ES2229779T3 - Guanililciclasa alfa1/beta1 humana soluble (hsgc alfa1/beta1) aislada y purificada. - Google Patents
Guanililciclasa alfa1/beta1 humana soluble (hsgc alfa1/beta1) aislada y purificada.Info
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Abstract
Guanililciclasa a 1/fl1 soluble humana purificada con homogeneidad aparente, en la que hsGCa1 está identificada por la SEC. ID nº: 2 y hsGCfi1 está identificada por la SEC. ID nº: 4. Un objetivo de la invención consiste en una guanililciclasa 1/ 1 (hsGC 1/ 1) soluble humana en forma aislada purificada hasta homogeneidad aparente, en la que hsGC 1 se identifica por la SEC. ID nº: 2 y hsGC 1 se identifica por la SEC. ID nº: 4. Otro objetivo de la invención consiste en un procedimiento para producir la guanililciclasa 1/ 1 soluble humana que comprende la expresión de un vector de expresión que contiene la secuencia de ADN para las subunidades hsGC 1 y hsGC 1 en células huésped procarióticas o eucarióticas y la recuperación de la guanililciclasa. En una forma de realización preferida del procedimiento de la presente invención para producir la guanililciclasa 1/ 1 soluble humana, la etapa de recuperación de la guanililciclasa 1/ 1 comprende la lisis de las células, la cromatografía por afinidad del lisado celular y la elución posterior de la guanililciclasa 1/ 1. Otro objetivo preferido de la presente invención es un procedimiento para producir la subunidad 1/ 1 de la guanililciclasa soluble humana, el vector de expresión contiene además al menos una secuencia de ADN de un dominio cromatográfico de afinidad específica (etiqueta de afinidad) con un punto de escisión de la proteasa adherente. Otro objetivo de la presente invención consiste en un procedimiento para producir guanililciclasa 1/ 1 humana soluble (hsGC 1/ 1) que comprende la expresión independiente de un vector de expresión que contiene la secuencia de ADN para hsGC 1 o hsGC 1 en las células huésped procarióticas o eucarióticas, la recuperación de las subunidades y la combinación de las subunidades hsGC 1 y hsGC 1 en la guanililciclasa 1/ 1 (hsGC 1/ 1) dimérica.
Description
Guanililciclasa \alpha1/\beta1 humana soluble
(hsGC \alpha1/\beta1) aislada y purificada.
La presente invención se refiere a la expresión
de los clones del ADNc para la subunidades \alpha_{1} (hsGC
\alpha1) y \beta_{1} (hsGC \beta1) de la guanililciclasa
humana soluble, a la purificación posterior de la enzima activa y a
la utilización de la misma, a la aplicación médica de la expresión
de estos clones por transferencia génica, así como a los anticuerpos
contra los péptidos derivados de la secuencia y a la utilización de
los mismos.
El sistema de señalización de NO/GMPc endógeno
media en importantes funciones tales como la vasodilatación, la
inhibición de la agregación de plaquetas, la neurotransmisión y la
respuesta inmunitaria. Además, está implicado en el desarrollo de
varios estados patológicos tales como la
isquemia-revascularización y las lesiones
inflamatorias (Schmidt y Walter, 1994). Por consiguiente, el sistema
NO/GMPc ha sido desde hace tiempo un punto de partida importante
para el desarrollo de nuevos fármacos destinados a la terapia de la
cardiopatía coronaria, la sensibilidad a la trombosis, la
insuficiencia cardíaca, la angina de pecho y el edema pulmonar
cardíaco dependiente, las crisis de hipertensión, los estados
inflamatorios y el infarto cardíaco. Hasta ahora, dichas terapias
han empleado varios donantes denominados de NO, por ejemplo
nitroglicerina, que libera NO, reemplazando por lo tanto el NO
endógeno y activando la guanililciclasa soluble (sGC) (Fig. 1). La
sGC forma GMPc que media en los efectos de la vía NO/GMPc por varias
enzimas receptoras intracelulares. La aplicación de donantes de NO
tiene dos limitaciones: I) La aplicación repetida de donantes de NO
produce tolerancia en el paciente, es decir pérdida de actividad,
cuando se vuelve a aplicar; II) NO reacciona con O_{2}^{-} para
formar peroxinitrito, que es citotóxico y menos eficaz para activar
la sGC. De este modo, la activación directa de sGC por nuevos
productos farmacéuticos que no contienen NO para la terapia o la
transferencia génica de sGC serían estrategias deseables. Los
activadores que no liberan NO de la sGC carecen potencialmente de
tolerancia e intoxicación por NO.
Recientemente, se ha descrito
"YC-1"
(3-(5'-hidroximetil-2'-furil)-1-bencilindazol)
como el primer activador de la sGC en las plaquetas que no libera NO
(Ko et al., 1994; Wu et al., 1995).
YC-1 activa también la sGC purificada procedente del
pulmón bovino y potencia la activación del NO (Friebe et al.,
1996). El efecto sobre la sGC humana no ha sido investigado. La
isoforma humana de sGC no está todavía disponible para la detección
farmacológica.
La sGC del receptor de NO consta de dos
subunidades, \alpha y \beta, que forman conjuntamente un
heterodímero enzimáticamente activo. Se han descrito en la
bibliografía tres isoformas diferentes de la subunidad \alpha y
tres de las subunidad \beta, aunque de diferentes especies. Las
isoformas mejor investigadas, las isoformas \alpha1/\beta1
bovina y la \alpha1/\beta1 de rata, tienen particular
significado para la investigación cardiovascular. Gupta G. et
al. han descrito la expresión y purificación de guanililciclasa
\alpha1/\beta1 de rata (Prot. Ex. y Pw., 10,
325-330, 1997). Hasta hace poco, un homólogo humano
de las sGC bovina y de rata (p. ej. los heterodímeros
sGC\alpha1/sGC\beta1) era desconocido. Se ha publicado que las
secuencias del ADNc según se informa corresponden a una isoforma
sGC\alpha3 y \beta3 humana (Giuili et al., 1992). Aunque
sGC\beta3 presentaba una gran homología con sGC\beta1
(bovina/rata), la secuencia de sGC\alpha3 contenía dos zonas
restringidas sin homología con sGC\alpha1 (bovina/rata),
denominadas en esta memoria S1 y S2 (Fig. 2). Además, se desconocía
si sGC\alpha3 y sGC\beta3 pueden formar un heterodímero de sGC
funcional y qué función desempeñan las zonas S1 y S2. Además,
ninguna otra subunidad de sGC humana ha sido expresada todavía como
proteína. Hace poco, se publicó en el GeneBank (nº de registro
U58855) que una secuencia denominada hsGC\alpha1 carece de las
diferencias de secuencia en sGC\alpha1 de los tejidos bovinos y de
rata en las zonas S1 y S2. Además, un producto cortado y empalmado
alternativamente de hsGC\beta3 fue publicado recientemente en el
GeneBank (nº de registro AF020340) que fue diseñado por los autores
como una forma de corte y empalme alternativa de hsGC\beta1. El
significado fisiológico de esta variante de corte y empalme de
hsGC\beta1/3 no está claro. Por lo tanto, surge la cuestión de
cuál de estas isoformas es responsable de qué función fisiológica en
qué tipos de células.
Además, ningún anticuerpo en la
sGC\alpha1/\beta1 humana está actualmente disponible que sea
monoespecífico, dirigido contra las secuencias humanas, o que se
hayan demostrado que son adecuados para las inmunotransferencias con
los tejidos humanos. Los anticuerpos de péptidos descritos de este
modo hace tiempo solamente presentan parcialmente estas
características: Harteneck et al. y Guthmann et al.
utilizaron una secuencia de péptido (VYKVETVGDKYMTVS
GLP) que está muy conservada en las guanililciclasas. Por consiguiente, puede esperarse la reacción cruzada con guanililciclasas en forma de partículas (p. ej. GC-C). Guthmann et al. utilizó una secuencia de péptidos (YGPEV
WEDIKKEA) idéntica a hsGC\beta1 y a una secuencia de péptidos (KKDVEEANANFLGKASGID) idéntica a hsGC\alpha1 excepto para dos intercambios de aminoácidos. Sin embargo, la función de estos anticuerpos en las inmunotransferencias se presentó solamente para hsGC enriquecida en plaquetas humanas. Además, el antisuero contra hsGC\alpha1 detecta un segundo producto inespecífico. Humbert et al. y Koesling et al. utilizaron una secuencia peptídico (SRKNTG
TEETEQDEN) de sGC\beta1 bovina que se solapa en parte (aminoácidos 1 a 10) con el péptido utilizado en la presente memoria para la sGC\beta1 humana (aminoácidos 13 a 22) y es idéntica en esta zona. El terminal C de este péptido bovino (aminoácidos 11 a 15), sin embargo, es claramente diferente de la secuencia humana. Por otra parte, el antisuero contra este péptido no fue probado con una proteína humana, sino que se utilizó únicamente para la inmunoprecipitación de la sGC bovina.
GLP) que está muy conservada en las guanililciclasas. Por consiguiente, puede esperarse la reacción cruzada con guanililciclasas en forma de partículas (p. ej. GC-C). Guthmann et al. utilizó una secuencia de péptidos (YGPEV
WEDIKKEA) idéntica a hsGC\beta1 y a una secuencia de péptidos (KKDVEEANANFLGKASGID) idéntica a hsGC\alpha1 excepto para dos intercambios de aminoácidos. Sin embargo, la función de estos anticuerpos en las inmunotransferencias se presentó solamente para hsGC enriquecida en plaquetas humanas. Además, el antisuero contra hsGC\alpha1 detecta un segundo producto inespecífico. Humbert et al. y Koesling et al. utilizaron una secuencia peptídico (SRKNTG
TEETEQDEN) de sGC\beta1 bovina que se solapa en parte (aminoácidos 1 a 10) con el péptido utilizado en la presente memoria para la sGC\beta1 humana (aminoácidos 13 a 22) y es idéntica en esta zona. El terminal C de este péptido bovino (aminoácidos 11 a 15), sin embargo, es claramente diferente de la secuencia humana. Por otra parte, el antisuero contra este péptido no fue probado con una proteína humana, sino que se utilizó únicamente para la inmunoprecipitación de la sGC bovina.
Por lo tanto, para la isoforma \alpha1/\beta1
humana que es importante para la investigación cardiovascular, no
han estado disponibles ni la proteína nativa ni la proteína
recombinada, ni un protocolo de purificación de una etapa, ni
los anticuerpos específicos. Un enfoque para la genoterapia (p. ej.
con adenovirus o similares) tampoco ha sido descrito todavía.
La activación de la sGC\alpha1/\beta1 humana
independiente de NO es un enfoque prometedor para descubrir nuevos
fármacos o técnicas de transferencia génica para la terapia
cardiovascular que ni produce tolerancia en el paciente ni forma
peroxinitrito citotóxico. Para descubrir dichos productos
farmacéuticos, es necesario un examen colectivo de las sustancias
activas adecuadas. Dicho examen farmacológico de activadores o
inhibidores específicos mediante ensayos en animales es demasiado
caro y no es razonable debido a las diferencias en las especies, los
posibles efectos secundarios y los efectos en otras isoformas. Los
sistemas de cultivo celular adolecen del inconveniente de que
únicamente con un esfuerzo adicional sustancial se puede determinar
en qué puntos de la cascada de señalización son eficaces las
sustancias. Además, el cultivo celular resulta caro y problemático.
La purificación de una proteína a partir de tejidos animales es una
labor intensa y produce un rendimiento bajo. De forma más
destacable, debido a las diferencias de especies los resultados de
dicho examen no son generalmente transferibles. En la presente
memoria, en particular, surge la cuestión del significado de las
isoformas hsGC\alpha1 y hsGC\alpha3 y si hsGC\beta3
corresponde de hecho a una hsGC\beta1 humana. Esto es un factor
importante a considerar en la selección de la proteína diana
apropiada para la identificación farmacológica o la genoterapia.
Para la identificación óptima, el homólogo humano de la proteína
sGC\alpha1/\beta1 tendría que purificarse en grandes cantidades
y estar disponible a bajo coste. No es posible una purificación de
grandes cantidades de proteína sGC\alpha1/\beta1 natural humana
procedente de tejidos humanos. Por lo tanto, se necesitan otros
procedimientos para el protocolo de identificación del fármaco.
Además, no se encuentran disponibles los anticuerpos purificados
para la detección de sGC\alpha1/\beta1 humana que se ha
demostrado que es adecuada para utilizaciones en diagnóstico, p. ej.
en inmunotransferencia normal, ELISA, RIA o EIA, entre otras
técnicas. Tampoco está disponible un enfoque para la expresión
artificial de la hsGC por transferencia génica en el hombre que
podría utilizarse terapéuticamente.
Por consiguiente, la presente invención se basa
en el problema técnico de proporcionar sGC\alpha1/\beta1 humana
aislada y purificada así como en un procedimiento para su producción
y purificación. Además, un problema técnico adicional de la presente
invención consiste en proporcionar anticuerpos dirigidos contra
sGC\alpha1/\beta1 humana. Otro problema técnico consiste en
proporcionar vectores de expresión que contienen el ADNc de la
sGC\alpha1/\beta1 humana basada en adenovirus. Por último, el
problema técnico de la presente invención consiste en proporcionar
sGC\alpha1/\beta1 humana en forma purificada y en cantidades
manejables para análisis de identificación del fármaco dirigido a
detectar moduladores, inhibidores y activadores de
sGC\alpha1/\beta1 humana.
La solución al problema técnico anterior la
proporciona el tema del asunto de las reivindicaciones y la
siguiente descripción de la invención.
Un objetivo de la invención consiste en una
guanililciclasa \alpha1/\beta1 (hsGC\alpha1/\beta1) soluble
humana en forma aislada purificada hasta homogeneidad aparente, en
la que hsGC\alpha1 se identifica por la SEC. ID nº: 2 y
hsGC\beta1 se identifica por la SEC. ID nº: 4.
Otro objetivo de la invención consiste en un
procedimiento para producir la guanililciclasa \alpha1/\beta1
soluble humana que comprende la expresión de un vector de expresión
que contiene la secuencia de ADN para las subunidades hsGC\alpha1
y hsGC\beta1 en células huésped procarióticas o eucarióticas y la
recuperación de la guanililciclasa.
En una forma de realización preferida del
procedimiento de la presente invención para producir la
guanililciclasa \alpha1/\beta1 soluble humana, la etapa de
recuperación de la guanililciclasa \alpha1/\beta1 comprende la
lisis de las células, la cromatografía por afinidad del lisado
celular y la elución posterior de la guanililciclasa
\alpha1/\beta1.
Otro objetivo preferido de la presente invención
es un procedimiento para producir la subunidad \alpha1/\beta1 de
la guanililciclasa soluble humana, el vector de expresión contiene
además al menos una secuencia de ADN de un dominio cromatográfico de
afinidad específica (etiqueta de afinidad) con un punto de escisión
de la proteasa adherente.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en un procedimiento para producir guanililciclasa \alpha1/\beta1
humana soluble (hsGC\alpha1/\beta1) que comprende la expresión
independiente de un vector de expresión que contiene la secuencia de
ADN para hsGC\alpha1 o hsGC\beta1 en las células huésped
procarióticas o eucarióticas, la recuperación de las subunidades y
la combinación de las subunidades hsGC\alpha1 y hsGC\beta1 en la
guanililciclasa \alpha1/\beta1 (hsGC\alpha1/\beta1)
dimérica.
Otra forma de realización preferida del
procedimiento de la presente invención para producir la
guanililciclasa \alpha1/\beta1 humana soluble
(hsGC\alpha1/\beta1) comprende la expresión conjunta de las
secuencias de ADN para hsGC\alpha1 y hsGC\beta1 en células
huésped procarióticas o eucarióticas, la lisis de las células que
contienen hsGC\alpha1 y hsGC\beta1, la cromatografía por
afinidad y la elución posterior de la guanililciclasa soluble.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en la utilización de una secuencia de ácido nucleico que codifica
las subunidades hsGC\alpha1 (SEC. ID nº: 2) y hsGC\beta1 (SEC.
ID nº: 4) de la guanililciclasa \alpha1/\beta1 humana soluble
como agente terapéutico para la preparación de una composición
farmacéutica para la genoterapia somática, en particular para la
prevención y terapia de la aterosclerosis y de las enfermedades
resultantes, de la restenosis, isquemia (infarto), enfermedades
obstructivas de las arterias periféricas e hipertensión arterial,
así como para la prevención en pacientes con factores de riesgo para
aterosclerosis, ataques isquémicos transitorios, isquemia cerebral,
ictus apoplético (apoplejía), cardiopatía coronaria, cuadro clínico
tras la cirugía coronaria con bypass, estenosis de la
carótida, para reforzar la terapia con activadores de sGC,
sustancias sensibilizantes de sGC, monóxido de nitrógeno (donantes
de NO) o inhibidores de fosfodiesterasa, insuficiencia cardíaca y
disfunción hepática.
En una forma de realización particularmente
preferida, se utilizan ADNc de hsGC\alpha1 y hsGC\beta1 que
contienen vectores adenovíricos en genoterapia somática. Sin
embargo, se pueden aplicar otros sistemas de vectores para la
utilización medicinal de la terapéutica genética.
En una forma de realización preferida, el Ad5
adenovírico y otros vectores adecuados que contienen la secuencia de
ácidos nucleicos de la guanililciclasa \alpha1 (hsGC\alpha1)
humana soluble y/o la guanililciclasa \beta1 (hsGC\beta1) humana
soluble se utilizan para la prevención y la terapia de las
enfermedades mencionadas anteriormente. Asimismo, una mezcla de dos
vectores en las que un vector contiene la secuencia de ácidos
nucleicos de la guanililciclasa \alpha1 (hsGC\alpha1) humana
soluble y el segundo de la guanililciclasa \beta1 humana soluble
(hsGC\beta1) se puede utilizar para la transferencia génica
somática. Se prefiere de forma especial la transferencia génica
somática en las células endoteliales, en las células vasculares del
músculo liso, en las células de la neoíntima, en fibroblastos y en
otras células vasculares así como en las partículas sanguíneas
(plaquetas, leucocitos y otros) y en el hígado.
Los procedimientos de transferencia génica
descritos en la presente invención se pueden utilizar también para
la transferencia génica de la guanililciclasa \alpha2 humana
soluble (GeneBank: x63282) y del homólogo humano de la
guaniliciclasa \beta2 soluble (de rata; GeneBank: m57507) así
como para otras guanililciclasas humanas solubles.
Otro objetivo de la presente invención se refiere
a anticuerpos monoespecíficos contra guanililciclasa
\alpha1/\beta1 humana soluble (hsGC\alpha1/\beta1), que se
puede obtener por inmunización de un mamífero con
hsGC\alpha1/\beta1 y aislamiento de los anticuerpos.
La Figura 1 presenta varias posibilidades de
modulación de guanililciclasa soluble
(GcsC-\alpha1/sGC-\beta1). La
activación normal está mediada por la NO sintetasa (NOS) y NO. NO,
sin embargo, reacciona con los radicales de oxígeno para formar
peroxinitrito (ONOO^{-}), que es citotóxico y activa solamente
muy poco a sGC. NO también puede ser liberado por los donantes de NO
tales como nitroglicerina o nitroprusida sódica. La sGC puede ser
activada directamente por los moduladores de sGC (p. ej.
YC-1); como alternativa, la activación por NO de sGC
está potenciada por estos moduladores. Además, sGC puede ser
sobreexpresada mediante la utilización de la transferencia génica
(p. ej. utilizando vectores adenovíricos) o puede compensarse un
nivel de expresión patológicamente bajo de sGC. Asimismo se pueden
utilizar vectores adenovíricos (u otros) con sGC mutada que tienen
una actividad basal mayor. De este modo, se podría conseguir de
forma permanente un nivel de GMPc elevado independiente de NOS, NO,
donantes de NO o de los moduladores de sGC.
La Figura 2 presenta una comparación esquemática
de las subunidades de sGC\alpha1 bovina y de rata junto con la
secuencia publicada del clon de ADNc humano denominado
"sGC\alpha3" (Giuili et al., 1992). Las barras
representan la proteína. "N" representa el terminal N y
"C" el terminal C. Los segmentos funcionales "dominio
regulador", "dominio de homología de sGC" y "dominio de
ciclasa" de estas proteínas están marcados con dibujos
diferentes. Las zonas "S1" y "S2" para las que no se
observan zonas homólogas en las proteínas sGC\alpha1 bovina y de
rata están marcadas en negro.
La Figura 3 presenta una ilustración esquemática
de un clon de sGC\alpha3 humana con los errores de la secuencia
publicados (Giuili et al., 1992). El ADNc se presentó
anteriormente: la barra representa la zona de codificación del ADNc,
las líneas a la izquierda y a la derecha de la barra representan las
zonas 5' y 3' no traducidas, respectivamente. "S1" y "S2"
representan las zonas que no tienen homología en las isoformas
bovina y de rata de sGC\alpha1 (véase Fig. 2). Las posiciones de
los errores de la secuencia están marcadas debajo: la línea a
muestra las inserciones de nucleótido, la línea b la deleción y la
línea c los intercambios. Debajo se muestra una escala de pares de
bases (bp). Los errores de secuencia para cada una de las 3 líneas
a, b y c están relacionados en la parte inferior: la letra
especifica el tipo de la base referida y el número su posición en el
ADNc.
La Figura 4 presenta la verificación de la
expresión de la sGC\alpha1 humana (A) y sGC\beta1 (B) en los
tejidos humanos mediante PCR utilizando bancos de ADNc. Se muestra
una fotografía de un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio
bajo luz UV con productos separados por PCR. La flecha de la
izquierda indica el producto especificado. Los cebadores de PCR son
visibles en la parte inferior de la foto. Los tejidos a partir de
los cuales se produjeron los bancos de ADNc están indicados en la
parte superior. No se añadió ADNc en la referencia negativa, y en la
referencia positiva, se añadió plásmido conteniendo el ADNc de
hsGC\alpha1.
Las Figuras 5 y 6 presentan los vectores de
transferencia pVL1393 y pAcG2T de baculovirus, respectivamente,
(ambos sin el ADNc de hsGC), que se utilizaron para la construcción
de baculovirus recombinados para la expresión de
sGC\alpha1/\beta1 humana en células Sf9. En la parte superior de
las figuras se muestra el plásmido circular con los puntos de
restricción (denominaciones cortas y posición en pares de bases), el
gen para resistencia a la ampicilina (Amp^{R}), el "origen de
replicación" (CoIE ori), el activador de polihedrina, la
secuencia de glutatión-S-transferasa
(solo en la Fig. 6) y el punto de clonación múltiple (MCS). La
Figura 5 presenta el punto de clonación múltiple con sus únicos
puntos de restricción en la parte inferior. La Figura 6 presenta el
punto de clonación múltiple con los puntos de restricción únicos así
como un punto de escisión de trombina normal en la parte
inferior.
La Figura 7 presenta la construcción de los
plásmidos hsGC\beta1-pVL1393 (sin la etiqueta de
GST) con el ADNc de hsGC\beta1, que se utilizó para obtener
baculovirus que expresan a hsGC\beta1 modificada genéticamente por
recombinación homóloga. El procedimiento para el plásmido
pAcG2T-hsGC\beta1 (con la etiqueta de GST =
glutatión-S-ADNc transferasa de
Schistosoma japonicum) es idéntico. Se produjo un fragmento
que lleva un punto BamHI adicional en su extremo 5' mediante PCR con
los cebadores A (bases 89 a 116 del ADNc de hsGC\beta1 + punto
BamHI en su extremo 5') y B (bases 692 a 711 del ADNc de
hsGC\beta1 [etiqueta sin codificación] con el punto de KpnI
natural). Debido a los puntos de restricción adicionales, el
fragmento 1 (fragmento de PCR con el punto BamHI nuevo) y el
fragmento 2 (ADNc de hsGC\beta1 desde el punto KpnI al punto
EcoRI) podría estar insertado conjuntamente en los puntos BamHI y
EcoRI del plásmido pVL1393. Por lo tanto, el ADNc de hsGC\beta1
completo está bajo el control del activador de polihedrina
(PHP).
La Figura 8 presenta la construcción del plásmido
hsGC\alpha1-pVL1393 (sin la etiqueta de GST) con
el ADNc de hsGC\alpha1, que se utilizó para obtener baculovirus
que expresan a hsGC\alpha1 modificada genéticamente por
recombinación homóloga. El procedimiento para el plásmido
pAcG2T-hsGC\alpha1 (con la etiqueta de GST =
glutatión-S-ADNc transferasa de
Schistosoma japonicum) es idéntico. Se produjo un fragmento
que lleva un punto BamHI adicional en su extremo 5' y un punto BsaAI
natural en la secuencia mediante PCR con los cebadores C (bases 524
a 541 del ADNc de hsGC\alpha1 + punto BamHI en su extremo 5') y D
(bases 1232 a 1249 del ADNc de hsGC\alpha1 [etiqueta sin
codificación]). Debido a los puntos de restricción adicionales, el
fragmento 3 cortado con BsaAI (fragmento de PCR con el punto BamHI
nuevo) y el fragmento 4 (ADNc de hsGC\alpha1 desde el punto BsaAI
al punto EcoRI) podría estar insertado conjuntamente en los puntos
BamHI y EcoRI del plásmido pVL1393. Por lo tanto, el ADNc de
hsGC\alpha1 completo está bajo el control del activador de
polihedrina (PHP).
La Figura 9 presenta la verificación de la
expresión de hsGC\alpha1/\beta1 en células Sf9, que se
infectaron con los virus genéticamente modificados descritos
anteriormente (con ADNc de hsGC\alpha1 o hsGC\beta1; ambos sin
etiqueta de GST = glutatión-S-ADNc
transferasa de Schistosoma japonicum). A la izquierda (A) se
muestra un gel de SDS al 10%-poliacrilamida teñido con Coomassie en
el que se cargan los homogeneizados celulares que se habían separado
en el sedimento (P) y en el sobrenadante (S) por centrifugación
(20.000 \times g). "Co" designa la referencia con células Sf9
no infectadas. "\alpha1" designa las células Sf9 que fueron
infectadas con virus que contenían el ADNc de hsGC\alpha1 y
"\beta1" designa las células Sf9 que fueron infectadas con
virus que contenían el ADNc de hsGC\beta1. Las posiciones de
hsGC\alpha1 y hsGC\beta1 en el gel están marcadas (\alpha1 ó
\beta1). A la derecha se presenta una inmunotransferencia con
sobrenadante (S) y sedimento (P) del homogeneizado celular de las
células Sf9 que no fueron infectadas (Co) o se infectaron
conjuntamente con baculovirus de hsGC\alpha1 y hsGC\beta1
(\alpha1 + \beta1). Se utilizaron los anticuerpos de péptido
contra hsGC\beta1 descritos anteriormente
(anti-hsGC\beta1) en primer lugar en
inmunotransferencia (Fig. 9B, líneas 1 a 4). Después, se volvió a
desarrollar la transferencia con los anticuerpos del péptido contra
hsGC\alpha1 (anti-hsGC\alpha1; Fig. 9B, bandas 5
a 8), que pusieron de manifiesto además las bandas de
hsGC\beta1.
La Figura 10 presenta la actividad de la
guanililciclasa (formación de GMPc a partir de GTP) en células Sf9
intactas que se infectaron conjuntamente con los baculovirus
modificados genéticamente que contienen ADNc de hsGC\alpha1 y
hsGC\beta1 descritos en esta memoria (ambos sin etiqueta de GST).
Se presenta el contenido de GMPc en pmol por 10^{6} células con
diferentes tratamientos, indicados en la parte inferior de la
figura. La muestra 1 está sin tratar en ambos paneles A y B. Se
añadió IBMX 1 mM
(3-isobutil-1-metilxantina)
a cada una de las demás muestras (línea superior: barra cruzada
negra). En la línea media, la concentración de SNP añadida a las
muestras se indica en \muM. La línea de la parte inferior presenta
la concentración de YC-1 añadida (A, izquierda) u
ODQ (B, derecha) en \muM.
YC-1 =
3-(5'-hidroximetil-2'-furil)-1-bencilindazol;
ODQ = 1
H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3,-a]quinoxalin-1-on;
SNP = nitroprusida sódica;
GMPc = monofosfato de 3',
5'-guanosina cíclica
La Figura 11 presenta la actividad de la
guanililciclasa (formación de GMPc a partir de GTP) en células Sf9
que se infectaron conjuntamente con los baculovirus modificados
genéticamente que contienen ADNc de hsGC\alpha1 y hsGC\beta1
descritos en la presente memoria (ambos sin etiqueta de GST). Tal
como se muestra en la parte superior, (A), se utilizó la fracción
celular soluble (sobrenadante tras la centrifugación a 20.000
\times g) y en la parte inferior, (B), el sedimento respectivo. En
cada caso, se muestra la cantidad de GMPc formada en pmol por mg de
proteína por minuto para los homogeneizados de las células que se
recogieron en diferentes puntos de tiempo (indicados en horas)
después de la infección con los baculovirus. Se midió la formación
de GMPc con adición (cuadros negros) y sin adición (cuadros blancos)
de SNP 100 \muM.
La Figura 12 presenta la actividad de la
guanililciclasa (formación de GMPc a partir de GTP) en células Sf9
que se infectaron conjuntamente con los baculovirus modificados
genéticamente que contienen ADNc de hsGC\beta1 (sin etiqueta de
GST) y ADNc de hsGC\alpha1 (con etiqueta de GST =
glutatión-S-ADNc transferasa
procedente de Schistosoma japonicum). Se presenta la
formación de GMPc en pmol por mg de proteína por minuto durante el
procedimiento de purificación (cromatografía por afinidad en
glutatión sepharose 4B). En cada caso, se midió la actividad en el
lisado (después de separar la parte insoluble por centrifugación a
20.000 \times g) en el sobrenadante después de la fijación de hsGC
a la glutatión sepharose 4B (flujo descendente) en ambos
sobrenadantes de los lavados de hsGC ligada a la glutatión sepharose
4B (lavado 1 y 2), así como en el sobrenadante tras la elución de
hsGC con glutatión reducido (elución 1 y 2). Se determinó la
formación de GMPc sin adición (cuadros negros, "basal") y con
adición (cuadros grises, "+ SNP 100 \muM") de SNP 100
\muM.
La Figura 13 presenta la expresión endógena,
natural de hsGC\alpha1 y hsGC\beta1 en diferentes tejidos
humanos en una inmunotransferencia.
Se utilizaron los anticuerpos peptídicos contra
hsGC\alpha1 descritos anteriormente
(anti-hsGC\alpha1) a la izquierda (A) y se
utilizaron los anticuerpos peptídicos contra hsGC\beta1
(anti-hsGC\beta1) a la derecha (B). A la derecha,
se añadió el péptido en el que se produjeron los anticuerpos como
referencia negativa (péptido: +), mientras que no se añadió ningún
péptido a la izquierda (péptido: -). Se cargaron en un gel de
poliacrilamida al 8% los extractos por SDS de GCrhs\alpha1- (en el
panel A de la figura) o de las células Sf9 que sobreexpresan a
GCrhs\beta1 (en el panel B de la figura) (Sf9), de la corteza
cerebral humana (corteza), del cerebelo humano (cerebelo) y del
pulmón humano (pulmón). Las bandas específicas de hsGC\alpha1
(\alpha1) y de hsGC\beta1 (\beta1) están designadas mediante
una flecha.
La Figura 14 presenta en inmunotransferencias la
purificación de hsGC\alpha1 (como dímero
hsGC\alpha1/hsGC\beta1) procedente de las células Sf9 que se
infectaron conjuntamente con los baculovirus modificados
genéticamente que contienen ADNc de hsGC\alpha1 con etiqueta de
GST (= glutatión-S-ADNc transferasa
de Schistosoma japonicum) y ADNc de hsGC\beta1 (sin
etiqueta de GST). Se incubó el lisado celular con glutatión
sepharose 4B, y tras la fijación, se cargó el sobrenadante
(sobrenadante tras la fijación). Se lavó la sefarosa dos veces y se
cargaron los respectivos sobrenadantes de este lavado (lavado 1 y
2). Posteriormente, se realizó la elución por escisión de la
proteína de hsGC\alpha1 procedente de la etiqueta de GST con
trombina y se cargó una alícuota ("elución con trombina"). A
continuación, se añadió un tampón de terminación de SDS a la
glutatión sepharose 4B y se cargó una alícuota (GSH sepharose
después de la elución). Además, se cargó la glutatión sepharose 4B
con hsGC\alpha1 ligada sin elución previa con trombina a la que se
había añadido tampón de SDS (GSH sepharose antes de la elución). Se
desarrolló la inmunotransferencia con los anticuerpos peptídicos
purificados por afinidad contra el terminal C de hsGC\alpha1
descrito anteriormente. Las flechas a la derecha indican las bandas
específicas de hsGC\alpha1 con etiqueta de GST
(GST-hsGC\alpha1) y hsGC\alpha1 sin etiqueta de
GST (hsGC\alpha1).
La Figura 15 presenta la purificación de
hsGC\alpha1/\beta1 procedente de las células Sf9 que se
infectaron conjuntamente con los baculovirus modificados
genéticamente que contienen ADNc de hsGC\alpha1 con etiqueta de
GST (= glutatión-S-ADNc transferasa
de Schistosoma japonicum) y ADNc de hsGC\beta1 sin etiqueta
de GST en un gel de SDS-poliacrilamida teñido con
azul brillante R250 de Coomassie. El lisado celular de estas células
Sf9 infectadas (lisado) se incubó con glutatión sepharose 4B y el
sobrenadante cargado tras la fijación (sobrenadante tras la
fijación). Se lavó dos veces la glutatión sepharose 4B y se cargaron
los respectivos sobrenadantes de este tampón de lavado (lavado 1 y
2). En una muestra, se eluyó el enlace
GST-hsGC\alpha1/\beta1 por incubación con
glutatión reducido y se cargó (elución con glutatión). En las demás
muestras, se lavó la glutatión sepharose con el tampón para la
escisión de trombina (sin trombina) y se cargó el sobrenadante de
este tampón (lavado 3). A continuación, se eluyó el dímero
hsGC\alpha1/\beta1 por incubación con diferentes cantidades de
trombina y se cargaron los eluidos (elución con
0,25-1 U/ml de trombina) [U = unidad]. Se utilizó la
misma cantidad relativa de cada una de las muestras. Las bandas
visibles con diferentes métodos de elución están indicadas a la
derecha: GST-hsGC\alpha1 = hsGC\alpha1 con
etiqueta de GST; hsGC\alpha1 = hsGC\alpha1 sin etiqueta de GST;
hsGC\beta1 = hsGC\beta1 sin etiqueta de GST. A la izquierda
están los pesos moleculares estándar cargados en el gel, cuyo tamaño
(en kDa) está indicado en la parte más a la izquierda.
La Figura 16 presenta la construcción de los
vectores hsGC adenovíricos recombinados. Se insertaron los ADNc de
hsGC\alpha1 y hsGC\beta1 (barras grises) en el plásmido pZS2 de
transferencia adenovírico, que tiene una deleción en la zona E1 del
adenovirus (\DeltaE1) y un único punto XbaI en este plásmido. Esto
fue el resultado en los plásmidos hsGC\alpha1-pZS2
y hsGC\beta1-pZS2, respectivamente.
hsGC\alpha1-pZS2 y
hsGC\beta1-pZS2 se cortaron con el enzima de
restricción XbaI (barra media, indicada como "sGCpZS2") se
ligaron en el punto XbaI del brazo largo (barra superior,
"RR5") de Ad5. Esto produjo los adenovectores
Ad5CMVhsGC\alpha1 y Ad5CMVhsGC\beta1, respectivamente (barra
inferior, "Ad 5 CMV sGC") en el que los ADNc de sGC se sitúan
bajo el control del activador de CMV y del potenciador de CMV (CMV =
citomegalovirus).
La Figura 17 presenta el estímulo de la actividad
de la sGC por SNP 100 \muM (nitroprusida sódica) en células
EA.hy926 que se infectaron conjuntamente con adenovirus de hsGC
tanto Ad5CMVhsGC\alpha1 como Ad5CMVhsGC\beta1 (muestras A a C) y
en células EA.hy926 no infectadas (muestra D). La cantidad de GMPc
en pmol formada por mg de proteína por minuto se representa en el
eje Y. Las barras negras representan la formación basal de GMPc sin
estímulo de SNP y las barras claras representan la formación de GMPc
con estímulo de SNP.
La Figura 18 presenta la secuencia de ADN de la
guanililciclasa \alpha1 humana soluble (hsGC\alpha1); SEC. ID
nº: 1.
La Figura 19 presenta la secuencia de aminoácidos
de la guanililciclasa \alpha1 humana soluble (hsGC\alpha1); SEC.
ID nº: 2.
La Figura 20 presenta la secuencia de ADN de la
guanililciclasa \beta1 humana soluble (hsGC\beta1); SEC. ID nº:
3.
La Figura 21 presenta la secuencia de aminoácidos
de la guanililciclasa \beta1 humana soluble (hsGC\beta1); SEC.
ID nº: 4.
La Figura 22 presenta la secuencia de aminoácidos
del péptido que se utilizó para la producción de anticuerpos contra
la guanililciclasa \alpha1 soluble humana (hsGC\alpha1)
(corresponde a los aminoácidos 634 a 647 de hsGC\alpha1); SEC. ID
nº: 5.
La Figura 23 presenta la secuencia de aminoácidos
del péptido que se utilizó para la producción de anticuerpos contra
la guanililciclasa \beta1 soluble humana (hsGC\beta1)
(corresponde a los aminoácidos 593 a 614 de hsGC\beta1); SEC. ID
nº: 6.
La Figura 24 presenta la secuencia de ADN del par
cebador de PCR para la guanililciclasa \alpha1 humana soluble
(hsGC\alpha1). El cebador superior (corresponde a los nucleótidos
524 a 541 de la secuencia del ADNc de hsGC\alpha1 con el punto de
restricción BamHI añadido); SEC. ID nº: 7. El cebador inferior
(corresponde a los nucleótidos 1249 a 1232 de la secuencia de ADNc
de hsGC\alpha1 [etiqueta sin codificación]); SEC. ID nº: 8.
La Figura 25 presenta la secuencia de ADN del par
cebador de PCR para la guanililciclasa \beta1 humana soluble
(hsGC\beta1). El cebador superior (corresponde a los nucleótidos
89 a 106 de la secuencia del ADNc de hsGC\beta1 con el punto de
restricción BamHI añadido); SEC. ID nº: 9. El cebador inferior
(corresponde a los nucleótidos 629 a 711 de la secuencia de ADNc de
hsGC\beta1 [etiqueta sin codificación]); SEC. ID nº: 10
La Figura 26 presenta el estímulo de la actividad
de la sGC por SNP 100 \muM (nitroprusida sódica) en células ECV
304 que se habían infectado conjuntamente con diferentes cantidades
de adenovirus de hsGC tanto Ad5CMVhsGC\alpha1 como
Ad5CMVhsGC\beta1 (muestras 1 a 6) y en células ECV 304 no
infectadas (muestra 7). La cantidad de GMPc formada por mg de
proteína por minuto se representa en el eje Y. Las barras oscuras
representan la formación de GMPc basal sin estímulo de SNP y las
barras claras representan la formación de GMPc con estímulo de
SNP.
La Figura 27 presenta el estímulo de la actividad
de la sGC por SNP 100 \muM (nitroprusida sódica) en células A10
que se habían infectado conjuntamente con diferentes cantidades de
adenovirus de hsGC tanto Ad5CMVhsGC\alpha1 como Ad5CMVhsGC\beta1
(muestras 1 a 6) y en células A10 no infectadas (muestra 7). La
cantidad de GMPc formada por mg de proteína por minuto se representa
en el eje Y. Las barras oscuras representan la formación de GMPc
basal sin estímulo de SNP y las barras claras representan la
formación de GMPc con estímulo de SNP.
La Figura 28 presenta el estímulo de la actividad
de la sGC por SNP 100 \muM (nitroprusida sódica) en células ECV
304 que se habían infectado conjuntamente con 5 \times 10^{10}
de cada uno de los adenovirus de hsGC Ad5CMVhsGC\alpha1 y
Ad5CMVhsGC\beta1 y a continuación se recogieron a diferentes
puntos de tiempo así como la actividad en las células ECV 304 no
infectadas. El intervalo de tiempo de la recogida, en días tras la
infección (0, sin infección) se representa en el eje X. La cantidad
de GMPc formada por mg de proteína por minuto se representa en el
eje Y. Las barras oscuras representan la formación de GMPc basal sin
estímulo de SNP y las barras claras representan la formación de GMPc
con estímulo de SNP.
La Figura 29 presenta el estímulo de la actividad
de la sGC por SNP 100 \muM (nitroprusida sódica) en células A10
que se habían infectado conjuntamente con 5 \times 10^{10} de
cada uno de los adenovirus de hsGC Ad5CMVhsGC\alpha1 y
Ad5CMVhsGC\beta1 y a continuación se recogieron a diferentes
puntos de tiempo así como la actividad en las células A10 no
infectadas. El punto de tiempo de la recogida, en días tras la
infección (0, sin infección) se representa en el eje X. La cantidad
de GMPc formada por mg de proteína por minuto se representa en el
eje Y. Las barras oscuras representan la formación de GMPc basal sin
estímulo de SNP y las barras claras representan la formación de GMPc
con estímulo de SNP.
La Figura 30 presenta la detección de subunidades
de sGC en células E304 y células A10, respectivamente, que habían
sido infectadas conjuntamente con 5 \times 10^{10}de cada uno de
los adenovirus de hsGC Ad5CMVhsGC\alpha1 y Ad5CMVhsGC\beta1
durante dos días en una inmunotransferencia de proteínas con los
anticuerpos peptídicos contra hsGC\alpha1 y hsGC\beta1 descritos
anteriormente. Banda 1, hsGC purificada (según la Figura 12); banda
2, células ECV 304 con transferencia génica de hsGC; banda 3,
células A10 con transferencia génica de hsGC; banda 4, hsGC
purificada (según la Figura 12).
1.) Se identificaron los clones de ADNc
descritos en la bibliografía como sGC\alpha3 y sGC\beta3 como
homólogos humanos de los sGC\alpha1 y sGC\beta1 bovino y de
rata, y en lo sucesivo se denominaron sGC\alpha1 humano
(hsGC\alpha1) y sGC\beta1 humano (hsGC\beta1). Según el
conocimiento actual, esta isoforma sGC\alpha1/\beta1 es
farmacológicamente más importante debido a su función en el sistema
cardiovascular. Debido a que se examinó el clon original de
hsGC\alpha3, se podría demostrar que hsGC\alpha1 y hsGC\alpha3
no existen en paralelo sino más bien solo en la forma hsGC\alpha1.
Por lo tanto, se ha identificado una proteína diana obvia para el
examen farmacológico colectivo y la genoterapia.
2.) Con los procedimientos descritos en la
presente invención, se ha obtenido por primera vez una expresión
funcional y activa de la sGC humana. Por lo tanto, la respectiva
proteína se puede producir por primera vez mediante procedimientos
genéticos.
3.) Mediante la utilización de los anticuerpos
peptídicos contra sGC de la presente invención, es posible
determinar la expresión de sGC en tejidos humanos así como
diagnosticar enfermedades disfuncionales (si la expresión de sGC es
demasiado alta, demasiado baja o ausente). Además, la presente
invención proporciona los prerrequisitos técnicos necesarios para
aclarar más el control de la transcripción y la traducción de hsGC.
Los anticuerpos peptídicos de la invención tienen la ventaja de que
son monoespecíficos, dirigidos a la secuencia humana y que se ha
demostrado su idoneidad para las inmunotransferencias en tejidos
humanos. Otros anticuerpos peptídicos presentan estas
características solo en parte: Harteneck et al. y Guthmann
et al. utilizaron una secuencia peptídica
(VYKVETVGDKYMTVSGLP) que está relativamente muy conservada en las
guanililciclasas. Por lo tanto, sería de esperar la reacción cruzada
con guanililciclasas en forma de partículas (p. ej.
GC-C). Además, Guthmann et al. utilizó una
secuencia de péptidos (YG
PEVWEDIKKEA) idéntica a hsGC\beta1 y una secuencia peptídica idéntica a hsGC\alpha1 excepto para dos intercambios de aminoácidos (KKDVEEANANFLGKASGID), pero la función de estos anticuerpos en la inmunotransferencia solo ha sido demostrada para hsGC enriquecida procedente de plaquetas humanas. Además, estos anticuerpos contra hsGC\alpha1 reconocieron un segundo producto no específico. Humbert et al. y Koesling et al. utilizaron una secuencia de péptidos (SRKNTGTEETEQDEN) de sGC\beta1 bovino que en parte (aminoácidos 1 a 10) es idéntica al péptido utilizado en la presente memoria (aminoácidos 13 a 22) para hsGC\beta1, aunque el terminal C (aminoácidos 11 a 15) se diferencian notablemente de los de la secuencia humana. El antisuero contra este péptido, sin embargo, no ha sido ensayado en la proteína humana y solamente ha sido utilizado para la inmunoprecipitación de la sGC bovina.
PEVWEDIKKEA) idéntica a hsGC\beta1 y una secuencia peptídica idéntica a hsGC\alpha1 excepto para dos intercambios de aminoácidos (KKDVEEANANFLGKASGID), pero la función de estos anticuerpos en la inmunotransferencia solo ha sido demostrada para hsGC enriquecida procedente de plaquetas humanas. Además, estos anticuerpos contra hsGC\alpha1 reconocieron un segundo producto no específico. Humbert et al. y Koesling et al. utilizaron una secuencia de péptidos (SRKNTGTEETEQDEN) de sGC\beta1 bovino que en parte (aminoácidos 1 a 10) es idéntica al péptido utilizado en la presente memoria (aminoácidos 13 a 22) para hsGC\beta1, aunque el terminal C (aminoácidos 11 a 15) se diferencian notablemente de los de la secuencia humana. El antisuero contra este péptido, sin embargo, no ha sido ensayado en la proteína humana y solamente ha sido utilizado para la inmunoprecipitación de la sGC bovina.
Además de los péptidos presentados en las Figuras
22 y 23 y sus fragmentos inmunógenos para la producción de los
anticuerpos contra hsGC\alpha1 o hsGC\beta1 en conejos de la
presente invención, es posible la producción de anticuerpos
monoclonales y policlonales contra la proteína
hsGC\alpha1/\beta1 en conjunto o sus productos de escisión. Se
pueden utilizar varias especies animales (preferentemente ratón,
rata o conejo) para la producción de estos anticuerpos.
4.) Mediante la utilización del sistema de
expresión de baculovirus/Sf9 eucariótico de la presente invención,
se puede producir guanililciclasa \alpha1/\beta1 humana soluble
en grandes cantidades. La unión de una secuencia de nucleótidos que
codifica un polipéptido adecuado por cromatografía por afinidad
(etiqueta de afinidad, p. ej.
glutatión-S-transferasa = etiqueta
de GST) con un punto de escisión de la proteasa unida al terminal N
del ADNc de la subunidad \alpha1 permite la purificación rápida y
sencilla de la proteína dimérica co-expresada por
medio de una sola etapa cromatográfica de afinidad. La etiqueta
unida por afinidad se separa posteriormente por digestión con una
proteasa. De este modo, se obtiene una proteína idéntica en
estructura primaria a la proteína natural. Esta purificación
revolucionaria, rápida y limpia da grandes cantidades de sGC
funcional humana, muy pura con nuevas posibilidades para un examen
colectivo para activadores específicos e inhibidores así como para
la caracterización farmacológica de fármacos potenciales. La
purificación de hsGC\alpha1/\beta1 también se puede realizar por
cromatografía de intercambio iónico, filtración en gel,
cromatografía por inmunoafinidad y otros procedimientos
cromatográficos, p. ej. en ATP-, GTP-, GMPc- o
sepharose-azul, y otros medios cromatográficos
similares.
5.) Se puede utilizar también el procedimiento de
la presente invención para otras isoformas de la enzima humana, de
rata y bovina de idéntica manera. En el procedimiento proporcionado
en la presente invención, se pueden utilizar varias etiquetas de
afinidad (p. ej. oligómero de histidina) y diferentes sistemas de
expresión (p. ej. E. coli). Se pueden utilizar también otras
partes de las secuencias de hsGC\alpha1 y hsGC\beta1 para la
producción de anticuerpos contra péptidos o de la proteína
completa.
6.) La disponibilidad de elevadas cantidades de
una proteína humana aislada con gran pureza y gran calidad resulta
esencial para el desarrollo farmacéutico moderno. Hasta ahora, este
requisito no se cumplía en la búsqueda de alternativas para los
donantes de NO clásicos. El examen colectivo de activadores o
inhibidores específicos en el ensayo animal es demasiado caro y no
tendría sentido debido a las diferencias de las especies, posibles
efectos secundarios y efectos sobre otras isoformas. Los sistemas de
cultivo celular adolecen del inconveniente de requerir esfuerzos
adicionales sustanciales para determinar precisamente en qué punto
dentro de las cascadas de señalización actúan las sustancias.
Además, el cultivo celular resulta caro y problemático. Comparado
con la expresión de una proteína que utiliza tecnología de ADN
recombinado, la purificación de una proteína a partir de tejidos
animales es una labor más intensa y produce menores rendimientos. En
particular, los resultados de un examen farmacológico se pueden
generalizar solamente en una medida limitada debido a las
diferencias entre las especies. En cambio, los procedimientos de la
presente invención proporcionan hsGC\alpha1/\beta1 recombinada,
económica en grandes cantidades y las predicciones inequívocas que
se refieren a la modulación, activación o inhibición de esta enzima
humana particular se pueden hacer a partir de un procedimiento de
identificación. Las diferencias de las especies y la falta de
aplicabilidad en el hombre están excluidas a priori por la
utilización de una enzima humana.
Además, hsGC está disponible de este modo en
grandes cantidades y pureza adecuada para la cristalización y
clarificación de esta estructura. Por lo tanto, mediante el modelado
molecular se cumple un importante prerrequisito para el diseño de un
fármaco racional.
7.) Además de la utilización de
hsGC\alpha1/\beta1 aislado, se pueden utilizar en experimentos
in vitro células Sf9 intactas descritas en la presente
memoria que expresan hsGC\alpha1/\beta1 que se infectan con
baculovirus recombinados.
8.) Se puede conseguir una sobreexpresión
transitoria (p. ej., con vectores adenovíricos) o estable mediante
la transferencia génica. De este modo, el nivel de GMPc se puede
elevar aún a baja concentración de NO o en el caso de poca
activación de sGC debida a la formación de peroxinitrito. Este
enfoque también presenta ventajas de concepto en comparación con la
transferencia génica de NOS (NO sintetasa). Debido a la formación de
peroxinitrito citotóxico, que es menos eficaz para activar sGC, se
supera con el enfoque de la presente invención. Además, se puede
conseguir un aumento permanente del nivel de GMPc (p. ej. con fines
terapéuticos) independientemente de NOS, NO, donantes de NO o
moduladores de sGC por transferencia génica de la sGC mutada con
elevada actividad basal.
9.) Además del procedimiento de purificación de
hsGC\alpha1/\beta1 descrito en esta memoria, la purificación a
partir de células Sf9 es también posible después de la infección con
los baculovirus descritos que contienen ADNc de hsGC\alpha1 o
hsGC\beta1 si se realiza la infección conjunta con baculovirus de
hsGC\alpha1 sin etiqueta de GST (etiqueta de GST = secuencia de
glutatión-S-transferasa adjunta
procedente de Schistosoma japonicum) y baculovirus de
hsGC\beta1 que tienen una etiqueta de GST así como con baculovirus
de hsGC\alpha1 que tienen una etiqueta de GST y baculovirus de
hsGC\beta1 que tienen una etiqueta de GST.
Además, es posible la utilización de una columna
que contiene glutatión sepharose 4B además de la utilización de
glutatión sepharose 4B sola en una etapa discontinua.
La purificación se puede realizar también
digiriendo la proteína de fusión dimérica
GST-hsGC\alpha1/\beta1 con trombina después de
la elución de la proteína de fusión de la glutatión sepharose 4B con
glutatión reducido. Después de la diálisis (para eliminar el
glutatión reducido) la etiqueta de GST que se ha escindido de la
proteína se puede separar de la mezcla por cromatografía por
afinidad adicional en glutatión sepharose 4B.
10.) El procedimiento de la presente invención se
puede utilizar también para la guanililciclasa \alpha2 humana
soluble (GeneBank: x63282) y cualquier homólogo humano
potencialmente existente de la guanililciclasa \beta2 soluble (de
rata; GeneBank: m57507) así como para otras guanililciclasas
solubles (en todas las variaciones técnicas descritas en la presente
invención).
11.) Utilizando la transferencia génica
adenovírica, somática de hsGC\alpha1 o hsGC\beta1 por medio de
infección conjunta con Ad5CMVhsGC\alpha1 o Ad5CMVhsGC\beta1,
respectivamente, se demostró en células endoteliales (ECV 304) y
músculo liso (A10) que la actividad de sGC intracelular medida como
contenido en GMPc después del estímulo de sGC con SNP aumentó desde
niveles indetectables (\leq 100 pmol/mg/min) hasta valores mayores
de 12 veces. Se determinó la concentración óptima, respecto de la
cantidad de adenovirus (pfu) así como una relación equimolar de
ambos adenovirus (basada en pfu), correspondiente a la estructura
homodimérica de la enzima. Este efecto sobre la actividad de sGC
intracelular fue todavía detectable 15 días tras una sola infección,
periodo suficiente para las aplicaciones deseadas.
Los ejemplos ilustran la presente invención.
Se secuenció de nuevo el clon original de las
isoformas sGC\alpha3 y sGC\beta3 humanas (Giuli et al.,
1992). Aunque se confirmó la secuencia del clon sGC\beta3 (véase
SEC. ID nº: 3 y la Figura 20), el secuenciado de sGC\alpha3
demostró que la publicación original (Giuli et al., 1992)
contenía 19 errores de secuenciado, que se resumen en la Figura 3.
La secuencia correspondiente de \alpha3-ADNc
corregida se presenta en la SEC. ID nº: 1 y en la Figura 18. La
secuencia de aminoácidos deducida se presenta en la SEC. ID nº: 2 y
en la Figura 19. Además, la secuencia corregida (véase SEC. ID nº: 1
y Figura 18) es idéntica a la secuencia sGC\alpha1 humana
publicada en el GeneBank (nº de registro U58855), por lo que la zona
5' no traducida de la secuencia proporcionada en esta memoria es 506
pares de bases más larga. Por consiguiente, "sGC\alpha3" está
clasificada actualmente como sGC\alpha1 humana (hsGC\alpha1).
Así pues, se demostró que dos subunidades de hsGC\alpha diferentes
\alpha1 y \alpha3 no existen en el hombre, lo que podría ser
importante para la investigación particular pero mejor (por analogía
con la situación en los tejidos bovino y de rata) solamente
hsGC\alpha1.
| Subunidades de sGC humana | ||
| \alpha | \beta | |
| isoforma 1 | ADNc y proteína detectable | ADNc y proteína detectable |
| activo, cuando se expresa conjuntamente | ||
| isoforma 2 | ADNc detectable | |
| activo, cuando se expresa junto con \beta1 bovina |
Se demostró la expresión de ARNm de sGC\alpha1
y sGC\beta1 en tejidos humanos por medio de PCR (Figura 4). La
amplificación de un fragmento de hsGC\beta1 con un par cebador de
PCR (5'-AAAAGGATCCATGTACGGATTTGT
GAAT-3' = nucleótidos 89 a 106 de la secuencia de ADNc de hsGC\beta1 con el punto de restricción añadido; 5'-ATGCGTGATTCCTGGGTACC-3' = 692 a 711 de la secuencia de ADNc de hsGC\beta1) con una temperatura de hibridación de 54ºC produjo una banda específica en cada uno de los bancos de ADNc del cerebro, corazón, riñón, pulmón, páncreas y músculo esquelético. Se confirmó la identidad del fragmento ampliado por secuenciado. La amplificación de un fragmento de hsGC\alpha1 con un par cebador de PCR (5'-AAAAGGATCCATGTTCTGCACGAAGCTC-3' = nucleótidos 524 a 541 de la secuencia de ADNc de hsGC\alpha1 con el punto de restricción añadido; 5'-ATTATGGAAG
CAGGGAGG-3' = 1249-1232 de la secuencia del ADNc de hsGC\alpha1) con una temperatura de hibridación de 54ºC dio como resultado una banda específica en cada una de las librerías de ADNc del corazón (Figura 4A) y pulmón (no mostrada). En cada caso, el secuenciado de los fragmentos dio como resultado la secuencia de hsGC\alpha1 corregida; y no se observó la secuencia de "hsGC\alpha3" publicada por Giuili et al.. Así pues, se demostró que en el hombre, solo existe una hsGC\alpha1/\beta1 y que la hsGC\alpha3/\beta3 potencial es el resultado de errores de secuenciado. Esto dio como resultado una fotografía clara en lo que se refiere a la investigación cardiovascular cuya isoforma de sGC sería la proteína objetiva para la identificación farmacológica.
GAAT-3' = nucleótidos 89 a 106 de la secuencia de ADNc de hsGC\beta1 con el punto de restricción añadido; 5'-ATGCGTGATTCCTGGGTACC-3' = 692 a 711 de la secuencia de ADNc de hsGC\beta1) con una temperatura de hibridación de 54ºC produjo una banda específica en cada uno de los bancos de ADNc del cerebro, corazón, riñón, pulmón, páncreas y músculo esquelético. Se confirmó la identidad del fragmento ampliado por secuenciado. La amplificación de un fragmento de hsGC\alpha1 con un par cebador de PCR (5'-AAAAGGATCCATGTTCTGCACGAAGCTC-3' = nucleótidos 524 a 541 de la secuencia de ADNc de hsGC\alpha1 con el punto de restricción añadido; 5'-ATTATGGAAG
CAGGGAGG-3' = 1249-1232 de la secuencia del ADNc de hsGC\alpha1) con una temperatura de hibridación de 54ºC dio como resultado una banda específica en cada una de las librerías de ADNc del corazón (Figura 4A) y pulmón (no mostrada). En cada caso, el secuenciado de los fragmentos dio como resultado la secuencia de hsGC\alpha1 corregida; y no se observó la secuencia de "hsGC\alpha3" publicada por Giuili et al.. Así pues, se demostró que en el hombre, solo existe una hsGC\alpha1/\beta1 y que la hsGC\alpha3/\beta3 potencial es el resultado de errores de secuenciado. Esto dio como resultado una fotografía clara en lo que se refiere a la investigación cardiovascular cuya isoforma de sGC sería la proteína objetiva para la identificación farmacológica.
Para verificar que hsGC\alpha1 y hsGC\beta1
pueden formar una proteína sGC heterodimérica, funcional, se
insertaron ambos ADNc en baculovirus. Utilizando estos baculovirus,
la proteína recombinada se expresó bajo el control del activador
fuerte de polihedrina en células de insectos (células Sf9). Para la
producción de baculovirus recombinantes, se utilizaron el vector
pVL1393 de transferencia al baculovirus (Pharmingen, San Diego,
California, USA; Figura 5) y el vector pAcG2T de transferencia al
baculovirus (con la secuencia de
glutatión-S-transferasa procedente
del Schistosoma japonicum y el punto de escisión de la
trombina; Pharmingen; Figura 6) en los que se clonaron los genes
hsGC\alpha1 y hsGC\beta1 extraños, respectivamente. La
transfección conjunta de dicho plásmido pVL1393 o pAcG2T recombinado
con ADN de baculovirus BaculoGold (Pharmingen) permitió el
aislamiento directo de los baculovirus modificados genéticamente con
ADNc de hsGC\alpha1 o hsGC\beta1 formado por recombinación
homóloga a partir del medio de cultivo celular.
En la Figura 7 se muestra esquemáticamente la
construcción de pVL1393-hsGC\beta1 (procedimiento
idéntico para pAcG2T-hsGC\beta1). La zona de
codificación del ADNc de hsGC\beta1 con la zona 3' no traducida
pero sin la zona 5' no traducida se clonó en el pVL1393. Para esto,
se introdujo el punto BamHI por medio de PCR con los cebadores A y B
inmediatamente corriente arriba del codón que codifica la metionina
inicial. El fragmento 1 amplificado de este modo se digerió con
BamHI/KpnI; se aisló el fragmento 2 del clon de ADNc de sGC\beta1
con KpnI/EcoRI. Se ligaron los fragmentos 1 y 2 así como el vector
abierto con BamHI y EcoRI (véase Figura 7).
En la Figura 8 se muestra esquemáticamente la
construcción de pVL1393-hsGC\alpha1 (procedimiento
idéntico para pAcG2T-hsGC\alpha1). La zona de
codificación del ADNc de hsGC\alpha1 con la zona 3' no traducida
pero sin la zona 5' no traducida se clonó en el pVL1393. Para esto,
se introdujo el punto BamHI por medio de PCR con los cebadores C y D
inmediatamente corriente arriba del codón que codifica la metionina
inicial. El fragmento 3 amplificado de este modo se digerió con
BamHI/BsaAI; se aisló el fragmento 4 del clon de ADNc de
sGC\alpha1 con BsaAI/EcoRI. Se ligaron los fragmentos 3 y 4 así
como el vector abierto con BamHI y EcoRI (véase Figura 8).
Para la producción de baculovirus de
hsGC\alpha1 y hsGC\beta1 recombinados, se transfectaron
conjuntamente cada uno de los vectores de transferencia de
baculovirus (pVL1393-hsGC\alpha1,
pAcG2T-hsGC\alpha1,
pVL1393-hsGC\beta1,
pAcG2T-hsGC\beta1) con ADN de baculovirus
(BaculoGold; Pharmingen, San Diego, California, USA) en monocapas de
cultivos celulares de Sf9. Para esto, se cultivaron las células a
27ºC en medio IPL-41 (Gibco) enriquecido con suero
de ternero fetal al 10% (vol/vol) (Biochrom), caldo de cultivo de
triptosa-fosfato al 4% (vol/vol) (Gibco), Pluronic
F68 al 1% (vol/vol) (Gibco), anfotericina B al 0,5% (Gibco), 80
\mug/ml de sulfato de gentamicina (Gibco) y ácido
\delta-aminolevulínico 0,5 mM (Merck). Se
adquirieron clones recombinados de baculovirus de hsGC\alpha1 y
hsGC\beta1 procedentes del medio de cultivo mediante purificación
en placa. Para la producción de soluciones madre del virus con
títulos altos, se infectaron cultivos de Sf9 (0,5 \times 10^{6}
células/ml) en agitación con una M.O.I. (multiplicidad de infección)
de 0,1 pfu/célula (pfu = unidades formadoras de placa) y se
recogieron 6 días después de la infección.
Se determinó la expresión de la proteína
recombinante en células Sf9 en diez de cada uno de los clones de
baculovirus de hsGC\alpha1 y hsGC\beta1 recombinantes. Para
esto, se infectaron cultivos de células monocapa de Sf9 con
baculovirus purificados en placa de hsGC\alpha1 o hsGC\beta1
recombinados, se incubaron a 27ºC durante 5 días, se recogieron con
una espátula para células, se volvieron a poner en suspensión en 0,5
ml de tampón de lisis (TEA 25 mM, pH 7,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, DTT
5 mM, leupeptina 1 \muM, 0,5 mg/l de inhibidor de tripsina) y se
homogeneizaron por tratamiento con ultrasonidos ("Sonifier
250", boquilla "estándar", Branson; 15 veces, "ciclo de
trabajo": 15%, intensidad: 1). Después de la centrifugación de
los homogeneizados a 20.000 \times g se analizó el sobrenadante y
el sedimento por SDS-PAGE. Tres de los clones de
baculovirus de hsGC\beta1 y dos de los clones de baculovirus de
hsGC\alpha1 dieron proteína recombinante en cantidades que eran
visibles en la fracción insoluble por tinción con azul brillante
R250 de Coomassie. sGC\alpha y sGC\beta humanas recombinadas
(GCrhs\alpha y GCrhs\beta) migraron con un peso molecular
aparente de 79,5 (hsGC\alpha1) y 68,5 kDa (hsGC\beta1), que es
muy próximo a los pesos moleculares previstos deducidos de la
secuencia de aminoácidos (77,5 y 70,5 kDa, respectivamente) (clones
representativos en la Figura 9). Los clones de baculovirus que
presentaban la expresión más alta de proteínas recombinadas en la
inmunotransferencia se utilizaron para la expresión de hsGC
funcional heterodimérica [véase los ejemplos 4 a 7].
Para la producción de sGC, GCrhs\alpha1 y
GCrhs\beta1 humanas funcionales heterodiméricas se expresaron
conjuntamente en células de Sf9 con baculovirus recombinados. Para
esto, se infectaron conjuntamente cultivos monocapa de Sf9
[2,5 \times 10^{6} células/placa, \oslash 90 mm; suplementos
véase ejemplo 2] con una M.O.I. (multiplicidad de infección) de 2
pfu/celda de cada baculovirus recombinado (hsGC\alpha1 y
hsGC\beta1; ambas sin etiqueta de GST) y se cultivaron durante 48
horas a 27ºC. Se determinó la actividad basal así como la estimulada
por NO de la sGC en las células midiendo el contenido en GMPc en las
células en presencia de IBMX
(3-isobutil-1-metilxantina)
inhibidor de fosfodiesterasa.
Para la determinación del contenido en GMPc, se
reemplazó el medio de cultivo por tampón de
Krebs-Ringer (KRB; NaCl 119 mM; KCl 4,74 mM;
CaCl_{2} 2,54 mM; MgSO_{4} 1,19 mM; KH_{2}PO_{4} 1,19 mM;
NaHCO_{3} 25 mM; HEPES 10 mM; pH 7,4; BSA al 0,1%) que, además,
contenía IBMX 1 mM. Se incubaron las células durante una hora a
27ºC. A continuación se lavaron las células con KRP enfriado en
hielo y se recogieron en 1 ml de etanol enfriado en hielo (80%) con
una espátula para células. Se homogeneizaron las células mediante
tratamiento con ultrasonidos [véase Ejemplo 3] y se centrifugaron a
20.000 \times g durante 20 minutos. Se secó el sobrenadante en una
secadora al vacío y se volvió a poner en suspensión el residuo en
TEA 25 mM, pH 7,8. Se determinó el contenido en GMPc mediante RIA
(Biotrend).
La expresión conjunta de GCrhs\alpha1 y
GCrhs\beta1 dio como resultado la formación de sGC funcional con
actividad basal en las células Sf9 (Figura 10): Mientras que las
células Sf9 no infectadas contenían aproximadamente 0,1 pmol de
GMPc/10^{6} células (no mostrado), se observó aproximadamente 20
pmol de GMPc/10^{6} células en las células que expresan a GCrhs
(Figura 10). Esta actividad basal de hsGC aumentó por un donante de
NO, SNP (nitroprusida sódica). Cuando se incubaron las células con
10, 100 ó 1000 \muM de SNP durante 2 minutos antes de la recogida,
el contenido en GMPc aumentó en función de la concentración hasta
más de 50 veces (Figura 10).
Se determinó la actividad de la hsGC recombinada
(después de la expresión con baculovirus recombinados descritos
anteriormente) no sólo en las células Sf9 intactas sino también en
los extractos de células Sf9. Para la producción de dichos
extractos, se infectaron conjuntamente cultivos de Sf9 [2 \times
10^{6} células/ml; suplementos véase Ejemplo 2] en agitación con
una M.O.I. (multiplicidad de infección) de 1 pfu/célula de cada
virus (hsGC\alpha1 y hsGC\beta1; ambos sin etiqueta de GST) y se
incubaron a 27ºC. Se tomaron muestras (4 ml) a las 0, 24, 48, 72, 96
y 118 horas tras la infección, se sedimentaron las células, se
volvieron a poner en suspensión en 1 ml de tampón de lisis y se
homogeneizaron por tratamiento con ultrasonidos [véase Ejemplo 3].
Se centrifugaron los homogeneizados a 20.000 \times g durante 15
minutos y se volvió a poner en suspensión el sedimento insoluble en
tampón de lisis. Se ajustaron las muestras al 50% de glicerina
(vol/vol) y se almacenaron a -20ºC. Se determinó la concentración de
proteína por espectrofotometría con el procedimiento normalizado de
Bradford (Bradford, 1976). Se determinó la actividad de sGC por la
formación de [^{32}P]GMPc procedente de
[\alpha^{32}P]GTP (Schulz y Böhme, 1984). Las reacciones
contenían TEA 50 mM (pH 7,4), MgCl_{2} 3 mM, DTT 3 mM, IBMX 1 mM,
GMPc 1 mM, fosfato de creatina 5 mM, 0,25 mg/ml de creatina cinasa y
GTP 500 \muM en un volumen total de 100 \mul. Después de la
incubación a 37ºC durante 10 minutos, se interrumpió la reacción por
adición simultánea de un extracto celular y de los activadores SNP,
CO o YC-1 de sGC. Se midió la [^{32}P]GMPc
formada tal como se describió (Schultz y Böhme, 1984).
La actividad basal de GCrhs (es decir la
formación de GMPc por GCrsh sin activación de la enzima por adición
de NO u otros activadores), principalmente observada en la fracción
celular de Sf9 soluble (Figura 11A), alcanzó su máximo 72 horas
después de la infección de las células y aumentó hasta 5 veces con
SNP 100 \muM (Figura 11A). La fracción del precipitado no contenía
actividad de sGC basal mensurable en ningún punto de tiempo; aunque
en presencia de SNP se observó un grado bajo de actividad de sGC
(Figura 11B).
YC-1
(3-(5'-hidroximetil-2'-furil)-1-bencilindazol)
y ODQ
(1H-[1,2,4]oxadiazol[4,3-a]quinoxalin-1-on)
son sustancias que se describieron para influenciar específicamente
en la actividad de sGC. Así pues, se investigó si esto también se
mantiene cierto para GCrhs.
Después de la expresión con los baculovirus
recombinantes (sin etiqueta de GST) descritos anteriormente, se
activó GCrhs en células Sf9 intactas por YC-1. Se
observó también el efecto potenciador de NO: el contenido en GMPc de
las células que expresan GCrhs aumentó 3,4 veces por incubación con
YC-1 10 \muM durante 2 minutos (Figura 10A).
YC-1 100 \muM tuvo el mismo efecto (Figura 10A).
Cuando se trataron las células simultáneamente con
YC-1 y SNP 100 \muM, se duplicaron las
concentraciones de GMPc en comparación con las concentraciones de
GMPc después del estímulo con SNP solo (Figura 10A). Se obtuvieron
resultados similares con GCrhs en los extractos celulares. ODQ se
describe como un inhibidor selectivo de sGC estimulado por NO que,
sin embargo, no inhibe la actividad basal (Garthwaite et al.,
1995). En las células Sf9 que expresan GCrhs (después de la
expresión con los baculovirus recombinados descritos anteriormente,
sin etiqueta de GST), ODQ no tuvo influencia en las concentraciones
basales de GMPc; el estímulo de GCrhs en las células intactas con
SNP, sin embargo, fue inhibido por la incubación simultánea con ODQ
(Figura 10B).
Para la purificación de hsGC\alpha1/\beta1
humana recombinada en las células Sf9, se utilizó un baculovirus
recombinado [véase Ejemplo 2] en el que se forma una proteína de
fusión compuesta por hsGC\alpha1 y unida a GST [denominada
etiqueta de GST, GST =
glutatión-S-transferasa de
Schistosoma japonicum; véase Ejemplo 2]. Utilizando esta
etiqueta de GST, que se une a glutatión con gran afinidad, se puede
realizar la cromatografía por afinidad específica en la glutatión
sepharose 4B (Pharmacia, Freiburg, Alemania). Las células Sf9
infectadas conjuntamente con baculovirus de hsGC\alpha1 (con
etiqueta de GST) y baculovirus de hsGC\beta1 (sin etiqueta de GST)
se lisaron en trietanolamina 25 mM pH 7,8 / EDTA 1 mM / DTT 5 mM /
leupeptina 1 \muM / 0,5 \mug/ml de inhibidor de tripsina / PMSF
0,2 mM (30 min de lisis hipotónica a 4ºC. Tras la adición de NaCl
(concentración final 75 mM, se centrifugó el homogeneizado a 75.000
\times g durante 1 hora a 4ºC. Se mezcló el sobrenadante con la
GSH sepharose 4B durante 1 hora a temperatura ambiente. La glutatión
sepharose 4B se sedimentó a continuación por centrifugación a 500
\times g durante 5 minutos y se eliminó el sobrenadante. Un
volumen de 10 veces de Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) /
NaCl 150 mM / CaCl_{2} 2,5 mM / 2-mercaptoetanol
al 0,1% se añadió a la glutatión sepharose 4B y se mezcló durante 1
minuto. Se volvió a centrifugar la mezcla a 500 \times g durante 5
minutos. Se eliminó el sobrenadante y la glutatión sepharose 4B se
lavó de nuevo de la misma manera. Para eluir de la sepharose, la
proteína hsGC\alpha1 (sin la hsGC\beta1 unida) fue escindida por
la trombina de la etiqueta de GST, que permanecía unida a la
glutatión sepharose 4B en el punto de escisión específico. Se
realizó la digestión con trombina en Tris-HCl 50 mM
(pH 8,0) / NaCl 150 mM / CaCl_{2} 2,5 mM /
2-mercaptoetanol al 0,1% con 0:25 a 1 unidades de
tampón de trombina/ml durante 1 ó 3 horas a temperatura ambiente. La
glutatión sepharose 4B (con la etiqueta de GST) se sedimentó de
nuevo por centrifugación a 500 \times g durante 5 minutos y se
eliminó el sobrenadante que contenía la hsGC\alpha1/\beta1. Se
realizó otro procedimiento de elución añadiendo
Tris-HCl 50 mM (pH 8,0)/glutatión reducido 5 mM y
mezclando durante 30 minutos a temperatura ambiente. De esta manera,
se separó la hsGC\alpha1/\beta1 con la etiqueta de GST de la
glutatión sepharose 4B. Después de centrifugación a 500 \times g
durante 5 minutos, se eliminó el sobrenadante que contenía la
GST-hsGC\alpha1/\beta1 disuelta.
Por elución con trombina, se consigue una
selectividad doble en una sola etapa cromatográfica por
afinidad:
1.) Solamente proteínas que presenten una
afinidad a glutatión reducido son capaces de unirse.
2.) De estas proteínas, sólo las proteínas que
son escindidas por la trombina se eluirán (como productos de
escisión).
La trombina se puede separar de la muestra en una
columna con p-amino-benzamidina a la
que se une trombina específicamente.
La Figura 12 muestra el enriquecimiento
específico de la actividad de sGC después de la elución de la GSH
sepharose 4B con glutatión comparada con la actividad en el lisado
de células Sf9 infectadas.
La Figura 14 muestra la unión de
GST-hsGC\alpha1 a glutatión sepharose 4B y la
escisión de hsGC\alpha1 de la etiqueta de GST por trombina en una
inmunotransferencia.
La Figura 15 muestra la purificación de
hsGC\alpha1 expresada conjuntamente con la etiqueta de GST y
hsGC\beta1 sin la etiqueta de GST por afinidad cromatográfica en
glutatión sepharose 4B en un gel de
SDS-poliacrilamida teñido con azul brillante R250 de
Coomassie. En la elución con glutatión reducido, sólo eran visibles
dos bandas, que corresponden a GST-hsGC\alpha1
(producto mayor) y hsGC\beta1 (producto más pequeño) (detectadas
en una inmunotransferencia). Después de la elución con trombina
(0,25, 0,5 ó 1 unidad/ml durante tres horas a temperatura ambiente),
sin embargo, la banda inferior fue idéntica (hsGC\beta1; peso
molecular estimado según la migración en el gel de aproximadamente
70 kDa), mientras que la banda superior fue significativamente más
pequeña comparada con la elución con glutatión (hsGC\alpha1; peso
molecular estimado de aproximadamente 80 kDa) debido a que la
etiqueta de GST se escindió por la utilización de la elución de
trombina. Esto corresponde aproximadamente a los pesos moleculares
de 77,5 kDa para hsGC\alpha1 y de 70,5 kDa para hsGC\beta1
deducidas de las secuencias de aminoácidos. En contraste con la
elución con glutatión reducido, una banda adicional muy pequeña de
aproximadamente 25 kDa fue visible tras la elución de la trombina,
que probablemente es la propia trombina. La trombina se puede
separar del eluido por medio de una columna con aminobenzamidina
sepharose a la que se une la trombina específicamente. No se
detectaron bandas adicionales en este experimento.
Se obtuvieron antisueros por inmunización de
conejos con péptidos sintéticos correspondientes a las secuencias de
hsGC\alpha1
(Phe-Thr-Pro-Arg-Ser-Arg-Glu-Glu-Leu-Pro-Pro-Asn-Phe-Pro
[Figura 22/SEC. ID nº: 5]; aminoácidos 634 a 647) y de hsGC\beta1
(Lys-Gly-Lys-Lys-Glu-Pro-Met-Gln-Val-Trp-Phe-Leu-Ser-Arg-Lys-Asn-Thr-Gly-Thr-Glu-Glu-Thr
[Figura 23/SEC. ID nº: 6] aminoácidos 593-614) que
se acoplaron a KLH (hemocianina de la lapa de ojo de cerradura)
mediante un terminal C adicional (\alpha1) o un residuo de
cisteína N-terminal (\beta1). Se purificaron los
antisueros por afinidad con los correspondientes péptidos acoplados
a sepharose activada por epoxi (Pharmacia, Freiburg, Alemania) según
las instrucciones del fabricante.
Se obtuvo tejido de pulmón humano de un área
exenta de tumor de una resección pulmonar y la corteza cerebral
humana y el cerebelo procedían de una autopsia normal. Se congelaron
inmediatamente todos los tejidos en nitrógeno líquido y se
almacenaron a -70ºC. Se homogeneizaron los tejidos congelados en un
mortero y se concentraron al doble, se añadió tampón de terminación
SDS caliente (Tris-HCl 130 mM, pH 6,8 / glicerol al
16% [v/v] / SDS al 4% [p/v] / azul de bromofenol al 0,025% [p/v] /
2-mercaptoetanol al 6,5% [v/v]) al polvo. Se incubó
esto a 95ºC durante 10 minutos y a continuación se centrifugó a
20.000 \times g durante 20 minutos. Se utilizó el sobrenadante
para la inmunotransferencia (para anticuerpos utilizados, véase
anteriormente).
La expresión de ambas subunidades (\alpha1 y
\beta1) se detectó en los tres tejidos (Figura 13). En cambio, no
se pudo detectar la expresión en el riñón, el hígado y el páncreas
(datos no mostrados).
Se aislaron los ADNc para hsGC\alpha1 y
hsGC\beta1 del plásmido original con la enzima de restricción
EcoRI como fragmentos de 3,0 kb (hsGC\alpha1) y 2,4 kb
(hsGC\beta3). Se insertó cada fragmento en los puntos de
restricción EcoRI del plásmido pZS2 de transferencia adenovírico
(Figura 16), que contiene una secuencia de tipo 5 de adenovirus
(Ad5) con una deleción en la zona E1 (\DeltaE1), seguido de una
casete de expresión con un activador/potenciador de CMV
(citomegalovirus) y un único punto de restricción XbaI.
hsGC\alpha1-pZS2 y
hsGC\beta1-pZS2 digeridos con XbaI se insertaron
en el punto del XbaI del brazo largo (RR5) de Ad5 (Figura 16). Los
vectores Ad5CMVhsGC\alpha1 y Ad5CMVhsGC\beta1 adenovíricos
recombinados resultantes son de replicación defectuosa porque
carecen de la zona E1. Para propagar los virus, se infectaron
células 293 que expresan E1 con estos virus. Aparecieron placas
virales, 12 a 24 horas después de la transfección. Se purificaron
virus procedentes de las placas individuales según un procedimiento
normalizado. Las placas que contenían virus recombinados
(Ad5CMVhsGC\alpha1 o Ad5CMVhsGC\beta1) se identificaron por
medio de análisis de PCR: el material de la placa se congeló y
descongeló tres veces, se incubó a 37ºC durante 30 minutos en tampón
de lisis (sulfato amónico 16,6 mM / Tris-HCl 67 mM
pH 6,8 / MgCl_{2} 6,7 mM / 2-mercaptoetanol 5 mM /
EDTA 6,7 mM/SDS 1,7 mM / 50 \mug/ml de proteinasa K) y a
continuación se inactivó térmicamente durante 10 minutos a 85ºC. Por
último, se aisló el ADN procedente del lisado por extracción normal
con fenl/cloroformo y se utilizó para análisis por PCR.
Se infectaron diez placas de cultivo celular de
10 cm con células "EA.hy926" conjuntamente con cada uno de los
adenovectores Ad5CMVhsGC\alpha1 y Ad5CMVhsGC\beta1 a 2 \times
10^{10} pfu (unidades formadoras de placas) por placa. Después de
72 horas, se recogieron las células añadiendo tampón de lisis
hipotónico (trietanolamina 25 mM pH 7,8 /
EDTA 1 mM / DTT 5 mM / leupeptina 1 \muM / 0,5 mg/l de inhibidor de tripsina / PMSF 0,2 mM) y separando con una espátula para células. Se centrifugó el homogeneizado a 500 \times g durante 15 minutos y se mezcló el sobrenadante con un volumen igual de glicerol y se almacenó a -20ºC. Se determinó el estímulo de hsGC por SNP (nitroprusida de sodio) 100 \muM midiendo la concentración de GMPc basal y la concentración de GMPc después del tratamiento con SNP según el procedimiento descrito anteriormente (véase Ejemplo 5). En las tres muestras (A, B, C), fue detectable una elevación de 7 veces a 10,75 veces en la concentración de GMPc comparada con la actividad basal después del estímulo de SNP, mientras que no se pudo medir una elevación significativa en la referencia sin infección por adenovirus (Figura 17).
EDTA 1 mM / DTT 5 mM / leupeptina 1 \muM / 0,5 mg/l de inhibidor de tripsina / PMSF 0,2 mM) y separando con una espátula para células. Se centrifugó el homogeneizado a 500 \times g durante 15 minutos y se mezcló el sobrenadante con un volumen igual de glicerol y se almacenó a -20ºC. Se determinó el estímulo de hsGC por SNP (nitroprusida de sodio) 100 \muM midiendo la concentración de GMPc basal y la concentración de GMPc después del tratamiento con SNP según el procedimiento descrito anteriormente (véase Ejemplo 5). En las tres muestras (A, B, C), fue detectable una elevación de 7 veces a 10,75 veces en la concentración de GMPc comparada con la actividad basal después del estímulo de SNP, mientras que no se pudo medir una elevación significativa en la referencia sin infección por adenovirus (Figura 17).
Se infectaron conjuntamente tres placas de
cultivo celular de 10 cm con células "ECV 304" con 10^{9}- 5
\times 10^{10} pfu (unidades formadoras de placas)
Ad5CMVhsGC\alpha1 y Ad5CMVhsGC\beta1. Después de 72 horas, se
recogieron las células mediante dos lavados con tampón PBS (solución
salina tamponada con fosfato), adición de tampón de lisis hipotónico
y a continuación se trató posteriormente según el procedimiento
descrito en el Ejemplo 11. Se almacenaron las muestras y se
determinó la actividad (contenido en GMPc en pmol/mg/min) según se
describe en el Ejemplo 5. Una actividad basal significativa (sin
SNP) y una actividad máxima significativa (con adición de SNP 100
\muM al ensayo) fue detectable solamente después de la
transferencia génica de Ad5CMVhsGC\alpha1 y Ad5CMVhsGC\beta1 (5
\times 10^{10} pfu cada una) (Figura 26). En los experimentos de
referencia sin Ad5CMVhsGC\alpha1 o Ad5CMVhsGC\beta1, no se
detectó ningún aumento significativo en la formación de GMPc por
SNP. Se obtuvieron resultados cuantitativamente similares en las
células vasculares del músculo liso "A10" si estas células se
habían infectado también conjuntamente con 10^{9}- 5 \times
10^{10} pfu de Ad5CMVhsGC\alpha1 y Ad5CMVhsGC\beta1. En la
presente memoria, también, solamente se detectó una actividad basal
significativa (sin SNP) y una actividad máxima significativa (con
adición de SNP 100 \muM en el ensayo) después de la transferencia
génica de Ad5CMVhsGC\alpha1 y Ad5CMVhsGC\beta1 (5 \times
10^{10}pfu de cada una) (Figura 26). En los experimentos de
referencia sin Ad5CMVhsGC\alpha1 o Ad5CMVhsGC\beta1, de nuevo no
se detectó ningún aumento significativo en la formación de GMPc por
SNP (Figura 28).
Se infectaron conjuntamente tres placas de
cultivo celular conteniendo células "ECV 304" o "A10" con
10^{9} - 5 \times 10^{10} pfu (unidades formadoras de placas)
Ad5CMVhsGC\alpha1 y Ad5CMVhsGC\beta1. Se recogieron las células
y se realizó el tratamiento posterior, el almacenamiento y la
determinación de la actividad según se describe en los Ejemplos 12,
11 y 5. Mientras que el día 0 (antes de la infección conjunta), no
se detectó ningún aumento significativo de la formación de GMPc por
SNP, 15 días después de la transferencia génica de
Ad5CMVhsGC\alpha1 y AdCMVhsGC\beta1, se detectó un aumento
significativo en la formación de GMPc después de la adición de SNP
(Figura 28). Se obtuvieron resultados cuantitativamente similares en
las células vasculares del músculo liso "A10" si estas células
se habían infectado también conjuntamente con 10^{9}- 5 \times
10^{10} pfu de Ad5CMVhsGC\alpha1 y Ad5CMVhsGC\beta1. En la
presente memoria, 15 días después de la infección conjunta, se
detectó también un aumento en la formación de GMPc por SNP (Figura
29). De nuevo, el día 0 (antes de la infección conjunta), no existía
todavía un aumento significativo en la formación de GMPc por SNP. En
los mismos experimentos, se detectaron subunidades de sGC después de
la transferencia génica adenovírica, pero no en las células de
referencia no infectadas (Figura 30).
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Vasopharm Biotech GmBH & Co. KG
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Leichtackerst 6
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Veitshöchheim
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Babiera
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 97209
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Guanilil ciclasa \alpha1/\beta1 humana soluble (hsGC\alpha1/\beta1) aislada y purificada
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 10
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- LISTADO DESCIFRABLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA INFORMÁTICO: Patentin Release nº 1.0, Versión nº 1.30 (EPA)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA LA SEC ID nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3015 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: dos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA LA SEC ID nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 695 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína (Guanilil ciclasa a1 humana soluble (hsGCa1)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA LA SEC ID nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2443 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: dos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA LA SEC ID nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 619 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína (Guanilil ciclasa b1 humana soluble (hsGCb1)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA LA SEC ID nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido (aminoácidos 637 a 647 de hsGCa1)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Thr Pro Arg Ser Arg Glu Glu Leu Pro Pro
Asn Phe Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA LA SEC ID nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido (aminoácidos 593 a 614 de hsGCb1)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Gly Lys Lys Glu Pro Met Gln Val Trp Phe
Leu Ser Arg Lys Asn Thr Lys Thr Glu Glu}
\sac{Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA LA SEC ID nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una cadena
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- CADENA COMPLEMENTARIA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAAAGGATCC ATGTTCTGCA CAAGCTC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA LA SEC ID nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una cadena
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- CADENA COMPLEMENTARIA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATTATGGAAG CAGGGAGG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA LA SEC ID nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una cadena
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- CADENA COMPLEMENTARIA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAAAGGATCC ATGTACGGAT TTGTGAAT
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS PARA LA SEC ID nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una cadena
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- CADENA COMPLEMENTARIA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGCGTGATT CCTGGGTACC
\hfill20
Claims (12)
1. Guanililciclasa \alpha1/\beta1 soluble
humana purificada con homogeneidad aparente, en la que hsGC\alpha1
está identificada por la SEC. ID nº: 2 y hsGC\beta1 está
identificada por la SEC. ID nº: 4.
2. Procedimiento para la producción de
guanililciclasa \alpha1/\beta1 soluble humana según la
reivindicación 1, que comprende la expresión de un vector de
expresión que contiene la secuencia de ADN para las subunidades
hsGC\alpha1 y hsGC\beta1 en células huésped procarióticas o
eucarióticas y la recuperación de la guanililciclasa.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque la etapa de recuperación de la
guanililciclasa \alpha1/\beta1 comprende la lisis de las
células, la cromatografía por afinidad del lisado celular y la
elución posterior de la guanililciclasa \alpha1/\beta1.
4. Procedimiento según la reivindicación 2 ó 3,
caracterizado porque el vector de expresión contiene además
por lo menos una secuencia de ADN para un dominio cromatográfico de
afinidad específica (etiqueta de afinidad) con un punto de escisión
de la proteasa adherente.
5. Procedimiento según la reivindicación 4,
caracterizado porque el vector de expresión contiene la
secuencia de ADN para hsGC\alpha1 con la etiqueta de afinidad, la
secuencia de ADN para hsGC\beta1 con la etiqueta de afinidad, la
secuencia de ADN para hsGC\alpha1 con la etiqueta de afinidad y la
secuencia de ADN para hsGC\beta1, la secuencia de ADN para
hsGC\beta1 con la etiqueta de afinidad y la secuencia de ADN para
hsGC\alpha1, o la secuencia de ADN para hsGC\alpha1 con la
etiqueta de afinidad y la secuencia de ADN para hsGC\beta1 con la
etiqueta de afinidad.
6. Procedimiento para la producción de
guanililciclasa \alpha1/\beta1 soluble humana según la
reivindicación 1, que comprende la expresión independiente de un
vector de expresión que contiene la secuencia de ADN para
hsGC\alpha1 y hsGC\beta1 en las células huésped procarióticas o
eucarióticas, la recuperación de las subunidades y la combinación de
las subunidades hsGC\alpha1 y hsGC\beta1 en la guanililciclasa
\alpha1/\beta1 dimérica.
7. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado porque la etapa de recuperación de las
subunidades comprende la lisis independiente de las células que
contienen hsGC\alpha1 y hsGC\beta1, la cromatografía por
afinidad independiente de los lisados celulares y la elución
posterior de las subunidades.
8. Procedimiento para la producción de
guanililciclasa \alpha1/\beta1 humana soluble según la
reivindicación 1, que comprende la expresión conjunta de las
secuencias de ADN para hsGC\alpha1 y hsGC\beta1 en células
huésped procarióticas o eucarióticas, la lisis de las células que
contienen hsGC\alpha1 y hsGC\beta1, la cromatografía por
afinidad y la elución posterior de la guanililciclasa soluble.
9. Utilización de secuencias de ácidos nucleicos
que codifican subunidades hsGC\alpha1 identificadas por la SEC. ID
nº: 2 y hsGC\beta1 identificada por la SEC. ID nº: 4 de la
guanililciclasa \alpha1/\beta1 humana soluble como agentes
terapéuticos para la preparación de una composición farmacéutica
para la genoterapia somática destinada a la prevención y terapia de
la aterosclerosis y de las enfermedades resultantes, de la
restenosis, isquemia (infarto), enfermedades obstructivas de las
arterias periféricas e hipertensión arterial, así como para la
prevención en pacientes con factores de riesgo de aterosclerosis,
ataques isquémicos transitorios, isquemia cerebral, ictus apoplético
(apoplejía), cardiopatía coronaria, cuadro clínico tras la cirugía
coronaria con bypass, estenosis de la carótida, para la
terapia de refuerzo con activadores de sGC, sustancias
sensibilizantes de sGC, monóxido de nitrógeno (donantes de NO) o
inhibidores de fosfodiesterasa, insuficiencia cardíaca y disfunción
hepática.
10. Utilización según la reivindicación 9,
caracterizada porque se utiliza un vector como agente
terapéutico, que contiene las secuencias de ácido nucleico para la
guanililciclasa \alpha1 humana soluble (hsGC\alpha1) y la
guanililciclasa \beta1 humana soluble (hsGC\beta1).
11. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 9 y 10, caracterizada porque la
transferencia génica somática tiene lugar en las células
endoteliales, en las células de los músculos lisos de los vasos
sanguíneos del músculo liso, en las células de la neoíntima, en
fibroblastos y en otras células de los vasos sanguíneos o en los
componentes corpusculares de la sangre (plaquetas, leucocitos y
otros) y en las células del hígado.
12. Anticuerpo monoespecífico contra la
guanililciclasa \alpha1/\beta1 humana soluble según la
reivindicación 1.
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