ES2244057T3 - Subunidad teta humana del receptor gaba-a. - Google Patents
Subunidad teta humana del receptor gaba-a.Info
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Abstract
La presente invención se refiere a la clonación de una nueva secuencia de ADNc que codifica la subunidad theta del receptor de GABAA; a las líneas celulares eucariotas cotarnsfectadas de manera estable, capaces de expresar un receptor de GABAA, comprendiendo dicho receptor la nueva subunidad theta del receptor de GABAA; y a la utilización de dichas líneas celulares en la búsqueda y diseño de medicamentos que actúen sobre los receptores de GABAA.
Description
Subunidad teta humana del receptor
GABA_{A}.
La invención se refiere a la clonación de una
secuencia de ADNc novedosa que codifica una subunidad particular del
receptor GABA_{A} humano. Además, la invención se refiere a una
línea celular estable capaz de expresar dicho ADNc y al uso de la
línea celular en una técnica de selección para el diseño y
desarrollo de medicamentos de subunidades específicas.
El ácido gamma-amino butírico
(GABA) es un neurotransmisor inhibidor principal en el sistema
nervioso central. Media la inhibición sináptica rápida abriendo el
canal cloruro intrínseco al receptor GABA_{A}. Este receptor
comprende una proteína multimérica de 230-270 kDa de
tamaño molecular con sitios de unión específicos para una diversidad
de fármacos que incluyen benzodiazepinas, barbituratos y
\beta-carbolinas, además de los sitios para el
ligando agonista GABA (para revisiones véase MacDonald y Olsen,
Ann. Rev. Neurosci, 1994, 17, 569; y Whiting y col., Int.
Rev. Neurobiol., 1995, 38, 95).
Estudios biológicos moleculares demuestran que el
receptor de compone de varios tipos distintos de subunidad, que se
dividen en cuatro clases (\alpha, \beta, \gamma y \delta)
basándose en similitudes de secuencias. Hasta la fecha, en los
mamíferos, se han identificado seis tipos de subunidades \alpha
(Schofield y col., Nature (London), 1987, 328, 221; Levitan y
col., Nature (London), 1988, 335, 76; Ymer y col., EMBO
J., 1989, 8, 1665; Pritchett & Seeberg, J.
Neurochem., 1990, 54, 802; Luddens y col., Nature
(London), 1990, 346, 648; y Khrestchatisky y col.,
Neuron, 1989, 3, 745), tres tipos de \beta (Ymer y col.,
EMBO J., 1989, 8, 1665), tres tipos de \gamma (Ymer y col.,
EMBO J., 1990, 9, 3261; Shivers y col., Neuron, 1989,
3, 327; y Knoflach et al, FEBS Lett., 1991, 293, 191)
y una subunidad \delta (Shivers y col., Neuron, 1989, 3,
327). Más recientemente, se ha identificado un miembro adicional
de los genes del receptor GABA, \varepsilon, (Davies y col.,
Nature, 1997, 385, 820). El polipéptido es de 506
aminoácidos de longitud y muestra la mayor identidad de secuencia
de aminoácidos con la subunidad \gamma_{3} del receptor
GABA_{A} (47%), aunque este grado de homología no es suficiente
para que se clasifique como una cuarta subunidad \gamma.
La distribución diferencial de muchas de las
subunidades se han caracterizado mediante hibridación in
situ. (Shivers y col., Neuron, 1989, 3, 327; Wisden y
col., J. Neurosci., 1992, 12, 1040; y Laurie y col.,
J. Neurosci, 1992, 12, 1063) y esto ha permitido que
se especule qué subunidades, mediante su localización, podrían
teóricamente existir en el mismo complejo receptor.
Diversas combinaciones de subunidades se han
co-transfectados en células para identificar las
combinaciones sintéticas de subunidades cuya farmacología es
paralela a los receptores GABA_{A} auténticos in vivo
(Pritchett y col., Science, 1989, 245, 1389; Pritchett y
Seeberg, J. Neurochem., 1990, 54, 1802; Luddens y col., Nature
(London), 1990, 346, 648; Hadingham y col., Mol. Pharmacol.,
1993, 43, 970; y Hadingham y col., Mol. Pharmacol., 1993,
44, 1211). Este planteamiento revela que, además de una subunidad
\alpha y \beta, o bien \gamma_{1} o \gamma_{2}
(Pritchett y col., Nature (London), 1989, 338, 582; Ymer y
col., EMBO J., 1990, 9, 3261; y Wafford y col., Mol.
Pharmacol., 1993, 44, 437) o \gamma_{3} (Herb y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 1433; Knoflach y col., FEBS
Lett., 1991, 293, 191; y Wilson-Shaw y col., FEBS
Lett., 1991, 284, 211) también se requiere generalmente para
conferir sensibilidad a benzodiazepina, y que la farmacología de
benzodiazepina del receptor expresado depende en gran medida de la
identidad de las subunidades \alpha y \gamma presentes. Los
receptores que contienen una subunidad \delta (es decir,
\alpha\beta\delta) no parece que se unan a las
benzodiazepinas (Shivers y col., Neuron, 1989, 3, 327;
y Quirk y col., J. Biol. Chem., 1994, 269, 16020). Se
han identificado combinaciones de subunidades que muestran el perfil
farmacológico de un receptor de tipo BZ_{1}
(\alpha_{1}\beta_{1}\gamma_{2}) y un tipo de receptor
BZ_{2} (\alpha_{2}\beta_{1}\gamma_{2} o
\alpha_{3}\beta_{1}\gamma_{2}, Pritchett y col.,
Nature (London), 1989, 338, 582), así como receptores
GABA_{A} con una farmacología novedosa,
\alpha_{5}\beta_{2}\gamma_{2} (Pritchett y Seeberg,
J. Neurochem., 1990, 54, 1802),
\alpha_{4}\beta_{2}\gamma_{2} (Wisden y col., FEBS
Lett., 1991, 289, 227) y
\alpha_{6}\beta_{2}\gamma_{2} (Luddens y col., Nature
(London), 1990, 346, 648). La farmacología de estos
receptores expresados parece similar a la de los identificados en
el tejido cerebral mediante unión a radioligandos, y se han
comenzado experimentos biológicos para determinar la composición de
las subunidades de receptores GABA nativos (McKernan & Whiting,
Tr. Neurosci., 1996, 19, 139). La estructura exacta
de los receptores in vivo todavía no se ha aclarado
definitivamente.
La presente invención se refiere a una nueva
clase de subunidad del receptor GABA, de aquí en adelante denominada
la subunidad teta (subunidad \theta).
La secuencia de nucleótidos para la presente
subunidad teta, junto con su secuencia de aminoácidos deducida
correspondiente a ella, se muestra en la figura 1 de los dibujos
acompañantes.
La presente invención de acuerdo con lo anterior
proporciona, en un primer aspecto, una molécula de ADN que codifica
la subunidad teta del receptor GABA humano que comprende la
secuencia mostrada en la figura 1.
En un aspecto alternativo, la presente invención
proporciona una molécula de ADN que codifica la subunidad teta del
receptor GABA humano que comprende la secuencia mostrada en la
figura 2.
La secuenciación de las moléculas de ADNc
novedosas de acuerdo con la invención pueden convenientemente
llevarse a cabo mediante el procedimiento convencional descrito en
el ejemplo 1 acompañante; o se puede realizar mediante técnicas de
clonación molecular alternativas que se conocen bien en la técnica,
tales como las descritas por Maniatis y col., en Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press,
New York, 2ª edición, 1989.
La presente invención además se refiere a un
polipéptido de la subunidad teta de GABA que tiene la secuencia de
aminoácidos deducida de la figura 1 o figura 2.
El polipéptido de la presente invención puede ser
un polipéptido recombinante, un polipéptido natural o un polipéptido
sintético, preferiblemente un polipéptido recombinante.
Las polipéptidos y moléculas de ADN de la
presente invención se proporcionan preferiblemente en una forma
aislada, y preferiblemente se purifican hasta homogeneidad.
El término "aislado" significa que el
material se retira de su entorno original (por ejemplo, el ambiente
natural si es de origen natural). Por ejemplo, se aísla una
molécula de ADN o polipéptido de origen natural presente en un
animal vivo no se aísla, pero la misma molécula de ADN o
polipéptido, separada de alguno o todos los materiales coexistentes
en el sistema natural. Tales moléculas de ADN pueden ser parte de
un vector y/o tales moléculas de ADN o polipéptidos pueden ser parte
de una composición, y sin embargo se aísla de manera que ese vector
o composición no sea parte de su entorno natural.
En otro aspecto, la invención proporciona un
vector de expresión recombinante que comprende la secuencia de
nucleótidos de la subunidad teta del receptor GABA humano junto con
secuencias adicionales capaces de dirigir la síntesis de dicha
subunidad teta del receptor GABA humano en cultivos de células
eucarióticas establemente cotransfectadas.
El término "vectores de expresión" como se
usa en esta memoria descriptiva se refiere a secuencias de ADN que
se requieren para la transcripción de copias clonadas de secuencias
de ADN recombinante o genes y la traducción de sus ARNm en el
huésped apropiado. Tales vectores se pueden usar para expresar genes
eucarióticos en una diversidad de huéspedes tales como bacterias,
algas azul-verdes, células de levaduras, células de
insecto, células de plantas y células de animales. Los vectores
diseñados específicamente permiten la transferencia de ADN entre
células de bacterias-levaduras,
bacterias-plantas o
bacterias-animales. Un vector de expresión
apropiadamente construido debe contener: un origen de replicación
para la replicación autónoma en células de huéspedes, marcadores
selectivos, un número limitado de sitios de enzimas de restricción,
un número alto de copias, y fuertes promotores. Un promotor se
define como una secuencia de ADN que dirige la RNA polimerasa para
que se una a ADN e inicie la síntesis de ARN. Un promotor fuerte es
uno que provoca que los ARNm se inicien a alta frecuencia. Los
vectores de expresión pueden incluir, pero sin limitación a,
vectores de clonación, vectores de clonación modificados, plásmidos
o virus específicamente diseñados.
El término "vector de clonación" como se usa
en esta memoria descriptiva se refiere a una molécula de ADN,
usualmente un plásmido pequeño o ADN de bacteriófago capaz de
auto-replicarse en un organismo huésped, y usado
para introducir un fragmento de ADN foráneo en una célula huésped.
El ADN foráneo combinado con el ADN vector constituye una molécula
de ADN recombinante que se obtiene de la tecnología recombinante.
Los vectores de clonación pueden incluir plásmidos, bacteriófagos,
virus y cósmicos.
El vector de expresión recombinante de acuerdo
con la invención se puede preparar insertando la secuencia de
nucleótidos de la subunidad teta de GABA en un vector de expresión
precursor adecuado (de aquí en adelante denominado "vector
precursor") usando metodología de ADN recombinante convencional
conocida en la técnica. El vector precursor se puede obtener
comercialmente, o construir mediante técnicas convencionales de
vectores de expresión conocidos. El vector precursor adecuadamente
contiene un marcador de selección, típicamente un gen de resistencia
a antibiótico, tal como el gen de resistencia a neomicina o
amplicilina. El vector precursor preferiblemente contiene un gen de
resistencia a neomicina, adyacente al ayuste temprano de SV40 y
región de poliadenilación; un gen de resistencia a ampicilina; y un
origen de replicación, por ejemplo, pBR322 ori. El vector también
contiene preferiblemente un promotor inducible, tal como
MMTV-LTR (inducible con dexametasona) o
metalotionina (inducible con cinc), de manera que la transcripción
se pueda controlar en la línea celular de esta invención. Esto
reduce o evita cualquier problema de toxicidad en las células
debido al canal de cloruro intrínseco al receptor GABA_{A}.
Un vector precursor adecuado es pMAMneo,
disponible de laboratorios Clontech (Lee y col., Nature,
1981, 294, 228; y Sardet y col., Cell, 1989, 56,
271). Como alternativa el vector precursor pMSGneo se puede
construir a partir de los vectores pMSG y pSV2neo.
El vector de expresión recombinante de la
presente invención se produce después mediante clonación del ADNc de
la subunidad teta del receptor GABA en el vector precursor adecuado.
El ADNc de la subunidad del receptor se subclona a partir del vector
en el que se alberga, y se liga en un sitio de enzima de
restricción, por ejemplo, el sitio Hind III, en el poliengarce del
vector precursor, por ejemplo pMAMneo o pMSGneo, mediante
tecnología de clonación convencional conocida en la técnica, y en
particular mediante técnicas análogas a las descritas en esta
memoria descriptiva. Antes de esta subclonación, a menudo es
ventajoso, con el fin de mejorar la expresión, modificar el extremo
del ADNc de la subunidad teta con secuencias no traducidas en 5'
adicionales, por ejemplo modificando el extremo 5' del ADN de la
subunidad teta mediante la adición de secuencias de la región no
traducida en 5' a partir del ADN de la subunidad \alpha1. Como
alternativa, la expresión del ADNc de la subunidad teta se puede
modificar mediante la inserción de una secuencia del epítope tag
tal como c-myc.
De acuerdo con un aspecto adicional de la
presente invención, se proporciona una línea celular eucariótica
establemente cotransfectada que comprende un vector que codifica la
subunidad teta del receptor GABA humano como se muestra en la SEC ID
Nº 2 ó 4 de dicha línea celular capaz de expresar un receptor GABA,
dicho receptor comprende la subunidad del receptor teta, al menos
una subunidad del receptor alfa y opcionalmente una o más
subunidades beta, gama, delta, o epsilon.
Esto se logra cotransfectando células con
vectores de expresión múltiples, cada uno albergando los ADNc que
codifican una subunidad \alpha, \theta, y opcionalmente una o
más subunidades \beta, \gamma, \delta, o \varepsilon del
receptor GABA. Por lo tanto, en un aspecto adicional, la presente
invención proporciona un procedimiento para la preparación de una
línea celular eucariótica capaz de expresar un receptor GABA, que
comprende cotransfectar establemente una célula eucariótica con al
menos dos vectores de expresión, uno de tales vectores albergando la
secuencia de ADNc que codifica la subunidad del receptor GABA, y
otro de tales vectores que alberga la secuencia de ADNc que codifica
una subunidad alfa del receptor GABA. La línea celular estable que
se establece expresa un receptor GABA \theta\alpha.
Por lo tanto, cada receptor expresado, que
comprende una única combinación de subunidades \beta, \gamma,
\delta o \varepsilon, se denominará de aquí en adelante
"combinación de subunidades" del receptor GABA.
La expresión del receptor GABA se puede lograr
mediante una diversidad de sistemas de expresión de promotores en
una diversidad de deferentes células huéspedes. Las células huésped
eucarióticas incluyen adecuadamente células de levaduras, de
insecto y de mamíferos. Preferiblemente las células eucarióticas que
pueden proporcionar el huésped para la expresión del receptor son
células de mamíferos. Las células huésped adecuadas incluyen líneas
de fibroblastos de roedores, por ejemplo Ltk^{-} de ratón.
Células de ovario de hámster chino (CHO) y de riñón de cría de
hámster (BHK); HeLa y HEK293. Es necesario incorporar al menos una
subunidad \alpha, la subunidad \theta, y opcionalmente una o
más subunidades seleccionadas entre \beta, \gamma, \delta o
\varepsilon en la línea celular con el fin de producir el
receptor requerido. Dentro de esta limitación, la elección de la
combinación de las subunidades del receptor se realiza de acuerdo
con el tipo de actividad o selectividad que se está
seleccionado.
Con el fin de emplear esta invención más
eficazmente para propósitos de selección, es preferible construir
una genoteca de líneas celulares, cada una de las cuales con una
combinación diferente de subunidades. Típicamente una genoteca de 5
ó 6 tipos de líneas celulares es conveniente para este propósito.
Las combinaciones de subunidades preferidas incluyen:
\alpha\theta\beta, \alpha\theta\gamma,
\alpha\theta\delta, y \alpha\theta\varepsilon, y más
especialmente \alpha_{1}\theta\gamma_{2}. Las
combinaciones de subunidades preferidas adicionales incluyen
\alpha\beta\theta\gamma y
\alpha\beta\theta\varepsilon, y más especialmente
\alpha_{2}\beta_{1}\theta\gamma_{1} y
\alpha_{2}\beta_{3}\theta\gamma_{2}.
Después las células se cotransfectan con la
combinación deseada de los vectores de expresión. Existen diversas
técnicas comúnmente usadas para la transfección de células
eucarióticas in vitro. La más comúnmente usada es la técnica
de precipitación con fosfato de calcio de ADN (Bachetti y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74,
1590-1594; Maitland y col., Cell, 1977,
14, 133-141), y representa una técnica
favorable en el contexto de la presente invención.
Un pequeño porcentaje de las células huésped
recoge la combinación de ADN. En un pequeño porcentaje de aquellas,
el ADN se integrará en el cromosoma de la célula huésped. Debido a
que un gen marcador de resistencia a antibiótico, tal como el gen
de resistencia a neomicina o zeocina, se habrá incorporado es estas
células huésped, se pueden seleccionar aislando los clones
individuales que se desarrollarán en presencia del antibiótico
elegido, por ejemplo, neomicina o zeocina. Después cada uno de tales
clones se pueden ensayar para identificar aquellos que producirán
el receptor. Este se puede lograr introduciendo la producción por
ejemplo con dexametasona, y después detectando la presencia de
receptor por medio de unión a radioligando.
Como alternativa, la expresión del receptor GABA
se puede efectuar en huevos de Xenopus (véase, por ejemplo,
Hadingham y col., Mol. Pharmacol., 1993, 44,
1211-1218). En resumen, los núcleos de oocitos
aislados se inyectan directamente con tampón de inyección o agua
estéril que contiene al menos una subunidad alfa, la subunidad
teta, y opcionalmente una o más subunidades del receptor beta,
gamma, delta o epsilon del receptor, modificada por ingeniería
genética en un vector de expresión adecuado. Después de incuban los
oocitos.
La expresión de las combinaciones de las
subunidades en oocitos transfectados se pueden demostrar usando
ensayo de patch-clamp. Este ensayo mide el flujo de
carga dentro y fuera de un electrodo sellado sobre la superficie de
la célula. El flujo de iones cloro que entran en la célula mediante
el canal de calcio activado por GABA se mide como una función de la
corriente que deja que la célula mantenga equilibrio eléctrico
dentro de la célula a medida que se abre el orificio.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona preparaciones de proteínas de combinaciones de
subunidades del receptor GABA que contienen la subunidad teta como
se muestra en las SEC ID números 2 ó 4, especialmente las
combinaciones de las subunidades del receptor GABA humano, obtenidas
de cultivos de células eucarióticas establemente transfectadas que
contienen la subunidad teta.
Las preparaciones de proteínas de las
combinaciones de las subunidades del receptor GABA se pueden
recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes
mediante procedimientos que incluyen precipitación por sulfato de
amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio
aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía
de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía
en hidroxilapatita cromatografía en lectina. Se pueden usar etapas
de replegamiento de proteínas, según sea necesario, completando la
configuración de la proteína madura. Finalmente, cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC) se puede emplear para las etapas
de purificación final.
Los polipéptidos de la presente invención pueden
ser un producto purificado de origen natural, o un producto de
procedimientos de síntesis química, o producido mediante técnicas
recombinantes a partir de un huésped procariótico o eucariótico
(por ejemplo, mediante células de bacterias, de levaduras, de
plantas superiores, de insectos y de mamíferos en cultivo).
Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción
recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden estar
glucosilados o no glucosilados. Los polipéptidos de la invención
también pueden incluir un resto de aminoácido metionina
inicial.
El polipéptido de la subunidad teta de GABA de la
presente invención también es útil para identificar otras
sustancias del receptor GABA. Un ejemplo de un procedimiento para
identificar estas subunidades comprende la inducción de antisueros
policlonales de título alto contra polipéptidos teta de GABA
expresados bacterianamente únicos. Estos antisueros policlonales se
usan después para inmunoprecipitar los receptores GABA
solubilizados en detergente a partir de un cerebro de mamífero, por
ejemplo, un cerebro de rata.
La invención también proporciona preparaciones de
membranas que contienen combinaciones de subunidades del receptor
GABA que contiene la subunidad teta como se muestra en las SEC ID
números 2 ó 4, especialmente combinaciones de las subunidades del
receptor GABA humano, obtenidas de cultivos de células eucarióticas
establemente trasnfectadas que contienen la subunidad teta.
La línea celular, y las preparaciones de
membranas de la misma, de acuerdo con la presente invención tienen
utilidad en la selección y diseño de fármacos que actúan sobre el
receptor GABA, por ejemplo benzodiacepinas, barbituratos,
\beta-carbolinas y neuroesteroides.
Los estudios de localización de receptores que
usan hibridación in situ en cerebros de mono muestran que al
subunidad teta tiene una localización restringida; residiendo
principalmente en componentes del sistema límbico (implicado en
emociones tales como furor, miedo, comportamientos sexuales de
motivación y alimentación); septo medio, córtex cingulado, la
amígdala y campos del hipocampo, en diversos campos del hipotálamo,
y en regiones que se han asociado con la percepción de dolor; el
córtex cingulado, córtex insular, u en el cerebro medio y
estructuras de protuberancias anulares.
De acuerdo con lo anterior la presente invención
proporciona el uso de líneas celulares cotransfectadas establemente
descritas anteriormente, y las preparaciones de membranas derivadas
de las mismas, en la selección de y diseño de medicamentos que
actúan sobre los receptores GABA que comprenden la subunidad
\theta. De particular interés en este contexto son las moléculas
capaces de interaccionar selectivamente con receptores GABA hechos
de combinaciones de subunidades variables. Como será fácilmente
evidente, la línea celular de acuerdo con la presente invención, y
la preparación de membranas derivadas de las mismas, proporciona
sistemas ideales para el estudio de estructura. En particular, las
selecciones preferidas son ensayos funcionales que utilizan las
propiedades farmacológicas de las combinaciones de las subunidades
del receptor GABA de la presente invención.
De este modo, de acuerdo con un aspecto adicional
de la presente invención, se proporciona un procedimiento para
determinar si un ligando, que no se conoce que sea capaz de unirse
a un receptor GABA_{A} humano que comprende la subunidad teta, se
puede unir a un receptor GABA_{A} humano que comprende la
subunidad teta, que comprende poner en contacto una célula de
mamífero que comprende las moléculas de ADN que codifican al menos
una subunidad alfa del receptor, la subunidad teta del receptor, y
opcionalmente una o mas subunidades beta, gamma, delta, o epsilon
del receptor como se muestra en las SEC ID números 1 ó 3 con el
ligando en las condiciones que permiten la unión de ligandos
conocidos que se unen al receptor GABA_{A}, que detectan la
presencia de cualquiera de los ligandos unidos al receptor
GABA_{A} que comprende la subunidad teta, y por lo tanto
determinado si el ligando se une al receptor GABA_{A} que
comprende al subunidad teta. El ADN que codifica la subunidad teta
en la célula tiene una secuencia que codifica la misma como la
secuencia que codifica mostrada en la figura 1 ó figura 2.
Preferiblemente, la célula de mamífero es no neuronal en origen. Un
ejemplo de una célula de mamífero no neuronal es una célula de
fibroblastos tal como una célula Ltk-. El procedimiento preferido
para determinar si un ligando es capaz de unirse a un receptor
GABA_{A} humano que comprende la subunidad teta comprende poner
en contacto una célula de mamífero no neuronal transfectada (es
decir una célula que no expresa naturalmente ningún tipo de
receptor GABA_{A}, y de este modo no solamente expresará tal
receptor si se transfecta en la célula) que expresa un receptor
GABA_{A} que comprende la subunidad teta sobre su superficie, o
poner en contacto una preparación de membranas a partir de tal
célula transfectada, con el ligando en condiciones que se sabe que
prevalece, y de este modo se asocia con, unión in vivo de
los ligandos a un receptor GABA_{A} que comprende al subunidad
teta, que detecta la presencia de cualquiera de los ligandos que se
están ensayando unido al receptor GABA_{A} que comprende al
subunidad teta sobre la superficie de la célula, y por lo tanto
determinado si el ligando se une a un receptor GABA_{A} humano
que comprende la subunidad teta. Este sistema de respuesta se puede
basar en cambios de flujo de iones medidos, por ejemplo, mediante
conteo por centelleo (donde el ion esta marcado radiactivamente) o
mediante interacción del ion con un marcador fluorescente. Los iones
particularmente adecuados son iones cloruro. Tal sistema huésped se
aísla convenientemente a partir de líneas celulares preexistentes.
Tal sistema de transfección proporciona un sistema de respuesta
completo para investigación o ensayo de la actividad de receptores
GABA_{A} humanos que comprende la subunidad teta con ligandos
como se ha descrito anteriormente. Los sistemas de transfección son
útiles como cultivos de células vivas para ensayos de unión
competitiva entre fármacos conocidos o candidatos y ligandos que se
unen al receptor y que están marcados por reactivos radiactivos,
espectroscópicos u otros. Las preparaciones de membranas que
contienen el receptor aislado de células transfectadas son útiles
aprestos ensayos de unión competitiva. Un sistema de transfección
constituye un "sistema de descubrimiento de fármacos" útil
para la identificación de compuestos naturales o sintéticos con
potencial para el desarrollo de fármacos que además se pueden
modificar o usar directamente como compuestos terapéuticos para
activar, inhibir o modular las funciones naturales de receptores
GABA_{A} humanos que comprenden la subunidad teta. El sistema de
transfección también es útil para determinar la afinidad y eficacia
de fármacos conocido en sitios del receptor GABA_{A} humano que
comprende la subunidad teta.
Esta invención también proporciona un
procedimiento de selección de fármacos para identificar fármacos
que actúan específicamente con, y se unen a, un receptor GABA_{A}
humano que comprende la subunidad teta sobre la superficie de una
célula que comprende poner en contacto una célula de mamífero que
comprende moléculas de ADN que codifican al menos una subunidad del
receptor alfa, la subunidad teta del receptor, como se muestra en
las SEC ID números 1 ó 3, y opcionalmente una o más subunidades
beta, gamma, delta o epsilon del receptor sobre la superficie de la
célula con una pluralidad de fármacos, que determina que aquellos
fármacos se unan a la célula de mamífero, y por lo tanto
identificando fármacos que específicamente interactúan con, y se
unen a, receptores GABA_{A} humanos que comprenden la subunidad
teta. El ADN que codifica las subunidades teta en la célula pueden
tener una secuencia que sustancialmente codifica la misma como la
secuencia codificadora mostrada en al figura 1 o figura 2.
Preferiblemente, la célula de mamífero es no neuronal en origen. Un
ejemplo de una célula no neuronal es una célula de fibroblasto tal
como una célula Ltk-. Los fármacos candidatos se identifican
eligiendo los compuestos químicos que se unen con alta afinidad a la
proteína del receptor GABA_{A} expresado en células
transfectadas, usando procedimientos de unión de radioligandos bien
conocidos en la técnica. Los candidatos de fármacos también se
seleccionan para selectividad identificando los compuestos que se
unen con alta afinidad a una combinación de receptores GABA_{A}
particular pero no se une con alta afinidad a cualquier otra
combinación de receptores GABA_{A} o a cualquier otro sitio del
receptor conocido. Debido a que los compuestos selectivos, con alta
afinidad interactúan principalmente con el sitio del receptor
GABA_{A} conocido después de la administración al paciente, las
posibilidades de producción de un fármaco con efectos secundarios no
deseados se minimizan mediante este planteamiento.
En las selecciones anteriores, la célula de
mamífero puede, por ejemplo, comprender moléculas de ADN que
codifican al menos una subunidad alfa del receptor, la subunidad
teta, y opcionalmente una o más subunidades gama del receptor y
opcionalmente una o más subunidades beta del receptor.
Más preferiblemente, en las selecciones
anteriores, la célula de mamífero comprende moléculas de ADN que
codifican al menos una subunidad alfa del receptor, al menos una
subunidad gamma del receptor y la subunidad teta del receptor.
Los ligandos de candidatos de fármacos
identificados anteriormente pueden ser agonistas o antagonistas en
los receptores GABA_{A} humanos que comprenden la subunidad teta,
o pueden ser agentes que modulan alostéricamente un receptor
GABA_{A} humano que comprende la subunidad teta. Estos ligandos o
candidatos de fármacos identificados anteriormente se pueden
emplear como agentes terapéuticos, por ejemplo, para la modulación
de emociones tales como furor y miedo, de comportamientos sexuales y
del apetito y percepción del dolor.
Los ligandos o candidatos de fármacos de la
presente invención así identificados como agentes terapéuticos se
pueden emplear en combinación con un vehículo farmacéutico adecuado.
Tales composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz
del agonista o antagonista, y un vehículo o excipiente
farmacéuticamente aceptable.
Preferiblemente las composiciones que contienen
el ligando o candidato de fármaco se acuerdo con los procedimientos
de la presente invención están en formas de dosificación unitaria
tales como comprimidos, píldoras, cápsulas, obleas y similares.
Adicionalmente, el agente terapéutico se puede presentar en forma de
gránulos o polvos para formulación extratemporánea como soluciones
o suspensiones de volumen definido. Alternativamente, el agente
terapéutico se puede presentar en soluciones o suspensiones
definidas de volumen de preparación fácil. Las formas preferidas
son comprimidos y cápsulas.
Para preparar composiciones sólidas tales como
comprimidos, el ingrediente activo principal se mezcla con un
vehículo farmacéutico, por ejemplo, ingredientes de formulación de
comprimidos convencionales tales como almidón de maíz, lactosa,
sacarosa, sorbitol, talco, ácido esteárico, estearato de magnesio,
fosfato dicálcico o gomas, y otros diluyentes farmacéuticos, por
ejemplo agua, para formar una composición de preformulación sólida
que contiene una mezcla homogénea de un compuesto de la presente
invención, o una sal farmacéuticamente aceptable no tóxica de los
mismos. Cuando se refiere a estas composiciones de preformulación
como homogénea, significa que el ingrediente activo se dispersa
uniformemente por toda la composición de manera que la composición
se puede subdividir fácilmente en formas de dosificación unitarias
igualmente eficaces tales como comprimidos, píldoras y cápsulas.
Esta composición de preformulación sólida después se subdivide en
formas de dosificación unitaria del tipo descrito anteriormente que
contiene entre 0,1 y aproximadamente 500 mg del ingrediente activo
de la presente invención. Los comprimidos o píldoras de la
composición novedosa se pueden revestir o de otra manera combinar
para proporcionar una forma de dosificación que produzca la ventaja
de acción prolongada. Por ejemplo, el comprimido o píldora puede
comprender un componente de dosificación interna y uno de
dosificación externa, esta última estando en la forma de una
envuelta sobre la anterior. Los dos componentes pueden estar
separados por una capa entérica que sirve para resistir la
disgregación en el estómago y permite que el componente interno
pase intacto en el duodeno o se retrase en su liberación. Se pueden
usar una diversidad de materiales que para tales capas entéricas o
revestimientos, tales materiales incluyen numerosos ácidos
poliméricos y mezclas de ácidos poliméricos con materiales tales
como goma laca, alcohol cetílico y acetato de celulosa.
Las formas líquidas en las que las composiciones
novedosas de la presente invención se pueden incorporar para
administración por vía oral incluyen soluciones acuosas, jarabes
aromatizados adecuadamente, suspensiones acuosas u oleosas, y
emulsiones aromatizadas con aceites comestibles tales como aceite de
semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de coco, aceite de
cacahuete o aceite de soja, así como elixires y vehículos
farmacéuticos similares. Los agentes de dispersión o de suspensión
adecuados para las suspensiones acuosas incluyen gomas sintéticas y
naturales tales como tragacanto, goma arábiga, alginato, dextrano,
carboximetlcelulosa de sodio, metilcelulosa,
polivinil-prrolidona o gelatina.
Las composiciones de la presente invención
también se pueden administrar mediante la cavidad bucal usando la
tecnología convencional, por ejemplo, obleas de absorción.
Las composiciones en la forma de comprimidos,
píldoras, cápsulas u obleas para administración oral se prefieren
particularmente.
Un nivel mínimo de dosificación mínimo para el
ligando o candidato de fármaco identificado de acuerdo con los
procedimientos de la presente invención es aproximadamente 0,05 mg
al día, preferiblemente aproximadamente 0,5 mg al día y
especialmente aproximadamente 2,5 mg al día. Un nivel máximo de
dosificación para el ligando o candidato de fármaco es
aproximadamente 3000 mg al día, preferiblemente aproximadamente
1500 mg al día y especialmente aproximadamente 500 mg al día. Los
compuestos de administran en un régimen de 1 a 4 veces al día,
preferiblemente una o dos veces al día, y especialmente una vez al
día.
Se apreciará que la cantidad del agente
terapéutico requerida para uso en terapia variará dependiendo no
solamente de los compuestos o composiciones particulares
seleccionados pero también con la vía de administración, la
naturaleza de al afección, y por último estará a discreción del
medico o farmacéutico del paciente.
Figura 1: secuencia de nucleótidos para la
subunidad teta, junto con su secuencia de aminoácidos deducida
correspondiente a ella. (SEC ID Nº 1 y SEC ID Nº 2,
respectivamente).
Figura 2: secuencia de nucleótidos preferida
para la subunidad teta, junto con su secuencia de aminoácidos
deducida correspondiente a ella. (SEC ID Nº 3 y SEC ID Nº 4,
respectivamente).
Figura 3: curvas dosis-respuesta
de células HEK transfectadas transitoriamente con y sin los
receptores GABA-A que contienen la subunidad
\theta (\alpha_{2}\beta_{1}\theta\gamma_{1} y
\alpha_{2}\beta_{1}\gamma_{1}).
Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran la
presente invención.
La base de datos del Genbank se investigó con las
secuencias de aminoácidos del polipéptido del receptor GABA_{A}
que usa el algoritmo de investigación BLAST, y un número de
secuencias homólogas identificadas. Una de éstas U47334 se investigó
en más detalle. La U47334 contenía secuencias homólogas para
separar el dominio extracelular amino terminal y el dominio de
extensión TM4 de otras subunidades del receptor GABA_{A}, pero no
parece que contengan ninguna secuencia homóloga a las regiones de
extensión de estos dominios. La reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) se realizó para determinar si el tamaño de la secuencia de
U47334 era correcto, o era, por ejemplo, el resultado de un
episodio de ayuste incorrecto. Para la PCR, se generaron un cebador
de polaridad positiva (5' gcaaatgaagctgtggttc 3') (SEC ID Nº 5) y
de polaridad negativa (5' caatgttgaacaacccaaag 3') (SEC ID Nº 6) a
partir de la secuencia U47334, y se realizó la PCR usando
condiciones habituales (Whiting y col., PNAS) usando ADNc de cerebro
entero humano (Clontech) como molde. Después se realizó una segunda
reacción de PCR usando cebadores encajados de polaridad positiva (5'
gcctgagaccgaattttgg 3') (SEC.ID.Nº. 7) y de polaridad negativa (5'
ggaaccgggaccacttgtc 3') (SEC ID.Nº. 8) generados a partir de la
secuencia U47334, y usando los productos de la primera PCR como
molde. Se obtuvo un único producto de la PCR de aproximadamente 1600
pares de bases sugiriendo que la secuencia U47334 representa un
mensaje procesado incorrectamente. Este producto se secuenció
directamente usando un secuenciador de ADN de Applied Biosystems 373
y química exterminadora de tintes.
Las secuencias de ADNc 5' y 3' de al secuencia
U47334 se obtuvieron mediante PCR anclada en
5'-3'-PCR usando el kit de clonación
de ADNc Maratón de cerebro humano (Clontech) según los protocolos
del fabricante. Los cebadoers de polaridad negativa encajados (5'
tagtccagggtcaagttc 3' 5' tagtatgctaagcgtgaatc 3') (SEC ID número. 9
y 10) y de polaridad positiva (5' gagtttgaggatagttgc 3' y 5'
tgctccttcactgaaggg 3') (SEC ID números 11 y 12) se obtuvieron ambos
de la secuencia U47334 y la secuencia de las amplificaciones por PCR
iniciales.
Un ADNc de longitud completa se generó usando
cebadores obtenidos de secuencias cadena abajo del ATG de iniciación
(5' ccatgactcaagcttgccaccatgctgcgagccgcagtgatc 3', que incorpora un
sitio HindIII) (SEC.ID.Nº 13) y en el 3' UT del producto de PCR
anclado (5' tgaaaggagcacagcacagtgctcccg 3') (SEC.ID.Nº 14). El
producto de PCR (1958 pares de bases) se clonó en pMOS (Amersham),
se subclonó en pCDNAI Amp (Invitrogen), y se secuenció completamente
sobre ambas hebras mediante el secuanciación anterior. El análisis
de secuencia se realizó usando los programas de ordenador Inherit
(Applied Biosystems), Sequencher (Genecodes), y Genetics Computer
Group (Univ. Wisconsin).
La región que codifica 627 aminoácidos y tiene
todos los motives estructurales esperados de una subunidad de los
canales de calcio iónicos activados por ligando. La comparación con
otras subunidades de los canales de calcio iónicos activados por
ligando indica que es más similar a las subunidades del receptor
GABA_{A}, siendo la más alta homología con la subunidad
\beta_{1} (45% de identidad). Sin embargo, esta identidad de
secuencia es suficientemente baja como para indicar que al nueva
subunidad no se puede clasificar como una cuarta subunidad \beta,
sino representa una clase novedosa de subunidad, clasificada como
\theta, dentro de la familia de genes del receptor GABA.
Las sondas de oligonucleótidos de polaridad
negativa para la secuencia de la subunidad \theta humana se generó
en un sintetizador de ADN de Applied Biosystems Automated.
Sonda
1
5'
CTG-CTT-CTT-GCA-CAC-CCT-TCT-CGC-CAT-GGT-GAA-GCA-TGG-GCT-TCC
3' (SEC ID Nº 15)
Sonda
2
5'TGT-CGC-CTA-GGC-TGG-CGC-CGA-GGT-CCT-CGA-CTG-TAG-AAA-AGA-TAG
3' (SEC ID Nº 16)
Cada oligonucleótido se marcó en el extremo 3'-
con [^{35}S] 5'-(tiotrifosfato) de desoxiadenosina en una
relación molar 30:1 de
^{35}S-isótopo:oligonucleótido usando
deoxinucleotidil transferasa terminal durante 15 minutos a 37ºC en
el tampón de reacción suministrado. El oligonucleótido marcado
radiactivamente se separó de los nucleótidos no incorporados usando
columnas giratorias Sephadex G50. Las actividades específicas de
las sondas marcadas en varias reacciones de marcado variaban entre
1,2-2.3 x 10^{9} cpm/mg. Se retiraron cerebros de
mono y se congelaron frescos en bloques de 1 cm. Se tomaron
secciones de 12 \mum y se fijaron para hibridación in situ.
La hibridación de las secciones se llevó a cabo de acuerdo con el
procedimiento de Sirinathsingji y Dunnett (expresión de genes por
formación de imágenes en injerto neural; Molecular Imaging in
Neuroscience: A Practical Approach, N.A. Sharif (ed), Oxford
University Press, Oxford, páginas 43-70, 1993). En
resumen, se retiraron las secciones del alcohol, se secaron al aire
y 3 x10^{5} cpm de cada sonda marcada con ^{35}S en 100 \mul
de tampón de hibridación se aplicaron a cada portaobjeto. La sonda
de "polaridad negativa" marcada también se usó en presencia de
un exceso de concentración (100 x) de sonda de polaridad negativa no
marcada para definir la hibridación no específica. Se colocaron
cubreobjetos de Parafilm sobre las secciones que se incubaron
durante toda una noche (aproximadamente 16 horas) a 37ºC. Después
de la hibridación las secciones se lavaron durante 1 hora a 57ºC en
1 x SSC después se enjuagó brevemente en 0,1 x SSC, se deshidrataron
en serie en alcoholes, se secaron al aire y se expusieron a
película de rayos X Hyperfilm \betamax de Amersham y se evaluó la
distribución relativa del ARNm para una diversidad de regiones del
cerebro.
Se observó el ARM mensajero para la subunidad en
los componentes del sistema límbico (implicado en emociones tales
como furor, miedo, comportamientos sexuales de motivación y
alimentación); septo medial, córtex cingulado, la amígdala y campos
del hipocampo (giro dentado, CA3, CA2, CA2) y en diversos núcleos
del hipotálamo (a menudo asociado al sistema límbico). El ARN
mensajero también estaba presente en regiones que se habían asociado
con la percepción del dolor; el córtex cingulado, córtex insular, y
en cerebro medio y estructuras de protuberancia anular (por
ejemplo, formación de la materia gris central y reticular).
Los anticuerpos para la subunidad teta de
GABA_{A} humano se generaron mediante inyección subcutánea de
conejos blancos de Nueva Zelanda con una proteína de fusión
glutatión -S-transferasa (GST) constituida por
residuos 353-595 de la gran región bucle
citoplasmática de la subunidad teta. El ADN que codifica esta
región se clonó en el vector de expresión bacteriana
pGEX-2T (Pharmacia), transformada en células DH10B
de E. coli (Life Technologies), y la expresión de la
proteína de fusión se llevó a cabo usando los protocolos de
Pharmacia. Las células bacterianas se incubaron sobre hielo en
solución STE (NaCl 150 mM, Tris-HCl 10 mM pH 8, EDTA
1 mM) que contenía 100 \mug/ml de Lisozima durante 20 min antes de
la adición de N-lauril sarcosina hasta 1,5% (p/v).
La suspensión bacteriana se sonicó en hielo, y se retiró cualquier
materia insoluble mediante centrifugación. Se añadió Triton
X-100 hasta 3% (v/v) final y la proteína de fusión
GST-fusión se purificó mediante cromatografía de
afinidad sobre glutatión-agarosa. Las columnas se
lavaron extensivamente con PBS y la proteína unida se eluyó con
glutatión libre 20 mM en NaCl 150 mM, Tris-HCl 100
mM pH 9, EDTA 1 mM, Ditiotreitol 1 mM. La proteína eluida se
concentró mediante precipitación con 5 volúmenes de acetona fría, se
volvió a suspender en agua, y se almacenó a -70ºC hasta uso.
Para análisis de transferencia de Western se
retiraron muestras de tejido y se diseccionaron sobre una placa de
vidrio a 4ºC. El tejido se homogeneizó en Tris 50 mM, pH 7,5, que
contenía PMSF 1 mM, pepstatin A 1 \muM. El homogenato se
centrifugó (2000 X g) durante 10 minutos y el sobrenadante se
centrifugó a 20,000 X g durante 45 minutos. El sedimento se volvió
a suspender en Tris 50 mM y se volvió a centrifugar. El sedimento
final se volvió a suspender en Tris 50 mM pH 7,4 que contenía
inhibidores de proteasa y detergente (desoxicolato de Na:0,25%, NaCl
150 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, pepstatina y leupeptina 1 \muM. Las
preparaciones de membranas se separaron sobre un gel de Tris tricina
poliacrilamida al 10% y se transfirió electroforéticamente a
nitrocelulosa. La nitrocelulosa se bloqueó con lecha no grasa al 5%
(marvel™)/PBS/Tween (0,5%) durante 1 hora a temperatura ambiente. El
anticuerpo de la subunidad anti \theta se usó a una concentración
de 1:500 preparada en PBS/Tween/leche a 4ºC durante toda una noche,
se lavó y se incubó con anti-conejo IgG HRP unido
(Amersham) a 1:1000 en PBS/Tween/leche durante una hora a
temperatura ambiente. Los filtros se lavaron, se incubaron en ECL
(Amersham) durante 1 minuto y se opusieron a la película. Una banda
individual de aproximadamente 60-66 kDa se visualizó
en tronco cerebral y membranas estradas, cerca del peso molecular
predicho para la subunidad \theta de 68-74
kDa.
Para la localización de la subunidad \theta
mediante inmunoquímica se anestesió profundamente un mono rhesus con
cetamina y pentobarbitona de sodio y se perfusionó transcardialmente
con solución salina, seguido de solución salina de formal al 10%. Se
retiró el cerebro, se fijó posteriormente durante 24 horas, y se
cortó en rodajas en bloques coronales, que después de deshidrataron
a través de alcoholes graduados, se clarificaron y se embebieron en
era de parafina. Se cortaron secciones coronales (8 \mum) sobre un
microtomo Sledge básico y se montaron sobre portaobjetos de
microscopio de vidrio. Las secciones se desparafinaron, se
rehidrataron y se enjuagaron en solución salina tamponada con
fosfato (PBS) 0,1 M. Con el fin de potenciar las secciones
inmunorreactivas se sometieron a técnicas de recuperación de
antígenos. En resumen, las secciones se colocaron en tampón citrato
0,1 M pH 6,0 y proporcionó estallidos de 5 minutos a potencia
completa en un horno microondas convencional (800 W). Una vez
aclaradas en PBS, las secciones se incubaron en suero de cabra
normal al 5% en PBS, durante 1 hora para bloquear la tinción de
fondo. Después las secciones se incubaron durante toda una noche a
+4ºC en el anticuerpo policlonal de conejo de la subunidad anti
\theta (diluido 1 : 1000 en tampón de bloqueo). La
inmunorreactividad se visualizó usando el sistema Vector
elite ™ (Vector laboratories, Peterborough, Reino Unido),
seguido de desarrollo en diaminobencidina (DAB) (Sigma, Reino
Unido). Las secciones se tiñeron por contraste en hematoxilina de
Gill (Biomen, High Wycombe, Reino Unido), se deshidrató y se montó
para examen microscópico. Para comparación, las muestras de
inmersión en formalina al 10% se fijaron de tronco cerebral pert
mortem se procesaron de manera idéntica. Se usaron secciones
comparables para detectar la subunidad \theta y tirosina
hidroxilasa (Institut Jacques Boy, Reims,
Francia)inmunorreactividad mediante la aplicación de
inmunoglobulina de cabra anti conejo marcada con ^{35}S 1 : 100
(Amersham Life Sciences, Reino Unido) durante 1 hora. Los
portaobjetos se enjuagaron en agua destiladas, se deshidrataron con
etanol al 95%, se secaron al aire y se expusieron a Amersham
Hyperfilm \betamax. Las secciones usadas para la colocalización
inmunofluoerscente de la subunidad \theta y tirosina hidoxilasa se
trataron previamente de la misma manera, la inmunorreactividad de la
subunidad anti \theta se detectó usando primeramente un anti
conejo biotinilado; 1 : 200 (Laboratorios Vector) seguido de
estreptavidina conjugada a FITC (Sigma, Reino Unido). El segundo
suero policlonal de conejo, anti tirosina hidroxilasa, se visualizó
de nuevo usando anti conejo biotinilado, se hizo reaccionar con
estreptavidina conjugada a Cy3 (Sigma, Reino Unido). Las secciones
se tiñeron por contraste con 33258 de Hoescht (0.5 \mug/ml). Para
evitar cualquier reactividad cruzada de los sistemas de detección,
se colocaron secciones en agua destilada en ebullición durante 5
minutos antes de la aplicación del segundo anticuerpo primario y su
posterior detección. La distribución de la inmunorreactividad de la
subunidad \theta en cerebro de mono reflejó la distribución del
ARNm de \theta observada mediante estudio de hibridación in
situ (ejemplo 2). Se observaron las neuronas marcadas de
neuronas del hipotálamo y piramidales corticales. Se observó un
marcado significativo de células en el tronco cerebral, incluyendo
las áreas pars compacta de la sustancia negra, ventral y tegmental
lateral, neuronas pigmentadas del locus coeruleus y población
restringida dentro del rafe dorsal. También se observó el marcado de
terminales celulares dentro del putamen caudado. La distribución se
encontró que se parecía estrechamente a la distribución de la
inmunorreactividad de la tirosina hidroxilasa, un marcador de
neuronas catocolaminérgicas y sus procesos, se visualizaron mediante
inmunorradiografía. Se confirmó la colocalización de las neuronas
que contenían la subunidad \theta con tirosina hidroxilasa,
usando inmunofluorescencia de combinación. La expresión de la
subunidad \theta observada en tanto las neuronas
catacolaminérgicas de pars compacta de la sustancia negra como locus
coeruleus se sustanció adicionalmente en secciones de tronco
cerebral post mortem humano.
Una construcción quimérica de la subunidad teta
se construyó en el vector de expresión de mamífero pcDNA3.1Zeo
(Invitrogen) que consistía en las bases -224 a +99 del gen \alpha1
de GABA_{A}, una secuencia que codifica el epítope
c-myc (residuos 410-419 del producto
c-myc de oncogen humano), un sitio de clonación que
codifica los aminoácidos
asparagina-serina-glicina, y ADN que
codifica los residuos 22-627 del producto génico de
\theta de GABA_{A}. Esta construcción se linealizó y se
transfectó el ADN en una población clonal de células Ltk^{-} de
ratón que se había mostrado previamente que estaba establemente
transfectada con las subunidades
\alpha_{2}\beta_{1}\gamma_{1} del receptor GABA_{A} y
separadamente una línea Ltk^{-} transfectada establemente con
\alpha_{2}\beta_{3}\gamma_{2}. Las células resultantes
se seleccionaron clonalmente con selección de Zeocina (100
\mug/ml), y se seleccionaron para verificar la integración y
expresión estable de
\alpha_{2}\beta_{1}\theta\gamma_{1} y
\alpha_{2}\beta_{3}\theta\gamma_{2}
respectivamente.
Se realizaron experimentos sobre células HEK 293
transfectadas transitoriamente con combinaciones de células HEK 293
transfectadas transitoriamente con combinaciones de ADNc humano
\alpha2\beta1\gamma1, y \alpha2\beta1\theta\gamma1
(4 \mug de ADNc por cubreobjeto) usando precipitación con fosfato
de calico (Chen y Okayama, 1988) como se ha descrito previamente
(Hadingham y col., 1993). Los cubreobjetos que contenían las células
en un cultivo monocapa se transfirieron a una cámara perspex sobre
la fase de microscopio invertido Nikon Diaphot. Se perfundieron de
manera continua células con una solución que contenía NaCl 124 mM,
KCl 2 mM, CaCl_{2} 2 mM, MgCl_{2}1 mM, KH_{2}PO_{4}1,25 mM,
NaHCO_{3} 25 mM, D-glucosa 11 mM, a pH 7,2, y se
observaron usando óptica de contraste de fase. Se usaron pipetas
patch con un diámetro de punta de 2 \mum y una resistencia de 4
M\Omega con vidrio de borosilicato y se llenaron con CsCl 130 mM,
HEPES 10 mM, EGTA 10 mM, Mg^{+}-ATP 3 mM, pH
ajustado hasta 7,3 con CsOH. Las células se sometieron a
patch-clamp en modo de células enteras usando un
amplificador de patch-clamp Axopatch 200 B. Se
aplicaron soluciones de fármaco mediante un conjunto de doble pipeta
de forma cilíndrica, controladas mediante un motor de velocidad
gradual unido a un manipulador Prior, que permite un equilibrio
rápido alrededor de la célula. Las concentraciones crecientes de
GABA se aplicaron durante pulsos de 2 segundos con intervalos de 30
segundos entre aplicaciones. Se construyeron curvas
concentración-respuesta no acumulativa para GABA.
Las curvas se ajustaron usando un programa de ajuste por mínimos
cuadrados no lineal a la ecuación f(x) =
B_{MAX}/[1+(EC_{50}/x)^{n}] en la que x es
la concentración del fármaco, CE_{50} es la concentración del
fármaco que genera una respuesta semi-máxima y
n es el coeficiente Hill. Las CE_{50} se analizaron
mediante la prueba de t de student no apareada.
El valor de EC_{50} De GABA de las células HEK
293 que expresaban transitoriamente la combinación de las
subunidades del receptor GABA_{A}
\alpha_{2}\beta_{1}\theta\gamma_{1} es
significativamente menor que la de las células HEK 293 que
expresaban transitoriamente la combinación de subunidades del
receptor GABA_{A} \alpha_{2}\beta_{1}\gamma_{1}
(véase la Figura 3).
| \alpha_{2}\beta_{1}\gamma_{1} | \alpha_{2}\beta_{1}\theta\gamma_{1} | |
| CEC_{50} | 16,7 \pm 3,7 nM | 62,7 \pm 6,7 nM* |
| Pendiente | 1,6 \pm 0,2 | 1,5 \pm 0,1 |
| * p < 0,001 |
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Merck Sharp & Dohme Limited
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Terlings Park, Eastwick Road
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Harlow
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Essex
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Inglaterra
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): CM20 2QR
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: +44 1279 440175
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: +44 1279 440717
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Subunidad teta humana del receptor GABA-A
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 16
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE DE ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS / MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release nº 1,0, versión nº 1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1884 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 627 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1884 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 627 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCAAATGAAG CTGTGGTTC
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAATGTTGAA CAACCCAAAG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCTGAGACC GAATTTTGG
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAACCGGGA CCACTTGTC
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAGTCCAGGG TCAAGTTC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAGTATGCTA AGCGTAGAATC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGTTTGAGG ATAGTTGC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGCTCCTTCA CTGAAGGG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCATGACTCA AGCTTGACCAC CATGCTGCGA GCCGCAGTGA TC
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGAAAGGAGC ACAGCACAGT GCTCCCG
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGCTTCTTG CACACCCTTC TCGCCATGGT GAAGCATGGG CTTCC
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGTCGCCTAG GCTGGCGCCG AGGTCCTCGA CTGTAGAAAA GATAG
\hfill45
Claims (13)
1. Una línea celular eucariótica, cotransfectada
de manera estable que comprende un vector que codifica una subunidad
teta del receptor GABA humano como se muestra en las SEC ID números
2 ó 4, dicha línea celular capaz de expresar un receptor GABA
recombinante se muestra en las SEC ID números 2 ó 4, al menos una
subunidad alfa del receptor y opcionalmente una o más subunidades
del receptor seleccionadas entre las subunidades beta, gamma, delta
y epsilon.
2. Una línea celular de acuerdo con la
reivindicación 1 que es una línea celular de fibroblastos de
roedores.
3. Un procedimiento para la preparación de una
línea celular eucariótica capaz de expresar un receptor GABA, que
comprende cotransfectar de manera estable una línea celular
eucariótica con al menos dos vectores de expresión, uno de tales
vectores albergando la secuencia de ADNc que codifica la subunidad
teta del receptor GABA como se muestra en las SEC ID números 1 ó 3,
otro de tales vectores albergando la secuencia de ADNc que codifica
una subunidad alfa del receptor GABA, y opcionalmente uno o más
vectores adicionales albergando la secuencia de ADNc que codifica
una subunidad beta, gamma, delta o epsilon del receptor GABA.
4. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3 en la que la línea celular es una línea celular de
fibroblastos de roedores.
5. Una molécula de ADN aislada que codifica la
subunidad teta del receptor GABA humano que comprende la secuencia
mostrada en la SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 3.
6. Un vector de expresión recombinante que
comprende la secuencia de nucleótidos de la subunidad teta del
receptor GABA humano mostrada en las SEC ID números 1 ó 3 junto con
las secuencias adicionales capaces de dirigir la síntesis de dicha
subunidad teta del receptor GABA humano en cultivos de células
eucarióticas cotransfectadas de manera estable.
7. Una preparación de proteínas de una
combinación de subunidades del receptor GABA recombinante que
comprende una subunidad teta del receptor como se muestra en las SEC
ID números 2 ó 4 obtenida de una línea celular de acuerdo con las
reivindicaciones 1 ó 2.
8. Una preparación de membranas que contiene
combinaciones de subunidades del receptor GABA recombinante que
comprende una subunidad teta del receptor como se muestra en las SEC
ID números 2 ó 4 obtenida de una línea celular de acuerdo con las
reivindicaciones 1 ó 2.
9. Una preparación de acuerdo con las
reivindicaciones 7 u 8 en la que la combinación de subunidades
obtenida es la combinación de subunidades
\alpha_{1}\theta\gamma_{2},
\alpha_{2}\beta_{1}\theta\gamma_{1} o
\alpha_{2}\beta_{3}\theta\gamma_{2} del receptor
GABA.
10. El uso de una célula de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2 o una preparación de membranas obtenida de la
misma de acuerdo con la reivindicación 8 en la selección de y diseño
de medicamentos que actúan sobre un receptor GABA que comprende la
subunidad teta.
11. Un procedimiento para determinar si un
ligando, que no se conoce que sea capaz de unirse a un receptor
GABA_{A} humano que comprende la subunidad teta, se puede unir a
un receptor GABA_{A} humano que comprende la subunidad teta, que
comprende poner en contacto una célula de mamífero que comprende las
moléculas de ADN que codifican al menos una subunidad alfa del
receptor, la subunidad teta del receptor, como se muestra en als SEC
ID números 1 ó 3, y opcionalmente una o mas subunidades beta, gamma,
delta, o epsilon del receptor con el ligando en las condiciones que
permiten la unión de ligandos conocidos que se unen al receptor
GABA_{A}, que detectan la presencia de cualquiera de los ligandos
unidos al receptor GABA_{A} que comprende la subunidad teta, y
por lo tanto determinado si el ligando se une al receptor
GABA_{A} que comprende al subunidad teta.
12. Un procedimiento de selección de fármacos que
interactúan específicamente con, y se unen a, un receptor GABA_{A}
humano que comprende la subunidad teta sobre la superficie de una
célula que comprende poner en contacto una célula de mamífero que
comprende una molécula de ADN que codifica al menos una subunidad
alfa del receptor, la subunidad teta del receptor, como se muestra
en las SEC ID números 1 ó 3, y opcionalmente una o más subunidades
beta, gamma, delta o epsilon del receptor, sobre la superficie de la
célula con una pluralidad de fármacos, que determina que aquellos
fármacos se unan a la célula de mamífero, y por lo tanto
identificando fármacos que específicamente interactúan con, y se
unen a, receptores GABA_{A} humanos que comprenden la subunidad
teta.
13. Un polipéptido de la subunidad teta del
receptor GABA aislado que tiene la secuencia de aminoácidos de la
SEC ID Nº: 2 o SEC ID Nº: 4.
Applications Claiming Priority (2)
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