ES2274621T3 - Peptidos que contienen una secuencia de reconocimiento del colesterol y usos de los mismos. - Google Patents

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Abstract

Péptido aislado con una secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol seleccionada de entre el grupo constituido por la SEC. ID nº: 2, SEC. ID nº: 3, SEC. ID nº: 4 y SEC. ID nº: 5.

Description

Péptidos que contienen una secuencia de reconocimiento del colesterol y usos de los mismos.
Introducción
El punto de control principal en la estimulación aguda de la esteroidogénesis por hormonas conlleva la primera etapa en su serie de reacciones de biosíntesis donde el colesterol se transforma en pregnenolona mediante la enzima citocromo P-450 de escisión de la cadena lateral C_{27} del colesterol (P-450scc) y las proteínas auxiliares de transferencia de electrones, situadas en las membranas internas de las mitocondrias (IMM) (Simpson, E. R. y Waterman, M. R., 1983, Can. J. Biochem. Cell. Biol. 61:692-717; Jefcoate, C. R. et al., 1992, J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 43: 751-767). Estudios más detallados han demostrado que la reacción catalizada por P-450scc no es la etapa limitativa de la velocidad en la síntesis de las hormonas esteroideas. Antes bien, la etapa limitativa de la velocidad es el transporte del precursor del colesterol, procedente de fuentes intracelulares a las IMM. Este mecanismo de transporte dependiente de hormonas se demostró que está localizado en la mitocondria (Simpson y Waterman, 1983, supra; Jefcoate, et al., 1992, supra). Todos los documentos citados anteriormente y a continuación en la presente memoria están incorporados en la misma en su totalidad con referencia a la misma.
El receptor de benzodiazepina de tipo periférico (PBR) se descubrió en un principio porque se une al benzodiazepina diazepam con afinidad relativamente elevada (Papadopoulos, V. 1993, Endocr. Rev. 14:222-240). Las benzodiazepinas están entre los fármacos más recetados debido a sus acciones farmacológicas en el alivio de la ansiedad mediado por la modulación de la actividad de los receptores del ácido \gamma-aminobutírico en el sistema nervioso central (Costa, E. y Guidotti, A. 1979, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 19:531-545). PBR es otra clase de puntos de fijación para las benzodiazepinas distinta de los receptores del neurotransmisor mencionados anteriormente. Estudios adicionales demostraron que además de las benzodiazepinas, el PBR se une a otras clases de compuestos orgánicos con gran afinidad (Papadopoulos, 1993, supra). PBR, aunque está presente en todos los tejidos examinados se observó que era especialmente abundante en los tejidos que producen esteroides, donde se localizaba principalmente en la membrana externa de la mitocondria (OMM) (Anholt, R. R. H. et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:576-583). Se identificó como PBR una proteína que se une a la isoquinolina de 18 kDa (Papadopoulos, V. 1998, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 217:130-142). Se demostró a continuación que PBR es un componente funcional del sistema estereoidogénico (Papadopoulos, 1998, supra; Papadopoulos V. et al. 1990, J. Biol. Chem. 265:3772-3779) que media en la liberación del colesterol desde la membrana externa a la interna de las mitocondrias (Krueger, K. E. y Papadopoulos, V. 1990, J. Biol. Chem. 265:15015-15022). Estudios adicionales demostraron que la reducción producida farmacológicamente de las concentraciones de PBR suprarrenales in vivo producían la disminución de las concentraciones de glucocorticoide circulantes (Papadopoulos, V. 1998, supra). Además, la descomposición dirigida del gen PBR en las células de Leydig producían la interrupción del transporte del colesterol en las mitocondrias y formación de esteroide; la transfección de las células mutantes con una esteroidogénesis recuperada por ADNc de PBR (Papadopoulos, V. et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:32129-32135). No se sabe cómo el PBR afectaba el transporte del colesterol y si o no interactuaba directamente con PBR con el colesterol.
Glenny J. R. (FEBS Letters 314(1), páginas 45-49) da a conocer la secuencia de ADNc de la caveolina del pulmón humano. Esta es homóloga a la secuencia del ADNc de la caveolina del pollo y de VIP 21.
Boyle T. P. y Marotti K. R. (Gene 117, páginas 243-247) da a conocer la secuencia del gen de la apolipoproteína A-I murina.
Su P. et al. (Medline Abstract 91083838) da a conocer el cribado de un banco de expresión de ADNc procedente del hígado de rata con un anticuerpo policlonal específico para la vitamina D3 25-hidroxilasa mitocondrial y un ADNc para el citocromo P450c26 mitocondrial de hígado de conejo. Se identificó un citocromo P450 de mitocondrias bifuncional capaz de catalizar la 25-hidroxilación de la vitamina D3 y la 26-hidroxilación del colesterol.
Pikuleva I. A. et al. (Medline Abstract 96004795) da a conocer el efecto de los restos específicos de mutación del citocromo P450scc por escisión de la cadena lateral del colesterol bovino sobre la fijación del sustrato. Pikuleva et al. sugiere que Y94 interactúa con la cadena lateral del colesterol.
Sumario de la invención
Basándose en la secuencia de aminoácidos conocida de la proteína PBR de 18 kDa humana y de ratón, se desarrolló un modelo tridimensional de esta proteína receptora utilizando simulaciones dinámicas moleculares (Bernassau, J. M. et al., 1993, J. Mol. Graph. 11:236-245; Papadopoulos, V. 1996, en: Payne A. H., Hardy, M. P., Russell, L. D. (eds) The Leydig Cell. Cashe River Press, Viena, IL, págs. 598-628). El análisis de la estructura tridimensional indicó que tanto el PBR humana como de ratón podrían adaptar posiblemente el colesterol y la función como canal. En la presente invención, se describe la experimentación y comprobación de esta hipótesis.
En la presente invención, los solicitantes identifican una secuencia de aminoácidos de reconocimiento del colesterol en PBR, común a todas las proteínas que se ha demostrado que interactúan con el colesterol, y se demuestra que el PBR funciona como estructura de tipo canal de colesterol, que media en el transporte del colesterol a través de las membranas.
El colesterol, que procede de varias fuentes intracelulares, es reconocido por el modelo de consenso de aminoácidos de reconocimiento/interacción del colesterol presente en el terminal carboxi del PBR en la membrana externa de la mitocondria (OMM). Este grupo de colesterol se introduce en la (OMM) en las zonas de PBR donde permanece sin mezclarse con otros componentes de la membrana. La fijación del ligando al receptor produce la liberación de este receptor. Cuando se libera, puede accederse al colesterol por la P450scc y se escinde en pregnenolona, precursor de todos los esteroides.
Por consiguiente, un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar péptidos con una secuencia de aminoácidos de reconocimiento/interacción de colesterol.
La presencia de la secuencia de aminoácidos de reconocimiento/interacción del colesterol en una proteína supone la probabilidad de interacción con el colesterol.
Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de reconocimiento/interacción del colesterol descrita anteriormente, y los vectores que incorporan toda o parte de dicha secuencia, y las células, procarióticas y eucarióticas, transformadas o transfectadas con dichos vectores, para su utilización en la producción de péptidos con una secuencia de interacción/reconocimiento del colesterol. Las células transformadas o transfectadas sirven para identificar agentes o fármacos que alteran la interacción/reconocimiento del colesterol, y la absorción del colesterol.
Otro objetivo todavía de la presente invención consiste en proporcionar un método para identificar si una proteína reconoce o interactúa o no con el colesterol comprendiendo dicho método identificar la presencia o ausencia de la secuencia de aminoácidos de reconocimiento/interacción del colesterol antes mencionada en la que la presencia de la secuencia es una indicación de la probabilidad de que la proteína reconoce/interactúa con el colesterol.
Otro objetivo de la presente invención todavía consiste en proporcionar un método para dotar a la molécula de la capacidad de interactuar con el colesterol introduciendo en una molécula o polipéptido natural o sintética, una secuencia de reconocimiento/interacción del colesterol de modo que la proteína o polipéptido, natural o sintética, sea capaz ahora de reconocer/interactuar con el colesterol.
Otro objetivo todavía de la presente invención consiste en proporcionar una molécula, natural o sintética que comprende la secuencia de reconocimiento/interacción del colesterol descrita anteriormente.
Un objetivo adicional de la presente invención consiste en proporcionar una molécula que bloquee o compita con la capacidad de interacción/reconocimiento del colesterol de la secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol descrita anteriormente. La molécula puede ser un anticuerpo, un péptido, un péptido que comprende la secuencia de consenso de interacción/reconocimiento del colesterol o un fármaco.
Otro objetivo todavía de la presente invención consiste en proporcionar un método para alterar la capacidad de fijación del colesterol de las moléculas que contienen la secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol descrita anteriormente, que comprende alterar dicho punto de modo que el reconocimiento del colesterol se reduzca, elimine o aumente. El reconocimiento del colesterol puede aumentarse proporcionando una bolsa de colesterol perfecta, o alternativamente, proporcionando más de una secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol en una molécula de proteína.
Otro objetivo adicional de la presente invención consiste en proporcionar un PBR con capacidad reducida para reconocer e interactuar con el colesterol modificando la secuencia de reconocimiento/interacción del colesterol del PBR, por ejemplo cambiando el aminoácido 153 de tirosina a serina, o cambiando el aminoácido 155 de arginina a leucina. Esta modificación o modificaciones similares pueden utilizarse para reducir el reconocimiento/interacción del colesterol o la fijación de otras proteínas o agentes que contienen la secuencia de aminoácidos para interacción/reconocimiento del colesterol descrita anteriormente.
Breve descripción de los dibujos
Estas y otras propiedades, aspectos y ventajas de la presente invención se entenderán mejor con referencia a la siguiente descripción y reivindicaciones adjuntas y a los dibujos adjuntos, en los que:
La Figura 1 presenta el efecto de los ligandos de PBR sobre el transporte del colesterol en la célula de Leydig MA-10 y la formación de pregnenolona. Las mitocondrias de las células de Leydig MA-10 se incubaron con ^{3}H-colesterol en presencia o ausencia de los compuestos indicados. Se midió la ^{3}H-pregnenolona tal como se describe en Materiales y Métodos. Los datos (media \pm SD) mostrados son representativos de dos a cuatro experimentos independientes, cada uno con ensayos por triplicado. El efecto observado fue estadísticamente significativo en todas las líneas
(P<0,001).
Las Figuras 2A, B y C presentan la expresión de PBR recombinante en bacterias. Se desarrolló y utilizó el vector de expresión de PBRm recombinante para transformar la cepa BL21 (DE3) de Escherichia coli como se describe en Materiales y Métodos. La expresión de la proteína PBRm recombinante fue inducida por IPTG 1 mM.
A) La expresión de la proteína PBR fue controlada por SDS-PAGE seguida de tinción con Coomassie Blue o análisis por inmunotransferencia. 1, Referencia: 2 y 3, dos preparaciones diferentes de bacterias tratadas con IPTG.
B) Especificidad de fijación de el PBR inducida por IPTG en Escherichia coli. La fijación específica de [^{3}H]PK11195 (1,0 nM) se midió en presencia de las concentraciones indicadas de varios ligandos.
C) Representación de Scatchard de la fijación específica de ^{3}H-PK11195 a la bacteria inducida por IPTG.
Figura 3. Características de la absorción de ^{3}H-colesterol por células de E. coli.
A) La absorción del ^{3}H-colesterol por células de E. coli se examinó utilizando concentraciones crecientes de bacterias de control o transformadas tratadas con IPTG incubadas en presencia de ^{3}H-colesterol 6,7 nM (50,0 Ci/mmoles) durante 60 min. a 37ºC. La absorción específica del colesterol se define como los valores de referencia negativos que producen IPTG.
B) Absorción específica de ^{3}H-colesterol examinada a las temperaturas indicadas utilizando 100 \mug de proteína bacteriana.
C) Efecto de los tóxicos energéticos sobre la absorción de ^{3}H-colesterol por las bacterias transformadas producidas por IPTG.
D) La expresión de PBR provoca la absorción de colesterol solamente. Se incubaron bacterias en las mismas condiciones descritas anteriormente en presencia del esteroide radiomarcado indicado.
E) Absorción específica de ^{3}H-colesterol determinada en presencia de concentraciones crecientes de ^{3}H-colesterol.
F) Liberación producida por el ligando de la absorción de colesterol por las membranas bacterianas. Las membranas marcadas con ^{3}H-colesterol de bacterias transformadas inducidas por IPTG se incubaron con concentraciones crecientes de PK11195 o clonazepam, y se cuantificó la cantidad liberada de ^{3}H-colesterol. Los resultados mostrados representan la media \pmSD de un experimento realizado por triplicado. Resultados similares se obtuvieron en otros tres experimentos independientes.
Figura 4. Análisis de la mutación con deleción de la fijación del ligando función de PBR-PK11195 y absorción de ^{3}H-colesterol por las bacterias transfectadas con las PBR naturales y mutadas. La expresión de las proteínas fue inducida por IPTG. Izquierda, se presentan las cinco zonas de transmembrana de PBR así como la posición de las deleciones acometidas. Derecha, se presenta el efecto de cada deleción sobre la fijación del ligando PK11195 y la absorción del colesterol. Los resultados mostrados son las medias de los triplicados. El 100% de la fijación del ligando PK11195 corresponde a 280 \pm 22 fmol/mg de proteína. El 100% de la absorción específica del colesterol corresponde al 1,35 \pm 0,15 pmol/mg de proteína.
Figura 5. Identificación de los aminoácidos específicos responsables de la absorción del colesterol. Absorción
de ^{3}H-colesterol por bacterias transfectadas con las PBR naturales y mutadas en el punto (abajo). La expresión de las proteínas fue inducida por IPTG. El 100% de la absorción específica del colesterol corresponde a 1,2 \pm 0,1 pmol de colesterol por mg de proteína. Análisis de inmunotransferencia de las PBR mutadas expresadas por las bacterias examinadas para la absorción de ^{3}H-colesterol (parte superior). Los resultados presentados son las medias de los triplicados.
Descripción detallada
En una forma de realización, la presente invención se refiere a un péptido aislado con una secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol seleccionada de entre las secuencias siguientes:
Leu Asn Tyr Tyr Val Trp Arg (SEC. ID nº: 1)
Leu Asn Tyr Cys Val Trp Arg (SEC. ID nº: 2)
Leu Asn Tyr Arg (SEC. ID nº: 3)
Val Ala Tyr His Gln Tyr Tyr Gln Arg (SEC. ID nº: 4)
y SEC. ID nº: 5
Todos los péptidos en la presente memoria se escriben NH_{2}…COOH y los aminoácidos son los isómeros L naturales.
Se han descubierto secuencias de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol en moléculas mostradas o sugeridas para interactuar con colesterol, tales como la apolipoproteína A-1 (Boyle, T. P. y Marotti, K. R., 1992, Gene 117, 243-247), caveolina (Murata, M. et al. 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10339-10343), DBI (Papadopoulos, V. 1993, Endocr. Rev. 14, 222-240; Papadopoulos, V. 1998, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 217, 130-142), proteína reguladora de la estereoidogénesis aguda (StAR) (Stocco, D. M. y Clark, B. J. 1996, Endocr. Rev. 17, 221-244), proteína erizo (Porter, J. A. et al. 1996, Science 274, 255-259), citocromo P450 C26/25 (Su, P. et al. 1990, DNA Cell Biol. 9-657-667), anexina II (Harder, T. et al. 1997, Mol. Biol. Cell 8, 533-545), proteína 2 transportadora de esterol (Colles, S. M. et al. 1995, Lipids 30, 795-803), colesterol 7\alpha-monooxigenasa (Kai, M. et al. 1995, Lipid Res. 36, 367-374), colesterol oxidasa (Ishizaki, T. et al. 1991, J. Bacteriol. 171, 596-601), colesterol deshidrogenasa (Horinouchi, S. et al. 1991, Appl. Environ. Microbiol. 57, 1386-1393), precursor de lipasa activado por sales biliares (colesterol esterasa) (Nilsson, J. et al. 1990, Eur. J. Biochem. 192, 543-550) y acil-CoA colesterol aciltransferasa (Pape M. E. et al. 1995, J. Lipid Res 36, 823-838) como se muestra en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 1 Identificación de secuencias de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol
\vskip1.000000\baselineskip
PBR de ratón 149- VLNYYVWR (SEC. ID nº: 5)
PBR de rata 150- LNYYVWR (SEC. ID nº: 6)
PBR humana 150- LNYCVWR (SEC. ID nº: 7)
PBR bovina 149- LNYR (SEC. ID nº: 8)
P450scc de rata 88- VAYHQYYQR (SEC. ID nº: 9)
P450scc humana 88- VAYHQYYQR (SEC. ID nº: 10)
P450scc de cerdo 88- VAYHZHYQK (SEC. ID nº: 11)
Apolipoproteína A-I de ratón 210- LNEYHTR (SEC. ID nº: 12)
Caveolina de ratón 94- VTKYWFYR (SEC. ID nº: 13)
Erizo humana 251- VFYVIETR (SEC. ID nº: 14)
DBI de ratón 25- LFIYSHFK (SEC. ID nº: 15)
StAR de ratón 6- LCAGSSYRHMR (SEC. ID nº: 16)
Anexina II de rata 145- VYKEMYKTDLEK (SEC. ID nº: 17)
P450c26/25 de rata 424- VLCTYVVSR (SEC. ID nº: 18)
Colesterol oxidasa de strept. 420- VSLYAITK (SEC. ID nº: 19)
Colesterol 7''-monooxigenasa de ratón 167- VTEGMYAFCYR (SEC. ID nº: 20)
Colesterol deshidrogenasa de Nocardia 91- VTEAYRQR (SEC. ID nº: 21)
Lipasa humana activada por sales biliares 226- LSPYNKGLIR (SEC. ID nº: 22)
Acil-CoA colesterol aciltransferasa de conejo 96- VVDYIDEGR (SEC ID 23)
La presencia de una secuencia de aminoácidos para interacción/reconocimiento de colesterol en las proteínas listadas en la Tabla 1 significa la probabilidad de que las proteínas interactúen con el colesterol y proporciona comprensión de cómo esta proteína realiza sus funciones de forma coordinada con el colesterol y de cómo alterar estas funciones. Por ejemplo, en el caso de la anexina que es una proteína de fijación de actina a calcio-fosfolípido/colesterol importante para varias funciones celulares, es decir, a partir del mantenimiento de la forma y estabilidad de la membrana celular para facilitar la interiorización de los componentes de la membrana plasmática, alterando la zona de reconocimiento/interacción del colesterol de la anexina puede producir desestabilización y colapso del citoesqueleto. Éste podría ser un método útil para el direccionamiento y la destrucción del crecimiento de la célula tumoral.
Una vez revisada la descripción de la presente invención, estaría dentro de las capacidades de un experto en la materia diseñar proteínas mutantes en las que la secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol se ha alterado de modo que la capacidad de la proteína para interactuar/reconocer el colesterol se ha reducido, aumentado o eliminado. Los experimentos en estos mutantes proporcionarán además tratamientos para las enfermedades asociadas con una función alterada, reducida o aumentada de estas proteínas, o incluso quizás un método para dirigir proteínas específicas mediante su capacidad para interactuar con el colesterol para alterar la función de reconocimiento/interacción del colesterol con una finalidad deseada.
Una vez revisada la presente descripción, será evidente para un experto en la materia que es posible determinar si una proteína interactúa o no con el colesterol o reconoce el colesterol. Este conocimiento proporcionará comprensión de cómo funciona o es regulada una proteína específica, ya se conozca o haya de descubrirse todavía.
En otra forma de realización, la presente invención proporciona una secuencia nucleotídica que codifica los péptidos descritos anteriormente. Los nucleótidos que corresponden a codones que especifican los aminoácidos de las secuencias de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol descritas anteriormente son conocidos en general en la técnica.
La generación de moléculas de ácido nucleico que codifican la(s) secuencia(s) de consenso de aminoácidos para interacción/reconocimiento del colesterol descrita(s) anteriormente es una rutina para un experto en la materia. Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden estar en forma de ARN, tal como ARNm, o en forma de ADN, incluyendo, por ejemplo ADNc y ADN genómico obtenido por clonación o producido por síntesis. El ADN puede ser de doble cadena o de una sola cadena. El ADN o ARN de una sola cadena puede ser la cadena de codificación, también conocida como cadena transcrita, o puede ser la cadena no codificadora, denominada también cadena complementaria. También están incluidos los ácidos nucleicos modificados químicamente y sustituidos, p. ej., los que incorporan bases nucleotídicas modificadas o que incorporan un grupo marcador.
El ácido nucleico puede estar aislado. "Aislado" significa una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que ha sido separada de su medio natural. Por ejemplo, las moléculas de ADN recombinante contenidas en un vector se consideran aisladas para los objetivos de la presente invención. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcritos de ARN in vivo o in vitro de las moléculas de ADN de la presente invención. Las moléculas de ácido nucleico aisladas según la presente invención incluyen además dichas moléculas producidas por síntesis.
Dichas moléculas de ácido nucleico aisladas son útiles para sondas destinadas a detectar un gen que contiene esta secuencia de consenso en una muestra biológica, por ejemplo, por PCR, transferencia Southern, transferencia Northern u otra forma de análisis de hibridación como la descrita en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Sambrook, J. Fritsch, E. F. y Maniatis T., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) o DNA Cloning, volúmenes I y II (D. N. Glover ed., 1985) o Current Protocols in Molecular Biology Ausubel, F. M. et al. (eds.) John Wiley & Sons, Inc. para los métodos generales de clonación). Las descripciones completas de los documentos citados en esta solicitud están incorporadas en su totalidad por referencia a los mismos. Las sondas típicas de ácido nucleico pueden prepararse a partir de las secuencias de aminoácidos de consenso. En particular, pueden prepararse sondas basándose en los segmentos de la secuencia de aminoácidos que poseen niveles relativamente bajos de degeneración, es decir, pocas o una secuencia posible de ácidos nucleicos que codifican la misma. Estas sondas pueden comprender además un grupo detectable para la identificación y posición fáciles de las secuencias complementarias.
Pueden cribarse bancos de ADNc o genómicos de varios tipos para nuevos alelos o secuencias relacionadas que utilicen las sondas anteriores. Pueden utilizarse bancos de fago o de plásmido.
Además de comprender un segmento que codifica los péptidos con la secuencia de consenso de la presente invención, el ácido nucleico de la presente invención puede comprender además un segmento que codifica una proteína heteróloga, de modo que el gen se expresa para producir las dos proteínas como una proteína de fusión.
Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que codifican la secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol de la presente invención pueden incluir, pero no se limitan a las que codifican la secuencia de aminoácidos del consenso por sí mismas; y las secuencias de codificación adicionales que codifican aminoácidos adicionales, tales como las que proporcionan funcionalidades adicionales. Por lo tanto, las secuencias que codifican la secuencia de consenso pueden fusionarse a una secuencia de marcador, tal como una secuencia que codifica un péptido que facilita la purificación del polipéptido fusionado.
Además de su utilización como sondas, los ácidos nucleicos de la presente invención pueden utilizarse también en la preparación de los péptidos con la secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol de la presente invención.
El ADN que codifica los péptidos con la secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol de la presente invención se incorporará típicamente en los montajes de ADN capaces de la introducción y la expresión en un cultivo celular in vitro. Con frecuencia, los ácidos nucleicos de la presente invención pueden utilizarse para producir una célula huésped recombinante adecuada. Específicamente, los montajes de ADN serán adecuados para la replicación en un huésped unicelular, tal como una bacteria, p. ej., E. coli, pero también pueden ser propuestos para la introducción en un mamífero, planta, insecto cultivado u otras líneas celulares eucarióticas. Los montajes de ADN preparados para la introducción en bacterias o levaduras incluirán de manera típica un sistema de replicación reconocido por el huésped, codificando el segmento de ADN propuesto el polipéptido deseado, las secuencias reguladoras de la iniciación terminación de la transcripción de la traducción unidas de forma operativa al segmento que codifica el polipéptido. Un segmento de ADN está operativamente unido cuando se coloca en una relación operativa con otro segmento de ADN. Por ejemplo, un activador o potenciador está operativamente unido a una secuencia de codificación si estimula la transcripción de la secuencia; el ADN para una secuencia señal está operativamente unido al ADN que codifica un polipéptido si es expresado como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido. Generalmente, las secuencias de ADN que están operativamente unidas son contiguas, y en el caso de una secuencia señal tanto contigua como en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no necesitan estar contiguos a las secuencias de codificación cuya transcripción controlan. La unión se realiza por ligadura en las secuencias de restricción convenientes o se insertan adaptadores o enlazadores en su lugar. La selección de una secuencia activadora apropiada dependerá generalmente de la célula huésped seleccionada para la expresión del segmento de ADN. Ejemplos de secuencia activadora adecuada incluyen los activadores procarióticos y eucarióticos bien conocidos en la materia e incluyen activadores tales como los activadores trp, lac y del fago, activadores de ARNt y activadores de enzimas glucolíticas, activador T7, activador T3, activador SP6, activador SV40, activador CMV y MoMLV LTR son conocidos y están disponibles. Véase Sambrook et al., 1989, supra. Las secuencias reguladoras de la transcripción incluirán típicamente un potenciador o activador heterólogo que es reconocido por el
huésped.
Los vectores de expresión útiles en la presente invención incluyen vectores derivados de cromosomas, de episomas y de virus, p. ej., vectores derivados de plásmidos bacterianos, bacteriófagos, episomas de levadura, elementos cromosómicos de levadura, virus tales como baculovirus, papova virus, virus de vacuna, adenovirus, virus de viruela aviar, virus de pseudorrabia y retrovirus, y vectores derivados de las combinaciones de los mismos tales como cósmidos y fagómidos.
Pueden emplearse vectores de expresión convenientemente disponibles que incluyen el sistema de replicación y las secuencias reguladoras de la transcripción y de la traducción junto con la secuencia de inserción para el segmento que codifica el péptido de la secuencia de consenso. Entre los vectores preferidos para su utilización en bacterias se incluyen los vectores pBS, vectores Phagescript, vectores Bluescript disponibles en el mercado. Entre los vectores eucarióticos preferidos están pSV2CAT, pWLNEO, disponible en Stratagene; y pSVK2, pMSG disponible en Pharmacia. Otros vectores adecuados serán con fácilmente evidentes para el especialista experto tales como los vectores pET, tales como pET15b, pZeoSV2, pCMV y similares. Ejemplos de combinaciones operables de líneas celulares y de vectores de expresión se describen en Sambrook et al. y en Metzger et al., Nature 334, 31-36, 1988. Por ejemplo, cuando se selecciona una célula huésped de insecto como la célula huésped de selección para expresar el polipéptido, el ADNc que codifica los polipéptidos de la invención puede clonarse en un vector de expresión de baculovirus (pV-IKS). El baculovirus recombinante puede utilizarse a continuación para transfectar una célula huésped de insecto adecuada, p. ej. las células SF9, que pueden expresar entonces el polipéptido. Véase, p. ej. D. D. Morrison et al., Cell 58, 649-657, 1989, M. D. Summers y G. E. Smith, A Manual of Methods for Baculovirus and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Station, College Station, Tex., 1987.
Los vectores que contienen segmentos de ADN de interés, p. ej. los que codifican los péptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol de la presente invención, pueden transferirse a la célula huésped por métodos bien conocidos, que pueden variar dependiendo del tipo de huésped utilizado. Por ejemplo, las células procarióticas utilizan habitualmente la transcripción con cloruro de calcio, mientras que otros huéspedes pueden utilizar el tratamiento con fosfato cálcico. La introducción del montaje dentro de la célula huésped puede efectuarse por transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por líquido catiónico, electroporación, transducción, infección u otros métodos. Véase Davis et al. Basic Methods in Molecular Biology, 1986. La expresión "célula transformada" tal como se utiliza en la presente memoria, incluye la descendencia de las células transformadas en origen.
En otra forma de realización, la presente invención proporciona una célula transfectada de manera estable con un vector que comprende la secuencia de aminoácidos para interacción/reconocimiento del colesterol de la presente invención. El término "transfectada" como se utiliza en la presente memoria se refiere a la célula que ha experimentado el proceso de introducción de ácido nucleico o de un vector de ácido nucleico dentro de una célula. Son posibles varios métodos de transfección de una célula incluyendo la microinyección, precipitación con CaPO_{4}, lipofección (fusión del liposoma), electroporación y utilización de un cañón de genes. El término "estable" como se utiliza en la presente memoria se refiere a la introducción de un gen en el cromosoma de la célula diana donde se integra y se convierte en un componente permanente del material genético en esta célula. Una célula transfectada que contiene un vector con un péptido que comprende la secuencia de consenso puede transfectarse únicamente de manera transitoria, produciendo la expresión transitoria del péptido. El término "transitoria" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la introducción de un gen en una célula para expresar un péptido que contiene el consenso del colesterol, donde el ADN introducido no está integrado en el genoma de la célula huésped y está por consiguiente eliminado de la célula huésped durante un periodo de tiempo. Expresión transitoria se refiere a la expresión de un producto durante un periodo de transfección transitoria. Una transfección episómica es una variante de transfección estable en la que el gen introducido no está incorporado en los cromosomas de la célula huésped sino más bien está replicado como un elemento extracromosómico. Esto puede conducir a la transfección aparentemente estable de las características de una célula.
Una célula puede transfectarse con un vector que contiene un marcador seleccionable o cotransfectarse con un segundo vector que contiene el marcador seleccionable deseado. Este marcador seleccionable se utiliza para seleccionar aquellas células que se han llegado a transfectar. Los tipos de marcadores seleccionables que pueden utilizarse son bien conocidos por los expertos en la materia.
En otra forma de realización, se proporciona una célula transfectada en la que un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol de la presente invención se expresa como un péptido de la superficie celular. Péptido de la "superficie celular" significa un péptido que abarca total o parcialmente la membrana celular, y que está expuesto sobre la superficie de la célula. El péptido que comprende la secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol de la presente invención puede expresarse como péptido segregado. "Péptido segregado" significa un péptido que no está asociado a la membrana celular, sino más bien está procesado intracelularmente por secreción en el medio extracelular u otro compartimento celular.
El célula que comprende la secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol de la presente invención puede recuperarse y purificarse a partir de cultivos de células recombinantes por métodos bien conocidos que incluyen la precipitación con sulfato amónico o etanol, la extracción con ácido, la cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, la cromatografía con fosfocelulosa, la cromatografía por interacción hidrófoba, la cromatografía por afinidad, la cromatografía con hidroxilapatito, la cromatografía con lectina y la cromatografía líquida de alta resolución ("HPLC") se emplean para purificación. Los polipéptidos de la presente invención comprenden productos purificados de forma natural, productos de procedimientos de síntesis química y productos producidos por técnicas recombinantes a partir de un huésped procariótico o eucariótico, que incluyen, por ejemplo, células bacterianas, levaduras, de plantas superiores, de insectos y de mamíferos.
Otro aspecto de la invención consiste en proporcionar una planta transgénica que comprende en su genoma un montaje genético que comprende un ácido nucleico que codifica el PBR con una secuencia de reconocimiento/interacción de colesterol alterada en la que la capacidad de el PBR para interactuar con el colesterol y canalizarle dentro de la célula está reducida o suprimida, dando como resultado de este modo una absorción reducida o suprimida del colesterol en la célula y/o una producción reducida o suprimida de esteroides en la planta transgénica. Este método puede ofrecer una oportunidad para regular las concentraciones de colesterol en las plantas, así como de los esteroides vegetales específicos tales como las cardenolidas, etc. requeridas para la nutrición o cualquier otra finalidad. La investigación ha demostrado que las plantas transgénicas son capaces de traspasar los genes insertados a su descendencia mediante herencia mendeliana normal (Christou et al., 1990, Trends in Biotechnol. 8, 145-151). Todas las plantas de dicha descendencia que heredan el montaje genético insertado son también plantas transgénicas en la forma que se utiliza el término en la presente memoria.
La producción de plantas transgénicas es conocida en la materia. Véase por ejemplo, la patente US nº 5.869.720 de John, M. E. publicada el 9 de febrero de 1999 y la patente US nº 5.859.347 de Brown et al. publicada el 12 de enero de 1999. Las descripciones de ambas patentes están incorporadas de este modo en su totalidad por referencia a las mismas.
En resumen, el ácido nucleico deseado puede insertarse en un vector de transformación de la planta adecuado para su transformación en la especie vegetal deseada. Los vectores de transformación de plantas adecuados incluyen los derivados de un plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens. Un vector de transformación vegetal incluye preferentemente todos los elementos necesarios para la transformación de las plantas o de las células vegetales. Los tejidos vegetales específicos pueden ser dirigidos utilizando activadores específicos para la expresión en frutos, fibras, raíces, etc… Los activadores utilizados pueden ser inducibles por hormonas vegetales tal como ecdisona, por antibióticos, tal como tetraciclina, por cambios de temperatura, tales como los elementos de choque térmico. Los vectores de transformación vegetal típicos comprenden genes marcadores seleccionables, uno o ambos de los extremos del T-ADN, secuencias de clonación, genes bacterianos apropiados para facilitar la identificación de transconjugados, funciones de replicación y movilización de una amplia gama de huéspedes y otros elementos que se deseen.
La transformación de las células vegetales puede efectuarse mediante la administración de un vector de transformación o de un ADN libre mediante la utilización de un cañón de partículas que comprende microproyectiles a alta velocidad recubiertos con el vector en el tejido vegetal. La selección de células vegetales transformadas y la regeneración en las plantas completa puede realizarse utilizando procedimientos convencionales. Pueden utilizarse otras técnicas de transformación capaces de insertar el gen o el ácido nucleico deseado en las células vegetales, tales como la electroporación o productos químicos que aumentan la absorción del ácido nucleico libre. Ejemplos ilustrativos de métodos adecuados para la regeneración de plantas transgénicas son: maíz (Fromm et al., 1990, Bio/Technology 8:833-839; y Gordon-Kamm et al., 1990 The Plant Cell 2:603-618); arroz (Wang et al., 1988, Plant Mol. Biol. 11:433-439) y trigo (Vasil et al., Bio/Technology 8:743-747).
En un aspecto, las células transformadas o transfectadas sirven para los agentes de cribado o los fármacos que alteran la capacidad de los polipéptidos que comprenden la secuencia y los mutantes del aminoácido para reconocimiento/interacción del colesterol de dicha secuencia para interactuar, reconocer o unirse al colesterol y sus derivados. Puede diseñarse un sistema in vitro para determinar si un compuesto, fármaco o agente es un agonista o antagonista de la capacidad del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol de la presente invención para interactuar con el colesterol. Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos para el reconocimiento/interacción del colesterol de la presente invención puede incubarse junto con colesterol en condiciones, es decir sales, pH, lípidos, iones, en las que tenga lugar la interacción entre el colesterol y el péptido que comprende la secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol. El complejo puede incubarse a continuación con un compuesto de ensayo. La interacción entre el polipéptido y el colesterol puede medirse a continuación. Un aumento o disminución del nivel de interacción entre el polipéptido y el colesterol en respuesta a un compuesto determinado indicaría que el compuesto es un agonista o antagonista de esta unión, respectivamente.
El mismo ensayo puede administrarse en células que expresan un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol. El pH y la temperatura que son más eficaces para la interacción del colesterol se utilizan preferentemente pero es posible replicar las condiciones obtenidas en una célula enferma para probar el efecto de un fármaco concreto con respecto a una terapia propuesta para la enfermedad.
Un compuesto de ensayo puede ser un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto preparado a partir de materiales biológicos tales como bacterias, plantas, hongos o células o tejidos de animal.
Para muchos de los métodos de la presente invención, los polipéptidos y ácidos nucleicos de la invención pueden estar unidos o ligados por enlaces covalentes a un grupo detectable para facilitar la identificación y detección. Los grupos o marcadores detectables útiles, generalmente son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, un grupo detectable puede ser un grupo radiomarcado, tal como con, ^{125}I, ^{32}P o ^{35}S o un grupo fluorescente o quimioluminiscente. Alternativamente, el grupo detectable, puede ser un sustrato, cofactor, inhibidor, ligando de afinidad, etiqueta del epítopo que se une al anticuerpo o una enzima que sea capaz ser ensayada. Las enzimas adecuadas incluyen, p. ej. peroxidasa del rábano picante, luciferasa u otras enzimas fácilmente ensayables. Estos grupos enzimáticos pueden estar unidos al polipéptido que comprende la secuencia de consenso por métodos químicos o expresada como una proteína de fusión como ya se describió.
En otra forma de realización, la presente invención proporciona un método para detectar la presencia, ausencia, aumento o disminución del colesterol en una muestra biológica. Esto puede realizarse inmovilizando el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol en un soporte sólido, p. ej., un pocillo de microvaloración o una membrana de nitrocelulosa. La muestra que ha de analizarse se expone al polipéptido inmovilizado y se mide la cantidad de polipéptido unido al colesterol.
El soporte sólido puede incluir agarosa, celulosa, dextrano, Sephadex, Sepharose, carboximetilcelulosa, poliestireno, papel de filtro, nitrocelulosa, resinas de intercambio iónico, películas de plástico, perlas de vidrio, copolímero de poliaminametilvinil éter y ácido maleico, copolímero de aminoácidos, copolímero de etileno-ácido maleico, nilón, seda, etc. El soporte puede estar en forma de, p. ej., un tubo de ensayo, placas de microvaloración, tiras de ensayo o similares. La reacción del soporte sólido con el polipéptido puede llevarse a cabo por métodos bien conocidos en la técnica. "Muestra biológica" significa cualquier muestra biológica extraída de un animal, línea celular, cultivo tisular, planta, insecto u otra fuente que pueda contener colesterol o sus derivados, o ARNm o ADN con polipéptidos que interactúan/reconocen al colesterol. Las muestras biológicas incluyen fluidos corporales (tales como saliva, sangre, plasma, orina, mucosidades, fluido sinovial, etc.) tejidos (tales como músculo, piel y cartílago) y cualquier otra fuente biológica susceptible de contener colesterol o derivados del colesterol, o polipéptido o ácidos nucleicos que se unen al colesterol. Los métodos para extraer muestras biológicas tales como tejido son bien conocidos en la técnica.
En otra forma de realización, la presente invención proporciona un método para identificar si una proteína reconoce o interactúa o no con el colesterol comprendiendo dicho método la identificación de la presencia o ausencia de la secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol analizando la secuencia de aminoácidos para interacción/reconocimiento del colesterol de la proteína desconocida como se expone en los ejemplos a continuación. La presencia de la secuencia de aminoácidos de la presente invención es una indicación de la probabilidad de que la proteína reconoce/interactúa con el colesterol.
En otra forma de realización, la presente invención proporciona un método para dotar a una molécula de la capacidad para interactuar con el colesterol que es reconocida por la secuencia de aminoácidos de reconocimiento/interacción del colesterol. Como la secuencia de consenso para la interacción/reconocimiento del colesterol se ha interpretado, actualmente es posible introducir en una molécula o polipéptido, natural o sintético, una secuencia de reconocimiento/interacción del colesterol de modo que la proteína o polipéptido, natural o sintético, es ahora capaz de reconocer/interactuar con el colesterol o un derivado del colesterol. La secuencia de consenso puede producirse a nivel del ADN o del ARN, insertando la secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de consenso en una parte del gen para dicha molécula, de modo que la secuencia de consenso es traducida junto con la molécula y juntas forman una proteína de fusión. Preferentemente, la secuencia de consenso se inserta en el terminal amino o carboxi del gen de modo que el plegamiento secundario y terciario del producto génico no inhiba la interacción de la secuencia de consenso con el colesterol. Puede determinarse la capacidad para interactuar/reconocer o unirse al colesterol o a un derivado del colesterol de la proteína de fusión. Estas proteínas de fusión pueden utilizarse en terapia o diagnósticos. La molécula en la que se desea la secuencia de interacción/reconocimiento del colesterol puede ser natural o sintética.
En otra forma de realización todavía, la presente invención proporciona una molécula que bloquea la capacidad de un péptido de interacción/reconocimiento del colesterol que comprende la secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol descrita anteriormente para reconocer/interactuar con el colesterol. La molécula puede ser un anticuerpo, un péptido o un fármaco. La producción de anticuerpo que utiliza péptido es bien conocida en la técnica, véase, p. ej., Sutcliffe, et al. Science 219, 660-666, 1983; Wilson et al., Cell 37, 767-778, 1984, y Bittle et al., J. Gen. Virol. 66, 2357-2354, 1985. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "anticuerpo" (AB) o "anticuerpo monoclonal" (Mab) significa que incluye moléculas íntegras, anticuerpos completos con una sola cadena y fragmentos de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo de la presente invención incluyen Fab y F(ab')_{2} y otros fragmentos que incluyen los Fv de una sola cadena (scFv) y los Fv unidos a disulfuro (sdFv). También se incluyen en la presente invención anticuerpos monoclonales híbridos y humanizados y anticuerpos policlonales específicos para los polipéptidos de la presente invención. Los anticuerpos de la presente invención pueden prepararse por cualquiera de varios métodos. Por ejemplo, las células que expresan un polipéptido de la presente invención o un fragmento antigénico del mismo pueden administrarse a un animal para inducir la producción de sueros que contienen anticuerpos policlonales. Pueden prepararse anticuerpos monoclonales utilizando la tecnología del hibridoma conocida en la técnica, véase, p. ej., Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 2ª ed., 1988). Además, los anticuerpos capaces de unirse a un antígeno polipeptídico de la presente invención pueden producirse mediante la utilización de anticuerpos anti-idiotípicos. Dicho método hace uso del hecho de que los anticuerpos son los propios antígenos, y de que, por consiguiente, es posible obtener un anticuerpo que se una a un segundo anticuerpo.
Además, el péptido de interacción/reconocimiento del colesterol puede servir para el modelado de pequeñas moléculas que interfieren con la unión al colesterol in vivo. En particular, la estructura del dominio de interacción/reconocimiento del colesterol de la secuencia de aminoácidos conocida y la estructura tridimensional, que puede determinarse por métodos cristalográficos de rayos X conocidos en la materia, pueden ampliarse generando análogos sintéticos, derivados del colesterol y simulaciones del dominio concreto de interacción/reconocimiento del colesterol. Los elementos sintéticos pueden montarse basándose en su analogía con los aspectos estructurales químicos del dominio de interacción/reconocimiento del colesterol. Dichas simulaciones, análogos y derivados pueden utilizarse para bloquear o inhibir funciones específicas resultantes de la unión del colesterol a un péptido o producto génico. Estas funciones pueden variar dado que una función para el colesterol ha estado implicada en la señalización de células, proliferación celular, regulación génica, anclaje y estabilidad del citoesqueleto, transmisión neural, fertilidad, estrés, diabetes, ictus, por nombrar unos pocos, y puede por eso ser útil como tratamientos terapéuticos según los métodos descritos en la presente memoria.
En otra forma de realización, la presente invención se refiere a un método para alterar la capacidad para la unión del colesterol de las moléculas que contienen la secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol descrita anteriormente, que comprende alterar dicha secuencia de modo que se reduzca o se elimine el reconocimiento del colesterol.
Los solicitantes han podido producir PBR con capacidad reducida o sin ella para reconocer e interactuar con el colesterol modificando la secuencia del PBR para reconocimiento/interacción del colesterol, por ejemplo cambiando el aminoácido 153 tirosina por serina, o cambiando el aminoácido 155 arginina por leucina. Es de esperar que estas modificaciones produzcan resultados similares en especies que expresan PBR, y en otras proteínas aparte de PBR que contienen la secuencia de consenso. Por consiguiente, debería ser posible alterar la capacidad de un polipéptido para el reconocimiento/interacción del colesterol que comprende la secuencia de consenso del péptido de la presente invención cambiando la tirosina en la secuencia de consenso por serina u otro aminoácido sin carga, por ejemplo, o cambiando la arginina de la secuencia de consenso por leucina o cualquier otro aminoácido sin
carga.
En esta solicitud se describe la primera secuencia de aminoácidos para interacción/reconocimiento del colesterol descubierta en PBR. Además de la presencia de PBR en la membrana de la mitocondria, PBR está presente en la membrana plasmática (Oke, B. O. et al. 1992, Mol. Cell. Endocr. 87:R1-R6; Garnier, M. et al. 1993, Endocrinology 132:444) y en la membrana nuclear (Hardwick et al. 1999, Cancer Research 59:831-842). Los resultados publicados en esta solicitud indican que el terminal carboxi del receptor es responsable de la interacción y absorción posterior del colesterol. El colesterol se libera del receptor una vez se une un ligando a la parte del terminal amino del receptor. En el caso de las mitocondrias, el colesterol se libera en la membrana mitocondrial interna donde está disponible para la interacción con P450scc y se escinde para producir pregnenolona en las células estereoidogénicas. La pregnenolona es el precursor de los esteroides.
Además de las utilizaciones descritas anteriormente, los polipéptidos y ácidos nucleicos de la presente invención pueden utilizarse también en aplicaciones terapéuticas para el tratamiento de pacientes mamíferos humanos o no humanos.
El ácido nucleico que codifica el polipéptido que comprende la secuencia de interacción del colesterol de la presente invención puede utilizarse como un aceptor de colesterol para regular la cantidad de colesterol en un tejido o en la sangre. El ácido nucleico se administra solo o como parte de un vector tal como es traducido, y el polipéptido resultante es capaz de interactuar con el colesterol o unirse a éste. La secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido que comprende la secuencia de consenso para interacción/reconocimiento del colesterol puede administrarse de manera profiláctica, a pacientes que presentan una enfermedad o dolencia caracterizada por una concentración elevada de colesterol en el plasma. "Concentración elevada" significa una concentración mayor en relación con la que se encuentra normalmente en el plasma. La administración puede ser mediante administración exógena del ácido nucleico como ADN desnudo, ADN asociado a portadores específicos o en un vector de expresión del ácido nucleico a un tejido deseado por medio de un vehículo de administración apropiado, p. ej. un liposoma, mediante la utilización de iontoforesis, electroporación y otros métodos de administración farmacológicamente aprobados. Algunos métodos de administración pueden incluir: encapsulación en liposomas, transducción por vectores retrovíricos, localización en el compartimento nuclear utilizando la zona de direccionamiento nuclear hallada en la mayoría de las proteínas nucleares, transfección de células ex vivo con reimplantación o administración posterior de las células transfectadas, un sistema transportador de ADN. Puede utilizarse la administración intravenosa con un fármaco portador diseñado para aumentar la vida media de la circulación del ácido nucleico que codifica la secuencia de interacción interacción/reconocimiento del colesterol. Además, el tratamiento de cualquier trastorno puede comprender técnicas de terapia génica que implican la secuencia de dominio de interacción/reconocimiento del colesterol o una mutación o alteración de la secuencia de dominio de la interacción/reconocimiento del colesterol. Las estrategias para la terapia génica se estudian en Friedman, Science 244, 1275, 1989.
Los vehículos para la administración de fármaco son eficaces tanto para la administración general como tópica. Pueden diseñarse para que sirvan como depósito de liberación lenta, o para liberar su contenido directamente en la célula diana. Una ventaja de la utilización de vehículos farmacéuticos de administración directa es que se liberan múltiples moléculas por absorción. Se ha demostrado que dichos vehículos aumentan la vida media de la circulación de fármacos que de otro modo se eliminarían rápidamente en el torrente sanguíneo. Algunos ejemplos de dichos vehículos de administración farmacéutica especializados son los liposomas, hidrogeles, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradables y microesferas bioadhesivas.
La secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de reconocimiento/interacción del colesterol puede también administrarse de forma generalizada. Absorción general se refiere a la acumulación de fármacos en el torrente sanguíneo seguida de distribución en todo el cuerpo. Las vías de administración que conducen a la absorción general incluyen: intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, intratecal y oftálmica. Puede también utilizarse un cañón génico. La dosis dependerá de la indicación de la enfermedad y de la vía de administración pero debería estar comprendida entre 1 y 1.000 \mug/kg de peso corporal/día. La duración del tratamiento se prolongará a lo largo del curso de los síntomas de la enfermedad, posiblemente en continuo. El número de dosis dependerá del vehículo de administración para la enfermedad y de los datos de eficacia a partir de las pruebas
clínicas.
El ácido nucleico que comprende la secuencia de consenso de interacción/reconocimiento del colesterol puede administrarse utilizando un método in vivo mediante el cual el ácido nucleico se administrará directamente a un animal por inyección intravenosa, inyección intramuscular o por cateterización y administración directa del ácido nucleico a través de los vasos sanguíneos y dirigida a un órgano objetivo utilizando activadores específicos del tejido.
Los polipéptidos de la presente invención pueden utilizarse para inhibir o bloquear la absorción del colesterol en las células al competir por el colesterol. Estos métodos pueden utilizarse generalmente en el tratamiento de varias enfermedades que resultan de un aumento del colesterol en la célula o en el plasma, o en la identificación de compuestos eficaces para dicho tratamiento. El colesterol es necesario para el crecimiento normal de las células y la estructura y función apropiadas de la membrana. La acumulación no regulada del colesterol es citotóxica y una insuficiencia para mantener la homeostasis del colesterol produce numerosos estados patológicos (véase: Subcellular Biochemistry vol. 28, Cholesterol: its Functions and Metabolism in Biology and Medicine. Bittman, Robert (Ed.), Plenum Press, N.Y.). Los trastornos específicos incluyen litiasis biliar, ateroesclerosis, Niemann-Pick C., sitosterolemia, distrofia, proliferación tumoral (tumorigénesis), distrofia del cristalino corneal de Schnyder. Los trastornos cerebrales incluyen el metabolismo del colesterol y la enfermedad de Alzheimer, toxicidad por teluro, el síndrome de Smith-Lemli-Opitz, mielinización, desarrollo de anomalías y desmielinización: enfermedad de Charcot-Marie-Tooth; enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, esclerosis múltiple, SLA, por nombrar unas pocas. Alternativamente, los métodos y composiciones pueden ser útiles como tratamientos profilácticos o en la identificación de compuestos eficaces en tratamientos profilácticos.
En otro aspecto de la invención, el péptido que comprende la secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol de la presente invención puede utilizarse para administrar, cuando sea necesario, colesterol, o un derivado de colesterol que se une a la secuencia para reconocimiento/interacción del colesterol de la presente invención. El péptido puede acomplejarse con colesterol antes de la administración, impidiendo de este modo la unión no específica del colesterol a otros factores tal como la albúmina, por ejemplo.
Las cantidades y reactivos necesarios para la terapia eficaz, denominados también en la presente memoria "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" dependerá de muchos factores diferentes, incluyendo el medio de administración, la zona objetivo, el estado fisiológico del paciente y otros medicamentos administrados. Así, será necesario valorar las dosis de tratamiento para optimizar la seguridad y la eficacia. Típicamente, las dosis utilizadas in vitro pueden proporcionar orientaciones útiles en las cantidades útiles para la administración in situ de estos reactivos. La experimentación de dosis eficaces en animales para el tratamiento de determinados trastornos proporcionará más indicación de pronóstico de la dosis humana. Generalmente, cantidades terapéuticamente eficaces de polipéptido que comprenden el dominio para la interacción/reconocimiento del colesterol de la presente invención estarán comprendidas entre aproximadamente 0,0001 y aproximadamente 100 mg/kg, y más habitualmente, entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 0,1 mg/kg del peso corporal del paciente. Se describen varias consideraciones, p. ej., en Gilman et al., (Eds.), Goodman y Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, (8ª ed., 1990), Pergamon Press, y Remington's Pharmaceutical Sciences (7ª ed., 1985) Mack Publishing Co., Easton, Pa. Los métodos de administración, descritos asimismo en las referencias anteriores, comprenden, p. ej., la administración oral, intravenosa, intraperitoneal o intramuscular y la administración local, incluyendo la administración tópica, transdérmica, por difusión y en aerosol, para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico. El agente activo generalmente se administrará en una composición que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluirán agua, solución salina, tampones y otros compuestos descritos en, p. ej., el Merck Index, Merck y Co., Rahway, N. J.
"Sujeto" significa pez, animales, incluyendo plantas, insectos, monos, simios, gatos, perros, pájaros, vacas, cerdos, ratones, caballos, conejos y seres humanos.
Los constituyentes de composiciones farmacéuticas, además de agentes activos, incluyen los conocidos generalmente en la materia para los varios métodos de administración utilizados. Por ejemplo, las formas orales generalmente incluyen polvos, comprimidos, píldoras, cápsulas, pastillas y líquidos. Asimismo, las formulaciones intravenosas, intraperitoneales o intramusculares generalmente se disolverán o se suspenderán en un vehículo farmacéuticamente aceptable, p. ej., agua, agua tamponada, solución salina y similares. Además, estas composiciones pueden incluir constituyentes adicionales que pueden ser necesarios para condiciones próximas a las fisiológicas, tales como agentes de ajuste de pH y tamponantes, agentes de ajuste de toxicidad, agentes humectantes y similares. Para las composiciones sólidas, pueden utilizarse vehículos sólidos no tóxicos convencionales que incluyen, p. ej., calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y similares.
La administración puede realizarse también a modo de composición o dispositivo de liberación controlada, mediante la cual una liberación lenta del ingrediente activo permite la administración continua durante un periodo prolongado de tiempo.
Se utilizaron los siguientes Materiales Y Métodos en los ejemplos que siguen.
Células Leydig MA-10- Se mantuvieron células tumorales de Leydig de ratón MA-10 tal como se describió anteriormente (Papadopoulos, V. et al. 1990, J. Biol. Chem. 265:3772-3779). Para el control de los ensayos de absorción, se aislaron mitocondrias como se describió (Papadopoulos et al. 1990, supra; Krueger y Papadopoulos, 1990, supra) y se volvieron a poner en suspensión en tampón A (sacarosa 250 mM, KCl 20 mM, hidrocloruro de trietanolamina 15 mM (pH 7,0), K_{3}PO_{4} 10 mM y MgCl_{2} 10 mM) a una concentración total de proteína de 1 mg/ml (Leaver, H. A. y Boyd G. S. 1981, J. Endocrinol. 91:123-133). Se incubaron a continuación las mitocondrias con [1,2-^{3}H]-colesterol (0,127 \muCi/100 nmoles) en 0,3 ml de tampón A a 37ºC (o a la temperatura indicada) durante el periodo de tiempo indicado. Al final de la incubación, se extrajeron los esteroides y la ^{3}H-pregnenolona formada se aisló por cromatografía en capa fina y se cuantificó (Amri, H. et al. 1996, Endocrinology 137:5707-5718).
Construcción del vector de expresión de PBR de ratón (pET15bPBR) y expresión de PBR recombinante en bacte- rias- Se utilizó el sistema pET (Novagen, Madison, WI) para expresar la proteína recombinante PBR (PBRm) de ratón MA-10. La inserción que contiene la secuencia de codificación completa así como las prolongaciones de las secuencias NdeI y XhoI en los extremos 5' y 3' se generaron por PCR utilizando los cebadores siguientes: ATATATA
CATATGCCTGAATCCTGGGTG (SEC. ID nº: 24) y ATACTCGAGTGGGTGCCTTCACTCTG (SEC. ID nº: 25), respectivamente. Se utilizó ADNc de PBR completo de MA-10 (Garnier, N. et al. 1994, Mol. Pharm. 45:201-211) como plantilla y codifica la secuencia ATVLNYYVWRDNS de aminoácidos. Este fragmento de PBRm se insertó en el vector pET156 y se linealizó con NdeI y XhoI corriente abajo del activador T71ac. Se utilizó el vector de expresión de PBRm recombinante para transformar la cepa BL21 (DE3) de Escherichia coli (Novagen) donde la expresión de la proteína PBRm recombinante fue inducida por isopropil-1-tiol-\beta-D-galactopiranósido 1 mM (IPTG). Se controló la expresión de la proteína PBR por SDS-PAGE seguido de tinción con Coomassie Blue o análisis de inmunotransferecia utilizando antisuero anti-PBR (Amri et al. 1996, supra). Se determinó la especificidad de enlace del PBR inducida por IPTG en E. coli en estudios de enlace donde el enlace específico de ^{3}H-PK 11195 (1,0 nM) se midió en presencia de las concentraciones indicadas de los ligandos indicados.
Se examinó la absorción de ^{3}H-colesterol por células de E. coli utilizando las concentraciones indicadas de bacterias transformadas de referencia o tratadas con IPTG incubadas en presencia de ^{3}H-colesterol 6,7 nM (50,0 Ci/mmol) durante 60 min. a 37ºC. La absorción específica del colesterol se define como los valores inducidos por ITPG menos los de referencia. Se prepararon protoplastos de E. coli a partir de células cultivadas en LB a 37ºC hasta la fase logarítimica de crecimiento y se centrifugaron a 10.000 g durante 5 min. Se lavaron las células dos veces en tampón Tris-HCl 10 mM [pH 8,0] y el sedimento se volvió a poner en suspensión en una solución que contiene 20% (p/p) de sacarosa y Tris-HCl 0,1 M [pH 8,0]. Las células se pusieron en suspensión a continuación en 1 ml de tampón para una D.O._{450} de 10 y se mezclaron. En 1 min se añadió lisozima de una solución madre de 2 mg/ml en agua destilada hasta una concentración final de 100 \mug/ml a 37ºC, y se continuó la agitación durante los siguientes 12 min. Se diluyó 1:10 la suspensión celular con Na_{2}EDTA 0,1 M precalentado a 37ºC. La agitación continua y la dilución lenta durante 2,5 min impidió la lisis celular. Más del 99% de las células se volvieron esféricas en 10 minutos (Weiss, R. L. 1978, Meth. Cell Biol. 20:141-147). Se preincubaron a continuación protoplastos (100 \mug en un volumen final de 0,3 ml) en presencia de ^{3}H-colesterol 6,7 nM (50,0 Ci/mmol) durante 60 min a 37ºC para los ensayos de absorción del colesterol. Las membranas marcadas con ^{3}H-colesterol de bacterias transformadas inducidas por IPTG, se incubaron con ^{3}H-colesterol 30 nM, se trataron con PK 11195 o clonazepam y se cuantificó el ^{3}H-colesterol liberado por espectrometría de centelleo líquido.
Mutagénesis dirigida al punto - Se realizaron mutaciones utilizando el kit de mutagénesis dirigida al punto QuikChange de Stratagene (La Jolla, CA). En resumen, se utilizó ADNds del plásmido pET-PBR de minipreparación como plantilla. Los pares oligonucleótido cebador sintéticos que contienen las mutaciones puntuales A147T, Y153S y R155L y las deleciones del PBR, \Delta5-20, \Delta41-51, \Delta108-119, \Delta120-122, \Delta141-152, \Delta153-169, complementaria cada una de la cadena opuesta del vector, se prolongaron durante el ciclo de temperatura por la pfu ADN polimerasa. En el momento de la incorporación de los cebadores de oligonucleótido, se generaron plásmidos mutados que contienen muescas escalonadas. Después del ciclo de temperatura se trataron los productos con Dpn I utilizado para digerir la plantilla de ADN precursor y se seleccionaron para la mutación generada. Los ADN del vector con muesca que contienen las mutaciones deseadas se transformaron a continuación en E. coli. Se prepararon plásmidos mutados mediante el kit Prism Miniprep de ABI. Las mutaciones y deleciones generadas se confirmaron por secuenciado utilizando el kit de reacción preparado para el secuenciado del ciclo terminador del tinte Prism de ABI (Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA). El secuenciado del ADN se realizó en el Lombardi Cancer Center Sequencing Core Facility (Universidad de Georgetown).
Ensayos de fijación de radioligando - Se realizaron estudios de fijación de ^{3}H-1-(2-clorofenil)-N-metil-N-(1-metil-propil)-3-isoquinolinacarboxamida (PK 11195) como se describió anteriormente (Papadopoulos, V. et al. 1990, J. Biol. Chem. 265:3772-3779; Garnier, M. et al. 1994, Mol. Pharm. 45:201-211). Se determinaron la constante de disociación (Kd) y el número de puntos de fijación (Bmax) por análisis de transferencia de Scatchard de los datos utilizando el programa LIGAND (Munson, P. J. y Rodbard, D. 1980, Anal. Biochem. 107:220-239).
Determinación de proteínas - Se cuantificaron las cantidades en microgramos de proteína utilizando el ensayo de fijación de colorante de Bradford (Bradford, M. M. 1976, Anal. Biochem. 72:248-254) que utiliza albúmina de suero bovino como patrón.
Estadística - Los resultados presentados representan la media \pm S.D. o S.E.M. de 2 a 6 experimentos independientes. Se realizó análisis estadístico por ANOVA seguido de la prueba de Student-Newman-Keuls o el ensayo de comparaciones múltiples de Dunnett utilizando el paquete Instat (v.2.04) de GraphPad, Inc. (San Diego, CA).
Ejemplo 1
Se construyó un modelo tridimensional de PBR humano utilizando simulaciones dinámicas moleculares y se demostró que se adapta a la molécula de colesterol en sus cinco hélices (Bernassau, J. M. et al. 1993, J. Mol. Graph. 11:236-245). A pesar de las diferencias en la secuencia primaria de aminoácidos entre el PBR humana y de ratón, se obtuvieron datos similares cuando la proteína PBR de 18 kDa de ratón se sometió al mismo análisis (Papadopoulos, V. 1996, supra), lo que sugiere además que el PBR puede funcionar como un canal para el colesterol. Para probar este modelo hipotético se utilizaron dos sistemas de modelo celular: (i) las células de Leydig MA-10, un modelo de célula esteroidogénica que expresa grandes niveles de PBR (\sim40 pmoles/mg de proteína; Papadopoulos, V. et al. 1990, J. Biol. Chem. 265:3772-3779) y como todas las células eucarióticas contiene colesterol endógeno; y (ii) las células DE3 de E. coli que no expresan PBR (este estudio), no tienen colesterol endógeno (Mota, A. G. y Foster, J. W. 1995, Microbial Physiology. Wiley-Liss, Nueva York) y no forman esteroides. Así, utilizando estos modelos de células los solicitantes intentaron correlacionar la expresión de PBR con la función de transporte del colesterol. Además, los solicitantes utilizaron un método con colesterol radiomarcado (Leaver, H. A. y Boyd, G. S., 1981, J. Endocrinol. 91:123-133) para cuantificar el movimiento del colesterol. Este método permite la distinción entre el colesterol aportado de forma exógena y el colesterol endógeno, lo que permite una fácil cuantificación, y la medición directa de la pregnenolona formada, en el caso de las células esteroidogénicas donde el colesterol transportado a IMM es escindido por la P450scc para generar pregnenolona. Los datos mostrados en la Fig. 1 validan la utilización de este método. La Fig. 1 demuestra que en las células esteroidogénicas de Leydig, la absorción de ^{3}H-colesterol por las mitocondrias y el transporte desde OMM hasta IMM fueron estimulados por ligandos de PBR específicos que dan como resultado el aumento de la formación de ^{3}H-pregnenolona. Estos datos están de acuerdo con los descubrimientos anteriores en todos los tipos de células del cuerpo que sintetizan esteroides (Papadopoulos, V. 1993, Endocr. Rev. 14:222-240; Papadopoulos, V. 1998, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 217:130-142). Además, un mecanismo de transporte de colesterol dependiente de PBR similar desde OMM hasta IMM fue identificado recientemente en las mitocondrias del hígado (Tsankova, V. et al., 1995, Eur. J. Pharm. 294:601-607). El transporte del colesterol a IMM del hígado puede ser necesario para la desintoxicación de colesterol desde la periferia por la IMM esterol-27-hidroxilasa (Tsankova et al., 1995, supra). Es interesante que la velocidad de absorción del colesterol y del transporte intramitocondrial hasta IMM, en respuesta a la activación del ligando PBR, era idénticas (0,9 nmoles/mg de proteína/min.) para las mitocondrias suprarrenales (Krueger, K. E. y Papadopoulos, V. 1990, J. Biol. Chem. 265:15015-15022) y hepáticas (Tsankova et al., 1995, supra), lo que sugiere que un mecanismo de transporte de colesterol similar mediado por PBR es operativo tanto en tejidos esteroidogénicos como no esteroidogénicos.
Como se indicó anteriormente una bacteria es un sistema modelo sin colesterol endógeno (Mota y Foster, 1995, supra). Además, las bacterias no expresan la proteína PBR (Fig. 2A) ni el enlace del ligando (no mostrado) aunque la presencia de una proteína PBR homóloga, la proteína tspO sensible rica en triptófano (denominada también crtK), implicada en la biosíntesis de carotenoides en las bacterias fotosintéticas Rhodobacter capsulatus y Rhodobacter sphaeroides, se ha descrito (Yeliseev, A. A. y Kaplan S. 1995, J. Biol. Chem. 270:21167-21175). Se transfirieron Escherichia coli con ADNc con PBR de ratón en un vector pET. La adición de IPTG a las bacterias transfectadas produjo la expresión de la proteína PBR de 18 kDa (Fig. 2A) y la fijación del ligando (Fig. 2B; Kd=1,1 nM y Bmax=0,23 pmoles/mg de proteína) con características farmacológicas similares a las descritas anteriormente para PBR (Papadopoulos, 1993, supra; Papadopoulos, V. et al. 1990, supra) (Fig. 2C). La expresión de PBR inducida por IPTG produjo una proteína (Fig. 3A), y la absorción dependiente del tiempo (Fig. 3B) y de la temperatura de colesterol radiomarcado (Fig. 3B). Esta absorción del colesterol se mantuvo cuando se prepararon protoplastos lo que indica que PBR reside en la membrana plasmática bacteriana interna (datos no mostrados). La absorción del colesterol no pudo ser bloqueada por toxinas energéticas (DeGrella, R. F. y Simoni, R. d., 1982, J. Biol. Chem. 257:14256-14262) (Fig. 3C). Además, fue específica para el colesterol ya que ninguna absorción de otro esteroide radiomarcado pudo observarse (Fig. 3D) y no pudo saturarse a las concentraciones utilizadas de colesterol radiomarcado (Fig. 3E), lo que sugiere que PBR funciona como un canal para el colesterol en lugar de una proteína de enlace del colesterol, lo que está de acuerdo con los estudios de modelado (Bernassau, et al., 1993, supra; Papadopoulos, V. 1996, supra). Cuando las membranas bacterianas inducidas por IPTG y cargadas con colesterol se trataron con PK 11195, se liberó colesterol de las membranas (Fig. 3F), lo que sugiere que el colesterol capturado por PBR se libera en el momento de la fijación del ligando. Así, PBR sirve de canal o hace una función de boca donde el colesterol puede introducirse y residir almacenado dentro de la membrana sin interactuar con los componentes lipídicos o proteicos de la bicapa lipídica. Esta puede ser también la manera mediante la que las mitocondrias se clasifican entre el grupo esteroidogénico del colesterol del componente colesterol de la membrana. Así, los ligandos PBR controlan el estado de abertura/liberación del canal, mediando el movimiento del colesterol a través de las membranas. Además de los ligandos del fármaco PBR, el inhibidor del enlace del polipéptido diazepam (DBI) y las porfirinas (Papadopoulos, V. 1993, supra) se han identificado como ligandos endógenos naturales). Debe observarse que actualmente no se puede excluir la posibilidad de que PBR funcione como una flipasa o un transportador.
En apoyo de los datos presentados en la presente memoria, la interrupción dirigida del gen PBR en las células esteroidogénicas produjo la inhibición del transporte del colesterol a IMM y la interrupción de la biosíntesis de esteroides (Papadopoulos, V. et al. 1997, J. Biol. Chem. 272:32129-32135). Transfectando las células de Leydig mutantes con PBR con el ADNc con PBR se recuperó la esteroidogénesis y se demostró la función obligatoria de PBR en el transporte de colesterol (Papadopoulos, V. 1996, supra).
Ejemplo 2
PBR es una proteína hidrófoba de 18 kDa con cinco dominios supuestos de transmembrana situados en la OMM. Como primera etapa en la definición de las zonas del receptor implicadas en la interacción con el ligando del fármaco y el colesterol, los solicitantes construyeron las PBR mutantes con las deleciones indicadas en el panel izquierdo de la Fig. 4. En la Fig. 4 se presenta también la posición de las cinco zonas de transmembrana del receptor (I a V). Debe observarse que el terminal amino de las proteínas de la membrana mitocondrial se dirige hacia el interior del orgánulo en el que el terminal carboxi está en el lado citoplásmico. El panel derecho de la Fig. 4 muestra el efecto de deleción de las secuencias de aminoácido específicas en el enlace del ligando de PBR y la absorción del colesterol examinada en el sistema bacteriano descrito anteriormente. La deleción de las secuencias 5 a 20 y 41 a 51 de aminoácidos en el terminal amino del receptor disminuyó del 30 al 45% la capacidad de PBR para fijarse al ligando PK 11195. Los resultados de los solicitantes están de acuerdo con los estudios anteriores en PBR humana expresada en levadura (Farges, R. et al., 1994, Mol. Pharm. 46:1160-1167), aunque en esos estudios la deleción del terminal amino de PBR humana suprimió completamente la capacidad del receptor para unirse a PK 11195. La deleción de los aminoácidos 120 a 133 en el cuarto dominio de transmembrana disminuyó también el enlace del ligando de PBR en el 45%. Una disminución más pequeña (25%) del enlace de PK 11195 se observó también cuando se eliminaron las zonas 141 a 152 y 153 a 169. Estos resultados sugieren que aunque el terminal amino del receptor puede dotar de capacidad para unir ligandos farmacéuticos, tal como la isoquinolina PK 11195, las secuencias de aminoácidos en el cuarto dominio de transmembrana puede participar en la formación del punto de fijación al ligando. Debe observarse que las deleciones que afectan a la unión de ligando PK 11195 no tenían un efecto mayor sobre la capacidad del receptor recombinante expresado en las membranas bacterianas para absorber el colesterol
radiomarcado.
La Fig. 4 demuestra también que la deleción de los aminoácidos 153 a 169 en el terminal carboxi de PBR tuvo un efecto drástico sobre la capacidad de la molécula para absorber ^{3}H-colesterol cuando se expresa en bacterias (disminución del 70%). Este resultado sugiere que el dominio del terminal carboxi citoplásmico del receptor es responsable de la interacción y posterior absorción del colesterol. En un esfuerzo para identificar aminoácidos específicos en PBR responsable de la interacción con el colesterol los solicitantes emprendieron estudios de mutagénesis dirigida al punto en la zona carboxi terminal.
Ejemplo 3
Estudios recientes por Pikuleva et al. (1995, Arch. Biochem. Biophys. 322:189-197) con otra proteína que interactúa con el colesterol, la enzima P450scc, indicó que una tirosina en el punto activo del P450scc interactúa con la cadena lateral del colesterol. Alineando la secuencia de aminoácidos del punto activo de P450scc con el terminal carboxi de PBR indicó que puede existir un modelo de consenso de aminoácidos común en estas dos moléculas que reconocen el colesterol (Tabla I). Este modelo de consenso se compone de un aminoácido neutro e hidrófobo (Z), tal como leucina o valina, un aminoácido neutro y polar (Y), tal como tirosina y un aminoácido básico (Q), tal como arginina o lisina. Uno a cinco aminoácidos diferentes pueden colocarse entre estos tres aminoácidos de codificación. Así, el modelo de consenso propuesto es -Z-(X)_{0-5}-Y-(X)_{0-5}-Q-. La leucina o la valina interactuarán con la cadena lateral hidrófoba del colesterol y la tirosina interactuará con el grupo OH en 3' polar del colesterol, mientras que la arginina o la lisina pueden ayudar a crear una bolsa. Esta hipótesis fue probada (Fig. 5). La sustitución de Y153 por serina o R156 por leucina suprimió completamente la capacidad de PBR para absorber el colesterol radiomarcado. La mutación y sustitución de A147 con treonina, no afectó la absorción de colesterol por las bacterias que expresan el receptor mutado. La Fig. 5 también demuestra que las proteínas receptoras recombinantes mutadas se expresaron a niveles iguales en la inducción de IPTG.
Ejemplo 4
En un esfuerzo para observar si este supuesto modelo de consenso de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol está presente en otras moléculas mostradas o sugeridas para interactuar con colesterol, tales como la apolipoproteína A-1 (Boyle, T. P. y Marotti, K. R., 1992, Gene 117, 243-247), caveolina (Murata, M. et al. 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10339-10343), DBI (Papadopoulos, V. 1993, Endocr. Rev. 14, 222-240; Papadopoulos, V. 1998, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 217, 130-142), proteína reguladora de la estereoidogénesis aguda (StAR) (Stocco, D. M. y Clark, B. J. 1996, Endocr. Rev. 17, 221-244), proteína erizo (Porter, J. A. et al. 1996, Science 274, 255-259), citocromo P450 C26/25 (Su, P. et al. 1990, DNA Cell Biol. 9-657-667), anexina II (Harder, T. et al. 1997, Mol. Biol. Cell 8, 533-545), proteína 2 transportadora de esterol (Colles, S. M. et al. 1995, Lipids 30, 795-803), colesterol 7\alpha-monooxigenasa (Kai, M. et al. 1995, Lipid Res. 36, 367-374), colesterol oxidasa (Ishizaki, T. et al. 1991, J. Bacteriol. 171, 596-601), colesterol deshidrogenasa (Horinouchi, S. et al. 1991, Appl. Environ. Microbiol. 57, 1386-1393), precursor de lipasa activado por sales biliares (colesterol esterasa) (Nilsson, J. et al. 1990, Eur. J. Biochem. 192, 543-550) y acil-CoA colesterol aciltransferasa (Pape M. E. et al. 1995, J. Lipid Res. 36, 823-838) los solicitantes observaron la presencia del modelo de consenso de aminoácidos -Z-(X)_{0-5}-Y-(X)_{0-5}-Q- para el reconocimiento/interacción del colesterol en estas proteínas. La Tabla I demuestra que todas estas proteínas, con excepción de la proteína-2 transportadora de esterol, contienen este modelo de consenso de aminoácidos. Las proteínas tales como la alfa-actina del músculo esquelético de la rata, la cadena lateral de la miosina no del músculo y del músculo liso no contienen este modelo de consenso para el reconocimiento/interacción del colesterol. Sin embargo dada cualquier tirosina existe una probabilidad razonablemente elevada de que esta secuencia de consenso de aminoácidos se encuentre en muchas proteínas. De hecho, una búsqueda del motivo en los diversos bancos de datos génicos indicó que este modelo de consenso de aminoácidos está presente en varias proteínas. Esto no es sorprendente ya que es sabido que la interacción colesterol/proteína desempeña una función no solamente en el transporte y/o almacenamiento de colesterol sino también en la estabilidad, plegamiento y/o localización de la proteína. Así pues, es posible que solamente en algunas proteínas esta secuencia de consenso sea operativa. La intensidad y especificidad de la interacción de una proteína que contiene esta secuencia de consenso de aminoácidos con el colesterol puede ser debida ya sea a la presencia de un determinado micromedio, o a la posición de la secuencia de consenso en la proteína, o a una conformación específica de la proteína que permite la utilización de esta secuencia de aminoácidos. En este último caso, es posible también que la secuencia de consenso identificada represente solamente una fracción, quizás el núcleo, de un motivo mayor que debe identificarse.
De especial interés para la esteroidogénesis es la observación de que el modelo de consenso de aminoácidos para el reconocimiento/interacción del colesterol se observó en el polipéptido DBI (Papadopoulos, V. 1993, supra; Papadopoulos, V. 1998, supra) y la proteína StAR precursora (Stocco, D. M. y Clark, B. J. 1996, Endocr. Rev. 17, 221-244). En la búsqueda de un factor citosólico estimulante de la esteroidogénesis, se purificó una proteína que demostró ser idéntica a DBI (Papadopoulos, V. 1993, supra). DBI se purificó inicialmente a partir del cerebro controlando su capacidad para desplazar diazepam de sus zonas de reconocimiento en sinaptosomas. DBI es también idéntica a la proteína de fijación acil-CoA- (Knudsen, J. et al., 1993, Mol. Cell. Biochem. 123:129-138). Se demostró que la DBI purificada estimula el transporte del colesterol intramitocondrial y aumenta la formación de pregnenolona por las mitocondrias aisladas (Papadopoulos, V. 1998, supra). Después de esto, se demostró que esta acción de DBI estaba mediada por PBR (Papadopoulos, V. 1993, supra; Papadopoulos, V. 1998, supra). Además se demostró que DBI aumenta la carga de colesterol en la P450scc aislada (Brown, A. S. y Hall, P. F., 1991 Biochem. Biophys. Res. Commun. 180:609-614). Así pues, la identificación del modelo de consenso de aminoácidos para el reconocimiento/interacción del colesterol en DBI puede ayudar a comprender su función en la esteroidogénesis y su efecto directo sobre P450scc. Resulta interesante que los solicitantes demostraron en el pasado que el producto de DBI de tratamiento natural, el triacontatetrapéptido TTN (DBI_{17-50}), pero no el octadecanuropéptido ODN (DBI_{33-50}), pudo simular el efecto de DBI en la esteroidogénesis mitocondrial (Papadopoulos, V. et al. 1991, Endocrinology 129:1481-1488). El descubrimiento de que en DBI el modelo de consenso de aminoácidos para el reconocimiento/interacción del colesterol está situado en la secuencia de aminoácidos 25 a 32 (Tabla I) puede ahora explicar este resultado. Debe observarse también que el modelo e consenso de aminoácidos para el reconocimiento/interacción del colesterol se encuentra en medio de la identificación de la proteína que se une a acil-CoA (aminoácidos 19 a 37) importante en la formación de la zona de unión a acil-CoA (Knudsen et al. 1993, supra).
Se ha descubierto StAR en las células de las gónadas y de las cápsulas suprarrenales, donde están recién sintetizadas en respuesta a hormonas tróficas, como una proteína precursora citoplásmica de 37 kDa dirigida a las mitocondrias (Stocco y Clark, 1996 supra). La síntesis de StAR en las células de Leydig comienza 60 min después de la adición de la hormona y a continuación va paralela a la capacidad de las células para producir esteroides en respuesta a las hormonas tróficas (Stocco y Clark, 1996 supra; Clark, B. J. et al., 1995, Mol. Endocr. 9:1346-1355). El precursor StAR de 37 kDa experimenta además escisión para producir la proteína StAR "madura" mitocondrial de 30 kDa y su contrapartida fosforilada (Stocco y Clark, 1996 supra). Este tratamiento de la proteína se cree que se produce a nivel de las zonas de contacto de la membrana mitocondrial externas/internas y se ha propuesto que es responsable del transporte del colesterol desde la membrana mitocondrial externa a la interna (Stocco y Clark, 1996 supra). Considerando que el modelo de consenso de aminoácidos para el reconocimiento/interacción del colesterol se encuentra en el terminal amino de la proteína precursora StAR, que se separa de la proteína madura, es posible que la función de la proteína precursora StAR sea para lanzar el colesterol desde los depósitos intracelulares hasta la membrana mitocondrial
externa.
En conclusión, los resultados presentados en la presente memoria demuestran que PBR puede desempeñar una función de tipo canal para el colesterol en la OMM. El grupo esteroidogénico del colesterol, que procede de varias fuentes intracelulares, es reconocido por el modelo de consenso de aminoácidos -Z-(X)_{0-5}-Y-(X)_{0-5}-Q- para el reconocimiento/ interacción del colesterol presente en el terminal carboxi de PBR en la OMM. Este grupo de colesterol se introduce en la OMM en las zonas de PBR donde permanece sin mezclarse con otros componentes de la membrana. El enlace del ligando al receptor produce la liberación de este colesterol. Considerando que se ha demostrado que el PBR está asociado al canal aniónico dependiente del voltaje (Papadopoulos, V. 1998, supra), descubierto en los puntos de contacto de la membrana mitocondrial externa/interna, el colesterol liberado puede ahora acceder directamente a la P450scc en la IMM donde se escindirá a pregnenolona, precursora de todos los
esteroides.
\newpage
Además de ser un precursor para la síntesis de hormonas esteroides, el colesterol es un elemento estructural esencial de las membranas celulares y un precursor para la síntesis de ácidos biliares y lipoproteínas. Las células de mamífero obtienen colesterol por interiorización de las lipoproteínas de baja densidad o por la síntesis de novo en el retículo endoplásmico. La distribución subcelular del colesterol de novo sugiere que el colesterol es transportado e incorporado rápidamente desde los puntos de adquisición a la membrana objetivo (Liscum, L. y Underwood, K. W. 1995, J. Biol. Chem. 270:15433-15446). Así pues, se consigue la homeostasis del colesterol específica para el tejido y las células. Considerando el caso difundido de PBR y su localización subcelular específica en el tejido y en las células (Papadopoulos, V. 1993, supra; Papadopoulos, V. 1998, supra), estos resultados sugieren una función más general para PBR en el transporte y compartimentación del colesterol intracelular.
<110> GEORGETOWN UNIVERSITY MEDICAL CENTER
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<120> SECUENCIA DE RECONOCIMIENTO DEL COLESTEROL
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<130> 23521-0118
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<140> PCT/US99/05853
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<141> 1999-03-12
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<160> 25
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 7
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
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<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Asn Tyr Tyr Val Trp Arg}
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<211> 7
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
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<400> 2
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
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<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Asn Tyr Arg}
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
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\sa{Val Ala Tyr His Gln Tyr Tyr Gln Arg}
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
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<400> 5
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\sa{Val Leu Asn Tyr Tyr Val Trp Arg}
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
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\sa{Leu Asn Tyr Arg}
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
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<400> 9
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\sa{Val Ala Tyr His Gln Tyr Tyr Gln Arg}
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
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<400> 10
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\sa{Val Ala Tyr His Gln Tyr Tyr Gln Arg}
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
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<400> 11
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\sa{Val Ala Tyr His Glx His Tyr Gln Lys}
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<211> 7
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
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<400> 12
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\sa{Leu Asn Glu Tyr His Thr Arg}
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<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
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<400> 13
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\sa{Val Thr Lys Tyr Trp Phe Tyr Arg}
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<210> 14
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<211> 8
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 14
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\sa{Val Phe Tyr Val Ile Glu Thr Arg}
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<210> 15
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Phe Ile Tyr Ser His Phe Lys}
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<211> 11
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Cys Ala Gly Ser Ser Tyr Arg His Met Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
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\sa{Val Tyr Lys Glu Met Tyr Lys Thr Asp Leu Glu Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
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<211> 9
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Leu Cys Thr Tyr Val Val Ser Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Ser Leu Tyr Leu Ala Ile Thr Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Thr Glu Gly Met Tyr Ala Phe Cys Tyr Arg}
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<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Thr Glu Ala Tyr Arg Gln Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Ser Pro Tyr Asn Lys Gly Leu Ile Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Val Asp Tyr Ile Asp Glu Gly Arg}
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atatatacat atgcctgaat cctgggtg
\hfill
28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atactcgagt gggtgccttc actctg
\hfill
26

Claims (29)

1. Péptido aislado con una secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol seleccionada de entre el grupo constituido por la SEC. ID nº: 2, SEC. ID nº: 3, SEC. ID nº: 4 y SEC. ID nº: 5.
2. Molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos para interacción/reconocimiento del colesterol seleccionada de entre el grupo constituido por:
a)
una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol tal como se define en la reivindicación 1;
b)
una secuencia de nucleótidos complementaria de (a).
3. Molécula de ácido nucleico que comprende:
(i)
un vector; y
(ii)
una molécula de ácido nucleico tal como se define en la reivindicación 2.
4. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 3, en el que dicho vector es un vector procariótico.
5. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 3, en el que dicho vector es un vector eucariótico.
6. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4 ó 5, en la que dicho vector es un vector de expresión.
7. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 6, en la que dicho vector es útil para la expresión en plantas.
8. Célula huésped transformada por la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3.
9. Célula huésped de la reivindicación 8, en la que dicha célula huésped es procariótica.
10. Célula huésped de la reivindicación 8, en la que dicha célula huésped es eucariótica.
11. Célula huésped de la reivindicación 10, en la que dicha célula huésped es una célula vegetal.
12. Método para detectar si una proteína reconoce el colesterol, que comprende identificar en la secuencia de aminoácidos de dicha proteína, la presencia o ausencia de una secuencia de aminoácidos para interacción/reconocimiento del colesterol tal como se define en la reivindicación 1, o identificar en la secuencia nucleotídica que codifica dicha proteína, la presencia o ausencia de una secuencia nucleotídica para interacción/reconocimiento del colesterol tal como se define en la reivindicación 2, en el que la presencia de un aminoácido para reconocimiento/interacción del colesterol o la presencia de una secuencia nucleotídica para reconocimiento/interacción del colesterol indica la interacción/reconocimiento de la proteína con el colesterol.
13. Método para dotar de reconocimiento/interacción del colesterol a una molécula, que comprende introducir en dicha molécula una secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol tal como se define en la reivindicación 1 de modo que dicha secuencia se expresa y dicha molécula interactúa con el coles-
terol.
14. Utilización de un péptido según la reivindicación 1, para la preparación de un medicamento destinado a regular la cantidad de colesterol en la sangre o tejido.
15. Utilización de un péptido según la reivindicación 14, en la que el medicamento destinado a regular la cantidad de colesterol en la sangre se utiliza para el tratamiento de litiasis biliar, ateroesclerosis, Niemann-Pick C., sitosterolemia, distrofia, tumorigénesis, distrofia del cristalino corneal de Schnyder, enfermedad de Alzheimer, toxicidad por teluro, síndrome de Smith-Lemli-Opitz, mielinización, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth; enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher y esclerosis múltiple.
16. Utilización de un ácido nucleico según la reivindicación 2, para la preparación de una composición destinada a reducir la concentración de colesterol en el suero en un sujeto.
17. Utilización de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos para interacción/reconocimiento del colesterol tal como se define en la reivindicación 1, acomplejada con una cantidad farmacéuticamente aceptable de colesterol y un diluyente farmacéuticamente aceptable en la preparación de una composición para administrar colesterol a un sujeto.
\newpage
18. Método para detectar un aumento o disminución de colesterol en una muestra biológica que comprende:
inmovilizar un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol tal como se define en la reivindicación 1 en un soporte sólido que da un polipéptido inmovilizado
exponer la muestra al polipéptido inmovilizado, y
medir la cantidad de polipéptido unido al colesterol en el que cuando se compara con un patrón puede determinarse un aumento o disminución con relación al patrón.
19. Método para identificar agentes o fármacos que son agonistas o antagonistas de la interacción entre los péptidos que comprende la secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol tal como se define en la reivindicación 1 y colesterol, que comprende:
exponer un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos para interacción/reconocimiento del colesterol tal como se define en la reivindicación 1 al colesterol en condiciones en las que se produce la interacción entre el colesterol y el péptido formando un complejo péptido/colesterol
incubar el complejo con un compuesto de ensayo
medir un aumento o disminución del nivel de interacción entre el péptido y el colesterol en respuesta al compuesto de ensayo en el que un aumento en la interacción indicaría que el compuesto de ensayo es un agonista y una disminución en la interacción indicaría que el compuesto de ensayo es un antagonista de la fijación péptido/colesterol.
20. Método según la reivindicación 19, que es para la identificación de antagonistas de interacción entre los péptidos que comprende la secuencia de aminoácidos para interacción/reconocimiento del colesterol tal como se define en la reivindicación 1 y colesterol, en el que el compuesto de ensayo es un péptido, fármaco o anticuerpo.
21. Método según la reivindicación 20, cuyo método comprende además una etapa de producción de un antagonista identificado en el método.
22. Método para reducir la capacidad de fijación del colesterol de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos para reconocimiento/interacción del colesterol tal como se define en la reivindicación 1 que comprende:
modificar una tirosina por una serina,
modificar una arginina por una leucina,
modificar una treonina por una serina,
modificar una valina por una leucina,
modificar una leucina por una isoleucina,
modificar una tirosina por una valina,
modificar una tirosina por una isoleucina,
modificar una valina por una isoleucina,
modificar una arginina por una isoleucina, y
modificar un aspartato por un glutamato.
23. Receptor de benzodiazepina de tipo periférico, en el que la función para reconocimiento/interacción del colesterol de dicho receptor se reduce según el método de la reivindicación 22.
24. Receptor de benzodiazepina de tipo periférico incapaz de reconocer/interactuar con el colesterol, receptor que presenta una deleción que comprende una secuencia de aminoácidos para interacción/reconocimiento del colesterol tal como se define en la reivindicación 1.
25. Utilización de un ácido nucleico tal como se define en la reivindicación 2, para la preparación de una composición destinada a reducir los síntomas de una enfermedad en un sujeto procedente de un aumento de colesterol.
26. Utilización según la reivindicación 25, en la que dicha composición comprende microesferas.
27. Planta transgénica que comprende un ácido nucleico que codifica un receptor de benzodiazepina de tipo periférico según la reivindicación 24 ó 25.
28. Planta transgénica que comprende un ácido nucleico que codifica un receptor de benzodiazepina de tipo periférico según la reivindicación 24 ó 25 operativamente ligado a un activador inducible.
29. Planta transgénica según la reivindicación 28, en la que dicho activador es inducible en cualquiera de las condiciones siguientes: calor, administración de antibióticos y administración de hormonas vegetales.
ES99912635T 1998-03-12 1999-03-12 Peptidos que contienen una secuencia de reconocimiento del colesterol y usos de los mismos. Expired - Lifetime ES2274621T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US7775398P 1998-03-12 1998-03-12
US77753P 1998-03-12

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