KR101280843B1 - 카르니틴 수송체 효능제 또는 길항제의 스크리닝 방법 및이의 용도 - Google Patents

카르니틴 수송체 효능제 또는 길항제의 스크리닝 방법 및이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 카르니틴 수송체 효능제 또는 카르니틴 수송체 길항제의 스크리닝 방법, 카르니틴 수송체 효능제 또는 카르니틴 수송체 길항제의 스크리닝 방법을 수행하기 위한 키트, 카르니틴 수송체 결핍증 치료용 의약의 제조방법, 카르니틴 수송체 결핍증의 진단방법, 카르니틴 수송체와 반응하는 항체의 제조를 위한 단백질의 용도, 올리고뉴클레오타이드 및 카르니틴 수송체 결핍증의 치료방법에 관한 것이다.
카르니틴 수송체, 스크리닝, 효능제, 길항제, 카르니틴 수송체 결핍증, 카르니틴 수송체와 반응하는 항체

Description

카르니틴 수송체 효능제 또는 길항제의 스크리닝 방법 및 이의 용도{Method of screening for a carnitine transporter agonist or antagonist and its uses}
본 발명은 카르니틴 수송체 효능제 또는 카르니틴 수송체 길항제의 스크리닝 방법, 카르니틴 수송체 효능제 또는 카르니틴 수송체 길항제의 스크리닝 방법을 수행하기 위한 키트, 카르니틴 수송체 결핍증 치료용 의약의 제조방법, 카르니틴 수송체 결핍증의 진단방법, 카르니틴 수송체와 반응하는 항체의 제조를 위한 단백질의 용도, 올리고뉴클레오타이드 및 카르니틴 수송체 결핍증의 치료방법에 관한 것이다.
사람의 카르니틴 결핍증은 각종 중증 증상을 야기한다 [참조: Rodriguez P. R. et al, 1988, Eur. J. Pediatr., 148, 193-197]. 가장 중증인 증상 중에는 심근병증, 만성 근무력증, 및 저혈당 또는 공복시 케톤형성 실패로 인해 유발되는 혼수상태가 있으며, 이들 증상은 조직 내, 특히 간, 신장, 심장, 근육 및 장 내의 카르니틴의 낮은 혈청 수준의 결과이다.
카르니틴 결핍증의 증상은 신장 및 장에서의 카르니틴 수송의 결핍의 결과인 것으로 추측되었다 [참조: Rodriguez P. R. et al, 1988]. 간 및 장의 카르니틴 수송 시스템의 장애는 지방산의 수송과 분해의 장애를 초래하여 각종 중증 증상, 특히 지질근육병증 (lipidmyopathy) 및 낮은 근육 카르니틴 수준을 통해서 진단될 수 있는 진행성 근무력증, 및 심근병증 및 호흡기 장애, 저혈압, 호흡부전, 저혈당, 간비대, 간부전, 부정맥, 의식 상실, 비대성 또는 팽창성 심근병증, 유아 돌연사, 혼수상태, 간기능 장애, 횡문근 융해증, 말초 신경병증, 망막병증, 간병증, 안면중앙부 형성부전을 동반한 선천성 이형증, 신낭종, 근긴장이상증, 신생아 심근병증, 소두증, 이형증을 유발할 수 있다. 전신 카르니틴 결핍증은 유전성 질환이며 이의 증상은 이미 신생아 및 유아에서도 종종 일어난다.
현재까지, 카르니틴 수송체 hOCTN2의 돌연변이가 감소된 카르니틴 수준에 기여한다는, 유전성 카르니틴 결핍증의 희귀 상염색체 열성 형태에 기여하는 기전만이 공지되어 있다 [참조: Nezu J.I. et al. 1999, Nature Genet 21 :91-94]. 그러나, 아미노산 서열이 NCBI 데이타베이스에서 등록번호 NP_003051하에 입수가능하며 본원의 서열번호 12에 상응하는 hOCTN2는 장 또는 신장에서 조직-특이적 방식으로 합성되지 않고, 인체의 도처에서 합성된다. 따라서, 식이로부터 카르니틴 흡수와 신장 여과액으로부터 카르니틴 회수에 의한 신장내 카르니틴 항상성을 매개하는 주요 기전은 아직 공지되어 있지 않다 [참조: Rodriguez P. R. et al, 1988].
또한, OCTN2는 장의 내강면 및 신장 상피에서만 검출되었고 카르니틴이 혈관으로 수송될 필요가 있는 원위 부위에서는 검출되지 않았기 때문에 이는 장 및 신장에서 카르니틴 흡수를 매개하는데 충분하지 않다 [참조: Lahjouji K et al. 2002, Biochim Biophys Acta 1558: 82-93]. 흥미롭게도, 전신 카르니틴 결핍증을 앓는 환자가 식이 카르니틴 투여가 아니라 카르니틴의 정맥내 투여에 의해서만 치료될 수 있다는 보고가 있다 [참조: Rodriguez P. R. et al. 1988, Eur. J. Pediatr. 148: 193-197].
따라서, hOCTN2의 결핍증은 대다수의 카르니틴 결핍 증후군에 대한 적합한 마커가 아니다.
게다가, 아미노산 서열이 NCBI 데이타베이스 (National Center for Biotechnology Information USA)에서 등록번호 NP_149116하에 입수가능하고 본원의 서열번호 14에 상응하는 단백질 CT2는 고환에서만 형성되는 사람 카르니틴 수송체이다. 따라서, 이의 결핍은 전신 카르니틴 결핍증의 증상의 원인이 되지 않을 것이다.
WO 2001077174에는 본원의 서열번호 1에 상응하는 단백질이 기재되어 있지만, 카르니틴 수송체로서의 당해 단백질의 기능에 관한 정보는 제공되어 있지 않다. NCBI 데이타베이스에서 등록번호 XM_291120하에 입수가능하고 본원의 서열번호 10에 상응하는 아미노산 서열은 서열번호 1의 전체 아미노산 서열 및 서열번호 1의 아미노산 296과 297 사이에 39개 아미노산을 포함하는 부가적 서열 (서열번호 10의 아미노산 297 내지 335에 상응함)을 포함하고, 따라서 이는 서열번호 1의 스플라이스 변이체이다. 미국 특허 제5,559,021호에는 본원의 서열번호 1과 47% 아미노산 서열 동일성을 공유하는 랫트 단백질 AAW07635 (rB21a)이 개시되어 있지만, 카르니틴 수송체로서의 당해 단백질의 기능에 관한 정보는 제공하지 않는다. 본원의 서열번호 1과 46%의 아미노산 서열 동일성을 공유하는 AAW07635에 상응하는 사람 서열은 NCBI 데이타베이스에서 등록번호 AJ276207하에 입수가능하지만, 신경전달물질 수송체인 것으로 추측되었다. CN 특허 제1287170호에는 본원의 서열번호 1과 47% 아미노산 서열 동일성을 공유하는 단백질 AAG64193이 개시되어 있지만, 당해 단백질은 사람 신경 물질-전달 단백질 (nerve-mass transferring protein)인 것으로 추측되었다. 유럽 특허 제881290호에는 본원의 서열번호 1과 46% 아미노산 서열 동일성을 공유하는 AAW73376 단백질, 즉 사람 HPDDV78이 개시되어 있지만, 당해 단백질은 신경전달물질 수송체인 것으로 추측되었다. 본원에 포함된 마우스 및 랫트 아미노산 서열 서열번호 2 및 서열번호 3은 공개된 데이타베이스에서 입수가능한 서열의 일부를 구성하지만, 공개된 데이타베이스에서는 이들 서열에 주석이 없었으며 카르니틴 수송체를 포함하는 것으로 추측되지 않았다.
상기로부터 알 수 있는 바와 같이, 장 또는 신장의 조직-특이적으로 합성된 카르니틴 수송체가 공지되어 있지 않으며 이에 따라 결핍되면 대다수의 카르니틴 결핍증을 초래하는 효소도 공지되어 있지 않다.
따라서, 현재 카르니틴 수송체의 수준에서 대다수의 카르니틴 결핍증 증후군을 검출하는 진단 방법이 존재하지 않을 뿐 아니라, 관련 효소의 검출법도 요구된다. 또한, 현재 방해된 관련 효소 활성의 수준에서 전신 카르니틴 결핍증의 치료를 위한 치료 방법이 존재하지 않는다. 현재 이용가능한 치료 방법은 오로지 카르니틴을 투여하는 것이며, 이는 흔히 장으로부터 카르니틴의 흡수가 감소되거나 심지어 결여된다는 문제점을 갖고 있다.
이러한 관점에서, 카르니틴 결핍증을 진단 및 치료하기 위한 신규 방법을 제공하는 것이 요구된다. 따라서, 본 발명의 목적은 카르니틴 결핍증의 신규한 진단 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 추가의 목적은 카르니틴 결핍증을 치료하기 위한 치료학적 방법에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 추가 목적은 카르니틴 결 핍과 관련된 질환을 진단하기 위한 신규 방법 및 카르니틴 결핍과 관련된 질환을 치료하기 위한 신규 치료학적 방법에 관한 것이다.
본 발명은 특히 사람, 마우스 및 랫트의 장 및 신장에서 조직-특이적 방식으로 형성되는 카르니틴 수송체의 유익한 용도를 제공한다. 본 발명에서 검출된 사람 카르니틴 수송체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하며, 밀접하게 관련된 쥐 카르니틴 수송체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, 밀접하게 관련된 랫트 카르니틴 수송체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명은 특히 카르니틴 수송체의 활성에 영향을 주는 약물의 개발 방법 및 관련된 시험 키트, 카르니틴 결핍증 치료용 의약의 제조방법, 카르니틴 수송체에 대한 항체의 제조, 카르니틴 결핍증의 진단방법, 카르니틴 수송체를 암호화하는 핵산을 검출하기 위한 올리고뉴클레오타이드 및 카르니틴 결핍증의 치료를 위한 치료학적 방법에 관한 것이다.
본 발명의 첫번째 바람직한 양태는 (a) 카르니틴 수송체를 제공하는 단계; (b) 시험 화합물을 제공하는 단계, 및 (c) 카르니틴 수송체의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 카르니틴 수송체 효능제 또는 길항제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 카르니틴 수송체 효능제 또는 길항제의 스크리닝 방법은 (a) 카르니틴 수송체를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 세포, 조직 샘플 또는 유기체를 제공하는 단계, (b) 시험 화합물을 상기 세포, 조직 샘플 또는 유기체에게 제공하는 단계, 및 (c) 카르니틴 수송체의 활성을 측정하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 카르니틴 수송체의 활성을 측정하는 것은 카르니틴 수송체를 암호화하는 핵산 분자의 발현을 측정하고/하거나 카르니틴 수송체에 대한 기질을 상기 세포, 조직 샘플 또는 유기체에게 제공하고 카르니틴 수송체에 의한 상기 세포, 조직 샘플 또는 유기체의 지질 막을 가로지르는 상기 기질의 수송을 측정하는 단계를 포함한다. 카르니틴 수송체를 암호화하는 핵산 분자의 발현을 측정하는 것은 바람직하게는 당해 핵산 분자의 전사 활성을 측정하고/하거나 카르니틴 수송체 단백질의 양을 측정함을 포함한다.
또는, 카르니틴 수송체 효능제 또는 길항제의 스크리닝 방법은 (a) 수성 매질을 포함하는 두 용적을 분리시키는 지질 막에 포함된 카르니틴 수송체를 제공하는 단계, (b) 상기 용적들 중 하나 이상에 시험 화합물을 제공하는 단계, 및 (c) 카르니틴 수송체의 활성을 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 카르니틴 수송체의 활성의 측정은 상기 용적들 중 하나 이상에 카르니틴 수송체에 대한 기질을 제공하고 지질 막을 가로지르는 기질의 수송을 측정함을 포함한다.
시험 화합물은 바람직하게는 카르니틴 수송체에 미치는 효능제 또는 길항제 활성에 대해 시험된다. 바람직하게는, 다수의 시험 화합물이 카르니틴 수송체 효능제 또는 길항제에 대해 스크리닝된다. 바람직하게는, 카르니틴 수송체에 대한 적합한 기질은 카르니틴, 노르아드레날린, 메틸페닐피리디늄, 크레아틴 또는 세로토닌이다.
카르니틴 수송체의 활성은 바람직하게는 카르니틴 수송체에 의한 기질의 수송율을 측정함으로써 측정된다. 바람직하게는, 지질 막을 가로지르는 기질의 수송율을 측정한다. 바람직하게는, 한 용적으로부터 다른 용적으로의 기질의 수송율을 측정한다. 바람직하게는, 지질 막은 실험 환경의 2개의 챔버를 분리시키거나, 폐쇄되어 지질 소포의 막을 형성하거나 살아있는 또는 재구성된 세포의 원형질 막을 형성한다. 바람직하게는, 지질 막은, 기질이 한 챔버에서 다른 챔버로 수송되도록 하거나 지질 소포의 막을 가로질러 또는 원형질 막을 가로질러 수송되도록 하는 배향으로 카르니틴 수송체를 포함한다. 바람직하게는, 지질 막을 가로지르는 기질의 수송율을 측정하는 것은 지질 막을 가로질러 수송된 기질의 양을 측정함을 포함한다.
바람직하게는, 카르니틴 수송체의 활성에 대한 시험 화합물의 효능제 또는 길항제 활성은, 시험 화합물의 존재하의 카르니틴 수송체에 의한 기질의 수송율을 측정하고, 이를 시험 화합물의 부재하의 카르니틴 수송체에 의한 기질의 수송율과 비교함으로써 측정한다. 바람직하게는, 당해 방법은 카르니틴 수송체가 없는 지질 막 위에서의 기질의 수송을 측정하는 대조 측정을 포함한다.
본 발명의 임의의 양태에서, 카르니틴 수송체의 기질은 카르니틴 수송체, 바람직하게는 식물 또는 동물 카르니틴 수송체, 바람직하게는 포유동물 카르니틴 수송체, 바람직하게는 사람, 마우스 또는 랫트 카르니틴 수송체, 특히 사람, 마우스 또는 랫트의 신장 또는 장의 카르니틴 수송체에 의해 수송되는 임의의 기질이다. 바람직하게는 기질은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 4를 포함하는 핵산 분자에 의해 암호화되는 카르니틴 수송체 또는 본 발명의 임의의 양태에서 기술되는 카르니틴 수송체에 의해 수송되는 임의 의 기질이다. 바람직하게는, 기질은 카르니틴, 노르아드레날린, 메틸페닐피리디늄, 크레아틴 및/또는 세로토닌이다. 보다 바람직하게는, 기질은 카르니틴이다.
본 발명의 양태에서, 카르니틴은 바람직하게는 L-카르니틴 및/또는 D-카르니틴, 바람직하게는 L-카르니틴을 포함한다. 바람직하게는, 카르니틴은 카르니틴 유도체 및/또는 카르니틴 유사체를 포함한다. 바람직하게는, 카르니틴 유도체는 카르니틴 대사물 및 카르니틴 접합체를 포함한다. 바람직하게는, 카르니틴 대사물은생체내에서 L-카르니틴 또는 D-카르니틴의 화학적 변화에 의해 형성되는 생리학적 카르니틴 대사물, 예를 들면, 아세틸카르니틴을 포함한다. 바람직하게는, 카르니틴 접합체는 이펙터 분자에 커플링되는 L-카르니틴, D-카르니틴 또는 카르니틴 유사체를 포함한다. 바람직하게는, 이펙터 분자는 지질 막 위에서 카르니틴 수송체에 의해 카르니틴과 함께 공동 수송되는 화합물이다. 바람직하게는, 이펙터 분자는 약물이다. 바람직하게는, 커플링은 임의의 화학적 결합, 바람직하게는 공유 결합, 이온 결합 또는 반데르발스 결합이다. 바람직하게는, 카르니틴 유사체는 카르니틴 수송체에 의해 수송될 수 있도록 하는, 카르니틴과 유사한 화학적 구조를 지니는 화합물이다.
본 발명의 카르니틴 수송체 효능제 또는 길항제의 스크리닝 방법은 바람직하게는 시험 화합물을 카르니틴 수송체의 활성을 증강시키는 효능제 작용에 대해 시험함을 포함한다. 대안으로서, 당해 방법은 시험 화합물을 카르니틴 수송체의 활성을 억제하는 길항제 작용에 대해 시험함을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 카르니틴 수송체 효능제 또는 길항제의 스크리닝 방법은 개별적 시험 화합물의 시 험이 단시간을 필요로 하고 바람직하게는 개별적 시험 화합물의 시험이 경제적이고 소량의 시약, 특히 시험 화합물을 필요로 하는, 다수의 화합물의 스크리닝에 적합하다.
본 발명의 카르니틴 수송체 효능제 또는 길항제의 스크리닝 방법에서 시험되는 시험 화합물은 바람직하게는 소분자, 바람직하게는 단백질 또는 효소 조인자에 결합하는 이펙터 화합물의 후보이다. 바람직하게는, 시험 화합물은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 본 발명의 양태에서 기술되는 임의의 카르니틴 수송체에 결합할 수 있는 이펙터 화합물의 후보이다.
바람직하게는, 시험 화합물은 단백질 또는 효소 조인자에 결합할 수 있는 이펙터 화합물에 대한 후보이거나, 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 또는 본 발명의 양태에서 기술하는 임의의 카르니틴 수송체에 결합하는 화합물에 대한 후보이다.
바람직하게는, 시험 화합물은 전사 인자 또는 해독 인자에 결합할 수 있는 이펙터 화합물에 대한 후보이며, 여기서 바람직하게는 전사 인자 또는 해독 인자는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 합성을 증가 또는 감소시키거나 본 발명의 양태에서 기술되는 임의의 카르니틴 수송체의 합성을 증가 또는 감소시킨다.
바람직하게는, 시험 화합물은 전사 인자 또는 해독 인자의 합성 또는 활성을 직접 또는 간접적으로 증가 또는 감소시킬 수 있는 이펙터 화합물에 대한 후보이며, 여기서 바람직하게는 전사 인자 또는 해독 인자는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 합성을 증가 또는 감소시키거나 본 발명의 양태에서 기술되는 임의의 카르니틴 수송체의 합성을 증가 또는 감소시킨다.
바람직하게는, 시험 화합물은 천연 화합물 또는 천연 화합물과 동일하거나 유사한 화학적으로 합성된 화합물과 같은 임의의 화합물 또는 천연적으로 존재하지 않는 임의의 화학적으로 합성된 화합물이다.
천연 화합물은 바람직하게는 다세포 또는 단세포 유기체에서 검출되거나 분리될 수 있는 화합물, 특히 동물, 식물, 진균류, 효모, 세균 또는 임의의 기타 세포 함유 유기체 또는 바이러스에서 검출되거나 분리될 수 있는 화합물이다. 천연에서 존재하지 않는 화학적으로 합성된 화합물은 바람직하게는 조합적 화학에 의해 합성된다. 바람직하게는, 이는 천연 화합물로부터, 바람직하게는 단백질 또는 효소 조인자에 결합할 수 있는 이펙터 분자에 대한 후보로부터 유도된 선도 구조를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 동정되거나 본 발명의 양태에서 사용되는 카르니틴 수송체 효능제 또는 길항제는 각각 개체, 바람직하게는 건강한 개체의 신장 또는 장 카르니틴 수송체의 활성을 증강시키거나 억제한다. 바람직하게는, 카르니틴 수송체 효능제는 카르니틴 수송체 결핍증을 앓는 개체의 카르니틴 수송체의 활성을 증강시킨다. 바람직하게는, 카르니틴 수송체 효능제는 카르니틴 수송체의 양이 감소된 개체에서 카르니틴 수송체의 활성을 증강시킨다.
바람직하게는, 카르니틴 수송체 효능제 또는 길항제는 각각 개체에서 카르니틴 수송체의 유전학적 변이체의 활성을 증강시키거나 감소시킨다. 바람직하게는, 카르니틴 수송체 효능제는 카르니틴 결핍증과 관련된 카르니틴 수송체의 유전학적 변이체의 활성을 증강시킨다. 바람직하게는, 카르니틴 수송체 길항제는, 카르니틴 수송체의 활성이 증가되거나 카르니틴 수송체의 양이 증가된 개체에서 카르니틴 수송체, 바람직하게는 신장 또는 장 카르니틴 수송체의 활성을 감소시킨다. 바람직하게는, 본원에서 언급한 바와 같은 카르니틴 수송체의 활성은 기질에 대한 카르니틴 수송체의 수송율, 카르니틴 수송체의 양 및/또는 카르니틴 수송체를 암호화하는 핵산 분자의 발현 수준을 의미한다.
바람직하게는, 본 발명의 카르니틴 수송체 효능제 또는 길항제의 스크리닝 방법에 제공된 카르니틴 수송체는 본 발명의 임의의 다른 양태에서도 사용될 수 있다. 카르니틴 수송체는 바람직하게는 식물 또는 동물 카르니틴 수송체, 바람직하게는 포유동물 카르니틴 수송체, 바람직하게는 사람, 마우스 또는 랫트 카르니틴 수송체, 바람직하게는 신장 또는 장 카르니틴 수송체, 바람직하게는 장 카르니틴 수송체이다.
바람직하게는, 카르니틴 수송체는 본 발명의 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 카르니틴 수송체는 건강한 개체의 신장 및 장에서 생산되는 고친화성 카르니틴 수송체이다. 바람직하게는, 카르니틴 수송체는 사람 신장 및 장의 고친화성 카르니틴 수송체의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 카르니틴 수송체는 서열번호 1의 아미노산 296과 297 사이에 39개 아미노산을 포함하는 부가적 서열 (서열번호 10의 아미노산 297 내지 335에 상응함)을 포함하는, 서열번호 1의 기능적 스플라이스 변이체인 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 카르니틴 수송체는 건강한 동물의 신장 및 장에서 생산되는 동족 (orthologous) 마우스 또는 랫트 고친화성 카르니틴 수송체이다. 바람직하게는, 카르니틴 수송체는 각각 마우스 또는 랫트 신장 및 장의 고친화성 카르니틴 수송체의 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 카르니틴 수송체는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3과 관련된 아미노산 서열을 포함하는 관련된 카르니틴 수송체이다. 바람직하게는,카르니틴 수송체는 서열번호 1과 관련된 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 카르니틴 수송체는 서열번호 10과 관련된 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 관련된 카르니틴 수송체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 10 중 어느 하나와 30% 이상의 서열 동일성과, 서열번호 1 또는 서열번호 10, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 카르니틴 수송체의 하나 이상의 기질, 바람직하게는 카르니틴, 바람직하게는 L-카르니틴에 대한 기질 수송 활성의 10% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 70% 이상을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 관련된 카르니틴 수송체는 등록번호 AJ276207하에 입수가능한 랫트 단백질 AAW07635 (rB21a), CN 특허 제1287170호에 개시된 단백질 AAG64193 또는 단백질 AAW73376, 즉 유럽 특허 제881290호에 개시된 사람 HPDDV78의 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 관련된 카르니틴 수송체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 10 중 하나 이상과 60% 이상의 서열 동일성과, 서열번호 1 또는 서열번호 10, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 카르니틴 수송체의 하나 이상의 기질, 바람직하게는 카르니틴, 바람직하게는 L-카르니틴에 대한 기질 수송 활성의 10% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 80% 이상 또는 90% 이상을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 카르니틴 수송체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 10 중 하나 이상과 85% 이상, 바람직하게는 86% 이상, 바람직하게는 86.5% 이상의 서열 동일성과, 서열번호 1 또는 서열번호 10, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 카르니틴 수송체의 하나 이상의 기질, 바람직하게는 카르니틴, 바람직하게는 L-카르니틴에 대한 기질 수송 활성의 10% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 80% 이상 또는 90% 이상을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 카르니틴 수송체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 10 중 하나 이상과 95% 이상, 바람직하게는 95.4% 이상의 서열 동일성과, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 카르니틴 수송체의 하나 이상의 기질, 바람직하게는 카르니틴, 바람직하게는 L-카르니틴에 대한 기질 수송 활성의 10% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 70% 이상을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 카르니틴 수송체의 아미노산 서열은 당업자에게 공지되어 있고 단백질의 활성 및 이에 따라 카르니틴 수송체의 활성에 거의 영향을 주지 않거나 전혀 영향을 주지 않는 것으로 추측되는 소위 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 상이하다. 바람직하게는 카르니틴 수송체는 하기에서 본원의 도 3에 개시된 서열번호 1, 서열번호 2와 서열번호 3 간의 아미노산 서열 정렬을 고려하는 당업자가 카르니틴 수송체의 활성에 거의 영향을 주지 않거나 전혀 영향을 주지 않는다고 추측하는 아미노산 치환에 의해 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및/또는 서열번호 10과 상이하다.
바람직하게는, 본 발명의 임의의 양태에서 사용되는 카르니틴 수송체는 신장 및/또는 장에서 생산되는 사람 카르니틴 수송체를 암호화하는 핵산 분자에 의해 암호화된다. 바람직하게는, 핵산 분자는 신장 및/또는 장에서 조직-특이적으로 발현된다. 바람직하게는, 핵산 분자는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 사람 또는 마우스 또는 랫트 카르니틴 수송체를 암호화한다.
바람직하게는, 핵산 분자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 사람 신장 및 장 카르니틴 수송체를 암호화하는 서열번호 4를 포함한다. 바람직하게는, 핵산 분자는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 유사한 쥐 신장 및 장 카르니틴 수송체를 암호화하는 서열번호 5를 포함한다. 바람직하게는, 핵산 분자는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 유사한 쥐 신장 및 장 카르니틴 수송체를 암호화하는 서열번호 8을 포함한다.
바람직하게는, 핵산 분자는 서열번호 4의 기능적 스플라이스 변이체이며 서열번호 10의 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 9를 포함한다. 서열번호 9는 서열번호 4의 뉴클레오타이드 887과 888 사이에 삽입된 117개의 뉴클레오타이드를 포함하는 부가적 서열 (서열번호 9의 뉴클레오타이드 888 내지 1004에 상응함)을 포함한다.
바람직하게는, 카르니틴 수송체는 사람 신장 및 장 카르니틴 수송체에 대한 서열번호 15를 포함하는 mRNA에 의해 암호화된다. 서열번호 15는 서열번호 4에 따르는 개방 판독 프레임 (open reading frame)과 부가적 비-해독 5' 및 3' 플랭킹 (flanking) 서열을 포함한다. 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 카르니틴 수송체를 암호화하는 서열번호 15를 포함하는 완전한 mRNA를 최초로 제공한다. 서열번호 15는 서열번호 1을 암호화하는 서열번호 4에 따르는 개방 판독 프레임, 서열번호 15의 뉴클레오타이드 1 내지 45를 포함하는 5' 플랭킹 영역 및 서열번호 15의 뉴클레오타이드 1951 내지 5175를 포함하는 3' 플랭킹 영역을 포함한다.
바람직하게는, 카르니틴 수송체는 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 15와 유사한 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 암호화되는 카르니틴 수송체를 검출하기 위해 통상의 실험을 사용하는 당업자에 의해 검출 될 수 있는 핵산 분자에 의해 암호화된다. 바람직하게는, 카르니틴 수송체는 서열번호 4와 유사한 핵산 서열에 의해 암호화된다. 바람직하게는, 핵산 분자는 서열번호 9와 유사하다. 바람직하게는, 핵산 분자는 서열번호 15와 유사하다.
바람직하게는, 카르니틴 수송체를 암호화하는 핵산 분자는 공지된 서열을 포함하는 핵산 분자의 검출을 위한 통상의 실험에 의해 검출될 수 있다. 바람직하게는, 카르니틴 수송체를 암호화하는 핵산 분자는 공지된 서열과 유사한, 바람직하게는 공지된 핵산 서열과 관련된, 공지된 핵산 서열과 상동성인 서열을 포함하는 핵산 분자의 검출을 위한 통상의 실험에 의해 검출될 수 있다.
바람직하게는, 카르니틴 수송체는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자와 유사한 핵산 서열에 의해 암호화된다
바람직하게는, 핵산 분자는, 당해 핵산 분자가 당업자에 의해 쉽게 인지되는 검출가능한 서열 상동성 정도, 바람직하게는 검출가능한 서열 동일성 정도를 갖는 서열을 포함한다면, 본 발명의 임의의 양태의 카르니틴 수송체를 암호화하는 핵산 분자와 유사한 것이다. 바람직하게는, 핵산 분자는 본 발명에서 유용한 카르니틴 수송체에 대해 당업자에 의해 쉽게 인지되는 검출가능한 서열 상동성, 바람직하게는 검출가능한 서열 동일성 정도를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 경우, 본 발명의 임의의 양태의 카르니틴 수송체를 암호화하는 핵산 분자와 유사한 것이다. 바람직하게는, 핵산 분자들 간의 서열 동일성 및 서열 상동성은 엄중한 조건 또는 비-엄중한 조건 (non-stringent condition)하에 상보적 염기쌍을 형성하게 하는 하이브리드화 실험으로 과도한 노력없이 검출할 수 있다.
바람직하게는, 핵산 분자는, 당해 핵산 분자가 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 15, 또는 이의 상보적 서열을 포함하는 핵산 분자에 하이브리드화하거나, 18개 이상의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 25개 이상의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 50개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 이들의 단편 또는 이의 상보적 서열에 하이브리드화한다면, 본 발명의 양태의 카르니틴 수송체를 암호화하는 핵산 분자와 유사한 것이다. 바람직하게는, 비-엄중한 조건이 사용되며, 보다 바람직하게는 엄중한 조건이 사용된다. 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자의 유사성은 유사한 방식으로 측정된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 카르니틴 수송체를 암호화하는 핵산 분자는 서열번호 15의 5' 플랭킹 영역 또는 서열번호 15의 3' 플랭킹 영역, 바람직하게는 3' 플랭킹 영역을 검출하기 위해 사용하는 당업자에 의해 검출될 수 있다. 바람직하게는, 서열번호 15의 3' 영역의 단편이 사용되며, 당해 단편은 바람직하게는 18개 이상의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 25개 이상의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 50개 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. 바람직하게는, 비-엄중한 조건이 사용되며, 보다 바람직하게는, 엄중한 조건이 사용된다. 바람직하게는, 검출은 모두 익히 공지된 상보적 염기쌍 개념에 근거하는 하이브리드화 검정 또는 PCR 분석을 포함한다.
하이브리드화의 비-엄중한 조건 및 엄중한 조건은 당업자에게 공지되어 있다. 바람직하게는, 비-엄중한 조건은 3x SSC, 0.5% 나트륨 N-라우릴 사르코신 및 60℃를 포함한다. 바람직하게는, 엄중한 조건은 1x SSC, 0.1% 나트륨 도데실설페이트 (SDS) 및 65℃를 포함한다. 바람직하게는, 2Ox SSC는 3M NaCl, 0.3M 트리-나트륨 시트레이트, pH 7.0을 포함한다.
지질 막에 포함된 카르니틴 수송체를 제공함을 포함하는, 본 발명의 카르니틴 수송체 효능제 또는 길항제의 스크리닝 방법에서, 카르니틴 수송체는 바람직하게는 세포 막, 바람직하게는 미토콘드리아 내막 또는 원형질 막에 포함된다. 적합한 막 지질은 세포 막의 천연 막 지질 및/또는 천연에서 공지되어 있지 않지만 화학자에게 공지되어 있는 막-형성 지질이다. 바람직하게는, 지질 막은 카르니틴 수송체를 포함할 수 있는 막을 형성하는 지질을 포함한다. 이러한 지질은 당업자에게 공지되어 있다. 바람직하게는, 지질은 세포 막, 바람직하게는 원형질 막 또는 미토콘드리아 내막의 성분이거나 이로부터 유도된다. 바람직하게는, 지질은 생물학적 막의 지질과 동일하거나 이와 유사한 화학적 구조를 갖고, 수성 매질 중에서 2개의 친수성 표면을 갖는 지질 2중층 또는 지질 단층을 형성할 수 있다.
바람직하게는, 카르니틴 수송체를 포함하는 지질 막은 수성 매질을 포함하는 2개의 용적을 분리시킨다. 바람직하게는, 이들 2개의 용적은 실험 환경의 2개의 완충 탱크이다.
카르니틴 수송체를 포함하는 지질 막은 바람직하게는 재구성된 세포 막을 포함한다. 재구성된 세포 막은 바람직하게는 살아있는 세포로부터 유도된다. 재구성된 세포 막의 형성 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
바람직하게는, 카르니틴 수송체는 지질 소포 막에 포함된다. 바람직하게는, 지질 소포는 리포좀 또는 폐쇄된 재구성된 세포 막을 포함한다. 리포좀 또는 재구성된 세포 막은 임의의 적합한 방법으로 형성시킨다. 바람직하게는, 리포좀 또는 재구성된 막 소포는 한 종류 이상의 막 지질과 카르니틴 수송체를 포함하는 혼합물을 초음파에 노출시키거나 이 혼합물을 소직경 배출구, 특히 시린지를 통해서 완충액 중으로 유도함으로써 형성된다. 바람직하게는, 재구성된 세포는, 살아있는 세포를 개방시켜 카르니틴 수송체를 제공하고 원형질 막을 재봉인하여 제조한다. 세포 성분의 개방 및 재봉인 동안, 세포질의 성분들이 손실될 수 있거나 손실되지 않을 수 있으므로, 카르니틴 수송체를 포함하는 재구성된 원형질 막은 살아있는 세포에 속할 수 있거나 소위 막 고스트 (membrane ghost)가 될 수 있다.
바람직한 양태에서, 카르니틴 수송체는 시험 세포의 원형질 막에 포함된다. 바람직하게는, 시험 세포는 카르니틴 수송체, 바람직하게는 식물 또는 동물 카르니틴 수송체, 바람직하게는 포유동물, 바람직하게는 마우스 또는 랫트 카르니틴 수송체, 바람직하게는 사람 카르니틴 수송체, 바람직하게는 신장 또는 장 카르니틴 수송체, 바람직하게는 사람, 마우스 또는 랫트 신장 또는 장 카르니틴 수송체를 암호화하는 핵산 분자를 발현한다.
바람직하게는, 시험 세포는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 10의 아미노산 서열, 등록번호 AJ276207하에 입수가능한 랫트 단백질 AAW07635 (rB21a), CN 특허 제1287170호에 개시된 단백질 AAG64193 또는 단백질 AAW73376, 즉 유럽 특허 제881290호에 개시된 사람 HPDDV78을 암호화하는 핵산 서열 분자를 발현한다. 바람직하게는, 시험 세포는 서열번호 1 , 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 10, 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 10, 바람직하게는 서열번호 1을 암호화하는 핵산을 발현한다. 바람직하게는, 시험 세포는 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 15, 바람직하게는 서열번호 4, 서열번호 9 또는 서열번호 15, 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 15를 포함하는 핵산을 발현한다. 바람직하게는, 시험 세포는 전사 활성화인자 서열에 작동적으로 연결된 상기한 핵산 분자들 중 어느 하나, 바람직하게는 전사 활성화인자 서열에 작동적으로 연결된 서열번호 4, 서열번호 9 또는 서열번호 15, 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 15를 포함한다. 바람직하게는, 시험 세포는 서열번호 4, 서열번호 9 또는 서열번호 15, 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 15에 상응하는 서열을 포함하는 해독가능한 RNA 분자를 포함한다. 바람직하게는, 시험 세포는 서열번호 4, 서열번호 9 또는 서열번호 15, 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 15에 상응하는 서열을 포함하는 미세주입 (microinject)된 cRNA 분자를 포함한다.
바람직하게는, 시험 세포는 이의 원형질 막 내에 기능적 카르니틴 수송체를 포함한다. 바람직하게는, 카르니틴 수송체는 원형질 막을 가로질러 카르니틴, 노르아드레날린, 메틸페닐피리디늄, 크레아틴 및/또는 세로토닌으로부터 선택된 기질을 수송한다. 바람직하게는, 카르니틴 수송체는 기질을 시험 세포내로 수송한다. 바람직하게는, 시험 세포는 세균 또는 진핵생물 세포, 특히 효모 세포이다. 바람직하게는, 시험 세포는 1차 세포주 또는 영구적 세포주에 속한다. 바람직하게는, 시험 세포는 제노푸스 래비스 (Xenopus laevis) 난모세포이다. 바람직하게는, 제노푸스 래비스 난모세포는 서열번호 4, 서열번호 9 또는 서열번호 15, 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 15를 포함하는 주사된 cRNA를 포함한다.
바람직하게는, 카르니틴 수송체에 대한 검출가능한 기질이 사용된다. 바람직하게는, 검출가능한 기질은 시험 세포에서 내부 검출될 수 있도록 한다. 바람직하게는, 검출가능한 기질은 시험 세포의 내부에 축적되는 소량의 당해 검출가능한 기질이 정량될 수 있도록 한다.
본 발명의 카르니틴 수송체의 효능제 또는 길항제 활성에 대한 시험 화합물의 스크리닝 방법은 카르니틴 수송체에 의해 지질 막, 특히 원형질 막을 가로질러 시험 세포내로 수송되는 검출가능한 기질의 양을 측정함을 포함하고, 여기서 지질 막을 가로질러 수송된 기질의 양은 카르니틴 수송체의 활성의 지표가 된다.
바람직하게는, 검출가능한 카르니틴 수송체 기질은 방사성 표지된 기질, 스트렙타비딘-표지된 또는 바이오티닐화된 (biotinylated) 기질 또는 항체와 반응하는 기질이다.
바람직하게는, 카르니틴 수송체에 대한 효능제 또는 길항제 활성을 갖는 것으로 스크리닝된 시험 화합물은 화합물 라이브리러의 형태로 제공된다. 본 발명에 따라서, "화학적 화합물 라이브러리"는 화학적으로 합성된 분자 및 천연 산물을 포함하는 임의의 다수의 공급원으로부터 어셈블리되었거나 조합적 화학 기술로 제조된 다수의 화학적 화합물을 의미한다.
바람직하게는, 본 발명의 카르니틴 수송체 효능제 또는 길항제의 스크리닝 방법은 자동화되며, 바람직하게는, 당해 방법은 로봇식 시스템에서 수행된다.
본 발명의 제2 바람직한 양태는 카르니틴 수송체 및 카르니틴 수송체에 대한 검출가능한 기질을 포함하는, 본 발명의 카르니틴 수송체 효능제 또는 길항제의 스크리닝 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다. 본 발명의 키트는 바람직하게는 시험 화합물의 그룹, 특히 화학적 화합물 라이브러리에 포함된 시험 화합물들을 스크리닝할 수 있도록 한다.
바람직하게는, 본 발명의 키트내에 제공된 카르니틴 수송체는 사람, 마우스 또는 랫트 카르니틴 수송체이다. 바람직하게는, 카르니틴 수송체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 10, 등록번호 AJ276207하에 입수가능한 랫트 단백질 AAW07635 (rB21a), CN 특허 제1287170호에 개시된 단백질 AAG64193 또는 단백질 AAW73376, 즉 유럽 특허 제881290호에 개시된 사람 HPDDV78, 바람직하게는 서열번호 1 , 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 10, 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 10, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 카르니틴 수송체는 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 9, 서열번호 15, 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 15를 포함하는 핵산 분자에 의해 또는 상기 단백질들 중 하나 이상을 암호화하는 핵산에 암호화된다. 바람직하게는, 지질 막은 실험 환경의 2개의 용적, 특히 2개의 완충 탱크를 분리시키거나 폐쇄되어 지질 소포를 형성하거나 살아있는 세포 또는 재구성된 세포의 원형질 막을 형성한다. 바람직하게는, 카르니틴 수송체는 지질 소포 막에 포함된다. 바람직하게는, 카르니틴 수송체는 시험 세포의 원형질 막에 포함된다.
바람직하게는, 본 발명의 키트는 카르니틴 수송체에 대한 검출가능한 기질, 특히 방사성, 스트렙타비딘-표지된 또는 바이오티닐화된 기질 또는 항체로 검출될 수 있는 기질을 포함한다. 바람직하게는, 당해 키트는 기질과 반응하는 항체를 포함한다. 바람직하게는, 기질은 카르니틴, 노르아드레날린, 메틸페닐피리디늄, 크레아틴 및/또는 세로토닌이다. 바람직하게는, 기질은 카르니틴이다.
본 발명의 임의의 양태에서, "항체"란 표현은 본원에 명시된 항원과의 반응성을 포함하여 임의의 모노클로날 항체, 항혈청, 특히 다가 항혈청, 항혈청 분획, 항체 단편, 재조합적으로 생산된 항체 또는 항체 단편을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 키트는 본 발명의 카르니틴 수송체 효능제 또는 길항제의 스크리닝 방법의 임의의 성분 또는 특징을 포함한다.
본 발명의 제3 바람직한 양태는 (a) 본 발명의 카르니틴 수송체 효능제 또는 길항제의 스크리닝 방법을 사용하여 카르니틴 수송체의 효능제를 동정하는 단계, (b) 충분한 양의 효능제를 제공하는 단계 및 (c) 효능제를 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 보조제 물질과 함께 제형화하는 단계를 포함하는, 카르니틴 수송체 결핍증의 치료용 의약의 제조방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 당해 방법은 신장 또는 장 카르니틴 수송체의 카르니틴 수송체 결핍증 치료용 의약의 제조법을 의미한다. 바람직하게는, 당해 방법은 전신 카르니틴 결핍증 치료용 의약의 제조법을 의미한다.
바람직하게는, 당해 방법은 카르니틴, 노르아드레날린, 메틸페닐피리디늄, 크레아틴 및/또는 세로토닌 수송체 결핍증 치료용 의약의 제조법을 의미한다. 바람직하게는, 당해 방법은, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 10의 아미노산 서열, 등록번호 AJ276207하에 입수가능한 랫트 단백질 AAW07635 (rB21a), CN 특허 제1287170호에 개시된 단백질 AAG64193 또는 단백질 AAW73376, 즉 유럽 특허 제881290호에 개시된 사람 HPDDV78, 바람직하게는 서열번호 1 , 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 10, 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 10, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 9, 서열번호 15, 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 15를 포함하는 핵산 분자에 의해 암호화되거나 상기 단백질들 중 하나 이상을 암호화하는 핵산에 의해 암호화되는 본 발명의 사람 또는 동물 카르니틴 수송체에 의해 수송되는 기질의 임의의 결핍증을 치료하기 위한 의약의 제조법을 의미한다. 바람직하게는, 당해 방법은 본원에서 기술한 바와 같이 검출될 수 있거나 당업자가 본원의 기술내용에 기초하여 과도한 노력 없이 검출할 수 있는 본 발명의 카르니틴 수송체와 유사한 아미노산 서열을 갖는 임의의 카르니틴 수송체에 의해 수송되는 임의의 기질의 결핍증을 치료하기 위한 의약의 제조법을 의미한다.
바람직하게는, 본 발명의 카르니틴 수송체 효능제의 스크리닝 방법의 임의의 측면은 또한 카르니틴 수송체 결핍증 치료용 의약의 제조를 위한 본 발명의 카르니틴 수송체의 효능제를 동정하는 단계에 관한 것이다.
의약의 제조방법에 있어, 충분한 양의 효능제는 치료학적 유효량, 바람직하게는 의약의 투여 단위 용량의 치료학적 유효량이다. 바람직하게는, 치료학적 유효량은 환자에서 기능적 카르니틴 수송체의 양 감소에 의해 유발되거나 환자에서 활성이 감소된 카르니틴 수송체의 변이체에 의해 유발된 카르니틴 수송체 결핍증의 치료를 위해 치료학적으로 충분한 양이다.
임의의 특정 환자에 대한 구체적 치료학적 유효량 수준은 동정된 카르니틴 수송체 효능제의 활성, 환자의 연령, 체중 및 성별, 치료 기간 및 의약 분야에 널리 공지된 유사 요인을 포함하는 각종 요인들에 따라 좌우될 것이다. 바람직하게는, 단위 용량은 성인, 아동, 신생아의 치료 또는 임신기간 동안의 태아의 치료를 위해 치료학적으로 충분하다.
사람 또는 기타 포유동물에게 단일 용량 또는 분할된 용량으로 투여되는 본 발명의 카르니틴 수송체 효능제의 총 1일 용량은 예를 들면, 약 0.01 내지 약 50 mg/kg 체중 또는 보다 바람직하게는 약 0.1 내지 약 25mg/kg 체중이다. 단일 용량 조성물은 이러한 양 또는 합해서 1일 용량이 되는 이의 세분된 양을 함유할 수 있다. 일반적으로 본 발명에 따른 치료 요법은 이러한 치료가 필요한 환자에게 1일당 본 발명의 카르니틴 수송체 효능제 약 10mg 내지 약 1000mg를 단일 또는 다수 용량으로 투여함을 포함한다.
바람직하게는, 하나 이상의 카르니틴 수송체 효능제들의 배합물이 의약의 제조를 위해 사용된다. 보다 바람직하게는, 의약은 카르니틴을 부가적으로 포함한다. 바람직하게는, 단위 용량 의약에 포함되는 카르니틴의 양은 당해 단위 용량 의약에 포함되는 카르니틴 수송체 효능제에 의해 매개되는 카르니틴 수송체의 활성에 맞게 조정한다.
의약의 제조를 위해, 본 발명의 카르니틴 수송체 효능제를 바람직하게는 투여 종류에 따라서 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 첨가제 또는 보조제 물질, 예를 들면, 생리학적 완충액 (예: 염화나트륨 용액), 탈염수, 안정화제 (예: 프로테아제 또는 뉴클레아제 억제제, 바람직하게는 아프로티닌, ε-아미노카프르산 또는 펩스타틴 A) 또는 격리제 (예: EDTA), 겔 제형 (예: 백색 바셀린, 저점성 파라핀 및/또는 황랍) 등을 사용하여 제형화한다.
적합한 추가의 첨가제로는 예를 들면, 세제, 예를 들면, Triton X-100 또는 나트륨 데옥시콜레이트 뿐만 아니라 폴리올, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 또는 글리세롤, 당, 예를 들면, 슈크로즈 또는 글루코즈, 쯔비터이온성 화합물, 예를 들면, 아미노산 (예: 글리신) 또는 특히 타우린 또는 베타인 및/또는 단백질 (예; 소 또는 사람 혈청 알부민)이 있다. 세제, 폴리올 및/또는 쯔비터이온성 화합물이 바람직하다.
생리학적 완충액은 바람직하게는 약 6.0 내지 8.0의 pH, 특히 약 6.8 내지 7.8의 pH, 특히 약 7.4의 pH 및/또는 약 200 내지 400밀리오스몰/리터, 바람직하게는 약 290 내지 310밀리오스몰/리터의 오스몰 농도를 갖는다. 약제학적 조성물의 pH는 일반적으로 적합한 유기 또는 무기 완충액, 예를 들면, 바람직하게는 포스페이트 완충액, 트리스 완충액 (트리스(하이드록시메틸)아미노메탄), HEPES 완충액 ([4-(2-하이드록시에틸)피페라지노]에탄설폰산) 또는 MOPS 완충액 (3-모르폴리노-1-프로판설폰산)을 사용하여 조정한다. 개별적 완충액의 선택은 일반적으로 목적하는 완충액 몰농도에 의존한다. 예를 들면, 포스페이트 완충액은 주사액 및 주입액용으로 적합하다.
약제학적 조성물은 통상의 방식으로, 예를 들면, 정제 또는 캡슐제와 같은 경구 투여 형태, 점막, 예를 들면, 비강 또는 구강에 의해, 피부 아래로 이식되는 저장소 형태, 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 함유하는 주사, 주입 또는 겔에 의해 투여될 수 있다. 게다가, 경우에 따라 약제학적 조성물을 리포좀 복합체의 형태로 국소 또는 국부 투여할 수 있다. 또한, 약제학적 조성물의 일시적으로 제어된 방출을 가능하게 하는 경피 치료학적 시스템 (TTS)을 사용하여 치료를 수행할 수 있다. TTS는 예를 들면, 유럽 공개특허공보 제0 944 398 A1호, 제0 916 336 A1호,제0 889 723 A1호 또는 제0 852 493 A1호에 공지되어 있다.
주사액은 일반적으로 비교적 소량의 용액 또는 현탁액, 예를 들면, 약 1 내지 약 20ml이 신체에 투여되는 경우에 사용된다. 주입액은 대량의 용액 또는 현탁액, 예를 들면 1ℓ 이상이 투여되는 경우에 일반적으로 사용된다. 주입액과 달리 주사액의 경우 오직 수 밀리리터만이 투여되기 때문에, 주사액에 있어 혈액 또는 조직 체액의 pH 및 삼투압과의 적은 차이는 이들 주사액을 통증 지각과 관련해 현저하지 않게 만들거나 사소한 정도로만 현저하다. 따라서, 본 발명에 따른 제형의 희석액을 사용하는 것이 일반적이나 필수적인 것이 아니다. 그러나, 비교적 대량 투여의 경우, 본 발명에 따른 제형은 적어도 대략적 등장성 용액이 수득되도록 투여 전에 간단히 희석되어야 한다. 등장성 용액의 예는 0.9% 농도의 염화나트륨 용액이다. 주입의 경우, 예를 들면, 멸균수를 사용하여 희석을 수행할 수 있으며, 예를 들면, 소위 바이패스 (bypass)를 통해 투여를 수행할 수 있다.
약제학적 조성물은 경구, 비강, 직장, 비경구, 질, 국소 또는 질 투여용으로 제조될 수 있다. 비경구 투여에는 피하, 피내, 근육내, 정맥내 또는 복강내 투여가 포함된다.
또한, 본 발명은 본 발명의 카르니틴 수송체 효능제 또는 길항제의 스크리닝 방법을 사용하여 동정될 수 있는 카르니틴 수송체의 효능제 및 길항제에 관한 것이다.
본 발명의 제4 바람직한 양태는 동물, 바람직하게는 사람 환자에서 카르니틴 수송체 결핍증을 진단하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 당해 방법은 동물 또는 사람 환자로부터 수득된 조직 샘플 중에서 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 10의 아미노산 서열, 등록번호 AJ276207하에 입수가능한 랫트 단백질 AAW07635 (rB21a), CN 특허 제1287170호에 개시된 단백질 AAG64193 또는 단백질 AAW73376, 즉 유럽 특허 제881290호에 개시된 사람 HPDDV78, 바람직하게는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 10, 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 10, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 카르니틴 수송체의 양을 측정함을 포함한다.
바람직하게는, 당해 진단 방법에서는 카르니틴 수송체와 반응하는 항체가 사용된다. 바람직하게는, 본 발명의 항체가 사용된다. 바람직하게는, 항체와 반응하는 단백질의 부재 또는 존재가 측정되며 이것이 조직 샘플 중의 카르니틴 수송체의 부재 또는 존재 여부의 지표가 된다.
바람직한 양태에서, 카르니틴 수송체 결핍증과 관련된 카르니틴 수송체의 변이체와 반응하는 항체가 사용된다. 카르니틴 수송체 또는 이의 변이체의 양을 항체를 사용하여 측정하는 본 발명의 진단방법은 항체가 이의 항원의 양을 측정하기 위해 사용되는, 당해 분야의 또는 장래에 이용가능할 수 있는 임의의 면역학적 방법을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명은 조직 샘플 중의 카르니틴 수송체 또는 이의 변이체의 부재 또는 존재를 측정하기 위한 당해 분야에 공지된 ELISA 검정의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, ELISA 검정은 건강한 개체와 비교한, 환자로부터 수득된 조직 샘플 중의 카르니틴 수송체의 상대적 양을 측정하는데 사용된다. 바람직하게는, 본 발명은 조직 샘플 중의 카르니틴 수송체 또는 이의 변이체의 양 및 크기를 측정할 수 있는, 당해 분야에 공지되어 있는 웨스턴 분석의 용도에 관한 것이다.
바람직한 양태에서, 당해 진단방법은 본 발명의 진단방법 전에 동물 또는 사람 환자로부터 수득된 조직 샘플을 사용하여 실시하는 시험관내 진단방법이다.
추가의 바람직한 양태, 당해 진단방법은 조직 샘플을 동물 또는 사람 환자로부터 수득하는 부가적 초기 단계를 포함한다. 바람직하게는, 당해 진단방법은 동물 또는 사람 환자의 신체 내에서 실시되는 하나 이상의 단계를 포함한다.
본 발명의 제5 바람직한 양태는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 10의 아민산 서열, 등록번호 AJ276207하에 입수가능한 랫트 단백질 AAW07635 (rB21a), CN 특허 제1287170호에 개시된 단백질 AAG64193 또는 단백질 AAW73376, 즉 유럽 특허 제881290호에 개시된 사람 HPDDV78, 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 10, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 카르니틴 수송체와 반응하는 항체를 제조하기 위한 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 10의 아미노산 서열, 등록번호 AJ276207하에 입수가능한 랫트 단백질 AAW07635 (rB21a), CN 특허 제1287170호에 개시된 단백질 AAG64193 또는 단백질 AAW73376, 즉 유럽 특허 제881290호에 개시된 사람 HPDDV78, 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 10, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 단백질의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, 카르니틴 수송체 결핍증과 관련된 카르니틴 수송체의 변이체가 사용된다.
본 발명의 항체의 제조는 당해 분야에서 이용가능하거나 장래에 이용가능할 수 있는, 항체의 임의의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 항체의 제조는 본원에서 언급되는 모든 의미의 "항체"란 용어에 대한 것이다.
바람직하게는, 동물 또는 사람 환자에서 카르니틴 결핍증과 관련된 카르니틴 수송체의 변이체는 당해 항체의 제조를 위해 사용된다. 카르니틴 결핍증과 관련된 카르니틴 수송체의 변이체는 바람직하게는 카르니틴 결핍증, 바람직하게는 전신 카르니틴 결핍증을 앓는, 동물 또는 바람직하게는 사람 환자의 조직 샘플에 포함된 카르니틴 수송체이다. 카르니틴 수송체의 변이체는 바람직하게는 신장 또는 장으로부터의 조직 샘플 중에 포함된다.
본 발명의 제6 바람직한 양태는 (a) 카르니틴 결핍증과 관련된, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 10, 등록번호 AJ276207하에 입수가능한 랫트 단백질 AAW07635 (rB21a), CN 특허 제1287170호에 개시된 단백질 AAG64193 또는 단백질 AAW73376, 즉 유럽 특허 제881290호에 개시된 사람 HPDDV78, 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 10, 바람직하게는 서열번호 1의 변이체를 암호화하는 핵산 서열을 측정하는 단계 및 (b) 상기 카르니틴 수송체의 변이체의 아미노산 서열을 추론하는 단계를 포함하여, 카르니틴 결핍증과 관련된 카르니틴 수송체의 변이체를 측정하는 방법에 관한 것이다.
핵산 서열은 바람직하게는 카르니틴 수송체의 변이체를 포함하는 동물 조직 샘플 또는 사람 조직 샘플을 사용하여 측정된다. 바람직하게는, 조직 샘플에 포함된 핵산 분자의 핵산 서열이 측정된다. 바람직하게는 핵산 서열은 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 8 또는 서열번호 15, 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 15에 상응하거나, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 10의 아미노산 서열, 등록번호 AJ276207하에 입수가능한 랫트 단백질 AAW07635 (rB21a), CN 특허 제1287170호에 개시된 단백질 AAG64193 또는 단백질 AAW73376, 즉 유럽 특허 제881290호에 개시된 사람 HPDDV78, 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 10, 바람직하게는 서열번호 1, 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 10, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산을 포함하는 카르니틴 수송체의 변이체를 암호화한다.
핵산 서열의 측정은 바람직하게는 당해 분야의 임의의 핵산 서열 측정 방법, 특히 DNA 서열분석 프로토콜 또는 장래에 이용할 수 있는 임의의 핵산 서열 측정 방법을 사용하여 실시한다.
카르니틴 수송체 변이체를 암호화하는 핵산 서열로부터 카르니틴 수송체 변이체의 아미노산을 추론하는 것은 바람직하게는 개개의 아미노산을 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 개방 판독 프레임내 임의의 뉴클레오타이드 염기 트리플렛 (nucleotide base triplet)에 배정하는 당해 분야에 공지된 명확한 소위 유전자 코드를 사용하여 실시한다.
본 발명의 제7 바람직한 양태는 조직 샘플 중에서 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 10의 아미노산 서열, 등록번호 AJ276207하에 입수가능한 랫트 단백질 AAW07635 (rB21a), CN 특허 제1287170호에 개시된 단백질 AAG64193 또는 단백질 AAW73376, 즉 유럽 특허 제881290호에 개시된 사람 HPDDV78, 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 10, 바람직하게는 서열번호 1, 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 10, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산을 포함하는 카르니틴 수송체를 암호화하는 핵산 분자의 양을 측정하는 단계를 포함하는, 카르니틴 수송체 결핍증의 진단방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 8 또는 서열번호 15, 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 15를 포함하는 핵산의 양이 측정된다.
바람직하게는, DNA 분자의 양이 측정된다. 바람직하게는, RNA 분자의 양이 측정된다. 바람직하게는, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 8 또는 서열번호 15, 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 15를 포함하는 DNA 분자의 양 또는 상응하는 RNA 분자의 양이 측정된다. 바람직하게는, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 10의 아미노산 서열, 등록번호 AJ276207하에 입수가능한 랫트 단백질 AAW07635 (rB21a), CN 특허 제1287170호에 개시된 단백질 AAG64193 또는 단백질 AAW73376, 즉 유럽 특허 제881290호에 개시된 사람 HPDDV78, 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 10, 바람직하게는 서열번호 1, 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 10, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산을 암호화하는 DNA 분자의 양 또는 상응하는 RNA 분자의 양이 측정된다.
바람직하게는, 진단방법은 공지된 서열을 포함하거나 공지된 핵산 서열과 검출가능한 유사성을 갖는 핵산 분자의 양을 측정하기 위한 당해 분야에 공지된 또는 장래에 이용가능한 임의의 방법의 사용을 포함한다. 바람직하게는, 당해 진단방법은 카르니틴 수송체를 암호화하는 핵산 분자와 본 발명의 상보적 핵산 프로브 간의 상보적 염기쌍 형성 단계를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 핵산 프로브는 카르니틴 수송체를 암호화하는 핵산 분자에 상보적인 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 바람직하게는, 핵산 프로브는 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 8 또는 서열번호 15, 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 15에 상보적인 서열을 포함한다. 바람직하게는, 핵산 프로브는 비-엄중한 조건, 바람직하게는 엄중한 조건하에 카르니틴 수송체를 암호화하는 핵산 분자에 하이브리드화한다. 바람직하게는, 핵산 프로브는 18개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 핵산 프로브는 카르니틴 수송체 결핍증과 관련된 카르니틴 수송체의 변이체를 암호화하는 핵산 분자의 변이체에 하이브리드화한다. 바람직하게는, 핵산 분자의 변이체는 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 8 또는 서열번호 15, 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 15의 변이체를 포함한다.
바람직하게는, 상보적 염기쌍 형성은 카르니틴 수송체를 암호화하는 핵산 분자와 상보적 서열을 포함하는 프로브 간의 염기쌍 형성 뿐만 아니라 당해 핵산 분자의 변이체와 핵산 프로브 간의 염기쌍 형성도 의미하며, 여기서 핵산 프로브는 오직 부분적으로만 핵산 분자의 변이체에 상보적이다. 바람직하게는, 상보적 염기쌍 형성은 건강한 개체의 카르니틴 수송체를 암호화하는 핵산 분자에 대해 검출가능한 유사성을 갖는, 카르니틴 수송체의 변이체를 암호화하는 어떠한 핵산 분자라도 검출할 수 있게 한다.
바람직하게는, 핵산 분자 또는 핵산 분자에 의해 암호화되는 카르니틴 수송체 또는 이의 변이체, 특히 카르니틴 수송체 결핍증과 관련된 임의의 변이체 또는 임의의 동족 또는 상동 변이체에 관한 것인 본 발명의 임의의 양태는, 또한 특히 본원에서 기술한 바와 같은 유사한 서열을 포함하는 핵산 분자에 또한 관한 것이다. 바람직하게는, 유사한 서열은 상보적 염기쌍 형성 방식으로 하이브리드화한다. 바람직하게는 유사한 서열은 비-엄중한 조건, 바람직하게는 엄중한 조건하에 하이브리드화한다.
바람직하게는, 진단방법은 핵산 분자에 대한 당해 분야의 하이브리드화 방법, 특히 조직 샘플 중에서 카르니틴 수송체를 암호화하는 DNA 분자를 검출하기 위한 서던 하이브리드화 방법 또는 조직 샘플 중에서 카르니틴 수송체를 암호화하는 RNA 분자를 검출하기 위한 노던 하이브리드화 방법을 포함한다. 바람직하게는, 조직 샘플 중에서 DNA 분자 또는 RNA 분자와 하이브리드화하는 본 발명의 핵산 프로브는 DNA 칩의 성분이다. 바람직하게는, 진단방법은 조직 샘플로부터 DNA 분자 또는 RNA 분자를 추출하는 단계를 포함하며, 이 단계는 본 발명의 핵산 프로브와 하이브리드화시키기 전에 실시한다.
바람직하게는, 진단방법은 조직 샘플에 포함된 카르니틴 수송체를 암호화하는 핵산 분자를 증폭시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 당해 방법은 핵산 분자의 증폭용으로 당해 분야에 공지된 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 포함한다. 바람직하게는, 조직 샘플에 포함된 DNA 분자를 증폭시킨다. 대안으로, RNA 분자를 DNA 분자로 역전사시키는 부가적 초기 단계 후에, 조직 샘플에 포함된 RNA 분자를 증폭시킨다.
본 발명의 제8 바람직한 양태는 서열번호 6을 포함하거나 서열번호 7에 상보적인 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 유리하게도, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 신장 및 장의 사람 고친화성 카르니틴 수송체에 대한 유전자를 분리할 수 있게 한다.
바람직하게는, 서열번호 6을 포함하거나 서열번호 7에 상보적인 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 본 발명의 카르니틴 수송체 결핍증의 진단방법에서 사용한다. 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오타이드를 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에서 프라이머로서 사용한다. 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오타이드를 DNA 어레이 (array)의 성분으로서 사용한다.
본 발명의 제9 바람직한 양태는 (a) 본 발명의 제7 바람직한 양태에 따른 카르니틴 수송체 결핍증의 진단방법을 사용하여 조직 샘플로부터 카르니틴 수송체의 변이체를 암호화하는 핵산 분자를 분리시키는 단계; 및 (b) 상기 핵산 분자의 핵산 서열을 측정하는 단계를 포함하여, 카르니틴 수송체 결핍증과 관련된 카르니틴 수송체의 변이체를 암호화하는 핵산의 변이체를 측정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제10 바람직한 양태는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 10의 아미노산 서열, 등록번호 AJ276207하에 입수가능한 랫트 단백질 AAW07635 (rB21a), CN 특허 제1287170호에 개시된 단백질 AAG64193 또는 단백질 AAW73376, 즉 유럽 특허 제881290호에 개시된 사람 HPDDV78, 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 10, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 카르니틴 수송체를 암호화하는 핵산 분자를 세포내로 도입시킴을 포함하는, 카르니틴 수송체 결핍증의 치료방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 8 또는 서열번호 15, 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 15를 포함하는 DNA 분자를 세포내로 도입시킨다. 바람직하게는, 상기 DNA 서열은 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 8 또는 서열번호 15, 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 15에 작동적으로 연결된 전사 프로모터 서열을 포함한다.
본 발명의 제11 바람직한 양태는 세포에서 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 10의 아민노산 서열, 등록번호 AJ276207하에 입수가능한 랫트 단백질 AAW07635 (rB21a), CN 특허 제1287170호에 개시된 단백질 AAG64193 또는 단백질 AAW73376, 즉 유럽 특허 제881290호에 개시된 사람 HPDDV78, 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 10, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 카르니틴 수송체를 암호화하는 핵산 분자의 전사 활성을 증강시킴을 포함하는, 카르니틴 수송체 결핍증의 치료방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 8 또는 서열번호 15, 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 15를 포함하는 세포 유전자의 전사 활성을 증강시킨다.
본 발명의 카르니틴 수송체 결핍증의 치료방법에서, 당해 핵산 분자가 도입되어지거나 카르니틴 수송체를 암호화하는 핵산 분자의 전사 활성이 증강되는 세포 는 바람직하게는 신장 세포, 장 세포, 간 세포, 심장 세포 및/또는 근육 세포이다.
바람직하게는, 본 발명의 카르니틴 수송체 결핍증의 치료방법은 카르니틴, 노르아드레날린, 메틸페닐피리디늄, 크레아틴, 및/또는 세로토닌 수송체의 결핍증의 치료 또는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 10의 아미노산 서열, 등록번호 AJ276207하에 입수가능한 랫트 단백질 AAW07635 (rB21a), CN 특허 제1287170호에 개시된 단백질 AAG64193 또는 단백질 AAW73376, 즉 유럽 특허 제881290호에 개시된 사람 HPDDV78, 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 10, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 의해 수용되는 임의의 기질의 결핍증의 치료를 의미한다. 바람직하게는, 당해 방법은 전신 카르니틴 결핍증의 치료를 의미한다.
바람직하게는, 본 발명의 카르니틴 수송체 결핍증의 치료방법은 세포가 시험관내에서 치료되는 시험관내 방법이다. 바람직하게는, 세포는 본 발명의 치료방법 단계 전에 환자로부터 분리되었다.
본 발명의 치료방법의 추가 바람직한 양태는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 10에 따른 카르니틴 수송체, 등록번호 AJ276207하에 입수가능한 랫트 단백질 AAW07635 (rB21a), CN 특허 제1287170호에 개시된 단백질 AAG64193 또는 단백질 AAW73376, 즉 유럽 특허 제881290호에 개시된 사람 HPDDV78, 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 10, 바람직하게는 서열번호 1을 암호화하는 핵산 분자를 사람 신체, 바람직하게는 신장 또는 장에 포함된 세포내로 도입시키는 것에 관한 것이다. 대안으로서, 세포를 먼저 시험관내에서 조작하고 후속적으로 사람 신체로 전달시킨다.
바람직하게는, 본 발명의 치료방법에 사용되는 세포는 신장 또는 장, 특히 장으로부터 수득된다.
서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 8 또는 서열번호 15, 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 15를 포함하는 핵산 분자는 본 발명의 스크리닝 방법의 시험 세포내로 또는 본 발명의 치료방법에서 사용되는 사람 세포내로 나출형 (naked) 형태, 유전자 전달 벡터 형태 또는 리포좀 또는 금 입자와 복합체화된 형태로 도입될 수 있다.
유전자 전달 벡터의 예는 바이러스 벡터, 예를 들면, 아데노바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터이다 [참조: Lindemann et al. (1997), Mol. Med., 3, 466-76; Springer et al. (1988) MoI. Cell., 2, 549-58]. 리포좀과의 복합체는 통상적으로, 특히 피부 세포의 형질감염의 매우 높은 효율을 달성한다 [참조: Alexander and Akhurst, 1995, Hum. MoI. Genet. 4:2279-85]. 리포펙션 (lipofection)에서, 양이온성 지질로 이루어진 소형 단일 라멜라 소포는 리포좀 현탁액을 초음파처리하여 제조된다. DNA는 순 양전하가 보유되고 모든 플라스미드 DNA가 리포좀에 의해 복합체화되는 비율로 리포좀의 표면에 이온성에 의해 결합된다. 문헌 [참조: Feigner, P.L. et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 84, 7413 - 7414]에서 사용된 DOTMA (1,2-디올레일옥시프로필-3-트리메틸암모늄 브로마이드) 및 DOPE (디올레오일포스파딜에탄올아민) 지질 혼합물 외에, 다수의 지질 제형이 현재까지 합성되고 각종 세포주에서의 이의 형질감염 효율에 대해 시험되어 왔다 [참조: Behr et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6982-6986; Gao and Huang (1991), Biochim. Biophys. Acta, 1189, 195-203; Feigner et al. (1994) J. Biol. Chem., 269, 2550-2561]. 지질 제형의 예는 DOTAP N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸 설페이트 또는 DOGS (디옥타데실아미도글리실스페르민)이 있다.
세포내로의 핵산의 전달을 증가시키는 보조제 물질은 예를 들면, DNA에 결합되는 단백질 또는 펩타이드, 또는 핵산이 세포의 핵으로 수송될 수 있도록 하는 합성 펩타이드-DNA 분자일 수 있다 [참조: Schwartz et al. (1999) Gene Therapy 6:282; Branden et al. (1999) Nature Biotech., 17, 784]. 보조제 물질에는 핵산이 세포의 세포질로 방출될 수 있도록 하는 분자 [참조: Planck et al. (1994) J. Biol. Chem., 269, 12918; Kichler et al. (1997) Bioconj. Chem., 8, 213] 또는 예를 들면 리포좀 [참조: Uhlmann and Peyman (1990), supra]이 포함된다.
또 다른 특히 적합한 형태는 상기한 핵산을 금 입자에 도포하고 이 입자를 소위 "유전자 총 (gene gun)"을 사용하여 조직 또는 세포로 발포함으로써 수득될 수 있다 [참조: Wang et al. (1999) J. Invest. Dermatol. 112: 775-81, Tuting et al. (1998) J. Invest. Dermatol. 111: 183-8].
하기 도면, 서열 및 실시예에서, 본 발명의 몇가지 바람직한 양태가 도 1 및 2를 참조로 하여 실시예에서 보다 상세히 기술된다. 그러나, 이들 바람직한 양태의 상세한 설명은 본 발명의 범주를 제한하기 위함이 아니다. 대조적으로, 본 발명은 본원의 실시에에서 명백히 언급되지는 않지만 당업자가 과도한 노력없이 알아 낼 수 있는 세부사항을 포함하는 임의의 양태에 적절하다.
도 1은 상이한 기질을 사용한 본 발명의 방법에 포함된 카르니틴 수송체의 활성을 예시하는 히스토그램을 도시한 것이다. 도 1은 기질 L-카르니틴 (칼럼 1), 노르아드레날린 (칼럼 2), 메틸페닐피리디늄 (칼럼 3) 및 세로토닌 (칼럼 4)과 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 카르니틴 수송체의 활성을 측정한 예를 도시한 것이다. 도 1에서, 좌측 컬럼 (1) 내지 (4)는 각각의 기질에 대한 카르니틴 수송체의 수송율 (pmol 시간-1 난모세포-1)을 나타낸다. 우측 컬럼 (1) 내지 (4)는 카르니틴 수송체를 포함하지 않는 적합한 대조군의 수송율을 나타낸다.
서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 카르니틴 수송체는 도 1에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 카르니틴 수송체에 대해 나타낸 활성과 필적하는 활성을 지닌다. 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3을 포함하는 카르니틴 수송체는 크레아틴을 또한 수송한다.
도 1은 서열번호 4를 포함하는 cRNA, 및 방사성 표지된 기질 L-카르니틴 (칼럼 1), 노르아드레날린 (칼럼 2), 메틸페닐피리디늄 (칼럼 3) 및 세로토닌 (칼럼 4)과 함께 주사된 제노푸스 래비스로 수득된 결과를 도시한 것이다. 각 칼럼의 우측 절반에 도시된 대조군은 cRNA 대신에 물과 함께 주사된 제노푸스 래비스를 이용하여 각 기질에 대해 수행된 대조 실험을 포함한다.
도 2는 본 발명의 방법에 포함된 카르니틴 수송체의 반응속도를 예시하는 도표를 도시한 것이다. 도 2는 기질 L-카르니틴과 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 카르니틴 수송체의 반응속도를 측정한 예를 도시한 것이다. 카르니틴 수송체는 기질 노르아드레날린, 메틸페닐피리디늄, 세로토닌 및 크레아틴의 경우 필적하는 반응속도를 나타낸다. 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 카르니틴 수송체는 도 2에서와 필적하는 반응속도를 나타낸다. 도 2에서, 도표의 x-축은 카르니틴 농도 (μmol 리터-1)를 나타내고, y-축은 카르니틴 수송체의 수송율 (pmol 시간-1 난모세포-1)을 나타낸다.
도 2에 도시한 바와 같이, 카르니틴 수송체에 의한 L-카르니틴 수송의 농도 의존성의 측정은 미하엘리스-멘텐 (Michaelis-Menten) 반응속도론을 통해서 조정될 수 있는 카르니틴 수송의 포화를 나타낸다. 도 2에 예시한 예에서, 15μM의 KM-값이 수득된다. 따라서, 본 발명의 방법에서 사용된 카르니틴 수송체, 특히, 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 4에 의해 암호화되는 카르니틴 수송체는 신장 및 장에서의 카르니틴 수송에 대해 기술한 바와 같은 고친화성 카르니틴 수송체이다 [참조: Lahjouji K, MaIo C, Mitchell GA, Qureshi IA, 2002, Biochim Biophys Acta, 1558, 82-93].
도 3은 각각 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 1을 포함하는 밀접하게 관련된 쥐, 랫트 및 사람 신장 및 장 카르니틴 수송체를 포함하는 아미노산 서열 정렬을 도시한 것이며, 이들 서열 각각은 634개 아미노산을 포함한다. 개별적 카르니틴 수송체의 상응하는 아미노산 위치는 도 3에 서로 아래에 배열되어 있으며, 관련 단백질내 소위 보존된 영역을 관측할 수 있고 보다 가변적 영역을 관측할 수 있도록 1개의 서열의 소정의 위치 또는 모든 3개의 서열의 소정의 위치에 존재하는 아미노산 서열이 표시되어 있다.
도 3의 서열 동일성으로부터 모든 3개의 단백질이 밀접하게 관련되고, 또한 마우스 및 랫트 단백질은 사람 카르니틴 수송체보다 서로에 대해 더욱 밀접하게 관련됨을 알 수 있다. 추가로, 당업자는 도 3으로부터 과도한 노력 없이 도시된 서열의 관련성이 서열 동일성을 능가하며 서열내 상응하는 위치에서의 소위 보존된 아미노산 치환을 포함함을 알 수 있다. 당해 분야에 널리 공지되어 있는 바와 같이, 보존된 아미노산 치환은 소정의 서열 위치에 있는 아미노산의 기능적으로 유사한 아미노산으로의 치환을 포함하며, 이러한 아미노산의 기능은 이의 측면 그룹의 화학적 특성, 특히 측면 그룹의 전하, 산 특성 또는 염기 특성, 친수성, 소수성, 황-함량, 방향족 특성 또는 크기, 특히 작은 크기와 관련된다.
또한, 당업자는 도 3으로부터 과도한 노력 없이 서열번호 1, 서열번호 2 및/또는 서열번호 3 중 2개 또는 3개를 포함하는 그룹에 특징적인 또는 개개의 카르니틴 수송체, 바람직하게는 서열번호 1에 특징적인 임의의 개수의 아미노산을 포함하는 다양한 서열 모티프를 알 수 있다. 바람직하게는, 특징적 서열 모티프는 단백질에서 덜 빈번하게 존재하는 1개 이상, 바람직하게는 2개 이상의 아미노산의 그룹을 포함한다. 당업자는 과도한 노력 없이 비통상적 아미노산을 포함하는 특징적 서열 모티프를 동정할 수 있다.
또한, 당업자는 서열번호 1과 서열번호 2, 서열번호 1과 서열번호 3 및 서열 번호 2와 서열번호 3 간의 아미노산 서열 정렬을 보여주는 본원의 도 4, 5 및 6에 제공된 유사한 아미노산들 간 및 매우 유사한 아미노산 간의 아미노산 치환에 관한 부가적 정보를 고려한다.
바람직하게는, 본 발명의 임의의 양태에서 사용된 카르니틴 수송체는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산을 포함하는 모든 3개의 카르니틴 수송체에 특징적인 또는 상기 카르니틴 수송체 중 2개를 포함하는 임의의 그룹에 특징적인 또는 상기 카르니틴 수송체 중 하나, 바람직하게는 서열번호 1에 특징적인 아미노산 서열 모티프를 포함하는 카르니틴 수송체이다. 바람직하게는, 카르니틴 수송체는 도 3에 도시된 모든 3개의 카르니틴 수송체에 특징적인 또는 2개의 카르니틴 수송체를 포함하는 임의의 그룹에 특징적인 또는 1개의 카르니틴 수송체, 바람직하게는 서열번호 1에 특징적인 서열 모티프와의 유사성으로 인해 과도한 노력없이 동정될 수 있는 아미노산 모티프를 포함한다.
도 4는 86.9% 아미노산 서열 동일성을 공유하는 서열번호 1 및 서열번호 2를 각각 포함하는 밀접하게 관련된 사람 및 쥐 신장 및 장 카르니틴 수송체를 포함하는 아미노산 서열 정렬을 도시한 것이다. 동일한 아미노산은 막대로 표시하며, 기능적으로 유사한 아미노산은 1개 점으로 표시하며, 기능적으로 및/또는 구조적으로 거의 동일한 매우 유사한 아미노산은 2중 점으로 표시한다.
도 5는 86.7% 아미노산 서열 동일성을 공유하는 서열번호 1 및 서열번호 3을 각각 포함하는 밀접하게 관련된 사람 및 랫트 신장 및 장 카르니틴 수송체를 포함하는 아미노산 서열 정렬을 도시한 것이다. 동일한 아미노산은 막대로 표시하며, 기능적으로 유사한 아미노산은 1개 점으로 표시하며, 기능적으로 및/또는 구조적으로 거의 동일한 매우 유사한 아미노산은 2중 점으로 표시한다.
도 6은 95.4% 아미노산 서열 동일성을 공유하는 서열번호 2 및 서열번호 3을 각각 포함하는 밀접하게 관련된 쥐 및 랫트 신장 및 장 카르니틴 수송체를 포함하는 아미노산 서열 정렬을 도시한 것이다. 동일한 아미노산은 막대로 표시하며, 기능적으로 유사한 아미노산은 1개 점으로 표시하며, 기능적으로 및/또는 구조적으로 거의 동일한 매우 유사한 아미노산은 2중 점으로 표시한다.
도 7은 서열번호 1 및 서열번호 10을 포함하는 아미노산 서열 정렬을 도시한 것이다. 서열번호 1은 사람 신장 및 장 카르니틴 수송체의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 10은 서열번호 1의 기능적 스플라이스 변이체의 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호 10은 서열번호 1의 완전한 동일한 아미노산 서열과, 서열번호 1의 아미노산 296과 297 사이의 위치에 상응하는 위치에 삽입된 39개 아미노산을 포함하는 부가적 아미노산 서열 (서열번호 10의 아미노산 297 내지 335에 상응함)을 포함한다.
도 8은 서열번호 4 및 서열번호 9를 포함하는 핵산 서열 정렬을 도시한 것이다. 서열번호 4는 서열번호 1에 따른 사람 신장 및 장 카르니틴 수송체의 아미노산 서열을 암호화하고, 서열번호 9는 서열번호 1의 기능적 스플라이스 변이체의 아미노산 서열, 즉 서열번호 10에 따른 아미노산 서열을 암호화한다. 서열번호 9는 서열번호 4의 완전한 동일한 핵산 서열과, 서열번호 4의 뉴클레오타이드 887과 888 사이의 위치에 상응하는 위치에 삽입된 117개의 뉴클레오타이드를 포함하는 부가적 핵산 서열 (서열번호 9의 뉴클레오타이드 888 내지 1004에 상응함)을 포함한다.
도 9는 서열번호 5를 도시한 것이다.
도 10은 서열번호 6 및 7을 도시한 것이다.
도 11은 서열번호 8을 도시한 것이다.
도 12는 서열번호 11 (NM_003060)을 도시한 것이다.
도 13은 서열번호 12 (NP_003051)을 도시한 것이다.
도 14는 서열번호 13 (NM_0033125)을 도시한 것이다.
도 15는 서열번호 14 (NP_49116)을 도시한 것이다
도 16은 서열번호 15를 도시한 것이다.
서열의 설명:
서열번호 1은 사람 신장 및 장 카르니틴 수송체의 아미노산 서열을 포함한다.
서열번호 2는 서열번호 1과 동족인 마우스 신장 및 장 카르니틴 수송체의 아미노산 서열을 포함한다.
서열번호 3은 서열번호 1과 동족인 랫트 신장 및 장 카르니틴 수송체의 아미노산 서열을 포함한다.
서열번호 4는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 사람 신장 및 장 카르니틴 수송체를 암호화하는 개방 판독 프레임 DNA 서열을 포함한다.
서열번호 5는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 마우스 신장 및 장 카르니틴 수송체를 암호화하는 개방 판독 프레임 DNA 서열을 포함한다.
서열번호 6은 서열번호 4를 클로닝하기 위해 사용된, 서열번호 4의 개시부로부터의 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 (전방향 클로닝 프라이머)를 도시한 것이다.
서열번호 7은 서열번호 4를 클로닝하기 위해 역방향 프라이머로서 사용된, 서열번호 4의 말단으로부터의 다운스트림의 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 도시한 것이다.
서열번호 8은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 랫트 신장 및 장 카르니틴 수송체를 암호화하는 개방 판독 프레임 DNA 서열을 포함한다.
서열번호 9는 서열번호 4, 및 서열번호 4의 뉴클레오타이드 887과 888 사이에 삽입된 117개 뉴클레오타이드를 포함하는 부가적 서열을 포함한다. 서열번호 9는 NCBI 데이타베이스 (National Center for Biotechnology Information U.S.A.)에서 등록번호 XM_291120하에 입수가능하다.
서열번호 10은 서열번호 9에 의해 암호화되는 아미노산 서열로서, 서열번호 1과 서열번호 9의 아미노산 296과 297 사이에 삽입된 39개 아미노산을 포함하는 부가적 서열을 포함한다. 서열번호 10은 NCBI 데이타베이스에서 등록번호 XP_291120하에 입수가능하다.
서열번호 11은 인체 내의 도처에서 발현되는 사람 카르니틴 수송체 OCTN2를 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. 서열번호 11은 NCBI 데이타베이스에서 등록번호 NM_003060하에 입수가능하다.
서열번호 12는 서열번호 11에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하며, 이는 NCBI 데이타베이스에서 등록번호 NP_003051하에 입수가능하다.
서열번호 13은 사람 고환에서만 발현되는 사람 카르니틴 수송체 CT"를 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. 서열번호 13은 NCBI 데이타베이스에서 등록번호 NM_0033125하에 입수가능하다.
서열번호 14는 서열번호 13에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하며, 이는 NCBI 데이타베이스에서 등록번호 NP_149116하에 입수가능하다.
서열번호 15는 사람 신장 및 장 카르니틴 수송체에 대한 mRNA에 상응하는 DNA 서열을 포함하며, 이는 서열번호 4, 부가적 5'-플랭킹 서열 및 부가적 3'-플랭킹 서열을 포함한다.
신장 및 장 카르니틴 수송체의 유전자의 동정 및 클로닝
놀랍게도, 서열번호 4를 포함하는 핵산 분자가 사람 신장 및 사람 장에서 조직 특이적 방식으로 발현된다는 것이 밝혀졌다. 서열번호 4는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 카르니틴 수송체를 암호화한다.
서열번호 4를 포함하는 DNA 분자를, 주형으로서의 사람 신장 유래의 DNA, 및 서열번호 7에 상보적인 서열과 서열번호 6을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 (이는 데이타베이스에서 등록번호 AK09054로서 공개적으로 입수할 수 있는 DNA 서열로부터 유도되었다)를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)로 증폭시켰다.
난모세포를 사용한 수송 측정
방사성 표지된 화합물의 수송 측정을, 제노푸스 래비스 난모세포 막을 가로지르는 세포질로의 기질의 수송율을 측정하는 소위 "추적자 유동 방법 (tracer flux method)"에서 제노푸스 래비스 난모세포를 사용하여 실시하였다.
발톱 개구리 제노푸스 래비스의 난모세포의 주사
제노푸스 래비스 난모세포에 서열번호 4를 포함하는 cRNA 분자를 주사하였다.
주사될 난모세포를 실가드 그루브 (Sylgard groove)에 배열하였다. 백열광 나선형 필라멘트 내에서 가늘게 신장된, 붕규산으로부터 제조된 유리 모세관 (제조원: Hildenberg, Malsfeld; 내부 직경: 0.5mm; 외부 직경: 1.0 mm)을 사용하여 주사하였다. 샘플 용액을 흡인하고 가압 배출하기 위해, 드루몬드사 (Drummond)로부터 구입한 미세주사 펌프를 사용하였다. 모세관을 공기 버블 없이 광유 (Sigma 400-5 중질 백색 오일, D = 0.88 g/ml)로 충전시키고, 조작기가 제공된 마이크로펌프에 고정시켰다.
오일을 펌핑하고 목적하는 용적의 RNA를 흡인하기 위해, 핀셋을 사용하여 주사 모세관의 스틸 융합된 팁을 조심스럽게 깨뜨려서 개방시켰다. RNA의 농도의 증가 및 오염에 의한 이의 분해를 피하기 위해 멸균 광유 막하에 RNA를 주사 모세관 내로 흡인시켰다. 주사 모세관을 난모세포의 표면에 90° 각도로 위치시키고 약한 압력하에 난모세포내로 천공시켜 넣었다. 팁은 100 내지 200㎛ 보다 깊게 세포질내로 관통되지 않아야 한다. 주사물의 용적은 50 nl (약 0.9㎕ 용적의 난모세포의 약 5%)을 초과하지 않았다. 압력을 보정하고 개방된 천공 채널을 통한 주사물의 누출을 피하기 위해, 목적하는 용적을 적용한 후 주사 모세관을 5 내지 10초 동안 난모세포 내에 방치하였다.
누출을 피하기 위한 부가적 조건은 10mM NaCl 대신에 130을 포함하는 ORi, 즉 고장성 용액 중에서 주사 전 10분 이상 난모세포를 "예비수축"시키는 것이었다. 상당량의 난황 및 이에 따른 주사액의 일부분이 손실된 난모세포는 분류 제거하였다.
기질 흡수를 측정할 때까지, 주사된 난모세포를 18℃에서 겐타마이신 (50mg/L)을 포함하는 배양 배지 ORi에 저장하였다. 손상된, 실질적으로 변경되거나 이후에 심하게 손상된 세포는 폐기하였다.
72시간 후, 난모세포를 카르니틴 수송체 효능제 또는 길항제의 스크리닝을 위해 사용하였다.
배양 배지 ORi 용액
표준 완충액은 110mM NaCl, 3mM KCl, 2mM CaCl2, 1mM MgCl2 및 5mM MOPS를 포함하는 난모세포-링거액 ORi였다.
경우에 따라, 겐타마이신이 50mg/l로 부가되었다.
기질 흡수의 측정
난모세포 균질물로 처리된 폴리스티렌 웰에 기질 용액 200㎕을 충전시켰다. 난모세포를 측정에 사용하기 전에 먼저 ORi 용액으로 2회 세척하였다. 통계학적 평가를 위해 8 내지 10개의 난모세포가 반응 혼합물에서 사용되었다. 난모세포를 기질 용액에 부가한 후, 반응 혼합물을 약하게 혼합하고 항온처하였다. 항온처리는 1시간 동안 22℃에서 수행하였다. 반응을 중단시키기 위해, 빙냉 ORi 1ml을 부가하였다.
난모세포를 15ml 빙냉 ORi로 4회 세척하였다. 이어서, 난모세포를 개별적으로 6ml 카운터 바이알로 옮겼다. 100㎕ 5§ SDS 용액을 부가하여 난모세포 원형질 막을 붕괴시켰다. 상기 바이알을 가볍게 교반하여 원형질 막을 붕괴시켰다. 30분 내지 45분 동안 교반하여 원형질 막을 완전히 붕괴시켰다. 용해물을 신틸레이션 칵테일 2ml과 혼합하였다. 용해물의 방사성을 발광에 대한 보정 및 외부 표준을 포함하는 액체 신틸레이션 계수기에서 측정하였다. 각각의 바이알을 5분 동안 계수하였다.
난모세포의 점적 후에 기질 농도를 측정하기 위해, 2×10㎕ 용액을 반응 혼합물로부터 제거하고, 100㎕ 5% SDS 용액을 부가하고, 계수기를 사용하여 평가를 수행하였다. 수득된 값을 수송율의 계산시에 고려하였다.
KM-값의 측정
농도-의존적 기질 흡수를 측정하기 위해, 조사된 기질의 일련의 희석액을 제조하고, 상청액에서 10000 내지 20000cpm의 각 반응 혼합물이 계수되도록 방사성을 분배하였다. KM 측정을 위해, 1시간 동안 기질 흡수를 측정하였다. 또한, 배경값, 즉 예를 들면, 확산 또는 내인성 수송 단백질에 의해 매개되는 비특이적 기질 흡수를 측정하기 위해 H2O-주사된 난모세포를 사용하여 측정을 수행하였다. 수송율을 계산하고 기질 농도에 대해 그래프로서 작도하고 미하엘리스-멘텐 방정식에 따라 수학적으로 보정하였다.
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Asn 355 360 365 Ala Ser Asp Pro Ala Ala Tyr Ala Gln Leu Val Phe Gln Thr Cys Asp 370 375 380 Ile Asn Ala Phe Leu Ser Glu Ala Val Glu Gly Thr Gly Leu Ala Phe 385 390 395 400 Ile Val Phe Thr Glu Ala Ile Thr Lys Met Pro Leu Ser Pro Leu Trp 405 410 415 Ser Val Leu Phe Phe Ile Met Leu Phe Cys Leu Gly Leu Ser Ser Met 420 425 430 Phe Gly Asn Met Glu Gly Val Val Val Pro Leu Gln Asp Leu Arg Val 435 440 445 Ile Pro Pro Lys Trp Pro Lys Glu Val Leu Thr Gly Leu Ile Cys Leu 450 455 460 Gly Thr Phe Leu Ile Gly Phe Ile Phe Thr Leu Asn Ser Gly Gln Tyr 465 470 475 480 Trp Leu Ser Leu Leu Asp Ser Tyr Ala Gly Ser Ile Pro Leu Leu Ile 485 490 495 Ile Ala Phe Cys Glu Met Phe Ser Val Val Tyr Val Tyr Gly Val Asp 500 505 510 Arg Phe Asn Lys Asp Ile Glu Phe Met Ile Gly His Lys Pro Asn Ile 515 520 525 Phe Trp Gln Val Thr Trp Arg Val Val Ser Pro Leu Leu Met Leu Ile 530 535 540 Ile Phe Leu Phe Phe Phe Val Val Glu Val Ser Gln Glu Leu Thr Tyr 545 550 555 560 Ser Ile Trp Asp Pro Gly Tyr Glu Glu Phe Pro Lys Ser Gln Lys 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Phe 130 135 140 Gln Glu Pro Leu Pro Trp Ser Glu Cys Pro Leu Asn Gln Asn Gln Thr 145 150 155 160 Gly Tyr Val Glu Glu Cys Ala Lys Ser Ser Ser Val Asp Tyr Phe Trp 165 170 175 Tyr Arg Glu Thr Leu Asn Ile Ser Thr Ser Ile Ser Asp Ser Gly Ser 180 185 190 Ile Gln Trp Trp Ile Leu Leu Cys Leu Thr Cys Ala Trp Ser Val Leu 195 200 205 Tyr Val Cys Ile Ile Arg Gly Ile Glu Thr Thr Gly Lys Ala Val Tyr 210 215 220 Ile Thr Ser Thr Leu Pro Tyr Val Val Leu Thr Ile Phe Leu Ile Arg 225 230 235 240 Gly Leu Thr Leu Lys Gly Ala Thr Asn Gly Ile Val Phe Leu Phe Thr 245 250 255 Pro Asn Ile Thr Glu Leu Ser Asn Pro Asn Thr Trp Leu Asp Ala Gly 260 265 270 Ala Gln Val Phe Tyr Ser Phe Ser Leu Ala Phe Gly Gly Leu Ile Ser 275 280 285 Phe Ser Ser Tyr Asn Ser Val His Asn Asn Cys Glu Met Asp Ser Val 290 295 300 Ile Val Ser Val Ile Asn Gly Phe Thr Ser Val Tyr Ala Ala Thr Val 305 310 315 320 Val Tyr Ser Ile Ile Gly Phe Arg Ala Thr Glu Arg Phe Asp Asp Cys 325 330 335 Val Asn Thr Asn Ile Leu Thr Leu Ile Asn Gly Phe Asp Leu Pro 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Asp Asp Cys 325 330 335 Val Asn Thr Asn Ile Leu Thr Leu Ile Asn Gly Phe Asp Leu Pro Glu 340 345 350 Gly Asn Val Thr Ala Glu Asn Phe Glu Ala Tyr Gln His Trp Cys Asn 355 360 365 Ala Thr Asn Pro Glu Ala Tyr Ala Gln Leu Thr Phe Gln Thr Cys Asp 370 375 380 Ile Asn Thr Phe Leu Ser Glu Gly Val Glu Gly Thr Gly Leu Ala Phe 385 390 395 400 Ile Val Phe Thr Glu Ala Ile Thr Lys Met Pro Val Ser Pro Leu Trp 405 410 415 Ser Val Leu Phe Phe Ile Met Leu Phe Cys Leu Gly Leu Ser Ser Met 420 425 430 Phe Gly Asn Met Glu Gly Val Val Val Pro Leu Gln Asp Leu Asn Ile 435 440 445 Thr Pro Lys Lys Trp Pro Lys Glu Leu Leu Thr Gly Leu Ile Cys Leu 450 455 460 Gly Thr Tyr Leu Ile Ala Phe Ile Phe Thr Leu Asn Ser Gly Gln Tyr 465 470 475 480 Trp Leu Ser Leu Leu Asp Ser Tyr Ala Gly Ser Ile Pro Leu Leu Ile 485 490 495 Ile Ala Phe Cys Glu Met Phe Ala Val Val Tyr Val Tyr Gly Val Asp 500 505 510 Arg Phe Asn Lys Asp Ile Glu Phe Met Ile Gly His Lys Pro Asn Ile 515 520 525 Phe Trp Gln Val Thr Trp Arg Val Val Ser Pro Leu Ile Met 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360 acgtccttca tggtgggact gtattacaac accatcatct cctggatcat gtggtactta 420 ttcaactcct tccaggagcc tctgccctgg agcgactgcc cgctcaacga gaaccagaca 480 gggtatgtgg acgagtgcgc caggagctcc cctgtggact acttctggta ccgagagacg 540 ctcaacatct ccacgtccat cagcgactcg ggctccatcc agtggtggat gctgctgtgc 600 ctggcctgcg catggagcgt cctgtacatg tgcaccatcc gcggcatcga gaccaccggg 660 aaggccgtgt acatcacctc cacgctgccc tatgtcgtcc tgaccatctt cctcatccga 720 ggcctgacgc tgaagggcgc caccaatggc atcgtcttcc tcttcacgcc caacgtcacg 780 gagctggccc agccggacac ctggctggac gcgggcgcac aggtcttctt ctccttctcc 840 ctggccttcg ggggcctcat ctccttctcc agctacaact ctgtgcatgg ctcagcctct 900 cactcctggg gctggcgctc tgggcgggat gcggatgctg ccctgggctg tgtcctgacc 960 tgggacctca tcgccagccg ccatgacact ggtctcgtct gcagcaacaa ctgcgagaag 1020 gactcggtga ttgtgtccat catcaacggc ttcacatcgg tgtatgtggc catcgtggtc 1080 tactccgtca ttgggttccg cgccacacag cgctacgacg actgcttcag cacgaacatc 1140 ctgaccctca tcaacgggtt cgacctgcct gaaggcaacg tgacccagga gaactttgtg 1200 gacatgcagc 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acttcgaggg gatttatgac cacgtggggc acttcggcag 120 attccagaga gtcctctatt tcatatgtgc cttccagaac atctcttgtg gtattcacta 180 cttggcttct gtgttcatgg gagtcacccc tcatcatgtc tgcaggcccc caggcaatgt 240 gagtcaggtt gttttccata atcactctaa ttggagtttg gaggacaccg gggccctgtt 300 gtcttcaggc cagaaagatt atgttacggt gcagttgcag aatggtgaga tctgggagct 360 ctcaaggtgt agcaggaata agagggagaa cacatcgagt ttgggctatg aatacactgg 420 cagtaagaaa gagtttcctt gtgtggatgg ctacatatat gaccagaaca catggaaaag 480 cactgcggtg acccagtgga acctggtctg tgaccgaaaa tggcttgcaa tgctgatcca 540 gcccctattt atgtttggag tcctactggg atcggtgact tttggctact tttctgacag 600 gctaggacgc cgggtggtct tgtgggccac aagcagtagc atgtttttgt ttggaatagc 660 agcggcgttt gcagttgatt attacacctt catggctgct cgcttttttc ttgccatggt 720 tgcaagtggc tatcttgtgg tggggtttgt ctatgtgatg gaattcattg gcatgaagtc 780 tcggacatgg gcgtctgtcc atttgcattc cttttttgca gttggaaccc tgctggtggc 840 tttgacagga tacttggtca ggacctggtg gctttaccag atgatcctct ccacagtgac 900 tgtccccttt atcctgtgct gttgggtgct cccagagaca cctttttggc ttctctcaga 960 gggacgatat gaagaagcac aaaaaatagt tgacatcatg gccaagtgga acagggcaag 1020 ctcctgtaaa ctgtcagaac ttttatcact ggacctacaa ggtcctgtta gtaatagccc 1080 cactgaagtt cagaagcaca acctatcata tctgttttat aactggagca ttacgaaaag 1140 gacacttacc gtttggctaa tctggttcac tggaagtttg ggattctact cgttttcctt 1200 gaattctgtt aacttaggag gcaatgaata cttaaacctc ttcctcctgg gtgtagtgga 1260 aattcccgcc tacaccttcg tgtgcatcgc catggacaag gtcgggagga gaacagtcct 1320 ggcctactct cttttctgca gtgcactggc ctgtggtgtc gttatggtga tcccccagaa 1380 acattatatt ttgggtgtgg tgacagctat ggttggaaaa tttgccatcg gggcagcatt 1440 tggcctcatt tatctttata cagctgagct gtatccaacc attgtaagat cgctggctgt 1500 gggaagcggc agcatggtgt gtcgcctggc cagcatcctg gcgccgttct ctgtggacct 1560 cagcagcatt tggatcttca taccacagtt gtttgttggg actatggccc tcctgagtgg 1620 agtgttaaca ctaaagcttc cagaaaccct tgggaaacgg ctagcaacta cttgggagga 1680 ggctgcaaaa ctggagtcag agaatgaaag caagtcaagc aaattacttc tcacaactaa 1740 taatagtggg ctggaaaaaa cggaagcgat tacccccagg gattctggtc ttggtgaata 1800 aatgtgccat gcctgctgtc tagcacctga aatattattt accctaatgc ctttgtatta 1860 gaggaatctt attctcatct cccatatgtt gtttgtatgt ctttttaata aattttgtaa 1920 gaaaatttta aagcaaatat gttataaaag aaataaaaac taagatgaaa aaaaaaaaaa 1980 aaa 1983 <210> 14 <211> 577 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Gly Ser Arg His Phe Glu Gly Ile Tyr Asp His Val Gly His Phe 1 5 10 15 Gly Arg Phe Gln Arg Val Leu Tyr Phe Ile Cys Ala Phe Gln Asn Ile 20 25 30 Ser Cys Gly Ile His Tyr Leu Ala Ser Val Phe Met Gly Val Thr Pro 35 40 45 His His Val Cys Arg Pro Pro Gly Asn Val Ser Gln Val Val Phe His 50 55 60 Asn His Ser Asn Trp Ser Leu Glu Asp Thr Gly Ala Leu Leu Ser Ser 65 70 75 80 Gly Gln Lys Asp Tyr Val Thr Val Gln Leu Gln Asn Gly Glu Ile Trp 85 90 95 Glu Leu Ser Arg Cys Ser Arg Asn Lys Arg Glu Asn Thr Ser Ser Leu 100 105 110 Gly Tyr Glu Tyr Thr Gly Ser Lys Lys Glu Phe Pro Cys Val Asp Gly 115 120 125 Tyr Ile Tyr Asp Gln Asn Thr Trp Lys Ser Thr Ala Val Thr Gln Trp 130 135 140 Asn Leu Val Cys Asp Arg Lys Trp Leu Ala Met Leu Ile Gln Pro Leu 145 150 155 160 Phe Met Phe Gly Val Leu Leu Gly Ser Val Thr Phe Gly Tyr Phe Ser 165 170 175 Asp Arg Leu Gly Arg Arg Val Val Leu Trp Ala Thr Ser Ser Ser Met 180 185 190 Phe Leu Phe Gly Ile Ala Ala Ala Phe Ala Val Asp Tyr Tyr Thr Phe 195 200 205 Met Ala Ala Arg Phe Phe Leu Ala Met Val Ala Ser Gly Tyr Leu Val 210 215 220 Val Gly Phe Val Tyr Val Met Glu Phe Ile Gly Met Lys Ser Arg Thr 225 230 235 240 Trp Ala Ser Val His Leu His Ser Phe Phe Ala Val Gly Thr Leu Leu 245 250 255 Val Ala Leu Thr Gly Tyr Leu Val Arg Thr Trp Trp Leu Tyr Gln Met 260 265 270 Ile Leu Ser Thr Val Thr Val Pro Phe Ile Leu Cys Cys Trp Val Leu 275 280 285 Pro Glu Thr Pro Phe Trp Leu Leu Ser Glu Gly Arg Tyr Glu Glu Ala 290 295 300 Gln Lys Ile Val Asp Ile Met Ala Lys Trp Asn Arg Ala Ser Ser Cys 305 310 315 320 Lys Leu Ser Glu Leu Leu Ser Leu Asp Leu Gln Gly Pro Val Ser Asn 325 330 335 Ser Pro Thr Glu Val Gln Lys His Asn Leu Ser Tyr Leu Phe Tyr Asn 340 345 350 Trp Ser Ile Thr Lys Arg Thr Leu Thr Val Trp Leu Ile Trp Phe Thr 355 360 365 Gly Ser Leu Gly Phe Tyr Ser Phe Ser Leu Asn Ser Val Asn Leu Gly 370 375 380 Gly Asn Glu Tyr Leu Asn Leu Phe Leu Leu Gly Val Val Glu Ile Pro 385 390 395 400 Ala Tyr Thr Phe Val Cys Ile Ala Met Asp Lys Val Gly Arg Arg Thr 405 410 415 Val Leu Ala Tyr Ser Leu Phe Cys Ser Ala Leu Ala Cys Gly Val Val 420 425 430 Met Val Ile Pro Gln Lys His Tyr Ile Leu Gly Val Val Thr Ala Met 435 440 445 Val Gly Lys Phe Ala Ile Gly Ala Ala Phe Gly Leu Ile Tyr Leu Tyr 450 455 460 Thr Ala Glu Leu Tyr Pro Thr Ile Val Arg Ser Leu Ala Val Gly Ser 465 470 475 480 Gly Ser Met Val Cys Arg Leu Ala Ser Ile Leu Ala Pro Phe Ser Val 485 490 495 Asp Leu Ser Ser Ile Trp Ile Phe Ile Pro Gln Leu Phe Val Gly Thr 500 505 510 Met Ala Leu Leu Ser Gly Val Leu Thr Leu Lys Leu Pro Glu Thr Leu 515 520 525 Gly Lys Arg Leu Ala Thr Thr Trp Glu Glu Ala Ala Lys Leu Glu Ser 530 535 540 Glu Asn Glu Ser Lys Ser Ser Lys Leu Leu Leu Thr Thr Asn Asn Ser 545 550 555 560 Gly Leu Glu Lys Thr Glu Ala Ile Thr Pro Arg Asp Ser Gly Leu Gly 565 570 575 Glu <210> 15 <211> 5175 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 agcttctgcc ctgcctgctg tgtgcggagc cgtccagcga ccaccatggt gaggctcgtg 60 ctgcccaacc ccggcctaga cgcccggatc ccgtccctgg ctgagctgga gaccatcgag 120 caggaggagg ccagctcccg gccgaagtgg gacaacaagg cgcagtacat gctcacctgc 180 ctgggcttct gcgtgggcct cggcaacgtg tggcgcttcc cctacctgtg tcagagccac 240 ggaggaggag ccttcatgat cccgttcctc atcctgctgg tcctggaggg catccccctg 300 ctgtacctgg agttcgccat cgggcagcgg ctgcggcggg gcagcctggg tgtgtggagc 360 tccatccacc cggccctgaa gggcctaggc ctggcctcca tgctcacgtc cttcatggtg 420 ggactgtatt acaacaccat catctcctgg atcatgtggt acttattcaa ctccttccag 480 gagcctctgc cctggagcga ctgcccgctc aacgagaacc agacagggta tgtggacgag 540 tgcgccagga gctcccctgt ggactacttc tggtaccgag agacgctcaa catctccacg 600 tccatcagcg actcgggctc catccagtgg tggatgctgc tgtgcctggc ctgcgcatgg 660 agcgtcctgt acatgtgcac catccgcggc atcgagacca ccgggaaggc cgtgtacatc 720 acctccacgc tgccctatgt cgtcctgacc atcttcctca tccgaggcct gacgctgaag 780 ggcgccacca atggcatcgt cttcctcttc acgcccaacg tcacggagct ggcccagccg 840 gacacctggc tggacgcggg cgcacaggtc ttcttctcct tctccctggc cttcgggggc 900 ctcatctcct tctccagcta caactctgtg cacaacaact gcgagaagga ctcggtgatt 960 gtgtccatca tcaacggctt cacatcggtg tatgtggcca tcgtggtcta ctccgtcatt 1020 gggttccgcg ccacgcagcg ctacgacgac tgcttcagca cgaacatcct gaccctcatc 1080 aacgggttcg acctgcctga aggcaacgtg acccaggaga actttgtgga catgcagcag 1140 cggtgcaacg cctccgaccc cgcggcctac gcgcagctgg tgttccagac ctgcgacatc 1200 aacgccttcc tctcagaggc cgtggagggc acaggcctgg ccttcatcgt cttcaccgag 1260 gccatcacca agatgccgtt gtccccactg tggtctgtgc tcttcttcat tatgctcttc 1320 tgcctggggc tgtcatctat gtttgggaac atggagggcg tcgttgtgcc cctgcaggac 1380 ctcagagtca tccccccgaa gtggcccaag gaggtgctca caggcctcat ctgcctgggg 1440 acattcctca ttggcttcat cttcacgctg aactccggcc agtactggct ctccctgctg 1500 gacagctatg ccggctccat tcccctgctc atcatcgcct tctgcgagat gttctctgtg 1560 gtctacgtgt acggtgtgga caggttcaat aaggacatcg agttcatgat cggccacaag 1620 cccaacatct tctggcaagt cacgtggcgc gtggtcagcc ccctgctcat gctgatcatc 1680 ttcctcttct tcttcgtggt agaggtcagt caggagctga cctacagcat ctgggaccct 1740 ggctacgagg aatttcccaa atcccagaag atctcctacc cgaactgggt gtatgtggtg 1800 gtggtgattg tggctggagt gccctccctc accatccctg gctatgccat ctacaagctc 1860 atcaggaacc actgccagaa gccaggggac catcaggggc tggtgagcac actgtccaca 1920 gcctccatga acggggacct gaagtactga gaaggcccat cccacggcgt gccatacact 1980 ggtgtcaggg aaggaggaac cagcaagacc tgtggggtgg gggccgggct gcacctgcat 2040 gtgtgtaagc gtgagtgtat gctcgtgtgt gagtgtgtgt attgtacacg catgtgccat 2100 gtgtgcagat atgtatcgtg tgtgcatgta catgcatggg cactgtgagt gtgcacgtgt 2160 atgcacacat atacatgtgt gtgggtgtgt gtattgtatg tgcatgtgcc atgtgtgcag 2220 atgtgtcatg ttgtgtgtgt gcatgtacat gtatggacat tgtgtgagtg tgcaagtgtg 2280 catgcatata catgtgtgcg atatttgctg cccgtgtgtg tgcatgtata tatagacata 2340 catgcctatg ttgtgtgtgg tgtgcatatg tgtgaacaca cacgtgtata catgcatgca 2400 catgtgctcg tacaatgggt gtccacatgc acgtgtatat gtatatctgt gagtgtatat 2460 acatgcatgc aattgtgtgt atgtgtgttc tgtgtgtgcg tttgcaagta tatatgcaca 2520 tgtgtatatg tacatgtatg cctgtgtgac gtgtgtatat gtgagcatgt gtacgtgtgt 2580 gtatacgtgt gttgtgtata tgtgtgtgtc tgtacctgtt tgtgtatatg tgtgtgatgt 2640 gtgctcgtgt gtgtgcatat tcaggcaggt gtgcatttgt gcatcccagt gtgtatgtat 2700 gtgcgcatat ggacacgcat ggacacgcat atggacacat atggacacac atatggacac 2760 gtgtggatat gtgtgcgtac acgtcgctgg gacacatgcc tgccactcgg ggcccagctg 2820 accctctgtg tttgtccttg ccacagtcac ggggtgcatg tgcagagggg agcagaccac 2880 tggggacgtg ctgtgccctg cacgtgcccg ggggaagcgg aagctgcagc tggggtgggg 2940 gcagcacctc tatgcttcat ctctgtgggt ggcaggagac aaaagcacag ggtactatct 3000 tggctcctgg gagcgactct tgctacccac ccccacccat ccccttcccc ttggtgttga 3060 cctttgacct gggggttccc agagccctgt agccctcgac ccggagcagc ctctcggaag 3120 ccggagtggg cagttgctgg cgattctgag aaaacttggc cgcatccacc ggggccctgc 3180 ctccagtcgg ccgctgccga gtctctgcgt tctggccgct tcccggctta atgaatgcca 3240 gccatttaat cattgctcct gccaccacaa atagatgagc agttaaataa aactcaactt 3300 ggcataattc aaggcaaata ccactctgtg cattttctta agaggacatg agctgtgtga 3360 atttttagcc agcctttgga aaagatgggt tacagggtaa ctcaaccctg gctgccatcc 3420 ttgggcactg tgtgtgtcca gggcaccttg gaggaccgtg cagcccccag aagcttccag 3480 ctcccgcacc actcagtgaa gcccagcctg gcgcctgccc tgcccccgtc acgggatggg 3540 cccccattgg ggttcaacat tccatcgcag ccaaaggcag tcggcacttg ggacatctgc 3600 ttccacggac aggtcacctc cgctttgcac ggaagaatct ggatgcttac attaaactga 3660 tgttctgaga gttcctacgg acaggtcacc tccgctttgc atggaagaat ctggatgctt 3720 acattaaact ggtgttctga gagttcctac ggacaggtca cctccgcttt ccatagaaga 3780 atctggacgc ttacattaaa ctgatgttct gagaattcct acaggcagga ctgaaagcct 3840 ggtgtgtgcc agtatgatgt tccacccacg gaaacctggt cacaatcgtc ccttccagca 3900 ccccatccag cagtgactgc acacactgag ccccctacca gcccctttca ccctgctgac 3960 tgtcactggg ccctgggatg tgcaagactc cacagcagca gaggtggggg gacatatcac 4020 agcctctgcc cccggctgtg atgccaccga ggggctcgcc tgctgatggc ttcaacaggg 4080 tctcacctca tcttttcctg ctctttggcc ctggatcgag aaaatttcca tcagtgcccc 4140 attaatatgc tgccctgtgg catctgccca ggaggccctg ccaggcgtgc acaggtgtgc 4200 attggtgtac cctggcatgc acaggtgtgc actgatgtgc cctggcatcc attggtgtac 4260 cctggtgtgc ctgccatagg accctgggcg ggagctccca tctcatctac atctcctgat 4320 tcatgcgttg tttcataggt ttcaatgtct ctgtaaatgt ggtagaaatg caggctttat 4380 gggcataaag tgtacatttc taaataaatc ccttctattt agtatgctca ccctagaagt 4440 tactgttgtc cagacgtaga gggatgagtg agccagtgac ctcagacggg atggtgggga 4500 cggcaggtcc agctcctgcc tcctcctggg gggtctggct ttgggggctt gctccgaaga 4560 ggccatggcc caggcctgtg gcctcacaat ggggaccaac cagctcttct catcttcttc 4620 cctcacactt cctctcactc aaataagaac cttccaaaaa tgtgtccacc tgggcccctg 4680 ccctgggact catggatttg gagttgtggc cacacggttg aggggtgcag tgtccagtgg 4740 aatggggcaa ttgcgggcct gggggccctt ggcctgtccg tggcgggagc atctgcaagg 4800 aggagcccca gagtccaggg agcactgtgg ggagctcctt agagctgaac tcacccggcg 4860 tcaactcatc aaccctccac ccatggacag gggtgccccc agcacaggag aggactcagc 4920 cctctgcccc cacgcacggt gggtgcctgt caccctgtcc tgcccagcgg cccgagggca 4980 gcagtgggtg tgagggcagc ccccggcctc ccaagagcag ctgagaggat ccctgcggga 5040 atccgggctt cgggtgcatg cgatctgatc tgagttgttt ctgacagtga cagagtgaca 5100 atctataagt atctcaagat caaatggtta aataaaacat aagaaattta aaacgattaa 5160 aaaaaaaaaa aaaaa 5175

Claims (48)

  1. (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 4 또는 서열번호 15를 포함하는 핵산 분자에 의해 암호화되는 카르니틴 수송체를 제공하는 단계,
    (b) 시험 화합물을 제공하는 단계,
    (c) 기질인 카르니틴을 제공하는 단계,
    (d) 기질의 수송율을 측정함으로써 카르니틴 수송체의 활성을 측정하는 단계,
    (e) 시험 화합물의 부재 하에서 기질의 수송율을 측정하는 단계, 및
    (f) 단계 (d)에 따른 수송율을 단계 (e)에 따른 수송율과 비교하는 단계를 포함하는, 카르니틴 수송체 효능제 또는 길항제의 스크리닝 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 카르니틴 수송체가 지질 막에 포함되는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 카르니틴 수송체가 지질 소포 막에 포함되는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 카르니틴 수송체가 시험 세포의 원형질 막에 포함되는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 시험 세포가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 카르니틴 수송체를 암호화하는 핵산 분자를 발현하거나 서열번호 4 또는 서열번호 15를 포함하는 핵산 분자를 발현하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 시험 세포가 전사 활성화인자 서열에 작동적으로 연결된 서열번호 4 또는 서열번호 15를 포함하는 DNA 분자를 포함하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 시험 세포가 서열번호 4 또는 서열번호 15에 상응하는 서열을 포함하는 cRNA 분자를 포함하는 방법.
  9. 제6항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 시험 세포가 제노푸스 래비스 (Xenopus laevis) 난모세포인 방법.
  10. 제5항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 카르니틴 수송체가 기질을 지질 막을 가로질러 시험 세포 내로 수송하는 방법.
  11. 제1항 및 제3항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 검출가능한 기질, 방사성 기질, 스트렙타비딘-표지된 또는 바이오틴 표지된 기질 또는 항체와 반응하는 기질이 사용되는 방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제1항 및 제3항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 로봇식 시스템에서 수행되는 방법.
  15. (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 서열번호 4 또는 서열번호 15를 포함하는 핵산 분자에 의해 암호화되는 카르니틴 수송체를 포함하는 지질 막 및
    (b) 카르니틴 수송체에 대한 검출가능한 기질을 포함하는, 제1항 및 제3항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 따른 방법을 실시하기 위한 키트.
  16. 삭제
  17. 제15항에 있어서, 카르니틴 수송체가 지질 소포 막에 포함되는 키트.
  18. 제15항에 있어서, 카르니틴 수송체가 시험 세포의 원형질 막에 포함되는 키트.
  19. 삭제
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