KR100816797B1 - 유충 시기에 검은 반점이 나타나는 초파리 ｃｇ５１１６의유전자 돌연변이체 및 그의 제조방법 - Google Patents
유충 시기에 검은 반점이 나타나는 초파리 ｃｇ５１１６의유전자 돌연변이체 및 그의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 초파리 CG5116 유전자의 돌연변이체인 jum9 및 jum73에서 나타나는 검은 반점 현상에 관한 것으로, 구체적으로 CG5116 유전자의 주변에 있는 P 전이인자의 삽입 변이주(UY3132)와 활성 트랜스퍼라제를 가지고 있는 Δ2-3을 이용하여 부정확 절단방법으로 제작한 CG5116 절단 돌연변이체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 CG5116 절단 돌연변이체는 돌연변이에 의한 초파리 유전자의 기능뿐만 아니라 사람의 유전자 기능 연구, 새로운 유전자의 발견 및 질병 연구에 매우 유용한 동물 모델로 이용될 수 있다.
CG5116, P 전이인자, UY3132, 유전자 돌연변이, 초파리, 절단 돌연변이, 동물모델
Description
도 1은 초파리 CG5116 유전자의 단백질 도메인을 나타낸 도면이다.
도 2는 초파리 CG5116 유전자의 단백질과 인간 단백질(GTP 결합 단백질)과의 유사도를 비교하여 나타낸 것이다.
도 3은 UY3132 변이주에서 P 전이인자의 삽입위치를 나타낸 도면이다.
도 4는 부정확 절단(imprecise excision)방법을 이용한 CG5116 절단 돌연변이체를 제작하는 유전학적 과정을 나타낸 것이다.
도 5는 UY3132 변이주에 있어서 절단 돌연변이체의 결손위치를 확인하기 위하여 사용된 프라이머의 위치를 나타낸 도면이다.
도 6은 PCR 반응의 산물을 1% 아가로스 겔에 전기영동하여 나타낸 도면이다.
도 7은 UY3132 변이주에 있어서 두 개의 부정확 절단 돌연변이체인 jum9 및 jum73에서의 결손위치를 나타낸 도면이다.
도 8은 정상적인 유충과 검은 반점이 생기는 부정확 절단 돌연변이 유충과의 표현형을 비교한 사진이다.
도 9는 정상 유충과 CG5116 돌연변이 jum9 유충과의 혈구세포를 비교한 사진이다.
본 발명은 초파리 CG5116 유전자의 돌연변이체인 jum9 및 jum73에서 나타나는 검은 반점 현상에 관한 것으로, 보다 상세하게는 CG5116 유전자의 주변에 있는 P 전이인자의 삽입 변이주(UY3132)와 활성 트랜스퍼라제를 가지고 있는 Δ2-3을 이용하여 부정확 절단방법으로 제작한 CG5116 절단 돌연변이체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
곤충이 지구상에서 번영을 쟁취하고 있는 요인으로서 여러 사항을 들 수 있는데 예를 들어, 초파리의 경우는 10일∼14일, 누에의 경우는 50일 정도의 단기간을 통한 뛰어난 생식능력, 가혹한 생식환경을 극복하는데 도움이 되는 휴면ㆍ변태 및 외부의 적으로부터 몸을 지키는 효과적인 생체방어기구 등을 가지고 있다. 이들은 모두 오랜 기간의 진화 과정에서 획득한 환경에 대한 적응능력으로, 이러한 다양한 적응능력에 의한 무한의 다양성을 가진 곤충은 생물자원의 관점에서도 연구대상이 된다.
또한, 곤충의 특이적 기능을 유지하는 다양한 생체물질의 대부분은 미지이며 생물자원으로서 미개척 자원이다. 따라서, 이러한 생물자원을 만들어내는 다양한 곤충의 기능을 해석하는 것은 생명과학연구에 공헌할 뿐만 아니라, 생물자원의 활용을 이용한 응용연구를 통하여 산업발달에 많은 기여를 할 것으로 판단된다.
또한, 의료분야와 산업분야에 대한 응용연구로서의 곤충연구도 중요하다. 말라리아 원충을 매개하는 학질모기 및 잠자는 병의 원인이 되는 원충 트리파노소마(trypanosoma)를 매개하는 체체파리 등 병의 숙주가 되는 곤충에 관한 연구도 세계적으로 중요한 연구분야이다. 특히, 학질모기에 있어서는 초파리에 이어 곤충으로는 두 번째로 전체 게놈이 해독되었다. 이러한 곤충 호르몬의 연구를 통하여 인위적으로 곤충의 발육을 제어할 수 있게 된다면 이들 숙주의 이용에도 도움이 될 것으로 기대된다.
덧붙여, 곤충으로부터는 각종 생리활성물질 및 유용 생체고분자물질이 발견되기 때문에 이러한 곤충은 산업발달에 유용한 새로운 화합물의 탐색원으로서 주목받을 수 있다. 예를 들면, 곤충의 공생미생물이 생산하는 유용물질은 사람이나 가축 등의 의약품의 탐색원으로서 기대되고 있다. 따라서, 상기와 같은 연구기반 위에서 곤충의 발육제어와 호르몬 연구, 곤충의 생체방어기능연구 및 곤충의 공생미생물연구 등 대표적으로 곤충이 가지고 있는 특이적 기능의 해석을 발전시키는 것은 생명과학연구의 한 분야로서 매우 중요할 것이다.
이에, 본 발명에서는 상기의 곤충에 대한 기능적 연구에 있어서 초파리를 대상으로 한 돌연변이 연구를 통해 특정 유전자의 기능을 조사하였다. 특히, 초파리 는 분자생물학분야에서 가장 많은 연구가 진행되고 있는 곤충으로서, 이러한 초파리가 생물학의 실험재료로서 주목받은 것은 1910년대에 미국의 Morgan 박사(컬럼비아 대학)에 의해 유전학연구의 재료로서 사용된 시기부터이다. 그 후 돌연변이 유발법, 타선염색체를 이용한 유전자 매핑(mapping)법 및 한번 일어난 돌연변이를 보유하기 위한 밸런스 염색체(balancer chromosome)의 활용 등 생물학적 실험재료로서의 우위성을 높여 왔다.
더욱이, 초파리 연구에 있어서는 1980년대에 P 전이인자(transposable element)라는 트랜스포존(transposon)의 발견 및 그 이용에 의한 형질전환 기술이 확립됨으로써 유전자 도입기술이 자유롭게 이용될 수 있게 되었다. 2000년에는 곤충으로는 최초로 전체 게놈이 해독됨으로써 곤충의 대표적인 분자생물학 연구모델로서 확립되었으며, 게놈 해독에 근거하는 게놈 바이오인포매틱스를 이용한 유전자 기능해석 이외에 마이크로어레이를 이용한 유전자 발현해석, RNAi(RNA interference, RNA 간섭)법에 의한 유전자 발현의 억제 및 유전자 타겟팅(gene targeting) 등의 방법을 이용한 유전자 기능 연구가 진행되어 오고 있다. 특히, 초파리를 이용한 기능 연구는 다음과 같은 장점을 가지고 있다.
첫째, 돌연변이 검색 및 유전자조작 방법이 고도로 발달되어 있다는 것이다. 특히, 유전자에 대한 기능 연구를 위해서는 돌연변이 유발이 필수적인데, 이런 경우 초파리의 에틸메탄설포네이트(ethyl methane sulphonate, EMS), P 전이인자의 도약(jumping-out), RNAi, 결손 stock을 이용한 기능상실 돌연변이(loss-of-function mutation) 효과 및 상위활성화서열(upstream activation sequence, UAS)/GAL4 시스템을 이용한 기능획득 돌연변이(gain-of-function mutation) 효과를 통하여 유전자 기능을 연구할 수 있다.
둘째, 인핸서 트랩 돌연변이 생성(enhancer trap mutagenesis)을 이용하여 특정 유전자를 클로닝하기 이전 단계에서 이미 그 발현 양상을 확인함으로써 특정 조직이나 세포에서 발현하는 유전자를 체계적으로 얻을 수 있다.
셋째, P 전이인자의 도약(jumping) 시스템과 상위활성화서열(upstream activation sequence, UAS)/GAL4 시스템을 이용하여 특정한 조직이나 세포에서 미지의 유전자를 과량발현시킴으로써 돌연변이 표현형을 관찰 및 이러한 표현형을 유발하는 특정유전자를 연구할 수 있다.
넷째, 상위활성화서열(upstream activation sequence, UAS)-hid를 이용한 세포사멸 유전자를 과발현시켜 돌연변이를 유발할 수 있다.
다섯째, 초파리 게놈 서열이 완성됨으로써 동물들간에 유전 정보를 원활하게 비교할 수 있고, 검색을 통하여 필요한 변이주를 쉽게 검색 및 입수할 수 있기 때문에 초파리 기능 연구를 매우 효율적으로 수행할 수 있다. 특히, 본 발명의 초파리 CG5116 유전자의 5' 상단부위에 한 개의 P 전이인자가 삽입된 UY3132 변이주도 이와 같은 방법을 이용하여 데이터베이스인 flybase(http://flybase.bio.indiana.edu)로부터 검색하여 찾은 후 이 변이주를 브루밍턴 초파리 스톡 센터(Bloomington Drosophila stock center, 미국)에서 입수할 수 있었다.
또한, 상기의 초파리 게놈 프로젝트에 의해 유전자 서열이 밝혀진 후 생물체 연구에 있어서 가장 중요한 일 중의 하나가 바로 유전자의 기능연구이다. 이를 위하여 여러 모델 동물에서 결손 돌연변이를 만들고 있는데 가장 이상적인 방법은 상동 재조합에 의한 유전자 제자리에서의 돌연변이 유도이다. 그러나, 효모를 제외하고는 현실적으로 이 방법이 가능한 생물체가 없기 때문에 임의의 위치에 전이인자를 끼워 넣어 발생하는 돌연변이 집합체를 제조하여 가능한 많은 수의 돌연변이를 한번에 제작하는 시도가 초파리를 대상으로 시도되었는데, 이를 P 전이인자 돌연변이 프로젝트라 하고 현재 초파리 유전자 총 14,000개의 유전자 중 표현형이 쉽게 구별되는 3,200개의 30% 정도의 돌연변이가 초파리의 4개 염색체 중 2번 및 3번 염색체에서 확립되었다(Spradling, A. C., et al ., Genetics , 153, 135-177, 1999). 이 돌연변이의 특징은 유전자 한 개당 전이인자가 한 개씩 끼워져 있고 전이인자 주변서열이 분석된 후 데이터베이스에 저장되어 있어, 일단 돌연변이가 선택되면 EST(expressed sequence tag) 서열과 비교하여 가장 유사한 유전자를 여러 생물종에서 확인할 수 있다는 것이다. 또한, 최근에는 초파리 유전자의 40%에 해당하는 완전한 cDNA 서열이 결정되어 전이인자 돌연변이에서 삽입부위서열과 유사한 cDNA를 직접 입수할 수 있는 프로젝트가 진행 중에 있으며 앞으로 80%의 cDNA를 확보할 것으로 판단하고 있다(Rubin, G. M., et al ., Science , 287, 2204-2215, 2000).
한편, 14,000개의 유전자 중 표현 형질을 보이는 돌연변이가 3,200개 정도이므로 나머지 부분에 해당하는 유전자의 기능을 확인할 수 있는 방법이 필요하기 때문에 이를 위하여 초파리에서는 효모의 전자인자 GAL4와 그 표적 유전자 상위활성 화 인자(upstream activation element, UAE) 체계를 이용하여 유전자 원래 발현부위 또는 전혀 다른 부위에서 과량 발현하여 유전자의 기능을 연구하는 방법이 고안되었다(Rorth, P., et al ., Development , 125, 1049-1057, 1998). 즉, P 전이인자 프로모터와 GAL4 유전자를 조합시켜 P 전이인자 벡터를 이용하여 초파리 염색체의 임의의 위치에 삽입한 후 다양한 종류의 유전자의 인핸서에 의해 조절되는 GAL4 전사인자를 발현하는 형질전환 초파리군을 확립하고 이들의 발현을 감지하기 위하여 5개의 연속적인 GAL4 결합부위 상위활성화서열(upstream activation sequence, UAS)과 lacZ 유전자를 결합시켜 변형된 유전자의 발현효과를 분석할 수 있다. 또한, 상기 유전자를 상위활성화서열(UAS) 부위와 결합시킨 형질전환 초파리와 필요할 때마다 교배시켜 변형된 유전자의 발현효과를 분석할 수 있다. 특히, 이 방법에 있어서는 특정 유전자의 분리 및 정제 없이도 여러 종류의 특정 세포나 조직에서 발현시킬 수 있는 다양한 초파리군을 손쉽게 마련할 수 있고, 전사인자 GAL4와 그 결합부위를 포함하는 유전자 UAS-X의 형질전환체 초파리를 별도로 유지하기 때문에 유해한 산물을 발현하는 유전자의 효과도 용이하게 조사할 수 있는 장점이 있다. 반면, 단점으로는 초파리의 이른 발생단계(6 단계) 이후에야 GAL4에 의하여 조절되는 발현을 감지할 수 있다는 점 및 암컷의 생식세포에서는 발현이 되지 않는다는 점이지만 다른 방법에 비하여 앞서 기술한 문제점을 용이하게 접근할 수 있는 우수한 점 때문에 최근 신경세포, 근육세포 및 표피세포 등의 다양한 세포의 운명결정 및 분화작용 메카니즘 연구와 각 구조 및 기관의 발달에 대한 연구에 유용하게 이용되고 있다.
최근, 버클리 초파리 게놈프로젝트(Berkeley Drosophila Genome Project, BDGP, 미국, http://www.fruitfly.org)에 의해 초파리 CG5116 유전자의 염기서열이 밝혀지게 되었다. 우선, 상기의 초파리 CG5116 유전자의 위치를 결정하기 위하여 유전자 지도를 작성하였으며, 구체적으로 200bp 내지 500bp의 염기서열을 이용하여 상기 초파리 게놈 유전자 서열을 PCR로 증폭한 후 유전자 또는 특정지표의 위치를 밝혀내는데 지침이 되는 물리지도(physical map)상에 이 증폭된 유전자의 위치를 원위치혼성화(in situ hybridization) 방법으로 초파리 유전체상에 존재하는 특정 유전자의 위치를 결정하였다. 특히, 이러한 유전자 지도를 작성하기 위해서는 DNA 시퀀싱을 수행해야 하는데, 상기의 프로젝트에서는 게놈산탄법(whole genome shotgunning)을 이용하여 염색체를 DNase 또는 초음파분쇄기(sonicator)를 이용하여 무작위로 절단한 후 이 DNA 조각들을 적합한 벡터에 클로닝 및 PCR로 증폭한 다음 이 DNA를 겔에 모세관 방식으로 쭉 펼친 후 자동화 염기서열분석기를 이용하여 서열을 분석하였으며, 이를 기존에 구축된 DNA 데이터베이스와 이미 염기서열이 밝혀진 예쁜꼬마선충(C. elegans) 또는 효모(S. cerevisiae) 등과의 초파리 유전자 DNA 데이터베이스를 바탕으로 비교 검토한 후 유전자 지도의 정확한 위치에 재배열하는 방식으로 완성하였다.
또한, 상기의 프로젝트와 함께 동시에 진행된 게놈상에서 실제로 발현되는 염기서열 조각을 나타내는 EST(expressed sequence taq) 프로젝트에 의해, 초파리 유충단계에서 발현되는 mRNA를 합성된 cDNA로 확인함으로써 예측된 CG5116 유전자가 실제로 초파리에서 발현된다는 것이 확인되었다.
이에, 본 발명자들은 초파리 CG5116 유전자의 5' 상단부위에 한 개의 P 전이인자가 삽입된 돌연변이인 UY3132를 부정확 절단방법으로 제작하여 상기 돌연변이체의 표현형 차이를 이용한 기능 연구 즉, 인간 유전자의 기능, 새로운 기능 유전자의 발견 및 질병에 관한 연구 등에 매우 유용한 모델 동물임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 초파리 CG5116 유전자의 돌연변이체를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 돌연변이체를 이용한 유전자 기능 연구를 통해 상기 CG5116 유전자에 상응하는 인간 유전자의 기능 연구, 새로운 기능 유전자의 발견 및 질병에 관한 연구 등에 유용한 모델 동물을 구축하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CG5116 유전자가 결손된 초파리 돌연변이체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 돌연변이체의 제조방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 이들의 표현형을 제공한다.
본 발명은 CG5116 유전자가 결손된 초파리 돌연변이체를 제공한다.
초파리 CG5116 유전자는 서열번호 1과 같이 2459bp의 DNA 염기서열을 가지고 있으며, 서열번호 2와 같이 526개의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 코딩하는 것으로 확인되었고, CG5116 단백질은 Hf1X 단백질 영역을 가지고 있기 때문에 생체신호 전달자인 GTP(guanosine triphosphate)를 GDP(guanosine diphosphate)로 분해하는 GTPase의 기능을 수행할 것으로 예측된다(도 1 참조). 또한, NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)를 이용하여 상동성 분석을 수행한 결과, 아미노산 수준에서 CG5116 단백질은 인간 GTP 결합 단백질, 마우스 GTP 결합 단백질, 개구리(Xenopus laevis)의 MGC83645단백질 및 예쁜 꼬마선충(C. elegans)의 F46B6.4 단백질 등과 높은 상동성이 있음을 확인할 수 있었고, 특히 CG5116 단백질은 인간 GTP 결합 단백질과 64% 정도의 유사한 아미노산 서열을 가지고 있다는 것이 확인되었다(도 2 참조).
이에, 본 발명자들은 버클리 초파리 게놈 프로젝트(Berkeley Drosophila Genome Project, BDGP, 미국)에 의해 제작된 초파리 DNA 전이인자(transposable element)인 P 전이인자의 삽입 돌연변이 중 flybase(http://flbase.bio.indiana.edu) 검색을 통하여 CG5116 유전자의 5' 상단부위에 한 개의 P 전이인자가 삽입된 UY3132(stock number, BL7355; http://flybase.bio.indiana.edu/.bin/fbidq.html?FBal0155675) 변이주를 선별한 후 이 변이주를 브루밍턴 초파리 스톡 센터(Bloomington Drosophila Stock Center, 미국)로부터 입수하였다. 도 3은 UY3132 변이주에서 P 전이인자가 삽입되어 있는 위치를 보여주고 있으며, 구체적으로 UY3132 변이주에서 P 전이인자는 CG5116 유전 자의 전사개시부위로부터 219 bp 앞부분에 삽입되어 있음을 알 수 있었다.
또한, 본 발명자들은 상기 UY3132 변이주를 포함한 CG5116 유전자의 절단 돌연변이체를 제작하기 위하여 P 전이인자를 이용한 부정확 절단(imprecise excison) 방법을 이용하였다(Robertson, H. M., et al ., Genetics , 118, 461-470, 1988; 및 Adams, M. D. & Sekelsky, J. J., Nat . Rev . Genet ., 3, 189-198, 2002). 구체적으로, P 전이인자는 전이활성화효소(transposase)에 의해 전이를 일으키는데, 이 과정은 크게 절단(excision) 및 삽입(insertion)과정으로 이루어져 있다. 특히, 절단과정 중 P 전이인자 주변의 DNA 단편 즉, 초파리 게놈 DNA의 일부분이 부정확하게 절단되어 절단 돌연변이(deletion mutant)가 생성되기도 하는데, 본 발명자들은 이러한 특성을 이용하여 CG5116 유전자의 주변에 있는 P 전이인자가 삽입된 UY3132 변이주와 전이활성화효소(transposase)를 몸속에 가지고 있는 Δ2-3 변이주(Laski, F. A., et al ., Cell , 44, 7-19, 1986)를 이용하여 CG5116 돌연변이를 제작하였다(도 4 참조).
이때, 상기 절단되는 초파리 게놈 DNA는 CG5116 유전자 전사개시부위로부터 150 내지 1500 번째 염기를 포함하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 CG5116 유전자 전사개시부위로부터 159 내지 1219번째 염기를 포함하는 것이 바람직하며, 보다 더 바람직하게는 P 전이인자 절단부위가 전사개시부위 이전 754bp부터 전사개시 후 1219bp 또는 P 전이인자 절단부위가 전사개시부위 이전 754bp부터 전사개시 후 159bp까지인 것이 바람직하나 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 돌연변이체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, CG5116 돌연변이 제조방법은 하기 1 내지 5 단계를 포함한다:
1) UY3132 변이주의 교미하지 않은 암컷 초파리와 Δ2-3 변이주 수컷 초파리를 교배하는 방법;
2) 단계 1의 자손 중 P 전이인자와 Δ2-3 변이주를 동시에 갖는 초파리를 선별하는 방법;
3) 단계 2의 선별된 초파리와 TM6B를 갖고 표현형이 Tb(Tubby)인 교미하지 않은 암컷 초파리와 교배하는 방법;
4) 단계 3의 자손 중 P 전이인자를 갖고 Tb이며, Sb(Stubble)가 아닌 초파리 선별하는 방법; 및
5) PCR 방법에 의한 부정확 절단 돌연변이 선별 및 구축 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법이다.
이어, 본 발명자들은 상기의 부정확 절단(imprecise excison)방법을 이용하여 제작된 CG5116 유전자의 절단 돌연변이체에 있어서의 결손부위를 찾기 위하여 도 5와 같은 방법으로 절단 변이주 200개를 대상으로 각각 PCR을 수행하였고, 이때 사용된 프라이머로는 서열번호 3(F4)과 서열번호 4(3'-1)를 이용하였다. 그 결과, 도 6에서와 같이 대조군(3.2kb)에 비해 결손부위를 가진 Δ9(jum9) 및 Δ72(jum73)는 각각 1.3kb와 2.3kb의 단편이 증폭됨을 확인할 수 있었고, 이러한 결과로부터 본 발명자들은 CG5116 유전자와 이 주변에 있는 P 전이인자가 삽입된 UY3132 부위에서 결손부위가 발생하는 것을 확인할 수 있었다(도 7 참조).
또한, 본 발명은 이들의 표현형을 제공한다.
본 발명자들은 상기의 PCR 방법으로 CG5116 유전자의 결손부위를 찾은 후 이를 각각 jum9과 jum73으로 명명하였고(jum, 점박이의 약자임), 이들의 유전학적 표현형의 차이를 정상적인 유충과 비교하였다. 그 결과, 도 8에서와 같이 정상 유충에서는 특별한 외형적 특성이 관찰되지 않는 반면, CG5116의 절단 돌연변이체인 jum9 및 jum73에서는 검은 반점이 나타나는 것을 관찰할 수 있었다. 특히, 두 절단 돌연변이체 사이에서도 서로 다른 표현형의 차이를 보였으며, 상기 CG5116 유전자상에서 결손부위가 더 많을수록 검은 반점의 크기가 다양하고 더욱 많은 수를 나타냄을 확인하였다(도 8 참조).
또한, 초파리 혈구세포는 척추동물의 골수성(myeloid lineage) 혈구세포와 기능적으로 유사한 3가지의 세포 즉, 플라스마토사이트(plasmatocyte), 크리스탈 세포(crystal cells) 및 라멜로사이트(lamellocytes)로 구성되어 있다(Meister, M., Curr. Opin . Immunol ., 16, 10-15, 2004). 특히, 초파리의 혈구세포 중 플라스마토사이트와 라멜로사이트 사이에서의 조혈과정(hematopoiesis)에 이상이 생겼을 경우, 인간의 질병과 유사한 형질을 보이는 사례들이 발견되었으며, 이는 특정 유전자 부위에 돌연변이가 생겼을 경우, 플라스마토사이트의 개체수가 급격히 증가 시킴으로써 라멜로사이트 증가를 초래하여 검은 흑색종(melanoma)을 생성하는 것으로 보고되었다(Evans, C. J., et al ., Dev . Cell , 5, 673-690, 2003).
상기와 같이, 초파리 혈구 형성과정과 그 분자적 기작이 척추동물과 매우 유사하고, 또한 초파리 혈구에서 인간의 질병과 유사한 증상인 혈구세포의 과다분열 및 흑색종이 형성됨에도 불구하고, 현재까지 이와 관련된 인자 및 작용 메카니즘은 규명되어 있지 않다. 본 발명자들은 본 발명의 초파리 돌연변이체에서 인간의 질병과 유사한 증상인 혈구세포의 과다분열이 나타남을 확인하였는데(도 9 참조), 이는 본 발명의 CG5116 유전자가 암호화하고 있는 새로운 GTP 결합단백질 돌연변이체의 이용이 혈구세포의 증식 및 분화 기전을 규명하는데 있어서 앞으로 새로운 방법을 제시할 수 있음을 시사하고 있다.
따라서, 본 발명은 이러한 유전학적 표현형의 차이로 인해 초래될 수 있는 유전학적 특성 즉, 초파리의 돌연변이를 이용한 유전자 기능의 연구 및 이와 관련된 인간의 유전자 기능 연구, 새로운 기능 유전자의 발견 및 질병에 관한 연구에 있어서 유용한 모델 동물을 구축할 수 있음을 제시하고 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
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실시예
1> 부정확 절단방법에 의한 초파리
CG5116
유전자 돌연변이의 제작
본 발명에서는 부정확 절단(imprecise excision) 방법에 의한 CG5116 절단 돌연변이를 제작하기 위하여 도 4에서와 같은 유전학적 설계방법을 통하여, 먼저 UY3132 변이주의 교미하지 않은 암컷( 
)초파리를 Δ2-3 변이주 수컷( 
)초파리와 교배한 후, 교배를 통해 나온 자손 중 유전학적 마커인 Tb(Tubby, 몸이 짧고 어깨 털이 정상에 비해 많은 특성을 가짐, http://flybase.bio.indiana.edu/.bin/fbidq.html?FBgn0003668)와 Sb(Stubble, 털이 정상에 비해 짧은 특성을 가짐, http://flybase.bio.indiana.edu/.bin/fbidq.html?FBgn0003319) 등을 유전학적 마커로 사용하여 P 전이인자와 Δ2-3 염색체를 동시에 가진 초파리를 해부현미경하에서 관찰하여 선별하였으며, 이때 이 초파리의 생식세포(정원세포, 후에 정자가 되는 세포임)에서 P 전이인자는 절단(excision) 또는 도약(jumping)된다.
이어, 이 초파리를 밸런서(balancer, 평형장치) 염색체인 TM6B 및 Tb를 가진 교미하지 않은 암컷(
)초파리(Bloomington stock center, http://flybase.bio.indiana.edu, number, BL3703)와 교배한 다음 이 교배를 통해 나온 자손 중 P 전이인자의 유전학적 마커인 w(white, 초파리 눈 색깔이 흰색, http://flybase.bio.indiana.edu/.bin/fbidq.html?FBgn0003996) 음성이고, Tb이며 Sb가 아닌 초파리를 표현형을 기반으로 선별하였다.
이때 이 초파리의 경우, 각각 P 전이인자의 마커(w, white)와 전이활성화효소(transposase) 마커(Sb, Stubby)에 있어서 모두 음성이므로 P 전이인자가 절단되 었음을 확인할 수 있었다. 또한, 절단이 발생한 초파리 중 많은 수는 정확 절단(precise excision)이 일어났거나 또는 절단부위가 너무 넓어 CG5116 유전자 이외에 다른 주변에 있는 유전자들의 절단이 발생하였기 때문에 CG5116만이 절단된 돌연변이를 얻기 위하여 200개의 P 전이인자 절단 변이주를 구축하였다.
이어, 상기로부터 수득한 P 전이인자 절단 돌연변이체 중 CG5116 절단 돌연변이를 선별하기 위하여, 도 5에서와 같이, F4 프라이머(5'-AAAACTGTCGCTTGAACTG-3', 서열번호 3)와 3'-1 프라이머(5'-TTGCGACTTTTGCGAGCCG-3', 서열번호 4)를 이용하여 PCR을 수행하였고, UY3132 변이주의 절단 돌연변이들 중 정확 절단(precise excision)이 일어난 경우에는 3.2 kb의 DNA 단편이 증폭되는 반면, P 전이인자 부위에서 절단이 일어난 경우에는 더 작은 DNA 단편이 증폭될 것으로 예측하였다.
<
실시예
2> 제작된 돌연변이체의 결손부위 확인
<2-1>
PCR
에 의한 결손부위 확인
본 발명자들은 상기 <실시예 1>의 PCR 반응을 수행하기 위하여, 각각 P 전이인자가 삽입된 절단 돌연변이 및 P 전이인자가 삽입되지 않은 대조군 초파리(Bloominton stock center number, BL19889)로부터 게놈 DNA를 추출하였으며, 이때 사용된 추출방법으로는 버클리 초파리 게놈 프로젝트(Berkeley Drosophila Genome Project, BDGP)에서 고안된 방법을 이용하였다(www.fruitfly.org). 구체적으로, 검은 반점이 있는 유충(5마리)을 골라 1.5 mL 튜브에 넣고 얼음에 보관하여 냉동시킨 후, 100 ㎕의 완충용액 A(100 mM Tris-HCl, pH 7.5; 100 mM EDTA; 100 mM NaCl; 0.5% SDS)에 넣어 분쇄한 다음, 추가적으로 100 ㎕ 의 완충용액 A를 첨가하여 65℃에서 30분 동안 부유시켰다. 이어, 400 ㎕의 LiCl/KAc(5 M KAc 농축액과 6 M LiCl 농축액을 각각 1 : 2.5 비율로 혼합) 용액을 첨가하여 얼음에서 10분간 부유시킨 후 상온에서 15분간 12,000 rpm으로 원심분리하여 얻어진 500 ㎕의 상층액을 새로운 1.5 mL 마이크로 튜브로 옮긴 다음, 600 ㎕의 이소프로판올을 첨가하여 섞은 후 상온에서 다시 15분간 12,000rpm으로 원심분리하였다. 이어, 상기 상층액을 제거한 후 남은 침전물을 600 ㎕의 70% 알코올을 첨가하여 상온에서 10분간 12,000rpm으로 원심분리한 다음 이 상층액을 제거한 뒤 남아있는 침전물을 건조시킨 후 50 ㎕의 증류수를 첨가하여 용출하였다.
이어, 상기와 같은 방법으로 수득한 산물을 하기와 같은 반응 조성물 및 반응 조건에서 PCR을 수행하였으며, 구체적으로 전체 50 ㎕[1 ㎕의 각 초파리 게놈 DNA(1 ㎍/㎕); 1 ㎕의 F4 프라이머(10 pmol/㎕); 1 ㎕의 3'-1 프라이머(10 pmol/㎕); 0.25 ㎕의 TaqTM 폴리머라제(5 unit/㎕); 5 ㎕의 TaqTM 완충용액; 4 ㎕의 dNTP 혼합물(각각 2.5 mM); 37.75 ㎕의 증류수]의 PCR 반응 조성물을 Applide Biosystem 2700(Applied Biosystems, 미국)를 이용하여 98℃에서 2분간 반응시킨 후, 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 72℃에서 4분간 35회 반복시킨 다음 72℃에서 5분간 반응을 수행하였다.
상기와 같은 방법으로 200개의 절단 변이주에 대해 모두 PCR 반응을 수행한 결과, 도 6에서 보듯이 Δ9(1.3 kb, 변이주 3) 및 Δ73(2.3 kb, 변이주 4)에서는 대조군(3.3 kb, 변이주 2)보다 작은 단편을 확인할 수 있었다.
<2-2>
jum
9
및
jum
73
에서의 결손부위
이어, 본 발명자들은 상기 도 6의 아가로스-겔 전기영동에서 확인한 Δ9 및 Δ73의 밴드를 겔 용출하여 각 단편의 유전자를 분리 및 정제한 후(Gene All Gel SV kit, General biosystem) 이 유전자들의 염기서열을 분석하였다.
그 결과, Δ9에 있어서의 절단부위는 CG5116 유전자의 전사개시 전 754bp부터 전사개시 후 1219bp까지의 부위가 절단(도 7의 jum9 부위)되었으며, Δ73에 있어서의 절단부위는 전사개시 전 754bp부터 전사개시 후 159bp까지의 부위가 절단됨을 확인할 수 있었다(도 7의 jum73 부위). 특히, 이러한 돌연변이체들은 검은색 반점을 나타내는 표현형을 가지고 있어 "jumbagi"라 명명하였고 줄여서 "jum"으로 표기하였으며, 이때 본 발명에서는 상기 두 변이주를 각각 "jum9" 및 "jum73" 이라 명명하였다(도 7).
<
실시예
3>
CG5116
돌연변이체들(
jum
9
및
jum
73
)의 표현형 분석
<3-1> 정상 유충과 돌연변이 유충의 표현형 비교
본 발명에서는 정상적인 유충과 jum9 및 jum73 돌연변이체들의 유충 시기에 나타나는 검은 반점 양상을 비교하였다. 그 결과, 정상 유충에서는 검은 반점이 없고 매끈한 표현형을 나타내는데 반해, 상기 돌연변이체들(jum9 및 jum73)에서는 주로 몸 뒤쪽에 위치나 크기가 무작위적인 검은 반점이 생기는 표현형을 관찰할 수 있었다(도 8).
<3-2>
jum
9
과
jum
73
돌연변이체의 검은 반점 양상 및 혈구세포 형질 비교
이어, 본 발명자들은 상기의 돌연변이체 즉, jum9과 jum73에서 검은 반점이 생기는 양상을 조사하였다. 그 결과, CG5116 돌연변이체 Δ9(jum9)에서는 검은 반점의 크기가 Δ73(jum73)의 검은 반점의 크기에 비해 보다 크고 많은 수를 갖을 뿐 아니라 작은 크기에서부터 큰 크기까지 다양한 표현형을 나타냄을 관찰할 수 있었던 반면, Δ73(jum73)에서는 검은 반점의 크기가 작았고 그 개수에 있어서도 한 개 이상은 찾아볼 수 없었다. 이러한 결과는, Δ9(jum9)이 Δ73(jum73)에 비해 보다 많은 수의 검은 반점을 갖는 유충을 발생시킬 수 있다는 것을 의미한다.
또한, 이들 돌연변이 초파리의 혈구세포를 정상 유충의 것과 광학 현미경하에서 비교해 본 결과, 혈구세포 양이 약 3배 정도 증가하였으며, 혈구세포의 크기 또한 정상 유충의 것에 비해 증가하였음을 관찰할 수 있었다(도 9). 이러한 결과는, CG5116이 혈구세포 증식을 억제하는 물질임을 의미하며, 앞에서 언급하였듯이, 초파리 혈구세포의 증식 및 흑색종(melanotic masses)의 형성과 유사한 형질을 나 타내는 인간의 백혈병 연구에 유용하게 이용될 수 있음을 시사한다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 부정확 절단방법에 의해 발생하는 검은 반점이 생기는 초파리 CG5116 유전자의 돌연변이체 즉, jum9 및 jum73 과정상 유충에서 나타나는 표현형의 차이는 이러한 초파리의 결손 돌연변이를 이용한 초파리 유전자 기능 연구뿐 아니라 사람의 유전자 돌연변이에 의한 기능 연구 및 새로운 기능 유전자의 발견과 질병 연구에 있어서 매우 유용한 동물 모델로서 이용될 수 있음을 시사한다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (15)
- CG5116 유전자 전사개시부위 이전 754 bp부터 전사개시부위 후 159 bp 또는 1219 bp까지의 DNA 단편의 절단으로 인해 CG5116 유전자가 녹아웃(knock out)된 초파리 돌연변이체.
- 제 1항에 있어서, UY3132 변이주로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 초파리 돌연변이체.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1항에 있어서, CG5116 유전자는 서열번호 2로 기재되는 아미노산을 서열을 코딩하는 것을 특징으로 하는 초파리 돌연변이체.
- 제 1항에 있어서, CG5116 유전자는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 초파리 돌연변이체.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 검은색 반점을 나타내는 표현형을 갖는 것을 특징으로 하는 초파리 돌연변이체.
- 1) UY3132 변이주의 교미하지 않은 암컷 초파리와 Δ2-3 변이주 수컷 초파리를 교배하는 단계;2) 단계 1의 자손 중 P 전이인자와 Δ2-3 변이주를 동시에 갖는 초파리를 선별하는 단계;3) 단계 2의 선별된 초파리와 TM6B를 갖고 표현형이 Tb(Tubby)인 교미하지 않은 암컷 초파리와 교배하는 단계;4) 단계 3의 자손 중 P 전이인자를 갖고 Tb이며, Sb(Stubble)가 아닌 초파리 선별하는 단계; 및5) 단계 4의 초파리 중 PCR 방법에 의한 부정확 절단 돌연변이 선별 및 구축하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제 1항의 초파리 돌연변이체 제조방법.
- 제 14항에 있어서, 단계 1의 UY3132 변이주는 CG5116 유전자의 5' 상단부위에 한 개의 P 전이인자가 삽입된 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 초파리 돌연변이체 제조방법.
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| KR1020060048682A KR100816797B1 (ko) | 2006-05-30 | 2006-05-30 | 유충 시기에 검은 반점이 나타나는 초파리 ｃｇ５１１６의유전자 돌연변이체 및 그의 제조방법 |
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| KR20070114968A KR20070114968A (ko) | 2007-12-05 |
| KR100816797B1 true KR100816797B1 (ko) | 2008-03-26 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR20030051664A (ko) * | 2000-09-29 | 2003-06-25 | 노파르티스 아게 | 베타 아밀로이드를 발현하는 형질전환 노랑초파리 |
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2006
- 2006-05-30 KR KR1020060048682A patent/KR100816797B1/ko not_active IP Right Cessation
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