JP2003511065A - 新規ヒトカリウムチャンネルサブユニット - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、カリウムチャンネルサブユニットＩｓＫ２をコードする新規ヒトＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列にコードされるタンパク質、該ＤＮＡ配列を含むベクター、該ベクターを含有する宿主細胞、ならびに該ヒトＩｓＫ２サブユニットを含有するカリウムチャンネルのインヒビターおよびアゴニストの同定方法に関する。
Description
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、カリウムチャンネルサブユニットをコードする新規ヒトＤＮＡ配列
、該ＤＮＡ配列にコードされるタンパク質、組換え細胞における該タンパク質の
発現方法、ならびに該サブユニットを含むカリウムチャンネルのアクチベーター
およびインヒビターの同定方法に関する。
、該ＤＮＡ配列にコードされるタンパク質、組換え細胞における該タンパク質の
発現方法、ならびに該サブユニットを含むカリウムチャンネルのアクチベーター
およびインヒビターの同定方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
電位依存性カリウムチャンネルは、細胞膜電位の変化に応答して開く膜貫通ポ
アを形成し、カリウムイオンを選択的に膜通過させる。電位依存性カリウムチャ
ンネルは、多数の細胞（例えば、ニューロン、筋細胞および膵β細胞）における
細胞膜電位の維持および活動電位の再分極の制御に関与することが示されている
。脱分極後、電位依存性カリウムチャンネルは開き、カリウム流出を可能にして
、膜の再分極を可能にする。この挙動のため、電位依存性カリウムチャンネルは
、種々の疾患に関連した薬物発見のための重要な標的となっている。その結果、
多数の電位依存性カリウムチャンネルが同定されており、多数がクローニングさ
れている。それらは、それらの一次アミノ酸配列、組織特異的発現パターン、な
らびに電気生理学的および薬理学的特性により区別されうる。電位依存性カリウ
ムチャンネルの総説としては、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，１９９７，Ｔｒｅｎｄｓ
Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１８：４７４−４８３；Ｊａｎ ＆ Ｊａｎ，１
９９７，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５０５：２６７−２８２；Ｃａｔｔｅｒａｌｌ，
１９９５，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：４９３−５３１を参照され
たい。
アを形成し、カリウムイオンを選択的に膜通過させる。電位依存性カリウムチャ
ンネルは、多数の細胞（例えば、ニューロン、筋細胞および膵β細胞）における
細胞膜電位の維持および活動電位の再分極の制御に関与することが示されている
。脱分極後、電位依存性カリウムチャンネルは開き、カリウム流出を可能にして
、膜の再分極を可能にする。この挙動のため、電位依存性カリウムチャンネルは
、種々の疾患に関連した薬物発見のための重要な標的となっている。その結果、
多数の電位依存性カリウムチャンネルが同定されており、多数がクローニングさ
れている。それらは、それらの一次アミノ酸配列、組織特異的発現パターン、な
らびに電気生理学的および薬理学的特性により区別されうる。電位依存性カリウ
ムチャンネルの総説としては、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，１９９７，Ｔｒｅｎｄｓ
Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１８：４７４−４８３；Ｊａｎ ＆ Ｊａｎ，１
９９７，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５０５：２６７−２８２；Ｃａｔｔｅｒａｌｌ，
１９９５，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：４９３−５３１を参照され
たい。
【０００３】
多数の機能的電位依存性カリウムチャンネルは、６個の膜貫通伸長セグメント
をそれぞれが含有する４個のαサブユニットの四量体であると考えられている。
四量体を構成するαサブユニットは同一であることもあれば（ホモ四量体の場合
）、異なることもある（ヘテロ四量体の場合）。該四量体を構成する膜伸長αサ
ブユニットは、該四量体の挙動を改変しうる追加的なβサブユニットを伴うこと
がある。
をそれぞれが含有する４個のαサブユニットの四量体であると考えられている。
四量体を構成するαサブユニットは同一であることもあれば（ホモ四量体の場合
）、異なることもある（ヘテロ四量体の場合）。該四量体を構成する膜伸長αサ
ブユニットは、該四量体の挙動を改変しうる追加的なβサブユニットを伴うこと
がある。
【０００４】
一方、他のタイプの電位依存性カリウムチャンネルは、追加的なタイプのサブ
ユニットを含有する少々異なる構造を有するらしい。特に、心臓活動電位の再分
極の一部を媒介するカリウムチャンネルは、２つの異なるサブユニット（ＫｖＱ
ＬＴ１およびｍｉｎＫ）のヘテロマーであり、遅く活性化する遅延整流カリウム
電流をもたらす（Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ ３８４
：８０−８３）。
ユニットを含有する少々異なる構造を有するらしい。特に、心臓活動電位の再分
極の一部を媒介するカリウムチャンネルは、２つの異なるサブユニット（ＫｖＱ
ＬＴ１およびｍｉｎＫ）のヘテロマーであり、遅く活性化する遅延整流カリウム
電流をもたらす（Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ ３８４
：８０−８３）。
【０００５】
ＫｖＱＬＴ１は、６個の疎水性膜伸長αヘリックスと典型的なカリウムチャン
ネルシグネチャー配列とを有するタンパク質である（Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉら
，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ ３８４：８０−８３；Ｈｅｇｉｎｂｏｔｈａｍら，
１９９４，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６６：１０６１−１０６７）。ＭｉｎＫは、単
一の膜貫通ドメインを有する小さな（１２９〜１３０アミノ酸）タンパク質であ
る（Ｔａｋｕｍｉら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０４２−１０４５
；Ｓｗａｎｓｏｎら，１９９３，Ｓｅｍ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５：１１７−１２
４）。ＫｖＱＬＴ１は単独でイオンチャンネルを形成しうるが、遅いゲーティン
グ速度論、小さな単位コンダクタンス、第２メッセンジャーに対する感受性、お
よびクラスＩＩＩ抗不整脈剤に対する親和性（天然ＩＫｓチャンネルにより示さ
れるもの）を有する複合体を生成するためにはｍｉｎＫの存在が必要である（Ｔ
ａｋｕｍｉら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０４２−１０４５；Ｇｏ
ｌｄｓｔｅｉｎ ＆ Ｍｉｌｌｅｒ，１９９１，Ｎｅｕｒｏｎ ７：４０３−４
０８；Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ ＆ Ｋａｃｚｍａｒｅｋ，１９９４，Ｊ．Ｎｅｕ
ｒｏｓｃｉ．１４：３０９７−３１０５；Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉら，１９９６
，Ｎａｔｕｒｅ ３８４：８０−８３；Ｂｕｓｃｈら，１９９７，Ｂｒ．Ｊ．Ｐ
ｈａｒｍａｃｏｌ．１２２：１８７−１８９；Ｓｅｓｔｉ ＆ Ｇｏｌｄｓｔｅ
ｉｎ，１９９８，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓ．１１２：６５１−６６４；Ｔａｉ ＆
Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ ３９１：６０５−６０８；Ｂ
ａｒｈａｎｉｎら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ ３８４：７８−８０）。
ネルシグネチャー配列とを有するタンパク質である（Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉら
，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ ３８４：８０−８３；Ｈｅｇｉｎｂｏｔｈａｍら，
１９９４，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６６：１０６１−１０６７）。ＭｉｎＫは、単
一の膜貫通ドメインを有する小さな（１２９〜１３０アミノ酸）タンパク質であ
る（Ｔａｋｕｍｉら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０４２−１０４５
；Ｓｗａｎｓｏｎら，１９９３，Ｓｅｍ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５：１１７−１２
４）。ＫｖＱＬＴ１は単独でイオンチャンネルを形成しうるが、遅いゲーティン
グ速度論、小さな単位コンダクタンス、第２メッセンジャーに対する感受性、お
よびクラスＩＩＩ抗不整脈剤に対する親和性（天然ＩＫｓチャンネルにより示さ
れるもの）を有する複合体を生成するためにはｍｉｎＫの存在が必要である（Ｔ
ａｋｕｍｉら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０４２−１０４５；Ｇｏ
ｌｄｓｔｅｉｎ ＆ Ｍｉｌｌｅｒ，１９９１，Ｎｅｕｒｏｎ ７：４０３−４
０８；Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ ＆ Ｋａｃｚｍａｒｅｋ，１９９４，Ｊ．Ｎｅｕ
ｒｏｓｃｉ．１４：３０９７−３１０５；Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉら，１９９６
，Ｎａｔｕｒｅ ３８４：８０−８３；Ｂｕｓｃｈら，１９９７，Ｂｒ．Ｊ．Ｐ
ｈａｒｍａｃｏｌ．１２２：１８７−１８９；Ｓｅｓｔｉ ＆ Ｇｏｌｄｓｔｅ
ｉｎ，１９９８，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓ．１１２：６５１−６６４；Ｔａｉ ＆
Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ ３９１：６０５−６０８；Ｂ
ａｒｈａｎｉｎら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ ３８４：７８−８０）。
【０００６】
もう１つのタイプの遅延整流カリウムチャンネル電流はＩＫｒ電流である。Ｉ Ｋｒ
電流は、タンパク質ｈ−ｅｒｇ（ヒトｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏ関連遺伝
子）がポア形成サブユニットであるカリウムチャンネルにより媒介される（Ｓａ
ｎｇｕｉｎｅｔｔｉら，１９９５，Ｃｅｌｌ ８１：２９９−３０７；Ｃｕｒｒ
ａｎら，１９９５，Ｃｅｌｌ ８０：７９５−８０３）。ＭｉｎＫもｈ−ｅｒｇ
と共集合して機能的心臓ＩＫｒチャンネルを形成しうる（ＭｃＤｏｎａｌｄら，
１９９７，Ｎａｔｕｒｅ ３８８：２８９−２９２）。
子）がポア形成サブユニットであるカリウムチャンネルにより媒介される（Ｓａ
ｎｇｕｉｎｅｔｔｉら，１９９５，Ｃｅｌｌ ８１：２９９−３０７；Ｃｕｒｒ
ａｎら，１９９５，Ｃｅｌｌ ８０：７９５−８０３）。ＭｉｎＫもｈ−ｅｒｇ
と共集合して機能的心臓ＩＫｒチャンネルを形成しうる（ＭｃＤｏｎａｌｄら，
１９９７，Ｎａｔｕｒｅ ３８８：２８９−２９２）。
【０００７】
公知サブユニットに関連した他の新規カリウムチャンネルサブユニット、特に
、限局化組織発現を示すものを見出すことが望ましい。そのような新規サブユニ
ットは薬物発見の魅力的な標的となり、イオンチャンネル生物学に関する更なる
詳細を理解するための重要な研究手段となろう。
、限局化組織発現を示すものを見出すことが望ましい。そのような新規サブユニ
ットは薬物発見の魅力的な標的となり、イオンチャンネル生物学に関する更なる
詳細を理解するための重要な研究手段となろう。
【０００８】
本発明者らによるＩｓＫ２遺伝子の発見後、Ａｂｂｏｔｔら，１９９９，Ｃｅ
ｌｌ ９７：１７５−１８７は、本明細書に開示するＩｓＫ２タンパク質と同じ
アミノ酸配列を有するＭｉＲＰ１と称される遺伝子のクローニングを報告した。
ｌｌ ９７：１７５−１８７は、本明細書に開示するＩｓＫ２タンパク質と同じ
アミノ酸配列を有するＭｉＲＰ１と称される遺伝子のクローニングを報告した。
【０００９】
（発明の概要）
本発明は、遅延整流カリウムチャンネルのｍｉｎＫサブユニットに類似したタ
ンパク質であるＩｓＫ２をコードする新規ヒトＤＮＡ配列に関する。本発明のＤ
ＮＡは、配列番号１および配列番号１の７９−４４７位として示すヌクレオチド
配列を含む。該新規ＤＮＡ配列にコードされるタンパク質も提供する。該タンパ
ク質は、配列番号２として示すアミノ酸配列およびその断片を含む。組換え系に
おける該新規サブユニットタンパク質の発現方法、ならびに該サブユニットタン
パク質を含むカリウムチャンネルのアクチベーターおよびインヒビターの同定方
法を提供する。
ンパク質であるＩｓＫ２をコードする新規ヒトＤＮＡ配列に関する。本発明のＤ
ＮＡは、配列番号１および配列番号１の７９−４４７位として示すヌクレオチド
配列を含む。該新規ＤＮＡ配列にコードされるタンパク質も提供する。該タンパ
ク質は、配列番号２として示すアミノ酸配列およびその断片を含む。組換え系に
おける該新規サブユニットタンパク質の発現方法、ならびに該サブユニットタン
パク質を含むカリウムチャンネルのアクチベーターおよびインヒビターの同定方
法を提供する。
【００１０】
（図面の簡単な記載）
図１Ａは、ＩｓＫ２をコードするＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。開始ＡＴ
Ｇコドンは７９−８１位であり、終結コドンは４４８−４５０位である。図１Ｂ
は、ＩｓＫ２サブユニットの推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
Ｇコドンは７９−８１位であり、終結コドンは４４８−４５０位である。図１Ｂ
は、ＩｓＫ２サブユニットの推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【００１１】
図２は、ＩｓＫ２（配列番号２）とヒトｍｉｎＫ（配列番号３）とのアミノ酸
配列アライメントを示す。
配列アライメントを示す。
【００１２】
図３Ａ〜Ｆは、ヒトの胃におけるＩｓＫ２発現のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイ
ゼーション／免疫組織化学的局在化研究を示す。図３Ａ〜Ｃは、同じ組織切片を
示す。図３Ａは、ビオチンで標識されＴｅｘａｓ Ｒｅｄで検出された、ＩｓＫ
２遺伝子からのｍＲＮＡ転写産物に特異的なリボヌクレオチドプローブでのｉｎ
ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示し、ＩｓＫ２ ｍＲＮＡを発現する細胞
は赤色で出現する。図３Ｂは、図３Ａと同じ細胞の免疫組織化学を示すが、この
場合には、ガストリンに特異的な抗体で可視化されており、ＦＩＴＣ共役二次抗
体で検出されている。ガストリンペプチドを発現する細胞は緑色で出現する。図
３Ａにおける赤染色のパターンは図３Ｂにおける緑染色のパターンと同じである
と理解され、このことは、ＩｓＫ２を発現する同じ細胞がガストリンをも発現す
ることを示している。これは、ＩｓＫ２およびガストリンの両方に関して該細胞
が同時に染色される結果を示す図３Ｃにおいて確認される。この場合、該細胞は
黄色（赤と緑との組合せ）で出現し、この場合にも、このことは、該細胞がＩｓ
ｋ２およびガストリンの両方を発現することを示している。図３Ｄは、ＩｓＫ２
およびガストリンに関して染色された胃細胞の別の領域を示す。この場合にも、
唯一の染色細胞は黄色で出現する。図３Ｅは、ＩｓＫ２およびソマトスタチンに
関して染色された（ソマトスタチンに対する抗体を使用し、ＦＩＴＣ共役二次抗
体で検出された）胃細胞の別の領域を示す。この場合、ＩｓＫ２を発現する細胞
（赤色に染色されている）は、ソマトスタチンを発現する細胞（緑色に染色され
ている）とは異なる。図３Ｆは、ＩｓＫ２およびサブスタンスＰの両方に関して
染色された（サブスタンスＰに対する抗体を使用し、ＦＩＴＣ共役二次抗体で検
出された）胃細胞の別の領域を示す。この場合、ＩｓＫ２を発現する細胞（赤色
に染色されている）は、サブスタンスＰを発現する細胞（緑色に染色されている
）とは異なる。
ゼーション／免疫組織化学的局在化研究を示す。図３Ａ〜Ｃは、同じ組織切片を
示す。図３Ａは、ビオチンで標識されＴｅｘａｓ Ｒｅｄで検出された、ＩｓＫ
２遺伝子からのｍＲＮＡ転写産物に特異的なリボヌクレオチドプローブでのｉｎ
ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示し、ＩｓＫ２ ｍＲＮＡを発現する細胞
は赤色で出現する。図３Ｂは、図３Ａと同じ細胞の免疫組織化学を示すが、この
場合には、ガストリンに特異的な抗体で可視化されており、ＦＩＴＣ共役二次抗
体で検出されている。ガストリンペプチドを発現する細胞は緑色で出現する。図
３Ａにおける赤染色のパターンは図３Ｂにおける緑染色のパターンと同じである
と理解され、このことは、ＩｓＫ２を発現する同じ細胞がガストリンをも発現す
ることを示している。これは、ＩｓＫ２およびガストリンの両方に関して該細胞
が同時に染色される結果を示す図３Ｃにおいて確認される。この場合、該細胞は
黄色（赤と緑との組合せ）で出現し、この場合にも、このことは、該細胞がＩｓ
ｋ２およびガストリンの両方を発現することを示している。図３Ｄは、ＩｓＫ２
およびガストリンに関して染色された胃細胞の別の領域を示す。この場合にも、
唯一の染色細胞は黄色で出現する。図３Ｅは、ＩｓＫ２およびソマトスタチンに
関して染色された（ソマトスタチンに対する抗体を使用し、ＦＩＴＣ共役二次抗
体で検出された）胃細胞の別の領域を示す。この場合、ＩｓＫ２を発現する細胞
（赤色に染色されている）は、ソマトスタチンを発現する細胞（緑色に染色され
ている）とは異なる。図３Ｆは、ＩｓＫ２およびサブスタンスＰの両方に関して
染色された（サブスタンスＰに対する抗体を使用し、ＦＩＴＣ共役二次抗体で検
出された）胃細胞の別の領域を示す。この場合、ＩｓＫ２を発現する細胞（赤色
に染色されている）は、サブスタンスＰを発現する細胞（緑色に染色されている
）とは異なる。
【００１３】
図４Ａ〜Ｆは、種々のヒト組織におけるＩｓＫ２（図４Ａ）、ＫｖＬＱＴ１（
図４Ｂ）、ＫＣＮＱ２（図４Ｃ）、ＫＣＮＱ３（図４Ｄ）、ＫＣＮＱ４（図４Ｅ
）およびｈ−ｅｒｇ（図４Ｆ）の発現のノーザンブロット分析を示す。
図４Ｂ）、ＫＣＮＱ２（図４Ｃ）、ＫＣＮＱ３（図４Ｄ）、ＫＣＮＱ４（図４Ｅ
）およびｈ−ｅｒｇ（図４Ｆ）の発現のノーザンブロット分析を示す。
【００１４】
図５Ａ〜Ｅは、ヒトの胃におけるＩｓＫ２および他のカリウムチャンネルサブ
ユニットの発現の二重ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション局在化研究を示す
。ＩｓＫ２遺伝子からのｍＲＮＡ転写産物に特異的なリボヌクレオチドプローブ
を、ビオチンで標識し、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄで検出した。ＩｓＫ２ ｍＲＮＡを
発現する細胞は赤色で出現する。その他のカリウムチャンネルサブユニットから
のｍＲＮＡ転写産物はＦＩＴＣで可視化したため、緑色で出現する。Ｉｓｋ２と
もう１つのサブユニットとを共発現する細胞は黄色（赤と緑との組合せ）で出現
する。図５Ａは、Ｉｓｋ２およびＫＣＮＨ２（ｈｅｒｇ）に特異的なプローブを
使用した場合の結果を示し、黄色の細胞は認められない。図５Ｂは、Ｉｓｋ２お
よびＫＣＮＱ４に特異的なプローブを使用した場合の結果を示し、黄色の細胞は
認められない。図５Ｃは、Ｉｓｋ２およびＫＣＮＱ１（ＫｖＬＱＴ１）に特異的
なプローブを使用した場合の結果を示す。図５Ｄは図５Ｃの拡大図であり、多数
の黄色の細胞が明らかであり、このことは、それらの細胞におけるＩｓｋ２およ
びＫＣＮＱ１の共発現を示しており、Ｉｓｋ２およびＫＣＮＱ１が共集合してそ
れらの細胞においてヘテロマーカリウムチャンネルを形成しうることを示唆して
いる。図５Ｅは、Ｉｓｋ２およびＫＣＮＱ１に特異的なプローブを使用して得ら
れた胃細胞の別の領域であり、この場合にも、多数の黄色の細胞が認められる。
ユニットの発現の二重ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション局在化研究を示す
。ＩｓＫ２遺伝子からのｍＲＮＡ転写産物に特異的なリボヌクレオチドプローブ
を、ビオチンで標識し、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄで検出した。ＩｓＫ２ ｍＲＮＡを
発現する細胞は赤色で出現する。その他のカリウムチャンネルサブユニットから
のｍＲＮＡ転写産物はＦＩＴＣで可視化したため、緑色で出現する。Ｉｓｋ２と
もう１つのサブユニットとを共発現する細胞は黄色（赤と緑との組合せ）で出現
する。図５Ａは、Ｉｓｋ２およびＫＣＮＨ２（ｈｅｒｇ）に特異的なプローブを
使用した場合の結果を示し、黄色の細胞は認められない。図５Ｂは、Ｉｓｋ２お
よびＫＣＮＱ４に特異的なプローブを使用した場合の結果を示し、黄色の細胞は
認められない。図５Ｃは、Ｉｓｋ２およびＫＣＮＱ１（ＫｖＬＱＴ１）に特異的
なプローブを使用した場合の結果を示す。図５Ｄは図５Ｃの拡大図であり、多数
の黄色の細胞が明らかであり、このことは、それらの細胞におけるＩｓｋ２およ
びＫＣＮＱ１の共発現を示しており、Ｉｓｋ２およびＫＣＮＱ１が共集合してそ
れらの細胞においてヘテロマーカリウムチャンネルを形成しうることを示唆して
いる。図５Ｅは、Ｉｓｋ２およびＫＣＮＱ１に特異的なプローブを使用して得ら
れた胃細胞の別の領域であり、この場合にも、多数の黄色の細胞が認められる。
【００１５】
（発明の詳細な記載）
本発明の目的においては、「他のタンパク質を実質的に含有しない」は、他の
タンパク質から少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％、
より一層好ましくは９９．９％フリーである（すなわち、かかる割合分は他のタ
ンパク質を含有しない）ことを意味する。したがって、他のタンパク質を実質的
に含有しないヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質調製物は、その全タンパク質
に対する割合として、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以
下、より一層好ましくは０．１％以下の、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質
でないタンパク質を含有するであろう。ある与えられたヒトＩｓＫ２サブユニッ
トタンパク質調製物が他のタンパク質を実質的に含有しないか否かは、適当な検
出方法（例えば、銀染色または免疫ブロット法）と組合せた例えばドデシル硫酸
ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）などのタンパ
ク質純度を評価する通常の技術により判定することができる。
タンパク質から少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％、
より一層好ましくは９９．９％フリーである（すなわち、かかる割合分は他のタ
ンパク質を含有しない）ことを意味する。したがって、他のタンパク質を実質的
に含有しないヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質調製物は、その全タンパク質
に対する割合として、１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以
下、より一層好ましくは０．１％以下の、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質
でないタンパク質を含有するであろう。ある与えられたヒトＩｓＫ２サブユニッ
トタンパク質調製物が他のタンパク質を実質的に含有しないか否かは、適当な検
出方法（例えば、銀染色または免疫ブロット法）と組合せた例えばドデシル硫酸
ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）などのタンパ
ク質純度を評価する通常の技術により判定することができる。
【００１６】
「他の核酸を実質的に含有しない」は、他の核酸から少なくとも９０％、好ま
しくは９５％、より好ましくは９９％、より一層好ましくは９９．９％フリーで
あることを意味する。したがって、他の核酸を実質的に含有しないヒトＩｓＫ２
サブユニットＤＮＡ調製物は、その全核酸に対する割合として、１０％以下、好
ましくは５％以下、より好ましくは１％以下、より一層好ましくは０．１％以下
の、ヒトＩｓＫ２をコードしない核酸を含有するであろう。ある与えられたヒト
ＩｓＫ２サブユニットＤＮＡ調製物が他の核酸を実質的に含有しないか否かは、
適当な染色方法（例えば、臭化エチジウム染色）と組合せた例えばアガロースゲ
ル電気泳動などの核酸純度を評価する通常の技術により、または配列決定により
判定することができる。
しくは９５％、より好ましくは９９％、より一層好ましくは９９．９％フリーで
あることを意味する。したがって、他の核酸を実質的に含有しないヒトＩｓＫ２
サブユニットＤＮＡ調製物は、その全核酸に対する割合として、１０％以下、好
ましくは５％以下、より好ましくは１％以下、より一層好ましくは０．１％以下
の、ヒトＩｓＫ２をコードしない核酸を含有するであろう。ある与えられたヒト
ＩｓＫ２サブユニットＤＮＡ調製物が他の核酸を実質的に含有しないか否かは、
適当な染色方法（例えば、臭化エチジウム染色）と組合せた例えばアガロースゲ
ル電気泳動などの核酸純度を評価する通常の技術により、または配列決定により
判定することができる。
【００１７】
「同類アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基が、化学的に類似した別のアミノ
酸残基により置換されることを意味する。そのような同類置換の具体例としては
、疎水性残基（イソロイシン、ロイシン、バリンまたはメチオニン）間での置換
、ある極性残基を同じ電荷の別の極性残基で置換すること（例えば、リシンから
アルギニンへの、アスパラギン酸からグルタミン酸への置換）、芳香族アミノ酸
（トリプトファン、チロシンまたはフェニルアラニン）間での置換が挙げられる
。
酸残基により置換されることを意味する。そのような同類置換の具体例としては
、疎水性残基（イソロイシン、ロイシン、バリンまたはメチオニン）間での置換
、ある極性残基を同じ電荷の別の極性残基で置換すること（例えば、リシンから
アルギニンへの、アスパラギン酸からグルタミン酸への置換）、芳香族アミノ酸
（トリプトファン、チロシンまたはフェニルアラニン）間での置換が挙げられる
。
【００１８】
あるポリペプチドが「ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質と実質的に同じ生
物活性」を有するのは、そのポリペプチドが別のカリウムチャンネルサブユニッ
トと一緒になって、機能的カリウムチャンネルを構成する複合体を形成すること
が可能であり、該ＩｓＫ２タンパク質がその別のサブユニットに付与する電気生
理学的または薬理学的特性に類似した（その別のサブユニット単体と比較して）
変化した電気生理学的または薬理学的特性を該ポリペプチドが該複合体に付与し
、該ポリペプチドが、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどの標準的なプログラムに
より測定された場合に配列番号２と少なくとも約５０％同一であるアミノ酸配列
を有する場合である。該ポリペプチドが一緒になりうる別のカリウムチャンネル
サブユニットの具体例としては、ＫｖＱＬＴ１、ＫｖＬＱＴ２、ＫｖＬＱＴ３、
ＫｖＬＱＴ４、ＫｖＬＱＴ５およびｈ−ｅｒｇが挙げられる。
物活性」を有するのは、そのポリペプチドが別のカリウムチャンネルサブユニッ
トと一緒になって、機能的カリウムチャンネルを構成する複合体を形成すること
が可能であり、該ＩｓＫ２タンパク質がその別のサブユニットに付与する電気生
理学的または薬理学的特性に類似した（その別のサブユニット単体と比較して）
変化した電気生理学的または薬理学的特性を該ポリペプチドが該複合体に付与し
、該ポリペプチドが、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどの標準的なプログラムに
より測定された場合に配列番号２と少なくとも約５０％同一であるアミノ酸配列
を有する場合である。該ポリペプチドが一緒になりうる別のカリウムチャンネル
サブユニットの具体例としては、ＫｖＱＬＴ１、ＫｖＬＱＴ２、ＫｖＬＱＴ３、
ＫｖＬＱＴ４、ＫｖＬＱＴ５およびｈ−ｅｒｇが挙げられる。
【００１９】
本発明は、ヒトＩｓＫ２タンパク質をコードするＤＮＡの同定およびクローニ
ングに関する。ゲノムＤＮＡおよびＥＳＴデータベースの検索において、ＩｓＫ
タンパク質に対する相同性を有するタンパク質をコードするクローンとして、ｃ
ＤＮＡを同定した。該ＩｓＫタンパク質（ｍｉｎＫとしても公知である）は、心
臓Ｋ＋電流（ＩＫｒおよびＩＫｓ）の再分極を引き起こす２つのカリウムチャン
ネルのサブユニットである。該ＩｓＫタンパク質に対するその相同性を考慮して
、該ｃＤＮＡにコードされるタンパク質をＩｓＫ２と命名した。ＩｓＫ２の発現
パターンのノーザンブロット分析は、ヒトの胃における強力な発現、および結腸
および小腸における非常に弱い発現を示し、試験した他のいずれの組織において
も、発現は全く検出されなかった（図４Ａ）。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼー
ションおよび免疫組織化学による更に詳細な分析は、ヒトの胃におけるこのチャ
ンネルタンパク質の発現が主としてＧ細胞（すなわち、胃のガストリン分泌細胞
；図３Ａ〜Ｆを参照されたい）におけるものであり、胃平滑筋においても非常に
少量の発現が認められることを示した。
ングに関する。ゲノムＤＮＡおよびＥＳＴデータベースの検索において、ＩｓＫ
タンパク質に対する相同性を有するタンパク質をコードするクローンとして、ｃ
ＤＮＡを同定した。該ＩｓＫタンパク質（ｍｉｎＫとしても公知である）は、心
臓Ｋ＋電流（ＩＫｒおよびＩＫｓ）の再分極を引き起こす２つのカリウムチャン
ネルのサブユニットである。該ＩｓＫタンパク質に対するその相同性を考慮して
、該ｃＤＮＡにコードされるタンパク質をＩｓＫ２と命名した。ＩｓＫ２の発現
パターンのノーザンブロット分析は、ヒトの胃における強力な発現、および結腸
および小腸における非常に弱い発現を示し、試験した他のいずれの組織において
も、発現は全く検出されなかった（図４Ａ）。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼー
ションおよび免疫組織化学による更に詳細な分析は、ヒトの胃におけるこのチャ
ンネルタンパク質の発現が主としてＧ細胞（すなわち、胃のガストリン分泌細胞
；図３Ａ〜Ｆを参照されたい）におけるものであり、胃平滑筋においても非常に
少量の発現が認められることを示した。
【００２０】
染色体マッピング研究は、ＩｓＫ２遺伝子が、逆配向の該ＩｓＫ遺伝子の約８
０ｋｂ以内で且つ同一染色体上、２１ｑ２２．１にマッピングされることを示し
ている。
０ｋｂ以内で且つ同一染色体上、２１ｑ２２．１にマッピングされることを示し
ている。
【００２１】
本発明は、ヒトＩｓＫ２サブユニットをコードする、他の核酸を実質的に含有
しないＤＮＡを提供する。本発明はまた、ヒトＩｓＫ２サブユニットをコードす
る単離された及び／又は組換えＤＮＡ分子を提供する。本発明は、配列番号１に
示すヌクレオチド配列を含む、他の核酸を実質的に含有しないＤＮＡ分子を提供
する。
しないＤＮＡを提供する。本発明はまた、ヒトＩｓＫ２サブユニットをコードす
る単離された及び／又は組換えＤＮＡ分子を提供する。本発明は、配列番号１に
示すヌクレオチド配列を含む、他の核酸を実質的に含有しないＤＮＡ分子を提供
する。
【００２２】
本発明は、配列番号１のコード領域を含む単離されたＤＮＡ分子および他の核
酸を実質的に含有しないＤＮＡ分子を含む。したがって、本発明は、配列番号１
の７９−４４７位（コード配列）を含む配列を有する単離されたＤＮＡ分子およ
び他の核酸を実質的に含有しないＤＮＡ分子を含む。
酸を実質的に含有しないＤＮＡ分子を含む。したがって、本発明は、配列番号１
の７９−４４７位（コード配列）を含む配列を有する単離されたＤＮＡ分子およ
び他の核酸を実質的に含有しないＤＮＡ分子を含む。
【００２３】
また、配列番号１の７９−４４７位を含むヌクレオチド配列を有する組換えＤ
ＮＡ分子も含まれる。ヒトＩｓＫ２サブユニットをコードする本発明の新規ＤＮ
Ａ配列は、全体的または部分的に、他のＤＮＡ配列（すなわち、ヒトＩｓＫ２サ
ブユニットが天然では結合していないＤＮＡ配列）と結合して、ヒトＩｓＫ２サ
ブユニットをコードする「組換えＤＮＡ分子」を形成しうる。そのような他の配
列は、転写または翻訳を制御するＤＮＡ配列、例えば、翻訳開始配列、ＩＲＥＳ
（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅｓ）、ＲＮＡポ
リメラーゼＩＩのプロモーター、転写または翻訳終結配列、エンハンサー配列、
微生物における複製を制御する配列、抗生物質耐性を付与する配列、またはポリ
ペプチド「タグ」（例えば、ポリヒスチジン領域、ＦＬＡＧエピトープ、ｍｙｃ
エピトープ）をコードする配列を含みうる。本発明の新規ＤＮＡ配列は、プラス
ミド、コスミド、ウイルスベクター、Ｐ１人工染色体、酵母人工染色体などのベ
クター内に挿入することができる。
ＮＡ分子も含まれる。ヒトＩｓＫ２サブユニットをコードする本発明の新規ＤＮ
Ａ配列は、全体的または部分的に、他のＤＮＡ配列（すなわち、ヒトＩｓＫ２サ
ブユニットが天然では結合していないＤＮＡ配列）と結合して、ヒトＩｓＫ２サ
ブユニットをコードする「組換えＤＮＡ分子」を形成しうる。そのような他の配
列は、転写または翻訳を制御するＤＮＡ配列、例えば、翻訳開始配列、ＩＲＥＳ
（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅｓ）、ＲＮＡポ
リメラーゼＩＩのプロモーター、転写または翻訳終結配列、エンハンサー配列、
微生物における複製を制御する配列、抗生物質耐性を付与する配列、またはポリ
ペプチド「タグ」（例えば、ポリヒスチジン領域、ＦＬＡＧエピトープ、ｍｙｃ
エピトープ）をコードする配列を含みうる。本発明の新規ＤＮＡ配列は、プラス
ミド、コスミド、ウイルスベクター、Ｐ１人工染色体、酵母人工染色体などのベ
クター内に挿入することができる。
【００２４】
本発明には、高いストリンジェンシーの条件下で配列番号１にハイブリダイズ
するＤＮＡ配列が含まれる。例えば、高いストリンジェンシーの条件を用いる方
法としては、以下のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。ＤＮ
Ａを含有するフィルターのプレハイブリダイゼーションを、６×ＳＳＣ、５×デ
ンハルト液および１００μｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡを含むバッファー中、
６５℃で２時間〜一晩行なう。１００μｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡおよび５
〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含有するプレハイブリダイゼーシ
ョン混合物中、フィルターを６５℃で１２〜４８時間ハイブリダイズさせる。２
×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを含有する溶液中、３７℃で１時間、フィルターの
洗浄を行なう。この後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で４５分間
の洗浄を行ない、ついでオートラジオグラフィーに付す。
するＤＮＡ配列が含まれる。例えば、高いストリンジェンシーの条件を用いる方
法としては、以下のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。ＤＮ
Ａを含有するフィルターのプレハイブリダイゼーションを、６×ＳＳＣ、５×デ
ンハルト液および１００μｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡを含むバッファー中、
６５℃で２時間〜一晩行なう。１００μｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡおよび５
〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含有するプレハイブリダイゼーシ
ョン混合物中、フィルターを６５℃で１２〜４８時間ハイブリダイズさせる。２
×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを含有する溶液中、３７℃で１時間、フィルターの
洗浄を行なう。この後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で４５分間
の洗浄を行ない、ついでオートラジオグラフィーに付す。
【００２５】
高いストリンジェンシーの条件を用いる他の方法は、５×ＳＳＣ、５×デンハ
ルト液、５０％ ホルムアミド中、４２℃で１２〜４８時間行なうハイブリダイ
ゼーション、または０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ ＳＤＳ中、６５℃で３０〜６
０分間行なう洗浄工程を含むであろう。
ルト液、５０％ ホルムアミド中、４２℃で１２〜４８時間行なうハイブリダイ
ゼーション、または０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ ＳＤＳ中、６５℃で３０〜６
０分間行なう洗浄工程を含むであろう。
【００２６】
高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを行なうための前記方法で
挙げた試薬は当技術分野でよく知られている。これらの試薬の組成の詳細は、例
えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，１９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ ｌ ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓに記載されている。前記のもの以外の使用可能な他の高いストリンジ
ェンシー条件は当技術分野でよく知られている。
挙げた試薬は当技術分野でよく知られている。これらの試薬の組成の詳細は、例
えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，１９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ ｌ ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓに記載されている。前記のもの以外の使用可能な他の高いストリンジ
ェンシー条件は当技術分野でよく知られている。
【００２７】
遺伝暗号の縮重のため、２種のアミノ酸を除く全てのアミノ酸に関しては、２
以上のコドンが１つの特定のアミノ酸をコードする。このため、配列番号１のヌ
クレオチド配列とは有意に異なるが配列番号１と同じヒトＩｓＫ２サブユニット
タンパク質を尚もコードする合成ＤＮＡヌクレオチド配列を有するヒトＩｓＫ２
サブユニットタンパク質コード化合成ＤＮＡの構築が可能となる。そのような合
成ＤＮＡは本発明の範囲内にあると意図される。
以上のコドンが１つの特定のアミノ酸をコードする。このため、配列番号１のヌ
クレオチド配列とは有意に異なるが配列番号１と同じヒトＩｓＫ２サブユニット
タンパク質を尚もコードする合成ＤＮＡヌクレオチド配列を有するヒトＩｓＫ２
サブユニットタンパク質コード化合成ＤＮＡの構築が可能となる。そのような合
成ＤＮＡは本発明の範囲内にあると意図される。
【００２８】
配列番号１の突然変異形態は本発明の範囲内にあると意図される。特に、野生
型Ｉｓｋ２タンパク質と別のカリウムチャンネルサブユニットとの組合せにより
形成されるカリウムチャンネルと比較して改変された電位感受性、電流伝達特性
、薬理学的特性または他の特性を有するカリウムチャンネルを前記の別のカリウ
ムチャンネルサブユニットと一緒になった場合に与えるタンパク質をコードする
配列番号１の突然変異形態は、本発明の範囲内にあると意図される。そのような
突然変異形態は、ヌクレオチドの欠失、置換または付加を有することにより、配
列番号１とは異なりうる。
型Ｉｓｋ２タンパク質と別のカリウムチャンネルサブユニットとの組合せにより
形成されるカリウムチャンネルと比較して改変された電位感受性、電流伝達特性
、薬理学的特性または他の特性を有するカリウムチャンネルを前記の別のカリウ
ムチャンネルサブユニットと一緒になった場合に与えるタンパク質をコードする
配列番号１の突然変異形態は、本発明の範囲内にあると意図される。そのような
突然変異形態は、ヌクレオチドの欠失、置換または付加を有することにより、配
列番号１とは異なりうる。
【００２９】
また、配列番号１に対応する配列を有するＲＮＡ分子も、本発明の範囲内にあ
ると意図される。配列番号１の逆相補体であるアンチセンスヌクレオチド、ＤＮ
ＡもしくはＲＮＡまたはそれらの一部も、本発明の範囲内である。また、少数の
位置が非天然または修飾ヌクレオチド（例えば、イノシン、メチル−シトシンま
たはデアザ−グアノシン）で置換された配列番号１に基づくポリヌクレオチドは
、本発明の範囲内にあると意図される。本発明のポリヌクレオチドはまた、該ヌ
クレオチド間に非天然連結が存在する配列番号１に基づく配列を含みうる。その
ような非天然連結は、例えば、メチルホスホナート、ホスホロチオアート、ホス
ホロジチオナート、ホスホロアミジットおよびリン酸エステルでありうる。本発
明のポリヌクレオチドはまた、ヌクレオチド間の架橋としてデ−ホスホ連結、例
えばシロキサン、カルボナート、カルボキシメチルエステル、アセトアミダート
、カルバマートおよびチオエーテル架橋を有する配列番号１に基づく配列を含み
うる。存在しうる他のヌクレオチド間連結は、Ｎ−ビニル、メタクリルオキシエ
チル、メタクリルアミドまたはエチレンイミン連結を含む。配列番号１に基づく
ペプチド核酸も本発明に含まれる。
ると意図される。配列番号１の逆相補体であるアンチセンスヌクレオチド、ＤＮ
ＡもしくはＲＮＡまたはそれらの一部も、本発明の範囲内である。また、少数の
位置が非天然または修飾ヌクレオチド（例えば、イノシン、メチル−シトシンま
たはデアザ−グアノシン）で置換された配列番号１に基づくポリヌクレオチドは
、本発明の範囲内にあると意図される。本発明のポリヌクレオチドはまた、該ヌ
クレオチド間に非天然連結が存在する配列番号１に基づく配列を含みうる。その
ような非天然連結は、例えば、メチルホスホナート、ホスホロチオアート、ホス
ホロジチオナート、ホスホロアミジットおよびリン酸エステルでありうる。本発
明のポリヌクレオチドはまた、ヌクレオチド間の架橋としてデ−ホスホ連結、例
えばシロキサン、カルボナート、カルボキシメチルエステル、アセトアミダート
、カルバマートおよびチオエーテル架橋を有する配列番号１に基づく配列を含み
うる。存在しうる他のヌクレオチド間連結は、Ｎ−ビニル、メタクリルオキシエ
チル、メタクリルアミドまたはエチレンイミン連結を含む。配列番号１に基づく
ペプチド核酸も本発明に含まれる。
【００３０】
本発明のもう１つの態様は、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質をコードす
るＤＮＡ配列を含有および／または発現するように操作された宿主細胞を含む。
ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を産生させるために、そのような組換え宿
主細胞を適当な条件下で培養することができる。組換え宿主細胞内でヒトＩｓＫ
２サブユニットタンパク質を発現させるために、ヒトＩｓＫ２サブユニットタン
パク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを使用することができる。組
換え宿主細胞は、原核性または真核性であることが可能であり、それらには、大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌、酵母などの真菌細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サ
ルおよびげっ歯類由来の細胞系を含む（これらに限定されるものではない）哺乳
類細胞、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞などの両生類細胞、およびショ
ウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）およびカイコに由来する細胞系を含む（
これらに限定されるものではない）昆虫細胞が含まれるが、これらに限定される
ものではない。ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質の組換え発現に適した広く
入手可能な細胞および細胞系には、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ
１．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．２）、２９３（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣ
Ｃ ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７
（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、
３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６
５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ １７１）、ＣＰＡＥ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２０９）、Ｓａｏｓ−２（
ＡＴＣＣ ＨＴＢ−８５）、ＡＲＰＥ−１９ヒト網膜色素上皮（ＡＴＣＣ ＣＲ
Ｌ−２３０２）、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）黒色素胞およびツメガエル（Ｘ
ｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。
るＤＮＡ配列を含有および／または発現するように操作された宿主細胞を含む。
ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を産生させるために、そのような組換え宿
主細胞を適当な条件下で培養することができる。組換え宿主細胞内でヒトＩｓＫ
２サブユニットタンパク質を発現させるために、ヒトＩｓＫ２サブユニットタン
パク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを使用することができる。組
換え宿主細胞は、原核性または真核性であることが可能であり、それらには、大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌、酵母などの真菌細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サ
ルおよびげっ歯類由来の細胞系を含む（これらに限定されるものではない）哺乳
類細胞、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞などの両生類細胞、およびショ
ウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）およびカイコに由来する細胞系を含む（
これらに限定されるものではない）昆虫細胞が含まれるが、これらに限定される
ものではない。ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質の組換え発現に適した広く
入手可能な細胞および細胞系には、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ
１．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．２）、２９３（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣ
Ｃ ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７
（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、
３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６
５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ １７１）、ＣＰＡＥ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２０９）、Ｓａｏｓ−２（
ＡＴＣＣ ＨＴＢ−８５）、ＡＲＰＥ−１９ヒト網膜色素上皮（ＡＴＣＣ ＣＲ
Ｌ−２３０２）、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）黒色素胞およびツメガエル（Ｘ
ｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
哺乳類細胞内で組換えヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を発現させるため
には、種々の哺乳類発現ベクターを使用することができる。商業的に入手可能な
適当な哺乳類発現ベクターには、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐ
ＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｃＤＮＡＩおよびｐｃＤＮＡＩａｍｐ、ｐ
ｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＥＢ
Ｏ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（Ａ
ＴＣＣ ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ
３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（
ＡＴＣＣ ３７１９８）、ｐＩＺＤ３５（ＡＴＣＣ ３７５６５）およびｐＳＶ
２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）が含まれるが、これらに限定されるもの
ではない。もう１つの適当なベクターとしては、ＰＴ７ＴＳ卵母細胞発現ベクタ
ーが挙げられる。
には、種々の哺乳類発現ベクターを使用することができる。商業的に入手可能な
適当な哺乳類発現ベクターには、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐ
ＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｃＤＮＡＩおよびｐｃＤＮＡＩａｍｐ、ｐ
ｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＥＢ
Ｏ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（Ａ
ＴＣＣ ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ
３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（
ＡＴＣＣ ３７１９８）、ｐＩＺＤ３５（ＡＴＣＣ ３７５６５）およびｐＳＶ
２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）が含まれるが、これらに限定されるもの
ではない。もう１つの適当なベクターとしては、ＰＴ７ＴＳ卵母細胞発現ベクタ
ーが挙げられる。
【００３２】
組換え細胞内での発現後、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を、他のタン
パク質を実質的に含有しないレベルにまで通常の技術により精製することができ
る。使用しうる技術には、硫安沈殿、疎水性または親水性相互作用クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、
ホスホセルロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、分取ゲ
ル電気泳動およびアルコール沈殿が含まれる。いくつかの場合には、そのような
技術に加えてタンパク質の変性および／またはリフォールディング工程を用いる
のが有利かもしれない。
パク質を実質的に含有しないレベルにまで通常の技術により精製することができ
る。使用しうる技術には、硫安沈殿、疎水性または親水性相互作用クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、
ホスホセルロースクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、分取ゲ
ル電気泳動およびアルコール沈殿が含まれる。いくつかの場合には、そのような
技術に加えてタンパク質の変性および／またはリフォールディング工程を用いる
のが有利かもしれない。
【００３３】
ある種の電位依存性カリウムチャンネルサブユニットは、高レベルで適切に発
現され膜内に挿入されるためには、他の電位依存性カリウムチャンネルサブユニ
ットの発現を要することが判明している。例えば、ＫＣＮＱ３の共発現は、ツメ
ガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞におけるＫＣＮＱ２の発現を増強するらしい
（Ｗａｎｇら，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１８９０−１８９３）。ま
た、いくつかの電位依存性カリウムチャンネルＫｖ１αサブユニットは他の関連
αサブユニットまたはＫｖβ２サブユニットを要する（Ｓｈｉら，１９９５，Ｎ
ｅｕｒｏｎ １６：８４３−８５２）。したがって、ヒトＩｓＫ２サブユニット
タンパク質の組換え発現は、ある条件下では、他のカリウムチャンネルタンパク
質の共発現から利益が得られることがあり、そのような共発現は本発明の範囲内
にあると意図される。特に好ましい共発現形態は、ヒトＩｓＫ２サブユニットタ
ンパク質とヒトＫｖＱＬＴ１サブユニットタンパク質またはヒトｈ−ｅｒｇサブ
ユニットタンパク質との共発現である。そのような共発現は、ヒトＩｓＫ２サブ
ユニットタンパク質をコードする発現ベクターを、ヒトＫｖＱＬＴ１サブユニッ
トタンパク質またはヒトｈ−ｅｒｇサブユニットタンパク質を天然で発現する細
胞内にトランスフェクトすることにより行うことができる。あるいは、ヒトＩｓ
Ｋ２サブユニットタンパク質をコードする発現ベクターを、ヒトＫｖＱＬＴ１サ
ブユニットタンパク質またはヒトｈ−ｅｒｇサブユニットタンパク質をコードす
る発現ベクターもトランスフェクトされている細胞内にトランスフェクトするこ
とができる。好ましくは、そのような細胞は、ヒトＫｖＱＬＴ１サブユニットタ
ンパク質もヒトｈ−ｅｒｇサブユニットタンパク質も天然では発現しない。
現され膜内に挿入されるためには、他の電位依存性カリウムチャンネルサブユニ
ットの発現を要することが判明している。例えば、ＫＣＮＱ３の共発現は、ツメ
ガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞におけるＫＣＮＱ２の発現を増強するらしい
（Ｗａｎｇら，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１８９０−１８９３）。ま
た、いくつかの電位依存性カリウムチャンネルＫｖ１αサブユニットは他の関連
αサブユニットまたはＫｖβ２サブユニットを要する（Ｓｈｉら，１９９５，Ｎ
ｅｕｒｏｎ １６：８４３−８５２）。したがって、ヒトＩｓＫ２サブユニット
タンパク質の組換え発現は、ある条件下では、他のカリウムチャンネルタンパク
質の共発現から利益が得られることがあり、そのような共発現は本発明の範囲内
にあると意図される。特に好ましい共発現形態は、ヒトＩｓＫ２サブユニットタ
ンパク質とヒトＫｖＱＬＴ１サブユニットタンパク質またはヒトｈ−ｅｒｇサブ
ユニットタンパク質との共発現である。そのような共発現は、ヒトＩｓＫ２サブ
ユニットタンパク質をコードする発現ベクターを、ヒトＫｖＱＬＴ１サブユニッ
トタンパク質またはヒトｈ−ｅｒｇサブユニットタンパク質を天然で発現する細
胞内にトランスフェクトすることにより行うことができる。あるいは、ヒトＩｓ
Ｋ２サブユニットタンパク質をコードする発現ベクターを、ヒトＫｖＱＬＴ１サ
ブユニットタンパク質またはヒトｈ−ｅｒｇサブユニットタンパク質をコードす
る発現ベクターもトランスフェクトされている細胞内にトランスフェクトするこ
とができる。好ましくは、そのような細胞は、ヒトＫｖＱＬＴ１サブユニットタ
ンパク質もヒトｈ−ｅｒｇサブユニットタンパク質も天然では発現しない。
【００３４】
本発明は、他のタンパク質を実質的に含有しないヒトＩｓＫ２サブユニットタ
ンパク質を含む。完全長ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質のアミノ酸配列は
、配列番号２に示されている。したがって、本発明は、アミノ酸配列配列番号２
を有する、他のタンパク質を実質的に含有しないヒトＩｓＫ２サブユニットタン
パク質を含む。本発明はまた、アミノ酸配列配列番号２を有する単離されたヒト
ＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含む。
ンパク質を含む。完全長ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質のアミノ酸配列は
、配列番号２に示されている。したがって、本発明は、アミノ酸配列配列番号２
を有する、他のタンパク質を実質的に含有しないヒトＩｓＫ２サブユニットタン
パク質を含む。本発明はまた、アミノ酸配列配列番号２を有する単離されたヒト
ＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含む。
【００３５】
ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質の突然変異形態は、本発明の範囲内であ
ると意図される。特に、他のカリウムチャンネルサブユニットと一緒になった場
合に改変された電気生理学的または薬理学的特性を有するカリウムチャンネルを
与える配列番号２の突然変異形態は、本発明の範囲内である。
ると意図される。特に、他のカリウムチャンネルサブユニットと一緒になった場
合に改変された電気生理学的または薬理学的特性を有するカリウムチャンネルを
与える配列番号２の突然変異形態は、本発明の範囲内である。
【００３６】
多数のタンパク質の場合と同様、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質のアミ
ノ酸の多数を修飾し、それでもなお、元のタンパク質と実質的に同じ生物活性を
保有させることが可能である。したがって、本発明は、アミノ酸の欠失、付加ま
たは置換を有するが天然に存在するヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質と実質
的に同じ生物活性を依然として保有する修飾されたヒトＩｓＫ２サブユニットタ
ンパク質を含む。単一のアミノ酸の置換は通常はタンパク質の生物活性を改変し
ないことが、一般に認められている（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ ｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ ，Ｗａｔｓｏｎら，１９８７，第４版，Ｔｈｅ
Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｉｎ
ｃ．，ｐ．２２６；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ ＆ Ｗｅｌｌｓ，１９８９，
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５を参照されたい）。したがって、
本発明は、配列番号２において１つのアミノ酸置換が施されているポリペプチド
であって、天然に存在するヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質と実質的に同じ
生物活性を依然として保有するポリペプチドを含む。本発明はまた、配列番号２
において２以上のアミノ酸置換が施されているポリペプチドであって、天然に存
在するヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質と実質的に同じ生物活性を依然とし
て保有するポリペプチドを含む。特に、本発明は、前記置換が同類置換である実
施形態を含む。特に、本発明は、保存された位置には前記置換が存在しない実施
形態を含む。保存された位置は、ヒトＩｓＫ２およびヒトｍｉｎＫタンパク質が
同一アミノ酸を有する位置である（図２を参照されたい）。
ノ酸の多数を修飾し、それでもなお、元のタンパク質と実質的に同じ生物活性を
保有させることが可能である。したがって、本発明は、アミノ酸の欠失、付加ま
たは置換を有するが天然に存在するヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質と実質
的に同じ生物活性を依然として保有する修飾されたヒトＩｓＫ２サブユニットタ
ンパク質を含む。単一のアミノ酸の置換は通常はタンパク質の生物活性を改変し
ないことが、一般に認められている（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ ｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ ，Ｗａｔｓｏｎら，１９８７，第４版，Ｔｈｅ
Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｉｎ
ｃ．，ｐ．２２６；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ ＆ Ｗｅｌｌｓ，１９８９，
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５を参照されたい）。したがって、
本発明は、配列番号２において１つのアミノ酸置換が施されているポリペプチド
であって、天然に存在するヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質と実質的に同じ
生物活性を依然として保有するポリペプチドを含む。本発明はまた、配列番号２
において２以上のアミノ酸置換が施されているポリペプチドであって、天然に存
在するヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質と実質的に同じ生物活性を依然とし
て保有するポリペプチドを含む。特に、本発明は、前記置換が同類置換である実
施形態を含む。特に、本発明は、保存された位置には前記置換が存在しない実施
形態を含む。保存された位置は、ヒトＩｓＫ２およびヒトｍｉｎＫタンパク質が
同一アミノ酸を有する位置である（図２を参照されたい）。
【００３７】
本発明のヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質は、翻訳後修飾、例えば、共有
結合した炭水化物、リン酸化、ミリストイル化、パルミルトイル化などを含有し
うる。
結合した炭水化物、リン酸化、ミリストイル化、パルミルトイル化などを含有し
うる。
【００３８】
本発明はまた、キメラヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含む。キメラヒ
トＩｓＫ２サブユニットタンパク質は、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質か
らのものではないポリペプチド配列に融合したヒトＩｓＫ２サブユニットタンパ
ク質の少なくとも一部の連続したポリペプチド配列よりなる。
トＩｓＫ２サブユニットタンパク質は、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質か
らのものではないポリペプチド配列に融合したヒトＩｓＫ２サブユニットタンパ
ク質の少なくとも一部の連続したポリペプチド配列よりなる。
【００３９】
本発明はまた、単離されたヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質、およびこれ
らの単離されたサブユニットをコードするＤＮＡを含む。「単離（された）」な
る語の使用は、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質またはＤＮＡが、その通常
の細胞環境から取り出されていることを示す。したがって、単離されたヒトＩｓ
Ｋ２サブユニットタンパク質は無細胞溶液中に存在していたり、あるいはそれが
天然に存在する場合とは異なる細胞環境中に存在しうる。単離（された）なる語
は、単離されたヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質が、存在する唯一のタンパ
ク質であることを必ずしも意味するものではなく、単離されたヒトＩｓＫ２サブ
ユニットタンパク質が、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質に天然で付随する
非アミノ酸物質（例えば、核酸、脂質、炭水化物）から少なくとも９５％フリー
であることを意味する。例えば、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質のうち、
それを天然（すなわち、ヒトの介入の不存在下）では発現しない細菌内または更
には真核細胞内で組換え手段により発現されたものは、「単離されたヒトＩｓＫ
２サブユニットタンパク質」である。
らの単離されたサブユニットをコードするＤＮＡを含む。「単離（された）」な
る語の使用は、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質またはＤＮＡが、その通常
の細胞環境から取り出されていることを示す。したがって、単離されたヒトＩｓ
Ｋ２サブユニットタンパク質は無細胞溶液中に存在していたり、あるいはそれが
天然に存在する場合とは異なる細胞環境中に存在しうる。単離（された）なる語
は、単離されたヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質が、存在する唯一のタンパ
ク質であることを必ずしも意味するものではなく、単離されたヒトＩｓＫ２サブ
ユニットタンパク質が、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質に天然で付随する
非アミノ酸物質（例えば、核酸、脂質、炭水化物）から少なくとも９５％フリー
であることを意味する。例えば、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質のうち、
それを天然（すなわち、ヒトの介入の不存在下）では発現しない細菌内または更
には真核細胞内で組換え手段により発現されたものは、「単離されたヒトＩｓＫ
２サブユニットタンパク質」である。
【００４０】
ある種のカリウムチャンネルサブユニットは相互作用してヘテロマー複合体を
形成して、機能的カリウムチャンネルを与えることが公知である。例えば、ＫＣ
ＮＱ２とＫＣＮＱ３とが集合してヘテロマー機能的カリウムチャンネルを形成し
うる（Ｗａｎｇら，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１８９０−１８９３）
。したがって、本発明のヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質も、機能的カリウ
ムチャンネルを構成するヘテロマー構造を他のタンパク質と共に形成しうる可能
性があると考えられる。したがって、本発明は、ヒトＩｓＫ２サブユニットタン
パク質を含むそのようなヘテロマーを含む。好ましいヘテロマーは、本発明のヒ
トＩｓＫ２サブユニットタンパク質がヒトＫｖＱＬＴ１またはｈ−ｅｒｇとヘテ
ロマーを形成しているものである。
形成して、機能的カリウムチャンネルを与えることが公知である。例えば、ＫＣ
ＮＱ２とＫＣＮＱ３とが集合してヘテロマー機能的カリウムチャンネルを形成し
うる（Ｗａｎｇら，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１８９０−１８９３）
。したがって、本発明のヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質も、機能的カリウ
ムチャンネルを構成するヘテロマー構造を他のタンパク質と共に形成しうる可能
性があると考えられる。したがって、本発明は、ヒトＩｓＫ２サブユニットタン
パク質を含むそのようなヘテロマーを含む。好ましいヘテロマーは、本発明のヒ
トＩｓＫ２サブユニットタンパク質がヒトＫｖＱＬＴ１またはｈ−ｅｒｇとヘテ
ロマーを形成しているものである。
【００４１】
ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質をコードするＤＮＡは、当技術分野でよ
く知られた方法により得ることができる。例えば、完全長ヒトＩｓＫ２タンパク
質をコードするｃＤＮＡ断片は、適当なプライマー対を使用するポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）を用いることによりヒト胃ｃＤＮＡライブラリーから単離する
ことができる。そのようなプライマー対は、図１に配列番号１として示すヒトＩ
ｓＫ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列に基づいて選択することができる。適
当なプライマー対としては、例えば以下のものが挙げられるであろう： ５’−ＡＴＡ ＧＣＣ ＡＡＡ ＴＣＣ ＡＧＡ ＡＡＡ−３’（配列番号４）
および ５’−ＧＣＴ ＴＧＧ ＴＧＣ ＣＴＴ ＴＣＴ ＣＣＣ−３’（配列番号５）
く知られた方法により得ることができる。例えば、完全長ヒトＩｓＫ２タンパク
質をコードするｃＤＮＡ断片は、適当なプライマー対を使用するポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）を用いることによりヒト胃ｃＤＮＡライブラリーから単離する
ことができる。そのようなプライマー対は、図１に配列番号１として示すヒトＩ
ｓＫ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列に基づいて選択することができる。適
当なプライマー対としては、例えば以下のものが挙げられるであろう： ５’−ＡＴＡ ＧＣＣ ＡＡＡ ＴＣＣ ＡＧＡ ＡＡＡ−３’（配列番号４）
および ５’−ＧＣＴ ＴＧＧ ＴＧＣ ＣＴＴ ＴＣＴ ＣＣＣ−３’（配列番号５）
【００４２】
前記のプライマーは例示的なものであるにすぎない。当業者は、配列番号１に
基づき、他の適当なプライマーを容易に設計しうるであろう。そのようなプライ
マーは、当技術分野でよく知られたオリゴヌクレオチド合成方法により製造され
うるであろう。
基づき、他の適当なプライマーを容易に設計しうるであろう。そのようなプライ
マーは、当技術分野でよく知られたオリゴヌクレオチド合成方法により製造され
うるであろう。
【００４３】
ＡｍｐｌｉＴａｑ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＧｏｌｄまたはＶｅｎｔポリメラーゼ
を含む（これらに限定されるものではない）種々の熱安定酵素でＰＣＲ反応を行
なうことができる。ＡｍｐｌｉＴａｑの場合には、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（
ｐＨ８．３）、２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、５０ｍＭ
ＫＣｌ、０．２μＭの各プライマー、１０ｎｇのＤＮＡ鋳型、０．０５単位／μ
ｌのＡｍｐｌｉＴａｑ中で反応を行なうことができる。該反応を９５℃で３分間
加熱し、ついで９５℃で２０秒間、６２℃で２０秒間、７２℃で３分間の適当な
サイクリングパラメーターを用いる３５サイクルに付す。これらの条件に加えて
、適当な種々のＰＣＲプロトコールがＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ， Ａ Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，Ｃ．Ｗ．ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＧ．Ｓ．Ｄ
ｖｅｋｓｌｅｒ編，１９９５，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、またはＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉ ｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ，Ｍｉｃｈａ
ｅｌら編，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに記載されている。
を含む（これらに限定されるものではない）種々の熱安定酵素でＰＣＲ反応を行
なうことができる。ＡｍｐｌｉＴａｑの場合には、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（
ｐＨ８．３）、２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、５０ｍＭ
ＫＣｌ、０．２μＭの各プライマー、１０ｎｇのＤＮＡ鋳型、０．０５単位／μ
ｌのＡｍｐｌｉＴａｑ中で反応を行なうことができる。該反応を９５℃で３分間
加熱し、ついで９５℃で２０秒間、６２℃で２０秒間、７２℃で３分間の適当な
サイクリングパラメーターを用いる３５サイクルに付す。これらの条件に加えて
、適当な種々のＰＣＲプロトコールがＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ， Ａ Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，Ｃ．Ｗ．ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＧ．Ｓ．Ｄ
ｖｅｋｓｌｅｒ編，１９９５，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、またはＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉ ｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ，Ｍｉｃｈａ
ｅｌら編，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに記載されている。
【００４４】
本発明のＩｓＫ２チャンネルサブユニットは他のカリウムチャンネルサブユニ
ットと相同であるため（図２を参照されたい）、所望のＩｓＫ２サブユニットが
実際に得られたことを確認するために、本明細書に記載の方法により得られたク
ローンを配列決定することが望ましい。
ットと相同であるため（図２を参照されたい）、所望のＩｓＫ２サブユニットが
実際に得られたことを確認するために、本明細書に記載の方法により得られたク
ローンを配列決定することが望ましい。
【００４５】
これらの方法により、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質をコードするｃＤ
ＮＡクローンを得ることができる。これらのｃＤＮＡクローンを、適当なクロー
ニングベクターまたは発現ベクター、例えば哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．
１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）内にクローニングする
ことができる。ついでヒトＩｓＫ２サブユニットまたはその一部をコードする発
現ベクターを適当な宿主細胞内に導入し、該宿主細胞を適当な条件下で培養する
ことにより、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を製造することができる。つ
いで、当技術分野でよく知られた方法により、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパ
ク質を単離することができる。
ＮＡクローンを得ることができる。これらのｃＤＮＡクローンを、適当なクロー
ニングベクターまたは発現ベクター、例えば哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．
１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）内にクローニングする
ことができる。ついでヒトＩｓＫ２サブユニットまたはその一部をコードする発
現ベクターを適当な宿主細胞内に導入し、該宿主細胞を適当な条件下で培養する
ことにより、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を製造することができる。つ
いで、当技術分野でよく知られた方法により、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパ
ク質を単離することができる。
【００４６】
前記ＰＣＲ法に代わる方法として、オリゴヌクレオチドプローブでｃＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングするための当技術分野でよく知られた方法を用いヒ
トＩｓＫ２サブユニットタンパク質に特異的なオリゴヌクレオチドをプローブと
して使用して、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質をコードするｃＤＮＡクロ
ーンをｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。そのような方法は、例
えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．（編），１９８５，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＭＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ
．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．，Ｖｏｌ．Ｉ，ＩＩに記載されている。ヒトＩｓＫ
２サブユニットタンパク質に特異的でｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに
使用されうるオリゴヌクレオチドは、図１Ａに示すＤＮＡ配列に基づき容易に設
計することができ、当技術分野でよく知られた方法により合成することができる
。
イブラリーをスクリーニングするための当技術分野でよく知られた方法を用いヒ
トＩｓＫ２サブユニットタンパク質に特異的なオリゴヌクレオチドをプローブと
して使用して、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質をコードするｃＤＮＡクロ
ーンをｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。そのような方法は、例
えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．（編），１９８５，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＭＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ
．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．，Ｖｏｌ．Ｉ，ＩＩに記載されている。ヒトＩｓＫ
２サブユニットタンパク質に特異的でｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに
使用されうるオリゴヌクレオチドは、図１Ａに示すＤＮＡ配列に基づき容易に設
計することができ、当技術分野でよく知られた方法により合成することができる
。
【００４７】
ヒトＩｓＫ２サブユニット遺伝子を含有するゲノムクローンは、ヒトゲノムＤ
ＮＡを鋳型として使用するＰＣＲにより、あるいはＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬから商業的に入手可能なヒトＰＡＣまた
はＢＡＣライブラリーから得ることができる。あるいは、本明細書に開示するヒ
トＩｓＫ２サブユニットＤＮＡ配列に基づくプローブを使用して、ヒトＩｓＫ２
サブユニット遺伝子を含有するゲノムクローンが単離されうるゲノムライブラリ
ー（例えば、Ｐ１人工染色体ベクター中のもの）を調製することができる。その
ようなライブラリーの調製方法は当技術分野で公知である（例えば、Ｉｏａｎｎ
ｏｕら，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．６：８４−８９を参照されたい
）。
ＮＡを鋳型として使用するＰＣＲにより、あるいはＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬから商業的に入手可能なヒトＰＡＣまた
はＢＡＣライブラリーから得ることができる。あるいは、本明細書に開示するヒ
トＩｓＫ２サブユニットＤＮＡ配列に基づくプローブを使用して、ヒトＩｓＫ２
サブユニット遺伝子を含有するゲノムクローンが単離されうるゲノムライブラリ
ー（例えば、Ｐ１人工染色体ベクター中のもの）を調製することができる。その
ようなライブラリーの調製方法は当技術分野で公知である（例えば、Ｉｏａｎｎ
ｏｕら，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．６：８４−８９を参照されたい
）。
【００４８】
本発明の新規ＤＮＡ配列は、種々の診断方法において使用することができる。
本発明は、ある患者がヒトＩｓＫ２サブユニット遺伝子内に突然変異を保持する
か否かを判定するための診断方法を提供する。広い意味では、そのような方法は
、該患者からのヒトＩｓＫ２サブユニット遺伝子内またはその近傍の領域のＤＮ
Ａ配列を決定し、その配列を、非罹患者（すなわち、診断されている状態を有さ
ない者）からのヒトＩｓＫ２サブユニット遺伝子の対応領域からの配列と比較す
ることを含み、該患者からの遺伝子のＤＮＡ配列と該非罹患者からの遺伝子のＤ
ＮＡ配列との配列における相違は、該患者がヒトＩｓＫ２サブユニット遺伝子内
に突然変異を有することを示す。
本発明は、ある患者がヒトＩｓＫ２サブユニット遺伝子内に突然変異を保持する
か否かを判定するための診断方法を提供する。広い意味では、そのような方法は
、該患者からのヒトＩｓＫ２サブユニット遺伝子内またはその近傍の領域のＤＮ
Ａ配列を決定し、その配列を、非罹患者（すなわち、診断されている状態を有さ
ない者）からのヒトＩｓＫ２サブユニット遺伝子の対応領域からの配列と比較す
ることを含み、該患者からの遺伝子のＤＮＡ配列と該非罹患者からの遺伝子のＤ
ＮＡ配列との配列における相違は、該患者がヒトＩｓＫ２サブユニット遺伝子内
に突然変異を有することを示す。
【００４９】
本発明はまた、ヒトＩｓＫ２サブユニットを有する突然変異形態を有する患者
を同定するための診断方法において、またはヒトＩｓＫ２サブユニットをコード
するＲＮＡの発現レベルを測定するために、または他の種からのヒトＩｓＫ２サ
ブユニットに相同な遺伝子を単離するために使用しうる、配列番号１に基づくオ
リゴヌクレオチドプローブを提供する。特に、本発明は、配列番号１の少なくと
も約１０、１５または１８個の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡオリゴヌクレ
オチドを含み、該オリゴヌクレオチドプローブは、前記の少なくとも約１０、１
５または１８個の連続したヌクレオチド以外は、配列番号１からの５個を超える
連続したヌクレオチドの伸長を含まない。該オリゴヌクレオチドは、他の核酸を
実質的に含有しないことが可能である。本発明はまた、対応ＲＮＡオリゴヌクレ
オチドを提供する。該ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドは、キット中にパ
ッケージ化されうる。
を同定するための診断方法において、またはヒトＩｓＫ２サブユニットをコード
するＲＮＡの発現レベルを測定するために、または他の種からのヒトＩｓＫ２サ
ブユニットに相同な遺伝子を単離するために使用しうる、配列番号１に基づくオ
リゴヌクレオチドプローブを提供する。特に、本発明は、配列番号１の少なくと
も約１０、１５または１８個の連続したヌクレオチドを含むＤＮＡオリゴヌクレ
オチドを含み、該オリゴヌクレオチドプローブは、前記の少なくとも約１０、１
５または１８個の連続したヌクレオチド以外は、配列番号１からの５個を超える
連続したヌクレオチドの伸長を含まない。該オリゴヌクレオチドは、他の核酸を
実質的に含有しないことが可能である。本発明はまた、対応ＲＮＡオリゴヌクレ
オチドを提供する。該ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドは、キット中にパ
ッケージ化されうる。
【００５０】
本発明は、種々の細胞型におけるヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質の組換
え発現を可能にする。そのような組換え発現は、このタンパク質の研究を可能に
し、その結果、その生化学的活性および種々の疾患（例えば、胃運動障害または
胃酸分泌障害）におけるその役割が明らかにされうる。
え発現を可能にする。そのような組換え発現は、このタンパク質の研究を可能に
し、その結果、その生化学的活性および種々の疾患（例えば、胃運動障害または
胃酸分泌障害）におけるその役割が明らかにされうる。
【００５１】
本発明はまた、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャ
ンネルの生物活性を測定するアッセイの開発を可能にする。組換え的に発現され
たヒトＩｓＫ２サブユニットタンパクを使用するそのようなアッセイに、特に関
心が持たれる。ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャン
ネルの活性のアクチベーターまたはインヒビターである化合物を同定するために
、化合物のライブラリーまたは他の化合物源をスクリーニングするために、その
ようなアッセイを用いることができる。そのような同定された化合物は、カリウ
ムチャンネル活性を増強または抑制することが有益である疾患を有する患者を治
療するために使用しうる医薬の開発のための「リード体」として使用することが
できる。
ンネルの生物活性を測定するアッセイの開発を可能にする。組換え的に発現され
たヒトＩｓＫ２サブユニットタンパクを使用するそのようなアッセイに、特に関
心が持たれる。ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャン
ネルの活性のアクチベーターまたはインヒビターである化合物を同定するために
、化合物のライブラリーまたは他の化合物源をスクリーニングするために、その
ようなアッセイを用いることができる。そのような同定された化合物は、カリウ
ムチャンネル活性を増強または抑制することが有益である疾患を有する患者を治
療するために使用しうる医薬の開発のための「リード体」として使用することが
できる。
【００５２】
前記アッセイの変法においては、突然変異ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク
質を含有するカリウムチャンネルを使用し、該突然変異カリウムチャンネルの活
性のインヒビターまたはアクチベーターを同定する。
質を含有するカリウムチャンネルを使用し、該突然変異カリウムチャンネルの活
性のインヒビターまたはアクチベーターを同定する。
【００５３】
ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質の組換え発現のための好ましい細胞系は
、内因性カリウムチャンネルを発現しない細胞系（例えば、ＣＶ−１、ＮＩＨ−
３Ｔ３、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＯＳ−７）である。そのような細胞系に、カリウムチ
ャンネルを通過しうるイオンである８６Ｒｂをローディングすることができる。 ８６ Ｒｂがローディングされた細胞を、物質の集合体（例えば、組合せライブラ
リー、天然物、医化学的方法により製造されたリード化合物の類似体）にさらし
、８６Ｒｂ流出を改変しうる物質を同定することができる。そのような物質は、
ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルのアクチベ
ーターまたはインヒビターであると考えられる。
、内因性カリウムチャンネルを発現しない細胞系（例えば、ＣＶ−１、ＮＩＨ−
３Ｔ３、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＯＳ−７）である。そのような細胞系に、カリウムチ
ャンネルを通過しうるイオンである８６Ｒｂをローディングすることができる。 ８６ Ｒｂがローディングされた細胞を、物質の集合体（例えば、組合せライブラ
リー、天然物、医化学的方法により製造されたリード化合物の類似体）にさらし
、８６Ｒｂ流出を改変しうる物質を同定することができる。そのような物質は、
ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルのアクチベ
ーターまたはインヒビターであると考えられる。
【００５４】
ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルのアクチ
ベーターおよびインヒビターは、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有す
るカリウムチャンネルに結合しうる物質であると考えられる。したがって、１つ
のタイプのアッセイは、集合体の物質の１以上がそのような結合能を有するか否
かを判定するものである。
ベーターおよびインヒビターは、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有す
るカリウムチャンネルに結合しうる物質であると考えられる。したがって、１つ
のタイプのアッセイは、集合体の物質の１以上がそのような結合能を有するか否
かを判定するものである。
【００５５】
したがって、本発明は、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリ
ウムチャンネルに結合する物質の同定方法であって、 （ａ）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルを
発現する細胞を準備すること、 （ｂ）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルに
結合することが知られていない物質に該細胞をさらすこと、 （ｃ）該細胞への該物質の結合の量を測定すること、 （ｄ）工程（ｃ）における結合の量を、対照細胞（該対照細胞は、該対照細胞
がヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を発現しないこと以外は、工程（ａ）の
細胞と実質的に同一である）への該物質の結合の量と比較することを含んでなり
、 工程（ｃ）における結合の量が対照細胞への該物質の結合の量より多い場合、
該物質が、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネル
に結合するものである、方法を提供する。
ウムチャンネルに結合する物質の同定方法であって、 （ａ）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルを
発現する細胞を準備すること、 （ｂ）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルに
結合することが知られていない物質に該細胞をさらすこと、 （ｃ）該細胞への該物質の結合の量を測定すること、 （ｄ）工程（ｃ）における結合の量を、対照細胞（該対照細胞は、該対照細胞
がヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を発現しないこと以外は、工程（ａ）の
細胞と実質的に同一である）への該物質の結合の量と比較することを含んでなり
、 工程（ｃ）における結合の量が対照細胞への該物質の結合の量より多い場合、
該物質が、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネル
に結合するものである、方法を提供する。
【００５６】
工程（ａ）の細胞と実質的に同一である対照細胞の一例として、工程（ａ）の
ヒトＩｓＫ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルを発現する細胞を得るた
めにＩｓＫ２タンパク質をコードする発現ベクターでトランスフェクトされる親
細胞系が挙げられるであろう。
ヒトＩｓＫ２タンパク質を含有するカリウムチャンネルを発現する細胞を得るた
めにＩｓＫ２タンパク質をコードする発現ベクターでトランスフェクトされる親
細胞系が挙げられるであろう。
【００５７】
このアッセイのもう１つの変法は、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含
有するカリウムチャンネルに結合することが知られている化合物を使用する。こ
れらの既知化合物の結合を増強または遮断する能力により、新規結合体を同定す
る。この能力を有する物質はそれ自体が、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質
を含有するカリウムチャンネルのインヒビターまたはアクチベーターであると考
えられる。
有するカリウムチャンネルに結合することが知られている化合物を使用する。こ
れらの既知化合物の結合を増強または遮断する能力により、新規結合体を同定す
る。この能力を有する物質はそれ自体が、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質
を含有するカリウムチャンネルのインヒビターまたはアクチベーターであると考
えられる。
【００５８】
したがって、本発明は、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリ
ウムチャンネルに結合し従ってヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質含有カリウ
ムチャンネルのインヒビターまたはアクチベーターでありうる物質の同定方法で
あって、 （ａ）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルを
発現する細胞を準備すること、 （ｂ）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルに
結合することが知られていない物質の存在下および不存在下、ヒトＩｓＫ２サブ
ユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルに結合することが知られてい
る化合物に該細胞をさらすこと、 （ｃ）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルに
結合することが知られていない物質の存在下および不存在下、該細胞への該化合
物の結合の量を測定することを含んでなり、 該物質の存在下の該化合物の結合の量が該物質の不存在下の結合の量と異なる
場合、該物質が、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャ
ンネルに結合しヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャン
ネルのインヒビターまたはアクチベーターでありうる、方法を含む。
ウムチャンネルに結合し従ってヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質含有カリウ
ムチャンネルのインヒビターまたはアクチベーターでありうる物質の同定方法で
あって、 （ａ）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルを
発現する細胞を準備すること、 （ｂ）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルに
結合することが知られていない物質の存在下および不存在下、ヒトＩｓＫ２サブ
ユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルに結合することが知られてい
る化合物に該細胞をさらすこと、 （ｃ）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルに
結合することが知られていない物質の存在下および不存在下、該細胞への該化合
物の結合の量を測定することを含んでなり、 該物質の存在下の該化合物の結合の量が該物質の不存在下の結合の量と異なる
場合、該物質が、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャ
ンネルに結合しヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャン
ネルのインヒビターまたはアクチベーターでありうる、方法を含む。
【００５９】
一般には、該既知化合物を標識（例えば、放射能、酵素的、蛍光的標識）して
、該カリウムチャンネルへのその結合の測定を容易にする。
、該カリウムチャンネルへのその結合の測定を容易にする。
【００６０】
前記方法により物質を同定したら、それがインヒビターまたはアクチベーター
であるか否かを判定するために、それを機能的試験（例えば、本明細書に記載の
もの）においてアッセイすることができる。
であるか否かを判定するために、それを機能的試験（例えば、本明細書に記載の
もの）においてアッセイすることができる。
【００６１】
特定の実施形態においては、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有する
カリウムチャンネルに結合することが知られている化合物は、メタンスルホンア
ニリドクラスＩＩＩ抗不整脈剤、例えばＥ−４０３１（Ａｂｂｏｔｔら，１９９
９，Ｃｅｌｌ ９７：１７５−１８７）、Ｅ−４０３１の誘導体（例えばＭＫ−
４９９（Ｌｙｎｃｈら，１９９４，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ
ａｐｅｕｔ．２６９：５４１−５５４））、およびＩＫｓを遮断または活性化す
る化合物（例えばＬ−３６４，３７３（Ｓａｌａｔａら，１９９８，Ｍｏｌ．Ｐ
ｈａｒｍａｃｏｌ．５３：２２０−２３０）、Ｌ−７６８，６７３（Ｓｅｌｎｉ
ｃｋら，１９９７，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０：３８６５−３８６８）または
Ｌ−７３５，８２１（Ｓａｌａｔａら，１９９６，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９
４：Ｉ−５２９））よりなる群から選ばれる。
カリウムチャンネルに結合することが知られている化合物は、メタンスルホンア
ニリドクラスＩＩＩ抗不整脈剤、例えばＥ−４０３１（Ａｂｂｏｔｔら，１９９
９，Ｃｅｌｌ ９７：１７５−１８７）、Ｅ−４０３１の誘導体（例えばＭＫ−
４９９（Ｌｙｎｃｈら，１９９４，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ
ａｐｅｕｔ．２６９：５４１−５５４））、およびＩＫｓを遮断または活性化す
る化合物（例えばＬ−３６４，３７３（Ｓａｌａｔａら，１９９８，Ｍｏｌ．Ｐ
ｈａｒｍａｃｏｌ．５３：２２０−２３０）、Ｌ−７６８，６７３（Ｓｅｌｎｉ
ｃｋら，１９９７，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０：３８６５−３８６８）または
Ｌ−７３５，８２１（Ｓａｌａｔａら，１９９６，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９
４：Ｉ−５２９））よりなる群から選ばれる。
【００６２】
本発明は、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネ
ルのアクチベーターまたはインヒビターの同定方法であって、 （ａ）組換え的に発現したヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質が、それ単独
で又は他のカリウムチャンネルサブユニットタンパク質とのヘテロマーを形成す
ることによりカリウムチャンネルを形成するよう、ヒトＩｓＫ２サブユニットタ
ンパク質または突然変異ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を宿主細胞内で組
換え的に発現させること、 （ｂ）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの
アクチベーターまたはインヒビターであると疑われる物質の存在下および不存在
下、工程（ａ）で形成したカリウムチャンネルの生物活性を測定することを含ん
でなり、 該物質の不存在下と比較した場合の該物質の存在下の、工程（ａ）で形成した
カリウムチャンネルの生物活性の変化が、該物質が、ヒトＩｓＫ２サブユニット
タンパク質を含有するカリウムチャンネルのアクチベーターまたはインヒビター
である、方法を含む。
ルのアクチベーターまたはインヒビターの同定方法であって、 （ａ）組換え的に発現したヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質が、それ単独
で又は他のカリウムチャンネルサブユニットタンパク質とのヘテロマーを形成す
ることによりカリウムチャンネルを形成するよう、ヒトＩｓＫ２サブユニットタ
ンパク質または突然変異ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を宿主細胞内で組
換え的に発現させること、 （ｂ）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの
アクチベーターまたはインヒビターであると疑われる物質の存在下および不存在
下、工程（ａ）で形成したカリウムチャンネルの生物活性を測定することを含ん
でなり、 該物質の不存在下と比較した場合の該物質の存在下の、工程（ａ）で形成した
カリウムチャンネルの生物活性の変化が、該物質が、ヒトＩｓＫ２サブユニット
タンパク質を含有するカリウムチャンネルのアクチベーターまたはインヒビター
である、方法を含む。
【００６３】
カリウムチャンネルのその他のサブユニット（例えば、ヒトＫｖＱＬＴ１また
はｈ−ｅｒｇサブユニット）を組換え的に発現させることが有利であろう。ある
いは、そのような他のサブユニットを内因的に発現する宿主細胞を使用すること
が有利であろう。
はｈ−ｅｒｇサブユニット）を組換え的に発現させることが有利であろう。ある
いは、そのような他のサブユニットを内因的に発現する宿主細胞を使用すること
が有利であろう。
【００６４】
特定の実施形態においては、該生物活性は、電位依存性カリウム電流の生成ま
たは８６Ｒｂの流出である。
たは８６Ｒｂの流出である。
【００６５】
特定の実施形態においては、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質をコードす
るベクターをツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞内に導入して、ヒトＩｓＫ
２サブユニットタンパク質を該卵母細胞内で発現させる。あるいは、ヒトＩｓＫ
２サブユニットタンパク質をコードするＲＮＡをインビトロで調製し、該卵母細
胞内に注入することによっても、該卵母細胞内でヒトＩｓＫ２サブユニットタン
パク質を発現させることができる。該卵母細胞内でのヒトＩｓＫ２サブユニット
タンパク質の発現後、およびこれらのサブユニットと他のカリウムサブユニット
（その「他の」サブユニットも該卵母細胞内に導入されうる）とを含有するカリ
ウムチャンネルの形成後、膜電位を数工程で変化させた後、膜電流を測定する。
該カリウムチャンネルが開いてカリウムイオンの流動が可能になった場合に、膜
電流の変化が認められる。同様の卵母細胞研究が、ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３
カリウムチャンネルに関して、Ｗａｎｇら，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２
：１８９０−１８９３に、また、ｍｉｎＫ含有チャンネルに関して、Ｇｏｌｄｓ
ｔｅｉｎ ＆ Ｍｉｌｌｅｒ，１９９１，Ｎｅｕｒｏｎ ７：４０３−４０８に
報告されている。これらの参考文献およびそれらに引用されている参考文献は、
そのような研究の実施方法の指針として参考になるであろう。
るベクターをツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞内に導入して、ヒトＩｓＫ
２サブユニットタンパク質を該卵母細胞内で発現させる。あるいは、ヒトＩｓＫ
２サブユニットタンパク質をコードするＲＮＡをインビトロで調製し、該卵母細
胞内に注入することによっても、該卵母細胞内でヒトＩｓＫ２サブユニットタン
パク質を発現させることができる。該卵母細胞内でのヒトＩｓＫ２サブユニット
タンパク質の発現後、およびこれらのサブユニットと他のカリウムサブユニット
（その「他の」サブユニットも該卵母細胞内に導入されうる）とを含有するカリ
ウムチャンネルの形成後、膜電位を数工程で変化させた後、膜電流を測定する。
該カリウムチャンネルが開いてカリウムイオンの流動が可能になった場合に、膜
電流の変化が認められる。同様の卵母細胞研究が、ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３
カリウムチャンネルに関して、Ｗａｎｇら，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２
：１８９０−１８９３に、また、ｍｉｎＫ含有チャンネルに関して、Ｇｏｌｄｓ
ｔｅｉｎ ＆ Ｍｉｌｌｅｒ，１９９１，Ｎｅｕｒｏｎ ７：４０３−４０８に
報告されている。これらの参考文献およびそれらに引用されている参考文献は、
そのような研究の実施方法の指針として参考になるであろう。
【００６６】
ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルのインヒ
ビターは、該卵母細胞を物質または物質の集合体にさらし、該物質の不存在下で
認められる膜電流を該物質が遮断または減弱しうるか否かを判定することにより
同定することができる。
ビターは、該卵母細胞を物質または物質の集合体にさらし、該物質の不存在下で
認められる膜電流を該物質が遮断または減弱しうるか否かを判定することにより
同定することができる。
【００６７】
したがって、本発明は、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリ
ウムチャンネルのインヒビターの同定方法であって、 （ａ）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質をツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）
卵母細胞内で発現させて、該ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカ
リウムチャンネルを形成させること、 （ｂ）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの
インヒビターであると疑われる物質の存在下および不存在下、該卵母細胞の膜電
位を変化させること、 （ｃ）工程（ｂ）の後に膜カリウム電流を測定することを含んでなり、 工程（ｃ）において測定したカリウム膜電流が該物質の存在下より不存在下で
大きい場合、該物質が、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウ
ムチャンネルのインヒビターである、方法を提供する。
ウムチャンネルのインヒビターの同定方法であって、 （ａ）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質をツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）
卵母細胞内で発現させて、該ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカ
リウムチャンネルを形成させること、 （ｂ）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの
インヒビターであると疑われる物質の存在下および不存在下、該卵母細胞の膜電
位を変化させること、 （ｃ）工程（ｂ）の後に膜カリウム電流を測定することを含んでなり、 工程（ｃ）において測定したカリウム膜電流が該物質の存在下より不存在下で
大きい場合、該物質が、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウ
ムチャンネルのインヒビターである、方法を提供する。
【００６８】
本発明はまた、第１蛍光色素と第２蛍光色素との間の蛍光共鳴エネルギー移動
（ＦＲＥＴ）に基づく、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウ
ムチャンネルのアクチベーターおよびインヒビターの同定のためのアッセイを含
み、この場合、該第１色素は、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有する
カリウムチャンネルを発現する細胞の形質膜の一方の側に結合し、該第２色素は
、膜電位の変化に応答して該膜の一方の面から他方の面へ自由に往復できる。あ
る実施形態においては、該第１色素は該細胞の形質膜に不透過性であり、主に形
質膜の細胞外表面に結合する。該第２色素は形質膜内に捕捉されるが、該膜内で
自由に拡散できる。該膜の通常の（すなわち、負の）静止電位においては、該第
２色素は主に形質膜の細胞外面の内部表面に結合し、したがって該第２色素は該
第１色素に接近して位置する。この接近性は、それらの２つの色素の間の大量の
ＦＲＥＴの生成を可能にする。膜の脱分極の後、該第２色素は該膜の細胞外面か
ら細胞内面に移動し、それらの色素の間の距離が増加する。この距離の増加は、
ＦＲＥＴの減少およびそれに対応した、該第１色素由来の蛍光発光の増加、およ
びそれに対応した、該第２色素からの蛍光発光の減少につながる。このようにし
て、それらの２つの色素間のＦＲＥＴの量を用いて、該膜の分極状態を測定する
ことができる。この技術の更に詳細な説明については、Ｇｏｎｚａｌｅｚおよび
Ｔｓｉｅｎ，１９９７，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４：２６９
−２７７を参照されたい。また、ＧｏｎｚａｌｅｚおよびＴｓｉｅｎ，１９９５
，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６９：１２７２−１２８０および米国特許第５，６６１
，０３５号も参照されたい。
（ＦＲＥＴ）に基づく、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウ
ムチャンネルのアクチベーターおよびインヒビターの同定のためのアッセイを含
み、この場合、該第１色素は、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有する
カリウムチャンネルを発現する細胞の形質膜の一方の側に結合し、該第２色素は
、膜電位の変化に応答して該膜の一方の面から他方の面へ自由に往復できる。あ
る実施形態においては、該第１色素は該細胞の形質膜に不透過性であり、主に形
質膜の細胞外表面に結合する。該第２色素は形質膜内に捕捉されるが、該膜内で
自由に拡散できる。該膜の通常の（すなわち、負の）静止電位においては、該第
２色素は主に形質膜の細胞外面の内部表面に結合し、したがって該第２色素は該
第１色素に接近して位置する。この接近性は、それらの２つの色素の間の大量の
ＦＲＥＴの生成を可能にする。膜の脱分極の後、該第２色素は該膜の細胞外面か
ら細胞内面に移動し、それらの色素の間の距離が増加する。この距離の増加は、
ＦＲＥＴの減少およびそれに対応した、該第１色素由来の蛍光発光の増加、およ
びそれに対応した、該第２色素からの蛍光発光の減少につながる。このようにし
て、それらの２つの色素間のＦＲＥＴの量を用いて、該膜の分極状態を測定する
ことができる。この技術の更に詳細な説明については、Ｇｏｎｚａｌｅｚおよび
Ｔｓｉｅｎ，１９９７，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４：２６９
−２７７を参照されたい。また、ＧｏｎｚａｌｅｚおよびＴｓｉｅｎ，１９９５
，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６９：１２７２−１２８０および米国特許第５，６６１
，０３５号も参照されたい。
【００６９】
ある実施形態においては、該第１色素は、蛍光供与体として作用する蛍光性レ
クチンまたは蛍光性リン脂質である。そのような第１色素の具体例としては、ク
マリン標識ホスファチジルエタノールアミン（例えば、Ｎ−（６−クロロ−７−
ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボキサミドアセチ
ル）−ジミリストイルホスファチジル−エタノールアミン）またはＮ−（７−ニ
トロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）−ジパルミトイルホ
スファチジルエタノールアミン）；蛍光標識レクチン（例えば、フルオレセイン
標識コムギ胚芽凝集素）が挙げられる。ある実施形態においては、該第２色素は
、蛍光受容体として作用するオキソノールである。そのような第２色素の具体例
としては、ビス（１，３−ジアルキル−２−チオバルビツラート）トリメチンオ
キソノール（例えば、ビス（１，３−ジヘキシル−２−チオバルビツラート）ト
リメチンオキソノール）またはペンタメチンオキソノール類似体（例えば、ビス
（１，３−ジヘキシル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノール）
；またはビス（１，３−ジブチル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキ
ソノール）が挙げられる。本発明での使用に適した種々の色素の合成方法に関し
ては、ＧｏｎｚａｌｅｚおよびＴｓｉｅｎ，１９９７，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆
Ｂｉｏｌｏｇｙ ４：２６９−２７７を参照されたい。ある実施形態において
は、該アッセイは、一重項酸素による光力学損傷を軽減するための天然カロテノ
イド（例えば、アスタキサンチン）を含みうる。
クチンまたは蛍光性リン脂質である。そのような第１色素の具体例としては、ク
マリン標識ホスファチジルエタノールアミン（例えば、Ｎ−（６−クロロ−７−
ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボキサミドアセチ
ル）−ジミリストイルホスファチジル−エタノールアミン）またはＮ−（７−ニ
トロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）−ジパルミトイルホ
スファチジルエタノールアミン）；蛍光標識レクチン（例えば、フルオレセイン
標識コムギ胚芽凝集素）が挙げられる。ある実施形態においては、該第２色素は
、蛍光受容体として作用するオキソノールである。そのような第２色素の具体例
としては、ビス（１，３−ジアルキル−２−チオバルビツラート）トリメチンオ
キソノール（例えば、ビス（１，３−ジヘキシル−２−チオバルビツラート）ト
リメチンオキソノール）またはペンタメチンオキソノール類似体（例えば、ビス
（１，３−ジヘキシル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノール）
；またはビス（１，３−ジブチル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキ
ソノール）が挙げられる。本発明での使用に適した種々の色素の合成方法に関し
ては、ＧｏｎｚａｌｅｚおよびＴｓｉｅｎ，１９９７，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆
Ｂｉｏｌｏｇｙ ４：２６９−２７７を参照されたい。ある実施形態において
は、該アッセイは、一重項酸素による光力学損傷を軽減するための天然カロテノ
イド（例えば、アスタキサンチン）を含みうる。
【００７０】
前記アッセイは、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチ
ャンネルのアクチベーターおよびインヒビターを見出すために用いることができ
る。そのようなアッセイでは、一般には、例えば、ヒトＩｓＫ２サブユニットタ
ンパク質と所望により他のカリウムチャンネルサブユニットとをコードする発現
ベクターでのトランスフェクションによりヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質
含有カリウムチャンネルを発現する細胞を使用する。そのような細胞においては
、該膜電位の増加（すなわち、脱分極）が該カリウムチャンネルを開口させうる
。これはカリウム流出を引き起こし、該脱分極に抗する傾向にあるであろう。す
なわち、該細胞は再分極する傾向にあるであろう。ＩｓＫ２タンパク質を含有す
るカリウムチャンネルのインヒビターの存在は、この再分極を妨害または減弱さ
せるであろう。したがって、インヒビターの存在下では、膜電位は、より正にな
る傾向にあるであろう。該カリウムチャンネルのアゴニストはこのチャンネルを
開口して、該膜電位を過分極させる傾向にあるであろう。ＩｓＫ２タンパク質を
含有するカリウムチャンネルのインヒビターおよびアゴニストにより引き起こさ
れる膜電位の変化（脱分極および過分極）は、前記のＦＲＥＴを用いるアッセイ
によりモニターすることができる。
ャンネルのアクチベーターおよびインヒビターを見出すために用いることができ
る。そのようなアッセイでは、一般には、例えば、ヒトＩｓＫ２サブユニットタ
ンパク質と所望により他のカリウムチャンネルサブユニットとをコードする発現
ベクターでのトランスフェクションによりヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質
含有カリウムチャンネルを発現する細胞を使用する。そのような細胞においては
、該膜電位の増加（すなわち、脱分極）が該カリウムチャンネルを開口させうる
。これはカリウム流出を引き起こし、該脱分極に抗する傾向にあるであろう。す
なわち、該細胞は再分極する傾向にあるであろう。ＩｓＫ２タンパク質を含有す
るカリウムチャンネルのインヒビターの存在は、この再分極を妨害または減弱さ
せるであろう。したがって、インヒビターの存在下では、膜電位は、より正にな
る傾向にあるであろう。該カリウムチャンネルのアゴニストはこのチャンネルを
開口して、該膜電位を過分極させる傾向にあるであろう。ＩｓＫ２タンパク質を
含有するカリウムチャンネルのインヒビターおよびアゴニストにより引き起こさ
れる膜電位の変化（脱分極および過分極）は、前記のＦＲＥＴを用いるアッセイ
によりモニターすることができる。
【００７１】
したがって、本発明は、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリ
ウムチャンネルのアクチベーターの同定方法であって、 （ａ）試験細胞を準備すること（該試験細胞は、 （１）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネル
が該細胞内で形成されるように、該細胞内でのヒトＩｓＫ２サブユニットタンパ
ク質の発現を指令する発現ベクター、 （２）該細胞の形質膜の一方の側に結合している第１蛍光色素、および （３）膜電位の変化に応答して該細胞の形質膜の一方の面から他方の面へ自
由に往復できる第２蛍光色素を含む）、 （ｂ）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの
アクチベーターであると疑われる物質に該試験細胞をさらすこと、 （ｃ）該物質にさらされた試験細胞における蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥ
Ｔ）の量を測定すすること、 （ｄ）該物質にさらされた試験細胞により示されたＦＲＥＴの量を、対照細胞
により示されたＦＲＥＴの量と比較することを含んでなり、 該試験細胞により示されたＦＲＥＴの量が、該対照細胞により示されたＦＲＥ
Ｔの量より多い場合、該物質が、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有す
るカリウムチャンネルのアクチベーターであり、 該対照細胞が、（１）それが（ａ）（１）〜（３）に記載の事項の少なくとも
１つを含まないこと以外は該試験細胞と実質的に同じであるが、該物質にさらさ
れた細胞、または（２）該物質にさらされていない試験細胞である、方法を提供
する。
ウムチャンネルのアクチベーターの同定方法であって、 （ａ）試験細胞を準備すること（該試験細胞は、 （１）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネル
が該細胞内で形成されるように、該細胞内でのヒトＩｓＫ２サブユニットタンパ
ク質の発現を指令する発現ベクター、 （２）該細胞の形質膜の一方の側に結合している第１蛍光色素、および （３）膜電位の変化に応答して該細胞の形質膜の一方の面から他方の面へ自
由に往復できる第２蛍光色素を含む）、 （ｂ）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの
アクチベーターであると疑われる物質に該試験細胞をさらすこと、 （ｃ）該物質にさらされた試験細胞における蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥ
Ｔ）の量を測定すすること、 （ｄ）該物質にさらされた試験細胞により示されたＦＲＥＴの量を、対照細胞
により示されたＦＲＥＴの量と比較することを含んでなり、 該試験細胞により示されたＦＲＥＴの量が、該対照細胞により示されたＦＲＥ
Ｔの量より多い場合、該物質が、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有す
るカリウムチャンネルのアクチベーターであり、 該対照細胞が、（１）それが（ａ）（１）〜（３）に記載の事項の少なくとも
１つを含まないこと以外は該試験細胞と実質的に同じであるが、該物質にさらさ
れた細胞、または（２）該物質にさらされていない試験細胞である、方法を提供
する。
【００７２】
また、本発明は、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチ
ャンネルのインヒビターの同定方法であって、 （ａ）試験細胞を準備すること（該試験細胞は、 （１）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネル
が該細胞内で形成されるように、該細胞内でのヒトＩｓＫ２サブユニットタンパ
ク質の発現を指令する発現ベクター、 （２）該細胞の形質膜の一方の側に結合している第１蛍光色素、および （３）膜電位の変化に応答して該細胞の形質膜の一方の面から他方の面へ自
由に往復できる第２蛍光色素を含む）、 （ｂ）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの
インヒビターであると疑われる物質に該試験細胞をさらすこと、 （ｃ）該物質にさらされた試験細胞における蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥ
Ｔ）の量を測定すること、 （ｄ）該物質にさらされた試験細胞により示されたＦＲＥＴの量を、対照細胞
により示されたＦＲＥＴの量と比較することを含んでなり、 該試験細胞により示されたＦＲＥＴの量が、該対照細胞により示されたＦＲＥ
Ｔの量より少ない場合、該物質が、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有
するカリウムチャンネルのインヒビターであり、 該対照細胞が、（１）それが（ａ）（１）〜（３）に記載の事項の少なくとも
１つを含まないこと以外は該試験細胞と実質的に同じであるが、該物質にさらさ
れた細胞、または（２）該物質にさらされていない試験細胞である、方法を提供
する。
ャンネルのインヒビターの同定方法であって、 （ａ）試験細胞を準備すること（該試験細胞は、 （１）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネル
が該細胞内で形成されるように、該細胞内でのヒトＩｓＫ２サブユニットタンパ
ク質の発現を指令する発現ベクター、 （２）該細胞の形質膜の一方の側に結合している第１蛍光色素、および （３）膜電位の変化に応答して該細胞の形質膜の一方の面から他方の面へ自
由に往復できる第２蛍光色素を含む）、 （ｂ）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの
インヒビターであると疑われる物質に該試験細胞をさらすこと、 （ｃ）該物質にさらされた試験細胞における蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥ
Ｔ）の量を測定すること、 （ｄ）該物質にさらされた試験細胞により示されたＦＲＥＴの量を、対照細胞
により示されたＦＲＥＴの量と比較することを含んでなり、 該試験細胞により示されたＦＲＥＴの量が、該対照細胞により示されたＦＲＥ
Ｔの量より少ない場合、該物質が、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有
するカリウムチャンネルのインヒビターであり、 該対照細胞が、（１）それが（ａ）（１）〜（３）に記載の事項の少なくとも
１つを含まないこと以外は該試験細胞と実質的に同じであるが、該物質にさらさ
れた細胞、または（２）該物質にさらされていない試験細胞である、方法を提供
する。
【００７３】
前記アッセイの変法においては、該細胞の膜電位をそれ自身で定常状態に到達
させる代わりに、該膜電位を、ＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリ
ウムチャンネルが開く電位に人工的に設定する。これは、例えば、公知方法で外
部Ｋ＋濃度を変化（例えば、外部Ｋ＋濃度を増加）させることにより行なうこと
ができる。開いたヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質含有カリウムチャンネル
を有するそのような細胞をインヒビターにさらすと、該カリウムチャンネルは閉
じ、該細胞の膜電位は脱分極するであろう。この脱分極はＦＲＥＴの減少として
観察されうる。
させる代わりに、該膜電位を、ＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリ
ウムチャンネルが開く電位に人工的に設定する。これは、例えば、公知方法で外
部Ｋ＋濃度を変化（例えば、外部Ｋ＋濃度を増加）させることにより行なうこと
ができる。開いたヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質含有カリウムチャンネル
を有するそのような細胞をインヒビターにさらすと、該カリウムチャンネルは閉
じ、該細胞の膜電位は脱分極するであろう。この脱分極はＦＲＥＴの減少として
観察されうる。
【００７４】
したがって、本発明は、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリ
ウムチャンネルのインヒビターの同定方法であって、 （ａ）細胞を準備すること（該細胞は、 （１）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネル
が該細胞内で形成されるように、該細胞内でのヒトＩｓＫ２サブユニットタンパ
ク質の発現を指令する発現ベクター、 （２）該細胞の形質膜の一方の側に結合している第１蛍光染料、および （３）膜電位の変化に応答して該細胞の形質膜の一方の面から他方の面へ自
由に往復できる第２蛍光染料を含む）、 （ｂ）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルに
より形成されたイオンチャンネルが開くように該細胞の膜電位を調節すること、 （ｃ）該試験細胞における蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の量を測定す
ること、 （ｄ）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの
インヒビターであると疑われる物質に該細胞をさらしながら、工程（ｂ）および
工程（ｃ）を繰返すことを含んでなり、 該物質にされされた細胞により示されたＦＲＥＴの量が、該物質にさらされて
ない細胞により示されたＦＲＥＴの量より少ない場合、該物質が、ヒトＩｓＫ２
サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルのインヒビターである、
方法を提供する。
ウムチャンネルのインヒビターの同定方法であって、 （ａ）細胞を準備すること（該細胞は、 （１）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネル
が該細胞内で形成されるように、該細胞内でのヒトＩｓＫ２サブユニットタンパ
ク質の発現を指令する発現ベクター、 （２）該細胞の形質膜の一方の側に結合している第１蛍光染料、および （３）膜電位の変化に応答して該細胞の形質膜の一方の面から他方の面へ自
由に往復できる第２蛍光染料を含む）、 （ｂ）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルに
より形成されたイオンチャンネルが開くように該細胞の膜電位を調節すること、 （ｃ）該試験細胞における蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の量を測定す
ること、 （ｄ）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの
インヒビターであると疑われる物質に該細胞をさらしながら、工程（ｂ）および
工程（ｃ）を繰返すことを含んでなり、 該物質にされされた細胞により示されたＦＲＥＴの量が、該物質にさらされて
ない細胞により示されたＦＲＥＴの量より少ない場合、該物質が、ヒトＩｓＫ２
サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルのインヒビターである、
方法を提供する。
【００７５】
前記方法の特定の実施形態においては、該発現ベクターを該試験細胞内にトラ
ンスフェクトする。
ンスフェクトする。
【００７６】
前記方法の特定の実施形態においては、該ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク
質は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する。前記方法の特定の実施形態にお
いては、該発現ベクターは配列番号１の７９−４４７位を含む。
質は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する。前記方法の特定の実施形態にお
いては、該発現ベクターは配列番号１の７９−４４７位を含む。
【００７７】
前記方法の特定の実施形態においては、該第１蛍光染料は、蛍光性レクチン、
蛍光性リン脂質、クマリン標識ホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−（６−ク
ロロ−７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボキサ
ミドアセチル）−ジミリストイルホスファチジル−エタノールアミン）、Ｎ−（
７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）−ジパルミト
イルホスファチジルエタノールアミン）およびフルオレセイン標識コムギ胚芽凝
集素よりなる群から選ばれる。
蛍光性リン脂質、クマリン標識ホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−（６−ク
ロロ−７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボキサ
ミドアセチル）−ジミリストイルホスファチジル−エタノールアミン）、Ｎ−（
７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）−ジパルミト
イルホスファチジルエタノールアミン）およびフルオレセイン標識コムギ胚芽凝
集素よりなる群から選ばれる。
【００７８】
前記方法の特定の実施形態においては、該第２蛍光染料は、蛍光受容体として
作用するオキソノール、ビス（１，３−ジアルキル−２−チオバルビツラート）
トリメチンオキソノール、ビス（１，３−ジヘキシル−２−チオバルビツラート
）トリメチンオキソノール、ビス（１，３−ジアルキル−２−チオバルビツラー
ト）クワトラ（ｑｕａｔｒａ）メチンオキソノール、ビス（１，３−ジアルキル
−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノール、ビス（１，３−ジヘキ
シル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノール、ビス（１，３−ジ
ブチル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノール）、およびビス（
１，３−ジアルキル−２−チオバルビツラート）ヘキサメチンオキソノールより
なる群から選ばれる。
作用するオキソノール、ビス（１，３−ジアルキル−２−チオバルビツラート）
トリメチンオキソノール、ビス（１，３−ジヘキシル−２−チオバルビツラート
）トリメチンオキソノール、ビス（１，３−ジアルキル−２−チオバルビツラー
ト）クワトラ（ｑｕａｔｒａ）メチンオキソノール、ビス（１，３−ジアルキル
−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノール、ビス（１，３−ジヘキ
シル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノール、ビス（１，３−ジ
ブチル−２−チオバルビツラート）ペンタメチンオキソノール）、およびビス（
１，３−ジアルキル−２−チオバルビツラート）ヘキサメチンオキソノールより
なる群から選ばれる。
【００７９】
前記方法の特定の実施形態においては、該細胞は真核細胞である。もう１つの
実施形態においては、該細胞は哺乳類細胞である。他の実施形態においては、該
細胞は、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．２）、２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）、Ｒａ
ｊｉ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯ
Ｓ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６
５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ
９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣ
Ｃ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）、ツメ
ガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）黒色素胞、またはツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母
細胞である。
実施形態においては、該細胞は哺乳類細胞である。他の実施形態においては、該
細胞は、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．２）、２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）、Ｒａ
ｊｉ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯ
Ｓ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６
５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ
９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣ
Ｃ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）、ツメ
ガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）黒色素胞、またはツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母
細胞である。
【００８０】
前記方法の特定の実施形態においては、該対照細胞は（ａ）（１）項は含まな
いが、（ａ）（２）および（ａ）（３）項は含む。
いが、（ａ）（２）および（ａ）（３）項は含む。
【００８１】
ＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルのアクチベー
ターまたはインヒビターを同定するためのアッセイにおいては、機能的ヘテロマ
ーカリウムチャンネルを形成させるために、該ヒトＩｓＫ２サブユニットに加え
て、もう１つのカリウムチャンネルサブユニットを共発現させることが有利であ
ろう。特に、ヒトＫｖＱＬＴ１（Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉら，１９９６，Ｎａｔ
ｕｒｅ ３８４：８０−８３；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ７１０７７
およびＵ４０９９０）、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）ＫｖＱＬＴ１（Ｓａｎｇ
ｕｉｎｅｔｔｉら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ ３８４：８０−８３；ＧｅｎＢａ
ｎｋアクセッション番号Ｕ７１０７６）またはｈ−ｅｒｇ（Ｗａｒｍｋｅ ＆
Ｇａｎｅｔｚｋｙ，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９１：３４３８−３４４２；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０４２７０
）のようなカリウムチャンネルサブユニットを共発現させることが有利であろう
。
ターまたはインヒビターを同定するためのアッセイにおいては、機能的ヘテロマ
ーカリウムチャンネルを形成させるために、該ヒトＩｓＫ２サブユニットに加え
て、もう１つのカリウムチャンネルサブユニットを共発現させることが有利であ
ろう。特に、ヒトＫｖＱＬＴ１（Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉら，１９９６，Ｎａｔ
ｕｒｅ ３８４：８０−８３；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ７１０７７
およびＵ４０９９０）、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）ＫｖＱＬＴ１（Ｓａｎｇ
ｕｉｎｅｔｔｉら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ ３８４：８０−８３；ＧｅｎＢａ
ｎｋアクセッション番号Ｕ７１０７６）またはｈ−ｅｒｇ（Ｗａｒｍｋｅ ＆
Ｇａｎｅｔｚｋｙ，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９１：３４３８−３４４２；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ０４２７０
）のようなカリウムチャンネルサブユニットを共発現させることが有利であろう
。
【００８２】
前記方法は、明示的には、「ある１つの」物質が、ヒトＩｓＫ２サブユニット
タンパク質を含有するカリウムチャンネルのアクチベーターまたはインヒビター
であるか否かの試験に関するものであるが、そのような方法は、物質の集合体、
例えば組合せ（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ）ライブラリー、ファージ提示ライ
ブラリー、天然物の集合体を試験してそのような集合体のいずれかのメンバーが
ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質含有カリウムチャンネルのアクチベーター
またはインヒビターであるか否かを判定するのに応用されうることが当業者に明
らかであろう。したがって、前記方法における物質として物質の集合体またはそ
のような集合体の個々のメンバーを使用することが、本発明の範囲内に含まれる
。特に、カリウムイオンチャンネルのモジュレーションに関連していることが知
られている化学構造体を含むように設計されたライブラリー、例えば、カリウム
チャンネルアクチベーターに関するジヒドロベンゾピランライブラリー（国際特
許公開ＷＯ９５／３０６４２）またはカリウムチャンネルインヒビターに関する
ビフェニル−誘導体ライブラリー（国際特許公開ＷＯ９５／０４２７７）が特に
適していると予想される。
タンパク質を含有するカリウムチャンネルのアクチベーターまたはインヒビター
であるか否かの試験に関するものであるが、そのような方法は、物質の集合体、
例えば組合せ（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ）ライブラリー、ファージ提示ライ
ブラリー、天然物の集合体を試験してそのような集合体のいずれかのメンバーが
ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質含有カリウムチャンネルのアクチベーター
またはインヒビターであるか否かを判定するのに応用されうることが当業者に明
らかであろう。したがって、前記方法における物質として物質の集合体またはそ
のような集合体の個々のメンバーを使用することが、本発明の範囲内に含まれる
。特に、カリウムイオンチャンネルのモジュレーションに関連していることが知
られている化学構造体を含むように設計されたライブラリー、例えば、カリウム
チャンネルアクチベーターに関するジヒドロベンゾピランライブラリー（国際特
許公開ＷＯ９５／３０６４２）またはカリウムチャンネルインヒビターに関する
ビフェニル−誘導体ライブラリー（国際特許公開ＷＯ９５／０４２７７）が特に
適していると予想される。
【００８３】
本発明は、本明細書に記載の方法により同定されたヒトＩｓＫ２サブユニット
タンパク質を含むカリウムチャンネルのアクチベーターまたはインヒビターを含
んでなる医薬組成物を含む。一般には、該アクチベーターまたはインヒビターを
医薬上許容される担体と一緒にして医薬組成物を得る。アクチベーターまたはイ
ンヒビターと担体とを含有する医薬組成物の製剤化のそのような担体および方法
の具体例は、Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓ
ｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに記載されている。有効な投与に適した
医薬上許容される組成物を形成させるためには、そのような組成物は、該アクチ
ベーターまたはインヒビターの治療的に有効な量を含有するであろう。
タンパク質を含むカリウムチャンネルのアクチベーターまたはインヒビターを含
んでなる医薬組成物を含む。一般には、該アクチベーターまたはインヒビターを
医薬上許容される担体と一緒にして医薬組成物を得る。アクチベーターまたはイ
ンヒビターと担体とを含有する医薬組成物の製剤化のそのような担体および方法
の具体例は、Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓ
ｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに記載されている。有効な投与に適した
医薬上許容される組成物を形成させるためには、そのような組成物は、該アクチ
ベーターまたはインヒビターの治療的に有効な量を含有するであろう。
【００８４】
治療用または予防用組成物は、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有す
るカリウムチャンネルの活性が異常である状態を治療または予防するのに十分な
量で個体に投与する。該有効量は、個体の状態、体重、性別、年齢などの種々の
要因によって様々となりうる。他の要因には投与様式が含まれる。適当な量は、
熟練した医師により決定されうる。一般には、有効量は、約０．０１〜約１，０
００、好ましくは約０．１〜約２５０、より一層好ましくは約１〜約５０ｍｇ／
ヒト成人／日である。
るカリウムチャンネルの活性が異常である状態を治療または予防するのに十分な
量で個体に投与する。該有効量は、個体の状態、体重、性別、年齢などの種々の
要因によって様々となりうる。他の要因には投与様式が含まれる。適当な量は、
熟練した医師により決定されうる。一般には、有効量は、約０．０１〜約１，０
００、好ましくは約０．１〜約２５０、より一層好ましくは約１〜約５０ｍｇ／
ヒト成人／日である。
【００８５】
組成物は、適当な投与量で単独で使用することができる。あるいは、他の物質
の同時投与または連続的投与が望ましいことがある。
の同時投与または連続的投与が望ましいことがある。
【００８６】
該組成物は、通常の投与用ビヒクル中の多種多様な治療用剤形として投与する
ことができる。例えば、該組成物は、錠剤、カプセル剤（それぞれは時限放出（
ｔｉｍｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）および徐放製剤を含む）、丸剤、散剤、顆粒剤、
エリキシル剤、チンキ剤、水剤、懸濁剤、シロップ剤、乳剤などの経口剤形とし
て又は注射により投与することができる。同様に、それらを、静脈内（ボーラス
および注入の両方）、腹腔内、皮下、局所（閉塞（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）の存在
下または不存在下）または筋肉内形態として投与することも可能であり、それら
はすべて、薬学分野の当業者によく知られた形態を用いることが可能である。
ことができる。例えば、該組成物は、錠剤、カプセル剤（それぞれは時限放出（
ｔｉｍｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）および徐放製剤を含む）、丸剤、散剤、顆粒剤、
エリキシル剤、チンキ剤、水剤、懸濁剤、シロップ剤、乳剤などの経口剤形とし
て又は注射により投与することができる。同様に、それらを、静脈内（ボーラス
および注入の両方）、腹腔内、皮下、局所（閉塞（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）の存在
下または不存在下）または筋肉内形態として投与することも可能であり、それら
はすべて、薬学分野の当業者によく知られた形態を用いることが可能である。
【００８７】
組成物を単回１日量で投与したり、あるいは合計１日量を毎日２、３、４回以
上の分割量で投与するのが有利かもしれない。さらに、組成物は、適当な鼻腔内
ビヒクルの局所的使用により鼻腔内形態で、または当業者によく知られた経皮皮
膚パッチの形態を使用して経皮経路により投与することができる。もちろん、経
皮デリバリーシステムの形態で投与されるためには、該投与量の投与は、該投与
計画の全体にわたり、断続的なものではなく連続的なものとなるであろう。
上の分割量で投与するのが有利かもしれない。さらに、組成物は、適当な鼻腔内
ビヒクルの局所的使用により鼻腔内形態で、または当業者によく知られた経皮皮
膚パッチの形態を使用して経皮経路により投与することができる。もちろん、経
皮デリバリーシステムの形態で投与されるためには、該投与量の投与は、該投与
計画の全体にわたり、断続的なものではなく連続的なものとなるであろう。
【００８８】
該組成物を使用する投与計画は、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別および
医学的状態；治療すべき状態の重症度；投与経路；患者の腎、肝および心臓血管
機能；および使用するその個々の組成物を含む種々の要因に応じて選択される。
通常の技量を有する医師は、該状態の進行の予防、阻止または停止に必要な組成
物の有効量を容易に決定し、処方することができる。毒性を伴うことなく効力を
与える範囲内の組成物濃度を最適に正確に得るためには、標的部位に対する該組
成物のアベイラビリティーの速度論に基づく計画が必要である。これは、組成物
の分布、平衡および消失に関する考慮を含む。
医学的状態；治療すべき状態の重症度；投与経路；患者の腎、肝および心臓血管
機能；および使用するその個々の組成物を含む種々の要因に応じて選択される。
通常の技量を有する医師は、該状態の進行の予防、阻止または停止に必要な組成
物の有効量を容易に決定し、処方することができる。毒性を伴うことなく効力を
与える範囲内の組成物濃度を最適に正確に得るためには、標的部位に対する該組
成物のアベイラビリティーの速度論に基づく計画が必要である。これは、組成物
の分布、平衡および消失に関する考慮を含む。
【００８９】
ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルのインヒ
ビターおよびアクチベーターは、過剰または不十分なカリウムチャンネル活性に
関連した種々の疾患の治療に有用である。
ビターおよびアクチベーターは、過剰または不十分なカリウムチャンネル活性に
関連した種々の疾患の治療に有用である。
【００９０】
本発明のインヒビターは、現在販売されているカリウムチャンネルインヒビタ
ーが有効な状態において有用であると予想される。例えば、カリウムチャンネル
アンタゴニストは、心筋梗塞を治療するためのクラスＩＩＩ抗不整脈剤として使
用されている。本発明のインヒビターもこのような様態で有用でありうると予想
される。
ーが有効な状態において有用であると予想される。例えば、カリウムチャンネル
アンタゴニストは、心筋梗塞を治療するためのクラスＩＩＩ抗不整脈剤として使
用されている。本発明のインヒビターもこのような様態で有用でありうると予想
される。
【００９１】
ヒトＩｓＫ２タンパク質は胃のＧ細胞において特異的に発現される。胃のＧ細
胞は、壁細胞による酸分泌の調節に関与するガストリンを分泌する。したがって
、ＩｓＫ２を含むカリウムチャンネルの活性のモジュレーターは、ガストリン分
泌および酸生成の調節において有用でありうる。
胞は、壁細胞による酸分泌の調節に関与するガストリンを分泌する。したがって
、ＩｓＫ２を含むカリウムチャンネルの活性のモジュレーターは、ガストリン分
泌および酸生成の調節において有用でありうる。
【００９２】
本発明のＩｓＫ２サブユニットは、他のイオンチャンネルのアクチベーターお
よびインヒビターを同定するように設計されたスクリーニングに関して有用であ
る。標的イオンチャンネルと特異的に相互作用する潜在的医薬を同定するために
化合物をスクリーニングする場合には、同定される化合物が該標的イオンチャン
ネルに対して可能な限り特異的であることを保証する必要がある。これを行なう
ためには、該標的イオンチャンネルに類似した可能な限り多種多様なイオンチャ
ンネルに対して該化合物をスクリーニングする必要がある。例えば、イオンチャ
ンネルＡと相互作用する潜在的医薬である化合物を見出すためには、該化合物が
イオンチャンネルＡ（「プラス標的」）と相互作用しイオンチャンネルＡを介し
て所望の薬理学的効果をもたらすことを保証するだけでは十分ではない。該化合
物がイオンチャンネルＢ、Ｃ、Ｄなど（「マイナス標的」）とは相互作用しない
ことを確認する必要もある。一般に、スクリーニング計画の一部として、可能な
限り多数のマイナス標的を有することが重要である（Ｈｏｄｇｓｏｎ，１９９２
，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：９７３−９８０、９８０頁を参照され
たい）。ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質、ヒトＩｓＫ２サブユニットタン
パク質をコードするＤＮＡ、およびヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を発現
するように操作された組換え細胞は、他のイオンチャンネルと特異的に相互作用
する化合物を同定するように設計されたスクリーニングにおいて「マイナス標的
」として使用されうる点で有用である。例えば、Ｗａｎｇら，１９９８，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２８２：１８９０−１８９３は、ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３が、「
Ｍ−チャンネル」として公知のヘテロマーカリウムイオンチャンネルを形成する
ことを示している。ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３における突然変異は、てんかん
の原因となるため（Ｂｉｅｒｖｅｒｔら,１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：
４０３−４０６；Ｓｉｎｇｈら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．１８：
２５−２９；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ １９９８，３９６：６８７
−６９０）、Ｍチャンネルは薬物発見のための重要な標的である。Ｍチャンネル
のアクチベーターまたはインヒビターを同定するように設計されたスクリーニン
グ計画は、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含むカリウムチャンネルの、
マイナス標的としての使用により、著しい利益を得るであろう。
よびインヒビターを同定するように設計されたスクリーニングに関して有用であ
る。標的イオンチャンネルと特異的に相互作用する潜在的医薬を同定するために
化合物をスクリーニングする場合には、同定される化合物が該標的イオンチャン
ネルに対して可能な限り特異的であることを保証する必要がある。これを行なう
ためには、該標的イオンチャンネルに類似した可能な限り多種多様なイオンチャ
ンネルに対して該化合物をスクリーニングする必要がある。例えば、イオンチャ
ンネルＡと相互作用する潜在的医薬である化合物を見出すためには、該化合物が
イオンチャンネルＡ（「プラス標的」）と相互作用しイオンチャンネルＡを介し
て所望の薬理学的効果をもたらすことを保証するだけでは十分ではない。該化合
物がイオンチャンネルＢ、Ｃ、Ｄなど（「マイナス標的」）とは相互作用しない
ことを確認する必要もある。一般に、スクリーニング計画の一部として、可能な
限り多数のマイナス標的を有することが重要である（Ｈｏｄｇｓｏｎ，１９９２
，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：９７３−９８０、９８０頁を参照され
たい）。ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質、ヒトＩｓＫ２サブユニットタン
パク質をコードするＤＮＡ、およびヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を発現
するように操作された組換え細胞は、他のイオンチャンネルと特異的に相互作用
する化合物を同定するように設計されたスクリーニングにおいて「マイナス標的
」として使用されうる点で有用である。例えば、Ｗａｎｇら，１９９８，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２８２：１８９０−１８９３は、ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３が、「
Ｍ−チャンネル」として公知のヘテロマーカリウムイオンチャンネルを形成する
ことを示している。ＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３における突然変異は、てんかん
の原因となるため（Ｂｉｅｒｖｅｒｔら,１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：
４０３−４０６；Ｓｉｎｇｈら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．１８：
２５−２９；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ １９９８，３９６：６８７
−６９０）、Ｍチャンネルは薬物発見のための重要な標的である。Ｍチャンネル
のアクチベーターまたはインヒビターを同定するように設計されたスクリーニン
グ計画は、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含むカリウムチャンネルの、
マイナス標的としての使用により、著しい利益を得るであろう。
【００９３】
イオンチャンネルモジュレーターの同定を目的とした薬物発見計画は、ＩＫｓ
電流を引き起こすカリウムチャンネルをマイナス標的として利用するカウンター
スクリーニング（ｃｏｕｎｔｅｒｓｃｒｅｅｎ）を含むべきであると認識されて
いる。例えば、Ｃｕｒｒａｎ，１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉ
ｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：５６５−５７２，５６７頁，左欄：“［
Ｓ］ｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｇａｉｎｓｔ ＩＫｒ ａｎｄ ＩＫｓ ｅａｒｌｙ
ｉｎ ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｐｒｏｃｅｓｓ ｓｈｏ
ｕｌｄ ｂｅ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ”を参照されたい。ｍｉｎＫは、ＩＫｓ電
流を引き起こすカリウムチャンネルのサブユニットであるため（Ｓａｎｇｕｉｎ
ｅｔｔｉら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ ３８４：８０−８３）、そしてＩｓＫ２
はｍｉｎＫと密接に関連しているため（本明細書の図２を参照されたい）、イオ
ンチャンネルモジュレーターの同定を目的とした薬物発見プログラムは、ＩｓＫ
２を含有するカリウムチャンネルをマイナス標的として利用するカウンタースク
リーニングを含むべきである。
スクリーニング（ｃｏｕｎｔｅｒｓｃｒｅｅｎ）を含むべきであると認識されて
いる。例えば、Ｃｕｒｒａｎ，１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉ
ｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：５６５−５７２，５６７頁，左欄：“［
Ｓ］ｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｇａｉｎｓｔ ＩＫｒ ａｎｄ ＩＫｓ ｅａｒｌｙ
ｉｎ ｔｈｅ ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｐｒｏｃｅｓｓ ｓｈｏ
ｕｌｄ ｂｅ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ”を参照されたい。ｍｉｎＫは、ＩＫｓ電
流を引き起こすカリウムチャンネルのサブユニットであるため（Ｓａｎｇｕｉｎ
ｅｔｔｉら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ ３８４：８０−８３）、そしてＩｓＫ２
はｍｉｎＫと密接に関連しているため（本明細書の図２を参照されたい）、イオ
ンチャンネルモジュレーターの同定を目的とした薬物発見プログラムは、ＩｓＫ
２を含有するカリウムチャンネルをマイナス標的として利用するカウンタースク
リーニングを含むべきである。
【００９４】
本発明はまた、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質に対する抗体を含む。そ
のような抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体でありうる。本発
明の抗体は、当技術分野でよく知られた方法により、全ヒトＩｓＫ２サブユニッ
トタンパク質に対して、または血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシア
ニンなどの適当な担体と共役した適当な抗原断片に対して産生させることができ
る。タンパク質の適当な抗原断片を同定する方法は、当技術分野で公知である。
例えば、Ｈｏｐｐ ＆ Ｗｏｏｄｓ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：３８２４−３８２８およびＪａｍｅｓｏｎ ＆ Ｗｏ
ｌｆ，１９８８，ＣＡＢＩＯＳ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）４：１８１−１８６を参照されたい
。
のような抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体でありうる。本発
明の抗体は、当技術分野でよく知られた方法により、全ヒトＩｓＫ２サブユニッ
トタンパク質に対して、または血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシア
ニンなどの適当な担体と共役した適当な抗原断片に対して産生させることができ
る。タンパク質の適当な抗原断片を同定する方法は、当技術分野で公知である。
例えば、Ｈｏｐｐ ＆ Ｗｏｏｄｓ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：３８２４−３８２８およびＪａｍｅｓｏｎ ＆ Ｗｏ
ｌｆ，１９８８，ＣＡＢＩＯＳ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）４：１８１−１８６を参照されたい
。
【００９５】
ポリクローナル抗体の産生のためには、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質
または抗原断片（適当な担体に共役させたもの）を、適当な非ヒト宿主動物（例
えば、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス）に定期的に注射する。該動物か
ら定期的に採血し、得られた血清を、注射されたサブユニットまたは抗原断片に
対する抗体の存在に関して試験する。該注射は、筋肉内、腹腔内、皮下などに行
なうことができ、アジュバントと共に行なうことができる。
または抗原断片（適当な担体に共役させたもの）を、適当な非ヒト宿主動物（例
えば、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス）に定期的に注射する。該動物か
ら定期的に採血し、得られた血清を、注射されたサブユニットまたは抗原断片に
対する抗体の存在に関して試験する。該注射は、筋肉内、腹腔内、皮下などに行
なうことができ、アジュバントと共に行なうことができる。
【００９６】
モノクローナル抗体の産生のためには、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質
または抗原断片（適当な担体に共役させたもの）を、ポリクローナル抗体の産生
に関して前記したのと同様に適当な非ヒト宿主動物に注射する。モノクローナル
抗体の場合には、該動物は一般にはマウスである。ついで該動物の脾臓細胞を不
死化させる。これは、しばしば、Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７
５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７に記載のとおり、骨髄腫細胞との融
合により行なう。モノクローナル抗体の産生の更に詳しい説明については、Ａｎ ｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，Ｈａｒｌｏｗ
＆ Ｌａｎｅ編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８を参照されたい。
または抗原断片（適当な担体に共役させたもの）を、ポリクローナル抗体の産生
に関して前記したのと同様に適当な非ヒト宿主動物に注射する。モノクローナル
抗体の場合には、該動物は一般にはマウスである。ついで該動物の脾臓細胞を不
死化させる。これは、しばしば、Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７
５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７に記載のとおり、骨髄腫細胞との融
合により行なう。モノクローナル抗体の産生の更に詳しい説明については、Ａｎ ｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，Ｈａｒｌｏｗ
＆ Ｌａｎｅ編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８を参照されたい。
【００９７】
ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を標的器官の細胞内に導入するために、
遺伝子治療を用いることができる。ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質をコー
ドするヌクレオチドは、レシピエント細胞への感染により該ヌクレオチドの導入
を媒介するウイルスベクターに連結させることができる。適当なウイルスベクタ
ーには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイ
ルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルスおよびポリオウイルスに基づくベク
ターが含まれる。あるいは、リガンド−ヌクレオチドコンジュゲートを使用する
受容体媒介標的化導入（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔａｒｇｅｔｅ
ｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ）、リポフェクション、膜融合または直接マイクロインジ
ェクションを含む非ウイルス技術により、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質
をコードするヌクレオチドを遺伝子治療のために細胞内に導入することができる
。これらの方法およびそれらの変法は、エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）およびイ
ンビボ遺伝子治療に適している。ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質での遺伝
子治療は、カリウムチャンネルの活性を上昇させることが有益である疾患の治療
に特に有用であろう。
遺伝子治療を用いることができる。ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質をコー
ドするヌクレオチドは、レシピエント細胞への感染により該ヌクレオチドの導入
を媒介するウイルスベクターに連結させることができる。適当なウイルスベクタ
ーには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイ
ルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルスおよびポリオウイルスに基づくベク
ターが含まれる。あるいは、リガンド−ヌクレオチドコンジュゲートを使用する
受容体媒介標的化導入（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔａｒｇｅｔｅ
ｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ）、リポフェクション、膜融合または直接マイクロインジ
ェクションを含む非ウイルス技術により、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質
をコードするヌクレオチドを遺伝子治療のために細胞内に導入することができる
。これらの方法およびそれらの変法は、エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）およびイ
ンビボ遺伝子治療に適している。ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質での遺伝
子治療は、カリウムチャンネルの活性を上昇させることが有益である疾患の治療
に特に有用であろう。
【００９８】
本発明は、非ヒト種からヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質のオーソログ（
ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）をクローニングするための方法を含む。一般には、その
ような方法は、配列番号１に基づくＰＣＲプライマーまたはハイブリダイゼーシ
ョンプローブを調製することを含み、これは、非ヒトＩｓＫ２サブユニットを含
有する断片を適当なＤＮＡ調製物から増幅するために（ＰＣＲの場合）または非
ヒトＩｓＫ２サブユニットを含有するｃＤＮＡもしくはゲノムクローンを適当な
ライブラリーから選択するために使用されうる。この方法の好ましい実施形態は
、該ＩｓＫ２サブユニットをマウスからクローニングするための方法である。
ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）をクローニングするための方法を含む。一般には、その
ような方法は、配列番号１に基づくＰＣＲプライマーまたはハイブリダイゼーシ
ョンプローブを調製することを含み、これは、非ヒトＩｓＫ２サブユニットを含
有する断片を適当なＤＮＡ調製物から増幅するために（ＰＣＲの場合）または非
ヒトＩｓＫ２サブユニットを含有するｃＤＮＡもしくはゲノムクローンを適当な
ライブラリーから選択するために使用されうる。この方法の好ましい実施形態は
、該ＩｓＫ２サブユニットをマウスからクローニングするための方法である。
【００９９】
本発明は、マウスＩｓＫ２サブユニットをコードするＤＮＡを提供することに
より、ＩｓＫ２サブユニットの活性が異常であるヒト疾患のモデル動物の作製を
可能にする。そのようなモデル動物は、改変されたＩｓＫ２サブユニット遺伝子
を含有するトランスジェニック「ノックアウト」または「ノックイン」マウスを
作ることにより作製することができる。マウスＩｓＫ２サブユニット遺伝子の部
分が欠失したノックアウトマウスを作製することができる。ヒト疾患を招くこと
が示されている突然変異が該マウス遺伝子内に導入されたノックインマウスを作
製することができる。そのようなノックアウトおよびノックインマウスは、カリ
ウムチャンネルと疾患との関係の研究における貴重な手段であり、カリウムチャ
ンネルが関与するヒト疾患の潜在的医薬または治療方法を試験するための重要な
モデル系を提供するであろう。
より、ＩｓＫ２サブユニットの活性が異常であるヒト疾患のモデル動物の作製を
可能にする。そのようなモデル動物は、改変されたＩｓＫ２サブユニット遺伝子
を含有するトランスジェニック「ノックアウト」または「ノックイン」マウスを
作ることにより作製することができる。マウスＩｓＫ２サブユニット遺伝子の部
分が欠失したノックアウトマウスを作製することができる。ヒト疾患を招くこと
が示されている突然変異が該マウス遺伝子内に導入されたノックインマウスを作
製することができる。そのようなノックアウトおよびノックインマウスは、カリ
ウムチャンネルと疾患との関係の研究における貴重な手段であり、カリウムチャ
ンネルが関与するヒト疾患の潜在的医薬または治療方法を試験するための重要な
モデル系を提供するであろう。
【０１００】
したがって、本発明は、
（ａ）マウスＩｓＫ２サブユニット遺伝子またはｃＤＮＡをクローニングする
のに使用するＰＣＲプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブを配列番号１
に基づき設計すること、 （ｂ）該ＰＣＲプライマーまたは該オリゴヌクレオチドプローブを使用して、
該マウスＩｓＫ２サブユニット遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部（該一部
は、トランスジェニックマウスの作製に使用するのに十分な程度に大きい）をク
ローニングすること、 （ｃ）天然状態から改変された該マウスＩｓＫ２サブユニット遺伝子の少なく
とも１つのコピーを有するトランスジェニックマウスを製造することを含んでな
る、トランスジェニックマウスの製造方法を含む。
のに使用するＰＣＲプライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブを配列番号１
に基づき設計すること、 （ｂ）該ＰＣＲプライマーまたは該オリゴヌクレオチドプローブを使用して、
該マウスＩｓＫ２サブユニット遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部（該一部
は、トランスジェニックマウスの作製に使用するのに十分な程度に大きい）をク
ローニングすること、 （ｃ）天然状態から改変された該マウスＩｓＫ２サブユニット遺伝子の少なく
とも１つのコピーを有するトランスジェニックマウスを製造することを含んでな
る、トランスジェニックマウスの製造方法を含む。
【０１０１】
ノックアウトマウスおよびノックインマウスの製造方法は当技術分野でよく知
られている。１つの方法は、標的遺伝子組換えトランスジェニックノックアウト
マウスの作製における標的遺伝子組換えＥＳ細胞の使用を含み、例えばＴｈｏｍ
ａｓら，１９８７，Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２に記載されており、種々の
文献に概説されている（Ｆｒｏｈｍａｎら，１９８９，Ｃｅｌｌ ５６：１４５
−１４７；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８９，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔ．５
：７０−７６；Ｂａｒｉｂａｕｌｔら，１９８９，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．
６：４８１−４９２）。
られている。１つの方法は、標的遺伝子組換えトランスジェニックノックアウト
マウスの作製における標的遺伝子組換えＥＳ細胞の使用を含み、例えばＴｈｏｍ
ａｓら，１９８７，Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２に記載されており、種々の
文献に概説されている（Ｆｒｏｈｍａｎら，１９８９，Ｃｅｌｌ ５６：１４５
−１４７；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８９，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔ．５
：７０−７６；Ｂａｒｉｂａｕｌｔら，１９８９，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．
６：４８１−４９２）。
【０１０２】
特定の変化を染色体遺伝子内に挿入するために標的化相同組換えを用いること
により任意の遺伝的領域を不活性化したり所望の実質的に任意の突然変異に改変
するための技術が利用可能である。一般には、「ターゲッティングベクター」、
すなわち、突然変異させたい遺伝的領域の部分を含有するプラスミドを使用する
。該プラスミド上の遺伝的領域のこの部分と該染色体上の対応遺伝的領域との相
同性に基づき、相同組換えを利用して該遺伝的領域内に該プラスミドを挿入して
、該遺伝的領域を破壊することができる。通常、該ターゲッティングベクターは
選択マーカー遺伝子も含有する。
により任意の遺伝的領域を不活性化したり所望の実質的に任意の突然変異に改変
するための技術が利用可能である。一般には、「ターゲッティングベクター」、
すなわち、突然変異させたい遺伝的領域の部分を含有するプラスミドを使用する
。該プラスミド上の遺伝的領域のこの部分と該染色体上の対応遺伝的領域との相
同性に基づき、相同組換えを利用して該遺伝的領域内に該プラスミドを挿入して
、該遺伝的領域を破壊することができる。通常、該ターゲッティングベクターは
選択マーカー遺伝子も含有する。
【０１０３】
１００％に近い頻度で生じる相同染色体外組換えと比較して、相同プラスミド
−染色体組換えは、１０−６〜１０−３の頻度でしか検出されないと当初は報告
された（Ｌｉｎら，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８２：１３９１−１３９５；Ｓｍｉｔｈｉｅｓら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ
３１７：２３０−２３４；Ｔｈｏｍａｓら，１９８６，Ｃｅｌｌ ４４：４１９
−４２８）。非相同プラスミド−染色体相互作用は、比較しうる相同的挿入より
頻繁であり、１０５倍（Ｌｉｎら，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１３９１−１３９５）〜１０２倍（Ｔｈｏｍａｓら，１
９８６，Ｃｅｌｌ ４４：４１９−４２８）大きなレベルで生じる。
−染色体組換えは、１０−６〜１０−３の頻度でしか検出されないと当初は報告
された（Ｌｉｎら，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８２：１３９１−１３９５；Ｓｍｉｔｈｉｅｓら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ
３１７：２３０−２３４；Ｔｈｏｍａｓら，１９８６，Ｃｅｌｌ ４４：４１９
−４２８）。非相同プラスミド−染色体相互作用は、比較しうる相同的挿入より
頻繁であり、１０５倍（Ｌｉｎら，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１３９１−１３９５）〜１０２倍（Ｔｈｏｍａｓら，１
９８６，Ｃｅｌｌ ４４：４１９−４２８）大きなレベルで生じる。
【０１０４】
マウスＥＳ細胞におけるこの低い標的化組換え率を克服するために、稀有（ｒ
ａｒｅ）相同組換え体を検出または選択するための種々の方法が開発されている
。相同改変事象を検出するための１つのアプローチでは、ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）を用いて相同的挿入に関して形質転換体細胞のプールをスクリーニン
グし、ついで個々のクローンをスクリーニングする（Ｋｉｍら，１９８８，Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：８８８７−８９０３；Ｋｉｍら，１９
９１，Ｇｅｎｅ １０３：２２７−２３３）。あるいは、相同的挿入が生じた場
合にのみ活性となるマーカー遺伝子を構築してこれらの組換え体が直接的に選択
されるのを可能にするポジティブ遺伝的選択アプローチが開発されている（Ｓｅ
ｄｉｖｙら，１９８９，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６
：２２７−２３１）。相同組換え体を選択するために開発された最も効果的なア
プローチの１つは、該改変の直接的選択が存在しない遺伝子用に開発されたポジ
ティブ−ネガティブ選択（ＰＮＳ）法である（Ｍａｎｓｏｕｒら，１９８８，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３３６：３４８−３５２；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８９，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８９，Ｔｒｅｎ
ｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔ．５：７０−７６）。ＰＮＳ法は、高レベルで発現され
ない遺伝子をターゲッティングするのに、より効率的である。なぜなら、該マー
カー遺伝子はそれ自体のプロモーターを有するからである。単純ヘルペスウイル
スチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子を使用しガンシクロビル（ＧＡＮＣ
）、ＦＩＡＵ（１−（２−デオキシ２−フルオロ−Ｂ−Ｄ−アラビノフラノシル
）−５−ヨードウラシル）などのヘルペス薬でその非相同的挿入に対して選択す
ることにより、非相同組換え体を選択する。この対抗選択により、生存している
形質転換体のうちの相同組換え体の割合を増加させることができる。
ａｒｅ）相同組換え体を検出または選択するための種々の方法が開発されている
。相同改変事象を検出するための１つのアプローチでは、ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）を用いて相同的挿入に関して形質転換体細胞のプールをスクリーニン
グし、ついで個々のクローンをスクリーニングする（Ｋｉｍら，１９８８，Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：８８８７−８９０３；Ｋｉｍら，１９
９１，Ｇｅｎｅ １０３：２２７−２３３）。あるいは、相同的挿入が生じた場
合にのみ活性となるマーカー遺伝子を構築してこれらの組換え体が直接的に選択
されるのを可能にするポジティブ遺伝的選択アプローチが開発されている（Ｓｅ
ｄｉｖｙら，１９８９，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６
：２２７−２３１）。相同組換え体を選択するために開発された最も効果的なア
プローチの１つは、該改変の直接的選択が存在しない遺伝子用に開発されたポジ
ティブ−ネガティブ選択（ＰＮＳ）法である（Ｍａｎｓｏｕｒら，１９８８，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３３６：３４８−３５２；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８９，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８９，Ｔｒｅｎ
ｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔ．５：７０−７６）。ＰＮＳ法は、高レベルで発現され
ない遺伝子をターゲッティングするのに、より効率的である。なぜなら、該マー
カー遺伝子はそれ自体のプロモーターを有するからである。単純ヘルペスウイル
スチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子を使用しガンシクロビル（ＧＡＮＣ
）、ＦＩＡＵ（１−（２−デオキシ２−フルオロ−Ｂ−Ｄ−アラビノフラノシル
）−５−ヨードウラシル）などのヘルペス薬でその非相同的挿入に対して選択す
ることにより、非相同組換え体を選択する。この対抗選択により、生存している
形質転換体のうちの相同組換え体の割合を増加させることができる。
【０１０５】
トランスジェニックマウスを製造するための他の方法は、受精卵の雄性前核の
マイクロインジェクションを含む。そのような方法は当技術分野でよく知られて
いる。
マイクロインジェクションを含む。そのような方法は当技術分野でよく知られて
いる。
【０１０６】
本発明は、トランスジェニック非ヒト動物であって、該動物のゲノムが、ヒト
ＩｓＫ２サブユニットの少なくとも一部をコードするＤＮＡを含有することを特
徴とする動物を含む。
ＩｓＫ２サブユニットの少なくとも一部をコードするＤＮＡを含有することを特
徴とする動物を含む。
【０１０７】
本発明を更に例示するために、以下に非限定的な実施例を記載する。
【０１０８】
実施例１
ヒトＩｓＫ２サブユニットの同定およびｃＤＮＡクローニング
ヒトｍｉｎＫをコードするＤＮＡ配列を使用して、相同配列に関してＧｅｎｂ
ａｎｋデータベースを検索した。この検索は、部分的なＩｓＫ２配列を含有する
ＥＳＴ（ＡＩ２４６２３９）を与えた。また、このＥＳＴ配列は、ゲノムＤＮＡ
配列ＡＰ０００５２（ヌクレオチド８０２１８−８０５８９）内で見出された。
この情報から、合成オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号４および５）を使
用して、ヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から、完全長コード領域、何ら
かの５’非翻訳配列（インフレーム終結コドンを含む）および少量の３’非翻訳
配列を増幅した。このＤＮＡ断片をＤＮＡクローニングベクター（ｐＣＲ２．１
，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にサブクローニングし、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１
０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して万能（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）
Ｔ７およびＭ１３リバースシークエンシングプライマーで配列決定した。ヒトの
胃におけるＩｓＫ２発現を示したノーザン分析に基づき、同じ合成オリゴヌクレ
オチドプライマー（配列番号４および５）を使用して、ヒト胃ｍＲＮＡからｃＤ
ＮＡ断片を増幅した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）、８ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、３ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ｄＮＴＰおよび２４単位のＡＭＶ
逆転写酵素中、１９μＭ ランダムヘキサマープライマーを４２℃で９０分間使
用して、第１鎖胃ｃＤＮＡを１．５ｇのヒトポリＡ＋ ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅ
ｃｈ）から合成した。ついで、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．７５）、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ Ｔｒ
ｉｔｏｎＸ１００、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、２００μＭ ｄＮＴＰ、１μＭ オリゴヌクレオチドプライマー、５単位のＴａｑ Ｐｌｕｓ Ｌｏｎｇ（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ）中、５％（２μＬ）の該合成ｃＤＮＡを鋳型として使用して
、ＰＣＲを行った。サイクリングパラメーターは、９４℃で１分間、５６℃で２
分間および７２℃で３分間の２５サイクルであった。このようにして増幅したｃ
ＤＮＡ断片をＴＡクローニングベクター内にクローニングし、配列決定した。該
胃ｃＤＮＡの配列と該ゲノムＤＮＡ断片の配列とは同一であった。
ａｎｋデータベースを検索した。この検索は、部分的なＩｓＫ２配列を含有する
ＥＳＴ（ＡＩ２４６２３９）を与えた。また、このＥＳＴ配列は、ゲノムＤＮＡ
配列ＡＰ０００５２（ヌクレオチド８０２１８−８０５８９）内で見出された。
この情報から、合成オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号４および５）を使
用して、ヒトゲノムＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から、完全長コード領域、何ら
かの５’非翻訳配列（インフレーム終結コドンを含む）および少量の３’非翻訳
配列を増幅した。このＤＮＡ断片をＤＮＡクローニングベクター（ｐＣＲ２．１
，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にサブクローニングし、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１
０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して万能（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）
Ｔ７およびＭ１３リバースシークエンシングプライマーで配列決定した。ヒトの
胃におけるＩｓＫ２発現を示したノーザン分析に基づき、同じ合成オリゴヌクレ
オチドプライマー（配列番号４および５）を使用して、ヒト胃ｍＲＮＡからｃＤ
ＮＡ断片を増幅した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）、８ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、３ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ｄＮＴＰおよび２４単位のＡＭＶ
逆転写酵素中、１９μＭ ランダムヘキサマープライマーを４２℃で９０分間使
用して、第１鎖胃ｃＤＮＡを１．５ｇのヒトポリＡ＋ ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅ
ｃｈ）から合成した。ついで、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．７５）、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ Ｔｒ
ｉｔｏｎＸ１００、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、２００μＭ ｄＮＴＰ、１μＭ オリゴヌクレオチドプライマー、５単位のＴａｑ Ｐｌｕｓ Ｌｏｎｇ（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ）中、５％（２μＬ）の該合成ｃＤＮＡを鋳型として使用して
、ＰＣＲを行った。サイクリングパラメーターは、９４℃で１分間、５６℃で２
分間および７２℃で３分間の２５サイクルであった。このようにして増幅したｃ
ＤＮＡ断片をＴＡクローニングベクター内にクローニングし、配列決定した。該
胃ｃＤＮＡの配列と該ゲノムＤＮＡ断片の配列とは同一であった。
【０１０９】
実施例２
ヒトＩｓＫ２サブユニットの発現の分析
ＲＴ−ＰＣＲ分析：
種々の組織における該ＩｓＫ２遺伝子の転写をＲＴ−ＰＣＲにより調べた。種
々のヒト組織（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、
前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸および末梢血白血球）に由来するポリ（Ａ＋）
−ＲＮＡから調製されたｃＤＮＡをＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃ
Ａ）から購入した。ＩｓＫ２ ｃＤＮＡの存在（これは、ある組織におけるこの
遺伝子の発現を示す）を、ＰＣＲによるその断片の増幅によりアッセイした。使
用したプライマーは、ＩｓＫ２の８４ｂｐの断片を増幅する５’−ＣＣＴ ＣＡ
Ｔ ＧＧＴ ＧＡＴ ＧＡＴ ＴＧＧ ＡＡ−３’（配列番号６）および５’−
ＧＡＧ ＴＧＴ ＴＣＣ ＣＧＴ ＣＴＣ ＴＴＧ ＧＡ−３’（配列番号７）
であった。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１
．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰ、２５０ｎＭの各オリゴヌクレオ
チドプライマー、０．０５Ｕ Ａｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅ
ｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）および０．４ｎｇ ｃＤ
ＮＡを含有する２０μＬの総容積中、ＰＣＲ増幅を行った。サイクリングパラメ
ーターは、９４℃で１０分間、ついで３５サイクルの９４℃で３０秒間、５６℃
で３０秒間および７２℃で９０秒間、ならびに最終的な７２℃で７分間の伸長期
よりなるものであった。増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分析した。
々のヒト組織（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、
前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸および末梢血白血球）に由来するポリ（Ａ＋）
−ＲＮＡから調製されたｃＤＮＡをＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃ
Ａ）から購入した。ＩｓＫ２ ｃＤＮＡの存在（これは、ある組織におけるこの
遺伝子の発現を示す）を、ＰＣＲによるその断片の増幅によりアッセイした。使
用したプライマーは、ＩｓＫ２の８４ｂｐの断片を増幅する５’−ＣＣＴ ＣＡ
Ｔ ＧＧＴ ＧＡＴ ＧＡＴ ＴＧＧ ＡＡ−３’（配列番号６）および５’−
ＧＡＧ ＴＧＴ ＴＣＣ ＣＧＴ ＣＴＣ ＴＴＧ ＧＡ−３’（配列番号７）
であった。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１
．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰ、２５０ｎＭの各オリゴヌクレオ
チドプライマー、０．０５Ｕ Ａｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅ
ｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）および０．４ｎｇ ｃＤ
ＮＡを含有する２０μＬの総容積中、ＰＣＲ増幅を行った。サイクリングパラメ
ーターは、９４℃で１０分間、ついで３５サイクルの９４℃で３０秒間、５６℃
で３０秒間および７２℃で９０秒間、ならびに最終的な７２℃で７分間の伸長期
よりなるものであった。増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分析した。
【０１１０】
ノーザンブロット分析：
ヒト心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、
精巣、卵巣、小腸、結腸、末梢血白血球、副腎髄質、甲状腺、副腎皮質、胃、子
宮および膀胱から単離されたポリ（Ａ＋）−ＲＮＡのノーザンブロットを、Ｃｌ
ｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａ）から購入し、３２Ｐ−標識ランダム
プライムドＩｓＫ２（配列番号１）でプローブした。該ハイブリダイゼーション
を、５×ＳＳＰＥ、１０×デンハルト液、５０％ ホルムアミド、２％ ＳＤＳ
、１００μｇ／ｍＬ サケ精子ＤＮＡ中、４２℃で一晩行った。ブロットを、２
×ＳＳＣ、０．０５％ ＳＤＳ中、４２℃で４０分間、ついで１×ＳＳＣ、０．
０５％ ＳＤＳ中、５０℃で４０分間、段階的に洗浄した。高いストリンジェン
シーの洗浄を、０．１×ＳＳＣ、０．０５％ ＳＤＳ中、６５℃で４０分間行っ
た。該ブロットをＫｏｄａｋ ＸＡＲ Ｘ線フィルムにさらすことにより又はＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓホスホイメージャーを使用する電子的検出
により、ハイブリダイゼーションを検出した。
精巣、卵巣、小腸、結腸、末梢血白血球、副腎髄質、甲状腺、副腎皮質、胃、子
宮および膀胱から単離されたポリ（Ａ＋）−ＲＮＡのノーザンブロットを、Ｃｌ
ｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａ）から購入し、３２Ｐ−標識ランダム
プライムドＩｓＫ２（配列番号１）でプローブした。該ハイブリダイゼーション
を、５×ＳＳＰＥ、１０×デンハルト液、５０％ ホルムアミド、２％ ＳＤＳ
、１００μｇ／ｍＬ サケ精子ＤＮＡ中、４２℃で一晩行った。ブロットを、２
×ＳＳＣ、０．０５％ ＳＤＳ中、４２℃で４０分間、ついで１×ＳＳＣ、０．
０５％ ＳＤＳ中、５０℃で４０分間、段階的に洗浄した。高いストリンジェン
シーの洗浄を、０．１×ＳＳＣ、０．０５％ ＳＤＳ中、６５℃で４０分間行っ
た。該ブロットをＫｏｄａｋ ＸＡＲ Ｘ線フィルムにさらすことにより又はＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓホスホイメージャーを使用する電子的検出
により、ハイブリダイゼーションを検出した。
【０１１１】
実施例３
どのαサブユニットがＩｓＫ２と潜在的に相互作用しうるのかを判定するため のノーザン分析
ノーザンブロット分析を用いて、公知αサブユニット遺伝子がＩｓＫ２と同じ
組織において発現され従ってそれと共集合して機能的チャンネルを形成しうるか
否かを判定した。骨格筋、子宮、結腸、小腸、膀胱、心臓、胃および前立腺から
単離された２μｇのポリＡ＋ ＲＮＡを含有するヒト多組織ノーザンブロットを
Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入した。ＫｖＬＱＴ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション
番号ＡＦ０００５７１；ヌクレオチド１２８９−２１４７）、ＫＣＮＱ２（Ｇｅ
ｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０３３３４８；ヌクレオチド１２３５−１４
２０）、ＫＣＮＱ３（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０３３３４７；ヌ
クレオチド１４７８−２４８２）、ＫＣＮＱ４（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション
番号ＡＦ１０５２０２；ヌクレオチド１１９２−１３６０）およびｈ−ｅｒｇ（
Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ０４２７０；ヌクレオチド１７８−３６６
３）に特異的なプローブで、該ブロットをプローブした。プローブは、ｃＤＮＡ
（制限断片として単離されランダムヘキサマープライミングにより＞１×１０９ ｃｐｍ／μｇの比活性にまで３２Ｐで標識されたもの）または合成オリゴヌクレ
オチドプローブ（フィルイン反応により＞１×１０８ｃｐｍ／ｐｍｏｌの比活性
にまで標識されたもの）であった。ｃＤＮＡ断片でプローブされたブロットに関
しては、５×ＳＳＰＥ、１０×デンハルト液、５０％ ホルムアミド、２％ Ｓ
ＤＳ、１００μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ中、４２℃で一晩、ハイブリダイゼー
ションを行った。オリゴヌクレオチドプローブでプローブされたブロットに関し
ては、５×ＳＳＰＥ、２×デンハルト液、０．５％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ
中、４２℃で一晩、ハイブリダイゼーションを行った。すべてのブロットを、２
×ＳＳＣ、０．０５％ ＳＤＳ中、４２℃で４０分間、ついで１×ＳＳＣ、０．
０５％ ＳＤＳ中、５０℃で４０分間、段階的に洗浄した。高いストリンジェン
シーの洗浄を、０．１×ＳＳＣ、０．０５％ ＳＤＳ中、６５℃で４０分間行っ
た。該ブロットをＫｏｄａｋ ＸＡＲ Ｘ線フィルムにさらすことにより又はＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓホスホイメージャーを使用する電子的検出
により、ハイブリダイゼーションを検出した。ＫｖＬＱＴ１はヒトの胃において
豊富に発現され、ＫＣＮＱ４およびｈ−ｅｒｇも、より低いレベルでではあるが
ヒトの胃において発現される。したがって、これらの３つのタンパク質は、Ｉｓ
Ｋ２と共集合して機能的カリウムチャンネルを形成しうるＫチャンネルαサブユ
ニットの候補体である。結果については、図４を参照されたい。
組織において発現され従ってそれと共集合して機能的チャンネルを形成しうるか
否かを判定した。骨格筋、子宮、結腸、小腸、膀胱、心臓、胃および前立腺から
単離された２μｇのポリＡ＋ ＲＮＡを含有するヒト多組織ノーザンブロットを
Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入した。ＫｖＬＱＴ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション
番号ＡＦ０００５７１；ヌクレオチド１２８９−２１４７）、ＫＣＮＱ２（Ｇｅ
ｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０３３３４８；ヌクレオチド１２３５−１４
２０）、ＫＣＮＱ３（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０３３３４７；ヌ
クレオチド１４７８−２４８２）、ＫＣＮＱ４（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション
番号ＡＦ１０５２０２；ヌクレオチド１１９２−１３６０）およびｈ−ｅｒｇ（
Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ０４２７０；ヌクレオチド１７８−３６６
３）に特異的なプローブで、該ブロットをプローブした。プローブは、ｃＤＮＡ
（制限断片として単離されランダムヘキサマープライミングにより＞１×１０９ ｃｐｍ／μｇの比活性にまで３２Ｐで標識されたもの）または合成オリゴヌクレ
オチドプローブ（フィルイン反応により＞１×１０８ｃｐｍ／ｐｍｏｌの比活性
にまで標識されたもの）であった。ｃＤＮＡ断片でプローブされたブロットに関
しては、５×ＳＳＰＥ、１０×デンハルト液、５０％ ホルムアミド、２％ Ｓ
ＤＳ、１００μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ中、４２℃で一晩、ハイブリダイゼー
ションを行った。オリゴヌクレオチドプローブでプローブされたブロットに関し
ては、５×ＳＳＰＥ、２×デンハルト液、０．５％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ
中、４２℃で一晩、ハイブリダイゼーションを行った。すべてのブロットを、２
×ＳＳＣ、０．０５％ ＳＤＳ中、４２℃で４０分間、ついで１×ＳＳＣ、０．
０５％ ＳＤＳ中、５０℃で４０分間、段階的に洗浄した。高いストリンジェン
シーの洗浄を、０．１×ＳＳＣ、０．０５％ ＳＤＳ中、６５℃で４０分間行っ
た。該ブロットをＫｏｄａｋ ＸＡＲ Ｘ線フィルムにさらすことにより又はＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓホスホイメージャーを使用する電子的検出
により、ハイブリダイゼーションを検出した。ＫｖＬＱＴ１はヒトの胃において
豊富に発現され、ＫＣＮＱ４およびｈ−ｅｒｇも、より低いレベルでではあるが
ヒトの胃において発現される。したがって、これらの３つのタンパク質は、Ｉｓ
Ｋ２と共集合して機能的カリウムチャンネルを形成しうるＫチャンネルαサブユ
ニットの候補体である。結果については、図４を参照されたい。
【０１１２】
本発明の範囲は、本明細書に記載の特定の実施形態に限定されるものではない
。実際のところ、前記の記載から、本明細書に記載のものに加えて本発明の種々
の修飾が当業者に明らかとなるであろう。そのような修飾は、特許請求の範囲の
範囲内に含まれると意図される。
。実際のところ、前記の記載から、本明細書に記載のものに加えて本発明の種々
の修飾が当業者に明らかとなるであろう。そのような修飾は、特許請求の範囲の
範囲内に含まれると意図される。
【０１１３】
本明細書には種々の刊行物が引用されているが、それらの開示の全体を参照に
より本明細書に組み入れることとする。
より本明細書に組み入れることとする。
【図１Ａ】
ＩｓＫ２をコードするＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。。
【図１Ｂ】
ＩｓＫ２サブユニットの推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図２】
ＩｓＫ２（配列番号２）とヒトｍｉｎＫ（配列番号３）とのアミノ酸配列アラ
イメントを示す。
イメントを示す。
【図３Ａ】
ヒトの胃におけるＩｓＫ２発現のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション／免
疫組織化学的局在化研究を示し、ビオチンで標識されＴｅｘａｓ Ｒｅｄで検出
された、ＩｓＫ２遺伝子からのｍＲＮＡ転写産物に特異的なリボヌクレオチドプ
ローブでのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す。ＩｓＫ２ ｍＲＮＡ
を発現する細胞は赤色で出現する。
疫組織化学的局在化研究を示し、ビオチンで標識されＴｅｘａｓ Ｒｅｄで検出
された、ＩｓＫ２遺伝子からのｍＲＮＡ転写産物に特異的なリボヌクレオチドプ
ローブでのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す。ＩｓＫ２ ｍＲＮＡ
を発現する細胞は赤色で出現する。
【図３Ｂ】
ヒトの胃におけるＩｓＫ２発現のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション／免
疫組織化学的局在化研究を示し、図３Ａと同じ組織片について、ガストリンに特
異的な抗体で可視化し、ＦＩＴＣ共役二次抗体での検出を示す。
疫組織化学的局在化研究を示し、図３Ａと同じ組織片について、ガストリンに特
異的な抗体で可視化し、ＦＩＴＣ共役二次抗体での検出を示す。
【図３Ｃ】
ヒトの胃におけるＩｓＫ２発現のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション／免
疫組織化学的局在化研究を示し、図３Ａと同じ組織片について、ＩｓＫ２および
ガストリンの両方に関して該細胞が同時に染色される結果を示す。この場合、該
細胞は黄色（赤と緑との組合せ）で出現する。
疫組織化学的局在化研究を示し、図３Ａと同じ組織片について、ＩｓＫ２および
ガストリンの両方に関して該細胞が同時に染色される結果を示す。この場合、該
細胞は黄色（赤と緑との組合せ）で出現する。
【図３Ｄ】
ヒトの胃におけるＩｓＫ２発現のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション／免
疫組織化学的局在化研究を示し、ＩｓＫ２およびガストリンに関して染色された
胃細胞の別の領域を示す。この場合にも、唯一の染色細胞は黄色で出現する。
疫組織化学的局在化研究を示し、ＩｓＫ２およびガストリンに関して染色された
胃細胞の別の領域を示す。この場合にも、唯一の染色細胞は黄色で出現する。
【図３Ｅ】
ヒトの胃におけるＩｓＫ２発現のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション／免
疫組織化学的局在化研究を示し、ＩｓＫ２およびソマトスタチンに関して染色さ
れた（ソマトスタチンに対する抗体を使用し、ＦＩＴＣ共役二次抗体で検出され
た）胃細胞の別の領域を示す。この場合、ＩｓＫ２を発現する細胞（赤色に染色
されている）は、ソマトスタチンを発現する細胞（緑色に染色されている）とは
異なる。
疫組織化学的局在化研究を示し、ＩｓＫ２およびソマトスタチンに関して染色さ
れた（ソマトスタチンに対する抗体を使用し、ＦＩＴＣ共役二次抗体で検出され
た）胃細胞の別の領域を示す。この場合、ＩｓＫ２を発現する細胞（赤色に染色
されている）は、ソマトスタチンを発現する細胞（緑色に染色されている）とは
異なる。
【図３Ｆ】
ヒトの胃におけるＩｓＫ２発現のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション／免
疫組織化学的局在化研究を示し、ＩｓＫ２およびサブスタンスＰの両方に関して
染色された（サブスタンスＰに対する抗体を使用し、ＦＩＴＣ共役二次抗体で検
出された）胃細胞の別の領域を示す。この場合、ＩｓＫ２を発現する細胞（赤色
に染色されている）は、サブスタンスＰを発現する細胞（緑色に染色されている
）とは異なる。
疫組織化学的局在化研究を示し、ＩｓＫ２およびサブスタンスＰの両方に関して
染色された（サブスタンスＰに対する抗体を使用し、ＦＩＴＣ共役二次抗体で検
出された）胃細胞の別の領域を示す。この場合、ＩｓＫ２を発現する細胞（赤色
に染色されている）は、サブスタンスＰを発現する細胞（緑色に染色されている
）とは異なる。
【図４】
種々のヒト組織におけるＩｓＫ２（図４Ａ）、ＫｖＬＱＴ１（図４Ｂ）、ＫＣ
ＮＱ２（図４Ｃ）、ＫＣＮＱ３（図４Ｄ）、ＫＣＮＱ４（図４Ｅ）およびｈ−ｅ
ｒｇ（図４Ｆ）の発現のノーザンブロット分析を示す。
ＮＱ２（図４Ｃ）、ＫＣＮＱ３（図４Ｄ）、ＫＣＮＱ４（図４Ｅ）およびｈ−ｅ
ｒｇ（図４Ｆ）の発現のノーザンブロット分析を示す。
【図５Ａ】
ヒトの胃におけるＩｓＫ２および他のカリウムチャンネルサブユニットの発現
の二重ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション局在化研究を示し、Ｉｓｋ２およ
びＫＣＮＨ２（ｈｅｒｇ）に特異的なプローブを使用した場合の結果を示す。
の二重ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション局在化研究を示し、Ｉｓｋ２およ
びＫＣＮＨ２（ｈｅｒｇ）に特異的なプローブを使用した場合の結果を示す。
【図５Ｂ】
ヒトの胃におけるＩｓＫ２および他のカリウムチャンネルサブユニットの発現
の二重ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション局在化研究を示し、Ｉｓｋ２およ
びＫＣＮＱ４に特異的なプローブを使用した場合の結果を示す。
の二重ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション局在化研究を示し、Ｉｓｋ２およ
びＫＣＮＱ４に特異的なプローブを使用した場合の結果を示す。
【図５Ｃ】
ヒトの胃におけるＩｓＫ２および他のカリウムチャンネルサブユニットの発現
の二重ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション局在化研究を示し、Ｉｓｋ２およ
びＫＣＮＱ１（ＫｖＬＱＴ１）に特異的なプローブを使用した場合の結果を示す
。
の二重ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション局在化研究を示し、Ｉｓｋ２およ
びＫＣＮＱ１（ＫｖＬＱＴ１）に特異的なプローブを使用した場合の結果を示す
。
【図５Ｄ】
ヒトの胃におけるＩｓＫ２および他のカリウムチャンネルサブユニットの発現
の二重ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション局在化研究を示し、図５Ｃの拡大
図である。
の二重ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション局在化研究を示し、図５Ｃの拡大
図である。
【図５Ｅ】
ヒトの胃におけるＩｓＫ２および他のカリウムチャンネルサブユニットの発現
の二重ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション局在化研究を示し、Ｉｓｋ２およ
びＫＣＮＱ１に特異的なプローブを使用して得られた胃細胞の別の領域を示す。
の二重ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション局在化研究を示し、Ｉｓｋ２およ
びＫＣＮＱ１に特異的なプローブを使用して得られた胃細胞の別の領域を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02
5/10 1/68 Ａ
Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ
1/68 33/50 Ｚ
Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566
33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
33/566 5/00 Ａ
(72)発明者 リウ，ユーアン
アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・
07065−0907、ローウエイ、イースト・リ
ンカーン・アベニユー・126
(72)発明者 フオランダー，キンバリー
アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・
07065−0907、ローウエイ、イースト・リ
ンカーン・アベニユー・126
Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA14 BB20 BB24 CB01
CB21 CB26 DA12 DA13 DA14
DA36 DA37 DB10 FB02 FB03
FB04 FB07 FB12 GC19 GC20
4B024 AA11 BA80 CA04 CA09 CA12
CA20 DA01 DA02 DA05 DA12
GA11 HA11 HA13 HA14
4B063 QA01 QA05 QQ21 QQ41 QQ61
QQ89 QR77 QR80 QS36 QX10
4B065 AA01X AA58X AA72X AA87X
AA93Y AB01 AC14 AC20
BA02 BD50 CA24 CA46
4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40
DA75 EA20 EA50 FA72 FA74
Claims (15)
- 【請求項１】 ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質をコードするヌクレオ
チドを含んでなる単離されたＤＮＡ。 - 【請求項２】 配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
ドするヌクレオチドを含む、請求項１記載のＤＮＡ。 - 【請求項３】 配列番号１および配列番号１の７９−４４７位よりなる群か
ら選ばれるヌクレオチド配列を含む、請求項１記載のＤＮＡ。 - 【請求項４】 ストリンジェントな条件下で請求項３記載のＤＮＡにハイブ
リダイズする単離されたＤＮＡ。 - 【請求項５】 請求項３記載のＤＮＡを含んでなる発現ベクター。
- 【請求項６】 請求項３記載のＤＮＡを含んでなる組換え宿主細胞。
- 【請求項７】 単離されたヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質。
- 【請求項８】 配列番号２に示すアミノ酸配列を有する、請求項７記載のタ
ンパク質。 - 【請求項９】 単一のアミノ酸置換を含有する、請求項８記載のタンパク質
。 - 【請求項１０】 保存された位置には存在しない２以上のアミノ酸置換を含
有する、請求項８記載のタンパク質。 - 【請求項１１】 ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質に特異的に結合する
抗体。 - 【請求項１２】 配列番号１からの少なくとも１０個の連続したヌクレオチ
ドを含んでなるＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドプローブ。 - 【請求項１３】 ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウム
チャンネルに結合する物質の同定方法であって、 （ａ）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルを
発現する細胞を準備すること、 （ｂ）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルに
結合することが知られていない物質に該細胞をさらすこと、 （ｃ）該細胞への該物質の結合の量を測定すること、 （ｄ）工程（ｃ）における結合の量を、対照細胞（該対照細胞は、該対照細胞
がヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を発現しないこと以外は、工程（ａ）の
細胞と実質的に同一である）への該物質の結合の量と比較することを含んでなり
、 工程（ｃ）における結合の量が対照細胞への該物質の結合の量より多い場合、
該物質が、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネル
に結合するものである、方法。 - 【請求項１４】 ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウム
チャンネルに結合し従ってヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質含有カリウムチ
ャンネルのインヒビターまたはアクチベーターでありうる物質の同定方法であっ
て、 （ａ）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルを
発現する細胞を準備すること、 （ｂ）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルに
結合することが知られていない物質の存在下および不存在下、ヒトＩｓＫ２サブ
ユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルに結合することが知られてい
る化合物に該細胞をさらすこと、 （ｃ）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルに
結合することが知られていない物質の存在下および不存在下、該細胞への該化合
物の結合の量を測定することを含んでなり、 該物質の存在下の該化合物の結合の量が該物質の不存在下の結合の量と異なる
場合、該物質が、ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャ
ンネルに結合しヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質含有カリウムチャンネルの
インヒビターまたはアクチベーターでありうる、方法。 - 【請求項１５】 ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウム
チャンネルのアクチベーターまたはインヒビターの同定方法であって、 （ａ）組換え的に発現したヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質が、それ自体
により又は他のカリウムチャンネルサブユニットタンパク質とのヘテロマーを形
成することによりカリウムチャンネルを形成するよう、ヒトＩｓＫ２サブユニッ
トタンパク質または突然変異ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を宿主細胞内
で組換え的に発現させること、 （ｂ）ヒトＩｓＫ２サブユニットタンパク質を含有するカリウムチャンネルの
アクチベーターまたはインヒビターであると疑われる物質の存在下および不存在
下、工程（ａ）で形成したカリウムチャンネルの生物活性を測定することを含ん
でなり、 該物質の不存在下と比較した場合の該物質の存在下の、工程（ａ）で形成した
カリウムチャンネルの生物活性の変化が、該物質が、ヒトＩｓＫ２サブユニット
タンパク質を含有するカリウムチャンネルのアクチベーターまたはインヒビター
であることを示す、方法。
Applications Claiming Priority (3)
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|---|---|---|---|
| US15878199P | 1999-10-12 | 1999-10-12 | |
| US60/158,781 | 1999-10-12 | ||
| PCT/US2000/028014 WO2001027246A1 (en) | 1999-10-12 | 2000-10-10 | Novel human potassium channel subunit |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| JP (1) | JP2003511065A (ja) |
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| US6864364B1 (en) | 1999-04-15 | 2005-03-08 | University Of Utah Research Foundation | MinK-related genes, formation of potassium channels and association with cardiac arrhythmia |
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- 2000-10-10 CA CA002387237A patent/CA2387237A1/en not_active Abandoned
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