JPH06181769A - Ｅａａ１ファミリーのカイネート結合ヒトｃｎｓ受容体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ヒトにおけるＣＮＳ異常を治療するのに有効
な治療法の研究において、これまでに単離されているラ
ット受容体を用いて得られるよりもよくヒトの状態を表
わす候補化合物に対するスクリーンを提供すること。 【構成】 カイネート結合型ＥＡＡ受容体をコードする
ＤＮＡの単離及び受容体のタンパク質のキャラクタリゼ
ーション、ＥＡＡ受容体を異質膜結合産物として産生す
る組換え細胞系、及び、ＥＡＡ受容体刺激を変化させる
化合物を検出するツールとしての本発明の組換え細胞系
の使用。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、神経生物学の分野にお
ける組換えＤＮＡ技術の適用に係わる。特に本発明は、
興奮性アミノ酸（ＥＡＡ）受容体、特にヒトＥＡＡ受容
体をコードするＤＮＡのクローニング及び発現に係わ
る。

【０００２】

【従来の技術】哺乳動物中枢神経系（ＣＮＳ）におい
て、インパルスの伝達は、“放出（ｓｅｎｄｉｎｇ）”
ニューロンによって放出される神経伝達物質と“受容
（ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ）”ニューロン上の表面受容体と
の相互作用によって制御される。Ｌ−グルタメートはＣ
ＮＳにおける最も豊富な神経伝達物質であって、脊椎動
物における主要な興奮性経路を仲介する。従ってグルタ
メートは興奮性アミノ酸（ＥＡＡ）と称され、それに応
答する受容体は、グルタメート受容体、より一般的には
ＥＡＡ受容体と様々に称されている。

【０００３】哺乳動物の脳から単離した組織または種々
の合成受容体アゴニストを使用し、ＥＡＡ受容体の薬学
的知識は幾分みがかれている。ＥＡＡ受容体ファミリー
のメンバーは、かかるアゴニストへの結合の相違に基づ
いて３つの主要タイプに分類される。グルタメートのほ
かにアゴニストＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテ
ート）にも結合する１つのタイプのＥＡＡ受容体は、Ｎ
ＭＤＡ型のＥＡＡ受容体と称されている。ＮＭＤＡに結
合しない他の２つのグルタメート結合タイプのＥＡＡ受
容体は、他の２種のＥＡＡ受容体アゴニスト、即ちＡＭ
ＰＡ（α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−イソ
キサゾール−４−プロピオネート）及びカイネートに結
合する優先度に従って命名されている。特に、グルタメ
ートに結合するがＮＭＤＡには結合せず且つＡＭＰＡよ
りもカイネートにより高い親和性で結合する受容体は、
カイネート型ＥＡＡ受容体と称されている。同様に、グ
ルタメートに結合するがＮＭＤＡには結合せず且つカイ
ネートよりもＡＭＰＡにより高い親和性で結合するＥＡ
Ａ受容体は、ＡＭＰＡ型ＥＡＡ受容体と称されている。

【０００４】このグルタメート結合ＥＡＡ受容体ファミ
リーは生理学的及び医学的に重要である。グルタメート
は、多くの態様の長期増強（ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｐｏ
ｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ）（学習及び記憶）、シナプス可
塑性（ｓｕｎａｐｔｉｃ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）の発
生、てんかん性発作、卒中または他の低酸素状態に続く
虚血によって惹起される神経細胞障害、及び、他の形態
の神経変性プロセスに関与する。しかしながら、上記プ
ロセスを緩和する治療法の開発は、ＥＡＡ受容体の界面
で特異的に相互作用する選択的結合薬物分子を発見する
ための均質な受容体材料源が欠如しているため、極めて
困難である。候補薬物をスクリーニングするのに最近使
用されている脳由来の組織は不均質な受容体源であり、
問題のＥＡＡ受容体／リガンド界面の研究を妨害する多
数の受容体型をその表面に有する。ヒト治療法の研究
は、ヒト由来の脳組織の入手が制限されていることによ
っても難しくなっている。従って、問題の受容体のみを
産生するように遺伝子工学処理された細胞を得ることが
望まれている。クローン化受容体遺伝子を発現する細胞
系を用いると、所望の受容体について均質の基質が薬物
スクリーニングプログラムに提供される。

【０００５】極めて最近、非ヒト資源、主にラット由来
のＥＡＡ受容体の置換ポリペプチドをコードする遺伝子
が発見された。Ｈｏｌｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３４２：６４３，１９８９は、元々はＧｌｕ
Ｒ−Ｋ１と称されていた（今は単にＧｌｕＲ１と呼ばれ
ている）遺伝子をラットから単離したと記載した。この
遺伝子はラットＥＡＡ受容体ファミリーの１メンバーを
コードし、これは最初はカイネート型であると考えられ
た。これに続くＫｅｉｎａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２４９：５５６ １９９０の研究は、ここ
でもラットにおいて、実際には既に単離されていたＧｌ
ｕＲ１と同一であったＧｌｕＲ−Ａと称される遺伝子
が、カイネート型ではなくＡＭＰＡ型の受容体をコード
することを示した。上記２つのグループの研究者らは、
その後、ラット資源から単離された５種の近縁遺伝子を
報告した。Ｂｏｕｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ２４９：１０３３，１９９０は、ＧｌｕＲ１のほか
に、ラットは３種の他の近縁遺伝子を含むことを明らか
にし、それらをＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３及びＧｌｕＲ４
と称し、また、Ｂｅｔｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕ
ｒｏｎ ５：５８３，１９９０はＧｌｕＲ５を記載し
た。Ｋｅｉｎａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（上掲）は、それ
ぞれＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３及びＧｌｕＲ
４と正確に対応するＧｌｕＲ−Ａ ＧｌｕＲ−Ｂ、Ｇｌ
ｕＲ−Ｃ及びＧｌｕＲ−Ｄと称される遺伝子を記載し
た。Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
４９：１５８０，１９９０は更に、ＧｌｕＲ−Ａ Ｇｌ
ｕＲ−Ｂ、ＧｌｕＲ−Ｃ及びＧｌｕＲ−Ｄについて、各
遺伝子に対して２種類の別様にスプライシングされた形
態を示した。上記著者及びＭｏｎｙｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ６：７９９，１９９１は、上記遺
伝子の別様にスプライシングされた形態がラット脳にお
いて別様に発現されることを示すことができた。これら
のＡＭＰＡ受容体遺伝子の単離に加え、より最近では、
既知の受容体の種々の混合物のイオンゲート制御特性を
決定する研究が幾つか試みられている（Ｎａｋａｎｉｓ
ｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ５：５６９，１９
９０；Ｈｏｌｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２５２：８５１，１９９１；Ｖｅｒｄｏｏｒｎ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１７１５，１９
９１；及び国際公開第ＷＯ ９１／０６６４８号参
照）。

【０００６】カイネート型受容体をコードするとみられ
る非ヒト遺伝子に係わる研究も最近幾つかが公開され
た。Ｅｇｅｂｊｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ
３５１：７４５，１９９１は、ＧｌｕＲ６と称されるラ
ット由来の遺伝子の単離を記載しており、この遺伝子
は、ＡＭＰＡ受容体遺伝子と配列が近縁であるが、ＡＭ
ＰＡによってではなくグルタメート、キスカレート及び
優先的にはカイネートによって活性化される受容体を形
成する。他のカイネート結合タンパク質は、カエル由来
（Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：６
８４，１９８９）、ニワトリ由来（Ｇｒｅｇｏｒ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：６８９，１９８９）
及びラット由来（Ｗｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ
ｕｒｅ ３５１：７４２，１９９１）のものが記載され
ている。これら後者の遺伝子は、それ自体が発現したと
きに、カイネートに結合するが、容易には機能的イオン
チャンネルを形成することのないタンパク質をコードす
る。

【０００７】ＥＡＡ受容体及びそれらのサブユニットは
ラット脳中に存在するので、これらの構造的特性は上記
の分子クローニングの進歩によってより理解されてい
る。最近のＥＡＡ受容体の構造モデルに従えば、各ＥＡ
Ａ受容体は、各々が４つのトランスメンブラン領域と、
リガンド結合特性をある程度左右し且つ受容体結合体に
よって提供されるイオンゲート制御機能に寄与する細胞
外ドメインとを有する個別の膜固着（ｍｅｍｂｒａｎｅ
−ａｎｃｈｏｒｅｄ）サブユニットからなるヘテロ構造
である。Ｋｅｉｎａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（上掲）は、
例えば、ＧｌｕＲ−Ａ、ＧｌｕＲ−Ｂ、ＧｌｕＲ−Ｃ及
びＧｌｕＲ−Ｄと称されるものを含むラットＧｌｕＲ受
容体の各サブユニットは、それらの結合状態においてグ
ルタメート、ＡＭＰＡ及びカイネートによってゲート制
御されるカチオンチャンネル活性を表わすことを示し
た。しかしながら、例えばＧｌｕＲ−ＡをＧｌｕＲ−Ｂ
と組み合わせるなど、組み合わせて発現させると、明ら
かにより大きい電流を有するゲート制御イオンチャンネ
ルが宿主哺乳動物細胞中に生成される。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】ヒトにおけるＣＮＳ異
常を治療するのに有効な治療法の研究において、これま
でに単離されているラット受容体を用いて得られるより
もよくヒトの状態を表わす候補化合物に対するスクリー
ンを提供することが極めて望まれる。特に、ヒト治療用
化合物に対する適正スクリーンを生成するために、ヒト
受容体をコードするクローン化遺伝子、及びかかる遺伝
子を発現する細胞系を提供することが望まれる。従って
これらのことが本発明の目的である。

【０００９】本発明の目的は、ヒトＥＡＡ受容体をコー
ドするＤＮＡ分子を単離形態で提供することである。

【００１０】本発明の別の目的は、カイネート結合ヒト
ＥＡＡ受容体を産生するように遺伝子工学処理された細
胞を提供することである。

【００１１】本発明の他の目的は以下の本発明の説明か
ら明らかとなろう。

【００１２】

【課題を解決するための手段】ヒト脳に内在するＥＡＡ
受容体ファミリーをコードする遺伝子は同定及び特性分
析されている。ＥＡＡ１ａと称されるこのヒトＥＡＡ受
容体ファミリーの代表的メンバーは、ＥＡＡ受容体に典
型的な親和性でグルタメートを結合する上に、カイネー
ト型ＥＡＡ受容体に特徴的なリガンド結合特性をも示す
受容体タンパク質をコードする。ヒトＥＡＡ１ａ受容体
の天然変異体をコードする配列近縁遺伝子もまた同定さ
れており、以降はヒトＥＡＡ１受容体ファミリーと表記
する上記受容体ファミリーの別のメンバーを構成する。

【００１３】本発明は、１つの態様においては、ヒトＥ
ＡＡ１受容体またはそのカイネート結合フラグメントを
コードする、ＤＮＡまたはＲＮＡからなる単離ポリヌク
レオチドを提供する。

【００１４】本発明は、別の態様において、本明細書に
おいて定義されたＥＡＡ１ファミリーに属するカイネー
ト結合ヒトＥＡＡ受容体を産生するように遺伝子工学処
理された細胞を提供する。この関連態様において本発明
は、かかる細胞を製造するのに有効な組換えＤＮＡ構築
物及び関連方法をも提供する。

【００１５】更に別の態様において本発明は、ヒトＥＡ
Ａ１受容体の特性を有する受容体に結合するための、選
択された化合物の親和性を評価する方法であって、該化
合物を本発明の遺伝子工学処理された細胞またはそれか
ら誘導された膜調製物と一緒に、試験化合物の受容体結
合親和性を測定するのに適した方法でインキュベートす
るステップを含む方法を提供する。

【００１６】本明細書に記載の新規知見の種々の適用を
含む本発明の他の態様は、以下の詳細説明及び添付の図
面から明らかとなろう。

【００１７】発明の詳細な説明及び 好ましい実施態様 本発明はヒト由来の興奮性アミノ酸（ＥＡＡ）受容体に
関するものであり、より特定的には新規のカイネート系
ヒトＥＡＡ受容体ファミリーに関する。本明細書ではこ
の受容体ファミリーをヒトＥＡＡ１受容体ファミリーと
称する。本明細書中の「ヒトＥＡＡ１受容体」には、ヒ
トＥＡＡ１ａ受容体と、該ＥＡＡ１ａ受容体のカイネー
ト結合性変異体であって構造的に該受容体と同類であ
る、即ち該受容体に対して９５％以上の相同を有する変
異体とが含まれる。ＥＡＡ１ａ受容体のカイネート結合
性変異体には、天然のものと合成によって誘導したもの
とがある。天然のヒトＥＡＡ１ａ受容体変異体としては
特に、本明細書でヒトＥＡＡ１ｂ受容体、ヒトＥＡＡ１
ｃ受容体及びヒトＥＡＡ１ｄ受容体と称するものが挙げ
られる。本明細書中の「カイネート結合性（ｋａｉｎａ
ｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ）」とは、本明細書に記載のよう
な一般的設計のアッセイで測定して、カイネートに対す
る結合親和性がグルタメート、ＡＭＰＡ又はＮＭＤＡに
対する結合親和性より大きい受容体変異体及び受容体フ
ラグメントを表す用語である。

【００１８】天然のＥＡＡ１類はいずれも、ＥＡＡ受容
体全般に特有の構造的特徴、例えば細胞外Ｎ末端及びＣ
末端領域、並びに受容体を細胞表面膜内に固定するのに
使用される４つの内部疎水性領域を有する。ＥＡＡ１ａ
と称する特定のヒトＥＡＡ受容体は、最初に２０残基Ｎ
末端シグナルペプチドを有する前駆体形態で産生され、
このシグナルペプチドを欠失し且つFig.１に単一文字符
号で示した配列中の９３６個のアミノ酸を含む成熟した
形態で細胞表面に運ばれる単一ポリペプチド鎖として構
造的に特徴付けられるタンパク質である。特に説明がな
い限り、ＥＡＡ１受容体のアミノ酸残基は成熟タンパク
質配列に基づいて番号付けしてある。受容体の構造的領
域については、ハイドロパシー分析（ｈｙｄｒｏｐａｔ
ｈｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）により４つの推定トランスメ
ンブラン領域が明らかにされている。その１つは残基５
２７〜５４６にまたがり（ＴＭ−１）、２つ目は残基５
７１〜５８９にまたがり（ＴＭ−２）、３つ目は残基６
００〜６１８にまたがり（ＴＭ−３）、４つ目は残基７
８５〜８０５にまたがる（ＴＭ−４）。この割り当てに
基づけば、天然の膜結合形態のヒトＥＡＡ１ａ受容体構
造は、５２６アミノ酸Ｎ末端細胞外領域と、これに続い
て４つのトランスメンブラン領域を含む疎水性領域と、
細胞外１３１アミノ酸Ｃ末端領域とを含むと考えられ
る。

【００１９】Fig.４に示すように、ヒト脳組織中に天然
に存在する構造的に同類のＥＡＡ１ａ受容体変異体も既
に同定されている。これらの変異体をコードする遺伝子
のヌクレオチド配列から推論すると、これらの変異体は
ＥＡＡ１ａとの間に約９８％以上のアミノ酸相同を有す
る。即ち、アミノ酸レベルではＥＡＡ１ａに対する相同
が約９８％以上である。変異体の１つＥＡＡ１ｂは実質
的にＥＡＡ１ａと同じであるが、ヌクレオチドが１つだ
け異なっており、その結果ＧＴＴコドンがＡＴＴコドン
となり、アミノ酸レベルでバリンがイソロイシンに変化
している。他の２つの変異体ＥＡＡ１ｃ及びＥＡＡ１ｄ
はＥＡＡ１ａに対する実質的相異点がもっと多い。変異
体ＥＡＡ１ｃは２４塩基対欠失を特徴とし、その結果ア
ミノ酸レベルで、ＥＡＡ１ａ受容体の細胞外領域から８
つの残基が欠失した状態になっている。変異体ＥＡＡ１
ｄは、ＥＡＡ１ｃで２４個のヌクレオチドが欠失してい
る位置に１１個のヌクレオチドが挿入されていることを
特徴とする。ＥＡＡ１ｄに挿入された１１個の塩基対は
読み取り枠をシフトさせる効果を有し、実際、この挿入
の又はその近傍の位置３’にストップコドンを導入す
る。その結果、ＥＡＡ１ｄをコードするＤＮＡは実際に
は、先端を切ったタンパク質、又は本質的には細胞外Ｅ
ＡＡ１ａフラグメントをコードすることになる。

【００２０】ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリー、即ちＥＡ
Ａ１ａ受容体をコードするＤＮＡの単離源では、ＥＡＡ
１ａ受容体がFig.１のヌクレオチド配列でコードされ
る。前出の出版物に記述されているようなマウス組織中
に発見されたＥＡＡ受容体に対するヒトＥＡＡ１受容体
ファミリーのアミノ酸相同は約４５％以下であるが、ご
く最近になって前出の出版物（１９９１）に発表された
Ｗｅｒｎｅｒらの論文に記述されているように、マウス
ＫＡ１タンパク質はヒトＥＡＡ１ａに対して約９４％の
アミノ酸相同を有する。このマウス受容体とヒトＥＡＡ
１受容体との最も重要な相異は、これら受容体の細胞外
Ｃ末端領域に見られる。

【００２１】他のヒトＥＡＡ１受容体ファミリーと同様
に、受容体サブタイプＥＡＡ１ａは薬理学的プロフィ
ル、即ちリガンド結合「特性（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）」
が、ＮＭＤＡ及びＡＭＰＡのような他の興奮性アミノ酸
受容体と異なり、カイネート系薬理の方に強く向いてい
ることを特徴とする。カイネート結合性受容体が薬理学
的に機能するためには、多重型のそしておそらくは異数
型（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ）のサブユニット構造が必
要であるという認識にもかかわらず、単位ＥＡＡ１ａ受
容体を産生する細胞は、他の受容体サブユニットとの結
合とは関係なく、興奮性アミノ酸結合を信頼性をもって
示すことが判明した。そこで本発明では主な特徴とし
て、ＥＡＡ受容体結合に関して内因性ＥＡＡ受容体リガ
ンド及び該リガンドの公知の合成類似体と競合する能力
を有する可能性のある化合物をスクリーニングする目的
で、ヒトＥＡＡ１ａ受容体を使用する。

【００２２】受容体結合アッセイで使用する場合は、遺
伝子工学技術を使用して、機能形態のヒトＥＡＡ１受容
体を異種産物として産生する哺乳動物細胞を構築するの
が望ましい。このような細胞系の構築は、次のような組
換えＤＮＡ構造体（構築物）、即ち細胞表面に運ぶこと
ができる形態を有する、即ち天然性のシグナルペプチド
又はその機能性異種等価物を有するヒトＥＡＡ１受容体
をコードするＤＮＡが、選択した宿主内で受容体コード
ＤＮＡの発現を促すように機能して所望のＥＡＡ１受容
体タンパク質を産生せしめる発現制御エレメントと協働
する組換えＤＮＡ構造体を、選択したヒト宿主細胞中に
導入することによって達成される。このような細胞は、
本明細書では、受容体をコードするＤＮＡが「発現可能
なように（ｅｘｐｒｅｓｓｉｂｌｙ）」組込まれている
ことを特徴とする。受容体をコードするＤＮＡは、この
ようなＤＮＡが特定の宿主中に天然に存在しない場合に
は、特定細胞宿主に対して「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇ
ｏｕｓ）」であると言う。ヒトＥＡＡ１受容体を産生す
るための宿主として使用するのに選択する特定の細胞の
種類は、当業界で現在使用されている幾つかの細胞の種
類のうち任意のものであってよいが、興奮性アミノ酸に
結合し得る表面受容体を天然状態で産生し、従って形成
した細胞系から得られる所期のアッセイ結果を乱すよう
な種類は勿論避けなければならない。一般的に、この種
の問題は非神経細胞系を宿主として選択することにより
回避され、通常のように非ヒト細胞系を使用すれば更に
確実に回避できる。但し、検査リガンドへの「バックグ
ラウンド」結合をアッセイ結果で考慮すれば、神経細胞
及びヒト細胞を発現宿主として使用することもできる。
本発明の実施態様の１つでは、ＥＡＡ１受容体産生の宿
主として使用すべく選択する細胞系が哺乳動物細胞であ
る。この種の細胞系は現在遺伝子工学操作で数種類使用
されており、その具体例としては、チャイニーズハムス
ター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えばＰｒｏ５変異体（ＡＴ
ＣＣ ＣＲＬ １２８１）を含むＫ１系（ＡＴＣＣ Ｃ
ＣＬ ６１）；ＣＶ−１系（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７
０）、ＣＯＳ−１系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）及
びＣＯＳ−７系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）のＳＶ４
０形質転換アフリカミドリザル腎臓由来の繊維芽細胞様
細胞；マウスＬ細胞、マウス３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ Ｃ
ＲＬ １６５８）、マウスＣ１２７細胞、２９３系（Ａ
ＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）のヒト腎胚細胞、ＨｅＬａ
系（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）のものを含むヒト癌細胞、
並びにＩＭＲ−３２系（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １２７）、
ＳＫ−Ｎ−ＭＣ系（ＡＴＣＣ ＨＴＢ １０）及びＳＫ
−Ｎ−ＳＨ系（ＡＴＣＣ ＨＴＢ １１）の神経芽腫細
胞が挙げられる。

【００２３】これらの宿主と一緒に使用できる遺伝子発
現システムはこれまで色々開発されており現在市販され
ているが、ＥＡＡ１受容体をコードするＤＮＡの発現を
促すためには、これらのシステムのうち任意のものを選
択し得る。これらのシステムは通常プラスミド系ベクタ
ーの形態で入手でき、発現制御配列を構成するＤＮＡを
含む機能成分（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｎｅ
ｎｔｓ）を有する発現カセットを含んでいる。前記発現
制御配列は宿主によって認識され、受容体をコードする
ＤＮＡの５’と結合してこのＤＮＡの発現を可能にす
る。これらのシステムは更に、受容体をコードする領域
の３’に結合して発現を終結させるＤＮＡ配列も含んで
いる。例えば、選択した哺乳動物細胞宿主内で発現させ
る場合には、運搬可能な受容体前駆体をコードするＤＮ
Ａが宿主によって認識される発現制御ＤＮＡ配列に結合
している組換えＤＮＡ発現構造体であって、発現を促す
受容体コーディングＤＮＡの５’領域と発現を終結させ
る３’領域とを含んでいる組換えＤＮＡ発現構造体を形
成する。この発現構造体を有するプラスミド系ベクター
は一般に、発現宿主中でのプラスミドの複製を可能にし
且つ望ましくは大腸菌のような細菌宿主中でのプラスミ
ド増幅を行うために、通常はウイルス由来である複製起
点のような他の機能成分を含んでいる。安定に形質転換
した組換え細胞の選択を可能にするマーカーを与えるた
めには、ベクターが更に、生存に関する利点を形質転換
細胞に付与する遺伝子、例えばネオマイシン耐性をコー
ドする遺伝子をも含み、その場合は形質転換細胞をネオ
マイシン添加媒質中でプレート（ｐｌａｔｅ）する。

【００２４】受容体をコードするＤＮＡを哺乳動物細胞
中で発現させるのに使用できる種々の組換えＤＮＡ発現
システムとしては、哺乳動物細胞に感染するウイルスの
プロモーター、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）
由来、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルス（ＲＳＶ）由来、サルウイ
ルス（ＳＶ４０）由来、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴ
Ｖ）由来等のプロモーターを利用するものが挙げられ
る。発現を促すのに有用なプロモーターとしてはその他
に、レトロウイルスのＬＴＲ、昆虫細胞プロモーター、
例えば温度によって調節されるもの、ショウジョウバエ
から単離したもの、哺乳動物遺伝子プロモーター、例え
ば重金属で調節されるもの、即ちメタロチオネイン遺伝
子プロモーター、並びに他のステロイド誘導性プロモー
ターが挙げられる。

【００２５】組換えＤＮＡ発現ベクターに組込む場合
は、選択した遺伝子単離方法又は遺伝子合成方法を用い
て、所望のＥＡＡ１受容体、即ちＥＡＡ１ａ受容体又は
該受容体のカイネート結合性変異体をコードするＤＮＡ
を得ることができる。後述の実施例で詳述するように、
ＥＡＡ１ａ受容体並びに該受容体のＥＡＡ１ｂ、ＥＡＡ
１ｃ及びＥＡＡ１ｄ変異体はヒト脳組織のゲノム内でコ
ードされ、従って一般的な遺伝子単離方法及びクローニ
ング方法を注意深く適用することにより取得できる。そ
の場合は通常、新鮮なヒト脳組織源、好ましくは小脳又
は海馬組織から完全なメッセンジャーＲＮＡを抽出し、
次いでメッセージをｃＤＮＡに変換し、且つライブラリ
ーを例えば細菌プラスミド、より一般的にはバクテリオ
ファージ中に形成する。このようなヒトＤＮＡフラグメ
ントを有するバクテリオファージは通常、個々のファー
ジプラーク又はコロニーを単離できるように敏感な大腸
菌バクテリアのローン（ｌａｗｎ）上にプレートするこ
とによって増殖させる。次いで通常は、ファージコロニ
ーに担持されたＤＮＡをニトロセルロース又はナイロン
ベースのハイブリダイゼーション膜上に固定し、その後
注意深く調節した条件で、放射性の（又は他の）標識を
付けた適当な配列のオリゴヌクレオチドプローブとハブ
リダイズさせて、受容体をコードするＤＮＡ又はそのフ
ラグメントを含む特定ファージコロニーを同定する。通
常は、このようにして同定した遺伝子又はその一部分を
プラスミド系ベクターにサブクローンして核酸配列を分
析する。本明細書には種々のヒトＥＡＡ１受容体のヌク
レオチド配列を示したが、これらの受容体をコードする
ＤＮＡの形成には自動的な遺伝子合成及び／又は増幅方
法を実施し得る。ＥＡＡ１受容体をコードするＤＮＡの
長さに起因して、自動合成は段階的な遺伝子構築を必要
とし得る。即ち、約３００個のヌクレオチドに及ぶ長さ
の遺伝子の領域を個々に合成し、次いで正確な順序で連
結して最終的集合体を形成するのである。個々に合成し
た遺伝子領域は、集合前にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）技術を用いて増幅し得る。

【００２６】自動遺伝子合成方法を使用すると、天然の
ＥＡＡ１遺伝子類の配列変異体を形成する機会が得られ
る。例えば、本明細書に記載のＥＡＡ１受容体をコード
するポリヌクレオチドは、ここで同定した天然ポリヌク
レオチド配列に示されているコドンに代えて同じ意味の
コドンを用いることにより形成し得る。更に、本明細書
に記載のＥＡＡ１受容体の合成変異体をコードするポヌ
クレオチドとして、例えば１つ以上の単一アミノ酸の置
換、欠失又は添加を含むものを形成し得る。通常はスク
リーニングの目的で受容体の天然リガンド結合プロフィ
ルを保持するのが望ましいため、アミノ酸置換は例えば
いわゆる保存性置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｒｅ
ｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、即ち類似電荷のアミノ酸を置換
する手法に限定するのが望ましく、置換位置は、受容体
活性にとってそれほど重要ではない部位、例えば成熟受
容体の最初の２０個のＮ末端残基の範囲、並びに受容体
領域の地図の作成によって明らかになるような他の領域
に限定するのが望ましい。適当な鋳型ＤＮＡがあれば、
ＰＣＲ増幅技術を最終的遺伝子の全体又は一部分を直接
形成するために使用することもできる。その場合は、最
終産物のＰＣＲ増幅を開始させるプライマーを単一片
で、又は互いに連結し得る複数の片で合成する。この合
成は、ブラントエンドを有する増幅したＤＮＡフラグメ
ントの段階的連結を介して、又は好ましくは天然の制限
エンドヌクレアーゼ部位を有するフラグメントの段階的
連結を介して実施し得る。この場合は、ｃＤＮＡ又はゲ
ノムＤＮＡをＰＣＲ増幅の鋳型として使用できる。前者
の場合は、海馬及び小脳を含む種々のヒト脳組織の市販
又は手製のｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡ鋳型を得
ることができる。

【００２７】受容体をコードするＤＮＡが得られたら、
このＤＮＡを発現のために任意の適当な発現ベクターに
組込み、これで、一般的な方法、例えばＤＮＡ媒介形質
転換、エレクトロポレーション又はパーティクルガン
（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｇｕｎ）形質転換を用いて宿主細
胞のトランスフェクションを行う。発現ベクターは、受
容体コードＤＮＡを一時的に又は安定して（定常的に）
発現する形質転換細胞系が得られるように選択し得る。
遷移（一時的）発現の場合には、哺乳動物細胞中で機能
する複製起点を有する発現ベクターで宿主細胞を形質転
換するのが一般的である。定常発現の場合には前述のよ
うな複製起点は不要であるが、通常はベクターが、その
選択を可能にするために、生存に関する利点を形質転換
細胞に付与する産物をコードする遺伝子を含むようにす
る。このような選択可能なマーカーをコードする遺伝子
としては、マイコフェノール酸耐性を与える大腸菌ｇｐ
ｔ遺伝子、抗生物質Ｇ４１８及びネオマイシンに対する
耐性を与えるトランスポゾンＴｎ５由来のネオ遺伝子、
ＤＨＦＲ−細胞の表現型をＤＨＦＲ＋細胞に変えるネズ
ミ細胞由来もしくは大腸菌由来のｄｈｆｒ配列、並びに
ＴＫ−細胞の表現型をＴＫ＋細胞にする単純ヘルペスウ
イルスのｔｋ遺伝子が挙げられる。遷移発現でも定常発
現でも、リガンドスクリーニングアッセイで使用するた
めの形質転換細胞系並びにこの細胞系に由来する膜調製
物を得ることができる。 スクリーニングアッセイで使
用するために、受容体をコードするＤＮＡを遷移的に発
現させる細胞は、後で使用するために凍結して貯蔵し得
るが、プラスミドの複製速度が速く結局細胞が通常数日
以内に死んでしまうため、形質転換した細胞は、出来る
限り早く使用しなければならない。このようなアッセイ
は、完全な細胞、またはこのような細胞から誘導した膜
調製物で実施し得る。膜調製物は通常、リガンド結合実
験用により都合の良い基質を提供し、従って結合基質と
して好ましい。スクリーニング工程（即ち、リガンド結
合実験）用の膜調製物を製造するために、凍結した完全
な細胞を冷水中でホモジナイズし、遠心分離後、膜ペレ
ットを収集する。次いでペレットを冷水で洗浄し、透析
してアッセイで結合を競合する内在ＥＡＡリガンド（例
えば、グルタメート）を除去する。透析した膜を、その
まま、または凍結乾燥状態で貯蔵後に、リガンド結合分
析で使用し得る。あるいは、遷移的トランスフェクショ
ンの約２日後、または定常的にトランスフェクトした細
胞を新しくプレートして約２日後に収穫した完全な、新
鮮な細胞を、膜調製物に使用したように同一方法により
リガンド結合測定法に使用し得る。細胞を使用すると
き、細胞を傷つけないようにより穏やかな条件の遠心分
離により収穫しなければならなく、且つ総ての洗浄操作
は、浸透ショック及び細胞の破壊を避けるために、緩衝
させた媒質（例えば、リン酸で緩衝させた生理食塩水）
中で実施しなければならない。

【００２８】本発明の選択したヒトＥＡＡ１受容体に候
補のリガンドを結合させることは、通常、（例えば、蛋
白質決定で測定した）細胞から誘導した膜の予め決定し
た量、一般的に約25μg〜100μgを使用して評価する。
通常、競合的結合測定法は、カイネートに対し試験物質
の親和性を評価するのに有用である。この競合的結合測
定法は、種々の濃度で添加した未標識試験物質の存在
下、放射性標識したカイネート（例えば、［3H］-カイ
ネート）を有する膜調製物をインキュベートすることに
より実施し得る。インキュベート後、置換または結合し
た放射性標識したカイネートを回収し、次いで測定し
て、基質として使用した特定の受容体として試験物質及
びカイネートの相対結合親和性を決定した。このように
して、カイネート型ヒトＥＡＡ受容体の種々の化合物の
親和性を測定し得る。

【００２９】受容体をコードするＤＮＡを発現する細胞
を使用する代わりに、ＥＡＡ１受容体をコードするメッ
センジャーＲＮＡを導入後、機能性膜に結合した受容体
を産生する細胞（例えば、ツメガエル卵母細胞）を使用
してもリガンドを特徴付け得る。この場合、本発明のＥ
ＡＡ１受容体遺伝子は、通常、導入した遺伝子がプラス
ミドベクター（例えば、Ｔ３またはＴ７バクテリオファ
ージプロモーター）により供給される隣接ＲＮＡ翻訳プ
ロモーターを介してＲＮＡに容易に転写し得るように、
プラスミドベクターにサブクローン化される。次いでＲ
ＮＡは、挿入された遺伝子からin vitroで転写され、そ
してツメガエル卵母細胞に注入され得る。ＲＮＡ溶液の
容積ｎＬを注入後、卵母細胞を残し数日間インキュベー
トし、次いで洗浄溶液中に供給した特定のリガンド分子
に対する反応能力の試験をする。機能性ＥＡＡ受容体
は、これを介してイオンが選択的に通過する膜チャンネ
ルを操作することにより一部作用し、洗浄溶液中の特定
のリガンド分子に反応する受容体の機能性、通常、細胞
に挿入した微小電極を使用して電流として測定し得る。

【００３０】リガンドスクリーニングに有用な細胞系を
構築するために受容体をコードするＤＮＡを使用する以
外に、本発明のもう１つの態様によりＤＮＡの発現は、
構造解析のために溶解形で受容体のフラグメントを製造
し、他の実験に使用するために抗体を産生する目的でな
し得る。細胞の外側のリガンド分子残基に結合する原因
となるＥＡＡ１受容体の一部は、即ち、細胞外であると
予測される。従って、第一段階では（受容体の残余を含
まない）量及び隔離形でこの細胞外リガンドに結合する
ドメイン（領域）を提供することにより受容体-リガン
ドの相互作用の特徴付けを容易にするのが好ましい。こ
れを達成するために、完全長ＥＡＡ１受容体をコードす
るＤＮＡは、特定部位の突然変異誘発により修飾され
得、シークエンスが第１のトランスメンブランドメイン
（ＴＭ１）（即ち、Fig.１に示されている残基527）を
コードする直前に、翻訳停止コドンを細胞外Ｎ-末端領
域に導入する。受容体を膜に「固定」するためにトラン
スメンブランドメインはもはや製造されないので、修飾
された遺伝子が発現すると、細胞外リガンド結合ドメイ
ンのみが溶解形で分泌する。このようにして製造した細
胞外ドメインに対する候補の化合物の結合度を確かめる
ために、標準リガンド結合測定法を実施し得る。無論、
単離したドメインに対するリガンド結合度を最適化する
ために、細胞外領域の幾つかの異なる型を製造するため
に特定部位の突然変異誘発を使用することも必要であ
る。

【００３１】あるいは、代わりにカルボキシ末端［例え
ば、即ち、Fig.１に含まれるアミノ酸残基805と936との
間に存在する第４のトランスメンブランドメイン（ＴＭ
４）の直後のドメイン］からよりは、成熟蛋白質のアミ
ノ末端から誘導し得ない受容体の細胞外ドメインを製造
することも好ましい。この場合、特定部位の突然変異誘
発及び/またはＰＣＲベースの増幅法を、重要な受容体
ドメインをコードする遺伝子の限定フラグメントを提供
するために直ちに使用し得る。このようなＤＮＡシーク
エンスは、遺伝子フラグメントをコードするＤＮＡが発
現ベクターにより提供された翻訳開始コドンに隣接して
挿入され、且つ必要な翻訳読取枠が注意深く一定保持さ
れるという条件のもとで、細胞内または分泌型に所望の
受容体フラグメントの発現を達成するために使用し得
る。

【００３２】このような細胞外リガンド結合ドメインの
製造が、種々の宿主細胞中で実施し得ることは高く評価
される。哺乳類細胞（例えば、CHO細胞）は、この目的
のために使用され得、発現は、高レベルの発現が可能な
発現プロモーター［例えば、CMV（サイトメガロウイル
ス）プロモーター］により通常実施される。あるいは、
非-哺乳類細胞［例えば、昆虫Sf9（Spodotera frugiper
da）細胞］を使用し得、通常、バキュロウイルスの発現
プロモーター［例えば、強く、遅いpolyhedrin蛋白質プ
ロモーター］により発現される。糸状菌系も、ＥＡＡ受
容体のこのような細胞外ドメインを多量に分泌するため
に使用し得る。例えば、alcAプロモーターにより発現し
たAspergillus nidulansは、このような許容可能な系を
構築する。このような発現宿主に加えて、細胞内または
細胞外でも同様に許容可能である、異種の遺伝子または
遺伝子フラグメントを発現し得る任意の原核生物または
他の真核生物発現系も好ましい。

【００３３】受容体蛋白質の単離した細胞外リガンド結
合ドメインを利用すると、Ｘ線結晶学方法と二次元-Ｎ
ＭＲ方法とを組み合わせることにより、これに錯形成し
た候補のリガンドを使用してもしなくても、これらのリ
ガンド結合領域の三次元構造の決定が可能となる。この
ようにして、三次元受容体構造との必要な相互作用を有
すると予見されたさらに新しい候補の化合物は、特異的
に設計且つ試験され得る。

【００３４】大きなドメインを使用する結晶学的方法
は、単離したドメイン及び天然のリガンド（または好適
なアンタゴニスト若しくはアゴニスト分子）との共-錯
体の両方の構造解析の選択方法である。特定のドメイン
を、十分に小さく、例えば、長さ約100〜130アミノ酸に
し得る場合、有効な二次元ＮＭＲ方法を構造決定に適用
し得る。これにより、ドメイン構造が決定できるだけで
なく、薬品-受容体相互作用についての動的情報も適用
し得る。

【００３５】例えば、脳組織内のＥＡＡ１受容体の存在
及び/または配置を検出する特定の使用に関しては、本
発明は、もう１つの態様として、ヒトＥＡＡ１受容体に
対する標識抗体も提供する。このような抗体を産生する
ために、免疫原として、上記の微生物若しくは哺乳類宿
主中に産生されたか若しくは標準ペプチド合成法により
製造された、完全な、溶解性受容体またはその免疫学的
フラグメントを使用し得る。免疫学的フラグメントとし
て使用するのに特に好適なＥＡＡ１ａ受容体の領域は、
受容体の細胞外領域にシークエンス中で相当する部分、
細胞外領域部分（例えば、特定の残基106〜120、178〜1
91若しくは463〜509を含む残基１〜526を含むペプチ
ド）及び、トランスメンブランドメインＴＭ-２とＴＭ-
３との間の領域に相当するペプチド（例えば、残基590
〜599からなるペプチド）を含む。Ｃ-末端ドメイン（残
基806〜936）からなるペプチド、またはそのフラグメン
ト（例えば、残基895〜936若しくは915〜930からなるペ
プチド）は、抗体の産生にも使用し得る。実質的にヒト
ＥＡＡ１ｂ、ＥＡＡ１ｃ及びＥＡＡ１ｄ受容体の同一領
域は、これらの受容体に対する抗体の産生にも使用し得
る。

【００３６】所望のＥＡＡ１受容体または免疫原フラグ
メントに対する抗体の産生は、慣用の設計の免疫プロト
コルを使用するポリクローナル抗体及び、任意の種々の
哺乳類宿主（例えば、ヒツジ、ヤギ及びウサギ）に関し
て実施し得る。あるいは、モノクローナル抗体産生に関
しては、免疫細胞（例えば、脾細胞）を、免疫した動物
から回収し、且つ、ハイブリドーマ方法を使用して骨髄
腫細胞に融合し得る。次いで融合生成物を選択培地で培
養することによりスクリーニングし、抗体を産生する細
胞を連続成長させ次いで抗体を回収するために回収す
る。回収した抗体を、この目的のために確立されたリン
カー方法を使用して、検出可能な標識（例えば、放射性
標識、酵素標識、蛍光標識等）に共有結合し得る。

【００３７】脱着可能な標識形（例えば、放射性標識
形）では、ヒトＥＡＡ１受容体をコードするＤＮＡまた
はＲＮＡ及びその選択領域は、本発明のもう１つの態様
に於いては、ハイブリダイゼーション標識として、例え
ば、ヒト若しくは他の哺乳類ゲノム（またはｃＤＮＡラ
イブラリー）中に存在するシークエンスに関連した遺伝
子を識別するために、または検体（例えば、脳組織）中
にＥＡＡ１をコードするＤＮＡを配置するためにも使用
し得る。これは、完全なコード領域または、その中に取
り込まれた放射性標識（例えば、³²Ｐ）を有するそのフ
ラグメントを使用して実施し得る。検体中のＥＡＡ１を
コードするＤＮＡを識別するためには、これらをコード
する完全長ｃＤＮＡまたは、これに対して独特のフラグ
メントを使用するのが好ましい。Fig.１及び、その上に
表されている番号のついたヌクレオチドに関して、この
ようなヌクレオチドフラグメントは、受容体のＮ-末端
若しくはＣ-末端をコードする領域にシークエンス中で
対応するもの、またはその5'-未翻訳若しくは3'-未翻訳
領域を表すもの（例えば、以下のヌクレオチド領域の一
つ：8-156，157-1563，531-575，1278-1359，2826-290
9，2958-3073及び3024-3708）を含む。これらのシーク
エンス及び完全遺伝子自身は、無論、ＥＡＡ１に関連す
るヒト遺伝子、特にそのｃＤＮＡ等価物を、標準ハイブ
リダイゼーション方法によりクローン化するために使用
し得る。

【００３８】

【実施例】実施例１ ：ヒトＥＡＡ１ａ受容体をコードするＤＮＡの
単離 ヒトＥＡＡ受容体をコードするＤＮＡの単離の第１段階
として、ラットGluR１受容体の公知のヌクレオチドシー
クエンスと、鶏及びカエルカイネート結合蛋白質とを、
プライマー結合用の部位として提供し得る相同領域及び
PCRベースの増幅領域を識別するために比較した。ヒト
ｃＤＮＡ中のシークエンスに関連する領域にハイブリダ
イズし、且つ続いてクローン化するためのHindIII制限
部位を有する非-ハイブリダイジングフランク端を有し
得る推定上のオリゴヌクレオチドプライマーを、慣用の
遺伝子合成方法を使用してラットGluR１遺伝子の公知シ
ークエンスをベースとして合成し、以下のシークエン
ス： 5' GGGGTTTAAGCTTGAGCGTCGTCCTCTTCCTGGT 3' 5' GGGGTTTAAGCTTGTGAAGAACCACCAGACGCCG 3' のプライマーを製造した。

【００３９】［Clontech Laboratories（Palo Alto，Ca
lifornia．U.S.A.）からのEcoRIベースのλgt10ライブ
ラリーとして得られた］鋳型としてヒト海馬ｃＤＮＡを
使用し、ポリメラーゼ鎖反応方法を適用することによ
り、ヒトｃＤＮＡ中の相同シークエンスを増幅する試み
にプライマーを使用した。反応混合物は、100μl中に、
ヒト海馬ｃＤＮＡ100ng、各プライマー125pmol及び２U
Taqポリメラーゼ（10mMTris-HCl，pH9.0，50mM KCl，1.
5mM MaCl₂及び各デオキシリボ核酸0.2mM）を含んでい
た。次いで、94C/1分を30サイクル；58C/1分；72C/2分
次いで、72C/30分の最終サイクルを実施した。

【００４０】予想通りのヌクレオチド長（239bp）を有
する増幅産生物が生成した。次いで増幅産生物をゲルか
ら遊離させ、ファージ中間ベクターpTZ19（Pharmacia）
のHindIII部位にシークエンシングするためにサブ-クロ
ーン化した。（プライマーを含まない）増幅産生物のヌ
クレオチドシークエンスは、ヌクレオチド＃1850〜ヌク
レオチド＃2020（Fig.１）で表される。オリゴヌクレオ
チドプライマーをベースとしたラットGluR遺伝子の対応
する領域とヒトｃＤＮＡ鋳型から増幅したシークエンス
とを比較すると、ほんの約60%の同一性であることが明
らかになった。これは、関連しないヒト遺伝子からのフ
ラグメントが識別されたことを示す。

【００４１】完全ヒトＥＡＡ１ａ受容体をコードするｃ
ＤＮＡを単離するために、ヒト海馬ｃＤＮＡのλgt10ベ
ースのライブラリーを、239bp増幅産生物のPCRから製造
した（α-³²Ｐ-dCTP）標識型を使用して標識した。スク
リーンした10⁶個のクローンの内、以下の厳密度の高い
ハイブリダイゼーション条件（６ｘSSC，50% ホルムア
ミド，5% Denhardt溶液，0.5% SDS，100μg/ml 変性サ
ケ精液ＤＮＡ）下で、60個の推定上のクローンを識別し
た。ハイブリダイゼーションを37℃で一晩実施し、フィ
ルターを0.5%SDSを含むSSCで、25℃５分間を２回、次い
で、0.5%SDSを含むSSCで、50℃15分間で２回洗浄した。
最終洗浄を、0.5%SDSを含むSSCで、50℃15分間で１回実
施した。フィルターを、Ｘ線フィルム（Kodak）に一晩
暴露した。

【００４２】ハイブリダイゼーション研究を二重に実施
し、両方の複製物で十分にハイブリダイズしたこれらの
クローンのみを次の分析用に選択した。第２ラウンドの
スクリーニングでは、推定上60個の元のクローンの内50
個を選択した。推定上50個総てのクローンをプラーク精
製し、大規模ＤＮＡ製造を実施し、ここから遊離したＤ
ＮＡ挿入物を、シークエンス分析用にpTZ18ベクターのE
coRI部位にサブクローン化した。シークエンシングによ
り、元の239bpサブクローンのシークエンスと同一のヌ
クレオチドシークエンスを有する領域を内部に包含する
１つのクローンが明らかになった。次いで、単離したク
ローン（1058bp）の全シークエンスを決定した。この10
58bpのサブクローンは、ヌクレオチド1245〜ヌクレオチ
ド2302（Fig.１）から表される。

【００４３】他の受容体遺伝子を用いた分析法によって
も同様に、1058bpは完全長ではなかったので、λZAP II
として公知のλファージ系で構築したもう１つのヒト海
馬ｃＤＮＡライブラリー（Stratagene Cloning System
s，La Jolla，California，U.S.A．）が得られ且つ1058
bpサブクローンのPCR生成した、放射性標識した型を使
用してスクリーンした。このライブラリーの10⁶個を、
上記の厳密な条件下でハイブリダイゼーションによりス
クリーニングし、50個の陽性クローンを選択した。スク
リーニングするために、挿入物を保持する中間ファージ
（phagemid）を削除して、Bluescript-SKとして公知の
中間ファージの挿入物を保持する変体を製造した。シー
クエンシング分析で、重複するシークエンスを共有する
２つの中間ファージクローンを識別した。2.2kb EcoRI/
EcoRI挿入物を保持し、且つ明らかに読取枠の５’領域
を表す１個のクローンを、pBS/RKLS181とした。3.1kb E
coRI/EcoRI挿入物を保持し、且つ読取枠の残りの３’領
域を表す重複クローンを、pBS/RKLS161とした。読取枠
全体を構築するために、Fig.３（１）に示される方法を
使用して、3.0kb Bluescript-SK中間ファージバックグ
ラウンド中に、3.7kb EcoRI/PstＩ挿入物（3.7kb NotI/
NotI挿入物として完全に回収し得る）としてＥＡＡ１ａ
をコードするＤＮＡを保持する、中間ファージpBS/Hum
ＥＡＡ１ａを製造した。EcoRI/PstI挿入物の全シークエ
ンスは、Fig.１に示されている。

【００４４】ブタペスト条約下で、6.7kb中間ファージp
BS/humＥＡＡ１ａ-NotＩを、American Type Culuture C
ollection［Rockville，Maryland USA（1991年8月21
日）］に供託し、ATCC承認番号75063を受けた。

【００４５】実施例２−ＥＡＡ１ａ受容体をコードする
ＤＮＡを得るための第二ストラテジィ 本発明によれば、ＥＡＡ１ａをコードするＤＮＡのヌク
レオチド配列が得られたので、上記手順による単離が不
要であり、その代わりに全自動の遺伝子合成及び増幅法
を使用できることが理解されよう。適当なｃＤＮＡライ
ブラリイ、例えば慎重に調製されたヒト海馬ｃＤＮＡラ
イブラリイを鋳型として用い、ポリメラーゼ鎖反応法を
使用して所望のｃＤＮＡ産物を増幅させ得る。現行のＰ
ＣＲ手順では３.７ｋｂの完全遺伝子を直接増幅するこ
とは難しいが、結合可能な遺伝子フラグメントを生成す
る限局性増幅による遺伝子構築方法を使用できよう。

【００４６】特にＥＡＡ１ａをコードするＤＮＡに関し
ては、ＰＣＲ手順によって例えばFig.２に示すように遺
伝子構築を進行させ得る。より詳細に説明すると、以後
の遺伝子組立ステップで使用する制限部位を構成する非
ハイブリダイズ５′末端を含むプライマーを用い、クロ
ーン化したｃＤＮＡ鋳型の領域を数１００個のオーダの
ヌクレオチドから成るフラグメントとして増幅させる。
Fig.２に示す例では、遺伝子を４つの個別フラグメント
として増幅させる。制限部位が慎重に選択されるのでこ
れらのフラグメントが１ステップで結合し、完全ＥＡＡ
１ａ受容体をコードするＤＮＡを形成し得る。

【００４７】また、ＰＣＲによって増幅しその後で結合
できる遺伝子フラグメントを形成するためにも全自動の
遺伝子合成法を使用できることが理解されよう。例えば
Ｂａｒｎｅｔｔ他によってＮｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．、１９９１、１８ (１０）：３０９４に記載された
ような現行の手順を用い、長さ約３００塩基以下のフラ
グメントを合成し、次いで、新しい合成遺伝子領域の組
立を容易にする制限部位をテイルに付けたプライマーを
再度使用して増幅させる。

【００４８】実施例３−ヒトＥＡＡ１ａ受容体を産生す
る遺伝子操作された細胞の構築 哺乳類細胞中で遷移的発現させるために、ヒトＥＡＡ１
ａ受容体をコードするｃＤＮＡを哺乳類発現ベクターｐ
ｃＤＮＡ１に組み込んだ。このベクターは、Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ (Ｓａｎ Ｄｉｅ
ｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ；カタログ番号Ｖ
４９０−２０）によって市販されている。このベクター
は、真核細胞系中のｃＤＮＡ発現及び原核細胞中のｃＤ
ＮＡ分析のために設計された多機能の４.２ｋｂのプラ
スミドベクターである。ＣＭＶのプロモーターとエンハ
ンサー、スプライスセグメント及びポリアデニル化シグ
ナル、ＳＶ４０ポリオーマウイルスの複製起点、配列決
定及び突然変異誘発のために１本鎖ＤＮＡを取出すＭ１
３起点、センス及びアンチセンスのＲＮＡ転写物を産生
するためのＳｐ６及びＴ７ ＲＮＡプロモーター、並び
にＣｏｌ Ｅ１のような高複写プラスミド起点をベクタ
ーに組込む。ポリリンカーはＣＭＶプロモーター (及び
Ｔ７プロモーターの３′）のかなり下流に位置する。

【００４９】ＥＡＡ１ａ受容体をコードするｃＤＮＡを
発現ベクターに組込むために、ｃＤＮＡのソースインサ
ートをｐＢＳ／ｈｕｍ ＥＡＡ１ａ−ＮｏｔＩから３.
７ｋｂのＮｏｔＩ／ＮｏｔＩフラグメントとして分離
し、これをｐｃＤＮＡ１ポリリンカーのＮｏｔＩ部位に
組込んだ。ｐｃＤＮＡ１中の適正なインサート配向を確
認するためにＮｏｔＩの配列決定を行なった。得られた
プラスミドをｐｃＤＮＡ１／ｈｕｍＥＡＡ１ａと命名
し、次に、遷移的発現のために選択された哺乳類細胞宿
主に導入した。この場合には、ＣＯＳ−１系統のサル由
来の線維芽細胞様細胞 (Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉ
ｌｌｅ、ＭａｒｙｌａｎｄよりＡＴＣＣ ＣＲＬ １６
５０として入手可）を使用した。

【００５０】ＥＡＡ１をコードするＤＮＡの遷移的発現
のために、ＣＯＳ−１細胞に、ＣＯＳ細胞１０⁶あたり
約８μｇのＤＮＡ (ｐｃＤＮＡ１／ｈｕｍＥＡＡ１ａと
して）をＤＥＡＥ媒介ＤＮＡトランスフェクションによ
ってトランスフェクトし、Ｍａｎｉａｔｉｓ他、前出、
に記載の手順でクロロキンで処理した。簡単に説明する
と、ＣＯＳ−１細胞を５×１０⁶細胞／皿の密度でプレ
ートし、ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で２
４時間増殖させた。次に培地を除去し、細胞をＰＢＳ及
び培地で順次洗浄した。次に、ＤＥＡＥデキストラン
(０.４ｍｇ／ｍｌ）、１００μＭのクロロキン、１０％
のＮｕＳｅｒｕｍ、ＤＮＡ (０.４ｍｇ／ｍｌ）をＤＭ
ＥＭ／Ｆ１２培地中に含む１０ｍｌのトランスフェクシ
ョン溶液を細胞に加えた。３７℃で３時間インキュベー
ション後、上記と全く同様に細胞をＰＢＳ及び培地で洗
浄し、次に、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中の１０％ＤＭＳＯ
で１分間衝撃した。１０％ＦＢＳを補充した培地中で細
胞を２〜３日間増殖させ、インキュベーション期間が終
わると皿を氷に載せ、氷冷したＰＢＳで洗浄し、次いで
掻取った。次に、１０００ｒｐｍで１０分間遠心して細
胞を採集し、以後のリガント結合アッセイで使用するた
めに細胞性ペレットを液体窒素中で凍結させた。凍結細
胞の解凍アリコートをＮｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析
し、保存された細胞中で受容体をコードするｃＤＮＡが
発現していることを確認した。

【００５１】また、２つの異なる細胞系、即ちＣＨＯ
Ｋ１及びＣＨＯ Ｐｒｏ５を宿主として使用し、同様に
処理して、安定にトランスフェクトされた細胞系を調製
した。これらの細胞系を構築するために、ヒトＥＡＡ１
ａをコードするｃＤＮＡを、プラスミドベクターｐｃＤ
ＮＡ１の７.１ｋｂ誘導体のＮｏｔＩ部位に組込んだ。
この誘導体はネオマイシン遺伝子をラウス肉腫ウイルス
のＬＴＲプロモーターのコントロール下に組込んでお
り、ｐｃＤＮＡ／ＮＥＯ (同じくＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可、カタログ番号Ｖ
４９２−２０）と命名されている。同様にして、適当な
挿入用ＮｏｔＩ部位を再度使用し、受容体をコードする
ｃＤＮＡを、定常的発現が可能な哺乳類発現ベクターｐ
ＲＣ／ＣＭＶ (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。こ
の部位に挿入することによってｃＤＮＡは、サイトメガ
ロウイルスプロモーターの発現コントロール下に、ウシ
成長ホルモン遺伝子のポリアデニル化部位及びターミネ
ーターの上流で、 (ＳＶ４０初期プロモーターによって
促進される）ネオマイシン耐性遺伝子を選択可能マーカ
ーとして含むベクターバックグラウンド内に配置され
る。

【００５２】上記のごとく構築されたプラスミドを導入
するために、１０％ＦＢＳを補充したＭＥＭ培地に宿主
ＣＨＯ細胞を５×１０⁵の密度でまず播種した。２４時
間増殖させた後、新しい培地をプレートに添加し、３時
間後に、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈手順 (Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ他、前出）を用いて細胞をトランスフェクトし
た。簡単に説明すると、カルシウム緩衝溶液に３μｇの
ＤＮＡを混合し、室温で１０分間インキュベートした。
等量のリン酸塩緩衝溶液を添加し、懸濁液を室温で１５
分間インキュベートした。次に、インキュベートした懸
濁液を細胞に加えて４時間維持し、除去して、１５％グ
リセロールを含む培地で細胞を衝撃した。３分後に細胞
を培地で洗浄し、普通増殖条件で２４時間インキュベー
トした。Ｇ４１８ (１ｍｇ／ｍｌ）を含む１０％ＦＢＳ
を補充したα−ＭＥＭ培地中でネオマイシン耐性細胞を
選択した。約２〜３週後にＧ１８耐性細胞の個々のコロ
ニーを単離し、クローンを選択し、アッセイのために増
殖させた。

【００５３】実施例４−リガンド結合アッセイ 凍結状態のトランスフェクト細胞をハンドホモジナイザ
ーを用いて氷冷蒸留水に再懸濁させ、５０,０００ｇで
２０分間遠心した。上清を廃棄し、膜ペレットを−７０
Ｃで冷凍保存した。

【００５４】ＣＯＳ細胞膜ペレットを５０ｍＭの氷冷Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ７.５５、５℃）に懸濁させ、Ｓ
ｐｅｃｔｒａｐｏｒ ７ (ＥＤＴＡ処理したイオウを含
まない）透析チューブに入れた。懸濁液を氷冷した４リ
ットルの５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ７.５５、
５℃）に入れ、結合に競合する内因性グルタメートを除
去するために５℃で１６〜２４時間透析した。チューブ
の洗浄に使用した少量のバッファと共に組織懸濁液をチ
ューブから回収した。得られたこの膜調製物を以下の結
合実験の組織ソースとして使用した。Ｐｉｅｒｃｅ試薬
をＢＳＡと共に標準として使用してタンパク質を定量し
た。

【００５５】次に、タンパク質の測定量から判断して２
５〜１００μｇに等価の量のＣＯＳ由来の膜を使用して
結合アッセイを実施し、放射性標識リガンドを選択し
た。特に、グルタメート結合アッセイの場合には、５０
ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ７.５５、５℃）中の２
５〜１００μｇの組織タンパク質と [３,４−３Ｈ〕Ｌ
−グルタミン酸 (４７.３Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ、最終濃度
１０ｎＭ）とから成る最終容量１ｍｌのインキュベーシ
ョン混合物を形成した。１ｍＭのＬ−グルタメートの存
在下では非特異的結合が生じた。プラスチックミニバイ
アルに入れたサンプルを氷上で６０分間インキュベート
した。５０,０００ｇ (４℃）で１０分間遠心して結合
リガンドと遊離リガンドとを分離した。組織ペレットの
表面を２×６ｍｌの氷冷インキュベーションバッファで
洗浄した。ペレットを可溶化し、５ｍｌのＢｅｃｋｍａ
ｎ Ｒｅａｄｙ Ｐｒｏｔｅｉｎシンチレーションカク
テル中でカウントした。

【００５６】カイネート結合アッセイの場合には、冷た
いインキュベーションバッファ中の２５〜１００μｇの
組織タンパク質と [ビニリデン−３Ｈ〕カイニン酸 (５
８Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ、最終濃度５ｎＭ）とから最終容量
１ｍｌのインキュベーション混合物を形成した。１ｍＭ
のＬ−グルタメートの存在下では非特異的結合が生じ
た。サンプルをグルタメート結合アッセイと同様にイン
キュベートし、Ｂｒａｎｄｅｌ細胞採集器及び氷冷０.
３％ポリエチレンイミンに予め浸漬させたＧＦ／Ｂフィ
ルターを用いた高速濾過によって結合リガンドと遊離リ
ガンドとを分離した。６ｍｌの冷たいインキュベーショ
ンバッファ中でフィルターを２回洗浄し、次いでカウン
トするために、５ｍｌのＢｅｃｋｍａｎ Ｒｅａｄｙ−
Ｓａｆｅシンチレーションカクテルを入れたシンチレー
ションバイアルに入れた。

【００５７】また、ＡＭＰＡアッセイも上記のカイネー
ト結合アッセイとほぼ同様の手順で実施した。但し、こ
の場合には、Ｄ、Ｌ−α− [５−メチル−３Ｈ〕アミノ
−３−ヒドロキシ−５−メチルイソキサゾル−４−プロ
ピオン酸 (３Ｈ−ＡＭＰＡ、２７.６Ｃｉ／ｍｍｏｌ
ｅ、最終濃度５ｎＭ）をリガンドとして、０.１ＭのＫ
ＳＣＮ及び２.５ｍＭのＣａＣｌ₂と共に１ｍｌの最終容
量で使用した。

【００５８】ＥＡＡ１ａを産生するＣＯＳ細胞に由来の
膜調製物を使用して実施した上記のごときアッセイか
ら、標識リガンドが５ｎＭで特異的 [３Ｈ〕−カイネー
ト結合し、１０ｎＭで [３Ｈ〕−グルタメート結合する
ことが判明した (Fig.５）。Ｍｏｃｋトランスフェクト
細胞は被検リガンドのいずれとも特異的結合を全く示さ
なかった。これらの結果は、ヒトＥＡＡ１ａ受容体が高
い親和性でカイネート結合することをはっきりと示す。
ＡＭＰＡまたはＮＭＤＡとの結合がほとんどまたは全く
観察されないことを考え合わせると、上記の活性は、Ｅ
ＡＡ１ａ受容体がカイネート型のＥＡＡ受容体であるこ
とを明らかに示している。特にカイネート結合が高親和
性 (即ちナノモルの範囲）を有することを示すこの結合
プロフィルは更に、受容体が適正に機能していることを
示しており、従って完全 (ｉｎｔａｃｔ）なヒト脳に由
来の対応する非組換え体とのリガンド結合 「特性 (ｓｉ
ｇｎａｔｕｒｅ）」を確実に予測させ得る。これらの特
徴によって組換え受容体は、受容体に結合するリガンド
化合物の選択及びキャラクタリゼーション、及び／また
は受容体から別のリガンドを排除することによって作用
し得る化合物の選択及びキャラクタリゼーションのため
に特に有用である。ＥＡＡ１ａ受容体遺伝子が、単独の
ホモジニアスな受容体種として発現され得る純粋な形態
で単離されるので、その結果としてリガンド結合アッセ
イにおいては、ヒト脳に由来の複合のヘテロジニアスな
受容体調製物を使用して上記のごときキャラクタリゼー
ションを行なうときに生じる精度の欠如が解消される。

【００５９】実施例５−ヒトＥＡＡ１ａ受容体の天然産
生変異体 ヒトＥＡＡ１ａ受容体の同定を成功させた同じ１０５８
ｂｐのプローブを使用し、近縁の配列を有する３つの変
異体を実質的に同様の方法で同定した。Fig.４に示すよ
うに、ＥＡＡ１ｄと命名された１つの変異体は、ヒトＥ
ＡＡ１ａ受容体と多くの構造的類似点を有しており、唯
一の違いは、ＥＡＡ１ｄが、ＥＡＡ１ａのヌクレオチド
１４２６位と１４２７位との間に挿入された正確に１１
ｂｐのインサートを含むことである。ＥＡＡ１ｄをコー
ドするＤＮＡを、ＥＡＡ１ａをコードするＤＮＡと同様
にヒト海馬ＤＮＡのｃＤＮＡライブラリイから単離し
た。完全読取枠を含む全長ｃＤＮＡを構築するために、
重複するクローンｐＢＳ／ＲＫＬＳ１８１ (５′−領
域）及びｐＢＳ／ＲＫＬＳ９１１ (３′−領域）をFig.
３ (２）に示すストラテジィで組合わせた。結合を試験
するために、単離したｃＤＮＡインサートをｐＢＳｈｕ
ｍＥＡＡ１ｄ−ＮｏｔＩから３.７ｋｂのＮｏｔＩ／Ｎ
ｏｔＩフラグメントとして遊離させ、遷移的発現のため
にはベクターｐｃＤＮＡ１に挿入した後でＣＯＳ−１系
細胞に導入し、定常的発現のためにはベクターｐｃＤＮ
Ａ１／ＮＥＯ及びｐＲＣ／ＣＭＶに挿入した後でＣＨＯ
Ｋ１またはＣＨＯ Ｐｒｏ５細胞に導入した。すべて
の処理をヒトＥＡＡ１ａに関する上記の処理と同様に行
なった。

【００６０】３.０ｋｂのＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ
バックグラウンド中にヒトＥＡＡ１ｄ受容体をコードす
る３.７ｋｂのＮｏｔＩ／ＮｏｔＩ ｃＤＮＡインサー
トを含むｐＢＳ／ｈｕｍＥＡＡ１ｄ−ＮｏｔＩと命名さ
れたプラスミドを、ブダペスト条約に基づいて、Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ Ｕ
ＳＡ、に１９９１年８月２１日付けで受託番号ＡＴＣＣ
７５０６４で寄託した。

【００６１】同じクローニングストラテジィを用いてヒ
ト海馬ｃＤＮＡライブラリイから単離されヒトＥＡＡ１
ｂ受容体と命名された別の変異体は、すべての点でＥＡ
Ａ１ａとほぼ等しいが、１７３７位の１つのヌクレオチ
ドだけが異なっており、このためFig.４に示すようにＥ
ＡＡ１ａの細胞外Ｎ末端領域内のバリンがイソロイシン
に変化している。ヒトＥＡＡ１ｃと命名された第３の変
異体をコードするＤＮＡも同じクローニングストラテジ
ィ及びヒト海馬ｃＤＮＡライブラリイを用いて単離し
た。この変異体はＥＡＡ１ａに比べて細胞外Ｎ末端領域
の２４ｂｐ (８アミノ酸）が欠失している (Fig.４）。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の興奮性アミノ酸受容体をコードするＤ
ＮＡのヌクレオチド配列及びその推定アミノ酸配列の説
明図である。

【図２】本発明の興奮性アミノ酸受容体をコードするＤ
ＮＡのヌクレオチド配列及びその推定アミノ酸配列の説
明図である。

【図３】本発明の興奮性アミノ酸受容体をコードするＤ
ＮＡのヌクレオチド配列及びその推定アミノ酸配列の説
明図である。

【図４】本発明の興奮性アミノ酸受容体をコードするＤ
ＮＡのヌクレオチド配列及びその推定アミノ酸配列の説
明図である。

【図５】本発明の興奮性アミノ酸受容体をコードするＤ
ＮＡのヌクレオチド配列及びその推定アミノ酸配列の説
明図である。

【図６】本発明の興奮性アミノ酸受容体をコードするＤ
ＮＡのヌクレオチド配列及びその推定アミノ酸配列の説
明図である。

【図７】本発明の興奮性アミノ酸受容体をコードするＤ
ＮＡのヌクレオチド配列及びその推定アミノ酸配列の説
明図である。

【図８】Fig.１に示すＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣ
Ｒに基づくストラテジィの概略説明図である。

【図９】Fig.１に示すＤＮＡ配列を組込んだ発現ベクタ
ーを構築するために使用されるストラテジィを線形プラ
スミドマップと共に示す説明図である。

【図１０】Fig.１に示すＤＮＡ配列を組込んだ発現ベク
ターを構築するために使用されるストラテジィを線形プ
ラスミドマップと共に示す説明図である。

【図１１】Fig.１に示すＤＮＡ配列を組込んだ発現ベク
ターを構築するために使用されるストラテジィを線形プ
ラスミドマップと共に示す説明図である。

【図１２】Fig.１に示すＥＡＡ受容体の天然発生変異体
のＤＮＡ及びアミノ酸配列をFig.１との比較によって示
す説明図である。

【図１３】Fig.１に示すＥＡＡ受容体の天然発生変異体
のＤＮＡ及びアミノ酸配列をFig.１との比較によって示
す説明図である。

【図１４】Fig.１に与えられたコード領域から発現され
るＥＡＡ受容体のリガンド結合特性を示すグラフであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ステイーブン・エル・ナツト カナダ国、オンタリオ・エム・８・ブイ・ ２・エル・２、エトビコウク、バーリント ン・ストリート・74、アパートメント・ナ ンバー・１ (72)発明者 リー・シエクター カナダ国、オンタリオ・エム・５・エヌ・ １・ジエイ・４、トロント、シヤルマー・ ブールバード・10、アパートメント・ナン バー・509 (72)発明者 マイケル・エイ・ウオスニツク カナダ国、オンタリオ・エル・４・ジエ イ・２・ピー・２、ソーンヒル、ムーレ ン・ドライブ・262

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトＥＡＡ１受容体またはヒトＥＡＡ１
   受容体のカイネート結合フラグメントをコードする核酸
   配列を含む単離ポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】 ＤＮＡからなる請求項１に記載の単離ポ
   リヌクレオチド。
3. 【請求項３】 ヒトＥＡＡ１ａ受容体をコードするＤＮ
   Ａ配列を含む請求項２に記載の単離ポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 ヒトＥＡＡ１ａ受容体の天然ヒト変異体
   をコードするＤＮＡ配列を含む請求項２に記載の単離ポ
   リヌクレオチド。
5. 【請求項５】 前記ＤＮＡ配列がヒトＥＡＡ１ｂ受容体
   をコードする請求項４に記載の単離ポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 前記ＤＮＡ配列がヒトＥＡＡ１ｃ受容体
   をコードする請求項４に記載の単離ポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 前記ＤＮＡ配列がヒトＥＡＡ１ｄ受容体
   をコードする請求項４に記載の単離ポリヌクレオチド。
8. 【請求項８】 請求項１に記載のポリヌクレオチドが組
   み込まれている組換えＤＮＡ構築物。
9. 【請求項９】 前記ポリヌクレオチドがヒトＥＡＡ１ａ
   受容体をコードする請求項８に記載の組換えＤＮＡ構築
   物。
10. 【請求項１０】 前記構築物がプラスミドｐＢＳ／ｈｕ
    ｍＥＡＡ１ａ−ＮｏｔＩ（ＡＴＣＣ ７５０６３）であ
    る請求項９に記載の組換えＤＮＡ構築物。
11. 【請求項１１】 前記ポリヌクレオチドがヒトＥＡＡ１
    ｂ受容体をコードする請求項８に記載の組換えＤＮＡ構
    築物。
12. 【請求項１２】 前記ポリヌクレオチドがヒトＥＡＡ１
    ｃ受容体をコードする請求項８に記載の組換えＤＮＡ構
    築物。
13. 【請求項１３】 前記ポリヌクレオチドがヒトＥＡＡ１
    ｄ受容体をコードする請求項８に記載の組換えＤＮＡ構
    築物。
14. 【請求項１４】 前記構築物がプラスミドｐＢＳ／ｈｕ
    ｍＥＡＡ１ｄ−ＮｏｔＩ（ＡＴＣＣ ７５０６４）であ
    る請求項１３に記載の組換えＤＮＡ構築物。
15. 【請求項１５】 カイネート結合ヒトＥＡＡ受容体を産
    生するように遺伝子工学処理された細胞であって、ヒト
    ＥＡＡ１受容体またはそのカイネート結合フラグメント
    をコードする異種ＤＮＡ分子を発現可能に組み込んでい
    る前記細胞。
16. 【請求項１６】 前記異種ＤＮＡ分子がヒトＥＡＡ１ａ
    受容体をコードする請求項１５に記載の細胞。
17. 【請求項１７】 前記異種ＤＮＡ分子がヒトＥＡＡ１ｂ
    受容体をコードする請求項１５に記載の細胞。
18. 【請求項１８】 前記異種ＤＮＡ分子がヒトＥＡＡ１ｃ
    受容体をコードする請求項１５に記載の細胞。
19. 【請求項１９】 前記異種ＤＮＡ分子がヒトＥＡＡ１ｄ
    受容体をコードする請求項１５に記載の細胞。
20. 【請求項２０】 前記細胞が哺乳動物細胞である請求項
    １１に記載の細胞。
21. 【請求項２１】 請求項１５に記載の細胞から誘導され
    る膜調製物。
22. 【請求項２２】 請求項１６に記載の細胞から誘導され
    る膜調製物。
23. 【請求項２３】 単離形態のヒトＥＡＡ１受容体タンパ
    ク質。
24. 【請求項２４】 ヒトＥＡＡ１受容体タンパク質のカイ
    ネート結合フラグメント。
25. 【請求項２５】 ヒトＥＡＡ１受容体タンパク質に結合
    する抗体。
26. 【請求項２６】 ヒトＥＡＡ１ａ受容体をコードするＤ
    ＮＡにハイブリダイズし得る標識ポリヌクレオチド。
27. 【請求項２７】 ヒトＥＡＡ受容体に対する結合親和性
    について化合物をアッセイする方法であって、前記化合
    物の放射性標識類似体を請求項１５に記載の細胞または
    それから誘導された膜調製物と一緒にインキュベートす
    るステップと、未結合の放射性標識類似体をインキュベ
    ーション混合物から洗浄するステップと、膜に結合した
    放射性標識類似体の存在を測定するステップとを含む方
    法。
28. 【請求項２８】 ヒトＥＡＡ受容体に対する化合物の結
    合親和性を測定する方法であって、請求項１５に記載の
    細胞またはそれから誘導された膜調製物を標識ＥＡＡ受
    容体リガンドと一緒にインキュベートしてリガンド／受
    容体結合体を形成するステップと、未結合のリガンドを
    除去するステップと、受容体／リガンド結合体を前記化
    合物と一緒にインキュベートするステップと、受容体／
    リガンド結合体から置換されたまたはそこに残っている
    放射性標識リガンドの量を測定するステップとを含む方
    法。