ES2345318T3 - Composiciones utilizables para regular la actividad de la parquina. - Google Patents
Composiciones utilizables para regular la actividad de la parquina. Download PDFInfo
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Abstract
Polipéptido que interactúa con la parquina que presenta en toda su longitud una identidad de al menos 95% con la secuencia SEQ ID Nº: 2.
Description
Composiciones utilizables para regular la
actividad de la parquina.
La presente invención se refiere a composiciones
y métodos utilizables para regular la actividad de la parquina. Se
refiere principalmente a una nueva proteína, denominada PAP1, pareja
de la parquina, así como a los péptidos o polipéptidos derivados u
homólogos de esta proteína. Se refiere principalmente a compuestos
capaces de modular al menos parcialmente la actividad de la
parquina, principalmente de interferir con la interacción entre la
parquina y la PAP1. La presente invención se puede usar en los
campos terapéuticos, de diagnóstico o para la constitución de
dianas farmacológicas que permitan el desarrollo de nuevos
medicamentos.
El gen de la parquina muta en algunas formas
familiares (juveniles autosómicas recesivas) de la enfermedad de
Parkinson (Kitada et al., 1998). La enfermedad de Parkinson
(Lewy, 1912) es una de las enfermedades neurodegenerativas más
comunes que afecta a más de 15 de la población mayor de 55 años. Los
pacientes afectados de esta enfermedad tienen trastornos
neurológicos agrupados con el término de síndrome parquinsoniano,
caracterizado por rigidez, bradiquinesia y temblores Estos
síntomas son consecuencia de una degeneración de las neuronas
dopaminérgicas de la sustancia negra del cerebro.
La mayor parte de casos con enfermedad de
Parkinson no tienen una historia familiar. Sin embargo, existen
casos familiares de los que algunos corresponden a una forma
monogénica de la enfermedad. Hasta el momento, solo se han
identificado tres genes diferentes en algunas formas hereditarias
raras. La primera forma corresponde a una forma autosómica
dominante cuyo gen responsable codifica para la alfa sinucleina
(Polymeropoulos et al., 1997). Esta proteína es un
constituyente en la que abundan inclusiones intracitoplasmáticas,
denominadas cuerpos de Lewy, que sirven como marcador de la
enfermedad de Parkinson (Lewy, 1912). La segunda forma, igualmente
autosómica dominante, está unida a una mutación en un gen que
codifica para una hidrolasa denominada ubiquitina carboxiterminal
hidrolasa L1 (Leroy et al., 1998). Se supone que esta enzima
hidroliza los polímeros o los conjugados de las ubiquitinas en
monómeros de ubiquitina. La tercera forma se distingue de las
precedentes por una transmisión autosómica recesiva y un inicio a
menudo antes de los 40 años, así como por una ausencia de cuerpos
de Lewy. Estas enfermedades responden más favorablemente a la
levodopa, un precursor de la dopamina usado como tratamiento de la
enfermedad de Parkinson.
El gen implicado en esta forma codifica para una nueva proteína denominada parquina (Kitada et al., 1998).
El gen implicado en esta forma codifica para una nueva proteína denominada parquina (Kitada et al., 1998).
El gen de la parquina está constituido por 12
exones que cubren una región genómica de más de 500.000 pares de
bases sobre el cromosoma 6 (6q25.2-q27). Hasta el
momento se conocen dos tipos importantes de mutaciones de este gen
en el origen de la enfermedad, bien deleciones de tamaño variable en
la región que cubre los exones 2 a 9 o bien mutaciones puntuales
que producen la aparición prematura de un codon de terminación o el
cambio de un aminoácido (Kitada et al., 1998; Abbas et
al., 1999; Lucking et al., 1998; Hattori et al.,
1998). La naturaleza de estas mutaciones y el modo de transmisión
autosómica recesiva sugieren una pérdida de función de la parquina
que lleva a la enfermedad de Parkinson.
Este gen se expresa en un gran número de tejidos
y principalmente en la sustancia negra. Existes varios tránscritos
que corresponden a este gen y que provienen de empalmes alternativos
diferentes (Kitada et al., 1998; Sunada et al.,
1998). En el cerebro se encuentran dos tipos de ARN mensajero de los
que uno está desprovisto de la parte correspondiente al exón 5. En
los leucocitos se han identificado ARN mensajeros de la parquina
que no contienen la región que codifica para los exones 3, 4 y 5. El
más largo de los ARN mensajeros de la parquina, presente en el
cerebro, contiene 2960 bases y codifica para una proteína de 465
aminoácidos.
Esta proteína tiene una pequeña homología en su
parte N-terminal con la ubiquitina. Su extremo
C-terminal contiene dos restos "ring
finger" separados por un dominio IBR (por sus iniciales en
inglés: "In Between Ring") que corresponde con un región
rica en cisteina que puede unirse a metales como los dominios
"dedos de zinc" (Morett, 1999). Se ha demostrado por
inmunocitoquímica que la parquina está localizada en el citoplasma
del aparato de Golgi de las neuronas de la sustancia negra que
contienen melanina (Shimura et al., 1999). Además, esta
proteína está presente en algunos cuerpos de Lewy de los enfermos de
Parkinson. La función celular de la parquina aún no ha sido
demostrada, pero podría tener un papel de transportador de las
vesículas sinápticas, en la maduración o degradación de las
proteínas y en el control del crecimiento, de la diferenciación o
del desarrollo celular. En las formas autosómicas recesivas
juveniles, la parquina está ausente confirmando así que la pérdida de esta función es responsable de la enfermedad.
juveniles, la parquina está ausente confirmando así que la pérdida de esta función es responsable de la enfermedad.
La elucidación del papel exacto de la proteína
parquina en el proceso de degeneración de las neuronas
dopaminérgicas constituye por tanto un reto importante para la
comprensión y el enfoque terapéutico de la enfermedad de Parkinson
y, más generalmente, de las enfermedades del sistema nervioso
central.
La presente invención se refiere a la
identificación de una pareja de la parquina que interacciona con
esta proteína en condiciones fisiológicas. Esta pareja representa
una nueva diana farmacológica para la fabricación o la
investigación de compuestos capaces de modular la actividad de la
parquina, principalmente su actividad sobre la degeneración de las
neuronas dopaminérgicas y/o el desarrollo de patologías nerviosas.
Esa proteína, los anticuerpos, los ácidos nucleicos
correspondientes así como las sondas o cebos específicos, son
también utilizables para la detección o dosificación de las
proteínas en muestras biológicas, en particular muestras de tejido
nervioso. Estas proteínas o ácidos nucleicos son también utilizables
en métodos terapéuticos para modular la actividad de la parquina,
así como cualquier compuesto según la invención capaz de modular la
interacción entre la parquina y los polipéptidos de la
invención.
La presente invención resulta más
particularmente de la demostración por la Solicitante de una nueva
proteína humana, denominada PAP1 (por sus iniciales en inglés:
Parkine Associated Protein 1) o LY111 que
interacciona con la parquina. La proteína PAP1 (secuencias SEQ ID
Nº: 1 ó 2) presenta cierta homología con las sinaptotagminas y es
capaz de interactuar más particularmente con la región central de la
parquina (representada por las secuencias SEQ ID Nº: 3 ó 4). La
proteína PAP1 ha sido igualmente clonada, secuenciada y
caracterizada a partir de diferentes tejidos de origen humano,
principalmente del pulmón (SEQ ID Nº: 12, 13) y del cerebro (SEQ ID
Nº: 42, 43), así como de formas cortas que corresponden a variantes
de empalme (SEQ ID Nº: 14, 15, 44, 45).
La presente invención resulta igualmente de la
identificación y de la caracterización de regiones particulares de
la proteína PAP1, implicadas en la modulación de la función de la
parquina. La demostración de la existencia de esa proteína y de
regiones implicadas en su función permite en particular preparar
nuevos compuestos y/o composiciones utilizables como agentes
farmacéuticos y desarrollar métodos industriales de selección de
tales compuestos.
Un primer objetivo de la invención se refiere a
un polipéptido que interacciona con la proteína que presenta en toda
su longitud una identidad de al menos 95% con la secuencia SEQ ID
Nº: 2.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
ácido nucleico que codifica para la proteína PAP1, sus fragmentos,
derivados u homólogos, así como cualquier vector que comprenda dicho
ácido nucleico, cualquier célula recombinante que contenga dicho
ácido nucleico o vector y cualquier mamífero no humano que comprenda
en sus células dicho ácido nucleico.
La invención se refiere también a anticuerpos
capaces de unir la proteína PAP1, sus fragmentos, derivados y
homólogos, principalmente anticuerpos policlonales o monoclonales,
más preferentemente anticuerpos capaces de unir la proteína PAP1 y
de inhibir al menos parcialmente su interacción con la parquina.
Otro aspecto de la invención se refiere a sondas
o iniciadores nucleotídicos, específicos de la PAP1, utilizables
para detectar o amplificar el gen de pap1 o una región de este en
cualquier muestra biológica.
La invención se refiere además a composiciones
farmacéuticas, métodos de detección de anomalías genéticas, métodos
de producción de polipéptidos tales como los que se han definido
anteriormente, así como a métodos de selección o de caracterización
de compuestos activos.
En el sentido de la presente invención, la
denominación proteína PAP1 se refiere a la proteína en sí, así como
a todas sus formas homólogas. Por forma homóloga se entienden todas
las proteínas equivalentes a la proteína considerada, de origen
celular diverso y en particular derivadas de células de origen
humano, o de otros organismos, y que posean una actividad del mismo
tipo. Dichos homólogos comprenden igualmente los variantes naturales
de la proteína PAP1 de secuencia SEQ ID Nº: 2, principalmente los
variantes polimórficos o de empalme. Dichos homólogos se pueden
obtener por experimentos de hibridación entre los ácidos nucleicos
codificadores (principalmente el ácido nucleico de la secuencia SEQ
ID Nº: 1). En el sentido de la invención, basta que una secuencia de
este tipo presente un porcentaje de identidad significativo para
conducir a un comportamiento fisiológico asimilable al de la
proteína PAP1 tal como se reivindica. A este respecto, variantes y/o
homólogos de la secuencia SEQ ID Nº: 2 se describen en las
secuencias SEQ ID Nº: 13, 15, 43 y 45, identificados a partir de
tejidos de origen humano. La denominación PAP1 engloba por lo tanto
igualmente a estos polipéptidos. El porcentaje de "identidad"
entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos, en el sentido de
la presente invención, se puede determinar comparando dos
secuencias alineadas de forma óptima a través de una ventana de
comparación.
La parte de la secuencia nucleotídica o
polipéptido en la ventana de comparación puede comprender por lo
tanto adiciones o deleciones (por ejemplo discontinuidades o
"gaps") con respecto a la secuencia de referencia (que
no comprende estas adiciones ni estas deleciones) de forma que se
obtenga un alineamiento óptimo de las dos
secuencias.
secuencias.
El porcentaje se calcula determinando el número
de posiciones en las que una base nucleica o un resto de aminoácido
idéntico se observa para las dos secuencias (nucleica o peptídica)
comparadas, dividiendo después el número de posiciones en las que
hay identidad entre las dos bases o restos de aminoácidos por el
número total de posiciones en la ventana de comparación y a
continuación multiplicando el resultado por 100 con el fin de
obtener el porcentaje de identidad de secuencia.
El alineamiento óptimo de las secuencias para la
comparación se puede realizar de forma informática mediante
algoritmos conocidos contenidos en el paquete informático de la
sociedad WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER
GROUP (GCG), 575 Science Doctor, Madison, WISCONSIN.
Como ilustración, el porcentaje de identidad de
secuencia se podrá realizar mediante el programa BLAST (versiones
BLAST 1.4.9 de marzo de 1996. BLAST 2.0.4 de febrero de 1998 y BLAST
2.0.6 de septiembre de 1998), usando exclusivamente los parámetros
por defecto (Altschul et al, J. Mol. Biol., (1990)
215: 403-410; Altschul et al, Nucleic
Acids Res. (1997) 25: 3389-3402). BLAST busca
secuencias similares/homólogas a una secuencia solicitada de
referencia mediante el algoritmo de Altschul et al.
(Supra). La secuencia solicitada y las bases usadas pueden
ser peptídicas o nucleicas, siendo posible cualquier combinación
entre ellas.
En el sentido de la presente invención, el
término derivado denomina cualquier secuencia que se diferencia de
la secuencia considerada debido a una degeneración del código
genético, obtenida por una o varias modificaciones de naturaleza
genética y/o química, así como cualquier péptido codificado por una
secuencia que hibrida con la secuencia nucleica SEQ ID Nº: 1 o un
fragmento de esta, por ejemplo con las secuencias nucleicas SEQ ID
Nº: 12, 14, 42 ó 44 o un fragmento de estas, y que presentan la
capacidad de interferir a nivel de la interacción entre la proteína
PAP1, o uno de sus homólogos, y la parquina. Por "modificación de
naturaleza genética y/o química" se puede entender cualquier
mutación, sustitución, deleción, adición y/o modificación de uno o
varios restos. El término derivado comprende igualmente las
secuencias homólogas a la secuencia considerada, procedentes de
otras fuentes celulares y principalmente de células de origen humano
o de otros organismos, y que poseen una actividad del mismo tipo.
Dichas secuencias homólogas se pueden obtener mediante experimentos
de hibridación. Las hibridaciones se pueden realizar a partir de
bancos de ácidos nucleicos usando como sonda la secuencia natural o
un fragmento de ella, en condiciones variables de hibridación
(Maniatis et al., 1989). Por otra parte, el término
"fragmento" o "parte" denomina cualquier porción de la
molécula considerada que comprenda al menos 5 restos consecutivos,
preferentemente al menos 9 restos consecutivos, aún más
preferentemente al menos 15 restos consecutivos. Fragmentos típicos
pueden comprender al menos 25 restos consecutivos.
Dichos derivados o fragmentos se pueden generar
con objetivos diferentes, tales como principalmente el de aumentar
su eficacia terapéutica o de reducir sus efectos secundarios o el de
conferirles nuevas propiedades farmacocinéticas y/o biológicas.
Un objetivo específico de la presente invención
se refiere a la proteína PAP1 de secuencias SEQ ID Nº: 13 ó 43.
Otro objetivo de la invención se refiere a los
anticuerpos o fragmentos o derivados de anticuerpos policlonales o
monoclonales dirigidos contra un polipéptido tal como se ha definido
anteriormente. Dichos anticuerpos se pueden generar por métodos
conocidos por el profesional. En particular, estos anticuerpos se
pueden preparar por inmunización de un animal frente a un compuesto
peptídico de la invención (principalmente un polipéptido o un
péptido que comprende toda o parte de la secuencia SEQ ID Nº: 2),
toma de sangre y aislamiento de los anticuerpos. Estos anticuerpos
se pueden generar igualmente por preparación de hibridomas según las
técnicas conocidas por el profesional.
Más preferentemente, los anticuerpos o
fragmentos de anticuerpos de la invención presentan la capacidad de
modular al menos parcialmente la interacción con la parquina de los
péptidos reivindicados.
Por otra parte, esos anticuerpos se pueden
utilizar también para detectar y/o dosificar la expresión de la
PAP1 en muestras biológicas y, por tanto, para informar sobre su
estado de activación.
Los fragmentos o derivados de anticuerpos son,
por ejemplo, fragmentos Fab, Fab'2, anticuerpos de cadena sencilla
(ScFv), etc. Se trata en particular de cualquier fragmento o
derivado que conserve la especificidad antigénica de los
anticuerpos de los que se deriva.
Los anticuerpos según la invención son más
preferentemente capaces de unir las proteínas que comprenden las
secuencias SEQ ID Nº: 2, 13, 15, 43 ó 45, principalmente la región
de esta proteína implicada en la interacción con la parquina. Estos
anticuerpos (o fragmentos o derivados) son más preferentemente
capaces de unir un epítopo presente en la secuencia comprendida
entre los restos 1 y 344 de la secuencia SEQ ID Nº: 2.
La invención se refiere igualmente a los
compuestos no peptídicos o no exclusivamente peptídicos utilizables
como agente farmacéutico. En efecto, a partir de los restos
proteicos activos descritos en la presente solicitud es posible
realizar moléculas moduladoras de la actividad PAP1 no
exclusivamente peptídicas y compatibles con un uso farmacéutico, en
particular duplicando los restos activos de los péptidos con una
estructura no peptídica o de naturaleza no exclusivamente
peptídica.
La presente invención tiene también como
objetivo cualquier ácido nucleico que codifique para un compuesto
peptídico de acuerdo con la invención. Se puede tratar, en
particular, de un ácido nucleico que comprende toda o parte de las
secuencias SEQ ID Nº: 1,12, 14, 42 ó 44, o uno de sus derivados. Por
secuencia derivada se entiende en el sentido de la presente
invención cualquier secuencia que se hibrida con la secuencia
presentada en la SEQ ID Nº: 1, o con un fragmento de ésta, y que
codifica para un compuesto peptídico según la invención, así como
las secuencias resultantes de estas últimas por degeneración del
código genético. Ácidos nucleicos según la invención comprenden por
ejemplo toda o parte de las secuencias nucleicas SEQ ID Nº: 12, 14,
42 ó 44.
La presente invención se refiere además a
secuencias que presentan un porcentaje de identidad significativo
con la secuencia presentada en SEQ ID Nº 1 o con un fragmento de
esta que codifica para un compuesto peptídico que presenta un
comportamiento fisiológico asimilable al de la proteína PAP1. Se
entiende por porcentaje de identidad significativo un porcentaje de
al menos 60%, preferentemente 80%, más preferentemente 90% y todavía
más preferentemente de 95%.
Las diferentes secuencias nucleotídicas de la
invención pueden ser de origen artificial o no. Puede tratarse de
secuencias genómicas, de ADNc, de ARN, de secuencias híbridas o de
secuencias sintéticas o semisintéticas. Estas secuencias se pueden
obtener bien por selección de bancos de ADN (banco de ADNc, banco de
ADN genómico), bien por síntesis química, bien por métodos mixtos
que incluyan la modificación química o enzimática de secuencias
obtenidas por selección de bancos o bien por investigación de
homología en las bases de datos nucleicas o proteicas. La
hibridación mencionada anteriormente se realiza preferentemente en
las condiciones descritas por Sambrook et al (1989, páginas
9.52-9.55).
Se realiza preferentemente en condiciones de
hibridación muy estrictas. Por condiciones de "hibridación muy
estrictas" se entenderá, en el sentido de la presente invención,
las condiciones siguientes:
Mezclar: 40 \mul de ADN de esperma de salmón
(10 mg/ml) + 40 \mul de ADN de placenta humana (10 mg/ml)
Desnaturalizar durante 5 minutos a 96ºC y a
continuación sumergir la mezcla en hielo.
Extraer el tampón SSC 2X y verter 4 ml de mezcla
de formamida en el tubo de hibridación que contiene las
membranas.
Añadir la mezcla de los dos ADNs
desnaturalizados.
Incubación a 42ºC durante 5 a 6 horas con
rotación.
\vskip1.000000\baselineskip
Añadir a la sonda marcada y purificada de 10 a
50 \mul de ADN Cot I, según la cantidad de hibridaciones no
específicas.
Desnaturalizar durante 7 a 10 minutos a
95ºC.
Incubar a 65ºC durante 2 a 5 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Extraer la mezcla de
pre-hibridación.
Mezclar 40 \mul de ADN de esperma de salmón +
40 \mul de ADN de placenta humana; desnaturalizar durante 5
minutos a 96ºC y a continuación sumergir en hielo.
Añadir en el tubo de hibridación 4 ml de mezcla
de formamida, la mezcla de los dos ADN y sonda marcada/ADN Cot I
desnaturalizado.
Incubar de 15 a 20 horas a 42ºC con
rotación.
\vskip1.000000\baselineskip
Un lavado a temperatura ambiente en SSC 2X, para
aclarar.
2 veces 5 minutos a temperatura ambiente con SSC
2X y SDS 0,1%.
2 veces 15 minutos con SSC 0,1X y SDS 0,1% a
65ºC.
Cubrir las membranas con Saran y exponer.
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones de hibridación descritas
anteriormente están adaptadas a la hibridación en condiciones muy
estrictas de una molécula de ácido nucleico de una longitud variable
de 20 nucleótidos a varios cientos de nucleótidos.
No hace falta decir que las condiciones de
hibridación descritas anteriormente pueden adaptarse en función de
la longitud del ácido nucleico cuya hibridación se pretende realizar
o del tipo de marcado elegido, según las técnicas conocidas por los
expertos en la técnica.
Las condiciones convenientes de hibridación
pueden adaptarse, por ejemplo, según las enseñanzas contenidas en
la obra de HAMES y HIGGINS (1985) (Nucleic acid Hybridization. A
practical Approach, Hames and Higgins Ed., IRL Press, Oxford) o
también en la obra de F. AUSUBEL et al (1999) (Currents
Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and
Wiley Interscience, N. Y.).
\newpage
Un ácido nucleico particular en el sentido de la
invención codifica para un polipéptido que comprende la secuencia
SEQ ID Nº: 2 o un fragmento o derivado de esta, en particular para
la proteína PAP1 humana. Se trata ventajosamente de un ácido
nucleico que comprende las secuencias SEQ ID Nº: 1, 12, 14, 42 ó
44.
Dichos ácidos nucleicos se pueden utilizar para
la producción de los compuestos peptídicos de la invención. Por
tanto, la presente solicitud se refiere a un procedimiento de
preparación de dichos compuestos peptídicos según el cual se
cultiva una célula que contiene un ácido nucleico según la
invención, en condiciones de expresión de dicho ácido nucleico y se
recupera el compuesto peptídico producto. En ese caso, la parte que
codifica para dicho compuesto peptídico se coloca generalmente bajo
el control de señales que permiten su expresión en un huésped
celular. La elección de estas señales (promotores, terminadores,
secuencia líder de secreción, etc.) puede variar en función del
huésped celular utilizado. Por otra parte, los ácidos nucleicos de
la invención pueden formar parte de un vector que puede ser de
replicación autónoma o integradora. Más particularmente, se pueden
preparar vectores de replicación autónoma utilizando secuencias de
replicación autónoma en el huésped elegido. Cuando se trata de
vectores integradores, éstos se pueden preparar, por ejemplo,
utilizando secuencias homólogas a ciertas regiones del genoma del
huésped, permitiendo, por recombinación homóloga, la integración
del vector. Se puede tratar de un vector de tipo plasmídico,
episómico, cromosómico, viral, etc.
Los huéspedes celulares utilizables para la
producción de los compuestos peptídicos de la invención por vía
recombinante son tanto huéspedes eucariotas como procariotas. Entre
los anfitriones eucarióticos convenientes se pueden citar las
células animales, las levaduras o los hongos. En particular,
tratándose de levaduras, se pueden citar las levaduras del género
Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia,
Schwanniomyces, o Hansenula. Cuando se trata de
células animales, se pueden citar las células COS, CHO, C127, PC12,
etc. Entre los hongos, se pueden citar más particularmente
Aspergillus ssp. o Trichoderma ssp. Como anfitriones
procarióticos, se prefiere utilizar las bacterias siguientes: E.
coli, Bacillus o Streptomyces.
La presente invención tiene además como
objetivo mamíferos no humanos que comprenden en sus células un ácido
nucleico o un vector según la invención.
Dichos mamíferos (roedores, canes, conejos,
etc.) se pueden utilizar principalmente para el estudio de las
propiedades de la PAP1 y la identificación de compuestos con
objetivos terapéuticos. La modificación del genoma de dicho animal
transgénico puede resultar de una alteración o de una modificación
de uno o varios genes por "knock-in" o
por "knock-out". Estas modificaciones se
pueden realizar mediante agentes alteradores o mutágenos clásicos o
bien por mutagénesis dirigida. La modificación del genoma puede
resultar igualmente de una inserción de un gen o genes o del
reemplazo de un gen o genes en su forma salvaje o mutada. Las
modificaciones del genoma se efectúan ventajosamente sobre las
células madre reproductoras y ventajosamente sobre los pronúcleos.
La transgénesis se puede realizar por microinyección de una
cassette de expresión que comprende los genes modificados en
los dos pronúcleos fecundados. Por lo tanto, se puede obtener un
animal según la presente invención por inyección de una
cassette de expresión que comprende un ácido nucleico. De
manera preferencial, este ácido nucleico es un ADN que puede ser un
ADN genómico (ADNg) o un ADN complementario (ADNc).
La construcción de animales transgénicos según
la invención se puede realizar según técnicas clásicas bien
conocidas por los expertos en la técnica. El experto en la técnica
podrá en particular referirse a la producción de animales
transgénicos y particularmente a la producción de ratones
transgénicos, tales como los descritos en las patentes US
4.873.191, US 5.464.764 y US 5.789.215, incorporándose el contenido
de estos documentos como referencia en la presente memoria.
En resumen, una construcción polinucleotídica
que comprende un ácido nucleico según la invención se inserta en
una línea de células madre del tipo ES. La inserción de la
construcción polinucleotídica se realiza preferentemente por
electroporación, tal como se describe en el documento Thomas et
al. (1987, Cell, Vol. 51: 503-512).
Las células que hayan experimentado la etapa de
electroporación se eligen a continuación en función de la presencia
de la construcción polinucleotídica (por ejemplo por selección
mediante marcadores o también por PCR o por análisis sobre gel de
electroforesis de ADN de tipo Southern) con el fin de elegir las
células positivas que hayan integrado la construcción
polinucleotídica exógena en su genoma, si es necesario después de un
acontecimiento de recombinación homóloga. Dicha técnica se describe
por ejemplo en MANSOUR et al. (Nature (1988) 336:
348-352).
A continuación, las células elegidas
positivamente se aíslan, se clonan y se inyectan en blastocitos de
ratón de 3,5 días, como ha sido descrito por BRADLEY (1987,
Production and Analysis of Chimaeric mice. En: E. J. ROBERTSON
(Ed., teratocarcinomas and embryonic stem cells: a practical
approach. IRL press, Oxford, página 113). A continuación se
introducen los blastocitos en un animal huésped hembra y se prosigue
el desarrollo del embrión hasta término.
Según una alternativa, se ponen en contacto
células de tipo ES elegidas positivamente con embriones de 2,5 días
en un estado de 8-16 células (mórula) como ha sido
descrito por WOOD et al. (1993, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, vol. 90: 4582-4585) o por NAGY
et al. (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.
90: 8424-8428), internalizándose las células ES con
el fin de colonizar extensivamente el blastocito, incluidas las
células que dan nacimiento a la línea germinal.
\newpage
Los descendientes se analizan a continuación con
el fin de determinar aquellos que han integrado la construcción
polinucleotídica (el transgen).
Los ácidos nucleicos según la invención pueden
servir también para la realización de oligonucleótidos antisentido
o antisentido genéticos utilizables como agentes farmacéuticos. Las
secuencias antisentido son oligonucleótidos pequeños,
complementarios de la hebra codificadora de un gen dado y por esto
capaces de hibridarse específicamente con el ARNm transcrito,
inhibiendo su traducción en proteína. La invención tiene por lo
tanto como objetivo las secuencias antisentido capaces de inhibir
al menos parcialmente la interacción de las proteínas PAP1 sobre la
parquina. Dichas secuencias pueden estar constituidas por toda o una
parte de las secuencias nucleicas definidas anteriormente. Se trata
generalmente de secuencias o de fragmentos de secuencias
complementarias de las secuencias codificadoras para los péptidos
que interaccionan con la parquina. Tales oligonucleótidos pueden
obtenerse por fragmentación, etc. o por síntesis química.
Las secuencias reivindicadas se pueden utilizar
en el marco de terapias génicas para la transferencia de la
expresión in vivo de secuencias antisentido o de péptidos
capaces de modular la interacción de la proteína PAP1 con la
parquina. A este respecto las secuencias se pueden incorporar en
vectores virales o no-virales, permitiendo su
administración in vivo (Kahn, A. et al., 1991). Como
vectores virales según la invención se pueden citar muy
particularmente los vectores de tipo adenovirus, retrovirus, virus
asociado al adenovirus (AAV) o virus del herpes. La presente
solicitud tiene igualmente como objetivo virus recombinantes
defectuosos que comprenden un ácido nucleico que codifica para un
polipéptido según la invención, principalmente un polipéptido o
péptido que comprende toda o parte de la secuencia SEQ ID Nº: 2 o de
un derivado de esta, por ejemplo toda o parte de las secuencias SEQ
ID Nº: 12, 14, 42 ó 44 o de derivados de estas.
La invención permite también la realización de
sondas nucleotídicas, sintéticas o no, capaces de hibridarse con
las secuencias nucleotídicas definidas anteriormente o con su hebra
complementaria. Tales sondas se pueden utilizar in vitro
como herramienta de diagnóstico, para la detección de la expresión o
la sobre-expresión de la PAP1, o también para la
demostración de anomalías genéticas (empalme defectuoso,
polimorfismo, mutaciones puntuales, etc.). Esas sondas pueden
utilizarse también para poner de relieve y aislar secuencias de
ácidos nucleicos homólogas que codifican para péptidos tales como
se han definido anteriormente, a partir de otras fuentes celulares
y preferentemente de células de orígenes humanos. Las sondas de la
invención comprenden generalmente al menos 10 bases, y pueden
comprender por ejemplo hasta la totalidad de una de las secuencias
citadas anteriormente o de su hebra complementaria. Preferentemente
esas sondas se marcan antes de su utilización. Para ello se pueden
usar diferentes técnicas conocidas por los expertos en la técnica
(marcado radiactivo, fluorescente, enzimático, químico, etc.).
La invención se refiere igualmente a iniciadores
o pares de iniciadores que permiten amplificar todo o parte de un
ácido nucleico que codifica para una PAP1, por ejemplo un iniciador
de secuencia elegida entre las secuencias SEQ ID Nº:
16-41.
La invención tiene además como objetivo
cualquier composición farmacéutica que comprende como principio
activo al menos un compuesto tal como se ha definido anteriormente,
en particular un compuesto peptídico.
En particular tiene como objetivo cualquier
composición farmacéutica que comprende como principio activo al
menos un anticuerpo y/o un fragmento de anticuerpo tal como se ha
definido anteriormente, así como cualquier composición farmacéutica
que comprende como principio activo al menos un ácido nucleico o un
vector tal que se ha definido anteriormente.
También tiene como objetivo cualquier
composición farmacéutica que comprenda como principio activo una
molécula química capaz de aumentar o de disminuir la interacción
entre la proteína PAP1 y la parquina.
Por otra parte, también tiene como objetivo las
composiciones farmacéuticas en las que los péptidos, anticuerpos,
moléculas químicas y secuencias nucleotídicas definidos
anteriormente se asocian entre ellos o con otros principios
activos.
Las composiciones farmacéuticas según la
invención se pueden usar para modular la actividad de la proteína
parquina y de esta forma mantener la supervivencia de las neuronas
dopaminérgicas. Más particularmente, estas composiciones
farmacéuticas están destinadas a modular la interacción entre la
proteína PAP1 y la parquina. Se trata más preferentemente de
composiciones farmacéuticas destinadas al tratamiento de
enfermedades del sistema nervioso central como por ejemplo la
enfermedad de Parkinson.
La invención tiene además como objetivo la
utilización de las moléculas descritas anteriormente para modular
la actividad de la parquina o la tipificación de enfermedades del
sistema nervioso central. En particular, la invención se refiere a
la utilización de estas moléculas para modular al menos parcialmente
la actividad de la parquina.
La invención se refiere también a un
procedimiento para la selección o la caracterización de moléculas
activas sobre la función de la parquina, que comprende la selección
de moléculas capaces de unir la secuencia SEQ ID Nº: 2 o la
secuencia SEQ ID Nº: 4, o un fragmento (o derivado) de éstas. El
procedimiento comprende convenientemente la puesta en contacto,
in vitro, de la o de las moléculas de prueba con un
polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID Nº: 2 o la secuencia
SEQ ID Nº: 4, o un fragmento (o derivado) de éstas, y la selección
de moléculas capaces de unir la secuencia SEQ ID Nº: 2 (en
particular la región comprendida entre los restos 1 y 344) o la
secuencia SEQ ID Nº: 4. Las moléculas probadas pueden ser de
naturaleza variada (péptido, ácido nucleico, lípido, azúcar, etc.,
o mezclas de tales moléculas, por ejemplo bibliotecas combinatorias,
etc.). Como se ha indicado anteriormente, las moléculas así
identificadas se pueden utilizar para modular la actividad de la
parquina, y representan agentes terapéuticos potenciales para el
tratamiento de patologías neurodegenerativas.
Otras ventajas de la presente invención
aparecerán con la lectura de los ejemplos y figuras que siguen, que
deben ser considerados como ilustrativos y no limitativos.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: Representación del vector
pLex9-Parquina (135-290).
Figura 2: Resultados del primer experimento
5'-RACE. se han obtenido 8 clones. La secuencia
electrónica inicial se indica en la parte de abajo de la
figura.
Figura 3: Resultados del segundo experimento
5'-RACE. Solo dos de los 8 clones obtenidos en el
primer experimento han sido validados (clones A12 y D5). La
secuencia electrónica inicial se indica en la parte de abajo de la
figura. La secuencia completa de los ADN y proteínas se da en las
secuencias 12-15.
Figura 4: Detalle de la organización de los
clones C5 y D4 del segundo experimento 5'-RACE. La
secuencia de consenso resultante se indica en la parte superior de
la figura.
Figura 5: Estructura de los tránscritos aislados
a partir del cerebro humano.
Figura 6: Secuencia nucleica y proteica de la
LY111 (longitud total) de cerebro humano. Subrayado doble: cisteinas
conservadas del dominio en dedo de zinc. Negrita: Dominio C_{2}1.
Cursiva: dominio C_{2}2.
Figura 7: Secuencia nucleica y proteica del
LY111 (versión corta) de cerebro humano. Subrayado doble: cisteinas
conservadas del dominio en dedo de zinc. Negrita: Dominio C_{2}1.
Cursiva: dominio C_{2}2.
Figura 8: Localización de la proteína LY111
corta (8b) o larga (8a) después de la expresión en las células
Cos-7.
Figura 9: Secuencia nucleica y proteica del
LY111 (versión larga) de pulmón humano.
Figura 10: Secuencia nucleica y proteica del
LY111 111 (versión corta) de cerebro humano.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa L40 del género S. cerevisiae
(Mata, his3D200, trp1-901,
leu2-3,112, ade2, LYS2::
(lexAop)_{4}-HIS3,
URA3::(lexAop)_{8}LacZ, GAL4, GAL80) ha sido
usada para verificar las interacciones
proteína-proteína cuando uno de los miembros de la
pareja proteica se fusiona con la proteína LexA. Esta última es
capaz de reconocer el elemento de respuesta LexA controlando la
expresión de los genes transportadores LacZ y His3.
Se ha cultivado en los medios de cultivo
siguientes:
Medio YPD completo:
- -
- Extracto de levadura (10 g/l) (Difco)
- -
- Bactopeptona (20 g/l) (Difco)
- -
- Glucosa (20 g/l) (Merck)
Este medio se ha vuelto sólido por adición de 20
g/l de agar (Difco).
Medio YNB mínimo:
- -
- Base Nitrogenada para Levadura (sin aminoácidos) (6,7 g/l) (Difco)
- -
- Glucosa (20 g/l) (Merck)
\newpage
Este medio se puede volver sólido por adición de
20 g/l de agar (Difco). Igualmente puede ser complementado en
aminoácidos y/o en
3-amino-1,2,4-triazol
por adición de los medios CSM [CSM -Leu, -Trp, -His (620 mg/l), CSM
-Trp (740 mg/l) o CSM -Leu, -Trp (640 mg/l)(Bio101)] y/o de
3-amino-1,2,4-triazol
2,5 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa TG1 de Escherichia coli, genotipo
supE, hsd\Delta5, thi, \Delta(lac-proAB),
F'[tra D36 pro A^{+}B^{+} lacI^{q} lacZ\DeltaM15], se ha
usado para la construcción de plásmidos y como medio de
amplificación y de aislamiento de los plásmidos recombinantes
usados. Se ha cultivado en el medio siguiente:
Medio LB:
- -
- NaCl (5 g/l) (Prolabo)
- -
- Bactotriptona (10 g/l)(Difco)
- -
- Extracto de Levadura (5 g/l)(Difco)
Este medio se ha vuelto sólido por adición de 15
g/l de agar (Difco).
Se ha utilizado ampicilina, a 100 \mug/ml,
este antibiótico sirve para seleccionar las bacterias que hayan
recibido los plásmidos que portan como marcador el gen de
resistencia a este antibiótico.
Se ha empleado la cepa HB101 de Escherichia
coli de genotipo supE44, aral4, galK2, lacYl,
\Delta(gpt-proA)62,
rpsL20(Str^{r}), xyl-5,
mtl-1, recA13,
\Delta(mcrC-mrr),
HsdS^{-}(r^{-}m^{-}) como medio de amplificación y de
aislamiento de los plásmidos que provienen del banco de ADNc de
linfocito humano. Se ha cultivado en:
Medio M9:
- -
- Na_{2}HPO_{4} (7 g/l) (Prolabo)
- -
- NaCl (3 g/l) (Prolabo)
- -
- NH_{4}Cl (1 g/l) (Prolabo)
- -
- NaCl (0,5 g/l) (Prolabo)
- -
- Glucosa (20 g/l) (Sigma)
- -
- MgSO_{4} (1 mM) (Prolabo)
- -
- Tiamina (0,001%) (Sigma)
Este medio se ha vuelto sólido por adición de 15
g/l de agar (Difco).
Se deben añadir leucina (50 mg/l) (Sigma) y
prolina (50 mg/l) (Sigma) al medio M9 para permitir el crecimiento
de la cepa HB101.
Durante la selección de los plásmidos que
provienen del banco de híbridos de ADN de linfocito, no se ha
añadido leucina al medio ya que los plásmidos llevan un marcador de
selección Leu2.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector pLex9 (pBTM116) (Bartel et al.,
1993) de 5kb homólogo del pGBT10 que contiene un sitio múltiple de
clonación situado en dirección 3' de la secuencia que codifica para
el represor bacteriano LexA y en dirección 5' de un terminador para
formar una proteína de fusión.
El pLex-HaRasVal12, plásmido
pLex9, tal como se ha descrito en la solicitud WO98/21327, que
contiene la secuencia que codifica para la proteína HaRas mutada en
posición Val12 conocida por interactuar con la proteína Raf de
mamífero (Vojtek et al., 1993). Este plásmido ha sido usado
para ensayar la especificidad de interacción de la proteína PAP1 en
la cepa L40.
El pLex9-cAPP, plásmido pLex9
que contiene la secuencia que codifica para el dominio
citoplasmático de la proteína APP conocida por interactuar con el
dominio PTB2 de FE65. Este plásmido ha sido usado para ensayar la
especificidad de interacción de la proteína PAP1 en la cepa L40.
\vskip1.000000\baselineskip
Oligonucleótidos que han permitido obtener el
fragmento de PCR correspondiente a la región central de la parquina
delimitada por los sitios EcoRI y BamHI.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Oligonucleótidos que han servido para secuenciar
el inserto correspondiente al gen PAP1.
Los oligonucleótidos se sintetizan en el
instrumento Applied System ABI 394-08. Se retiran de
la matriz de síntesis por medio de amoníaco y precipitan dos veces
por 10 volúmenes de n-butanol, después se recogen en
agua. La cuantificación se ha realizado por medida de la densidad
óptica (1DO_{260} corresponde a 30 \mug/ml).
\vskip1.000000\baselineskip
Las preparaciones en pequeña cantidad y en gran
cantidad de ADN plasmídico se han realizado según los protocolos
recomendados por el fabricante Quiagen de los kits de purificación
de ADN:
Kit Quiaprep Spin Miniprep, ref: 27106
Kit Quiaprep Plasmid Maxiprep, ref: 12163.
\vskip1.000000\baselineskip
Las reacciones de PCR se realizan en un volumen
final de 100 \mul en presencia de la matriz de ADN, de dNTP
(0,2 mM), de tampón de PCR (Tris-HCL pH 8,5 10 mM, MgCl_{2} 1 mM, KCl 5 mM, gelatina al 0,01%), de 10-20 pmoles de cada uno de los oligonucleótidos y de 2,5 UI de polimerasa Ampli Taq DNA (Perkin Elmer). La mezcla se recubre con 2 gotas de aceite de parafina para limitar la evaporación de la muestra. El instrumento utilizado es el "Crocodile II" de Appligene.
(0,2 mM), de tampón de PCR (Tris-HCL pH 8,5 10 mM, MgCl_{2} 1 mM, KCl 5 mM, gelatina al 0,01%), de 10-20 pmoles de cada uno de los oligonucleótidos y de 2,5 UI de polimerasa Ampli Taq DNA (Perkin Elmer). La mezcla se recubre con 2 gotas de aceite de parafina para limitar la evaporación de la muestra. El instrumento utilizado es el "Crocodile II" de Appligene.
Se ha utilizado una temperatura de
desnaturalización de la matriz de 94ºC, una temperatura de
hibridación de 52ºC y una temperatura de alargamiento por la enzima
de 72ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Todas las reacciones de ligadura se realizan a
37ºC durante una hora en un volumen final de 20 \mul en presencia
de 100 a 200 ng de vector, 0,1 a 0,5 \mug de inserto, 40 UI de
enzima T4 DNA ligasa (Biolabs) y un tampón de ligadura
(Tris-HCl 50 mM pH 7,8; MgCl_{2} 10 mM; DTT 10 mM;
ATP 1 mM). El testigo negativo está constituido por la ligadura del
vector en ausencia de inserto.
La transformación de las bacterias por un
plásmido se realiza según el protocolo siguiente: se utilizan 10
\mul del volumen de ligadura para transformar las bacterias TG1
según el método de Chung (Chung et al., 1989). Después de la
transformación, las bacterias se colocan en un medio LB + ampicilina
y se incuban durante 16 horas a 37ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
La separación de los ADN se realiza en función
de su tamaño por electroforesis sobre gel de agarosa según Maniatis
(Maniatis et al., 1989): gel de agarosa al 1% (Gibco BRL) en
un tampón TBE (Tris base 90 mM; borato 90 mM; EDTA 2 mM);
\vskip1.000000\baselineskip
La técnica de secuenciación utilizada se deriva
del método de Sanger (Sanger et al., 1977) y está adaptada
para la secuenciación por fluorescencia desarrollada por Applied
Biosystems. El protocolo utilizado es el descrito por los
inventores del sistema (Perkin Elmer1997).
\vskip1.000000\baselineskip
Los plásmidos se introducen en la levadura por
una técnica clásica de transformación de la levadura puesta a punto
por Gietz (Gietz et al., 1992) y modificada de la forma
siguiente:
En el caso particular de la transformación de la
levadura por el banco de ADNc de linfocito, la levadura utilizada
contiene el plásmido pLex9-parquina
(135-290) que codifica para la parte central de la
parquina fusionada con la proteína LexA. Se cultiva en 200 ml de
medio mínimo YNB complementado en aminoácidos
CSM-Trp a 30ºC con agitación hasta una densidad de
10^{7} células/ml. Para efectuar la transformación de las
levaduras según el protocolo anterior, la suspensión celular se ha
separado en 10 tubos de 50 \mul en los que se han añadido 5
\mug del banco. El choque térmico se ha realizado durante 20
minutos y a continuación las células se han recogido por
centrifugación y se vuelven a poner en suspensión en 100 ml de medio
YPD durante 1 hora a 30ºC y en 100 ml de medio YNB complementado
con CSM-Leu-Trp durante 3 horas 30
minutos a 30ºC. La eficacia de la transformación se determina
exponiendo diferentes diluciones transformadas en medio YNB sólido
complementado en CSM-Trp, -Leu. Después de un
cultivo a 30ºC durante 3 días, las colonias obtenidas se han contado
y se ha determinado la tasa de transformación por \mug de ADN del
banco de linfocitos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se centrifugan 5 ml de un cultivo de levadura
incubada durante 16 horas a 30ºC y se recogen en 200 \mul de un
tampón de lisis (Sorbitol 1M, KH_{2}PO_{4}/K_{2}HPO_{4} 0,1M
pH 4, zimoliasa 12,5 mg/ml) y se incuban durante 1 hora a 37ºC. El
lisado se trata a continuación según el protocolo recomendado por el
fabricante Quiagen del klt de purificación de ADN, kit Quiaprep
Spin Miniprep, ref: 27106.
\vskip1.000000\baselineskip
Se deposita previamente una hoja de
nitrocelulosa sobre la caja Petri que contiene los clones de
levaduras individualizados. Esta hoja se sumerge a continuación en
nitrógeno líquido durante 30 segundos para hacer estallar las
levaduras y liberar así la actividad
\beta-galactosidasa. Después de descongelación se
deposita la hoja de nitrocelulosa, colonias hacia arriba, en otra
caja Petri que contiene un papel Whatman previamente embebido en
1,5 ml de disolución de PBS (Na_{2}HPO_{4} 60 mM,
NaH_{2}PO_{4} 40 mM, KCl 10 mM, MgSO_{4} 1 mM, pH 7) que
contiene 15 \mul de X-Gal
(5-bromo-4-cloro-3-indoil-\beta-D-galactósido)
a 40 mg/ml en N,N-dimetilformamida. A continuación
se pone la caja en una
estufa a 37ºC. Se dice que el ensayo es positivo cuando las colonias viran al azul en la membrana al cabo de 12 horas.
estufa a 37ºC. Se dice que el ensayo es positivo cuando las colonias viran al azul en la membrana al cabo de 12 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
La selección de un banco usando el sistema de
doble híbrido hace necesario que la región central de la parquina
se fusione con una proteína que une el ADN como el represor
bacteriano LexA. La expresión de esta proteína de fusión se realiza
mediante el vector pLex9 (cf. materiales y métodos), en el que se ha
introducido, en el mismo marco de lectura que la secuencia que
corresponde a la proteína LexA, la secuencia que codifica para la
región central de la parquina que figura en la secuencia presentada
en la SEQ ID Nº 3 ó 4.
El fragmento de ADN de 468 pdb que corresponde a
los 156 aminoácidos de la región central de la parquina que
comienza en el aminoácido 135 ha sido obtenido por PCR a partir de
los oligonucleótidos (SEQ ID Nº 5 y Nº 6) que igualmente han
permitido introducir el sitio EcoRI en el extremo 5' y un
codon de terminación y un sitio BamHI en el extremo 3'. El
fragmento de la PCR ha sido introducido entre los sitios
EcoRI y BamHI del sitio múltiple de clonación del
plásmido pLex9 en dirección 3' de la secuencia que codifica para la
proteína LexA para dar el vector pLex9-parquina
(135-290) (Fig.1).
La construcción se ha verificado por
secuenciación del ADN. Esta verificación nos ha permitido demostrar
que ese fragmento no presentaba mutaciones generadas en el curso de
la reacción de PCR y que estaba fusionado en la misma fase abierta
de lectura que la del fragmento correspondiente a LexA.
Se ha utilizado el método de Doble Híbrido
(Fields y Song, 1989).
La selección de un banco de fusión permite
identificar clones que producen proteínas fusionadas en el dominio
transactivador GAL4 que pueden interactuar con la proteína de
interés descrita en el ejemplo 1 (región central de la parquina).
Esta interacción permite reconstituir un transactivador que será
entonces capaz de inducir la expresión de los genes transportadores
His3 y LacZ en la cepa L40.
Para efectuar esta selección hemos escogido un
banco de fusión realizado a partir de ADNc que provienen de
linfocitos humanos periféricos suministrados por Richard Benarous
(Peytavi et al., 1999). Las levaduras han sido transformadas
por el banco de linfocitos y se han elegido clones positivos como se
ha descrito anteriormente.
Durante la selección es necesario preservar la
probabilidad de que cada plásmido independiente del banco de fusión
esté presente en al menos una levadura al mismo tiempo que el
plásmido pLex9-parquina (135-290).
Para preservar esta probabilidad es importante tener una buena
eficacia de transformación de la levadura. Para ello hemos elegido
un protocolo de transformación de la levadura que da una eficacia de
2,6x10^{5} células transformadas por \mug de ADN. Además, como
la co-transformación de la levadura por dos
plásmidos diferentes reduce esta eficacia, se ha preferido utilizar
una levadura previamente transformada por el plásmido
pLex9-parquina (135-290). Esta cepa
L40-pLex9-parquina
(135-290) de fenotipo His-, Lys-, Leu-, Ade- ha sido
transformada por 50 \mug de ADN plasmídico del banco de fusión.
Esta cantidad de ADN nos ha permitido obtener tras valoración
1,3x10^{7} células transformadas, lo que corresponde a un número
ligeramente superior al número de plásmidos independientes que
constituyen el banco. Según ese resultado podemos pensar que la casi
totalidad de los plásmidos del banco ha servido para transformar
las levaduras. La selección de células transformadas, capaces de
reconstituir un transactivador funcional, se ha realizado en un
medio YNB complementado con
3-amino-1,2,4-triazol
2,5 mM y 620 mg/l de CSM (Bio101) que no contenían histidina de
leucina y de triptofano.
Al terminar esta selección se han obtenido
numerosos clones con un fenotipo His+. Con estos transformadores se
ha realizado un ensayo de actividad
\beta-galactosidasa con el fin de validar la
expresión del otro gen transportador, LacZ, este número de
clones obtenidos 115 clones presentaban el doble fenotipo His+,
\beta-Gal+ que puede corresponder a una
interacción proteína-proteína.
Con el fin de identificar las proteínas que
pueden interaccionar con la región central de la parquina, se han
extraído los plásmidos del banco de fusión contenidos en las
levaduras seleccionadas durante la selección de doble híbrido. Para
poder obtenerlos en gran cantidad, este aislamiento necesita
previamente una transformación de E. coli por un extracto de
ADN de las cepas de levaduras positivas. Como el plásmido del banco
contenido en este extracto es un plásmido lanzadera levadura/E.
coli, puede fácilmente replicarse en la bacteria. El plásmido
del banco ha sido elegido por complementación de la bacteria HB101
auxotrofa para la leucina en un medio desprovisto de leucina.
Los ADN plasmídicos de las colonias bacterianas
obtenidas después de transformación por extractos de ADN de
levaduras se han analizado por digestión con enzimas de restricción
y separación de los fragmentos de ADN sobre gel de agarosa. Entre
los 115 clones, se ha obtenido un clon que contiene un plásmido del
banco que presenta un perfil diferente de los otros. Este plásmido,
denominado pGAD-Ly1111b, ha sido estudiado con más
detalle.
La secuenciación del inserto contenido en el
plásmido identificado ha sido realizada en primer lugar a partir
del oligonucleotido de la secuencia SEQ ID Nº 7 complementaria de la
secuencia de GAL4TA en la proximidad del sitio EcoRI de
inserción del banco de ADNc de linfocitos. Después, en una segunda
etapa, a partir de los oligonucleótidos de secuencias SEQ ID Nº 8 a
SEQ ID Nº 11, que corresponden a la secuencia del inserto obtenido
en el transcurso de la progresión de la secuenciación. La secuencia
obtenida se presenta en la secuencia SEQ ID Nº 1. La proteína así
identificada se ha denominado PAP1 (por sus iniciales en inglés:
Parkin-Associated Protein 1).
La comparación de la secuencia de este inserto
con las secuencias contenidas en los bancos de datos GENBank y EMBL
(European Molecular Biology Lab) ha presentado una homología de 25%
a nivel proteico, con diferentes miembros de la familia de las
sinaptotagminas. Las sinaptotagminas forman parte de una familia de
proteínas membranales codificadas por al menos once genes
diferentes expresados en el cerebro y otros tejidos. Contienen un
dominio transmembranal único y dos dominios regulados por el calcio
denominados C_{2}. En este dominio se encuentra la homología
entre las sinaptotagminas y la proteína PAP1. No se ha observado
ninguna otra homología significativa.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de determinar la especifidad de
interacción entre el fragmento que corresponde a la proteína PAP1 y
la región central de la parquina, se ha realizado un análisis de
interacción específica de dos híbridos con otras proteínas no
relevantes. Para realizar este análisis, se ha transformado la cepa
L40 por los plásmidos de control plex9-cAPP o
pLex9-HaRasVal12, en lugar del plásmido
pLex9-parquina (135-290), que
codifican respectivamente para el dominio citoplasmático del APP o
la proteína HaRasVal12 fusionadas con el dominio de enlace del ADN
de LexA, y por el plásmido aislado durante la selección del banco de
dos híbridos. Se ha realizado un ensayo de actividad
\beta-Gal en las células transformadas por los
diferentes plásmidos con el fin determinar una interacción
proteína-proteína. Según los resultados del
análisis, solo las levaduras transformadas por el plásmido aislado
durante la selección del banco de dos híbridos y por el plásmido
pLex9-parquina (135-290)
presentaban una actividad \beta-Gal+, demostrando
así una interacción entre la región central de la parquina y la
proteína PAP1. Se ha probado que esta interacción es por lo tanto
específica ya que este fragmento de la PAP1 no parece interaccionar
con las proteínas cAPP o HaRasVal12.
Estos resultados demuestran por lo tanto la
existencia de una nueva proteína, denominada PAP1, capaz de
interactuar de forma específica con la parquina. Esta proteína,
relacionada con las sinaptotagminas, no presenta ninguna homología
significativa con proteínas conocidas y se puede usar en
aplicaciones terapéuticas o de diagnóstico, para la producción de
anticuerpos, sondas o péptidos, o también para la selección de
moléculas activas.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el objetivo de identificar la secuencia
completa del gen PAP1 humano y caracterizar la existencias de
formas variantes, se han realizado dos enfoques de elongación
electrónica a partir de la secuencia SEQ ID Nº: 1. Se han obtenido
así dos secuencias electrónicas, de 1644 pb y de 1646 pb
respectivamente, que comprenden una elongación de 330 pb con
respecto a la secuencia SEQ ID Nº: 1. Sin embargo, el análisis de
estas secuencias ha mostrado diferencias en la región de consenso,
que se han hecho evidentes después de la traducción. Así, en un
caso se ha obtenido un ORF de 420 aminoácidos, y un ORF de 230
aminoácidos con la otra secuencia. La secuencia proteica obtenida
se ha comparado con las secuencias conocidas y ha mostrado una
homología de 24% en los 293 aminoácidos que cubren la sinaptogamina
humana 1 (p65)(p21579). La función de la sinaptogamina I puede
tener un papel regulador en las interacciones membranales en el
transcurso del tráfico de vesículas sinápticas en la zona de la
sinapsis. Une los fosfolípidos ácidos con cierta especificidad.
Además, se ha informado de cierta interacción dependiente del
calcio entre la sinaptogamina y los receptores de la proteína
cinasa C activada. La sinaptogamina puede igualmente unir otras tres
proteínas que son la neurexina, la sintaxina y la ap2. Teniendo en
cuenta la desaparición brusca y precoz de cualquier homología entre
las secuencias identificadas y la familia de las sinaptogaminas, es
posible que las secuencias identificadas presenten una deleción con
respecto a la secuencia natural. Para verificar esta hipótesis y
validar las secuencias, se ha realizado un experimento de
RT-PCR usando la secuencia de 1644 pb. La secuencia
obtenida comprende un ORF de 420 aminoácidos que presentan una
homología del mismo orden con las sinaptogaminas.
Para intentar obtener una secuencia mayor y
verificar si la secuencia obtenida podía corresponder a una forma
de empalme, se ha iniciado un experimento de elongación por
5'-RACE a partir de de la región 3' de la secuencia
validada, por medio de los oligopéptidos L1 y L2 en una preparación
de ADNc de pulmón humano.
Los resultados obtenidos se presentan en la
figura 2 y muestran la identificación de 8 clones que corresponden
a 6 extremos 5' terminales diferentes. Tres de entre ellas contienen
un codon de terminación que interrumpe el ORF (clones A12, F2, F12)
y el clon A3 no contiene ningún ORF. La presencia de diferentes
tránscritos ha sido confirmada por RT-PCR y
RT-PCR interna (Tabla 1).
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Las parejas de iniciadores U3-L3
y C-B son específicas del fragmento común de la
secuencia, los oligopéptidos A y U1 son específicos de la secuencia
inicial y del clon C11, el oligopéptido L4 es específico de la
secuencia inicial y el iniciador U2 es específico del clon A3. Se
ha realizado un segundo 5'-RACE con los
oligopéptidos L3 y L7 localizados en la región común de los
diferentes clones (Figura 2). Los resultados obtenidos se presentan
en las Figuras 3 y 4. La presencia de diferentes tránscritos ha sido
confirmada por RT-PCR y RT-PCR
interna (Tabla 2).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
La secuencia de iniciadores y oligonucleótidos
se da en las tablas 3 y 4 (SEQ ID Nº: 16-37).
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El conjunto de estos resultados permite validar
la secuencia de consenso correspondiente a la isoforma larga
(Figura 9, SEQ ID Nº: 12 y 13) y a la isoforma corta (Figure 10, SEQ
ID Nº 14 y 15) de la proteína PAP1 identificada a partir del pulmón
humano. Esta proteína se denomina igualmente a continuación de los
ejemplos con el término LY111. La isoforma larga está codificada
por un ORF de 1833 pb localizado en los restos
237-2069 de la SEQ ID Nº 12 y comprende 610
aminoácidos. La señal de poliadenilación está localizada a partir
del nucleótido 2315. La isoforma corta está codificada por un ORF
de 942 pb localizado en los restos 429-1370 de la
SEQ ID Nº 14 y comprende 313 aminoácidos. La señal de
poliadenilación está localizada a partir del nucleótido 1616.
A continuación se han realizado experimentos de
transferencia de Northern en diferentes tejidos humanos con sondas
(amplimer CD y E-F) y han permitido revelar un
tránscrito de 6 kb en el músculo, un tránscrito en el corazón (3
kb), así como un tránscrito de 6 kb en el hígado fetal. El ejemplo 7
describe por otra parte la clonación de un tránscrito en el cerebro
fetal humano.
Se han realizado diferentes estudios de
homologías en diferentes bases de datos proteicas cuyos resultados
se muestran en la tabla 5 siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de confirmar la presencia de un
tránscrito Ly111b full-length
("completo") en el cerebro humano, se ha realizado una PCR a
partir del ADN complementario obtenido de cerebro fetal humano
(Marathon Ready ADNc, Clontech), usando como iniciadores los
oligonucleótidos LyF1 (AAT GGA AGG GCG TGA CGC, figura 5, SEQ ID Nº:
38) y HA71 (CCT CAC GCC TGC TGC AAC CTG, SEQ ID Nº: 39). Se ha
amplificado un fragmento del ADN débilmente representado de
aproximadamente dos kilobases. El producto central de esta primera
PCR ha servido de matriz para una PCR interna, efectuada con los
oligonucleótidos LyEcoF (GCACGAATTC ATG GCC CAA GAA ATA GAT CTG, SEQ
ID Nº: 40) y HA72 (CTG TCT TCG TAT TTC TCC GCC TTG, SEQ ID Nº: 41).
Los productos amplificados han sido digeridos con las enzimas de
restricción EcoRI (integrada en el oligonucleótido LyEcoF) y BstEII
(figura 5) e insertados en el vector de expresión pcDNA3 y a
continuación se ha determinado su secuencia. El análisis de la
secuencia de clones obtenidos ha revelado la presencia de dos
tránscritos Ly111b potenciales completos
(full-length) en el cerebro fetal humano
(figura 5). El primero de estos tránscritos (Ly111b_{fullA})
corresponde al ARNm identificado en el pulmón humano (ejemplo 6) y
codifica una proteína de 609 aminoácidos (pLy111b_{fullA};
figuras 5, 6, SEQ ID Nº: 42-43). El segundo
(Ly111b_{fullB}) representa aparentemente un producto de empalme
alternativo de un ARNm primario común. En este tránscrito, idéntico
al Ly111b_{fullA}, la secuencia entre los nucleótidos 752 y 956
de la secuencia validada en el pulmón humano no está presente (SEQ
ID Nº: 42). Ly111b_{fullB} codifica, por lo tanto, para una
proteína de 541 aminoácidos (pLy111b_{fullB}) idéntica al
pLy111_{fullA}, en la que sin embargo el dominio incluido entre
los aminoácidos 172 y 240 (figuras 5, 7, SEQ ID Nº:
44-45) no está presente. Las dos proteínas
pLy111b_{fullA/fullB} integran el dominio de interacción con el
fragmento de la parquina que comprende los aminoácidos 135 a 290,
identificado en la levadura (secuencia inicial Ly111b, figura 5) y,
por lo tanto, pueden teóricamente mantener esta interacción.
\vskip1.000000\baselineskip
pLy111b_{fullA/fullB} presentan una homología
con las proteínas de la familia RIM/rabfilina (Wang Y, Sugita S
& Südhof T G. The RIM/NIM family of neuronal C2 domain proteins.
J Biol Chem (2000) 275, 20033-20044) y en
particular con las granulofilinas (Wang Jie, Takeuchi T, Yokota H
& Izumi T. Novel
Rabphilin-3-like protein associates
with insulin-containing granules in pancreatic beta
cells. J Biol Chem (1999) 274, 28542-28548).
Se caracterizan por la presencia de un dominio dedo de zinc
en la parte N-terminal de dos dominios C_{2} en
la parte C-terminal (Figuras 6 y 7). El dominio
dedo de zinc de las proteínas de la familia RIM/rabfilina ha
sido implicado en la interacción con las proteínas Rab. Estas
últimas proteínas que fijan la GTP son componentes esenciales de la
maquinaria del tráfico membranal en las células eucariotas. Por otra
parte, se ha descrito que los dominios C_{2} de las proteínas de
la familia RIM/rabfilina pueden también unir membranas a través de
la interacción con fosfolípidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha insertado la secuencia que codifica los
tránscritos Ly111b_{fullA/B} en el vector de expresión eucariota
pcDNA3 en fase con la secuencia que codifica un epítope myc
N-terminal
(pcDNA3-mycLy111b_{fullA/B}). Las células de la
línea cos-7 transfectadas mediante estos vectores
producen proteínas de un peso molecular aparente de aproximadamente
67 kDa (pcDNA3-mycLy111b_{fullA}) y 60 kDa
(pcDNA3-mycLy111b_{fullB}), correspondiente al
peso molecular esperado. Estas proteínas, puestas en evidencia por
inmunomarcación mediante un anticuerpo dirigido contra el epítope
N-terminal myc, se distribuyen de forma no
homogénea, punteada, en el citoplasma, las prolongaciones y a veces
el núcleo de la línea cos-7 (figura 8a, b, columna
A). Cuando se sobre-expresan con la parquina,
revelada por medio de un anticuerpo anti-parquina
Asp5 en las células de la línea cos-7 (figura 8a,
b, columna B), se puede observar una distribución similar y una
co-localización de estas proteínas (figure 8a, b,
columna C).
\vskip1.000000\baselineskip
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<110> AVENTIS PHARMA
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LA RECHERCHE M
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> COMPUESTOS CAPACES DE MODULAR LA
ACTIVIDAD DE LA PARQUINA, SECUENCIAS NUCLEOTÍDICAS Y USOS.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PRJ00004
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1313
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(1032)
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<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 344
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 471
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(471)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 4
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<211> 156
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 5
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<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido
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<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttaagaattc ggaagtccag caggtag
\hfill27
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido
\newpage
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<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattaggatcc ctacacacaa ggcagggag
\hfill29
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 19
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido
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<400> 7
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\hskip-.1em\dddseqskipgcgtttggaa tcactacag
\hfill19
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido
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<400> 8
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\hskip-.1em\dddseqskipggtctcggtg tggcatc
\hfill17
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<210> 9
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido
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<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskipccgcttgctt ggaggaac
\hfill18
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<210> 10
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido
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<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskipcgtatttctc cgccttgg
\hfill18
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<210> 11
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<211> 28
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<212> ADN
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido
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<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskipaatagctcga gtcagtgcag gacaagag
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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artificial: Oligonucleótido
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artificial: Oligonucleótido
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artificial: Oligonucleótido
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artificial: Oligonucleótido
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artificial: Oligonucleótido
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artificial: Oligonucleótido
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artificial: Oligonucleótido
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<223> Descripción de la secuencia
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido
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<212> ADN
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> PRT
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 313
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgtagagca gcaggtccaa g
\hfill21
Claims (18)
1. Polipéptido que interactúa con la parquina
que presenta en toda su longitud una identidad de al menos 95% con
la secuencia SEQ ID Nº: 2.
2. Polipéptido que presenta una de las
secuencias SEQ ID Nº: 13 y SEQ ID Nº: 43.
3. Polipéptido que presenta una de las
secuencias SEQ ID Nº: 15 y SEQ ID Nº: 45.
4. Ácido nucleico que codifica para un
polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Ácido nucleico según la reivindicación 4,
caracterizado porque presenta una identidad de al menos 95%
con la secuencia SEQ ID Nº: 1.
6. Ácido nucleico según la reivindicación 4,
caracterizado porque presente una de las secuencias SEQ ID
Nº: 12 y SEQ ID Nº: 42.
7. Ácido nucleico según la reivindicación 4 que
presenta una de las secuencias SEQ ID Nº: 14 y SEQ ID Nº: 44.
8. Vector que comprende un ácido nucleico según
una de las reivindicaciones 4 a 7.
9. Virus recombinante defectivo que comprende un
ácido nucleico según una de las reivindicaciones 4 a 7.
10. Composición farmacéutica que comprende al
menos un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 3.
11. Composición farmacéutica que comprende al
menos un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 4 a 7 o
un vector según una de las reivindicaciones 8 ó 9.
12. Composición según una de las
reivindicaciones 10 u 11 destinada al tratamiento de patologías
neurodegenerativas.
13. Procedimiento para la selección o la
caracterización de moléculas destinadas al tratamiento de patologías
neurodegenerativas que comprende una etapa de selección de
moléculas capaces de unir la secuencia SEQ ID Nº: 2, o un fragmento
de ella.
14. Procedimiento para la selección o la
caracterización de moléculas destinadas al tratamiento de patologías
neurodegenerativas que comprende una etapa de selección de
moléculas capaces de unir una secuencia elegida entre las
secuencias SEQ ID Nº: 13, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 43 y SEC ID Nº:
45, o un fragmento de ellas.
15. Procedimiento de producción de un
polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende
el cultivo de una célula que contiene un ácido nucleico según una de
las reivindicaciones 4 a 7 o un vector según la reivindicación 8 ó
9, en condiciones de expresión de dicho ácido nucleico, y la
recuperación del compuesto peptídico producto.
16. Célula que contiene un ácido nucleico según
una de las reivindicaciones 4 a 7 o un vector según la
reivindicación 8 ó 9.
17. Mamífero no humano que comprende, en sus
células, un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 4 a
7.
18. Anticuerpos, fragmentos o derivados de
anticuerpo dirigidos contra un polipéptido según una de las
reivindicaciones 1 a 3.
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