entonces como el
farmacoro. De este modo, se pueden diseñar fármacos que tengan
actividad inhibidora del transporte, que interaccionen
diferencialmente en Pro385 y Ser385, o que obvien la proteína de
Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, todo junto.
Se pueden usar, con las realizaciones de la
invención, muchos programas de ordenador y bases de datos. La
siguiente lista está destinada a no limitar la invención sino a
proporcionar una guía de los programas y bases de datos que son
útiles con las realizaciones de secuencias de ácidos nucleicos y de
proteínas de la presente invención. Los programas y las bases de
datos que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a: MacPattern
(EMBL), DiscoveryBase (Molecular Applications Group), GeneMine
(Molecular Applications Group), Look (Molecular Applications Group),
MacLook (Molecular Applications Group), BLAST y BLAST2 (NCBI),
BLASTN y BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:
403 (1990)), FASTA (Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 85: 2444 (1988)), Catalyst (Molecular Simulations Inc.),
Catalyst/SHAPE (Molecular Simulations Inc.), Cerius^{2}.DBAccess
(Molecular Simulations Inc.), HypoGen (Molecular Simulations Inc.),
Insight II, (Molecular Simulations Inc.), Discover (Molecular
Simulations Inc.), CHARMm (Molecular Simulations Inc.), Félix
(Molecular Simulations Inc.), DelPhi, (Molecular Simulations Inc.),
QuanteMM. (Molecular Simulations Inc.), Homology (Molecular
Simulations Inc.), Modeler (Molecular Simulations Inc.), Modeller 4
(Sali y Blundell J. Mol. Biol. 234:217-241 (1997)),
ISIS (Molecular Simulations Inc.), Quanta/Protein Design (Molecular
Simulations Inc.), WebLab (Molecular Simulations Inc.), WebLab
Diversity Explorer (Molecular Simulations Inc.), Gene Explorer
(Molecular Simulations Inc.), SeqFold (Molecular Simulations Inc.),
la base de datos de EMBL/Swissprotein, la base de datos de MDL
Available Chemicals Directory, la base de datos de MDL Drug Data
Report, la base de datos de Comprehensive Medicinal Chemistry, la
base de datos del Índice de Fármacos Mundiales de Derwents, y la
base de datos de BioByteMasterFile. Muchos otros programas y bases
de datos serán manifiestos para la persona experta en la materia,
dada la presente descripción. El Ejemplo 7 describe la preparación
de cebadores de PCR y la amplificación de ADN de Pro385 o Ser385
GABA_{A} \alpha6.
Ejemplo
7
Las sondas de la invención pueden corresponder a
cualquier región de Pro385 o Ser385, en tanto que esté presente el
codón que codifica el resto de prolina o de serina en la posición
385. Las sondas de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6 tienen
generalmente al menos 10 bases, y preferiblemente al menos 12, 15 ó
17 bases de longitud. Más preferiblemente, las sondas de Pro385Ser
tienen al menos 20-30 bases de longitud. En algunas
realizaciones, las sondas de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6
pueden tener más de 30 bases de longitud.
Las sondas derivadas de ácidos nucleicos que
codifican Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, o sus porciones, se
pueden marcar con señales detectables, familiares por los expertos
en la técnica, incluyendo radioisótopos y marcadores no
radioactivos, para proporcionar una sonda detectable. La sonda
detectable puede ser monocatenaria o bicatenaria, y se puede obtener
usando técnicas conocidas en la técnica, incluyendo la transcripción
in vitro, la traducción del corte, o reacciones de quinasa.
Una muestra de ácido nucleico, que contiene una secuencia capaz de
hibridarse con la sonda marcada, se pone en contacto con la sonda
marcada. Si el ácido nucleico en la muestra es bicatenario, se puede
desnaturalizar antes de ponerlo en contacto con la sonda. En algunas
aplicaciones, la muestra de ácido nucleico se puede inmovilizar
sobre una superficie, tal como una membrana de nitrocelulosa o de
nailon. La muestra de ácido nucleico puede comprender ácidos
nucleicos obtenidos a partir de una variedad de fuentes, incluyendo
ADN genómico, librerías de ADNc, ARN, o muestras biológicas. Se
entiende que una muestra biológica es una muestra obtenible a
partir de un ser humano que tiene células nucleadas que comprenden
ácido nucleico. Por ejemplo, una muestra biológica en el contexto de
la invención puede ser una muestra de sangre extraída mediante
venipunción de la yema de un dedo, o un algodón puesto en contacto
con la parte interna de la mejilla de un ser humano, con lo que se
recogen las células epiteliales.
Los procedimientos usados para detectar la
presencia de ácidos nucleicos capaces de hibridarse con la sonda
detectable incluyen técnicas bien conocidas, tales como
transferencia Southern, transferencia Northern, transferencia de
punto, hibridación de colonias, e hibridación de placas. En algunas
aplicaciones, el ácido nucleico capaz de hibridarse con la sonda
marcada se puede clonar en vectores, tales como vectores de
expresión, vectores de secuenciación, o en vectores de transcripción
in vitro, para facilitar la caracterización y la expresión de
los ácidos nucleicos que se hibridan en la muestra. Por ejemplo,
tales técnicas se pueden usar para aislar y clonar secuencias en
una librería genómica o en una librería de ADNc, que son capaces de
hibridarse a la sonda detectable. Como alternativa, los ácidos
nucleicos que codifican Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6 se
manipulan usando técnicas convencionales en biología molecular, para
crear constructos recombinantes que expresen el polipéptido de
Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6. El Ejemplo 8 proporciona
varios enfoques para sintetizar, expresar y aislar o purificar la
proteína de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, o sus
fragmentos.
Ejemplo
8
Para expresar las proteínas codificadas por
Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, o una porción del mismo, se
obtienen ácidos nucleicos que contienen la secuencia codificante
para las proteínas o sus porciones, y se clonan en un vector de
expresión adecuado, de forma que la región codificante esté enlazada
de forma operable a un promotor heterólogo. Por ejemplo, el ácido
nucleico puede codificar un polipéptido que comprende al menos 3, 6
ó 10 aminoácidos consecutivos de la secuencia deducida a partir de
SEC ID nº 11 ó 12. En algunas realizaciones, el ácido nucleico puede
codificar un polipéptido que comprende al menos 15 aminoácidos
consecutivos de la secuencia deducida a partir de SEC ID nº 11 ó
12. En otras realizaciones, el ácido nucleico puede codificar un
polipéptido que comprende al menos 25 aminoácidos consecutivos de la
secuencia de SEC ID nº 11 ó 12. En otras realizaciones, el ácido
nucleico puede codificar un polipéptido que comprende al menos 60,
al menos 75, al menos 100 o más de 100 aminoácidos consecutivos de
la secuencia deducida a partir de SEC ID nº 11 ó 12. Aún más, en
otras realizaciones, el ácido nucleico puede codificar toda la
región codificante de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, y puede
tener un peso molecular de alrededor de 50 kD en SDS PAGE al
10%.
El ácido nucleico que codifica la proteína o
polipéptido a expresar se enlaza operablemente a un promotor en un
vector de expresión, usando una tecnología de clonación
convencional. El vector de expresión puede ser cualquiera de los
sistemas de expresión de mamífero, de levadura, de insecto, de
parásitos, o bacteriano, conocido en la técnica. Existen vectores y
sistemas de expresión comercialmente disponibles de una variedad de
proveedores, incluyendo Genetics Institute (Cambridge, MA),
Stratagene (La Jolla, California), Promega (Madison, Wisconsin), e
Invitrogen (San Diego, California). Si se desea, para aumentar la
expresión y facilitar el plegamiento apropiado de las proteínas, se
puede optimizar el contexto del codón y el emparejamiento del codón
de la secuencia para el organismo de expresión particular en el que
se introduce el vector de expresión, como se explica por Hatfield,
et al., patente U.S. nº 5.082.767. Además, se puede
incorporar una secuencia líder secretora, para facilitar la
purificación de la proteína. Se contemplan muchos constructos
recombinantes de vectores que tienen la secuencia de ácidos
nucleicos de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6 (su longitud
completa o una porción de la misma), que permiten la expresión de la
proteína de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6.
Lo siguiente se proporciona como un posible
método para expresar las proteínas codificadas por los ácidos
nucleicos descritos anteriormente. En primer lugar, se identifican
el codón de iniciación de metionina para el gen y la señal de poly A
del gen. Si el ácido nucleico que codifica el polipéptido a expresar
carece de metionina para que sirva como sitio de iniciación, se
puede introducir una metionina de iniciación próxima al primer codón
del ácido nucleico, usando técnicas convencionales. De forma
similar, si el ADNc de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6 carece
de una señal de poly A, esta secuencia se puede añadir al
constructo, por ejemplo, mediante corte de la señal de poly A de
pSG5 (Stratagene), usando enzimas de endonucleasas de restricción
BglI y SalI, e incorporándola en el vector de expresión de mamífero
pXT1 (Stratagene). El vector pXT1 contiene las LTR y una porción del
gen gag del virus de la leucemia murina de Moloney. La
posición de las LTR en el constructo permite la transfección estable
eficaz. El vector incluye el promotor de timidina quinasa del virus
del herpes simple, y el gen de neomicina seleccionable.
El ácido nucleico que codifica el polipéptido a
expresar se puede obtener mediante PCR a partir del vector
bacteriano, usando cebadores oligonucleotídicos complementarios al
ácido nucleico y que contienen secuencias de endonucleasas de
restricción para Pst I incorporado en el cebador 5', y BglII en el
extremo 5' del cebador 3' del ADNc correspondiente, teniendo cuidado
de asegurarse de que el ácido nucleico esté situado en el marco con
la señal de poly A. El fragmento purificado obtenido de la reacción
de PCR resultante se digiere con PstI, se finaliza de forma roma con
una exonucleasa, se digiere con BglII, se purifica y se liga a pXT1,
que contiene ahora una señal de poly A, y se digiere con BglII. El
producto ligado se transfecta en una línea celular adecuada, por
ejemplo células NIH 3T3 de ratón, usando Lipofectina (Life
Technologies, Inc. Grand Island, New York) en condiciones expuestas
en la especificación del producto. Los transfectantes positivos se
seleccionan después de hacer crecer las células transfectadas en 600
\mug/ml 6418 (Sigma, St. Louis, Missouri). Preferiblemente, la
proteína expresada se libera en el medio de cultivo, facilitando de
ese modo la purificación.
Como alternativa, el ácido nucleico de Pro385 o
Ser385 GABA_{A} \alpha6, o una porción del mismo, se puede
clonar en pED6dpc2, como se describe anteriormente. Los constructos
de pEDBdpc2 resultantes se pueden transfectar en una célula
hospedante, tal como las células COS 1. Se seleccionan y se expanden
células resistentes a metotrexato. Preferiblemente, la proteína
expresada a partir del ADNc extendido se libera en el medio de
cultivo, facilitando de ese modo la purificación.
Otra realización contemplada utiliza el
"sistema Xpress para la expresión y purificación" (Invitrogen,
San Diego, CA). El sistema Xpress se diseña para la producción en
cantidades elevadas y la purificación de proteínas recombinantes a
partir de células bacterianas, de mamíferos y de insectos. Los
vectores de Xpress producen proteínas recombinantes fusionadas a un
péptido líder N-terminal corto, que tiene una
afinidad elevada por cationes divalentes. Usando una resina quelante
de níquel (Invitrogen), se puede purificar la proteína recombinante
en una etapa, y el líder se puede eliminar subsiguientemente
mediante ruptura con enteroquinasa.
Un vector para la expresión del polipéptido de
Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6 es el pBlueBacHis2 Xpress. El
vector pBlueBacHis2 Xpress es un vector de expresión de baculovirus
que contiene un sitio de clonación múltiple, un gen de resistencia a
ampicilina, y un gen lac-z. Mediante un enfoque, el
ácido nucleico de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, o una
porción del mismo, se clona en el vector de pBlueBacHis2 Xpress, y
se infectan células SF9. La proteína de expresión se aisla entonces
y se purifica según las instrucciones del fabricante. Otras líneas
celulares cultivadas, que tienen constructos o vectores
recombinantes que comprenden la secuencia de Pro385 o Ser385
GABA_{A} \alpha6, o porciones de la misma, son realizaciones de
la presente invención, y su fabricación sería habitual dada la
descripción presente.
Las proteínas en el medio de cultivo también se
separan mediante electroforesis en gel. Las proteínas separadas se
detectan entonces usando técnicas tales como tinción con Coomassie o
con plata, o usando anticuerpos contra la proteína. Las técnicas de
tinción con Coomassie y con plata son familiares para los expertos
en la materia.
Si se desea, las proteínas se pueden precipitar
mediante sulfato de amonio, o se pueden separar basándose en el
tamaño o la carga, antes de la electroforesis. La proteína
codificada por el gen de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, el
ADNc de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, o una porción del
mismo, también se puede purificar usando técnicas de
inmunocromatografía estándares. En tales procedimientos, se aplica
una disolución que contiene la proteína, tal como el medio de
cultivo o un extracto celular, a una columna que tiene anticuerpos
frente a la proteína segregada, unidos a la matriz de la
cromatografía. Se deja que la proteína segregada se una a la columna
de inmunocromatografía. Después, la columna se lava para eliminar
las proteínas unidas no específicamente. Después, la proteína
segregada, unida específicamente, se libera de la columna y se
recupera usando técnicas estándares.
Si la producción de anticuerpos es indeseable, el
ácido nucleico de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, o una
porción del mismo, se puede incorporar en vectores de expresión
diseñados para uso en esquemas de purificación que emplean
polipéptidos quiméricos. En tales estrategias, la secuencia
codificante del ácido nucleico de Pro385 o Ser385 GABA_{A}
\alpha6, o una porción del mismo, se inserta en el marco con el
gen que codifica la otra mitad de la quimera. La otra mitad de la
quimera puede ser \beta-globina o una secuencia
que codifica un polipéptido que se une a níquel. Después, se usa una
matriz de cromatografía, que tiene un anticuerpo frente a
\beta-globina, o níquel unido a ella, para
purificar la proteína quimérica. Los sitios de ruptura mediante
proteasas se pueden manipular mediante ingeniería entre el gen de
\beta-globina o el polipéptido de unión a níquel y
el ADNc de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, tal como
enteroquinasa. De este modo, los dos polipéptidos de la quimera se
pueden separar entre sí mediante digestión con proteasas.
Un vector de expresión útil para generar
quiméricos de \beta-globina es pSG5 (Stratagene),
que codifica \beta-globina de conejo. El intrón II
del gen de \beta-globina de conejo facilita el
corte y empalme del transcrito expresado, y la señal de
poliadenilación incorporada en el constructo aumenta el nivel de
expresión. Estas técnicas, como se describen, son bien conocidas por
los expertos en la técnica de biología molecular. Los métodos
estándares están publicados en textos de métodos tales como Davis
et al., (Basic Methods in Molecular Biology, L.G.
Davis, M.D. Dibner, y J.F. Battey, ed., Elsevier Press, NY, 1986), y
muchos de los métodos están disponibles de Stratagene, Life
Technologies, Inc., o Promega. El polipéptido se puede producir
adicionalmente a partir del constructo usando sistemas de traducción
in vitro, tal como el kit de traducción Exoress^{TM}
Translation Kit (Stratagene).
Además de preparar y purificar el polipéptido de
Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6 usando técnicas de ADN
recombinante, los polipéptidos de Pro385 o Ser385 GABA_{A}
\alpha6, los fragmentos y/o sus derivados se pueden preparar
mediante métodos de síntesis química (tales como la síntesis de
péptidos en fase sólida), usando métodos bien conocidos en la
técnica, tales como los expuestos por Merrifield et al., J.
Am. Chem. Soc. 85:2149 (1964), Houghten et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 82:51-32 (1985), y Stewart y Young
(síntesis de péptidos en fase sólida, Pierce Chem Co., Rockford, IL
(1984)). Tales péptidos se pueden sintetizar con o sin una metionina
en el término de la amina. Los polipéptidos o fragmentos de Pro385 o
Ser385 GABA_{A} \alpha6 sintetizados químicamente se pueden
oxidar usando métodos expuestos en estas referencias, para formar
puentes de disulfuro. Los polipéptidos o fragmentos de Pro385 o
Ser385 GABA_{A} \alpha6 se pueden emplear como sustitutos
biológicamente activos o inmunológicos del polipéptido de Pro385 o
Ser385 GABA_{A} \alpha6 natural, purificado, en procesos
terapéuticos e inmunológicos. Después de la síntesis o expresión y
purificación de las proteínas codificadas por el ácido nucleico de
Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, o una porción del mismo, las
proteínas purificadas se pueden usar para generar anticuerpos como
se describe en el Ejemplo 9.
Ejemplo
9
Mediante un enfoque, la proteína o polipéptido de
Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, sustancialmente pura, se aisla
de una célula transfectada o transformada. La concentración de
proteína en la preparación final se ajusta, por ejemplo, mediante
concentración en un dispositivo de filtro Amicon, hasta el nivel de
unos pocos microorganismos/ml. Después, el anticuerpo monoclonal o
policlonal frente a la proteína se puede preparar según lo
siguiente.
El anticuerpo monoclonal frente a epítopos de
cualquiera de los péptidos identificados y aislados como se
describe, se puede preparar a partir de hibridomas murinos según el
método clásico de Kohler, G. y Milstein, C., Nature 256:495
(1975) o métodos derivados del mismo. De forma breve, se inocula de
forma repetida un ratón con unos pocos microgramos de la proteína
seleccionada, o péptidos derivados de ella, durante un período de
unas pocas semanas. El ratón se sacrifica entonces, y se aislan las
células del bazo productoras de anticuerpos. Las células del bazo se
fusionan en presencia de polietilenglicol con células de mieloma de
ratón, y el exceso de células sin fusionar se destruye haciendo
crecer el sistema en medio selectivo que comprende aminopterina
(medio HAT). Las células fusionadas con éxito se diluyen, y se
colocan partes alícuotas de la dilución en pocillos de una placa de
microtitulación, en la que se continúa el crecimiento del cultivo.
Los clones productores de anticuerpos se identifican mediante
detección del anticuerpo en el sobrenadante de los pocillos,
mediante procedimientos de inmunoensayos, tales como ELISA, como se
describe originalmente por Engvall, E., Meth. Enzymol.
70:419 (1980), y métodos derivados del mismo. Los clones positivos
seleccionados se pueden expandir, y su producto de anticuerpo
monoclonal se puede cosechar para uso. Los procedimientos detallados
para la producción de anticuerpos monoclonales se describen en
Davis, L. et al., Basic Methods in Molecular Biology
Elsevier, New York. Sección 21-2.
El antisuero policlonal que contiene anticuerpos
frente a epítopos heterogéneos de una proteína individual se puede
preparar inmunizando animales adecuados con la proteína expresada, o
péptidos derivados de la misma descritos anteriormente, que se
pueden modificar o no modificar para potenciar la inmunogenicidad.
La producción eficaz de anticuerpos policlonales se ve afectada por
muchos factores relacionados tanto con el antígeno como con la
especie hospedante. Por ejemplo, las moléculas pequeñas tienden a
ser menos inmunógenas que otras, y pueden requerir el uso de
portadores y adyuvantes. También, los animales hospedantes varían en
respuesta al sitio de las inoculaciones y a la dosis, dando dosis
tanto inadecuadas como excesivas de antígeno como resultado
antisueros de bajo título. Las dosis pequeñas (nivel de ng) de
antígeno, administradas en sitios intradérmicos múltiples parecen
ser las más fiables. Un protocolo de inmunización eficaz para
conejos se puede encontrar en Vaitukaitis, J. et al., J.
Clin. Endocrinol. Metab. 33:988-991 (1971).
Se pueden administrar revacunaciones a intervalos
regulares, y el antisuero se puede cosechar cuando el título del
anticuerpo del mismo, según se determina semicuantitativamente, por
ejemplo, mediante doble inmunodifusión en agar frente a
concentraciones conocidas del antígeno, comienza a caer. Véase, por
ejemplo, Ouchterlony, O. et al., Cap, 19 en: Handbook of
Experimental Immunology, D. Wier (ed) Balckwell (1973). La
concentración de meseta del anticuerpo está habitualmente en el
intervalo de 0,1 a 0,2 mg/ml de suero (alrededor de 12 M). La
afinidad de los antisueros por el antígeno se determina preparando
curvas de unión competitivas, como se describe, por ejemplo, por
Fischer, D., Cap. 42 en: Manual of Clinical Immunology, 2ª
Ed. (Rose y Friedman, Eds.) Amer. Soc. For Microbiol., Washington,
D.C. (1980).
Las preparaciones de anticuerpos preparadas según
cualquiera de los protocolos son útiles en inmunoensayos
cuantitativos que determinan concentraciones de sustancias que
poseen antígenos, en muestras biológicas; también se usan
semicuantitativa o cualitativamente (por ejemplo, en realizaciones
de diagnóstico que identifican la presencia de Pro385Ser en muestras
biológicas). El Ejemplo 10 describe un método de diagnóstico de la
invención basado en ácidos nucleicos.
Ejemplo
10
En una realización, se aisla ADN de
"muestra" a partir de una fuente biológica, tal como sangre, de
sujetos que necesiten la terapia de BZD. Después, se utiliza un
panel de cebadores de PCR basados en regiones del ácido nucleico o
ácidos nucleicos que codifican Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6,
para amplificar el ADN de una longitud de aproximadamente
100-700 bases a partir de la muestra de ADN.
Preferiblemente, los cebadores de PCR extienden las regiones en las
que se identificaron las variantes polimórficas. Como controles, se
amplifican secuencias de tipo natural procedentes de sujetos de
control. Cada uno de los ADN de muestra se secuencia entonces usando
técnicas estándares, y una simple comparación identificaría la
presencia del alelo de Ser385 y, de este modo, la predilección del
sujeto a la insensibilidad a BZD. Los cebadores de PCR usados para
identificar la presencia de Pro385Ser en la muestra también se
pueden incorporar en tubos de PCR, y se pueden envasar como un kit
de diagnóstico. Aunque se prefiere la PCR, también pueden ser útiles
para poner en práctica la invención otros métodos de amplificación
tales como el procedimiento de amplificación mediada por
transcripción, descrito en la patente US nº 5.399.491. Mediante el
uso de los diagnósticos y del método presentado anteriormente, se
puede determinar rápidamente una identificación exacta del
aminoácido en el posición 385 en la subunidad \alpha6 del receptor
del neurotransmisor GABA_{A} en un sujeto, y se puede identificar
la predilección de un sujeto a la insensibilidad a BZD/etanol. El
Ejemplo 11 describe métodos de hibridación que se pueden usar para
identificar la presencia de Pro385Ser en una muestra biológica.
Ejemplo
11
En otra realización, se repite el procedimiento
del Ejemplo 10 para obtener un panel de secuencias amplificadas a
partir de una muestra. Este ADN generado mediante PCR se digiere
entonces con una o con una combinación de enzimas de restricción.
Preferiblemente, el ADN generado mediante PCR se digiere con enzimas
de restricción. Tales enzimas están comercialmente disponibles y son
conocidas por los expertos en la materia. Como alternativa, con la
condición de que se pueda obtener una cantidad suficiente de muestra
biológica, el ADN aislado de la sangre se puede digerir
directamente con enzimas de restricción, y se puede evaluar según el
método siguiente.
Después de la digestión, los fragmentos génicos
resultantes se separan por tamaños en un gel de poliacrilamida, y se
transfieren a nitrocelulosa usando técnicas de electrotransferencia,
bien conocidas por los expertos en la materia. Como alternativa, se
pueden emplear la electroforesis en gel de agarosa y la
transferencia Southern convencional. Para un repaso de la
transferencia Southern, véase Davis et al., (Basic Methods
in Molecular Biology, 1986, Elsevier Press. p.
62-65).
Se marca radiactiva o colorimétricamente un panel
de sondas basadas en la secuencia del ácido nucleico que codifica
Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6 o sus porciones (que tienen al
menos 10 bases), usando métodos conocidos en la técnica, tales como
la traducción del corte o el marcado del extremo, y el panel se
híbrida para la transferencia Southern, usando técnicas conocidas en
la técnica (Davis et al., supra). Preferiblemente, la
sonda comprende al menos 12, 15 ó 17 nucleótidos consecutivos del
ADNc extendido (o de los ADN genómicos obtenibles del mismo). Más
preferiblemente, la sonda comprende al menos 20-30
nucleótidos consecutivos del ADNc extendido (o los ADN genómicos
obtenibles del mismo). En algunas realizaciones, la sonda comprende
más de 30 nucleótidos de los ácidos nucleicos que codifican Pro385 o
Ser385 GABA_{A} \alpha6, o sus porciones. En otras
realizaciones, la sonda comprende al menos 40, al menos 50, al menos
75, al menos 100, al menos 150, o al menos 200, nucleótidos
consecutivos de los ácidos nucleicos que codifican Pro385 o Ser385
GABA_{A} \alpha6, o sus porciones.
Los expertos en la técnica conocen muchas
condiciones de hibridación y de lavado. Mediante un enfoque, la
sonda de ácido nucleico se híbrida al ácido nucleico inmovilizado,
en las siguientes condiciones: 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS),
0,5 M de NaPO4 pH 7,0, 1 mM de EDTA a 50ºC; y el lavado se realiza
con 1% de SDS a 42ºC. Más específicamente, el método descrito en el
Ejemplo 12 se usa para identificar un polimorfismo de \alpha6.
Ejemplo
12
Se identifican dos pacientes que necesitan un
tratamiento de fármacos benzodiazepínicos, usando procedimientos de
diagnóstico que son familiares por aquellos que tienen una pericia
normal en la materia. Después, se obtiene una muestra biológica, por
ejemplo, se extraen muestras sanguíneas de los dos pacientes, se
obtienen las poblaciones de células sanguíneas nucleadas mediante
centrifugación, y el ADN genómico se aisla de las muestras celulares
resultantes, usando procedimientos de laboratorio estándares.
Después, se usan partes alícuotas de las dos
muestras de ADN como fuentes de moldes en una reacción de PCR
estándar, empleando cebadores que tienen secuencias
polinucleotídicas dadas por SEC ID nº 9 y SEC ID nº 10. Los
productos de la amplificación resultantes se digieren con
endonucleasa de restricción Fok I, los productos de la digestión se
separan en un gel de poliacrilamida, y el gel resultante se tiñe con
bromuro de etidio, todo ello según técnicas de laboratorio
estándares familiares por aquellos que tienen una pericia normal en
la materia.
Los resultados de la separación electroforética
indican que los dos pacientes tienen diferentes polimorfismos de
\alpha6. El ADN amplificado procedente del primer paciente tiene
una longitud de 365 pb y no se escinde por la endonucleasa de
restricción Fok I, indicando de ese modo que el primer paciente está
caracterizado por el alelo de Pro385 \alpha6 más habitual.
Contrariamente, el ADN amplificado procedente del segundo paciente
se escinde en dos fragmentos que tienen unas longitudes de 261 y 104
pb, respectivamente. Este último resultado indica que el segundo
paciente posee el polimorfismo de Pro385Ser, o el alelo de Ser385.
Estos resultados también indican que los dos pacientes serán
diferentemente sensibles a fármacos benzodiazepínicos y a etanol. El
paciente que tiene el alelo de Pro385 \alpha6 se trata con
diazepam. Este paciente es sensible al fármaco y muestra una mejora
en los síntomas tratables por una terapia de fármacos
benzodiazepínicos. El hallazgo de que el segundo paciente porta el
alelo de Ser385 indica que el paciente será menos sensible a la
terapia con fármacos benzodiazepínicos. En consecuencia, para el
segundo paciente se prescribe una medicación diferente de un fármaco
benzodiazepínico. En el Ejemplo 13 se proporciona un método rápido
para detectar la secuencia de ácidos nucleicos de Pro385 o Ser385
GABA_{A} \alpha6 en una muestra de ADN.
Ejemplo
13
Otra técnica para identificar la presencia de
Ser385 y Pro385, o sus porciones, utiliza una técnica de hibridación
mediante transferencia de punto. Como antes, se aisla el ADN, se
purifica, o se amplifica a partir de una muestra biológica,
preferiblemente sangre. Se sintetizan sondas oligonucleotídicas de
aproximadamente 10-30 pb que complementan a los
ácidos nucleicos que codifican Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6,
o porciones del mismo. Las sondas se usan para hibridarlas al ADN
genómico mediante condiciones conocidas por los expertos en la
técnica, pero preferiblemente en 7% de dodecilsulfato de sodio
(SDS), 0,5 M de NaPO4 pH 7,0, 1 mM de EDTA, a 50ºC, y lavando en 1%
de SDS, a 42ºC. Los oligonucleótidos se marcan entonces con P^{32}
en sus extremos usando polinucleotidoquinasa (Pharmacia), y se crean
transferencias de punto manchando el ADN de la muestra sobre
nitrocelulosa o similar, usando un colector de transferencia de
punto a vacío (BioRad, Richmond California). El filtro de
nitrocelulosa, que contiene las secuencias genómicas, se cuece o se
liga mediante UV al filtro, prehibridado o hibridado con la sonda
marcada, usando técnicas conocidas en la materia (Davis et
al., supra). Los fragmentos de ADN marcados con ^{32}P
se pueden hibridar secuencialmente con condiciones sucesivamente
restrictivas, para detectar las diferencias mínimas entre la
secuencia de 30 pb y el ADN. La aparición de manchas radioactivas
sobre la membrana representa una hibridación positiva y la
identificación de la presencia de ácido nucleico que codifica Pro385
o Ser385 GABA_{A} \alpha6. El Ejemplo 14 proporciona varios
enfoques que se pueden usar para crear un soporte multimérico que
tiene Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6 o fragmentos
polipeptídicos del mismo.
\newpage
Ejemplo
14
Un soporte multimérico, que comprende Pro385 o
Ser385 GABA_{A} \alpha6 o sus péptidos, se puede obtener
acoplando la proteína, o el fragmento polipeptídico, a un soporte
macromolecular. Un "soporte" también puede ser un vehículo, una
resina o cualquier estructura macromolecular usada para unir o
inmovilizar a una proteína o fragmento polipeptídico. En muchas
realizaciones, se contempla como soporte un liposoma o una bicapa
lipídica (natural o sintética). El soporte macromolecular puede
tener una superficie hidrófoba que interacciona con las regiones
hidrófobas de la proteína, o fragmento polipeptídico, mediante
interacción no covalente hidrófoba. La superficie hidrófoba del
soporte también puede ser un polímero, tal como plástico, o
cualquier otro polímero en el que los grupos hidrófobos se han
enlazado, tal como poliestireno, polietileno, o polivinilo. Como
alternativa, la proteína de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, o
su fragmento polipeptídico, se puede unir covalentemente a
portadores que incluyen proteínas y oligopolisacáridos (por ejemplo,
celulosa, almidón, glicógeno, quitosano, o sefarosa aminada). En
estas últimas realizaciones, se puede usar un grupo reactivo en la
proteína de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, o su fragmento
polipeptídico, tal como un hidroxi o un amino, para unirse a un
grupo reactivo en el portador, para crear el enlace covalente.
Además, el soporte puede comprender un portador inorgánico tal como
un material de óxido de silicio (por ejemplo, gel de sílice,
zeolita, tierra de diatomeas, o vidrio aminado), al que se enlaza
covalentemente Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, o sus
fragmentos polipeptídicos, a través de un grupo hidroxi, carboxi o
amino, o a través de un grupo reactivo sobre el portador.
Se contempla además que puede ser ventajosa la
incorporación de ligadores o espaciadores, tales como ligadores
lambda, entre la proteína de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, o
fragmento polipeptídico, y el soporte. La inserción de ligadores
lambda de una longitud apropiada puede favorecer una mayor
flexibilidad en la molécula, y puede superar el impedimento estérico
que se puede producir cuando la proteína se une al soporte. La
determinación de una longitud apropiada del ligador, que permita la
unión óptima del ligando a la proteína multimérica de Pro385 o
Ser385 GABA_{A} \alpha6, o a sus fragmentos polipeptídicos, se
puede determinar sin experimentación innecesaria. El Ejemplo 15
proporciona varios métodos de determinación de rendimiento elevado
que se usan para identificar agentes que interaccionan con la
proteína de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, o con sus
fragmentos polipeptídicos.
Ejemplo
15
Un enfoque desarrollado para marcar canales
iónicos funcionales se basa en el flujo físico de iones conductores
a través del canal de interés. Para una corriente iónica de un
picoamperio, pueden pasar aproximadamente 10^{6} iones a través de
un canal iónico. Utilizando la propiedad de los iones de talio
monovalentes (T(I^{+})) de cristalizar a concentración muy
baja con iones haluro, tales como Br^{-}, se pueden marcar los
canales iónicos funcionales. De forma operativa, una vez que los
iones de talio se aplican a un lado de la membrana, pasarán a través
de los poros del canal, crearán un aumento local de la concentración
de talio, y eventualmente cristalizarán con iones de Br^{-} que
estén presentes en el otro lado de la membrana. Los cristales crecen
hasta un tamaño visible, y de este modo marcan la localización de
canales iónicos en la membrana (por ejemplo, véase Lopatin et
al., Biophysical Journal 74:2159-2170
(1998)).
En un aspecto de la invención, se inyecta un
primer grupo deXenopus oocytes con aproximadamente 5 ng de
ARNc de Ser385 GABA_{A} \alpha6 en el hemisferio (polo) del
animal (oscuro), y se registra una medida de la corriente de oocito
y del potencial de membrana, para proporcionar un valor de
referencia. Como control, se mide la corriente y el potencial de
membrana de un segundo grupo de Xenopus oocytes que se ha
inyectado con aproximadamente 5 ng de ARNc de Pro385. Los dos grupos
de oocitos se inyectan entonces con aproximadamente 50 nl de 30 mM
de KBr, para llevar la concentración intracelular de KBr hasta
aproximadamente 3 mM, y se mide el voltaje mediante cintas, con una
pinza de voltaje de 2 microelectrodos, en una disolución que
contiene talio. Después se aplican 40 x rampas de voltaje lineal de
410 ms, desde 80 mV hasta +50 mV, a una frecuencia de 0,75 Hz, para
accionar el flujo hacia el interior de iones de talio, y se
registran las corrientes iónicas. Después, se fotografía a los dos
grupos de oocitos. Múltiples cristales blancos serán visibles
mediante microscopio de luz en el hemisferio del animal si los
oocitos que expresan Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6 permiten
el transporte de iones. Comparando las capacidades relativas de los
dos grupos de oocitos para cristalizar el talio, el experto en la
materia puede determinar fácilmente el grado en el que la proteína
de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6 funciona como un
transportador iónico. Adicionalmente, el ensayo de cristalización
descrito anteriormente se puede realizar en un formato de múltiples
pocillos, y se pueden identificar librerías de agentes, tales como
péptidos, peptidomiméticos, y productos químicos, para determinar su
capacidad para interferir con el nivel de transporte iónico
potenciado por la proteína de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6.
De esta manera, se pueden identificar rápidamente agentes,
particularmente fármacos de BZD y compuestos relacionados, para
determinar su capacidad de interaccionar con la proteína de Pro385 o
Ser385 GABA_{A} \alpha6, y modular el transporte iónico.
En un método alternativo, se cargan con iones
bromuro (Br) liposomas que tienen la proteína de Pro385 o Ser385
GABA_{A} \alpha6. Subsiguientemente, los liposomas que tienen la
proteína de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6 se ponen en
contacto con iones de talio, y se aplica una corriente eléctrica. El
incremento local de la concentración de talio en el interior del
liposoma se detecta mediante observación microscópica de los
cristales que se forman en la localización de los canales iónicos.
Comparando las capacidades relativas de los liposomas que tienen
Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6 para cristalizar talio, el
experto en la materia puede determinar fácilmente el grado en el que
el Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6 funciona como un
transportador iónico. Adicionalmente, el ensayo de cristalización
descrito anteriormente se puede realizar en un formato de múltiples
pocillos, y se pueden identificar librerías de agentes, tales como
péptidos, peptidomiméticos, y productos químicos, para determinar su
capacidad de modular el transporte iónico potenciado por la proteína
de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6.
Para medir directamente el transporte iónico, se
usa una técnica de semitenaza de agarosa, basada en la capacidad de
la agarosa para conducir eléctricamente iones así como una
disolución libre mientras se obvia el grueso del flujo. (Véase, por
ejemplo, Lopatin et al.). Mediante este enfoque, los oocitos
que expresan la proteína de Ser385 GABA_{A} \alpha6, y los
oocitos que expresan la proteína de Pro385, se sujetan con tenazas
de voltaje en una disolución de un baño de TlCl, y se usan 2
microelectrodos para registrar las corrientes iónicas.
Subsiguientemente, el circuito de tenaza se apaga, se retiran los
electrodos, y la celda se sumerge completamente en agar al 1% en la
disolución de TlCl. Después de que el agar se endurece y se enfría
hasta temperatura ambiente, la pieza del gel que contiene la célula
se corta, y nuevamente se mide con las tenazas de voltaje la célula.
Comparando las capacidades relativas de los oocitos que expresan
Pro385 GABA_{A} \alpha6 y los oocitos que expresan Ser385
GABA_{A} \alpha6 para conducir la electricidad, el experto en la
materia puede determinar fácilmente el grado en el que Pro385 y
Ser385 GABA_{A} \alpha6 funciona como un transportador iónico.
Adicionalmente, la técnica de semitenaza de agarosa, descrita
anteriormente, se puede realizar en un formato de múltiples
pocillos, y se pueden identificar librerías de agentes, tales como
péptidos, peptidomiméticos, y productos químicos, para determinar su
capacidad para modular el transporte iónico potenciado por la
proteína de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6.
Mediante un enfoque alternativo, se emplean
soportes multiméricos que tienen unida la proteína de Pro385 o
Ser385 GABA_{A} \alpha6, o sus fragmentos polipeptídicos, y se
determina el análisis de impedancia del transporte iónico a través
de la proteína de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6 inmovilizada.
(Steinem et al., Bioelectro Chemistry and
Bioenergetics, 42:213-220 (1997)).
En esta realización, se construyen dos tipos de
soportes multiméricos reconstituyendo las proteínas de tipo natural
de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6 en grandes vesículas de una
sola laminilla (LUV) de bromuro de dimetildioctadecilamonio (DODAB),
que entonces se fusionan sobre una monocapa cargada negativamente de
ácido 3-mercaptopropiónico (MPA). Después se realiza
una determinación inicial de la impedancia en presencia de
diferentes cationes monovalentes, a concentraciones variables, para
los dos tipos de soportes multiméricos. Se usa la espectroscopía de
impedancia de A.C., como un método electroquímico integral, debido a
que ofrece la posibilidad de determinar los parámetros eléctricos de
películas delgadas, tales como biomembranas, sin iones marcadores
redox activos. De este modo, los iones que atraviesan por permeación
la membrana muestran una resistencia paralela a la capacitancia de
la membrana, y en serie con la capacitancia del sustrato.
El análisis de la impedancia A.C. se realiza
usando un analizador de ganancia de impedancia/fase SI 1260, de
Solartron Instruments (Gran Bretaña), controlado por un ordenador
personal; sin embargo, los expertos en la materia serán capaces de
usar otros analizadores de la impedancia de A.C. Para preparar el
soporte multimérico de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, se
exponen electrodos de poro, durante alrededor de 10 minutos, a una
disolución 10 mM del MPA, para formar una monocapa automontada muy
orientada. Después, los electrodos se aclaran concienzudamente con
una disolución tampón de Tris, pH 8,6, para eliminar cualquier
molécula fisisorbida que quede. Para controlar el recubrimiento
superficial y, por lo tanto, la calidad de la película, cada etapa
se monitoriza mediante espectroscopía de impedancia. Una
capacitancia de alrededor de 9 mM F/cm^{2} es un valor de
referencia para una monocapa depositada con éxito.
Las grandes vesículas de una sola laminilla (LUV)
de DODAB (1,5 mg/ml), con 1% en moles de Pro385 o Ser385 GABA_{A}
\alpha6, se preparan mediante un método de extrusión en la misma
disolución del tampón, como es conocido por los expertos en la
materia. (Steinem et al., Biochim. Biophys. Acta
1279:169-180 (1996)). Las vesículas de LUV se añaden
a la monocapa de MPA preparada, en la celda electroquímica. Se forma
una bicapa a temperatura ambiente, sin agitar la disolución. Después
de una hora, el proceso está acabado, y la suspensión de la vesícula
se sustituye por tampón puro.
A continuación, se observa la formación de una
bicapa soportada sólida mediante espectroscopía de impedancia, y se
toman las medidas en ausencia de iones. Subsiguientemente, se toman
medidas de la impedancia en presencia de diferentes concentraciones
de LiCl, NaCl, KCl, y CsCl. Después de la adición de diferentes
concentraciones de un tipo de ion a la bicapa de DODAB, la
disolución se sustituye por tampón puro, y se registra un espectro
de impedancia a fin de asegurar de que la bicapa soportada sólida no
se había destruido. El grado en el que la proteína de Pro385 o
Ser385 GABA_{A} \alpha6 tiene la capacidad para transportar el
ion particular será determinable, dado que la impedancia del sistema
electroquímico disminuye significativamente a medida que aumenta la
concentración del ion.
Similar a los métodos descritos anteriormente, se
puede diseñar un sistema de elevado rendimiento para identificar
librerías de compuestos o agentes que podrían interaccionar con
Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, y modular el transporte de
iones. En esencia, el enfoque anterior se aumenta a escala, y se
realiza la espectroscopía de impedancia sobre múltiples cámaras de
medida, teniendo cada una un conjunto de electrodos de trabajo. Las
medidas de la impedancia se toman antes de la adición del agente a
partir de la librería de péptidos, peptidomiméticos, y productos
químicos, de forma que se determine una lectura de valor de
referencia para un ion particular. Una vez se registra el valor de
referencia, se añaden diferentes agentes a cada cámara de medida, y
nuevamente se registran las medidas de la impedancia. A
continuación, los agentes que interaccionan con la proteína de
Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6, y que afectan al transporte de
iones, se identifican según el cambio relativo de la impedancia, en
presencia del agente. Esto es, un aumento en la impedancia del
sistema eléctrico cuando el agente está presente, en comparación con
su ausencia, por ejemplo, indicará que el compuesto interfiere con
la capacidad de la proteína de Pro385 o Ser385 GABA_{A} \alpha6
para transportar el ion.
<110> Iwata, Nakao
\hskip1cmGoldman, David
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> SUBUNIDAD ALFA-6 DEL
RECEPTOR POLIMÓRFICO HUMANO GABA A
\vskip0.400000\baselineskip
<130> NIH153.001 PR
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
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<213> Humano
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskipatggcgtcat ctctgccctg
\hfill20
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<210> 2
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Humano
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipctccaaatcc cggccgcagc
\hfill20
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<210> 3
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<212> ADN
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<213> Humano
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<210> 6
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<400> 6
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\hfill18
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<213> Humano
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<400> 7
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<210> 9
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<400> 9
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\hfill20
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<210> 10
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<211> 20
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<212> ADN
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<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskipgagaagcatc tacacaagtc
\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
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<211> 365
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<212> ADN
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<210> 12
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<210>13
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<211> 233
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<212> ADN
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<210>14
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<212> ADN
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<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>14
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (18)
1. Polinucleótido aislado que codifica la
subunidad \alpha6 del receptor del neurotransmisor GABA_{A}
humano, en el que dicho polinucleótido tiene un codón para la
posición 385 del aminoácido de dicha secuencia polipeptídica de
\alpha6, en el que dicho codón codifica un resto de serina.
2. Polinucleótido aislado según la reivindicación
1, en el que dicho polinucleótido comprende SEC ID nº 12.
3. Polinucleótido aislado según la reivindicación
1, en el que dicho polinucleótido comprende al menos 10 bases
consecutivas de SEC ID nº 12.
4. Polinucleótido aislado según la reivindicación
1, en el que dicho polinucleótido comprende al menos 10 bases
consecutivas que se hibridan con SEC ID nº 12, o con una secuencia
complementaria a la misma, en las siguientes condiciones: 7% de
dodecilsulfato de sodio (SDS), 0,5 M de NaPO_{4} pH 7,0, 1 mM de
EDTA, a 50ºC; y lavado con 1% de SDS, a 42ºC.
5. Subunidad de \alpha6 aislada del receptor
del neurotransmisor GABA_{A} humano, que tiene un resto de serina
en la posición 385 de aminoácidos.
6. Subunidad \alpha6 aislada según la
reivindicación 5, en la que uno o más restos de aminoácidos están
sustituidos por otro aminoácido, dando como resultado una alteración
silenciosa.
7. Subunidad \alpha6 aislada según la
reivindicación 6, en la que dicha subunidad comprende al menos 3
aminoácidos consecutivos deducidos de la SEC ID nº 12.
8. Anticuerpo aislado que se une específicamente
a la subunidad \alpha6 del receptor del neurotransmisor GABA_{A}
humano que tiene un resto de serina en la posición 385 de
aminoácidos, diferenciando dicha subunidad que tiene un resto de
serina en la posición 385 de aminoácidos de una subunidad que tiene
un resto de prolina en la posición 385 de aminoácidos.
9. Anticuerpo según la reivindicación 8, en el
que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
10. Método para detectar un polimorfismo en un
gen que codifica la subunidad \alpha-6 del
receptor del neurotransmisor GABA_{A} de un ser humano, que
comprende las etapas siguientes:
- -
- analizar una muestra biológica para determinar la presencia de un polinucleótido de diagnóstico, codificando dicho polinucleótido de diagnóstico la subunidad \alpha-6 del receptor del neurotransmisor GABA_{A} que tiene un resto de serina en la posición 385 de aminoácidos de la secuencia polipeptídica de \alpha-6; y
- -
- identificar dicho gen porque tiene dicho polimorfismo, cuando se detecta en dicha muestra biológica la presencia de dicho polinucleótido de diagnóstico.
11. Método según la reivindicación 10, en el que
dicho análisis de dicha muestra biológica comprende además realizar
una reacción en cadena de polimerasa (PCR) con cebadores
oligonucleotídicos que tienen las secuencias de SEC ID nº 9 y SEC ID
nº 10.
12. Método según la reivindicación 10, en el que
dicho análisis de dicha muestra biológica comprende además realizar
una digestión con endonucleasa de restricción Fok I.
13. Método para identificar si un ser humano
tiene o no sensibilidad a un fármaco benzodiazepínico o a etanol,
que comprende las etapas siguientes:
- -
- analizar una muestra biológica para determinar la presencia de un polinucleótido de diagnóstico, codificando dicho polinucleótido de diagnóstico la subunidad \alpha-6 del receptor del neurotransmisor GABAA que tiene un resto de serina en la posición 385 de aminoácidos de la secuencia polipeptídica de \alpha-6, o codificando dicho polinucleótido de diagnóstico la subunidad \alpha-6 del receptor del neurotransmisor GABAA que tiene un resto de prolina en la posición 385 de aminoácidos de la secuencia polipeptídica de \alpha-6; y
- -
- identificar a dicho ser humano por no tener sensibilidad a un fármaco benzodiazepínico o a etanol cuando se detecta la presencia de un resto de serina en la posición 385 de la secuencia polipeptídica de \alpha-6, e identificar al ser humano por tener una sensibilidad a un fármaco benzodiazepínico o a etanol cuando se detecta la presencia de un resto de prolina en la posición 385 de la secuencia polipeptídica de la secuencia de \alpha-6.
14. Método según la reivindicación 13, en el que
dicho fármaco benzodiazepínico es diazepam.
15. Método según la reivindicación 13, en el que
dicho análisis de dicha muestra biológica comprende además realizar
una reacción en cadena de polimerasa (PCR) con cebadores
oligonucleotídicos que tienen las secuencias de SEC ID nº 9 y SEC ID
nº 10.
16. Método según la reivindicación 13, en el que
dicho análisis de dicha muestra biológica comprende además realizar
una digestión con endonucleasa de restricción Fok I.
17. Método para identificar un polimorfismo en el
gen que codifica la subunidad \alpha-6 del
receptor del neurotransmisor GABA_{A} humano en una muestra
biológica, que comprende la etapa de comparar una primera secuencia
procedente de dicha muestra biológica, en la que la primera
secuencia se selecciona del grupo que consiste en un gen que
codifica la subunidad \alpha-6 de GABA_{A}, un
ARN que codifica la subunidad \alpha-6 de
GABA_{A}, un ADNc que codifica la subunidad
\alpha-6 de GABA_{A}, y un polipéptido que
corresponde a la subunidad \alpha-6 de GABA_{A},
con una segunda secuencia seleccionada del grupo que consiste en un
gen que codifica la subunidad \alpha-6 de
GABA_{A} que tiene un resto de prolina o de serina en la posición
385 de aminoácidos, un ARN que codifica la subunidad
\alpha-6 de GABA_{A} que tiene un resto de
prolina o de serina en la posición 385 de aminoácidos, un ADNc que
codifica la subunidad \alpha-6 de GABA_{A} que
tiene un resto de prolina o de serina en la posición 385 de
aminoácidos, y un polipéptido que corresponde a la subunidad
subunidad \alpha-6 de GABA_{A} que tiene un
resto de prolina o de serina en la posición 385 de aminoácidos.
18. Método según la reivindicación 17, en el que
dicha segunda secuencia es SEC ID nº 11 ó nº 12.
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