NO330684B1 - In vitro fremgangsmate for identifisering av GPRCR modulatorer. - Google Patents
In vitro fremgangsmate for identifisering av GPRCR modulatorer. Download PDFInfo
- Publication number
- NO330684B1 NO330684B1 NO20030068A NO20030068A NO330684B1 NO 330684 B1 NO330684 B1 NO 330684B1 NO 20030068 A NO20030068 A NO 20030068A NO 20030068 A NO20030068 A NO 20030068A NO 330684 B1 NO330684 B1 NO 330684B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- protein
- cell
- signal transduction
- proteins
- receptor
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 28
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims description 4
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 claims abstract description 69
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 claims abstract description 68
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims abstract description 40
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 10
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 claims abstract 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 48
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 20
- 230000026792 palmitoylation Effects 0.000 claims description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 6
- 230000007498 myristoylation Effects 0.000 claims description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 abstract 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 abstract 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 abstract 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 abstract 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract 1
- 102000034286 G proteins Human genes 0.000 description 60
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 54
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 54
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 18
- 102000034354 Gi proteins Human genes 0.000 description 14
- 108091006101 Gi proteins Proteins 0.000 description 14
- 108050001286 Somatostatin Receptor Proteins 0.000 description 11
- 102000011096 Somatostatin receptor Human genes 0.000 description 11
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 11
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 101000887167 Gallus gallus Gallinacin-6 Proteins 0.000 description 9
- 101000887235 Gallus gallus Gallinacin-9 Proteins 0.000 description 9
- 101000608766 Mus musculus Galectin-6 Proteins 0.000 description 9
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 9
- 102000034353 G alpha subunit Human genes 0.000 description 7
- 108091006099 G alpha subunit Proteins 0.000 description 7
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 5
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 5
- 108020001588 κ-opioid receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000015554 Dopamine receptor Human genes 0.000 description 4
- 108050004812 Dopamine receptor Proteins 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 3',5'-cyclic GMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 102100031819 Kappa-type opioid receptor Human genes 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000011011 Sphingosine 1-phosphate receptors Human genes 0.000 description 3
- 108050001083 Sphingosine 1-phosphate receptors Proteins 0.000 description 3
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 3
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- RIRGCFBBHQEQQH-SSFGXONLSA-N (-)-n6-(2-phenylisopropyl)adenosine Chemical compound C([C@@H](C)NC=1C=2N=CN(C=2N=CN=1)[C@H]1[C@@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C1=CC=CC=C1 RIRGCFBBHQEQQH-SSFGXONLSA-N 0.000 description 2
- 102000009346 Adenosine receptors Human genes 0.000 description 2
- 108050000203 Adenosine receptors Proteins 0.000 description 2
- 108060003345 Adrenergic Receptor Proteins 0.000 description 2
- 102000017910 Adrenergic receptor Human genes 0.000 description 2
- 108010000239 Aequorin Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000004076 Dopamine D1 Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108090000511 Dopamine D1 Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000004980 Dopamine D2 Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108090001111 Dopamine D2 Receptors Proteins 0.000 description 2
- 108091006068 Gq proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000052606 Gq-G11 GTP-Binding Protein alpha Subunits Human genes 0.000 description 2
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000014415 Muscarinic acetylcholine receptor Human genes 0.000 description 2
- 108050003473 Muscarinic acetylcholine receptor Proteins 0.000 description 2
- 108090000137 Opioid Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000003840 Opioid Receptors Human genes 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 101100221606 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS7 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 2
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 2
- 102000004136 Vasopressin Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108090000643 Vasopressin Receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000001800 adrenalinergic effect Effects 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N argipressin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N1)=O)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)C1=CC=CC=C1 KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 108010014499 beta-2 Adrenergic Receptors Proteins 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 150000001982 diacylglycerols Chemical class 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 2
- -1 inositol monophosphates Chemical class 0.000 description 2
- 102000048260 kappa Opioid Receptors Human genes 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 229950001037 quinpirole Drugs 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 2
- 238000011191 terminal modification Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- JWZZKOKVBUJMES-UHFFFAOYSA-N (+-)-Isoprenaline Chemical compound CC(C)NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 JWZZKOKVBUJMES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QXOQNNAWFUXKMH-UHFFFAOYSA-N 1-(Malonylamino)cyclopropanecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)NC1(C(O)=O)CC1 QXOQNNAWFUXKMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CNWINRVXAYPOMW-FCNJXWMTSA-N 1-stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phospho-1D-myo-inositol 4,5-biphosphate Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)O[C@H](COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)COP(O)(=O)O[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H]1O CNWINRVXAYPOMW-FCNJXWMTSA-N 0.000 description 1
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MEMQQZHHXCOKGG-UHFFFAOYSA-N 8-benzyl-2-[(4-fluorophenyl)methyl]-6-(4-hydroxyphenyl)imidazo[1,2-a]pyrazin-3-ol Chemical compound Oc1c(Cc2ccc(F)cc2)nc2c(Cc3ccccc3)nc(cn12)-c1ccc(O)cc1 MEMQQZHHXCOKGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100039705 Beta-2 adrenergic receptor Human genes 0.000 description 1
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 description 1
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 description 1
- 101150049660 DRD2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010001496 Galectin 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100021735 Galectin-2 Human genes 0.000 description 1
- 101150087426 Gnal gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- JWZZKOKVBUJMES-NSHDSACASA-N L-isoprenaline Chemical compound CC(C)NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 JWZZKOKVBUJMES-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090001050 Phosphoric Diester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 1
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 1
- MMWCIQZXVOZEGG-HOZKJCLWSA-N [(1S,2R,3S,4S,5R,6S)-2,3,5-trihydroxy-4,6-diphosphonooxycyclohexyl] dihydrogen phosphate Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@H]1OP(O)(O)=O MMWCIQZXVOZEGG-HOZKJCLWSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 108010041089 apoaequorin Proteins 0.000 description 1
- 102000016966 beta-2 Adrenergic Receptors Human genes 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- AIXAANGOTKPUOY-UHFFFAOYSA-N carbachol Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCOC(N)=O AIXAANGOTKPUOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004484 carbachol Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 102000034345 heterotrimeric G proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006093 heterotrimeric G proteins Proteins 0.000 description 1
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-M hexadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012203 high throughput assay Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940039009 isoproterenol Drugs 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 125000001421 myristyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 125000000913 palmityl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000007793 ph indicator Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000955 prescription drug Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001300 stimulation of adenylate cyclase Effects 0.000 description 1
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N tetradecanoic acid Chemical group CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Stabilization Of Oscillater, Synchronisation, Frequency Synthesizers (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Inspection Of Paper Currency And Valuable Securities (AREA)
- Analysing Materials By The Use Of Radiation (AREA)
Description
Oppfinnelsen vedrører en bredt anvendbar invitro fremgangsmåte for identifisering av kjemiske forbindelser som modifiserer G-proteinkoblede reseptorer, ved hjelp av nye hybrid-G-proteiner med meget bred reseptorspesifisitet.
G-proteinkoblede reseptorer ((GPCR) spiller en viktig rolle ved et stort antall fysiolo-giske prosesser. De utgjør en av de viktigste hittil kjente proteinfamilier og man antar at det i det humane genom er omtrent 1000 gener som koder for medlemmer i denne reseptorklasse. GPCR har en karakteristisk struktur: Det dreier seg om peptidtråder som i form av cc-helikser snor seg gjennom cellemembranens fosfolipid-dobbeltlag, idet de anordner seg i sirkelform. Man anslår at omtrent 60% av de for tiden disponible reseptpliktige legemidler binder til disse GPCR-reseptorer. Dette understreker den viktige rolle av denne reseptorklasse for den legemiddelforskende industri. Alle G-proteinkoblede reseptorer fungerer etter et felles basismønster: Bindingen av en ekstracellulær ligand fører til en konformasjonsendring av reseptorproteinet slik at dette kan opprette kontakt med et G-protein. De G-proteiner som ligger på den cytoplasmatiske side av plasmamembranen er formidlere av det ekstracellulære signal i det indre av cellen og kan der utløse forskjellige reaksjoner.
GPCR-reseptorer representerer de hittil viktigste terapeutiske målproteiner. Anslagsvis virker 40% av de av legen ordinerte legemidler som agonister eller antagonister av GPCR-reseptorer. På grunn av størrelsen og betydningen av proteinfamilien og det fak-tum at det for mange GPCR-reseptorer ennå ikke er kjent noen kjemiske bin-dingspartnere ("orphan" GPCR-reseptorer) kan man gå ut fra at denne reseptorklasse i fremtiden blir et av de viktigste reservoarer for egnede målproteiner ved søking etter nye legemidler.
GPCR-reseptorer er integrale membranproteiner. De overfører et signal formidlet via et oftest hydrofilt signalstoff som bindes på den ytre side av cellen ved hjelp av en familie av guanin-nukleotid-bindende proteiner, såkalte G-proteiner, i det indre av cellen. Derved utløser de, avhengig av spesifisiteten av reseptoren og de derved aktiverte G-proteiner, forskjellige signal-transduksjonsveier. Alt etter typen av reseptor fremkalles forskjellige virkninger, som alle har til følge dannelsen av "second messengers" (andre budbringermolekyler). Således kan de via aktivering av en membranresisterende ade-nylat-cyklase øke det intracellulære cAMP-nivå, henholdsvis synke ved en hemming. Stimuleringen av en cGMP-spesifikk fosfodiesterase kan føre til en senking av cGMP-nivået. Videre kan det aktiverte G-protein via binding til en ionekanal f.eks. føre til stigning av Ca - eller K -ioner. Videre kan det via et aktivert G-protein bevirkes akti- veiing av en fosfolipase og dermed dannelse av inositol-l,4,5-trisfosfat og diacylglycerol. Dette fører igjen enten til Ca<2+->stigning eller til aktivering av en proteinkinase C med ytterligere effekter i begge tilfeller. "Second messengers" er intracellulære budbringermolekyler som f.eks. cAMP, cGMP, Ca<2>og andre, som ved hjelp av aktivering eller deaktivering av intracellulære proteiner utløser reaksjoner i cellen.
De heterotrimere G-proteiner ligger på den indre side av plasmamembranen. De består av de tre underenhetene a, (3 og y. En aktivert reseptor oppretter kontakt med G-proteinheterotrimeren som deretter dissosieres i en a-underenhet og et (Jy-kompleks. Både den aktiverte a-underenhet så vel som også (3y-komplekset kan påvirke intracellulære effektorproteiner. G-protein-a-underenhetsfamilien blir for tiden inndelt i fire forskjellige klasser (Gas-, Gai-, Gaq- og Gal2-klassen). GPCR-reseptorer blir klassifisert tilsvarende for det i signaltransduksjonen innbundne G-protein.
Det vil si at CPCR-reseptorene av Gs-klassen ved hjelp av aktivering av Gas formidler stimuleringen av adenylatcyklasen og forhøyer den intracellulære cAMP-konsentrasjonen, GPCR-reseptorer av Gi-klassen formidler via aktivering av Gai en hemming av adenylatcyklasen og senker intracellulært cAMP, GPCR-reseptorer av Gq-klassen formidler via aktivering av Gaq en stimulasjon av forskjellige PLCp-isoformer og fører til en hydrolyse av membranresiderende fosfatidyl-inositol-4,5-bisfosfat til diacylglycerol og inositiltrisfofat (IP3).
IP3 frigir Ca<2+>fra intracellulære reservoarer.
De fleste GPCR-reseptorer kan opprette kontakt med en G-protein-a-underenhetsfarni-lie, dvs. de har selektivitet for en bestemt signaltransduksjonsvei. For det formål å ut-vikle en fremgangsmåte ved hvis hjelp kjemiske forbindelser skal identifiseres, og som modifiserer de GPCR-reseptoravhengige signaltransduksjonsveier, er denne snevre spesifisitet til stort hinder. Utover dette gir slike signaltransduksjonsveier bare et egnet signal som lar seg utnytte i en assaytype med høy prøvekapasitet (= High Throughput Screening = HTS) hvor f.eks. G-proteinaktiveringen fører til økning av det intracellulære Ca<2+->nivå.
Slike G-proteiner med endret reseptorspesifisitet og forskjellig tilknytning til en signaltransduksjonsvei, kan konstrueres ved å føye bestanddeler fra forskjellige G-proteiner sammen til hybrid-G-proteinet ved hjelp av metoder fra molekylærbiologien og biokjemien.
Hybrid-G-proteiner er fusjonskonstruksjoner som innenfor et protein forener sekvenser av forskjellige Ga-underenheter. Således kan det f.eks. ved fusjon av reseptorgjenkjen-nelses-regionen av Gai med effektor-aktiveringsregionen av Gaq fremstilles et Gaq/i-hybrid som mottar signaler fra Gi-koblede reseptorer, men tilkobler Gaq-PLC(3-signaltransduksjonsveien. Et slikt hybrid, hvor de C-terminale 5 aminosyrer fra Gaq er blitt erstattet med den tilsvarende Gai-sekvens (Gaqi5) ble for første gang beskrevet av Conklin et al., Nature 363, 274 - 276 (1993).
Denne "omkobling" av reseptorer har den fordel at assay-endepunktet (stigning av den intracellulære Ca" -konsentrasjonen i sammenligning med hemmingen av adenylatcyklasen) mer enkelt er tilgjengelig ved hjelp av måletekniske metoder og kan anvendes ved HTS "High-Throughput-Screening".
En ulempe ved disse Gaq/Gai-fusjonskonstruksjoner er imidlertid at de ikke er i stand til å kunne aktivere noen GPCR-reseptorer som f.eks. SSTRI-reseptoren qi5 (Conklin et al., Mol. Pharmacol. 50, 885 - 890 (1996)).
Fusjonskonstruksjoner mellom Gaq og Gas ble også beskrevet. Også disse har den ulempe at de ikke kan bindes til alle Gs-koblede reseptorer som f.eks. den p2-adrenerge reseptor eller dopamin Dl-reseptoren på PLCP-signaltransduksjonsveien.
I tillegg til de C-terminale modifikasjoner for endring av bindingen av reseptorer til be-stemte signaltransduksjonsveier, ble en N-terminal modifikasjon av Gaq beskrevet, og som fører til reseptor-"promiskuitet". Med reseptor-promiskuitet skal det her forstås ev-nen av et G-protein til å oppta signaler fra forskjellige reseptorer og viderelede disse. Det dreier seg om et Gaq-protein ved hvilket den høykonserverte, N-terminale, 6aa-om-fattende region ble deletert (Kostenis et al., J. Biol. Chem. 272,19107 - 19110 (1997)). Denne delesjonen tillater den resulterende Gq (også benevnt -6q) ikke bare å motta signaler fra Gq-, men også fra Gs- eller Gi/o-koblede reseptorer og viderelede disse til PLCp.
Denne Ga-underhet omfatter nå også reseptorer som SSTRl-somatostatin-reseptoren, dopamin-Dl og den adrenerge p2-reseptor. Riktignok kan reseptoren edg5 heller ikke bindes av dette G-protein. Utover dette er signalintensiteten av dette G-protein så svak at det i praksis ikke kan anvendes (Kostenis et al., J. Biol. Chem. 272,19107 - 19110
(1997)).
Videre er med Ga 16 en Ga-underenhet kjent, som binder GPCR-reseptorene fra forskjellige funksjonelle klasser til PLCpCa<2+->signaltransduksjonsveien. Det dreier seg
praktisk om et fra naturen ikke-selektivt G-protein. Heller ikke denne underenhet er uni-versalt anvendbar, idet reseptorer som edg5-reseptoren eller SSTRl-somatostatin-reseptoren ikke eller bare svakt, kobler til Gal 6. Av denne grunn ville det være til stor nytte hvis det kunne stå et G-protein til disposisjon som kunne aktiveres ved hjelp av ytterligere funksjonelle klasser av GPCR-reseptorene og utover dette i cellen ville kunne gi et tilstrekkelig sterkt signal, og som kunne utnyttes i et assay, spesielt et HTA "High-Troughput-Assay" for identifisering av forbindelser som modulerer GPCR-reseptorene og/eller de respektive avhengige signaltransduksjonsveier, som f.eks. forhøyelsen eller nedsettelsen av den intracellulære Ca<2+->konsentrasjon.
WO9905177 beskriver mutante Gq-proteiner og anvendelsen av slike i metoder for å identifisere forbindelser som kan modulere G-proteinkoblede reseptorer.
Anal. Biochem, 1999, vol. 270. side 242-248 omtaler kimære Gq-proteiner som endrer G-proteinkoblet reseptorbinding slik at Gi-koblet signalering kan måles ved et signal som er avhengig av Gq-koblet signaltransduksjonsvei, slik som intracellulær kalsiumkonsentrasjon.
WO9748820 gjør kjent en cellelinje som utrykker en Ga subenhet fra et promiskuøst G-protein og anvendelsen av denne for å identifisere forbindelser som modulerer GPCR-avhengig signaltransduksjon i en celle.
Oppgaven som ligger til grunn for den foreliggende oppfinnelse består følgelig deri at
ytterligere hybrid-G-proteiner for screening-prosesser stilles til disposisjon for identifisering av kjemiske forbindelser og som utmerker seg ved at de fremviser en meget bred spesifisitet med hensyn til de gjenkjennbare GPCR-reseptorer og disse G-proteiner kob-les til en signalvei som fører til en forhøyelse av den intracellulære Ca<2+->konsentrasjon. I tillegg blir de så høyt utrykt at signalintensiteten forbedres.
Et første aspekt ved oppfinnelsen vedrører en invitro fremgangsmåte for identifisering av en kjemisk forbindelse som modifiserer virkningen av i det minste én G-proteinkoblet reseptor (GPCR) avhengig signaltransduksjonsvei i en organisme, kjennetegnet ved at den nevnte fremgangsmåte omfatter følgende fremgangsmåtetrinn:
a) å tilveiebringe minst én celle som inneholder minst én GPCR-avhengig signaltransduksjonsvei og som produserer ett eller fler enn ett G-protein; b) å tilveiebringe minst én kjemisk forbindelse som skal undersøkes; c) å bringe en celle ifølge a) i kontakt med en kjemisk forbindelse ifølge b); d) å bestemme kvantitativ eller kvalitativ effekt, av en kjemisk forbindelse ifølge b), på signaltransduksjonsveien av en celle ifølge a) ved hjelp av et målbart
signaltransuksjonsveiavhengig signal;
kjennetegnet ved at minst ett G-protein er valgt fra -6qi4myr eller -6qs5myr, hvorved "-6qi4" betyr at G-protein a subenheten av klassen Gaq har en N-terminal delesjon på seks aminosyrer og bærer en ai-sekvens ved C-terminalen, hvorved "-6qs5" betyr at G-protein a subenheten av klassen Gaq har en N-terminal delesjon på seks aminosyrer og bærer en as-sekvens ved C-terminalen, og hvorved "myr" betyr at G-proteinet har en MGCC
myristoylerings/palmitoylerings gjenkjennelsessekvens ved N-terminalen.
Modifiseringen av virkningen av minst én signaltransduksjonsvei som er avhengig av en G-proteinkoblet reseptor (GPCR) i en biologisk organisme kan skje inhiberende eller stimulerende. En inhiberende virkning av en kjemisk forbindelse foreligger når det målbare signal som er avhengig av signaltransduksjonsveien i avhengighet av den kjemiske forbindelse viser seg svakere enn når denne utelates. Forbindelser som fremkaller en slik virkning benevnes også antagonister. På den annen side foreligger en simulerende virkning av en kjemisk forbindelse når det målbare signal som er avhengig av signaltransduksjonsveien viser seg sterkere enn når den kjemiske forbindelse utelates. Slike forbindelser benevnes også agonister.
Fremgangsmåten betjener seg i en foretrukket utførelsesform av en celle hvori minst to G-proteiner fremstilles. Disse G-proteiner kan være avhengig av én eller flere forskjellige GPCR-reseptorer. I prinsippet kommer for gjennomføring av fremgangsmåten alle egnede G-proteiner på tale, uansett deres reseptorspesifisitet, deres sekvens, deres opp-bygning, opprinnelsen med hensyn til celle, vev eller organ eller med hensyn til de spe-sies for hvilke de er spesifikke. Minst ett G-protein er valgt fra -6qi4myr eller - 6qs5myr. Foretrukket fremstilles i cellen minst ett G-protein fra -6qi4myr, -6qs5myr, - 6qi4, -6qs5. Ved G-proteinene -6qi4myr, -6qs5myr, -6qi4, -6qs5 dreier det seg om hybrid-G-proteiner som ble satt sammen fra deler fra forskjellige G-proteiner fra mus og i noen tilfeller, inneholder ytterligere modifikasjoner. G-proteinene kan fremstilles enkeltvis eller i kombinasjon av cellen. Spesielt kan av en celle bortsett fra de allerede nevnte hybrid-G-proteiner, også fremstilles Gal6. Hvert av G-proteinene kan foreligge i en celle enkeltvis eller i kombinasjon med ett eller flere andre G-proteiner. Fremstillingen av Ga 16 i en celle skal imidlertid ved dette alltid skje slik at det aldri fremstilles alene, men i kombinasjon med et annet av de i det foregående nevnte, G-proteiner.
Aminosyresekvensene av de foretrukne G-proteiner er vist for -6qi4-myr i Seq id. Nr 2, for -6qi5myr i Seq id. Nr. 4, for -6qi4 i Seq id. 6, for -6qs5 i Seq id. Nr 8 og for Gal 6 i Seq id. Nr. 10.
Tilveiebringelsen av en kjemisk forbindelse skjer vanlig i oppløst form. Foretrukket anvendes vann for løsningen av den kjemiske forbindelse. Oppløsningen kan i tillegg til løsningsmiddelet inneholde buffersubstanser, salter eller hjelpestoffer som løsningsfor-midler, detergenter, konserveringsstoffer eller andre.
Tilveiebirngelsen av en celle omfatter dens fremstilling, dyrking og viderebearbeiding. Tilveiebirngelsen skjer f.eks. ved preparasjon av egnet cellemateriale fra organer eller vev eller ved formering av egnede cellelinjer eller mikroorganismer. For dyrkingen kan det anvendes forskjellige egnede næringsmedier. Cellene holdes ved den for organismen optimale temperatur. Eventuelt tilsettes til det respektivt anvendte dyrkingsmedium, konserveringsmidler, antibiotika, pH-indikatorer, blodserum-bestanddeler, blodserum, hjelpestoffer eller annet. Fremgangsmåte for fremstilling, dyrking og viderebearbeiding er beskrevet i standardverk. (F.eks. Basic Cell Culture; Ed. J.M. Davis; IRL Press; 1994.)
I fremgangsmåten beskrevet i det foregående, tilveiebringes i foretrukne utførelsesfor-mer cellen av et virveldyrspesies, et insektspesies, et C. Elegans eller en gjær. I spesielt foretrukne utførelsesformer tilveiebringes cellen av en HeLa-, 293-, COS-, CHO-celle eller en Saccharomyces cerivisiae celle.
For bestemmelse av den kvantitative eller kvalitative effekt av en forbindelse som skal undersøkes på signaltransduksjonsveien for en celle av et målbart signal avhengig av signaltransduksjonsveien, anvendes i en foretrukket utførelsesform den intracellulære Ca<2+->konsentrasjonen. Endringen av den intracellulære Ca<2+->konsentrasjonen lar seg på-vise f.eks. ved anvendelse av aequorin, et fargestoff, eller "FLIPR"-teknologien fra fir-maet "Molecular Devices".
De fremgangsmåter som er beskrevet i det foregående kan i en foretrukket utførelses-form anvendes for identifisering av et legemiddel.
For fremstillingen og rensingen av de betegnede proteiner kan det tilsvarende anvendes kjente metoder som beskrevet i "F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, New York". Et protein med en aminosyresekvens ifølge Seq. id. nr. 2,4,6, 8 eller fremstilt ifølge den angitte fremgangsmåte, kan anvendes for fremstilling av antistoffer.
Eksempler
Eksempel 1:
Aktivering av en signaltransduksjonsvei ved hjelp av Ga-proteinmutanten -6q ved hjelp av forskjellige reseptorer
COS7-celler ble dyrket i DMEM (Dulbeccos modifiserte Eagles medium) under tilset-ning av 10% FCS (føtalt kalveserum) ved 37°C (5% C02). For transfeksjoner ble 1 x
IO<6>celler inokulert i 100 mm plater. Omtrent 24 timer senere ble cellene kotransformert med ekspresjonsplasmidene ccq eller -6q (1 ug DNA/100 mm plate) og med en av hver av de følgende reseptorkonstruksjoner (4 \ xg DNA/100 mm plate): M2 (muskarinreseptor i pCD), D2 (dopaminreseptor i pCDNAI), kappa (opioid-reseptor i pCDNA3), SSTR1 (somatostatin-reseptor i pCMV), Al (adenosinreseptor i CDM7), Dl (dopaminreseptor i pCDNAI), V2 (vasopressinreseptor i pCD-ps), P2 (adrenergreseptor i pSVL).
Omtrent 24 timer etter transfeksjonen ble cellene oppdelt i 6 brønners plater i like por-sjoner og tilsatt i DMEM 3 uCi/ml [<3>H]myo-inositol (20 Ci/mmol). Etter 24 timers inkubasjon ble cellene ved romtemperatur inkubert med HBSS (+10 mM LiCl) i 20 mi-nutter. Deretter ble cellene stimulert i 1 time med de tilsvarende agonister og stigningen av intracellulære inositolmonofosfater bestemt ved anion ionebytterkromatografi. Ga-proteinmutantene -6q mangler sammenlignet med villtypesekvensen de seks høykon-serverte aminosyreestere av den aminoterminale enden. Slike konstruksjoner er vist i figur 1 med hensyn til aminoenden. Villtypesekvensen er betegnet som a (WTq). Resul-tatene i det følgende ble erholdt ved hjelp av Ga-proteinkonstruksjonen -6q. Figur 1 viser utover dette ytterligere sekvenseksempler. Fremstillingen av slike mutanter eller av de anvendte reseptorkonstruksjoner skjedde ved hjelp av standardmetoder fra molekylærbiologien som utførlig beskrevet f.eks. i "".M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, New York".
C0S7-celler som uttrykker WTq eller-6q og forskjellige Gi/o- (A) eller Gs-koblede reseptorer (B) ble inkubert i 1 time (37°C) i nærvær og fravær av de tilsvarende agonister (se herunder). Stigningen av den intracellulære IP1-konstruksjon ble målt som i den vedføyde protokoll 1. Dataene utgjør middelverdier ± standardfeil fra 3 - 7 uavhengige forsøk utført hvert som tredobbelte bestemmelser. De følgende ligander ble anvendt: Fig. 2A: m2 (muskarinreseptor): Carbachol (100 uM); D2 (dopaminreseptor): (-)-Quinpirole (10 uM); kappa (opioidreseptor): (-)-U50488 (10 uM); SSTR1 (soma-tostatinreseptor): somatostatin 14 (l uM); B, Al (adenosinreseptor): R(-)-PIA (10 Mm);
Fig. 2B: Dl (dopaminreseptor): dopamin (ImM); V2 (vasopressinreseptor): AVP (lnM); P2 (adrenergreseptor): (-)-isoproterenol (200 uM). Nummerangivelsene under figurene angir omfanget av den reseptive PLC-stimulasjon som relativ økning av PLC-stimulasjonen fra -6q til WTq.
Fra figur 2 kan det ses at Ga-proteinmutanten -6q stimulerer en IP1-dannelse i avhengighet av forskjellige reseptorklasser. IP1 er et signalmolekyl som dannes i PLC-P-signaltransduksjonsveien og i det videre forløp av signalvidereføringen fører til forhøyelse av den intracellulære Ca<2+->konsentrasjonen. Forsøksresultatene for -6q er i figur 2 satt i forhold til stimulering ved hjelp av villtypekonstruksjonen (WTq) og en ytterligere kontroll med vektorkonstruksjonen uten noen Ga-innskudd (vektor). IP1-frigivelsen ved hjelp av -6q-konstruksjonen lykkes både med Gi/o-koblede (figur 2A: m2, D2, k-OR, SSTR1, Al) så vel som også med Gs-koblede (fig. 2B: Dl, V2, p2) reseptorer.
Eksempel 2:
Fremstilling av høytekspirmerende mutanter av Ga-proteiner med bred reseptorspesifisitet
Først ble hybride G-protein-a-underenheter konstruert, hvori de seks høykonserverte aminosyrer av aminoenden mangler og som samtidig på C-enden fremviser enten ai-eller as-sekvens. Tilsvarende den inneholdte ai-sekvens hhv. as-sekvens, skjer beteg-ningen som —qi4 eller-6qsa5. Konstruksjonen -6qi4 forbinder de Gs- så vel som noen Gi/o-koblede reseptorer med PLCP-signaltransduksjonveien. Disse reseptorer inkluderer også SSTR1 eller edg5-reseptoren. edg5-reseptoren lar seg med Gal6 ikke binde til PLCP-signaltransduksjonsveien. Ga 16 er et G-protein med bred reseptorspesifisitet, som er omhandlet i WO 97/48820 (Tittel: Promiskuøst G-proteinblandinger og deres anvendelse).
Konstruksjonen -6qs5 binder Gi/o- så vel som enda ytterligere Gs-koblede reseptorer til PLCP-signaltransduksjonsveien og inkluderer nå også reseptorer som dopamin Dl eller den adrenerge (32-reseptor.
En kombinasjon av disse to G-protein-a-underenheter i en cellelinje, inkluderer dermed et ytterligere spektrum av GPCR-reseptorer som hver underenhet for seg eller Gal 6.
Anvendbarheten i den tekniske screeningmetode lar seg ytterligere forbedre når ekspresjonen av disse Ga-underenheter (-6qi4; -6qs5) ble forhøyet, idet det dermed også kunne oppnås et sterkere signal.
Av denne grunn ble det i tillegg i det aminoterminale område av Ga-underenhetene innbygget myristoylerings/palmitoylerings-gjenkjennelsessekvenser. Dette førte til kon-struksjon av G-proteinene -6qi4myr og -6qs5myr. Proteinsekvensen av -6qi4myr og
-6qs5myr med hensyn til aminoenden er MGCC til forskjell fra MACC i utgangssek-vensen for -6q-variantene. De nye konstruksjoner -6qi4myr og -6qs5myr inneholder nå en konsesus-sekvens for myristoylering/palmitoylering. -6qi4myr ble fremstilt fra -6qi4 og -6qs5myr ble fremstilt fra -6qs5. Det er kjent at fjernelsen av myristyl- eller palmi-tylrester i G-proteiner fører til en omfordeling i cellen. Tap av palmitat- eller myristat-rester påvirker ekspresjonsmønsteret for G-proteiner på den måte at borttagning av fett-syrerestene resulterer i en hovedsakelig cytosolisk lokalisasjon. G-protein-a-underenheter finner man både i cellemembranen som også cytosolen. Imidlertid kan bare de membranresiderende G-proteiner viderelede signalene fra CPCR-reseptorene til de intracellulære effektorer. Tidligere var bare konsekvensen av fjernelse av en konsensus-sekvens kjent for palmitoylering/myristoylering ved mutasjon. Ikke kjent var det derimot at inn-føringen av ytterligere konsensussteder for myristoylering/palmitoylering i Ga-dele-sjonsmutantene førte til forhøying av ekspresjonen. Det kunne vises at innføringen av ytterligere palmitoylering/myirstoyleringssteder øker den i cellemembranen uttrykte
mengde av Ga-underenhet (fig. 3, fig. 4). I SDS-PAGE-Westernblottingen (natriumdo-decylsulfat-polyakrylamid-gelelektroforese-Westernblotting) i figur 3 kan det ses at ekspresjonen av -6qi4myr i sammenligning med -6qi4 er tydelig forhøyet. I figur 4 er det vist en SDS-PAGE-Westernblotting av en fraksjonering i en partikkelholdig fraksjon (p; inneholdende membraner) og oppløselig fraksjon (s; sc) fra qwt og -6qi4myr. Den høy-ere myristoylerte/palmitoylerte variant -6qi4myr, er bare inneholdt i den partikkelhol-dige fraksjon.
Respektive 20 jig membranproteiner ble for dette preparert fra transfeksjonerte COS 7-celler, oppdelt ved hjelp av SDS-PAGE-gelelektroforese (10%) og analysert ved hjelp av Western blotanalyse under anvendelse av det 12CA5 monoklonale antistoff (Roche Biosciences).
Alle G-protein-cc-underenheter ble påvist med det 12CA5 monoklonale antistoff (koblet til pepperrot-peroksidase) rettet på HA-epitopen tag. HA-tag er inneholdt i alle G-proteinkonstruksjoner. I qwt og qi5 erstatter den aminosyrene 125 - 130, i de N-termi-nalt deleterte G-proteiner (-6q, -6qi4, -6qi4myr) erstatter den aminosyrene 119 - 124. Respektive 20 ug membranprotein, preparert og fra transfeksjonerte COS7-celler ble oppdelt ved hjelp av SDS-PAGE gelelektroforese, underkastet blotting på nitrocellulose og G-protein-cc-underenhetene ble påvist med 12CA5-antistoffet. Immunreaktive G-proteiner ble gjort synlige ved hjelp av et kjemiluminescenssystem (Amersham).
Eksempel 3:
Simulering av forskjellige høytuttrykte Ga-proteiner med bred reseptorspesifisitet ved hjelp av forskjellige reseptorer
Stimuleringen av de høytuttrykte Ga-varianter -6qs5myr og -6qi4myr ved hjelp av forskjellige reseptorer er illustrert i figurene 5 og 6.1 figur 5 ses det at -6qi4myr (= A6qi4myr) ved hjelp av Gi/o-koblede reseptorer (f.eks. dopamin D2, edg5, CCR5, SSTR1, KOR) tilsluttes til PLCP-signaltransduksjonsveien og fører til et høyere signal, som forløper proporsjonalt til Ca<2+->frigivelsen. Som kontroller ble det anvendt en vektorkonstruksjon så vel som Gal6-proteinet (+16). Figur 6 viser at de Gs-koblede reseptorer ved hjelp av -6qs5myr (= A6qs5myr) forbindes til PLCP-signaltransduksjonsveien. Som referanse tjener her også G-proteinet Gal 6.
For eksperimentell bestemmelse av det frigitte Ca ved hjelp av aequorinsystemet ble CHO-celler kotransfeksjonert med apoaequorin-ekspresjonsplasmidet cytAEQ/- pCDNAI, den angitte reseptor DNA (SSTR1, KOR, D2, Dl, beta2) så vel som G-protein-a-underenhetene Gl6 og -6qi4myr under anvendelse av Lipofectamin. Etter 10 timers inkubasjon i "OPTIMEM"-medium ble cellene vasket én gang med RPMI 1640-medium og inkubert med 5 uM Coelenterazin f i RPMI 1640 i 2 timer ved 37°C. Deretter ble cellene vasket to ganger med PBS og stimulert med de tilsvarende reseptorago-nister: Somatostatin 14 for SSTRI-reseptoren, U50488 for kappa opioid-reseptoren,
(-)-Quinpirol for dopamin D2-reseptoren, dopamin for dopamin Dl-reseptoren og iso-proterenol for beta2-reseptoren. Agoniststimulasjon av de Gi/o-koblede reseptorer
(SSTR1, KOR, D2) og de Gs-koblede reseptorer (Dl, beta2) fører til aktivering av G-proteinene G16 så vel som -6qi4myr med etterfølgende stimulasjona v PLCP og intracellulære Ca-frigivelse. Ca-bindingen til Apoaequorin-Coelenterazin-komplekset fører til lysemisjon som ble målt med et luminometer ("TOPCount", Hewlett Packard).
Beskrivelse av figurene:
Figur 1 gjengir en orientering av de aminoterminale områder av forskjellige Ga-proteiner. Figur 2 viser en stimulering av PLCP-signaltransduksjonsveien ved hjelp av -6q-Ga-proteinvariasjon ved hjelp av Gi/o-koblede (A) og Gs-koblede (B) reseptorer under anvendelse av den høyest mulige konsentrasjon av de respektive agonister. Figur 3 viser en SDS-PAGE-Westernblotting med ekspresjonen av -6qi4myr i sammenligning til -6qi4.1 tillegg er ekspresjonen av ytterligere Ga-proteiner vist. I figur 4 er en SDS-PAGE-Westernblotting avbildet hvorpå en fraksjonering i partikkelholdig fraksjon (p; inneholdende membraner) og oppløselig fraksjon (s; sc) av qwt og -6qi4myr er vist. G-proteinunderenhetene ble påvist med 12CA5 monoklonalt antistoff og viser proteinbånd i en størrelse på~42KD. Figur 5 viser tilbindingen av forskjellige Gi/o-koblede reseptorer ved hjelp av -6qi4myr (= A6qi4myr) til PLCP-signaltransduksjonsveien. D2, Kappa og SSTR1 er Gi/o-koblede reseptorer. Som kontroller ble det anvendt en vektorkonstruksjon så vel som Gal6-protein(+16). Figur 6 viser at Gs-koblede reseptorer ved hjelp av -6qs5myr (=A6qs5myr) blir bundet til PLCP-signaltransduksjonsveien.
pl, P2 og Dl er Gs-koblede reseptorer. Som referanse tjener en vektorkonstruksjon G-proteinet Gal 6 (+16).
Figur 7 viser tilbindingen av den Gi/o-koblede dopamin D2-reseptor til PLCP-Ca-signaltransduksjonsveien i nærvær av den mindre sensitive a-underenhet Gl6, i nærvær av den meget sensitive Ga-underenhet -6qi4myr så vel som i kombinasjon av Gl 6 og -
6qi4myr. Det er åpenbart at den sterktvirkende aktivering av kalsiumfrigivelsen ved hjelp av -6qi4myr ikke påvirkes ved nærværet av Gl6.
Claims (8)
1.
Invitro fremgangsmåte for identifisering av en kjemisk forbindelse som modifiserer virkningen av i det minste én G-proteinkoblet reseptor (GPCR) avhengig signaltransduksjonsvei i en organisme,karakterisertved at den nevnte fremgangsmåte omfatter følgende fremgangsmåtetrinn: a) å tilveiebringe minst én celle som inneholder minst én GPCR-avhengig signaltransduksjonsvei og som produserer ett eller fler enn ett G-protein; b) å tilveiebringe minst én kjemisk forbindelse som skal undersøkes; c) å bringe en celle ifølge a) i kontakt med en kjemisk forbindelse ifølge b); d) å bestemme kvantitativ eller kvalitativ effekt, av en kjemisk forbindelse ifølge b), på signaltransduksjonsveien av en celle ifølge a) ved hjelp av et målbart signaltransuksjonsveiavhengig signal;
kjennetegnet ved at minst ett G-protein er valgt fra -6qi4myr eller -6qs5myr, hvorved "-6qi4" betyr at G-protein a subenheten av klassen Gaq har en N-terminal delesjon på seks aminosyrer og bærer en ai-sekvens ved C-terminalen, hvorved "-6qs5" betyr at G-protein a subenheten av klassen Gaq har en N-terminal delesjon på seks aminosyrer og bærer en as-sekvens ved C-terminalen, og hvorved "myr" betyr at G-proteinet har en MGCC myristoylerings/palmitoylerings gjenkjennelsessekvens ved N-terminalen.
2.
Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat cellen tilveiebrakt ifølge a) produserer minst to G-proteiner.
3.
Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisertv e d at cellen tilveiebrakt ifølge a) produserer minst to G-proteiner valgt fra - 6qi4myr, -6qs5myr, -6qi4, -6qs5 eller Galfal6.
4.
Fremgangsmåte ifølge ett eller flere av kravene 1 til 3,karakterisert vedat cellen tilveiebrakt ifølge a) produserer minst ett protein med en aminosyresekvens ifølge Seq. id. nr. 2, Seq. id. nr. 4, Seq. id. nr. 6 eller Seq. id. nr. 8.
5.
Fremgangsmåte ifølge ett eller flere av kravene 1 til 4,karakterisert vedat cellen ifølge a) er cellen av et virveldyrspesies, et insektspesies, et C. Elegans eller en gjær.
6.
Fremgangsmåte ifølge krav 5,karakterisert vedat cellen er en HeLa-, 293-, COS-, CHO-celle eller en celle fra Saccharomyces cerevisiae.
7.
Fremgangsmåte ifølge ett eller flere av kravene 1 til 6,karakterisert vedat den omfatter bruk av den intracellulære Ca 9+ -konsentrasj•onen for å bestemme den kvantitative eller kvalitative effekt av den kjemisk forbindelse som skal undersøkes ved hjelp av et signaltransduksjonsveiavhengig målbart signal som definert i krav ld).
8.
Fremgangsmåte ifølge ett eller flere av kravene 1 til T,karakterisert vedat den kjemiske forbindelse er et farmasøytikum.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10033353A DE10033353A1 (de) | 2000-07-08 | 2000-07-08 | Breit einsetzbares Verfahren zur Identifizierung von Modulatoren von G-Protein gekoppelten Rezeptoren |
| PCT/EP2001/007667 WO2002004665A2 (de) | 2000-07-08 | 2001-07-05 | Breit einsetzbares verfahren zur identifizierung von modulatoren von g-protein gekoppelten rezeptoren |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20030068D0 NO20030068D0 (no) | 2003-01-07 |
| NO20030068L NO20030068L (no) | 2003-01-07 |
| NO330684B1 true NO330684B1 (no) | 2011-06-06 |
Family
ID=7648325
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20030068A NO330684B1 (no) | 2000-07-08 | 2003-01-07 | In vitro fremgangsmate for identifisering av GPRCR modulatorer. |
| NO20101390A NO20101390L (no) | 2000-07-08 | 2010-10-07 | Fremgangsmate med bredt anvendelsesomrade for identifisering av modulatorer av G-proteinkoblede reseptorer |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20101390A NO20101390L (no) | 2000-07-08 | 2010-10-07 | Fremgangsmate med bredt anvendelsesomrade for identifisering av modulatorer av G-proteinkoblede reseptorer |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20040002109A9 (no) |
| EP (1) | EP1319022B1 (no) |
| JP (1) | JP4991081B2 (no) |
| KR (1) | KR100922701B1 (no) |
| AT (1) | ATE462721T1 (no) |
| AU (2) | AU7252201A (no) |
| BR (1) | BR0112300B1 (no) |
| CA (1) | CA2415460C (no) |
| CY (1) | CY1110049T1 (no) |
| DE (2) | DE10033353A1 (no) |
| DK (1) | DK1319022T3 (no) |
| ES (1) | ES2342453T3 (no) |
| IL (2) | IL153818A0 (no) |
| MX (1) | MXPA02012641A (no) |
| NO (2) | NO330684B1 (no) |
| NZ (1) | NZ523480A (no) |
| PT (1) | PT1319022E (no) |
| WO (1) | WO2002004665A2 (no) |
| ZA (1) | ZA200300707B (no) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2002213409A1 (en) * | 2000-10-30 | 2002-05-15 | Senomyx, Inc. | Galphaqproetin variants and their use in the analysis and discovery of agonists and antagonists of chemosensory receptors |
| EP1520861A1 (en) * | 2003-09-11 | 2005-04-06 | Aventis Pharma Deutschland GmbH | Test system for the identification of APJ receptor ligands |
| US20050112701A1 (en) * | 2003-09-11 | 2005-05-26 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Test system for the identification of APJ receptor ligands |
| DE102007002260A1 (de) | 2007-01-16 | 2008-07-31 | Sanofi-Aventis | Verwendung von substituierten Pyranonsäurederivaten zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung des Metabolischen Syndroms |
| CN102083432B (zh) | 2008-05-05 | 2016-02-17 | 赛诺菲-安万特 | 酰基氨基取代的稠合环戊烷羧酸衍生物及它们作为药物的用途 |
| AR079022A1 (es) | 2009-11-02 | 2011-12-21 | Sanofi Aventis | Derivados de acido carboxilico ciclico sustituidos con acilamino, su uso como productos farmaceuticos, composicion farmaceutica y metodo de preparacion |
| EP2862574A1 (en) | 2013-10-15 | 2015-04-22 | Sanofi | {4-[5-(3-chloro-phenoxy)-oxazolo[5,4 d]pyrimidin-2-yl]-2,6-dimethyl-phenoxy}-acetic acid for use in the prevention or treatment of acute kidney injury |
| CN109946451B (zh) * | 2019-04-16 | 2022-05-20 | 浙江诺迦生物科技有限公司 | 一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒 |
| CN109946450B (zh) * | 2019-04-16 | 2022-04-19 | 浙江诺迦生物科技有限公司 | 一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的阿片类活性物质的检测方法及其检测试剂盒 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6004808A (en) * | 1996-06-21 | 1999-12-21 | Aurora Biosciences Corporation | Promiscuous G-protein compositions and their use |
| US6383761B2 (en) | 1997-07-28 | 2002-05-07 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for identifying modulators of G-protein-coupled receptors |
-
2000
- 2000-07-08 DE DE10033353A patent/DE10033353A1/de not_active Withdrawn
-
2001
- 2001-07-05 ES ES01951650T patent/ES2342453T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-05 EP EP01951650A patent/EP1319022B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-05 BR BRPI0112300-9A patent/BR0112300B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-07-05 AU AU7252201A patent/AU7252201A/xx active Pending
- 2001-07-05 DE DE50115416T patent/DE50115416D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-05 AU AU2001272522A patent/AU2001272522B2/en not_active Ceased
- 2001-07-05 DK DK01951650.9T patent/DK1319022T3/da active
- 2001-07-05 AT AT01951650T patent/ATE462721T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-07-05 MX MXPA02012641A patent/MXPA02012641A/es active IP Right Grant
- 2001-07-05 NZ NZ523480A patent/NZ523480A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-07-05 JP JP2002509518A patent/JP4991081B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-07-05 IL IL15381801A patent/IL153818A0/xx unknown
- 2001-07-05 WO PCT/EP2001/007667 patent/WO2002004665A2/de active IP Right Grant
- 2001-07-05 CA CA2415460A patent/CA2415460C/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-07-05 PT PT01951650T patent/PT1319022E/pt unknown
- 2001-07-05 KR KR1020037000278A patent/KR100922701B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2001-07-06 US US09/899,295 patent/US20040002109A9/en not_active Abandoned
-
2003
- 2003-01-06 IL IL153818A patent/IL153818A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-01-07 NO NO20030068A patent/NO330684B1/no not_active IP Right Cessation
- 2003-01-27 ZA ZA200300707A patent/ZA200300707B/en unknown
-
2005
- 2005-02-17 US US11/060,023 patent/US7378252B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-05-27 CY CY20101100467T patent/CY1110049T1/el unknown
- 2010-10-07 NO NO20101390A patent/NO20101390L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR0112300A (pt) | 2004-07-27 |
| US7378252B2 (en) | 2008-05-27 |
| ATE462721T1 (de) | 2010-04-15 |
| NO20101390L (no) | 2003-01-07 |
| NO20030068D0 (no) | 2003-01-07 |
| WO2002004665A3 (de) | 2002-12-19 |
| US20020127601A1 (en) | 2002-09-12 |
| CA2415460A1 (en) | 2002-01-17 |
| ZA200300707B (en) | 2004-04-15 |
| DE10033353A1 (de) | 2002-01-24 |
| CY1110049T1 (el) | 2015-01-14 |
| JP2004502463A (ja) | 2004-01-29 |
| KR100922701B1 (ko) | 2009-10-22 |
| ES2342453T3 (es) | 2010-07-07 |
| JP4991081B2 (ja) | 2012-08-01 |
| BR0112300B1 (pt) | 2014-01-21 |
| CA2415460C (en) | 2011-05-10 |
| IL153818A (en) | 2010-05-31 |
| AU7252201A (en) | 2002-01-21 |
| NO20030068L (no) | 2003-01-07 |
| DK1319022T3 (da) | 2010-07-26 |
| WO2002004665A2 (de) | 2002-01-17 |
| NZ523480A (en) | 2008-04-30 |
| EP1319022A2 (de) | 2003-06-18 |
| AU2001272522B2 (en) | 2007-05-31 |
| KR20030021246A (ko) | 2003-03-12 |
| DE50115416D1 (de) | 2010-05-12 |
| US20050255531A1 (en) | 2005-11-17 |
| IL153818A0 (en) | 2003-07-31 |
| PT1319022E (pt) | 2010-06-11 |
| MXPA02012641A (es) | 2003-04-25 |
| US20040002109A9 (en) | 2004-01-01 |
| EP1319022B1 (de) | 2010-03-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Komolov et al. | G protein-coupled receptor kinases: Past, present and future | |
| Pierce et al. | Classical and new roles of β-arrestins in the regulation of G-protein-coupled receptors | |
| Smrcka | G protein βγ subunits: central mediators of G protein-coupled receptor signaling | |
| Lopez-Ilasaca et al. | The angiotensin II type I receptor-associated protein, ATRAP, is a transmembrane protein and a modulator of angiotensin II signaling | |
| Tennakoon et al. | Subtype-dependent regulation of Gβγ signalling | |
| JP2011200229A (ja) | レポーター酵素変異体相補作用の利用によるｇタンパク共役受容体およびオーファン受容体機能の高感度検知のための改良システム | |
| US7378252B2 (en) | Process for identifying modulators of G-protein-coupled receptors | |
| Duvernay et al. | A single conserved leucine residue on the first intracellular loop regulates eR export of G protein‐coupled receptors | |
| Kim et al. | Identification of specific transmembrane residues and ligand-induced interface changes involved in homo-dimer formation of a yeast G protein-coupled receptor | |
| Li et al. | Ligand-specific changes in M3 muscarinic acetylcholine receptor structure detected by a disulfide scanning strategy | |
| Linder | 8 Reversible modification of proteins with thioester-linked fatty acids | |
| Schwartz et al. | Molecular structure and function of 7TM G-protein-coupled receptors | |
| EP2420830B1 (en) | Chloride transporter ClC-7 and cell-based screening method | |
| Morales Rodriguez | Location-Biased Signaling of Proton-Sensing Receptor GPR65 Within the Endocytic Pathway | |
| Wagner et al. | Differential regulation of G protein α-subunit GTPase activity by peptides derived from the third cytoplasmic loop of the α2-adrenergic receptor | |
| Janezic | Elucidating the role of unique structural features of the α1D-adrenergic receptor: A tale of two tails | |
| Kurth | Probing the lipid environment of the G-protein coupled receptor Metabotropic glutamate receptor 2 | |
| Huang | Interaction of a G protein-coupled receptor (Ste2p) of Saccharomyces cerevisiae with its ligand and its G-protein alpha subunit | |
| Huang | Interaction of a G protein-coupled receptor (Ste2p) ofSaccharomyces cerevisiaewith its ligand and its G-protein alpha subunit | |
| Magali | GPCRs and G protein activation | |
| Georgoussi | Novel interacting partners regulating opioid receptor signaling | |
| Singh | A model system for understanding cellular signaling of the cannabinoid CB2 receptor via the inhibitory Gi protein | |
| Ma | Molecular mechanisms of G protein-receptor coupling | |
| Clark | RGS protein modulation of neuronal Galpha (q)-mediated signaling | |
| Kim | Formation of Multiple Dimer Interfaces in the Active and Inactive States of a Model G Protein-Coupled Receptor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FC2A | Withdrawal, rejection or dismissal of laid open patent application | ||
| ERR | Erratum |
Free format text: I PATENTTIDENDE NR. 09/06 BLE PATENTSOKNAD NR. 20030068 FEILAKTIG KUNNGJORT ENDELIG HENLAGT. SOKNADEN ER UNDER BEHANDLING. |
|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |