ES2284697T3

ES2284697T3 - Drosophila melanogaster transgenica que expresa beta amiloide.

Info

Publication number: ES2284697T3
Application number: ES01974319T
Authority: ES
Inventors: Dalia Cohen; Uwe Jochen Dengler; Alyce Lynn Finelli; Felix Freuler; Mary Konsolaki; Mischa Werner Henri Marie Reinhardt; Susan Zusman
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2000-09-29
Filing date: 2001-10-01
Publication date: 2007-11-16
Anticipated expiration: 2021-10-01
Also published as: EP1324652B1; WO2002026820A2; US20050138676A1; AU2001293858A1; DE60127982T2; ATE359704T1; DE60127982D1; PT1324652E; WO2002026820A3; US6900367B2; EP1324652A2; KR20030051664A; US20020174446A1; JP2004509646A; CA2423613A1

Abstract

Mosca transgénica cuyo genoma comprende una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido que consiste en la parte Abeta de la APP humana en la que dicha secuencia de ADN codifica para Abeta40 (SEQ ID NO:1) o Abeta42 (SEQ ID NO:2), fusionada a una secuencia señal, estando dicha secuencia de ADN unida funcionalmente a una secuencia de control de la expresión específica de tejido; y expresar dicha secuencia de ADN, en la que la expresión de dicha secuencia de ADN da como resultado que dicha mosca muestra un fenotipo alterado.

Description

Drosophila melanogaster transgénica que expresa beta amiloide.

Antecedentes de la invención

La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurológico que da como resultado la degeneración y finalmente la muerte de neuronas en centros cerebrales que controlan la memoria, la cognición y el comportamiento. El sello distintivo de la enfermedad es la formación de depósitos insolubles de amiloide (placas seniles), cuyo principal componente es el péptido de 40-42 aminoácidos amiloide beta (A\beta), un producto proteolítico la proteína precursora del amiloide (APP). Se cree ampliamente que estas placas son los agentes causantes principales que conducen a la degeneración y muerte de células neuronales.

Los tres genes principales conocidos asociados con la herencia de la enfermedad de Alzheimer familiar (EAF) en seres humanos son los genes del receptor transmembrana de la proteína precursora del amiloide (APP) y los dos de la presenilina (PS1 y PS2). Las mutaciones de pérdida de sentido en estos genes da como resultado el aumento de la producción del péptido A\beta, lo que subraya la importancia de este péptido en la contribución al estado de la enfermedad. La APP se escinde en dos sitios, beta y gamma, para liberar un péptido de 40-42 aminoácidos, A\beta (revisado en Mills, J. y Reiner, P.B. (1999) J. Neurochem 72: 443-460). Las mutaciones de pérdida de sentido en la APP cerca del sitio gamma (Goate, A. et al., (1991). Nature 349: 704-706.), en las que se escinde el extremo C-terminal del péptido, dan como resultado la producción de más A\beta 42, mediante la alteración de la proporción 40/42 (Suzuki, N., et al. (1994). Science 264: 1336-1340). Las mutaciones alrededor del sitio beta dan como resultado más producción global de ambas formas (Mullan, M., et al. (1992). Nat. Genet. 1: 345-347.); Citron, M. et al. (1995). Neuron 14: 661-
670).

Las presenilinas son proteínas transmembrana de paso múltiple, cuyas funciones son actualmente materia de debate. Las mutaciones de pérdida de sentido en las presenilinas aumentan la liberación de la forma A\beta 42 (Borchelt, D.R., et al. (1996). Neuron17: 1005-1013); Citron, M., et al. (1997). Nat. Med. 3: 67-72; Murayama, O. et al. (1999). Neurosci. Lett. 265: 61-63) y explican la mayoría de los casos de EAF (Sherrington, R., et al. (1995). Nature 375: 754-760).

Muchos de los estudios han examinado los papeles tanto de la forma soluble como de la insoluble (agregada) de A\beta y se cree ampliamente que la forma agregada del péptido es responsable de los efectos tóxicos observados (Pike, C.J., et al. (1993). J. Neurosci. 13: 1676-1687; Lorenzo, A. y Yankner, B.A. (1994). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 12243-12247; Giovannelli, L., et al (1998). Neurosci. 87: 349-357). Existen varios mecanismos que contribuyen a la muerte de neuronas inducida por A\beta, incluyendo la alteración de los niveles de calcio intracelular (para revisiones, véanse Fraser, S.P., et al. (1997). Trends Neurosci. 20: 67-72; Mattson, M.P. (1997). Physiol. Rev. 77: 1081-1132; Coughlan, C.M. y Breen, K.C. (2000). Pharmacol. and Ther. 86: 111-144), la inducción de una respuesta inflamatoria provocada por la activación de células microgliales (revisado en Coughlan, C.M. y Breen, K.C. (2000). Pharmacol. and Ther. 86: 111-144) y la degeneración y/o alteración marcada del sistema colinérgico del prosencéfalo basal, que está implicado en el aprendizaje y la memoria (tratado en Hellström-Lindahl y Court, 2000, Behav. Brain Res. 113 (1-2): 159-68). Por tanto, está claro que los efectos nocivos de la sobreproducción de A\beta y su contribución a la EA son numerosos y complejos.

Aunque se han dedicado una gran cantidad de investigaciones al estudio de la enfermedad de Alzheimer y a su patología general, el análisis genético de los trastornos neurodegenerativos humanos es limitado. Como resultado, no se entienden bien los acontecimientos que desencadenan la acumulación de beta amiloide, así como el papel preciso de los genes tales como APP y otros de los que se sospecha que desempeñan un papel en la enfermedad de Alzheimer.

A partir de estudios en sistemas modelo provienen numerosas contribuciones al establecimiento del papel central del A\beta en la manifestación y la progresión de la EA. Los ratones transgénicos que expresan o bien formas mutantes o bien de tipo natural de la APP muestran patología de EA, desarrollando en muchos casos placas de amiloide de una manera dependiente de la edad y en algunos casos mostrado comportamiento y cognición alterados (para revisión, véanse Price, D.L., et al (1998). Annu. Rev. Genet. 32: 461-493; van Leuven, F. (2000). Progress in Neurobiol. 61: 305-312). Los ratones transgénicos que expresan sólo el péptido A\beta 42 muestran degeneración neuronal extensa en regiones cerebrales afectadas normalmente en la EA, y el 50% mueren a los 12 meses de edad (LaFerla, F.M. et al. (1995). Nature Genet. 9: 21-30). Las células neurales en estos ratones experimentan finalmente apoptosis, seguido por astrogliosis y espongiosis. Esto demuestra que la expresión de A\beta 42 es tóxica in vivo, y da como resultado la degeneración y apoptosis neuronales.

Se ha probado que el uso de Drosophila como organismo modelo es una importante herramienta en el esclarecimiento de las vías de la enfermedad neurodegenerativa humana (tratado en Fortini, M y Bonini, N. (2000). Trends Genet. 16: 161-167), dado que el genoma de Drosophila contiene muchos ortólogos humanos relevantes que están extremadamente bien conservados en la función (Rubin, G.M., et al. (2000). Science 287: 2204-15). Por ejemplo, Drosophila melanogaster porta un gen que es homólogo a APP humano que está implicado en la función del sistema nervioso. El gen, similar a APP (Appl), es aproximadamente idéntico en un 40% a la isoforma neurogénica (695) del gen APP humano en tres dominios grandes (Rosen et al., PNAS USA 86:2478-2482(1988)) y, como APP695, se expresa exclusivamente en el sistema nervioso. Las moscas deficientes para el gen Appl muestran defectos de comportamiento que pueden solventarse mediante el gen APP humano, lo que sugiere que los dos genes tienen funciones similares en los dos organismos (Luo et al., Neuron 9:595-605 (1992)).

Además, los modelos de Drosophila de enfermedades por repetición de poliglutamina (Jackson, G.R., et al (1998). Neuron 21:633-642; Kazemi-Esfarjani, P. y Benzer, S. (2000). Science 287: 1837-1840; Fernandez-Funez et al. (2000) Nature 408 (6808):101-6, y Parkinson's disease (Feany, M.B. y Bender, W.W. (2000). Nature 404: 394-398) imitan estrechamente el estado de la enfermedad en seres humanos, tanto al nivel celular como también al fisiológico y se han usado de manera satisfactoria para identificar otros genes que desempeñan un papel en estas enfermedades. Por tanto, el poder de Drosophila como un sistema modelo está demostrado en la capacidad de representar el estado de la enfermedad y en realizar selecciones genéticas a gran escala.

Esta invención se refiere en general a un método para identificar compuestos y genes que actúan sobre la ruta de la APP en Drosophila melanogaster transgénica que expresa ectópicamente genes relacionados con la EA. La expresión de estos transgenes puede inducir fenotipos visibles y se contempla en el presente documento que las selecciones genéticas descritas en el presente documento pueden usarse para identificar genes implicados en la ruta de la APP mediante la identificación de mutaciones que modifican los fenotipos visibles inducidos. Los genes afectados por estas mutaciones se denominarán en el presente documento "modificadores genéticos". Se contempla en el presente documento que los homólogos humanos de modificadores genéticos así identificados serían dianas útiles para el desarrollo de agentes terapéuticos para tratar estados asociados con anomalías en la ruta de la APP, incluyendo, pero sin limitarse a, el desarrollo de agentes terapéuticos de la enfermedad de Alzheimer (EA). Se contempla en el presente documento que algunos de estos homólogos humanos podrían producirse en una zona del cromosoma 10 humano, que se ha mostrado que está vinculado con la enfermedad de Alzheimer (Bertram et al., Ertekin-Taner et al., Myers et al., Science 290, 2302-2305, 2000). Tales homólogos humanos podrían tener el potencial de estar genéticamente vinculados con la EA y servir como marcadores para la EA o como dianas para el desarrollo de agentes terapéuticos para tratar estados asociados con anomalías en la ruta de la APP, incluyendo, pero sin limitarse a, el desarrollo de agentes terapéuticos de la enfermedad de Alzheimer (EA). Tales homólogos humanos también podrían estar actuando en rutas celulares que impli-
can genes vinculados con la EA y estos homólogos humanos podrían usarse para identificar los genes en estas rutas.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a una mosca transgénica cuyo genoma comprende una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido que comprende la parte Abeta de la APP humana, en la que dicha secuencia de ADN codifica para Abeta40 (SEQ ID: NO 1) o Abeta42 (SEQ ID: NO 2), fusionadas a una secuencia señal, estando dicha secuencia de ADN unida funcionalmente a una secuencia de control de la expresión específica de tejido; y expresar dicha secuencia de ADN, en el que la expresión de dicha secuencia de ADN da como resultado que dicha mosca muestra un fenotipo alterado. En una realización particular, la secuencia de ADN codifica para Abeta42, la secuencia de control de la expresión específica de tejido comprende el promotor GMR específico del ojo y la expresión de la secuencia de ADN da como resultado un fenotipo alterado denominado fenotipo de "ojo rugoso".

También se describe una mosca transgénica cuyo genoma comprende una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido que comprende la parte C99 de tipo natural de la APP humana (SEQ. ID NO:3) o la parte C99 de la APP humana con la mutación London (SEQ ID NO: 4) fusionada a una secuencia señal, estando dicha secuencia de ADN unida funcionalmente a una secuencia de control de la expresión específica de tejido; y expresar dicha secuencia de ADN, en el que la expresión de dicha secuencia de ADN da como resultado que dicha mosca muestra un fenotipo alterado. En una realización, la secuencia de ADN codifica para C99 de tipo natural, la secuencia de control de la expresión específica de tejido es el elemento de control UAS, que se activa mediante la proteína Gal4 producida en el cerebro mediante el transgén 7GB-Gal4 y la expresión de la secuencia de ADN da como resultado un fenotipo alterado caracterizado por un defecto en la locomoción. En otra realización particular, la secuencia de ADN codifica para o bien C99 de tipo natural o bien la parte de C99 de la APP humana con la mutación London, la secuencia de control de la expresión específica de tejido es el elemento de control UAS activado mediante la proteína Gal4 producida mediante el transgén apterous-Gal4 y la expresión de la secuencia de ADN da como resultado un fenotipo alterado denominado fenotipo de "ala cóncava".

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para identificar modificadores genéticos de la ruta de la APP, comprendiendo dicho método proporcionar una mosca transgénica cuyo genoma comprende una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido que comprende la parte Abeta de la APP humana, en el que dicha secuencia de ADN codifica para Abeta40 (SEQ ID NO: 1) o Abeta42 (SEQ ID NO: 2), fusionadas a una secuencia señal, estando dicha secuencia de ADN unida funcionalmente a una secuencia de control de la expresión específica de tejido; y expresar dicha secuencia de ADN, en el que el que la expresión de dicho ADN da como resultado que dicha mosca muestra un fenotipo alterado; cruzar dicha mosca transgénica con una mosca que contiene una mutación en un gen conocido o predicho; y seleccionar la progenie de dichos cruces para obtener moscas que portan dicha secuencia de ADN y dicha mutación y muestran expresión modificada del fenotipo transgénico comparadas con los controles. En una realización, la secuencia de ADN codifica para Abeta42, la secuencia de control de la expresión específica de tejido comprende el promotor GMR específico del ojo y la expresión de dicha secuencia de ADN da como resultado que la mosca muestra un fenotipo alterado denominado fenotipo de "ojo rugoso".

También se describe un método para identificar modificadores de la ruta de la APP, comprendiendo dicho método: proporcionar una mosca transgénica cuyo genoma comprende una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido que comprende la parte C99 de tipo natural de la APP humana (SEQ. ID NO: 3) o la parte C99 de la APP humana con la mutación London (SEQ ID NO: 4) fusionadas a una secuencia señal, estando dicha secuencia de ADN funcionalmente unida a una secuencia de control de la expresión específica de tejido; y expresar dicha secuencia de ADN, en el que la expresión de dicha secuencia de ADN da como resultado que dicha mosca muestra un fenotipo alterado; cruzar dicha mosca transgénica con una mosca que contiene una mutación en un gen conocido o predicho; y seleccionar la progenie de dichos cruces para obtener moscas que portan dicha secuencia de ADN y dicha mutación y muestran expresión modificada del fenotipo transgénico comparadas con los controles. En una realización, la secuencia de ADN codifica para C99 de tipo natural, la secuencia de control de la expresión específica de tejido es el elemento de control UAS, activado mediante la proteína Gal4 producida en el cerebro mediante el transgén 7B-Gal4 y la expresión de dicha secuencia de ADN da como resultado que dicha mosca muestra un fenotipo alterado caracterizado por un defecto en la locomoción. En otra realización, la secuencia de ADN codifica para o bien C99 de tipo natural o bien para la parte de C99 de la APP humana con la mutación London, la secuencia de control de la expresión específica de tejido es el elemento de control UAS activado mediante la proteína Gal4 producida mediante el transgén apterous-Gal4 y la expresión de dicha secuencia de ADN da como resultado que la mosca muestra un fenotipo alterado denominado fenotipo de "ala cóncava".

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para identificar compuestos que actúan sobre productos génicos implicados en la ruta de la APP sometiendo a ensayo compuestos que pueden modificar los fenotipos inducidos por la expresión de Abeta, comprendiendo dicho método: proporcionar una mosca transgénica cuyo genoma comprende una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido que comprende la parte Abeta de la APP humana en el que dicha secuencia de ADN codifica para Abeta40 (SEQ ID NO: 1) o Abeta42 (SEQ ID NO: 2), fusionadas a una secuencia señal, estando dicha secuencia de ADN unida funcionalmente a una secuencia de control de la expresión específica de tejido; y expresar dicha secuencia de ADN, en la que la expresión de dicha secuencia de ADN da como resultado que dicha mosca muestra un fenotipo alterado; administrar a dicha mosca un compuesto candidato; y someter a ensayo para detectar cambios en el fenotipo de dicha mosca comparado con el fenotipo de una mosca transgénica similar a la que no se ha administrado el compuesto candidato. En una realización, la secuencia de ADN codifica para Abeta42, la secuencia de control de la expresión específica de tejido es el promotor GMR específico de tejido y la expresión de dicha secuencia de ADN da como resultado que dicha mosca muestra un fenotipo alterado denominado fenotipo de "ojo rugoso".

También se describe un método para identificar compuestos que actúan sobre productos génicos implicados en la ruta de la APP sometiendo a ensayo para detectar compuestos que pueden modificar los fenotipos inducidos por la expresión de C99, comprendiendo dicho método: proporcionar una mosca transgénica cuyo genoma comprende una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido que comprende la parte C99 de tipo natural de la APP humana (SEQ. ID NO:3) o la parte C99 de la APP humana con la mutación London (SEQ ID NO: 4) fusionadas a una secuencia señal, estando dicha secuencia de ADN unida funcionalmente a una secuencia de control de la expresión específica de tejido; y expresar dicha secuencia de ADN, en el que la expresión de dicha secuencia de ADN da como resultado que dicha mosca muestra un fenotipo alterado; administrar a dicha mosca un compuesto candidato; y someter a ensayo para detectar cambios en el fenotipo de dicha mosca comparado con el fenotipo de una mosca transgénica similar a la que no se ha administrado el compuesto candidato. En una realización, la secuencia de ADN codifica para C99 de tipo natural, la secuencia de control de la expresión específica de tejido es el elemento de control UAS activado mediante la proteína Gal4 producida en el cerebro mediante el transgén 7B-Gal4 y la expresión de dicha secuencia de ADN da como resultado que la mosca muestra un fenotipo caracterizado como un defecto de la locomoción. En otra realización, la secuencia de ADN codifica para o bien la parte C99 de tipo natural o bien para la C99 de la APP humana con la mutación London, la secuencia de control de la expresión específica de tejido es el elemento de control UAS activado mediante la proteína Gal4 producida mediante el transgén apterous-Gal4 y la expresión de dicha secuencia de ADN da como resultado que la mosca muestra un fenotipo alterado denominado fenotipo de "ala cóncava".

La invención facilita un método para identificar genes implicados en la aparición o progresión de estados asociados con la regulación anómala de la ruta de la APP, incluyendo pero sin limitarse a la enfermedad de Alzheimer, y cuyos productos proteicos podrían servir como marcadores potenciales para la enfermedad de Alzheimer, comprendiendo dicho método identificar los homólogos humanos de genes de mosca que se han identificado como modificadores genéticos según los métodos de la presente invención.

Todavía en otro aspecto, la invención facilita un método para identificar genes implicados en la aparición o progresión de estados asociados con la regulación anómala de la ruta de la APP, incluyendo pero sin limitarse a la enfermedad de Alzheimer, y cuyos productos proteicos podrían servir como marcadores potenciales para la enfermedad de Alzheimer, comprendiendo dicho método identificar homólogos humanos de genes de modificadores genéticos de la mosca que se ubican cerca de la zona del cromosoma 10 humano que se ha mostrado que tiene un vínculo genético con la enfermedad de Alzheimer.

También se describe un método para identificar genes implicados en la aparición o progresión de la enfermedad de Alzheimer y cuyos productos proteicos podrían servir como marcadores potenciales para la AD, comprendiendo dicho método identificar genes que están implicados en las rutas reguladas mediante los factores de transcripción codificados por las secuencias humanas hCP50765 (SEQ ID NO. 35, codificada por el gen EGR2), y hCP41313 (SEQ ID NO 15 , SEQ ID NO17 o SEQ ID NO 53, codificadas por el homólogo humano del gen nocA de Drosophila), localizándose las secuencias humanas cercanas a la zona del cromosoma 10 humano que se ha mostrado que tiene un vínculo genético con la enfermedad de Alzheimer.

Todavía en otro aspecto, la presente descripción se refiere a un método para identificar compuestos útiles para el tratamiento, prevención o mejora de los estados patológicos asociados con defectos en la ruta de la APP, incluyendo pero sin limitarse a la enfermedad de Alzheimer, que comprende administrar compuestos candidatos a un modelo in vitro o in vivo de la enfermedad de Alzheimer; y someter a ensayo para detectar cambios en la expresión de un homólogo genético de un modificador genético, en el que la expresión alterada de uno cualquiera de dichos homólogos comparada con los niveles en un control al que no se ha administrado un compuestos candidato, indica un compuesto de posible valor terapéutico.

También se describe un método para el tratamiento, prevención o mejora de los estados patológicos asociados con defectos en la ruta de la APP, incluyendo, pero sin limitarse a la enfermedad de Alzheimer, que comprende administrar a un sujeto con necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que puede inhibir o mejorar la función de uno cualquiera o más del polipéptido codificado por los homólogos humanos de los modificadores genéticos identificados en el presente documento.

También se describe un método para el tratamiento, prevención o mejora de los estados patológicos asociados con defectos en la regulación de la ruta de la APP, incluyendo pero sin limitarse a la enfermedad de Alzheimer, que comprende administrar a un sujeto con necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende una cualquiera o más sustancias seleccionadas del grupo que consiste en: ADN de triple hélice, oligonucleótidos o ribozimas antisentido, todos complementarios a la secuencia apropiada de ARNm que deriva de uno cualquiera o más de los homólogos humanos de los genes de modificadores genéticos identificados según los métodos de la presente invención.

También se describe un método para el tratamiento, prevención o mejora de los estados patológicos asociados con defectos en la regulación de la ruta de la APP, incluyendo pero sin limitarse a la enfermedad de Alzheimer, que comprende administrar a un sujeto con necesidad de la misma una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende moléculas de ARN de doble cadena dirigidas contra uno o más de los homólogos humanos de los modificadores genéticos identificados según los métodos de la presente invención.

También se describe un método para el tratamiento, prevención o mejora de los estados patológicos asociados con defectos en la ruta de la APP, incluyendo pero sin limitarse a la enfermedad de Alzheimer, que comprende administrar a un sujeto con necesidad de la misma una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o anticuerpos y/o fragmentos de los mismos dirigidos contra el polipéptido codificado por uno cualquiera o más del homólogo humano de los modificadores genéticos identificados según los métodos de la presente invención.

También se describe un método para el diagnóstico de estados patológicos asociados con anomalías en la ruta de la APP en un sujeto, incluyendo pero sin limitarse a la enfermedad de Alzheimer, que comprende medir el nivel de ARNm o el nivel de actividad de los polipéptidos codificados por uno cualquiera o más de los homólogos humanos de un modificador genético en una muestra biológica de un sujeto, en el que un nivel anómalo en relación con el nivel del mismo en un sujeto control es un diagnóstico de dicho estado.

También se describe un kit que comprende los componentes necesarios para detectar los niveles de expresión de los polipéptidos codificados por uno cualquiera o más de los homólogos humanos de un modificador genético o fragmentos del mismo o los polinucleótidos que codifican para uno cualquiera o más de dichos polipéptidos o fragmentos de los mismos, en una muestra biológica de un sujeto, comprendiendo tales kits anticuerpos que se unen a dichos polipéptidos o fragmentos de los mismos, o sondas oligonucleotídicas que hibridan con dichos polinucleótidos o con dichos fragmentos de los mismos e instrucciones para usar dicho kit.

También se describe una composición farmacéutica que comprende sustancias seleccionadas del grupo que consiste en: molécula antisentido, ribozima, ARN de doble cadena o ácidos nucleicos de triple hélice dirigidos contra uno cualquiera o más de los homólogos humanos de un modificador genético o fragmentos de los mismos, polipéptidos codificados por uno cualquiera o más de los homólogos humanos de un modificador genético o fragmentos de los mismos, polinucleótidos que codifican para dichos polipéptidos o fragmentos de los mismos, y anticuerpos que se unen a dichos polipéptidos o fragmentos de los mismos, junto con un vehículo, excipiente o diluyente farmacéutico adecuado, para el tratamiento de trastornos patológicos asociados con anomalías en la ruta de la APP, incluyendo pero sin limitarse a la enfermedad de Alzheimer.

También se describe un método para el tratamiento de estados patológicos asociados con anomalías en la ruta de la APP incluyendo pero sin limitarse a, la enfermedad de Alzheimer, que comprende introducir ácidos nucleicos que codifican para uno cualquiera o más de los homólogos humanos de un modificador genético en uno o más tejidos de un sujeto con necesidad de los mismos dando como resultado que se expresan una o más proteínas codificadas por los ácidos nucleicos y o se secretan por las células dentro del tejido.

Descripción detallada de la invención

En la práctica de la presente invención, se usan muchas técnicas convencionales en biología molecular y ADN recombinante. Estas técnicas se conocen bien y se explican en, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, volúmenes I, II, y III, 1997 (F. M. Ausubel ed.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning: A Practical Approach, volúmenes I y II, 1985 (D. N. Glover ed.); A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J. H. Miller y M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory); y Methods in Enzymology vol. 154 y vol. 155 (Wu y Grossman, y Wu, eds., respectivamente). Pueden encontrarse técnicas genéticas moleculares de Drosophila bien conocidas, por ejemplo, en Robert, D.B., Drosophila, A Practical Approach (IRL Press, Washington, D.C., 1986). Pueden encontrarse descripciones de materias primas de moscas en la base de datos Flybase en http://flybase.bio.indiana.edu.

Un organismo "transgénico" tal como se usa en el presente documento se refiere a un organismo que ha tenido material genético extra insertado en su genoma. Tal como se usa en el presente documento, una "mosca transgénica" incluye formas embrionarias, larvales y adultas de Drosophila melanogaster que contienen una secuencia de ADN del mismo u otro organismo insertada aleatoriamente en su genoma. Aunque se prefiere Drosophila melanogaster, se contempla que pueda usarse cualquier mosca del género Drosophila en la presente invención.

Tal como se usa en el presente documento, expresión ``ectópica del transgén se refiere a la expresión del transgén en un tejido o célula o en una fase de desarrollo específica en las que no se expresa normalmente.

Tal como se usa en el presente documento, "fenotipo" se refiere a las características físicas o bioquímicas observables de un organismo determinadas tanto mediante la composición genética como mediante las influencias
ambientales.

Tal como se usa en el presente documento, un compuesto que puede "inhibir o promover la función de cualquiera o más de los polipéptidos codificados por el homólogo humano de un modificador genético" incluye compuestos que pueden hacerlo indirectamente (mediante efectos en sentido de 3') o directamente, uniéndose a o interactuando de otra manera con la proteína e incluye, pero no se limita a, antagonistas o agonistas de la proteína.

Tal como se usa en el presente documento, un "ortólogo riguroso" se define como que cumple los siguientes criterios: la proteína X de la mosca tiene el mejor apareamiento con la proteína Y humana y la proteína X de la mosca no tiene un apareamiento mejor con otra proteína de la mosca que con la proteína Y humana y la proteína Y humana tiene el mejor apareamiento con la proteína X de la mosca y la proteína Y humana no tiene un apareamiento mejor con otra proteína humana que con la proteína X de la mosca, en la que "X" e "Y" significan cualesquiera dos proteínas humana y de mosca que se están comparando.

Un "ortólogo supuesto" se define en el presente documento como que cumple sólo los siguientes dos criterios: la proteína X de la mosca tiene el mejor apareamiento con la proteína Y humana y la proteína Y humana tiene el mejor apareamiento con la proteína X de la mosca, sin tener en cuenta si la proteína X de la mosca tenía un apareamiento mejor con otra proteína de la mosca y/o si la proteína Y tiene un apareamiento mejor con otra proteína humana. Tal como se describe en el presente documento, todos los otros apareamientos de proteínas humanas/de mosca se consideran "homólogos".

Tal como se usa en el presente documento, el término "secuencia de control de la expresión" se refiere a promotores y potenciadores. El término "promotor" se refiere a secuencias de ADN que se reconocen directa o indirectamente y se unen mediante una ARN polimerasa dependiente de ADN durante el inicio de la transcripción e incluye elementos potenciadores. Los potenciadores usados en la presente invención incluyen el elemento UAS que se activa mediante el regulador transcripcional Gal4 de levaduras.

El término "factor de transcripción" se refiere a cualquier proteína requerida para iniciar o regular la transcripción en eucariotas. Por ejemplo, el promotor GMR específico del ojo es un sitio de unión para el factor de transcripción específico del ojo, GLASS (Moses, K y Rubin, GM Genes Dev. 5(4):583-93 (1991)).

Tal como se usa en el presente documento, el término "Abeta" (A\beta) se refiere al péptido beta amiloide que es un péptido corto (40-42 aminoácidos) producido mediante escisión proteolítica de la APP mediante las beta y gamma secretasas. Es el componente principal de las deposiciones de amiloide, el rasgo distintivo de la EA y la causa de la muerte y degeneración de las células neuronales. El péptido Abeta de la presente invención incluye, pero no se limita a, los péptidos de 40 y 42 aminoácidos y se denominan, respectivamente, Abeta40 (o A\beta40) (SEQ ID NO: 1) y Abeta42 (o A\beta42) (SEQ ID NO: 2).

"C99" se refiere a un péptido que contiene la región Abeta más la cola citoplasmática de la APP (SEQ ID NO: 3). Tal como se usa en el presente documento, el término incluye la secuencia London C99, que porta la mutación London asociada a la enfermedad de Alzheimer familiar EAF (SEQ ID NO: 4) (Goate, A., et al (1991). Nature 349: 704-706). Los péptidos Abeta y C99 se conocen bien por el experto en la técnica (véanse, por ejemplo, Golde et al., Science 255:728-730 (1992); Coughlan, C.M. y Breen, K.C. (2000). Pharmacol. and Ther. 86: 111-144).

La región "UAS" tal como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de activación en sentido 5' reconocida por el activador transcripcional GAL-4.

Tal como se usa en el presente documento, una "secuencia señal" se refiere a una secuencia corta de aminoácidos que determina la ubicación final de una proteína en una célula, por ejemplo, la secuencia N-terminal o 20 aminoácidos más o menos que dirigen las proteínas transmembrana y secretoras incipientes hacia el retículo endoplasmático. Se contempla en el presente documento que pueda usarse cualquier secuencia señal convencional familiar para el experto en la técnica para garantizar la transferencia de las proteínas C99 o Abeta a través de la ruta secretora, incluyendo, pero sin limitarse a, la secuencia señal de Appl o presenilina de Drosophila endógena, o del gen windbeutel, que codifica para una proteína residente en el RE (retículo endoplasmático) (Konsolaki y Schupbach, Genes & Dev. 12: 120-131 (1998)), o la señal del gen de la preproencefalina humana (SEQ ID NO: 5).

Tal como se usa en el presente documento, una mosca de "control" se refiere a una larva o mosca que es del mismo genotipo que las larvas o moscas usadas en los métodos de la presente invención excepto que la larva o mosca de control no porta la mutación que se está sometiendo a prueba para detectar la modificación del fenotipo, o no se le administra compuestos candidatos.

Tal como se usa en el presente documento, un "sujeto de control" se refiere a un organismo que no padece un estado asociado con anomalías en la ruta de la APP.

Tal como se usa en el presente documento, un "vector de transformación de Drosophila" es un plásmido de ADN que contiene secuencias de elementos transponibles y que puede mediar en la integración de una pieza de ADN en el genoma del organismo. Esta tecnología es familiar para el experto en la técnica.

Tal como se usa el término en el presente documento, el fenotipo de "ojo rugoso" se caracteriza por la desorganización de los omatidios y de las cerdas interomatidiales y puede provocarse por degeneración de células neuronales. Este fenotipo es visible mediante un estereomicroscopio de disección.

Tal como se usa el término en el presente documento, el fenotipo de "ala cóncava" se caracteriza por el pliegue anómalo del ala de la mosca de modo que las alas están dobladas hacia arriba a lo largo de sus márgenes largos.

Tal como se usa en el presente documento, un "defecto en la locomoción" se refiere a un fenotipo en el que las moscas muestran respuestas afectadas a la agitación mecánica comparadas con moscas de tipo natural en ensayos de la actividad de locomoción convencionales.

Tal como se usa en el presente documento, las frases siguientes y relacionadas, los estados patológicos asociados con anomalías en la ruta de la APP, los estados asociados con la regulación anómala de la ruta de la APP, los estados relacionados con la enfermedad de Alzheimer, los estados patológicos asociados con defectos en la ruta de la APP, incluyen todos, pero sin limitarse a, la enfermedad de Alzheimer, e incluyen aquellos estados caracterizados por la degeneración y muerte final de neuronas en núcleos cerebrales que controlan la memoria, la cognición y el aprendizaje.

"Cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de principio activo, por ejemplo el compuesto o producto génico que mejora los síntomas del estado que se está tratando.

Los métodos para obtener organismos transgénicos, incluyendo Drosophila transgénica, se conocen bien por el experto en la técnica. Por ejemplo, una referencia usada comúnmente para la transformación mediada por el elemento P es Spradling, 1986. P element mediated transformation. En Drosophila: A practical approach (ed. D. B. Roberts), págs. 175-197. IRL Press, Oxford, UK)). La tecnología del elemento EP se refiere a un sistema binario, que utiliza el activador transcripcional Gal4 de levaduras, que se usa para regular de manera ectópica la transcripción de genes de Drosophila endógenos. Esta tecnología se describe en: Brand y Perrimon, 1993. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development 118, págs. 401-415 y en: Rorth et al, 1998. Systematic gain-of-function genetics in Drosophila. Development, 125(6), págs. 1049-1057.

La presente descripción describe una mosca transgénica, Drosophila melanogaster, que contiene en su genoma una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido que comprende la parte de beta amiloide (SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2) o la parte C99 del gen de la APP humano (SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4) que está fusionado en su extremo N-terminal según métodos convencionales a una secuencia de péptido señal, por ejemplo, SEQ ID NO: 5, para garantizar la transferencia del polipéptido codificado a través de la ruta secretora. Las secuencias de ADN fusionadas están unidas funcionalmente a secuencias de control de la expresión específicas de tejido tales como regiones promotoras o secuencias de activación en sentido 5' (UAS), dependiendo del sistema de expresión utilizado. Estas secuencias de control de la expresión incluyen las que son específicas para el tejido neural en la mosca e incluyen órganos tales como el ojo, ala, notum, cerebro, SNC y SNP. Bajo el control de estas secuencias de control específicas de tejido, los péptidos codificados se transcriben para formar ARNm que se traduce en niveles detectables de péptido beta amiloide o C99 y que provoca el fenotipo alterado en las moscas. Cuando se somete a ensayo para detectar cambios en estos fenotipos, pueden usarse estas moscas para identificar genes o compuestos que puedan afectar a la ruta de la APP y puedan proporcionar discernimiento de los mecanismos moleculares y bioquímicos de la ruta de la APP y de la enfermedad de Alzheimer.

Pueden usarse sistemas de control de la expresión convencionales para lograr la expresión ectópica de proteínas de interés, incluyendo los péptidos beta amiloide y C99 de la presente invención. Tal expresión puede dar como resultado la alteración de las rutas bioquímicas y la generación de fenotipos alterados. Un sistema de control de la expresión de este tipo implica la fusión directa de la secuencia de ADN con secuencias de control de la expresión de genes expresados específicamente en tejidos, tales como promotores o potenciadores. Otro sistema de control de la expresión que puede usarse es el sistema de activación transcripcional Gal4 binario (Brand y Perrimon, Development 118:401-415 (1993)).

El sistema Gal4 usa el activador tanscripcional Gal4 de levaduras, para dirigir la expresión de un gen de interés de una manera específica de tejido. Se ha insertado aleatoriamente en el genoma de la mosca el gen de Gal4, usando un sistema de transformación convencional, de modo que se ha puesto bajo el control de potenciadores genómicos que dirigen la expresión de una manera temporal y específica de tejido. Se han establecido cepas individuales de moscas, denominadas "controladoras", que portan las inserciones (Brand y Perrimon, Development 118:401-415 (1993)).

En el sistema Gal4, se clona un gen de interés dentro de un vector de transformación, de modo que su transcripción está bajo el control de la secuencia UAS ("Upstream Activating Sequence", secuencia activadora en sentido 5'), el elemento de respuesta a Gal4. Cuando se cruza una cepa de mosca que porta el gen UAS de la secuencia de interés con una cepa de mosca que expresa el gen Gal4 bajo el control de un potenciador específico de tejido, se expresará el gen con un patrón específico de tejido.

Con el fin de generar fenotipos que sean visibles fácilmente en tejidos adultos y por tanto puedan usarse en selecciones genéticas, pueden usarse los "controladores" de Gal4 que dirigen la expresión en las fases tardías del desarrollo de la mosca en la presente invención. Usando estos controladores, la expresión daría como resultado posibles defectos en las alas, los ojos, las patas, diferentes órganos sensoriales y el cerebro. Estos "controladores" incluyen, por ejemplo, apterous-Gal4 (alas), elav-Gal4 (SNC), sevenless-Gal4, eyeless-Gal4 y pGMR-Gal4 (ojos). Además, dado que Appl, el homólogo de la mosca de la APP, se expresa exclusivamente en el tejido neural, se prefieren las cepas "controladoras" en las que al menos se dirige un subconjunto de la expresión a una parte del sistema nervioso. Esto incluye el controlador 7B-Gal4 específico del cerebro. Las descripciones de las líneas Gal4 y las observaciones sobre sus patrones de expresión específica están disponibles en Flybase (http://flybase.bio.indiana.edu).

Pueden usarse diversos constructos de ADN para generar la Drosophila melanogaster transgénica de la presente invención. Por ejemplo, el constructo puede contener la parte de beta amiloide o C99 del gen de la APP humana fusionada a la secuencia de péptido señal del gen de la preproencefalina y unida funcionalmente al promotor específico del ojo, GMR. En otro ejemplo, el constructo puede contener la parte de beta amiloide o C99 del gen de la APP humana fusionada a la secuencia de péptido señal del gen de la preproencefalina clonado dentro del vector pUAST (Brand y Perrimon, Development 118:401-415 (1993)) que coloca la secuencia UAS en sentido 5' de la región transcrita. La inserción de estos constructos dentro del genoma de la mosca puede producirse mediante recombinación con el elemento P, recombinación del elemento Hobo (Blackman et al., EMBO J. 8:211-217 (1989)), recombinación homóloga (Rong y Golic, Science288:2013-2018 (2000)) y otras técnicas habituales conocidas por el experto en la técnica.

Tal como se trató anteriormente, un gen expresado de manera ectópica puede dar como resultado un fenotipo alterado por alteración de una ruta bioquímica particular. Se espera que las mutaciones en genes que actúan en la misma ruta bioquímica provoquen modificación del fenotipo alterado. Por tanto, las moscas de la presente invención pueden usarse para identificar genes que actúan en la ruta de la APP cruzando una mosca transgénica C99 o Abeta con una mosca que contiene una mutación en un gen conocido o predicho; y seleccionando la progenie de los cruces para obtener moscas que muestran modificación cuantitativa o cualitativa del fenotipo alterado de la mosca transgénica C99 o Abeta, en comparación con los controles. Por tanto, este sistema es extremadamente beneficioso para la aclaración de la función de los productos génicos procesados por la APP, así como la identificación de otros genes que interactúan directa o indirectamente con ellos. Las mutaciones que pueden seleccionarse incluye, pero no se limitan a, alelos de pérdida de función de genes conocidos, cepas de deleción, cepas "enhancer-trap" (atrapamiento de secuencias reguladoras adyacentes a su inserción) generadas mediante el elemento P y mutaciones de ganancia de función generadas mediante inserciones al azar dentro del genoma de Drosophila de un constructo inducible por Gal4 que puede activar la expresión ectópica de genes en la vecindad de su inserción. Se contempla en el presente documento que los genes implicados en la ruta de la APP puedan identificarse de esta manera y estos genes pueden servir entonces como dianas para el desarrollo de agentes terapéuticos para tratar estados asociados con anomalías en la ruta de la APP, que conducen a enfermedades, incluyendo pero sin limitarse a, la enfermedad de Alzheimer.

Las moscas transgénicas C99 o Abeta de la presente invención también pueden usarse en un método para identificar compuestos que pueden modificar la ruta de la APP y por tanto se ha demostrado que son útiles para el tratamiento de los estados tratados anteriormente. Dicho método puede comprender administrar compuestos candidatos a moscas transgénicas C99 o Abeta y después someterlas a ensayo para detectar cambios en el fenotipo en la mosca transgénica C99 o Abeta de control a las que no se les ha administrado el compuesto. Por ejemplo, usando métodos convencionales, pueden suministrarse compuestos candidatos a larvas que expresan un beta amiloide o C99. Pueden hacerse crecer entonces las larvas hasta la fase adulta y someterse a ensayo la modificación del fenotipo inducido por C99 o Abeta. También pueden suministrarse compuestos candidatos a moscas adultas y someterse a ensayo las modificaciones del fenotipo.

El mecanismo de acción de los compuestos así identificados puede examinarse comparando los fenotipos producidos mediante manipulación genética con los inducidos mediante la administración de un compuesto de interés. Tales compuestos incluyen los que pueden mejorar o empeorar el fenotipo alterado creado en las moscas transgénicas. La expresión de un fenotipo inducido por un compuesto similar a uno asociado con una modificación genética conocida sugeriría que el compuesto tiene un efecto sobre la misma ruta que la modificación genética que está afectando.

Además de seleccionar compuestos en las moscas transgénicas de la presente invención, tales compuestos también pueden someterse a ensayo empleando modelos in vitro y otros in vivo de EA usando métodos convencionales. Por ejemplo, pueden usarse numerosas líneas celulares como modelos in vitro de EA y son familiares para el experto en la técnica, incluyendo, por ejemplo, las líneas celulares descritas en Xia et al, 1997 PNAS USA 94 (15):8208-13. También existen modelos in vivo e incluyen, por ejemplo, el modelo de ratón de la EA descrito en el documento WO 94/00569.

La aclaración del mecanismo de acción de los compuestos que afectan a la acción del beta amiloide o C99 en las moscas transgénicas descritas en el presente documento puede realizarse también usando perfiles de ARN sobre chips (Affymetrix, Santa Clara) o usando otros métodos convencionales. Por ejemplo, los perfiles de ARN de moscas a las que se han administrado compuestos candidatos pueden someterse a ensayo y compararse con los de moscas que se han modificado genéticamente. Perfiles similares sugerirían que el compuesto actúa de alguna manera sobre la ruta afectada del beta amiloide o C99.

Se contempla en el presente documento que, todavía en otro aspecto, la invención se refiere a un método para identificar genes implicados en la aparición o progresión de la enfermedad de Alzheimer y cuyos productos proteicos podrían servir como posibles marcadores para la EA, comprendiendo dicho método identificar genes que están implicados en las rutas reguladas por los factores de transcripción codificados por las secuencias humanas hCP50765 (SEQ ID NO. 35, codificada por el gen EGR2), y hCP41313 (Seq ID NO 15, SEQ ID NO17 o SEQ ID NO 53, codificadas por el homólogo humano del gen nocA de Drosophila), siendo las secuencias humanas homólogas a los modificadores genéticos de Drosophila identificados tal como se describe en el presente documento y ubicándose cerca de la zona del cromosoma 10 humano que se ha demostrado que tiene un vínculo genético con la enfermedad de Alzheimer. La identificación de tales genes, regulados por los factores de transcripción mencionados anteriormente, puede lograrse usando métodos convencionales, incluyendo pero sin limitarse a, la tecnología denominada SELEX, a la que se hace referencia en Tuerk y Gold, 1990, Science 249, 505-510 y Brownand Gold, 1995, Biochemistry 34, 14765-14774. Por ejemplo, pueden identificarse genes que están regulados mediante un factor de transcripción específico determinando la secuencia de ADN diana del factor de transcripción específico. Tal identificación de la secuencia diana puede lograrse mediante diferentes métodos, incluyendo pero sin limitarse a SELEX. Una vez que se identifica la secuencia diana, puede determinarse la presencia de esta secuencia en las regiones reguladoras en sentido 5' de genes conocidos y predichos, usando herramientas bioinformáticas bien conocidas por el experto en la técnica. Puede esperarse que los genes que contienen la secuencia diana en sus regiones reguladoras en sentido 5' estén regulados por el factor de transcripción específico.

Se contempla que los compuestos que pueden afectar (por ejemplo inhibir o estimular) la función o expresión de las proteínas codificadas por los homólogos humanos de modificadores genéticos identificados según la presente invención pueden ser útiles para tratar la enfermedad de Alzheimer u otros estados asociados con defectos en la regulación de la ruta de la APP. Además, se contempla que, usando métodos convencionales, puedan crearse oligonucleótidos antisentido, ribozimas, ADN de triple hélice y/o ARN de doble cadena de valor terapéutico basados en las secuencias de nucleótidos de estos homólogos humanos de modificadores genéticos. También se contempla en el presente documento el uso terapéutico de anticuerpos dirigidos contra los polipéptidos codificados por homólogos humanos de modificadores genéticos y creados usando métodos convencionales. Por tanto, un aspecto adicional de la invención se refiere a la administración de una composición farmacéutica, junto con un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable, para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y estados relacionados. Tales composiciones farmacéuticas pueden comprender los compuestos, oligonucleótidos antisentido, ribozimas, ADN de triple hélice, ARN de doble cadena y/o anticuerpos tratados anteriormente. Las composiciones también pueden contener productos de expresión de homólogos humanos de los modificadores genéticos (por ejemplo, polipéptidos o fragmentos de los mismos) identificados según la presente invención. Las composiciones pueden administrarse solas o en combinación con al menos otro agente, tal como un compuesto estabilizante, que puede administrarse en cualquier vehículo farmacéutico estéril, biocompatible, incluyendo, pero sin limitarse a solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, y agua. Las composiciones pueden administrarse a un sujeto con necesidad de las mismas solas, o en combinación con otros agentes, fármacos u hormonas.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse mediante cualquiera de varias vías incluyendo, pero sin limitarse a, medios orales, intravenosos, intramusculares, intraarticulares, intraarteriales, intramedulares, intratecales, intraventriculares, transdérmicos, subcutáneos, intraperitoneales, intranasales, enterales, tópicos, sublinguales, o rectales.

Además de los principios activos, estas composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y agentes auxiliares que facilitan el procesamiento de los principios activos en las preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. Pueden encontrarse otros detalles sobre las técnicas para la formulación y administración en la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, Pa.).

Las composiciones farmacéuticas para la administración oral pueden formularse usando vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica en dosificaciones adecuadas para la administración oral. Tales vehículos permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen como comprimidos, píldoras, comprimidos recubiertos de azúcar, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones, y similares, para su ingestión por el paciente.

Las preparaciones farmacéuticas para uso oral pueden obtenerse a través de una combinación de compuestos activos con excipiente sólido, moliendo opcionalmente una mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, tras añadir ayudantes adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de comprimidos recubiertos de azúcar. Los excipientes adecuados son cargas de proteína o hidratos de carbono, tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol, o sorbitol; almidón de maíz, trigo, arroz, patata u otras plantas; celulosa, tal como metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, o carboximetilcelulosa de sodio; gomas, incluyendo goma arábiga y goma tragacanto; y proteínas tales como gelatina y colágeno. Si se desea, pueden añadirse agentes disgregantes o solubilizantes, tales como la polivinilpirrolidona reticulada, agar, ácido algínico, o una sal del mismo, tal como alginato de sodio.

Pueden usarse núcleos de comprimidos recubiertos de azúcar junto con recubrimientos adecuados, tales como soluciones de azúcar concentradas, que también pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol, y/u óxido de titanio, soluciones de laca, y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Pueden añadirse colorantes o pigmentos a los comprimidos o comprimidos recubiertos de azúcar para la identificación del producto o para caracterizar la cantidad de compuesto activo, es decir, la dosificación.

Las preparaciones farmacéuticas que pueden usarse por vía oral incluyen cápsulas duras hechas de gelatina, así como cápsulas blandas, selladas hechas de gelatina y un recubrimiento, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener principios activos mezclados con una carga o aglutinantes, tales como lactosa o almidones, lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio, y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, líquido, o polietilenglicol líquido con o sin estabilizantes.

Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración parenteral pueden formularse en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer, o solución salina fisiológicamente tamponada. Las suspensiones de inyección acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, o dextrano. Adicionalmente, pueden prepararse suspensiones de los principios activos como suspensiones de inyección oleosas apropiadas. Los disolventes o portadores lipófilos adecuados incluyen aceites oleosos tales como aceite de sésamo, ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. También pueden usarse aminopolímeros policatiónicos no lipídicos para la administración. Opcionalmente, la suspensión también puede contener establizantes o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.

Para administración tópica o nasal, se usan en la formulación agentes penetrantes apropiados para la barrera particular que va a penetrarse. Tales agentes penetrantes se conocen generalmente en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas pueden fabricarse de una manera que es conocida en la técnica, por ejemplo, mediante procedimientos de mezclado convencional, disolución, granulación, fabricación de comprimidos recubiertos de azúcar, levigación, emulsificación, encapsulación, atrapamiento, o liofilización.

La composición farmacéutica puede proporcionarse como una sal y puede formarse con muchos ácidos, incluyendo pero sin limitarse a ácido clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a ser más solubles en disolventes acuosos u otros disolventes protónicos que las formas de base libre correspondientes. En otros casos, la preparación preferida puede ser un polvo liofilizado que puede contener cualquiera o todos de los siguientes: histidina 1-50 mM, sacarosa al 0,1-2%, y manitol al 2-7%, a un intervalo de pH de 4,5 a 5,5, que se combina con tampón antes de su uso.

Una vez preparadas las composiciones farmacéuticas, pueden colocarse en un recipiente apropiado y etiquetarse para el tratamiento de un estado indicado. Para la administración de los compuestos o productos génicos identificados según la presente invención, tal etiquetado incluiría la cantidad, frecuencia, y método de administración.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en la invención incluyen composiciones en las que los principios activos están contenidos en una cantidad eficaz para lograr el fin pretendido. La determinación de una dosis eficaz está completamente dentro de la capacidad de los expertos en la técnica.

Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente o bien en ensayos de cultivo celular, por ejemplo, de células neoplásicas, o bien en modelos animales, normalmente ratones, conejos, perros, o cerdos. El modelo animal también puede usarse para determinar el intervalo de concentración apropiado y la vía de administración. Tal información puede usarse entonces para determinar las dosis y vías de administración útiles en seres humanos.

Una "dosis terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de principio activo, por ejemplo compuesto o producto génico que mejora los síntomas o el estado. La eficacia terapéutica y la toxicidad pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población) y DL50 (la dosis letal para el 50% de la población). La razón de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, y puede expresarse como la razón, DL50/DE50. Se prefieren las composiciones farmacéuticas que muestran índices terapéuticos grandes. Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y los estudios con animales se usan para formular un intervalo de dosificación para uso humano. La dosificación contenida en tales composiciones está preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poco o nada de toxicidad. La dosificación varía dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada, la sensibilidad del paciente, y la vía de administración.

La dosificación exacta la determinará el médico, a la luz de los factores relacionados con el sujeto que requiere tratamiento. La dosificación y administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes del resto activo o para mantener el efecto deseado. Los factores que pueden tomarse en cuenta incluyen la gravedad del estado de la enfermedad, salud general del sujeto, edad, peso, y sexo del sujeto, dieta, tiempo y frecuencia de administración, combinación(es)
de fármacos, sensibilidades a la reacción, y tolerancia/respuesta al tratamiento. Las composiciones farmacéuticas que actúan a largo plazo pueden administrarse cada de 3 a 4 días, cada semana, o una vez cada dos semanas dependiendo de la semivida y la tasa de eliminación de la formulación particular.

Las cantidades de dosificación normales pueden variar desde 0,1 hasta 100.000 microgramos, hasta una dosis total de aproximadamente 1 g, dependiendo de la vía de administración. Se proporciona en la bibliografía una orientación de las dosificaciones particulares y los métodos de administración y están disponibles generalmente para los profesionales en la técnica. Los expertos en la técnica emplearán diferentes formulaciones para nucleótidos que para proteínas o sus inhibidores. De manera similar, la administración de polinucleótidos o polipéptidos será específica para células, estados, ubicaciones, etc. particulares. Se describen formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración oral de proteínas, por ejemplo, en las patentes 5.008.114; 5.505.962; 5.641.515; 5.681.811; 5.700.486; 5.766.633; 5.792.451; 5.853.748; 5.972.387; 5.976.569; y 6.051.561.

También se contempla en el presente documento que es posible un método para el diagnóstico de estados patológicos asociados con anomalías en la ruta de la APP en un sujeto, incluyendo pero sin limitarse a la enfermedad de Alzheimer, dados los datos de la tabla 1. Por ejemplo, el método puede comprender medir el nivel de polipéptidos codificados por uno cualquiera o más de los homólogos genéticos humanos de los genes de la tabla 1 en una muestra biológica de un sujeto, en el que un nivel anómalo de uno cualquiera o más de dichos polipéptidos en relación con el nivel de los mismos en un sujeto normal es diagnóstico de dichos estados. Puede realizarse un ensayo de este tipo usando tecnologías convencionales familiares para el experto en la técnica.

En otra realización, se administran los ácidos nucleicos que comprenden una secuencia que codifica para un homólogo humano de un modificador genético o derivado funcional del mismo para estimular la función de la ruta de la APP, a modo de terapia génica. La terapia génica se refiere a la terapia realizada mediante la administración de un ácido nucleico a un sujeto. En esta realización de la invención, el ácido nucleico produce su proteína codificada que media un efecto terapéutico estimulando la función de la ruta de la APP normal.

Cualquiera de los métodos de terapia génica disponibles en la técnica puede usarse según la presente invención. Se describen a continuación métodos a modo de ejemplo.

En un aspecto preferido, el agente terapéutico comprende el ácido nucleico para un modificador genético que es parte de un vector de expresión que expresa una proteína modificadora genética o fragmento o proteína quimérica de la misma en un huésped adecuado. En particular, tal ácido nucleico tiene un promotor unido funcionalmente a la región codificante de la proteína modificadora genética, siendo tal promotor inducible o constitutivo, y, opcionalmente, específico de tenido. En otra realización particular, se usa una molécula de ácido nucleico en la que las secuencias codificantes de la proteína modificadora y cualesquiera otras secuencias deseadas están flanqueadas por regiones que estimulan la recombinación homóloga en un sitio deseado del genoma, proporcionando así la expresión intracromosómica del ácido nucleico (Koller y Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438).

La administración del ácido nucleico en un paciente puede ser o bien directa, en cuyo caso el paciente se expone directamente al ácido nucleico o al vector que porta el ácido nucleico, o bien indirecta, en cuyo caso, las células se transforman en primer lugar con el ácido nucleico in vivo, después se trasplantan al paciente. Estos dos enfoques se conocen, respectivamente, como terapia génica in vivo o ex vivo.

En una realización específica, el ácido nucleico se administra directamente in vivo, cuando se expresa para producir el producto codificado. Esto puede conseguirse mediante cualquiera de numerosos métodos conocidos en técnica, por ejemplo, construyéndolo como parte de un vector de expresión de ácidos nucleicos apropiado y administrándolo de modo que llega a ser intracelular, por ejemplo, mediante infección usando un vector retroviral o de otro virus defectuoso o atenuado (véase, por ejemplo, la patente estadounidense número 4.980.286 y otras mencionadas más adelante), o mediante inyección directa de ADN desnudo, o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola génica; Biolistic, Dupont), o recubriendo con lípidos o receptores de la superficie celular o agentes de transfección, encapsulación en liposomas, micropartículas, o microcápsulas, o administrándolo unidas a un péptido que se sabe que entra en el núcleo, administrándolo unido a un ligando sometido a endocitosis mediada por receptor (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses 5.166.320; 5.728.399; 5.874.297; y 6.030.954) (que puede usarse para seleccionar como objetivo tipos celulares que expresan específicamente los receptores), etc. En otra realización, puede formarse un complejo de ácido nucleico-ligando en el que el ligando comprende un péptido viral fusogénico para alterar los endosomas, permitiendo que el ácido nucleico evite la degradación lisosómica. Todavía en otra realización, el ácido nucleico puede seleccionarse como objetivo in vivo para la captación y expresión específicas de células, seleccionando como objetivo un receptor específico (véanse, por ejemplo, las publicaciones WO 92/06180; WO 92/22635; WO92/20316; WO93/14188; y WO 93/20221). Alternativamente, el ácido nucleico puede introducirse de manera intracelular e incorporarse dentro del ADN de la célula huésped para la expresión, mediante recombinación homóloga (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses 5.413.923; 5.416.260; y 5.574.205; y Zijlstra et al, 1989, Nature 342:435-438).

En una realización específica, se usa un vector viral que contiene un ácido nucleico modificador. Por ejemplo, puede usarse un vector retroviral (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses 5.219.740; 5.604.090; y 5.834.182). Estos vectores retrovirales se han modificado para delecionar secuencias retrovirales que no son necesarias para el empaquetamiento del genoma viral y la integración en el ADN de la célula huésped. El ácido nucleico modificador que va a usarse en la terapia génica se clona dentro del vector, lo que facilita la administración del gen a un paciente.

Los adenovirus son otros vectores virales que pueden usarse en la terapia génica. Los adenovirus son vehículos especialmente atractivos para administrar genes al epitelio respiratorio. Los adenovirus infectan de manera natural el epitelio, en el que provocan una enfermedad leve. Otras dianas para los sistemas de administración basados en adenovirus son el hígado, el sistema nervioso central, células endoteliales, y músculo. Los adenovirus tienen la ventaja de que pueden infectar células que no se dividen. Los métodos para realizar terapia génica basada en adenovirus se describen en, por ejemplo, las patentes estadounidenses 5.824.544; 5.868.040; 5.871.722; 5.880.102; 5.882.877; 5.885.808; 5.932.210; 5.981.225; 5.994.106; 5.994.132; 5.994.134; 6.001.557; y 6.033.8843.

También se han propuesto los virus adeno-asociados (VAA) para su uso en terapia génica. Los métodos para producir y utilizar VAA se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses 5.173.414; 5.252.479; 5.552.311; 5.658.785; 5.763.416; 5.773.289; 5.843.742; 5.869.040; 5.942.496; y 5.948.675.

Otro enfoque para la terapia génica implica transferir un gen a células en cultivos celulares mediante métodos tales como electroporación, lipofección, transfección mediada por fosfato de calcio, o infección viral. Normalmente, el método de transferencia incluye la transferencia de un marcador seleccionable a las células. Las células se colocan entonces bajo selección para aislar aquellas células que han captado y están expresando el gen transferido. Esas células se administran entonces a un paciente.

En esta realización, el ácido nucleico se introduce en una célula antes de la administración in vivo de la célula recombinante resultante. Tal introducción puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a transfección, electroporación, microinyección, infección con un vector viral o bacteriófago que contiene las secuencias de ácido nucleico, fusión celular, transferencia génica mediada por cromosomas, transferencia génica mediada por microcélulas, fusión de esferoplastos, etc. Se conocen en la técnica numerosas técnicas para la introducción de genes foráneos en células y pueden usarse según la presente invención, siempre que las funciones de desarrollo y fisiológicas necesarias de las células receptoras no se alteren. La técnica debe proporcionar la transferencia estable del ácido nucleico a la célula, de modo que el ácido nucleico puede expresarse por la célula y preferiblemente puede heredarse y expresarse por su progenie celular.

Las células recombinantes resultantes pueden administrarse a un paciente mediante diversos métodos conocidos en la técnica. En una realización preferida, se inyectan células epiteliales, por ejemplo, por vía subcutánea. En otra realización, pueden aplicarse células cutáneas recombinantes como un injerto cutáneo sobre el paciente. Las células sanguíneas recombinantes (por ejemplo, células madre o progenitoras hematopoyéticas) se administran preferiblemente por vía intravenosa. La cantidad de células prevista para su uso depende del efecto deseado, estado del paciente, etc., y puede determinarse por un experto en la técnica.

Las células dentro de las que puede introducirse un ácido nucleico para fines de terapia génica abarcan cualquier tipo celular deseado, disponible, e incluyen pero no se limitan a células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, células musculares, hepatocitos; células sanguíneas tales como linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariocitos, granulocitos; diversas células madre o progenitoras, en particular células madre o progenitoras hematopoyéticas, por ejemplo, tal como se obtienen de la médula ósea, sangre del cordón umbilical, sangre periférica, hígado fetal, etc.

En una realización preferida, la célula usada para la terapia génica es autóloga para el paciente.

En una realización en la que se usan células recombinantes en la terapia génica, se introduce un ácido nucleico modificador en las células de modo que puede expresarse mediante las células o su progenie, y las células recombinantes se administran entonces in vivo para un efecto terapéutico. En una realización específica, se usan células madre o progenitoras. Cualquier célula madre y/o progenitora que pueda aislarse y mantenerse in vitro puede usarse potencialmente según esta realización de la presente invención. Tales células madre incluyen pero no se limitan a células madre hematopoyéticas (CMH), células madre de tejidos epiteliales tales como la piel y el revestimiento interior del intestino, células del músculo cardiaco embrional no humanas, células madre del hígado (véase, por ejemplo, el documento WO 94/08598), y células madre neurales (Stemple y Anderson, 1992, Cell 71:973-985).

Pueden obtenerse células madre epiteliales (CME) o queratinocitos de tejidos tales como la piel y el revestimiento interior del intestino mediante procedimientos conocidos (Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A:229). En tejidos epiteliales estratificados tales como la piel, se produce la renovación mediante mitosis de células madre dentro de la capa germinal, la capa más cercana a la lámina basal. Las células madre dentro del revestimiento interior del intestino proporcionan una velocidad de renovación rápida de este tejido. Las CME o queratinocitos obtenidos de la piel o el revestimiento interior del intestino de un paciente o donante pueden hacerse crecer en cultivo de tejidos (Pittelkow y Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61:771). Si las CME las proporciona un donante, también puede usarse un método para la supresión de la reactividad del huésped frente al injerto (por ejemplo, irradiación, administración de fármacos o anticuerpos para promover una inmunosupresión suave).

Con respecto a las células madre hematopoyéticas (CMH), puede usarse cualquier técnica que proporcione el aislamiento, la propagación, y el mantenimiento in vitro de las CMH en esta realización de la invención. Las técnicas mediante las que puede conseguirse esto incluyen (a) el aislamiento y establecimiento de cultivos de CMH a partir de células de la médula ósea aisladas del futuro huésped, o un donante, o (b) el uso de cultivos de CMH a largo plazo establecidos previamente, que pueden ser alogénicos o xenogénicos. Se usan preferiblemente CMH no autólogas junto con un método para suprimir las reacciones inmunitarias frente al trasplante del futuro huésped/paciente. Pueden obtenerse células de la médula ósea humana de la cresta ilíaca posterior mediante aspiración con aguja (véase, por ejemplo, Kodo et al., 1984, J. Clin. Invest. 73:1377-1384). Las CMH pueden prepararse altamente enriquecidas o en forma sustancialmente pura. Este enriquecimiento puede conseguirse antes, durante, o después de cultivar a largo plazo, y puede realizarse mediante cualquier técnica conocida en la técnica. Los cultivos a largo plazo de células de la médula ósea pueden establecerse y mantenerse usando, por ejemplo, técnicas de cultivo celular de Dexter modificadas (Dexter et al., 1977, J. Cell Physiol. 91:335) o técnicas de cultivo de Witlock-Witte (Witlock y Witte, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:3608-3612).

En una realización específica, el ácido nucleico que va a introducirse para fines de terapia génica comprende un promotor inducible unido funcionalmente a la región codificante, de modo que la expresión del ácido nucleico puede controlarse controlando la presencia o ausencia del inductor apropiado para la transcripción.

Una realización adicional de la presente descripción se refiere al uso terapéutico de un anticuerpo purificado o un fragmento del mismo para el tratamiento de estados asociados con anomalías en la ruta de la APP, incluyendo pero sin limitarse a, EA. Se contempla que el anticuerpo purificado o un fragmento del mismo se una específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los homólogos humanos de los modificadores genéticos identificados en la tabla 1, preferiblemente, los polipéptidos de homólogos humanos ubicados en el cromosoma 10 descritos en el presente documento, lo más preferiblemente, el polipéptido codificado por SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 o SEQ m NO 53, es decir las secuencias de noc A curadas, o a un fragmento de dichos polipéptidos. Una realización preferida se refiere a un fragmento de un anticuerpo de este tipo, siendo el fragmento un fragmento Fab o F(ab')_{2}. En particular, el anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o un anticuerpo
monoclonal.

Se describen en el presente documento métodos para la producción de anticuerpos que pueden reconocer específicamente uno o más epítopos génicos expresados diferencialmente. Tales anticuerpos pueden incluir, pero no se limitan a anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (AcM), anticuerpos humanizados o quiméricos, anticuerpos de cadena única, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos producidos mediante una biblioteca de expresión de Fab, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-id), y fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores. Tales anticuerpos pueden usarse, por ejemplo, en la detección de un gen huella, diana, en una muestra biológica, o, alternativamente, como un método para la inhibición de actividad anómala del gen diana. Por tanto, tales anticuerpos pueden utilizarse como parte de los métodos de tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, y/o pueden usarse como parte de las técnicas de diagnóstico mediante lo cual los pacientes pueden someterse a prueba para detectar niveles anómalos de un polipéptido modificador, o para detectar la presencia de formas anómalas de un polipéptido modificador.

Para la producción de anticuerpos contra un polipéptido modificador específico, pueden inmunizarse diversos animales huésped mediante inyección con el polipéptido, o una parte del mismo. Tales animales huésped pueden incluir pero no se limitan a conejos, ratones y ratas, por nombrar sólo unos pocos. Pueden usarse diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie huésped, incluyendo pero sin limitarse a adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles pluronic, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa californiana, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.

Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo derivadas de los sueros de animales inmunizados con un antígeno, tal como un producto génico diana o un derivado funcional antigénico del mismo. Para la producción de anticuerpos policlonales, pueden inmunizarse animales huésped tales como los descritos anteriormente, mediante inyección con un polipéptido modificador, o una parte del mismo, complementado con adyuvantes descritos también anteriormente.

Los anticuerpos monoclonales, que son poblaciones homogéneas de anticuerpos contra un antígeno particular, pueden obtenerse mediante cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo. Estas incluyen, pero no se limitan a la técnica del hibridoma de Kohler y Milstein, (1975, Nature 256:495-497; y patente estadounidense número 4.376.110), la técnica del hibridoma de célula B humana (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030), y la técnica del hibridoma EBY (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96). Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de las mismas. El hibridoma que produce el AcM de esta invención puede cultivarse in vitro o in vivo. La producción de títulos altos de AcM in vivo hace que éste sea el método de producción preferido actualmente.

Además, pueden usarse las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314:452-454) mediante el corte y empalme de los genes de una molécula de anticuerpo de ratón de especificidad antigénica apropiada junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes partes derivan de especies animales diferentes, tales como las que tienen una región variable o hipervariable derivada de un AcM murino y una región constante de inmunoglobulina humana.

Alternativamente, pueden adaptarse las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena única (patente estadounidense número 4.946.778; Bird, 1988, Science 242:423-426; Huston et al., 1988, Proc-Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; y Ward et al., 1989, Nature 334:544-546) para producir anticuerpos de cadena única de genes expresados diferencialmente. Los anticuerpos de cadena única se forman uniendo los fragmentos de cadena pesada y ligera de la región Fv mediante un puente de aminoácidos, dando como resultado un polipéptido de cadena única.

Lo más preferiblemente, pueden adaptarse las técnicas útiles para la producción de "anticuerpos humanizados" para producir anticuerpos contra los polipéptidos, fragmentos, derivados y equivalentes funcionales descritos en el presente documento. Tales técnicas se describen en las patentes estadounidenses números 5.932.448; 5.693.762; 5.693.761; 5.585.089; 5.530.101; 5.910.771; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.545.580; 5.661.016; y 5.770.429.

Pueden generarse fragmentos de anticuerpo que reconocen epítopos específicos mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen pero no se limitan a: los fragmentos F(ab')_{2} que pueden producirse mediante digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab que pueden generarse reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')_{2}. Alternativamente, pueden construirse bibliotecas de expresión de Fab (Huse et al., 1989, Science, 246: 1275-1281) para permitir una identificación rápida y fácil de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada.

Puede usarse preferiblemente un anticuerpo en un método para el diagnóstico de un estado asociado con la regulación anómala de la ruta de la APP y/o enfermedad de Alzheimer en un sujeto, o para identificar un sujeto con una predisposición a dichos estados, que comprende: medir la cantidad de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los homólogos humanos de los modificadores genéticos identificados en la tabla 1, preferiblemente, los polipéptidos de los homólogos humanos ubicados en el cromosoma 10 descritos en el presente documento, lo más preferiblemente, el polipéptido codificado por SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO 53, es decir, las secuencias de noc A curadas, o fragmentos de las mismas, en un tejido o célula apropiados de un sujeto en el que la presencia de una cantidad elevada de dicho polipéptido o fragmentos del mismo, en relación con la cantidad de dicho polipéptido o fragmentos del mismo en el tejido respectivo de un sujeto de control, es diagnóstico de dicho estado. Un método de este tipo forma una realización adicional de la presente invención. Preferiblemente, dicha etapa de detección comprende poner en contacto dicho tejido o células apropiados con un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de uno cualquiera o más de los polipéptidos tratados anteriormente o un fragmento de los mismos y detectar la unión específica de dicho anticuerpo con un polipéptido en dicho tejido o célula apropiados, en el que la detección de la unión específica a un polipéptido indica la presencia de uno cualquiera o más de dichos polipéptidos o un fragmento de los mismos.

Se prefiere particularmente, para la facilidad de la detección, el ensayo de sándwich, del que existen varias variaciones, pretendiéndose que todas ellas estén abarcadas por la presente invención.

Por ejemplo, en un ensayo directo típico, se inmoviliza anticuerpo no marcado sobre un sustrato sólido y la muestra que va a someterse a prueba se pone en contacto con la molécula unida. Tras un periodo de incubación adecuado, durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la formación de un complejo binario anticuerpo-antígeno. En este punto, se añade y se incuba entonces un segundo anticuerpo, marcado con una molécula indicadora que puede inducir una señal detectable, dejando un tiempo suficiente para la formación de un complejo ternario de marcado con anticuerpo-antígeno. Cualquier material sin reaccionar se elimina lavando, y se determina la presencia del antígeno mediante observación de una señal, o puede cuantificarse comparando con una muestra control que contiene cantidades conocidas de antígeno. Las variaciones en el ensayo directo incluyen el ensayo simultáneo, en el que tanto la muestra como el anticuerpo se añaden simultáneamente al anticuerpo unido, o un ensayo inverso en el que el anticuerpo marcado y la muestra que va a someterse a prueba se combinan en primer lugar, se incuban y se añaden al anticuerpo no marcado unido a la superficie. Estas técnicas se conocen bien por los expertos en la técnica, y será fácilmente evidente la posibilidad de variaciones menores. Tal como se usa en el presente documento, un "ensayo de sándwich" pretende abarcar todas las variaciones sobre la técnica de dos sitios básica. Para los inmunoensayos de la presente invención, el único factor limitante es que el anticuerpo marcado es un anticuerpo que es específico para el polipéptido modificador o un fragmento del mismo.

Las moléculas indicadoras más comúnmente usadas en este tipo de ensayo son o bien enzimas, o bien moléculas que contienen fluoróforos o radionúclidos. En el caso de un inmunoensayo enzimático, se conjuga una enzima con el segundo anticuerpo, normalmente mediante glutaraldehído o peryodato. Sin embargo, tal como se reconocerá fácilmente, existe una amplia variedad de técnicas de ligación diferentes, que son bien conocidas por el experto. Las enzimas usadas comúnmente incluyen peroxidasa del rábano, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa y fosfatasa alcalina, entre otras. Los sustratos que van a usarse con las enzimas específicas se eligen generalmente para la producción, con hidrólisis mediante la enzima correspondiente, de un cambio de color detectable. Por ejemplo, el fosfato de p-nitrofenilo es adecuado para su uso con conjugados de la fosfatasa alcalina; para conjugados de peroxidasa, se usan comúnmente 1,2-fenilendiamina o toluidina. También es posible emplear sustratos fluorogénicos, que proporcionan un producto fluorescente en lugar de los sustratos cromogénicos indicados anteriormente. Se añade entonces una solución que contiene el sustrato apropiado al complejo terciario. El sustrato reacciona con la enzima unida al segundo anticuerpo, dando una señal visual cualitativa, que puede cuantificarse adicionalmente, normalmente espectrofotométricamente, para dar una evaluación de la cantidad de proteína modificadora que está presente en la muestra de suero.

Alternativamente, pueden acoplarse químicamente compuestos fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, a anticuerpos sin alterar su capacidad de unión. Cuando se activan mediante iluminación con luz de una longitud de onda particular, el anticuerpo marcado con fluorocromo absorbe la energía de la luz, induciendo un estado de excitabilidad en la molécula, seguido de la emisión de la luz a una longitud de onda mayor característica. La emisión aparece como un color característico detectable visualmente con un microscopio óptico. Las técnicas de inmunofluorescencia y IEE están ambas bien establecidas en la técnica y se prefieren particularmente para el presente método. Sin embargo, también pueden emplearse otras moléculas indicadoras, tales como radioisótopos, moléculas quimioluminiscentes o bioluminiscentes. Será fácilmente evidente para el experto cómo variar el procedimiento para ajustarlo al uso requerido.

Pueden usarse polinucleótidos que codifican para homólogos humanos de modificadores genéticos identificados según los métodos de la presente invención en un método para diagnosticar estados asociados con defectos en la regulación de la ruta de la APP, incluyendo pero sin limitarse a la enfermedad de Alzheimer o para identificar individuos con una predisposición genética a tales estados. Por ejemplo, dicho método comprende detectar el nivel de transcripción de ARNm transcrito a partir del gen que codifica para un homólogo humano de un modificador genético descrito en el presente documento en un tejido o célula apropiados de un ser humano, en el que la transcripción anómala comparada con niveles de control es diagnóstico de dicho estado o una predisposición a dicho estado. En particular, dicho modificador genético comprende la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los homólogos humanos de los modificadores genéticos identificados en la tabla 1, preferiblemente, los polipéptidos de homólogos humanos ubicados en el cromosoma 10 descritos en el presente documento, lo más preferiblemente, los polipéptidos codificados por SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO 53, es decir, las secuencias de noc A curadas, o el polipéptido codificado por SEQ ID NO: 35, es decir la secuencia de EGR2, o los polipéptidos codificados por SEQ ID NO: 41, o SEQ ID NO: 43, las secuencias relacionadas con la anquirina.

La detección de una forma mutada de un gen que codifica para un modificador genético identificado según los métodos de la presente invención que está asociado con una disfunción, proporcionará una herramienta de diagnóstico que puede añadirse a, o definir, un diagnóstico de una enfermedad, o propensión a una enfermedad, que resulta de la infraexpresión, sobreexpresión o expresión espacial o temporal alterada del gen. Dichas enfermedades pueden incluir, pero no se limitan a, enfermedad de Alzheimer u otros estados caracterizados por errores en la regulación de la ruta de la APP. Los individuos que portan mutaciones en dichos genes pueden detectarse al nivel del ADN mediante una variedad de técnicas.

Pueden obtenerse ácidos nucleicos, en particular ARNm, para el diagnóstico, a partir de células de un sujeto, tales como de la sangre, orina, saliva, biopsia de tejidos o material de autopsia. Puede usarse el ADN genómico directamente para la detección o puede amplificarse enzimáticamente usando PCR u otras técnicas de amplificación antes del análisis. También pueden usarse ARN o ADNc de manera similar. Pueden detectarse deleciones e inserciones por un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con el genotipo normal. La hibridación de ADN amplificado con secuencias de nucleótidos marcadas que codifican para el homólogo humano de un polipéptido modificador genético de la presente invención, puede identificar mutaciones puntuales. Pueden distinguirse secuencias apareadas perfectamente de dúplex desapareados mediante digestión con ARNasa o mediante diferencias en las temperaturas de fusión. También pueden detectarse diferencias en la secuencia de ADN mediante alteraciones en la movilidad electroforética de fragmentos de ADN en geles, con o sin agentes desnaturalizantes, o mediante secuenciación de ADN directa (por ejemplo, Myers et al., Science (1985) 230:1242). También pueden revelarse cambios en la secuencia en ubicaciones específicas mediante ensayos de protección por la nucleasa, tal como protección por ARNasa y S1 o el método de escisión química (véase Cotton et al., Proc Natl Acad Sci USA (1985) 85: 4397-4401). En otra realización, puede construirse una serie de sondas de oligonucleótidos que comprenden la secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido modificador genético de la presente invención o fragmentos de una secuencia de nucleótidos de este tipo para realizar una selección eficaz de por ejemplo, mutaciones genéticas. Los métodos de tecnología en serie se conocen bien y tiene aplicabilidad general y pueden usarse para abordar una variedad de cuestiones en genética molecular incluyendo la expresión génica, ligamiento genético, y variabilidad genética (véase por ejemplo: M. Chee et al., Science, vol 274, págs. 610-613 (1996)).

Los ensayos de diagnóstico ofrecen un procedimiento para diagnosticar o determinar una propensión a la enfermedad a través de la detección de una mutación en un homólogo humano de un gen modificador mediante los métodos descritos. Además, tales enfermedades pueden diagnosticarse mediante métodos que comprenden determinar a partir de una muestra derivada de un sujeto, un nivel aumentado o disminuido de manera anómala de polipéptido o ARNm. La expresión aumentada o disminuida puede medirse al nivel del ARN usando cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica para la cuantificación de polinucleótidos, tales como, por ejemplo, amplificación de ácido nucleico, por ejemplo PCR, RT-PCR, protección por ARNasa, inmunotransferencia de tipo Northern y otros métodos de hibridación. Las técnicas de ensayo que pueden usarse para determinar los niveles de una proteína, tal como un polipéptido de la presente invención, en una muestra derivada de un huésped, se conocen bien por los expertos en la técnica. Tales métodos de ensayo incluyen radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis por inmunotransferencia de tipo Western y ensayos de ELISA.

Tales condiciones de hibridación pueden ser altamente rigurosas o menos altamente rigurosas, tal como se describió anteriormente. En los casos en los que las moléculas de ácido nucleico son desoxioligonucleótidos ("oligos"), condiciones altamente rigurosas puede referirse a, por ejemplo, lavar en 6X SSC/pirofosfato de sodio al 0,05% a 37ºC (para oligos de 14 bases), 48ºC (para oligos de 17 bases), 55ºC (para oligos de 20 bases), y 60ºC (para oligos de 23 bases). Los intervalos adecuados de tales condiciones de rigurosidad para ácidos nucleicos de composiciones variables se describen en Krause y Aaronson (1991), Methods in Enzymology, 200:546-556 además de Maniatis et al., citado anteriormente.

Por tanto, en otro aspecto, la presente descripción se refiere a un kit de diagnóstico que comprende:

(a) un polinucleótido de un homólogo humano de un modificador genético identificado según los métodos de la presente invención, preferiblemente un polipéptido de un homólogo humano ubicado en el cromosoma 10 descrito en el presente documento, o un fragmento del mismo,

(b) una secuencia de nucleótidos complementaria a la de (a);

(c) un polipéptido de un modificador genético de la presente invención, preferiblemente el polipéptido de un homólogo humano de los modificadores genéticos identificados en la tabla 1, preferiblemente, el polipéptido de un homólogo humano ubicado en el cromosoma 10 descrito en el presente documento, o un fragmento del mismo; o

(d) un anticuerpo contra un polipéptido modificador genético de la presente invención, preferiblemente contra el polipéptido de un homólogo humano de los modificadores genéticos identificados en la tabla 1, preferiblemente, el polipéptido de un homólogo humano ubicado en el cromosoma 10 descrito en el presente documento.

Se apreciará que en cualquier kit de este tipo, (a), (b), (c) o (d) puede comprender un componente sustancial. También se contempla que un kit de este tipo puede comprender componentes dirigidos contra uno o más de dichos homólogos humanos. Un kit de este tipo puede usarse para diagnosticar una enfermedad o propensión a una enfermedad, particularmente a una enfermedad o estado asociado con errores en la regulación de la ruta de la APP incluyendo, pero sin limitarse a, la enfermedad de Alzheimer.

Las secuencias de nucleótidos de los homólogos humanos de modificadores genéticos de la presente invención también pueden usarse para análisis de ligamiento genético. Dado que se conoce la secuencia del genoma humano completo, la secuencia de nucleótidos de interés puede mapearse específicamente en una ubicación particular en un cromosoma humano individual. El mapeo de secuencias relevantes en cromosomas según la presente invención es una primera etapa importante para correlacionar esas secuencias con una enfermedad asociada a un gen. Una vez que la secuencia se ha mapeado en una ubicación cromosómica precisa, puede correlacionarse la posición física de la secuencia en el cromosoma con los datos del mapa genético. Tales datos se encuentran en, por ejemplo, V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (disponible en internet a través de la Johns Hopkins University Welch Medical Library). La relación entre genes y enfermedades que se han mapeado en la misma región cromosómica se identifica entonces a través de análisis de ligamiento (herencia conjunta de genes adyacentes físicamente). Los datos recientes indican que existe una región en el cromosoma 10 humano ligada a la enfermedad de Alzheimer (Bertram et al., Ertekin-Taner et al., Myers et al., Science 290, 2302-2305, 2000), por tanto, los homólogos humanos de modificadores genéticos identificados según los métodos de la presente invención pueden someterse a análisis por mapeo cromosómico usando técnicas convencionales.

También se describe una molécula de ácido nucleico aislada, preferiblemente una molécula de ADN, en la que la molécula de ácido nucleico es la secuencia curada del homólogo noc A humano expuesta en SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO:17 o SEQ ID NO 53. Asimismo, se prefiere una molécula de ácido nucleico aislada, preferiblemente una molécula de ADN, que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de EGR2, expuesta en SEQ ID NO:35. Asimismo, se prefiere una molécula de ácido nucleico aislada, preferiblemente una molécula de ADN, que codifica para un polipéptido que consiste en las secuencias de aminoácidos codificadas por cualquiera de las secuencias de las proteínas de repetición de anquirina, expuestas en SEQ ID NO:41, o SEQ ID NO: 43.

Usando técnicas convencionales, pueden crearse moléculas antisentido, ARN de doble cadena, ADN de triple hélice y ribozimas, dirigidos contra una secuencia de nucleótidos apropiada de un modificador genético. Pueden obtenerse modificaciones de la expresión génica diseñando moléculas antisentido, ADN, o ARN, para en las regiones control de los genes enumerados en la tabla 1, es decir, los promotores, potenciadores e intrones. Se prefieren oligonucleótidos derivados del sitio de inicio de la transcripción, por ejemplo, entre las posiciones -10 y +10 desde el sitio de inicio de la transcripción. De manera similar, puede lograrse la inhibición usando la metodología de apareamiento de bases de "triple hélice". El apareamiento de triple hélice es útil debido a que provoca la inhibición de la capacidad de la doble hélice de abrirse suficientemente para la unión de polimerasas, factores de transcripción, o moléculas reguladoras. Se han descrito en la bibliografía avances terapéuticos recientes usando ADN triple (Gee, J.E. et al. (1994) en: Huber, B.E. y B. I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y.). También pueden diseñarse las moléculas antisentido para que bloqueen la traducción de ARNm impidiendo que el transcrito se una a los ribosomas.

También pueden usarse moléculas de ARN enzimáticas, ribozimas, para catalizar la escisión específica del ARN. El mecanismo de acción de la ribozima implica hibridación específica de secuencia de la molécula de ribozima con ARN diana complementario, seguido de escisión endonucleolítica. Los ejemplos que pueden usarse incluyen moléculas de ribozima con el motivo de cabeza de martillo obtenidas por ingeniería genética que pueden catalizar eficaz y específicamente la escisión endonucleolítica de secuencias que codifican para los productos génicos de la tabla 1.

Los sitios de escisión de ribozima específicos dentro de cualquier diana de ARN potencial se identifican inicialmente explorando la molécula diana para detectar sitios de escisión de ribozimas que incluyan las siguientes secuencias: GUA, GUU y GUC. Una vez identificados, pueden evaluarse secuencias de ARN cortas de entre 15 y 20 ribonucleótidos que corresponden a la región del gen diana que contiene el sitio de escisión para detectar características estructurales secundarias que puedan convertir al oligonucleótido en inviable. También puede evaluarse la adecuación de las dianas candidatas sometiendo a prueba la accesibilidad a la hibridación con oligonucleótidos complementarios usando ensayos de protección por ribonucleasa.

Pueden prepararse moléculas antisentido y ribozimas mediante cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de moléculas de ácido nucleico. Estas incluyen técnicas para sintetizar químicamente oligonucleótidos tales como la síntesis química de fosforoamidita en fase sólida, Alternativamente, pueden generarse moléculas de ARN mediante transcripción in vitro e in vivo de secuencias de ADN que codifican para los genes de la tabla 1. Tales secuencias de ADN pueden incorporarse a una amplia variedad de vectores con promotores de ARN polimerasa adecuados tales como T7 o SP6. Alternativamente, pueden introducirse estos constructos de ADNc que sintetizan ARN antisentido de manera constitutiva o inducible, en líneas celulares, células, o tejidos.

Pueden introducirse vectores en células o tejidos mediante muchos medios disponibles, y pueden usarse in vivo, in vitro o ex vivo. Para el tratamiento ex vivo, pueden introducirse vectores en células madre tomadas del paciente y propagadas de manera clonal para trasplante autólogo de nuevo en el mismo paciente. Puede lograrse la administración mediante transfección y mediante inyecciones de liposomas usando métodos que se conocen bien en la técnica.

También puede lograrse inhibición específica de gen de la expresión génica usando tecnologías de ARN de doble cadena convencionales. Puede encontrarse una descripción de tal tecnología en el documento WO 99/32619.

Todavía adicionalmente, pueden usarse tales moléculas como componentes de métodos de diagnóstico y kits mediante los cuales puede detectarse la presencia de un alelo que provoca enfermedades asociadas con anomalías en la ruta de la APP y/o la enfermedad de Alzheimer.

Otros objetos, características, ventajas y aspectos de la presente invención resultarán evidentes para los expertos a partir de la siguiente descripción. Sin embargo, debe entenderse que la siguiente descripción y los ejemplos específicos, aunque indican realizaciones preferidas de la invención, se dan sólo a modo de ilustración.

Ejemplos

Se llevan a cabo los siguientes procedimientos para realizar los ejemplos:

Moscas transgénicas

Los métodos para la creación de moscas Drosophila melanogaster transgénicas los conoce bien el experto en la técnica. Puede emplearse cualquier método convencional, por ejemplo, las técnicas de laboratorio básicas que están implicadas en la creación de las moscas de la presente invención se describen en Spradling, anteriormente. Tal como se contempla en el presente documento, pueden crearse moscas transgénicas mediante fusión directa de secuencias de ADN de interés con secuencias de control de la expresión tal como se describe a continuación. Por ejemplo, se generan cepas transformadas usando los constructos tratados anteriormente según métodos convencionales. Pueden obtenerse varias inserciones independientes para los constructos, UAS-Abeta40, UAS-Abeta42, UAS-C99wt, UAS-C99V717l (mutación London) y pGMR-Abeta42.

Reservas de mosca

Las líneas de Gal4 que pueden usarse para dirigir la expresión de los transgenes en las moscas transgénicas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, apterous-Gal4, y 7B-Gal4. Las descripciones de las líneas de Gal4 mencionadas y observaciones sobre sus patrones de expresión específicos pueden encontrarse en Flybase (http://flybase.bio.indiana.edu). Las nuevas cepas transgénicas generadas internamente incluyen cepas que portan los transgenes UAS Abeta_{40} y Abeta_{42}, UAS C99 de tipo natural y UAS C99 London (que porta la mutación London asociada a la enfermedad de Alzheimer familiar, EAF) y GMR Abeta_{42}.

La cepa yw; BcElp/CyOHop, que expresa la transposasa, y las cepas yw; Gla/SM6a y yw; Dr/TM3 Sb Ser se obtuvieron de R. Padgett, Waksman Institute, Rutgers University. Las moscas W^{1118} y las moscas GMR-GAL4 eran del centro de reserva Bloomington. La cepa pGMR-1 es una reserva disponible públicamente y se obtuvo del laboratorio G. Rubin en UC Berkeley.

Constructos de ADN y técnicas moleculares

Se amplifica por PCR un fragmento de ADN que codifica para el péptido A\beta 42 y que está fusionado con el péptido señal de la preproencefalina humana, y se clona en el sitio Bgl II del vector de transformación del elemento P específico del ojo de Drosophila, pGMR (Hay et al., 1994 Development 120:2121-2129) y se secuencia el inserto mediante secuenciación de fluorescencia automatizada (ACGT Inc.). Se ha mostrado que el péptido señal de la preproencefalina humana dirige satisfactoriamente la secreción de A\beta 42 a partir de células de mamífero transfectadas. GMR está compuesto de cinco copias en tándem de un elemento de respuesta derivado del promotor del gen rodopsina-1, un sitio de unión para el factor de transcripción GLASS específico del ojo (Ellis et al., Development 119(3):855-65(1993). Por tanto, la expresión de Abeta se dirige según el patrón del activador transcripcional GLASS en el ojo. El fragmento de ADN anterior se clona posteriormente dentro de un vector que contiene el elemento P que facilita la inserción del transgén en el genoma de Drosophila. Todas las manipulaciones moleculares se realizan según protocolos convencionales. (Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, ``Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Se amplifica por PCR un fragmento de ADN que codifica para el péptido C99 y que está fusionado con el péptido señal de la preproencefalina humana, y se clona dentro del vector de transformación pUAST tal como se describe en Brand y Perimmon.

Los constructos UAS-Abeta40, UAS-Abeta42, UAS-C99wt y UAS-C99V7171 contienen el péptido señal del gen de la preproencefalina seguido de fragmentos de Abeta humana (40 o 42) o C99 (de tipo natural o con la mutación London). Los fragmentos humanos se clonan dentro del vector pUAST tal como se describe en Brand y Perrimon, anteriormente. La clonación dentro de este vector coloca la secuencia UAS en sentido 5' de la región transcrita del gen insertado y permite también la integración en el genoma de la mosca a través de recombinación con el elemento P.

Cruces genéticos, análisis y visualización de los fenotipos

Se cruzan las moscas según métodos convencionales excepto porque todos los cruces se mantienen a 29ºC para una expresión máxima de los fenotipos. En el sistema de expresión de Gal4 binario, esta temperatura maximiza la actividad de la proteína Gal4. En el caso de pGMR-Abeta42, se observa que el fenotipo es más fuerte a 29ºC, así que estas moscas se mantienen a esta temperatura también.

Análisis de Western

Puede someterse a ensayo la expresión génica ectópica realizando análisis de Western según métodos convencionales. Los anticuerpos que pueden usarse incluyen el anticuerpo monoclonal 6E10 humano producido contra la parte de beta amiloide del gen de APP y que también reconoce la parte C99 de la APP (Senetek PLC, Napa, CA).

Protocolo del Western

Para detectar la expresión del péptido A\beta 42, se crían moscas de los genotipos K18.1/K18.1, K18.3/K18.3, K18.1/K18.1;K18.3/K18.3, KJ103/TM3Sb Ser, KJ103/KJ103, KJ54/CyO; KJ54/TM2 Ubx y pGMR-1 (moscas que portan el vector pGMR sin inserto) a 29ºC. Se recogen 80-90 cabezas de Drosophila de cada una de las cepas anteriores, se colocan en un tubo eppendorf en hielo seco que contiene 100 \mul de SDS al 2%, sacarosa al 30%, Bistris 0,718 M y Bicina 0,318 M, con inhibidores de la proteasa "completos" (Boehringer Mannheim) y se muelen usando un homogenizador mecánico. Se calientan las muestras durante 5 min a 95ºC, se centrifugan durante 5 min a 12.000 rpm, y se transfieren los sobrenadantes a un tubo eppendorf nuevo. Se añaden \beta-mercaptoetanol al 5% y azul de bromofenol al 0,01% y se hierven las muestras antes de cargarse. Se cargan aproximadamente 200 ng de extracto de proteína total para cada muestra, en un gel de SDS PAGE tricina al 15%/Tris que contiene urea 8 M. El control de péptido A\beta 1-42 es \beta-amiloide humano [1-42] (BIOSOURCE International, nº 03-111). Se hacen pasar las muestras a 40 V en el gel concentrador, y a 120 V en el gel separador. Se transfieren las muestras a membranas de PVDF (BIO-RAD, nº 162-0174) durante 1 h a 100 V, y se hierven posteriormente las membranas en PBS durante 3 min. La hibridación de anticuerpos es tal como sigue: el Ac primario 6E10 (SENETECK PLC, nº 300-02), que reconoce los primeros 19 aminoácidos del péptido A\beta, se usa para sondear (a una concentración de 1:2000) en leche desnatada al 5%, 1X PBS que contiene Tween 20 al 0,1%, durante 90 min a TA. Se lavan las muestras 3 veces durante 5 min, 15 min y 15 minutos cada una, en 1XPBS-Tween-20 al 0,1%. El Ac secundario es anti-ratón-HRP (Amersham Pharmacia Biotech, nº NA 931) y se usa a 1:2000 en leche desnatada al 5%, 1X PBS que contiene Tween 20 al 0,1%, durante 90 min a TA. Se lavan las muestras 3 veces durante 5 min, 15 min y 15 min cada una, en 1X PBS-Tween 20 al 0,1%. Se usa para la detección ECL (reactivos de detección de inmunotransferencia de tipo Western por ECL, Amersham Pharmacia Biotech, nº RPN 2209).

Histología

Se realizan secciones en plástico de cabezas de mosca según métodos convencionales, por ejemplo, según los protocolos descritos en: Drosophila Protocols, página 236. Eds. W. Sullivan, M. Ashbumer, S. Hawley, CSHL Press 2000.

Criosecciones

Se crioseccionan ojos adultos según Wolff, en Drosophila Protocols, CSHL Press, 2000, secciones 13.1 y 13.2. El anticuerpo primario es el 6E10 monoclonal (Senetek), que reconoce el péptido A\beta 42 humano, usado a una dilución de 1:3000. El sistema de detección es el kit Vectastain ABC (con el secundario de IgG anti-ratón biotinilado, y peroxidasa H del rábano) (Vector Laboratories). Las siguientes modificaciones al protocolo están hechas por Wolf: antes de la incubación con el anticuerpo primario 6E10, se bloquean las criosecciones en solución de bloqueo que contiene suero de caballo normal, según el protocolo del kit Vectastain ABC. Se realiza la incubación con el secundario (preadsorbido con tejido del ojo pGMR-1) en PBS/BSA al 1% que contiene suero de caballo normal al 1-2%, también según el protocolo del kit Vectastain ABC. Se sigue el procedimiento para el kit ABC; se realizan incubaciones con el reactivo ABC en PBS/saponina al 0,1%, seguido de lavados 4X de 10 min en PBS/saponina al 0,1%. Se incuban entonces las secciones en 0,5 ml por portaobjeto de la solución de sustrato de peroxidasa H del rábano, 3,3'-diaminobencideno (DAB) 400 \mug/ml, H_{2}O_{2} al 0,006% en PBS/saponina al 0,1%, y se para la reacción tras 3 min con azida de sodio al 0,02% en PBS. Se aclaran las secciones varias veces en PBS y se deshidratan a través de una serie de etanol antes de montarlas en DPX (Fluka).

Caracterización del perfil de ARN para la selección de compuestos

Pueden someterse a ensayo los perfiles de ARN según metodología conocida, incluyendo el uso de análisis por inmunotransferencia de tipo Northern así como tecnología de chip en micromatriz (Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA; Affymetrix , Santa Clara, CA).

Ejemplo 1 El fenotipo de ojo rugoso inducido por la expresión ectópica de A\beta 42

Con el fin de aclarar las rutas y el/los mecanismo(s) en gran parte desconocidos mediante los que A\beta 42 provoca neurodegeneración, se usa como modelo el ojo de Drosophila, un tejido neural. En un esfuerzo por imitar la sobreexpresión de A\beta 42 específica de tejido, se crean moscas transgénicas cuyo genoma comprende el transgén de amiloide GMR-Abeta42 usando el sistema de expresión por fusión de GMR descrito anteriormente con el fin de expresar ectópicamente el transgén en el ojo de Drosophila en desarrollo.

I. La sobreexpresión de A\beta 42 provoca fenotipos de ojo rugoso

Con el fin de expresar el péptido A\beta 42 en el ojo de Drosophila, se clona la secuencia de A\beta 42 dentro del vector pGMR. El vector pGMR ("Glass Multimer Reporter", indicador multimérico de Glass) contiene un pentámero de sitios de unión truncados para el factor de transcripción Glass. Glass se expresa ampliamente durante el desarrollo del ojo, comenzando en los discos ópticos, los precursores de los ojos de Drosophila adultos, en los que se detecta en neuronas fotorreceptoras en diferenciación. Continúa expresándose específicamente en el ojo durante el desarrollo de la pupa y el adulto (Moses et al, 1989 Nature 340 (6234):531-536; Moses y Rubin, 1991 Genes Dev. 5:583-593). Se examina la expresión del elemento GMR en moscas de 2 semanas de edad usando un gen indicador y se detecta una buena expresión, lo que sugiere que el elemento GMR es activo muy entrado en la edad adulta. Por tanto, la expresión regulada por GMR se dirige al tejido del ojo durante todo el desarrollo del ojo, así como durante la edad adulta, convirtiéndolo en un sistema adecuado para la expresión de A\beta 42.

Se establecen originalmente dos líneas transgénicas independientes con el constructo pGMR-A\beta 42, K18.1 y K18.3. Además, se examina otra línea transgénica, pGMR-1, que expresa el mismo vector sin un inserto, como un control negativo. Las moscas control con el transgén pGMR-1 y las moscas que portan una copia de o bien el transgén K18.3 o el K18.1 no muestran un ojo rugoso. De manera similar, las moscas que portan una copia cada una de ambos transgenes anteriores (K18.3 y K18.1) o dos copias del transgén K18.1 también tienen ojos de tipo natural. Por el contrario, las moscas con dos copias de K18.3 tienen un fenotipo de ojo rugoso suave; el examen de los ojos de las moscas al microscopio óptico indica que la sobreexpresión ectópica de A\beta42 altera la disposición trapezoidal regular de las células fotorreceptoras de los omatidios (unidades únicas idénticas, que forman el ojo compuesto de Drosophila). Las observaciones anteriores sugieren que podría haber una respuesta a la dosis del fenotipo de ojo rugoso respecto al número de copias de los transgenes presentes en el genoma de la mosca. Para examinar adicionalmente esta hipótesis, se aumenta el número de transgenes a tres (2 copias de K18.1 con una copia de K18.3 o una copia de K18.1 con dos copias de K18.3). Estas cepas también mostraron ojos rugosos. Finalmente, cuanto estaban presentes cuatro copias del transgén (2 copias de K18.1 con 2 copias de K18.3), las moscas mostraron un fenotipo de ojo rugoso mucho más grave, lo que confirma la hipótesis de respuesta a la dosis. La penetrancia de los fenotipos de ojo rugoso es del 100% en todas las combinaciones genéticas. También debe indicarse que se observa un fenotipo más grave cuando las moscas se crían a 29ºC. Se ha descrito previamente un requisito de temperatura para la expresión de fenotipos del ojo (Karim y Rubin, 1998 Development 125(1):1-9) y puede ser específico para el ojo, incluso aunque no esté limitado a sistemas de expresión que contienen GMR. Tal dependencia podría atribuirse a tasas de transcripción y/o metabólicas superiores, o a una conformación proteica alterada a temperaturas superiores.

II. Los transgénicos de A\beta 42 muestran fenotipos de ojo rugoso, cuya gravedad depende del número de copias del transgén

Está bien establecido que el nivel de expresión de transgenes en Drosophila depende de la ubicación cromosómica de las inserciones específicas, un fenómeno conocido como "efecto de posición" (Kellum, R. y Schedl, P. (1991). Cell. 64: 941-50). Es posible entonces, generando inserciones independientes adicionales con el mismo transgén, recuperar líneas transgénicas que expresan niveles diferentes de la proteína transgénica. Por tanto, podría ser posible aislar líneas transgénicas que expresarían el transgén de A\beta 42 a un nivel lo suficientemente alto como para provocar un fenotipo a una temperatura inferior (25ºC), reflejando así condiciones más fisiológicas. Para someter a prueba esta hipótesis, se generan nuevas inserciones del transgén pGMR-A\beta 42 en el genoma de la mosca, usando "salto de elemento P" (Robertson, H.M. et al. (1988). Genetics 118: 461-470).

Se establecen un total de 19 líneas independientes del constructo pGMR-A\beta 42 en nuevas ubicaciones cromosómicas. Se consideran las nuevas cepas como que portan nuevas inserciones basándose en el enlace cromosómico o estado letal homocigótico del transgén, así como mediante diferencias en el color del ojo (provocadas por niveles de expresión diferencial del gen blanco, usado como un marcador de la transformación). Se crían posteriormente larvas jóvenes de las nuevas cepas anteriores a 29ºC hasta la eclosión y se examinan para detectar la presencia de un fenotipo del ojo. De las 19 líneas nuevas, 7 líneas, o el 38%, muestran un fenotipo de ojo rugoso. Las cepas que muestran un fenotipo de ojo rugoso se crían posteriormente a 25ºC y se puntúa el fenotipo del ojo.

Las nuevas líneas transgénicas muestran grados variables de gravedad fenotípica, mostrando algunas de ellas un fenotipo más grave que el que se observó originalmente en la línea K18.1 y K18.3. Un ejemplo de este tipo es la línea KJ.103, en la que una copia del transgén convierte los ojos adultos en suavemente rugosos, caracterizada por la presencia de "puntos" más oscuros intercalados (correspondientes a omatidios pigmentados en rojo más oscuro) en el lado ventral del ojo, mientras que dos copias del transgén provocan desorganización extensa de los fotorreceptores. De manera más importante, esta línea específica muestra el fenotipo de ojo rugoso incluso cuando las moscas se crían a 25ºC. Cuando las moscas KJ.103 se crían a 29ºC, la gravedad del fenotipo provocado por o bien una o bien dos copias del transgén aumenta espectacularmente.

En resumen, los fenotipos de ojo rugoso provocados por el péptido A\beta 42 muestran un intervalo de gravedad. Las líneas muy suaves muestran normalmente numerosos "puntos" oscuros/negros en el lado ventral del ojo, mientras que las líneas suaves tienen una apariencia más rugosa, desorganizada que cubre la parte ventral del ojo. Las líneas moderadas muestran mayor rugosidad en todo el ojo, mientras que en las líneas más graves el ojo entero parece haber perdido/fusionado muchos de los omatidios y cerdas interomatidiales, y el ojo entero tiene una apariencia lisa, brillante. De manera interesante, el tamaño del ojo está afectado sólo moderadamente en moscas con el nivel más alto de expresión de A\beta 42 (cepa KJ54). Esto concuerda con observaciones en moscas que expresan \alpha-sinucleína humana (Feany, M.B. y Bender, W.W. (2000) Nature 404:394-398). En moscas que expresan huntingtina humana expandida con poliglutamina, se observa una reducción muy ligera del tamaño del ojo, en las líneas transgénicas de expresión más fuerte (Warrick, J.M., et al (1998). Cell 93: 939-949). Los resultados anteriores sugieren que la neurodegeneración inducida por la sobreexpresión de genes de la enfermedad humana difiere de los fenotipos provocados por la sobreexpresión de genes que actúan en rutas apoptóticas (Grether, M. E. et al. (1995). Genes Dev. 9, 1694-1708), en las que se ven afectados principalmente el tamaño o el ojo.

Basándose en los resultados anteriores, se plantea la hipótesis de que la gravedad del fenotipo de ojo rugoso depende de la cantidad de proteína Abeta presente. Como consecuencia de esta hipótesis, debe esperarse que el transgén KJ.103 muestre un nivel superior de expresión proteica que el transgén K18.3 (véase a continuación).

III. La expresión del fenotipo de ojo rugoso se correlaciona con los niveles de proteína A\beta42

Para determinar si la gravedad del fenotipo de ojo rugoso se correlaciona con los niveles de expresión del péptido A\beta 42, se realizan análisis por inmunotransferencia de tipo Western de extractos proteicos de cabezas de Drosophila (las cepas usadas se describen en los métodos anteriores). Los resultados indican que los animales con dos copias del transgén tienen aproximadamente dos veces la cantidad de péptido A\beta 42 que los animales con una copia del transgén. De manera interesante, incluso aunque las moscas con dos copias de K18.1 expresan el péptido A\beta 42 en cantidades detectables, no tienen un fenotipo de ojo adulto visible. Las moscas con dos copias del transgén K18.3 de expresión superior, que expresan cantidades globales más grandes de péptido A\beta 42, sí muestran el fenotipo de ojo rugoso. Esto es también cierto para las moscas que expresan dos copias del transgén K18.1 y dos copias del K18.3. Las moscas que expresan sólo una copia del transgén KJ103 tienen cantidades aproximadamente iguales de proteína que las moscas que expresan dos copias del transgén K18.3, lo que confirma la hipótesis de que el transgén KJ103 muestra niveles superiores de expresión proteica relativa.

Los resultados anteriores indican que existe un requisito de un determinado nivel de proteína A\beta42 con el fin de generar un fenotipo visible. Todavía es posible que cantidades inferiores de expresión de A\beta 42 provoquen alteraciones menores que sólo serían visibles al nivel ultraestructural. Para someter a prueba esto, se examinaron secciones delgadas (1,5 \mum) de cabezas de moscas adultas. Estos datos indican que, comparados con los ojos de una mosca que porta el vector pGMR vacío, en los que se presentan regularmente los fotorreceptores que se tiñen con azul de toluidina, las moscas que portan una copia del transgén K18.3 de expresión moderada tienen pequeñas anomalías - faltan algunos fotorreceptores, se forman masas que se tiñen de azul alrededor de los omatidios y aparecen algunos huecos en el tejido. Estos ojos parecen macroscópicamente normales.

Las secciones de ojos que expresan dos copias del transgén K18.3, de acuerdo con observaciones al nivel macroscópico, muestran una desorganización variable. A medida que el fenotipo empeora, la concentración de masas densas, que se tiñen alrededor de los omatidios aumenta, como lo hacen los huecos en el tejido. Los omatidios parecen más pequeños y faltan fotorreceptores. Dos copias del transgén KJ103 de expresión superior muestran un fenotipo similar en gravedad. Finalmente, los ojos de Drosophila que expresan cuatro copias del transgén KJ54 de expresión fuerte muestran una pérdida casi completa de fotorreceptores. Adicionalmente, estos ojos muestran una abundancia de masas densas, que se tiñen y de huecos en el tejido. Incluso aunque no está claro en este punto si las masas densas, que se tiñen que rodean los omatidios son células anómalas/moribundas o si contienen péptido Abeta de agregación, está claro que su acumulación coincide con la degeneración global del ojo observada.

Con el fin de visualizar la expresión de beta-amiloide en el tejido ocular, se tiñen secciones de ojos que expresan A\beta con un anticuerpo que reconoce el péptido A\beta humano. Las secciones transversales del tejido ocular muestran una tinción por puntos que está ausente en los controles. Se plantea la hipótesis de que esta tinción por puntos corresponde a depósitos/agregados pequeños de beta amiloide. La ubicación celular de esta tinción así como la naturaleza exacta del agregado/depósito, se está investigando usando colorantes de tinción de A\beta conocidos.

En resumen, se describe en el presente documento que la introducción de más copias del transgén A\beta 42 en el ojo de Drosophila, reflejada por niveles aumentados de proteína A\beta, tiene un efecto aditivo sobre el fenotipo de ojo rugoso. Es posible que se necesite una determinada concentración del péptido A\beta 42 para afectar a su estado de agregación/conformación. Alternativamente, podrían necesitarse niveles de saturación del péptido para la manifestación del efecto tóxico. El hecho de que A\beta ejerza efectos neurotóxicos en varias rutas de señalización, (niveles de calcio intracelular, estrés oxidativo, respuesta inflamatoria, señalización por receptores muscarínicos y nicotínicos, revisados en Fraser, S.P., et al (1997). Trends Neurosci. 20: 67-72; Mattson, M.P. (1997). Physiol. Rev. 77: 1081-1132; y Coughlan, C.M. y Breen, K.C. (2000). Pharmacol. and Ther. 86: 111-144; Hellström-Lindahland Court, 2000 Behav Brain Res. 113 (1-2):159-168), podría indicar la necesidad de niveles de saturación con el fin de provocar alteraciones. Sin embargo, está claro que la expresión de cantidades moderadas del péptido no parece tener consecuencias para la estructura del ojo adulto al nivel morfológico macroscópico.

IV. El fenotipo de ojo rugoso inducido por el péptido A\beta 42 empeora con la edad

Está bien establecido que en pacientes con Alzheimer, la acumulación crónica de péptido A\beta conduce a la manifestación inicial de la enfermedad y al progresivo empeoramiento de los síntomas. Con el fin de someter a prueba si se podría imitar este aspecto de la enfermedad en el modelo de Drosophila, se registra el grado de rugosidad del fenotipo del ojo en moscas de edad avanzada.

Se examinan dos cepas de moscas, que expresan pGMR1 (como control negativo) y K18.3. Se usan moscas K18.3 porque en esta cepa transgénica hay un intervalo de gravedad fenotípica y por tanto es más fácil registrar los cambios. Se crían moscas de las dos cepas a 25ºC y 0-2 días tras la eclosión se transfieren a 29ºC, para inducir una expresión superior del transgén. Después de eso, se puntúa el fenotipo del ojo de la mosca aproximadamente cada semana, durante un total de un mes. Las moscas K18.3 se clasifican en tres grupos diferentes (moderado, suave, intermedio), según la gravedad observada del fenotipo del ojo. Tal como se mencionó previamente, las moscas que expresan pGMR1 no mostraron ningún fenotipo del ojo.

Los datos indican un cambio en la gravedad fenotípica de las moscas que expresan Abeta a medida que envejecen: cuando las moscas eclosionan en primer lugar, no se observan ojos con un fenotipo intermedio, mientras que el 15% de la población a los siete días tiene un fenotipo intermedio. También a los 7 días, toda la progenie muestra un grado de fenotipo de ojo rugoso, mientras que el 42% no muestran ningún fenotipo en la eclosión. A los 32 días, incluso aunque un gran número de moscas han muerto, la proporción global de moscas con fenotipo suave frente a intermedio no cambia significativamente, lo que sugiere que se ha alcanzado el efecto máximo de la expresión de Abeta.

El modelo de Drosophila descrito en el presente documento parece que esta imitando el empeoramiento progresivo y asociado a la edad de los síntomas de la enfermedad de Alzheimer, un aspecto importante de la enfermedad. El aumento observado en la gravedad del fenotipo del ojo a medida que las moscas envejecen podría atribuirse a un aumento de la sensibilidad de las células neuronales a los niveles de péptido A\beta. De hecho, tal como se mencionó anteriormente, se está produciendo péptido A\beta durante toda la fase adulta de Drosophila. Por tanto, es posible que no pueda darse la vuelta al aumento de los niveles de A\beta, dando como resultado la acumulación del péptido en las células de Drosophila. Alternativamente, es posible que las células envejecidas sean más vulnerables a la presencia de péptido A\beta.

V. El fenotipo de ojo rugoso y el grado de células apoptóticas en discos imaginales del ojo larval y en ojos adultos

Tal como se mencionó anteriormente, el péptido A\beta 42 tiene efectos tóxicos conocidos y se sugiere que desempeña un papel en la apoptosis. Basándose en esto, se examinan discos imaginales del ojo larval de tercer estadio, los precursores del ojo adulto, para obtener pruebas de la apoptosis, o muerte celular programada. Se tiñen discos imaginales de ojos diseccionados de larvas K18.1 K18.1; K18.3/K18.3,criadas a 29ºC, con naranja de acridina según métodos convencionales, provocando la fluorescencia de las células apoptóticas. Como controles, se usan las siguientes cepas, ninguna de las cuales muestra ninguna anomalía en el ojo: W^{1118} (un control de tipo natural) y pGMR- 1 (que porta el vector pGMR "vacío") crecidas a 29ºC y GMR-GAL4 (que expresa Gal4 bajo el control del elemento GMR), criada a 18ºC.

Los resultados indican que se observa poca o nada de muerte celular en el control de tipo natural, W^{1118}. Por el contrario, puede detectarse alguna cantidad de muerte celular en la línea K18.1/K18.1; K18.3/K18.3. Cuando se examinan los controles que portan el vector pGMR pero no muestran ningún fenotipo del ojo (pGMR-1 y GMR-GAL4), se observa también algo de muerte celular, comparable en grado a la observada en las moscas experimentales, K18.1/K18.1; K18.3 K18.3. Por tanto, parece probable que se tolere una cierta cantidad de muerte celular durante el desarrollo del ojo y no provoque ningún defecto del ojo adulto, al menos al nivel morfológico macroscópico. Además, se sugiere en el presente documento que si la apoptosis tiene cualquier implicación en la generación del fenotipo de ojo rugoso, no se manifiesta durante el desarrollo temprano del ojo.

Para someter a prueba si el fenotipo de ojo rugoso observado está provocado por la apoptosis durante las fases adultas de Drosophila, se expresa conjuntamente el inhibidor DIAP1 de la apoptosis en el ojo de Drosophila. Podría esperarse que la expresión conjunta de DIAP1 en ojos que expresan Abeta suprima, al menos parcialmente, el fenotipo de ojo rugoso (datos no mostrados). Dado que no se observa supresión con dos cepas que expresan DIAP diferentes, puede ser que el fenotipo de ojo rugoso observado no esté provocado por muerte celular apoptótica inducida ectópicamente. Se obtuvieron los mismos resultados cuando se usó el gen P35 baculoviral antiapoptótico. Estos resultados sugieren que los efectos provocados por el péptido A\beta 42 en el ojo de Drosophila podrían estar mediados por rutas celulares que no dan como resultado la apoptosis.

Las acciones de A\beta 42 son bastante complejas y podrían afectar a otras proteínas que se conoce que son factores en el desarrollo de la EA. Se ha mostrado que PS 1 y PS 2 inmunoprecipitan conjuntamente con APP (Xia et al., 1997 PNAS USA 94 (15):8208-13) y que A\beta 42 puede unirse directamente a PS 2 in vitro (Czech et al., 1999 Society for Neuroscience 25:641.1). Es interesante indicar que la sobreexpresión de las formas de PS mutante y de tipo natural da como resultado también la propensión potenciada a la apoptosis en varios sistemas experimentales, incluyendo el ojo de Drosophila (Ye, Y. y Fortini, M. (1999). J. Cell Biol. 146: 1351-1364). En estos estudios, se sugiere que la presenilina de Drosophila (Dps) ejerce un efecto negativo dominante cuando se expresa a niveles altos. No está claro cómo Dps provoca la apoptosis de células, pero el mecanismo podría implicar la desregulación de las rutas de señalización del desarrollo Notch y/o Wnt (revisado en Anderton et al., 2000 Mol. Med. Today 6:54-59). No está claro si la sobreexpresión de A\beta 42 en el sistema descrito en el presente documento podría estar afectando a la función de Dps interfiriendo posiblemente con una o más rutas de señalización. De manera interesante, la sobreexpresión de A\beta 40 o A\beta 42 potencia un fenotipo inducido por Dps (presenilina de Drosophila) en el mismo tejido (datos no mostrados), lo que sugiere la implicación de las dos proteínas en la misma ruta.

Ejemplo 2 Fenotipo de ala cóncava inducido por la expresión ectópica de C99

Se crea una Drosophila transgénica que porta una copia de pUAS-C99 (o bien de tipo natural o bien con la mutación London) y una copia de apterous-Gal4, usando métodos convencionales y tal como se trató anteriormente. Los datos indican que estas moscas muestran una malformación de sus alas, porque el borde del ala se curva de una manera cóncava. Estos efectos se confirman con inserciones independientes múltiples del transgén C99. El análisis de tipo Western confirma la expresión de este transgén. Los extractos proteicos de larvas completas que expresan el C99 (o bien de tipo natural o bien con la mutación London) bajo el control de daughterless-Gal4 (un controlador de Gal 4 expresado de manera ubicua) muestran una banda proteica del tamaño esperado para C99, que inmunoreacciona con el anticuerpo 6E10 (producido contra los primeros 16 aminoácidos de C99). Existen datos de que cuando la parte del gen de APP humano denominada C 100 estaba insertada en el genoma de Drosophila y se expresaba en el disco del ala, no generó ningún fenotipo visible (Fossgfreen et al., PNAS 95:13703-13708 (1998)). Por el contrario, los datos notificados en el presente documento indican que las moscas transgénicas con la región C100 equivalente de la APP humana (denominada en el presente documento C99), fusionada a un péptido señal diferente, muestran una malformación del ala.

Ejemplo 3 Defectos cognitivos inducidos por la expresión ectópica de C99

Se crea una Drosophila transgénica que porta una copia de UAS-C99 (o bien de tipo natural o bien con la mutación London) y una copia de 7B-Gal4 (que permite la expresión en el cuerpo pedunculado del cerebro) usando técnicas convencionales. Pueden examinarse los defectos cognitivos de estas moscas realizando ensayos olfativos, de locomoción o aprendizaje y memoria según métodos convencionales. Por ejemplo, se observa un comportamiento de locomoción alterado en las moscas anteriores, sometidas a prueba usando el sistema de "reactividad oscura", descrito por Benzer, S. PNAS 58:1112-1119 (1967). Específicamente, las moscas que contienen una copia de UAS-C99 y una copia de 7B-Gal4 no responden a la agitación mecánica así como las moscas de tipo natural, caminando menos rápidamente que las moscas de tipo natural tras ser empujadas al fondo del aparato de ensayo. La prueba de "reactividad oscura" para la locomoción se describe también en "Behaviour, Learning and Memory" en : Drosophila, A Practical Approach. Ed. D.B. Roberts (1998) Oxford University Press Inc. Nueva York página 273.

Ejemplo 4 Genes que modifican los fenotipos de Drosophila como dianas para agentes terapéuticos de la enfermedad de Alzheimer

Tal como se describe en detalle a continuación, se establecieron selecciones genéticas con el fin de identificar modificadores genéticos del fenotipo de ala cóncava descrito en el ejemplo 2. Los modificadores candidatos sometidos a prueba incluyeron modificadores conocidos de dos fenotipos de Drosophila inducidos por la expresión ectópica de presenilina de Drosophila (Dps) en el ala y escutelo (G. Boulianne, Hospital for Sick Children, Toronto, Canadá, comunicación personal), así como mutaciones en otros genes candidatos. Basándose en el descubrimiento reciente de un "punto caliente" genético de la EA en el cromosoma 10, se realizó el mapeo cromosómico de los homólogos humanos de los modificadores genéticos de Drosophila mencionados anteriormente. Los datos descritos a continuación indican que los homólogos humanos de varios de los modificadores genéticos descritos en el presente documento se ubican también en el cromosoma 10 y se contempla en el presente documento que estos genes son dianas relevantes para el desarrollo de productos farmacéuticos útiles para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer así como otros estados asociados a errores en la regulación de la ruta de la APP.

Se seleccionaron un total de 93 mutaciones con el fin de identificar modificadores genéticos del fenotipo de ala cóncava inducido por la expresión ectópica de C99 en el ala de Drosophila. La selección se basa en la medición del cambio en la penetrancia del fenotipo del ala cuando está presente la mutación externa. Más específicamente, se cuenta el número de moscas con alas mutantes comparado con el número de moscas con alas de tipo natural en el grupo experimental (las moscas que expresan tanto C99 como la mutación que se está sometiendo a prueba) y el grupo de control (moscas que expresan sólo C99). La significación del cambio en la penetrancia del fenotipo mutante se evalúa midiendo el valor P mediante una prueba T, en los cuatro grupos mencionados anteriormente. Se consideró que las mutaciones modificaban significativamente el fenotipo de C99 cuando P<0,05.

Se proporciona en la tabla 1 una lista de modificadores genéticos que afectan al fenotipo de sobreexpresión de C99 y a los genes de Drosophila asociados a estos modificadores genéticos.

Todas las mutaciones identificadas como modificadores de los fenotipos de sobreexpresión de C99 y presenilina eran mutaciones insercionales (mediadas por la inserción en el genoma de Drosophila del elemento transponible similar a P-retroviral). Se ha determinado previamente la ubicación cromosómica exacta de cada una de estas inserciones (Drosophila Genome Project BDGP, httpJ/www.fruitfly.org). Con el fin de identificar el/los transcrito(s) afectados por cada una de estas inserciones, se exploró una zona genómica de 10 kB a la derecha y a la izquierda de cada inserción para detectar transcritos de Drosophila conocidos o predichos. Se adoptaron los siguientes criterios para la selección del transcrito más probablemente afectado por una inserción dada:

a) distancia de los transcritos desde el sitio de la inserción, y b) orientación de un transcrito en relación a la inserción.

Si una zona genómica contenía más de un transcrito candidato con la misma orientación que la inserción, se seleccionaron para análisis adicionales aquéllos más cercanos a la inserción. Las secuencias proteicas traducidas de los transcritos de Drosophila del análisis anterior forman el "conjunto A".

Se examinó la presencia de homólogos humanos de las proteínas de Drosophila anteriores (en el "conjunto A") en una zona del cromosoma 10 humano vinculada a la EA. Se han identificado dos regiones candidatas alrededor de los marcadores de sitio de secuencia marcada (STS) en el cromosoma 10 humano (Bertram et al., Ertekin-Taner et al., Myers et al., Science 290, 2302-2305, 2000) mediante análisis de ligamiento. Se mapearon las secuencias marcadoras STS usadas en estos estudios de análisis de ligamiento o las secuencias STS adyacentes a estos marcadores en los datos del genoma de Celera mediante comparaciones de secuencia blastn (Altschul et al., 1997). Basándose en esta información de mapeo se definió un subconjunto del cromosoma 10 humano que incluía las dos regiones candidatas que mostraban un ligamiento significativo (Bertram et al., 2000; Ertekin-Taner et al., 2000; Myers et al., 2000) y la región entre medias. Se recuperaron la secuencia de ADN (Celera contigs) y la lista correspondiente de traducciones proteicas de Celera para el subconjunto definido y se pusieron en bases de datos de formato blast. La secuencia de ADN y la lista de traducciones proteicas de Celera para las regiones genómicas descritas anteriormente forman el "conjunto B" y el "conjunto C", respectivamente.

Se realizaron entonces una búsqueda tblastn con el "conjunto A" frente al "conjunto B" y una búsqueda blastp con el "conjunto A" frente al "conjunto C". Se seleccionaron inicialmente resultados positivos de tblastn y blastp con valores E inferiores a 10^{-5}. Entonces, se eligió el mejor apareamiento para cada proteína de la mosca a partir de estas búsquedas y se comprobaron los transcritos/genes de mosca correspondientes para determinar su asociación con modificadores genéticos del fenotipo de Dps y C99. Los catorce pares resultantes de proteínas/transcritos humanos y de mosca forman el "conjunto D".

Se sometieron a prueba los catorce pares de proteínas del "conjunto D" para determinar la ortología rigurosa o supuesta. Esto se consiguió mediante comparaciones blastp en una base de datos combinada de todas las proteínas humanas y todas las proteínas Celera de la mosca. En primer lugar, se compararon las proteínas de mosca del "conjunto D" con cada proteína en esta base de datos. Después, se compararon de nuevo los mejores apareamientos humanos resultantes para cada una de las proteínas de mosca comparados con la base de datos de proteínas humanas/de mosca combinada. Se clasificó un apareamiento humano como ortólogo riguroso si se cumplían todos de los siguientes cuatro criterios:

1. La proteína X de mosca tiene el mejor apareamiento con la proteína Y humana.

2. La proteína X de mosca no tiene un apareamiento mejor con otra proteína de mosca que con la proteína Y humana.

3. La proteína Y humana tiene el mejor apareamiento con la proteína X de la mosca.

4. La proteína Y humana no tiene un apareamiento mejor con otra proteína humana que con la proteína X de mosca.

Si sólo se cumplen los criterios 1) y 3), un apareamiento humano se clasifica como ortólogo supuesto sin tener en cuenta si la proteína X de mosca tenía un apareamiento mejor con otra proteína de mosca, la proteína Y humana tenía un apareamiento mejor con otra proteína humana o ambos. Todos los otros apareamientos humanos se consideran homólogos. Tras la prueba de ortología, se priorizan los genes humanos candidatos según lo siguiente:

a) el gen humano es homólogo del gen de mosca afectado por el modificador genético de Drosophila, identificado en la selección genética

b) grado de semejanza de secuencia de la proteína humana (codificada por el gen humano de a) con respecto a la proteína de Drosophila (codificada por el gen de Drosophila en a)

c) la proteína humana es un ortólogo riguroso o supuesto de la proteína de mosca

d) ubicación cromosómica del gen humano con respecto a marcadores STS, otros genes candidatos o genes de la EA conocidos

e) función supuesta de la proteína humana y/o la proteína de Drosophila homóloga

f) pruebas de que se expresa el gen humano predicho

g) existencia de SNP codificantes y/o no codificantes validados o predichos en la región codificante del gen humano.

Para comprobar si se expresa el gen homólogo humano, se buscó en la base de datos Incyte LifeSeq EST con los transcritos humanos predichos correspondientes identificados a partir de la base de datos de Celera usando
blastn.

Basándose en estos criterios, se contempla en el presente documento que 4 genes humanos diferentes son genes relacionados con la EA ubicados en el cromosoma 10 humano. A continuación se enumeran las proteínas supuestas, codificadas por estos genes humanos propuestos.

(1) hCP50765 (EGR2) SEQ ID NO: 35

(2) hCP41313 (homóloga al gen nocA de mosca) SEQ ID: 15, SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO 53

(3) hCP33787 (proteína relacionada con anquirina) SEQ ID NO: 41

(4) hCP51594 (anquirina-3) SEQ ID NO: 43

El transcrito hCT15097 predicho por Celera se curó manualmente para producir dos formas supuestas de la proteína hCP41313. Se realizó la curación identificando los EST correspondientes a este locus mediante búsquedas blastn en las bases de datos Incyte LifeSeq y EST pública y alineando los EST identificados con la secuencia del transcrito predicho por Celera. La curación produjo ligeros cambios en la secuencia de aminoácidos C-terminal y residuos adicionales supuestos en el extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos predicha. Los cambios en la parte C-terminal de la secuencia proteica humana conducen a un alineamiento mejorado con nocA de mosca en esta región. Debido a que los residuos adicionales en el extremo N-terminal, Met 64 y Met 100 en la secuencia proteica de Celera (hCP41313) corresponden a Met 114 y Met 150 en la traducción de la secuencia del transcrito homólogo de nocA curado completo, respectivamente. Se analizaron y se compararon posteriormente secuencias de ADNc de la colección de ADNc de Novartis FGA y la colección de ADNc de Incyte. Basándose en estos análisis, se clonó y se secuenció un clon de ADNc correspondiente al gen nocA humano del cromosoma 10. El extremo 5' de este clon de ADNc consiste en ADNc obtenido a partir del clon fga94341 propiedad de Novartis y el extremo 3' de este clon consiste en ADNc obtenido del clon 242278.1 de Incyte (SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO. 53).

EGR2 es un ortólogo supuesto del transcrito CT23724 de mosca predicho por Celera (véase la tabla 1), que corresponde al gen stripe de Drosophila. La mutación P1505 de mosca (véase la tabla 1), que afecta al gen stripe, modifica sólo el fenotipo de presenilina.

NocA humano es un ortólogo supuesto del trascripto CT14619 de mosca predicho por Celera (véase la tabla 1), que corresponde al gen nocA de Drosophila. La mutación EP2173 de mosca (véase la tabla 1), que afecta al gen nocA, modifica los fenotipos de sobreexpresión tanto de presenilina como de C99.

EGR2 es un factor de transcripción de dedo de zinc tipo C2H2 que regula la mielinización en el SNP. Se ha mostrado que es importante en ratones para el desarrollo del cerebelo (Schneider-Maunoury et al., Cell 75, 1199-1214, 1993; Swiatek & Gridley, Genes Dev. 7, 2071-2084, 1993). Se han descrito cuatro mutaciones en EGR2 que están asociadas con neuropatías periféricas heredadas (Warner et al., Nature Genet 18, 382-384, 1998; Timmerman et al., Neurology 52, 1827-1832, 1999).

El homólogo humano nocA es un factor de transcripción supuesto con un dominio de dedo de zinc tipo C2H2. Aunque no se ha determinado todavía su función exacta, según los datos descritos en el presente documento, puede desempeñar un papel significativo en la patología de la enfermedad de Alzheimer. La proteína de Drosophila codificada por el gen nocA es un factor de transcripción implicado en el desarrollo del cerebro embrional y las estructuras ocelares adultas.

La anquirina-3 existe en dos isoformas específicas del cerebro de 480 y 270 kDa (Kordeli et al., J Biol Chem 270, 2352-2359, 1995). Los polipéptidos de anquirina-3 específicos neurales son candidatos a participar en el mantenimiento y selección como objetivo de canales iónicos y moléculas de adhesión celular a nodos de Ranvier y segmentos axonales iniciales. Se ha mostrado que la anquirina-3 se asocia con el canal de sodio dependiente de voltaje in vitro y se ubica conjuntamente con esta molécula en los nodos de Ranvier, segmentos axonales iniciales, y la unión neuromuscular (Srinivasan et al., Nature 333, 177-180, 1988; Kordeli et al., J Cell Biol 110, 1341-1352, 1990; Kordeli & Bennett, J Cell Biol 114, 1243-1259, 1991; Flucher & Daniles, Neuron 3, 163-175, 1989).

El segundo homólogo humano del transcrito CT18415 de mosca pertenece a la familia de las proteínas relacionadas con anquirina (hCP33787). El gen correspondiente se ubica a 469 kpb desde la enzima degradadora de la insulina (IDE). Además de repeticiones de anquirina, hCP33787 contiene un dominio de motivo alfa estéril (SAM). Se ha sugerido que el dominio SAM está implicado en la regulación de procesos de desarrollo (Shultz et al., Protein Sci 6, 249-253, 1997), se ha descrito como que media en interacciones proteína-proteína específicas, y se ha sugerido que forma estructuras poliméricas extendidas (Thanos et al., Science 283, 833-836). El dominio SAM está incluido en el alineamiento entre el transcrito CT18415 de mosca y hCP33787. Se especula que podría desempeñar un papel en la agregación de \beta-amiloide.

Se ha planteado la hipótesis de que la \gamma-sinucleína podría estar implicada en la EA (Luedecking et al., Neuroscience Letters 261, 186-188, 1999). Se postula que la \gamma-sinucleína podría interaccionar con la proteína hCP33787 que contiene repeticiones de anquirina. En apoyo de esto, se ha mostrado una interacción proteína-proteína entre la sinfilina, una proteína relacionada con la repetición de anquirina, y la \alpha-sinucleína (Engelender et al., Nature Gen 22, 110-114, 1999). También se conoce que los miembros de la familia de sinucleína comparten un alto grado de semejanza de secuencia (el 64% de identidad de secuencia entre la \alpha-sinucleína y la \gamma-sinucleína, Lavedan, Genome Res 8, 871-880, 1998). Dado que se conserva el plegamiento de una unidad de repetición de anquirina, los argumentos anteriores ayudan a apoyar una interacción proteína-proteína supuesta entre hCP33783 o hCP51594 y \gamma-sinucleína. Es de interés indicar que se predice un SNP (E \rightarrow K) (polimorfismo de nucleótido único) codificante para hCP33787 en la posición 48 de la secuencia, que corresponde al comienzo de la región de repetición de anquirina. Esta variación de la secuencia podría ser relevante en el contexto de una interacción \gamma-sinucleína-anquirina supuesta debido a que implica cadenas laterales de aminoácidos cargados de manera opuesta. El SNP predicho en la proteína relacionada con anquirina es particularmente interesante dado que la \gamma-sinucleína tiene un SNP (V \rightarrow E) codificante en la posición 110 (Ninkina et al., Hum Mol Genet 7, 1417-1424, 1998), que codifica para el intercambio de una cadena lateral de aminoácidos neutra por una cargada negativamente. Se postula que estos polimorfismos podrían ser relevantes para una interacción supuesta de \gamma-sinucleína con o bien hCP33783 o bien hCP51594.

1

2

3

4

<110> Cohen, Dalia et al.

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<120> Identificación de genes implicados en la enfermedad de Alzheimer usando Drosophila Melanogaster

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<130> 4-31612 A

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<150> 60/236.893

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<151> 29-09-2000

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<150> 60/298.309

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<151> 14-06-2001

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<160> 53

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<170> FastSEQ para Windows versión 4.0

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<210> 1

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<211> 123

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<212> ADN

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<213> Homo Sapiens

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<400> 1

5

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<210> 2

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<211> 129

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<212> ADN

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<213> Homo Sapiens

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<400> 2

6

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<210> 3

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<211> 300

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<212> ADN

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<213> Homo Sapiens

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<400> 3

7

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<210> 4

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<211> 300

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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<210> 5

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<211> 72

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<212> ADN

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<213> Homo Sapiens

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<400> 5

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9

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<210> 6

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<211> 1537

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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10

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<210> 7

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<211> 332

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

11

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<210> 8

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<211> 1053

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

12

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<210> 9

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<211> 351

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

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13

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<210> 10

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<211> 1425

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 10

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14

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<210> 11

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<211> 433

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 11

15

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<210> 12

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<211> 1242

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 12

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16

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<210> 13

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<211> 381

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 13

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17

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<210> 14

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<211> 1779

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 14

18

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<210> 15

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<211> 593

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 15

19

20

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<210> 16

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<211> 1938

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 16

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21

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<210> 17

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<211> 645

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 17

22

23

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<210> 18

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<211> 4022

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1)...(4022)

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<223> n = A, T, C o G

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<400> 18

24

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<210> 19

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<211> 1265

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (1)...(1265)

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<223> Xaa = Cualquier aminoácido

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<400> 19

25

26

27

28

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<210> 20

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<211> 954

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 20

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29

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<210> 21

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<211> 288

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1006

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 240

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2442

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 813

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

34

35

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1357

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 254

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

38

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1812

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

39

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 603

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

41

\newpage

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1351

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 451

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(451)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Cualquier aminoácido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3750

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1249

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

46

47

48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2887

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 488

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

50

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 300

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2404

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 278

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2409

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 802

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

56

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5175

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

58

59

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1724

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

60

61

62

63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1305

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 434

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

65

66

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1337

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 444

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

68

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3378

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 904

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

70

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2815

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

72

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 937

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

73

74

75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3313

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 646

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

77

78

Claims

1. Mosca transgénica cuyo genoma comprende una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido que consiste en la parte Abeta de la APP humana en la que dicha secuencia de ADN codifica para Abeta40 (SEQ ID NO:1) o Abeta42 (SEQ ID NO:2), fusionada a una secuencia señal, estando dicha secuencia de ADN unida funcionalmente a una secuencia de control de la expresión específica de tejido; y expresar dicha secuencia de ADN, en la que la expresión de dicha secuencia de ADN da como resultado que dicha mosca muestra un fenotipo alterado.

2. Mosca transgénica según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de ADN codifica para Abeta42, y en la que dicha secuencia de control de la expresión específica de tejido comprende el promotor GMR específico del ojo.

3. Mosca transgénica según la reivindicación 2, en la que dicha expresión de dicha secuencia de ADN da como resultado que dicha mosca muestra el fenotipo de "ojo rugoso".

4. Método para identificar modificadores genéticos de la ruta de APP, comprendiendo dicho método:

(a): proporcionar una mosca transgénica cuyo genoma comprende una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido que consiste en la parte Abeta de la APP humana en la que dicha secuencia de ADN codifica para Abeta40 (SEQ ID NO:1) o Abeta42 (SEQ ID NO:2), fusionada a una secuencia señal, estando dicha secuencia de ADN unida funcionalmente a una secuencia de control de la expresión específica de tejido; y expresar dicha secuencia de ADN, en el que la expresión de dicha secuencia de ADN da como resultado que dicha mosca muestra un fenotipo alterado.

(b): cruzar dicha mosca transgénica con una mosca que contiene una mutación en un gen conocido o predicho; y

(c): seleccionar la progenie de dichos cruces para obtener moscas que portan dicha secuencia de ADN y dicha mutación y muestran expresión modificada del fenotipo transgénico comparadas con los controles.

5. Método según la reivindicación 4, en el que dicho modificador genético y/o su homólogo humano es un gen que afecta al transcurso de la enfermedad de Alzheimer.

6. Método según la reivindicación 4, en el que dicha secuencia de ADN codifica para Abeta42, y en el que dicha secuencia de control de la expresión específica de tejido comprende el promotor GMR específico del ojo.

7. Método según la reivindicación 6, en el que dicha secuencia de ADN da como resultado que dicha mosca muestra el fenotipo de "ojo rugoso".

8. Método para identificar dianas para el desarrollo de productos terapéuticos para tratar, prevenir o mejorar los estados asociados a la regulación anómala de la ruta de APP, comprendiendo dicho método:

(b): cruzar dicha mosca transgénica con una mosca que contiene una mutación en un gen conocido o predicho; y seleccionar la progenie de dichos cruces para obtener moscas que porten dicha secuencia de ADN y dicha mutación y muestran expresión modificada del fenotipo transgénico comparadas con los controles; e,

(c): identificar los homólogos humanos de la secuencia de ADN de (b).

9. Método según la reivindicación 8, en el que dicho estado es la enfermedad de Alzheimer.

10. Método según la reivindicación 8 que comprende además identificar los homólogos humanos de los modificadores genéticos que se mapea en la zona del cromosoma 10 humano que se ha mostrado que tiene un ligamiento genético con la enfermedad de Alzheimer.

11. Método para identificar compuestos útiles en el tratamiento, prevención o mejora de estados asociados a la regulación anómala de la ruta de la APP que comprende someter a ensayo los compuestos que pueden modificar los fenotipos inducidos por la expresión de Abeta, comprendiendo dicho método:

(a): proporcionar una mosca transgénica cuyo genoma comprende una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido que comprende la parte Abeta de la APP humana en la que dicha secuencia de ADN codifica para Abeta40 (SEQ ID NO:1) o Abeta42 (SEQ ID NO:2), fusionada a una secuencia señal, estando dicha secuencia de ADN unida funcionalmente a una secuencia de control de la expresión específica de tejido; y expresar dicha secuencia de ADN, en el que la expresión de dicha secuencia de ADN da como resultado que dicha mosca muestra un fenotipo alterado;

(b): administrar a dicha mosca un compuesto candidato; y,

(c): someter a ensayo para detectar cambios en el fenotipo de dicha mosca de la etapa (a) comparado con el fenotipo de una mosca de la etapa (a) a la que no se ha administrado el compuesto candidato.

12. Método según la reivindicación 11, en el que dicho estado es la enfermedad de Alzheimer.

13. Método según la reivindicación 11, en el que dicha secuencia de ADN codifica para Abeta42, y en el que dicha secuencia de control de la expresión específica de tejido es el promotor GMR específico del ojo.

14. Método según la reivindicación 13, en el que dicha secuencia de ADN da como resultado que dicha mosca muestra dicho fenotipo alterado denominado fenotipo de "ojo rugoso".