ES2315273T3 - Parejas del dominio ptb1 de fe65, preparacion y utilizaciones. - Google Patents
Parejas del dominio ptb1 de fe65, preparacion y utilizaciones. Download PDFInfo
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Abstract
Polipéptido que presenta la secuencia SEQ ID Nº:9, que comprende el cultivo de una célula que contiene un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3 o un vector o virus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 y 5, en condiciones de expresión de dicho ácido nucleico, y la recuperación del polipéptido producto.
Description
Parejas del dominio PTB1 de FE65, preparación y
utilizaciones.
La enfermedad de Alzheimer (EA) es una
enfermedad neurodegenerativa que afecta a una gran proporción de la
población mayor. Esta enfermedad se caracteriza bajo el punto de
vista clínico por la pérdida de las funciones cognoscitivas, y bajo
el punto de vista neuropatológico por la presencia en el cerebro de
depósitos neurofibrilares intracelulares y de depósitos
extracelulares del péptido \beta-amiloide
(A\beta) que forman las placas amiloides (Yankner, 1996). Las
placas amiloides están compuestas mayoritariamente por péptidos
A\beta de 40 ó 42 aminoácidos que se generan por un proceso
proteolítico de la proteína precursora del péptido
\beta-amiloïde (APP) (Golde et al., 1992).
Los depósitos extracelulares de A\beta son específicos de la EA.
Representan la característica precoz e invariable de todas las
formas de la EA, que incluyen las formas familiares. Las formas
familiares de la enfermedad aparecen de manera relativamente precoz
(entre 40 y 60 años) y se deben a mutaciones en el gen de la APP y
en los genes de la presenilina-1 (PS1) y de la
presenilina-2 (PS2). Las mutaciones en esos tres
genes inducen cambios en la proteolisis de la APP, que conduce a una
sobreproducción de A\beta y a la aparición precoz de la patología
y síntomas que son similares a los de las formas esporádicas de la
EA.
La internalización de la APP membranosa es una
etapa necesaria para el proceso de proteolisis de la APP (Koo et
Squazzo, 1994) que depende de su dominio citoplásmico. En efecto, la
supresión de esta región de la proteína o la presencia de
mutaciones puntuales a nivel de la secuencia
Tyr-Glu-Asn-Pro-Thr-Tyr
en el dominio citoplásmico de la APP induce una disminución
importante de la producción del péptido
\beta-amiloide (Perez et al., 1999). Se
han identificado varias proteínas que interaccionan con el dominio
citoplásmico de la APP, por tanto éstas podrían participar en la
regulación del proceso proteolítico de la APP y por tanto en la
producción de péptido \beta-amiloide. Citemos las
dos familias de proteínas FE65 y X11 que interaccionan con la
secuencia
Tyr-Glu-Asn-Pro-Thr-Tyr
del dominio citoplásmico de la APP (Borg et al., 1996, 1998 ;
Bressler et al., 1996; Duilio et al., 1998; Fiore
et al., 1995; Guénette et al., 1996; McLoughlin et
Miller, 1996; Mercken et al., 1998; Tanahashi y Tabira,
1999a, 1999b y 1999c). La familia de proteínas FE65 está constituida
por tres miembros llamados FE65, COFE65/FE65L1 y FE65L2. La familia
de proteínas X11 está constituida también por tres miembros
llamados X11\alpha, X11\beta y X11\gamma. Esas dos familias de
proteínas tienen efectos opuestos sobre la regulación de la
producción del péptido \beta-amiloide. Hemos
demostrado, así como otro laboratorio, que la
sobre-expresión de FE65 induce un aumento de la
producción de péptido A\beta (Mercken et al., 1998; Sabo
et al., 1999), mientras que la
sobre-expresión de X11 induce una disminución de la
producción de péptido A\beta (Borg et al., 1998; Sastre
et al., 1998).
El análisis de la estructura primaria de FE65
indica que esta proteína juega verdaderamente el papel de adaptador.
En efecto, FE65 contiene tres dominios proteicos implicados en
interacciones proteína-proteína: un dominio WW en
el resto amino-terminal y dos dominios PTB
(PhosphoTyrosine Binding domain, dominio enlazante de
fosfotirosina), llamados PTB1 y PTB2, en el resto
carboxi-terminal. La construcción de supresiones ha
demostrado que el dominio PTB2 de FE65 está implicado en la
interacción con el dominio citoplásmico de la APP. El dominio WW
interacciona con al menos cinco proteínas de las que dos han sido
identificadas como la proteína Mena (Mammalian homologue of
Enabled, homóloga en mamíferos a Enabled) (Ermekova et al.,
1997). Además, el dominio PTB1 de FE65 interacciona con el factor
de transcripción CP2/LSF/LBP1 (Zambrano et al., 1997) y con
el receptor LRP (LDL receptor-Related Protein,
proteína relacionada con receptores de LDL) (Trommsdorff et
al., 1998). El papel de esas proteínas en la función
fisiológica de FE65 no se conoce hasta ahora.
La elucidación del papel exacto de la proteína
FE65 en el proceso de producción del péptido
\beta-amiloide constituye por tanto un reto
importante para la comprensión y enfoque terapéutico de la
enfermedad de Alzheimer y, más generalmente, de las enfermedades
neurodegenerativas.
La presente invención se refiere a la
identificación de parejas de la proteína FE65 que interaccionan con
esta proteína en condiciones fisiológicas. Esas parejas representan
nuevos blancos farmacológicos para la fabricación o la
investigación de compuestos capaces de modular la actividad de FE65,
en particular su actividad sobre la producción de péptido
\beta-amiloide. Esas proteínas, los anticuerpos,
los ácidos nucleicos correspondientes así como las sondas o cebos
específicos, son también utilizables para la detección o
dosificación de las proteínas en muestras biológicas, en particular
muestras de tejido nervioso. Esas proteínas o ácidos nucleicos son
también utilizables en métodos terapéuticos para modular la
actividad de FE65, así como cualquier compuesto de acuerdo con la
invención, capaces de modular la interacción entre FE65 y los
polipéptidos de la invención.
La presente invención resulta más
particularmente de poner de relieve, por la solicitud, dos proteínas
humanas que interaccionan con el dominio PTB1 de FE65 (representado
en la secuencia SEQ ID Nº: 1 y 2). Así, la presente invención
demuestra que la región central de la proteína hnRNPL interacciona
con el dominio PTB1 de FE65. Describe también la identificación de
una nueva proteína, llamada FEBP1 (FE65 Binding
PTB1 domain protein, proteína FE65 del dominio
PTB1 enlazante), capaz de interaccionar con el dominio
PTB1 de FE65.
La presente invención resulta también de la
identificación y de la caracterización de regiones particulares de
las proteínas hnRNPL y FEBP1 citadas anteriormente, implicadas en la
modulación de la función de la proteína FE65. La demostración de la
existencia de esas proteínas y de regiones implicadas en su función
permite en particular preparar nuevos compuestos y/o composiciones
utilizables como agentes farmacéuticos y desarrollar métodos
industriales de cribado de tales compuestos.
En el sentido de la presente invención, la
denominación de las proteínas hnRNPL y FEBP1 cubre las mismas
proteínas así como todas sus formas homólogas. Por forma homóloga
se entiende indicar todas las proteínas equivalentes a la proteína
considerada, de origen celular diverso y en particular derivado de
células de origen humano, o de otros organismos, y que poseen una
actividad del mismo tipo. Tales homólogos comprenden también las
variantes naturales de las proteínas indicadas, en particular las
variantes polimórficas o de corte y empalme. Las proteínas (o
polipéptidos) homólogas se pueden obtener por ejemplo por
experimentos de hibridación entre los ácidos nucleicos
codificantes. En el sentido de la invención, basta que una secuencia
de ese tipo presente un porcentaje de identidad significativo para
conducir a un comportamiento fisiológico asimilable a los de las
proteínas hnRNPL y/o FEBP1 tales como se reivindican.
La presente invención tiene por objetivo un
polipéptido que presenta la secuencia SEQ ID Nº 9.
Otro objetivo de la invención se refiere a
anticuerpos o fragmentos de anticuerpos policlonales o monoclonales
dirigidos contra la proteína que presenta la secuencia SEQ ID Nº
9.
Dichos anticuerpos se pueden generar por métodos
conocidos por el profesional. En particular, esos anticuerpos se
pueden preparar por inmunización de un animal contra un péptido de
la invención, por extracción de sangre, y aislamiento de los
anticuerpos. Estos anticuerpos se pueden generar igualmente por
preparación de hibridomas según las técnicas conocidas por el
profesional.
Más preferentemente, los anticuerpos o
fragmentos de anticuerpos de la invención presentan la capacidad de
modular al menos parcialmente la interacción de los compuestos
peptídicos definidos anteriormente o de las proteínas hnRNPL y/o
FEBP1 con el dominio PTB1 de FE65, y pueden utilizarse para modular
la actividad de FE65.
Por otra parte, esos anticuerpos se pueden
utilizar también para detectar y/o dosificar la expresión de los
péptidos reivindicados en muestras biológicas y, por tanto, para
informar sobre su estado de activación.
Los fragmentos o derivados de anticuerpos son,
por ejemplo, fragmentos Fab, Fab'2, anticuerpos de cadena sencilla
(ScFv), etc. Se trata en particular de cualquier fragmento o
derivado que conserve la especificidad antigénica de los
anticuerpos de los que se deriva.
Esos anticuerpos (o fragmentos o derivados) son
más preferentemente capaces de unir un epítope presente en la
secuencia comprendida entre los residuos 1 y 349 de la SEQ ID Nº:7 o
entre los residuos 1 y 337 de la SEQ ID Nº 6.
La presente invención tiene también por objetivo
cualquier ácido nucleico que codifique para un compuesto peptídico
de acuerdo con la invención. Se puede tratar en particular de una
secuencia que comprende toda o parte de la secuencia presente en la
SEQ ID Nº:8 o de sus derivados. Por secuencia derivada se entiende
en el sentido de la presente invención cualquier secuencia que se
híbrida con las secuencias presentadas en SEQ ID Nº:8, o con un
fragmento de éstas, que codifica para un péptido de acuerdo con la
invención, así como las secuencias resultantes de estas últimas por
degeneración del código genético. Las diferentes secuencias
nucleotídicas de la invención pueden ser de origen artificial o no.
Se puede tratar de secuencias genómicas, de ADNc, de ARN, de
secuencias híbridas o de secuencias sintéticas o semisintéticas.
Esas secuencias se pueden obtener por cribado de bancos de ADN
(banco de ADNc, banco de ADN genómico), o por síntesis química, o
por métodos mixtos que incluyen la modificación química o
enzimática de secuencias obtenidas por cribado de bancos. La
hibridación mencionada anteriormente se realiza preferentemente en
condición de estringencia elevada, y particularmente a una
temperatura de 50ºC durante 1 hora en una disolución que contiene
8,823 g/l de citrato trisódico-2H_{2}O, 17,532
g/l de cloruro sódico y 1% de dodecilsulfato sódico, o incluso en
las condiciones descritas por Sambrook et al (1989, páginas
9.52-9.55).
Un ácido nucleico particular en el sentido de la
invención codifica para un polipéptido que comprende la secuencia
SEQ ID Nº:9 o un fragmento o derivado de ésta, en particular para la
proteína FEBP1 humana. Se trata convenientemente de un ácido
nucleico que comprende la secuencia nucleica SEQ ID Nº:8.
Los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención
se pueden utilizar para la producción de los compuestos peptídicos
de la invención. Por tanto la presente solicitud se refiere también
a un procedimiento de preparación de un compuesto peptídico según
el cual se cultiva una célula que contiene un ácido nucleico de
acuerdo con la invención, en condiciones de expresión de dicho
ácido nucleico y se recupera el compuesto peptídico producto. En ese
caso, la parte codificante para dicho polipéptido se coloca
generalmente bajo el control de señales que permiten su expresión
en un huésped celular. La elección de esas señales (promotores,
terminadores, secuencia "líder" de secreción, etc.) puede
variar en función del huésped celular utilizado. Por otra parte, los
ácidos nucleicos de la invención pueden formar parte de un vector
que puede ser de replicación autónoma o integradora. Más
particularmente, se pueden preparar vectores de replicación autónoma
utilizando secuencias de replicación autónoma en el huésped
elegido. Cuando se trata de vectores integradores, éstos se pueden
preparar por ejemplo utilizando secuencias homólogas a ciertas
regiones del genoma del huésped, permitiendo, por recombinación
homóloga, la integración del vector. Se puede tratar de un vector de
tipo plasmídico, episómico, cromosómico, viral, etc.
Los huéspedes celulares utilizables para la
producción de los péptidos de la invención por vía recombinante son
tanto huéspedes eucariotas como procariotas. Entre los huéspedes
eucariotas que convienen se pueden citar las células animales, las
levaduras o los hongos. En particular, tratándose de levaduras, se
pueden citar las levaduras del género Saccharomyces, Kluyveromyces,
Pichia, Schwanniomyces, o Hansenula. Cuando se trata
de células animales, se pueden citar las células COS, CHO, C127, PC
12 etc. Entre los hongos, se pueden citar más particularmente
Aspergillus ssp. o Trichoderma ssp. Como huéspedes
procariotas se prefieren utilizar las bacterias siguientes: E.
coli, Bacillus o Streptomyces.
Los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención
pueden servir también para la realización de oligonucleótidos
antisentido o antisentido genéticos utilizables como agentes
farmacéuticos o de diagnóstico. Las secuencias antisentido son
oligonucleótidos pequeños, complementarios de la hebra codificadora
de un gen dado, y por esto son capaces de hibridarse
específicamente con el ARNm transcrito, inhibiendo su traducción en
proteína. La invención tiene así por objetivo las secuencias
antisentido capaces de inhibir al menos parcialmente la interacción
de las proteínas hnRNPL y/o FEBP 1 sobre el dominio PTB1 de FE65.
Tales secuencias pueden estar constituidas por la totalidad o parte
de las secuencias definidas anteriormente. Se trata generalmente de
secuencias o de fragmentos de secuencias complementarias de
secuencias que codifican para péptidos que interaccionan con el
dominio PTB 1 de FE65. Tales oligonucleótidos pueden obtenerse por
fragmentación, o por síntesis química, etc.
Las secuencias nucleicas pueden utilizarse
también en el ámbito de las terapias, para transferencia y expresión
in vivo de secuencias antisentido o de péptidos capaces de
modular la interacción de las proteínas hnRNPL y/o FEBP1 con el
dominio PTB1 de FE65. A este respecto las secuencias se pueden
incorporar en vectores virales o no-virales,
permitiendo su administración in vivo (Kahn, A. et
al., 1991). Como vectores virales conformes con la invención se
pueden citar muy particularmente los vectores de tipo adenovirus,
retrovirus, virus asociado al adenovirus (AAV) o virus del herpes.
La presente solicitud tiene también por objetivo virus
recombinantes defectivos que comprenden un ácido nucleico que
codifica para un polipéptido de acuerdo con la invención.
La invención permite también la realización de
sondas nucleotídicas, sintéticas o no, capaces de hibridarse con
los ácidos nucleicos definidos anteriormente o con su hebra
complementaria. Tales sondas pueden utilizarse in vitro como
herramienta de diagnóstico, para la detección de la expresión o
sobre-expresión de las proteínas hnRNPL y/o FEBP1,
o incluso para poner de relieve anomalías genéticas (mal corte y
empalme, polimorfismos, mutaciones puntuales, etc.). Esas sondas
pueden utilizarse también para poner de relieve y aislar secuencias
de ácidos nucleicos homólogas que codifican para péptidos tales como
se han definido anteriormente, a partir de otras fuentes celulares
y preferentemente de células de orígenes humanos. Las sondas de la
invención comprenden generalmente al menos 10 bases, y pueden
comprender por ejemplo hasta la totalidad de una de las secuencias
citadas anteriormente o de su hebra complementaria. Preferentemente
esas sondas están marcadas antes de su utilización. Para ello se
pueden usar diferentes técnicas conocidas por el profesional
(marcaje radiactivo, fluorescente, enzimático, químico, etc.).
La invención tiene aún por objetivo cualquier
composición farmacéutica que comprende como principio activo al
menos un compuesto tal como se ha definido anteriormente, en
particular un compuesto peptídico.
En particular tiene por objetivo cualquier
composición farmacéutica que comprende como principio activo al
menos un anticuerpo y/o un fragmento de anticuerpo tal como se ha
definido anteriormente, así como cualquier composición farmacéutica
que comprende como principio activo al menos un ácido nucleico o un
vector tal que se ha definido anteriormente.
También tiene por objetivo cualquier composición
farmacéutica que comprende como principio activo una molécula
química capaz de aumentar o de disminuir la interacción entre las
proteínas hnRNPL y/o FEBP1 y la proteína FE65.
Por otra parte, también tiene por objetivo las
composiciones farmacéuticas en las que los péptidos, anticuerpos,
moléculas químicas y secuencias nucleotídicas definidos
anteriormente se asocian entre ellos o con otros principios
activos.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con
la invención se pueden utilizar para modular la actividad de las
proteínas hnRNPL y/o FEBP1 y por esta razón modificar la función de
la APP, su transporte intracelular, su maduración y su conversión
en péptido \beta-amiloide. Más particularmente,
esas composiciones farmacéuticas están destinadas a modular la
interacción entre las proteínas hnRNPL o FEBP1 y la proteína FE65.
Se trata más preferentemente de composiciones farmacéuticas
destinadas al tratamiento de enfermedades neurodegenerativas como
por ejemplo la enfermedad de Alzheimer. Las composiciones (o
compuestos) de la invención están más particularmente destinadas a
inhibir, al menos parcialmente, la interacción entre la proteína
FE65 y la proteína hnRNPL y/o FEBP1.
La invención tiene aún por objetivo la
utilización de las moléculas descritas anteriormente para modular la
actividad de la proteína FE65 o el tipado de enfermedades
neurodegenerativas. En particular, la invención se refiere a la
utilización de esas moléculas para modular al menos parcialmente la
actividad del dominio PTB1 de FE65.
La invención se refiere también a un
procedimiento para el cribado o la caracterización de moléculas
activas sobre la función de la proteína FE65, que comprende la
selección de moléculas capaces de unir la secuencia SEQ ID Nº:7 o
la secuencia Nº:9, o un fragmento (o derivado) de éstas. El
procedimiento comprende convenientemente la puesta en contacto,
in vitro, de la o de las moléculas de prueba con un
polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID Nº:7 o la secuencia
SEQ ID Nº:9, o un fragmento (o derivado) de éstas, y la selección de
moléculas capaces de unir la secuencia SEQ ID Nº:7 (en particular
la región comprendida entre los residuos 1 y 349) o la secuencia
SEQ ID Nº:9 (en particular la región comprendida entre los residuos
1 y 337). Las moléculas probadas pueden ser de naturaleza variada
(péptido, ácido nucleico, lípido, azúcar, etc., o mezclas de tales
moléculas, por ejemplo bibliotecas combinatorias, etc.). Como se ha
indicado anteriormente, las moléculas así identificadas se pueden
utilizar para modular la actividad de la proteína FE65, y
representan agentes terapéuticos potenciales para el tratamiento de
patologías neurodegenerativas.
La cepa L40 del género S. cerevisiae
(Mata, his3D200, trp1-901, leu2-3,112, ade2,
LYS2:: (lexAop)4-HIS3,
URA3::(lexAop)8-LacZ, GAL4, GAL80) se ha
utilizado como herramienta de cribado del banco de fusión de cerebro
por el sistema de Dos Híbridos. Esta cepa permite poner de
manifiesto la interacción proteína-proteína cuando
una de las parejas proteicas se fusiona a la proteína LexA (Vojtek
et al., 1993). Se ha cultivado en el medio de cultivo
siguiente:
Medio YNB mínimo:
- Base Nitrogenada para Levadura (sin aminoácidos) (6,7 g/l) (Difco)
- Glucosa (20 g/l) (Merck).
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede volver sólido este medio por adición de
20 g/l de agar (Difco).
Para permitir el crecimiento de levaduras
auxótrofas en este medio, es necesario añadir los aminoácidos o las
bases nitrogenadas para las que son dependientes a 50 mg/ml. Se
añaden 100 \mug/ml de ampicilina al medio para evitar
contaminaciones bacterianas.
La cepa TG1 de Escherichia coli, genotipo
supE, hsd\Delta5, thi, \Delta(lac-proAB),
F'[tra D36 pro A^{+}B^{+} lacI^{q} lacZ\DeltaM15], se ha
usado para la construcción de plásmidos y para la multiplicación y
aislamiento de plásmidos. Se ha cultivado en el medio
siguiente:
Medio LB:
- NaCl (5 g/l) (Sigma)
- Bactotriptona (10 g/l)(Difco)
- Extracto de Levadura (5 g/l)(Difco).
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede volver sólido este medio por adición de
20 g/l de agar (Difco).
Se ha utilizado ampicilina, a 100 \mug/ml,
para seleccionar las bacterias que hayan recibido los plásmidos que
portan como marcador el gen de resistencia a este antibiótico.
El vector pGAD10, suministrado por Clontech®,
permite la expresión, en levadura, de proteínas de fusión entre el
dominio transactivador de GAL4 y una proteína codificada por el ADNc
procedente de un banco de cerebro.
El vector pLex9 (pBTM116) (Bartel et al.,
1993) permite la expresión, en levadura, de proteínas de fusión con
la proteína LexA.
El vector pGAD424, (Clontech®), permite la
expresión, en levadura, de proteínas de fusión con el dominio
transactivador de GAL4.
pLex-FE65PTB1, plásmido pLex9
que contiene la secuencia que codifica para el dominio PTB1 de la
proteína FE65 (aminoácidos 395 a 543). Este plásmido se ha
utilizado para el cribado de parejas proteicas del dominio PTB1 de
FE65.
pLex-FE65PTB2, plásmido pLex9
que contiene la secuencia que codifica para el dominio PTB2 de la
proteína FE65 (aminoácidos 565 a 698) conocida por interaccionar
con la región citoplásmica de la APP (Precursora del Péptido
\beta-amiloide). Este plásmido se ha utilizado
para probar la especificidad de interacción de las proteínas hnRNPL
y FEBP1 con los dominios PTB de FE65.
pLex-HaRasVal12, plásmido pLex9
que contiene la secuencia que codifica para la proteína HaRas mutada
en posición Val12 conocida por interaccionar con la proteína Raf de
mamífero (Vojtek et al., 1993). Este plásmido se ha
utilizado para probar la especificidad de interacción de las
proteínas hnRNPL y FEBP1 con FE65.
pGAD-Raf, plásmido pGAD424 que
contiene la secuencia que codifica para la proteína Raf (Vojtek
et al., 1993). Este plásmido se ha utilizado para probar la
especificidad de interacción de las proteínas hnRNPL y FEBP1 con
FE65.
pGAD-App, plásmido pGAD10 que
contiene la secuencia que codifica para el dominio citoplásmico de
la proteína APP conocida por interaccionar con el dominio PTB2 de
FE65 (Mercken et al., 1998). Este plásmido se ha utilizado
para probar la especificidad de interacción de las proteínas hnRNPL
y FEBP1 con FE65.
Los oligonucleótidos se sintetizan en el
instrumento Applied System ABI 394-08. Se retiran de
la matriz de síntesis por medio de amoníaco y precipitan dos veces
por 10 volúmenes de n-butanol, después se recogen en
agua. La cuantificación se realiza por medida de la densidad
óptica.
- SEQ ID Nº 3: CTTCCCGGGTCCCCCACGGAATACCAAC
- SEQ ID Nº 4: GGGGTCGACGGCATTACGCCGTTCGGC
Estos oligonucleótidos han permitido obtener el
fragmento PCR correspondiente al dominio PTB1 de FE65 (representado
en la secuencia SEQ ID Nº 1), introduciendo los sitios XmaI y SalI
en los extremos (subrayados).
- SEQ ID Nº 5: CCACTACAATGGATGATG
Este oligonucleótido (GAL4TA) se ha utilizado
para secuenciar los insertos contenidos en los plásmidos del banco
Deux Hybrides (Dos Híbridos) de ADNc de cerebro.
Las preparaciones en pequeña cantidad y en gran
cantidad de ADN plasmídico se han realizado según los protocolos
recomendados por el fabricante Quiagen de los estuches de
purificación de ADN:
- Estuche Quiaprep Spin Miniprep, ref: 27106
- Estuche Quiaprep Plasmid Maxiprep, ref: 12163.
Las reacciones de PCR se realizan en un volumen
final de 50 \mul en presencia de la matriz de ADN, de dNTP (0,2
mM), de tampón PCR (Tris-HCL pH 8,5 10 mM,
MgCl_{2} 1 mM, KCl 5 mM, gelatina al 0,01%), de 0,5 \mug de
cada uno de los oligonucleótidos y de 2,5 UI de polimerasa Ampli Taq
DNA (Perkin Elmer) con o sin formamida (5%). La mezcla se recubre
por 2 gotas de aceite de parafina para limitar la evaporación de la
muestra. El instrumento utilizado es el "Crocodile II" de
Appligene.
Hemos utilizado una temperatura de
desnaturalización de la matriz de 90ºC, una temperatura de
hibridación de 50ºC y una temperatura de alargamiento por la enzima
a 72ºC.
Todas las reacciones de ligación se realizan a
+14ºC durante una noche en un volumen final de 10 \mul en
presencia de 100 a 200 ng de vector, 0,5 a 2 \mug de inserto, 40
UI de enzima T4 DNA ligasa (Biolabs) y un tampón de ligación
(Tris-HCl 50 mM pH 7,8; MgCl_{2} 10 mM; DTT 10 mM;
ATP 1 mM).
La transformación de las bacterias por un
plásmido se realiza según el protocolo siguiente: La totalidad del
volumen de ligación (10 \mul) se utiliza para transformar las
bacterias TG1 hechas competentes por el método de Chung et
al, (1988).
La separación y extracción de los fragmentos de
ADN se realizan de acuerdo con Sambrook et al. (1989).
\newpage
La técnica de secuenciación utilizada se deriva
del método de Sanger et al., (1977) y está adaptada para la
secuenciación por fluorescencia y desarrollada por Applied
Biosystems. El protocolo utilizado es el descrito por los
inventores del sistema (Perkin Elmer).
Este preparación se ha realizado siguiendo las
recomendaciones del proveedor (Clontech®).
Las levaduras se hacen competentes por un
tratamiento con LiAC/PEG según el método descrito por Gietz et
al, (1995).
En el caso particular de la transformación de la
levadura por el banco de ADNc de cerebro se utilizan 250 ml con
10^{7} células/ml de un cultivo, en medio mínimo
YNB+His+Lys+Ade+Leu, de levadura que contiene el plásmido
pLex-FE65PTB1. Las levaduras hechas competentes de
acuerdo con el protocolo citado anteriormente, se transforman por
30 \mug de ADNc del banco de cerebro. Después de las etapas de
transformación las levaduras se ponen de nuevo en cultivo en 250 ml
de YNB+His+Lys+Ade+Leu a 28ºC durante 16 horas, después se recogen
por centrifugación para ser extendidas sobre un medio YNB+Lys+Ade e
incubadas 3 días a 28ºC. La determinación de la eficacia de
transformación y el porcentaje de multiplicación se ha realizado
según el protocolo Clontech®.
Se centrifugan 3 ml de un cultivo de levadura
incubada 16 h a 30ºC y se recogen en 200 \mul de un tampón de
lisis (Sorbitol 1 M, KH_{2}PO_{4}/K_{2}HPO_{4} 0,1 M pH 7,4,
zimoliasa 12,5 mg/ml) y se incuban 1 h a 37ºC. El lisado se trata
después de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante
Quiagen del estuche de purificación de ADN, estuche Quiaprep Spin
Miniprep, ref: 27106.
Se deposita previamente una hoja de
nitrocelulosa sobre la caja Petri que contiene los clones de
levaduras individualizados. Esta hoja se sumerge a continuación en
nitrógeno líquido durante 30 segundos para hacer estallar las
levaduras y liberar así la actividad
\beta-galactosidasa. Después de descongelación se
deposita la hoja de nitrocelulosa, colonias hacia arriba, en otra
caja Petri que contiene un papel Whatman previamente embebido en
1,5 ml de disolución de PBS (Na_{2}HPO_{4} 60 mM,
NaH_{2}PO_{4} 40 mM, KCl 10 mM, MgSO_{4} 1 mM, pH7) que
contiene 15 \mul de X-Gal
(5-bromo-4-cloro-3-indoil-\beta-D-galactósido)
a 40 mg/ml en N,N-dimetilformamida. A continuación
se pone la caja en una estu-
fa a 37ºC. Se dice que el ensayo es positivo cuando las colonias viran al azul en la membrana al cabo de 6 horas.
fa a 37ºC. Se dice que el ensayo es positivo cuando las colonias viran al azul en la membrana al cabo de 6 horas.
El cribado de un banco que utiliza el sistema
Double-Hybride (Doble Híbrido) necesita que el
dominio PTB1 de FE65 (FE65PTB1) se fusione a la proteína LexA. La
expresión de esta proteína de fusión se realiza gracias al vector
pLex9, en el que se ha introducido, en el mismo marco de lectura que
la secuencia correspondiente a la proteína LexA, la secuencia que
codifica para el dominio PTB1 de FE65 (SEQ ID
Nº1-2).
El fragmento de ADN de 448 pb correspondiente a
los aminoácidos 395 a 543 de la proteína FE65 humana (SEQ ID Nº:2)
se ha obtenido por PCR a partir de los oligonucleótidos SEQ ID Nº3 y
SEQ ID Nº4 que también nos han permitido introducir los sitios XmaI
y SalI en los extremos de la secuencia. El fragmento de PCR se ha
introducido entre los sitios XmaI y SalI del multisitio de clonaje
del plásmido plex9 más abajo de la secuencia correspondiente a LexA
para dar el vector pLex-FE65PTB 1.
La construcción se ha verificado por
secuenciación del ADN. Esta verificación nos ha permitido demostrar
que ese fragmento no presentaba mutaciones generadas en el curso de
la reacción de PCR y que estaba fusionado en la misma fase abierta
de lectura que la del fragmento correspondiente a LexA.
Hemos utilizado el método de
Double-Hybride (Fields et Song, 1989). El cribado de
un banco de fusión permite identificar clones que producen
proteínas fusionadas al dominio transactivador de GAL4 que pueden
interaccionar con el dominio PTB1 de FE65. Esta interacción permite
reconstituir un transactivador que será capaz de inducir la
expresión de los genes reporteros His3 y LacZ en la cepa L40.
Para efectuar ese cribado hemos elegido un banco de fusión
realizado a partir de ADNc de cerebro humano (Clontech®).
Durante el cribado es necesario preservar la
probabilidad de que cada plásmido independiente del banco de fusión
esté presente en al menos una levadura al mismo tiempo que el
plásmido pLex-FE65PTB1. Para preservar esta
probabilidad es importante tener una buena eficacia de
transformación de la levadura. Para ello hemos elegido un protocolo
de transformación de la levadura que da una eficacia de 10^{5}
células transformadas por \mug de ADN. Además, como la
co-transformación de la levadura por dos plásmidos
diferentes reduce esta eficacia, hemos preferido utilizar una
levadura previamente transformada por el plásmido
pLex-FE65PTB1. Esta cepa
L40-FE65PTB1 de fenotipo His-, Lys-, Ade- Leu- ha
sido transformada por 30 \mug de ADN plasmídico del banco de
fusión. Esta cantidad de ADN nos ha permitido obtener tras
valoración 2,8 10^{6} células transformadas, lo que corresponde a
un número ligeramente superior al número de plásmidos independientes
que constituye el banco. Según ese resultado podemos pensar que la
casi-totalidad de los plásmidos del banco ha servido
para transformar las levaduras. La selección de las células
transformadas, capaces de reconstituir un transactivador GAL4
funcional, se ha hecho sobre un medio YNB+Lys+Ade.
Al terminar esta selección se han obtenido 97
clones con un fenotipo His+. Se ha realizado una prueba de actividad
\beta-galactosidasa sobre esos transformadores
para determinar el número de clones que expresan el otro gen
reportero, LacZ. De 97 clones obtenidos 27 presentaban el
doble fenotipo His+, \betaGal+, demostrando así que expresan
proteínas que pueden interaccionar con el dominio PTB1 de FE65.
Para identificar las proteínas que pueden
interaccionar con el dominio PTB1 de FE65, hemos extraído los
plásmidos del banco de fusión contenidos en las levaduras
seleccionadas durante el cribado Double-Hybride.
Para poder obtenerlos en gran cantidad, este aislamiento necesita
previamente una transformación de E. coli por un extracto de
ADN de las cepas de levaduras positivas. Como el plásmido del banco
contenido en este extracto es un plásmido lanzadera levadura/E.
coli, puede fácilmente replicarse en la bacteria.
Los ADN plasmídicos de las colonias bacterianas
obtenidas después de transformación por extractos de ADN de
levaduras se han analizado por digestión con enzimas de restricción
y separación de los fragmentos de ADN sobre gel de agarosa. Hemos
obtenido 6 perfiles de restricción diferentes entre los 23 clones
analizados, de los que 2 estaban muy representados. Estos
resultados han demostrado que al menos 6 plásmidos diferentes se
han aislado durante este cribado, nos hemos interesado más
particularmente en el fragmento de ADN procedente del banco de ADNc
contenido en los dos plásmidos más representados (8 y 4 veces).
Se ha realizado la secuenciación para los 2
plásmidos más representados a partir del oligonucleótido GAL4TA
(SEQ ID Nº5) complementario de la región de GAL4TA cerca del sitio
de inserción del banco de cDNA de cerebro, a 52 pdb del sitio
EcoRI.
La comparación de la secuencia del primer
plásmido seleccionado con las secuencias contenidas en los bancos
de datos GENBank y EMBL (European Molecular Biology Lab, Laboratorio
Europeo de Biología Molecular) ha mostrado que la secuencia del
ADNc presente en ese primer plásmido presenta más de 99% de
identidad a nivel nucleotídico con el gen humano que codifica para
la proteína hnRNPL que tiene el número de acceso:
NP_001524/g4557645. La secuencia de ese gen que hemos clonado por
el sistema Deux Hybrides comienza en el nucleótido 346
correspondiente al aminoácido 116 y se termina en el nucleótido
1392 correspondiente al aminoácido 464 situado a 58 aminoácidos del
fin de la proteína hnRNPL (SEQ ID Nº:6 y 7). Este resultado revela
que el dominio de interacción de hnRNPL con la proteína FE65 humana
está contenido en la región central de hnRNPL. Esta región contiene
una secuencia de tipo NPXY que se conoce por ser el sitio consenso
de fijación de los dominios PTB (Borg et al., 1996). La
secuencia de hnRNPL (SEQ ID Nº6-7) que hemos clonado
difiere de la secuencia publicada (Pinol-Roma et
al, 1989) por la sustitución de una guanina por timidina en
posición 748 conducente al cambio de una glicina a cisteina a nivel
del aminoácido 250 de la secuencia SEQ ID Nº:6, correspondiente al
nucleótido 1093 y al aminoácido 365 de la proteína hnRNPL
entera.
La comparación de la secuencia del segundo
plásmido seleccionado con las secuencias contenidas en los bancos
de datos GENBank y EMBL (European Molecular Biology Lab, Laboratorio
Europeo de Biología Molecular) ha revelado que la secuencia del
ADNc contenida en este plásmido no presenta homología alguna
significativa con las secuencias contenidas en esos bancos de
datos.
Se ha encontrado una homología significativa con
la proteína de secuencia SEQ ID Nº4 de la solicitud WO99/26961. Sin
embargo, la proteína de secuencia SEQ ID nº9 objetivo de la presente
solicitud se distingue de la proteína de secuencia SEQ ID Nº4 de la
solicitud WO99/26961. En particular, la proteína de secuencia SEQ ID
nº9 es más corta en 42 aminoácidos. En el resto de la secuencia
existe una cierta homología, pero también diferencias notables. En
particular, los aminoácidos en posiciones 1, 48, 61, 305 son
diferentes de los aminoácidos en las posiciones correspondientes en
la parte que presenta una cierta homología de la proteína de
secuencia SEQ ID Nº4 de la solicitud WO99/26961.
Esta secuencia (SEQ ID Nº8-9) de
1275 nucleótidos presenta un código de terminación en posición 1012,
y codifica para un péptido de 337 aminoácidos. La proteína
correspondiente a esta secuencia se ha llamado FEBP1, por
FE65 Binding PTB1 domain protein
(proteína FE65 del dominio PTB1 enlazante).
Para determinar la especificidad de interacción
entre los dominios PTB1 y PTB2 de la proteína FE65 humana y las
proteínas hnRNPL y FEBP1, hemos realizado una prueba de interacción
por el método Deux Hybrides (Dos Híbridos) utilizando el plásmido
pLex-FE65PTB2 que codifica para el dominio PTB2 de
FE65 fusionado a la proteína LexA, en lugar del plásmido
pLex-FE65PTB1. La ausencia de interacción entre el
dominio PTB2 y esas dos proteínas permitiría revelar una
especificidad de interacción con el dominio PTB1 de FE65.
Para realizar esa prueba hemos transformado la
cepa L40 por los plásmidos aislados durante el cribado del banco de
ADNc de cerebro y por el plásmido pLex-FE65PTB2.
También se han realizado controles de especificidad de interacción
transformando esta cepa por diferentes plásmidos como se ha indicado
en la tabla Nº 1. Se ha realizado una prueba de actividad
\betaGal en las células transformadas por los diferentes plásmidos
para detectar una interacción proteína-proteína. El
conjunto de las combinaciones de plásmidos, y por tanto de las
interacciones, probados en el sistema Double-Hybride
se presentan en la Tabla Nº 1. Las combinaciones de plásmidos y el
tipo de vector correspondiente (pLex o pGAD) se indican en las
columnas "Combinaciones de Plásmidos". Los signos + y - en la
columna "Interacción" corresponden a los resultados de la
prueba \betaGal e indican respectivamente la detección o la no
detección de interacción proteína-proteína.
De acuerdo con el resultado de la prueba (Cf.
Tabla Nº1), solo las levaduras transformadas por los dos plásmidos
aislados del banco de ADNc de cerebro y por el plásmido
pLex-FE65PTB1 presentaban una actividad \betaGal+,
demostrando así que entre los dos dominios PTB de FE65 solo el
dominio PTB1 interacciona con la parte central de hnRNPL o el
fragmento de la proteína FEBP1. El dominio PTB1 de FE65 parece
interaccionar de manera específica con hnRNPL y FEBP1, puesto que
no hemos podido demostrar interacciones con la proteína HaRasVal12 o
el dominio C-terminal de la APP por la técnica de
Deux Hybrides.
Bartel, P.L., C.-T. Chien, R. Stenglanz Y S.
Fields. 1993 D.A Hartley Ed, Oxford University press:
153.
Borg, J.-P., J. Ooi, E.
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preparación y utilizaciones
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<130> PRJ99058 - RPR
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<210> 1
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<211> 447
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(447)
\newpage
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<400> 1
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\hskip1cm
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<210> 2
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<211> 149
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 2
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\hskip1cm
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<210> 3
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<211> 28
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido
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<400> 3
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\hskip1cm
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido
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<400> 4
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<210> 5
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido
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<400> 5
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\hskip1cm
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<210> 6
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<211> 1047
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(1047)
\newpage
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<400> 6
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\hskip1cm
\hskip1cm
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<211> 349
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 7
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\hskip1cm
\hskip1cm
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<210> 8
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<211> 1275
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(1014)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
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<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 337
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
Claims (12)
1. Polipéptido que presenta la secuencia SEQ ID
Nº:9.
2. Ácido nucleico que codifica para el
polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1.
3. Ácido nucleico de acuerdo con la
reivindicación 2, caracterizado porque comprende la secuencia
SEQ ID Nº:8.
4. Vector que comprende un ácido nucleico de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3.
5. Virus recombinante defectivo que comprende un
ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
2 a 3.
6. Anticuerpo o fragmento de anticuerpo,
caracterizado porque está dirigido contra el polipéptido de
acuerdo con la reivindicación 1.
7. Composición farmacéutica que comprende al
menos el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o un
anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 6.
8. Composición farmacéutica que comprende al
menos un ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 2 y 3 o un vector de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 4 y 5.
9. Composición de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 7 y 8 destinada a modular, al menos
parcialmente, la interacción entre la proteína FE65 y la proteína
hnRNPL o el polipéptido que presenta la secuencia SEQ ID Nº 9.
10. Composición de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 7 y 8 destinada al tratamiento de patologías
neurodegenerativas.
11. Procedimiento para el cribado o la
caracterización de moléculas activas en el tratamiento de patologías
neurodegenerativas, que comprende una etapa de selección de
moléculas capaces de unir la secuencia SEQ ID Nº 7 o la secuencia
SEQ ID Nº 9, o un fragmento de éstas capaz de interaccionar con el
dominio PTB1 de FE65.
12. Procedimiento de producción de un
polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende el
cultivo de una célula que contiene un ácido nucleico de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3 o un vector o virus de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 y 5, en
condiciones de expresión de dicho ácido nucleico, y la recuperación
del polipéptido producto.
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