ES2274621T3 - Peptidos que contienen una secuencia de reconocimiento del colesterol y usos de los mismos. - Google Patents
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Abstract
Péptido aislado con una secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol seleccionada de entre el grupo constituido por la SEC. ID nº: 2, SEC. ID nº: 3, SEC. ID nº: 4 y SEC. ID nº: 5.
Description
Péptidos que contienen una secuencia de
reconocimiento del colesterol y usos de los mismos.
El punto de control principal en la estimulación
aguda de la esteroidogénesis por hormonas conlleva la primera etapa
en su serie de reacciones de biosíntesis donde el colesterol se
transforma en pregnenolona mediante la enzima citocromo
P-450 de escisión de la cadena lateral C_{27} del
colesterol (P-450scc) y las proteínas auxiliares de
transferencia de electrones, situadas en las membranas internas de
las mitocondrias (IMM) (Simpson, E. R. y Waterman, M. R., 1983,
Can. J. Biochem. Cell. Biol. 61:692-717;
Jefcoate, C. R. et al., 1992, J. Steroid Biochem. Molec.
Biol. 43: 751-767). Estudios más detallados han
demostrado que la reacción catalizada por P-450scc
no es la etapa limitativa de la velocidad en la síntesis de las
hormonas esteroideas. Antes bien, la etapa limitativa de la
velocidad es el transporte del precursor del colesterol, procedente
de fuentes intracelulares a las IMM. Este mecanismo de transporte
dependiente de hormonas se demostró que está localizado en la
mitocondria (Simpson y Waterman, 1983, supra; Jefcoate,
et al., 1992, supra). Todos los documentos citados
anteriormente y a continuación en la presente memoria están
incorporados en la misma en su totalidad con referencia a la
misma.
El receptor de benzodiazepina de tipo periférico
(PBR) se descubrió en un principio porque se une al benzodiazepina
diazepam con afinidad relativamente elevada (Papadopoulos, V. 1993,
Endocr. Rev. 14:222-240). Las benzodiazepinas
están entre los fármacos más recetados debido a sus acciones
farmacológicas en el alivio de la ansiedad mediado por la
modulación de la actividad de los receptores del ácido
\gamma-aminobutírico en el sistema nervioso
central (Costa, E. y Guidotti, A. 1979, Annu. Rev. Pharmacol.
Toxicol. 19:531-545). PBR es otra clase de
puntos de fijación para las benzodiazepinas distinta de los
receptores del neurotransmisor mencionados anteriormente. Estudios
adicionales demostraron que además de las benzodiazepinas, el PBR se
une a otras clases de compuestos orgánicos con gran afinidad
(Papadopoulos, 1993, supra). PBR, aunque está presente en
todos los tejidos examinados se observó que era especialmente
abundante en los tejidos que producen esteroides, donde se
localizaba principalmente en la membrana externa de la mitocondria
(OMM) (Anholt, R. R. H. et al., 1986, J. Biol. Chem.
261:576-583). Se identificó como PBR una proteína
que se une a la isoquinolina de 18 kDa (Papadopoulos, V. 1998,
Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 217:130-142). Se
demostró a continuación que PBR es un componente funcional del
sistema estereoidogénico (Papadopoulos, 1998, supra;
Papadopoulos V. et al. 1990, J. Biol. Chem.
265:3772-3779) que media en la liberación del
colesterol desde la membrana externa a la interna de las
mitocondrias (Krueger, K. E. y Papadopoulos, V. 1990, J. Biol.
Chem. 265:15015-15022). Estudios adicionales
demostraron que la reducción producida farmacológicamente de las
concentraciones de PBR suprarrenales in vivo producían la
disminución de las concentraciones de glucocorticoide circulantes
(Papadopoulos, V. 1998, supra). Además, la descomposición
dirigida del gen PBR en las células de Leydig producían la
interrupción del transporte del colesterol en las mitocondrias y
formación de esteroide; la transfección de las células mutantes con
una esteroidogénesis recuperada por ADNc de PBR (Papadopoulos, V.
et al., 1997, J. Biol. Chem.
272:32129-32135). No se sabe cómo el PBR afectaba el
transporte del colesterol y si o no interactuaba directamente con
PBR con el colesterol.
Glenny J. R. (FEBS Letters 314(1),
páginas 45-49) da a conocer la secuencia de ADNc de
la caveolina del pulmón humano. Esta es homóloga a la secuencia del
ADNc de la caveolina del pollo y de VIP 21.
Boyle T. P. y Marotti K. R. (Gene 117,
páginas 243-247) da a conocer la secuencia del gen
de la apolipoproteína A-I murina.
Su P. et al. (Medline Abstract 91083838)
da a conocer el cribado de un banco de expresión de ADNc procedente
del hígado de rata con un anticuerpo policlonal específico para la
vitamina D3 25-hidroxilasa mitocondrial y un ADNc
para el citocromo P450c26 mitocondrial de hígado de conejo. Se
identificó un citocromo P450 de mitocondrias bifuncional capaz de
catalizar la 25-hidroxilación de la vitamina D3 y la
26-hidroxilación del colesterol.
Pikuleva I. A. et al. (Medline Abstract
96004795) da a conocer el efecto de los restos específicos de
mutación del citocromo P450scc por escisión de la cadena lateral
del colesterol bovino sobre la fijación del sustrato. Pikuleva
et al. sugiere que Y94 interactúa con la cadena lateral del
colesterol.
Basándose en la secuencia de aminoácidos
conocida de la proteína PBR de 18 kDa humana y de ratón, se
desarrolló un modelo tridimensional de esta proteína receptora
utilizando simulaciones dinámicas moleculares (Bernassau, J. M.
et al., 1993, J. Mol. Graph.
11:236-245; Papadopoulos, V. 1996, en: Payne A. H.,
Hardy, M. P., Russell, L. D. (eds) The Leydig Cell. Cashe
River Press, Viena, IL, págs. 598-628). El análisis
de la estructura tridimensional indicó que tanto el PBR humana como
de ratón podrían adaptar posiblemente el colesterol y la función
como canal. En la presente invención, se describe la
experimentación y comprobación de esta hipótesis.
En la presente invención, los solicitantes
identifican una secuencia de aminoácidos de reconocimiento del
colesterol en PBR, común a todas las proteínas que se ha demostrado
que interactúan con el colesterol, y se demuestra que el PBR
funciona como estructura de tipo canal de colesterol, que media en
el transporte del colesterol a través de las membranas.
El colesterol, que procede de varias fuentes
intracelulares, es reconocido por el modelo de consenso de
aminoácidos de reconocimiento/interacción del colesterol presente
en el terminal carboxi del PBR en la membrana externa de la
mitocondria (OMM). Este grupo de colesterol se introduce en la (OMM)
en las zonas de PBR donde permanece sin mezclarse con otros
componentes de la membrana. La fijación del ligando al receptor
produce la liberación de este receptor. Cuando se libera, puede
accederse al colesterol por la P450scc y se escinde en pregnenolona,
precursor de todos los esteroides.
Por consiguiente, un objetivo de la presente
invención consiste en proporcionar péptidos con una secuencia de
aminoácidos de reconocimiento/interacción de colesterol.
La presencia de la secuencia de aminoácidos de
reconocimiento/interacción del colesterol en una proteína supone la
probabilidad de interacción con el colesterol.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en proporcionar una secuencia nucleotídica que codifica la
secuencia de aminoácidos de reconocimiento/interacción del
colesterol descrita anteriormente, y los vectores que incorporan
toda o parte de dicha secuencia, y las células, procarióticas y
eucarióticas, transformadas o transfectadas con dichos vectores,
para su utilización en la producción de péptidos con una secuencia
de interacción/reconocimiento del colesterol. Las células
transformadas o transfectadas sirven para identificar agentes o
fármacos que alteran la interacción/reconocimiento del colesterol, y
la absorción del colesterol.
Otro objetivo todavía de la presente invención
consiste en proporcionar un método para identificar si una proteína
reconoce o interactúa o no con el colesterol comprendiendo dicho
método identificar la presencia o ausencia de la secuencia de
aminoácidos de reconocimiento/interacción del colesterol antes
mencionada en la que la presencia de la secuencia es una indicación
de la probabilidad de que la proteína reconoce/interactúa con el
colesterol.
Otro objetivo de la presente invención todavía
consiste en proporcionar un método para dotar a la molécula de la
capacidad de interactuar con el colesterol introduciendo en una
molécula o polipéptido natural o sintética, una secuencia de
reconocimiento/interacción del colesterol de modo que la proteína o
polipéptido, natural o sintética, sea capaz ahora de
reconocer/interactuar con el colesterol.
Otro objetivo todavía de la presente invención
consiste en proporcionar una molécula, natural o sintética que
comprende la secuencia de reconocimiento/interacción del colesterol
descrita anteriormente.
Un objetivo adicional de la presente invención
consiste en proporcionar una molécula que bloquee o compita con la
capacidad de interacción/reconocimiento del colesterol de la
secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del
colesterol descrita anteriormente. La molécula puede ser un
anticuerpo, un péptido, un péptido que comprende la secuencia de
consenso de interacción/reconocimiento del colesterol o un
fármaco.
Otro objetivo todavía de la presente invención
consiste en proporcionar un método para alterar la capacidad de
fijación del colesterol de las moléculas que contienen la secuencia
de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol
descrita anteriormente, que comprende alterar dicho punto de modo
que el reconocimiento del colesterol se reduzca, elimine o aumente.
El reconocimiento del colesterol puede aumentarse proporcionando
una bolsa de colesterol perfecta, o alternativamente, proporcionando
más de una secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción
del colesterol en una molécula de proteína.
Otro objetivo adicional de la presente invención
consiste en proporcionar un PBR con capacidad reducida para
reconocer e interactuar con el colesterol modificando la secuencia
de reconocimiento/interacción del colesterol del PBR, por ejemplo
cambiando el aminoácido 153 de tirosina a serina, o cambiando el
aminoácido 155 de arginina a leucina. Esta modificación o
modificaciones similares pueden utilizarse para reducir el
reconocimiento/interacción del colesterol o la fijación de otras
proteínas o agentes que contienen la secuencia de aminoácidos para
interacción/reconocimiento del colesterol descrita
anteriormente.
Estas y otras propiedades, aspectos y ventajas
de la presente invención se entenderán mejor con referencia a la
siguiente descripción y reivindicaciones adjuntas y a los dibujos
adjuntos, en los que:
La Figura 1 presenta el efecto de los ligandos
de PBR sobre el transporte del colesterol en la célula de Leydig
MA-10 y la formación de pregnenolona. Las
mitocondrias de las células de Leydig MA-10 se
incubaron con ^{3}H-colesterol en presencia o
ausencia de los compuestos indicados. Se midió la
^{3}H-pregnenolona tal como se describe en
Materiales y Métodos. Los datos (media \pm SD) mostrados son
representativos de dos a cuatro experimentos independientes, cada
uno con ensayos por triplicado. El efecto observado fue
estadísticamente significativo en todas las líneas
(P<0,001).
(P<0,001).
Las Figuras 2A, B y C presentan la expresión de
PBR recombinante en bacterias. Se desarrolló y utilizó el vector de
expresión de PBRm recombinante para transformar la cepa BL21 (DE3)
de Escherichia coli como se describe en Materiales y
Métodos. La expresión de la proteína PBRm recombinante fue inducida
por IPTG 1 mM.
A) La expresión de la proteína PBR fue
controlada por SDS-PAGE seguida de tinción con
Coomassie Blue o análisis por inmunotransferencia. 1, Referencia: 2
y 3, dos preparaciones diferentes de bacterias tratadas con
IPTG.
B) Especificidad de fijación de el PBR inducida
por IPTG en Escherichia coli. La fijación específica de
[^{3}H]PK11195 (1,0 nM) se midió en presencia de las
concentraciones indicadas de varios ligandos.
C) Representación de Scatchard de la fijación
específica de ^{3}H-PK11195 a la bacteria inducida
por IPTG.
Figura 3. Características de la absorción de
^{3}H-colesterol por células de E.
coli.
A) La absorción del
^{3}H-colesterol por células de E. coli se
examinó utilizando concentraciones crecientes de bacterias de
control o transformadas tratadas con IPTG incubadas en presencia de
^{3}H-colesterol 6,7 nM (50,0 Ci/mmoles) durante
60 min. a 37ºC. La absorción específica del colesterol se define
como los valores de referencia negativos que producen IPTG.
B) Absorción específica de
^{3}H-colesterol examinada a las temperaturas
indicadas utilizando 100 \mug de proteína bacteriana.
C) Efecto de los tóxicos energéticos sobre la
absorción de ^{3}H-colesterol por las bacterias
transformadas producidas por IPTG.
D) La expresión de PBR provoca la absorción de
colesterol solamente. Se incubaron bacterias en las mismas
condiciones descritas anteriormente en presencia del esteroide
radiomarcado indicado.
E) Absorción específica de
^{3}H-colesterol determinada en presencia de
concentraciones crecientes de
^{3}H-colesterol.
F) Liberación producida por el ligando de la
absorción de colesterol por las membranas bacterianas. Las membranas
marcadas con ^{3}H-colesterol de bacterias
transformadas inducidas por IPTG se incubaron con concentraciones
crecientes de PK11195 o clonazepam, y se cuantificó la cantidad
liberada de ^{3}H-colesterol. Los resultados
mostrados representan la media \pmSD de un experimento realizado
por triplicado. Resultados similares se obtuvieron en otros tres
experimentos independientes.
Figura 4. Análisis de la mutación con deleción
de la fijación del ligando función de PBR-PK11195 y
absorción de ^{3}H-colesterol por las bacterias
transfectadas con las PBR naturales y mutadas. La expresión de las
proteínas fue inducida por IPTG. Izquierda, se presentan las cinco
zonas de transmembrana de PBR así como la posición de las
deleciones acometidas. Derecha, se presenta el efecto de cada
deleción sobre la fijación del ligando PK11195 y la absorción del
colesterol. Los resultados mostrados son las medias de los
triplicados. El 100% de la fijación del ligando PK11195 corresponde
a 280 \pm 22 fmol/mg de proteína. El 100% de la absorción
específica del colesterol corresponde al 1,35 \pm 0,15 pmol/mg de
proteína.
Figura 5. Identificación de los aminoácidos
específicos responsables de la absorción del colesterol.
Absorción
de ^{3}H-colesterol por bacterias transfectadas con las PBR naturales y mutadas en el punto (abajo). La expresión de las proteínas fue inducida por IPTG. El 100% de la absorción específica del colesterol corresponde a 1,2 \pm 0,1 pmol de colesterol por mg de proteína. Análisis de inmunotransferencia de las PBR mutadas expresadas por las bacterias examinadas para la absorción de ^{3}H-colesterol (parte superior). Los resultados presentados son las medias de los triplicados.
de ^{3}H-colesterol por bacterias transfectadas con las PBR naturales y mutadas en el punto (abajo). La expresión de las proteínas fue inducida por IPTG. El 100% de la absorción específica del colesterol corresponde a 1,2 \pm 0,1 pmol de colesterol por mg de proteína. Análisis de inmunotransferencia de las PBR mutadas expresadas por las bacterias examinadas para la absorción de ^{3}H-colesterol (parte superior). Los resultados presentados son las medias de los triplicados.
En una forma de realización, la presente
invención se refiere a un péptido aislado con una secuencia de
aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol
seleccionada de entre las secuencias siguientes:
Leu Asn Tyr Tyr Val Trp Arg
(SEC. ID nº: 1)
Leu Asn Tyr Cys Val Trp Arg
(SEC. ID nº: 2)
Leu Asn Tyr Arg (SEC. ID
nº: 3)
Val Ala Tyr His Gln Tyr Tyr Gln
Arg (SEC. ID nº: 4)
y SEC. ID nº: 5
Todos los péptidos en la presente memoria se
escriben NH_{2}…COOH y los aminoácidos son los isómeros L
naturales.
Se han descubierto secuencias de aminoácidos
para reconocimiento/interacción del colesterol en moléculas
mostradas o sugeridas para interactuar con colesterol, tales como
la apolipoproteína A-1 (Boyle, T. P. y Marotti, K.
R., 1992, Gene 117, 243-247), caveolina
(Murata, M. et al. 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92, 10339-10343), DBI (Papadopoulos, V. 1993,
Endocr. Rev. 14, 222-240; Papadopoulos, V.
1998, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 217,
130-142), proteína reguladora de la
estereoidogénesis aguda (StAR) (Stocco, D. M. y Clark, B. J. 1996,
Endocr. Rev. 17, 221-244), proteína erizo
(Porter, J. A. et al. 1996, Science 274,
255-259), citocromo P450 C26/25 (Su, P. et
al. 1990, DNA Cell Biol.
9-657-667), anexina II (Harder, T.
et al. 1997, Mol. Biol. Cell 8,
533-545), proteína 2 transportadora de esterol
(Colles, S. M. et al. 1995, Lipids 30,
795-803), colesterol
7\alpha-monooxigenasa (Kai, M. et al.
1995, Lipid Res. 36, 367-374), colesterol
oxidasa (Ishizaki, T. et al. 1991, J. Bacteriol. 171,
596-601), colesterol deshidrogenasa (Horinouchi, S.
et al. 1991, Appl. Environ. Microbiol. 57,
1386-1393), precursor de lipasa activado por sales
biliares (colesterol esterasa) (Nilsson, J. et al. 1990,
Eur. J. Biochem. 192, 543-550) y
acil-CoA colesterol aciltransferasa (Pape M. E.
et al. 1995, J. Lipid Res 36, 823-838)
como se muestra en la Tabla 1.
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| PBR de ratón | 149- VLNYYVWR (SEC. ID nº: 5) |
| PBR de rata | 150- LNYYVWR (SEC. ID nº: 6) |
| PBR humana | 150- LNYCVWR (SEC. ID nº: 7) |
| PBR bovina | 149- LNYR (SEC. ID nº: 8) |
| P450scc de rata | 88- VAYHQYYQR (SEC. ID nº: 9) |
| P450scc humana | 88- VAYHQYYQR (SEC. ID nº: 10) |
| P450scc de cerdo | 88- VAYHZHYQK (SEC. ID nº: 11) |
| Apolipoproteína A-I de ratón | 210- LNEYHTR (SEC. ID nº: 12) |
| Caveolina de ratón | 94- VTKYWFYR (SEC. ID nº: 13) |
| Erizo humana | 251- VFYVIETR (SEC. ID nº: 14) |
| DBI de ratón | 25- LFIYSHFK (SEC. ID nº: 15) |
| StAR de ratón | 6- LCAGSSYRHMR (SEC. ID nº: 16) |
| Anexina II de rata | 145- VYKEMYKTDLEK (SEC. ID nº: 17) |
| P450c26/25 de rata | 424- VLCTYVVSR (SEC. ID nº: 18) |
| Colesterol oxidasa de strept. | 420- VSLYAITK (SEC. ID nº: 19) |
| Colesterol 7''-monooxigenasa de ratón | 167- VTEGMYAFCYR (SEC. ID nº: 20) |
| Colesterol deshidrogenasa de Nocardia | 91- VTEAYRQR (SEC. ID nº: 21) |
| Lipasa humana activada por sales biliares | 226- LSPYNKGLIR (SEC. ID nº: 22) |
| Acil-CoA colesterol aciltransferasa de conejo | 96- VVDYIDEGR (SEC ID 23) |
La presencia de una secuencia de aminoácidos
para interacción/reconocimiento de colesterol en las proteínas
listadas en la Tabla 1 significa la probabilidad de que las
proteínas interactúen con el colesterol y proporciona comprensión
de cómo esta proteína realiza sus funciones de forma coordinada con
el colesterol y de cómo alterar estas funciones. Por ejemplo, en el
caso de la anexina que es una proteína de fijación de actina a
calcio-fosfolípido/colesterol importante para
varias funciones celulares, es decir, a partir del mantenimiento de
la forma y estabilidad de la membrana celular para facilitar la
interiorización de los componentes de la membrana plasmática,
alterando la zona de reconocimiento/interacción del colesterol de
la anexina puede producir desestabilización y colapso del
citoesqueleto. Éste podría ser un método útil para el
direccionamiento y la destrucción del crecimiento de la célula
tumoral.
Una vez revisada la descripción de la presente
invención, estaría dentro de las capacidades de un experto en la
materia diseñar proteínas mutantes en las que la secuencia de
aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol se ha
alterado de modo que la capacidad de la proteína para
interactuar/reconocer el colesterol se ha reducido, aumentado o
eliminado. Los experimentos en estos mutantes proporcionarán además
tratamientos para las enfermedades asociadas con una función
alterada, reducida o aumentada de estas proteínas, o incluso quizás
un método para dirigir proteínas específicas mediante su capacidad
para interactuar con el colesterol para alterar la función de
reconocimiento/interacción del colesterol con una finalidad
deseada.
Una vez revisada la presente descripción, será
evidente para un experto en la materia que es posible determinar si
una proteína interactúa o no con el colesterol o reconoce el
colesterol. Este conocimiento proporcionará comprensión de cómo
funciona o es regulada una proteína específica, ya se conozca o haya
de descubrirse todavía.
En otra forma de realización, la presente
invención proporciona una secuencia nucleotídica que codifica los
péptidos descritos anteriormente. Los nucleótidos que corresponden a
codones que especifican los aminoácidos de las secuencias de
aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol descritas
anteriormente son conocidos en general en la técnica.
La generación de moléculas de ácido nucleico que
codifican la(s) secuencia(s) de consenso de
aminoácidos para interacción/reconocimiento del colesterol
descrita(s) anteriormente es una rutina para un experto en la
materia. Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención
pueden estar en forma de ARN, tal como ARNm, o en forma de ADN,
incluyendo, por ejemplo ADNc y ADN genómico obtenido por clonación o
producido por síntesis. El ADN puede ser de doble cadena o de una
sola cadena. El ADN o ARN de una sola cadena puede ser la cadena de
codificación, también conocida como cadena transcrita, o puede ser
la cadena no codificadora, denominada también cadena
complementaria. También están incluidos los ácidos nucleicos
modificados químicamente y sustituidos, p. ej., los que incorporan
bases nucleotídicas modificadas o que incorporan un grupo
marcador.
El ácido nucleico puede estar aislado.
"Aislado" significa una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN,
que ha sido separada de su medio natural. Por ejemplo, las
moléculas de ADN recombinante contenidas en un vector se consideran
aisladas para los objetivos de la presente invención. Las moléculas
de ARN aisladas incluyen transcritos de ARN in vivo o in
vitro de las moléculas de ADN de la presente invención. Las
moléculas de ácido nucleico aisladas según la presente invención
incluyen además dichas moléculas producidas por síntesis.
Dichas moléculas de ácido nucleico aisladas son
útiles para sondas destinadas a detectar un gen que contiene esta
secuencia de consenso en una muestra biológica, por ejemplo, por
PCR, transferencia Southern, transferencia Northern u otra forma de
análisis de hibridación como la descrita en Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2ª edición, Sambrook, J. Fritsch, E. F. y
Maniatis T., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, N. Y. (1989) o DNA Cloning, volúmenes I y II (D. N.
Glover ed., 1985) o Current Protocols in Molecular Biology
Ausubel, F. M. et al. (eds.) John Wiley & Sons, Inc. para
los métodos generales de clonación). Las descripciones completas de
los documentos citados en esta solicitud están incorporadas en su
totalidad por referencia a los mismos. Las sondas típicas de ácido
nucleico pueden prepararse a partir de las secuencias de
aminoácidos de consenso. En particular, pueden prepararse sondas
basándose en los segmentos de la secuencia de aminoácidos que
poseen niveles relativamente bajos de degeneración, es decir, pocas
o una secuencia posible de ácidos nucleicos que codifican la misma.
Estas sondas pueden comprender además un grupo detectable para la
identificación y posición fáciles de las secuencias
complementarias.
Pueden cribarse bancos de ADNc o genómicos de
varios tipos para nuevos alelos o secuencias relacionadas que
utilicen las sondas anteriores. Pueden utilizarse bancos de fago o
de plásmido.
Además de comprender un segmento que codifica
los péptidos con la secuencia de consenso de la presente invención,
el ácido nucleico de la presente invención puede comprender además
un segmento que codifica una proteína heteróloga, de modo que el
gen se expresa para producir las dos proteínas como una proteína de
fusión.
Las moléculas de ácido nucleico de la presente
invención que codifican la secuencia de aminoácidos para
reconocimiento/interacción del colesterol de la presente invención
pueden incluir, pero no se limitan a las que codifican la secuencia
de aminoácidos del consenso por sí mismas; y las secuencias de
codificación adicionales que codifican aminoácidos adicionales,
tales como las que proporcionan funcionalidades adicionales. Por lo
tanto, las secuencias que codifican la secuencia de consenso pueden
fusionarse a una secuencia de marcador, tal como una secuencia que
codifica un péptido que facilita la purificación del polipéptido
fusionado.
Además de su utilización como sondas, los ácidos
nucleicos de la presente invención pueden utilizarse también en la
preparación de los péptidos con la secuencia de aminoácidos para
reconocimiento/interacción del colesterol de la presente
invención.
El ADN que codifica los péptidos con la
secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del
colesterol de la presente invención se incorporará típicamente en
los montajes de ADN capaces de la introducción y la expresión en un
cultivo celular in vitro. Con frecuencia, los ácidos
nucleicos de la presente invención pueden utilizarse para producir
una célula huésped recombinante adecuada. Específicamente, los
montajes de ADN serán adecuados para la replicación en un huésped
unicelular, tal como una bacteria, p. ej., E. coli, pero
también pueden ser propuestos para la introducción en un mamífero,
planta, insecto cultivado u otras líneas celulares eucarióticas.
Los montajes de ADN preparados para la introducción en bacterias o
levaduras incluirán de manera típica un sistema de replicación
reconocido por el huésped, codificando el segmento de ADN propuesto
el polipéptido deseado, las secuencias reguladoras de la iniciación
terminación de la transcripción de la traducción unidas de forma
operativa al segmento que codifica el polipéptido. Un segmento de
ADN está operativamente unido cuando se coloca en una relación
operativa con otro segmento de ADN. Por ejemplo, un activador o
potenciador está operativamente unido a una secuencia de
codificación si estimula la transcripción de la secuencia; el ADN
para una secuencia señal está operativamente unido al ADN que
codifica un polipéptido si es expresado como una preproteína que
participa en la secreción del polipéptido. Generalmente, las
secuencias de ADN que están operativamente unidas son contiguas, y
en el caso de una secuencia señal tanto contigua como en fase de
lectura. Sin embargo, los potenciadores no necesitan estar
contiguos a las secuencias de codificación cuya transcripción
controlan. La unión se realiza por ligadura en las secuencias de
restricción convenientes o se insertan adaptadores o enlazadores en
su lugar. La selección de una secuencia activadora apropiada
dependerá generalmente de la célula huésped seleccionada para la
expresión del segmento de ADN. Ejemplos de secuencia activadora
adecuada incluyen los activadores procarióticos y eucarióticos bien
conocidos en la materia e incluyen activadores tales como los
activadores trp, lac y del fago, activadores de ARNt y
activadores de enzimas glucolíticas, activador T7, activador T3,
activador SP6, activador SV40, activador CMV y MoMLV LTR son
conocidos y están disponibles. Véase Sambrook et al., 1989,
supra. Las secuencias reguladoras de la transcripción
incluirán típicamente un potenciador o activador heterólogo que es
reconocido por el
huésped.
huésped.
Los vectores de expresión útiles en la presente
invención incluyen vectores derivados de cromosomas, de episomas y
de virus, p. ej., vectores derivados de plásmidos bacterianos,
bacteriófagos, episomas de levadura, elementos cromosómicos de
levadura, virus tales como baculovirus, papova virus, virus de
vacuna, adenovirus, virus de viruela aviar, virus de pseudorrabia y
retrovirus, y vectores derivados de las combinaciones de los mismos
tales como cósmidos y fagómidos.
Pueden emplearse vectores de expresión
convenientemente disponibles que incluyen el sistema de replicación
y las secuencias reguladoras de la transcripción y de la traducción
junto con la secuencia de inserción para el segmento que codifica
el péptido de la secuencia de consenso. Entre los vectores
preferidos para su utilización en bacterias se incluyen los
vectores pBS, vectores Phagescript, vectores Bluescript disponibles
en el mercado. Entre los vectores eucarióticos preferidos están
pSV2CAT, pWLNEO, disponible en Stratagene; y pSVK2, pMSG disponible
en Pharmacia. Otros vectores adecuados serán con fácilmente
evidentes para el especialista experto tales como los vectores pET,
tales como pET15b, pZeoSV2, pCMV y similares. Ejemplos de
combinaciones operables de líneas celulares y de vectores de
expresión se describen en Sambrook et al. y en Metzger et
al., Nature 334, 31-36, 1988. Por
ejemplo, cuando se selecciona una célula huésped de insecto como la
célula huésped de selección para expresar el polipéptido, el ADNc
que codifica los polipéptidos de la invención puede clonarse en un
vector de expresión de baculovirus (pV-IKS). El
baculovirus recombinante puede utilizarse a continuación para
transfectar una célula huésped de insecto adecuada, p. ej. las
células SF9, que pueden expresar entonces el polipéptido. Véase, p.
ej. D. D. Morrison et al., Cell 58,
649-657, 1989, M. D. Summers y G. E. Smith, A
Manual of Methods for Baculovirus and Insect Cell Culture
Procedures, Texas Agricultural Station, College Station, Tex.,
1987.
Los vectores que contienen segmentos de ADN de
interés, p. ej. los que codifican los péptidos que comprenden la
secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del
colesterol de la presente invención, pueden transferirse a la
célula huésped por métodos bien conocidos, que pueden variar
dependiendo del tipo de huésped utilizado. Por ejemplo, las células
procarióticas utilizan habitualmente la transcripción con cloruro de
calcio, mientras que otros huéspedes pueden utilizar el tratamiento
con fosfato cálcico. La introducción del montaje dentro de la
célula huésped puede efectuarse por transfección mediada por
DEAE-dextrano, transfección mediada por líquido
catiónico, electroporación, transducción, infección u otros métodos.
Véase Davis et al. Basic Methods in Molecular Biology,
1986. La expresión "célula transformada" tal como se utiliza en
la presente memoria, incluye la descendencia de las células
transformadas en origen.
En otra forma de realización, la presente
invención proporciona una célula transfectada de manera estable con
un vector que comprende la secuencia de aminoácidos para
interacción/reconocimiento del colesterol de la presente invención.
El término "transfectada" como se utiliza en la presente
memoria se refiere a la célula que ha experimentado el proceso de
introducción de ácido nucleico o de un vector de ácido nucleico
dentro de una célula. Son posibles varios métodos de transfección
de una célula incluyendo la microinyección, precipitación con
CaPO_{4}, lipofección (fusión del liposoma), electroporación y
utilización de un cañón de genes. El término "estable" como se
utiliza en la presente memoria se refiere a la introducción de un
gen en el cromosoma de la célula diana donde se integra y se
convierte en un componente permanente del material genético en esta
célula. Una célula transfectada que contiene un vector con un
péptido que comprende la secuencia de consenso puede transfectarse
únicamente de manera transitoria, produciendo la expresión
transitoria del péptido. El término "transitoria" tal como se
utiliza en la presente memoria se refiere a la introducción de un
gen en una célula para expresar un péptido que contiene el consenso
del colesterol, donde el ADN introducido no está integrado en el
genoma de la célula huésped y está por consiguiente eliminado de la
célula huésped durante un periodo de tiempo. Expresión transitoria
se refiere a la expresión de un producto durante un periodo de
transfección transitoria. Una transfección episómica es una variante
de transfección estable en la que el gen introducido no está
incorporado en los cromosomas de la célula huésped sino más bien
está replicado como un elemento extracromosómico. Esto puede
conducir a la transfección aparentemente estable de las
características de una célula.
Una célula puede transfectarse con un vector que
contiene un marcador seleccionable o cotransfectarse con un segundo
vector que contiene el marcador seleccionable deseado. Este marcador
seleccionable se utiliza para seleccionar aquellas células que se
han llegado a transfectar. Los tipos de marcadores seleccionables
que pueden utilizarse son bien conocidos por los expertos en la
materia.
En otra forma de realización, se proporciona una
célula transfectada en la que un péptido que comprende la secuencia
de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol de la
presente invención se expresa como un péptido de la superficie
celular. Péptido de la "superficie celular" significa un
péptido que abarca total o parcialmente la membrana celular, y que
está expuesto sobre la superficie de la célula. El péptido que
comprende la secuencia de aminoácidos para
reconocimiento/interacción del colesterol de la presente invención
puede expresarse como péptido segregado. "Péptido segregado"
significa un péptido que no está asociado a la membrana celular,
sino más bien está procesado intracelularmente por secreción en el
medio extracelular u otro compartimento celular.
El célula que comprende la secuencia de
aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol de la
presente invención puede recuperarse y purificarse a partir de
cultivos de células recombinantes por métodos bien conocidos que
incluyen la precipitación con sulfato amónico o etanol, la
extracción con ácido, la cromatografía de intercambio aniónico o
catiónico, la cromatografía con fosfocelulosa, la cromatografía por
interacción hidrófoba, la cromatografía por afinidad, la
cromatografía con hidroxilapatito, la cromatografía con lectina y la
cromatografía líquida de alta resolución ("HPLC") se emplean
para purificación. Los polipéptidos de la presente invención
comprenden productos purificados de forma natural, productos de
procedimientos de síntesis química y productos producidos por
técnicas recombinantes a partir de un huésped procariótico o
eucariótico, que incluyen, por ejemplo, células bacterianas,
levaduras, de plantas superiores, de insectos y de mamíferos.
Otro aspecto de la invención consiste en
proporcionar una planta transgénica que comprende en su genoma un
montaje genético que comprende un ácido nucleico que codifica el PBR
con una secuencia de reconocimiento/interacción de colesterol
alterada en la que la capacidad de el PBR para interactuar con el
colesterol y canalizarle dentro de la célula está reducida o
suprimida, dando como resultado de este modo una absorción reducida
o suprimida del colesterol en la célula y/o una producción reducida
o suprimida de esteroides en la planta transgénica. Este método
puede ofrecer una oportunidad para regular las concentraciones de
colesterol en las plantas, así como de los esteroides vegetales
específicos tales como las cardenolidas, etc. requeridas para la
nutrición o cualquier otra finalidad. La investigación ha
demostrado que las plantas transgénicas son capaces de traspasar
los genes insertados a su descendencia mediante herencia mendeliana
normal (Christou et al., 1990, Trends in Biotechnol.
8, 145-151). Todas las plantas de dicha descendencia
que heredan el montaje genético insertado son también plantas
transgénicas en la forma que se utiliza el término en la presente
memoria.
La producción de plantas transgénicas es
conocida en la materia. Véase por ejemplo, la patente US nº
5.869.720 de John, M. E. publicada el 9 de febrero de 1999 y la
patente US nº 5.859.347 de Brown et al. publicada el 12 de
enero de 1999. Las descripciones de ambas patentes están
incorporadas de este modo en su totalidad por referencia a las
mismas.
En resumen, el ácido nucleico deseado puede
insertarse en un vector de transformación de la planta adecuado
para su transformación en la especie vegetal deseada. Los vectores
de transformación de plantas adecuados incluyen los derivados de un
plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens. Un vector de
transformación vegetal incluye preferentemente todos los elementos
necesarios para la transformación de las plantas o de las células
vegetales. Los tejidos vegetales específicos pueden ser dirigidos
utilizando activadores específicos para la expresión en frutos,
fibras, raíces, etc… Los activadores utilizados pueden ser
inducibles por hormonas vegetales tal como ecdisona, por
antibióticos, tal como tetraciclina, por cambios de temperatura,
tales como los elementos de choque térmico. Los vectores de
transformación vegetal típicos comprenden genes marcadores
seleccionables, uno o ambos de los extremos del
T-ADN, secuencias de clonación, genes bacterianos
apropiados para facilitar la identificación de transconjugados,
funciones de replicación y movilización de una amplia gama de
huéspedes y otros elementos que se deseen.
La transformación de las células vegetales puede
efectuarse mediante la administración de un vector de transformación
o de un ADN libre mediante la utilización de un cañón de partículas
que comprende microproyectiles a alta velocidad recubiertos con el
vector en el tejido vegetal. La selección de células vegetales
transformadas y la regeneración en las plantas completa puede
realizarse utilizando procedimientos convencionales. Pueden
utilizarse otras técnicas de transformación capaces de insertar el
gen o el ácido nucleico deseado en las células vegetales, tales
como la electroporación o productos químicos que aumentan la
absorción del ácido nucleico libre. Ejemplos ilustrativos de
métodos adecuados para la regeneración de plantas transgénicas son:
maíz (Fromm et al., 1990, Bio/Technology
8:833-839; y Gordon-Kamm et
al., 1990 The Plant Cell 2:603-618);
arroz (Wang et al., 1988, Plant Mol. Biol.
11:433-439) y trigo (Vasil et al.,
Bio/Technology 8:743-747).
En un aspecto, las células transformadas o
transfectadas sirven para los agentes de cribado o los fármacos que
alteran la capacidad de los polipéptidos que comprenden la secuencia
y los mutantes del aminoácido para reconocimiento/interacción del
colesterol de dicha secuencia para interactuar, reconocer o unirse
al colesterol y sus derivados. Puede diseñarse un sistema in
vitro para determinar si un compuesto, fármaco o agente es un
agonista o antagonista de la capacidad del polipéptido que comprende
la secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del
colesterol de la presente invención para interactuar con el
colesterol. Un polipéptido que comprende la secuencia de
aminoácidos para el reconocimiento/interacción del colesterol de la
presente invención puede incubarse junto con colesterol en
condiciones, es decir sales, pH, lípidos, iones, en las que tenga
lugar la interacción entre el colesterol y el péptido que comprende
la secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del
colesterol. El complejo puede incubarse a continuación con un
compuesto de ensayo. La interacción entre el polipéptido y el
colesterol puede medirse a continuación. Un aumento o disminución
del nivel de interacción entre el polipéptido y el colesterol en
respuesta a un compuesto determinado indicaría que el compuesto es
un agonista o antagonista de esta unión, respectivamente.
El mismo ensayo puede administrarse en células
que expresan un polipéptido que comprende la secuencia de
aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol. El pH y
la temperatura que son más eficaces para la interacción del
colesterol se utilizan preferentemente pero es posible replicar las
condiciones obtenidas en una célula enferma para probar el efecto
de un fármaco concreto con respecto a una terapia propuesta para la
enfermedad.
Un compuesto de ensayo puede ser un compuesto
químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula
biológica o un extracto preparado a partir de materiales biológicos
tales como bacterias, plantas, hongos o células o tejidos de
animal.
Para muchos de los métodos de la presente
invención, los polipéptidos y ácidos nucleicos de la invención
pueden estar unidos o ligados por enlaces covalentes a un grupo
detectable para facilitar la identificación y detección. Los grupos
o marcadores detectables útiles, generalmente son bien conocidos en
la materia. Por ejemplo, un grupo detectable puede ser un grupo
radiomarcado, tal como con, ^{125}I, ^{32}P o ^{35}S o un
grupo fluorescente o quimioluminiscente. Alternativamente, el grupo
detectable, puede ser un sustrato, cofactor, inhibidor, ligando de
afinidad, etiqueta del epítopo que se une al anticuerpo o una enzima
que sea capaz ser ensayada. Las enzimas adecuadas incluyen, p. ej.
peroxidasa del rábano picante, luciferasa u otras enzimas
fácilmente ensayables. Estos grupos enzimáticos pueden estar unidos
al polipéptido que comprende la secuencia de consenso por métodos
químicos o expresada como una proteína de fusión como ya se
describió.
En otra forma de realización, la presente
invención proporciona un método para detectar la presencia,
ausencia, aumento o disminución del colesterol en una muestra
biológica. Esto puede realizarse inmovilizando el polipéptido que
comprende la secuencia de aminoácidos para
reconocimiento/interacción del colesterol en un soporte sólido, p.
ej., un pocillo de microvaloración o una membrana de nitrocelulosa.
La muestra que ha de analizarse se expone al polipéptido
inmovilizado y se mide la cantidad de polipéptido unido al
colesterol.
El soporte sólido puede incluir agarosa,
celulosa, dextrano, Sephadex, Sepharose, carboximetilcelulosa,
poliestireno, papel de filtro, nitrocelulosa, resinas de
intercambio iónico, películas de plástico, perlas de vidrio,
copolímero de poliaminametilvinil éter y ácido maleico, copolímero
de aminoácidos, copolímero de etileno-ácido maleico, nilón, seda,
etc. El soporte puede estar en forma de, p. ej., un tubo de ensayo,
placas de microvaloración, tiras de ensayo o similares. La reacción
del soporte sólido con el polipéptido puede llevarse a cabo por
métodos bien conocidos en la técnica. "Muestra biológica"
significa cualquier muestra biológica extraída de un animal, línea
celular, cultivo tisular, planta, insecto u otra fuente que pueda
contener colesterol o sus derivados, o ARNm o ADN con polipéptidos
que interactúan/reconocen al colesterol. Las muestras biológicas
incluyen fluidos corporales (tales como saliva, sangre, plasma,
orina, mucosidades, fluido sinovial, etc.) tejidos (tales como
músculo, piel y cartílago) y cualquier otra fuente biológica
susceptible de contener colesterol o derivados del colesterol, o
polipéptido o ácidos nucleicos que se unen al colesterol. Los
métodos para extraer muestras biológicas tales como tejido son bien
conocidos en la técnica.
En otra forma de realización, la presente
invención proporciona un método para identificar si una proteína
reconoce o interactúa o no con el colesterol comprendiendo dicho
método la identificación de la presencia o ausencia de la secuencia
de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol
analizando la secuencia de aminoácidos para
interacción/reconocimiento del colesterol de la proteína desconocida
como se expone en los ejemplos a continuación. La presencia de la
secuencia de aminoácidos de la presente invención es una indicación
de la probabilidad de que la proteína reconoce/interactúa con el
colesterol.
En otra forma de realización, la presente
invención proporciona un método para dotar a una molécula de la
capacidad para interactuar con el colesterol que es reconocida por
la secuencia de aminoácidos de reconocimiento/interacción del
colesterol. Como la secuencia de consenso para la
interacción/reconocimiento del colesterol se ha interpretado,
actualmente es posible introducir en una molécula o polipéptido,
natural o sintético, una secuencia de reconocimiento/interacción
del colesterol de modo que la proteína o polipéptido, natural o
sintético, es ahora capaz de reconocer/interactuar con el
colesterol o un derivado del colesterol. La secuencia de consenso
puede producirse a nivel del ADN o del ARN, insertando la secuencia
nucleotídica que codifica la secuencia de consenso en una parte del
gen para dicha molécula, de modo que la secuencia de consenso es
traducida junto con la molécula y juntas forman una proteína de
fusión. Preferentemente, la secuencia de consenso se inserta en el
terminal amino o carboxi del gen de modo que el plegamiento
secundario y terciario del producto génico no inhiba la interacción
de la secuencia de consenso con el colesterol. Puede determinarse la
capacidad para interactuar/reconocer o unirse al colesterol o a un
derivado del colesterol de la proteína de fusión. Estas proteínas de
fusión pueden utilizarse en terapia o diagnósticos. La molécula en
la que se desea la secuencia de interacción/reconocimiento del
colesterol puede ser natural o sintética.
En otra forma de realización todavía, la
presente invención proporciona una molécula que bloquea la capacidad
de un péptido de interacción/reconocimiento del colesterol que
comprende la secuencia de aminoácidos para
reconocimiento/interacción del colesterol descrita anteriormente
para reconocer/interactuar con el colesterol. La molécula puede ser
un anticuerpo, un péptido o un fármaco. La producción de anticuerpo
que utiliza péptido es bien conocida en la técnica, véase, p. ej.,
Sutcliffe, et al. Science 219,
660-666, 1983; Wilson et al., Cell
37, 767-778, 1984, y Bittle et al., J.
Gen. Virol. 66, 2357-2354, 1985. Tal como se
utiliza en la presente memoria, el término "anticuerpo" (AB) o
"anticuerpo monoclonal" (Mab) significa que incluye moléculas
íntegras, anticuerpos completos con una sola cadena y fragmentos de
anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo de la presente invención
incluyen Fab y F(ab')_{2} y otros fragmentos que incluyen
los Fv de una sola cadena (scFv) y los Fv unidos a disulfuro
(sdFv). También se incluyen en la presente invención anticuerpos
monoclonales híbridos y humanizados y anticuerpos policlonales
específicos para los polipéptidos de la presente invención. Los
anticuerpos de la presente invención pueden prepararse por
cualquiera de varios métodos. Por ejemplo, las células que expresan
un polipéptido de la presente invención o un fragmento antigénico
del mismo pueden administrarse a un animal para inducir la
producción de sueros que contienen anticuerpos policlonales. Pueden
prepararse anticuerpos monoclonales utilizando la tecnología del
hibridoma conocida en la técnica, véase, p. ej., Harlow et
al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor
Laboratory Press 2ª ed., 1988). Además, los anticuerpos capaces de
unirse a un antígeno polipeptídico de la presente invención pueden
producirse mediante la utilización de anticuerpos
anti-idiotípicos. Dicho método hace uso del hecho de
que los anticuerpos son los propios antígenos, y de que, por
consiguiente, es posible obtener un anticuerpo que se una a un
segundo anticuerpo.
Además, el péptido de interacción/reconocimiento
del colesterol puede servir para el modelado de pequeñas moléculas
que interfieren con la unión al colesterol in vivo. En
particular, la estructura del dominio de interacción/reconocimiento
del colesterol de la secuencia de aminoácidos conocida y la
estructura tridimensional, que puede determinarse por métodos
cristalográficos de rayos X conocidos en la materia, pueden
ampliarse generando análogos sintéticos, derivados del colesterol y
simulaciones del dominio concreto de interacción/reconocimiento del
colesterol. Los elementos sintéticos pueden montarse basándose en su
analogía con los aspectos estructurales químicos del dominio de
interacción/reconocimiento del colesterol. Dichas simulaciones,
análogos y derivados pueden utilizarse para bloquear o inhibir
funciones específicas resultantes de la unión del colesterol a un
péptido o producto génico. Estas funciones pueden variar dado que
una función para el colesterol ha estado implicada en la
señalización de células, proliferación celular, regulación génica,
anclaje y estabilidad del citoesqueleto, transmisión neural,
fertilidad, estrés, diabetes, ictus, por nombrar unos pocos, y puede
por eso ser útil como tratamientos terapéuticos según los métodos
descritos en la presente memoria.
En otra forma de realización, la presente
invención se refiere a un método para alterar la capacidad para la
unión del colesterol de las moléculas que contienen la secuencia de
aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol descrita
anteriormente, que comprende alterar dicha secuencia de modo que se
reduzca o se elimine el reconocimiento del colesterol.
Los solicitantes han podido producir PBR con
capacidad reducida o sin ella para reconocer e interactuar con el
colesterol modificando la secuencia del PBR para
reconocimiento/interacción del colesterol, por ejemplo cambiando el
aminoácido 153 tirosina por serina, o cambiando el aminoácido 155
arginina por leucina. Es de esperar que estas modificaciones
produzcan resultados similares en especies que expresan PBR, y en
otras proteínas aparte de PBR que contienen la secuencia de
consenso. Por consiguiente, debería ser posible alterar la capacidad
de un polipéptido para el reconocimiento/interacción del colesterol
que comprende la secuencia de consenso del péptido de la presente
invención cambiando la tirosina en la secuencia de consenso por
serina u otro aminoácido sin carga, por ejemplo, o cambiando la
arginina de la secuencia de consenso por leucina o cualquier otro
aminoácido sin
carga.
carga.
En esta solicitud se describe la primera
secuencia de aminoácidos para interacción/reconocimiento del
colesterol descubierta en PBR. Además de la presencia de PBR en la
membrana de la mitocondria, PBR está presente en la membrana
plasmática (Oke, B. O. et al. 1992, Mol. Cell. Endocr.
87:R1-R6; Garnier, M. et al. 1993,
Endocrinology 132:444) y en la membrana nuclear (Hardwick
et al. 1999, Cancer Research
59:831-842). Los resultados publicados en esta
solicitud indican que el terminal carboxi del receptor es
responsable de la interacción y absorción posterior del colesterol.
El colesterol se libera del receptor una vez se une un ligando a la
parte del terminal amino del receptor. En el caso de las
mitocondrias, el colesterol se libera en la membrana mitocondrial
interna donde está disponible para la interacción con P450scc y se
escinde para producir pregnenolona en las células estereoidogénicas.
La pregnenolona es el precursor de los esteroides.
Además de las utilizaciones descritas
anteriormente, los polipéptidos y ácidos nucleicos de la presente
invención pueden utilizarse también en aplicaciones terapéuticas
para el tratamiento de pacientes mamíferos humanos o no humanos.
El ácido nucleico que codifica el polipéptido
que comprende la secuencia de interacción del colesterol de la
presente invención puede utilizarse como un aceptor de colesterol
para regular la cantidad de colesterol en un tejido o en la sangre.
El ácido nucleico se administra solo o como parte de un vector tal
como es traducido, y el polipéptido resultante es capaz de
interactuar con el colesterol o unirse a éste. La secuencia de ácido
nucleico que codifica un péptido que comprende la secuencia de
consenso para interacción/reconocimiento del colesterol puede
administrarse de manera profiláctica, a pacientes que presentan una
enfermedad o dolencia caracterizada por una concentración elevada
de colesterol en el plasma. "Concentración elevada" significa
una concentración mayor en relación con la que se encuentra
normalmente en el plasma. La administración puede ser mediante
administración exógena del ácido nucleico como ADN desnudo, ADN
asociado a portadores específicos o en un vector de expresión del
ácido nucleico a un tejido deseado por medio de un vehículo de
administración apropiado, p. ej. un liposoma, mediante la
utilización de iontoforesis, electroporación y otros métodos de
administración farmacológicamente aprobados. Algunos métodos de
administración pueden incluir: encapsulación en liposomas,
transducción por vectores retrovíricos, localización en el
compartimento nuclear utilizando la zona de direccionamiento
nuclear hallada en la mayoría de las proteínas nucleares,
transfección de células ex vivo con reimplantación o
administración posterior de las células transfectadas, un sistema
transportador de ADN. Puede utilizarse la administración
intravenosa con un fármaco portador diseñado para aumentar la vida
media de la circulación del ácido nucleico que codifica la secuencia
de interacción interacción/reconocimiento del colesterol. Además,
el tratamiento de cualquier trastorno puede comprender técnicas de
terapia génica que implican la secuencia de dominio de
interacción/reconocimiento del colesterol o una mutación o
alteración de la secuencia de dominio de la
interacción/reconocimiento del colesterol. Las estrategias para la
terapia génica se estudian en Friedman, Science 244, 1275,
1989.
Los vehículos para la administración de fármaco
son eficaces tanto para la administración general como tópica.
Pueden diseñarse para que sirvan como depósito de liberación lenta,
o para liberar su contenido directamente en la célula diana. Una
ventaja de la utilización de vehículos farmacéuticos de
administración directa es que se liberan múltiples moléculas por
absorción. Se ha demostrado que dichos vehículos aumentan la vida
media de la circulación de fármacos que de otro modo se eliminarían
rápidamente en el torrente sanguíneo. Algunos ejemplos de dichos
vehículos de administración farmacéutica especializados son los
liposomas, hidrogeles, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradables
y microesferas bioadhesivas.
La secuencia de ácido nucleico que codifica una
secuencia de reconocimiento/interacción del colesterol puede
también administrarse de forma generalizada. Absorción general se
refiere a la acumulación de fármacos en el torrente sanguíneo
seguida de distribución en todo el cuerpo. Las vías de
administración que conducen a la absorción general incluyen:
intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intranasal,
intratecal y oftálmica. Puede también utilizarse un cañón génico.
La dosis dependerá de la indicación de la enfermedad y de la vía de
administración pero debería estar comprendida entre 1 y 1.000
\mug/kg de peso corporal/día. La duración del tratamiento se
prolongará a lo largo del curso de los síntomas de la enfermedad,
posiblemente en continuo. El número de dosis dependerá del vehículo
de administración para la enfermedad y de los datos de eficacia a
partir de las pruebas
clínicas.
clínicas.
El ácido nucleico que comprende la secuencia de
consenso de interacción/reconocimiento del colesterol puede
administrarse utilizando un método in vivo mediante el cual
el ácido nucleico se administrará directamente a un animal por
inyección intravenosa, inyección intramuscular o por cateterización
y administración directa del ácido nucleico a través de los vasos
sanguíneos y dirigida a un órgano objetivo utilizando activadores
específicos del tejido.
Los polipéptidos de la presente invención pueden
utilizarse para inhibir o bloquear la absorción del colesterol en
las células al competir por el colesterol. Estos métodos pueden
utilizarse generalmente en el tratamiento de varias enfermedades
que resultan de un aumento del colesterol en la célula o en el
plasma, o en la identificación de compuestos eficaces para dicho
tratamiento. El colesterol es necesario para el crecimiento normal
de las células y la estructura y función apropiadas de la membrana.
La acumulación no regulada del colesterol es citotóxica y una
insuficiencia para mantener la homeostasis del colesterol produce
numerosos estados patológicos (véase: Subcellular
Biochemistry vol. 28, Cholesterol: its Functions and
Metabolism in Biology and Medicine. Bittman, Robert (Ed.),
Plenum Press, N.Y.). Los trastornos específicos incluyen litiasis
biliar, ateroesclerosis, Niemann-Pick C.,
sitosterolemia, distrofia, proliferación tumoral (tumorigénesis),
distrofia del cristalino corneal de Schnyder. Los trastornos
cerebrales incluyen el metabolismo del colesterol y la enfermedad de
Alzheimer, toxicidad por teluro, el síndrome de
Smith-Lemli-Opitz, mielinización,
desarrollo de anomalías y desmielinización: enfermedad de
Charcot-Marie-Tooth; enfermedad de
Pelizaeus-Merzbacher, esclerosis múltiple, SLA, por
nombrar unas pocas. Alternativamente, los métodos y composiciones
pueden ser útiles como tratamientos profilácticos o en la
identificación de compuestos eficaces en tratamientos
profilácticos.
En otro aspecto de la invención, el péptido que
comprende la secuencia de aminoácidos para
reconocimiento/interacción del colesterol de la presente invención
puede utilizarse para administrar, cuando sea necesario, colesterol,
o un derivado de colesterol que se une a la secuencia para
reconocimiento/interacción del colesterol de la presente invención.
El péptido puede acomplejarse con colesterol antes de la
administración, impidiendo de este modo la unión no específica del
colesterol a otros factores tal como la albúmina, por ejemplo.
Las cantidades y reactivos necesarios para la
terapia eficaz, denominados también en la presente memoria
"cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz"
dependerá de muchos factores diferentes, incluyendo el medio de
administración, la zona objetivo, el estado fisiológico del paciente
y otros medicamentos administrados. Así, será necesario valorar las
dosis de tratamiento para optimizar la seguridad y la eficacia.
Típicamente, las dosis utilizadas in vitro pueden
proporcionar orientaciones útiles en las cantidades útiles para la
administración in situ de estos reactivos. La experimentación
de dosis eficaces en animales para el tratamiento de determinados
trastornos proporcionará más indicación de pronóstico de la dosis
humana. Generalmente, cantidades terapéuticamente eficaces de
polipéptido que comprenden el dominio para la
interacción/reconocimiento del colesterol de la presente invención
estarán comprendidas entre aproximadamente 0,0001 y aproximadamente
100 mg/kg, y más habitualmente, entre aproximadamente 0,001 y
aproximadamente 0,1 mg/kg del peso corporal del paciente. Se
describen varias consideraciones, p. ej., en Gilman et al.,
(Eds.), Goodman y Gilman's: The Pharmacological Basis of
Therapeutics, (8ª ed., 1990), Pergamon Press, y Remington's
Pharmaceutical Sciences (7ª ed., 1985) Mack Publishing Co.,
Easton, Pa. Los métodos de administración, descritos asimismo en las
referencias anteriores, comprenden, p. ej., la administración oral,
intravenosa, intraperitoneal o intramuscular y la administración
local, incluyendo la administración tópica, transdérmica, por
difusión y en aerosol, para el tratamiento terapéutico y/o
profiláctico. El agente activo generalmente se administrará en una
composición que comprende además un vehículo farmacéuticamente
aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluirán
agua, solución salina, tampones y otros compuestos descritos en, p.
ej., el Merck Index, Merck y Co., Rahway, N. J.
"Sujeto" significa pez, animales,
incluyendo plantas, insectos, monos, simios, gatos, perros, pájaros,
vacas, cerdos, ratones, caballos, conejos y seres humanos.
Los constituyentes de composiciones
farmacéuticas, además de agentes activos, incluyen los conocidos
generalmente en la materia para los varios métodos de
administración utilizados. Por ejemplo, las formas orales
generalmente incluyen polvos, comprimidos, píldoras, cápsulas,
pastillas y líquidos. Asimismo, las formulaciones intravenosas,
intraperitoneales o intramusculares generalmente se disolverán o se
suspenderán en un vehículo farmacéuticamente aceptable, p. ej.,
agua, agua tamponada, solución salina y similares. Además, estas
composiciones pueden incluir constituyentes adicionales que pueden
ser necesarios para condiciones próximas a las fisiológicas, tales
como agentes de ajuste de pH y tamponantes, agentes de ajuste de
toxicidad, agentes humectantes y similares. Para las composiciones
sólidas, pueden utilizarse vehículos sólidos no tóxicos
convencionales que incluyen, p. ej., calidades farmacéuticas de
manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica,
talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y
similares.
La administración puede realizarse también a
modo de composición o dispositivo de liberación controlada, mediante
la cual una liberación lenta del ingrediente activo permite la
administración continua durante un periodo prolongado de tiempo.
Se utilizaron los siguientes Materiales Y
Métodos en los ejemplos que siguen.
Células Leydig MA-10- Se
mantuvieron células tumorales de Leydig de ratón
MA-10 tal como se describió anteriormente
(Papadopoulos, V. et al. 1990, J. Biol. Chem.
265:3772-3779). Para el control de los ensayos de
absorción, se aislaron mitocondrias como se describió (Papadopoulos
et al. 1990, supra; Krueger y Papadopoulos, 1990,
supra) y se volvieron a poner en suspensión en tampón A
(sacarosa 250 mM, KCl 20 mM, hidrocloruro de trietanolamina 15 mM
(pH 7,0), K_{3}PO_{4} 10 mM y MgCl_{2} 10 mM) a una
concentración total de proteína de 1 mg/ml (Leaver, H. A. y Boyd G.
S. 1981, J. Endocrinol. 91:123-133). Se
incubaron a continuación las mitocondrias con
[1,2-^{3}H]-colesterol (0,127
\muCi/100 nmoles) en 0,3 ml de tampón A a 37ºC (o a la temperatura
indicada) durante el periodo de tiempo indicado. Al final de la
incubación, se extrajeron los esteroides y la
^{3}H-pregnenolona formada se aisló por
cromatografía en capa fina y se cuantificó (Amri, H. et al.
1996, Endocrinology 137:5707-5718).
Construcción del vector de expresión de PBR
de ratón (pET15bPBR) y expresión de PBR recombinante en
bacte- rias- Se utilizó el sistema pET (Novagen, Madison,
WI) para expresar la proteína recombinante PBR (PBRm) de ratón
MA-10. La inserción que contiene la secuencia de
codificación completa así como las prolongaciones de las secuencias
NdeI y XhoI en los extremos 5' y 3' se generaron por PCR utilizando
los cebadores siguientes: ATATATA
CATATGCCTGAATCCTGGGTG (SEC. ID nº: 24) y ATACTCGAGTGGGTGCCTTCACTCTG (SEC. ID nº: 25), respectivamente. Se utilizó ADNc de PBR completo de MA-10 (Garnier, N. et al. 1994, Mol. Pharm. 45:201-211) como plantilla y codifica la secuencia ATVLNYYVWRDNS de aminoácidos. Este fragmento de PBRm se insertó en el vector pET156 y se linealizó con NdeI y XhoI corriente abajo del activador T71ac. Se utilizó el vector de expresión de PBRm recombinante para transformar la cepa BL21 (DE3) de Escherichia coli (Novagen) donde la expresión de la proteína PBRm recombinante fue inducida por isopropil-1-tiol-\beta-D-galactopiranósido 1 mM (IPTG). Se controló la expresión de la proteína PBR por SDS-PAGE seguido de tinción con Coomassie Blue o análisis de inmunotransferecia utilizando antisuero anti-PBR (Amri et al. 1996, supra). Se determinó la especificidad de enlace del PBR inducida por IPTG en E. coli en estudios de enlace donde el enlace específico de ^{3}H-PK 11195 (1,0 nM) se midió en presencia de las concentraciones indicadas de los ligandos indicados.
CATATGCCTGAATCCTGGGTG (SEC. ID nº: 24) y ATACTCGAGTGGGTGCCTTCACTCTG (SEC. ID nº: 25), respectivamente. Se utilizó ADNc de PBR completo de MA-10 (Garnier, N. et al. 1994, Mol. Pharm. 45:201-211) como plantilla y codifica la secuencia ATVLNYYVWRDNS de aminoácidos. Este fragmento de PBRm se insertó en el vector pET156 y se linealizó con NdeI y XhoI corriente abajo del activador T71ac. Se utilizó el vector de expresión de PBRm recombinante para transformar la cepa BL21 (DE3) de Escherichia coli (Novagen) donde la expresión de la proteína PBRm recombinante fue inducida por isopropil-1-tiol-\beta-D-galactopiranósido 1 mM (IPTG). Se controló la expresión de la proteína PBR por SDS-PAGE seguido de tinción con Coomassie Blue o análisis de inmunotransferecia utilizando antisuero anti-PBR (Amri et al. 1996, supra). Se determinó la especificidad de enlace del PBR inducida por IPTG en E. coli en estudios de enlace donde el enlace específico de ^{3}H-PK 11195 (1,0 nM) se midió en presencia de las concentraciones indicadas de los ligandos indicados.
Se examinó la absorción de
^{3}H-colesterol por células de E. coli
utilizando las concentraciones indicadas de bacterias transformadas
de referencia o tratadas con IPTG incubadas en presencia de
^{3}H-colesterol 6,7 nM (50,0 Ci/mmol) durante 60
min. a 37ºC. La absorción específica del colesterol se define como
los valores inducidos por ITPG menos los de referencia. Se
prepararon protoplastos de E. coli a partir de células
cultivadas en LB a 37ºC hasta la fase logarítimica de crecimiento y
se centrifugaron a 10.000 g durante 5 min. Se lavaron las células
dos veces en tampón Tris-HCl 10 mM [pH 8,0] y el
sedimento se volvió a poner en suspensión en una solución que
contiene 20% (p/p) de sacarosa y Tris-HCl 0,1 M [pH
8,0]. Las células se pusieron en suspensión a continuación en 1 ml
de tampón para una D.O._{450} de 10 y se mezclaron. En 1 min se
añadió lisozima de una solución madre de 2 mg/ml en agua destilada
hasta una concentración final de 100 \mug/ml a 37ºC, y se continuó
la agitación durante los siguientes 12 min. Se diluyó 1:10 la
suspensión celular con Na_{2}EDTA 0,1 M precalentado a 37ºC. La
agitación continua y la dilución lenta durante 2,5 min impidió la
lisis celular. Más del 99% de las células se volvieron esféricas en
10 minutos (Weiss, R. L. 1978, Meth. Cell Biol.
20:141-147). Se preincubaron a continuación
protoplastos (100 \mug en un volumen final de 0,3 ml) en presencia
de ^{3}H-colesterol 6,7 nM (50,0 Ci/mmol) durante
60 min a 37ºC para los ensayos de absorción del colesterol. Las
membranas marcadas con ^{3}H-colesterol de
bacterias transformadas inducidas por IPTG, se incubaron con
^{3}H-colesterol 30 nM, se trataron con PK 11195 o
clonazepam y se cuantificó el ^{3}H-colesterol
liberado por espectrometría de centelleo líquido.
Mutagénesis dirigida al punto - Se
realizaron mutaciones utilizando el kit de mutagénesis dirigida al
punto QuikChange de Stratagene (La Jolla, CA). En resumen, se
utilizó ADNds del plásmido pET-PBR de
minipreparación como plantilla. Los pares oligonucleótido cebador
sintéticos que contienen las mutaciones puntuales A147T, Y153S y
R155L y las deleciones del PBR, \Delta5-20,
\Delta41-51, \Delta108-119,
\Delta120-122, \Delta141-152,
\Delta153-169, complementaria cada una de la
cadena opuesta del vector, se prolongaron durante el ciclo de
temperatura por la pfu ADN polimerasa. En el momento de la
incorporación de los cebadores de oligonucleótido, se generaron
plásmidos mutados que contienen muescas escalonadas. Después del
ciclo de temperatura se trataron los productos con Dpn I
utilizado para digerir la plantilla de ADN precursor y se
seleccionaron para la mutación generada. Los ADN del vector con
muesca que contienen las mutaciones deseadas se transformaron a
continuación en E. coli. Se prepararon plásmidos mutados
mediante el kit Prism Miniprep de ABI. Las mutaciones y deleciones
generadas se confirmaron por secuenciado utilizando el kit de
reacción preparado para el secuenciado del ciclo terminador del
tinte Prism de ABI (Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City,
CA). El secuenciado del ADN se realizó en el Lombardi Cancer Center
Sequencing Core Facility (Universidad de Georgetown).
Ensayos de fijación de radioligando - Se
realizaron estudios de fijación de
^{3}H-1-(2-clorofenil)-N-metil-N-(1-metil-propil)-3-isoquinolinacarboxamida
(PK 11195) como se describió anteriormente (Papadopoulos, V. et
al. 1990, J. Biol. Chem. 265:3772-3779;
Garnier, M. et al. 1994, Mol. Pharm.
45:201-211). Se determinaron la constante de
disociación (Kd) y el número de puntos de fijación (Bmax) por
análisis de transferencia de Scatchard de los datos utilizando el
programa LIGAND (Munson, P. J. y Rodbard, D. 1980, Anal.
Biochem. 107:220-239).
Determinación de proteínas - Se
cuantificaron las cantidades en microgramos de proteína utilizando
el ensayo de fijación de colorante de Bradford (Bradford, M. M.
1976, Anal. Biochem. 72:248-254) que utiliza
albúmina de suero bovino como patrón.
Estadística - Los resultados presentados
representan la media \pm S.D. o S.E.M. de 2 a 6 experimentos
independientes. Se realizó análisis estadístico por ANOVA seguido
de la prueba de
Student-Newman-Keuls o el
ensayo de comparaciones múltiples de Dunnett utilizando el
paquete Instat (v.2.04) de GraphPad, Inc. (San Diego, CA).
Se construyó un modelo tridimensional de PBR
humano utilizando simulaciones dinámicas moleculares y se demostró
que se adapta a la molécula de colesterol en sus cinco hélices
(Bernassau, J. M. et al. 1993, J. Mol. Graph.
11:236-245). A pesar de las diferencias en la
secuencia primaria de aminoácidos entre el PBR humana y de ratón,
se obtuvieron datos similares cuando la proteína PBR de 18 kDa de
ratón se sometió al mismo análisis (Papadopoulos, V. 1996,
supra), lo que sugiere además que el PBR puede funcionar como
un canal para el colesterol. Para probar este modelo hipotético se
utilizaron dos sistemas de modelo celular: (i) las células de Leydig
MA-10, un modelo de célula esteroidogénica que
expresa grandes niveles de PBR (\sim40 pmoles/mg de proteína;
Papadopoulos, V. et al. 1990, J. Biol. Chem.
265:3772-3779) y como todas las células eucarióticas
contiene colesterol endógeno; y (ii) las células DE3 de E.
coli que no expresan PBR (este estudio), no tienen colesterol
endógeno (Mota, A. G. y Foster, J. W. 1995, Microbial
Physiology. Wiley-Liss, Nueva York) y no forman
esteroides. Así, utilizando estos modelos de células los
solicitantes intentaron correlacionar la expresión de PBR con la
función de transporte del colesterol. Además, los solicitantes
utilizaron un método con colesterol radiomarcado (Leaver, H. A. y
Boyd, G. S., 1981, J. Endocrinol. 91:123-133)
para cuantificar el movimiento del colesterol. Este método permite
la distinción entre el colesterol aportado de forma exógena y el
colesterol endógeno, lo que permite una fácil cuantificación, y la
medición directa de la pregnenolona formada, en el caso de las
células esteroidogénicas donde el colesterol transportado a IMM es
escindido por la P450scc para generar pregnenolona. Los datos
mostrados en la Fig. 1 validan la utilización de este método. La
Fig. 1 demuestra que en las células esteroidogénicas de Leydig, la
absorción de ^{3}H-colesterol por las mitocondrias
y el transporte desde OMM hasta IMM fueron estimulados por ligandos
de PBR específicos que dan como resultado el aumento de la formación
de ^{3}H-pregnenolona. Estos datos están de
acuerdo con los descubrimientos anteriores en todos los tipos de
células del cuerpo que sintetizan esteroides (Papadopoulos, V.
1993, Endocr. Rev. 14:222-240; Papadopoulos,
V. 1998, Proc. Soc. Exp. Biol. Med.
217:130-142). Además, un mecanismo de transporte de
colesterol dependiente de PBR similar desde OMM hasta IMM fue
identificado recientemente en las mitocondrias del hígado (Tsankova,
V. et al., 1995, Eur. J. Pharm.
294:601-607). El transporte del colesterol a IMM del
hígado puede ser necesario para la desintoxicación de colesterol
desde la periferia por la IMM
esterol-27-hidroxilasa (Tsankova
et al., 1995, supra). Es interesante que la velocidad
de absorción del colesterol y del transporte intramitocondrial hasta
IMM, en respuesta a la activación del ligando PBR, era idénticas
(0,9 nmoles/mg de proteína/min.) para las mitocondrias suprarrenales
(Krueger, K. E. y Papadopoulos, V. 1990, J. Biol. Chem.
265:15015-15022) y hepáticas (Tsankova et
al., 1995, supra), lo que sugiere que un mecanismo de
transporte de colesterol similar mediado por PBR es operativo tanto
en tejidos esteroidogénicos como no esteroidogénicos.
Como se indicó anteriormente una bacteria es un
sistema modelo sin colesterol endógeno (Mota y Foster, 1995,
supra). Además, las bacterias no expresan la proteína PBR
(Fig. 2A) ni el enlace del ligando (no mostrado) aunque la
presencia de una proteína PBR homóloga, la proteína tspO
sensible rica en triptófano (denominada también crtK), implicada en
la biosíntesis de carotenoides en las bacterias fotosintéticas
Rhodobacter capsulatus y Rhodobacter sphaeroides, se
ha descrito (Yeliseev, A. A. y Kaplan S. 1995, J. Biol. Chem.
270:21167-21175). Se transfirieron Escherichia
coli con ADNc con PBR de ratón en un vector pET. La adición de
IPTG a las bacterias transfectadas produjo la expresión de la
proteína PBR de 18 kDa (Fig. 2A) y la fijación del ligando (Fig.
2B; Kd=1,1 nM y Bmax=0,23 pmoles/mg de proteína) con características
farmacológicas similares a las descritas anteriormente para PBR
(Papadopoulos, 1993, supra; Papadopoulos, V. et al.
1990, supra) (Fig. 2C). La expresión de PBR inducida por
IPTG produjo una proteína (Fig. 3A), y la absorción dependiente del
tiempo (Fig. 3B) y de la temperatura de colesterol radiomarcado
(Fig. 3B). Esta absorción del colesterol se mantuvo cuando se
prepararon protoplastos lo que indica que PBR reside en la membrana
plasmática bacteriana interna (datos no mostrados). La absorción
del colesterol no pudo ser bloqueada por toxinas energéticas
(DeGrella, R. F. y Simoni, R. d., 1982, J. Biol. Chem.
257:14256-14262) (Fig. 3C). Además, fue específica
para el colesterol ya que ninguna absorción de otro esteroide
radiomarcado pudo observarse (Fig. 3D) y no pudo saturarse a las
concentraciones utilizadas de colesterol radiomarcado (Fig. 3E), lo
que sugiere que PBR funciona como un canal para el colesterol en
lugar de una proteína de enlace del colesterol, lo que está de
acuerdo con los estudios de modelado (Bernassau, et al.,
1993, supra; Papadopoulos, V. 1996, supra). Cuando las
membranas bacterianas inducidas por IPTG y cargadas con colesterol
se trataron con PK 11195, se liberó colesterol de las membranas
(Fig. 3F), lo que sugiere que el colesterol capturado por PBR se
libera en el momento de la fijación del ligando. Así, PBR sirve de
canal o hace una función de boca donde el colesterol puede
introducirse y residir almacenado dentro de la membrana sin
interactuar con los componentes lipídicos o proteicos de la bicapa
lipídica. Esta puede ser también la manera mediante la que las
mitocondrias se clasifican entre el grupo esteroidogénico del
colesterol del componente colesterol de la membrana. Así, los
ligandos PBR controlan el estado de abertura/liberación del canal,
mediando el movimiento del colesterol a través de las membranas.
Además de los ligandos del fármaco PBR, el inhibidor del enlace del
polipéptido diazepam (DBI) y las porfirinas (Papadopoulos, V. 1993,
supra) se han identificado como ligandos endógenos
naturales). Debe observarse que actualmente no se puede excluir la
posibilidad de que PBR funcione como una flipasa o un
transportador.
En apoyo de los datos presentados en la presente
memoria, la interrupción dirigida del gen PBR en las células
esteroidogénicas produjo la inhibición del transporte del colesterol
a IMM y la interrupción de la biosíntesis de esteroides
(Papadopoulos, V. et al. 1997, J. Biol. Chem.
272:32129-32135). Transfectando las células de
Leydig mutantes con PBR con el ADNc con PBR se recuperó la
esteroidogénesis y se demostró la función obligatoria de PBR en el
transporte de colesterol (Papadopoulos, V. 1996, supra).
PBR es una proteína hidrófoba de 18 kDa con
cinco dominios supuestos de transmembrana situados en la OMM. Como
primera etapa en la definición de las zonas del receptor implicadas
en la interacción con el ligando del fármaco y el colesterol, los
solicitantes construyeron las PBR mutantes con las deleciones
indicadas en el panel izquierdo de la Fig. 4. En la Fig. 4 se
presenta también la posición de las cinco zonas de transmembrana
del receptor (I a V). Debe observarse que el terminal amino de las
proteínas de la membrana mitocondrial se dirige hacia el interior
del orgánulo en el que el terminal carboxi está en el lado
citoplásmico. El panel derecho de la Fig. 4 muestra el efecto de
deleción de las secuencias de aminoácido específicas en el enlace
del ligando de PBR y la absorción del colesterol examinada en el
sistema bacteriano descrito anteriormente. La deleción de las
secuencias 5 a 20 y 41 a 51 de aminoácidos en el terminal amino del
receptor disminuyó del 30 al 45% la capacidad de PBR para fijarse
al ligando PK 11195. Los resultados de los solicitantes están de
acuerdo con los estudios anteriores en PBR humana expresada en
levadura (Farges, R. et al., 1994, Mol. Pharm.
46:1160-1167), aunque en esos estudios la deleción
del terminal amino de PBR humana suprimió completamente la
capacidad del receptor para unirse a PK 11195. La deleción de los
aminoácidos 120 a 133 en el cuarto dominio de transmembrana
disminuyó también el enlace del ligando de PBR en el 45%. Una
disminución más pequeña (25%) del enlace de PK 11195 se observó
también cuando se eliminaron las zonas 141 a 152 y 153 a 169. Estos
resultados sugieren que aunque el terminal amino del receptor puede
dotar de capacidad para unir ligandos farmacéuticos, tal como la
isoquinolina PK 11195, las secuencias de aminoácidos en el cuarto
dominio de transmembrana puede participar en la formación del punto
de fijación al ligando. Debe observarse que las deleciones que
afectan a la unión de ligando PK 11195 no tenían un efecto mayor
sobre la capacidad del receptor recombinante expresado en las
membranas bacterianas para absorber el colesterol
radiomarcado.
radiomarcado.
La Fig. 4 demuestra también que la deleción de
los aminoácidos 153 a 169 en el terminal carboxi de PBR tuvo un
efecto drástico sobre la capacidad de la molécula para absorber
^{3}H-colesterol cuando se expresa en bacterias
(disminución del 70%). Este resultado sugiere que el dominio del
terminal carboxi citoplásmico del receptor es responsable de la
interacción y posterior absorción del colesterol. En un esfuerzo
para identificar aminoácidos específicos en PBR responsable de la
interacción con el colesterol los solicitantes emprendieron
estudios de mutagénesis dirigida al punto en la zona carboxi
terminal.
Estudios recientes por Pikuleva et al.
(1995, Arch. Biochem. Biophys. 322:189-197)
con otra proteína que interactúa con el colesterol, la enzima
P450scc, indicó que una tirosina en el punto activo del P450scc
interactúa con la cadena lateral del colesterol. Alineando la
secuencia de aminoácidos del punto activo de P450scc con el
terminal carboxi de PBR indicó que puede existir un modelo de
consenso de aminoácidos común en estas dos moléculas que reconocen
el colesterol (Tabla I). Este modelo de consenso se compone de un
aminoácido neutro e hidrófobo (Z), tal como leucina o valina, un
aminoácido neutro y polar (Y), tal como tirosina y un aminoácido
básico (Q), tal como arginina o lisina. Uno a cinco aminoácidos
diferentes pueden colocarse entre estos tres aminoácidos de
codificación. Así, el modelo de consenso propuesto es
-Z-(X)_{0-5}-Y-(X)_{0-5}-Q-.
La leucina o la valina interactuarán con la cadena lateral
hidrófoba del colesterol y la tirosina interactuará con el grupo OH
en 3' polar del colesterol, mientras que la arginina o la lisina
pueden ayudar a crear una bolsa. Esta hipótesis fue probada (Fig.
5). La sustitución de Y153 por serina o R156 por leucina suprimió
completamente la capacidad de PBR para absorber el colesterol
radiomarcado. La mutación y sustitución de A147 con treonina, no
afectó la absorción de colesterol por las bacterias que expresan el
receptor mutado. La Fig. 5 también demuestra que las proteínas
receptoras recombinantes mutadas se expresaron a niveles iguales en
la inducción de IPTG.
En un esfuerzo para observar si este supuesto
modelo de consenso de aminoácidos para reconocimiento/interacción
del colesterol está presente en otras moléculas mostradas o
sugeridas para interactuar con colesterol, tales como la
apolipoproteína A-1 (Boyle, T. P. y Marotti, K. R.,
1992, Gene 117, 243-247), caveolina (Murata,
M. et al. 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,
10339-10343), DBI (Papadopoulos, V. 1993, Endocr.
Rev. 14, 222-240; Papadopoulos, V. 1998,
Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 217, 130-142),
proteína reguladora de la estereoidogénesis aguda (StAR) (Stocco,
D. M. y Clark, B. J. 1996, Endocr. Rev. 17,
221-244), proteína erizo (Porter, J. A. et
al. 1996, Science 274, 255-259),
citocromo P450 C26/25 (Su, P. et al. 1990, DNA Cell
Biol. 9-657-667), anexina II
(Harder, T. et al. 1997, Mol. Biol. Cell 8,
533-545), proteína 2 transportadora de esterol
(Colles, S. M. et al. 1995, Lipids 30,
795-803), colesterol
7\alpha-monooxigenasa (Kai, M. et al. 1995,
Lipid Res. 36, 367-374), colesterol oxidasa
(Ishizaki, T. et al. 1991, J. Bacteriol. 171,
596-601), colesterol deshidrogenasa (Horinouchi, S.
et al. 1991, Appl. Environ. Microbiol. 57,
1386-1393), precursor de lipasa activado por sales
biliares (colesterol esterasa) (Nilsson, J. et al. 1990,
Eur. J. Biochem. 192, 543-550) y
acil-CoA colesterol aciltransferasa (Pape M. E.
et al. 1995, J. Lipid Res. 36,
823-838) los solicitantes observaron la presencia
del modelo de consenso de aminoácidos
-Z-(X)_{0-5}-Y-(X)_{0-5}-Q-
para el reconocimiento/interacción del colesterol en estas
proteínas. La Tabla I demuestra que todas estas proteínas, con
excepción de la proteína-2 transportadora de
esterol, contienen este modelo de consenso de aminoácidos. Las
proteínas tales como la alfa-actina del músculo
esquelético de la rata, la cadena lateral de la miosina no del
músculo y del músculo liso no contienen este modelo de consenso
para el reconocimiento/interacción del colesterol. Sin embargo dada
cualquier tirosina existe una probabilidad razonablemente elevada
de que esta secuencia de consenso de aminoácidos se encuentre en
muchas proteínas. De hecho, una búsqueda del motivo en los diversos
bancos de datos génicos indicó que este modelo de consenso de
aminoácidos está presente en varias proteínas. Esto no es
sorprendente ya que es sabido que la interacción
colesterol/proteína desempeña una función no solamente en el
transporte y/o almacenamiento de colesterol sino también en la
estabilidad, plegamiento y/o localización de la proteína. Así pues,
es posible que solamente en algunas proteínas esta secuencia de
consenso sea operativa. La intensidad y especificidad de la
interacción de una proteína que contiene esta secuencia de consenso
de aminoácidos con el colesterol puede ser debida ya sea a la
presencia de un determinado micromedio, o a la posición de la
secuencia de consenso en la proteína, o a una conformación
específica de la proteína que permite la utilización de esta
secuencia de aminoácidos. En este último caso, es posible también
que la secuencia de consenso identificada represente solamente una
fracción, quizás el núcleo, de un motivo mayor que debe
identificarse.
De especial interés para la esteroidogénesis es
la observación de que el modelo de consenso de aminoácidos para el
reconocimiento/interacción del colesterol se observó en el
polipéptido DBI (Papadopoulos, V. 1993, supra; Papadopoulos,
V. 1998, supra) y la proteína StAR precursora (Stocco, D. M.
y Clark, B. J. 1996, Endocr. Rev. 17,
221-244). En la búsqueda de un factor citosólico
estimulante de la esteroidogénesis, se purificó una proteína que
demostró ser idéntica a DBI (Papadopoulos, V. 1993, supra).
DBI se purificó inicialmente a partir del cerebro controlando su
capacidad para desplazar diazepam de sus zonas de reconocimiento en
sinaptosomas. DBI es también idéntica a la proteína de fijación
acil-CoA- (Knudsen, J. et al., 1993, Mol.
Cell. Biochem. 123:129-138). Se demostró que la
DBI purificada estimula el transporte del colesterol
intramitocondrial y aumenta la formación de pregnenolona por las
mitocondrias aisladas (Papadopoulos, V. 1998, supra). Después
de esto, se demostró que esta acción de DBI estaba mediada por PBR
(Papadopoulos, V. 1993, supra; Papadopoulos, V. 1998,
supra). Además se demostró que DBI aumenta la carga de
colesterol en la P450scc aislada (Brown, A. S. y Hall, P. F., 1991
Biochem. Biophys. Res. Commun. 180:609-614).
Así pues, la identificación del modelo de consenso de aminoácidos
para el reconocimiento/interacción del colesterol en DBI puede
ayudar a comprender su función en la esteroidogénesis y su efecto
directo sobre P450scc. Resulta interesante que los solicitantes
demostraron en el pasado que el producto de DBI de tratamiento
natural, el triacontatetrapéptido TTN
(DBI_{17-50}), pero no el octadecanuropéptido ODN
(DBI_{33-50}), pudo simular el efecto de DBI en la
esteroidogénesis mitocondrial (Papadopoulos, V. et al. 1991,
Endocrinology 129:1481-1488). El
descubrimiento de que en DBI el modelo de consenso de aminoácidos
para el reconocimiento/interacción del colesterol está situado en la
secuencia de aminoácidos 25 a 32 (Tabla I) puede ahora explicar
este resultado. Debe observarse también que el modelo e consenso de
aminoácidos para el reconocimiento/interacción del colesterol se
encuentra en medio de la identificación de la proteína que se une a
acil-CoA (aminoácidos 19 a 37) importante en la
formación de la zona de unión a acil-CoA (Knudsen
et al. 1993, supra).
Se ha descubierto StAR en las células de las
gónadas y de las cápsulas suprarrenales, donde están recién
sintetizadas en respuesta a hormonas tróficas, como una proteína
precursora citoplásmica de 37 kDa dirigida a las mitocondrias
(Stocco y Clark, 1996 supra). La síntesis de StAR en las
células de Leydig comienza 60 min después de la adición de la
hormona y a continuación va paralela a la capacidad de las células
para producir esteroides en respuesta a las hormonas tróficas
(Stocco y Clark, 1996 supra; Clark, B. J. et al.,
1995, Mol. Endocr. 9:1346-1355). El
precursor StAR de 37 kDa experimenta además escisión para producir
la proteína StAR "madura" mitocondrial de 30 kDa y su
contrapartida fosforilada (Stocco y Clark, 1996 supra). Este
tratamiento de la proteína se cree que se produce a nivel de las
zonas de contacto de la membrana mitocondrial externas/internas y se
ha propuesto que es responsable del transporte del colesterol desde
la membrana mitocondrial externa a la interna (Stocco y Clark, 1996
supra). Considerando que el modelo de consenso de aminoácidos
para el reconocimiento/interacción del colesterol se encuentra en
el terminal amino de la proteína precursora StAR, que se separa de
la proteína madura, es posible que la función de la proteína
precursora StAR sea para lanzar el colesterol desde los depósitos
intracelulares hasta la membrana mitocondrial
externa.
externa.
En conclusión, los resultados presentados en la
presente memoria demuestran que PBR puede desempeñar una función de
tipo canal para el colesterol en la OMM. El grupo esteroidogénico
del colesterol, que procede de varias fuentes intracelulares, es
reconocido por el modelo de consenso de aminoácidos
-Z-(X)_{0-5}-Y-(X)_{0-5}-Q-
para el reconocimiento/ interacción del colesterol presente en el
terminal carboxi de PBR en la OMM. Este grupo de colesterol se
introduce en la OMM en las zonas de PBR donde permanece sin
mezclarse con otros componentes de la membrana. El enlace del
ligando al receptor produce la liberación de este colesterol.
Considerando que se ha demostrado que el PBR está asociado al canal
aniónico dependiente del voltaje (Papadopoulos, V. 1998,
supra), descubierto en los puntos de contacto de la membrana
mitocondrial externa/interna, el colesterol liberado puede ahora
acceder directamente a la P450scc en la IMM donde se escindirá a
pregnenolona, precursora de todos los
esteroides.
esteroides.
\newpage
Además de ser un precursor para la síntesis de
hormonas esteroides, el colesterol es un elemento estructural
esencial de las membranas celulares y un precursor para la síntesis
de ácidos biliares y lipoproteínas. Las células de mamífero
obtienen colesterol por interiorización de las lipoproteínas de baja
densidad o por la síntesis de novo en el retículo endoplásmico. La
distribución subcelular del colesterol de novo sugiere que el
colesterol es transportado e incorporado rápidamente desde los
puntos de adquisición a la membrana objetivo (Liscum, L. y
Underwood, K. W. 1995, J. Biol. Chem.
270:15433-15446). Así pues, se consigue la
homeostasis del colesterol específica para el tejido y las células.
Considerando el caso difundido de PBR y su localización subcelular
específica en el tejido y en las células (Papadopoulos, V. 1993,
supra; Papadopoulos, V. 1998, supra), estos
resultados sugieren una función más general para PBR en el
transporte y compartimentación del colesterol intracelular.
<110> GEORGETOWN UNIVERSITY MEDICAL
CENTER
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<120> SECUENCIA DE RECONOCIMIENTO DEL
COLESTEROL
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<130> 23521-0118
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<140> PCT/US99/05853
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<141>
1999-03-12
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<160> 25
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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artificial: péptido sintético
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artificial: péptido sintético
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatatatacat atgcctgaat cctgggtg
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatactcgagt gggtgccttc actctg
\hfill26
Claims (29)
1. Péptido aislado con una secuencia de
aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol
seleccionada de entre el grupo constituido por la SEC. ID nº: 2,
SEC. ID nº: 3, SEC. ID nº: 4 y SEC. ID nº: 5.
2. Molécula aislada de ácido nucleico que
comprende una secuencia de nucleótidos para
interacción/reconocimiento del colesterol seleccionada de entre el
grupo constituido por:
- a)
- una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol tal como se define en la reivindicación 1;
- b)
- una secuencia de nucleótidos complementaria de (a).
3. Molécula de ácido nucleico que
comprende:
- (i)
- un vector; y
- (ii)
- una molécula de ácido nucleico tal como se define en la reivindicación 2.
4. Molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 3, en el que dicho vector es un vector
procariótico.
5. Molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 3, en el que dicho vector es un vector
eucariótico.
6. Molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 4 ó 5, en la que dicho vector es un vector de
expresión.
7. Molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 6, en la que dicho vector es útil para la expresión
en plantas.
8. Célula huésped transformada por la
molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3.
9. Célula huésped de la reivindicación 8, en
la que dicha célula huésped es procariótica.
10. Célula huésped de la reivindicación 8, en
la que dicha célula huésped es eucariótica.
11. Célula huésped de la reivindicación 10, en
la que dicha célula huésped es una célula vegetal.
12. Método para detectar si una proteína
reconoce el colesterol, que comprende identificar en la secuencia
de aminoácidos de dicha proteína, la presencia o ausencia de una
secuencia de aminoácidos para interacción/reconocimiento del
colesterol tal como se define en la reivindicación 1, o identificar
en la secuencia nucleotídica que codifica dicha proteína, la
presencia o ausencia de una secuencia nucleotídica para
interacción/reconocimiento del colesterol tal como se define en la
reivindicación 2, en el que la presencia de un aminoácido para
reconocimiento/interacción del colesterol o la presencia de una
secuencia nucleotídica para reconocimiento/interacción del
colesterol indica la interacción/reconocimiento de la proteína con
el colesterol.
13. Método para dotar de
reconocimiento/interacción del colesterol a una molécula, que
comprende introducir en dicha molécula una secuencia de aminoácidos
para reconocimiento/interacción del colesterol tal como se define
en la reivindicación 1 de modo que dicha secuencia se expresa y
dicha molécula interactúa con el coles-
terol.
terol.
14. Utilización de un péptido según la
reivindicación 1, para la preparación de un medicamento destinado a
regular la cantidad de colesterol en la sangre o tejido.
15. Utilización de un péptido según la
reivindicación 14, en la que el medicamento destinado a regular la
cantidad de colesterol en la sangre se utiliza para el tratamiento
de litiasis biliar, ateroesclerosis, Niemann-Pick
C., sitosterolemia, distrofia, tumorigénesis, distrofia del
cristalino corneal de Schnyder, enfermedad de Alzheimer, toxicidad
por teluro, síndrome de
Smith-Lemli-Opitz, mielinización,
enfermedad de Charcot-Marie-Tooth;
enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher y esclerosis
múltiple.
16. Utilización de un ácido nucleico según la
reivindicación 2, para la preparación de una composición destinada
a reducir la concentración de colesterol en el suero en un
sujeto.
17. Utilización de un péptido que comprende la
secuencia de aminoácidos para interacción/reconocimiento del
colesterol tal como se define en la reivindicación 1, acomplejada
con una cantidad farmacéuticamente aceptable de colesterol y un
diluyente farmacéuticamente aceptable en la preparación de una
composición para administrar colesterol a un sujeto.
\newpage
18. Método para detectar un aumento o
disminución de colesterol en una muestra biológica que
comprende:
inmovilizar un polipéptido que comprende la
secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del
colesterol tal como se define en la reivindicación 1 en un soporte
sólido que da un polipéptido inmovilizado
exponer la muestra al polipéptido inmovilizado,
y
medir la cantidad de polipéptido unido al
colesterol en el que cuando se compara con un patrón puede
determinarse un aumento o disminución con relación al patrón.
19. Método para identificar agentes o fármacos
que son agonistas o antagonistas de la interacción entre los
péptidos que comprende la secuencia de aminoácidos para
reconocimiento/interacción del colesterol tal como se define en la
reivindicación 1 y colesterol, que comprende:
exponer un péptido que comprende la secuencia de
aminoácidos para interacción/reconocimiento del colesterol tal como
se define en la reivindicación 1 al colesterol en condiciones en las
que se produce la interacción entre el colesterol y el péptido
formando un complejo péptido/colesterol
incubar el complejo con un compuesto de
ensayo
medir un aumento o disminución del nivel de
interacción entre el péptido y el colesterol en respuesta al
compuesto de ensayo en el que un aumento en la interacción
indicaría que el compuesto de ensayo es un agonista y una
disminución en la interacción indicaría que el compuesto de ensayo
es un antagonista de la fijación péptido/colesterol.
20. Método según la reivindicación 19, que es
para la identificación de antagonistas de interacción entre los
péptidos que comprende la secuencia de aminoácidos para
interacción/reconocimiento del colesterol tal como se define en la
reivindicación 1 y colesterol, en el que el compuesto de ensayo es
un péptido, fármaco o anticuerpo.
21. Método según la reivindicación 20, cuyo
método comprende además una etapa de producción de un antagonista
identificado en el método.
22. Método para reducir la capacidad de
fijación del colesterol de un péptido que comprende la secuencia de
aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol tal como
se define en la reivindicación 1 que comprende:
modificar una tirosina por una serina,
modificar una arginina por una leucina,
modificar una treonina por una serina,
modificar una valina por una leucina,
modificar una leucina por una isoleucina,
modificar una tirosina por una valina,
modificar una tirosina por una isoleucina,
modificar una valina por una isoleucina,
modificar una arginina por una isoleucina, y
modificar un aspartato por un glutamato.
23. Receptor de benzodiazepina de tipo
periférico, en el que la función para reconocimiento/interacción del
colesterol de dicho receptor se reduce según el método de la
reivindicación 22.
24. Receptor de benzodiazepina de tipo
periférico incapaz de reconocer/interactuar con el colesterol,
receptor que presenta una deleción que comprende una secuencia de
aminoácidos para interacción/reconocimiento del colesterol tal como
se define en la reivindicación 1.
25. Utilización de un ácido nucleico tal como
se define en la reivindicación 2, para la preparación de una
composición destinada a reducir los síntomas de una enfermedad en un
sujeto procedente de un aumento de colesterol.
26. Utilización según la reivindicación 25, en
la que dicha composición comprende microesferas.
27. Planta transgénica que comprende un ácido
nucleico que codifica un receptor de benzodiazepina de tipo
periférico según la reivindicación 24 ó 25.
28. Planta transgénica que comprende un ácido
nucleico que codifica un receptor de benzodiazepina de tipo
periférico según la reivindicación 24 ó 25 operativamente ligado a
un activador inducible.
29. Planta transgénica según la reivindicación
28, en la que dicho activador es inducible en cualquiera de las
condiciones siguientes: calor, administración de antibióticos y
administración de hormonas vegetales.
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