JP2003521223A - コレステロール認識配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 −Ｚ−(Ｘ)_0-5−Ｙ−(Ｘ)_0-5−Ｑ（ここで、Ｚは、中性で疎水性のアミノ酸（例えば、ロイシンまたはバリン）を表し、Ｙは、中性で極性のアミノ酸を（例えば、チロシン）表し、Ｑは、塩基性アミノ酸（例えば、アルギニンまたはリジン）を表し、およびＸは、どのようなアミノ酸も表す。）を含む、コレステロールの認識／相互作用に関するコンセンサス配列。タンパク質中のこのコンセンサス配列の存在は、コレステロールとの相互作用の可能性を推断する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （序文） ホルモンによるステロイド産生の急な刺激における制御の最初のポイントは、
Ｃ₂₇コレステロール側鎖分裂チトクロームP-450酵素（P-450ｓｃｃ）と、ミトコ
ンドリア膜内（ＩＭＭ）に局在する補助電子移動タンパク質によってコレステロ
ールをプレグネノロンに転化する、この生合成経路における第１段階を伴う（シ
ンプソン・イー・アールおよびウォーターマン・エム・アール著、1983年、カナ
ディアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー・アンド・セル・バイオロジ
ー61：第692頁〜第717頁；ヨフコテ・シー・アールら著1992年、ジャーナル・オ
ブ・ステロイド・バイオケミストリー・モレキュラー・バイオロジー(Molec. Bi
ol.)43：第751頁〜第767頁）。より詳細な研究は、P-450ｓｃｃで触媒活性され
た反応が、ステロイドホルモンの合成における律速段階ではないといことを示し
ている。むしろ、律速段階は、前駆体であるコレステロールの細胞内の源からＩ
ＭＭへの輸送である。このホルモン依存輸送メカニズムは、ミトコンドリア内に
制限されていることが分かった（シンプソンおよびウォーターマン著、1983年、
上記文献；ヨフコテ・シー・アールら著1992年、上記文献）。本明細書において
、上述および以降に引用される文献はいずれも、それらの内容を参照としてここ
に挿入する。

【０００２】 周辺型ベンゾジアゼピン受容体（ＰＢＲ）は、本来、ベンゾジアゼピンジアゼ
パムを比較的高いアフィニティで固定することから発見された（ラパドポーラス
・ヴイ、1993年、エンドクライン・レヴュー、14：第222頁〜第240頁）。ベンゾ
ジアゼピンは、中枢神経系でのγ-アミノ酪酸受容体の活性を調整することによ
り投薬される、救助の不安におけるその薬理活性のために最も高い頻度で処方さ
れる薬である（コスタ・イーおよびグアドッチ・エイ著1979年、アニューアル・
レヴュー・イン・ファーマコロジカル・トキシコロジー19：第531頁〜第545頁）
。ＰＢＲは、上記神経伝達物質受容体からの、明らかにベンゾジアゼピンのため
の結合部位のもう一つのクラスである。別の研究は、ベンゾジアゼピンに加えて
、ＰＢＲが、非常に高いアフィニティで有機化合物の別のクラスと結合している
ことを示していた（パパドポーラス著1993年、上記文献）。ＰＢＲは、評価され
る組織中に含まれているが、ステロイド産生組織に非常に高いことが分かってお
り、主にミトコンドリア膜外（ＯＭＭ）に局在していた（アンホルト・アール・
ア−ル・エイチら著1996年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
261：第576号〜第583号）。18ｋＤａのイソキノリン結合タンパクは、クローン
化および発現されたＰＢＲとして同定された（パラドポーラス・ヴイ著1998年、
プロシーディングズ・オブ・ソサイエティ・フォア・エクスペリメンタル・バイ
オロジー・アンド・メディスン217：第130頁〜第142頁）。次いで、ＰＢＲが、
ミトコンドリア膜内からミトコンドリア膜外へのコレステロールの運搬を媒介す
る（クルーガー・ケイ・イーおよびパラドポーラス・ヴイら著1990年、ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー265：第15015頁〜第15022頁）、ステ
ロイド産生機構の官能性成分であることも示された（パパドポーラス著、1998年
、上記文献；パラドポーラス・ヴイら著1990年、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー265：第3772頁〜第3779頁）。更なる研究により、副腎ＰＢ
Ｒレベルの薬理学的に誘発された還元が、生体内では低い循環糖質コルチコイド
レベルとなることが示された（パラドポーラス・ヴイ著1998年、上記文献）。更
には、ライディヒ細胞内でのＰＢＲ遺伝子の標的にされる分裂が、ミトコンドリ
ア中へのコレステロール輸送およびステロイド形成を停止し；ＰＢＲ ｃＤＮＡ
によるミュータント細胞の形質移入が、ステロイド産生を解放した（パラドポー
ラス・ヴイら著1997年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー272
：第32129頁〜第32135頁）。ＰＢＲがコレステロール輸送にどのような影響を及
ぼすのか、およびＰＢＲがコレステロールと直接相互作用をするかどうかは分か
らなかった。

【０００３】 （発明の要旨） ヒトおよびマウスの18ｋＤａＰＢＲタンパク質の既知のアミノ酸配列に基づい
て、この受容体タンパク質の立体モデルを分子力学シミュレーションを用いて展
開した（バーナソー・ジェイ・エムら著1993年、ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・グラフィックス11：第236頁〜第245頁；パパドポーラス・ブイ著1996年、Ｉ
ｎ：パイン・エイ・エイチ、ハーディ・エム・ピー、ラッセル・エル・ディ（編
）ライディヒ細胞、カーシュ・リヴァー・プレス、ウィーン、ＩＬ、第598頁〜
第628頁）。立体構造の分析により、ヒトとマウスのＰＢＲがいずれもコレステ
ロールを出きる限り適応させて、チャンネルとして機能し得ることが示された。
本発明には、この仮説の試験と立証が記載されている。

【０００４】 本発明には、コレステロールと相互作用することが分かっている全てのタンパ
ク質に共通の、ＰＢＲに対するコレステロール認識アミノ酸配列が示されており
、ＰＢＲが、膜を横切るコレステロール輸送を媒介する、コレステロールチャン
ネル様の構造として機能することも示されている。

【０００５】 様々な分子内源から発現するコレステロールは、ミトコンドリア外の膜（ＯＭ
Ｍ）中のＰＢＲのカルボキシ末端に存在するコレステロール認識／相互作用アミ
ノ酸コンセンサスパターンによって認識される。コレステロールのこの貯蔵は、
他の膜成分と混合することなく保持されるＰＢＲ部位で（ＯＭＭ）中に入る。受
容体と結合するリガンドは、このコレステロールの放出を誘発する。放出される
と、コレステロールは、P-450ｓｃｃに接近されて、全ステロイドの前駆体であ
るプレグネノロンへ分裂する。

【０００６】 そのため、本発明の目的は、 −Ｚ−(Ｘ)_0-5−Ｙ−(Ｘ)_0-5−Ｑ （ここで、Ｚは、中性で疎水性のアミノ酸（例えば、ロイシンまたはバリン）を
表し、Ｙは、中性で極性のアミノ酸を（例えば、チロシン）表し、Ｑは、塩基性
アミノ酸（例えば、アルギニンまたはリジン）を表し、およびＸは、どのような
アミノ酸も表す。） を含む、コレステロールの認識／相互作用に関するコンセンサス配列を提供する
ことである。タンパク質中のコンセンサス配列の存在は、コレステロールとの相
互作用の可能性を推断する。

【０００７】 本発明のもう一つの目的は、コレステロール相互作用／認識配列を有するペプ
チドの産生に使用される前記コンセンサス配列をコード化するヌクレオチド配列
、およびこの配列の全部または一部を組み込んだベクター、およびこのベクター
を用いて形質転換または形質移入された細胞、原核生物、真核生物を提供するこ
とである。形質転換または形質移入された細胞は、コレステロール相互作用／認
識を変化させる試薬または薬をスクリーニングするのに有用である。

【０００８】 本発明の更なる目的は、タンパク質がコレステロールと認識するかまたは相互
作用するかどうかを確認する方法を提供することであり、この方法は、前記コレ
ステロール認識／相互作用コンセンサス配列の存在または不存在を確認すること
を含む。ここで、この配列の存在は、タンパク質がコレステロールを認識するお
よび／またはコレステロールと相互作用する可能性の示唆である。

【０００９】 本発明の別の目的は、天然または合成のタンパク質またはポリペプチドがコレ
ステロールを認識し得るおよび／またはコレステロールと相互作用し得るように
、天然または合成の分子またはポリペプチド中にコレステロール認識／相互作用
配列を導入することによって、コレステロールと相互作用する可能性を分子に与
える方法を提供することである。

【００１０】 本発明の目的は、前記コレステロール認識／相互作用配列を含む、天然または
合成の分子を提供することでもある。

【００１１】 本発明の目的は、前記コレステロール認識／相互作用コンセンサスのコレステ
ロール認識／相互作用能力をブロックするかまたはその能力と競争する分子を提
供することでもある。この分子は、抗体、ペプチド、コレステロール認識／相互
作用コンセンサス配列を含むペプチド、または薬で有り得る。

【００１２】 本発明の目的は、コレステロール認識が低減されるか、削除されるかまたは増
加するように結合部位を変化させることを含む、前記コレステロール認識／相互
作用コンセンサスを含有する分子のコレステロール結合能力を変化させる方法を
提供することでもある。コレステロール認識は、完全なコレステロールポケット
を提供することにより、あるいはタンパク質もしくは分子中に１以上のコンセン
サス配列を提供することにより、増加させることができる。

【００１３】 さらに、本発明の目的は、ＰＢＲのコレステロール認識／相互作用部位を変更
することにより（例えば、チロシンからセリンまでのアミノ酸153を変えること
により、またはアルギニンからロイシンまでのアミノ酸155をかえることにより
）、コレステロールを認識しかつコレステロールと相互作用する能力が低減した
ＰＢＲを提供することでもある。このような変更またはこれと同様の変更は、コ
レステロール認識／相互作用を低減するか、または前記コレステロール認識／相
互作用コンセンサス配列を含む他のタンパク質もしくは試薬と結合するのに使用
されてよい。

【００１４】 本発明の目的は、コレステロールがＰＢＲから放出されるように、ＰＢＲリガ
ンドを導入することによって細胞内のコレステロールの存在を増加させる方法を
提供することでもある。

【００１５】 本発明の目的は、ＰＢＲと結合するＰＢＲリガンドを抑制することにより、Ｐ
ＢＲからのコレステロールの放出を抑制する、試薬を導入することによって細胞
内のコレステロールの存在を低減させる方法を提供することでもある。この試薬
は、分子、ペプチドまたは薬で有り得る。

【００１６】 本発明の目的は、ＰＢＲの過剰発現となる試薬を導入することにより、細胞内
のコレステロールの存在を増加させるか、または遺伝子治療によってコレステロ
ール相互作用／認識配列を含むペプチド中で増加させる方法、または細胞内の特
定の細胞小器官にコレステロール相互作用／認識配列を標的とさせることによっ
て（すなわち、Ｎ−末端での核挿入に特効のある信号配列を添加することによっ
て）コレステロールの分布および区画化を変化させる方法を提供することでもあ
る。

【００１７】 本発明の目的は、ＰＢＲが、その後、プレグネロンに分解され得るコレステロ
ールを放出するようにＰＢＲリガンドをステロイド産生細胞に提供することを含
む、ステロイド産生細胞中でプレグネロン産生を高める方法を提供することであ
る。あるいは、コレステロール相互作用／認識配列を含むペプチドは、ステロイ
ド産生細胞に提供でき（すなわち、遺伝子療法によって）、それによって、ステ
ロイド産生細胞中のコレステロールの存在を増やすことができ、結果として、プ
レグネロン産生を高める。

【００１８】 本発明の更なる目的は、コレステロールに結合されるＰＢＲの放出が抑制され
、それによってコレステロールのプレグネロンへの分解が抑制されるように、Ｐ
ＢＲリガンド阻害剤をステロイド産生細胞に提供することを含む、ステロイド産
生細胞中でのプレグネロン産生を低減させる方法を提供することである。あるい
は、コレステロール相互作用／認識配列を含むペプチドを使用して、細胞内で成
長するＰＢＲ受容体上の結合部位からのコレステロールを競争させることができ
る。この方法は、ステロイドの高い産生からもたらされる病気の症状（例えば、
ストレスやコウシング病(Coushing's disease)）を低減するのに有用である。

【００１９】 本発明の目的は、ＰＢＲが、その後プレグネロンに分解するのに有効でかつ全
ステロイドの前駆体として使用されるコレステロールを放出するようにＰＢＲリ
ガンドをステロイド産生細胞に提供することを含む、ステロイド産生細胞中での
ステロイド産生を高める方法を提供することでもある。

【００２０】 更に、本発明の目的は、ＰＢＲ結合コレステロールが放出されずかつコレステ
ロールが全ステロイドの前駆体であるプレグネロンに分解されないように、ＰＢ
Ｒと結合するＰＢＲリガンドを抑制する試薬を提供することを含む、ステロイド
産生細胞中でのステロイド産生を低減する方法を提供することでもある。

【００２１】 本発明の上記およびそれ以外の特徴、外観および利点は、以下の記載および添
付したクレームおよび添付の図面を参照してより十分に理解できるであろう。

【００２２】 図１は、MA-10ライディヒ細胞コレステロール輸送およびプレグネロン形成に
おけるＰＢＲリガンドの効果を示す。MA-10ライディヒ細胞からのミトコンドリ
アを、同定された化合物の存在または不存在下、³Ｈ−コレステロールと共にイ
ンキュベートした。形成される³Ｈ−プレグネロンを、マテリアルズ・アンド・
メソッドの記載通りに測定した。図に示したデータ（平均±ＳＤ）は、２〜４個
の独立した実験の代表例であり、各３通りのアッセイを有している。目に見える
効果は、どの時間においても統計学上顕著であった（Ｐ＜0.001）。

【００２３】 図２Ａ、ＢおよびＣは、バクテリア中での組換えＰＢＲの発現を示す。組換え
ｍＰＢＲ発現ベクターを発生させ、マテリアルズ・アンド・メソッドに記載の通
り、BL21（ＤＥ３）大腸菌株に形質変換するのに使用した。組換えｍＰＢＲタン
パク質の発現は、１ｍＭ ＩＰＴＧによって誘発した。 Ａ）ＰＢＲタンパク発現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、クーマシーブルー染色
またはイムノブロット分析でモニターした。１、対照；２および３、ＩＰＴＧ処
理したバクテリアの２つの異なる標本。 Ｂ）大腸菌中でのＩＰＴＧ誘発ＰＢＲの結合特異性。［³Ｈ］PH11195（1.0
Ｍ）の特異性結合は、種々のリガンドの図示された濃度の存在下で測定した。 Ｃ）［³Ｈ］PH11195のＩＰＴＧ誘発バクテリアへの特異性結合のスキャッチ
ャード表現。

【００２４】 図３は、大腸菌による³Ｈ−コレステロール摂取（uptake）の特徴。 Ａ）大腸菌による³Ｈ−コレステロール摂取は、³Ｈ−コレステロール 6.7
ｍＭ（50.0 Ｃｉ／ミリモル）の存在下、37℃で60分間インキュベートした対照
またはＩＰＴＧ処理した形質変換したバクテリアの増加する濃度を用いて試験し
た。特異性コレステロール摂取を、ＩＰＴＧ誘発マイナス基底値としてあらわし
ている。 Ｂ）バクテリア性タンパク質100μｇを用い、図示した温度で試験した³Ｈ−
コレステロール特異性摂取。 Ｃ）ＩＰＴＧ誘発変質携帯バクテリアによる³Ｈ−コレステロール摂取にお
けるエネルギー弊害の影響。 Ｄ）ＰＢＲ発現は、コレステロールのみの摂取を誘発する。バクテリアは、
図示した放射標識されたステロイドの存在下、上記と同じ条件でインキュベート
した。 Ｅ）増加する³Ｈ−コレステロール濃度の元で決定された³Ｈ−コレステロー
ル特異性摂取。 Ｆ）バクテリア性膜によって摂取されたコレステロールのリガンド誘発放出
。ＩＰＴＧ誘発された形質変換バクテリアの³Ｈ−コレステロール標識された膜
を、高濃度のPK11195またはクロナゼパムと共にインキュベートし、放出された³ Ｈ−コレステロールを定量した。示された結果は、３回行なわれた実験からの平
均±ＳＤを意味する。他の独立した３つの実験においても同様の結果が得られた
。

【００２５】 図４。ＰＢＲ作用−PK11195リガンド結合および野生型突然変異ＰＢＲで形質移
入されたバクテリアによる³Ｈ−コレステロール摂取の欠失突然変異分析。タン
パク質の発現は、ＩＰＴＧによって誘発した。左側には、ＰＢＲの５つの膜貫通
領域と、試みられた欠失の配置が示されている。右側には、PK11195リガンド結
合およびコレステロール摂取に対する各欠失効果が示されている。示された結果
は、３値平均である。PK11195リガンド結合100％は、タンパク質１ｍｇ当たり28
0±22フェムトモルに相当する。特異性コレステロール摂取100％は、タンパク質
１ｍｇ当たり1.35±0.15ピコモルに相当する。

【００２６】 図５．コレステロールの摂取に応答する特異性アミノ酸の同定。野生型点変異し
たＰＢＲで形質移入したバクテリアによる³Ｈ−コレステロール摂取（下図）。
タンパク質の発現は、ＩＰＴＧで誘発した。特異性コレステロール摂取100％は
、タンパク質１ｍｇ当たりコレステロール1.2±0.1ピコモルに相当する。³Ｈ−
コレステロール摂取を実験したバクテリアによって発現したイムノブロット分析
（上図）。示した結果は、３値平均である。

【００２７】 （詳細な説明） 一つの態様において、本発明は、コレステロールとの認識／相互作用に特異性の
最小アミノ酸配列、いわゆるアミノ酸配列 −Ｚ−(Ｘ) _0-5−Ｙ−(Ｘ)_0-5−Ｑ に関する。 [ここで、Ｚは、中性で疎水性のアミノ酸（例えば、ロイシン、バリン、アラニ
ン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニンおよびトリプトファン）を表
し、Ｙは、中性で極性のアミノ酸（例えば、チロシン、トレオニン、セリン、グ
リシン、グルタミン、システイン、アスパラギン）を表し、Ｑは、塩基性アミノ
酸（例えば、アルギニン、リジンまたはアルギニン(arginine)）を表し、および
Ｘは、アラニン（Ala、Ａ）、アルギニン（Arg、Ｒ）、アスパラギン（Asn、Ｎ
）、アスパルチン酸（Asp、Ｄ）、システイン（Cys、c）、グルタミン（Gln、Ｑ
）、グルタミン酸（Glu、Ｅ）、グリシン（Gly、Ｇ）、ヒスチジン（His、Ｈ）
、イソロイシン（Ile、Ｉ）、ロイシン（Leu、Ｌ）、リジン（Lys、Ｋ）、メチ
オニン（Met、Ｍ）、フェニルアラニン（Phe、Ｆ）、プロリン（Pro、Ｐ）、セ
リン（Ser、Ｓ）、トレオニン（Thr、Ｔ）、トリプトファン（Trp、Ｗ）、チロ
シン（Tyr、Ｙ）およびバリン（Val、Ｖ）から成る郡より選択されるいずれのア
ミノ酸も表す。]

【００２８】 例えば、本発明の配列としては、以下のものが挙げられる。

【化１】

【化２】

【００２９】 アミノ酸の数Ｘは、アミノ酸０〜５、好ましくは１〜５、より好ましくは２〜
５、そして最も好ましくは３〜５であり得る。このアミノ酸は、コンセンサス配
列の適正な折りたたみを提供して、認識／相互作用部位を生成するように作用す
る。ここにおいて、全ペプチドは、ＮＨ₂...ＣＯＯＨで書かれ、アミノ酸は、天
然起源のＬ異性体である。

【００３０】 特別な理論に拘束されることなく、研究は、Ｚ部のロイシンまたはバリンが、
コレステロールの疎水性側鎖と相互作用し、Ｙ部のチロシンが、コレステロール
の極性3'ＯＨ基と相互作用するが、Ｑ部のアルギニンまたはロイシンは、ポケッ
トを形成するのに役立つということを示している。

【００３１】 このコレステロール認識／相互作用アミノ酸配列コンセンサスパターンが、コ
レステロールと相互作用することが分かったまたは示された分子[例えば、下表
１に示すようなアポリポタンパク質Ａ−１（ボイル・ティ・ピーおよびマロッテ
ィ・ケイ・アール著、1992年、遺伝子(Gene)117、第243頁〜第247頁）、カベオ
リン（ムラタ・アムら著1995年、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンスＵＳＡ92、第10339頁〜第10343頁）、ＤＢＩ（パパド
ポーラス・ヴイ1993年、エンドクライン・レヴュー14、第222頁〜第240頁；パパ
ドポーラス・ヴイ1998年、プロシーディングズ・オブ・ソサイエティ・フォア・
エキスペリメンタル・バイオロジー・アンド・メディスン217、第130頁〜第142
頁）、ステロイド産生急性調節タンパク質（ＳｔＡＲ）（ストッコ・ディ・エム
およびクラーク・ビー・ジェイ著1996年、エンドクライン・レヴュー17、第221
頁〜第244頁）、ヘッジホッグタンパク質（ポーター・ジェイ・エイら著1996年
、サイエンス274、第255頁〜第259頁）、チトクロムP450 C26/25（スー・ピー
ら著1990年、ＤＮＡセル・バイオロジー9-657-667）、アネキシンII（ハーダー
・ティら1997年、モレキュラー・バイオロ.・セル8、第533頁〜第545頁）、ステ
ロールキャリアータンパク質−２（コールズ・エス・エムら著1995年、リピッズ
30、第795頁〜第803頁）、コレステロール７α-モノオキシゲナーゼ（カイ・エ
ムら著1995年、リピッド・レス.36、第367頁〜第374頁）、コレステロールオキ
シダーゼ（イシザキ・ティら著1991年、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー17
1、第596頁〜第601頁）、コレステロールデヒドロゲナーゼ（ホリノウチ・エス
ら著1991年、アプライド・アンド・エンヴァロンメンタル・マイクロバイオロジ
ー57、第1386頁〜第1393頁）、胆汁酸塩活性化リパーゼ前駆体（コレステロール
エステラーゼ）（ニルソン・ジェイら著1990年、ヨーロピアン・ジャーナル・オ
ブ・バイオケミストリー192、第543頁〜第550頁）、およびアシル-ＣｏＡコレス
テロールアシルトランスフェラーゼ（ペペ・エム・イーら著1995年、ジャーナル
・オブ・リピッド・レス.36、第823頁〜第838頁）]中に見出された。

【００３２】 表１：コレステロール認識／相互作用アミノ酸コンセンサスパターンの同定

【表１】

【表２】

【００３３】 表１に挙げたタンパク質中のコレステロール相互作用／認識コンセンサス配列
の存在は、タンパク質が、コレステロールと相互作用して、どのようにしてこの
タンパク質がコレステロールと協力して機能を発揮するか、およびこの機能をど
のように変化させるかを見抜く洞察力を提供する可能性を示している。例えば、
アネキシンの場合、様々な細胞に重要なカルシウム−リン酸脂質／コレステロー
ルアクチン結合タンパクが機能する（すなわち、細胞膜形状やプラズマ膜成分の
内部移行を促進する安定性を維持することから、アネキシンのコレステロール認
識／相互作用部位の変更が、細胞骨格の不安定化および崩壊をもたらし得る）。
このことは、腫瘍細胞成長を標的として破壊するのに有用な方法であることがあ
った。

【００３４】 本発明の説明を概説することにより、コレステロールを相互作用／認識するタ
ンパク質の能力が低減、向上または完全に無くなるようにコレステロール認識／
相互作用コンセンサス配列が変更された変異体タンパク質をデザインすることは
、当該分野における通常の知識を有する者の技術範囲内であろう。この変異体に
関する実験は、このタンパク質の変更、低減および向上された機能と関連する病
気の治療、あるいは所望の目的に対し、コレステロール認識／相互作用機能を変
更するための、コレステロールと相互作用する能力により特異性タンパク質を標
的とする方法も提供する。

【００３５】 この開示を概説することにより、タンパク質がコレステロールと相互作用する
かあるいはコレステロールを認識するか否かを決定できることが、当該分野にお
ける通常の知識を有する者には明白であろう。この知識は、特異性タンパク質が
どのように機能するかまたは調整されるかを見ぬく洞察力（分かるか見出すかは
どちらでもよい）を提供するであろう。

【００３６】 別の態様において、本発明は、アミノ酸配列または前記ペプチドをコード化す
るヌクレオチド配列を提供する。上記コンセンサス配列のアミノ酸を特異化する
コドンに相当するヌクレオチドは当業者に既知である。この配列は、例えば、以
下のものが挙げられる。 Leu Asn Thr Cys Val Trp Arg（配列ＩＤ番号：７）

【００３７】 前記コレステロール相互作用／認識アミノ酸コンセンサス配列をコード化する
核酸分子の発現は、当該分野における通常の知識を有する者には、ごく普通のこ
とである。本発明の核酸分子は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態またはＤＮ
Ａ（例えば、クローン化によって得られるかまたは合成上生成されるｃＤＮＡお
よびゲノムのＤＮＡを含む）の形態であってよい。ＤＮＡは、二本鎖でも一本鎖
であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、有意鎖(sense strand)としても
知られる有意鎖(coding strand)であってよく、または反意鎖とも呼ばれる非翻
訳鎖であってもよい。化学変性されかつ置換された核酸（例えば、変性ヌクレオ
チド塩基を組み込むか、または標識群を組み込んだもの）も包含される。

【００３８】 核酸は、単離され得る。「単離される」ことによって、自然界から取り除かれ
た核酸分子ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。例えば、ベクター中に含まれる組換
え型ＤＮＡ分子は、本発明の目的のために単位されると考えられる。単離された
ＲＮＡ分子は、本発明のＤＮＡ分子の生体内または生体外のＲＮＡ転写物を包含
する。本発明の単離された核酸分子は、合成上産生される分子も包含する。 この単離された核酸分子は、生体試料中でこのコンセンサス配列を含む遺伝子
を、例えば、ＰＣＲ、サザンブロット、ノーザンブロット、またはモレキュラー ・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル 、第二編、サンブロック・ジェ
イ・フリッシュ・イー・エフおよびマニアチス・ティ編；コールド・スプリング
・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニュー
ヨーク（1989年）、またはＤＮＡクローニング、第ＩおよびII巻（ディ・エヌ・
グローヴァー編、1985年）または一般的なクローン化法としてのカレント・プロ トコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー アウスベル・エフ・エムら（編集
）ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・インコーポレイテッドに記載のハイブリ
ッド形成分析の他の形態で検出するためのプローブに有用である。本明細書で引
用する文献の開示全てを、参照としてここに挿入する。典型的な核酸プローブは
、コンセンサスアミノ酸配列から調製され得る。特に、プローブは、比較的低レ
ベルの縮重（すなわち、そのためにコード化するのが可能な核酸配列数個または
１個）を有するアミノ酸配列のセグメントに基づいて調製され得る。このプロー
ブは、相補的な配列の同定および配置を容易にする検出可能な集団を含んでいて
よい。

【００３９】 ｃＤＮＡまたは種々の型のゲノムのライブラリーが、このプローブを用いて、
新規対立遺伝子または相対配列についてスクリーニングされ得る。ファージまた
はプラスミドのライブラリーも使用してよい。

【００４０】 本発明のコンセンサス配列を有するペプチドをコード化するセグメントを含む
他に、本発明の核酸は、遺伝子が発現して融合タンパク質として２個のタンパク
質を産生するように、異種タンパク質をコード化するセグメントも含んでいてよ
い。

【００４１】 本発明のアミノ酸コンセンサス配列をコード化する本発明の核酸分子は、単独
でコンセンサスのアミノ酸配列をコード化するもの；および別のアミノ酸につい
てコード化する別のコード配列（例えば、別の機能性を提供するもの）を包含す
るが、これらに限定されない。従って、このコンセンサス配列をコード化する配
列は、融合ポリペプチドの精製を促進するペプチドをコード化する配列のような
マーカー・ソーエンス(a marker seuence)と融合されてもよい。

【００４２】 プローブとしてのその使用に加えて、本発明の核酸は、本発明のコンセンサス
アミノ酸配列を有するペプチドの調製にも使用できる。

【００４３】 本発明のコンセンサスアミノ酸配列を有するペプチドをコード化するＤＮＡは
、通常、生体外細胞培養への導入および生体外細胞培養での発現が可能なＤＮＡ
作成物中に組み込まれるであろう。本発明の核酸は、好適な組換え型ホスト細胞
を産生するのに使用されることもある。具体的には、ＤＮＡ作成物は、バクテリ
ア（例えば、大腸菌）のような単細胞ホスト中での複製に適しているが、培養さ
れる哺乳類、植物、昆虫または真核生物株化細胞中への導入も意図され得る。バ
クテリアまたはイースト菌への導入のために調製されるＤＮＡ作成物は、通常、
ホストで認識される複製系、所望のポリペプチドをコード化する意図されるＤＮ
Ａセグメント、セグメントをコード化するポリペプチドと操作できるように結合
された転写および翻訳開始および停止制御性配列を包含する。ＤＮＡセグメント
は、別のＤＮＡセグメントと機能的な関係に置かれると、操作できるように結合
される。例えば、プロモーターまたはエンハンサー（転写促進因子）が、配列の
転写を刺激すると、コード配列と操作できるように結合される。信号配列に関す
るＤＮＡが、ポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現される
と、ポリペプチドをコード化するＤＮＡと操作できるように結合される。一般に
、操作できるように結合されるＤＮＡ配列は、隣接しており、信号配列の場合に
は、隣接しかつ読み相中にある。しかし、エンハンサーは、転写を制御するコー
ド配列と隣接している必要はない。結合は、便利な限定部位での核酸連結、また
はその場所に挿入されるアダプターもしくはリンカーによって達成される。好適
なプロモーター配列の選択は、一般には、ＤＮＡセグメントの発現のために選択
されるホスト細胞に依存している。好適なプロモーター配列の例としては、当該
分野で既知の原核生物および真核生物プロモーターが挙げられ、trp、lacおよび
ファージプロモーターのようなプロモーターも包含され、ｔＲＮＡプロモーター
および糖分解酵素プロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６
プロモーター、ＳＶ40プロモーター、ＣＭＶプロモーターおよびMoMLVLTRが既知
でかつ入手可能である。サンブロックら著1989年、上記文献を参照せよ。転写性
制御配列は、通常、ホストによって認識される異種エンハンサーまたはプロモー
ターを包含する。

【００４４】 本発明に有用な発現ベクターとしては、染色体−、エピソーム−およびウィル
ス−由来のベクター（例えば、バクテリア性プラスミド、バクテリオファージ、
イーストエピソーム、イースト染色体要素、バキュロウィルス、パポーバウィル
ス、ワクシニアウィルス、アデノウィルス、伝染性上皮種ウィルス、オーエスキ
ー病ウィルスおよびレトロウィルスのようなウィルス由来のベクター、およコス
ミドおよびファージミドのようなそれらの組み合わせに由来するベクター）が挙
げられる。

【００４５】 複製系および転写および翻訳制御配列を、コンセンサス針列ペプチドコード化
セグメントのための挿入部と共に包含する従来より入手可能な発現ベクターを使
用してよい。ベクターのうち、バクテリアに使用するのに好ましいものは、市販
のｐＢＳベクター、ファージスクリプトベクター、ブルースクリプトベクターで
ある。好ましい真核生物ベクターは、シュトラタゲーンから入手可能なpSV2CAT
、pWLNEO、およびファーマシアから収入可能なpSVK2、pMSGである。pETベクター
、およびpWT15nb、pZeoSV2、pCMV等のような他の好適なベクターは、当業者には
容易に理解できるであろう。株化細胞および発現ベクターの作業可能な組み合わ
せの例は、サンブロックら著およびメッツガーら著、ネイチャー334、第31頁〜
第36頁に記載されている。例えば、昆虫ホスト細胞が、ポリペプチドを発現する
選び抜かれたホスト細胞として選択される場合、本発明のポリペプチドをコード
化するｃＤＮＡは、バキュロウィルス発現ベクター（pV-IKS）へクローン化され
得る。次に、組換え型バキュロウィルスを使用して、好適な昆虫ホスト細胞（例
えば、その後、ポリペプチドを発現し得るSF9細胞）を形質移入してよい。ディ
・ディ・モリソンら著、セル58、第649頁〜第657頁、1989年、エム・エヒ・サマ
ーおよびジー・イー・スミス著、ア・マニュアル・オブ・メソッズ・フォア・バ キュロウィルス・ヴェクターズ・アンド・インセクト・セル・カルチャー・プロ セデュアー 、テキサス・アグリカルチュラル・ステイション、カレッジ・ステー
ション、テキサス州、1987年を参照せよ。

【００４６】 重要なＤＮＡセグメントを含有するベクター（例えば、本発明のコンセンサス
配列を含むペプチドをコード化するもの）は、周知の方法でホスト細胞に形質移
入でき、その方法は、使用されるホストの種類に依存して変えてよい。例えば、
塩化カルシウム形質移入は、通常、原核生物細胞に使用され、リンＳナンカルシ
ウム処理は、他のホストに使用され得る。ホスト細胞中への作成物の導入は、Ｄ
ＥＡＥ−デキストラン媒介形質移入、カチオン脂質媒介形質移入、電気穿孔法、
伝達、感染または他の方法によってもたらされ得る。ディビスら著、ベイシック ・メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー 、1986年を参照せよ。ここで、
「形質転換された細胞」は、元々形質転換された細胞の子孫を包含する。

【００４７】 もう一つの態様において、本発明は、本発明のコレステロール相互作用／認識
コンセンサス配列を含むベクターによって安定に形質移入された細胞を提供する
。ここで使用される「形質移入された」とい用語は、核酸または核酸ベクターを
細胞へ導入するプロセスを行なった細胞をいう。微量注入、ＣａＰＯ₄沈降、リ
ポフェクション（リポソーム融合）、電気穿孔法、およびジーンガン(gene gun)
の使用を包含する、細胞を形質移入する様々な方法が可能である。ここで、「安
定な」とい用語は、統合して、細胞中の遺伝子物質の恒久成分となる、標的とさ
れる細胞の染色体への遺伝子の導入をいう。前記コンセンサス配列を含むペプチ
ドを有するベクターを含有する形質移入された細胞だけが、過渡的に形質移入で
き、ペプチドの過渡的な発現となる。ここで、「過渡的」という用語は、ペプチ
ドを含有するコレステロールコンセンサスを発現する細胞への遺伝子の導入をい
い、導入されるＤＮＡは、ホスト細胞ゲノムへ統合されず、そのため、時間とと
もにホスト細胞から除去される。過渡的な発現は、過渡的な形質移入の間の生成
物の発現に関する。エピソーム形質移入は、導入される遺伝子が、ホスト細胞染
色体に組み込まれないが、むしろ、染色体外の要素として複製される、安定な形
質移入の変態である。これは、細胞の特徴の見掛け上安定な形質移入を導くこと
がある。

【００４８】 細胞は、選択可能なマーカーを含有するベクターで形質移入されても、所望の
選択可能なマーカーを含有する別のベクターで同時形質移入されてもよい。この
選択可能なマーカーは、形質移入された細胞を選択するのに使用される。使用で
きる選択可能なマーカーの種類は、当業者には周知である。

【００４９】 更なる態様において、本発明のコレステロールコンセンサス配列を含むペプチ
ドが細胞面ペプチドとして発現される、形質移入された細胞が提供される。「細
胞面」ペプチドは、細胞膜全体または部分的に広がって、細胞の表面上に露出さ
れたペプチドを意味する。本発明のコレステロールコンセンサス配列を含むペプ
チドは、分泌ペプチドとして発現され得る。「分泌ペプチド」は、細胞膜と関連し
ないが、むしろ、細胞外環境または他の細胞区分への分泌において細胞内で生じ
るペプチドを意味する。

【００５０】 本発明のコンセンサスアミノ酸配列を含むペプチドは、回収されて、組換え型
細胞培養から周知の方法で精製でき、例えば、硫酸アンモニウムまたはエタノー
ル沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、リン酸セル
ロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティ
クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンク
ロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が、精製
のために使用される。本発明のポリペプチドは、自然に精製された生成物、化学
合成手順の生成物、および原核生物または真核生物ホストから組換え技術により
産生される生成物（例えば、バクテリア、イースト、高級植物、昆虫および哺乳
類の細胞）を包含する。

【００５１】 更なる好ましい態様は、コレステロール相互作用／認識コンセンサス配列核酸
を含有する遺伝子組換え動物を提供する。コンセンサス配列は、ベクター単独で
、または遺伝子の一部として表され得る。「遺伝子組換え動物」とは、上述およ
び当該分野において既知の通り、そのゲノムが、別のコピー、または遺伝子操作
またはクローン化技術によって導入される同一種または別の種からの所望の遺伝
子のコピーを含有する動物を意味する。遺伝子組換え動物は、ベクターが、発達
した動物またはその動物の子孫から胚に挿入されて得られる動物を包含し得る。
ここで、「子孫」は、遺伝子組換え動物の直接的な子孫と同様に、後続の子孫の
子孫を包含する。すなわち、当業者は、２つの異なる遺伝子組換え動物が異なる
遺伝子をそれぞれ用いて作られて掛け合わされた場合、得られる子孫の幾つかは
２以上の導入された遺伝子を含むという可能性が存在することを容易に認識でき
るであろう。当業者は、交配を制御することにより、多数の導入された遺伝子を
含む遺伝子組換え動物が作成できることを容易に認識するであろう。この遺伝子
組換え動物は、遺伝子組換え動物中でのコレステロール相互作用、認識、摂取お
よび代謝における薬理学的効果における化合物のスクリーニングに有用である。

【００５２】 更なる態様において、本発明は、遺伝子組換え昆虫を提供する。ＰＢＲが昆虫
に見出され、かつ哺乳類のＰＢＲと異種同形であることは、研究により示されて
いる。そのため、当該分野に既知の方法を用いて、コレステロールを認識するか
またはコレステロールと相互作用するＰＢＲの能力が、無くなるまたは低減され
る、あるいは別のコレステロール相互作用／認識配列を導入することによってス
テロイド産生を高めるように、前記ゲノムＰＢＲ配列中に突然変異を導入するこ
とができる。ＰＢＲを介してのコレステロールの摂取を制御することによる昆虫
内でのステロイドの産生を制御する能力は、昆虫の複製を制御する有力な方法を
表す。

【００５３】 本発明のもう一つの態様では、ゲノム内に、コレステロール相互作用／認識配
列または変更されたコレステロール相互作用／認識配列をコード化する核酸を含
む遺伝子組換え植物であって、コレステロール相互作用が低減されるか、無くな
るか、または向上される、遺伝子組換え植物が提供される。コレステロール相互
作用／認識配列は、単独でまたは遺伝子の一部として、あるいはベクター単独で
、または遺伝子の一部として搬送され得る。証拠は、植物中のＰＢＲ受容体が、
哺乳類のＰＢＲと同様に機能し、配列内で異種同形であることを示している。従
って、本発明のもう一つの観点は、ゲノム内に、変更されたコレステロール認識
／相互作用配列でＰＢＲをコード化する核酸を遺伝子作成物を含む遺伝子組換え
植物を提供することであり、その場合、コレステロールと相互作用し、かつおよ
びそれを細胞中に運搬するＰＢＲの能力が、低減されるか、無くなるかまたは向
上し、それによって細胞内でのコレステロールの摂取が低減されるか、無くなる
かまたは向上し、および／または遺伝子組換え植物内でのステロイドの産生が低
減されるか、無くなるかまたは向上する。この方法は、植物内でのコレステロー
ルレベルを調製する機会、並びに栄養物摂取または他の目的に必要なカルデノイ
ド等のような特異性植物ステロイドを与え得る。調査により、遺伝子組換え植物
が、通常のメンデル遺伝によって挿入された遺伝子がその子孫に変化し得ること
が示されている（クリストーら著1990年、トレンズ・イン・バイオテクノロジー
８、第145頁〜151頁）。挿入された遺伝子作成物を受け継ぐ子孫植物はいずれも
、ここで使用する用語の通り、遺伝子組換え植物でもある。

【００５４】 遺伝子組換え植物の産生は、当該分野では既知である。例えば、1999年2月9日
発効の米国特許第5,869,720号（ジョン・エム・イー）および1999年2月12日発行
の米国特許第5,859,347号（ブラウンら）を参照せよ。両方の特許の開示内容を
、参照としてここに挿入する。

【００５５】 簡単には、所望の核酸は、所望の植物種への形質転換に適した植物形質転換ベ
クターに挿入され得る。好適な植物形質転換ベクターは、アグロバクテリウム属
腫大物のＴｉプラスミド由来のものを包含する。植物形質転換ベクターは、好ま
しくは、植物または植物細胞の形質転換に要する必要な要素を全て包含する。特
異性植物組織は、果実、繊維、根などの中での発現に特異的なプロモーターを用
いて標的にされ得る。使用されるプロモーターは、エクダイソンのような植物ホ
ルモンによって、テトラサイクリンのような構成物質によって、ヒートショック
要素のような温度変化によって誘発され得る。典型的な植物転換ベクターは、選
択可能なマーカー遺伝子、T-ＤＮＡ境界の一方または両方、クローン化部位、接
合体の同定を促進する適切なバクテリア遺伝子、広いホスト領域複製および可動
化機能、および上述の他の要素を含む。

【００５６】 植物細胞の形質変換は、形質変換ベクターの搬送、またはベクターで植物組織
内に塗布された高粘度微粒子を含む粒状ガンの使用による遊離ＤＮＡの搬送によ
って作用され得る。形質変換される植物細胞の選択、および植物全体への再生は
、通常の手順を用いて行なわれてよい。例えば、電気穿孔法、または遊離核酸摂
取を向上する化学のような、所望の遺伝子または核酸を植物細胞中に挿入できる
他の形質変換技術も使用してよい。遺伝子組換え植物を再生するのに好適な方法
の例証となる例としては、トウモロコシ（フロムら著1990年、バイオ／テクノロ
ジー8：第833頁〜第839頁；およびゴードン-カムら著1990年、ザ・プラント・セ
ル2：第603頁〜第618頁）；米（ワングら著1988年、プラント・モレキュラー・
バイオロジー11：第433頁〜第439頁）および小麦（ヴェイシルら、バイオ／テク
ノロジー8：第743頁〜第747頁）。

【００５７】 一つの観点において、形質転換または形質移入される細胞は、コンセンサス配
列およびコレステロールまたはその誘導体と相互作用、認識または結合するこの
配列の変異体を含むポリペプチドの能力を変えるスクリーニング剤または薬に有
用である。化合物、薬または試薬が、本発明のコンセンサス配列を含むポリペプ
チドの、コレステロールと相互作用する能力の作用物質または拮抗剤であるかど
うかを決定する生体外系をデザインすることができる。本発明のコンセンサス配
列を含むポリペプチドは、コレステロールと共に、コレステロールとコンセンサ
ス配列を含むペプチド間の相互作用が生じる条件下（すなわち、塩ｐＨ、脂質、
イオン）でインキュベートすることができる。次いで、複合体を試験化合物と共
にインキュベートしてよい。その後、ポリペプチドとコレステロール間の相互作
用を測定することができる。特定の化合物に対応する、ポリペプチドとコレステ
ロール間の相互作用レベルの向上または低下は、化合物がそれぞれその結合の作
用物質または拮抗剤であることを示す。

【００５８】 同様の試験を、コレステロール相互作用／認識コンセンサス配列を含むポリペ
プチドを発現する細胞に投与することができる。コレステロール相互作用に最も
効果的なｐＨと温度が好ましく使用されるが、病気に対して提案される治療に関
する特定の薬の効果を試験するために、病気にかかった細胞内に見出される条件
を複製することもできる。

【００５９】 試験化合物は、化学化合物、化学化合物の混合物、生物学上の高分子、または
生物学的物質（例えば、バクテリア、植物、菌、または動物細胞もしくは組織）
からの抽出物であってよい。

【００６０】 本発明の方法の多くにおいて、本発明のポリペプチドと核酸は、スクリーニン
グおよび検出を促進するために、検出可能な集団と共有的に付着または結合して
いてよい。有用な検出可能な集団または標識は、一般に、当該分野で周知である
。例えば、検出可能な集団は、放射標識（例えば、¹²⁵Ｉ、³²Ｐまたは³⁵Ｓ、あ
るいは蛍光または化学ルミネッセンス群）されていてよい。または、検出可能な
集団は、基質、補助因子、阻害剤、アフィニティリガンド、抗体結合エピトープ
タグ、またはアッセイできる酵素であってよい。好適な酵素としては、例えば、
セイヨウワサビのペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、または別の容易にアッセ
イ可能な酵素が挙げられる。この酵素群は、化学手段によって前記コンセンサス
配列を含むポリペプチドと付着していても、既に記載したような融合タンパク質
として発現されてもよい。

【００６１】 別の態様では、本発明は、生物学的試料におけるコレステロールもしくはコレ
ステロールの誘導体の存在、不存在、増加または低下を検出方法を提供する。こ
れは、数通りで行なうことができ、例えば、ある場合には、コンセンサス配列を
含むポリペプチドを固体支持体（例えば、マイクロタイター穴、またはニトロセ
ルロース膜）上に固定化することが有用であることがある。アッセイされる試料
は、固定化ポリペプチドに曝露して、コレステロール結合したポリペプチドの数
を測定する。

【００６２】 また、本発明は、固体支持体上に、コレステロール相互作用／認識配列を含む
ペプチドと相互作用し得るコレステロールまたはコレステロール誘導体を塗布し
、コレステロールまたはその誘導体を、本発明のコンセンサス配列を含むポリペ
プチドを含有する試料に曝露して、コレステロール結合したポリペプチドを検出
することにより、本発明のコンセンサス配列を含むポリペプチドの存在を検出す
る方法も提供する。コレステロールまたはコレステロール誘導体のレベルの、適
切な対照に比べた増加または低下の検出が必要であることがある。

【００６３】 固体支持体としては、アガロースセルロース、デキストリン、セファデックス
(Sephadex)、セファロース(Sepharose)、カルボキシメチルセルロース、ポリス
チレン、濾紙、ニトロセルロース、イオン交換樹脂、プラスチックフィルム、ガ
ラスビーズ、ポリアミンメチルビニルエーテル−マレイン酸コポリマー、アミノ
酸コポリマー、エチレン−マレイン酸コポリマー、ナイロン絹などが挙げられる
。支持体は、例えば、試験管、マイクロタイタープレート、ビーズ、試験片等の
形状であってよい。コレステロールまたはポリペプチドを含む固体支持体の反応
は、当該分野において周知の方法で行なってよい。

【００６４】 「生物学的試料」とは、動物、株化細胞、組織培養、植物、昆虫、またはコレ
ステロールまたはその誘導体あるいはコレステロール相互作用／認識ポリペプチ
ドｍＲＮＡまたはＤＮＡを含んでいてよい他の源から得られる生物学的試料をい
ずれも意図する。生物学的試料としては、体液（例えば、唾液、血液、血漿、尿
、粘液、関節液等）、組織（例えば、筋肉、皮膚および軟骨）、およびコレステ
ロールまたはコレステロール誘導体、あるいはコレステロール結合ポリペプチド
または核酸を含有し得る他の生物学上の源が挙げられる。組織のような生物学的
試料を得る方法は、当該分野では周知である。

【００６５】 別の態様において、本発明は、タンパク質がコレステロールまたはコレステロ
ール誘導体を認識するかまたはそれと相互作用するか否かを確認する方法を提供
し、この方法は、以下のじっしれに記載する通り、道のタンパク質のコレステロ
ール認識／相互作用アミノ酸配列を分析することによって上記コレステロール認
識／相互作用コンセンサスの存在または不存在を確認することを含む。本発明の
アミノ酸配列の存在は、タンパク質がコレステロールまたはコレステロール誘導
体を認識／相互作用する見込みの示唆である。

【００６６】 もう一つの態様において、本発明は、分子に、コレステロール認識／相互作用
配列によって認識されるコレステロールまたはコレステロール誘導体と相互作用
する能力を与える方法を提供する。コレステロールの相互作用／認識に関するコ
ンセンサス配列が解明されたことから、分子またはポリペプチドに、天然または
合成のコレステロール認識／相互作用配列を、天然または合成のタンパク質また
はポリペプチドが、コレステロールまたはコレステロール誘導体とコレステロー
ルを認識／相互作用できるように導入することが可能である。コンセンサス配列
は、コンセンサス配列をコード化するヌクレオチド配列を、分子における遺伝子
の一部に挿入することによってＤＮＡまたはＲＮＡレベルで導入できるので、コ
ンセンサス配列が、分子に添って翻訳され、それが合わさって融合タンパク質が
形成される。好ましくは、コンセンサス配列は、遺伝子生成物の第２および第３
の折り畳みがコレステロールとコンセンサス配列との相互作用を抑制しないよう
に、遺伝子のアミノまたはカルボキシ末端に挿入される。融合タンパク質は、そ
の相互作用／認識能力、またはコレステロールもしくはコレステロール誘導体を
結合する能力を試験することができる。この融合タンパク質は、治療または診断
に使用され得る。コレステロール相互作用／認識配列がその中に望まれる分子は
、天然であっても、合成であってもよい。

【００６７】 また、別の態様では、本発明は、コレステロールを認識／相互作用する前記コ
レステロール認識／相互作用コンセンサスを含むペプチドのコレステロール相互
作用／認識能力をブロックする分子を提供する。この分子は、抗体、ペプチドま
たは薬で有り得る。ペプチドを用いた抗体産生は当該分野では周知である（例え
ば、サトシッフェら著、サイエンス219、第660頁〜第666頁、1983年；ウィルソ
ンら著、セル37、第767頁〜第778頁、1984年、およびビットルら著、ジャーナル
・オブ・ゼネラル・ヴィロロジー66、第2357頁〜第2354頁、1985年）。ここで使
用するように、「抗体（ＡＢ）」または「単クローン性抗体（ＭａＢ）」という
用語は、完全な分子、単鎖全抗体および抗体フラグメントを包含することを意味
する。本発明の抗体フラグメントは、ＦａｂとＦ（ａｂ’）２、および単鎖Ｆｖ
ｓ（ｓｃＦｖ）とジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）を含む他のフラグメント
を包含する。本発明において、キメラおよびヒト化単クローン性抗体、および本
発明のポリペプチドに特異性のポリクローナル抗体である。本発明の抗体は、種
々の方法で調製され得る。例えば、本発明のポリペプチドを発現する細胞または
その抗体フラグメントを、多官能抗体を含有する血清の産生を誘発させるために
動物に投与することができる。単クローナル抗体は、当該分野で既知のハイブリ
ドーマ技術を用いて調製できる（例えば、ハーローら著、アンチボディーズ：ア ・ラボラトリー・マニュアル （コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
・プレス第二篇、1988年を参照せよ）。また、本発明のポリペプチド抗原と結合
し得る抗体は、抗イディオ型の抗体の使用により産生されてよい。この方法は、
抗体は、抗原自体であること、およびそのため、別の抗体と結合する抗体を得る
ことができることという事実の使用に役立つ。

【００６８】 さらに、コレステロール相互作用／認識ペプチドは、生体内で結合するコレス
テロールと相互作用する小さな分子を作成するのに有用であることがある。特に
、当該分野で既知のＸ線結晶法によって決定され得る、既知のアミノ酸配列から
のコレステロール相互作用／認識ドメインの構造およびその立体構造は、合成類
似物、コレステロール誘導体、および特別なコレステロール相互作用／認識ドメ
インの擬態を生じさせるときに適用され得る。合成要素は合わせて、その類似に
基づいて、コレステロール相互作用／認識ドメインの構造上観点および化学的観
点と結び付けられてよい。そのような擬態、類似物および誘導体は、ペプチドま
たは遺伝子産生物と結合するコレステロールからもたらされる特異性機能をブロ
ックするかまたは抑制するのに使用され得る。この機能は、コレステロールにつ
いての役割が、ほんの少し例を挙げれば、細胞情報伝達、細胞増殖、遺伝子制御
、細胞骨格の固着と安定、中性伝達、繁殖性、ストレス、糖尿病、脳卒中に影響
を及ぼしていることため、変更でき、また本明細書中で説明した方法により治療
処置としても有用で有り得る。

【００６９】 本発明は、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体を含むバイオ
素子およびバイオセンサーの両者、およびその使用の方法を包含する。本発明の
ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体を含むバイオ素子は、生物学的また
は環境上の試料中でその存在を検出して、ヒトを含む動物を診断するのに使用さ
れ得る。バイオ素子技術を用いてそれを検出する、本発明のポリヌクレオチドの
方法および特定の使用は、当該分野で既知のもの、および米国特許第5510270号
、同第5677195号、同第5607646号、および国際特許出願国際公開第WO97/10365号
、同第WO97/43447号に記載のものを包含し、これら公報に記載の各内容を全てこ
こに挿入する。

【００７０】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体を含むバイオセンサーも
、検出、モニターおよび診断するのに使用されてよい。バイオセンサーを用いた
方法および本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体の特定の使用と
しては、当該分野で既知のもの、および米国特許第5721102号、同第5658732号お
よび国際特許出願国際公開第WO97/35011号、同第WO97/20203号に記載のものを包
含し、これら公報に記載の各内容を全てここに挿入する。

【００７１】 別の態様では、本発明は上記コレステロール認識／相互作用(recognition/int
eraction)コンセンサスを含有する分子のコレステロール結合能を変換する方法
であって、コレステロール認識を減少し、除去しまたは増大するように上記サイ
トを変更することからなる。コレステロール認識の増大は、コレステロールポケ
ットが完全に形成され、または分子中に新しいまたは別のコレステロール認識／
相互作用配列を導入する時に、起こる。我々は、コレステロールを認識あるいは
相互作用する能力のないあるいは少ないＰＢＲを、ＰＢＲのコレステロール認識
／相互作用部位を変性すること、例えばアミノ酸１５３をチロシンからセリンに
変更したり、アミノ酸１５５をアルジニンからルイシンに変更することによって
製造することを可能にした。これらの変性は、ＰＢＲを表わす群およびＰＢＲ以
外のコンセンサス配列を含有するタンパク質において同様の結果をもたらす。従
って、本発明のペプチドコンセンサス配列を有するポリペプチドのコレステロー
ル認識／相互作用能をコンセンサス配列中のチロシンをセリンに変え、他の部分
は変えない、例えばコンセンサス配列のアルジニンをルイシンに変えて、他の部
分は変えないことにより変更することが可能であろう。

【００７２】 ＰＢＲ上に発見されたコレステロール相互作用／認識部位のためのコンセンサ
ス配列は本発明中に記載した。ミトコンドリア部位におけるＰＢＲの存在に加え
て、ＰＢＲはプラズマ膜（オーク（Oke）、O. B. et al．１９９２、Mol. Cell.
Endocr. ８７；Ｒ１−Ｒ６；ガーニア（Garnier）、M. ら、１９９３、Endocri
nology １３２；４４４）および核膜部分（ハードウィック（Hardwick）、M.ら
、１９９９、キャンサー・リサーチ５９；８３１−８４２）に存在する。この出
願においてリポートされた結果は、受容体のカルボキシ末端がコレステロールの
相互作用およびその後の摂取に関連することを示す。コレステロールはリガンド
が受容体のアミの末端部分に一旦結合したら、受容体から離れる。ミトコンドリ
アの場合には、コレステロールは内部ミトコンドリア膜に放出され、そこでｐ４
５０sccと相互作用に用いられ、解離して、ステロイド産生細胞中にプレグネノ
ロンを製造する。プレグネノロンはステロイドの前駆体である。

【００７３】 従って、本発明は受容体、ＰＢＲからの放出を抑制することにより細胞の膜中
でのコレステロールを増大する方法を提供する。また、ＰＢＲに結合するＰＢＲ
リガンドを抑制する薬剤を導入することにより、ＰＢＲからのコレステロールの
放出を抑制し、細胞内のコレステロールの存在を減少する方法も提供する。

【００７４】 別の態様では、本発明は別のＰＢＲリガンドを導入して、コレステロールをＰ
ＢＲから放出することにより細胞内部でのコレステロールの存在を増大する方法
も提供する。

【００７５】 ステロイド産生細胞中においては、ＰＢＲからのリガンド結合によるコレステ
ロール放出の増大は、プレグネノロン生成の増大をもたらす。従って、ＰＢＲリ
ガンドをステロイド産生細胞中に導入することにより、ＰＢＲがコレステロール
を放出し、それがプレグネノロン中への解離のために有効に利用されることから
なるプレグネノロン生成を増大する方法を提供する。ペプチドを特定のステロイ
ド生成細胞にターゲットすることが、それを生成をターゲットとするロイシン化
ホルモン、卵巣をターゲットとするファリカル刺激ホルモン（follicle stimula
ting hormone）および副腎をターゲットとするＡＣＦＨに結合することにより成
しうる。逆に言えば、ＰＢＲリガンド阻害剤を前記ステロイド産生細胞に提供し
て、ＰＢＲ結合コレステロールの放出を抑制し、それによりコレステロールのプ
レグネノロンへの分解を抑制することからなる、ステロイド産生細胞中でのプレ
グネノロン生成を減少する方法を提供する。

【００７６】 プレグネノロンはステロイド生成の前駆体であるので、ステロイド形成細胞に
おけるステロイド生成の増加方法は、ＰＢＲリガンドをステロイド細胞に提供し
て、ＰＢＲがコレステロールを放出し、そのコレステロールがプレグネノロンへ
の分解に用いられ、かつすべてのステロイドの前駆体として用いられることを特
徴とする。同様に、ＰＢＲにＰＢＲリガンドを抑制する薬剤を提供して、ＰＢＲ
結合コレステロールを放出せず、コレステロールをプレグネノロンおよびすべて
のステロイド前駆体に分解しないことを特徴とするステロイド形成細胞における
ステロイド生成を減少する方法をも提供する。この方法はステロイドの生成増加
からの病的兆候、例えばストレスおよびコウシング病に有用である。

【００７７】 上記使用方法に付け加えて、本発明のポリペプチドおよび核酸は、人間または
非人間動物患者のための治療用途に用いることもできる。

【００７８】 本発明のコレステロール相互作用配列を含有するポリペプチドをコードする核
酸をコレステロール受容体として用いて、コレステロール、またはコレステロー
ル誘導体の筋肉および血液中での量を制限する。核酸は単独またはそれが翻訳さ
れるベクターの一部として投与され、得られたポリペプチドはコレステロールと
相互作用あるいはコレステロールに結合し得る。コレステロール相互作用／認識
コンセンサス配列を含有するペプチドをコードした核酸配列を予防的にまたは結
晶コレステロール値の高いことによる疾患または状況にある患者に投与すること
もできる。「高レベル」とは血漿中で通常見られる値に比較して高い値を意味す
る。投与は裸のＤＮＡとして、特定のキャリアを有するＤＮＡまたは適当な分配
ビヒクルによる所望の組織への核酸表示ベクターの形で、例えばリポソーム、イ
オン導入法、エレクトロポレーションおよび他の薬剤学的に認められた分配方法
を用いることによって外部から分配することができる。他の分配方法、例えばリ
ポソーム中へのカプセル化、レトロウィルスによる形質転換、多くの核酸タンパ
ク質上に見られる各ターゲット部位を用いる各コンパートメントに対する局在化
、体外での細胞のトランスフェクションとその後の移入された細胞の再移入また
は投与、ＤＮＡトランスポータシステムを含む。コレステロール相互作用／認識
配列をコードした核酸の循環半減期を増大するようにデザインするようにドラッ
グキャリアによる静脈投与も用いてもよい。また、病気の治療は、コレステロー
ル相互作用／認識ドメイン配列を含む配列またはコレステロール相互作用／認識
ドメイン配列の変異または変化を含む遺伝子治療技術を含む。遺伝子治療に関す
る対策はフリードマン、サイエンス２４４、１２７５、１９８９に見られる。

【００７９】 薬剤分配ビヒクルは全身または局所投与の両方に効果的である。それらは徐放
リザーバーまたはターゲット細胞に直接内容物を分配するようにデザインされ得
る。直接分配薬剤ビヒクルを用いる利点は、複数の分子が吸収力に応じてデリバ
ーされることである。そのようなビヒクルは他の方法では血液流中から急速に除
去される薬剤の循環半減期を増加することが示されている。そのような特殊な薬
剤分配ビヒクルのいくつかの例は、リポソーム、ヒドロゲル、シクロデキストリ
ン、生物分解性ナノカプセルおよび生接着性マイクロスフェアーが挙げられる。

【００８０】 コレステロール認識／相互作用配列をコードする核酸配列は、また全身投与し
てもよい。全身吸収とは血流への薬剤の蓄積とそれ以降の身体全体への分配を意
味する。全身吸収へ導く投与ルートは、静脈、筋肉、皮下、腹膜、鼻腔、外皮内
および眼球内が挙げられる。ジーンガン（gene gun）も用いることができる。投
与量は病気の徴候および投与ルートに応じて変化し得るが、通常１〜１０００ug
／体重１kg／１日である。処置期間は病気の兆候に応じて拡大、または継続的に
なし得る。投与回数は分配ビヒクルおよび臨床実験からのデータに基づく。

【００８１】 コレステロール相互作用／認識コンセンサス配列を含む核酸は生体内アプロー
チを用いて投与してもよく、それにより核酸は静脈注射または筋肉注射により動
物に直接または、筋肉特異プロモータを用いて目的の組織に直接核酸の投与を行
ってもよい。

【００８２】 本発明のポリペプチドはまたコレステロールの競争により細胞内へのコレステ
ロールの吸収を抑制またはブロックするのに用いてもよい。これらの方法は細胞
またはプラズマ中でのコレステロールの増加からもたらされる各種病気の治療ま
たはそのような治療に効果的な化合物のスクリーニングに用いられる。コレステ
ロールは通常の細胞成長および適当な膜構造および機能のために要求される。コ
レステロールの蓄積の不均一性は細胞毒性であり、コレステロールホメオスタシ
ス（homeostasis）を維持する欠点は多くの病的状態をもたらす（サブセルラー
・バイオケミストリー（Subcellular Biochemistry）、第２８冊、コレステロー
ル；その機能およびメタポリズム・イン・バイオロジー・アンド・メデスン、ビ
ットマン（Bittman）、ロバート(Robert)（Ｅd）、プレナムプレス(Plenum Pres
s)、ニューヨーク）。特定の疾患としては、胆石、アテローム性動脈硬化、ニー
マン−ピックＣ、ヒトステロール症、栄養失調、増殖性腫瘍、シュナイダー性角
膜結晶症が挙げられる。脳疾患の例としては、コレステロールメタポリズムおよ
びアルツハイマー症、テルル毒症、スミス−レムリー−オピツシンドローム、ミ
エリンゼーション、異常形成およびデミエリゼーション；シャルコット−マリー
−ツゥース症、ぺリジーアス−メルツバッカー疾患、マルチプルスクレロシス（
Multiple sclerosis）、ＳＬＡが挙げられる。また、上記方法および組成物は予
防的治療あるいは予防治療における化合物の有効性のためのスクリーニングに有
用である。

【００８３】 本発明の別の態様では、本発明のコレステロール認識／相互作用コンセンサス
配列を含むペプチドを必要に応じてコレステロールまたは本発明のコレステロー
ル認識／相互作用を配列を結合する誘導体を分配するのに用いることができる。
ペプチドは投与前にコレステロールと複合して、それによりコレステロールの他
の要素、例えばアルブミンに非特異性結合することを避ける。

【００８４】 本明細書において「効果的量」または「治療に効果的な量」とは、効果的な治
療に必要な薬剤の量であって、異なる要因、例えば投与手段、ターゲット部位、
患者または他の投与される動物の肉体的状態に基づく。従って、処置投与量は有
効性および安全性を最適にするのに必要なものである。典型的には、体外で用い
る量がこれらの薬剤の体内投与に有用な量のガイダンスとして有効である。特定
の疾患のための処置の効果的な投与量の動物テストは人間の投与量の予測的値を
与える。一般的に、本発明のコレステロール相互作用／認識ドメインを含有する
ポリペプチドの治療に効果的な量は０.０００１〜約１００mg／kg、より一般的
には約０.００１〜約０.１mg／kg（対象物体重）であり得る。種々の考慮が例え
ばジルマン（Gillman）ら（Eds.）、グッドマン(Goodman)・アンド・ジルマンズ
；ザ・ファーマコロジカル・べーシス・オブ・セラピューテックス（８th ed、
１９９０）、パァーガモンプレス（Pergamon Press）、およびレミントンズ(Rem
ington's)・ファーマシューティカル・サイエンス（第７巻、１９８５）マック(
Mack)パプリッシング社、イートン（Eaton）、ＰＡ）に記載されている。投与方
法もまた上記文献に記載されおり、治療および／または予防的投与として、例え
ば経口投与、静脈内投与、筋肉投与および局所投与、局部投与、経皮投与、アエ
ロゾル投与が挙げられる。活性剤は一般的に他の薬学的に受け入れられるキャリ
アを含む組成物の形態で投与してもよい。薬剤学的に許容し得るキャリアは水、
食塩水、緩衝剤および他の化合物（メルクインデックス、メルク・アンド・コ（
Merk and Co.）、ローウェイ(Rahway)、ニュージャージ）に記載されているもの
が挙げられる。

【００８５】 「対象物」とは魚、動物を意味し、植物、昆虫、サル（monkey）、サル（apes
）、ネコ、イヌ、鳥、牛、豚、ネズミ、馬、ウサギおよび人間を含む。

【００８６】 上記活性物質に加えて薬剤組成物の構成物は種々の投与方法に用いられるため
に公知のものを含む。例えば、経口投与には粉末、錠剤、ピル、カプセル、薬用
ドロップおよび液体が含まれる。同様に、静脈、動脈および筋肉投与には薬剤学
的に許容し得るキャリア、例えば水、緩衝水、生理食塩水等中に溶解または分散
される。また、これらの組成物は他の構成物であって、ほぼ生理学的状境に応じ
て要求されるもの、例えばｐＨ調節または緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤等が挙げ
られる。固体状組成物には一般的な非毒性固体状キャリア、例えばマンニトール
、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マンガン、サッカリンナトリウム、タルカム
（talcum）、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等の薬剤
上のグレードを含む。

【００８７】 投与は徐放性組成物または装置によって行ってもよく、それにより活性剤が徐
々に放出されることが可能になり、長期間連続投与が行われる。

【００８８】 以下の物質および方法が下記の実施例に用いられた。 ＭＡ−１０ライディヒセル（Leydigcells）−ＭＡ−１０マウスライディヒ腫
瘍細胞が以前我々が記載したまま維持される（パパドパウルス（Papadopoulos）
、V.らが１９９０、J. Biol. Ｃhem. ２６５；３７７２−３７７９）。コレステ
ロール吸収アッセイには、ミトコンドリアをパパドパウルスら１９９０、スープ
ラ；クルーガ（Krueger）・アンド・パパドパウルス、１９９０、スープラに記
載したように単離し、緩衝剤Ａ（２５０mＭスクロース、２０mＭ ＫＣl、１５m
Ｍトリエトールアミンハイドロクロリド（pＨ７．０）、１０mＭ Ｋ₃ＰＯ₄およ
び１０mＭ ＭgＣl₂）中でトータルタンパク濃度１mg／mlで再分散した（リーバ
ー（Leaver）、H. A. およびボイド（Boyd）. G. S. １９８１、J. Endocrinol.
９１；１２３−１３３）。ミトコンドリアは次いで［１,２−³Ｈ］−コレステ
ロール（０．１２７uCi／１００nmol）と０．３ml／緩衝剤Ａ中で３７℃（また
は所定温度）で所定時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、
ステロイドを抽出し、形成された³Ｈ−プレグネノロンを薄層クロマトグラフィ
ーで単離し、量を測った（Amri、H. ら１９９６、Endocrinology １３７．５７
０７−５７１８）。

【００８９】 マウスＰＢＲ出現ベクター（bＥＴ１５bＰＢＲ）の構成およびバクテリア中で
の組換えＰＢＲの出現−ｐＥＴシステム（ノバーゲン（Novagen）、マジソン(Ma
dison)、ワイオミング州）をＭＡ−１０マウスＰＢＲ（mｐＢＲ）組換えタンパ
ク質を表わすのに用いた。フルレングスのコード配列を含むインサート、および
５'および３'末端のＮdeＩおよびＸhoＩ部位の延長は、以下のプライマー：ＡＴ
ＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＣＣＴＧＡＡＴＣＣＴＧＧＧＴＧ（配列ＩＤ番号：２４
）およびＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＧＣＣＴＴＣＡＣＴＣＴＧ（配列ＩＤ番
号：２５）を用いてＰＣＲによって得られた。ＭＡ−１０フルレングスＰＢＲc
ＤＮＡ（ガーニア（Garnier）、M.ら１９９４、Mol．Pharm．４５：２０１−２
１１）をテンプレートとして用いた。このmＰＢＲフラグメントをpＥＴ１５bベ
クターに導入し、ＮＴ７１acプロモータのＮdeＩおよびＸhoＩ下流でリニア化し
た。組換mＰＢＲ発現ベクターを用いて、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌ストレイン
（ノバーゲン）をトランスホームし、ここで組換え型mＰＢＲタンパク質の出現
を１mmイソプロピル−１−チオール−β−Ｄ−ガラクトピラノーシド（ＩＰＤＧ
）により誘導した。ＰＢＲタンパク質出現はＳＤＳ−ＰＡＧＥによりモニターし
、次いでanti−ＰＢＲアンチセリウム（Amri et al.1996, supra）を用いてクー
マッシブルースティーニング（Coomassie Blue staining）またはイムノブロッ
ト分析(immunoblot analysis)を行った。大腸菌（E.coli）中におけるＩＰＴＧ
−誘導ＰＢＲの結合特異性は³Ｈ−ＰＫ１１１９５（１．０mＭ）の特異結合を示
唆リガンドの示唆濃度の存在において測定する結合研究において決定した。

【００９０】 大腸菌細胞による³Ｈ−コレステロールの吸収はコントロールまたはＩＰＴＧ
−処理トランスフォームドバクテリアの所定濃度を用いて、６．７nＭ ³Ｈ−コ
レステロール（５０．０Ci／mmol）の存在下に６０分間３７℃でインキュベート
して試験した。特定のコレステロール吸収をＩＰＴＧ−誘導マイナスベイセルバ
リューとして定義した。大腸菌プロトプラスツをＬＢ中で３７℃でセル成長から
成長のロガリズム相まで調整し、１０，０００gで５分間遠心分離した。細胞を
１０mＭトリス−ＨＣl緩衝液（pＨ８．０）で２回洗浄し、ペレットを２０％（w
／w）スクロースおよび０．１Ｍトリス−ＨＣl（pＨ８．０）を含む溶液中で再
縣濁した。細胞を１０ Ｄ₄₅₀につき１mlの緩衝液中で縣濁し、混合した。１分
以内にリゾチームを２ml／ＭＬストック溶液から蒸留水中に加え、最終濃度を１
０ug／mlで３７℃にした。撹拌を約１２分間続けた。細胞縣濁液をあらかじめ３
７℃に温めた０．１Ｍ Ｎa₂ＥＤＴＡで１：１０に希釈した。連続的な撹拌およ
びゆっくりとした希釈がセルリシス（cell lysis）を防止した。細胞の９９％以
上が１０分以内に球状になった（ワイス（Weiss）、R.L.１９７８、Metd．Cell
Biol．２０：１４１−１４７）。プロトプラスト（０．３ml最終容量中１００ug
）を次いで６．７nＭ³Ｈ−コレステロールの存在下に６０分間３７℃でコレステ
ロール吸収アッセイのためにインキュベートした。３０nＭ ³Ｈコレステロール
でインキュベートした、ＩＰＴＧ誘導トランスフォームドバクテリアの³Ｈ−コ
レステロール−ラベル膜をＰＫ１１１９５またはクロナゼパムで処置し、Ｈ−コ
レステロール（放出）を液体閃光スペクトロメトリーによって測定した。

【００９１】 部位特異的突然変異誘発− 変異をストラッタジーン（Stratagene）（カリホ
ルニア州ラジョラ）からクィックチェンジ部位特異的突然変異誘発キット（Quik
Change Site-Directed Mutagenesis kit）を用いて行った。他にはミニプレップ
pＥＴ−ＰＢＲプラスミドdsＤＮＡをテンプレートとして用いた。Ａ１４７Ｔ、
Ｙ１５３Ｓ、Ｒ１５５Ｌポイント変異およびＰＢＲ除去、△５−２０、△４１−
５１、△１０８−１１９、△１２０−１３３、△１４１−１５２、△１５３−１
６９を含有するオリゴヌクレオチドプライマーぺアー、各々はベクターの反対ス
トランドに相補的であるものを、pfuＤＮＡポリメラーゼによって温度サイクリ
ングで伸ばした。オリゴヌクレオチドプライマーの導入について、スタッガーニ
ック（Staggered nick）を有する変異プラスミドを得た。温度サイクルの後、生
成物をＤbnＩで処理し、所望の変異を有するニックベクターＤＮＡを次いで大腸
菌中にトランスフォームした。変異プラスミドはＡＢＩプリズムミニプレップキ
ッドにより調製した。得られた変異およびＡＢＩプリズム・ダイ・ターミネータ
・サイクル・シークエンシング反応キッド（Prism Dye Terminator Cycle Seque
ncing ready reaction kit）（カリホルニア州フォスターシティ、パーキンエル
マーアプライドバイオシステムズ）を用いて塩基配列決定法で確認した。ＤＮＡ
シークエンシングはジョジタウンユニバーシティのランバルディ・キャンサー・
センター・シークェンシング・コア・ホシリティで行った。

【００９２】 放射性リガンド結合アッセイ−³Ｈ−１−（２−クロロフェニル）−Ｎ−メチ
ル−Ｎ−（１−メチル−プロピル）−３−イソキノリンカルボキシアミド（ＰＫ
１１１９５）結合研究を以前（パパドウポーラス、V.ら１９９０、J.Biol．Chem
．２６５：３７７２−３７７９；ガルニア（Garnier）、M.ら１９９４、Mol．Bh
arm．４５：２０１−２１１）で行った。解離定数（Ｋd）および結合部位の数（
Ｂmax）はリガンドプログラム（マンソン(Manson)、Ｐ．Ｊ．アンド・ロードボ
ード(Rodbard)、D.１９８０、Anal．Biochem．１０７；２２０−２３９）を用い
てデータのスカッチャードプロット分析により決定した。

【００９３】 タンパク質測定−マイクログラム量のタンパク質を、染料結合アッセイ（ブラ
ンドフォード（M.M.１９７６、Anal．Biochem．７２；２４８−２５４））によ
り、標準として牛の血清アルブミンを用いて測定した。

【００９４】 統計−表わされた結果は２〜６の個別の実験の平均±Ｓ．Ｄ．またはＳ．Ｅ．
Ｍ．を示す。統計的分析をＡＮＯＶＥによって行い、次いでInstatを用いてシチ
ューデント−ニューマン−ケールス（Student-Newman-Keuls'）テストまたはデ
ュナット（Dunnet）複合比較テスト（v．２．０４）パッケージ（グラフパッド
（GraphPad）インク）（カリホルニア州サンディエゴ）を用いて行った。

【００９５】 実施例１ 分子力学シミュレーションを用いてヒトＰＢＲの３次元モデルを構成し、コレ
ステロール分子をその５ヘリックス範囲内に調節することが示された（Bernassa
u, J.M.ら、１９９３年、J. Mol. Graph. 11:236-245）。ヒト及びマウスＰＢＲ
間の一次アミノ酸配列における相違にもかかわらず、マウス１８ｋＤａＰＢＲタ
ンパク質を同じ分析にかけると同様のデータが得られ（Papadopoulos, V.、１９
９６年、前出）、ＰＢＲがコレステロールのためのチャンネルとして機能しうる
ことを示している。この仮定のモデルを試験するために我々は２種の細胞モデル
系を用いた：（ｉ）ＭＡ−１０ライディヒ細胞、高レベルのＰＢＲ（〜40ピコモ
ル／ｍｇタンパク質；Papadopoulos, V.ら、１９９０年、J. Biol. Chem. 265:3
772-3779）を発現するステロイド産生細胞モデル、及びその結果、全ての真核細
胞は内因性コレステロールを含む；及び（ii）Ｅ.coli ＤＥ３ 細胞、これはＰ
ＢＲを発現せず（本研究）、内因性コレステロールを有さず（Moat, A.G.、及び
Foster, J.W.、１９９５年、Microbial Physiology、Wiley-Liss、ニューヨーク
）、ステロイドを形成しない。従って、我々は、これらの細胞モデルを用いてＰ
ＢＲ発現とコレステロール輸送機能とを相関させることを試みた。更に、我々は
放射標識されたコレステロールによる方法を用いて（Leaver, H.A.及びBoyd G.S
.、１９８１年、J. Endocrinol. 91:123-133）コレステロールの運動を定量化し
た。コレステロールがＩＭＭに輸送されたステロイド産生細胞がＰ４５０ｓｃｃ
により開裂されてプレグネノロンを産生する場合に、この方法は外因的に供給さ
れたコレステロールと内因性コレステロールとの間の区別を可能にし、形成され
たプレグネノロンの容易な定量化及び直接的な測定を可能にする。図１に示され
るデータはこの方法の使用が有効であることを示す。図１は、ステロイド産生ラ
イディヒ細胞において、ミトコンドリアよる³Ｈ−コレステロール取り込み、Ｏ
ＭＭからＩＭＭへの輸送が、特定ＰＢＲリガンドによりシミュレートされ、その
結果、増大された³Ｈ−プレグネノロン形成が得られたことを示す。これらのデ
ータは全てのステロイド合成細胞型のボディ（body）におけるこれまでの知見と
整合する（Papadopoulos, V.、１９９３年、Endocr. Rev. 14:222-240；Papadop
oulos, V.、１９９８年、Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 217:130-142）。更に、
ＯＭＭからＩＭＭへの同様なＰＢＲ−依存性コレステロール輸送機構が、近年肝
臓ミトコンドリアにおいて同定された（Tsankova, V.ら、１９９５年、Eur. J.
Pharm. 294:601-607）。コレステロールの肝臓ＩＭＭへの輸送は、ＩＭＭステロ
ール−２７−ヒドロキシラーゼによる抹消からのコレステロール解毒のために要
求されうる（Tsankovaら、１９９５年、前出）。興味深いことに、ＰＢＲリガン
ド活性化に応答する、コレステロール取り込み及びＩＭＭへのミトコンドリア間
輸送の速度は、副腎（Krueger, K.E.及びPapadopoulos, V.、１９９０年、J. Bi
ol. Chem. 265:15015-15022）及び肝臓（Tsankovaら、１９９５年、前出）ミト
コンドリアについて同一であり（毎分0.9ナノモル／ｍｇタンパク質）、両ステ
ロイド産生及び非ステロイド産生組織において同様のＰＢＲ−媒介コレステロー
ル輸送機構が作用していることが示唆される。

【００９６】 上述のように、バクテリアは内因性コレステロールを有しないモデル系である
（Moat及びFoster、１９９５年、前出）。更に、ロドバクターカプスラツス（Rh
odobacter capsulatus）及びロドバクタースファエロイデス（Rhodobacter spha
eroides）光合成バクテリアにおけるカロチノイドバイオ合成に含まれる、ＰＢ
Ｒ相同性タンパク質、トリプトファン−リッチ−センソリー−タンパク質ｔｓｐ
Ｏ（ｃｒｔＫとも呼ばれる。）が存在するにもかかわらず、バクテリアはＰＢＲ
タンパク質（図２Ａ）及びリガンド結合（非表示）を発現しないことが報告され
ている（Yeliseev, A.A.及びKaplan S.、１９９５年、J. Biol. Chem. 270:2116
7-21175）。エスチェリチアコリ（Escherichia coli）はマウスＰＢＲｃＤＮＡ
と共にｐＥＴベクター中に形質移入される。形質移入されたバクテリアにＩＰＴ
Ｇを添加することにより、ＰＢＲについて既に説明した（Papadopoulos、１９９
３年、前出；Papadopulos, V.ら、１９９０年、前出）（図２Ｃ）と同様の薬理
学的な特徴と共に、１８ｋＤａＰＢＲタンパク質（図２Ａ）、及びリガンド結合
（図２Ｂ；Kd=1.1ｎＭ、及びBmax=0.23ピコモル／ｍｇタンパク質）が発現する
。ＩＰＴＧ−誘起ＰＢＲ発現は、放射標識されたコレステロールの、タンパク質
（図３Ａ）、時間（図３Ｂ）及び温度依存性の取り込みとなる（図３Ｂ）。この
コレステロール取り込みは、プロトプラストが調製された場合に維持され、ＰＢ
Ｒが内部バクテリアプラズマ膜に存在することを示す（データには非表示）。コ
レステロールの取り込みはエネルギー毒によってブロックされ得ない（DeGrella
, R.F.及びSimoni, R.d.、１９８２年、J. Biol. Chem. 257:14256-14262）（図
３Ｃ）。更に、他の放射標識されたステロイドの取り込みは見られず（図３Ｄ）
、使用した放射標識されたコレステロールの濃度で飽和され得ない（図３Ｅ）こ
とから、これはコレステロールに特有であって、ＰＢＲはコレステロール結合タ
ンパク質としてよりは、むしろコレステロールのためのチャンネルとして機能す
ることを示唆しており、このことはモデリング研究と整合する（Bernassauら、
１９９３年、前出；Papadopoulos, V.、１９９６年、前出）。ＩＰＴＧ−誘起さ
れ、コレステロール充填され、ＰＫ１１１９５で処理されたバクテリア膜、コレ
ステロールが膜から離生される場合は（図３Ｆ）、ＰＢＲに捕捉されたコレステ
ロールがリガンド結合により放出されたことを示している。従って、ＰＢＲはチ
ャンネル様又はポート機能を奏し、コレステロールはリピッド２層のリピッド又
はタンパク質成分と相互作用することなく膜の内部に侵入及び存在蓄積されうる
。これは、膜のコレステロール成分からコレステロールのステロイド産生プール
の間に分類されるミトコンドリアによる方法でありうる。従って、ＰＢＲリガン
ドは、チャンネルの開口／解放状態を制御し、膜を横切るコレステロールの移動
を調節する。ＰＢＲドラッグリガンドに加えて、ポリペプチドジアゼパム結合阻
害剤（ＤＢＩ）及びポルフィリン（Papadopoulos, V.、１９９３年、前出）が自
然発生内因性リガンドとして同定されてきた。現時点では、ＰＢＲがフリッパー
ゼ（flippase）又はトランスポーターとして機能する可能性は排除できないこと
に注意すべきである。

【００９７】 ここに提示されるデータの支持により、ステロイド産生細胞中のＰＢＲ遺伝子
のターゲットされた分布は、ＩＭＭへのコレステロール輸送の禁止及びステロイ
ドバイオ合成の停止となる（Papadopulos, V.ら、１９９７年、J. Biol. Chem.
272:32129-32135）。ＰＢＲｃＤＮＡレスキューされたステロイド産生と共にＰ
ＢＲミュータントライディヒ細胞を形質移入し、コレステロール輸送におけるＰ
ＢＲの必須の役割が実証された（Papadopoulos, V.、１９９６年、前出）。

【００９８】 実施例２ ＰＢＲは上記ＯＭＭに位置する５つの推定経膜的ドメインを有する１８ｋＤａ
の疎水性タンパク質である。上記薬剤リガンドおよびコレステロールの相互作用
に含まれる受容体領域を限定する第１ステップとして、図４の左枠に示した欠失
（deletion）に伴なう突然変異ＰＢＲを図に示した。受容体（Ｉ〜Ｖ）の５つの
経膜的領域の位置も図４に示す。ミトコンドリア膜タンパク質のアミノ末端は、
カルボキシ末端が細胞質側であるのに対して、細胞小器官の内側に向いているこ
とは注目すべきである。図４の右枠は、特定アミノ酸配列の欠失の前述のバクテ
リア系で試験されたＰＢＲリガンド結合およびコレステロール摂取量への作用を
示す。受容体のアミノ末端中のアミノ酸配列５〜２０および４１〜５１の欠失は
ＰＢＲのリガンドＰＫ１１１９５を結合する能力を３０〜４５％だけ減少した。
われわれの結果は、酵母中で発現されたヒトＰＢＲにおける以前の研究（ファー
ゲス(Farges) R.等のMol. Pharm.、１９９４年、第４６巻、第１１６０〜１１６
７頁）と一致する。但し、それらの研究においてはヒトＰＢＲのアミノ末端の欠
失が上記受容体のＰＫ１１１９５を結合する能力を完全に破壊した。第４の経膜
的ドメインにおけるアミノ酸１２０−１３３の欠失もＰＢＲリガンド結合を４５
％だけ減少した。領域１４１−１５２および１５３−１６９を欠失した場合に、
ＰＫ１１１９５結合のより小さい減少（２５％）も見られた。これらの結果は、
上記受容体のアミノ末端は薬剤リガンド、例えばイソキノリンＰＫ１１１９５を
結合する能力を提供することができるが、第４の経膜的ドメイン中のアミノ酸配
列が上記リガンド結合位置の形成に関係することができることを提案する。ＰＫ
１１１９５リガンド結合に悪影響を与える欠失は、バクテリア膜中に発現される
組み換え型受容体の放射性同位元素を用いて識別したコレステロールを取り上げ
る能力に大きな影響を有さないことは注目すべきである。

【００９９】 図４はまた、ＰＢＲのカルボキシ末端におけるアミノ酸１５３−１６９の欠失
が上記分子のバクテリア中に発現される場合（７０％減少）に３Ｈ−コレステロ
ールを取り上げる能力に非常に大きな作用を及ぼすことも示している。この結果
は、上記受容体の細胞質カルボキシ末端ドメインがコレステロールの相互作用お
よび後の摂取の原因となることを提案する。コレステロールとの相互作用の原因
となるＰＢＲ中の特定アミノ酸を識別しようとする努力により、上記カルボキシ
末端領域における位置を指示した(site-directed)突然変異誘発の研究に取りか
かった。

【０１００】 実施例３ コレステロールと相互に作用する他のタンパク質、酵素Ｐ４５０ｓｃｃを用い
たピクレバ(Pikuleva)等の最近の研究（１９９５年、Arch. Biochem. Biophys.
、第３２２巻、第１８９〜１９７頁）は、Ｐ４５０ｓｃｃの活性位置におけるチ
ロシンがコレステロールの側鎖と相互に作用することを示す。ＰＢＲのカルボキ
シ末端を用いて上記Ｐ４５０ｓｃｃ活性位置アミノ酸配列を整列することは、コ
レステロールを認識するこれら２つの分子内に共通のアミノ酸コンセンサスパタ
ーンがあるかもしれないことを示す（表１）。このコンセンサスパターンは、中
性で疎水性のアミノ酸（Ｚ）、例えばロイシンまたはバリン、中性および極性ア
ミノ酸（Ｙ）、例えばチロシン、および塩基性アミノ酸（Ｑ）、例えばアルギニ
ンまたはリジンから構成される。５つの異なるアミノ酸の内の１つは、これら３
つの暗号化アミノ酸の間に配置されてもよい。従って、上記提案されたコンセン
サスパターンは、 ‐Ｚ‐(Ｘ)_0-5‐Ｙ‐(Ｘ)_0-5‐Ｑ‐ である。上記アルギニンまたはリジンがポケットをつくるのを援助するのに対し
て、ロイシンまたはバリンはコレステロールの疎水性側鎖と相互に作用し、チロ
シンはコレステロールの極性３’ＯＨ基と相互に作用する。この仮説を試験した
（図５）。Ｙ１５３のセリンによる置き換えまたはＲ１５６のロイシンによる置
き換えにより、ＰＢＲの放射性同位元素を用いて識別したコレステロールを取り
上げる能力を完全に破壊した。トレオニンを用いるＡ１４７の突然変異および置
き換えは、上記突然変異した受容体を発現するバクテリアによって、コレステロ
ール摂取には影響しなかった。図５はまた、ＩＰＴＧ誘発により野生型および突
然変異した組み換え型受容体タンパク質を同量発現したことを示す。

【０１０１】 実施例４ この推定コレステロール認識/相互作用アミノ酸コンセンサスパターンが、コ
レステロールと相互に作用することが示されまたは提案された他の分子、例えば
アポリポタンパク質Ａ−１（ボイル(Boyle) T.P.およびマロッテイ(Marotti) K.
R.、１９９２年、Gene、第１１７巻、第２４３〜２４７頁）、カベオリン（ムラ
タ(Murata) M.等、１９９５年、Proc. Natl. Aca. Aci. USA、第９２巻、第１０
３３９〜１０３４３頁）、ＤＢＩ（パパドポーラス (Papadopoulos) V.、１９９
３年、Endocr.Rev.、第１４巻、第２２２〜２４０頁；パパドポーラス V.、１９
９８年、Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 第２１７巻、第１３０〜１４２頁）、ス
テロイド合成急性調節タンパク質ＳｔＡＲ（ストッコ(Stocco) D.M.およびクラ
ーク(Clark) B.J.、１９９６年、Endocr.Rev.、第１７巻、第２２１〜２４４頁
）、ヘッジホッグ(Hedgehog)タンパク質（ポーター(Porter) J.A.等、１９９６
年、サイエンス(Science)、第２７４巻、第２５５〜２５９頁）、シトクロム Ｐ
４５０ Ｃ２６／２５（スー(Su) P.等、１９９０年、ＤＮＡ Cell Biol.、９−
６５７−６６７）、アネキシン(annexin)II（ハーダー(Harder) T.等、１９９７
年、Mol. Biol. Cell、第８巻、第５３３−５４５頁）、ステロールキャリアタ
ンパク質−２（コールズ(Colles) S.M.等、１９９５年、リピッズ(Lipids)、第３
０巻、第７９５〜８０３頁）、コレステロール７α−モノオキシゲナーゼ（カイ
(Kai) M.等、１９９５年、Lipid Res.、第３６巻、第３６７〜３７４頁）、コレ
ステロールオキシダーゼ（イシザキ(Ishizaki) T.等、１９９１年、J. Bacterio
l.、第１７１巻、第５９６〜６０１頁）、コレステロールデヒドロゲナーゼ（ホ
リノウチ(Horinouchi) S.等、１９９１年、Appl. Environ. Microbiol.、第５７
巻、第１３８６〜１３９３頁）、胆汁塩活性リパーゼ前駆物質（コレステロール
エステラーゼ）（ニルソン(Nilsson) J.、Lipid Res.、第３６巻、第８２３〜８
３８頁）の中に存在するかどうかを調べようとする努力により、われわれはこれ
らのタンパク質中にコレステロール認識/相互作用アミノ酸コンセンサスパター
ン： ‐Ｚ‐(Ｘ)_0-5‐Ｙ‐(Ｘ)_0-5‐Ｑ‐ の存在を探した。表Ｉは、ステロールキャリアタンパク質−２を除いて、これら
すべてのタンパク質が、このアミノ酸コンセンサスパターンを含むことを示す。
ラットの骨格筋肉α−アクチン、非筋肉および平滑筋ミオシン軽鎖等のタンパク
質はこのコレステロール認識/相互作用アミノ酸コンセンサスパターンを含まな
かった。しかしながら、どんなチロシンによっても、このコンセンサスアミノ酸
配列が多くのタンパク質中に発見されることは合理的に高い確率であることを示
す。更に、様々な遺伝子データバンクによるモチーフ調査によって、このアミノ
酸配列パターンが種々のタンパク質に存在することを示した。上記コレステロー
ル/タンパク質の相互作用が、コレステロールの輸送および/または貯蔵だけでな
く、タンパク質の安定性、折りたたみおよび/または局在化に役割を果たしてい
ることが知られているため驚くべきことではない。従って、いくつかのタンパク
質についてのみ、このコンセンサス配列が機能的になり得る。このアミノ酸配列
を含むタンパク質のコレステロールとの相互作用の強さおよび特異性は、ある微
小環境の存在、上記タンパク質内の上記コンセンサス配列の位置、またはこのア
ミノ酸配列の使用を可能とする上記タンパク質の特異コンホメーション(conform
ation)のいずれかによるかもしれない。最後の場合、識別された上記コンセンサ
ス配列が識別されるべきより大きなモチーフの、コアかもしれない、一部分だけ
を表すことも可能である。

【０１０２】 特にステロイド合成について興味深いことは、上記コレステロール認識/相互
作用アミノ酸コンセンサスパターンが、のポリペプチドＤＢＩ（前述のパパドポ
ーラス (Papadopoulos) V.著、１９９３年；前述のパパドポーラス (Papadopoul
os) V.著、１９９８年）および前駆物質ＳｔＡＲタンパク質（ストッコ(Stocco)
D.M.およびクラーク(Clark) B.J.著、１９９６年、Endocr.Rev.、第１７巻、第
２２１〜２４４頁）中に発見されたという観察である。シトソルのステロイド合
成−刺激ファクターの調査により、あるタンパク質が精製され、ＤＢＩ（前述の
パパドポーラス V.著、１９９３年）と同一であることが示された。ＤＢＩは最
初は、シナプトソーム中の認識位置からジアゼパムを置換する能力をモニターす
ることによって、脳から精製された。ＤＢＩは、アシル‐ＣｏＡ‐結合タンパク
質（ナドセン(Knudsen) J.等、１９９３年、Mol. Cell. Biochem.、第１２３巻
、第１２９〜１３８頁）とも同一である。精製ＤＢＩはミトコンドリア内のコレ
ステロール輸送を刺激し、隔離ミトコンドリア（前述のパパドポーラス V.著、
１９９８年）によるプレグネノロン生成を増加することが示された。その後、Ｄ
ＢＩのこの作用はＰＢＲ（前述のパパドポーラス V.著、１９９３年；前述のパ
パドポーラス V.著、１９９８年）によって媒介されることが示された。加えて
、ＤＢＩは隔離ｐ４５０ｓｃｃ（ブラウン(Brown) A.S.およびホール(Hall) P.F
.、Biochem. Biophys. Res. Commun.、第１８０巻、第６０９〜６１４頁）に荷
重をかけるコレステロールを増加することが示された。従って、ＤＢＩ中のコレ
ステロール識別/相互作用アミノ酸一致パターンの認定により、ステロイド合成
におけるその役割およびｐ４５０ｓｃｃへのその直接的作用を理解するのに役立
つ。興味深いことに、われわれは以前、ＤＢＩの自然発生プロセシング産生物、
オクタデカニューロペプチドＯＤＮ（ＤＢＩ_33-50）ではなく、トリアコンタテ
トラペプチドＴＴＮ（ＤＢＩ_17-50）が、ＤＢＩのミトコンドリアのステロイド
合成への作用（パパドポーラス (Papadopoulos) V.等、１９９１年、エンドクリ
ノロジー(Endocrinology)、第１２９巻、第１４８１〜１４８８頁）を模倣する
ことができることを示した。ＤＢＩにおいて上記コレステロール認識/相互作用
アミノ酸コンセンサスパターンがアミノ酸配列２５〜３２（表Ｉ）に配置される
発見は、ここでこの結果を説明する。上記コレステロール認識/相互作用アミノ
酸コンセンサスパターンが、アシル‐ＣｏＡ‐結合位置（前述のナドセン(Knuds
en) J.等著、１９９３年）を形成するのに重要なアシル‐ＣｏＡ‐結合タンパク
質の典型的ドメイン（アミノ酸１９〜３７）の途中で発見されたことも注目すべ
きである。

【０１０３】 ＳｔＡＲは、ミトコンドリア用の３７ｋＤａの細胞質前駆物質タンパク質（前
述のストッコ(Stocco) およびクラーク(Clark)著、１９９６年）として、それが
栄養ホルモンに応じて新しく合成される生殖腺および副腎細胞の中で発見された
。ライディヒ細胞中のＳｔＡＲの合成は、上記ホルモンを添加した後６０分で開
始され、次いで上記細胞の栄養ホルモンに応じてステロイドを産生する能力を平
行させる（前述のストッコおよびクラーク著、１９９６年；クラーク(Clark) B.
J.等、１９９５年、Mol. Endocr.、第９巻、第１３４６〜１３５５頁）。上記３
７ｋＤａのＳｔＡＲ前駆物質は更に分裂して３０ｋＤａミトコンドリアの「熟成
した」ＳｔＡＲ前駆物質およびそのリン酸化対照物を産生する（前述のストッコ
およびクラーク著、１９９６年）。このタンパク質のプロセスは、外側/内側ミ
トコンドリア膜接触位置のレベルで起こると考えられており、外側ミトコンドリ
ア膜から内側ミトコンドリア膜へのコレステロール輸送の原因であることが提案
されている（前述のストッコおよびクラーク著、１９９６年）。上記コレステロ
ール識別/相互作用アミノ酸コンセンサスパターンが上記熟成したタンパク質か
ら除去されるＳｔＡＲ前駆物質タンパク質のアミノ末端で発見されたことを考慮
すると、上記前駆物質ＳｔＡＲタンパク質の機能は、コレステロールを細胞内貯
蔵所から外側ミトコンドリア膜への往復輸送することであると言える。

【０１０４】 結論として、本明細書中に示された結果は、ＰＢＲは上記ＯＭＭ中のコレステ
ロール用のチャンネルのような機能を有していることを示している。種々の細胞
内源からのコレステロールのステロイド合成プールが、上記ＯＭＭ中のＰＢＲの
カルボキシ末端に存在するコレステロール認識/相互作用アミノ酸コンセンサス
パターン： ‐Ｚ‐(Ｘ)_0-5‐Ｙ‐（Ｘ)_0-5‐Ｑ‐ によって識別される。このコレステロールのプールは、他の膜成分と混合しない
ＰＢＲ位置でＯＭＭ内に入る。上記受容体に結合するリガンドは、このコレステ
ロールの解放を誘導する。ＰＢＲが上記外側/内側ミトコンドリア膜接触位置で
発見された電圧依存アニオンチャンネル（前述のパパドポーラス V.著、１９９
８年）と関連することが示されたことを考慮すると、解放されたコレステロール
は、プレグネノロン、すべてのステロイドの前駆物質に分裂するＩＭＭ中のＰ４
５０ｓｃｃに直接アクセスすることができる。ステロイドホルモン合成用の前駆
物質であることに加えて、コレステロールは細胞膜の必須の構造要素並びに胆汁
酸およびリポタンパク質の合成用の前駆物質である。哺乳類の細胞は、低密度リ
ポタンパク質の内面化、または細胞質網状構造における新たな合成によってコレ
ステロールを得る。上記コレステロールの亜細胞分布は、コレステロールが通過
し、すぐにターゲットの膜の獲得(acquisition)コンホメーションから組みこま
れることを提案している（リスカム(Liscum) L.およびアンダーウッド(Underwoo
d) K.W.、１９９５年、J. Biol. Chem.、第２７０巻、第１５４３３〜１５４４
６頁）。従って、組織および細胞特異性コレステロールホメオスタシスが達成さ
れる。ＰＢＲの広範囲な生成とその組織および細胞特異性亜細胞の局在化とを考
慮すると、これらの結果は細胞内コレステロール輸送および区画化におけるＰＢ
Ｒのより一般的な役割を提案している。

【図面の簡単な説明】

【図１】 MA-10ライディヒ細胞コレステロール輸送およびプレグネロン形
成におけるＰＢＲリガンドの効果を示す。

【図２】 バクテリア中での組換えＰＢＲの発現を示す。

【図３】 大腸菌による³Ｈ−コレステロール摂取の特徴を示す。

【図４】 ＰＢＲ作用−PK11195リガンド結合および野生型突然変異ＰＢＲ
で形質移入されたバクテリアによる³Ｈ−コレステロール摂取の欠失突然変異分
析を示す。

【図５】 コレステロールの摂取に応答する特異性アミノ酸の同定。野生型
点変異したＰＢＲで形質移入したバクテリアによる³Ｈ−コレステロール摂取お
よび³Ｈ−コレステロール摂取を実験したバクテリアによって発現したイムノブ
ロット分析を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 5/103 Ｃ０７Ｋ 14/705 ４Ｃ０８４ 7/06 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｃ０８６ 14/705 Ｃ１２Ｑ 1/60 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/10 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/60 33/92 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｒ 1:01 33/50 1:91 33/92 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ //(Ｃ１２Ｑ 1/60 5/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｑ 1/60 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 リ・フア アメリカ合衆国22209バージニア州アーリ ントン、フォート・マイヤー・ドライブ 1319番、アパートメント102 Ｆターム(参考） 2B030 AB04 AD08 CA06 CA17 CA19 CB03 CD03 CD07 CD09 2G045 AA13 AA40 CA25 CA26 DA36 DA69 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 DA01 DA06 EA04 FA02 GA11 HA01 HA11 4B063 QA01 QA19 QA20 QQ08 QQ76 QR48 QR75 QX07 4B065 AA26X AA91Y AA93Y AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA01 AA02 BA01 BA08 BA15 BA16 BA17 BA18 CA25 CA53 DC50 MA16 MA35 MA37 MA52 MA66 NA14 ZC332 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 NA14 ZC33 4H045 AA10 BA13 BA15 CA40 DA50 EA23 EA50 FA74

Claims (37)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 −Ｚ−(Ｘ)_0-5−Ｙ−(Ｘ)_0-5−Ｑ （ここで、Ｚは、中性で疎水性のアミノ酸を表し、Ｙは、中性で極性のアミノ酸
   を表し、Ｑは、塩基性アミノ酸を表し、およびＸは、どのようなアミノ酸も表す
   。） を含む、コレステロールの認識／相互作用アミノ酸コンセンサス配列。
2. 【請求項２】 Ｚがロイシンまたはバリンである請求項１記載のコレステロ
   ールの認識／相互作用アミノ酸コンセンサス配列。
3. 【請求項３】 Ｙがチロシンである請求項１記載のコレステロールの認識／
   相互作用アミノ酸コンセンサス配列。
4. 【請求項４】 Ｑがアルギニンまたはリジンである請求項１記載のコレステ
   ロールの認識／相互作用アミノ酸コンセンサス配列。
5. 【請求項５】 (i)Ｚがロイシンまたはバリンであり、 (ii)Ｑがアルギニンまたはリジンであり、および (iii)Ｙがチロシンである 請求項１記載のコレステロールの認識／相互作用アミノ酸コンセンサス配列。
6. 【請求項６】 Ｘがアミノ酸１個である請求項１記載のコレステロールの認
   識／相互作用アミノ酸コンセンサス配列。
7. 【請求項７】 Ｘがアミノ酸２個である請求項１記載のコレステロールの認
   識／相互作用アミノ酸コンセンサス配列。
8. 【請求項８】 Ｘがアミノ酸１〜３個である請求項１記載のコレステロール
   の認識／相互作用アミノ酸コンセンサス配列。
9. 【請求項９】 請求項１記載のコンセンサス配列をコード化する核酸分子。
10. 【請求項１０】 (i)ベクター、および (ii)請求項９記載のコレステロール相互作用／認識アミノ
    酸コンセンサス配列を含む核酸分子 を含む核酸分子。
11. 【請求項１１】 ベクターが原核生物ベクターである請求項１０記載の核酸
    分子。
12. 【請求項１２】 ベクターが発現ベクターである請求項１１記載の核酸分子
    。
13. 【請求項１３】 ベクターが真核生物ベクターである請求項１０記載の核酸
    分子。
14. 【請求項１４】 ベクターが発現ベクターである請求項１３記載の核酸分子
    。
15. 【請求項１５】 ベクターが植物における発現に有用である請求項１３記載
    の核酸分子。
16. 【請求項１６】 請求項１０記載の核酸分子で形質転換したホスト細胞。
17. 【請求項１７】 ホスト細胞が原核生物である請求項１６記載のホスト細胞
    。
18. 【請求項１８】 ホスト細胞が真核生物である請求項１６記載のホスト細胞
    。
19. 【請求項１９】 ホスト細胞が植物細胞である請求項１６記載のホスト細胞
    。
20. 【請求項２０】 請求項１記載のコレステロールの認識／相互作用アミノ酸
    コンセンサス配列を含むペプチド。
21. 【請求項２１】 タンパク質がコレステロールを認識するか否かを検出する
    方法であって、タンパク質のアミノ酸配列または核酸配列中で請求項１記載のコ
    レステロール認識／相互作用コンセンサス配列の存在または不存在を確認するこ
    とを含み、前記コンセンサス配列の存在が、コレステロールとタンパク質との相
    互作用／認識可能性を示す、タンパク質がコレステロールを認識するか否かを検
    出する方法。
22. 【請求項２２】 請求項１記載のコレステロール認識／相互作用コンセンサ
    ス配列が発現されて、分子がコレステロールと相互作用するように前記コンセン
    サス配列を分子中に導入することを含む、分子にコレステロール認識／相互作用
    を与える方法。
23. 【請求項２３】 対象中の血清コレステロールを減少させる方法であって、
    請求項１記載のコレステロール認識／相互作用コンセンサス配列が発現されて、
    コレステロールと相互作用するように、前記コンセンサス配列を含む核酸を対象
    に導入することを含む、対象中の血清コレステロールを減少させる方法。
24. 【請求項２４】 コレステロールと複合化した請求項１記載のコレステロー
    ル認識／相互作用コンセンサス配列を含むペプチドを、医薬品上容認できる希釈
    剤中、医薬品上容認できる量で投与することを含む、コレステロールを搬送する
    方法。
25. 【請求項２５】 生物学的試料中のコレステロールの増加または減少を検出
    する方法であって、 請求項１記載のコレステロール認識／相互作用コンセンサス配列を含むポリ
    ペプチドを固体支持体に固定化して固定化ポリペプチドを提供すること、 固定化ポリペプチドに試料を曝露すること、および コレステロール結合ポリペプチドの量を測定することであって、標準と比較
    したときに、標準を超える増加または減少が決定できること を含む、生物学的試料中のコレステロールの増加または減少を検出する方法。
26. 【請求項２６】 請求項１記載のコレステロール認識／相互作用コンセンサ
    ス配列を含むポリペプチドとコレステロールの間の相互作用の作用薬または拮抗
    剤である試薬または薬をスクリーニングする方法であって、 本発明の前記コンセンサス配列を含むポリペプチドを、コレステロールと前
    記ペプチドの間に相互作用が生じて、ペプチド／コレステロール複合体を形成す
    る条件下でコレステロールに曝露すること、 前記複合体を試験化合物と共にインキュベートすること、 試験化合物に応答するポリペプチドとコレステロール間の相互作用の増加ま
    たは減少を測定すること（ここで、相互作用の増加は、試験化合物が作用薬であ
    ることを示し、および相互作用の減少は、ペプチド／コレステロール結合の拮抗
    剤であることを示す。） を含む、試薬または薬をスクリーニングする方法。
27. 【請求項２７】 コレステロールと請求項１記載のコレステロール認識／相
    互作用コンセンサス配列を含むポリペプチドとの相互作用をブロックする分子。
28. 【請求項２８】 前記分子が、ペプチド、薬および抗体から成る群より選択
    される請求項２７記載の分子。
29. 【請求項２９】 請求項１記載のコレステロール認識／相互作用コンセンサ
    ス配列を含むペプチドのコレステロール結合能力を低減する方法であって、 Ｙを、チロシンからセリンに変更すること、または Ｑを、アルギニンからロイシンに変更すること を含む、ペプチドのコレステロール結合能力を低減する方法。
30. 【請求項３０】 請求項２９記載の方法により、受容体のコレステロール認
    識／相互作用機能性を低減する、周辺型ベンゾジアゼピン受容体。
31. 【請求項３１】 コレステロールと認識／相互作用できない周辺型ベンゾジ
    アゼピン受容体であって、該受容体のコレステロール相互作用／認識配列を含む
    欠失を含む周辺型ベンゾジアゼピン受容体。
32. 【請求項３２】 コレステロールの増加からもたらされる対象の病気症状を
    低減する方法であって、コレステロール認識／相互作用コンセンサス配列を含む
    ペプチドをコード化する核酸が発現されて、前記ペプチドが治療上有効な量で産
    生されるように、対象に、前記核酸を投与することを含む、コレステロールの増
    加からもたらされる対象の病気症状を低減する方法。
33. 【請求項３３】 投与が微粒子によって成される請求項３１記載の方法。
34. 【請求項３４】 請求項３０記載の周辺型ベンゾジアゼピン受容体をコード
    化する核酸を含む遺伝子組換え植物。
35. 【請求項３５】 請求項３１記載の周辺型ベンゾジアゼピン受容体をコード
    化する核酸を含む遺伝子組換え植物。
36. 【請求項３６】 誘導可能なプロモーターと操作できるように結合した周辺
    型ベンゾジアゼピン受容体をコード化する核酸を含む遺伝子組換え植物。
37. 【請求項３７】 プロモーターが、熱、構成物質の投与、植物ホルモンの投
    与のどの条件も誘導できる、請求項３５記載の遺伝子組換え植物