BR0112300B1 - Processo para identificação de composto químico, polinucleotídeo, célula hospederia, processo para preparar célula hospedeira e seu uso, proteína, processo para sua preparação e seu uso - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO PARA IDENTIFICAÇÃO DE COMPOSTO QUÍMICO, POLINUCLEOTÍDEO, CÉLULA HOSPEDEIRA, PROCESSO PARA PREPARAR CÉLULA HOS- PEDEIRA E SEU USO, PROTEÍNA, PROCESSO PARA SUA PREPARA- ÇÃO E SEU USO". A invenção refere-se a um processo amplamente aplicável para a identificação de compostos químicos, os quais modulam receptores aco- plados à proteína G por meio de novas proteínas G híbridas com especifici- dade do receptor muito ampla, bem como a compostos químicos os quais podem ser identificados por um tal processo.

Receptores acoplados à proteína G (GPCR) têm um papel impor- tante em inúmeros processos fisiológicos. Eles representam uma das famílias de proteínas mais importantes até agora conhecidas e presume-se que no ge- noma humano cerca de 1000 genes codificam para esta classe de receptores. GPCRs têm uma estrutura característica: trata-se de filamentos de peptídeos, que se enovelam sete vezes na forma de alfa-hélices pela camada dupla de fosfolipídeo da membrana celular, sendo que eles se dispõem em forma circu- lar. Avalia-se, que cerca de 60 % dos medicamentos vendidos somente com receita médica atualmente disponíveis se ligam em GPCRs. Isso acentua o pa- pel significativo desta classe de receptor para a indústria pesquisadora de me- dicamentos. Todos os receptores acoplados à proteína G funcionam segundo uma amostra básica comum: a ligação de um ligante extracelular conduz a uma mudança da conformação da proteína do receptor de modo tal, que este conta- to pode ser absorvido com uma proteína G. As proteínas G posicionadas no lado citoplasmático da membrana plasmática são os intermediários do sinal extracelular no interior da célula e podem solucionar ali diversas reações.

Os GPCRs representam as proteínas alvo terapêuticas mais significativas até agora. Aproximadamente 40 % dos medicamentos prescri- tos pelo médico atuam como agonistas ou antagonistas de GPCRs. Com base no tamanho e significado da família das proteínas e perante o fato de que para muitas GPCRs ainda não são conhecidos participantes de ligação química (GPCRs órfãos), parte-se do fato de que esta classe de receptores no futuro será um dos reservatórios mais importantes para proteínas alvo ade- quadas na busca por novos medicamentos. GPCRs são proteínas de membrana integrais. Eles transmitem um sinal intermediado por uma substância de sinal na maioria das vezes hidrófila, que é ligada do lado externo da célula, sobre uma família das pro- teínas fixadoras de guanina-nucleotídeo, as chamadas proteínas G, para o interior da célula. Com isso, em função da especificidade do receptor e das proteínas G ativadas com isso, elas provocam diferentes processos de transdução de sinal. Dependendo do tipo do receptor são provocados diver- sos efeitos, que têm todos como conseqüência a formação de "second mes- sengers". Assim, através da ativação de uma adenilato-ciclase em posição de membrana o nível cAMP intracelular pode aumentar ou cair em uma inibi- ção. A estimulação de uma fosfodiesterase cGMP específica podem condu- zir à diminuição do nível de cGMP. Além disso, a proteína G ativada pode conduzir através da ligação a um canal de íons, por exemplo, ao aumento de íons Ca2+ ou K+. Além disso, através de uma proteína G ativada pode ser provocada a ativação de uma fosfolipase e, com isso, a formação de inositol- 1,4,5-trisfosfato e diacilglicerol. Estes conduzem, novamente, ou ao aumento de Ca2+ ou à ativação de uma proteinquinase C, com outros efeitos nos dois casos. Second messenger são moléculas mensageiras intracelulares tal como por exemplo, cAMP, cGMP, Ca2+ ou outras, as quais através da ativa- ção ou desativação de proteínas intracelulares provocam reações na célula.

As proteínas G heterotrímeras encontram-se do lado interno da membrana plasmática. Elas se constituem das três subunidades alfa, beta e gama. Um receptor ativado faz contato com o heterotrímero da proteína G, a qual em seguida, dissocia para formar uma subunidade α e o complexo βγ.

Tanto a subunidade α ativada como também o complexo βγ podem influen- ciar proteínas de efetores intracelulares. A família da subunidade α da pro- teína G é atualmente dividida em quatro diferentes classes (classe Gas, Gai, Gaq e Ga 12). GPCRs são classificados correspondentemente à proteína G ligada na transdução de sinal.

Claims (22)

1. Processo para identificação de um composto químico, o dito processo sendo caracterizado pelo fato de compreende as seguintes etapas: a) fornecimento de pelo menos uma célula contendo pelo menos um trajeto de transdução de sinal dependente de GPCR e que produz uma ou mais de uma proteína G; b) fornecimento de pelo menos um composto químico a ser exami- nado; c) contato de uma célula de acordo com a) com um composto quí- mico a ser examinado de acordo com b); d) determinação do efeito quantitativo ou qualitativo de um compos- to químico de b) a ser examinado sobre o trajeto de transdução de sinal de uma célula de a) por meio de um sinal mensurável dependente do trajeto de transdução de sinal, em que pelo menos uma proteína G é selecionada dentre -6qi4myr ou - 6qs5myr, em que “-6qi4” significa que a subunidade α da proteína G da clas- se Gaq apresenta uma deleção terminal N de seis aminoácidos e uma se- quência ai no terminal C, em que “-6qs5” significa que a subunidade α da proteína G de classe Gaq apresenta uma deleção terminal N de seis amino- ácidos e uma sequência as no terminal C, e em que “myr” significa que a proteína G apresenta uma sequência de reconhecimento de miristoila- ção/palmitoilação no terminal N, sendo que, se um efeito quantitativo ou qualitativo do composto químico é determinado, o composto químico modifica a ação de pelo menos um trajeto de transdução de sinal dependente do receptor acoplado à proteína G (GPCR) de um organismo

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula fornecida de acordo com a) produz pelo menos duas proteínas G.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a célula fornecida de acordo com a) produz pelo menos du- as proteínas G escolhidas de -6qi4myr, -6qs5myr, -6qi4, -6qs5 ou Galfa16. cAMP intracelular, GPCRs da classe Gi realizam através da ativação de Gaq uma inibição da adenilatociclase e diminuem o cAMP intracelular. GPCRs da classe Gq realizam através da ativação de Gaq uma estimulação de diver- sas isoformas ΡΙΧβ e conduzem a uma hidrólise de fosfatidil-inositol-4,5- bifosfato em posição de membrana para formar diacilglicerol e inositoltrifos- fato (IP3). IP3 liberta Ca2+ de acumuladores intracelulares. A maioria dos GPCRs só podem fazer contato com uma família de subunidade α da proteína G, isto é, eles possuem seletividade para um determinado trajeto de transdução de sinal. Com a finalidade de desenvolver um processo, com cujo auxílio devem ser identificados compostos químicos, que modulam métodos de transdução de sinal dependentes de GPCR, esta especificidade estreita é muito impeditiva. Além disso, somente estes méto- dos de transdução de sinal fornecem um sinal adequado, o qual pode ser aproveitado em um tipo de ensaio com alta passagem de amostra (= High Throughput Screening = HTS)), nos quais por exemplo, a ativação da proteí- na G conduz ao aumento do nível de Ca2+ intracelular. Estas proteínas G com especificidade do receptor modificada e ligação diferenciada em um trajeto de transdução de sinal podem ser cons- truídas pela junção de componentes de diferentes proteínas G para formar proteínas G híbridas por meio dos métodos da biologia molecular e bioquí- mica. Proteínas G híbridas são constructos de fusão, que dentro de uma proteína reúnem seqüências de diferentes subunidades Ga. Assim, por exemplo, pela fusão da região de reconhecimento do receptor de Gai com a região de ativação do efetor de Gaq pode ser preparado um híbrido Gaq/i, que acolhe sinais de receptores acoplados a Gi, mas liga o trajeto de trans- dução de sinal Gaq-PLCp. Um tal híbrido, no qual os 5 aminoácidos com terminação C de Gaq foi substituído pela seqüência Gai correspondente (Gaqi5), foi descrito pela primeira vez por Conklin e outros, Nature 363, 274 -276 (1993). Este "reacoplamento" de receptores tem a vantagem de que o produto final do ensaio (aumento da concentração de Ca2+ intracelular em

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a célula fornecida de acordo com a) produz uma proteína apresentando uma sequência de aminoácidos de acordo com Seq ID No 4.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a célula de acordo com a) é a célula de uma espécie de vertebrado, de uma espécie de inseto, de um C. elegans ou de uma levedura.

6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula HeLa, 293, COS, CHO ou uma célula de Saccharomyces cerevisiae.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende usar a concentração de Ca2+ intracelular para a determinação do efeito quantitativo ou qualitativo de um composto químico a ser examinado por meio de um sinal mensurável de- pendente do trajeto de transdução de sinal como definido na reivindicação 1 d).

8. Processo para identificação de um composto químico de a- cordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de destinar-se a identificar um medicamento.

9. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de compreender uma sequência de polinucleotídeos, em que a sequência de polinucleotídeo é uma sequência de polinucleotídeo de acordo com a Seq ID No 3 ou a se- quência complementar correspondente.

10. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 9, caracteri- zado pelo fato de que o polinucleotídeo é componente de uma construção (construto) de vetor recombinante.

11. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 10, caracteri- zado pelo fato de que a construção do vetor recombinante é um vetor de expressão aplicável em eucariontes e/o procariontes.

12. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 11, caracteri- zado pelo fato de que o vetor de expressão contém um promotor constitutivo comparação com a inibição da adenilatociclase) é mais facilmente acessível por processos técnicos de medição e pode ser empregada no High- Throughput-Screening, A desvantagem deste constructo de fusão Gaq/ Gai é, no en- tanto, que elas não podem ativar alguns GPCRs tal como por exemplo, o receptor SSTR1 qi5 (Conklin e outros, Mol. Pharmacol. 50, 885 - 890 (1996)). Foram descritas igualmente constructos de fusão entre Gaq e Gas. Também estas possuem a desvantagem de não poderem ligar todos os receptores acoplados a Gs tal como por exemplo, o receptor adrenérgico β2 ou o receptor dopamina D1 ao trajeto de transdução de sinal ΡΙΧβ. Além das modificações do terminal C para a mudança da ligação de receptores a determinados métodos de transdução de sinal, foi descrita uma modificação terminal N de Gaq, que conduz a promiscuidade do re- ceptor. Por promiscuidade do receptor deve ser compreendida, com isso, a capacidade de uma proteína G de captar e encaminhar sinais de diferentes receptores. Neste caso, trata-se de uma proteína Gaq, na qual a região abrangendo 6aa, N-terminal, altamente conservada, foi deletada (Kostenis e outros, J. biol. Chem. 272,19107 - 19110 (1997)). Esta deleção permite ao Gq resultante (também mencionado -Gq) não receber somente sinais de receptores acoplados a Gq, mas também a Gs ou Gi/o e encaminhar ao ΡίΟβ. Esta subunidade Ga abrange agora também receptores tal como o receptor somatostatina SSTR1, a dopamina D1 e o receptor β2 adrenérgi- co. Todavia, o receptor edg5 também pode não ser abrangido por esta pro- teína G. Além disso, a intensidade de sinal desta proteína G é tão fraca que não pode ser empregado na prática (Kostenis e outros, J. Biol.Chem. 272, 19107-19110(1997)). Além disso, com Ga16 é conhecida uma subunidade Ga que liga GPCRs de diferentes classes funcionais ao trajeto de transdução de si- nal PLX$-Ca2+. Neste caso, trata-se praticamente de uma proteína G não seletiva por natureza. Mas também esta subunidade não é aplicável univer- e/ou induzível.

13. Célula hospedeira, que é uma célula de uma bactéria ou de uma levedura, caracterizada pelo fato de compreender um polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 12.

14. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 13, carac- terizada pelo fato de que a célula é uma célula de Escherichia coli ou Sac- charomyces cerevisiae.

15. Processo para preparar uma célula hospedeira, caracteriza- do pelo fato de compreender a introdução de um polinucleotídeo como defi- nido em qualquer uma das reivindicações 9 a 12 em uma célula eucariótica ou procariótica.

16. Processo para preparar uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira preparada é uma célula humana.

17. Processo para preparar uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira preparada é uma célula de uma espécie de vertebrado, de uma espécie de inseto, de um C. elegans, de uma bactéria ou de uma levedura..

18. Processo para preparar uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira preparada é uma célula HeLa, 293, COS, CHO, uma célula de Escherichia coli ou Saccharomyces cerevisiae.

19. Uso de uma célula hospedeira como definida na reivindica- ção 13 ou 14 ou como produzida pelo processo definido em qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizado pelo fato de que é em um proces- so como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

20. Proteína, caracterizada pelo fato de que apresenta uma se- quência de aminoácidos de Seq ID No 4.

21. Processo para preparação de uma proteína como definida na reivindicação 20, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes eta- pas: a) produção de uma célula hospedeira pelo processo definido em salmente, pois receptores tal como o receptor edg5 ou o receptor somatos- tatina SSTR1 não acoplam ou só acoplam fracamente ao Ga16. Por este motivo, seria de grande utilidade se estivesse à disposição uma proteína G que pudesse ser ativada por outras classes funcionais dos GPCRs e, além disso, fornecesse na célula um sinal suficientemente forte, o qual pudesse ser aproveitado em um ensaio, especialmente em um ensaio High Throuhput para a identificação de compostos que modulam GPCRs e/ou os métodos de transdução de sinal em cada caso dependentes, tal como por exemplo, o aumento ou a redução da concentração de Ca2+ intracelular. O objetivo da presente invenção consiste, portanto, em pôr à disposição outras proteínas G híbridas para processos de separação para a identificação de compostos químicos, que se destacam pelo fato de apre- sentarem uma especificidade muito ampla com respeito aos GPCRs reco- nhecíveis e acoplam estas proteínas G a um método de sinal que conduz ao aumento da concentração de Ca2+ intracelular. Adicionalmente, eles são ex- pressos tão intensamente, que a intensidade do sinal é aperfeiçoada. A invenção refere-se a um processo para a identificação de um composto químico, o qual modifica o efeito de pelo menos um dos métodos de transdução de sinal dependente do receptor acoplado a uma proteína G (GPCR) de um organismo biológico, sendo que o dito processo contém as seguintes etapas de processo: a) preparação de pelo menos uma célula contendo pelo menos um trajeto de transdução de sinal dependente de GPCR, no qual é preparada uma ou mais do que uma proteína G; b) preparação de pelo menos um composto químico a ser exami- nado; c) o contato de uma célula de acordo com a) com um composto químico a ser examinado de acordo com b); d) determinação do efeito quantitativo ou qualitativo de um com- posto químico de b) a ser examinado sobre o trajeto de transdu- ção de sinal de uma célula de a) por meio de um sinal mensurá- vel dependente do trajeto de transdução de sinal. uma das reivindicações 15 a 18; b) cultivo da célula hospedeira de a) em um meio de crescimento adequado para a célula hospedeira e também possivelmente a indução da expressão da proteína; c) obtenção do material da célula de b), desintegração das células; d) separação de uma proteína como definida na reivindicação 20 de outras proteínas da desintegração das células de c).

22. Uso de uma proteína como definida na reivindicação 20, ca- racterizado pelo fato de que é para a produção de anticorpos. A modificação do efeito de pelo menos um trajeto de transdução de sinal dependente de um receptor acoplado à proteína G (GPCR) de um organismo biológico, pode ser efetuada inibindo ou estimulando. Existe um efeito inibidor de um composto químico, quando o sinal mensurável depen- dente do trajeto de transdução de sinal precipita mais fraco na presença do composto químico do que se este é suprimido. Compostos que provocam um tal efeito também são chamados de antagonistas. Por outro lado, existe um efeito estimulante de um composto químico quando o sinal mensurável dependente do trajeto de transdução de sinal precipita com mais força do que se o composto químico fosse suprimido. Tais compostos também são mencionados de agonistas. Em uma maneira de execução preferida o pro- cesso serve-se de uma célula, na qual são preparadas pelo menos duas proteínas G. Estas proteínas G podem depender de uma ou de GPCRs dife- rentes. Fundamentalmente para a realização do processo podem ser toma- das em consideração todas as proteínas G adequadas, a despeito de sua especificidade do receptor, sua seqüência, sua constituição, a procedência com relação à célula, tecido ou órgão ou com relação à espécie, para as quais elas são específicas. De preferência, prepara-se na célula pelo menos uma proteína G de -6qi4myr, -6qs5myr, -6qi4, -6qs5. No caso das proteínas G -6qi4myr, -6qs5myr, -6qi4, -6qs5 trata-se de proteínas G híbridas, que foram compostas de partes de diferentes proteínas G do camundongo e em alguns casos contêm modificações adicionais. As proteínas G podem ser preparadas a partir da própria célula ou em combinação. Especialmente a partir de uma célula, apesar das proteínas G híbridas já citadas, também pode ser preparada Galfa16. Cada uma das proteínas G pode apresentar-se isolada ou em combinação com uma ou várias outras proteínas G em uma célula. A preparação de Galfal 6 em uma célula deve ser efetuada, com isso, sempre de modo tal que ela nunca seja preparada sozinha mas sim, em combinação com um outra das proteínas G citadas acima. As seqüências de aminoácidos das proteínas G preferidas são publicadas para -6qi4myr em Seq Dl n° 2. para -6qi5myr em Seq ID n° 4, para —6qi4 em Seq ID n° 6, -6qs5 em Seq ID n° 8 e para Galfa em Seq ID n° A preparação de um composto químico é efetuada usualmente em forma dissolvida. De preferência, para a solução do composto químico emprega-se água. A solução pode conter além do solvente, substâncias tampão, sais ou substâncias auxiliares tal como promotores de dissolução, detergentes, substâncias conservadoras ou outro. A preparação de uma célula abrange sua preparação, cultivo e transformação. A preparação é efetuada, por exemplo, pela preparação do material de célula adequado de órgãos ou tecidos ou pela multiplicação de linhas de células adequadas ou microorganismos. Para o cultivo podem ser empregados diversos meios nutritivos adequados. As células são mantidas nas ótimas temperaturas para o organismo. Eventualmente acrescentam-se ao meio de crescimento empregado agentes de conservação, antibióticos, indicadores de pH, componentes de soro de sangue, soro de sangue, sub- stâncias auxiliares e outro. Processos para a preparação, cultivo e transfor- mação são descritos em obras padrão, (exemplo: Basic Cell Culture; Ed. J.M. Davis; IRL Press; 1994). No processo descrito acima, em formas de execução preferidas, é preparada a célula de uma espécie de vertebrado, de uma espécie de in- seto, de um C elegans ou de uma levedura. Em formas de execução parti- cularmente preferidas é preparada a célula de uma célula HeLa, 293, COS, CHO ou Saccharomyces cerevisiae. Para a determinação do efeito quantitativo ou qualitativo de um composto químico a ser examinado no trajeto de transdução de sinal de uma célula de um sinal mensurável, dependente do trajeto de transdução de si- nal, aplica-se em uma forma de execução preferida a concentração Ca2+ in- tracelular. A mudança da concentração Ca2+ intracelular pode ser compro- vada, por exemplo, pela aplicação de Aequorin, um corante, ou pela tecno- logia FLIPR™ da Firma "Molecular Devices". Os processos descritos tal como acima podem ser empregados em uma forma de execução preferida para a identificação de um medica- mento. A invenção refere-se também a pelo menos um composto quími- co, o qual modifica o efeito de pelo menos um trajeto de transdução de sinal dependente do receptor acoplado à proteína G (GPCR) de um organismo biológico, sendo que este composto químico foi identificado por pelo menos um processo desta invenção. Estes compostos químicos poderíam abranger, por exemplo, mudanças com respeito à estrutura química de substâncias de sinal hidrófilas, que induzem GPCRs, tal como determinados hormônios, substâncias aromáticas, determinados medicamentos. A invenção refere-se além disso, a uma seqüência de polinucle- otídeos codificando para um polipeptídeo com a propriedade de uma proteí- na G, sendo que o polipeptídeo é escolhido a partir de uma das seqüências abaixo: a) um polipeptídeo com uma seqüência de aminoácidos de acordo com a Seq ID n° 2, Seq ID n° 4, Seq ID n° 6 ou Seq ID n° 8; b) um polipeptídeo de acordo com a), ao qual faltam um ou mais aminoácidos; c) um polipeptídeo de acordo com a), no qual estão acrescentados um ou mais aminoácidos; d) uma variante alela do polipeptídeo de acordo com a). As variantes alelas abrangem todos os polipeptídeos, que re- sultam de uma composição de bases da forma característica do gene no locus definido para os respectivos participantes das quotas das proteínas híbridas. A invenção refere-se, além disso, a um polinucleotídeo contendo uma seqüência de polinucleotídeo em que a seqüência de polinucleotídeo é escolhida a partir de uma das seqüências abaixo: a) uma seqüência de polinucleotídeo de acordo com Seq ID n° 1, Seq ID n° 3, Seq ID n° 5 ou Seq ID n° 7 ou da seqüência complementar cor- respondente; b) uma seqüência de polinucleotídeo, que hibridiza sob condi- ções estringentes com uma seqüência de polinucleotídeo de acordo com a). A estringência de uma solução é determinada por sua tempera- tura e teor de sal. Com a estringência pode ser ajustada a extensão do em- parelhamento das bases de duas seqüências de nucleotídeos homólogas. A estringência depende do comprimento e da composição da base de um poli- nucleotídeo. Há condições estringentes no sentido da invenção, quando a sequência de polinucleotídeo e a seqüência hibridizante apresentam uma concordância de 95 % ou mais. Uma forma de execução preferida de uma seqüência de polinu- cleotídeo ou de um polinucleotídeo tal como descrito acima é um polinucleo- tídeo, o qual é componente de uma construção de vetor recombinante. Construções de vetores recombinantes podem ser preparadas com auxílio da respectiva ciência, tal como representada por exemplo, em "F.M. Ausubel e outros, “Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, New York". Com isso, um polinucleotídeo codificando para uma seqüência de aminoáci- dos de acordo com uma das informações de seqüência (Seq ID n° 2, 4, 6,8) descritas acima ou uma seqüência de polinucleotídeo de acordo com uma das informações de seqüência (Seq ID n° 1, 3, 5, 7) descritas acima, é in- corporado em um vetor básico. Como vetor básico deve ser compreendido um vetor, no qual uma seqüência de polinucleotídeo de um polinucleotídeo é incorporado por meio dos métodos da biologia molecular e pode ser clonado em um microorganismo, por exemplo, em uma bactéria, fungo ou na célula de uma cultura de células. O vetor básico pode constituir-se por exemplo, de um plamídeo com um marcador de resistência ao antibiótico, de um "origin of replication" adequado para a multiplicação do plasmídeo em bactérias ou em culturas de células, bem como de um promotor adequado para a expres- são de uma proteína. O vetor básico, por exemplo, também pode constituir- se de um vetor fago, de um vetor fagemídeo, de um vetorfasmídeo, de um vetor cosmídeo, de um vetor vírus, de um vetor YAC ou de outros tipos de vetores. Exemplos de vetores básicos são pUC 18, pUC19, pBluescript, pKS, pSK e outros. A incorporação do polinucleotídeo a ser incorporado é efetuada através de sítios de restrição adequados por meio de enzimas de restrição correspondentes, as quais são oferecidas comercialmente pelas firmas como BioLabs, Roche Diagnostics, Stratagene e outros. Tais sítios de restrição podem ser, por exemplo, os locais de reconhecimento das enzimas de restrição BamHI, EcoRI, Sall, EcoRV e outras. A construção do vetor recombinante constitui-se em uma forma de execução preferida a partir de um vetor de expressão aplicável em euca- riontes e/ou procariontes. Um vetor de expressão contém um promotor, que pode ser ligado funcionalmente com uma seqüência de polinucleotídeos, de modo que uma proteína codificada por esta seqüência de polinucleotídeo é sintetizada em um organismo biológico, por exemplo, em uma bactéria, fun- go ou na célula de uma linhagem de células eucarióticas. O promotor pode ser induzível por exemplo, por meio de triptofano ou ele pode ser constituti- vamente ativo. Exemplos de vetores de expressão são pUC18, pUC19, pBluescript, pcDNA3.1 ou outros. A invenção refere-se, além disso, a uma célula hospedeira, a qual pode conter um polinucleotídeo ou uma construção de vetor recombi- nante tal como descrito acima. A célula hospedeira constitui-se em uma for- ma de execução preferida de uma célula humana. Em outras formas de exe- cução preferidas a célula hospedeira constitui-se de uma célula de uma es- pécie de vertebrado, de uma espécie de inseto, de um C. elegans, de uma bactéria ou de uma levedura. Em formas de execução particularmente prefe- ridas a célula constitui-se de uma célula HeLa, 293, COS, CHO, da célula de uma Escherichia coli ou da célula de um Saccharomyces cerevisiae. Além disso, podem ser aplicadas outras células eucarióticas, especialmente linhas de células, bactérias, especialmente Bacillus spec., Streptomyces spec. ou fungos, especialmente Penicillium spec, Aspergillus spec. A invenção refere-se, além disso, à preparação de uma célula hospedeira tal como descrita acima mediante introdução de um polinucleotí- deo de acordo com uma ou várias das seqüências de polinucleotídeos tal como publicado em Seq ID nQ (1 - 8) ou de uma construção de vetor recom- binante caracterizada tal como acima em uma célula eucariótica ou procarió- tica. A introdução das seqüências de polinucleotídeos pode ser efetuada, por exemplo, por eletroporação ou transformação das células eucarióticas ou procarióticas com a seqüência de polinucleotídeo, além disso, pela precipita- ção de fosfato de Ca2+ das células eucarióticas ou procarióticas junto com a seqüência de polinucleotídeo ou outros métodos. Uma tal célula hospedeira pode ser empregada para a realiza- ção de um processo desta invenção descrito acima. A invenção refere-se também a uma proteína com uma seqüên- cia de aminoácidos escolhida a partir das seqüências abaixo: Seq ID n° 2, Seq ID n9 4, Seq ID n9 6, Seq ID n9 8. Além disso, a invenção refere-se a um processo para a prepara- ção de uma proteína constituída de uma seqüência de aminoácidos escolhi- da a partir de uma das seqüências Seq ID n° 2, Seq ID n° 4, Seq ID n° 6, Seq ID n° 8 contendo as seguintes etapas do processo: a) preparação de uma célula hospedeira contendo uma seqüência de polinucleotídeo correspondente e preparada tal como descrito acima; b) cultivo desta célula hospedeira em um meio de crescimento adequado para a célula hospedeira, bem como eventualmente a indução da expressão da proteína; c) obtenção de um material de célula e desintegração das células; d) separação de uma proteína por meio de métodos bioquímicos para a purificação da proteína. Para a preparação e purificação das proteínas citadas podem ser empregados correspondentemente métodos conhecidos tal como des- critos em "F. M. Ausubel e outros, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, Nova Iorque". Uma proteína com uma seqüência de aminoácidos de acordo com Seq ID n° 2, 4, 6, 8 ou preparada de acordo com o processo represen- tado pode ser empregada para a preparação de anticorpos. Exemplos Exemplo 1: Ativação de um trajeto de transdução de sinal pelo mutante de proteína Ga -6q por diferentes receptores Células COS7 foram cultivadas em DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s Médium) com adição de 10 % de FCS (soro de vitela fetal) a 37°C (5 % de C02). Para transfecções foram semeadas 1 x 106 células em placas de 100 mm. Aproximadamente 24 horas mais tarde as células com os plasmí- deos de expressão aq ou -6q (1 pg de DNA/100 mm de placa) e em cada caso uma das construções de receptor abaixo (4 pg de DNA/100 mm de pla- ca) foram co-transformadas: M2 (receptor muscarina em pCD), D2 (receptor dopamina em pCDNAI), kappa (receptor opióide em pCDNA3), SSTR1 (re- ceptor somatostatina em pCMV), A1 (receptor adenosina em CDM7), D1 (receptor dopamina em pCDNAI), V2 (receptor vasopressina em pCD-ps), β2 (receptor adrenérgico em pSVL). Cerca de 24 horas após a transfecção as células foram divididas em placas de 6 cavidades em porções iguais e em DMEM acrescentados 3 pCi/ml de [aH]mio-inositol (20 Ci/mmoles). Depois de 24 horas de incubação as células foram incubadas à temperatura ambiente com HBSS (+ 10 mM de LiCI) durante 20 minutos. Depois as células foram estimuladas durante uma hora com os agonistas correspondentes e o aumento dos monofosfatos de inositol intracelulares foi determinado pela cromatografia de troca de ânions. Aos mutantes de proteína Ga -6q, comparados com a seqüência de tipo sel- vagem, faltam os seis radicais de aminoácido altamente conservados da ex- tremidade aminoterminal. Tais construções estão representadas na figura 1 com relação ao terminal amino. A seqüência de tipo selvagem é denominada como aq (WTq). Os resultados a seguir foram obtidos com a construção da proteína Ga-6q. A figura 1 fornece, além disso, ainda outros exemplos de seqüências. A preparação destes mutantes ou das construções de recepto- res empregados foi efetuada com auxílio de métodos padrão da biologia molecular tal como descrito pormenorizadamente, por exemplo, em "F.M. Ausubel e outros, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, Nova Iorque". Células COS7, que expressam os receptores WTq ou -6q e dife- rentes receptores acoplados a Gi/o- (A) ou Gs (B), foram incubadas durante uma hora (37°C) na presença e ausência dos agonistas correspondentes (ver abaixo). O aumento da concentração IP1 intracelular foi medido no pro- tocolo 1 anexo. Os dados representam valores médios + S.E. de 3-7 experi- mentos independentes, enumerados em cada caso como determinações triplas. Foram utilizados os ligantes abaixo: Figura 2 A: m2 (receptor muscarina): carbacol (100 pM); D2 (re- ceptor dopamina): (-)-quinpirol (10pM); kappa (receptor opióide): (-)-1150488 (10pM); SSTR1 (receptor somatostatina): somatostatina 14 (1μΜ): B, A1 (re- ceptor adenosina): R(-)-PIA (10mM); Figura 2 B: D1 (receptor dopamina): dopamina (1 mM): V2 (re- ceptor vasopressina): AVP (1 nM); β2 (receptor adrenérgico): (-)-isoproterenol (200μΜ). Os números abaixo das figuras indicam a extensão da respectiva estimulação PLC como aumento relativo da estimulação PLC de -6q para WTq. Da figura 2 é evidente que o mutante da proteína Ga -6q esti- mula uma formação IP1 em função de diferentes classes de receptores. IP1 é uma molécula de sinal, a qual se origina no trajeto de transdução de sinal PLC-β e no decurso seguinte da transmissão do sinal conduz ao aumento da concentração de Ca2+ intracelular. Os resultados do ensaio para -6q na figu- ra 2 estão colocados em relação com a estimulação por meio da construção do tipo selvagem (WTq) e de um outro controle com a construção do vetor sem qualquer inserção Ga (vetor). A liberação de IP1 por meio da constru- ção -6q é conseguida tanto com receptores acoplados com Gi/o (figura 2 A: m2, D2, k-OR, SSTR1, A1) como também com receptores acoplados com Gs (figura 2 B:D1,V2, β2). Exemplo 2: Preparação de mutantes de alta expressão de proteínas Ga com ampla especificidade com o receptor Inicialmente foram construídas subunidades α de proteína G hí- bridas, às quais faltam os seis aminoácidos altamente conservados do ter- minal amino e que apresentam simultaneamente no terminal C ou uma se- qüência ai ou as. Correspondentemente à seqüência ai ou seqüência as contida, a denominação é efetuada com -6qi4 ou -6qs5. A construção —6qi4 liga os receptores acoplados ao Gs bem como alguns Gi/o com o trajeto de transdução de sinal ΡΙΧβ. Esses receptores abrangem também o receptor SSTR1 ou o receptor edg5. O receptor edg5 não pode ser ligado com o Ga16 ao trajeto de transdução de sinal ΡΙ_Οβ. Ga16 é uma proteína G com ampla especificidade com o receptor, o qual é publicado na WO 97/48820 (título: Promiscuous G-protein compositions and their use). A construção -6qs5 liga os receptores acoplados a Gi/o bem como aos Gs adicionais ao trajeto de transdução de sinal ΡΙ_Οβ e abrange agora também receptores tal como a dopamina D1 ou o receptor β2 adre- nérgico. Uma combinação destas duas subunidades α de proteína G em uma linha de células abrange, com isso, um outro espectro de GPCRs como cada subunidade por si ou Ga16. A aplicabilidade em processos de separação técnicos poderia ser ulteriormente aperfeiçoada se a expressão destas subunidades Ga (- 6qi4; -6qs5) fosse aumentada, pois com isso também poderia ser obtido um sinal mais forte. Por este motivo seqüências de reconhecimento de miristoila- ção/palmitoilação adicionais foram incorporadas na região aminoterminal das subunidades Ga. Isto conduziu à construção das proteínas G -6qi4myr e - 6qs5myr. A seqüência de proteínas de -6qi4myr e -6qs5myr com relação ao terminal amino é MGCC diferentemente de MACC da seqüência de partida das variantes -6q. As novas construções -6qi4myr e -6qs5myr contêm ago- ra uma seqüência de consenso para a miristoilação/palmitoilação. -6qi4myr foi preparado a partir de -6qi4 e -6qs5myr a partir de -6qs5. Sabe-se, que a remoção de radicais miristila ou palmitila em proteínas G conduzem a uma redivisão na célula: perda de radicais palmitato ou miristato influenciam a amostra de expressão das proteínas G de maneira tal, que a remoção dos radicais de ácido graxo tem como conseqüência uma localização principal- mente citosólica. Subunidades α de proteína G são encontradas tanto na membrana celular como também no citosol. No entanto, somente as proteí- nas G na posição da membrana podem transmitir os sinais dos GPCRs aos efetores intracelulares. Somente as conseqüências da remoção de uma se- qüência de consenso para palmitoilação/miristoilação por mutação eram co- nhecidas. Ao contrário, não se sabia, que a introdução do local de consenso adicional para a miristoilação/palmitoilação nos mutantes de deleção Ga conduz ao aumento da expressão. Pôde ser mostrado, que a introdução de locais de palmitoilação/miristoilação adicionais aumenta a quantidade de subunidade Ga na membrana celular (figura 3, figura 4). No Westemblot SDS-PAGE (Westemblot de eletroforese de gel de poliacrilato de dode- cilsulfato de sódio) da figura 3 reconhece-se que a expressão de -6qi4myr em comparação com -6qi4 é nitidamente maior. Na figura 4 está represen- tado um Westemblot SDS-PAGE de um fracionamento em fração particular (p; contendo membranas) e fração solúvel (s; sc) de qwt e -6qi4myr. A vari- ante mais miristoilada/palmitoilada -6qi4myr só está contida na fração parti- cular. Em cada caso 20 pg de proteínas de membrana foram prepara- das para este fim a partir de células COS7 transfectadas, separadas por eletroforese de gel SDS-PAGE (10 %) e analisadas por meio de análise Westemblot com o emprego do anticorpo monoclonal 12CA5 (Roche Biosci- ences). Todas as subunidades α de proteína G foram detectadas com o anticorpo monoclonal 12CA5 (acoplado a peroxidase de rábano silvestre), que está voltado contra o epítopo HA tag. O Ha-tag está contido em todas as construções de proteína G. Em qwt e qi5 ele substitui os aminoácidos 125- 130, nas proteínas G deletadas no terminal N (-6q, -6qi4, -6qi4myr) os ami- noácidos 119-124. Em cada caso, 20 pg de proteína de membrana prepara- da a partir de células COS7 transfectadas foram separadas por meio de ele- troforese de gel SDS PAGE, marcadas sobre nitrocelulose e as subunidades α de proteína G detectadas com o anticorpo 12CA5. Proteínas G imunorea- tivas foram tornaram-se visíveis com um sistema de quimioluminescência (Amersham). Exemplo 3: Estimulação de diferentes proteínas Ga altamente expressas com ampla especificidade com o receptor através de diferentes receptores A estimulação das variantes Ga altamente expressas -6qs5myr e —6qi4myr por diferentes receptores está representada na figura 5 e na figu- ra 6. Na figura 5 reconhece-se que -6qi4myr (=A6qi4myr) é ligado por re- ceptores acoplados a Gi/o (por exemplo, dopamina D2, edg5, CCR5, SSTR1, KOR) ao trajeto de transdução de sinal PLC e conduz a um alto si- nal, o qual decorre proporcional à liberação de Ca2+. Como controle foram empregados uma construção de vetor bem como a proteína Ga16 (+16). A figura 6 mostra, que receptores acoplados a Gs são ligados por -6qs5myr (=A6qs5myr) ao trajeto de transdução de sinal ΡΙΧβ. Como referência serve também aqui a proteína G Ga16. Para a determinação experimental do Ca2+ liberado por meio do sistema Aequorin, células CHO foram co-transfectadas com o plasmídeo de expressão Apoaequorin cytAEQ/pCDNAI, o receptor indicado DNA (SSTR1, KOR, D2, D1, beta2) bem como as subunidades α G16 da proteína G e - 6qi4myr com o emprego de lipofectamina. Depois de 10 horas de incubação em meio OPTIMEM as células foram lavadas uma vez com RPMI 1640 e incubadas com 5 pM de coelenterazina f em RPMI 1640 durante 2 horas a 37°C. Depois as células foram lavadas duas vezes com PBS e estimuladas com agonistas de receptor correspondentes: somatostatina 14 para o receptor SSTR1, U50488 para o receptor kappa opióide, (-)-quinpirol para o receptor dopamina D2, dopamina para o receptor dopamina D1 e isoproterenol para o receptor beta2. Estimulação de agonistas dos receptores acoplados a Gi/o (SSTR1, KOR, D2) e dos receptores acoplados a Gs (D1, beta2) conduzem à ativação da proteínas G G16, bem como - 6qi4myr com estimulação seguinte do PLCp e liberação de Ca intracelular. Ligação Ca ao complexo Apoaequorin-coelenterazina conduz à emissão de luz, a qual foi medida com um luminômetro (TOPCount, Hewlett Packard). Descrição das figuras: Figura 1 representa um alignement das regiões aminoterminais de diferentes proteínas Ga. Figura 2 mostra uma estimulação do trajeto de transdução de sinal PLCp por meio da variação da proteína -6q-Ga por receptores acopla- dos a Gi/o (A) e acoplados a Gs (B) com o emprego da maior concentração possível do respectivo agonista, Figura 3 mostra um Westemblot SDS-PAGE com a expressão de -6qi4myr que é aumentada em comparação com -6qi4. Além disso, é mostrada a expressão de outras proteínas Ga. Na figura 4 é ilustrado um Westemblot SDS-PAGE, no qual está representado um fracionamento em fração particular (p; contendo membra- nas) e fração solúvel (s; sc) de qwt e -6qi4myr. As subunidades de proteína G foram detectadas com o anticorpo monoclonal 12CA5 e fornecem bandas de proteína em um tamanho de -42 KD. A figura 5 mostra a ligação de diversos receptores acoplados a Gi/o por -6qi4myr (=A6qi4myr) ao trajeto de transdução de sinal PLCp. D2, kappa e SSTR1 são receptores acoplados a Gi/o. Como controles foram empregados uma construção de vetor bem como a proteína Ga16 (+16). Figura 6 mostra, que receptores acoplados a Gs são ligados através de -6qs5myr (=A6qs5myr) ao trajeto de transdução de sinal ΡΙΧβ. β1, β2 e D1 são receptores acoplados a Gs. Como referência serve um constructo de vetor e a proteína G Ga16 (+16). Figura 7 mostra a ligação do receptor dopamina D2 acoplado a Gi/o ao trajeto de transdução de sinal PU^-Ca na presença da subunidade ocG16 pouco sensível, na presença da subunidade Ga muito sensitiva - 6qi4myr bem como em combinação de G16 e -6qi4myr. É evidente, que a ativação potente da liberação do cálcio pelo -6qi4myr não é prejudicada pela presença de G16. Listagem de Seqüência <110> Aventis Pharma Deutschland GmbH <120> "PROCESSO AMPLAMENTE APLICÁVEL PARA A IDENTIFICAÇÃO DE MODULADORES DE RECEPTORES ACOPLADOS À PROTEÍNA G" <130> AVE D-2000/A033 <140> <141> <160> 10 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1080 <212> DHA <213> Mus musculus <400> 1 atgactctgg agtccatcat ggcgtgctgc ctgagcgagg aggccaagga agcccggcgg 60 atcaacgacg agatcgagcg gcacgtccgc agggacaagc gggacgcccg ccgggagctc 120 aagctgctgc tgctcgggac aggagagagt ggcaagagta cgtttatcaa gcagatgaga 180 atcatccatg ggtcaggata ctetgatgaa gataaaaggg gcttcaccaa gctggtgtat 240 cagaacatet tcacggccat gcaggccatg atcagagcca tggacacact caagatccca 300 tacaagtatg agoacaataa ggctcatgca caattagttc gagaagttga tgtggagaag 360 gtgtctgctt ttgagaatcc atatgtagat gcaataaaga gtttatggaa tgatcctgga 420 atccaggaat gctatgatag acgacgagaa tatcaattat ctgactctac caaatactat 480 cttaatgact tggaccgcgt agctgaccct gcctacotgc ctacgcaaca agatgtgctt 540 agagttcgag tccccaccac agggatcatc gaatacccct ttgacttaoa aagtgtcatt 600 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