ES2279836T3 - Net, factor de transcripcion de la familia tcf, como regulador de la expresion del factor angiogenico. - Google Patents

Net, factor de transcripcion de la familia tcf, como regulador de la expresion del factor angiogenico. Download PDF

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Abstract

Uso de todo o parte de un polipéptido NET o células que expresan todo o parte del polipéptido NET en un método para identificar compuestos que modulen la angiogénesis o sean eficaces para prevenir y/o tratar patologías relacionadas con trastornos angiogénicos donde se selecciona el polipéptido NET entre el grupo que consiste en una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID Nº 2, una variante alélica de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID Nº 2, una variante de empalme de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID Nº 2, y donde parte del polipéptido NET comprende un fragmento de NET seleccionado entre el fragmento que corresponde a la caja A (humana) = aminoácidos 1-90 de la SEC ID Nº 2, caja B (humana) = aminoácidos 133-151 de la SEC ID Nº 2, caja C (humana) = aminoácidos 321-378 de la SEC ID Nº 2, caja D (humana) = aminoácidos 290-299 de la SEC ID Nº 2, dominio NID (humano) = aminoácidos153-308 de la SEC ID Nº 2; dominio JEX (humano) = aminoácidos 233-353 de la SEC ID Nº 2; dominio CID (humano) aminoácidos 274-282 de la SEC ID Nº 2; caja A (murina) = aminoácidos 1-90 de la SEC ID Nº 4, caja B (murina) = aminoácidos 133-151 de la SEC ID Nº 4, caja C (murina) = aminoácidos 323-380 de la SEC ID Nº 4, caja D (murina) = aminoácidos 291-301 de la SEC ID Nº 4; dominio NID (murino) = aminoácidos 155-197 de la SEC ID Nº 4; dominio JEX (murino) = aminoácidos 222-253 de la SEC ID Nº 4; dominio CID (murino) = aminoácidos 275-220 de la SEC ID Nº 4.

Description

NET, factor de transcripción de la familia TCF, como regulador de la expresión del factor angiogénico.
La presente invención se refiere a la regulación de la actividad de la proteína NET (ERP/SAP-2). La invención además se refiere a métodos para seleccionar agonistas o antagonistas de NET para identificar nuevos compuestos pro-angiogénicos o anti-angiogénicos y a los usos terapéuticos de estos compuestos. La invención también se refiere a animales transgénicos que llevan mutaciones en el gen NET.
Antecedentes de la invención
En las células de mamífero, los factores de transcripción TCF (Factor de Complejo Ternario) pertenecen a la familia ets 1. Comparten a través de sus dominios de unión al ADN de ets (85 aminoácidos) la capacidad de unirse al Elemento de Respuesta al suero (SRE) cuando se asocia a dímeros de SRF (Factor de Respuesta del Suero). La formación del complejo ternario requiere la presencia de una secuencia consenso SRE (C/A)(C/A)GGA(A/T) próxima a un sitio consenso SRF (CC(A/T)6GG) sin ningún requisito de orientación. Las proximidades de estas dos secuencias en varios promotores de genes tempranos inmediatos inducen su transcripción en respuesta a mitógenos como factores séricos o del crecimiento, pero también en respuesta a ésteres de forbol y estímulos de estrés. Estas secuencias se identificaron por primera vez en el promotor de c-fos al cual se unen constitutivamente proteínas Ets y SRF.
Son miembros conocidos de la familia TCF: Elk-1, SAP-1 y Net (SAP-2, ERP). Estas proteínas se expresan mucho.
Esta subfamilia de factores de transcripción de TCF se define por un fuerte patrón de homología de secuencia que está relacionado con la presencia de diferentes dominios funcionales. Empezando desde el extremo amino al extremo carboxi, los miembros de la familia TCF presentan al menos cuatro cajas de homología en su secuencia polipeptídica:
- la caja A, también denominada dominio de unión al ADN de ETS, que está implicada directamente en la unión con la secuencia consenso SRE,
- la caja B (una región hidrófila corta) que está implicada en la interacción con SRF,
- la caja D localizada cadena arriba de la caja C, que consiste en un dominio de dirección a MAPK,
- la caja C y las secuencias C-terminales, que contienen los sitios de fosforilación (de seis a siete motivos (S/T)P) por MAPquinasas (ERK, JNK y p38) y consiste en un dominio de activación de la transcripción. La inducción de la actividad de la transcripción por TCF requiere la fosforilación del TCF por MAPK en este dominio regulador.
La posición de las cajas A, B, C y D con respecto a la secuencia de aminoácidos del polipéptido humano o murino es la siguiente: A (humano) = 1-90, B (humano) = 133-151, C (humano) = 321-378, D (humano) = 290-299; A (murino) = 1-90, B (murino) = 133-151, C (murino) = 323-380, D (murino) = 291-301.
La formación del complejo ternario TCF-SRF-SRE requiere al mismo tiempo la unión de proteína/ADN (de TCF a SRE y de SRF a la secuencia consenso de SRF) y la interacción proteína/proteína entre la caja B de TCF y SRF. Este ensamblaje de complejo se facilita por la fosforilación del TCF por MAPK.
La proteína Net murina se clonó en 1994 por Giovane et al. (Genes Dev., 8, 1502-1513 (1994)) y también se presentó por T. Liberman et al. (ERP a new member of the ets transcription factor/oncoprotein family: cloning, characterization and differential expresion during B-lymphocyte development. Mol. Cell Biol. 1994, 14: 3292-309) (ERP) (Nº de acceso L19953). La secuencia humana se denomina Z36715 y la secuencia murina se denomina Z32815 en la base de datos GenBank. La localización cromosómica del gen net murino se mapeó en 10C-D1 y su homólogo humano en 12q22-23. Este último locus ahora se denomina ELK3. Esta localización corresponde al gen sap2. El laboratorio Jackson y HGMW aprobaron que elk3 ahora corresponde a los loci comunes para net/erp (murino) y sus loci correspondientes humanos sap-2 (humano) (Giovane et al. Locations of the ets subfamily members of net, elk1, and sap1 (ELK3, ELK1 y ELK4) on three homologous regions of the mouse and human genomes. Genomics (1995) 29:769-72).
Net, en un contexto celular normal, presenta actividad represora de la transcripción. Esto puede interpretarse por medio de una competición tanto por la fosforilación por MAPK como por la formación de TCF. El ácido nucleico antisentido de net estimula la actividad SRE cuando se estimula por suero. La hipótesis de la competición en el sitio de fosforilación se valida por la actividad de unión al ADN insignificante de la proteína Net en el SRE de c-fos. Recientemente también se describió una actividad represora sobre la transcripción dependiente de TCF para factores de transcripción bHLH a través de un mecanismo competitivo que implica su unión al dominio ETS, Yates et al. (Id helix-loop-helix proteins inhibit nucleoprotein complex formation by the TCF EST-domain transcription factors. EMBO J. (1999) 18:968-76.)
Entre los TCF, Net tiene la particularidad de poseer también un Nuevo Dominio Inhibidor NID localizado entre los aa 153-208, que contiene un motivo de interacción proteína-proteína Hélice-Bucle-Hélice. Este NID inhibe la unión específica del ADN por Net pero también la transactivación en ausencia de una señalización ras activada (Máire et al. Net (ERP/SAP2) one of the Ras inductible TCF, has a novel inhibitory domain with resemblance to the helix-loop-helix. motif. EMBO J. (1996) 15: 5849-65). Net también tiene un segundo dominio inhibidor, el CID, entre los aa 274-282, que interacciona con CtBP (Criqui-Filipe et al. Net, a negative Ras switchable TCF, contains a second inhibitory domain, the CID, that mediates repression though interactions with CtBP and de-acetylation. EMBO J. (1996) 15: 5849-65). EMBO J. (1999) 18:3392-3403).
El dominio C de Net integra la señalización de una serie de activadores de la cascada de MAPK en diferentes sitios de fosforilación consenso de MAPK (T/S-P). Dependiendo de la naturaleza de este activador, el potencial transcripcional de Net se regula por su translocación subcelular. La secuencia de Net contiene una señal de localización nuclear (NLS) en la caja D y una señal de exportación nuclear (NES) en el dominio de unión al ADN de Ets. C. Ducret et al. (the Net repressor is regulated by nuclear export in response to anisomycin, UV and heat shock. M.C.B, 19: 7076-7087) han demostrado que la ruta de JNK induce una exportación nuclear activa de la proteína Net. Este efecto se inhibe por la leptomicina B, que inhibe la unión de NES a CRMI, que se necesita para esta exportación nuclear activa. La presencia de esta NES activa es específica para la secuencia de Net. De esta manera, las JNK están implicadas en la fosforilación de Net, pero está activación no produce una activación de la transcripción debido a este reordenamiento citoplásmico. JNK induce el reordenamiento nuclear-citoplásmico por fosforilación de la caja JEX (aa 233-253). Por el contrario, la activación de la transcripción implica la fosforilación de la caja C por la ruta de p38 y ERK1-2 (Ras) (Ducret et al. Oncogene, en prensa).
La actividad transcripcional de Net puede activarse por los oncogenes Ras, Src y Mos, pero no por un encogen Raf, demostrando de esta manera que las ERK no deben estar implicadas directamente en la transactivación de NET.
En la técnica, existe la necesidad de entender mejor los mecanismos moleculares de Net en procesos celulares. En particular, existe la necesidad en la técnica de identificar funciones adicionales de Net y/o la interacción con componentes celulares. La presente invención se dirige a esta necesidad, como se describe más adelante.
Compendio de la invención
Como se ha indicado anteriormente, la presente invención se refiere a la identificación de nuevas funciones del factor de transcripción Net. De forma inesperada, los solicitantes han demostrado ahora que NET está implicada en la angiogénesis y que en la mutación del gen de Net en mamíferos afecta el sistema vascular. Los solicitantes ahora han demostrado que en condiciones normales, NET es un represor de la angiogénesis. Los solicitantes también han demostrado que NET puede activarse por medio de la fosforilación de restos específicos de Ser y han descubierto que la proteína NET activada promueve la angiogénesis. La angiogénesis mediada por NET activada implica la secreción de VEGF, y en un contexto en el que Net está activada, la regulación negativa de NET reduce la secreción de VEGF y reduce la angiogénesis. Además, se demostró que en un contexto en el que el gen de Net está activado, la regulación negativa de NET inhibe la formación de tumores y conduce a tumores hipóxicos.
Estos descubrimientos definirán a NET como un intermedio clave en la regulación de la angiogénesis. La regulación negativa de NET en un contexto normal aumenta la angiogénesis, mientras que la regulación negativa de NET en un contexto patológico o en un contexto en el que NET está activada, conduce a una reducción de la angiogénesis. Este descubrimiento proporciona una vía para obtener nuevas estrategias terapéuticas en la regulación de la angiogénesis por medio de la modulación de la actividad de Net. Este descubrimiento también proporciona nuevos sistemas modelo para estudiar la angiogénesis y enfermedades que implican trastornos angiogénicos, también proporciona nuevos métodos de selección para identificar compuestos útiles para la prevención o el tratamiento de estas enfermedades. El documento WO99/67283 describe la identificación y caracterización de dos proteínas (MSK1 y MSK2) que pertenecen a la familia MAPK. Los autores han formulado la hipótesis de que los compuestos que inhiben la fosforilación mediada por MSK1 o MSK2 también pueden ser útiles para prevenir la expresión de COX2 y, de esta manera, pueden ser útiles para el tratamiento del cáncer o de enfermedades inflamatorias, pero ningún elemento en este documento establece una asociación entre la señalización de MSK1/MSK2 y el factor de transcripción NET.
Por lo tanto, un primer aspecto de la invención proporciona el uso de todo o parte del polipéptido NET en un método para identificar compuestos que modulan la angiogénesis o que son eficaces para prevenir y/o tratar patologías relacionadas con trastornos angiogénicos. Como alternativa, la invención proporciona el uso de células que expresan todo o parte del polipéptido NET en tal método. En una realización específica, el polipéptido Net se selecciona entre el grupo consistente en una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID Nº: 2, una variante alélica de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID Nº: 2, una variante de empalme de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID Nº: 2, y una proteína homóloga de otra especie de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID Nº: 2. En otra realización, parte del polipéptido NET usado en el método comprende un fragmento de NET seleccionado entre los fragmentos correspondientes a la caja A (humana) = aa 1-90, caja B (humana) = aa 133-151, caja C (humana) = aa 321-378, caja D (humana) = aa 290-299, dominio NID (humano) = aa 153-308; dominio JEX (humano) = aa 233-353; dominio CID (humano) aa 274-282; caja A (murina) = aa 1-90; caja B (murina) = aa 133-151, caja C (murina) = aa 323-380, caja D (murina) = aa 291-301; dominio NID (murino) = 155-197; dominio JEX (murino) = aa 222-253; dominio CID (murino) = aa 275-220. La secuencia del polipéptido NET murino se proporciona en la SEC ID Nº: 4.
El método para identificar compuestos puede comprender la detección de la modulación de la actividad de transcripción de NET, la detección de la modulación de la interacción NET/ADN o de la modulación de la fosforilación de NET, o la evaluación de la capacidad de todo o un fragmento del polipéptido NET de interaccionar con otro elemento polipeptídico.
El compuesto a identificar puede ser un antagonista de NET y el compuesto puede usarse para la prevención y/o tratamiento de patologías relacionadas o asociadas con trastornos angiogénicos tales como sarcoma de Kaposi, crecimiento tumoral y/u otras patologías en las que está activada la proteína NET. Las patologías relacionadas con trastornos angiogénicos incluyen cánceres y tumores sólidos para los que el antagonista de Net actuarán como compuesto anti-angiogénico (en un contexto en el que el polipéptido Net está activado) y conducirá a la prevención, reducción o regresión del crecimiento tumoral.
El compuesto a identificar puede ser un modulador de NET (un agonista o un antagonista) y el compuesto puede usarse para la prevención y/o el tratamiento de patologías relacionadas con trastornos angiogénicos en un contexto en el que la proteína NET no está activada (o en un contexto en el que las células no están transformadas). Estas patologías pueden implicar una vascularización insuficiente y requerir el aumento de la angiogénesis. Estas patologías también pueden implicar un aumento de la vascularización y requerir la inhibición de la angiogénesis.
Como se ha indicado anteriormente, Net es un factor importante para la regulación de la angiogénesis. La presente invención ventajosamente proporciona un método para seleccionar moléculas que modulan la actividad de Net, y de esta manera la angiogénesis. Puede usarse cualquiera de los métodos de selección de la técnica, particularmente la selección de alto rendimiento. Por consiguiente, la invención proporciona un método para identificar compuestos que modulan la angiogénesis, comprendiendo dicho método (i) proporcionar una composición que comprende un factor de transcripción Net de mamífero, (ii) poner en contacto la composición con el compuesto candidato; y (iii) evaluar la capacidad de dicho compuesto candidato de modular la función de NET. La composición del método puede ser una célula, un extracto celular o un extracto semipurificado o un polipéptido NET purificado. En una realización específica, la etapa de evaluación comprende detectar la modulación de la actividad de transcripción de Net, tal como detectar un cambio en el nivel de expresión de un gen indicador expresado bajo el control de una proteína quimérica que contiene el dominio de transactivación de NET y un dominio de unión al ADN de un factor de transcripción (tal como el dominio de unión al ADN de GAL4). La detección de la expresión puede realizarse en una célula de mamífero transfectada de forma transitoria o estable. En otra realización, la etapa de evaluación comprende detectar la modulación de la interacción NET/ADN, por ejemplo, usando un ensayo de desplazamiento en gel o cuantificación de nucleótidos marcados unidos a la proteína NET. En otra realización, la etapa de evaluación comprende detectar la modulación de la fosforilación de NET. La detección de la modulación de la fosforilación de Net puede comprender la determinación de la fosforilación de NET como resultado de la actividad quinasa. La quinasa puede ser p38\alpha, p38\beta, ERK1, ERK2, JNK1, JNK2 o JNK3. En otra realización, la etapa de evaluación comprende evaluar la capacidad de todo o un fragmento del polipéptido NET de interaccionar con otros elementos polipeptídicos, tal como por medio de la evaluación de la capacidad del dominio de unión a SRF de NET para interaccionar con el elemento SRE o de la evaluación de la capacidad del dominio de unión a CtBP de NET (dominio CID) de interaccionar con el elemento CtBP, o por medio de la evaluación de ambas cosas. Los métodos de selección de la invención permiten la identificación de un agonista o antagonista de Net.
Otro aspecto de la invención proporciona un animal transgénico no humano que comprende una mutación en el gen de NET. En una realización específica, la mutación es una deleción. En una realización preferida, la deleción conduce al ARNm de NET de empalme alternativo que carece del exón 2. La mutación puede afectar a un alelo o a los dos alelos. En una realización específica, el animal es un roedor y preferiblemente un ratón.
Los animales transgénicos de acuerdo con la invención proporcionan sistemas modelo para estudiar patologías relacionadas con trastornos angiogénicos y para seleccionar y/o ensayar compuestos útiles para la prevención y/o el tratamiento de estas enfermedades. Para la selección y/o ensayo de estos compuestos también son útiles los órganos de los animales transgénicos (tales como retina, aorta, etc.).
Por lo tanto, otro aspecto de la invención proporciona un método para determinar la capacidad de un compuesto de modular la angiogénesis. Como alternativa, la invención proporciona métodos para identificar un compuesto eficaz para prevenir y/o para tratar patologías relacionadas con trastornos angiogénicos. El método preferido comprende administrar dicho compuesto a un animal transgénico que comprende una mutación en el gen de NET y comparar la angiogénesis con la de un animal de control no tratado.
Estos y otros objetos se tratan en la presente invención, que se explica con más detalle en los dibujos adjuntos y en la siguiente Descripción Detallada y Ejemplos.
Descripción de los dibujos
Figura 1
Formación de microtúbulos por células HUVEC en Matrigel inducida por un medio acondicionado de células NIH3T3 transfectadas de forma diferencial
Se transfectaron células NIH3T3 por pCEFL-GPCR solo (figura 1 a); pCEFL-GPCR con p601D-Net-antisentido (figura 1 c) o p601D-Net-transdominante (figura e). Antes de la incubación con las células HUVEC, parte del medio acondicionado se incubó con: (b) 0,2 \mug/ml de anticuerpo policlonal anti-VEGF de ratón (IgG de cabra total; R&D SYSTEMS) o con (d y f) 10 ng/ml de VEGF-A humano recombinante (R&D). Las placas se observaron después de 24 horas (contraste de fase, ampliación original, 40 aumentos).
Figura 2
Proliferación de células HUVEC en medio acondicionado
Se transfectaron células NIH3T3 con el vector de control para GPCR (pCEFL); el vector para GPCR con el vector de control para Net antisentido (p60ID); los vectores para GPCR y Net antisentido o Net transdominante (TD).
Figura 3
Fosforilación de Net endógena
Se transfectaron células NIH3T3 como se ha descrito anteriormente con el vector de control para GPCR (pCEFL) (línea 1) o el vector para GPCR (línea 2). Catorce horas después, las células se lavaron y se dejaron en el medio de crecimiento durante 2,5 horas. Después, las células se trataron con SB 203580 (10 \muM) (Alexia Corp.) o U0126 (10 mM) (Promega) durante 30 minutos. Después de 6 horas, los extractos se analizaron por SDS-PAGE y transferencia de Western con anticuerpos contra fosfo-serina 365 Net (anticuerpo 2F3, Ducret et al. (Oncogene, en prensa) o ERK activada (Promega).
Figura 4
La activación del promotor de VEGF por GPCR requiere Net
Se transfectaron células NIH3T3 como se ha descrito anteriormente por el vector de control de GPCR (pCEFL) + el vector de control de Net antisentido (p601D); pCEFL+antiNet; GPCR+p601D; GPCR + AntiNet con los indicadores: mdm2-Luc; p21-Luc; VEGF-Luc y pCMV-LacZ. Las células se recogieron, se lisaron y se realizaron ensayos de luciferasa de acuerdo con técnicas convencionales.
Figura 5
Niveles de péptido VEGF en medio acondicionado de células NIH3T3 transfectadas
Se transfectaron cantidades iguales de células NIH3T3 como se ha descrito anteriormente por pCEFL (vector de GPCR); GPCR + p601D (vector de AntiNet); GPCR + AntiNet; \Delta Ras (control inactivo para Ras V12); Ras-V12+p601D; Ras-V12+AntiNet; p601D; AntiNet con vector de expresión de puromicina (pSG5 puro). Se añadió una concentración 2 nM de puromicina después del lavado. Cuarenta y ocho horas después, los medios acondicionados se recogieron y las células se tripsinizaron, se resuspendieron en 1 ml de medio y las células vivas se contaron después de tinción con azul tripán. Los niveles de péptidos VEGF se midieron por ELISA (kit Mouse-VEGF Quantikine, R&D) y los resultados se corrigieron para las cantidades de células.
Figura 6
Niveles de péptido VEGF en medio acondicionado de clones transformados con GPCR
Se transformaron células NIH3T3 con pCEFL o GPCR y se seleccionaron por neomicina (SIGMA). Se recogieron clones individuales, se expandieron y se analizaron con respecto a los niveles de péptido VEGF como se ha descrito anteriormente.
Figura 7
Niveles de péptido VEGF en medio acondicionado de clones transformados por GPCR agrupados o aislados transfectados con vectores de control (p601D) y AntiNet
Se transformaron varios clones transformados con GPCR o se transfectaron con p601D o AntiNet con vectores de expresión de puromicina y se trataron con una concentración 2 nM de puromicina para obtener clones de GPCR-control transformados de forma estable; clones de GPCR-AntiNet y grupos de clones de GPCR transfectados con p601D o AntiNet. Los niveles de péptido VEGF se midieron por ELISA (kit Mouse-VEGF Quantikine, R&D) y los resultados se corrigieron con respecto a las cantidades de células.
Figura 8
Expresión de Net y Elk en grupos y clones de GPCR-control y GPCR-AntiNet
Se transfectaron clones de GPCR con p601D o AntiNet con vectores de puromicina y se seleccionaron con puromicina durante 48 horas. Los clones de GPCR-control y GPCR-AntiNet se dejaron crecer en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía suero bovino fetal al 10% (FCS) durante 24 horas (no alcanzaron la confluencia). Las células se recogieron y los extractos se analizaron por SDS-PAGE y transferencia de Western con anticuerpos contra Net, Elk1 y TBP.
Figura 9
Volumen de tumores formados por clones de GPCR-control y GPCR-AntiNet
Se tripsinizaron aproximadamente 10^{6} células de diferentes clones, se resuspendieron en PBS y se inyectaron por vía subcutánea en el costado izquierdo de ratones BALB/c nu/nu hembra de 8-10 semanas de edad (7 ratones por clon, dos clones para GPCR-control y GPCR-AntiNet). De 6 a 16 días después de la inyección, se midieron los diámetros menores y mayores del tumor cada dos días con un calibre, y los volúmenes de los tumores se calcularon la fórmula: Volumen = (4/3) x \pi x (1/2 x diámetro menor + 1/2 x diámetro mayor)^{2s}.
Figura 10
Aspecto de los tumores generados por los clones de GPCR y GPCR anti-Net en ratones desnudos
Se fotografiaron ratones BALB/c nu/nu que llevaban tumores (véase la leyenda de la figura 9) 16 días después de la inyección. Las fechas indican los vasos sanguíneos recién formados inducidos por el tumor.
Figura 11
Densidad de vasos en tumores
Los ratones se sacrificaron 16 días después de la inyección, los tumores se retiraron y se realizaron secciones de 10 mm en parafina. Los vasos sanguíneos en los tumores se detectaron con anticuerpos contra CD31 (Pharmingen).
Figura 12
Área cubierta de vasos en los tumores
Se analizaron secciones de parafina teñidas con CD31 obtenidas a partir de 5 tumores de cada clon con un microscopio controlado con un ordenador. Se registraron cinco campos seleccionados aleatoriamente de cada sección a 10 aumentos con una cámara digital y se realizaron análisis morfométricos con el software NSURFX.
Figura 13
Diferencias en la tensión hipóxica en tumores
Cuatro horas antes de sacrificar los ratones, se inyectó EF5 (Radiation Oncology Imaging Service Center, University of Pennsylvania; 10 mM), un marcador de hipoxia, en ratones que llevaban tumores (1 mg/ratón). Se tiñeron secciones de criostato (10 \mum) con anticuerpo anti-EF5 acoplado a Cy5 (Radiation Oncology Imaging Service Center, University of Pennsylvania) y se analizaron por un microscopio de fluorescencia controlado por un ordenador con una cámara digital. Se siguió el protocolo suministrado por el Radiation Oncology Imaging Service Center (University of Pennsylvania).
Figura 14
Mutagénesis dirigida del locus Net murino
(A) Representación esquemática del alelo Net de tipo silvestre, el vector de dirección y el alelo Net mutante recombinante. El exón delecionado contiene el codón de inicio de la traducción y codifica los aminoácidos 1-69 en el dominio de unión al ADN de la proteína Net. Se muestra la posición de la sonda 3' usada para el análisis de transferencia de Southern, así como los fragmentos digeridos por XbaI de 13 kb (tipo silvestre y 5 kb (alelo mutante); B, BamHI; X, XbaI.
(B) Análisis de transferencia de Southern de ADN digerido por XbaI de la descendencia de un entrecruzamiento heterocigoto (+/-). La hibridación realizada usando la sonda 3' produjo bandas correspondientes a fragmentos de 13 kb para el alelo de tipo silvestre (WT) o 5 kb para el alelo dirigido (M).
(C) Análisis de PCR de la misma descendencia. El genotipo se indica en la parte superior, la flechas señalan los productos de amplificación específicos para el alelo de tipo silvestre (WT, 1550 pb) y el alelo dirigido (M,1300 pb). La serie de cebadores de PCR (UC54, UC56, UC57) se indican en el esquema de dirección.
(D) Detección de transcritos de Net por RT-PCR. Se usó ARN aislado a partir de embriones E16 de tipo silvestre y mutantes homocigotos para reacciones de RT-PCR con cebadores de diferentes exones del gen Net (exón 1 a exón 4). Las series de cebadores de RT-PCR se indican en la parte izquierda del panel. Como era de esperar con la deleción del exón 2, no se observa ninguna amplificación en el ARN mutante (-/-) con las series ex1/ex2 o ex2/ex3. Sin embargo, se observa un producto de amplificación entre el exón 3 y el exón 4 (serie ex3/ex4) tanto en el mutante como en el embrión de tipo silvestre. La reacción de RT-PCR entre el exón 1 y el exón 3 (serie ex1/ex3) demuestra que existe un producto más pequeño (90 pb) en el embrión mutante homocigoto en comparación con el tipo silvestre (217 pb).
(E) Análisis de transferencia de Western de extractos de proteína de pulmón de ratones heterocigotos y homocigotos de tipo silvestre de dos semanas de edad. La cantidad de proteína Net de 49-kDA se reduce en el heterocigoto (+/-), hasta desaparecer totalmente en el animal mutante homocigoto (-/-). Sin embargo, aparece una nueva banda de proteína de 42-kDA en el extracto del mutante (como ocurre con el heterocigoto).
Figura 15
Fenotipo de ratones Net \delta/\delta
(A, B) Supervivencia de ratones Net \delta/\delta en comparación con animales de tipo silvestre y heterocigotos (+/\delta). (C) Imagen representativa del fenotipo desarrollado por los ratones Net \delta/\delta. Este animal mostró signos de insuficiencia respiratoria 6 días después de nacer y murió 2 días después. La cavidad torácica se encontró llena de un líquido blanquecino, típico de una efusión quilosa.
Figura 16
Análisis histológico de la cavidad torácica de ratones Net \delta/\delta
Se muestran secciones transversales teñidas con hematoxilina-eosina del tórax de un ratón de tipo silvestre (A) y mutante (B). Barra = 0,8 mm. Los síntomas de insuficiencia respiratoria se observaron a los 8 días de edad en el caso del ratón Net \delta/\delta, que se sacrificó para estos estudios histológicos con un ratón de la misma camada Net +/+ como control. En el mutante, el espacio pleural está claramente expandido, relleno por la efusión quilosa (estrella). Obsérvese la compresión de los pulmones y el corazón por la acumulación de esta efusión. Las fotografías (C) y (D) son ampliaciones de los cuadrados de línea discontinua trazados en (A) y (B), respectivamente. La pared torácica del ratón Net \delta/\delta (D) tiene vasos linfáticos dilatados en comparación con el control (C). R, costilla (del inglés, rib); lv, vaso linfático (del inglés, lymphatic vessel). Barra = 0,2 mm.
Figura 17
Dilatación de los vasos linfáticos torácicos en ratones Net \delta/\delta
Se visualizan los vasos linfáticos de ratones Net +/+, VEGFR3 +/- (A, C, E, G) y Net \delta/\delta, VEGFR3 +/- (B, D, F, H) por tinción con X-Gal (azul). (B, D y F) Un ratón Net \delta/\delta que desarrolló quilotórax a los 10 días de edad. Los vasos linfáticos de la pared torácica del mutante (B) están dilatados en comparación con el control de la misma camada (A). Barras = 90 \mum. Los vasos linfáticos de la piel pericárdica (C y D) y de la piel torácica (E y F) de los mismos animales no están alterados en los ratones Net \delta/\delta (Barras = 42 mm). En un ratón de 5 días de edad, antes del inicio de la efusión pleural, los vasos linfáticos torácicos ya están dilatados en los ratones Net \delta/\delta (H) en comparación con el control de la misma camada (G). R, costillas (del inglés, rib); ic, región intercostal (del inglés, intercostal region). (Barras = 90 \mum).
Figura 18
Detección por hibridación in situ en preparaciones completas de la expresión de ARNm de Net (A, C, E, G, H y J), y VEGF-R2 (B, D, F, I y K) en embriones en las fases E7.5 y E8.5
(A, B) Embriones E7.5. (C, D) Vistas laterales de embriones E8.5 en su saco vitelino. (E, F) Expresión en el saco vitelino diseccionado de los embriones E8.5. (G) Expresión de Net dentro de la superficie interna del cono ectoplacentario diseccionado. (H, I) Vistas anterior y (J, K) posterior del marcaje observado en embriones en fase E8.5. Abreviaturas: al, alantoides; ch, corion (del inglés, chorion); da, aorta dorsal (del inglés, dorsal aortae); em, tejido embrionario; ep, cono ectoplacentario (del ingles, ectoplacental cone); ex, tejido extraembrionario; ht, corazón (del ingles, heart); sv, seno venoso; ys, saco vitelino (del inglés, yolk sac).
Figura 19
Detección de ARNm de transcritos de Net (A, C y E) y VEGF-R2 (B, D y F) en preparaciones completas de las fases embrionarias E9.5 y E10.5
(A, B) Vistas laterales de embriones E9.5. (C, D) Expresión en la región cefálica de embriones E10.5. (E, F) Vistas laterales de la región troncal de embriones en fase E10.5. Abreviaturas: ao, aorta; b, arcos branquiales; fl, pata delantera (del inglés, forelimb); fn, masa frontonasal; hv, vasos cefálicos (del inglés, head vessels); isv, vasos intersomáticos (del inglés, intersomatic vessels); md, proceso mandibular; mx, proceso maxilar; sl, esclerotomo; uv, vena umbilical (del inglés, umbilical vein).
Figura 20
Análisis comparativo de la expresión de Net y VEGF-R2 por hibridación in situ en las fases embrionarias E7.5, E8.5, E12.5 y E14.5
Se han hibridado secciones consecutivas congeladas como se indica en las imágenes con sondas de Net y VEGF-R2. Cada fila de fases representada aquí contiene una vista de campo brillante para mostrar la histología (igual que en la figura 4). (A-C) y (D-F) representan secciones a través del embrión E7.5 y E8.5 respectivamente, localizadas en la decidua materna. (G-I) y (J-L) muestran secciones sagitales a través de embriones E12.5 y E14.5 respectivamente. Abreviaturas: ad, glándula suprarrenal (del inglés, adrenal gland); ep, cono ectoplacentario (del ingles, ectoplacental cone); gt, túbulo genital (del inglés, genital tubule); hd, cabeza (del inglés, head); ht, corazón (del ingles, heart); in, intestino; ri, costillas (del inglés, ribs); li, hígado (del inglés,liver); lx, laringe (del inglés, larynx); md, mandíbula; tl, cola (del inglés, tail); ys, saco vitelino (del inglés, yolk sac).
Figura 21
Expresión de Net y VEGF-R2 en secciones sagitales adyacentes en embriones E16.5 (A-F), y expresión de Net durante la diferenciación del cartílago de las extremidades (G-J) en las fases embrionarias E14.5 y E16.5
(B) y (E) muestran la expresión de Net en la región cefálica y torácica, respectivamente, mientras que (C) y (D) representan el patrón de VEGF-R2. Abreviaturas: ca, carpo; cp, plexo coroideo (del inglés, choroid plexus); d, dedo; im, mesénquima interdigital (del ingles interdigital mesenchyme); ht, corazón (del ingles, heart); li, hígado (del inglés,liver); lu, pulmón, (del inglés, lung); nc, cartílago nasal (del inglés, nasal cartilage); os, centro de osificación; pvp, plexo vascular perineural; ri, costillas (del inglés, ribs); ta, tarso; to, lengua (del inglés, tongue); zona ventricular.
Figura 22
Angiogénesis inducida por rhFGF-2 en la córnea de ratones
La técnica fue esencialmente la descrita en Kenyon et al. (Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1996, 37: 1625-1632). Se implantaron gránulos de Hydron que contenían bFGF (90 ng) y sucrafato (45 ng) en las córneas de ratones Net de tipo silvestre y mutantes. Los ojos se examinaron por biomicroscopía 3-6 días después de la implantación de los gránulos.
Figura 23
Formación de microvasos en el ensayo de angiogénesis de anillo aórtico de ratón
La técnica fue esencialmente la descrita en Giovane et al (Genes Dev. 1994, 8, 1502-13). Se cubrieron placas de cultivo de tejidos de doce pocillos con 200 \mul de Matrigel (Becton-Dickinson) y se dejaron gelificar durante 30 min a 37ºC. Se escindieron las aortas torácicas de ratones con Net de tipo silvestre y mutante de seis a ocho semanas de edad. Las secciones aórticas (de 1 mm de longitud) se pusieron con sus lados sobre esta capa y se cubrieron inmediatamente con 200 \mul de Matrigel, que se dejó gelificar durante 30 minutos. Después, los anillos se incubaron durante 5 días con medio sin suero suplementado con una combinación de factores de crecimiento optimizados para el crecimiento de células endoteliales (Clonetics, CA). El día 5, se examinaron las ramificaciones con un microscopio.
Figura 24
Dominios del polipéptido Net. Figura 24 a (humano), figura 24 b (ratón)
Caja A: (dominio ets), lwqfllqlll (NES); Caja B (interacción con SRF); NID (dominio inhibidor de Net); JEX (interacción de JNK y exportación inducida por la fosforilación); CID (dominio de interacción con CtBP); Caja D (unión de NLS y ERK1 + p38); Caja C (Transactivación inducida por fosforilación).
Descripción detallada de la invención
Como se sabe poco sobre la función biológica de NET, se realizaron investigaciones para identificar el efecto de la deleción de NET en ratones transgénicos para identificar las dianas biológicas de su actividad. Las invención se basa, en parte, en la observación del fenotipo de estos ratones transgénicos.
Por consiguiente, la invención se refiere al uso del ADNc humano que codifica la proteína NET, homólogos, variantes de empalme, mutantes de un solo punto o de deleción y las proteínas codificadas por estas secuencias para uso en la selección de moléculas pequeñas o productos naturales. En este proceso puede usarse la cepa 2-híbrida descrita en los ejemplos, la evaluación de la fosforilación de NET y la modificación de las actividades descritas de NET.
NET también puede usarse en aplicaciones de terapia génica (pueden utilizarse tanto moléculas codificantes como moléculas antisentido) para modular la angiogénesis. A continuación se describen las patologías que pueden tratarse por estas terapias génicas basadas en la sobreexpresión o la regulación negativa de NET.
Las patologías relacionadas con trastornos angiogénicos incluyen cánceres y tumores sólidos para los que los antagonistas de Net actuarán como compuestos anti-angiogénicos (en un contexto en el que el polipéptido Net está activado) y conducirán a la prevención, reducción o regresión del crecimiento tumoral. Los ejemplos de trastornos para los cuales puede usarse el método o los compuestos objeto de esta invención, solos o como parte de un régimen de tratamiento, incluyen: fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cáncer cervical, tumor testicular, carcinoma pulmonar, carcinoma pulmonar microcítico, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma.
El compuesto a identificar puede ser un modulador de NET (un agonista o un antagonista) y el compuesto puede usarse para la prevención y/o el tratamiento de patologías relacionadas con trastornos angiogénicos en un contexto en el que la proteína NET no está activada (o en un contexto en el que las células no están transformadas).
Estas patologías pueden implicar una vascularización insuficiente y requerir un aumento de la angiogénesis, estas patologías incluyen, pero sin limitación, isquemia cardiaca o periférica, defecto en la curación de heridas, reestenosis vascular, úlcera por decúbito o por estasis, úlceras gastrointestinales, insuficiencia placentaria, necrosis aséptica, defectos en la curación de fracturas óseas, hipertensión pulmonar y sistémica (corte vascular), ictus, demencia vascular, enfermedad de Alzheimer, CADASIL, pseudoquiste del tiroides, linfoedema etc.
Estas patologías también pueden implicar un aumento de la vascularización y requerir la inhibición de la angiogénesis, incluyendo dichas patologías, pero sin limitación, aterosclerosis, hemangioma, hemangioendotelioma, verrugas, crecimiento de pelo, queloides de cicatrices, edema alérgico, hemorragia uterina disfuncional, quistes foliculares, hiperestimulación ovárica, endometriosis, insuficiencia respiratoria, ascitis, esclerosis peritoneal (pacientes en diálisis), formación de adhesiones (cirugía abdominal), sobrecarga muscular y cardiaca, obesidad, artritis reumatoide, sinovitis, destrucción de hueso y cartílago, osteomielitis, desarrollo de pannus (queratitis superficial crónica), formación de osteofitos, inflamación y procesos infecciosos (hepatitis, neumonía, glomerulonefritis), asma, pólipos nasales, trasplante de diferentes órganos (hígado, riñón,... epitelio), retinopatía del prematuro, retinopatía diabética, trastornos coroidales y otros trastornos intraoculares, leucomalacia, tiroiditis, aumento del tiroides, trasplante de páncreas, etc.
Estos y otros aspectos de la invención, particularmente la expresión de la proteína NET, la generación de anticuerpos anti-NET, ensayos de selección para la modulación de NET, ensayos de selección para la identificación de antagonistas o agonistas de NET y la administración de vectores codificantes de NET, en particular para aplicaciones de terapia génica, se describen con detalle en las siguientes secciones. Los encabezados de las secciones se proporcionan meramente por comodidad del lector y en ningún caso deben considerarse limitantes.
Definiciones
La presente invención contempla el uso de un gen que codifica un polipéptido NET, incluyendo una forma de longitud completa o natural de NET, y cualquier fragmento del mismo, de cualquier origen animal, particularmente de mamífero o de ave, y más particularmente de origen humano. Como se usa en este documento, el término "gen" se refiere a un conjunto de nucleótidos que codifican un polipéptido e incluye ácidos nucleicos ADNc y ADN genómico. Como se usa en este documento, "NET" se refiere a un polipéptido NET, y "net" se refiere a un gen que codifica un polipéptido NET. La proteína NET también se conoce como Elk-3, Sap-2 y ERP. La secuencia de ácido nucleico del gen net humano se proporciona en la SEC ID Nº1, y el polipéptido correspondiente se proporciona en la SEC ID Nº2. La secuencia de ácido nucleico del gen net murino se proporciona en la SEC ID Nº3 y el polipéptido correspondiente se proporciona en la SEC ID Nº4.
De acuerdo con la presente invención, pueden emplearse técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y ADN recombinante dentro del alcance de la técnica. Dichas técnicas están explicadas con detalle en la bibliografía. Véase, p. ej., Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (en la presente memoria "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, volúmenes I y II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & SJ. Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbai, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).
Por lo tanto, si aparecen en este documento, los siguientes términos tendrán las definiciones que se indican a continuación.
Un "vector de clonación" es un replicón, tal como un plásmido, fago o cósmido, al que puede unirse otro segmento de ADN para conseguir la replicación del segmento adjunto. Un "replicón" es cualquier elemento genético (por ejemplo, plásmido, cromosoma, virus) que funciona como unidad autónoma de replicación de ADN in vivo, es decir, capaz de replicarse bajo su propio control. Los vectores de clonación pueden tener capacidad de replicación en un tipo celular y expresión en otro ("vector lanzadera").
Un "cassette" se refiere a un segmento de ADN que puede insertarse en un vector en sitios de restricción específicos. El segmento de ADN codifica un polipéptido de interés y el cassette y los sitios de restricción están diseñados para asegurar la inserción del cassette en la fase de lectura apropiada para la transcripción y la traducción.
Una célula se ha "transfectado" con ADN exógeno o heterólogo cuando dicho ADN se ha introducido dentro de la célula. Una célula se ha "transformado" con ADN exógeno o heterólogo cuando el ADN utilizado para transfectar la célula ocasiona un cambio fenotípico. El ADN transformante puede integrarse (unirse covalentemente) al ADN cromosómico que constituye el genoma de la célula.
Una "molécula de ácido nucleico" se refiere a la forma polimérica del éster fosfato de los ribonucleósidos (adenosina, guanosina, uridina o citidina; "moléculas de ARN") o de los desoxirribonucleósidos (desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina o desoxicitidina; "moléculas de ADN") o a cualquiera de sus análogos de fosfoéster, tales como los fosforotioatos y los tioésteres, ya sea en forma de una sola cadena o de una hélice de doble cadena. Son posibles las hélices de ADN-ADN, ADN-ARN y ARN-ARN de doble cadena. El término molécula de ácido nucleico, y, en particular, molécula de ADN o ARN, se refiere únicamente a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no se limita a ninguna forma terciaria concreta. Por lo tanto, este término comprende el ADN de cadena doble encontrado, entre otras, en moléculas de ADN lineales o circulares (por ejemplo, fragmentos de restricción), plásmidos y cromosomas. En la exposición de la estructura de determinadas moléculas de ADN de cadena doble, las secuencias pueden describirse en la presente memoria según el acuerdo habitual de proporcionar únicamente la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo de la cadena de ADN no transcrita (es decir, la cadena que tiene una secuencia homóloga a la del ARNm). Una "molécula de ADN recombinante" es una molécula de ADN que se ha sometido a una manipulación por biología molecular.
Una molécula de ácido nucleico "puede hibridar" con otra molécula de ácido nucleico, tal como ADNc, ADN genómico o ARN cuando una forma monocatenaria de la molécula de ácido nucleico puede hibridar con la otra molécula de ácido nucleico en las condiciones apropiadas de temperatura y de intensidad iónica (véase Sambrook et al., supra). Las condiciones de temperatura e intensidad iónica determinan la "rigurosidad" de la hibridación. Para una selección preliminar de ácidos nucleicos homólogos, pueden usarse condiciones de baja rigurosidad que corresponden a una T_{m} de 55º, por ejemplo, 5x SSC, SDS al 0,1%, lecha al 0,25%, y sin formamida; ó de formamida al 30%, 5x SSC, SDS al 0,5%. Las condiciones de rigurosidad moderadas en la hibridación corresponden a una T_{m} mayor, por ejemplo, formamida al 40%, con 5x ó 6x SCC. Las condiciones de alta rigurosidad en la hibridación corresponden a la T_{m} más alta, por ejemplo, formamida al 50%, 5x ó 6x SCC. La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de la rigurosidad de la hibridación, son posibles uniones erróneas entre las bases. La rigurosidad apropiada para la hibridación de ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementariedad, variables muy conocidas en la técnica. Cuanto mayor sea el grado de similitud u homología entre dos secuencias de nucleótidos, mayor será el valor de T_{m} para los híbridos de los ácidos nucleicos que tienen esas secuencias. La estabilidad relativa (correspondiente a la mayor Tm) de las hibridaciones de ácidos nucleicos disminuye en el siguiente orden: ARN:ARN, ADN:ARN, ADN:ADN. En el caso de híbridos con una longitud mayor de 100 nucleótidos, se han obtenido ecuaciones para calcular la T_{m} (véase Sambrook et al., supra, 9.50-0.51). Para hibridación con ácidos nucleicos más cortos, es decir, oligonucleótidos, es más importante la posición de los desacoplamientos, y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook et al., supra, 11.7-11.8). Preferiblemente, una longitud mínima para un ácido nucleico hibridable es al menos de aproximadamente 10 nucleótidos; preferiblemente al menos de aproximadamente 15 nucleótidos; y, más preferiblemente, la longitud es al menos de aproximadamente 20 nucleótidos;
En una realización específica, la expresión "condiciones de hibridación convencionales" se refiere a una T_{m} de 55ºC, y utiliza las condiciones indicadas anteriormente. En una realización preferida, la T_{m} es 60ºC; en una realización más preferida, la T_{m} es 65ºC.
Como se usa en este documento, el término "oligonucleótido" se refiere a un ácido nucleico, generalmente de al menos 18 nucleótidos, que puede hibridar con una molécula de ADN genómico, una molécula de ADNc o una molécula de ARNm que codifica NET. Los oligonucleótidos pueden marcarse, por ejemplo, con ^{32}P-nucleótidos o nucleótidos con los que se ha conjugado covalentemente un marcador, tal como biotina (véase la descripción anterior con respecto al marcaje de polipéptidos NET). En una realización, un oligonucleótido marcado puede usarse como sonda para detectar la presencia de un ácido nucleico que codifica NET. En otra realización, pueden usarse oligonucleótidos (pudiendo estar marcados uno o los dos) como cebadores de PCR, para la clonación de toda la longitud o un fragmento de NET, o para detectar la presencia de ácidos nucleicos que codifican NET. En otra realización, un oligonucleótido de la invención puede formar una triple hélice con una molécula de ADN de NET. Generalmente, los oligonucleótidos se preparan de manera sintética, preferiblemente en un sintetizador de ácidos nucleicos. De acuerdo con esto, los oligonucleótidos pueden prepararse con enlaces fosfoéster análogos que no están presentes en la naturaleza, tales como enlaces tioéster, etc.
Una "secuencia codificante" de ADN es una secuencia de ADN bicatenaria que se transcribe y traduce en un polipéptido en una célula in vitro o in vivo cuando se pone bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan por un codón de iniciación en el extremo 5' (amino) y un codón de parada de la traducción en el extremo 3' (carboxilo). Una secuencia codificante puede incluir, pero sin limitación, secuencias procarióticas, ADNc de ARNm eucariótico, secuencias de ADN genómico de ADN eucariótico (por ejemplo, de mamífero) e incluso secuencias de ADN sintéticas. Si la secuencia codificante se va a usar para la expresión en una célula eucariota, normalmente se localizará una señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de la transcripción en posición 3' con respecto a la secuencia codificante.
Una molécula "antisentido de Net" es una molécula de ARN o ADN que es complementaria al menos a una parte de la molécula de ARNm de NET. Este polinucleótido antisentido puede emplearse para inhibir la transcripción y/o traducción del ARNm del polipéptido Net reduciendo de esta manera la cantidad de polipéptido Net en la célula. Una secuencia codificante de la molécula antisentido de Net puede introducirse en un vector y expresarse en la célula. Como alternativa, la molécula antisentido de Net es un ADN monocatenario o un ARN monocatenario, ácido nucleico con cadena principal de metilfosfonato, ácido nucleico con cadena principal de fosforotioato, ácido nucleico de poliamida y estructuras antisentido similares conocidas en la técnica.
Las "secuencias de control de la transcripción y la traducción" son secuencias reguladoras de ADN tales como promotores, potenciadores, terminadores y similares, que proporcionan la expresión de una secuencia codificante en una célula hospedadora. En las células eucariotas, las señales de poliadenilación son secuencias de control.
Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificante cadena abajo (en dirección 3'). Para definir la presente invención, la secuencia promotora se une a su extremo 3' por el sitio de inicio de la transcripción y se extiende cadena arriba (en dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima de los niveles basales. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de inicio de la transcripción (definido convenientemente, por ejemplo, por mapeo con nucleasa S1), así como dominios de unión de proteínas (secuencias consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa.
Una secuencia codificante está "bajo el control" de secuencias de control de la transcripción y la traducción en una célula cuando la ARN polimerasa transcribe la secuencia codificante en ARNm, que después se corta y empalma (si la secuencia codificante contiene intrones) y se traduce en la proteína codificada por la secuencia codificante.
Como se usa en este documento, el término "homólogo", en todas sus formas gramaticales y variaciones ortográficas, se refiere a la relación entre proteínas que poseen un "origen evolutivo común", incluyendo proteínas de superfamilias (por ejemplo, la superfamilia de inmunoglobulinas) y proteínas homólogas de diferentes especies (por ejemplo, cadena ligera de miosina, etc.) (Reeck et al., 1987, Cell 50:667). Estas proteínas (y sus genes codificantes) tienen homología de secuencia, como se refleja por su grado de similitud de secuencia.
Por consiguiente, la expresión "similitud de secuencia", en todas sus formas gramaticales, se refiere al grado de identidad o correspondencia entre secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos de proteínas que pueden o no compartir un origen evolutivo común (véase Reeck et al., supra). Sin embargo, en el uso común y en la presente solicitud, el término "homólogo", cuando se modifica con un adverbio tal como "muy", puede hacer referencia a la similitud de secuencia y no a un origen evolutivo común.
En una realización específica, dos secuencias de ADN son "sustancialmente homólogas" o "sustancialmente similares" cuando al menos aproximadamente 50% (preferiblemente al menos aproximadamente 75%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 90 ó 95%) de los nucleótidos corresponden sobre la longitud definida de las secuencias de ADN. Las secuencias que son sustancialmente homólogas pueden identificarse comparando las secuencias usando el software convencional disponible en bancos de datos de secuencias, o en un experimento de hibridación de Southern, por ejemplo, en condiciones rigurosas como las definidas para ese sistema particular. La definición de las condiciones de hibridación apropiadas está dentro del alcance de la técnica. Véase, por ejemplo, Maniatis et al., supra; DNA Cloning, Vols. I & II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.
De manera similar, en una realización particular, dos secuencias de ácido nucleico son "sustancialmente homólogas" o "sustancialmente similares" cuando más de 30% de los aminoácidos son idénticos o más de aproximadamente 60% son similares (funcionalmente idénticos). Preferiblemente, las secuencias similares u homólogas se identifican por alineamiento usando, por ejemplo, el programa de apilamiento GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin).
La expresión "correspondiente a" se usa en este documento para hacer referencia a secuencias similares u homólogas, tanto si la posición exacta es idéntica como si es diferente de la de la molécula con la que se mide la homología o similitud. Un alineamiento de secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos puede incluir espacios. De esta manera, la expresión "correspondiente a" se refiere a la similitud de secuencia y no a la numeración de los restos aminoacídicos o bases nucleotídicas.
La presente invención también contempla el uso de genes de mamífero que codifican NET, tanto si son ADN genómico como si son ADNc, que pueden aislarse a partir de cualquier fuente, particularmente a partir de ADNc humano o de una biblioteca genómica. Los métodos para obtener el gen net son bien conocidos en la técnica, como se ha descrito anteriormente (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).
Por consiguiente, cualquier animal puede servir como fuente de ácido nucleico para la clonación molecular de un gen net. El ADN puede obtenerse por procedimientos convencionales conocidos en la técnica a partir de ADN clonado (por ejemplo, una "biblioteca" de ADN), y preferiblemente se obtiene a partir de una biblioteca de ADNc preparada a partir de tejidos con un alto nivel de expresión de la proteína (por ejemplo, células endoteliales, fibroblastos, condrocitos, timo, bazo, cartílago), por síntesis química, por clonación de ADNc, o por la clonación de ADN genómico o fragmentos de los mismos, o puede purificarse a partir de la célula deseada (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra; Glover, D.M. (ed.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Vol. I, II). Los clones derivados de ADN genómico pueden contener regiones de ADN reguladoras e intrónicas además de las regiones codificantes; los clones derivados de ADNc no contendrán secuencias intrónicas. Sea cual sea la fuente, el gen debe clonarse molecularmente en un vector apropiado para la propagación del gen.
La presente invención también contempla el uso de genes (por ejemplo, ADNc) que codifican variantes alélicas, variantes de empalme, análogos y derivados de NET, que tienen la misma o una actividad funcional homóloga a la de NET, y homólogos de los mismos procedentes de otras especies. La producción y uso de derivados y análogos relacionados con NET están dentro del alcance de la presente invención. En una realización específica, el derivado o análogo es funcionalmente activo, es decir, puede presentar una o más actividades funcionales asociadas con NET de tipo silvestre de longitud completa.
Los derivados de NET pueden obtenerse alterando secuencias de ácido nucleico codificantes por sustituciones, adiciones o deleciones que proporcionan moléculas funcionalmente equivalentes. Preferiblemente, se obtienen derivados que tienen una actividad funcional potenciada o aumentada con respecto a la proteína NET nativa.
Debido a la degeneración de las secuencias nucleotídicas codificantes, en la práctica de la presente invención pueden usarse otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que un gen net, incluyendo una secuencia de aminoácidos que contiene una variante de un solo aminoácido. Éstas incluyen, pero sin limitación, genes alélicos, genes homólogos de otras especies y secuencias de nucleótidos que comprenden todo o partes de genes net que se han alterado por la sustitución de diferentes codones que codifican el mismo resto aminoacídico dentro de la secuencia, produciendo de esta manera un cambio silencioso. De manera similar, los derivados de NET usados en la invención incluyen, pero sin limitación, los que contienen, como secuencia de aminoácidos primaria, todo o parte de la secuencia de aminoácidos de una proteína NET incluyendo secuencias alteradas en las que restos dentro de la secuencia se sustituyen por restos aminoacídicos funcionalmente equivalentes dando como resultado una sustitución de aminoácidos conservativa. Por ejemplo, uno o más restos aminoacídicos dentro de la secuencia pueden sustituirse por otro aminoácido de polaridad similar, que actúa como equivalente funcional, dando como resultado una alteración silenciosa. Los sustituyentes para un aminoácido dentro de la secuencia pueden seleccionarse entre otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos que contienen estructuras de anillo aromático son fenilalanina, triptófano y tirosina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. No es de esperar que estas alteraciones afecten al peso molecular aparente determinado por electroforesis en gel de poliacrilamida o al punto isoeléctrico.
Son sustituciones particularmente preferidas:
- Arg por Lys y viceversa de tal manera que pueda mantenerse la carga positiva;
- Asp por Glu y viceversa de tal manera que pueda mantenerse la carga negativa;
- Thr por Ser de tal manera que pueda mantenerse un -OH libre; y
- Asn por Gln de tal manera que pueda mantenerse un CONH_{2} libre.
También pueden introducirse sustituciones de aminoácidos para sustituir un aminoácido por otro con una propiedad particularmente preferida. Por ejemplo, una Cys puede introducir un sitio potencial para puentes disulfuro con otra Cys. Una His puede introducirse como un sitio particularmente "catalítico" (es decir, His puede actuar como un ácido o base y es el aminoácido más común en catálisis bioquímica). Pro puede introducirse debido a su estructura particularmente plana, que induce giros b en la estructura de la proteína.
Los genes que codifican derivados y análogos de NET usados en la invención pueden producirse por varios métodos conocidos en la técnica. Las manipulaciones que tienen como resultado su producción pueden realizarse a nivel génico o a nivel de la proteína. Por ejemplo, la secuencia del gen net clonado puede modificarse por cualquiera de numerosas estrategias conocidas en la técnica (Sambrook et al., 1989, supra). La secuencia puede escindirse en sitios apropiados con una o más endonucleasas de restricción, seguido de una modificación enzimática adicional, y si se desea aislarse y ligarse in vitro. En la producción del gen que codifica un derivado o análogo de NET, debe tenerse cuidado de asegurar que el gen modificado permanece dentro de la misma fase de lectura de traducción que el gen de NET, sin interrumpirse por señales de parada de la traducción, en la región del gen en la que se codifica la actividad
deseada.
Además, la secuencia de ácido nucleico que codifica NET puede mutarse in vitro o in vivo, para crear y/o destruir secuencias de inicio y/o terminación de la traducción o para crear variaciones en regiones codificantes y/o modificar el empalme y/o formar nuevos sitios de endonucleasas de restricción o destruir sitios preexistentes, para facilitar adicionalmente la modificación in vitro. En una realización y para preparar el animal transgénico de la invención, estas mutaciones inactivan la función de Net y preferentemente destruyen o modifican las secuencias de traducción y/o inicio. En otra realización y para terapia génica, estas mutaciones pueden mejorar la actividad funcional del producto del gen de Net mutado. Puede usarse cualquier técnica para mutagénesis conocida en la técnica, incluyendo pero sin limitación mutagénesis de localización dirigida in vitro (Hutchinson, C., et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551; Zoller y Smith, 1984, DNA 3:479-488; Oliphant et al., 1986, Gene 44:177; Hutchinson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:710), y el uso de enlazadores TAB® (Pharmacia), etc. Para la mutagénesis de localización dirigida se prefieren técnicas de PCR (véase Higuchi, 1989, "Using PCR to Engineer DNA", en PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press, Capítulo 6, páginas. 61-70).
El gen identificado y aislado después puede insertarse en un vector de clonación apropiado. Puede usarse un gran número de sistemas de vector-hospedador conocidos en la técnica. Los posibles vectores incluyen, pero sin limitación, plásmidos o virus modificados, pero el sistema del vector puede ser compatible con la célula hospedadora usada. Los ejemplos de vectores incluyen, pero sin limitación, E. coli, bacteriófagos tales como derivados de lambda o plásmidos tales como derivados del plásmido pBR322 o derivados del plásmido pUC, por ejemplo, vectores pGEX, pmal-c, pFLAG, etc. La inserción en un vector de clonación puede realizarse, por ejemplo; uniendo el fragmento de ADN a un vector de clonación que tiene extremos cohesivos complementarios. Sin embargo, si los sitios de restricción complementarios usados para fragmentar el ADN no están presentes en el vector de clonación, los extremos de las moléculas de ADN pueden modificarse enzimáticamente. Como alternativa, puede producirse cualquier sitio deseado uniendo secuencias de nucleótidos (enlazadores) a los extremos del ADN; estos enlazadores unidos pueden comprender oligonucleótidos sintetizados químicamente específicos que codifican secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción. Las moléculas recombinantes pueden introducirse en las células hospedadoras por transformación, transfección, infección, electroporación, etc. de manera que se generen muchas copias de la secuencia del gen. Preferiblemente, el gen clonado o el ADNc está contenido en un plásmido de vector lanzadera que proporciona expansión en una célula de clonación, por ejemplo, E. coli, y facilita la purificación para una inserción posterior en una línea celular de expresión apropiada, si se desea. Por ejemplo, un vector lanzadera, que es un vector que puede replicarse en más de un tipo de organismo, puede prepararse para replicación tanto en E. coli como en Saccharomyces cerevisiae por medio de la unión de secuencias de un plásmido de E. coli con secuencias del plásmido 2m de levadura.
Expresión de Polipéptidos NET
La secuencia de nucleótidos que codifica NET, un derivado o análogo del mismo, o un derivado funcionalmente activo del mismo, incluyendo una proteína quimérica, puede insertarse en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y la traducción de la secuencia codificante de proteínas insertada. Estos elementos se denominan en este documento "promotor". De esta manera, el ácido nucleico que codifica NET está asociado operativamente con un promotor en un vector de expresión. Tanto las secuencias de ADNc como las secuencias genómicas pueden clonarse y expresarse bajo el control de estas secuencias reguladoras. Un vector de expresión preferiblemente también incluye un origen de replicación.
Las señales de transcripción y traducción necesarias pueden proporcionarse en un vector de expresión recombinante, o pueden suministrarse por el gen nativo que codifica NET y/o sus regiones flanqueantes.
Los posibles sistemas hospedador-vector incluyen, pero sin limitación, sistemas de células de mamífero infectadas con virus (por ejemplo, virus vaccinia, adenovirus, etc.); sistemas de células de insecto infectadas con virus (por ejemplo, baculovirus); microorganismos tales como levaduras que contienen vectores de levadura; o bacterias transformadas con bacteriófagos, ADN, ADN plasmídico o ADN cosmídico. Los elementos de expresión de los vectores varían en sus intensidades y especificidades. Dependiendo del sistema hospedador-vector utilizado, puede usarse cualquiera de varios elementos de transcripción y traducción adecuados.
Una proteína NET recombinante, o fragmento funcional, derivado, construcción quimérica o análogo de la misma, puede expresarse cromosómicamente, después de la integración de la secuencia recombinante por recombinación. A este respecto, puede usarse cualquiera de varios sistemas de amplificación para conseguir altos niveles de expresión génica estable (véase Sambrook et al., 1989, supra).
La célula en la que está el vector recombinante que comprende el ácido nucleico que codifica NET se cultiva en un medio de cultivo celular apropiado en condiciones que permiten la expresión de NET por la célula.
Para construir vectores de expresión que contienen un gen que consiste en las señales de control de la transcripción/traducción apropiadas y las secuencias codificantes de la proteína, puede usarse cualquiera de los métodos descritos previamente para la inserción de fragmentos de ADN en un vector de clonación. Estos métodos pueden incluir técnicas sintéticas y técnicas de ADN recombinante in vitro y recombinación in vivo (recombinación genética).
La expresión de la proteína NET puede controlarse por cualquier elemento promotor/potenciador conocido en la técnica, pero estos elementos reguladores deben ser funcionales en el hospedador seleccionado para la expresión. Los promotores que pueden usarse para controlar la expresión del gen de NET incluyen, pero sin limitación, la región promotora temprana de SV40 (Benoist y Chambon, 1981, Nature 290:304-310), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus del Sarcoma de Rous (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797), el promotor de timidina quinasa de herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de metalotioneína (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); vectores de expresión procarióticos tales como el promotor de la b-lactamasa (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731), o el promotor tac (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25); véase también "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242:74-94; elementos promotores de levadura u otros hongos tales como el promotor de Gal 4, el promotor de ADC (alcohol deshidrogenasa), el promotor de PGK (fosfoglicerol quinasa), el promotor de la fosfatasa alcalina; y regiones de control de la transcripción de animales, que presentan especificidad de tejidos y se han utilizado en animales transgénicos: región de control del gen de la elastasa I que es activo en células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); región de control del gen de insulina que es activo en células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), región de control del gen de inmunoglobulina que es activo en células linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), región de control del virus de tumor mamario de ratón que es activo en testículo, mama, células linfoides y mastocitos (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495), región de control del gen de albúmina que es activo en hígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276), región de control del gen de la alfa-fetoproteína que es activo en hígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58), región de control del gen de alfa 1-antitripsina que es activo en hígado (Kelsey et al., 1987, Genes y Devel. 1:161-171), región de control del gen de la beta-globina que es activo en células mieloides (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94), región de control del gen de la proteína básica de mielina que es activo en células oligodendrocíticas del cerebro (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712), región de control del gen de la cadena ligera-2 de miosina que es activo en músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-286) y región de control de la hormona de liberación gonadotrópica que es activo en el hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).
En la expresión de las secuencias de ADN de esta invención puede emplearse una amplia diversidad de combinaciones de hospedador/vector de expresión. Los vectores de expresión útiles, por ejemplo, pueden consistir en segmentos de secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético. Los vectores adecuados incluyen derivados de SV40 y plásmidos bacterianos conocidos, por ejemplo, los plásmidos de E. coli col E1, pCR1, pBR322, pMal-C2, pET, pGEX (Smith et al., 1988, Gene 67:31-40), pMB9 y sus derivados, plásmidos tales como RP4; ADN de fago, por ejemplo, los numerosos derivados del fago 1, por ejemplo, NM989, y otros ADN de fago, por ejemplo, ADN monocatenario de fago M13 y filamentoso; plásmidos de levadura tales como el plásmido 2m o derivados del mismo; vectores útiles en células eucariotas tales como vectores útiles en células de insecto o de mamífero; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago, tales como plásmidos que se han modificado para emplear ADN de fago u otras secuencias de control de la expresión; y similares.
Por ejemplo, en un sistema de expresión de baculovirus, pueden usarse tanto vectores de transferencia sin fusión, tales como pero sin limitación pVL941 (sitio de clonación BamH1; Summers), pVL1393 (sitio de clonación BamH1, SmaI, XbaI, EcoR1, NotI, XmaIII, BglII, y PstI; Invitrogen), pVL1392 (sitio de clonación BglII, PstI, NotI, XmaIII, EcoRI, XbaI, SmaI, y BamH1; Summers e Invitrogen), y pBlueBacIII (sitio de clonación BamH1, BglII, PstI, NcoI, y HindIII, siendo posible la selección de recombinantes de color azul/blanco; Invitrogen), como vectores de transferencia de fusión tales como, pero sin limitación, pAc700 (sitio de clonación BamH1 y KpnI, donde el sitio de reconocimiento BamH1 empieza con el codón de iniciación; Summers), pAc701 y pAc702 (igual que pAc700, con diferentes fases de lectura), pAc360 (sitio de clonación BamH1 36 pares de bases cadena abajo de un codón de iniciación de polihedrina; Invitrogen (195)), y pBlueBacHisA, B, C (tres fases de lectura diferentes, con sitio de clonación BamH1, BglII, PstI, NcoI, y HindIII, un péptido N-terminal para la purificación de ProBond, y selección recombinante de color azul/blanco de las placas; Invitrogen (220)).
Los vectores de expresión de mamífero contemplados para uso en la invención incluyen vectores con promotores inducibles tales como el promotor de la dihidrofolato reductasa (DHFR), por ejemplo, cualquier vector de expresión con un vector de expresión de DHFR, o un vector de co-amplificación de DHFR/metotrexato, tal como pED (sitio de clonación PstI, SalI, SbaI, SmaI, y EcoRI, expresando el vector tanto el gen clonado como DHFR; véase Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology, 16.12 (1991)). Como alternativa, puede usarse un vector de co-amplificación de glutamina sintetasa/metionina sulfoximina, tal como pEE14 (sitio de clonación HindIII, XbaI, SmaI, SbaI, EcoRI, y BclI, en el que el vector expresa la glutamina sintasa y el gen clonado; Celltech). En otra realización, puede usarse un vector que dirige la expresión episomal bajo el control del Virus de Epstein Barr (EBV), tal como pREP4 (sitio de clonación BamH1, SfiI, XhoI, NotI, NheI, HindIII, NheI, PvuII, y KpnI, Repetición Terminal Larga del Virus del Sarcoma de Rous constitutivo (RSV-LTR) marcador de selección de higromicina; Invitrogen), pCEP4 (sitio de clonación BamH1, SfiI, XhoI, NotI, NheI, HindIII, NheI, PvuII, y KpnI, el gen temprano inmediato de citomegalovirus humano constitutivo (hCMV), marcador de selección de higromicina; Invitrogen), pMEP4 (sitio de clonación KpnI, PvuI, NheI, HindIII, NotI, XhoI, SfiI, BamH1, promotor del gen de la metalotioneína IIa inducible, marcador de selección de higromicina; Invitrogen), pREP8 (sitio de clonación BamH1, XhoI, NotI, HindIII, NheI, y KpnI, promotor de RSV-LTR, marcador de selección de histidinol; Invitrogen), pREP9 (sitio de clonación KpnI, NheI, HindIII, NotI, XhoI, SfiI, y BamHI, promotor de RSV-LTR, marcador de selección de G418; Invitrogen), y pEBVHis (promotor de RSV-LTR, marcador de selección de higromicina, péptido N-terminal purificable por medio de una resina ProBond y escindido por enteroquinasa; Invitrogen). Los vectores de expresión de mamífero que pueden seleccionarse para uso en la invención incluyen pRc/CMV (sitio de clonación HindIII, BstXI, NotI, SbaI, y ApaI, selección con G418; Invitrogen), pRc/RSV (sitio de clonación HindIII, SpeI, BstXI, NotI, XbaI, selección con G418; Invitrogen), y otros. Los vectores de expresión de mamífero de virus Vaccinia (véase, Kaufman, 1991, supra) para uso de acuerdo con la invención incluyen, pero sin limitación, pSC11 (sitio de clonación SmaI, selección con TK- y b-gal), pMJ601 (sitio de clonación SalI, SmaI, AflI, NarI, BspMII, BamHI, ApaI, NheI, SacII, KpnI, y HindIII; selección con TK- y b-gal), y pTKgptF1S (sitio de clonación EcoRI, PstI, SalI, AccI, HindII, SbaI, BamHI, y Hpa, selección con TK o XPRT).
De acuerdo con la invención también pueden usarse sistemas de expresión en levadura para expresar NET. Por ejemplo, de acuerdo con la invención puede emplearse el vector pYES2 sin fusión (sitio de clonación XbaI, SphI, ShoI, NotI, GstXI, EcoRI, BstXI, BamH1, SacI, Kpn1, y HindIII; Invitrogen) o la fusión pYESHisA, B, C (sitio de clonación XbaI, SphI, ShoI, NotI, BstXI, EcoRI, BamH1, SacI, KpnI, y HindIII, péptido N-terminal purificado con resina ProBond y escindido con enteroquinasa; Invitrogen), por mencionar sólo dos.
Una vez que se ha identificado y aislado una molécula de ADN recombinante particular, pueden usarse varios métodos conocidos en la técnica para propagarla. Una vez establecido un sistema hospedador y las condiciones de crecimiento adecuadas, pueden propagarse y prepararse grandes cantidades de vectores de expresión recombinante. Como se ha explicado previamente, los vectores de expresión que pueden usarse incluyen, pero sin limitación, los siguientes vectores o sus derivados: virus humanos o animales tales como virus vaccinia o adenovirus; virus de insectos tales como baculovirus; vectores de levadura; vectores de bacteriófago (por ejemplo, lambda), y vectores de ADN plasmídico y cosmídico, por nombrar algunos.
Además, puede elegirse una célula hospedadora que module la expresión de las secuencias insertadas o modifique y procese el producto génico de la forma específica deseada. Las diferentes células hospedadoras tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento traduccional y post-traduccional y la modificación de proteínas. Pueden elegirse líneas celulares o sistemas hospedadores apropiados para asegurar la modificación y el procesamiento deseados de la proteína extraña expresada. La expresión en levadura puede producir un producto biológicamente activo. La expresión en células eucariotas puede aumentar la probabilidad de replegamiento "nativo". Además, la expresión en células de mamífero puede proporcionar una herramienta para reconstituir o constituir la actividad de NET. Además, diferentes sistemas de expresión de vector/hospedador pueden afectar a las reacciones de procesamiento, tales como escisiones proteolíticas, en una medida diferente.
Se introducen vectores en las células hospedadoras deseadas por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, DEAE dextrano, precipitación con fosfato cálcico, lipofección (fusión de lisosomas), uso de una pistola génica o un transportador de vector de ADN (véase, por ejemplo, Wu et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967; Wu and Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263:14621-14624; Hartmut et al., Solicitud de Patente Canadiense Nº 2.012.311, presentada el 15 de marzo de 1990).
Pueden obtenerse formas solubles de la proteína recogiendo el fluido de cultivo o solubilizando cuerpos de inclusión, por ejemplo, por tratamiento con detergente, y si se desea sonicación u otros procesos mecánicos como se han descrito anteriormente. La proteína solubilizada o soluble puede aislarse usando diversas técnicas tales como electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), enfoque isoeléctrico, electroforesis en gel bidimensional, cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, de afinidad; de inmunoafinidad y cromatografía en columna por tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, inmunoprecipitación o por cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas.
Anticuerpos contra NET
De acuerdo con la invención, como antígeno o inmunógeno para generar anticuerpos que reconocen el polipéptido NET puede usarse un polipéptido NET producido de manera recombinante o por síntesis química, y fragmentos u otros derivados o análogos del mismo, incluyendo proteínas de fusión. Una molécula es "antigénica" cuando puede interaccionar de forma específica con una molécula de reconocimiento de antígeno del sistema inmune, tal como una inmunoglobulina (anticuerpo) o un receptor de antígenos de células T. Un polipéptido antigénico contiene al menos aproximadamente 5 y preferiblemente al menos aproximadamente 10 aminoácidos. Una parte antigénica de una molécula puede ser la parte que es inmunodominante para el reconocimiento del anticuerpo o el receptor de células T, o puede ser una parte usada para generar un anticuerpo contra la molécula por conjugación de la parte antigénica con una molécula de soporte para la inmunización. Una molécula que es antigénica no necesita ser inmunogénica, es decir, capaz de inducir una respuesta inmune sin un soporte.
Estos anticuerpos incluyen, pero sin limitación, anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos, monocatenarios, fragmentos Fab, y una biblioteca de expresión de Fab. Los anticuerpos anti-NET de la invención pueden presentar reacción cruzada, por ejemplo, pueden reconocer NET de diferentes especies. Los anticuerpos policlonales tienen mayor probabilidad de presentar reacción cruzada. Como alternativa, un anticuerpo de la invención puede ser específico para una sola forma de NET, tal como NET murino. Preferiblemente, dicho anticuerpo es específico para el polipéptido NET humano.
Para la producción de anticuerpos policlonales contra el polipéptido NET o un derivado o análogo del mismo pueden usarse diversos procedimientos conocidos en la técnica. Para la producción de anticuerpos, diversos animales hospedadores pueden inmunizarse por inyección con el polipéptido NET, o un derivado (por ejemplo, fragmento o proteína de fusión) del mismo, incluyendo pero sin limitación conejos, ratones, ratas, ovejas, cabras, etc. En una realización, el polipéptido NET o el fragmento del mismo puede conjugarse con un soporte inmunogénico, por ejemplo, albúmina de suero bovino (BSA) o hemocianina de lapa californiana (KLH). Para aumentar la respuesta inmunológica pueden usarse diversos adyuvantes dependiendo de la especie de hospedador, que incluyen pero sin limitación adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles pluronic, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.
Para la preparación de anticuerpos monoclonales dirigidos hacia el polipéptido NET o un fragmento, análogo derivado del mismo, puede usarse cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo. Estas técnicas incluyen, pero sin limitación, la técnica de hibridoma desarrollada originalmente por Kohler y Milstein [Nature 256:495-497 (1975)], así como la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de células B humanas [Kozbor et al., Immunology Today 4:72 1983); Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030 (1983)], y la técnica de EBV-hibridoma para producir anticuerpos monoclonales humanos [Cole et al., en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)]. En una realización adicional de la invención, pueden producirse anticuerpos monoclonales en animales en la línea germinal [Publicación de Patente Internacional Nº WO 89/12690, publicada el 28 de diciembre de 1989]. De hecho, de acuerdo con la invención, pueden usarse técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" [Morrison et al., J. Bacteriol. 159:870 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985)] por empalme de los genes de una molécula de anticuerpo de ratón específica para un polipéptido NET junto con genes procedentes de una molécula de anticuerpo humana de la actividad biológica apropiada; estos anticuerpos están dentro del alcance de esta invención. Estos anticuerpos quiméricos humanos o humanizados se prefieren para uso en terapia de enfermedades o trastornos humanos (descritos más adelante), ya que los anticuerpos humanos o humanizados tienen mucha menos probabilidad que los anticuerpos xenogénicos de inducir una respuesta inmune, en particular una respuesta alérgica, por sí mismos.
De acuerdo con la invención, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos Fv monocatenarios (scFv) [Patentes de Estados Unidos Nº 5.476.786 y 5.132.405 de Huston; Patente de Estados Unidos 4.946.778] pueden adaptarse para producir anticuerpos monocatenarios específicos para el polipéptido NET. Otra realización de la invención utiliza las técnicas descritas para la construcción de bibliotecas de expresión de Fab [Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989)] para permitir una identificación rápida y fácil de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada por un polipéptido NET, o sus derivados o análogos.
Pueden generarse fragmentos de anticuerpo que contienen el idiotipo de la molécula de anticuerpo por técnicas conocidas. Por ejemplo, estos fragmentos incluyen, pero sin limitación: El fragmento F(ab')_{2} que puede producirse por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo; los fragmentos Fab' que pueden generarse reduciendo los enlaces disulfuro del fragmento F(ab')_{2} y los fragmentos Fab que pueden generarse tratando la molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor.
En la producción de anticuerpos, la selección del anticuerpo deseado puede realizarse por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, radioinmunoensayo, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima), inmunoensayos de tipo "sandwich", ensayos inmunorradiométricos, reacciones de precipitación de difusión de gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ (usando oro coloidal, marcadores enzimáticos o radioisotópicos, por ejemplo), transferencias de western, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (por ejemplo, ensayos de aglutinación en gel, y ensayos de hemaglutinación), ensayos de fijación del complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis, etc. En una realización, la unión del anticuerpo se detecta detectando un marcador en el anticuerpo primario. En otra realización, el anticuerpo primario se detecta detectando la unión de un anticuerpo secundario o reactivo al anticuerpo primario. En otra realización, el anticuerpo secundario está marcado. Se conocen muchos métodos en la técnica para detectar la unión en un inmunoensayo y están dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, para seleccionar anticuerpos que reconocen un epítopo específico de un polipéptido NET, se pueden ensayar hibridomas generados para detectar un producto que se una a un fragmento del polipéptido NET que contiene dicho epítopo. Para la selección de un anticuerpo específico contra un polipéptido NET de una especie particular de animal, se puede seleccionar basándose en la unión positiva con el polipéptido NET expresado o aislado a partir de células de esa especie de animal.
Los anticuerpos anteriores pueden usarse en métodos conocidos en la técnica relacionados con la localización y actividad del polipéptido NET, por ejemplo, para transferencia de Western, formación de imágenes del polipéptido NET in situ, medición de sus niveles en muestras fisiológicas apropiadas, etc, usando cualquiera de las técnicas de detección mencionadas anteriormente o conocidas en la técnica.
En una realización específica, pueden generarse anticuerpos que agonizan o antagonizan la actividad del polipéptido NET. Estos anticuerpos pueden ensayarse usando los ensayos descritos más adelante para identificar ligandos. En particular, estos anticuerpos pueden ser anticuerpos scFv expresados intracelularmente.
Ensayos de Selección
La identificación de un papel de Net en la angiogénesis permite diseñar y seleccionar nuevos compuestos anti- o pro-angiogénicos. Por consiguiente, además del diseño racional de agonistas y antagonistas basándose en la estructura del polipéptido NET, la presente invención contempla un método alternativo para identificar ligandos específicos de NET usando diversos ensayos de selección conocidos en la técnica.
Para seleccionar agonistas o antagonistas de NET o para seleccionar antagonistas de la unión de NET/ADN puede usarse cualquier método de selección conocido en la técnica.
La presente invención contempla selecciones de ligandos de molécula pequeña, análogos de ligando y miméticos, así como selecciones de ligandos naturales que se unen y agonizan o antagonizan el polipéptido NET in vivo. Por ejemplo, pueden seleccionarse bibliotecas de productos naturales usando ensayos de la invención para moléculas que agonizan o antagonizan la actividad de NET.
Las moléculas o compuestos que agonizan o antagonizan la actividad de NET y/o que modulan la interacción NET/ADN pueden proporcionar nuevas formas para prevenir y/o tratar patologías que implican una regulación anómala de la expresión de genes controlados por Net y/o patologías relacionadas con una regulación anómala de la angiogénesis.
A este respecto, la invención también proporciona un método para tratar a un individuo que tiene necesidad de inhibir o activar la actividad NET o que tiene necesidad de regular la expresión de genes bajo el control del factor de transcripción NET, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de moléculas o compuestos que agonizan o antagonizan la actividad NET y/o que modulan la interacción NET/ADN. La invención proporciona el uso de estas moléculas o compuestos para la preparación de un medicamento.
La identificación y selección de antagonistas se facilita adicionalmente determinando características estructurales de la proteína, por ejemplo, usando cristalografía de rayos X, difracción de neutrones, espectrometría de resonancia magnética nuclear y otras técnicas para la determinación de la estructura. Estas técnicas proporcionan el diseño racional o la identificación de agonistas y antagonistas.
Otra estrategia usa bacteriófago recombinante para producir bibliotecas grandes. Usando el "método de fago" [Scott y Smith, 1990, Science 249:386-390 (1990); Cwirla, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:6378-6382 (1990); Devlin et al., Science, 249:404-406 (1990)], pueden construirse bibliotecas muy grandes (10^{6}-10^{8} entidades químicas). Una segunda estrategia usa métodos principalmente químicos, de los que son ejemplos el método de Geysen [Geysen et al., Molecular Immunology 23:709-715 (1986); Geysen et al. J. Immunologic Method 102:259-274 (1987)] y el método de Fodor et al. [Science 251:767-773 (1991)]. Furka et al. [14th International Congress of Biochemistry, Volume 5, Abstract FR:013 (1988); Furka, Int. J. Peptide Protein Res. 37:487-493 (1991)], Houghton [Patente de Estados Unidos Nº 4.631.211, expedida en diciembre de 1986] y Rutter et al. [Patente de Estados Unidos Nº 5.010.175, expedida el 23 de abril de 1991] describen métodos para producir una mezcla de péptidos que pueden ensayarse como agonistas o antagonistas.
En otro aspecto, pueden usarse bibliotecas sintéticas [Needels et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:10700-4 (1993); Ohlmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926 (1993); Lam et al., Publicación de Patente Internacional Nº WO 92/00252; Kocis et al., Publicación de Patente Internacional Nº WO 9428028, pudiendo incorporarse en este documento como referencia en su totalidad cada uno de los textos indicados], y similares, para seleccionar ligandos de NET de acuerdo con la presente invención.
La selección puede realizarse con células recombinantes que expresan NET, o como alternativa, usando proteína purificada, por ejemplo, producida de forma recombinante, como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, la capacidad de NET soluble marcado que incluye la parte de unión al ADN de NET o la parte de unión a la proteína de NET puede usarse para seleccionar bibliotecas como se ha descrito en las referencias anteriores.
En una realización, NET puede marcarse directamente. En otra realización, puede usarse un reactivo secundario marcado para detectar la unión de NET a una molécula de interés, por ejemplo, una molécula unida a un soporte en fase sólida. La unión puede detectarse por la formación in situ de un cromóforo por un marcador enzimático. Las enzimas adecuadas incluyen, pero sin limitación, fosfatasa alcalina y peroxidasa de rábano picante. En otra realización, puede usarse un ensayo de dos colores, usando dos sustratos cromogénicos con dos marcadores enzimáticos en diferentes moléculas aceptoras de interés. Los ligandos con reacción cruzada y con una sola reacción pueden identificarse con un ensayo de dos colores.
Otros marcadores para uso de la invención incluyen perlas de látex coloreadas, perlas magnéticas, marcadores fluorescentes (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceno (FITC), ficoeritrina (PE), rojo Texas (TR), rodamina, sales de la serie de los lantánidos libres o queladas, especialmente Eu^{3+}, por nombrar algunos fluoróforos), moléculas quimioluminiscentes, radio-isótopos o marcadores de formación de imágenes de resonancia magnética. Pueden realizarse ensayos de dos colores con dos o más perlas de látex coloreadas o fluoróforos que emiten a diferentes longitudes de onda. El compuesto marcado puede detectarse visualmente o por medios mecánicos/ópticos. Los medios mecánicos/ópticos incluyen clasificación activada por fluorescencia, es decir, un método análogo a FACS, y medios de eliminación de micromanipulador.
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Como se ejemplifica en este documento, el nivel de la proteína NET puede evaluarse por medio del marcaje metabólico de las proteínas. Como el marcaje metabólico se produce durante la incubación in vitro de la biopsia de tejido en presencia de medio de cultivo suplementado con [^{35}S]-metionina, el nivel de cada uno de los marcadores detectados puede verse afectado por las condiciones in vitro. Además del marcaje metabólico (o biosintético) con [^{35}S]-metionina, la invención además contempla el marcaje con [^{14}C]-aminoácidos y [^{3}H]-aminoácidos (con el tritio sustituido en posiciones no lábiles). De esta manera, una muestra o biblioteca de compuestos puede analizarse directamente después del marcaje de las proteínas, por ejemplo, por tinción colorimétrica usando plata, oro, azul de coomassie, o amido-schwartz, por mencionar algunas técnicas; marcaje isotópico, por ejemplo, con [^{32}P]-ortofosfato, [^{125}I], [^{131}I]; señales fluorescentes o quimioluminiscentes; y detección inmunológica con un anticuerpo marcado o una molécula de unión específica a un marcador.
También pueden usarse ADNc de NET y derivados en un sistema doble-híbrido en la selección en levaduras para identificar ligandos de NET, agonistas o antagonistas de la unión de NET/ADN y para identificar proteínas que puedan fosforilar o prevenir la fosforilación de Net.
Modulador de la actividad del factor de transcripción Net
Los solicitantes identificaron varios compuestos como moduladores del factor de transcripción Net tales como el inhibidor de la ruta de señalización de p38 SB203580: 4-[5-(4-fluorofenil)4-(4-(piridinil)-1H-imidazol-2-il]fenil metil sulfóxido o inhibidores de la ruta de señalización de ERK: PD98059 2-(2-amino-3-metoxifenil)-4H-cromen-4-ona y U0126: 1,4-diamino-2,3-diciano-1,4 bis[2-aminofeniltio]butadieno
Composiciones farmacéuticas
Cualquier compuesto o molécula antisentido de NET que pueda identificarse, preferiblemente se introducirá in vivo en un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiológicamente tolerables y típicamente no producen una reacción alérgica o similar indeseada, tal como acidez gástrica, mareos y similares, cuando se administra a un ser humano. Preferiblemente, como se usa en este documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del estado federal o un gobierno estatal o indicado en la Farmacopea de Estados Unidos u otra farmacopea reconocida generalmente para uso en animales, y más particularmente en seres humanos. El término "excipiente" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el cual se administra el compuesto. Estos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles tales como agua y aceites, incluyendo los procedentes de petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Como excipientes preferiblemente se emplean agua o soluciones salinas acuosas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol, particularmente para soluciones inyectables. Se describen excipientes farmacéuticos en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E.W. Martin.
Animales Transgénicos
El término "animal" se usa en este documento para incluir todos los animales vertebrados, excepto los seres humanos. También incluye un animal individual en todas las fases de desarrollo, incluyendo la fase embrionaria y fetal. Un "animal transgénico" es un animal que contiene una o más células que llevan la información genética recibida, directa o indirectamente, por manipulación genética deliberada a un nivel subcelular, tal como por microinyección o infección con virus recombinantes. Esta molécula de ADN introducida puede integrarse dentro de un cromosoma o puede ser un ADN de replicación extra-cromosómica. La expresión "animal transgénico en la línea de células germinales" se refiere a un animal transgénico en el que la información genética se introdujo en una célula de la línea germinal, confiriendo de esta manera la capacidad de transferir la información a la descendencia. Si esta descendencia efectivamente posee parte o toda la información, entonces también son animales transgénicos.
La información puede ser extraña para la especie de animal a la que pertenece el receptor, extraña únicamente al receptor individual particular o puede ser una información genética que ya tenía el receptor. En este último caso, el gen introducido puede expresarse de diferente manera en comparación con el gen endógeno nativo.
Los genes pueden obtenerse por aislamiento a partir de fuentes genómicas, por preparación de ADNc a partir de plantillas de ARN aisladas, por síntesis dirigida o por alguna combinación de estas técnicas.
Para expresarse, un gen debe estar unido operativamente a una región reguladora. Las regiones reguladoras, tales como promotores, pueden usarse para aumentar, reducir, regular o designar a ciertos tejidos o a ciertas fases de desarrollo la expresión de un gen. No es necesario que el promotor sea un promotor natural. Los "animales transgénicos no humanos" de la invención se producen por medio de la introducción de "transgenes" en la línea germinal del animal no humano. Los métodos que permiten la introducción de ADN en las células generalmente están disponibles y son bien conocidos en la técnica. Podrían usarse diferentes métodos de introducción de transgenes. Generalmente, el cigoto es la mejor diana para la microinyección. En el ratón, el pronúcleo masculino alcanza un tamaño de aproximadamente 20 \mum de diámetro, que permite la inyección reproducible de 1-2 pl de solución de ADN. El uso de cigotos como diana para la transferencia génica tiene una ventaja importante. En la mayoría de los casos, el ADN inyectado se incorporará en el gen hospedador antes de la primera escisión (Brinster, et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 4438-4442). Por consiguiente, casi todas las células del animal transgénico no humano llevarán el transgén incorporado. Generalmente, esto también tendrá como resultado la transmisión eficaz del transgén a la descendencia del fundador ya que 50% de las células germinales llevarán el transgén. Un método preferido para incorporar transgenes en la puesta en práctica de la invención es la microinyección de cigotos.
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También puede usarse infección retroviral para introducir un transgén en un animal no humano. El embrión no humano en desarrollo puede cultivarse in vitro hasta la fase de blastocisto. Durante este tiempo, los blastómeros pueden ser dianas de la infección retroviral (Jaenich, R. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 1260-1264). Se consigue una infección eficaz de los blastómeros por tratamiento enzimático para retirar la zona pelúcida (Hogan et al., (1986) in Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). El sistema de vector viral usado para introducir el transgén típicamente es un retrovirus con defectos de replicación que lleva el transgén (Jahner et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6927-6931; Van der Putten et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-6152). La transfección se obtiene fácil y eficazmente cultivando los blastómeros en una monocapa de células productoras de virus (Van der Putten, supra; Stewart et al., (1987) EMBO J. 6:383-388). Como alternativa, la infección puede realizarse en una etapa posterior. Pueden inyectarse virus o células productoras de virus en el blastocele (Jahner et al., (1982) Nature 298:623-628). La mayoría de los animales fundadores serán un mosaico para el transgén ya que la incorporación se produce únicamente en una subserie de las células que formaron el animal transgénico no humano. Además, el animal fundador puede contener inserciones retrovirales del transgén en una diversidad de posiciones del genoma; éstas generalmente se segregan en la descendencia. Además, también es posible introducir transgenes en la línea germinal, aunque con muy poca eficacia, por infección retroviral intrauterina del embrión en las fases intermedias de su gestación (Jahner et al., (1982) supra).
Un tercer tipo de célula diana para la introducción de transgenes es la célula madre embrionaria (ES). Las células ES se obtienen a partir de la pre-implantación de embriones cultivados in vitro (Evans, M.J., et al., (1981) Nature 292, 154-156; Bradley, A., et al. (1984) Nature 309, 255-258; Gossler, et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 9065-9060; y Robertson, et al., (1986) Nature 322, 445-448). Los transgenes pueden introducirse de forma eficaz en células ES por transfección con ADN o por transducción mediada por retrovirus. Las células ES transformadas resultantes posteriormente pueden combinarse con blastocistos de un animal no humano. Las células ES colonizan el embrión y contribuyen a la línea germinal del animal quimérico resultante (Como revisión, véase, Jaenisch, R. (1988) Science 240, 1468-1474).
Los métodos para evaluar la presencia del ADN introducido así como su expresión están disponibles y son bien conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero sin limitación, hibridación (de Southern) de ADN para detectar el ADN exógeno, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y transferencias de Western para detectar ADN, ARN y proteína. Los métodos incluyen técnicas inmunológicas e histoquímicas para detectar MDM2.
Como se usa en este documento, un "transgén" es una secuencia de ADN introducida en la línea germinal de un animal no humano por medio de la intervención humana tal como se indica en los Ejemplos descritos más adelante.
Terapia Génica y Vectores Transgénicos
Como se ha descrito anteriormente, un "vector" es cualquier medio para la transferencia de un ácido nucleico de acuerdo con la invención en una célula hospedadora. Los vectores preferidos son vectores virales, tales como retrovirus, virus del herpes, adenovirus y virus asociados a adeno. De esta manera, un gen o un ADNc que codifica el polipéptido NET o un fragmento del dominio polipeptídico de NET, o NET ScFv o NET mutante dominante del mismo o una molécula antisentido de NET se introduce in vivo, ex vivo, o in vitro usando un vector viral o por medio de la introducción directa del ADN. La expresión en tejidos diana puede realizarse dirigiendo el vector transgénico a células específicas, tal como con un vector viral o un ligando de receptor, o usando un promotor con especificidad de tejidos, o ambas cosas.
Los vectores de expresión de la invención pueden usarse, como se ha indicado anteriormente, tanto para transfectar células para la selección o ensayo biológico de moduladores de la actividad NET, como para la liberación de un gen net o gen antisentido de net in vivo o ex vivo para terapia génica, por ejemplo, para aumentar o reducir el nivel de actividad de NET. Un vector que expresa un scFv anti-NET también puede introducirse usando las técnicas descritas más adelante.
Los vectores virales habitualmente usados para la dirección in vivo o ex vivo y procedimientos de terapia son vectores basados en ADN y vectores retrovirales. Se conocen en la técnica métodos para construir y usar vectores virales [véase, por ejemplo, Miller y Rosman, BioTechniques 7:980-990 (1992)]. Preferiblemente, los vectores virales son deficientes en la replicación, es decir, no son capaces de replicarse autónomamente en la célula diana. En general, el genoma de los vectores virales deficientes en la replicación que se usan en el alcance de la presente invención carecen de al menos una región que es necesaria para la replicación del virus en la células infectada. Estas regiones pueden eliminarse (por completo o en parte), o volverse no funcionales por cualquier técnica conocida por un especialista en la técnica. Estas técnicas incluyen la retirada total, sustitución (por otras secuencias, en particular por el ácido nucleico insertado), deleción o adición parcial de una o más bases en una región esencial (para la replicación). Dichas técnicas pueden realizarse in vitro (sobre el ADN aislado) o in situ, usando las técnicas de manipulación genética o por tratamiento con agentes mutagénicos. Preferiblemente, el virus deficiente en la replicación retiene las secuencias de su genoma que son necesarias para encapsular las partículas virales.
Los vectores virales de ADN incluyen un virus de ADN atenuado o deficiente, tal como, pero sin limitación, virus del herpes simple (HSV), papilomavirus, virus de Epstein Barr (EBV), adenovirus, virus adeno-asociado (AAV), virus vaccinia, lentivirus, y similares. Los virus deficientes, que carecen completamente o casi completamente de los genes virales, son preferidos. Un virus deficiente no es competente para la replicación después de la introducción en una célula, y por lo tanto no conduce a una infección viral productiva. El uso de vectores virales deficientes permite la administración a células en un área específica, localizada, sin problemas de que el vector pueda infectar a otras células. Por lo tanto, puede fijarse como objetivo específicamente un tejido específico. Los ejemplos de vectores particulares incluyen, pero sin limitación, un vector del virus del herpes 1 (HSV1) deficiente [Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330 (1991)], un vector del virus del herpes deficiente que carece de un gen de la glico-proteína L [Publicación de Patente RD 371005 A], u otros vectores del virus del herpes deficientes [Publicación de Patente Internacional Nº WO 94/21807, publicada el 29 de septiembre de 1994; Publicación de Patente Internacional Nº WO 92/05263, publicada el 2 de abril de 1994]; un vector de adenovirus atenuado; tal como el vector descrito por Stratford-Perricaudet et al. [J. Clin. Invest. 90:626-630 (1992); véase también La Salle et al., Science 259:988-990 (1993)]; y un vector de virus adeno-asociado deficiente [Samulski et al., J. Virol. 61:3096-3101 (1987); Samulski et al., J. Virol. 63:3822-3828 (1989); Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996 (1988)].
Preferiblemente, para la administración in vivo, se emplea un tratamiento inmunosupresor apropiado junto con el vector viral, por ejemplo, vector de adenovirus, para evitar la inmunodesactivación del vector viral y las células transfectadas. Por ejemplo, pueden administrarse citoquinas inmunosupresoras, tales como interleuquina-12 (IL-12), interferón-\gamma (IFN-\gamma), o anticuerpo anti-CD4, para bloquear las respuestas inmunes humorales o celulares contra los vectores virales [véase, por ejemplo, Wilson, Nature Medicine (1995)]. Además, es ventajoso emplear un vector viral que esté modificado genéticamente para expresar una cantidad mínima de antígenos.
La invención contempla el suministro de un vector que expresará una cantidad terapéuticamente eficaz de NET antisentido o NET ScFv o NET dominante mutante para aplicaciones de terapia génica. Los ejemplos de NET dominante mutante son tales como C12 o GAL-N6 que se proporcionan en Maira et al. (EMBO J. (1996) 15:5849-65). La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se usa en este documento para indicar una cantidad suficiente para reducir en al menos aproximadamente 15%, preferiblemente en aproximadamente 50%, más preferiblemente en aproximadamente 90% la actividad NET, y más preferiblemente para prevenir una inhibición clínicamente significativa de la actividad NET o la mala regulación de la expresión de los genes controlados por NET. Como alternativa, una cantidad terapéuticamente eficaz es suficiente para causar una mejora en un estado clínicamente significativo en el hospedador.
Como alternativa, la invención contempla el suministro de un vector que expresara una cantidad terapéuticamente eficaz de NET para aplicaciones de terapia génica. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se usa en este documento para indicar una cantidad suficiente para reducir en al menos aproximadamente 15%, preferiblemente en al menos 50%, más preferiblemente en al menos 90%, y más preferiblemente prevenir un déficit clínicamente significativo en la actividad, función y respuesta del hospedador. Como alternativa, una cantidad terapéuticamente eficaz es suficiente para causar una mejora en un estado clínicamente significativo en el hospedador.
Cualquier vector, viral o no viral, de la invención se introducirá preferiblemente in vivo en un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiológicamente tolerables y no producen típicamente una reacción alérgica o similar indeseada, tal como acidez gástrica, mareos y similares, cuando se administra a un ser humano. Preferiblemente, como se usa en este documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal, o indicada en la Farmacopea de Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, y más particularmente en seres humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el que se administra el compuesto. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los derivados de petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Preferiblemente se emplean agua o soluciones salinas acuosas y soluciones de dextrosa y glicerol acuosas como vehículos, particularmente para soluciones inyectables. Se describen vehículos farmacéuticos adecuados en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin.
Vectores adenovirales
En una realización preferida, el vector es un vector adenoviral. Los adenovirus son virus de ADN eucarióticos que pueden modificarse para suministrar de forma eficaz un ácido nucleico de la invención a una diversidad de tipos celulares. Existen diversos serotipos de adenovirus. De estos serotipos, se da preferencia, dentro del alcance de la presente invención, al uso de adenovirus humanos de tipo 2 o tipo 5 (Ad 2 o Ad 5) o adenovirus de origen animal (véase el documento WO94/26914). Los adenovirus de origen animal que pueden usarse dentro del alcance de la presente invención incluyen adenovirus de origen canino, bovino, murino (ejemplo: Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovino, porcino, aviar, y de simio (ejemplo: SAV). Preferiblemente, el adenovirus de origen animal es un adenovirus canino, más preferiblemente un adenovirus CAV2 (por ejemplo, la cepa Manhattan o A26/61 (ATCC VR-800), por ejemplo).
Preferiblemente, los vectores adenovirales deficientes en la replicación de la invención comprenden las ITR, una secuencia de encapsidación y el ácido nucleico de interés. Aún más preferiblemente, al menos la región E1 del vector adenoviral es no funcional. La deleción en la región E1 se extiende preferiblemente desde los nucleótidos 455 a 3329 en la secuencia del adenovirus Ad5 (fragmento PvuII-BglII) o 382 a 3446 (fragmento HinfII-Sau3A) . También pueden modificarse otras regiones, en particular la región E3 (documento WO95/02697), la región E2 (documento WO94/28938), la región E4 (documentos WO94/28152, WO94/12649 y WO95/02697), o en cualquiera de los genes tardíos L1-L5.
En una realización preferida, el vector adenoviral tiene una deleción en la región E1 (Ad 1.0). Se describen ejemplos de adenovirus delecionados en E1 en el documento EP 185.573, cuyo contenido se incorpora en este documento como referencia. En otra realización preferida, el vector adenoviral tiene una deleción en las regiones E1 y E4 (Ad 3.0). Se describen ejemplos de adenovirus delecionados en E1/E4 en el documento WO95/02697 y el documento WO96/22378, cuyos contenidos se incorporan en este documento como referencia. En otra realización preferida más, el vector adenoviral tiene una deleción en la región E1 en la que se inserta la región E4 y la secuencia de ácido nucleico (véase el documento FR94 13355, cuyo contenido se incorpora en este documento como referencia).
Los adenovirus recombinantes deficientes en la replicación de acuerdo con la invención pueden prepararse por cualquier técnica conocida por los especialistas en la técnica (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, documento EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particular, pueden prepararse por recombinación homóloga entre un adenovirus y un plásmido que lleva, entre otros, la secuencia de ADN de interés. La recombinación homóloga se realiza después de la cotransfección del adenovirus y el plásmido en una línea celular apropiada. La línea celular que se emplea debe preferiblemente (i) ser transformable por dichos elementos, y (ii) contener las secuencias que son capaces de complementar la parte del genoma del adenovirus deficiente en la replicación, preferiblemente en forma integrada para evitar los riesgos de recombinación. Son ejemplos de líneas celulares que pueden usarse la línea celular de riñón embrionario humano 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) que contiene la parte izquierda del genoma del adenovirus Ad5 (12%) integrado en su genoma, y líneas celulares que son capaces de complementar las funciones de E1 y E4, como se describe en las solicitudes WO94/26914 y WO95/02697. Los adenovirus recombinantes se recuperan y purifican usando técnicas de biología molecular convencionales, que son bien conocidas para los especialistas en la técnica. La invención también se refiere, por lo tanto, a un adenovirus recombinante deficiente cuyo genoma incluye una secuencia que codifica un gen o un ADNc que codifica NET o un fragmento del dominio polipetídico de NET del mismo, o NET ScFv o NET mutante dominante.
Vectores virales asociados a adeno
Los virus asociados a adeno (AAV) son virus de ADN de tamaño relativamente pequeño que pueden integrarse, de un modo estable y con espedificidad de sitio, en el genoma de las células que infectan. Son capaces de infectar un amplio espectro de células sin inducir ningún efecto sobre el crecimiento, morfología o diferenciación celular, y no parecen estar implicados en patologías humanas. Se ha clonado, secuenciado y caracterizado el genoma de AAV. Incluye aproximadamente 4700 bases y contiene una región repetida terminal invertida (ITR) de aproximadamente 145 bases en cada extremo, que sirve como origen de replicación para el virus. El resto del genoma está dividido en dos regiones esenciales que llevan las funciones de encapsidación: la parte izquierda del genoma, que contiene el gen rep implicado en la replicación viral y la expresión de los genes virales; y la parte derecha del genoma, que contiene el gen cap que codifica las proteínas de la cápsida del virus.
Se ha descrito el uso de vectores derivados de los AAV para transferir genes in vitro e in vivo (véanse los documentos WO 91/18088; WO 93/09239; US 4.797.368, US 5.139.941, EP 488 528). Estas publicaciones describen diversas construcciones derivadas de AAV en las que los genes rep y/o cap están delecionados y reemplazados por un gen de interés, y el uso de estas construcciones para transferir dicho gen de interés in vitro (en células cultivadas) o in vivo, (directamente en un organismo). Los AAV recombinantes deficientes en la replicación de acuerdo con la invención pueden preparase cotransfectando un plásmido que contiene la secuencia de ácido nucleico de interés flanqueada por dos regiones repetidas terminales invertidas (ITR) de AAV, y un plásmido que lleva los genes de encapsulación de AAV (genes rep y cap), en una línea celular que está infectada con un virus auxiliar humano (por ejemplo un adenovirus). Los recombinantes AAV que se producen después se purifican por técnicas convencionales.
La invención también se refiere, por lo tanto, a un virus recombinante derivado de AAV cuyo genoma abarca una secuencia que codifica un gen o un ADNc que codifica NET o un fragmento del dominio polipeptídico de NET del mismo, o NET ScFv o NET mutante dominante flanqueado por las ITR de AAV. La invención también se refiere a un plásmido que abarca una secuencia que codifica NET o un fragmento del dominio polipeptídico de NET del mismo, o NET ScFv o NET mutante dominante flanqueado por dos ITR de un AAV. Dicho plásmido puede usarse como tal para transferir la secuencia de ácido nucleico, con el plásmido, cuando sea apropiado, incorporado en un vector liposomal (pseudo-virus).
Vectores retrovirales
En otra realización el gen net o el ADNc que codifica NET o el fragmento del dominio polipeptídico de NET del mismo, o NET ScFv o NET mutante dominante puede introducirse en un vector retroviral, por ejemplo, como se describe en Anderson et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.399.346; Mann et al., 1983, Cell 33:153; Temin et al., Patente de Estados Unidos Nº 4.650.764; Temin et al., Patente de Estados Unidos Nº 4.980.289; Markowitz et al., 1988, J. Virol. 62:1120; Temin et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.124.263; documentos EP 453242, EP178220; Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689; Publicación de Patente Internacional Nº WO 95/07358, publicada el 16 de marzo de 1995, por Dougherty et al.; y Kuo et al., 1993, Blood 82:845. Los retrovirus son virus integrantes que infectan a las células en división. El genoma retroviral incluye dos LTR, una secuencia de encapsulación y tres regiones codificantes (gag, pol y env). En vectores retrovirales recombinantes, los genes gag, pol y env están generalmente delecionados, por completo o en parte, y reemplazados por una secuencia de ácido nucleico heteróloga de interés. Estos vectores pueden construirse a partir de diferentes tipos de retrovirus, tales como, VIH, MoMuLV ("virus de la leucemia de Moloney murina" MSV ("virus del sarcoma de Moloney murino"), HaSV ("virus del sarcoma de Harvey"); SNV ("virus de necrosis del bazo"); RSV ("virus del sarcoma de Rous") y virus Friend. Se describen vectores retrovirales deficientes en el documento WO95/02697.
En general, para construir retrovirus recombinantes que contienen una secuencia de ácido nucleico se construye un plásmido, que contiene la LTR, la secuencia de encapsulación y la secuencia codificante. Esta construcción se usa para transfectar una línea celular de empaquetamiento, siendo capaz dicha línea celular de suministrar en trans las funciones retrovirales que están deficientes en el plásmido. En general, las líneas celulares de empaquetamiento son por lo tanto capaces de expresar los genes gag, pol y env. Dichas líneas celulares de empaquetado se han descrito en la técnica anterior, en particular la línea celular PA317 (US4 861.719); la línea celular PsiCRIP (documento WO90/02806) y la línea celular GP+envAm-12 (documento WO89/07150). Además, los vectores retrovirales recombinantes pueden contener modificaciones en las LTR para suprimir la actividad transcripcional así como secuencias de encapsulación extensivas que pueden incluir una parte del gen gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Los vectores retrovirales recombinantes se purifican por técnicas convencionales conocidas por los especialistas en la técnica.
Pueden construirse vectores retrovirales que funcionen como partículas de infección o para experimentar una única ronda de transfección. En el primer caso, el virus está modificado para retener todos sus genes excepto los responsables de las propiedades de transformación oncogénica, y para expresar un gen o un ADNc que codifica NET o un fragmento del dominio polipeptídico de NET del mismo, o NET ScFv o NET mutante dominante. Se preparan vectores virales no infecciosos para destruir la señal viral de empaquetamiento, pero que retengan los genes estructurales necesarios para empaquetar el virus co-introducido modificado genéticamente para que contenga el gen heterólogo y las señales de empaquetamiento. Por tanto, las partículas virales que se producen no son capaces de producir virus adicionales.
Se describe el suministro de genes dirigidos en la Publicación de Patente Internacional WO 95/28494, publicada en octubre de 1995.
Vectores no virales
Como alternativa, el vector que comprende un gen o un ADNc que codifica NET o un fragmento del dominio polipeptídico de NET del mismo, o NET ScFv o NET mutante dominante puede introducirse in vivo por lipofección. Durante la pasada década, ha estado aumentando el uso de liposomas para la encapsulación y transfección de ácidos nucleicos in vitro. Pueden usarse lípidos catiónicos sintéticos diseñados para limitar las dificultades y riesgos encontrados con la transfección mediada por liposomas para preparar liposomas para la transfección in vivo de un gen que codifica un marcador [Felgner, et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413-7417 (1987); véase Mackey, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8027-8031 (1988); Ulmer et al., Science 259:1745-1748 (1993)]. El uso de lípidos catiónicos puede promover la encapsulación de ácidos nucleicos cargados negativamente, y también puede promover la fusión con membranas celulares cargadas negativamente [Felgner y Ringold, Science 337:387-388 (1989)]. Se describen compuestos y composiciones lipídicas particularmente útiles para transferir ácidos nucleicos en las Publicaciones de Patente Internacional WO95/18863 y WO96/17823, y en la Patente de Estados Unidos Nº 5.459.127. El uso de lipofección para introducir genes exógenos en organismos específicos in vivo tiene ciertas ventajas prácticas. La dirección molecular de liposomas a células específicas representa un área de beneficio. Queda claro que dirigir la transfección a tipos celulares particulares sería particularmente ventajoso en un tejido con heterogeneidad celular, tal como el páncreas, hígado, riñón, y el cerebro. Los lípidos pueden unirse químicamente a otras moléculas para el propósito de dirigirlos [véase Mackey, et. al., supra]. Los péptidos dirigidos, por ejemplo, hormonas o neurotransmisores, y proteínas tales como anticuerpos, o moléculas no peptídicas podrían unirse a liposomas químicamente.
También son útiles otras moléculas para facilitar la transfección de un ácido nucleico in vivo, tal como un oligopéptido catiónico (por ejemplo, Publicación de Patente Internacional WO95/21931), péptidos derivados de proteínas de unión a ADN (por ejemplo, Publicación de Patente Internacional WO96/25508), o un polímero catiónico (por ejemplo, Publicación de Patente Internacional WO95/21931).
También es posible introducir el vector in vivo como un plásmido de ADN desnudo. Los vectores de ADN desnudos para terapia génica pueden introducirse en las células hospedadoras deseadas por método conocidos en la técnica, por ejemplo, transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, DEAE dextrano, precipitación con fosfato cálcico, el uso de una pistola génica, o el uso de un transportador de vectores de ADN [véase, por ejemplo, Wu et al., J. Biol. Chem, 267:963-967 (1992); Wu and Wu, J. Biol. Chem. 263:14621-14624 (1988); Hartmut et al., Solicitud de Patente Canadiense Nº 2.012.311, presentada el 15 de marzo de 1990; Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726-2730 (1991)]. También pueden usarse estrategias de suministro de ADN mediado por receptor [Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3:147-154 (1992); Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)].
La invención también se refiere, por lo tanto, a un plásmido que comprende una secuencia que codifica un gen o un ADNc que codifica NET o un fragmento del dominio polipeptídico de NET del mismo, o NET ScFv o NET mutante dominante
La presente invención pueden entenderse por referencia a los siguientes ejemplos no limitantes, que se proporcionan como ejemplares de la invención.
Material y método Plásmidos y Líneas celulares
pCEFL, pCEFL-GPCR, p601D-NET-antisentido y p601D (vector vacío) se han descrito en Giovane et al. (Genes Dev. 1994, 8, 1502-13).
Ga14-N5 se ha descrito en Maira et al. (EMBO J. (1996) 15:5849-65)
pRAS V12, \Delta Ras, se han descrito en Giovane et al. (Genomics (1995) 29:769-72.)
Formación de microtúbulos
a. Se transfectaron células NIH3T3 (C11) por la técnica de fosfato cálcico con pCEFL-KSHVGPCR (promotor EF12 de ratón) y el vector de expresión AntiNet o el vector vacío correspondiente (p601D: Beddinton et al. 1989, Development 106:37-46). 16 horas después de aplicar el precipitado, las células se lavaron dos veces con DMEM, se incubaron en DMEM con FCS al 0,05% durante 48 horas. Se recogió el medio y se ensayó inmediatamente o se almacenó a -80ºC.
b. Se cultivaron células HUVEC (pase 4-6) en DMEM/F12K que contenían FCS al 10%, Heparina (50 ng/ml), ECGF (Factor de Crecimiento de Células Endoteliales, Sigma, 50 ng/ml) y Glutamina (2 mM).
c. Se recubrieron los pocillos de placas de 24 pocillos con 120 ml/pocillo de Matriz MATRIGEL con Factor de Crecimiento Reducido (Collaborative Biomedical Products) a 4ºC y se incubaron durante 30 min a 37ºC.
d. Se resuspendieron células HUVEC tratadas con tripsina en DMEM/F12K que contenía FCS al 0,5-1,0%, Heparina (50 ng/ml) y Glutamina (2 mM) y después se sembraron en los pocillos recubiertos con Matriz (10.000 células por pocillo). Una vez unidas las células (alrededor de 4-6 horas), se añadieron los medios acondicionados de la etapa "a" (1:1 volumen:volumen). Las placas se observaron después de 16-24 horas.
e. Inhibición de anticuerpo Anti-VEGF y estimulación de VEGF recombinante de la actividad angiogénica in vitro. Se incubaron medios acondicionados de la etapa "a" con 0,2 mg/ml de anticuerpo policlonal anti-VEGF de ratón (R&D) o con 50 ng/ml de VEGF humano recombinante (R&D) durante 1 hora a 37ºC, y después se añadieron a la Matriz aplicada con recubrimiento y los pocillos sembrados con HUVEC como en la etapa "d".
Se observaron las placas después de 16-24 horas.
Genotipificación de células ES, embriones y ratones
Se aisló el ADN genómico de células ES o biopsias de la cola y se resuspendieron en 100 \mul de Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM. Para determinar el genotipo, se digirieron 15 \mul de DNA con XbaI, y se analizaron por transferencia de Southern usando una sonda de 3,8 kb aislada de la región 3' fuera de la construcción de dirección. Para un análisis de rutina, se genotipificaron los ratones por PCR usando los cebadores específicos de alelo: UC54 (SEC ID Nº 5), UC56 (SEC ID Nº 6) y UC57 (SEC ID Nº 7). Las condiciones de PCR fueron un ciclo a 94ºC durante 2 min seguido de 30 ciclos a 94ºC durante 30 seg, 64ºC durante 30 seg y 72ºC durante 45 seg, y 1 ciclo a 72ºC durante 5 min. Se usaron 0,5 \mul de ADN en una reacción de 25 \mul que contenía 200 ng de cada cebador más los reactivos de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Sigma). El tamaño de los productos fue 1550 pb de tipo silvestre y 1300 pb del alelo dirigido.
Protocolo de RT-PCR
Se extrajo el ARN de los tejidos del ratón con Trizol (Gibco/BRL) como se especifica por el fabricante. Se usó 1 \mug del ARN total para la transcripción inversa con diferentes cebadores específicos de exón. Las condiciones para la reacción de amplificación se describen por Giovane et al. (Genomics, 1995, 29: 769-72). El par de cebadores usado fue el siguiente:
EX1 (SEC ID Nº 8)/EX2a (SEC ID Nº 9):
CTAGAAATCTCCCCAAGAAGACTC/GTTGTCGTCATAGTATCTCAGCGC
EX2b (SEC ID Nº 10)/EX3a (SEC ID Nº 11):
TGCTGGACATCGAACGATGGCGAG/ACTTGTACACAAACTTCTGCCCGA
EX3b (SEC ID Nº 12)/EX4 (SEC ID Nº 13):
CTGGAGCCCCTGAATCTGTCATCG/TCGAGGCCAGAAACAGTCCACTTG
EX1 (SEC ID Nº 8)/EX3a (SEC ID Nº 11)
CTAGAAATCTCCCCAAGAAGACTC/ACTTGTACACAAACTTCTGCCCGA
Los productos de PCR se analizaron por electroforesis en geles de poliacrilamida al 5%, tiñendo con bromuro de etidio, y visualización en U.V.
Transferencias de Western
Se extrajeron los tejidos con tampón RIPA (NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, ácido desoxicólico al 0,5%, SDS al 0,1%, Tris-HCl 50 mM pH 8,0, 2 \mug/ml de aprotinina, 2 \mug/ml de leupeptina, y 100 mg/ml de fluoruro de fenilmetilsulfonilo) usando un homogeneizador Ultraturax. Se sometieron a electroforesis las proteínas (200-300 mg) en SDS PAGE al 10%, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se detectaron con el anticuerpo 375 purificado y el kit de detección de quimioluminiscencia potenciada (Amersham).
Ejemplos Ejemplo 1 La angiogénesis inducida por KSHV/HHV8 ORF 74 está mediada por Net
El virus del sarcoma de Kaposi (KSHV/HHV8) estimula la angiogénesis (Boshoff, Nature, 391, 24-25 (1998). Su ORF 74 codifica un receptor acoplado a la proteína G (GPCR) que se transforma e induce un fenotipo angiogénico a través de una ruta que implica las cascadas de señalización de ERK y p38 quinasa y VEGFa. La expresión de GPCR en NIH3T3 induce la secreción de factores angiogénicos en el medio, principalmente VEGFa (Bais et al., 1998). El medio acondicionado inducía la formación de microtubos por las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) que habían crecido en Matrigel (Fig. 1a) y anticuerpos contra VEGFa neutralizan esta actividad (Fig. 1b) [véase (Bais et al., Nature, 391, 86-89 (1998)].
Para determinar si Net está implicada en la angiogénesis inducida por KSVH/HHV8 ORF74, se ensayó la formación de microtúbulos por medio acondicionado a partir de células que expresan GPCR cuando Net está regulada negativamente por su ARN de net antisentido o un mutante Net trans-dominante (Gal.Net 219-409 = Ga14.N5).
La técnica es esencialmente como se describe en (Bais et al., 1998). Se mantuvieron células NIH3T3 en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía suero bovino fetal al 10% (FCS) y se transfectó por el método de fosfato cálcico con BBS en placas de 6 pocillos con pCEFL-GPCR solo; pCEFL-GPCR con p601D-Net-antisentido o p601D-Net-transdominante. 16 horas después, se lavaron las células y se mantuvieron en medio nuevo durante 24 horas. Antes de la incubación con las células HUVEC, se incubaron algunos de los medios acondicionados con: (b) 0,2 \mug/ml de anticuerpo policlonal anti-VEGF de ratón (IgG de total de cabra; R&D SYSTEMS) o con (d y f) 10 ng/ml de VEGF humano recombinante (R&D) durante 1 hora a 21ºC. Se recubrieron los pocillos de una placa de 24 pocillos con 150 \mul por pocillo de MATRIGEL (Becton Dickinson Labware) y se incubó durante 30 min a 37ºC. Se añadieron células HUVEC en medio con suero bovino al 10% (10^{5} por pocillo) y se añadieron los medios acondicionados una vez que unidas las células. Se observaron las placas durante 24 horas (contraste de fase, ampliación original, 40 aumentos).
Se inhibió la formación de microtúbulos por el medio acondicionado a partir de las células que expresan GPCR cuando Net está regulado negativamente por su ARN de net antisentido (Fig. 1c) o un mutante de Net trans-dominante (Gal.Net 219-409; Fig. 1e).
La producción de VEGFa está implicada en esta inhibición ya que añadiendo VEGFa al medio acondicionado se restauraba la actividad inductora de microtúbulos (compárense las Figs. 1d y c, y 1f y 1e).
El medio acondicionado de NIH3T3 que expresa GPCR estimula la proliferación de células HUVEC que crecen en placas de cultivo [véase (Bais et al., 1998)]. Para determinar el efecto de la regulación negativa de Net sobre la proliferación inducida por GPCR de HUVEC, se ensayó la proliferación celular de HUVEC cuando Net está regulada negativamente por ARN de net antisentido o un mutante de Net trans-dominante (Gal.Net 219-409, TD).
Se transfectaron células NIH3T3 como se ha descrito anteriormente con el vector de control para GPCR (pCEFL); el vector para GPCR con el vector de control para Net antisentido (p60ID); los vectores para GPCR y Net antisentido o Net transdominante (TD). Se añadieron células HUVEC (10^{5}) en medio con suero bovino al 10% por pocillo (grupos de 6 pocillos, Costar 3516), y se añadieron medios acondicionados una vez unidas las células. 48 horas después, las células se trataron con tripsina, se resuspendieron en 1 ml de medio y se contaron las células vivas después de tinción con azul tripán.
Los resultados demuestran que la regulación negativa de Net con ARN de net antisentido o una proteína trans-dominante (TD) reducía la proliferación inducida por GPCR de HUVEC (Fig. 2). El control demostró que el medio acondicionado de NIH3T3 que expresa GPCR estimula la proliferación de células HUVEC que crecen en placas de cultivo [véase la Fig. 2, compárese GPCR y el vector de control].
En los siguientes ejemplos, se descubrió que el mecanismo de angiogénesis inducida por GPCR a través de Net implicaba la activación por GPCR de las cascadas de señalización de ERK y la MAP quinasa p38, la fosforilación de Net endógena, la activación de la transcripción del promotor de VEGFa, y la secreción del péptido VEGFa.
Ejemplo 2 El mecanismo de la angiogénesis inducida por GPCR a través de Net implica la fosforilación de Net endógena
La fosforilación de Net endógena se siguió con un anticuerpo fosfo-específico que reconoce la fosfoserina 365, que es importante para la activación inducida por fosforilación de Net por las cascadas de señalización de ERK y
p38.
Se transfectaron células NIH3T3 como se ha descrito anteriormente con el vector de control para GPCR (pCEFL) o el vector para GPCR (pCEFL-GPCR). Catorce horas después, las células se lavaron y se dejaron en el medio de crecimiento durante 2,5 horas. Después se trataron las células con SB 203580 (10 \muM) (Alexis Corp.) o U0126 (10 \muM) (Promega) durante 30 min. Después de 6 horas, se analizaron los extractos por SDS-PAGE y transferencia de Western con anticuerpos contra fosfo-serina 365 Net [Anticuerpo 2F3, Giovane et al. (Genomics (1995) 29:769-72)] o ERK activada (Promega).
Los resultados se presentan en la figura 3. La fosforilación de Net inducida por GPCR (calles 1,2), y la inducción fue dependiente de las rutas de p38 y ERK, como se muestra por los inhibidores SB 203580 y U 0126, respectivamente (calles 3, 4; obsérvese que SB 203580 no inhibía la activación de ERK en las condiciones usadas).
Se alcanzaron conclusiones similares siguiendo la fosforilación de Net transfectada, y en un ensayo de trans-activación usando Gal4-Net (219-409) (datos no mostrados). Estos datos demuestran que GPCR induce la fosforilación y activación de Net a través de las rutas ERK y p38. Se deduce que los inhibidores de la ruta p38 o la ruta ERK deben evitar la fosforilación de NET y por tanto evitar la angiogénesis inducida por GPCR.
Ejemplo 3 El mecanismo de angiogénesis inducida por GPCR a través de Net implica la activación de la transcripción del promotor de VEGFa
Se ensayó el papel de Net sobre la activación del promotor de VEGF por GPCR cuando Net está regulada negativamente por ARN de net antisentido.
Se transfectaron células NIH3T3 como se ha descrito anteriormente por el vector de control de GPCR (pCEFL) + vector de control de Net antisentido (p601D); pCEFL+antiNet; GPCR+p601D; GPCR + AntiNet con los indicadores: mdm2-Luc; p21-Luc; VEGF-Luc y pCMV-LacZ. Se recogieron las células, se lisaron y se realizaron ensayos de luciferasa según técnicas convencionales.
Se descubrió que GPCR activa el promotor de VEGFa en ensayos de transactivación (véase la figura 4). La regulación negativa de Net con antisentido inhibía la activación por GPCR del promotor de VEGFa. Parece ser que la regulación negativa es específica porque net antisentido no afectaba las actividades de los promotores mdm2 y p21 WAF1 en presencia de GPCR
Ejemplo 4 El mecanismo de la angiogénesis inducida por GPCR a través de Net implica la secreción del péptido VEGFa
Para ensayar si la expresión de GPCR en fibroblastos inducía la secreción del péptido VEGFa, se transfectaron cantidades iguales de células NIH3T3 como se ha descrito anteriormente por pCEFL (vector de GPCR); GPCR+p601D (vector de control para AntiNet); GPCR+AntiNet; \Delta Ras; Ras-V12+p601D; Ras-V12+AntiNet; p601D; AntiNet con el vector de expresión de puromicina. Se añadió puromicina 2 nM después del lavado. Cuarenta y ocho horas después, se recogieron los medios acondicionados y las células se trataron con tripsina , se resuspendieron en 1 ml de medio y se contaron las células vivas después de tinción con azul tripán. Se midieron los niveles de péptido VEGF por ELISA (kit Mouse-VEGF Quantikine, R&D) y se corrigieron los resultados para las cantidades de células.
La expresión de GPCR en fibroblastos indujo la secreción del péptido VEGFa en el medio como se muestra en la figura 5 por comparación del vector GPCR con el vector de control. Net antisentido inhibió la secreción del péptido VEGFa en el medio.
El oncogén Ras estimula tanto la expresión de VEGFa (Arbiser et al., PNAS USA, 94, 861-866 (1997)) como la actividad Net (Giovane et al., Gene Dev, 8, 1502-1513, (1994)).
Los resultados demuestran que la secreción del péptido VEGFa inducida por Ras-V12 se inhibía por net-antisentido.
En condiciones no inducidas, Net es un represor (Giovane et al., 1994). Net antisentido en ausencia de activadores aumentaba los niveles de péptido VEGFa, demostrando que en condiciones basales Net es un represor de la producción de VEGFa.
Este ejemplo demuestra que en ausencia de activador de Net (oncogén Ras, por ejemplo), la inhibición de la expresión de Net o la inhibición de la actividad de Net puede promover la angiogénesis a través del aumento de la secreción del péptido VEGFa.
Este ejemplo también demuestra que cuando Net está activado (por el oncogén Ras por ejemplo), la inhibición de la expresión de Net o la inhibición de la actividad de Net puede inhibir o reducir la angiogénesis a través de una disminución de la secreción del péptido VEGFa.
Este ejemplo también demuestra que cuando Net está activado a través de la fosforilación mediante la ruta ERK y/o p38 (por GPCR, por ejemplo), la inhibición de la expresión de Net o la inhibición de la actividad Net en dicho contexto puede inhibir o reducir la angiogénesis a través de una disminución de la secreción de péptido VEGFa.
La inhibición de la expresión de Net puede obtenerse con Net antisentido, tal como por ejemplo el ADNc completo en orientación inversa en el sitio Eco RI de p601D (Giovane et al. Gene Dev. 1994, 8 1502-13), scFV, ARN bicatenario. La inhibición de la actividad Net puede obtenerse por Net dominante en Gal-Net tal como Gal.N5 o C 12 o por inhibidores de la fosforilación o por inhibidores de la translocación nuclear de Net.
Ejemplo 5 La regulación negativa de NET reduce la secreción de VEGFa
Para estudiar el papel de la regulación negativa de NET sobre la secreción de VEGFa, se prepararon clones estables de células NIH3T3 que expresan GPCR con o sin net antisentido.
Se transformaron células NIH3T3 con vectores que expresan GPCR y el marcador de selección "neomicina", se escogieron clones individuales, se expandieron y se analizaron para la expresión del péptido VEGF en comparación con clones de control transfectados con el vector vacío (Fig. 6).
Se eligieron dos clones típicos y se volvieron a transformar con un vector que expresa net antisentido o el vector de control junto con resistencia a puromicina, y se seleccionaron con puromicina (Fig. 7). Se expandieron varios clones independientes que expresan niveles reducidos de péptido VEGF. El análisis de grupos de clones transformados con Net antisentido demostró que su efecto global es reducir la secreción de VEGFa, de manera similar a los experimentos a corto plazo (véase Fig. 5).
El análisis de los clones por SDS-PAGE y transferencia de Western demostró que la expresión de Net se reducía (véase clones antisentido y de control, Fig. 8; TBP es un control para la carga igual).
La expresión de Elk1, una proteína que es muy homóloga a Net (75% a nivel proteico), no se redujo, demostrando que el antisentido es específico. El antisentido tampoco tuvo efecto sobre la expresión de H-Ras y GPCR (datos no mostrados).
Estos resultados confirman que cuando la actividad de Net se estimula por GPCR, la inhibición de la expresión de Net disminuye la secreción de péptido VEGFa y por lo tanto anti-Net antisentido puede inhibir o reducir la angiogénesis a través de la disminución de la secreción de péptido VEGFa.
Ejemplo 6 La regulación negativa de Net inhibe la formación de tumores GPCR
Para estudiar el papel de Net en la angiogénesis tumoral, se prepararon clones estables de células NIH3T3 que expresaban GPCR con o sin net antisentido (véase el ejemplo 5).
Se estudió el crecimiento tumoral en ratones BalbC nu/nu hembras de 8 semanas a las que se les había inyectado por vía subcutánea clones de GPCR y clones de GPCR-antinet (aproximadamente 10^{6} células por inyección). Los clones de GPCR formaron tumores mayores que los clones de GPCR-net-antisentido (Fig. 9), demostrando que la regulación negativa de Net inhibe la formación tumoral por GPCR.
Para los cinco clones ensayados, la regulación negativa de Net indujo la reducción del volumen del tumor en aproximadamente un 70% (de 210 a 30 mm^{3} de media)
Ejemplo 7 La regulación negativa de Net conduce a tumores hipóxicos
Se observó que los tumores GPCR eran de color rojo y estaban asociados con vasos sanguíneos recién formados inducidos por los tumores (Fig. 10; véanse las flechas). Por el contrario, los tumores GPCR/net antisentido eran pequeños sin vasos sanguíneos externamente visibles.
Se detectaron vasos sanguíneos en los tumores en secciones de parafina con anticuerpos contra CD31 (PECAM-1). Se detectó una vasculatura tumoral densa en los tumores GPCR (Fig. 11, a y c), mientras que los tumores GPCR/net antisentido tenían pocos vasos. El área superficial cubierta por los vasos en los clones de GPCR/net antisentido se redujo en 75% en comparación con los clones de GPCR (Fig. 12). La densidad reducida de los vasos sugiere que las cantidades formadas por los clones de GPCR/net antisentido tienen un nivel de oxígeno inferior. Se analizaron los tumores por inmunohistoquímica de fluorescencia contra EF5, un marcador sustituto para hipoxia (Evans et al., 1997). Se inyectó EF5 (1 mg/ratón) en ratones que tenían tumores y 4 h después se prepararon secciones, se tiñeron con un anticuerpo anti-EF5 acoplado a Cy5, y se analizaron por un microscopio de fluorescencia controlado por ordenador acoplado a una cámara digital. Hubo niveles mucho mayores de unión de EF5 en clones de GPCR/net antisentido en comparación con los clones de GPCR de control (Fig. 13). Estos datos demuestran que los tumores GPCR que carecen de Net son hipóxicos, muy probablemente debido a la reducida densidad de vasos sanguíneos.
Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que Net es necesario para la angiogénesis tumoral. Estos resultados también demuestran que los inhibidores de NET pueden proporcionar fármacos útiles para el tratamiento de tumores sólidos.
Ejemplo 8 Construcción de ratones que llevan la deleción del gen net (ratones mutantes Net \delta)
Se modificó el gen net por recombinación homóloga en ratones. El exón 2, que codifica el dominio de unión a ADN de Net, se reemplazó por el cassette PGK-neo (Fig. 14A).
Clonación del gen Net
Se clonó el gen net a partir de una biblioteca de fagos \lambda EMBL3 que contenían ADN genómico de la cepa de ratón 129/Sv. Se caracterizaron los clones que contenían en el exón 2 por análisis de transferencia de Southern y secuenciación de ADN.
Se construyó el vector de dirección insertando un fragmento de 11,5 kb BamHI-AvaI del extremo 5' del clon genómico net, y un casette de 1,8 kb PGK-neo, y un fragmento de 1,2 kb AvaI-BamHI del extremo 3' del clon genómico net en Vector pBluescript KS.
Alteración dirigida del gen Net
Se escindió la construcción de dirección del vector por digestión con NotI y se introdujo por electroporación en células D4 ES [procedimientos descritos en Deirich and Dollé (1997) Gene targeting in embryonic stem cells. En Methods in Developmental Toxicology and Biology (ed. S.T. Klug, R Thiel) páginas 111-123. Blackwell Science]. Se caracterizó el ADN genómico de clones resistentes a G418 por análisis de transferencia de Southern. Se digirió el ADN con XbaI, y se hibridaron las manchas de transferencia con una sonda que consistía en el fragmento de 3,8 kb NcoI-NcoI del extremo 3' del clon genómico net. El alelo de tipo silvestre produce un fragmento de 13 kb y el alelo mutado un fragmento de 5 kb.
Las células net ES heterocigóticas se inyectaron en blastocistos C57BL/6 para crear un ratón quimérico. Se usó un ratón quimérico que transmitía el alelo Net mutado a través de la línea germinal para generar ratones de la cepa mutante de deleción de Net (Net \delta), en dos fondos genéticos diferentes (129/Sv y C57BL/6). Se exploraron los ratones por PCR con ADN genómico de las colas de los ratones con los cebadores UC54, UC56 y UC57. El alelo de tipo silvestre genera un fragmento de 1550 pb y el alelo mutado genera un fragmento de 1300 pb.
UC54 TGAAACGTGTAATCCTTGTGTCCTC (SEC ID Nº 5)
UC56 TAATTTCCAAGTTCTCGGCACGTAG (SEC ID Nº 6)
UC57 GACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTA (SEC ID Nº 7)
La figura 14(A) es una representación esquemática del alelo Net de tipo silvestre, el vector de dirección y el alelo Net mutante recombinante. El exón 2 delecionado contiene el codón de inicio de la traducción y codifica 1-69 aminoácidos en el dominio de unión a ADN de la proteína Net. Se muestra la posición de la sonda 3' usada para el análisis de transferencia de Southern, así como los fragmentos digeridos con XbaI de 13 kb (tipo silvestre) y 5 kb (alelo mutante); B, BamHI; X, XbaI.
Se alteró el gen, como se muestra por análisis de ADN de ratón por transferencia de Southern (Fig. 14B) y PCR (Fig. 14C; véase Fig. 14A para los cebadores y sondas). La figura 14 (B) representa un análisis de transferencia de Southern de ADN digerido con XbaI de la descendencia de un cruce heterocigoto (+/-). La hibridación usando la sonda 3' produjo bandas correspondientes a fragmentos de 13 kb para el alelo de tipo silvestre (WT) o 5 kb para el alelo dirigido (M). La figura 14 (C) muestra el análisis de PCR de la misma descendencia. El genotipo se indica en la parte superior, la flechas representan los productos de amplificación específicos para el alelo de tipo silvestre (WT, 1550 pb) y el alelo dirigido (M,1300 bp). El conjunto de cebadores de PCR (UC54, UC56, UC57) están indicados en el esquema de dirección. Véase material y método: genotipificación de ES, embriones y ratones.
Los ratones expresaron un nuevo ARNm con corte y empalme alternativo que carece del exón 2 (Fig. 14D) y una proteína mutada que carece del dominio de unión a ADN producido por el inicio de la traducción en el exón 3 (Net \delta, Fig. 14E). La figura 14(D) muestra la detección de transcritos de Net por RT-PCR. Se usó el ARN aislado de embriones E16 de tipo silvestre y mutantes homocigóticos para reacciones de RT-PCR con cebadores de diferentes exones del gen Net (exón 1 a exón 4). Los conjuntos de cebadores de RT-PCR se indican en la parte izquierda del panel. Como se esperaba con la deleción del exón 2, no se observó amplificación en el ARN mutante (-/-) con los conjuntos ex1/ex2 o ex2/ex3. Sin embargo, se observó un producto de amplificación entre el exón 3 y el exón 4 (serie ex3/ex4) en el mutante como el embrión de tipo silvestre. La reacción de RT-PCR entre el exón 1 y el exón 3 (serie ex1/ex3) muestra que existe un producto más pequeño (90 pb) en el embrión mutante homocigoto en comparación con el de tipo silvestre (217 bp). La figura 14(E) muestra el análisis de transferencia de Western de extractos de proteína pulmonar de ratones heterocigóticos y homocigóticos de tipo silvestre de 2 semanas de edad. La cantidad de proteína Net de 49 kDA disminuye en el heterocigoto (+/-), hasta desaparecer completamente en el animal mutante homocigoto (-/-). Sin embargo, aparece una nueva banda de proteína de 42 kDA en el extracto mutante (como con el heterocigoto).
Ejemplo 9 La mutación del gen Net en ratones afecta al sistema vascular
Cuando se cruzaron ratones heterocigóticos +/\delta 129Sv, se descubrió que aproximadamente 25% de la descendencia era homocigótica para la mutación (Fig. 15A), pero en 10 semanas moría aproximadamente 90% de los animales homocigóticos (Fig. 15 B) de insuficiencia respiratoria debido a la acumulación de quilo en la caja torácica (Fig. 15C), una característica del quilotórax. En varios casos se observaron defectos en los vasos sanguíneos, pero con baja penetración (datos no mostrados). El examen histológico de secciones de ratones con quilotórax mostró que los ratones mutantes homocigóticos tenían vasos linfáticos dilatados (linfagiectasis; Fig. 16, véase lv), indicativo de defectos en el drenaje linfático debido a defectos estructurales o en las redes en el sistema circulatorio. Se identificaron los vasos linfáticos usando ratones knock-in VEGF-R3-\beta-gal heterocigóticos que expresan \beta-galactosidasa en vasos linfáticos (Dumont et al., 1998). Sobre este fondo, en ratones net \delta/\delta con quilotórax, se dilataron los vasos linfáticos en la caja torácica (Fig. 17A + B) pero no en el corazón (C+D) o en la dermis (E + F). Se observaron vasos dilatados en la caja torácica de ratones \delta/\delta de 5 días de edad sin quilotórax (G & H), y tan pronto como 17,5 dpc (datos no mostrados).
El fenotipo de vasos linfáticos en ratones 129Sv, y el fenotipo de vasos sanguíneos observado en algunos ratones, podría ser un efecto directo de la pérdida de función de Net en células endoteliales, donde se expresa de forma elevada.
Ejemplo 10 Net se expresa de forma elevada en células endoteliales
Se estudió la expresión de Net durante la embriogénesis por hibridación in-situ sobre preparaciones completas (Figs. 18, 19) y secciones (Figs. 20, 21). En E7.5, la expresión de net y VEGF-R2 (un marcador de células endoteliales) son bastante similares (Fig. 20, B y C). En E8.5 net y VEGF-R2 se co-expresan en el plexo capilar primario del saco vitelino (Fig. 18, E-F), que está experimentando vasculogénesis, así como en el endocardio (Fig. 20, H-I) y en el alantoides (Fig. 18, J & K). En E9.5 y E10.5 se co-expresan en vasos intersomáticos, en la aorta (Fig. 19, A B, E, F), y en vasos cefálicos principales (Fig. 19). Después, en E12.5, E14.5, y E16.5, hay muchas regiones de co-expresión de net y VEGF-R2, incluyendo la cola, el hígado, el corazón, los pulmones y el intestino (Fig. 20 G-L), que demuestran que net se expresa de forma elevada en células endoteliales. Sin embargo, hay diferencias en la expresión de net y VEGF-R2, principalmente porque net se expresa de forma elevada en regiones de diferenciación de cartílago (Fig. 21; G-J). La expresión de Net durante la vasculogénesis y la angiogénesis puede explicar el efecto de la mutación net en ratones (quilotórax).
Ejemplo 11 El gen Egr-1 es un gen diana para Net
Además, se ha descubierto que Egr-1 se sobre-expresa en el hígado y en algunos vasos sanguíneos principales de embriones net \delta/\delta (datos no mostrados). Egr-1 es un gen temprano inmediato con motivos SRE, y por tanto esto demuestra que Egr-1 es un gen diana para Net.
Es interesante observar que Egr-1 está implicado en patología vascular (Silverman y Collins, 1999) y (Yan et al. J. Clin Invest. 2000 Mar; 105(5): 553-4). Es necesario para la formación de la neoíntima después de una lesión mecánica debida principalmente a angioplastia. También es necesaria para la deposición de fibrina en la vasculatura durante hipoxemia, aparentemente a través de su regulación del factor tisular: Existe una expresión sostenida en lesiones ateroscleróticas, especialmente en células de músculo liso. Los ratones \delta/\delta net sugieren que la regulación negativa de Net aumenta la actividad de Egr-1. Por lo tanto, restaurar la actividad represora de Net debe ser útil en el tratamiento de reestenosis después de angioplastia y en el tratamiento de aterosclerosis.
Ejemplo 12 Net en condiciones normales es un represor de la angiogénesis
Se investigó el papel de Net en la angiogénesis con la técnica de incisión en la córnea. Esta técnica se ha descrito por Yoshida et al., (Histol. Histopathol., 14, 1287-1294 (1999)).
Se redujo la angiogénesis inducida por bFGF en ratones net \delta/\delta en comparación con sus equivalentes de tipo silvestre (Fig. 22), que demuestra que Net es necesario para la angiogénesis inducida por bFGF.
También se estudió la angiogénesis por crecimiento de células endoteliales desde anillos aórticos aislados en condiciones basales. Esta técnica se ha descrito por Brown et al., (Lab. Invest, 75, 539-555 (1996)).
Hubo un crecimiento aumentado a partir de los ratones mutantes (Fig. 23). Este resultado se correlaciona con el efecto de net antisentido en suero (condiciones basales), que es aliviar la represión de Net y estimular consecuentemente los niveles de péptido VEGF (Fig. 5).
Estos resultados demuestran que la angiogénesis en condiciones basales está inhibida por Net. Estos resultados también sugieren que la sobre-expresión de Net, o la restauración de la expresión de Net en células mutadas en Net conducirá a un aumento en el control de la angiogénesis
Ejemplo 13 Selección de agentes que modulan la actividad de NET en mamíferos
Los resultados anteriores proporcionan claras evidencia de un papel de Net en la angiogénesis, como un intermedio en las rutas de señalización de GPCR o Ras para la producción de VEGF. Por lo tanto, los compuestos que previenen la activación de Net por GPCR o Ras deben proporcionar fármacos antiangiogénicos útiles.
Pueden diseñarse varios tipos de ensayos de exploración tales como ensayo de genes indicadores celulares, interacción NET/ADN, interacción proteína/proteína en levaduras, ensayo de fosforilación.
13-A) Ensayo de gen indicador celular para Ga14-Net(C-term)/gen indicador gal4 (células transformadas con Ras o células activadas por un estímulo angiogénico)
Este ensayo se describe como un ensayo de gen indicador doble genérico, basado en células, en formato de 384 pocillos. Se obtuvieron dos líneas celulares transformadas humanas transfectadas de forma estable con un sistema de gen indicador:
Un clon HCT116 que expresa de forma estable 1) una proteína de fusión entre el dominio de unión a ADN de GAL4 y el dominio de transactivación de Net (dominio-C) y 2) el gen indicador de luciferasa de Renilla bajo el control del promotor de GAL4.
Para evitar la selección de moléculas que interfieran de forma no específica con la actividad transcripcional, se proporciona un control negativo con un clon de carcinoma de colon SW480, que expresa elevados niveles de proteína \beta-catenina, y que expresa de forma estable el gen indicador de luciferasa de Luciérnaga bajo el control, en este ensayo particular, de un promotor dependiente de factor de células T/Lef o cualquier otro ensayo de genes indicadores bajo el control de un promotor no relacionado con la familia del Factor de Complejo Ternario.
El ensayo comprende cuatro etapas: (i) Sembrar las dos líneas celulares de interés en una placa de 384 pocillos, incubación a 37ºC durante una noche (Medio: D-MEM sin rojo fenol + FCS al 10% filtrado a 0,22 \mum; (ii), adición de los compuestos candidatos; (iii), adición de reactivo LucLite (Packard, Kit FireLite); Lectura de la señal de luciferasa de Luciérnaga sobre Microbeta^{TM} Trilux (EG&G Wallac) (lectura de la transcripción dependiente de \beta-catenina) después de 24 horas de incubación (control negativo) y (iv), adición de reactivo RenLite; Lectura de la señal de luciferasa de Renilla en Microbeta^{TM} Trilux (EG&G Wallac) (lectura de la transcripción dependiente de NET).
Las moléculas de interés inhiben la luciferasa de Renilla pero no inhiben la actividad de luciérnaga para el ensayo de NET (inhibidores de Net). También pueden encontrarse activadores en esta selección seleccionando un activador de la actividad de Renilla.
13-B) Interacción Net/ADN
Esta propiedad de Net puede demostrarse en varias situaciones experimentales:
- un ensayo de desplazamiento en gel (Giovane et al. Gene Dev. 1994, 8, 1502-13).
- la cuantificación de un oligonucleótido marcado (2-cadenas) retenido en proteína Net. La secuencia del oligonucleótido marcado se obtiene de la secuencia SRE; la proteína Net puede expresarse parcialmente -dominio de interacción con ADN- o de longitud completa en células eucariotas o procariotas (en E. coli o en baculovirus) y preferentemente como una proteína de fusión (His, HA, GST, myc....) para facilitar su purificación. El oligonucleótido marcado puede ser por ejemplo la SEC ID Nº 14 5' TCGAGCCGGAAGTGACGTCGA 3' (véase Giovane et al. Gene Dev. 1994, 8, 1502-13)
13-C) Interacción proteína/proteína en levaduras 13-C-1. Interacción de Net/SRF en SRE en levaduras
Este ensayo consiste en la selección de pequeñas moléculas capaces de inhibir la transcripción dependiente de Net, en la levadura Saccharomyces cerevisiae, inhibiendo la necesidad de que Net interaccione previamente con SRF para la unión en SRE.
- La cepa de levadura CL9, que se usa generalmente como herramienta de exploración para el sistema 2-híbrido, se transfecta con un sistema indicador dependiente de la transcripción dependiente de GAL4. La reconstrucción a través de la interacción proteína/proteína de un factor de transcripción funcional conduce a la expresión de un gen indicador. Aquí, esta reconstrucción artificial de un factor de transcripción híbrido sólo se requiere parcialmente porque se usa la capacidad de las proteína de interés de unirse a una secuencia SRE específica en el ADN. Para evitar tener un elevado efecto de fondo, se usan las siguientes construcciones:
- Se clonó ADNc parcial de Net restringido a los aa 133-265 de los dominios A y B (domino de unión a ADN y dominio de unión a SRF) en un plásmido de expresión de levaduras (con un marcador de selección)
- Se clonó el ADNc parcial de SRF (restringido a los dominios de interacción con Net e interacción con SRE) en fase con el dominio de transactivación de Gal4 en el plásmido pGAD10 (Clontech)
- Se clonó el elemento SRE 5' TACACAGGATGTCCATATTAGGACA 3' (SEC ID Nº 15) como la secuencia promotora de un plásmido indicador que conduce a la expresión de un gen indicador como la beta-galactosidasa, URA3 o CAN1, LEU2, HIS3, CYH2, GFP,... (la proteína informadora tiene la capacidad de detectarse por un ensayo colorimétrico, fluorimétrico o enzimático).
Se transformaron tres plásmidos (1 \mug de cada plásmido) en la cepa de levadura por un tratamiento con LiAC/PEG como se describe por Gietz et al. (1995, studies on the transformation of intact yeast cells by LiAC/SS-DNA/PEG procedure. Yeast, 11: 355-360). La expresión de Net y SRF conduce a la expresión del gen indicador, según interaccionan las proteínas. La cepa de levaduras se permeabiliza por la introducción de mutantes en la familia de genes PDR o en el gen ERG6. Estos genes están implicados en procesos de destoxificación.
La cepa de levadura se cultiva en medio mínimo YNB (Base Nitrogenada de Levaduras (sin aminoácidos) - 6,7 g/l; Glucosa (20 g/l) con o sin agar para apoyar la gelificación.
Las moléculas pequeñas que inhiben la interacción proteína/proteína conducen al crecimiento de las levaduras que carecen de la actividad del gen indicador (colorimétrico, sensibilidad,...).
Este ensayo puede simplificarse y restringirse a la interacción Net-SRF usando en las construcciones los dominios de interacción de Net y SRF respectivos. En este caso, los fragmentos correspondientes de los ADNc se clonan en:
el plásmido PGAD 10 (Clontech) para la expresión de una proteína de fusión con el dominio de transactivación de la proteína GAL4 (Net-TA o SRF-TA).
El otro después se clona en pGBT9 (Clontech) para la expresión de una proteína de fusión con el dominio de unión a ADN de la proteína GAL4 (respectivamente, SRF-BD o Net-BD).
Aquí, la CL9 usada para este experimento llamado 2-híbrido inverso es un mutante cyh2 de la cepa JC981. CYH2 confiere la capacidad de crecer en presencia de cicloheximida. La cepa CL9 se transfectó por un plásmido (integrado en el locus trp1-901) donde el gen CYH2 de tipo silvestre se expresa bajo el control del promotor Gall (UAS)), el promotor UAS está controlando la sensibilidad a cicloheximida y la expresión del gen indicador.
Este ensayo por tanto consiste en un ensayo 2-híbrido inverso en una levadura permeabilizada. Una pequeña molécula que inhibe la interacción entre las proteínas conduce al crecimiento de las levaduras en medio de crecimiento selectivo (10 \mug/ml de cicloheximida).
Las moléculas se ensayan por el mismo protocolo en medio que contiene Cicloheximida.
El ensayo de moléculas pequeñas consta del crecimiento de la levadura transformada en un medio selectivo que contiene 10 \mug/ml de cicloheximida: Se ponen gotas de moléculas ensayadas sobre la superficie de la placa y las moléculas positivas son aquellas que dan un halo de crecimiento. Después se verifica el positivo comprobando la expresión del gen indicador.
13-C-2) Interacción Net-CtBP
Se usa este segundo ensayo 2-híbrido inverso pero, esta vez, el ADNc de Net contiene sólo la caja CID, en la que se mapea el dominio de interacción con la proteína CtBP. Se reemplazó el ADNc de SRF por el ADNc de CtBP. El procesamiento de la levadura transformada sigue siendo idéntico.
Con respecto a los ejemplos 13-C-1 y 2, están disponibles varios protocolos de la bibliografía tales como los descritos en los documentos US 5.283.173; US 5.468.614; US5525490; US 5.580.736; US 5.885.779.
13-D) Fosforilación de Net
Puede cuantificarse la fosforilación de Net en ELISA o en placas Cytostar (Flashplates) cubiertas por un anticuerpo anti-fosfoNet o en un ensayo de HTRF.
Net se sobreexpresa, bajo el control de un potente promotor (como por ejemplo el promotor CMV) en un clon de células de mamífero transformadas con Ras transfectadas de forma estable con un vector de expresión que contiene al mismo tiempo un gen de selección (resistencia a Higromicina, resistencia a Neomicina,....). La proteína Net está marcada en su extremo N o en su extremo C con un péptido que puede reconocerse por un anticuerpo monoclonal específico (Flag, señal myc, HA,...). Las células se siembran en placas MW96 (10000 a 100000 células por pocillo) y se tratan o no por las moléculas a evaluar como inhibidores de la fosforilación de Net.
Se lisan las células 24 horas después de la adición de las moléculas en HNTG (Hepes 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, Tritón al 0,1%, Glicerol al 10%, e inhibidores de fosfatasa y proteasa: Na3VO4 1 mM, 2,2 \mug/ml de Aprotinina, 1 \mug/ml de Leupeptina, 1 \mug/ml de Antipaína, 10 \mug/ml de Benzamidina, 1 \mu/ml de Inhibidor de Tripsina de Soja, 1 \mug/ml de Quimiostatina, 1 \mug/ml de Pepstatina-A) o tampones RIPA (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, NaDesoxicolato al 0,5%, SDS al 0,1%, Na3VO4 1 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 100 mM (PMSF), 25 \mug/ml de Aprotinina, 25 \mug/ml de Leupeptina).
Después se transfieren los lisados celulares a una placa MW96 previamente recubierta con el anticuerpo monoclonal 2F3. Este anticuerpo se une específicamente a la proteína Net fosforilada.
El experimento se realiza siguiendo el método ELISA clásico. La cuantificación de la cantidad de Net fosforilado en cada pocillo se revela a través de la unión de un segundo anticuerpo anti-señal marcado. Este marcaje permite la cuantificación del anticuerpo unido por una medición enzimática, o colorimétrica, o fluorescente, o radiactiva.
Una alternativa es marcar los extractos celulares con ortofosfato P^{33} o P^{32} e incubar el lisado celular en placas Cytostar MW96 (Amersham) previamente recubiertas con MoAB 2F3. La radiactividad unida se cuenta después de 3 lavados de placa en un contador de centelleo.
Otra alternativa a estos métodos consiste en la adaptación del método de exploración de HTRF usando un MoAb 2F3 marcado con Criptato de europio. En este caso los reactivos se añaden directamente en el lisado celular (MoAb 2F3 marcado con criptato de europio y un anticuerpo anti-señal marcado con APC (aloficocianina)). Si se desea mayor simplicidad, este segundo anticuerpo también puede biotinilarse y por tanto se añade a la mezcla de reacción APC-estreptavidina.
En este ensayo, la proximidad de EuKryptate anti-fosfoNet y APC anti-señal (debido a la fosforilación de Net) produce una transferencia de fluorescencia entre el Europio y la aloficocianina (APC), cuando el Europio se excita a 337 nm. Suceden dos emisiones de fluorescencia: una a 622 nm y la otra a 665 nm. La proporción de estas emisiones de fluorescencia se mide después: ``(665/622) x 10000.
13-E) Uso de péptidos derivados de Net (caja D) o proteína Net como sustratos en un ensayo de exploración de p38 o ERK basado en su actividad quinasa
Para este ensayo se produce un conjunto de péptido o proteínas recombinantes:
-
p38 de mamífero recombinante (alfa o beta)
-
ERK1, ERK2 de mamífero recombinante
-
JNK1, JNK2 o JNK3 de mamífero recombinante
Estas proteínas pueden ser proteínas de fusión (HA-señal o GST de modo que puedan purificarse fácilmente después de la producción en E. coli o en baculovirus)
-
Sustrato: Un péptido recombinante correspondiente al dominio de activación de la caja C o caja D de proteínas Net humanas o murinas (aminoácidos 289-407 en seres humanos) o a la proteína Net de longitud completa (expresada como previamente).
La reacción quinasa se realiza en presencia de ATP radiomarcado con gamma. La mezcla de reacción se incuba en presencia de las moléculas durante una hora a 30ºC y después se detiene la reacción y se cuentan las placas en un lector de centelleo de placas.
Es posible una adaptación no radiactiva de este protocolo usando el ensayo de transferencia de fluorescencia descrito (HTRF) previamente.
En este caso, el sustrato Net debe estar marcado y podrían usarse los mismos reactivos que los descritos en 13-D después de la reacción quinasa (que se hace aquí con ATP frío). Si Net no está señalizado, puede biotinilarse y entonces es necesario el uso de APC estreptavidina.
Referencias
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<110> AVENTIS PHARMA SA
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INSERM 
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<120> Net, un factor de transcripción de la familia TCF, como regulador de la expresión de factores angiogénicos
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<130> Net/anti-angiogénesis
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<141>
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<160> 15
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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1
2
3 
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<223> Secuencia del factor de transcripción de NET
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6 
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taatttccaa gttctcggca cgtag 
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: EX3b
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<220>
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<221> primer_bind
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<222> (1)..(24)
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<400> 12
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\hskip-.1em\dddseqskip
ctagaaatct ccccaagaag actc 
\hfill
24 
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<210> 13
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: EX4
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<220>
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<221> primer_bind
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<222> (1).. (24)
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<400> 13
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\hskip-.1em\dddseqskip
tcgaggccag aaacagtcca cttg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 14
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido derivado de la secuencia SRE
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<220>
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<400> 14
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\hskip-.1em\dddseqskip
tcgagccgga agtgacgtcg a 
\hfill
21 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia SRE
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<400> 15
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\hskip-.1em\dddseqskip
tacacaggat gtccatatta ggaca 
\hfill
25

Claims (36)

1. Uso de todo o parte de un polipéptido NET o células que expresan todo o parte del polipéptido NET en un método para identificar compuestos que modulen la angiogénesis o sean eficaces para prevenir y/o tratar patologías relacionadas con trastornos angiogénicos donde se selecciona el polipéptido NET entre el grupo que consiste en una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID Nº 2, una variante alélica de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID Nº 2, una variante de empalme de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID Nº 2, y donde parte del polipéptido NET comprende un fragmento de NET seleccionado entre el fragmento que corresponde a la caja A (humana) = aminoácidos 1-90 de la SEC ID Nº 2, caja B (humana) = aminoácidos 133-151 de la SEC ID Nº 2, caja C (humana) = aminoácidos 321-378 de la SEC ID Nº 2, caja D (humana) = aminoácidos 290-299 de la SEC ID Nº 2, dominio NID (humano) = aminoácidos 153-308 de la SEC ID Nº 2; dominio JEX (humano) = aminoácidos 233-353 de la SEC ID Nº 2; dominio CID (humano) aminoácidos 274-282 de la SEC ID Nº 2; caja A (murina) = aminoácidos 1-90 de la SEC ID Nº 4, caja B (murina) = aminoácidos 133-151 de la SEC ID Nº 4, caja C (murina) = aminoácidos 323-380 de la SEC ID Nº 4, caja D (murina) = aminoácidos 291-301 de la SEC ID Nº 4; dominio NID (murino) = aminoácidos 155-197 de la SEC ID Nº 4; dominio JEX (murino) = aminoácidos 222-253 de la SEC ID Nº 4; dominio CID (murino) = aminoácidos 275-220 de la SEC ID Nº 4.
2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el método para identificar compuestos comprende detectar la modulación de la actividad transcripcional de NET.
3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el método para identificar compuestos comprende detectar la modulación de la interacción NET/ADN.
4. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el método para identificar compuestos comprende detectar la modulación de la fosforilación de NET.
5. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el método para identificar compuestos comprende evaluar la capacidad de todo o parte del polipéptido NET de interaccionar con otros elementos polipeptídicos.
6. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el compuesto es un agonista de NET.
7. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el compuesto es un antagonista de NET.
8. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde las patologías relacionadas con trastornos angiogénicos implican vascularización insuficiente y requieren un aumento de la angiogénesis y se seleccionan entre isquemia cardiaca o periférica, defecto en la curación de heridas, reestenosis vascular, insuficiencia placentaria, necrosis aséptica, curación alterada de fracturas óseas, hipertensión pulmonar y sistémica, apoplejía, demencia vascular, pseudoquistes en la tiroides, linfoedema.
9. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde las patologías relacionadas con trastornos angiogénicos implican un aumento de la vascularización y requieren la inhibición de angiogénesis y se seleccionan entre aterosclerosis, hemangioma, hemangioendotelioma, edema alérgico, retinopatía del prematuro y retinopatía diabética.
10. Uso de acuerdo con la reivindicación 7, donde las patologías relacionadas con trastornos angiogénicos se seleccionan entre sarcoma de Kaposi, crecimiento tumoral y/u otras patologías en las que se activa NET.
11. Un método para identificar compuestos que modulan la angiogénesis, comprendiendo dicho método:
i) proporcionar una composición que comprende un factor de transcripción NET de mamífero;
ii) poner en contacto la composición con el compuesto candidato; y
iii) evaluar la capacidad de dicho compuesto candidato de modular la función de NET.
12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, donde la etapa de evaluación comprende detectar la modulación de la actividad de transcripción de NET.
13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, donde la modulación de la actividad de transcripción de Net comprende detectar un cambio en el nivel de expresión de un gen indicador expresado bajo el control de una proteína quimérica que consiste en el dominio de transactivación de NET y un dominio de unión a ADN de un factor de transcripción.
14. El método de la reivindicación 13, donde dicho dominio de unión a ADN de un factor de transcripción es el dominio de unión a ADN de GAL4.
\newpage
15. El método de acuerdo con la reivindicación 11, donde la detección de la expresión es en células de mamífero transfectadas de forma estable.
16. El método de la reivindicación 11, donde la etapa de evaluación comprende detectar la modulación de la interacción NET/ADN.
17. El método de la reivindicación 16, caracterizado porque la interacción NET/ADN se evalúa por ensayo de desplazamiento en gel.
18. El método de la reivindicación 16, caracterizado porque la interacción NET/ADN se evalúa por cuantificación de nucleótidos marcados o unidos a la proteína NET.
19. El método de la reivindicación 11, donde la detección de la etapa de evaluación comprende detectar la modulación de la fosforilación de NET.
20. El método de la reivindicación 19, donde la detección de la modulación de la fosforilación de Net comprende determinar la fosforilación de NET como resultado de la actividad quinasa.
21. El método de la reivindicación 20, donde la quinasa es p38\alpha, p38\beta, ERK1, ERK2, JNK1, JNK2 o JNK3.
22. El método de la reivindicación 11, donde la etapa de evaluación comprende evaluar la capacidad de todo o parte del polipéptido NET de interaccionar con otros elementos polipeptídicos o con ácidos nucleicos.
23. El método de la reivindicación 22, donde la capacidad del polipéptido NET de interaccionar con ácido nucleico comprende evaluar la capacidad del dominio de unión a SRF de NET de interaccionar con el elemento SRE.
24. El método de la reivindicación 22, donde la capacidad del polipéptido NET de interaccionar con otros polipéptidos comprende evaluar la capacidad del dominio de unión a CtBP de NET (CID) de interaccionar con el elemento CtBP.
25. El método de la reivindicación 11, donde la composición es una célula o un extracto celular.
26. El método de acuerdo con la reivindicación 11, donde el compuesto es un agonista de NET.
27. El método de acuerdo con la reivindicación 11, donde el compuesto es un antagonista de NET.
28. Un animal no humano transgénico para el gen NET que comprende una mutación en el gen NET.
29. Un animal transgénico de acuerdo con la reivindicación 28, donde dicha mutación es una deleción.
30. Un animal transgénico de acuerdo con la reivindicación 29, donde dicha deleción conduce a un ARNm de NET con corte y empalme alternativo que carece del exón 2.
31. Un animal transgénico de acuerdo con la reivindicación 28, donde la mutación afecta a un alelo.
32. Un animal transgénico de acuerdo con la reivindicación 28, donde la mutación afecta a los dos alelos.
33. Un animal transgénico de acuerdo con la reivindicación 28, donde dicho animal es un roedor.
34. Un animal transgénico de acuerdo con la reivindicación 33, donde dicho roedor es un ratón.
35. Un método para determinar la capacidad de un compuesto de modular la angiogénesis, comprendiendo dicho método administrar dicho compuesto a un animal transgénico de acuerdo con la reivindicación 28 a 34 y comparar la angiogénesis con la de un animal de control no tratado.
36. Un método para identificar un compuesto eficaz para prevenir y/o para tratar patologías relacionadas con trastornos angiogénicos, que comprende administrar dicho compuesto a un animal transgénico de acuerdo con las reivindicaciones 28 a 34, medir la angiogénesis, y comparar la angiogénesis con la de un animal de control no tratado.
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