KR100922701B1

KR100922701B1 - Ｇ-단백질-결합된 수용체의 조절제를 동정하는데광범위하게 적용되는 방법

Info

Publication number: KR100922701B1
Application number: KR1020037000278A
Authority: KR
Inventors: 코스테니스에비
Original assignee: 사노피-아벤티스 도이칠란트 게엠베하
Priority date: 2000-07-08
Filing date: 2001-07-05
Publication date: 2009-10-22
Also published as: AU7252201A; NO20101390L; BR0112300B1; ES2342453T3; JP4991081B2; BR0112300A; PT1319022E; NO330684B1; CY1110049T1; JP2004502463A; NO20030068L; US20040002109A9; AU2001272522B2; CA2415460C; EP1319022B1; US20020127601A1; KR20030021246A; IL153818A; DK1319022T3; IL153818A0

Abstract

본 발명은, 극히 광범위한 수용체 특이성 및 극히 고도의 발현성을 지닌 새로운 하이브리드 G-단백질을 이용하여, G-단백질-결합된 수용체를 조절하는 화학적 화합물을 동정하는데 광범위하게 적용되는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 유형의 방법에 의해 동정될 수 있는 화학적 화합물에 관한 것이다.

G-단백질-결합된 수용체, 하이브리드 G-단백질, 광범위한 수용체 특이성, GPCR-의존형 시그날 전달 경로, 수용체 무차별성

Description

Ｇ-단백질-결합된 수용체의 조절제를 동정하는데 광범위하게 적용되는 방법{Method with a wide range of applications, for identifying modulators of G-protein-coupled receptors}

본 발명은 G-단백질-결합된 수용체를 조절하는 화학적 화합물을 매우 광범위한 수용체 특이성을 지닌 신규한 하이브리드 G-단백질을 이용하여 동정하는 광범위하게 적용가능한 방법, 및 이러한 방법에 의해 동정될 수 있는 화학적 화합물에 관한 것이다.

G-단백질-결합된 수용체(GPCR)는 다양한 생리학적 과정에서 중요한 역할을 한다. 이들은 지금까지 공지된 가장 중요한 단백질 계열중의 하나이고, 사람 게놈내에서 약 1000개의 유전자가 이러한 수용체 부류를 암호화할 것으로 여겨진다. GPCR은 특징적 구조를 갖는다: 이들은 α-나선형으로 7회 세포막의 인지질 이중층을 관통하면서, 그자체가 환형으로 배열하는 펩티드 사(thread)이다. 현재 처방전을 통해 구입할 수 있는 약제의 약 60%가 GPCR에 결합하는 것으로 집계된다. 이는 이러한 수용체 부류가 약제학적 연구 산업에 있어 중요한 역할을 함을 강조한다.

모든 G-단백질-결합된 수용체는 공통의 기본적 패턴으로 작용한다: 세포외 리간드의 결합은 수용체 단백질의 입체형태적 변화를 유도하여, 수용체 단백질이 G-단백질과 접촉할 수 있게된다. 원형질막의 세포질 쪽에 위치한 G-단백질은 세포 외 시그날을 세포 내부로 매개하고 그곳에서 다양한 반응을 유발할 수 있다.

GPCR은 지금까지 가장 중요한 치료학적 표적 단백질이다. 의사에 의해 처방된 약제의 약 40%가 GPCR의 효능제 또는 길항제로서 작용한다. 당해 단백질 계열의 크기와 중요성 때문에, 그리고 다수의 GPCR(희규(orphan) GPCR)에 대하여 화학적 결합 파트너가 알려지지 않았다는 사실을 고려할 때, 이러한 수용체 부류가 장래에 새로운 의학 물질을 찾아내는데 있어 적합한 표적 단백질을 위한 가장 중요한 보고중의 하나 일 것이다.

GPCR은 내재성(integral) 막 단백질이다. 이들은, 세포의 바깥쪽에 결합된 대부분의 친수성 시그날 물질을 통해 매개된 시그날을 구아닌 뉴클레오티드-결합 단백질, 소위 G-단백질 계열을 통해 세포 내부로 전달한다. 당해 수용체의 특이성 및 이에 의해 활성화된 G-단백질에 따라, 이들은 다양한 시그날 전달 경로를 유도한다. 당해 수용체 유형에 따라, 다양한 작용이 일어나며, 이러한 작용은 모두 제2의 메신저의 형성을 유도한다. 따라서, 막-결합된 아데닐레이트 사이클라제의 활성화는 세포내 cAMP 수준의 증가를 유도할 수 있으며, 억제는 감소를 유도할 수 있다. cGMP-특이적 포스포디에스터라제의 자극은 cGMP 수준의 감소를 유도할 수 있다. 더구나, 활성화된 G-단백질은, 예를 들면 이온 채널에 결합함으로써 Ca²⁺ 또는 K⁺ 이온의 증가를 유도할 수 있다. 또한, 활성화된 G-단백질은 포스포리파제의 활성화를 초래하여, 이노시톨 1,4,5-트리포스페이트 및 디아실글리세롤을 형성시킬 수 있다. 이는 다시금 Ca²⁺ 증가를 유도하거나 단백질 키나제 C의 활성화를 유도하 며, 두 경우 모두에서 추가적 효과를 나타낸다. 제2의 메신저는 세포내 메신저 분자, 예를 들면 cAMP, cGMP, Ca²⁺및 기타, 세포내 단백질을 활성화하거나 불활성화하여 세포내에서 반응을 유발하는 것들이다.

이종삼량체 G-단백질은 원형질막의 내부에 위치한다. 이들은 3개의 아단위체, α, β 및 γ를 포함한다. 활성화된 수용체는 G-단백질 이종삼량체와 접촉하고, 이 결과 α아단위체와 βγ복합체로 해리된다. 활성화된 α아단위체와 βγ복합체는 모두 세포내 효과인자(effector) 단백질에 영향을 줄 수 있다. G-단백질 α아단위체 계열은 현재 4종의 상이한 부류(Gαs, Gαi, Gαq 및 Gα12 부류)로 분류된다. GPCR은 시그날 전달과 관련된 G-단백질에 따라 분류된다.

즉, Gs 부류의 GPCR은 Gαs의 활성화를 통해 아데닐레이트 사이클라제 자극을 매개하고 세포내 cAMP 농도를 증가시키고; Gi 부류의 GPCR은 Gαi의 활성화를 통해 아데닐레이트 사이클라제 억제를 매개하고 세포내 cAMP를 감소시키고; Gq 부류의 GPCR은 Gαq의 활성화를 통해 각종 PLCβ 이소형(isoform)의 자극을 매개하고 막-결합된 포스파티딜이노시톨 4,5-비스포스페이트의 가수분해를 유도하여 디아실글리세롤 및 이노시톨 트리포스페이트(IP3)를 생성시킨다. IP3는 세포내 축적물로 부터 Ca²⁺를 방출시킨다. 대부분의 GPCR은 하나의 G-단백질 α아단위체 계열과만 접촉할 수 있다. 즉, 이들은 특정 시그날 전달 경로에 선택적이다. 이러한 협소한 특이성은, GPCR-의존형 시그날 전달 경로를 조절하는 화학적 화합물을 동정하고자 하는 방법을 개발하는데 있어서 큰 장애이다. 또한, 많은 샘플 처리량(=고 처 리량 스크리닝=HTS(High Throughput Screening)의 분석 유형에서 이용될 수 있는 적합한 시그날은, 예를 들면 G-단백질 활성화가 세포내 Ca²⁺수준의 증가를 유도하는 이들 시그날 전달 경로로 부터만 수득된다.

변경된 수용체 특이성을 갖고 상이한 방식으로 시그날 전달 경로에 연결된 이들 G-단백질은, 분자생물학 및 생화학적 방법을 이용하여 다양한 G-단백질의 일부를 서로 결합하여 하이브리드 G-단백질을 생성시키는 방법에 의해 작제될 수 있다.

하이브리드 G-단백질은 하나의 단백질내에 다양한 Gα아단위체의 서열을 조합한 융합 작제물이다. 따라서, 예를 들면 Gαi 수용체 인식 영역을 Gαq 효과인자 활성화 영역에 융합시킴으로써, Gi-결합된 수용체로 부터 시그날을 수령하나, Gαq-PLCβ 시그날 전달 경로를 작동시키는 Gαq/i 하이브리드를 제조할 수 있다. Gαq의 C-말단 5개 아미노산이 상응하는 Gαi 서열에 의해 대체되어진 이러한 하이브리드(Gαqi5)가 처음으로 문헌[Conklin et al., Nature 363, 274-276 (1993)]에 기술되었다. 이러한 수용체의 "재결합(recoupling)"은, 분석 결과(아데닐레이트 사이클라제 억제와 비교하여 세포내 Ca²⁺농도의 증가)가 측정 방법을 통해 보다 쉽게 이용될 수 있고 고-처리량 스크리닝에 사용될 수 있는 이점을 갖는다.

그러나, 상기 Gαq/Gαi 융합 작제물의 단점은 이들이 일부 GPCR, 예를 들면 SSTR1 수용체 qi5를 활성화할 수 없다는 점이다[참조: Conklin et al., Mol. Pharmacol. 50, 885-890 (1996)].

또한, Gαq와 Gαs간의 융합 작제물이 기술되었다. 이들은, 예를 들면 β2-아드레날린성 수용체 또는 도파민 D1 수용체와 마찬가지로 모든 Gs-결합된 수용체를 PLCβ 시그날 전달 경로에 연결시킬 수 없는 단점을 가진다.

특정 시그날 전달 경로에 대한 수용체의 연결을 변경시키기 위한 C-말단 변형외에, 수용체 무차별성(promiscuity)을 유도하는 Gαq의 N-말단 변형이 기술되었다. 이와 관련하여 수용체 무차별성은, 상이한 수용체로 부터의 시그날을 수령하고 전달시킬 수 있는 G-단백질의 능력을 의미한다. 이러한 Gαq 단백질에서, 6개의 고도로 보존된 N-말단 아미노산이 결실되었다[참조 문헌: Kostenis et al., J. Biol. Chem. 272, 19107-19110 (1997)]. 이러한 결실로 인해, 생성된 Gq(또한 소위-6q)는 Gq- 뿐만 아니라 Gs- 또는 Gi/o-결합된 수용체로 부터 시그날을 수령하여 이들을 PLCβ로 전달할 수 있다.

현재, 상기 Gα 아단위체는 또한 SSTR1 소마토스타틴 수용체, 도파민 D1 수용체 및 아드레날린성 β2 수용체와 같은 수용체를 인식한다. 그러나, 이러한 G-단백질 조차 수용체 edg5를 인식할 수 없다. 또한, 상기 G-단백질의 시그날 강도는 매우 약하여 실제로 사용될 수 없다[참조 문헌: Kostenis et al., J. Biol. Chem. 272, 19107-19110 (1997)].

또 다른 공지된 Gα아단위체는, 다양한 기능적 부류로 부터의 GPCR을 PLCβ-Ca²⁺ 시그날 전달 경로에 연결하는 Gα16이다. 이러한 G-단백질은 실제로 자연적으로는 선택되지 않는다. 그러나, edg5 수용체 또는 SSTR1 소마토스타틴 수용체와 같은 수용체가 Gα16에 결합한다 할지라도 단지 약하게 결합하기 때문에, 이러한 아단위체도 보편적으로 적용될 수 없다.

이러한 이유 때문에, 다른 기능적 GPCR 부류에 의해 활성화되고 또한 세포내에서 충분히 강한 시그날을 제공하며, GPCR 및/또는 적당한 의존형 시그날 전달 경로, 예를 들면 세포내 Ca²⁺ 농도의 증가 또는 감소와 같은 시그날을 조절하는 화합물을 동정하기 위한 분석, 특히 고-처리량 분석에서 사용될 수 있는 G-단백질이 이용가능하다면 매우 유용할 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은, 화학적 화합물을 동정하는 스크리닝 방법을 위한 하이브리드 G-단백질(이러한 단백질은 인식될 수 있는 GPCR에 대해 매우 광범위한 특이성을 가지며 상기 G-단백질을 세포내 Ca²⁺ 농도의 증가를 유도하는 시그날 경로에 연결하는 특징을 갖는다)을 추가로 제공하는 것이다. 또한, 이들의 발현은 시그날 강도가 향상될 정도로 고수준이다.

본 발명은,

a) 하나 이상의 GPCR-의존형 시그날 전달 경로를 함유하고 하나 이상의 G-단백질을 생성하는 하나 이상의 세포를 제공하는 단계;

b) 연구하고자 하는 하나 이상의 화학적 화합물을 제공하는 단계;

c) 단계 a)에 따른 세포를 단계 b)에 따른 연구하고자 하는 화합물과 접촉시키는 단계; 및

d) 시그날 전달 경로-의존형 측정가능한 시그날을 이용하여, 단계 b)로 부터 의 연구하고자 하는 화학적 화합물이 단계 a)로 부터의 세포의 시그날 전달 경로에 미치는 정량적 또는 정성적 효과를 측정하는 단계를 포함하여, 생물체의 하나 이상의 G-단백질-결합된 수용체(GPCR)-의존형 시그날 전달 경로의 작용을 변형시키는 화학적 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다.

생물체의 하나 이상의 G-단백질-결합된 수용체(GPCR)-의존형 시그날 전달 경로의 작용은 억제 또는 자극 방식으로 변형될 수 있다. 시그날 전달 경로-의존형 측정가능한 시그날이 화학적 화합물의 부재시 보다 이의 존재시에 더 약한 경우에, 화학적 화합물의 억제 효과가 있는 것이다. 이러한 효과를 일으키는 화합물은 또한 길항제라고 불린다. 한편, 시그날 전달 경로-의존형 측정가능한 시그날이 화학적 화합물의 부재시 보다 이의 존재시에 더 강한 경우에, 화학적 화합물의 자극 효과가 있는 것이다. 이러한 화합물은 또한 효능제로 불린다.

바람직한 태양에서, 본 발명의 방법은 두개 이상의 G-단백질을 생산하는 세포를 사용한다. 상기 G-단백질은 하나의 또는 상이한 GPCR에 의존할 것이다. 원칙적으로, 모든 G-단백질은 이들의 수용체 특이성, 이들의 서열, 이들의 구조, 세포, 조직 또는 기관에 관한 기원 또는 이들이 특이적인 종에 관한 기원에 관계없이 본 발명의 방법을 수행하는데 적합하다. -6qi4myr, -6qs5myr, -6qi4, -6qs5 중의 하나 이상의 G-단백질을 생성하는 세포가 바람직하다. G-단백질 -6qi4myr, -6qs5myr, -6qi4, -6qs5는, 마우스의 상이한 G-단백질의 일부로 부터 조립되고 몇몇 경우에 추가적 변형을 함유하는 하이브리드 G-단백질이다. G-단백질은 세포에 의해 개별적으로 또는 공동으로 생성될 수 있다. 이미 언급된 하이브리드 G-단백질 외에, 세포는 특히 Gα16를 생성할 수 있다. 각각의 G-단백질은 세포내에 개별적으로 존재하거나 하나 이상의 다른 G-단백질과 함께 존재할 수 있다. 항상, Gα16은 단독으로 생성되는 것이 아니라 위에서 언급한 또 다른 G-단백질과 함께 생성되는 방식으로 세포내에서 생성되어야 한다.

바람직한 G-단백질의 아미노산 서열은, -6qi4myr의 경우 서열번호 2에, -6qi5myr의 경우 서열번호 4에, -6qi4의 경우 서열번호 6에, -6qs5의 경우 서열번호 8에, 그리고 Gα16의 경우 서열번호 10에 기술되어 있다.

화학적 화합물은 통상적으로 가용성 형태로 제공된다. 화학적 화합물을 용해시키는데 물을 사용하는 것이 바람직하다. 용매이외에, 당해 용액은 완충 물질, 염 또는 보조제, 예를 들면 용해화제, 세제, 보존제 또는 기타 물질을 함유할 수 있다.

세포의 제공은 이의 생산, 배양 및 처리 공정을 포함한다. 예를 들면, 기관 또는 조직으로 부터 적절한 세포 물질을 수득하거나 적절한 세포주 또는 미생물을 증식시키는 방법으로 세포가 제공된다. 각종 적합한 배양 배지가 배양에 사용될 수 있다. 세포를 당해 생물체의 최적 온도에서 유지시킨다. 적당한 경우, 보존제, 항생제, pH 지시제, 혈청 성분, 혈청, 보조제 또는 기타 물질이 각 경우에 사용된 성장 배지에 첨가될 수 있다. 생산, 배양 및 추가적인 처리 공정이 표준 교과서[예: Basic Cell Culture; Ed. J.M. Davis; IRL Press; 1994]에 기술되어 있다.

상기 방법의 바람직한 태양에서, 척추동물 종, 곤충 종, 씨.엘레간스(C. elegans) 또는 효모의 세포가 제공된다. 특히 바람직한 태양에서, HeLa, 293, COS 또는 CHO 세포 또는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 세포가 제공된다.

바람직한 태양에서, 세포내 Ca²⁺ 농도가, 연구하고자 하는 화합물이 시그날 전달 경로-의존형 측정가능한 시그날의 세포 시그날 전달 경로에 미치는 정량적 또는 정성적 효과를 결정하는데 사용될 것이다. 세포내 Ca²⁺ 농도의 변화는, 예를 들면 에쿼린, 염료의 사용에 의해 또는 FLIPR^TM 기법(Molecular Devices 제공)에 의해 검출할 수 있다.

바람직한 태양에서, 상기한 공정을 약제를 동정하는데 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 생물체의 하나 이상의 G-단백질-결합된 수용체(GPCR)-의존형 시그날 전달 경로의 작용을 변형시키는 하나 이상의 화학적 화합물에 관한 것이며, 이러한 화학적 화합물은 본 발명의 하나 이상의 방법에 의해 동정되어진다. 이러한 화학적 화합물의 예로는, GPCR을 유도하는 친수성 시그날 물질의 화학적 구조의 변형물, 예를 들면 특정 호르몬, 신트(scent) 또는 특정 약제가 포함된다.

또한, 본 발명은, 다음 서열:

a) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 8에 따른 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드;

b) 하나 이상의 아미노산이 결실된 a)에 따른 폴리펩티드;

c) 하나 이상의 아미노산이 추가된 a)에 따른 폴리펩티드; 및

d) a)에 따른 폴리펩티드의 대립유전자 변이체중 어느 하나의 서열로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하고, G-단백질의 특성을 지닌 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.

대립유전자 변이체는, 하이브리드 단백질을 구성하는 특정 파트너에 대한 정해진 유전자 좌에서 유전자의 특징적 형의 염기 조성으로 부터 생성되는 모든 폴리펩티드를 포함한다.

또한, 본 발명은, 다음 서열:

a) 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 7에 따른 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 상보적인 상응하는 서열; 및

b) 엄격한 조건하에서 a)에 따른 폴리뉴클레오티드 서열과 하이브리드를 형성하는 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

용액의 엄격도는 온도 및 이의 염 함량에 의해 결정된다. 엄격도를 이용하여, 두 개의 상동 뉴클레오티드 서열의 염기 쌍형성의 정도를 조정할 수 있다. 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 염기 조성에 의존한다. 본 발명에 따른 엄격한 조건은, 폴리뉴클레오티드 서열과 하이브리드형성 서열의 95% 이상이 일치하는 경우에 존재한다.

상기한 폴리뉴클레오티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드의 바람직한 태양은 재조합 벡터 작제물의 일부인 폴리뉴클레오티드이다. 재조합 벡터 작제물은, 예를 들면 문헌[F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, New York]에 설명된 바와 같은 관련 전문 지식을 이용하여 수득할 수 있다. 이는, 상기 서열 정보에 따른 아미노산 서열(서열번호 2, 4, 6, 8)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 상기 서열 정보에 따른 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 1, 3, 5, 7)을 기본 벡터에 삽입하는 과정을 수반한다. 기본 벡터는, 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 서열이 분자생물학적 방법에 의해 삽입되어져서, 미생물, 예를 들면 세균, 진균 또는 세포 배양물의 세포내에서 클로닝될 수 있는 벡터를 의미한다. 이러한 기본 벡터의 예로는 항생제 내성 마커, 세균 또는 세포 배양물에서 플라스미드를 증식시키기에 적합한 복제원, 및 단백질의 발현에 적합한 프로모터를 갖는 플라스미드가 포함된다. 또한, 기본 벡터의 예로는 파아지 벡터, 파아지미드(phagemid) 벡터, 플리스미드 벡터, 코스미드 벡터, 바이러스 벡터, YAC 벡터 또는 기타 유형의 벡터가 포함된다. 기본 벡터의 예로는 pUC 18, pUC19, pBluescript, pKS, pSK 등이 있다. 삽입하고자 하는 폴리뉴클레오티드를, 시판원[예를 들면, BioLabs, Roche Diagnostics, Stratagene, 등]에서 시판되고 있는 적당한 제한 효소를 이용하여 적합한 제한 절단 부위를 통해 삽입한다. 이러한 제한 절단 부위는, 예를 들면 제한 효소 BamHI, EcoRI, SalI, EcoRV 등의 인식 부위일 수 있다.

바람직한 태양에서, 재조합 벡터 작제물은 진핵생물 및/또는 원핵생물에서 사용가능한 발현 벡터를 포함한다. 발현 벡터는, 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 단백질이 생물체, 예를 들면 세균, 진균 또는 진핵 세포주의 세포에서 합성되도록, 당해 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있는 프로모터를 함유한다. 당해 프로모터는 예를 들면 트립토판에 의해 유도될 수 있거나, 또는 구성적(constitutive)일 수 있다. 발현 벡터의 예로는 pUC18, pUC19, pBluescript, pcDNA3.1 등 이 있다.

또한, 본 발명은 상기한 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 벡터 작제물을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 바람직한 태양에서, 숙주 세포는 사람 세포를 포함한다. 또 다른 바람직한 태양에서, 숙주 세포는 척추동물 종, 곤충 종, 씨. 엘레간스, 세균 또는 효모의 세포를 포함한다. 특히 바람직한 태양에서, 당해 세포는 HeLa, 293, COS 또는 CHO 세포, 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포 또는 사카로마이세스 세레비지애 세포를 포함한다. 또한, 다른 진핵생물 세포, 특히 세포주, 세균, 특히 바실루스(Bacillus) 종, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종, 진균, 특히 페니실륨(Penicillium) 종, 아스퍼길루스(Aspergillus) 종이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은, 서열번호 1 내지 8에 제시된 바와 같은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 상기한 바와 같은 특징을 갖는 재조합 벡터 작제물을 진핵생물 또는 원핵생물 세포속에 도입하는 방법에 의해 상기한 바와 같은 숙주 세포를 생산하는 것에 관한 것이다. 당해 폴리뉴클레오티드 서열은, 예를 들면 전기천공법, 폴리뉴클레오티드 서열에 의한 진핵생물 또는 원핵생물 세포의 형질전환법, 당해 폴리뉴클레오티드 서열과 함께 진핵생물 또는 원핵생물 세포의 Ca²⁺ 포스페이트 침전법 또는 기타 방법에 의해 도입될 수 있다.

이러한 종류의 숙주 세포는 상기한 본 발명의 방법을 수행하는데 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 및 서열번호 8중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 단백질에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은,

a) 상기한 바와 같이 수득된 적당한 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 숙주 세포를 생산하는 단계;

b) 숙주 세포에 적합하고 또한 단백질의 발현을 유도할 수 있는 성장 배지에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계;

c) 세포 물질을 수득하고 세포를 붕괴시키는 단계; 및

d) 단백질 정제를 위한 생화학적 방법에 의해 단백질을 회수하는 단계를 포함하여, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 및 서열번호 8중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

상기한 단백질을 제조하고 정제하기 위하여, 문헌[F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, New York]에 기술된 공지된 방법을 적절히 사용할 수 있다.

서열번호 2, 4, 6 또는 8에 따른 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 상기한 방법에 따라 제조된 단백질을 항체의 생산에 사용할 수 있다.

실시예 1

각종 수용체에 의한 Gα-단백질 돌연변이체 -6q를 통한 시그날 전달 경로의 활성화

COS7 세포를 10% FCS(태아 송아지 혈청)를 함유한 DMEM(Dulbeccos's Modified Eagle's Medium: 듈베코의 변형된 이글 배지)중에, 37℃(5% CO₂)에서 배양하였다. 형질감염을 위해, 1x10⁶개 세포를 100mm 플레이트에 시딩하였다. 약 24시간 후, 당해 세포를 발현 플라스미드 αq 또는 -6q(1㎍ DNA/100mm 플레이트), 및 각각의 경우에 하나의 다음의 수용체 작제물(4㎍ DNA/100mm 플레이트)로 공동형질전환시켰다: M2(pCD중의 무스카린성 수용체), D2(pCDNA1중의 도파민 수용체), 카파(pCDNA3중의 아편양제제 수용체), SSTR1(pCMV중의 소마토스타틴 수용체), A1(CDM7중의 아데노신 수용체), D1(pCDNA1중의 도파민 수용체), V2(pCD-ps중의 바소프레신 수용체), 및 β2(pSVL중의 아드레날린성 수용체)

형질감염한지 약 24시간 후에, 당해 세포를 6-웰 플레이트에 동일한 분량으로 나누고, DMEM중의 3μCi/ml[3H]미오(myo)-이노시톨(20 Ci/mmol)를 첨가하였다. 24시간 동안 항온처리한 후, 당해 세포를 실온에서 20분간 HBSS(+ 10mM LiCl)와 항온처리하였다. 이어서, 당해 세포를 적당한 효능제로 1시간 동안 자극하고, 세포내 이노시톨 모노포스페이트의 증가를 음이온 교환 크로마토그래피로 측정하였다.

야생형 서열과 비교하여, Gα-단백질 돌연변이체 -6q는 6개의 고도로 보존된 아미노산 서열 잔기가 아미노-말단부에 결실되어 있다. 이러한 유형의 작제물은 아미노 말단 부분이 도 1에 도시되어 있다. 야생형 서열은 αq(WTq)로 표시된다. 후속적인 결과가 Gα-단백질 작제물 -6q로 수득되었다. 또한, 도 1은 추가 서열 예를 제시한다. 사용된 이러한 유형의 돌연변이체 또는 수용체 작제물을, 예를 들면 문헌[F.M. Ausebel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, New York]에 상세히 기술된 바와 같이 표준 분자생물학적 방법을 이용하여 제조하였다.

WTq 또는 -6q 및 다양한 Gi/o-결합된 수용체(A) 또는 Gs-결합된 수용체(B)를 발현하는 COS7 세포를 적당한 효능제(하기 참조)의 존재 및 부재하에서 1시간 동안 항온처리(37℃)하였다. 세포내 IP1 농도의 증가를 첨부된 프로토콜 1에서와 같이 측정하였다. 당해 데이타는, 각 측정을 3회 수행한 3 내지 7회의 독립적인 실험의 평균 ±S.E.을 나타낸다. 아래의 리간드를 사용하였다:

도 2A: m2(무스카린성 수용체): 카바콜(100μM); D2(도파민 수용체): (-)-퀸피롤(10μM); 카파(아편양제제 수용체): (-)-U50488(10μM); SSTR1(소마토스타틴 수용체): 소마토스타틴 14(1μM); B, A1(아데노신 수용체): R(-)-PIA(10mM);

도 2B: D1(도파민 수용체): 도파민(1mM); V2(바소프레신 수용체): AVP(1nM); β2(아드레날린성 수용체):(-)-이소프로테레놀(200μM). 도면 아래의 숫자는, -6q로 부터 WTq로의 PLC 자극의 상대적 증가로서 특정 PLC 자극의 정도를 나타낸다.

도 2는, Gα-단백질 돌연변이체 -6q가 상이한 수용체 부류에 따라 IP1 형성을 자극함을 보여준다. IP1은 PLC-β-시그날 전달 경로에서 발생하고 시그날 전달의 또 다른 과정에서 세포내 Ca²⁺ 농도의 증가를 유도하는 시그날 분자이다. 도 2에서 -6q에 대한 실험 결과는 야생형 작제물(WTq)을 이용한 자극과 임의의 Gα 삽입체가 부재하는 벡터 작제물(벡터)를 사용한 또 다른 대조군을 비교한 것이다. -6q 작제물을 이용한 IP1 방출은 Gi/o-결합된 수용체(도 2A: m2, D2, k-OR, SSTR1, A1) 및 Gs-결합된 수용체(도 2B: D1, V2, β2) 모두에서 성공하였다.

실시예 2

광범위한 수용체 특이성을 지닌 고도로 발현되는 Gα단백질 돌연변이체의 제조

먼저, 아미노 말단부의 6개의 고도로 보존된 아미노산이 결실되고 동시에 C 말단부에 αi 또는 αs 서열을 갖는 하이브리드 G-단백질 α-아단위체를 작제하였다. 이들은, 함유된 αi 서열 또는 αs 서열에 상응하게 -6qi4 또는 -6qs5로 명명하였다. 작제물 -6qi4는 Gs-결합된 수용체 및 몇몇 Gi/o-결합된 수용체를 PLCβ시그날 전달 경로에 연결시킨다. 상기 수용체는 또한 SSTR1 수용체 또는 edg5 수용체를 포함한다. Gα16은 edg5 수용체를 PLCβ 시그날 전달 경로에 연결시킬 수 없다. Gα16은 광범위한 수용체 특이성을 지닌 G-단백질이고 WO 97/48820[발명의 명칭: 무차별성(promiscuous) G-단백질 조성물 및 이들의 용도]에 기술되어 있다. 작제물 -6qs5는 Gi/o-결합된 수용체 및 추가로 또한 Gs-결합된 수용체를 PLCβ 시그날 전달 경로에 연결시키고, 이제 또한 도파민 D1 수용체 또는 아드레날린성 β2 수용체와 같은 수용체를 인식한다.

하나의 세포주에서 상기 두개의 G-단백질 α아단위체의 조합체는 각 아단위체 개개 또는 Gα16 보다 더욱 광범위한 GPCR을 인식한다.

상기 Gα아단위체(-6qi4; -6qs5)의 발현이 증가되면 강한 시그날이 생성될 수 있기 때문에 기술적 스크리닝 과정의 적용성이 보다 향상될 수 있다.

이러한 이유 때문에, 추가적 미리스토일화/팔미토일화 인식 서열을 Gα아단위체의 아미노-말단 영역속에 삽입하였다. 이로써, G-단백질 -6qi4myr 및 -6qs5myr가 작제되었다. 아미노 말단에 있어서 -6qi4myr 및 -6qs5myr의 단백질 서열은 MGCC인 반면, -6q 변이체의 본래의 서열은 MACC이다. 이제, 새로운 작제물, -6qi4myr 및 -6qs5myr은 미리스토일화/팔미토일화를 위한 컨센서스 서열을 함유한다. -6qi4myr는 -6qi4로 부터 제조하고 -6qs5myr는 -6qs5로 부터 제조하였다. G-단백질로 부터 미리스틸 또는 팔미틸 잔기를 제거함으로써 세포내에서 재분포된다는 것이 공지되었다: 지방산 잔기가 제거되면 주로 세포질내 국한되는 것과 마찬가지로, 팔미테이트 또는 미리스테이트 잔기의 상실은 G-단백질의 발현 패턴에 영향을 준다. G-단백질 α단위체는 세포막 및 세포질 모두에서 발견된다. 그러나, 막-결합 G-단백질만이 시그날을 GPCR로 부터 세포내 효과인자에게 전해줄 수 있다. 팔미토일화/미리스토일화를 위한 컨센서스 서열을 돌연변이에 의해 제거한 결과만이 공지되었다. 그러나, 미리스토일화/팔미토일화를 위한 또 다른 컨센서스 부위를 Gα결실 돌연변이체에 도입하는 것이 발현 증가를 유도한다는 것은 공지되지 않았다. 또 다른 팔미토일화/미리스토일화 부위의 도입이 세포막에서 발현된 Gα 아단위체의 양을 증가시킬 수 있음을 보여줄 수 있었다(도 3, 도 4). 도 3에서 SDS-PAGE 웨스턴 블롯(나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 웨스턴 블롯)은 -6qi4에 비해 -6qi4myr의 발현이 확연히 증가하였음을 보여준다. 도 4는 qwt 및 -6qi4myr를 입자 분획(p: 막-함유)과 가용성 분획(s; sc)으로 분획화하는 SDS-PAGE 웨스턴 블롯을 도시한다. 고도로 미리스토일화/팔미토일화된 변이체, -6qi4myr은 입자 분획에만 존재한다. 이를 위하여, 막 단백질 20㎍을 형질감염된 COS7 세포로 부터 수득하고, SDS-PAGE 겔 전기영동(10%)으로 분획화하고, 12CA5 모노클로날 항체(Roche Biosciences)을 사용한 웨스턴 블롯 분석으로 분석하였다. 모든 G-단백질 α아단위체는, HA 에피토프 태그에 대해 유도된 12CA5 모노클로날 항체(호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)에 결합됨)에 의해 검출되었다. HA 태그는 모든 G-단백질 작제물중에 함유된다. qwt 및 qi5에서, 이는 아미노산 125 내지 130을 대체하고, N-말단이 결실된 G-단백질(-6q, -6qi4, -6qi4myr)에서 아미노산 119 내지 124를 대체한다. 형질감염된 COS7 세포로 부터 수득된 막 단백질 20㎍을 각 경우에 SDS PAGE 겔 전기영동으로 분획화하고, 니트로셀룰로즈상에 블롯팅하고, G-단백질 α아단위체를 12CA5 항체로 검출하였다. 면역반응성 G-단백질을 화학발광계(Amersham)을 사용하여 가시화하였다.

실시예 3

광범위한 수용체 특이성을 지닌 고도로 발현된 다양한 Gα-단백질의 상이한 수용체에 의한 자극

고도로 발현된 Gα변이체, -6qs5myr 및 -6qi4myr를 상이한 수용체로 자극시킨 것이 도 5 및 도 6에 도시되어 있다. 도 5는, -6qi4myr(Δ6qi4myr)이 Gi/o-결합된 수용체(예: 도파민 D2, edg5, CCR5, SSTR1, KOR)에 의해 PLCβ시그날 전달 경로에 연결되어 Ca²⁺방출에 비례하는 강한 시그날을 유도함을 보여준다. 사용된 대조군은 벡터 작제물 및 Gα16 단백질(+16)이였다. 도 6은, Gs-결합된 수용체가 -6qs5myr(Δ6qs5myr)에 의해 PLCβ시그날 전달 경로에 연결됨을 보여준다. G-단백질 Gα16도 또한 여기서 참조물로서 사용된다.

에쿼린 시스템을 이용하여 방출된 Ca²⁺을 실험적으로 측정하기 위하여, CHO 세포를 리포펙타민을 사용하여 아포에쿼린 발현 플라스미드 cytAEQ/pCDNA1, 상기된 수용체 DNA(SSTR1, KOR, D2, D1, 베타2) 및 G-단백질 α아단위체 G16 및 -6qi4myr로 공동형질감염시켰다. OPTIMEM 배지에서 10시간 동안 항온처리한 후, 당해 세포를 RPMI 1640 배지로 1회 세척하고, RPMI 1640에서 2시간 동안 5μM 코엘렌테라진 f와 37℃에서 항온처리하였다. 이어서, 당해 세포를 PBS로 2회 세척하고, 적당한 수용체 효능제[SSTR1 수용체의 경우 소마토스타틴 14, 카파 아편양제제 수용체의 경우 U50488, 도파민 D2 수용체의 경우 (-)-퀸피롤, 도파민 D1 수용체의 경우 도파민, 및 베타2 수용체의 경우 이소프로테레놀]를 사용하여 자극하였다. Gi/o-결합된 수용체(SSTR1, KOR, D2) 및 Gs-결합된 수용체(D1 및 베타2)의 효능제 자극은 G-단백질 G16 및 -6qi4myr의 활성화를 유도하고, 이어서 PLCβ 및 세포내 Ca 방출을 자극하였다. 아포에쿼린-코엘렌테라진 복합체에 Ca이 결합함으로써 빛이 방출되고, 이를발광측정기(TOPCount, Hewlett Packard)로 측정하였다.

도 1은 각종 Gα단백질의 아미노-말단부 영역의 정렬을 나타낸다.

도 2는 최대 농도의 관련 효능제를 사용한 Gi/o-결합된 수용체(A) 및 Gs-결합된 수용체(B)에 의한 -6q-Gα단백질 변이를 통한 PLCβ시그날 전달 경로의 자극을 보여준다.

도 3은 -6qi4에 비해 -6qi4myr의 발현이 증가됨을 나타내는 SDS-PAGE 웨스턴 블롯을 보여준다. 또한, 추가적 Gα단백질의 발현이 보인다.

도 4는 qwt 및 -6qi4myr의 입자 분획(p: 막-함유)과 가용성 분획(s; sc)으로 의 분획화를 보여주는 SDS-PAGE 웨스턴 블롯을 도시한다. G-단백질 아단위체는 12CA5 모노클로날 항체에 의해 검출되어, 약 42KD의 단백질 밴드로 나타난다.

도 5는 각종 Gi/o-결합된 수용체가 -6qi4myr(=Δ6qi4myr)에 의해 PLCβ시그날 전달 경로에 연결됨을 보여준다. D2, 카파 및 SSTR1은 Gi/o-결합된 수용체이다. 사용된 대조군은 벡터 작제물 및 Gα16 단백질(+16)이였다.

도 6은 Gs-결합된 수용체가 -6qs5myr(=Δ6qs5myr)에 의해 PLCβ시그날 전달 경로에 연결됨을 보여준다. β1, β2 및 D1은 Gs-결합된 수용체이다. 벡터 작제물 및 Gα16 단백질(+16)이 참조물로서 사용되었다.

도 7은 Gi/o-결합된 도파민 D2 수용체가, 저감도의 α아단위체 G16의 존재, 매우 민감한 Gα아단위체 -6qi4myr의 존재, 및 G16과 -6qi4myr의 조합의 존재하에서 PLCβ-Ca 시그날 전달 경로에 연결된 것을 보여준다. -6qi4myr에 의한 칼슘 방출의 잠재적 활성화가 G16의 존재에 의해 불리하게 영향받지 않음이 분명하다.

<110> Aventis Pharma Deutschland GmbH <120> Method with a wide range of applications, for identifying modulators of G-protein-coupled receptors <130> AVE D-2000/A033 <150> DE 10033353.2 <151> 2000-07-08 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1080 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 atgactctgg agtccatcat ggcgtgctgc ctgagcgagg aggccaagga agcccggcgg 60 atcaacgacg agatcgagcg gcacgtccgc agggacaagc gggacgcccg ccgggagctc 120 aagctgctgc tgctcgggac aggagagagt ggcaagagta cgtttatcaa gcagatgaga 180 atcatccatg ggtcaggata ctctgatgaa gataaaaggg gcttcaccaa gctggtgtat 240 cagaacatct tcacggccat gcaggccatg atcagagcca tggacacact caagatccca 300 tacaagtatg agcacaataa ggctcatgca caattagttc gagaagttga tgtggagaag 360 gtgtctgctt ttgagaatcc atatgtagat gcaataaaga gtttatggaa tgatcctgga 420 atccaggaat gctatgatag acgacgagaa tatcaattat ctgactctac caaatactat 480 cttaatgact tggaccgcgt agctgaccct gcctacctgc ctacgcaaca agatgtgctt 540 agagttcgag tccccaccac agggatcatc gaatacccct ttgacttaca aagtgtcatt 600 ttcagaatgg 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Met Tyr Ser His Leu Val Asp Tyr Phe Pro Glu 275 280 285 Tyr Asp Gly Pro Gln Arg Asp Ala Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Leu 290 295 300 Lys Met Phe Val Asp Leu Asn Pro Asp Ser Asp Lys Ile Ile Tyr Ser 305 310 315 320 His Phe Thr Cys Ala Thr Asp Thr Glu Asn Ile Arg Phe Val Phe Ala 325 330 335 Ala Val Lys Asp Thr Ile Leu Gln Leu Asn Leu Lys Glu Cys Gly Leu 340 345 350 Phe <210> 7 <211> 1062 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 atggcgtgct gcctgagcga ggaggccaag gaagcccggc ggatcaacga cgagatcgag 60 cggcacgtcc gcagggacaa gcgggacgcc cgccgggagc tcaagctgct gctgctcggg 120 acaggagaga gtggcaagag tacgtttatc aagcagatga gaatcatcca tgggtcagga 180 tactctgatg aagataaaag gggcttcacc aagctggtgt atcagaacat cttcacggcc 240 atgcaggcca tgatcagagc catggacaca ctcaagatcc catacaagta tgagcacaat 300 aaggctcatg cacaattagt tcgagaagtt gatgtggaga aggtgtctgc ttttgagaat 360 ccatatgtag atgcaataaa gagtttatgg aatgatcctg gaatccagga atgctatgat 420 agacgacgag aatatcaatt atctgactct accaaatact atcttaatga cttggaccgc 480 gtagctgacc ctgcctacct gcctacgcaa caagatgtgc ttagagttcg agtccccacc 540 acagggatca tcgaataccc ctttgactta caaagtgtca ttttcagaat ggtcgatgta 600 gggggccaaa ggtcagagag aagaaaatgg atacactgct ttgaaaatgt cacctctatc 660 atgtttctag tagcgcttag tgaatatgat caagttctcg tggagtcaga caatgagaac 720 cgaatggagg aaagcaaggc tctctttaga acaattatca catacccctg gttccagaac 780 tcctcggtta ttctgttctt aaacaagaaa gatcttctag aggagaaaat catgtattcc 840 catctagtcg actacttccc agaatatgat ggaccccaga gagatgccca ggcagcccga 900 gaattcattc tgaagatgtt cgtggacctg aacccagaca gtgacaaaat tatctactcc 960 cacttcacgt gcgccacaga caccgagaat atccgctttg tctttgctgc cgtcaaggac 1020 accatcctcc agttgaacct gaaggagtgt ggcctcttct aa 1062 <210> 8 <211> 353 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Met Ala Cys Cys Leu Ser Glu Glu Ala Lys Glu Ala Arg Arg Ile Asn 1 5 10 15 Asp Glu Ile Glu Arg His Val Arg Arg Asp Lys Arg Asp Ala Arg Arg 20 25 30 Glu Leu Lys Leu Leu Leu Leu Gly Thr Gly Glu Ser Gly Lys Ser Thr 35 40 45 Phe Ile Lys Gln Met Arg Ile Ile His Gly Ser Gly Tyr 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Leu 260 265 270 Leu Glu Glu Lys Ile Met Tyr Ser His Leu Val Asp Tyr Phe Pro Glu 275 280 285 Tyr Asp Gly Pro Gln Arg Asp Ala Gln Ala Ala Arg Glu Phe Ile Leu 290 295 300 Lys Met Phe Val Asp Leu Asn Pro Asp Ser Asp Lys Ile Ile Tyr Ser 305 310 315 320 His Phe Thr Cys Ala Thr Asp Thr Glu Asn Ile Arg Phe Val Phe Ala 325 330 335 Ala Val Lys Asp Thr Ile Leu Gln Leu Asn Leu Lys Glu Cys Gly Leu 340 345 350 Phe <210> 9 <211> 1128 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 9 gccatggccc gctcgctgac ctggcgctgc tgcccctggt gcctgacgga ggatgagaag 60 gccgccgccc gggtggacca ggagatcaac aggatcctct tggagcagaa gaagcaggac 120 cgcggggagc tgaagctgct gcttttgggc ccaggcgaga gcgggaagag caccttcatc 180 aagcagatgc ggatcatcca cggcgccggc tactcggagg aggagcgcaa gggcttccgg 240 cccctggtct accagaacat cttcgtgtcc atgcgggcca tgatcgaggc catggagcgg 300 ctgcagattc cattcagcag gcccgagagc aagcaccacg ctagcctggt catgagccag 360 gacccctata aagtgaccac gtttgagaag cgctacgctg cggccatgca gtggctgtgg 420 agggatgccg gcatccgggc ctgctatgag cgtcggcggg aattccacct gctcgattca 480 gccgtgtact acctgtccca cctggagcgc atcaccgagg agggctacgt ccccacagct 540 caggacgtgc tccgcagccg catgcccacc actggcatca acgagtactg cttctccgtg 600 cagaaaacca acctgcggat cgtggacgtc gggggccaga agtcagagcg taagaaatgg 660 atccattgtt tcgagaacgt gatcgccctc atctacctgg cctcactgag tgaatacgac 720 cagtgcctgg aggagaacaa ccaggagaac cgcatgaagg agagcctcgc attgtttggg 780 actatcctgg aactaccctg gttcaaaagc acatccgtca tcctctttct caacaaaacc 840 gacatcctgg aggagaaaat ccccacctcc cacctggcta cctatttccc cagtttccag 900 ggccctaagc aggatgctga ggcagccaag aggttcatcc tggacatgta cacgaggatg 960 tacaccgggt gcgtggacgg ccccgagggc agcaagaagg gcgcacgatc ccgacgcctt 1020 ttcagccact acacatgtgc cacagacaca cagaacatcc gcaaggtctt caaggacgtg 1080 cgggactcgg tgctcgcccg ctacctggac gagatcaacc tgctgtga 1128 <210> 10 <211> 374 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Met Ala Arg Ser Leu Thr Trp Arg Cys Cys Pro Trp Cys Leu Thr Glu 1 5 10 15 Asp Glu Lys Ala Ala Ala Arg Val Asp Gln Glu Ile Asn Arg Ile Leu 20 25 30 Leu Glu Gln Lys Lys Gln Asp Arg Gly Glu Leu Lys Leu Leu Leu Leu 35 40 45 Gly Pro Gly Glu Ser Gly Lys Ser Thr Phe Ile Lys Gln Met Arg Ile 50 55 60 Ile His Gly Ala Gly Tyr Ser Glu Glu Glu Arg Lys Gly Phe Arg Pro 65 70 75 80 Leu Val Tyr Gln Asn Ile Phe Val Ser Met Arg Ala Met Ile Glu Ala 85 90 95 Met Glu Arg Leu Gln Ile Pro Phe Ser Arg Pro Glu Ser Lys His His 100 105 110 Ala Ser Leu Val Met Ser Gln Asp Pro Tyr Lys Val Thr Thr Phe Glu 115 120 125 Lys Arg Tyr Ala Ala Ala Met Gln Trp Leu Trp Arg Asp Ala Gly Ile 130 135 140 Arg Ala Cys Tyr Glu Arg Arg Arg Glu Phe His Leu Leu Asp Ser Ala 145 150 155 160 Val Tyr Tyr Leu Ser His Leu Glu Arg Ile Thr Glu Glu Gly Tyr Val 165 170 175 Pro Thr Ala Gln Asp Val Leu Arg Ser Arg Met Pro Thr Thr Gly Ile 180 185 190 Asn Glu Tyr Cys Phe Ser Val Gln Lys Thr Asn Leu Arg Ile Val Asp 195 200 205 Val Gly Gly Gln Lys Ser Glu Arg Lys Lys Trp Ile His Cys Phe Glu 210 215 220 Asn Val Ile Ala Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Leu Ser Glu Tyr Asp Gln 225 230 235 240 Cys Leu Glu Glu Asn Asn Gln Glu Asn Arg Met Lys Glu Ser Leu Ala 245 250 255 Leu Phe Gly Thr Ile Leu Glu Leu Pro Trp Phe Lys Ser Thr Ser Val 260 265 270 Ile Leu Phe Leu Asn Lys Thr Asp Ile Leu Glu Glu Lys Ile Pro Thr 275 280 285 Ser His Leu Ala Thr Tyr Phe Pro Ser Phe Gln Gly Pro Lys Gln Asp 290 295 300 Ala Glu Ala Ala Lys Arg Phe Ile Leu Asp Met Tyr Thr Arg Met Tyr 305 310 315 320 Thr Gly Cys Val Asp Gly Pro Glu Gly Ser Lys Lys Gly Ala Arg Ser 325 330 335 Arg Arg Leu Phe Ser His Tyr Thr Cys Ala Thr Asp Thr Gln Asn Ile 340 345 350 Arg Lys Val Phe Lys Asp Val Arg Asp Ser Val Leu Ala Arg Tyr Leu 355 360 365 Asp Glu Ile Asn Leu Leu 370

Claims

a) 하나 이상의 G-단백질-결합된 수용체 (GPCR)-의존형 시그날 전달 경로를 함유하고 하나 이상의 미리스토일화된 -6q G-단백질 하이브리드를 생성하는 하나 이상의 세포를 제공하는 단계;

b) 연구하고자 하는 하나 이상의 화학적 화합물을 제공하는 단계;

c) 단계 a)에 따른 세포를 단계 b)에 따른 연구하고자 하는 화학적 화합물과 접촉시키는 단계; 및

d) 시그날 전달 경로-의존형 측정가능한 시그날을 이용하여, 단계 b)로 부터의 연구하고자 하는 화학적 화합물이 단계 a)로 부터의 세포의 시그날 전달 경로에 미치는 정량적 또는 정성적 효과를 측정하는 단계를 포함하여, 생물체의 하나 이상의 G-단백질-결합된 수용체(GPCR)-의존형 시그날 전달 경로의 작용을 변형시키는 화학적 화합물을 동정하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 a)에 따라 제공된 세포가 두 개 이상의 G-단백질을 생성하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 a)에 따라 제공된 세포가 -6qi4myr 및 -6qs5myr 중에서 선택되는 미리스토일화된 -6q G-단백질 하이브리드를 생성하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 a)에 따라 제공된 세포가 -6qi4, -6qs5 및 Gα16 중에서 선택되는 하나 이상의 G-단백질을 추가로 생성하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 a)에 따라 제공된 세포가 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 8에 따른 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 단백질을 생성하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 a)에 따른 세포가 척추동물 종, 곤충 종, 씨. 엘레간스(C. elegans) 또는 효모의 세포인 방법.
제6항에 있어서, 세포가 HeLa, 293, COS 또는 CHO 세포 또는 사카로마이세스 세레비지애의 세포인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 제1항의 단계 d)에서 청구된 바와 같이 시그날 전달 경로-의존형 측정가능한 시그날을 이용하여 연구하고자 하는 화학적 화합물의 정량적 또는 정성적 효과를 측정하기 위하여 세포내 Ca²⁺ 농도를 사용함을 포함하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 화학적 화합물이 약제인 방법.
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제1항에 있어서, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 8에 따른 아미노산 서열을 갖고 G-단백질의 특성을 지닌 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 사용하는, 생물체의 하나 이상의 G-단백질-결합된 수용체(GPCR)-의존형 시그날 전달 경로의 작용을 변형시키는 화학적 화합물을 동정하는 방법.
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제1항에 있어서, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5 또는 서열번호 7에 따른 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 상보적인 상응하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 사용하는, 생물체의 하나 이상의 G-단백질-결합된 수용체(GPCR)-의존형 시그날 전달 경로의 작용을 변형시키는 화학적 화합물을 동정하는 방법.