ES2326442T3

ES2326442T3 - Proteina fha1 con dominio asociado en forma de cabeza de tenedor, que interactua con resina treonina quinasas mekk1 (mif1).

Info

Publication number: ES2326442T3
Application number: ES99941444T
Authority: ES
Inventors: Christophe Marcireau; Marie-Christine Multon; Valerie Polard-Housset
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1998-07-21
Filing date: 1999-07-21
Publication date: 2009-10-09
Anticipated expiration: 2019-07-21
Also published as: DK1100913T3; PT1100913E; EP1100913A1; ATE430196T1; EP1100913B1; DE69940812D1; AU764094B2; WO2000005362A1; JP4548938B2; CY1109289T1; AU5505799A; JP2002524026A

Abstract

Un método para seleccionar moléculas que modulan la actividad de MIF1, siendo definida dicha actividad como la unión a MEKK1, que comprende: a) poner en contacto una proteína MIF1 con una molécula candidato, en el que la proteína MIF1 tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO:8; y b) detectar la unión de la molécula a la proteína MIF 1 por medio de MIF1 marcado o reactivo secundario marcado, en el que se proporciona el marcaje por marcaje isotópico, fluorescente o marcador quimioluminiscente, en el que dicha unión está asociada con la modulación de dicha actividad de MIF1.

Description

Proteína FHA1 con dominio asociado en forma de cabeza de tenedor, que interactúa con serina treonina quinasas MEKK1 (MIF1).

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una nueva proteína de la ruta de transducción de señal de MEKK, y el gen que la codifica. La invención se refiere además a usos diagnósticos y terapéuticos de la proteína o el gen, y a métodos de rastreo de agonistas o antagonistas de la proteína, particularmente con respecto a la actividad de MEKK.

Antecedentes de la invención

Las proteína quinasas activadas por mitógeno (MAP) han sido recientemente el objetivo de estudios intensivos. Esta familia de quinasas homólogas está implicada en una variedad de respuestas celulares respecto a estímulos extracelulares y su estatus de activación respectivo parece ser determinante para el destino celular. La identificación de distintas cascadas de MAPK, que consiste en al menos módulos de 3-quinasa, bien conservadas entre todos los eucariotas, ha ilustrado parcialmente el panel respectivo de respuestas que implican a cada una de la ruta de señalización de quinasas. El módulo de ERK se activa mediante mitógeno o una señal de diferenciación y a su vez, activa sus sustratos que incluyen S6 quinasa ribosómica de p90, cPLA2, PHAS-1, c-myc, MAPKAPK2 y Elk1. Por otra parte, las respuestas celulares frente al estrés, frente a algunos factores de crecimiento, citoquinas pro-inflamatorias, radiación UV o \gamma, ceramidas, péptidos vasoactivos, inhibidores de la síntesis de proteínas o choque térmico implican la activación de las quinasas N-terminal de Jun (JNKs) y de p38/HOG. Los puntos finales de estas cascadas de quinasa de estrés son la fosforilación de los factores de trascripción de c-Jun, Elk1 o ATF-2 (CRE-BP1). La persistente activación de las JNK se asocia con la detección del crecimiento, la aparición de la apoptosis o la activación de las células
hematopoyéticas.

Las JNK se activan por fosforilación dual por las JNK quinasas (MKK4/SEK1) que se activan, a su vez, por las serina treonina quinasas corriente arriba denominadas quinasas MEK (MEKK). Las MEKK representan una familia en expansión de quinasas. El cADN de MEKK1 de mamíferos codifica a una proteína de 78 kDa pero diversas formas de MEKK1 se indicaron en diversas líneas celulares (50, 78 o 98 kDa). A partir de esto, se clonó un cADN de cadena entera de MEKK1 de rata, que codifica una proteína de 195 kDa. Esto se indicó que se dividía por una caspasa, dando lugar a la expresión de una quinasa más corta y más activa durante la anoikis (la apoptosis debida a la pérdida de contacto celular). El producto de división de 98 kDa corresponde a los 625 aminoácidos en la parte del extremo C-terminal de la MEKK1 de cadena entera. Los recientes datos han demostrado que la MEKK1 regula también al factor de trascripción de nF\kappaB, fosforilando a la i\kappaB-\alpha quinasa.

El amplio rango de estímulos extracelulares o intracelulares que conducen a la activación de las MAPK da importancia a la cuestión de la especificidad de su mecanismo de activación. Se han descrito las etapas de activación de la cascada de quinasa de mitógeno (ERK). Por otra parte, las primeras etapas activantes que regulan la cascada de quinasa de estrés son por el momento desconocidas. Se han identificado reguladores comunes de esta cascada de MAPK/JNK, tales como fosfatasas, y actúan como determinantes del equilibrio entre el crecimiento celular y la apoptosis, el equilibrio que regula la homeostasis de todos los tejidos.

Tanto la Raf (la MAPKKK que se activa por señales mitogénicas, dependientes de Ras) como la MEKK1 interaccionan con Ras unido a GTP a través de su dominio efector pero no hay evidencias de que Ras-GTP activa directamente la proteína MEKK1. Sin embargo, la Ras oncogénica activa también la cascada de JNK, y esta activación parece ser necesaria para la transformación de Ras.

Estos ejemplos ilustran que MEKK1 participa en la regulación de un amplio rango de acontecimientos celulares que conducen tanto a la división celular, como a la activación celular como a la muerte celular. Así, debe existir un sorprendente control de su actividad en las células. Un aumento de la actividad de MEKK1 podría conducir a un exceso de la apoptosis o activación de células T, y estar en el origen de un amplio rango de patologías como la inflamación y el asma, inmunodepresión, isquemia cardíaca o hipertrofia, síndromes mielodisplásicos, neurodegeneración, etc. Por otra parte, una des-regulación de la actividad de MEKK1 podría inducir un exceso de proliferación celular y/o supervivencia y por lo tanto conducir al crecimiento tumoral, la excesiva angiogénesis, artritis reumatoide, psoriasis e infecciones virales sostenidas.

Un cADN que es 100% homólogo con respecto al cADN de MIF1 descrito en este documento fue publicado por Ren Y. et al., Eur. J. Biochem., 253, pp734-742, 1998, acc Genbank AF015308, y denominado proteína microesférula de Homo sapiens (MSP58). No se asignó ninguna función a esta proteína, no obstante.

Sin embargo, queda una necesidad en la técnica de entender mejor los mecanismos moleculares de procesos celulares mediados por MEKK. En particular, queda una necesidad en la técnica de identificar una proteína reguladora de MEKK.

La presente invención se dirige a esta necesidad, como se describe más adelante.

La cita de cualquier referencia en este documento no debe considerarse como un reconocimiento de que dicha referencia se encuentra disponible como "técnica anterior" de la presente solicitud.

Compendio de la invención

Como se dice anteriormente, la presente invención se refiere a la identificación de un factor regulador de MEKK. Este factor, denominado en este documento proteína FAH interactuante con MEKK (MIF1), proporciona una vía para modular la actividad de MEKK, y así muchos procesos fisiológicos tales como la apoptosis y las respuestas celulares frente a la inflamación y otros estímulos.

Así, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica una proteína FAH interactuante con MEKK (MIF1), en el que el ácido nucleico tiene una propiedad seleccionada entre las siguientes: se puede amplificar con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) empleando un cebador de oligonucleótidos derivado de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:7; se hibrida bajo condiciones restrictivas con un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos como la representada en SEQ ID NO:1; codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionado entre el grupo que consiste en SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:8, sus variantes de empalme, y sus variantes alélicas; y codifica un polipéptido que se une específicamente a un anticuerpo generado contra un péptido correspondiente a los aminoácidos 16-28 de MIF1 como se representa en SEQ ID NO:8. En una realización específica, ejemplificada infra, la MIF1 tiene una secuencia de aminoácidos como la representada en SEQ ID NO:2, por ejemplo, el ácido nucleico aislado comprende una secuencia de nucleótidos como la representada en SEQ ID NO:1. En una realización más, ejemplificada infra, la MIF 1 tiene una secuencia de aminoácidos como la representada en SEQ ID NO:8, por ejemplo, el ácido nucleico aislado comprende una secuencia de nucleótidos como la representada en SEQ ID NO:7. En otra realización, MIF1 tiene aproximadamente 483 aminoácidos. En una realización específica, el término "alrededor" o "aproximadamente" significa en el intervalo de un 20%, preferiblemente un 10%, y más preferiblemente un 5% de un determinado valor o intervalo.

Como puede apreciarse fácilmente por cualquier experto ordinario en la técnica, un medio eficaz para preparar un ácido nucleico de la invención, particularmente un cADN, es amplificar el ácido nucleico a partir de un genoteca de cADN que comprende una secuencia codificante para MIF1 usando la PCR. Pueden usarse diversos cebadores de la PCR, correspondientes a cualquier segmento deseado entre SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:7 de acuerdo con la invención. En realizaciones específicas, infra, los cebadores de la PCR que tienen las secuencias como las representadas en SEQ ID NOS: 10, 11, y 14 se usaron para amplificar y aislar un ácido nucleico de la invención. De forma alternativa, un ácido nucleico de la invención puede aislarse o identificarse con una sonda de oligonucleótidos, por ejemplo, de al menos 10 bases, que se hibrida bajo condiciones restrictivas a un nucleótido que tiene la secuencia o la secuencia complementaria representada en SEQ ID NO:7. En un aspecto específico, el oligonucleótido puede usarse en un método para detectar ADN genómico (análisis Southern) o expresión de mARN (análisis Northern) que codifica MIF1 en una célula. En cualquier caso, el método comprende poner en contacto una muestra a partir de la célula con el oligonucleótido que es detectable, por ejemplo, marcando con un radioisótopo o un cromóforo o fluoróforo, y detectar la hibridación del oligonucleótido con ADN genómico o mARN en la muestra, en el que la detección de la hibridación del oligonucleótido con ADN genómico indica la presencia de un gen que codifica MIF1 en el genoma, y la detección de la hibridación con mARN indica la expresión del mARN que codifica MIF1. También es posible usar métodos cuantitativos, por ejemplo, para detectar el número de genes MIF1 en el genoma, o detectar un aumento o disminución en el nivel de expresión de mARN.

Un oligonucleótido de la invención también puede ser un oligonucleótido antisentido, es decir, uno que se una al mARN que codifica MIF1 y prevenga su traslación en la célula. Tal molécula antisentido puede codificarse mediante un vector expresado en la célula, o puede ser un oligonucleótido sintético, preferiblemente uno que incluya enlaces no fosfoéster de modo que sea resistente a las nucleasas intracelulares.

En otra realización, el ácido nucleico aislado después que comprende una secuencia que codifica un marcador de polipéptido, mediante el cual el ácido nucleico codifica una proteína MIF1 marcada quimérica. Los marcadores apropiados incluyen, pero no están de ningún modo limitados a, una porción de proteína Myc, una secuencia de polihistidina, o una proteína de glutationa transferasa.

Naturalmente, los ácidos nucleicos de la invención, particularmente las moléculas de cADN, pueden proporcionarse en un vector de clonación o en un vector de expresión. En un vector de expresión, la secuencia que codifica para MIF1 está operativamente asociada con una secuencia control de expresión que permite la expresión del polipéptido de MIF1 en una célula huésped competente de expresión. Los vectores de la invención incluyen una molécula de ARN, una molécula de ADN de plásmido, y un vector viral. Cuando el vector es una molécula de ADN de plásmido, el ADN del plásmido puede comprender además una composición seleccionada entre el grupo que consiste en una proteína de condensación de ADN, un lípido catiónico, un liposoma, un polímero y un agente precipitante de ADN. Cuando el vector es un vector viral, el vector viral puede ser un retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociado, virus del herpes y virus de vacuna, por nombrar algunos de tales vectores. Los vectores de retrovirus preferidos incluyen vectores de la familia de los lentivirus, tales como el VIH. Además, la invención proporciona una célula huésped transfectada con el vector de clonación (dichas células huésped serán normalmente células procariotas, como se ejemplifica infra) o el vector de expresión. Las células huésped que contienen el vector de expresión incluyen células bacterianas, células de levaduras y células de mamíferos. En realizaciones específicas, se usan ambas células de levaduras y células huésped.

Las células huésped de la invención pueden usarse para producir MIF1 recombinantemente. Este método comprende cultivar la célula huésped en medio de cultivo bajo condiciones que permitan la expresión de MIF1; y aislar la MIF1 del cultivo.

En otro aspecto, la invención proporciona un MEKK aislado que interacciona con la proteína FHA (MIF1). La proteína puede codificarse mediante un ácido nucleico de la invención. De forma alternativa, una proteína MIF1 tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:8, sus variantes de empalme y sus variantes alélicas. En otra realización más, la proteína se caracteriza por unirse específicamente a un anticuerpo generado contra un péptido correspondiente a los aminoácidos 16-28 de MIF1 como se representa en SEQ ID NO:8. La invención proporciona tanto la MIF1 murina como la humana. En todavía otra realización, la proteína es una MIF1 quimérica que comprende un marcador de polipéptido, por ejemplo, como se describe antes.

También se proporciona un péptido antigénico que es un fragmento de un MEKK aislado que interacciona con la proteína de FHA (MIF1). En una realización específica, el péptido antigénico tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 16-28 de SEQ ID NO:8.

Naturalmente, la invención proporciona además un anticuerpo que se une específicamente a una proteína MIF1. Dichos anticuerpos pueden usarse diagnósticamente, para detectar la presencia y opcionalmente la cantidad de MIF1 en las células. Los anticuerpos de la invención, particularmente los anticuerpos de Fv de cadena simple (scFv) también pueden usarse terapéuticamente, para suprimir la actividad de MIF1. En una realización específica, ejemplificada infra, el anticuerpo reconoce específicamente los aminoácidos de MIF1 16-28 de SEQ ID NO:8. En otra realización específica, ejemplificada infra, el anticuerpo es policlonal. Los anticuerpos monoclonales, y los fragmentos de anticuerpo (además de los anticuerpos de scFv) también están contemplados en esta invención. Usando el anticuerpo de la invención, se puede detectar la expresión de la proteína MIF1 en una célula poniendo en contacto una muestra de la célula con el anticuerpo bajo condiciones que permitan la unión del anticuerpo a una proteína MIF1 en la muestra, y detectar la unión del anticuerpo a una proteína en la muestra, en la que la detección de la unión del anticuerpo a la proteína indica la expresión de MIF1 en la célula. Usando métodos de inmunoensayo cuantitativos o transferencia Western, es posible cuantificar la cantidad de MIF1, y particularmente detectar los aumentos o las disminuciones en la cantidad de MIF1 respecto a la célula en un tiempo más corto, o respecto a células
normales.

Como se menciona antes, la MIF1 regula la actividad de MEKK. MEKK es una importante molécula de la transducción de la señal en varios sistemas. La presente invención proporciona ventajosamente un método para seleccionar moléculas que modulan la actividad de MIF1, y por lo tanto MEKK. Puede usarse cualquiera de los métodos de selección de la técnica, particularmente la selección de alto rendimiento. En una realización específica, el método comprende poner en contacto una proteína MIF1 con una molécula candidato, y detectar la unión de la molécula a la proteína MIF1. En una realización específica, la detección de la unión de la molécula a MIF1 comprende detectar la modulación de la interacción de MIF1 y MEKK. En una realización específica, la modulación de la interacción de MIF1 y MEKK comprende detectar un cambio en el nivel de expresión de un gen reportero expresado bajo el control de una proteína quimérica que consiste en el dominio de unión de MIF1 de MEKK y un dominio de unión de ADN de un activador de la transcripción en una línea celular transfectada con MIF1 y la proteína quimérica de MEKK. Más particularmente, la detección de la expresión es en células mamíferas transitoriamente transfectadas. La modulación transitoria de la actividad de MEKK se ejemplifica en los ejemplos, infra. Los métodos de selección de la invención permiten la identificación de un agonista o antagonista de MIF1.

En todavía una realización más, la invención proporciona un método para disminuir la actividad de MEKK en una célula que comprende aumentar el nivel de la proteína MIF1 en la célula. La proteína MIF1 puede ser una MIF1 murina, y más preferiblemente es una MIF1 humana. En una realización preferida, la célula se ha transfectado con un vector que codifica MIF1 bajo condiciones que permitan la expresión de la proteína MIF1.

De forma alternativa, cuando se desee, la invención proporciona un método para aumentar la actividad de MEKK en una célula que comprende disminuir el nivel de la proteína MIF1 en la célula. El nivel de proteína MIF1 puede disminuirse introduciendo un ácido nucleico antisentido de MIF1 en la célula, cuyo ácido nucleico antisentido se hibrida bajo condiciones intracelulares en un mARN de MIF1. De forma alternativa, el nivel de la proteína MIF1 puede disminuirse introduciendo un anticuerpo de Fv de cadena simple (scFv) que se une específicamente a MIF1 en la célula a un nivel suficiente para unirse e inactivar a MIF1.

Un primer objeto de la invención, luego, es proporcionar un factor que regule la actividad de MEKK, específicamente MEKK1.

Un objeto relacionado es proporcionar un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido.

Incluso un objeto más es proporcionar oligonucleótidos, tanto como cebadores de la PCR para amplificar un ácido nucleico que codifica el factor regulador de MEKK, o como sondas de hibridación para detectar o aislar dicho ácido nucleico.

Todavía otro objeto de la invención es proporcionar un alto nivel de expresión de la proteína reguladora MEKK, tanto por fermentación de células transfectadas como transducidas para recuperar a la proteína purificada, o in vivo en células para su posterior ensayo in vitro o para la regulación de la actividad de MEKK in vivo, por ejemplo, para terapia génica.

Un objeto particular de la invención es proporcionar la selección de moduladores de moléculas pequeñas, por ejemplo, agonistas y antagonistas, de la actividad de MIF1, particularmente de la interacción de MIF1 con MEKK.

Estos y otros objetos se tratan en la presente invención, que se explica con más detalle en los dibujos adjuntos y en la siguiente Descripción Detallada y Ejemplos.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Detección de la actividad de \beta-GALACTOSIDASA en yCM17 de cepa de levadura transformada por diferentes pares de plásmidos que codifica la MEKK1 truncada y de longitud parcial o entera de MIF1.

Figura 2. Análisis Northern de muestras de tumor humano. La sonda consiste en un fragmento de KpnI-BamHI de 1069 bp obtenido del plásmido pCM562 (que codifica la MIF1 de longitud completa). La sonda se marca con el procedimiento estándar REDIPRIME (Amersham) y se híbrida según las instrucciones del fabricante.

Figura 3. Análisis Northern de tejidos humanos. La sonda era la misma que para la Figura 2.

Figura 4. La actividad de luciferasa en células NIH3T3 transfectadas por MEKK con y sin MIF1.

Figura 5. Transferencia Western de extractos celulares de K1 CHO. Las células se transfectaron o no con plásmido pcADN3 MIF1/MSP58. La expresión de MIF1 se determinó por la unión de un anticuerpo policlonal contra el péptido S14Y (residuos de aminoácidos 16-28).

Figura 6. Expresión de MIF1 en células CHO transfectadas (pool NeoR): Se transfectaron CHOK1 con pCADN3 (banda 1) y pCM562 (que codifica para proteína MIF1/MSP58 Myc-marcado) (banda 2) y seleccionado con G418. Las células resistentes se recolectaron y lisaron. Los extractos celulares se separaron en PAGE-SDS Tris-glicina al 10%, electro-transferidos y la expresión de MIF1/MSP58 se detectó usando anticuerpo anti-myc. El revelado se hizo usando el sistema ECL (Amersham) usando anticuerpo secundario acoplado con peroxidasa. La proteína MIF1/MSP58 se indica mediante una flecha.

Figura 7. Expresión de MIF1 en clones estables: Se derivaron clones estables individuales de un conjunto de células resistentes de NeoR después de la transfección con pCM562 por dilución límite de la suspensión celular en placas de 96 pocillos. Después de la amplificación, cada clon (los clones que se muestran son los Nos. 13, 14 y 34) se analizó respecto a la expresión de la proteína MIF/MSP58 usando el anticuerpo anti-myc. La banda T+pCM562 se cargó con extracto celular del conjunto de células transfectadas antes de la clonación.

Figura 8. Se sembraron células a una densidad de 1 a 5,10^{3} células/pocillo en una placa de 24 pocillos en medio completo (F12 de HAM, suero de bovino fetal al 10% inactivado por calor, penicilina al 1%, glutamina al 1%, 500 \muG/mkl G418). Para cada tiempo, los pocillos se numeraron y los resultados presentados se promedian a partir de 4 numeración independiente.

Figura 9. MIF1/MSP58 inhibe la actividad de JNK inducida por sorbitol. Las células estables CHOpcADN3 (clon estable de CHO obtenido con el vector vacío) y CHO-MIF34 (clon estable de CHO Nº 34 que sobrexpresa MIF1/MSP58) se estresaron por Sorbitol (200 mM) durante los tiempos indicados y el efecto de la sobrexpresión de MIF1/MSP58 sobre la activación de JNK fue comprobado directamente por fosforilación de un sustrato de GST-Jun (1-223) por extractos citosólicos (fosforilación in vitro).

Figura 10. La expresión de MIF1/MSP58 aumenta la apoptosis en respuesta a un choque osmótico medio (sorbitol 200 mM). Las células se sembraron en placas de 6 pocillos y se incubaron 24 h con o sin sorbitol 200 mM. La apoptosis fue entonces detectada por FACS después de tinción de yoduro de propidio.

Figura 11. La retención de GST-MEKK1 sobre GSH-sepharose. Se transfectaron células CHOMIF1/MSP58#34 con pBCGST (vector control, banda 1 y 2) o pBCGST-MEKK1 (banda 3 y 4) y se trataron (banda 1 y 3) o no (banda 2 y 4) con sorbitol 200 mM. Se fijaron extractos celulares sobre GSH sepharose, y se eluyeron complejos de proteína con un exceso de GSH. Después de cargar sobre PAGE-SDS, las proteínas unidas se analizaron usando anticuerpo anti-GST y se revelaron con el sistema ECL. Los resultados mostraron que ambas proteínas se unían sobre GSH-sepharose.

Figura 12. La activación de GST indica que MIF1/MSP58 interacciona con la proteína MEKK1. Se transfectaron células CHOMIF1/MSP58#34 con pBCGST (vector control, banda 1 y 2) o pBCGST-MEKK1 (banda 3 y 4) y se trataron (banda 1 y 3) o no (banda 2 y 4) con sorbitol 200 mM. Los extractos celulares se fijaron sobre GSH sepharose, y las proteínas unidas se eluyeron con GSH. Después de cargar sobre PAGE-SDS, se detectó la presencia de MIF1-MSP58 usando un anticuerpo anti-myc y se reveló con el sistema ECL. Los resultados indican que MIF1/MSP58 se une a GST-MEKK1 y que la unión se regula por estrés.

Figura 13. Principio de rastreo secundario para la identificación de antagonistas o agonistas de la unión de
MIF1/MSP58-MEKK1.

Descripción detallada de la invención

Ya que se sabe poco de la regulación corriente arriba de MEKK1, se hicieron esfuerzos para identificar a las parejas de MEKK1 para encontrar a los reguladores putativos de su actividad. La invención se basa, en parte, en la identificación de tal proteína reguladora, denominada en este documento MIF1. Un mejor conocimiento de las rutas de activación y de regulación para MEKK1 podría requerirse mediante la proteína MIF1. Se clonó MIF1(la proteína 1 de FHA que interacciona con MEKK1, 483 aminoácidos) usando una estrategia de 2-híbridos y MEKK1 como cebo.

La proteína MIF1 contiene una proteína motivo identificada en los bancos de datos de Prosite. Este dominio, el dominio de Asociado de Forkhead (FHA) ha sido descrito que está implicado en interacciones proteína-proteína y podría ser un motivo de unión a serinas y treoninas fosforiladas. La única proteína homóloga de forkhead probablemente localizada en el citoplasma que ha sido previamente descrita es la KAPP, una fosfatasa que interacciona con una serina/treonina quinasa de una forma dependiente de la fosforilación.

El mapeo del dominio de interacción entre MIF1 y MEKK1 indicaba que la interacción entre MIF1 y MEKK1 depende de la fosforilación de MEKK1. La interacción en levadura, entre MIF1 y MEKK1 puede observarse solo si MEKK1 tiene una actividad de quinasa no modificada y autofosforila el sitio de interacción. El dominio de MEKK1 que interacciona con MIF1 fue mapeado en el dominio regulatorio de la quinasa, entre los aminoácidos 284-369, usando diferentes fragmentos del ADN de MEKK1 (2-híbridos) (véase la Figura 1).

La invención de acuerdo con esto se refiere al use del cADN humano que codifica para la proteína MIF1, homólogos, variantes de empalme, mutantes de un sólo punto o de deleción y las proteínas codificadas por estas secuencias para su uso en la selección de pequeñas moléculas o productos naturales, por ejemplo, para la inhibición de interacciones MEKKs/MIF1. El uso de una cepa de 2-híbridos descrita en los ejemplos, la activación de las MEKK por fosforilación, la modificación de actividades descritas de MIF1, puede usarse en este proceso.

MIF1 también puede usarse en aplicaciones de terapia génica (pueden usarse tanto moléculas codificantes como antisentido) para modificar la activación de las JNK en células. Las patologías implicadas por estas terapias génicas basadas en la sobre-expresión o des-regulación de MIF1 se discuten en los Antecedentes de la Invención, supra.

Además, pueden usarse anticuerpos anti-MIF en aplicaciones diagnósticas y de purificación.

EL cADN de MIF1y los derivados pueden usarse de forma eficaz en una selección de 3-híbridos de levadura para clonar una nueva MAP4K, como regulador de las actividades de MAP3K. El cADN de MIF1 y los derivados también pueden usarse para seleccionar inhibidores de MAP4K.

Estos y otros aspectos de la invención, particularmente el aislamiento de genes de MIF1, expresión de la proteína MIF1, generación de anticuerpos anti-MIF1, ensayos de selección para la modulación de MIF1, ensayos de selección para identificar antagonistas o agonistas de la interacción de MIF1/MEKK, y la administración de vectores que codifican MIF1, en particular para aplicaciones de terapia génica, se discuten con detalle en las siguientes secciones. Los encabezados de las secciones se proporcionan meramente por comodidad del lector y en ningún caso deben considerarse limitantes.

Genes que codifican proteínas MIF1s

La presente invención contempla el aislamiento de un gen que codifica una MIF1 de la invención, incluyendo una forma de longitud completa o natural de MIF1, y cualquiera de sus fragmentos antigénico a partir de cualquier animal, particularmente fuentes de mamíferos o aviares, y más particularmente de seres humanos. Como se usa en este documento, el término "gen" se refiere a un conjunto de nucleótidos que codifican un polipéptido e incluye ácidos nucleicos ADNc y ADN genómico. Tal y como se emplea en este documento, "MIF1" se refiere al polipéptido MIF1, y "MIF1" se refiere a un gen que codifica al polipéptido MIF1.

De acuerdo con la presente invención, pueden emplearse técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y ADN recombinante dentro del alcance de la técnica. Dichas técnicas están explicadas con detalle en la bibliografía. Véase, p. ej., Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (en la presente memoria "Sambrook et al., 1989"); ADN Cloning: A Practical Approach, volúmenes I y II (D.N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames y S.J. Higgins eds., (1985)]; Transcription and Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds., (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed., (1986)]; Immobilized Cells and Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel y col. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

Por lo tanto, si aparecen en este documento, los siguientes términos tendrán las definiciones que se indican a continuación.

Un "vector de clonación" es un replicón, tal como un plásmido, un fago o un cósmido, al que se puede fijar otro segmento de ADN para conseguir la replicación del segmento fijado. Un "replicón" es cualquier elemento genético (por ejemplo, plásmido, cromosoma, virus) que funciona como unidad autónoma de replicación de ADN in vivo, es decir, capaz de replicarse bajo su propio control. Los vectores de clonación pueden tener capacidad de replicación en un tipo celular y de expresión en otro ("vector lanzadera").

Una "casete" se refiere a un segmento de ADN que puede insertarse en un vector en sitios de restricción específicos. El segmento de ADN codifica un polipéptido de interés y la casete y los sitios de restricción están diseñados para asegurar la inserción de la casete en el marco de lectura apropiado para la transcripción y la traducción.

Una célula se ha "transfectado" con ADN exógeno o heterólogo cuando dicho ADN se ha introducido dentro de la célula. Una célula se ha "transformado" con ADN exógeno o heterólogo cuando el ADN utilizado para transfectar la célula, ocasiona un cambio fenotípico. El ADN transformante puede integrarse (unido covalentemente) en el ADN cromosómico, constituyendo el genoma de la célula.

Una "molécula de ácido nucleico" se refiere a la forma polimérica del éster fosfato de los ribonucleósidos (adenosina, guanosina, uridina o citidina; "moléculas de ARN") o de los desoxirribonucleósidos (desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina o desoxicitidina; "moléculas de ADN") o a cualquiera de los análogos fosfoéster de éste, tales como los fosforotioatos y tioésteres, ya sea en forma de una cadena única o de una hélice bicatenaria. Son posibles las hélices de ADN-ADN, ADN-ARN y ARN-ARN bicatenarias. La expresión molécula de ácido nucleico y, en particular, molécula de ADN o ARN, se refiere únicamente a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no se limita a ninguna forma terciaria concreta. Por lo tanto, esta expresión comprende el ADN bicatenario encontrado, entre otras, en moléculas de ADN lineales o circulares (por ejemplo, fragmentos de restricción), plásmidos y cromosomas. En la exposición de la estructura de determinadas moléculas de ADN de cadena doble, las secuencias pueden describirse en la presente memoria según el acuerdo habitual de proporcionar únicamente la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo de la cadena de ADN no transcrita (es decir, la cadena que tiene una secuencia homóloga a la del ARNm). Una "molécula de ADN recombinante" es una molécula de ADN que se ha sometido a una manipulación por tecnologías de biología molecular.

Una molécula de ácido nucleico "puede hibridar" con otra molécula de ácido nucleico, tal como ADNc, ADN genómico o ARN cuando una forma monocatenaria de la molécula de ácido nucleico puede hibridar con la otra molécula de ácido nucleico en las condiciones apropiadas de temperatura y de intensidad iónica (véase Sambrook et al., supra). Las condiciones de temperatura e intensidad iónica determinan la "restricción" de la hibridación. Para un escrutinio preliminar de los ácidos nucleicos homólogos, pueden usarse condiciones de hibridación poco restrictivas que se corresponden con una T_{m} de 55º, por ejemplo, 5x SSC, SDS al 0,1%, leche al 0,25%, y sin formamida; o formamida al 30%, 5x SSC, SDS al 0,5%. Las condiciones de hibridación moderadamente restrictivas se corresponden con una T_{m} mayor, por ejemplo, formamida al 40%, con 5x ó 6x SCC. Las condiciones muy restrictivas de la hibridación se corresponden con la T_{m} más alta, por ejemplo, formamida al 50%, 5x ó 6x SCC. La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de la restricción de la hibridación, son posibles uniones erróneas entre las bases. La restricción apropiada para la hibridación de ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementación, variables muy conocidas en la técnica. Cuanto mayor sea el grado de similitud u homología entre dos secuencias de nucleótidos, mayor será el valor de T_{m} para los híbridos de los ácidos nucleicos que tienen esas secuencias. La estabilidad relativa (correspondiente a la mayor Tm) de las hibridaciones de ácidos nucleicos, disminuye en el siguiente orden: ARN:ARN, ADN:ARN, ADN:ADN. En el caso de híbridos con una longitud superior a 100 nucleótidos, se han obtenido ecuaciones para calcular la T_{m} (véase Sambrook y col., mencionado anteriormente, 9.50-0.51). Para hibridar con ácidos nucleicos más cortos, es decir, oligonucleótidos, es más importante la posición de los desacoplamientos, y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook y col., mencionado anteriormente, 11.7-11.8). Preferiblemente, una longitud mínima para un ácido nucleico hibridable es al menos de aproximadamente 10 nucleótidos; preferiblemente al menos de aproximadamente 15 nucleótidos; y, más preferiblemente, la longitud es al menos de aproximadamente 20 nucleótidos;

En una realización específica, la expresión "condiciones de hibridación convencionales" se refiere a una T_{m} de 55ºC, y se emplean las condiciones tal y como se han descrito anteriormente. En una realización preferida, la T_{m} es 60ºC; en una realización más preferida, la T_{m} es 65ºC.

Tal como se emplea en este documento, el término "oligonucleótido" se refiere a un ácido nucleico, generalmente de al menos 18 nucleótidos, que puede hibridar con una molécula de ADN genómico, una molécula de ADNc o una molécula de ARNm que codifica MIF1. Los oligonucleótidos pueden marcarse, por ejemplo, con ^{32}P-nucleótidos o nucleótidos con los que se ha conjugado covalentemente un marcador, tal como biotina (véase la descripción anterior con respecto al marcaje de polipéptidos MIF1). En una realización, un oligonucleótido marcado puede usarse como una sonda para detectar la presencia de un ácido nucleico que codifica MIF1. En otra realización, pueden usarse oligonucleótidos (pudiendo estar marcados uno o los dos) como cebadores de PCR, para la clonación de toda la longitud o un fragmento de MIF1, o para detectar la presencia de ácidos nucleicos que codifican MIF1. En otra realización, un oligonucleótido de la invención puede formar una triple hélice con una molécula de ADN de MIF1. Generalmente, los oligonucleótidos se preparan de manera sintética, preferiblemente en un sintetizador de ácidos nucleicos. De acuerdo con esto, los oligonucleótidos pueden prepararse con enlaces fosfoéster análogos que no están presentes en la naturaleza, tales como enlaces tioéster, etc.

Una "secuencia codificante" de ADN es una secuencia de ADN bicatenaria que se transcribe y se traduce en un polipéptido en una célula in vitro o in vivo cuando se pone bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan por un codón de iniciación en el extremo 5' (amino) y un codón de parada de la traducción en el extremo 3' (carboxilo). Una secuencia codificadora puede incluir, pero sin limitación, secuencias procarióticas, ADNc procedente de ARNm eucariótico, secuencias de ADN genómico procedentes de ADN eucariótico (por ejemplo, de mamífero) e incluso secuencias de ADN sintéticas. Si la secuencia codificante se va a usar para la expresión en una célula eucariota, normalmente se localizará una señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de la transcripción en la posición 3', con respecto a la secuencia codificante.

Las secuencias de control de la transcripción y la traducción son secuencias reguladoras de ADN, tales como promotoras, potenciadoras, terminadoras y similares, que proporcionan la expresión de una secuencia codificadora en una célula hospedadora. En las células eucariotas, las señales de poliadenilación son secuencias de control.

Una "secuencia promotora" es una región reguladora del ADN, capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificante aguas abajo (en dirección 3'). Para definir la presente invención, la secuencia promotora se une a su extremo 3' por el sitio de inicio de la transcripción y se extiende aguas arriba (en dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción con niveles detectables por encima de los niveles basales. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de inicio de la transcripción (definido convenientemente, por ejemplo, por cartografiado con la nucleasa S1), así como dominios de unión de proteínas (secuencias consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa.

Una secuencia codificante está "bajo el control" de secuencias de control de la transcripción y la traducción en una célula, cuando la ARN polimerasa transcribe la secuencia codificante en ARNm, que después se corta y empalma (si la secuencia codificante contiene intrones) y se traduce en la proteína codificada por la secuencia codificante.

Tal y como se emplea en esta memoria, el término "homólogo", en todas sus formas gramaticales y variaciones ortográficas, se refiere a la relación entre las proteínas que poseen un "origen evolutivo común", incluyendo proteínas procedentes de superfamilias (por ejemplo, la superfamilia de las inmunoglobulinas) y proteínas homólogas procedentes de diferentes especies (por ejemplo, la cadena ligera de la miosina, etc.) (Reeck y col., 1987, Cell 50:667). Estas proteínas (y sus genes codificantes) tienen homología de la secuencia, como se refleja por su alto grado de similitud de la secuencia.

Por consiguiente, la expresión "similitud de secuencia", en todas sus formas gramaticales, se refiere al grado de identidad o correspondencia entre secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos de proteínas que pueden o no compartir un origen evolutivo común (véase Reeck et al., supra). Sin embargo, en el uso común y en la presente solicitud, el término "homólogo", cuando se modifica con un adverbio tal como "muy", puede hacer referencia a la similitud de la secuencia y no a un origen evolutivo común.

En una realización específica, dos secuencias de ADN son "sustancialmente homólogas" o "sustancialmente similares" cuando al menos aproximadamente 50% (preferiblemente al menos aproximadamente 75%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 90 ó 95%) de los nucleótidos se corresponden entre sí a lo largo de la longitud definida de las secuencias de ADN. Las secuencias que son sustancialmente homólogas, pueden identificarse comparando las secuencias usando el programa informático convencional disponible en bancos de datos de secuencias, o en un experimento de hibridación de tipo Southern, por ejemplo, en condiciones rigurosas como las definidas para ese sistema particular. La definición de las condiciones de hibridación apropiadas, está dentro del alcance de la técnica. Véase, por ejemplo, Maniatis y col., mencionado anteriormente; DNA Cloning, Vol. I y II, mencionado anteriormente; Nucleic Acid Hybridization, supra.

De manera similar, en una realización particular, dos secuencias de ácido nucleico son "sustancialmente homólogas" o "sustancialmente similares" cuando más de 30% de los aminoácidos son idénticos o más de aproximadamente 60% son similares (funcionalmente idénticos). Preferiblemente, las secuencias similares u homólogas se identifican por alineamiento usando, por ejemplo, el programa de apilamiento GCG (Genetics Computer Group, Manual del Programa para el Paquete GCG, Versión 7, Madison, Wisconsin).

La expresión "correspondiente a" se usa en este documento para hacer referencia a secuencias similares u homólogas, tanto si la posición exacta es idéntica como si es diferente de la de la molécula con la que se mide la homología o similitud. Una alineación de las secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos puede incluir espacios. De esta manera, la expresión "correspondiente a" se refiere a la similitud de la secuencia y no a la numeración de los residuos aminoacídicos o de las bases nucleotídicas.

Un gen que codifica MIF1, tanto ADN genómico como ADNc, se puede aislar a partir de cualquier fuente, particularmente a partir de un ADNc humano o de una genoteca genómica. Los métodos para obtener el gen MIF1 son bien conocidos en la técnica, como se ha descrito anteriormente (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Por consiguiente, cualquier animal puede servir como fuente de ácido nucleico para la clonación molecular de un gen MIF1. El ADN se puede obtener mediante procedimientos convencionales, conocidos en la técnica a partir de ADN clonado (p. ej., una "genoteca" de ADN), y preferentemente se obtiene a partir de una genoteca de ADNc preparada a partir de tejidos con alto nivel de expresión de la proteína (p. ej., corazón, páncreas y ADNc de músculo esquelético, puesto que estas son las células que indican altos niveles de expresión de MIF1), mediante síntesis química, mediante clonación de ADNc o mediante clonación de ADN genómico o fragmentos de los mismos, purificados a partir de la célula deseada (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra; Glover, D.M. (ed.), 1985, ADN Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, Reino Unido, Vol. I, II). Los clones obtenidos a partir de ADN genómico pueden contener regiones de ADN reguladoras e intrones, además de las regiones codificantes; los clones obtenidos a partir de ADNc no contendrán secuencias de intrones. En una realización específica, fue aislado MIF1 a partir de una genoteca de células Hela. Sea cual sea la fuente, el gen debe clonarse molecularmente en un vector apropiado para la propagación del gen.

Una vez que se han generado los fragmentos de ADN, se puede realizar de distintas formas la identificación del fragmento de ADN específico que contiene el gen MIF1 deseado. Por ejemplo, los fragmentos de ADN se pueden seleccionar mediante hibridación de los ácidos nucleicos con una sonda marcada (Benton y Davis, 1977, Science 196:180; Grunstein y Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961). Los fragmentos de ADN que tienen una homología sustancial con la sonda, se hibridarán. Tal y como se ha indicado anteriormente, se puede emplear el mayor grado de homología y las condiciones de hibridación más restrictivas. En una realización específica, se emplean condiciones de hibridación de tipo Northern para identificar variantes por corte y empalme del ARNm de un gen
MIF1.

Una selección adicional se puede realizar basándose en las propiedades del gen, p. ej., si el gen codifica un producto proteico que tiene la composición de aminoácidos isoeléctrica y electroforética o una secuencia parcial de los aminoácidos de la proteína MIF1 tal y como se ha descrito anteriormente. Por tanto, la presencia del gen se puede detectar mediante ensayos basados en las características físicas, químicas o inmunológicas de su producto expresado. Por ejemplo, se pueden seleccionar clones de ADNc o clones de ADN seleccionados por hibridación con los ARNm adecuados, que producen una proteína que, p. ej., tiene una migración electroforética similar o idéntica un comportamiento electroforético en gel con enfoque isoeléctrico o sin pH de equilibrio, mapas de digestión proteolítica o propiedades antigénicas como las conocidas para MIF 1. En una realización específica, la proteína expresada se reconoce mediante un anticuerpo policlonal que es generado contra los aminoácidos 16-28 de MIF1.

La presente invención también se refiere a genes (por ejemplo, cADN) que codifican variantes alélicas, variantes de empalme, análogos, y los derivados de MIF1 de la invención, que tienen la misma o una actividad funcional homóloga a la MIF1, y sus homólogos a partir de otras especies. La producción y el uso de derivados y análogos relacionados con MIF1 están dentro del alcance de la presente invención. En una realización específica, el derivado o el análogo está funcionalmente activo, es decir, es capaz de mostrar una o varias actividades funcionales asociadas con una MIF1 de tipo silvestre de longitud completa de la invención. En particular, dicho análogo o derivado puede regular la actividad de MEKK. De forma alternativa, una variante alélica puede comprender una mutación que da como resultado la incapacidad de MIF1 de regular la actividad de MEKK.

Los derivados de MIF1 pueden obtenerse alterando secuencias de ácido nucleico codificantes por sustituciones, adiciones o deleciones que proporcionan moléculas funcionalmente equivalentes. Preferiblemente, se obtienen derivados que tienen una actividad funcional potenciada o aumentada con respecto a la proteína MIF1 nativa.

Debido a la degeneración de las secuencias nucleotídicas codificantes, en la práctica de la presente invención pueden usarse otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que un gen MIF1, incluyendo una secuencia de aminoácidos que contiene una variante de un solo aminoácido. Éstas incluyen, pero sin limitación, genes alélicos, genes homólogos procedentes de otras especies y secuencias de nucleótidos que comprenden todo o partes de los genes MIF1 los cuales se han alterado por la sustitución de diferentes codones que codifican el mismo residuo de aminoácido dentro de la secuencia, produciendo de esta manera un cambio silencioso. De manera similar, los derivados de MIF1 de la invención incluyen, pero sin estar limitados a los mismos, los que contienen, como secuencia de aminoácidos primaria, toda o parte de la secuencia de aminoácidos de una proteína MIF1 incluyendo secuencias alteradas en las que residuos dentro de la secuencia se sustituyen por residuos de aminoácidos funcionalmente equivalentes, dando como resultado una sustitución de aminoácidos conservadora. Por ejemplo, uno o más residuos aminoacídicos dentro de la secuencia pueden sustituirse por otro aminoácido de polaridad similar, que actúa como equivalente funcional, dando como resultado una alteración silenciosa. Los sustituyentes para un aminoácido dentro de la secuencia pueden seleccionarse entre otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos que contienen estructuras de anillo aromático son fenilalanina, triptófano y tirosina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. No es de esperar que estas alteraciones afecten al peso molecular aparente determinado por electroforesis en gel de poliacrilamida o al punto
isoeléctrico.

Son sustituciones particularmente preferidas:

\bullet: Arg por Lys y viceversa, de tal manera que pueda mantenerse la carga positiva;

\bullet: Asp por Glu y viceversa de tal manera que pueda mantenerse la carga negativa;

\bullet: Thr por Ser, de tal manera que pueda mantenerse un -OH libre; y

\bullet: Gln por Asn de tal manera que pueda mantenerse un CONH_{2} libre.

También pueden introducirse sustituciones de aminoácidos para sustituir un aminoácido por otro con una característica particularmente preferida. Por ejemplo, una Cys puede introducir un sitio potencial para puentes disulfuro con otra Cys. Una His puede introducirse como un sitio particularmente "catalítico" (es decir, His puede actuar como un ácido o base y es el aminoácido más común en la catálisis bioquímica). Pro puede introducirse debido a su estructura particularmente plana, que induce giros b en la estructura de la proteína.

Los genes que codifican derivados de MIF1 y los análogos de la invención, se pueden producir mediante diversos métodos conocidos en la técnica. Las manipulaciones que tienen como resultado su producción, pueden realizarse a nivel génico o a nivel proteico. Por ejemplo, la secuencia del gen MIF1 clonado puede modificarse por cualquiera de numerosas estrategias conocidas en la técnica (Sambrook et al., 1989, supra). La secuencia puede escindirse en sitios apropiados con una o más endonucleasas de restricción, seguido de una modificación enzimática adicional, y si se desea aislarse y ligarse in vitro. En la producción del gen que codifica un derivado o análogo de MIF1, debe tenerse cuidado de asegurar que el gen modificado permanece dentro de la misma fase de lectura de traducción que el gen de MIF1, sin interrumpirse por señales de parada de la traducción, en la región del gen en la que se codifica la actividad deseada.

Adicionalmente, la secuencia de ácido nucleico que codifica MIF1 se puede mutar in vitro o in vivo, para crear y/o destruir secuencias de la traducción, iniciación y/o terminación, o para crear variaciones en las regiones codificadoras y/o formar nuevos sitios para las endonucleasas de restricción o destruir los ya existentes, para facilitar una modificación adicional in vitro. Preferentemente, tales mutaciones potencian la actividad funcional del producto génico mutado de MIF1. Puede usarse cualquier técnica para mutagénesis conocida en la técnica, incluyendo pero sin limitación, la mutagénesis dirigida in vitro (Hutchinson, C., y col., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551; Zoller y Smith, 1984, DNA 3:479-488; Oliphant y col., 1986, Gene 44:177; Hutchinson y col., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:710), y el uso de enlazadores TAB® (Pharmacia), etc. Para la mutagénesis dirigida al sitio, se prefieren técnicas de PCR (véase Higuchi, 1989, "Using PCR to Engineer DNA", en PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press, Capítulo 6, páginas, 61-70).

El gen identificado y aislado puede insertarse después en un vector de clonación apropiado. Puede usarse un gran número de sistemas de vector-hospedador conocidos en la técnica. Los posibles vectores incluyen, pero sin limitación, plásmidos o virus modificados, pero el sistema del vector puede ser compatible con la célula hospedadora usada. Ejemplos de vectores incluyen, sin estar limitados a los mismos, E. coli, bacteriófagos tales como el derivados de lambda, o plásmidos tales como derivados de pBR322 o derivados del plásmido pUC, p. ej., vectores pGEX, pmal-c, pFLAG, etc. La inserción en un vector de clonación se puede realizar, p. ej., ligando el fragmento de ADN en un vector de clonación que tenga extremos cohesivos complementarios. Sin embargo, si los sitios de restricción complementarios usados para fragmentar el ADN no están presentes en el vector de clonación, los extremos de las moléculas de ADN pueden modificarse enzimáticamente. Como alternativa, puede producirse cualquier sitio deseado uniendo secuencias de nucleótidos (enlazadores) a los extremos del ADN; estos enlazadores ligados pueden comprender oligonucleótidos específicos sintetizados químicamente que codifican secuencias de reconocimiento de las endonucleasas de restricción. Las moléculas recombinantes pueden introducirse en las células hospedadoras por transformación, transfección, infección, electroporación, etc. de manera que se generen muchas copias de la secuencia del gen. Preferiblemente, el gen clonado está contenido en un plásmido de vector lanzadera que proporciona expansión en una célula de clonación, por ejemplo, E. coli, y facilita la purificación para una inserción posterior en una línea celular de expresión apropiada, si se desea. Por ejemplo, un vector lanzadera, que es un vector que puede replicarse en más de un tipo de organismo, puede prepararse para replicación tanto en E. coli como en Saccharomyces cerevisiae por medio de la unión de secuencias de un plásmido de E. coli con secuencias del plásmido 2m de levadura.

Expresión de Polipéptidos MIF1

La secuencia de nucleótidos que codifica MIF1, o un fragmento antigénico, un derivado o un análogo de la misma, o un derivado funcionalmente activo que incluye una proteína quimérica de la misma, se puede insertar en un vector de expresión adecuado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y la traducción de la secuencia insertada codificadora de la proteína. Estos elementos se denominan en este documento un "promotor". Por tanto, el ácido nucleico que codifica MIF1 de la invención está funcionalmente asociado a un promotor en un vector de expresión de la invención. Tanto las secuencias de ADNc como las secuencias genómicas pueden clonarse y expresarse bajo el control de estas secuencias reguladoras. Un vector de expresión preferiblemente también incluye un origen de replicación.

Las señales de transcripción y traducción necesarias pueden proporcionarse en un vector de expresión recombinante, o pueden suministrarse por el gen nativo que codifica MIF1 y/o sus regiones flanqueantes.

Los posibles sistemas de hospedador-vector incluyen, pero sin limitación, sistemas de células de mamífero infectadas con virus (por ejemplo, virus vaccinia, adenovirus, etc.); sistemas de células de insecto infectadas con virus (por ejemplo, baculovirus); microorganismos tales como levaduras que contienen vectores de levadura; o bacterias transformadas con bacteriófagos, ADN, ADN plasmídico o ADN cosmídico. Los elementos de expresión de los vectores varían en sus intensidades y especificidades. Dependiendo del sistema hospedador-vector utilizado, puede usarse cualquiera entre varios elementos de la transcripción y la traducción adecuados.

Una proteína de MIF1 recombinante de la invención o un fragmento funcional, un derivado, una estructura artificial quimérica o un análogo de la misma, se puede expresar en el cromosoma, después de integrar la secuencia codificante por recombinación. A este respecto, puede usarse cualquiera de varios sistemas de amplificación para conseguir altos niveles de expresión génica estable (véase Sambrook et al., 1989, supra).

La célula en la que está el vector recombinante que comprende el ácido nucleico que codifica MIF1 se cultiva en un medio de cultivo celular apropiado en condiciones que permiten la expresión de MIF1 por la célula.

Para construir vectores de expresión que contienen un gen que consta de las señales de control de la transcripción/traducción apropiadas y las secuencias codificantes de la proteína, puede usarse cualquiera de los métodos descritos previamente para la inserción de fragmentos de ADN en un vector de clonación. Estos métodos pueden incluir técnicas sintéticas y técnicas de ADN recombinante in vitro y recombinación in vivo (recombinación genética).

La expresión de la proteína MIF1 puede controlarse por cualquier elemento promotor/potenciador conocido en la técnica, pero estos elementos reguladores deben ser funcionales en el hospedador seleccionado para la expresión. Los promotores que pueden usarse para controlar la expresión del gen de MIF1 incluyen, pero sin limitación, la región promotora temprana de SV40 (Benoist y Chambon, 1981, Nature 290:304-310), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus del Sarcoma de Rous (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797), el promotor de timidina quinasa de herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de metalotioneína (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); vectores de expresión procarióticos tales como el promotor de la b-lactamasa (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731), o el promotor tac (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25); véase también "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242:74-94; elementos promotores de la levadura u otros hongos tales como el promotor de Gal 4, el promotor de ADC (alcohol deshidrogenasa), el promotor de PGK (fosfoglicerol quinasa), el promotor de la fosfatasa alcalina; y regiones de control de la transcripción de animales, que presentan especificidad del tejido y se han utilizado en animales transgénicos: la región de control del gen I de la elastasa que es activo en las células acinares pancreáticas (Swift y col., 1984, Cell, 38:639-646; Ornitz y col., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); la región de control del gen de la insulina que está activo en las células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature, 315:115-122), la región de control del gen de inmunoglobulina que está activo en las células linfoides (Grosschedl y col., 1984, Cell, 38:647-658; Adames y col., 1985, Nature 318:533-538; Alexander y col., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), la región de control del virus de tumor mamario de ratón que está activo en los testículos, la mama, las células linfoides y los mastocitos (Leder y col., 1986, Cell 45:485-495), la región de control del gen de la albúmina que está activo en el hígado (Pinkert y col., 1987, Genes and Devel. 1:268-276), la región de control del gen de la alfa-fetoproteína que está activo en el hígado (Krumlauf y col., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer y col., 1987, Science 235:53-58), la región de control del gen de alfa 1-antitripsina que está activo en el hígado (Kelsey y col., 1987, Genes y Devel. 1:161-171), la región de control del gen de la beta-globina que está activo en las células mieloides (Mogram y col., 1985, Nature 315:338-340; Kollias y col., 1986, Cell, 46:89-94), la región de control del gen de la proteína básica de mielina que está activo en las células oligodendrocíticas del cerebro (Readhead y col., 1987, Cell, 48:703-712), la región de control del gen de la cadena ligera-2 de miosina que está activo en el músculo esquelético (Sani, 1985, Nature, 314:283-286) y la región de control del gen de la hormona de liberación gonadotrópica que está activo en el hipotálamo (Mason y col., 1986, Science, 234:1372-1378).

Los vectores de expresión que contienen ácido nucleico que codifica una MIF1 de la invención, se pueden identificar por cinco estrategias generales: (a) amplificación con PCR del ADN plasmídico deseado o del ARNm específico, (b) hibridación del ácido nucleico, (c) presencia o ausencia de funciones de selección del gen marcador, (d) análisis con endonucleasas de restricción adecuadas, y (e) expresión de secuencias insertadas. En la cebadora estrategia, los ácidos nucleicos se pueden amplificar con PCR para proporcionar la detección del producto amplificado. En la segunda estrategia, la presencia de un gen ajeno insertado en un vector de expresión, se puede detectar con la hibridación del ácido nucleico, empleando sondas que comprenden secuencias que son homólogas a un gen marcador insertado. En la tercera estrategia, el sistema recombinante vector/hospedador se puede identificar y seleccionar basándose en la presencia o la ausencia de ciertas funciones "marcadores para la selección" del gen (p. ej., actividad \beta-galactosidasa, actividad timidina-quinasa, resistencia a antibióticos, fenotipo de transformación, formación de cuerpos de oclusión en baculovirus, etc.) debidas a la inserción de genes ajenos en el vector. En otro ejemplo, si el ácido nucleico que codifica MIF1 se inserta dentro de la secuencia génica del "marcador de selección" del vector, los recombinantes que contengan el inserto de MIF1, se pueden identificar por la ausencia de la función génica de MIF1. En la cuarta estrategia, los vectores de expresión recombinantes se identifican por la digestión con enzimas de restricción adecuadas. En la quinta estrategia, los vectores de expresión recombinantes se pueden identificar sometiendo a ensayo la actividad, las características bioquímicas o inmunológicas del producto génico expresado por el recombinante, con la condición de que la proteína expresada asuma una conformación funcionalmente activa.

En la expresión de las secuencias de ADN de esta invención puede emplearse una amplia diversidad de combinaciones de hospedador/vector de expresión. Los vectores de expresión útiles, por ejemplo, pueden consistir en segmentos de secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético. Los vectores adecuados incluyen derivados de SV40 y plásmidos bacterianos conocidos, por ejemplo, los plásmidos de E. coli col E1, pCR1, pBR322, pMa1-C2, pET, pGEX (Smith et al., 1988, Gene 67:31-40), pMB9 y sus derivados, plásmidos tales como RP4; ADN de fago, por ejemplo, los numerosos derivados del fago 1, por ejemplo, NM989, y otros ADN de fago, por ejemplo, ADN monocatenario de fago M13 y filamentoso; plásmidos de levadura tales como el plásmido 2m o derivados del mismo; vectores útiles en células eucariotas tales como vectores útiles en células de insecto o de mamífero; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADNs de fago, tales como plásmidos que se han modificado para emplear ADN de fago u otras secuencias de control de la expresión; y similares.

Por ejemplo, en un sistema de expresión de baculovirus, pueden usarse tanto vectores de transferencia sin fusión, tales como pero sin limitación, pVL941 (sitio de clonación BamHI; Summers), pVL1393 (sitio de clonación BamH1, SmaI, XbaI, EcoR1, NotI, XmaIII, BglII, y PstI; Invitrogen), pVL1392 (sitio de clonación BglII, PstI, NotI, XmaIII, EcoRI, XbaI, SmaI, y BamH1; Summers e Invitrogen), y pBlueBacIII (sitio de clonación BamH1, BglII, PstI, NcoI, y HindIII, siendo posible la selección de recombinantes de color azul/blanco; Invitrogen), como vectores de transferencia de fusión tales como, pero sin limitación, pAc700 (sitio de clonación BamH1 y KpnI, donde el sitio de reconocimiento BamH1 empieza con el codón de iniciación; Summers), pAc701 y pAc702 (igual que pAc700, con diferentes marcos de lectura), pAc360 (sitio de clonación de BamHI, 36 pares de bases aguas abajo de un codón de iniciación de polihedrina; Invitrogen (195)), y pBlueBacHisA, B, C (tres marcos de lectura diferentes, con sitio de clonación de BamHI, BglII, PstI, NcoI y HindIII, un péptido N-terminal para la purificación con ProBond, y un escrutinio de las placas recombinantes por el color azul/blanco; Invitrogen (220)).

Los vectores de expresión de mamífero contemplados para uso en la invención incluyen vectores con promotores inducibles tales como el promotor de la dihidrofolato reductasa (DHFR), por ejemplo, cualquier vector de expresión con un vector de expresión de DHFR, o un vector de co-amplificación de DHFR/metotrexato, tal como pED (sitio de clonación PstI, SalI, SbaI, SmaI, y EcoRI, expresando el vector tanto el gen clonado como DHFR; véase Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology, 16.12 (1991)). Como alternativa, puede usarse un vector de co-amplificación de glutamina sintetasa/metionina sulfoximina, tal como pEE14 (sitio de clonación de HindIII, XbaI, SmaI, SbaI, EcoRI, y BclI, en el que el vector expresa la glutamina sintasa y el gen clonado; Celltech). En otra realización, puede usarse un vector que dirige la expresión episómica bajo el control del Virus de Epstein Barr (EBV), tal como pREP4 (sitio de clonación BamH1, SfiI, XhoI, NotI, NheI, HindIII, NheI, PvuII, y KpnI, Repetición Terminal Larga del Virus del Sarcoma de Rous constitutivo (RSV-LTR) marcador de selección de higromicina; Invitrogen), pCEP4 (sitio de clonación de BamHI, SfiI, XhoI, NotI, NheI, HindIII, NheI, PvuII y KpnI, el gen temprano inmediato de citomegalovirus humano constitutivo (hCMV), el marcador de selección de higromicina; Invitrogen), pMEP4 (sitio de clonación KpnI, PvuI, NheI, HindIII, NotI, XhoI, SfiI, BamH1, promotor del gen de la metalotioneína IIa inducible, marcador de selección de higromicina; Invitrogen), pREP8 (sitio de clonación BamH1, XhoI, NotI, HindIII, NheI, y KpnI, promotor de RSV-LTR, marcador de selección de histidinol; Invitrogen), pREP9 (sitio de clonación KpnI, NheI, HindIII, NotI, XhoI, SfiI, y BamHI, promotor de RSV-LTR, marcador de selección de G418; Invitrogen), y pEBVHis (promotor de RSV-LTR, marcador de selección de la higromicina, péptido N-terminal purificable por medio de una resina ProBond y escindido por enteroquinasa; Invitrogen). Los vectores de expresión en mamífero que pueden seleccionarse para uso en la invención incluyen pRc/CMV (sitio de clonación de HindIII, BstXI, NotI, SbaI, y ApaI, selección con G418; Invitrogen), pRc/RSV (sitio de clonación de HindIII, SpeI, BstXI, NotI, XbaI, selección con G418; Invitrogen), y otros. Los vectores de expresión en mamífero del virus vaccinia (véase, Kaufman, 1991, mencionado anteriormente) para uso de acuerdo con la invención, incluyen pero no están limitados a pSC 11 (sitio de clonación de SmaI, selección con TK y \beta-gal), pMJ601 (sitio de clonación de SalI, SmaI, AflI, NarI, BspMII, BamHI, ApaI, NheI, SacII, KpnI, y HindIII; selección con TK- y \beta-gal), y pTKgptF1S (sitio de clonación EcoRI, PstI, SalI, AccI, HindII, SbaI, BamHI, y Hpa, selección con TK o XPRT).

De acuerdo con la invención también pueden usarse sistemas de expresión en levadura para expresar MIF 1. Por ejemplo, de acuerdo con la invención puede emplearse el vector pYES2 sin fusión (sitio de clonación XbaI, SphI, ShoI, NotI, GstXI, EcoRI, BstXI, BamH1, SacI, Kpn1, y HindIII; Invitrogen) o la fusión pYESHisA, B, C (sitio de clonación de XbaI, SphI, ShoI, NotI, BstXI, EcoRI, BamHI, SacI, KpnI, y HindIII, péptido N-terminal purificado con resina ProBond y escindido con enteroquinasa; Invitrogen), por mencionar sólo dos.

Una vez que se ha identificado y aislado una molécula de ADN recombinante particular, pueden usarse diversos métodos conocidos en la técnica para propagarla. Una vez establecido un sistema hospedador y las condiciones de crecimiento adecuadas, pueden propagarse y prepararse grandes cantidades de vectores de expresión recombinante. Como se ha explicado previamente, los vectores de expresión que pueden usarse incluyen, pero sin limitación, los siguientes vectores o sus derivados: virus humanos o animales tales como virus vaccinia o adenovirus; virus de insectos tales como baculovirus; vectores de levadura; vectores de bacteriófago (por ejemplo, lambda), y vectores de ADN plasmídico y cosmídico, por nombrar algunos.

Además, puede elegirse una cepa de células hospedadoras que module la expresión de las secuencias insertadas o modifique y procese el producto génico en la forma específica deseada. Las diferentes células hospedadoras tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento transduccional y post-traduccional y la modificación de proteínas. Pueden elegirse líneas celulares o sistemas hospedadores apropiados para asegurar la modificación y el procesamiento deseados de la proteína extraña expresada. La expresión en levaduras puede producir un producto biológicamente activo. La expresión en células eucariotas puede aumentar la probabilidad de plegamiento "natural". Además, la expresión en células de mamífero puede proporcionar una herramienta para reconstituir o constituir la actividad de MIF1. Además, diferentes sistemas de expresión de vector/hospedador pueden afectar a las reacciones de procesamiento, tales como escisiones proteolíticas, en una medida diferente.

Se introducen vectores en las células hospedadoras deseadas por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, DEAE dextrano, precipitación con fosfato cálcico, lipofección (fusión de lisosomas), uso de una pistola génica o un transportador de vector de ADN (véase, por ejemplo, Wu et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967; Wu y Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263:14621-14624; Hartmut y col., Solicitud de Patente Canadiense Nº 2.012.311, presentada el 15 de marzo de 1990).

Pueden obtenerse formas solubles de la proteína recogiendo el fluido del cultivo o solubilizando cuerpos de inclusión, por ejemplo, por tratamiento con detergente, y si se desea someter a ultrasonidos u a otros procesos mecánicos, tales como los que se han descrito anteriormente. La proteína solubilizada o soluble se puede aislar empleando diversas técnicas, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), enfoque isoeléctrico, electroforesis en gel bidimensional, cromatografía (p. ej., de intercambio iónico, de afinidad, de inmunoafinidad, y cromatografía en columna por tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, inmunoprecipitación o por cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas.

Anticuerpos frente a MIF1

De acuerdo con la invención, como antígeno o inmunógeno para generar anticuerpos que reconocen el polipéptido MIF1 puede usarse un polipéptido MIF1 producido de manera recombinante o por síntesis química, y fragmentos u otros derivados o análogos del mismo, incluyendo proteínas de fusión. Una molécula es "antigénica" cuando puede interaccionar de forma específica con una molécula de reconocimiento de antígeno del sistema inmune, tal como una inmunoglobulina (anticuerpo) o un receptor de antígenos de linfocitos T. Un polipéptido antigénico contiene al menos aproximadamente 5 y preferiblemente al menos aproximadamente 10 aminoácidos. Una parte antigénica de una molécula puede ser la parte que es inmunodominante para el reconocimiento del anticuerpo o del receptor de linfocitos T, o puede ser una parte usada para generar un anticuerpo contra la molécula, por conjugación de la parte antigénica con una molécula de soporte para la inmunización. Una molécula que es antigénica no necesita ser inmunógena, es decir, capaz de inducir una respuesta inmune sin un soporte.

Estos anticuerpos incluyen, pero sin limitación, anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos, monocatenarios, fragmentos Fab, y una biblioteca de expresión de Fab. Los anticuerpos anti-MIF1 de la invención pueden reaccionar de forma cruzada, p. ej., pueden reconocer MIF1 procedente de diferentes especies. Los anticuerpos policlonales tienen mayor probabilidad de presentar reacción cruzada. De forma alternativa, un anticuerpo de la invención puede ser específico para una sola forma de MIF1, tal como MIF1 murino. Preferiblemente, dicho anticuerpo es específico para el polipéptido MIF1 humano.

Para la producción de anticuerpos policlonales contra el polipéptido MIF1 o un derivado o análogo del mismo pueden usarse diversos procedimientos conocidos en la técnica. Para la producción de anticuerpos, diversos animales hospedadores pueden inmunizarse por inyección con el polipéptido MIF1, o un derivado (por ejemplo, fragmento o proteína de fusión) del mismo, incluyendo pero sin limitación conejos, ratones, ratas, ovejas, cabras, etc. En una realización, el polipéptido MIF1 o el fragmento del mismo puede conjugarse con un soporte inmunogénico, por ejemplo, albúmina de suero bovino (BSA) o hemocianina de lapa californiana (KLH). Para aumentar la respuesta inmunológica pueden usarse diversos adyuvantes, dependiendo de la especie del hospedador, que incluyen pero sin limitación, adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles pluronic, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles, tales como BCG (bacilo Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales dirigidos hacia el polipéptido MIF1 o un fragmento, análogo derivado del mismo, puede usarse cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo. Estas técnicas incluyen, pero sin limitación, la técnica del hibridoma desarrollada originalmente por Kohler y Milstein [Nature 256:495-497 (1975)], así como la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de linfocitos B humanos [Kozbor y col., Immunology Today 4:72 1983); Cote y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030 (1983)], y la técnica de hibridoma de EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos [Cole y col., en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96 (1985)]. En una realización adicional de la invención, pueden producirse anticuerpos monoclonales en animales exentos de patógenos [documento de Publicación de la Patente Internacional Nº WO 89/12690, publicada el 28 de diciembre de 1989]. De hecho, de acuerdo con la invención, pueden usarse técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" [Morrison y col., J. Bacteriol. 159:870 (1984); Neuberger y col., Nature 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985)] por corte y empalme de los genes procedentes de una molécula de anticuerpo de ratón, específica para un polipéptido de Akt3, junto con genes procedentes de una molécula de anticuerpo humana con la actividad biológica apropiada; estos anticuerpos están dentro del alcance de esta invención. Estos anticuerpos quiméricos humanos o humanizados se prefieren para uso en la terapia de enfermedades o trastornos humanos (descritos más adelante), ya que los anticuerpos humanos o humanizados tienen mucha menos probabilidad de inducir una respuesta inmune, que los anticuerpos xenogénicos en particular una respuesta alérgica, por sí mismos.

De acuerdo con la invención, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos Fv monocatenarios (scFv) [documentos de Patentes de Estados Unidos Nº 5.476.786 y 5.132.405 de Huston; Patente de Estados Unidos
4.946.778] pueden adaptarse para producir anticuerpos monocatenarios específicos para el polipéptido MIF1. Una realización adicional de la invención utiliza las técnicas descritas para la construcción de genotecas de expresión de Fab [Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989)] para permitir una identificación rápida y fácil de los fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada hacia un polipéptido de MIF1, o sus derivados o análogos.

Pueden generarse fragmentos de anticuerpo que contienen el idiotipo de la molécula del anticuerpo por técnicas conocidas. Por ejemplo, estos fragmentos incluyen, pero sin limitación: el fragmento F(ab')_{2} que puede producirse por digestión con pepsina de la molécula del anticuerpo; los fragmentos Fab' que pueden generarse reduciendo los puentes disulfuro del fragmento F(ab')_{2} y los fragmentos Fab que pueden generarse tratando la molécula del anticuerpo con papaína y un agente reductor.

En la producción de anticuerpos, la selección del anticuerpo deseado puede realizarse por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, radioinmunoensayo, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima), inmunoensayos de tipo "sándwich", radioinmunoensayos, reacciones de precipitación de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ (usando oro coloidal, marcadores enzimáticos o radioisotópicos, por ejemplo), transferencias de tipo Western, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (por ejemplo, ensayos de aglutinación en gel y ensayos de hemaglutinación), ensayos de fijación del complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis, etc. En una realización, la unión del anticuerpo se detecta detectando un marcador en el anticuerpo primario. En otra realización, el anticuerpo primario se detecta detectando la unión de un anticuerpo secundario o reactivo al anticuerpo primario. En otra realización, el anticuerpo secundario está marcado. Se conocen muchos métodos en la técnica para detectar la unión en un inmunoensayo y están dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, para seleccionar anticuerpos que reconocen un epítopo específico de un polipéptido de MIF1 se pueden someter a ensayo hibridomas generados para un producto que se une a un fragmento de polipéptido de MIF1 que contiene tal epítopo. Para la selección de un anticuerpo específico contra un polipéptido de MIF1 procedente de una especie particular de animal, se puede seleccionar basándose en la unión positiva con el polipéptido de MIF1 expresado o aislado a partir de células de esa especie de animal.

Los anticuerpos anteriores pueden usarse en métodos conocidos en la técnica, relacionados con la localización y la actividad del polipéptido de MIF1, por ejemplo, para la transferencia de tipo Western, la formación de imágenes del polipéptido de MIF1 in situ, medición de sus niveles en muestras fisiológicas apropiadas, etc, usando cualquiera de las técnicas de detección mencionadas anteriormente o conocidas en la técnica.

En una realización específica, pueden generarse anticuerpos que agonizan o antagonizan la actividad del polipéptido MIF1. Estos anticuerpos pueden someterse a ensayo con los ensayos descritos más adelante para identificar ligandos. En particular, estos anticuerpos pueden ser anticuerpos scFv expresados intracelularmente.

Ensayos de Selección

La identificación y el aislamiento de un gen que codifica una proteína MIF1 de la invención proporciona una expresión de MIF1 en cantidades superiores a las que se pueden aislar a partir de fuentes naturales, o en células indicadoras que se manipulan por ingeniería genética, especialmente para indicar la actividad de MIF1 expresada después de la transfección o la transformación de las células. Por consiguiente, además del diseño racional de agonistas y antagonistas basándose en la estructura del polipéptido MIF1, la presente invención contempla un método alternativo para identificar ligandos específicos de MIF1 usando diversos ensayos de escrutinio conocidos en la técnica.

Para seleccionar agonistas o antagonistas de MIF1 o para seleccionar antagonistas de la unión de MIF1/MEKK1 puede usarse cualquier método de selección conocido en la técnica.

La presente invención contempla selecciones de ligandos de molécula pequeña, análogos de ligando y miméticos, así como selecciones de ligandos naturales que se unen y agonizan o antagonizan el polipéptido MIF1 in vivo. Por ejemplo, pueden seleccionarse bibliotecas de productos naturales usando ensayos de la invención para moléculas que agonizan o antagonizan la actividad de MIF1.

Las moléculas o compuestos que agonizan o antagonizan la actividad de MIF1 y/o que modulan la interacción de MIF1/MEKK pueden proporcionar una nueva vía para prevenir y/o tratar patologías que están implicadas en la desregulación de la apoptosis celular u otras patologías como inflamación y asma, inmunodepresión, isquemia cardíaca o hipertrofia, síndromes mielodisplásicos, trastornos neurodegenerativos, trastornos degenerativos hepáticos, enfermedades autoinmunes, infecciones virales, SIDA, patologías relacionadas con trastornos de la angiogénesis, artritis reumatoide, defectos de la curación de heridas, aterosclerosis, retinopatía diabética, sarcoma de Kaposi, psoriasis, etc.

A este respecto, la invención también proporciona un método para tratar a un individuo que tiene necesidad de inhibir o activar la actividad de MIF1o que tiene necesidad de regular la actividad de MEKK que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de moléculas o compuestos que agonizan o antagonizan la actividad de MIF1 y/o que modulan la interacción de MIF1/MEKK. La invención proporciona el uso de estas moléculas o compuestos para la preparación de un medicamento.

Un conocimiento de la secuencia primaria de MIF1, y la similitud de esta secuencia con proteínas de función conocida, puede proporcionar una pista inicial sobre los inhibidores o los antagonistas de la proteína. La identificación y el escrutinio de antagonistas se facilita adicionalmente, determinando las características estructurales de la proteína, por ejemplo, usando cristalografía de rayos X, difracción de neutrones, espectrometría con resonancia magnética nuclear y otras técnicas para la determinación de la estructura. Estas técnicas proporcionan el diseño racional o la identificación de agonistas y antagonistas.

Otra estrategia usa un bacteriófago recombinante para producir genotecas grandes. Usando el "método de fago" [Scott y Smith, 1990, Science 249:386-390 (1990); Cwirla, et al., Proc. Natl. Acad Sci., 87:6378-6382 (1990); Devlin et al., Science, 249:404-406 (1990)], pueden construirse bibliotecas muy grandes (10^{6}-10^{8} entidades químicas). Una segunda estrategia usa métodos principalmente químicos, de los que son ejemplos el método de Geysen [Geysen et al., Molecular Immunology 23:709-715 (1986); Geysen y col., J. Immunologic Method 102:259-274 (1987)] y el método de Fodor y col. [Science 251:767-773 (1991)]. Furka et al. [14th International Congreso de Bioquímica, Volumen 5, Resumen FR:013 (1988); Furka, Int. J. Peptide Protein Res. 37:487-493 (1991)], Houghton [documento de Patente de Estados Unidos Nº 4.631.211, expedida en diciembre de 1986] y Rutter y col. [documento de Patente de Estados Unidos Nº 5.010.175, expedida el 23 de abril de 1991] describen métodos para producir una mezcla de péptidos que se pueden someter a ensayo como agonistas o antagonistas.

En otro aspecto, pueden usarse bibliotecas sintéticas [Needels et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10700-4 (1993); Ohlmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926 (1993); Lam y col., documento de Publicación de Patente Internacional Nº WO 92/00252; Kocis et al., documento de Publicación de Patente Internacional No. WO 9428028, ], y similares, se pueden utilizar para escrutar ligandos de MIF1, de acuerdo con la presente invención.

La selección puede realizarse con células recombinantes que expresan MIF1, o como alternativa, usando proteína purificada, por ejemplo, producida de forma recombinante, como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, la capacidad de MIF1 marcado y soluble que incluye la porción de unión de MEKK de la molécula, puede usarse para rastrear genotecas, como se describe en las referencias anteriores.

En una realización, MIF1 puede marcarse directamente. En otra realización, puede usarse un reactivo secundario marcado para detectar la unión de MIF1 a una molécula de interés, por ejemplo, una molécula unida a un soporte en fase sólida. La unión puede detectarse por la formación in situ de un cromóforo, a través de un marcador enzimático. Las enzimas adecuadas incluyen, pero sin limitación, fosfatasa alcalina y peroxidasa de rábano picante. En otra realización, puede usarse un ensayo de dos colores, usando dos sustratos cromógenos con dos marcadores enzimáticos, en diferentes moléculas aceptoras de interés. Los ligandos con reacción cruzada y con una sola reacción, pueden identificarse con un ensayo de dos colores.

Otros marcadores para uso en la invención incluyen perlas de látex coloreadas, perlas magnéticas, marcadores fluorescentes (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceno (FITC), ficoeritrina (PE), rojo Texas (TR), rodamina, sales de la serie de los lantánidos libres o quelados, especialmente Eu^{3+}, por nombrar algunos fluoróforos), moléculas quimioluminiscentes, radio-isótopos o marcadores de formación de imágenes de resonancia magnética. Pueden realizarse ensayos de dos colores con dos o más perlas de látex coloreadas o fluoróforos que emiten a diferentes longitudes de onda. El compuesto marcado puede detectarse visualmente o por medios mecánicos/ópticos. Los medios mecánicos/ópticos incluyen la clasificación activada por fluorescencia, es decir, un método análogo a FACS, y los medios de eliminación con micromanipulador.

Como se ejemplifica en este documento, el nivel de la proteína MIF1 puede evaluarse por medio del marcaje metabólico de las proteínas. Como la marcación metabólica se produce durante la incubación in vitro de la biopsia de tejido, en presencia de medio de cultivo suplementado con [^{35}S]-metionina, el nivel de cada uno de los marcadores detectados puede verse afectado por las condiciones in vitro. Además de la marcación metabólica (o biosintética) con [^{35}S]-metionina, la invención además contempla la marcación con [^{14}C]-aminoácidos y [^{3}H]-aminoácidos (con el tritio sustituido en las posiciones no lábiles). De esta manera, una muestra o biblioteca de compuestos puede analizarse directamente después del marcaje de las proteínas, por ejemplo, por tinción colorimétrica usando plata, oro, azul de coomassie, o amido-schwartz, por mencionar algunas técnicas; marcaje isotópico, por ejemplo, con [^{32}P]-ortofosfato, [^{125}I], [^{131}I]; señales fluorescentes o quimioluminiscentes; y detección inmunológica con un anticuerpo marcado o una molécula de unión específica de un marcador.

También pueden usarse cADN de MIF1 y derivados en un sistema de dos-híbridos en el rastreo de levaduras para identificar ligandos a MIF1, agonistas o antagonistas de la unión de MIF1/MEKK1 y para identificar MAP4K que sean capaces de fosforilar a MEKK1.

Terapia Génica y Vectores Transgénicos

Como se ha descrito anteriormente, un "vector" es cualquier medio para la transferencia de un ácido nucleico de acuerdo con la invención, en una célula hospedadora. Los vectores preferidos son vectores víricos, tales como retrovirus, virus del herpes, adenovirus y virus asociados a adenovirus. Por tanto, un gen que codifica una proteína anti-angiogénica o un fragmento de un dominio del polipéptido de la misma, se introduce in vivo, ex vivo, o in vitro empleando un vector vírico o mediante la introducción directa del ADN. La expresión en tejidos diana puede realizarse dirigiendo el vector transgénico a células específicas, tal como con un vector vírico o un ligando de receptor, o usando un promotor con especificidad de tejido, o ambas cosas.

Los vectores de expresión de la invención se pueden emplear, tal y como se ha indicado anteriormente, para transfectar células para escrutar o someter a ensayo biológico los moduladores de la actividad de MIF1, o para entregar un gen MIF1 o un gen complementario de MIF1 in vivo o ex vivo para terapia génica, p. ej., para incrementar o disminuir el nivel de la actividad de MIF1. Un vector que expresa un scFv anti-MIF1 también puede introducirse usando las técnicas descritas más adelante.

Los vectores víricos habitualmente usados para dirigir hacia una diana in vivo o ex vivo y los procedimientos de terapia son vectores a base de ADN y vectores retrovíricos. Se conocen en la técnica métodos para construir y usar vectores víricos [véase, por ejemplo, Miller y Rosman, BioTechniques 7:980-990 (1992)]. Preferiblemente, los vectores víricos son defectuosos para la replicación, es decir, no son capaces de replicarse autónomamente en la célula diana. En general, el genoma de los vectores víricos defectuosos para la replicación que se usan en el alcance de la presente invención carecen al menos de una región que es necesaria para la replicación del virus en la célula infectada. Estas regiones pueden eliminarse (por completo o en parte), o volverse no funcionales por cualquier técnica conocida por un especialista en la técnica. Estas técnicas incluyen la retirada total, la sustitución (por otras secuencias, en particular por el ácido nucleico insertado), la deleción o la adición parcial de una o más bases en una región esencial (para la replicación). Dichas técnicas pueden realizarse in vitro (sobre el ADN aislado) o in situ, usando las técnicas de manipulación genética o por tratamiento con agentes mutagénicos. Preferiblemente, el virus defectuoso para la replicación conserva las secuencias de su genoma que son necesarias para encapsular las partículas víricas.

Los vectores víricos de ADN incluyen un virus de ADN atenuado o defectuoso, tal como, pero sin limitación, el virus del herpes simple (VHS), el papilomavirus, el virus de Epstein Barr (EBV), el adenovirus, el virus asociado a adenovirus (AAV), el virus vaccinia y similares. Los virus defectuosos, que carecen completamente o casi completamente de los genes víricos, son preferidos. Un virus defectuoso no es competente para la replicación después de la introducción en una célula, y por lo tanto no conduce a una infección vírica productiva. El uso de vectores víricos defectuosos permite la administración a células en un área específica y localizada, sin problemas de que el vector pueda infectar a otras células. Por lo tanto, puede fijarse como objetivo específicamente un tejido específico. Los ejemplos de vectores particulares incluyen, pero sin limitación, un vector del virus del herpes 1 (VHS1) defectuoso [Kaplitt y col., Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330 (1991)], un vector del virus del herpes defectuoso que carece de un gen de la glico-proteína L [Publicación de Patente RD 371005 A], u otros vectores del virus del herpes defectuosos [Publicación de Patente Internacional Nº WO 94/21807, publicada el 29 de septiembre de 1994; Publicación de Patente Internacional Nº WO 92/05263, publicada el 2 de abril de 1994]; un vector de adenovirus atenuado tal como el vector descrito por Stratford-Perricaudet y col. [J. Clin. Invest. 90:626-630 (1992); véase también La Salle y col., Science 259:988-990 (1993)]; y un vector del virus asociado a adenovirus defectuoso [Samulski y col., J. Virol. 61:3096-3101 (1987); Samulski y col., J. Virol. 63:3822-3828 (1989); Lebkowski y col., Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996 (1988)].

Preferiblemente, para la administración in vivo, se emplea un tratamiento inmunodepresor apropiado junto con el vector vírico, por ejemplo, un vector de adenovirus, para evitar la inmunodesactivación del vector vírico y las células transfectadas. Por ejemplo, pueden administrarse citoquinas inmunodepresoras, tales como interleuquina-12 (IL-12), interferón-\gamma (IFN-\gamma), o anticuerpo anti-CD4, para bloquear las respuestas inmunes humorales o celulares contra los vectores víricos [véase, por ejemplo, Wilson, Nature Medicine (1995)]. Además, es ventajoso emplear un vector vírico que esté modificado genéticamente para expresar una cantidad mínima de antígenos.

Naturalmente, la invención contempla el suministro de un vector que expresara una cantidad terapéuticamente eficaz de MIF1 para aplicaciones de terapia génica. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se usa en este documento para indicar una cantidad suficiente para reducir en al menos aproximadamente 15%, preferiblemente en al menos 50%, más preferiblemente en al menos 90%, y más preferiblemente prevenir un déficit clínicamente significativo en la actividad, la función y la respuesta del hospedador. Como alternativa, una cantidad terapéuticamente eficaz es suficiente para causar una mejora en un estado clínicamente significativo en el hospedador.

Cualquier vector, viral o no viral, de la invención se introducirá preferiblemente in vivo en un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiológicamente tolerables y no producen típicamente una reacción alérgica o similar indeseada, tal como acidez gástrica, mareos y similares, cuando se administra a un ser humano. Preferiblemente, como se usa en este documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal, o indicada en la Farmacopea de Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, y más particularmente en seres humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el que se administra el compuesto. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los derivados de petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Preferiblemente se emplean agua o soluciones salinas acuosas y soluciones de dextrosa y glicerol acuosas como vehículos, particularmente para soluciones inyectables. Se describen vehículos farmacéuticos adecuados en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin.

Vectores adenovirales

En una realización preferida, el vector es un vector adenovírico. Los adenovirus son virus de ADN eucarióticos que pueden modificarse para suministrar de forma eficaz un ácido nucleico de la invención a una diversidad de tipos celulares. Existen diversos serotipos de adenovirus. De estos serotipos, se da preferencia, dentro del alcance de la presente invención, al uso de adenovirus humanos de tipo 2 o de tipo 5 (Ad 2 o Ad 5) o adenovirus de origen animal (véase el documento WO94/26914). Los adenovirus de origen animal que pueden usarse dentro del alcance de la presente invención, incluyen adenovirus de origen canino, bovino, múrido (ejemplo: Mav1, Beard y col., Virology 75 (1990) 81), ovino, porcino, aviar, y de simio (ejemplo: SAV). Preferiblemente, el adenovirus de origen animal es un adenovirus canino, más preferiblemente un adenovirus CAV2 (por ejemplo, la cepa Manhattan o A26/61 (ATCC VR-800), por ejemplo).

Preferiblemente, los vectores adenovíricos defectuosos para la replicación de la invención comprenden las ITRs, una secuencia de encapsidación y el ácido nucleico de interés. Aún más preferiblemente, al menos la región E1 del vector adenovírico no es funcional. La deleción en la región E1 se extiende preferiblemente desde los nucleótidos 455 a 3329 en la secuencia del adenovirus Ad5 (fragmento PvuII-BglII) o 382 a 3446 (fragmento HinfII-Sau3A). También pueden modificarse otras regiones, en particular la región E3 (documento WO95/02697), la región E2 (documento WO94/28938), la región E4 (documentos WO94/28152, WO94/12649 y WO95/02697), o en cualquiera de los genes tardíos L1-L5.

En una realización preferida, el vector adenovírico tiene una deleción en la región E1 (Ad 1.0). Ejemplos de adenovirus con deleción de E1, se describen en el documento de patente EP 185.573. En otra realización preferida, el vector adenovírico tiene una deleción en las regiones E1 y E4 (Ad 3.0). Ejemplos de adenovirus con deleción de E1/E4, se describen en los documentos de patente WO95/02697 y WO96/22378. En aún otra realización preferida, el vector adenovírico tiene una deleción en la región E1 dentro de la cual se inserta la región E4 y la secuencia de ácido nucleico (véase el documento FR94 13355).

Los adenovirus recombinantes defectuosos en la replicación de acuerdo con la invención pueden prepararse por cualquier método conocido por los especialistas en la técnica (Levrero y col., gen 101 (1991) 195, documento EP 185.573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particular, pueden prepararse por recombinación homóloga entre un adenovirus y un plásmido que es portador, entre otros, de la secuencia de ADN de interés. La recombinación homóloga se efectúa después de la cotransfección del adenovirus y el plásmido en una línea celular apropiada. La línea celular que se emplea debe preferiblemente (i) ser transformable por dichos elementos, y (ii) contener las secuencias que son capaces de complementar la parte del genoma del adenovirus de replicación defectuosa, preferiblemente de forma integrada, para evitar los riesgos de recombinación. Ejemplos de líneas celulares que se pueden emplear son la línea 293 de células renales embrionarias humanas (Graham y col., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) que contiene la porción izquierda del genoma de un adenovirus Ad5 (12%) integrada en su genoma y las líneas celulares que son capaces de complementar las funciones E1 y E4, tal y como se describe en los documentos de solicitud de patente WO94/26914 y WO95/02697. Los adenovirus recombinantes se recuperan y purifican usando técnicas de biología molecular convencionales, que son bien conocidas para los especialistas en la técnica.

Vectores virales asociados a adeno

Los virus asociados a adenovirus (AAV) son virus de ADN de tamaño relativamente pequeño que pueden integrarse, de un modo estable y con especificidad del sitio, en el genoma de las células que infectan. Son capaces de infectar un amplio espectro de células sin inducir ningún efecto sobre el crecimiento, la morfología o la diferenciación celular, y no parecen estar implicados en patologías humanas. El genoma de AAV se ha clonado, secuenciado y caracterizado. Incluye aproximadamente 4700 bases y contiene una región repetida terminal invertida (ITR) de aproximadamente 145 bases en cada extremo, que actúa como origen de la replicación para el virus. El resto del genoma está dividido en dos regiones esenciales que son portadoras de las funciones de encapsulación: la parte izquierda del genoma, que contiene el gen rep implicado en la replicación vírica y la expresión de los genes víricos; y la parte derecha del genoma, que contiene el gen cap que codifica las proteínas de la cápsida del virus.

Se ha descrito el uso de vectores obtenidos a partir de los AAV para transferir genes in vitro e in vivo (véanse los documentos WO 91/18088; WO 93/09239; US 4.797.368, US 5.139.941, EP 488 528). Estas publicaciones describen diversas estructuras artificiales obtenidas a partir de AAV en las que los genes rep y/o cap están delecionados y reemplazados por un gen de interés, y el uso de estas estructuras artificiales para transferir dicho gen de interés in vitro (en células cultivadas) o in vivo, (directamente en un organismo). Los AAV recombinantes defectuosos para la replicación de acuerdo con la invención, pueden preparase cotransfectando un plásmido que contiene la secuencia de ácido nucleico de interés, flanqueada por dos regiones repetidas terminales invertidas (ITR) de AAV, y un plásmido portador de los genes de encapsulación de AAV (genes rep y cap), en una línea celular que está infectada con un virus auxiliar humano (por ejemplo un adenovirus). Los AAV recombinantes que se producen después se purifican mediante técnicas convencionales.

La invención también se refiere por tanto, a un virus recombinante obtenido a partir de AAV cuyo genoma comprende una secuencia que codifica un ácido nucleico que codifica un factor anti-angiogénico flanqueado por las ITR de AAV. La invención también se refiere a un plásmido que comprende una secuencia que codifica un ácido nucleico que codifica un factor anti-angiogénico flanqueado por dos ITR procedentes de un AAV. Dicho plásmido puede usarse como tal para transferir la secuencia de ácido nucleico, con el plásmido, cuando sea apropiado, incorporándola en un vector liposómico (pseudo-virus).

Vectores retrovirales

En otra realización, el gen se puede introducir en un vector retrovírico, p. ej., tal y como se describe en el documento de Anderson et al., Patente de EE.UU. Nº. 5.399.346; Mann et al., 1983, Cell 33:153; Temin y col., Patente de Estados Unidos Nº 4.650.764; Temin y col., Patente de Estados Unidos Nº 4.980.289; Markowitz y col., 1988, J. Virol. 62:1120; Temin y col., Patente de Estados Unidos Nº 5.124.263; documentos EP 453242, EP178220; Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689; Publicación de Patente Internacional Nº WO 95/07358, publicada el 16 de marzo de 1995, por Dougherty et al.; y Kuo y col., 1993, Blood 82:845. Los retrovirus son virus integrantes que infectan a las células en división. El genoma retrovírico incluye dos LTRs, una secuencia de encapsulación y tres regiones codificantes (gag, pol y env). En vectores retrovíricos recombinantes, los genes gag, pol y env están generalmente delecionados, por completo o en parte, y reemplazados por una secuencia de ácido nucleico heteróloga de interés. Estos vectores pueden construirse a partir de diferentes tipos de retrovirus, tales como, VIH, MoMuLV ("virus de la leucemia de Moloney murina" MSV ("virus del sarcoma de Moloney murino"), HaSV ("virus del sarcoma de Harvey"); SNV ("virus de la necrosis del bazo"); RSV ("virus del sarcoma de Rous") y el virus Friend. Se describen vectores retrovíricos defectuosos en el documento WO95/02697.

En general, para construir retrovirus recombinantes que contienen una secuencia de ácido nucleico se construye un plásmido, que contiene las LTRs, la secuencia de encapsulación y la secuencia codificante. Esta estructura artificial se usa para transfectar una línea celular de empaquetamiento, siendo capaz dicha línea celular de suministrar en trans las funciones retrovíricas que están defectuosas en el plásmido. En general, las líneas celulares de encapsulación son, por lo tanto, capaces de expresar los genes gag, pol y env. Dichas líneas celulares de encapsulación se han descrito en la técnica anterior, en particular la línea celular PA317 (documento US 4.861.719); la línea celular PsiCRIP (WO90/0280 y la línea celular GP+envAm-12 (documento WO89/07150). Además, los vectores retrovíricos recombinantes pueden contener modificaciones en las LTRs para suprimir la actividad transcripcional así como secuencias de encapsulación extensivas que pueden incluir una parte del gen gag (Bender y col., J. Virol. 61 (1987) 1639). Los vectores retrovíricos recombinantes se purifican mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica.

Pueden construirse vectores retrovíricos que actúen como partículas infecciosas o para experimentar una única ronda de transfección. En el cebador caso, el virus se modifica para conservar todos sus genes, excepto los responsables de las propiedades de transformación oncogénicas y para expresar el gen heterólogo. Se preparan vectores víricos no infecciosos para destruir la señal vírica de empaquetamiento, pero que conserven los genes estructurales necesarios para empaquetar el virus co-introducido modificado genéticamente para que contenga el gen heterólogo y las señales de empaquetamiento. Por tanto, las partículas víricas que se producen no son capaces de producir virus adicionales.

Se describe el suministro de genes dirigidos en la Publicación de Patente Internacional WO 95/28494, publicada en octubre de 1995.

Vectores no virales

Alternativamente, el vector se puede introducir in vivo mediante lipofección. Durante la pasada década, ha estado aumentando el uso de liposomas para la encapsulación y transfección de ácidos nucleicos in vitro. Pueden usarse lípidos catiónicos sintéticos diseñados para limitar las dificultades y riesgos encontrados con la transfección mediada por liposomas para preparar liposomas para la transfección in vivo de un gen que codifica un marcador [Feigner, et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413-7417 (1987); véase Mackey, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8027-8031 (1988);Ulmer y col., Science 259:1745-1748 (1993)]. El uso de lípidos catiónicos puede favorecer la encapsulación de ácidos nucleicos cargados negativamente, y también puede favorecer la fusión con membranas celulares cargadas negativamente [Felgner y Ringold, Science 337:387-388 (1989)]. Se describen compuestos y composiciones lipídicas particularmente útiles para transferir ácidos nucleicos en las Publicaciones de Patente Internacional WO95/18863 y WO96/17823, y en la Patente de Estados Unidos Nº 5.459.127. El uso de lipofección para introducir genes exógenos en organismos específicos in vivo tiene ciertas ventajas prácticas. El transporte molecular dirigido de liposomas a células específicas representa un área de beneficio. Queda claro que dirigir la transfección a tipos celulares particulares sería particularmente ventajoso en un tejido con heterogeneidad celular, tal como el páncreas, el hígado, el riñón, y el cerebro. Los lípidos pueden unirse químicamente a otras moléculas para el propósito de dirigirlos [véase Mackey, y col., mencionado anteriormente]. Los péptidos dirigidos, por ejemplo, hormonas o neurotransmisores, y proteínas tales como anticuerpos o las moléculas no peptídicas, podrían unirse químicamente a liposomas.

También son útiles otras moléculas para facilitar la transfección de un ácido nucleico in vivo, tal como un oligopéptido catiónico (por ejemplo, documento de Publicación de Patente Internacional WO95/21931), péptidos obtenidos a partir de proteínas que se unen al ADN (por ejemplo, documento de Publicación de Patente Internacional WO96/25508), o un polímero catiónico (por ejemplo, documento Publicación de Patente Internacional WO95/21931).

También es posible introducir el vector in vivo como un plásmido de ADN desnudo. Los vectores de ADN desnudos para terapia génica pueden introducirse en las células hospedadoras deseadas por método conocidos en la técnica, por ejemplo, transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, DEAE dextrano, precipitación con fosfato cálcico, el uso de una pistola génica, o el uso de un transportador de vectores de ADN [véase, por ejemplo, Wu y col., J. Biol. Chem, 267:963-967 (1992); Wu y Wu, J. Biol. Chem., 263:14621-14624 (1988); Hartmut et al., Solicitud de Patente Canadiense Nº 2.012.311, presentada el 15 de marzo de 1990; Williams y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726-2730 (1991)]. También pueden usarse estrategias de suministro de ADN mediado por receptor [Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3:147-154 (1992); Wu y Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)].

La presente invención puede entenderse mejor por referencia a los Ejemplos siguientes no limitantes, que se proporcionan a modo de ejemplo de la invención.

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Ejemplos Material y métodos

Cepa de levadura. La cepa YCM17 del género S. cerevisiae (MATa, ura3-52, his3-200, ade2-101, lys2-801, trp1-901, leu2-3,112, can1, gal4-542, gal80-538, met16::URA3-pGAL1/10-LacZ,) se usó como herramienta de selección del banco de fusión de células Hela vía el sistema de dos-híbridos.

Se cultivó sobre el siguiente medio de cultivo:

Medio completo de YPD

\bullet: Extracto de levadura (10 g/l) (Difco)

\bullet: Bacto-peptona (20 g/l) (Difco)

\bullet: Glucosa (20 g/l) (Merck)

Este medio se volvió sólido vía la adición de 20 g/l de agar (Difco).

Medio mínimo de YNB

\bullet: Base Nitrogenadas de Levadura (sin aminoácidos) (6,7 g/l) (Difco)

\bullet: Glucosa (20 g/l) (Merck)

Este medio se volvió sólido vía la adición de 20 g/l de agar (Difco).

Para permitir el crecimiento de levaduras auxotróficas sobre este medio, es necesario añadirle aminoácidos o bases nitrogenadas sobre las que son dependientes a 50 mg/l.

Cepa bacteriana. La cepa TG 1 de Escherichia coli del genotipo supE, hsdD5, thi, D(lac-proAB), F'[tra D36 pro A^{+}B^{+} lacI^{q} lacZDM15] se usó como un media para amplificar y aislar los plásmidos recombinantes utilizados.

Se cultivó sobre:

Medio LB

\bullet: NaCl (5 g/l) (Difco)

\bullet: Bacto-triptona (10 g/l) (Difco)

\bullet: Extracto de levadura (5 g/l) (Difco)

Este medio se volvió sólido vía la adición de 20 g/l de agar (Difco). La ampicilina (100 \mug/ml) permite la selección de la bacteria que ha recibido los plásmidos que llevan el gen que imparte resistencia frente a este antibiótico como marcador.

Plásmidos. Se emplearon vectores de las series pGBT (Clontech o descritas por Roder KH, Wolf SS, y Schweizer M (1996) Anal. Biochem 241: 260-2). Estos son plásmidos lanzadera que poseen un origen de replicación bacteriano y de levadura permitiéndoles replicarse con un alto número de copia en estos dos microorganismos. Estos plásmidos contienen un sitio de clonación múltiple localizado corriente abajo desde la secuencia codificante para el dominio de unión de ADN de GAL4 y corriente arriba desde un codón terminador para formar una proteína de fusión. También contienen el gen TRP1 de S. cerevisiae, lo que permite que las levaduras del genotipo trp1 sean complementadas para seleccionarlas sobre un medio mínimo que no contiene ningún triptófano. Este vector lleva el gen que imparte resistencia frente a la ampicilina que permita la selección de la bacteria que lo posee sobre un medio que contiene ampicilina.

También se emplearon vectores de las series de pGAD (Clontech). Estos son vectores que permiten la expresión en las proteínas de fusión de levadura entre el dominio transactivador de GAL4 y una proteína que es de interés o se codifica por el cADN que proviene de un banco de células Hela, insertado al nivel de los sitios EcoRI XhoI.

Los vectores pAV3 y pTD1 (Clontech), se usaron como vectores control positivos para indicar una interacción proteína-proteína entre la proteína p53 y el antígeno T.

Se usaron vectores de las series Bluescript (Stratagene). Estos vectores permiten que se realice la clonación justo como las series pMTL (Chambers et al.; Gene 1988, 68, pp 139-149).

Además, se usaron el vector pCADN3 (Invitrogen) y los vectores derivados (pSG42 y pCNW8), que permiten la expresión de proteínas en células de mamíferos bajo el control del promotor CMV.

También se usó el vector pCRII (Invitrogen), que permite la clonación de fragmentos PCR.

Las técnicas de manipulación genética usadas para clonar e insertar los cADN en estos protocolos de rutina empleados de plásmidos (Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds.), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987).

Preparación del ADN de plásmido. Se prepararon grandes cantidades de ADN usando el kit de preparación de ADN rápido de Promega de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se prepararon pequeñas cantidades de ADN de la siguiente manera: las bacterias que contienen el plásmido se cultivaron durante al menos 4 horas en 2 ml de medio LB en un agitador con agitación. Se centrifugaron después para 2 minutos a 14.000 rpm en tubos Eppendorf, luego el concentrado fue devuelto en la suspensión en 100 \mul de solución I (50 mM de glucosa, tampón 25 mM de Tris-HCl pH 8, 10 mM de EDTA pH 8), lisado con 200 \mul de solución II (0,2 M de NaOH, 1% SDS). La solución de lisis fue entonces neutralizada con 150 \mul de solución III (3 M de acetato de potasio, 11,5% (v/v) ácido acético glacial). Después de la agitación de los tubos hasta que se obtuvo un precipitado floculente, se añadieron 150 \mul de una mezcla de fenol/cloroformo (50% fenol y 50% cloroformo saturado en agua), y la mezcla entera se agitó durante 30 segundos. La fase acuosa que contiene el ADN se recuperó después de la centrifugación durante 2 minutos a 14.000 rpm. El ADN se precipitó después vía la adición de 0,5 volúmenes de isopropanol, luego se centrifugó durante 5 minutos a 14.000 rpm y se secó al aire para disolverlo finalmente en 20 \mul de TE-ARNsa (solución 10 mM de Tris-HCl y 1 mM de EDTA con 50 \mug/ml de ARNsa).

Amplificación enzimática del ADN por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Se realizaron reacciones PCR en un volumen final de 100 \mul en presencia del ADN bicatenario, dNTP (0,2 mM), tampón PCR (10 mM de Tris-HCL pH 8,5, 1 mM de MgCl_{2}, 5 mM de KCl, gelatina 0,01%), 0,5 \mug de cada uno de los oligonucleótidos, y 2,5 UI de ADN polimerasa de Ampli Taq (Perkin Elmer) con o sin formamida (5%). La mezcla se recuperó con 2 gotas de aceite de parafina para limitar la evaporación de la muestra. El equipo usado fue "Crocodile II" de Appligene. Se realizo la desnaturación a una temperatura de 90ºC para la desnaturación de la hélice, una temperatura para la hibridación de los oligonucleótidos al ADN desnaturizado (monocatenario) que era entre 5 y 10 grados inferior a la temperatura para la separación de los oligonucleótidos, y una temperatura de 72ºC para la elongación por la enzima. Los fragmentos obtenidos por PCR, que se usaron para clonar, se resecuenciaron sistemáticamente una vez que fueron clonados, para poder verificar la ausencia de cualquier mutación que pudiera haber ocurrido durante la amplificación.

Los oligodesoxinucleótidos se sintetizaron químicamente de acuerdo con el método de la fosforamidita utilizando grupos protectores de \beta-cianoetilo (Sinha, 1984). Después de la síntesis, los grupos protectores se eliminaron por tratamiento con amoniaco, y dos precipitaciones con butanol permitieron la purificación y concentración de los oligodesoxinucleótidos (Sawadogo, 1991). La concentración

\hbox{de ADN se determinó midiendo la densidad  óptica a 260
nm.}

Uniones. Todas las reacciones de unión se llevaron a cabo a +14ºC durante una noche en un volumen final de 10 \mul en presencia de 100 a 200 ng de vector, de 0,5 a 2 \mug de inserto, 40 UI de enzima T4 ADN ligasa (Biolabs), y un tampón de unión (50 mM de Tris-HCl pH 7,8; 10 mM de MgCl_{2}; 10 mM de DTT; 1 mM de ATP). El control negativo se formó por la unión del vector en ausencia del inserto.

El relleno de los extremos 5' protuberantes se llevó a cabo, según se necesitaba, antes de la unión vía el fragmento de Klenow de ADN Polimerasa I de E. coli (Biolabs) de acuerdo con las especificaciones del proveedor. La destrucción de los extremos 3' protuberantes se realiza en presencia de ADN Polimerasa del fago T4 (Biolabs) utilizada según las recomendaciones del fabricante.

Transformación de las bacterias. El volumen de unión entero (10 \mul) se usó para transformar las bacterias TG1, que se volvió competente por el método de Chung et al. (1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 86:2172-2175). Las bacterias TGl se colocaron en cultivo en un medio LB líquido durante varias horas en un incubador con agitación a 37ºC hasta que se obtuvo una OD de 0,6 a 600 nm. Después se centrifuga el medio a 6.000 rpm durante 10 min. Las bacterias se volvieron competentes disolviendo el concentrado bacteriano en un volumen de TSB (medio LB + 100 g/l de PEG 4000, 5% DMSO, 10 mM de MgCl_{2}, 10 mM de MgSO_{4}) correspondiente a 1/10 del volumen del medio del cultivo inicial. Después de la incubación a 4ºC durante 30 a 60 minutos, 200 \mul de bacterias se pusieron en contacto con los productos de unión durante 15 minutos sobre hielo. Después de la adición de 200 \mul de LB [medio], las bacteria se incubaron durante 30 min a 37ºC, luego se extendieron sobre un medio de LB + ampicilina.

Separación y extracción del ADN. La separación del ADN se realizó por electroforesis como una función de su tamaño. Para hace esto, se usaron diferentes geles dependiendo del tamaño de los fragmentos que se separaron:

\bullet: 1% gel agarosa (Gibco BRL) en un tampón TBE (90 mM de base Tris; 90 mM de borato; 2 mM de EDTA) para separar grandes fragmentos de ADN (mayores que 500 bp);

\bullet: 2% de gel de agarosa NuSieve (FMC Bioproducts) en un tampón TBE para separar pequeños fragmentos (menores de 500 bp).

Las migración sobre gel de agarosa o sobre gel de poliacrilamida se llevó a cabo en un tampón TBEy en presencia de un marcador de pesos moleculares (escala de 1 Kb, Gibco BRL). El ADN se mezcló con 1/10 del volumen de depósito de azul (200 g/l de Ficoll, 0,5 g/l de azul de bromofenol, 50 mM de EDTA) antes de ser depositado sobre el gel. Después de la migración a 100 Voltios y tinción con bromuro de etidio (concentración 0,5 \mug/ml de gel), las bandas se visualizaron bajo una lámpara UV.

La extracción del ADN a partir de la banda de un gel de agarosa se llevó a cabo mediante electroelución como sigue: El pedazo de gel que contiene el fragmento de ADN se recortó con un bisturí y se colocó en un tubo de diálisis cerrado con dos pinzas y que contienen entre 100 y 500 \mul de TBE. La mezcla entera se colocó en un tanque de electroforesis, donde se sometió a un campo eléctrico de 100 Volts. Después de retirarlo del gel, el ADN se purificó después por medio de dos extracciones con fenol/cloroformo seguido de dos extracciones con cloroformo, luego se precipitó en presencia de 0,3 M de acetato de sodio y 2,5 volúmenes de alcohol absoluto. Después de la centrifugación (5 min a 14.000 rpm), el concentrado de ADN se secó y luego se disolvió en 20 \mul de agua.

Secuenciación fluorescente de ADN de plásmido. La secuenciación se llevó a cabo de acuerdo con el método de Sanger usando 4 didesoxiribonucleótidos que poseen un marcador fluorescente diferente. La incorporación de uno de estos didesoxiribonucleótidos causó una parada en la replicación por la polimerasa Taq del ADN que se secuencia. Esta reacción proporcionó fragmentos de ADN de varios tamaños, todos los cuales se terminaron en 3' por uno de los 4 didesoxiribonucleótidos. Un \mug de un plásmido y 4 picomoles de un cebador se añadieron a 9,5 \mul de una "premezcla" suministrada por Applied Biosystems bajo la marca comercial PRISM©. El volumen final tenía que ser 20 \mul para realizar una PCR durante 25 ciclos, interrumpidos en una fase de desnaturación a 96ºC durante 30 segundos, una fase de hibridación a 50ºC durante 15 segundos, y una fase de elongación a 60ºC durante 4 minutos. Los fragmentos de ADN obtenidos después de la amplificación se purificaron en una columna de exclusión (Chromaspin-30 de Clontech) y se secaron luego en el Speed Vac. Todo el material seco se disolvió en 5 \mul de una mezcla preparada a partir de 24 \mul de EDTA (50 mM) y 120 \mul de formamida desionizada. Después de la desnaturación a 96ºC durante 3 minutos, se depositaron entre 3 y 5 \mul sobre un gel de electroforesis. Los diferentes fragmentos de ADN se separaron de acuerdo con su tamaño y luego se pasaron sucesivamente enfrente de un lector láser del secuenciador de ADN 370 de ABI (Applied Biosystems), donde se detectaron los diferentes cromóforos fluorescentes.

Preparación de plásmidos a partir del banco de células Hela (Clontech®). El banco de cADN de células Hela se obtuvo en la forma de bacterias. Después de la verificación del título del banco, 2 \mul de bacterias del banco de fusión de células Hela, que había sido colocado previamente en 8 ml de LB [medio], se esparcieron de una forma no convergente sobre un medio sólido para mantener la naturaleza representativa de este banco. Los inventores esparcieron así [las bacterias sobre] platos de 16 770 cm^{2} que contenían un medio LB+ampicilina. Para cada uno de los platos, las colonias que aparecieron se disolvieron en 30 ml de [medio] LB+ampicilina líquido. Las suspensiones obtenidas se pusieron luego en un [matraz] Erlenmeyer y se incubaron en un agitador a 37ºC durante 3 horas. El ADN se extrajo luego a partir de estas cepas por medio de la técnica Maxiprep. La concentración de ADN se determinó a 260 nm.

Transformación de la levadura por un plásmido. Se agruparon células de levadura cultivadas en 100 ml de medio líquido después de una centrifugación a 3.000 rpm durante 3 minutos y se pusieron en suspensión en 1 ml de agua estéril. Después de la centrifugación a 3.000 rpm durante 3 minutos, el concentrado celular se devolvió en suspensión en 1 ml de agua estéril, luego se centrifugó de nuevo. Esta operación se repitió una vez más para eliminar cualquier traza del medio de cultivo. Las células de levadura se disolvieron luego en 1 ml de solución de transformación I (0,1 M de LiAc, 10 mM de Tris-HCl pH 7,5, 1 mM de EDTA), y se centrifugaron a 3.000 rpm durante 3 minutos. El concentrado celular se disolvió de nuevo en 1 ml de solución de transformación I. Cincuenta \mul de esta suspensión se mezclaron con 50 \mug de ADN de esperma de salmón y de 1 a 5 \mug de ADN de plásmido. Trescientos \mul de una solución de transformación II (0,1 M de LiAc, 10 mM de Tris-HCl pH 7,5, 1 mM de EDTA en 40% PEG_{4000}) se añadieron a continuación, luego la mezcla entera se incubó a 28ºC durante 30 minutos. Luego se aplicó un choque térmico a la mezcla de transformación en un baño de agua a 40ºC durante 15 minutos, luego la mezcla entera se centrifugó a 15.000 rpm durante 1 min para agrupar al concentrado celular. Este concentrado se disolvió en 200 \mul de agua, luego se esparció sobre un medio mínimo de agar que no contenía ningún aminoácido correspondiente a los marcadores suministrados por el plásmido transformante. Las levaduras se cultivaron luego durante 72 horas a 28ºC.

La transformación de la levadura por el banco de cADN de células Hela implicaba un procedimiento diferente. La levadura empleada contenía el plásmido pCM433, lo que permitió la expresión de MEKK fusionado al dominio de unión de ADN de GAL4. Se cultivó en 250 ml de medio mínimo de YPG a 28ºC bajo agitación a una densidad de 10^{7} células/ml. Las células se agruparon mediante una centrifugación a 3.000 rpm durante 10 minutos y se disolvieron en 250 ml de agua. Después de otra centrifugación, el concentrado celular se disolvió en 100 ml de agua y se centrifugó de nuevo. El concentrado luego se disolvió en 10 ml de solución de transformación I y se incubó durante 1 hora a 28ºC bajo agitación. Después de la centrifugación, las células se disolvieron una vez más en 2,5 ml de solución de transformación I, 100 \mul del banco de cADN de células Hela, y 20 ml de solución de transformación II, luego se incubó durante 1 hora a 28ºC bajo agitación. Se realizó el choque térmico sobre esta mezcla de transformación a 42ºC durante 20 minutos. La centrifugación (3.000 rpm durante 5 min) se repitió 3 veces consecutivamente, disolviendo cada vez el concentrado en 10 ml de agua estéril. La tercera vez, el concentrado se disolvió en 2,5 ml de agua estéril. Así el PEG que era tóxico para las células se eliminó. 2,4 ml de esta suspensión se usaron para sembrar 250 ml de medio mínimo que contiene los aminoácidos His, Lys, y Met y las bases Ura y Ade, y se cultivaron durante una noche en un agitador a 28ºC. El cultivo de una noche se centrifugó (3.000 rpm durante 5 min) y se lavó con agua estéril dos veces en una columna. El concentrado se disolvió después en 2,5 ml de agua. 2,4 ml, el volumen del cual se aumentó a 10 ml en agua estéril, se usaron para sembrar 10 platos de 435-cm^{2} que contenían un medio YNB+Lys+Met+His+Ade, que se incubaron durante 3 días.

Preparación de la levadura genómico y ADN de plásmido. Una alícuota del clon de levadura promedio se puso en 200 \mul de una solución de TELT (2% Triton X100, 1% SDS, 100 mM de NaCl, 10 mM de Tris pH 8, 1 mM de EDTA), en presencia de 3 g de perlas de vidrio 450 \mum de diámetro y 200 \mul de fenol/cloroformo. Esta mezcla fue vibrado durante 15 minutos, luego fue centrifugado durante 2 minutos a 14.000 rpm. El sobrenadante se recuperó sin tomar ninguna de la torta de proteína, y el ADN contenido en esta fase se precipitó con 2,5 volúmenes de alcohol absoluto. Después de la centrifugación durante 2 minutos a 14.000 rpm, el concentrado de ADN se secó y se disolvió en 20 \mul de TE-ARNsa. Esta solución de ADN, que corresponde a una mezcla de genoma y ADN de plásmido, se usó directamente para transforma las bacterias. Solo el ADN de plásmido fue capaz de replicarse en la bacteria y se pudo analizar por medio de la técnica miniprep.

Ensayo de actividad de\beta-galactosidasa. Una hoja de nitrocelulosa había sido puesta previamente sobre la placa Petri que contenía los clones de levadura individuales. Debido al fenómeno de la adsorción, se obtuvo una imagen verdadera de la colocación de los clones. Esta hoja se hundió luego en nitrógeno líquido durante 30 segundos para hacer que las levaduras se rompieran y, de este modo, liberaran la actividad de \beta-galactosidasa. Después de descongelas, la hoja de nitrocelulosa se depositó, las colonias hacia arriba, en otra placa Petri que contenía papel Whatman que había sido previamente saturada con 1,5 ml de solución de PBS (60 mM de Na_{2}HPO4, 40 mM de NaH_{2}PO_{4}, 10 mM de KCl, 1 mM de MgSO_{4}, pH 7) y entre 10 y 30 \mul de X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indoil-\beta-D-galactosida) con 50 mg/ml de N,N-dimetilformamida. La placa se puso luego en una estufa a 37ºC con la tapa cerrada para prevenir la desecación. El tiempo para la tinción azul pareció variar mucho, desde unos pocos minutos a varias horas. Este ensayo se llevó a cabo en presencia de un control positivo, cuya interacción se conocía y que se volvió azul rápidamente.

Transfección de células CHO-K1: Se cultivaron células CHO-K 1 en medio completo (F12 de HAM, 10% suero de bovino fetal inactivado por calor, 1% penicilina, 1% glutamina). Se sembraron células (1,10^{5} células/pocillo) en una placa de 6 pocillos y se cultivó en medio completo durante 24 h. Las células luego se transfectaron con una cantidad total de 1 \mug/pocillo (pCADN3 o pCM562) de plásmidos usando una formulación de liposomas de GIBCO-BRL (reactivo de Lipofectamina) y según las recomendaciones del fabricante. 4 días después de la transfección, las células se sembraron en placas Petri de 10cm y se incubaron con 500 \mug/ml de G418 durante 2 semanas. Las células resistentes se agruparon luego y se expandieron con G418 hasta su análisis y/o congelación.

Extractos celulares y análisis de la expresión de proteína por PAGE-SDS: Las células se lavaron con PBS (KH2PO4 1,06 mM, NaCl 154 mM, Na2HP04 5,6 mM) y se recolectaron en tampón de lisis HNTG [Hepes pH 7,4 50 mM, NaCl 150 mM, TritonX100 1%, Glicerol 10%]. Después de lisis de 30 min, los extractos celulares se centrifugaron (10 min, 2000 rpm, temperatura ambiente) y la proteína en los sobrenadantes se cuantificaron usando un ensayo colorimétrico (Pierce). Después de la desnaturación por calor, 10 \mug de extractos celulares se separaron sobre 10% de Tris-glicina PAGE-SDS y fueron electro-transferidos sobre membranas de PVDF. Las transferencias se saturaron con leche deshidratada al 2% en TBS [Tris pH 7,5 mM 20 mM, NaCl 150 mM] -Tween 0,1% 16 h a 4ºC. La proteína Myc-marcada-MIF1/MSP58 se detectó usando anticuerpo anti-myc de ratón y el sistema de revelado ECL (Amersham) usando un anticuerpo anti-ratón acoplado a la enzima HRP como anticuerpo segundario.

Generación de clones estables que expresan la proteína MIF1/MSP58 Myc-marcada. Se obtuvieron clones estables de expresión de la proteína MIF1/MSP58 por clonación de células individuales. Las suspensiones celulares que contenían aproximadamente 0,1 célula/200 \mul se distribuyeron en placas de 96 pocillos (200 \mul/pocillo) y se incubaron a 37ºC durante varios días (se prepararon 3 placas). Después de 4 semanas de crecimiento, se obtuvieron 36 clones y los extractos celulares se analizaron por inmunotransferencia usando anticuerpo anti-myc para detectar la proteína MIF1/MSP58.

Análisis de la actividad de JNK quinasa en células tratadas con estímulos externos. Se sembraron células (2,10^{5}/
pocillo) en una placa de 6 pocillos y se incubaron en medio completo durante 24 h. Luego se añadieron 200 \muM de Sorbitol (recién diluido en PBS) y las células se incubaron durante 5, 15 ó 30 min. Las células control se trataron con 200 \mul de PBS. Después de la incubación, las células se lavaron rápidamente con PBS y se recolectaron en 200 \mul de tampón de b-glicerofosfato (b-glicerofosfato 80 mM pH 7,4, EGTA 20 mM pH 8, MgCl_{2} 15 mM) suplementado con inhibidores de proteasas PIC (Pefabloc 0,1 mM, 10 \mug/ml de Aprotinina, 10 \mug/ml de Leupeptina, 1 \mug/ml de Antipaína, 10 \mug/ml de Benzamidina, 1 \mug/ml de inhibidor Tripsina de Soja, 1 \mug/ml de quimostatina, 1 \mu/ml de PepstatinA). Las células luego se sonicaron (6X30sec) y los extractos celulares se aclararon por ultra-centrifugación a 100.000 rpm durante 30 minutos a 4ºC. Los sobrenadantes (extractos citosólicos) se almacenaron a -80ºC. Las concentraciones de proteínas se determinaron con reactivo de Pierce. 500 ng de extractos celulares se usaron para la fosforilación in vitro de proteína recombinante GST-cJun (1/223) como sustrato (2,5 \mug) en HEPES 20 mM pH 7,4, MgCL_{2} 5 mM, DTT 2 mM, EGTA 2 mM. La mezcla de reacción se suplementó con PKI (20 \mug/ml), Na3VO4 (1 mM), ATP (25 \muM) y ^{33}PgATP 3 \muCi. Las muestras se incubaron 10 minutos a 30ºC y la reacción se paró por la adición de tampón de carga de Laemmli (5X). Las proteínas se desnaturalizaron por calor (95ºC, 10 min) antes de separarlas sobre una PAGE-SDS de 10% Tris-Glicina. La proteína fosforilada GST-Jun (1-223) se cuantificó usando un visualizador de fósforo (Packard).

Ensayos de apoptosis: Se sembraron células (2,10^{5}/pocillo) en una placa de 6 pocillos y se incubaron en medio completo durante 24 h. Se añadieron 200 mM de sorbitol y las células se incubaron 24 h. El sobrenadante luego se centrifugó (3500 rpm, 10 min, temperatura ambiente) para sedimentar las células apoptóticas. Las células de las placas se recolectaron por tripsinación, se lavaron con PBS y se centrifugaron. El pelete luego se resuspendió suavemente en etanol frío y la apoptosis se chequeó en 10000 células por análisis FACS después de tinción con yoduro de propidio (10 \mug/ml) en presencia de Rnasa (1 mg/ml).

Construcción de plásmido de GST-MEKK1: El fragmento de HindIII[blunt]-XhoI de pCM556 que contiene el MEKK1 total (Russel, et al, 1995, J. Biol. Chem, vol 270 p11757) que codifica la secuencia se clonó en plásmido pBCGST (Biotechniques, 1995, vol 18, p142) cortado con enzima Hpa1 y Xho1. El marco de lectura abierto de GST (N-Term) fusionado a la secuencia MEKK1 (C-Term) se verificó por secuenciación de ADN. Este plásmido se denominaba pBCGST-MEKK1.

Análisis de interacción de MIF1/MSP58-MEKK1 por activación de GST. Se sembraron CHOMIF1/MSP58#34 (6x10^{5} células) en placas Petri de 10 cm y se cultivaron durante 3 días en medio completo. Las células luego se transfectaron con 10 \mug de plásmido que codificaba para tanto la proteína GST-MEKK1 (pBCGST-MEKK1) o pBCGST como control usando reactivo de lipofectamina (Gibco). Las células luego se cultivaron 24 h con medio completo. Las células luego se incubaron o no con sorbitol 200 mM durante 30 minutos antes de la lisis. Las células se lavaron con PBS y se lisaron a 4ºC en 500 \mul de tampón HNTG que contenía inhibidores de proteasas PIC con Na3VO4 1 mM, NaF 4 mM, AlCl3 10 \muM. Las células se sonicaron luego (6X30sec) y los extractos celulares se aclararon por centrifugación (10 min, 3000 rpm, 4ºC). Los sobrenadantes (500 \mul) se incubaron con 100 \mul de GSH-Sepharose 4B HNTG-equilibrado (Pharmacia) 1 h a 4ºC con rotación. Después de la centrifugación, GSH-sepharose se lavó tres veces con 200 \mul de HNTG. Los complejos de GST/GSH se eluyeron con 100 \mul de Tris.HCl pH7,7 50 mM, GSH 10 mM, 16 h a 4ºC. La GSH-sepharose luego se centrifugó 30 min a 4000 rpm (4ºC) y se cargó una alícuota de 30 \mul de eluato en PAGE-SDS de 10% Tris-Glicina y se analizó por transferencia Western usando anticuerpo anti-GST (Tebu) y anticuerpo anti-myc para la detección de MIF1/MSP58.

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Ejemplo 1

Construcción de un vector que permite la expresión de una proteína de fusión entre MEKK1 y el dominio de unión de ADN de GAL4

La selección de un banco usando el sistema de doble-híbridos requiere que la proteína MEKK1 se fusione al dominio de unión de ADN de la proteína GAL4 transactivadora. La expresión de esta proteína de fusión se realizó por medio del vector pGBT9 (Materiales y Métodos, supra), dentro del cual se introdujo, en el mismo marco de lectura como la secuencia correspondiente al dominio de unión de ADN de GAL4 (GAL4DB), un fragmento EcoR1-Xho1 de pCM411 (vector pMTL21 que lleva el gen que codifica para MEKK1). El gen MEKK1 se insertó al nivel del sitio EcoR1-Sal1 del plásmido pGBT9 para proporcionar el plásmido pCM433.

El constructo se secuenció, los que permitió la verificación de que el gen MEKK1 estaba, de hecho, en el mismo marco de lectura abierto que el del fragmento correspondiente a GAL4DB.

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Ejemplo 2

Selección del banco de fusión de células HELA

La selección de un banco de fusión permite la identificación de los clones que producen las proteínas fusionadas al dominio transactivador de GAL4, que puede interaccionar con la proteína que es de interés para los inventores. Esta interacción permite la reconstitución de un transactivador que será capaz así de inducir la expresión de los genes reporteros URA3 y LacZ en la cepa YCM 17.

Para realizar esta selección, se seleccionó un banco de fusión creado usando cADN de células Hela humanas. Ya que este banco se suministró en forma de bacterias, el ADN del plásmido del banco se purificó primero.

Preparación de ADN de plásmido a partir de un banco de fusión. El ADN de plásmido del banco de cADN de células Hela se extrajo de acuerdo con el protocolo de Clontech® (Materiales y Métodos). Durante esta preparación, era importante preservar la naturaleza representativa del banco, es decir, preservar el número de plásmidos independientes que los comprendidos, que hacían un total de 6 x 10^{6} plásmidos. Para prevenir la pérdida de plásmidos del banco durante esta preparación, el lote de ADN de plásmido se obtuvo a partir de un número de colonias de bacterias aisladas correspondientes a un poco respecto a tres veces la naturaleza representativa del banco, o 1,8 x 10^{7}
colonias.

Transformación por banco de células Hela y selección por el ensayo de actividad de\beta-galactosidasa. Durante la selección, se hizo necesario asegurarse de una alta probabilidad de que cada plásmido independiente del banco de fusión estaría presente en al menos una levadura en el mismo momento que el plásmido GAL4DB-MEKK1. Esto requirió una buena eficacia con respecto a la transformación de la levadura. Para este fin, fue elegido un protocolo de transformación de levadura que proporcionaba una eficacia de 10^{5} células transformadas por \mug de ADN. Además, ya que la co-transformación de la levadura por dos diferentes plásmidos reduce esta eficacia, se usó una levadura previamente transformada por el plásmido pCM433. Esta cepa de levadura se transformó por 100 \mug de ADN de plásmido a partir del banco de fusión. Esta cantidad de ADN les permitió a los inventores obtener 1,5 x 10^{6} células transformadas. La selección de las células transformadas capaces de reconstituir un transactivador de GAL4 funcional se realizó sobre un medio YNB+Lys+Met+His+Ade. La actividad de lacZ de los clones obtenidos se
verificó.

Al final de esta segunda selección, se obtuvieron 46 clones con un fenotipo Ura+ y bGal+.

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Ejemplo 3

Identificación de insertos de plásmidos seleccionados

Los plásmidos extraídos entre la levadura se introdujeron en las bacterias, y luego se prepararon como se describe en Material y Métodos. La secuenciación se llevó a cabo usando el oligonucleótido complementario CTATTCGAT
GATGAAGATACCCC (SEQ ID NO:9) de la región de GAL4TA en la vecindad del sitio de inserción del banco de cADN de células Hela, a 52 bp del sitio EcoRI. Entre los clones positivos, se encontró varias veces el mismo cADN que representaba un marco de lectura abierto (SEQ ID NO:1) pero que no presentaba ninguna homología significativa con las secuencias depositadas en el GenBank. Este gen se llamaba MIF1, y el plásmido correspondiente del banco de cADN se llamaba pCM480. Durante esta selección, otras cuatro secuencias presentaron un marco de lectura abierto. Dos fueron idénticos a las secuencias depositadas en el GenBank, esto es, centrina (o caltractina) y UBC9, correspondientes a los plásmidos pCM479 y pCM481. Una secuencia que presentaba un marco de lectura abierto, del plásmido pCM524, mostró, al nivel de proteínas, una ligera homología con un gen de Saccharomyces cerevisiae. La última secuencia que presentaba un marco de lectura abierto no mostró ninguna homología con las secuencias depositadas en el GenBank.

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Ejemplo 4

Construcción de un vector que permite la expresión en la levadura de una proteína de fusión entre diferentes fragmentos de deleción de MEKK1 y el dominio de ADN de GAL4

La deleción del fragmento Ncol-Ncol del plásmido pCM433 permitió que se obtuviera el plásmido pCM484. Este vector permitía la expresión de los aminoácidos 353 a 672 de MEKK I p en fusión con el dominio de unión de ADN de Gal4p.

La deleción del fragmento Pst1-Pst1 del plásmido pCM433 permitió que se obtuviera el plásmido pCM485. Este vector permitía la expresión de los aminoácidos 1 a 369 de MEKK1p en fusión con el dominio de unión de ADN de Gal4p.

La deleción del fragmento Sac 1-Sac1 del plásmido pCM433 permitió que se obtuviera el plásmido pCM486. Este vector permitía la expresión de los aminoácidos 287 a 672 de MEKK1p en fusión con el dominio de unión de ADN de Gal4p.

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Ejemplo 5

Localización de la zona de interacción de las proteínas MEKK1 y MIF1

La cepa de levadura yCM17 se co-transformó por los diferentes plásmidos descritos en los ejemplos 1 y 4 y pCM480. La actividad de \beta-gal se determinó como se describe en Material y Métodos, que permitió la detección de la región de MEKK1 que es esencial para su interacción con MIF1. De hecho, la región entre 287 y 353 parece ser importante para la interacción con MIF1 (véase la Figura 1).

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Ejemplo 6

Construcción de un vector que permite la expresión en la levadura de una proteína de fusión entre un mutante de muerte de quinasa de MEKK1 y del dominio de unión de ADN de GAL4

Sobre el plásmido pCM411, se amplificó un fragmento PCR con los oligonucleótidos 9471 y 7841. Este fragmento se digerió por Stu1 y PshA1, luego se ligó en el plásmido pCM433 cortado por las enzimas de restricción Stu1 y PshA1. El plásmido obtenido se llamaba pCM518.

La deleción del fragmento Sac1-Sac1 del plásmido pCM518 permitó que se obtuviera el plásmido pCM519. Este vector permitía la expresión de los aminoácidos 287 a 672 de quinasa-MEKK1p de muerte en fusión con el dominio de unión de ADN de Gal4p.

La deleción del fragmento Nco1-Nco1 del plásmido pCM518 permitó que se obtuviera el plásmido pCM520. Este vector permitía la expresión de los aminoácidos 353 a 672 de quinasa-MEKK1p de muerte en fusión con el dominio de unión de ADN de Gal4p.

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Ejemplo 7

Construcción de vectores que permiten la expresión en la levadura de una proteína de fusión entre la proteína MEKK1 y el dominio de transactivación de GAL4 y entre la proteína MIF1 y el dominio de unión de ADN de GAL4

La expresión de la proteína de fusión entre la proteína MEKK1 y el dominio de transactivación de Gal4 se logró por medio del vector pGAD424 (Materiales y Métodos), en el que se introdujo, en el mismo marco de lectura que la secuencia correspondiente al dominio de transactivación de Gal4 (GAL4TA), el fragmento EcoR1-Xho1 de pCM411. La secuencia de este plásmido se verificó. Este plásmido se llamaba pCM490.

La expresión de la proteína de fusión entre la proteína Mif1 y el dominio de unión de ADN de Gal4 se logró por medio del vector pGBT9+2 (Materiales y Métodos), en el que se introdujo, en el mismo marco de lectura que la secuencia correspondiente al dominio de unión de ADN de GAL4 (GAL4DB), el fragmento EcoR1-Xho1 de pCM480. La secuencia de este plásmido se verificó. Este plásmido se llamaba pCM491.

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Ejemplo 8

Localización de la zona de interacción de las proteínas Mekk1p y Mifp1

La cepa de levadura yCM17 se transformó por los diferentes plásmidos descritos en los ejemplos 1, 4, 5, 6, y 7 en el mismo momento que los plásmidos pCM479, pCM480, pCM481, pCM482, y pCM524. La actividad de \beta-gal se detectó como se describe en Materiales y Métodos. La actividad de quinasa de la proteína MEKK1p parece ser importante para su interacción con la proteína MIF1p (pCM480), centrina (pCM479), y la proteínas de los plásmidos pCM482 y pCM524. Por el contrario, su interacción con la proteína UBC9p (pCM481) no parece estar afectada por la ausencia de la actividad de quinasa (Figura 1).

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Ejemplo 9

Identificación de la porción 5' del gen que codifica para la proteína MIF1p

A partir de la colección de diferentes EST del GenBank que presentan un alto porcentaje de homología con la secuencia del inserto del plásmido pCM480 o entre ellos (es decir, EST no. W26888, no. entrada g1306116; EST no. AA134651, no. entrada g1695513; EST no. F12127, no. entrada g706460; EST no. W00383, no. entrada g1271822; EST no. T66207, no. entrada g675252; EST no. R28239, no. entrada g784374), se fue capaz de establecer una secuencia consenso. A partir de esta consenso, se seleccionaron oligonucleótidos para amplificar el extremo 5' de la secuencia codificante para la proteína MIF1: 5' CGC GGA GAA ATT GTT GGA 3' (SEQ ID NO:10)/5' CCG ATA TCG CAC TTG GTC CCC TTT GG 3' (SEQ ID NO:11). Después de que se llevara a cabo la PCR sobre el banco de cADN de células Hela, el fragmento obtenido se clonó en el plásmido pCR2 de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el proveedor para producir el plásmido pCM577. La secuencia del inserto del plásmido pCM577 se estableció, y se determinó que 603 de 980 nucleótidos del fragmento eran idénticos al extremo 5' del inserto del plásmido pCM480. Los otros 377 nucleótidos correspondieron a una porción del extremo 5' del cADN que codificaba para la proteína MIF1. La unión de estas dos secuencias les permitió a los inventores reconstituir la secuencia codificante entera de la proteína MIF1 (SEQ ID NO:7).

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Ejemplo 10

Construcción de un vector que permite la expresión de la proteína MIF1 con un myc-marcado en células de mamífero

Los oligonucleótidos:

5' agcttccaccatggagcagaagctgatctccgaggaggacctggaattctctcgag 3' (SEQ ID NO:12)

y

5'gatcctcgagagaattccaggtcctcctcggagatcagcttctgctccatggtgga 3' (SEQ ID NO:3)

se emparejaron y luego se unieron en el vector pCADN3, que se digerió mediante BamH1 y Hind3, para proporcionar el plásmido pSG47. El fragmento Sma1-Apa1 del vector pCM480 se insertó al nivel de los sitios EcoR5 y Apa1 de pSG47 para proporcionar el plásmido pCM500. Después, el fragmento Apa1-Apa1 se unió al nivel del sitio Apa1 de pCM500 en la orientación adecuada para proporcionar el plásmido pCM501. Mediante la PCR, usando los oligonucleótidos 5' CGG GAT CCA TGG ACA AAG ATT CTC AG 3' (SEQ ID NO:4) y 5' CCG ATA TCG CAC TTG GTC CCC TTT GG 3' (SEQ ID NO:11), el extremo 5' de la secuencia codificante para la proteína Miflp se amplificó a partir del plásmido pCM577, que se digerió por BamH1 y EcorV, y se unió en el vector pBluescriptII, que también se digerió mediante BamH1 y EcorV. El plásmido obtenido se llamaba pCM525. La secuencia de este plásmido se confirmó. El fragmento BamH1-PshA1 del plásmido pCM525 se insertó al nivel de los sitios BamH1-PshA1 del plásmido pCM501. El plásmido resultante, pCM562, permitió la expresión de la proteína Miflp con un myc-marcador en células mamíferas bajo el control del promotor CMV.

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Ejemplo 11

Construcción de un vector que permite la expresión de la proteína MEKK1p con un ha-marcador en células de mamífero

Los oligonucleótidos:

5'agcttccaccatgtatccgtatgatgtgcctgactacgcagaattctctcgag3' (SEQ ID NO: 5)

y

5'gatcctcgagagaattctgcgtagtcaggcacatcatacggatacagggtgga 3' (SEQ ID NO: 6)

se emparejaron y luego se unieron en el vector pCADN3, que se digerió mediante BamH1 y Hind3, para proporcionar el plásmido pSG52. El fragmento EcoR1-Xho1 del plásmido pCM411 se insertó al nivel de los sitios EcoR1-Xho1 del plásmido pSG52. El plásmido resultante, pCM556, permitió la expresión de MEKK1p con un marcador HA en células mamíferas bajo el control del promotor CMV.

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Ejemplo 12

Expresión eucariótica de MIF1 in vivo e in vitro

MIF1 se expresa en un amplio rango de tejidos, según se analiza por el rastreo de la genoteca de EST. Un análisis de transferencia Northern de muestras de tumor humano detecta a un solo ARN mensajero de 2,4 kb, expresado en todos los tumores analizados (Figura 2). MIF 1 también se expresa en tejidos normales como se muestra por análisis de transferencia Northern de una transferencia de tejido múltiple humano normalizado (Figura 3). Se encontró una expresión más fuerte en corazón, páncreas y placenta, y en este último tejido pudieron detectarse diferentes mensajeros. La observación de estos mensajeros de diferentes tamaños indica que existen variantes de empalme
naturales.

En experimentos de transfección transitorios en células NIH3T3, la proteína MIF1 disminuyó el nivel de activación de JNK obtenido por co-transfección con la proteína MEKK1 fusionada con el reportero de Gal4Jun (Figura 4). Se obtuvieron transfectantes estables en células CHO y PC 12. No se observó toxicidad de la sobrexpresión de la proteína MIF1. Esto es distinto del dominio catalítico de MEKK1, que había sido mencionado que inducía la apoptosis de células cuando se sobrexpresaba en células.

Se generó un anticuerpo policlonal dirigido contra un péptido correspondiente a los aminoácidos 16-28 (S14Y) de MIF1. Este anticuerpo reconocía tanto a la proteína MIF1 humana como de ratón y permitía la detección de la proteína MIF1 en transferencias Western (Figura 5).

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Ejemplo 13

Generación de clones estables que expresan la proteína MIF1

Se transfectaron células con plásmido que codificaba MIF ADN bajo el control del promotor CMV (pCM562) o un vector vacío como control (pCADN3). Se analizaron los extractos celulares de grupos de células resistentes a G418 por transferencia Western. Los resultados mostraron que las células transfectadas pCM562-estables expresaron la proteína marcada-MIF1/MSP58 (figura 6). El análisis por inmunofluorescencia usando anticuerpo anti-myc mostró un marcado desigual de los núcleos resultante de un nivel variable de la expresión de la proteína MIF1 en el grupo de células resistentes de G418. La clonación individual de células que expresaban un alto nivel de proteína MIF 1 se realizó después y se analizaron 36 clones individuales para la expresión de la proteína MIF1. Se seleccionaron dos clones con respecto al alto nivel de producción de proteína recombinante (Nº 14 y Nº 34) (figura 7). Estos clones no mostraron ninguna diferencia significativa en la tasa de crecimiento comparado con las células control transfectadas con el vector pCADN3 (figura 8).

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Ejemplo 14

MIF1 inhibe la actividad de JNK inducida por sorbitol

Los inventores usaron CHOMIF1 #34 para analizar el efecto de la expresión de MIF1 sobre la activación de JNK a través de la estimulación de MEKK1.

Yuriji et al (Science (1998), vol 282, p1911) mostró que MEKK1 activa las JNK en respuesta a sorbitol 200 mM. Para analizar el efecto de a expresión de MIF1 sobre la activación de MEKK1 por sorbitol, los inventores incubaron células CHOMIF1 y células control (CHOpCADN3) en presencia de 200 mM de sorbitol durante diferentes tiempos (5, 15 y 30 minutos). Los extractos de células se prepararon después y se analizó la activación de MEKK1 (y posterior activación de JNK) usando el ensayo de fosforilación de GST-Jun(1-223) in vitro (véase Materiales y Métodos). Las células que expresaban MIF 1 mostraron una inhibición de la activación de JNK (revelada por una débil fosforilación de GST-JUN) en respuesta a la incubación con sorbitol (figura 9). Estos resultados indicaron que MIF1 inhibía la activación de JNK después de la estimulación con sorbitol (200 mM) aparentemente a través de la actividad de la inhibición de MEKK1.

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Ejemplo 15

MIF1 interacciona con MEKK1 en condiciones de estrés

Para analizar la interacción entre la proteína MEKK1y la proteína MIF1 en células, los inventores construyeron un plásmido recombinante que codificaba para la proteína GST-MEKK1 (aproximadamente 120 Kda) (véase Materiales y Métodos). Después de la transfección en células CHOMIF1 #34, se añadió sorbitol (200 mM) o no durante 30 min, luego las células se lisaron y se fijaron GST-proteínas sobre GSH-sepharose. Después de la elución con un exceso de solución de GSH, los complejos proteicos se separaron sobre PAGE-SDS de Tris-Glicina y se analizaron por transferencia Western usando el anticuerpo anti-GST (figura 11) o el anticuerpo anti-myc (figura 12). Los resultados presentados en la figura 11 indicaron que GST y GST-MEKK1 interaccionaban con GSH sepharose después de la incubación de los extractos celulares. La figura 12 mostró que la proteína celular MIF1 -myc-marcada interaccionaba con la proteína MEKK1. Esta interacción es más importante en condiciones de estrés(+sorbitol) (comparar la banda 4 a 3), indicando que la interacción de MIF1 -MEKK1 está facilitada por la fosforilación de MEKK1 como se muestra previamente en los experimentos de 2-híbridos de levadura. Estos resultados confirman los datos obtenidos en el sistema de levadura de

\hbox{2-híbridos e indicaron que la proteína
MIF1 interacciona  en células con la proteína MEKK1
fosforilada.}

Tomados juntos, estos resultados validan la capacidad de que MIF1 inhiba la actividad de la cascada de quinasa de estrés por la proteína MEKK1 y que aparece por la interacción directa con la proteína MEKK1.

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Ejemplo 16

MIF1 potencia la sensitibilidad de células frente a la apoptosis inhibiendo la actividad de MEKK1

Se mostró que la activación de MEKK1 podía proteger a la célula de la apoptosis debido a la exposición a largo plazo de sorbitol (Yuriji et al, (1998), Science vol 282, p1911; Yuriji et al (1999), J. Biol. Chem., vol 274, p12605).

La sensibilidad frente a la apoptosis de CHOpCADN3 y CHOMIF1 #34 se analizó después de una incubación de las células durante 24 h en sorbitol 200 mM. Los resultados indicaron que las células que expresaban MIF1 eran más sensibles a la apoptosis inducida por sorbitol que las células control (figura 10).

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Ejemplo 17

Ensayo para la identificación de compuestos capaces de romper la interacción de MEKK1-proteína MIF1

El método descrito en esta memoria permite la identificación de fármaco(s) que inhiban la interacción de MEKK1-MIF 1, así como la actividad de quinasa de MEKK1. Este método se basa en la tecnología de 2-híbridos (revisada en Fields S, Sternglanz R Trends Genet 1994 Agosto; 10(8):286-92 The two-hybrid system: an assay for protein-protein interactions/Mendelsohn AR, Brent R Curr Opin Biotechnol 1994 Oct; 5(5):482-6 Applications of interaction traps/two-hybrid systems to biotechnology research/Bemis LT, Geske FJ, Strange R.Methods Cell Biol 1995; 46:139-51 Use of the yeast two-hybrid system for identifying the cascade of protein interactions resulting in apoptotic cell death/White MA. Proc Natl Acad Sci U S A 1996 Sep 17; 93(19):10001-3 The yeast two-hybrid systemm: forward and reverse/Luban J, Goff SP Curr Opin Biotechnol 1995 Feb; 6(1):59-64 The yeast two-hybrid system for studying protein-protein interactions./Bai C, Elledge SJ Methods Enzymol 1996; 273:331-47 Gene identification using the yeast two-hybrid system/Frederickson RM Curr Opin Biotechnol 1998 Feb; 9(1):90-6 Macromolecular matchmaking: advances in two-hybrid and related technologies./T Colas P, Brent R Trends Biotechnol 1998 Agosto; 16(8):355-63 The impact of one-hybrid and related methods on biotechnology. Nidal M, Legrain P Nucleic Acids Res 1999 Feb 15; 27(4):919-29 Yeast forward and reverse `n'-hybrid systems.).

Se usan MEKK1 de cadena completa o MEKK1 delecionada fusionada a un dominio de unión de ADN (las secuencias codificantes correspondientes se clonan en los plásmidos pCM433 y pCM486 de levadura como ejemplo (descrito en los ejemplos 1 y 4)). Se usa MIF1 de cadena completa o MIF1 delecionada fusionada a un dominio transactivador (como ejemplo se clona la secuencia codificante correspondiente en los plásmidos pCM480 (descritos en el ejemplo 3). Las cepas de dos híbridos de levadura usadas tienen al menos un gen reportero (entre ellos URA3, HIS3, LEU2, CYH2, CAN1, lacZ, GFP u otros genes reporteros) y mutación o mutaciones asociadas que permiten la detección de una expresión del gen reportero (es decir, mutación ura3 si el gen URA3 se usa como gen reportero, etc.) con o sin mutación (mutaciones) o inactivación (inactivaciones) del gen adicional para aumentar la concentración interna de cada compuesto analizado (véase el documento WO96/10082). Como ejemplo, se usa la cepa de yCM17 de levadura descrita en Materiales y Métodos. Los fármacos que conducen a una disminución de la interacción de MEKK1/MIF1 inducen a una disminución de la expresión del(de los) gen(es) reportero(s). Pueden usarse diferentes métodos para monitorizar la expresión del gen reportero tales como ensayos enzimáticos colorimétricos/fluorométricos/luminescentes de la proteína enzimática codificada por el(los) gen(es) reporter(os), - puede medir la inhibición del crecimiento halo en medio selectivo para el gen reportero que complementa a la mutación cromosómica de levadura versus medio no selectivo, determinación del crecimiento halo cuando hay disponible un contador-selección (fluoorato que contiene medio si el gen reportero es URA3, canavanina que contiene medio para CAN 1 como gen reportero con una levadura que alberga una mutación can 1 o inactivación, etc...). Todos estos métodos usados en la biología de la levadura están muy bien descritos en la bibliografía (Methods Enzymol 1991; 194:1-863 Guide to yeast genetics and molecular biology, Methods Enzymol 1983, 101:167-346 Recombinant DNA, Biotechnology 1989; 13:1-354 Yeast genetic engineering; Methods in molecular biology 1996, 53,1-433 Yeast protocols; Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach Editado por John R. Johnston 1994 1-300; The Yeast Two-Hybrid System 1997 1-356 Paul L. Bartel, y Stanley Fields; Methods in Yeast Genetics: A Laboratory Course Manual 1997; Methods in Yeast Genetics: A Laboratory Course Manual, 1990).

El principio de selección secundaria para identificar a antagonistas o agonistas de la unión de MIF1/MSP58-MEKK1 se describe en la figura 13. Un clon estable celular que sobre-expresa al MIF1/MSP58 (clon CHOMIF #34, por ejemplo) se transfecta con un sistema reportero que refleja la activación de la ruta de MEKK1/JNK (Yujiri et al, 1999, J. Biol. Chem. Vol 274, p12605; Yujiri et al, 1998, Science, vol 282, p1911). El plásmido 1 codifica para MIF1/MSP58 (pCM562 como ejemplo) y lleva el gen de la resistencia a la Neomicina. El plásmido 2 y 3 proporciona el sistema del gen reportero Gal4-Jun/Gal 4 Luc (Lassignal Johnson et al, 1996 J. Biol. Chem. Vol 271, p 3229; Gupta et al, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. Vol 90, p3216; Hibi et al 1993, Genes and Dev., Vol 7, p2135) y lleva otros dos marcadores diferentes seleccionables (el plásmido 2 lleva, por ejemplo, el gen de la resistencia a la higromicina y el plásmido 3 lleva el gen de la resistencia a la Zeocina). El plásmido 2 codifica para la proteína de fusión Gal4_{(n-147)}-
Jun _{(1-233)} (Hibi et al 1993, Genes and Dev., vol 7, p2135, Sadowski et al, 1989, Nucleic Acids Res, Vol 17, p7539). Esta proteína puede unirse a la secuencia Gal4-DBD localizada en el promotor corriente arriba del gen reportero luciferasa (Gupta et al, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. Vol 90, p3216) y activa la transcripción del gen de Luciferasa si parte de Jun está fosforilada. Los estímulos externos para activar la ruta de MEKK1/JNK pueden ser una baja concentración de sorbitol (200 mM) o choque de frío o nocodazol (0,5 \mug/ml) u otros (Yujiri et al, 1999, J. Biol. Chem. Vol 274, p12605; Yujiri et al, 1998, Science, vol 282, p1911). Se añaden las moléculas que se analizan en el medio completo en presencia (o antes o después) de los estímulos externos. La actividad de luciferasa se analiza después de la lisis de las células de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Promega) y se miden con un luminómetro.

La presente invención no está limitada en su alcance por las realizaciones específicas descritas en este documento. De hecho, para los expertos en la técnica serán evidentes diversas modificaciones de la invención además de las descritas en la presente memoria a partir de la descripción anterior y de las figuras adjuntas. Tales modificaciones se incluyen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Se debe entender adicionalmente que todos los tamaños de las bases o todos los tamaños de los aminoácidos y todos los valores de peso molecular o de masa molecular, dados para los ácidos nucleicos o los polipéptidos, son aproximados y se proporcionan a modo de descripción.

<110> Rh\hat{o}ne-poulenc Rorer

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<120> Proteína 1 de FHA que interacciona con MEKK1 (MIF1)

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<130> secuencias

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<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

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<150> 93590

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<151> 1998-07-21

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<160> 12

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<170> PatentIn Ver. 2,1

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<210> 1

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<211> 1553

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (2)..(1174)

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<400> 1

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\hskip0,8cm

1

\hskip0,8cm

2

\hskip0,8cm

3

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 390

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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\hskip0,8cm

4

\hskip0,8cm

5

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<210> 3

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<211> 56

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

gatcctcgag agaattccag gtcctcctcg gagatcagct tctgctccat ggtgga

\hfill

56

\newpage

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<210> 4

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<211> 26

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgggatccat ggacaaagat tctcag

\hfill

26

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<210> 5

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<211> 53

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

agcttccacc atgtatccgt atgatgtgcc tgactacgca gaattctctc gag

\hfill

53

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 53

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

gatcctcgag agaattctgc gtagtcaggc acatcatacg gatacagggt gga

\hfill

53

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<210> 7

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<211> 1914

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (147)..(1535)

\newpage

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<400> 7

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\hskip0,8cm

6

\hskip0,8cm

7

\hskip0,8cm

8

\hskip0,8cm

9

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<210> 8

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<211> 462

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

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\hskip0,8cm

10

\hskip0,8cm

11

\hskip0,8cm

12

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<210> 9

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

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<400> 9

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctattcgatg atgaagatac ccc

\hfill

23

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<210> 10

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: polinucleótido

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<400> 10

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgcggagaaa ttgttgga

\hfill

18

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<210> 11

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<211> 26

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: polinucleótido

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<400> 11

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccgatatcgc acttggtccc ctttgg

\hfill

26

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<210> 12

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<211> 56

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: polinucleótido

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<400> 12

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\hskip-.1em\dddseqskip

agcttccacc atggagcaga agctgatctc cgaggaggac ctggaattct ctcgag

\hfill

56

Claims

1. Un método para seleccionar moléculas que modulan la actividad de MIF1, siendo definida dicha actividad como la unión a MEKK1, que comprende:

a) poner en contacto una proteína MIF1 con una molécula candidato, en el que la proteína MIF1 tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO:8; y

b) detectar la unión de la molécula a la proteína MIF 1 por medio de MIF1 marcado o reactivo secundario marcado, en el que se proporciona el marcaje por marcaje isotópico, fluorescente o marcador quimioluminiscente, en el que dicha unión está asociada con la modulación de dicha actividad de MIF1.

2. Un método para seleccionar moléculas que modulan la actividad de MIF1, siendo definida dicha actividad como la unión a MEKK1, que comprende:

a) poner en contacto una proteína MIF1 con una molécula candidato, en el que la proteína MIF1 se selecciona entre el grupo que consiste en una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO:8, una variante alélica de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO:8, una variante de empalme de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO:8, y

b) detectar la unión de la molécula a la proteína MIF1 en el que dicha unión está asociada con la modulación de la interacción de MIF1 y MEKK1.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la modulación de la interacción de MIF1 y MEKK1 comprende detectar un cambio en el nivel de expresión de un gen reportero expresado bajo el control de una proteína quimérica que consiste en el dominio de unión de MIF1 de MEKK1 y un dominio de unión de ADN de un activador de la transcripción en una línea celular transfectada con MIF1 y la proteína quimérica MEKK1.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la detección de la expresión es en células mamíferas transfectadas transitoriamente.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la molécula es un agonista de MIF 1.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la molécula es un antagonista de MIF1.

7. Un método para disminuir la actividad de MEKK1 en una célula in vitro que comprende aumentar el nivel de proteína MIF1 en la célula, en el que la proteína MIF1 se selecciona entre el grupo que consiste en una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO:8, una variante alélica de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO:8, una variante de empalme de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO:8.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la proteína homóloga de otra especie es una proteína MIF1 murina.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la célula se ha transfectado con un vector que codifica MIF1 bajo condiciones que permitan la expresión de la proteína MIF1.

10. Un método para aumentar la actividad de MEKK1 en una célula in vitro, que comprende disminuir el nivel de la proteína MIF 1 en la célula, en el que la proteína MIF1 se selecciona entre el grupo que consiste en una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO:8, una variante alélica de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO:8, una variante de empalme de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO:8.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el nivel de la proteína MIF1 se disminuye introduciendo un ácido nucleico antisentido de MIF1 en la célula, cuyo ácido nucleico antisentido se hibrida bajo condiciones intracelulares a un mARN de MIF1.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el nivel de proteína MIF1 se disminuye introduciendo un anticuerpo de Fv de cadena simple (scFv) que se une específicamente a MIF1 dentro de la célula a un nivel suficiente para unirse e inactivar a MIF 1.

13. Un anticuerpo que reconoce específicamente a los aminoácidos 16-28 de MIF1 de SEQ ID NO:8.

14. El anticuerpo según la reivindicación 13, que es policlonal.