KR20030051664A - 베타 아밀로이드를 발현하는 형질전환 노랑초파리 - Google Patents

Abstract

인간 APP 유전자의 A베타 및 C99 부분의 발현으로 인한 변형된 표현형을 나타내는 형질전환 파리가 개시된다. 초파리 유전자 및 이들 초파리 유전자의 인간 호몰로그를 확인 하는 방법에서 이들 파리를 사용하는 것은 잠재적으로 알츠하이머병과 관련되고, 이것도 개시되어 있다. 알츠하이머 병 및 APP 경로에서의 결합과 관련된 기타 이상을 치료하는 약제의 개발을 위한 의약 표적으로서의 상기 인간 호몰로그의 사용 및 이들 유전자에 관한 물질을 포함하는 약제학적 조성물 또한 개시되어 있다.

Description

베타 아밀로이드를 발현하는 형질전환 노랑초파리{TRANSGENIC DROSOPHILA MELANOGASTER EXPRESSING BETA AMYLOID}

인간에서의 가족형 알츠하이머병(FAD)의 유전과 관련된 세 개의 주요 공지된 유전자는 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 및 두 개의프리세닐린(PS1및PS2) 유전자이다. 이들 유전자에서의 미스센스 돌연변이는 Ab 펩티드의 증가된 생성을 유도하는데, 질병 상태에 대한 이 펩티드의 중요성은 강조되고 있다. APP는 두 개의 부위, β 및 γ에서 절단되어 40-42 아미노산펩티드, Ap를 방출한다( Mills, J. and Reiner, P. B. (1999)J. Neurochem 72: 443-460에서 검토됨). 펩티드의 C-말단이 절단되는, γ 부위 (Goate, A. et al., (1991). Nature 349: 704-706.)근처에서의 APP 내 미스센스 돌연변이는, 40/42 비를 변경함으로써, 더 많은 Aβ 42의 생성을 유도한다(Suzuki, N., et al. (1994). Science 264 : 1336-1340). β 부위부근의 돌연변이는 두 형태 모두의 생산이 전체적으로 증가하는 것을 유도한다 (Mullan, M., et al. (1992). Nat. Genet. 1: 345-347.); Citron, M. et al. (1995). Neuron 14: 661-670).

프리세닐린은 다중 통과 막통과 단백질이고, 그 기능은 현재 논쟁 중에 있다. 프리세닐린에서의 미스센스 돌연변이는 Aβ 42 형태의 방출을 증가시키고(Borchelt, D. R., et al. (1996). Neuron 17: 1005-1013); Citron, M., et al.(1997). Nat. Med. 3: 67-72; Murayama, O. et al. (1999). Neurosci. Lett. 265: 61-63),FAD 의 주요한 원인이다(Sherrington, R., et al. (1995). Nature 375: 754760).

여러 연구에서 가용성 및 불용성(응집) 형태 모두의 Aβ 역할을 연구하고 있고 펩티드의 응집 형태는 드러난 독성 효과의 원인인 것으로 널리 고려되고 있다(Pike, C. J., et al. (1993). J. Neurosci.13: 1676-1687; Lorenzo, A. and Yankner, B. A. (1994). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 12243-12247; Giovannelli, L., et al (1998). Neurosci. 87: 349-357). 세포내 칼슘 수준의 붕괴(검토를 위해 Fraser, S. P., et al. (1997). Trends Neurosci. 20: 67-72; Mattson, M. P. (1997). Physiol. Rev. 77: 1081-1132; Coughlan, C. M. and Breen, K. C. (2000). Pharmacol. and Ther. 86: 111-144 참조), 미세교세포의 활성화에 의한 염증 반응의 유도( Coughlan,C. M. and Breen, K. C. (2000). Pharmacol. and Ther. 86 : 111-144에서 검토됨), 및 학습 및 기억에 수반되는 전뇌 기저부 교감 신경계의 현저한 퇴화 및/또는 붕괴(Hellstrom-Lindahl and Court,2000, Behav. Brain Res. 113 (1-2): 159-68에서 검토됨)를 포함하는, Ap-유도된 뉴런 죽음에 공헌하는 여러 메카니즘이 있다. 따라서, Aβ 과다생산 및 AD에 대한 기여의 나쁜 영향은 여러가지이고 복잡한 것이 분명하다.

비록 상당량의 연구가 알츠하이머병 및 그 일반적 병리 연구에 바쳐졌지만, 인간 신경퇴화 장애의 유전적 분석은 한계가 있다. 결과적으로, 베타 아밀로이드의 축적을 개시하는 사건과 더불어 APP 및 알츠하이머 병에 기여한다고 의심되는 다른 유전자의 정확한 역할을 제대로 이해되지 못하고 있다.

AD의 확장 및 진전에서 중추 역할의 확립에 대한 여러 공헌은 모델 시스템에서의 연구로부터 나온다. APP의 야생형 또는 돌연변이형을 발현하는 형질전환 마우스는 AD 병리를 나타내고, 많은 경우 연령-의존적 형식으로 아밀로이드 반점을 진행시키고 어떤 경우 변화된 행동 및 인지를 나타낸다(검토를 위해 Price, D. L., et al (1998). Annu. Rev. Genet. 32: 461-493; van Leuven, F. (2000). Progress in Neurobiol. 61: 305-312 참조). Aβ 42 펩티드만을 발현하는 형질전환 마우스는 AD에서 정상적으로 영향을 받는 뇌 영역에서 광범위한 신경 퇴화를 나타내고, 50%는 12 개월에 죽는다(LaFerla, F. M. et al. (1995). Nature Genet. 9: 21-30). 이들 마우스에서 신경 세포는 궁극적으로 퇴화하고, 성상교세포증(astrogliosis) 및 호산구성 해면증(spongiosis)이 뒤따른다. 이는 생체 내에서 Aβ 42 발현이 유독하고, 신경세포 퇴화 및 아폽토시스를 유발한다는 것을 입증한다.

모델 유기체로서의 초파리의 사용은 인간 신경퇴화성 질병 경로의 규명에 중요한 도구로 입증되었는데(Fortini, M and Bonini, N. (2000). Trends Genet. 16: 161-167에서 검토됨), 초파리는 기능이 극히 잘 보존된 많은 관련 인간 오르톨로그(ortholog)을 함유하기 때문이다(Rubin, G.M., et al. (2000). Science 287: 2204-15). 예를 들면 노랑초파리는 신경계 기능에 수반되는 인간APP와 상동인 유전자를 가지고 있다. 유전자, APP-형 (Appl)은 세 개의 주요 도메인에 걸쳐 인간APP유전자의 신경적 이소형태(695)와 대략 40% 일치하고(Rosen et al., PNAS USA 86: 2478-2482 (1988)) 인간APP695처럼 신경계에서만 발현된다.Appl유전자가 결핍한 초파리는 인간APP유전자에 의해 구조가능한 행동적 결함을 나타내는데, 이는 두 개의 유전자가 두 유기체 내에서 유사한 기능을 함을 암시한다(Luo et al., Neuron 9: 595-605 (1992)).

부가적으로, 폴리글루타민 재발 질병의 초파리 모델(Jackson, G. R., et al (1998). Neuron 21: 633-642 ; Kazemi-Esfarjani, P. and Benzer, S. (2000). Science 287: 1837-1840; Fernandez-Funez et al. (2000) Nature 408 (6808): 101-6, and Parkinson's disease (Feany, M. B. and Bender, W. W. (2000). Nature 404: 394-398)은 인간 내의 질병 상태를 근사하게 흉내내고, 이 둘은 생리학적 수준뿐만 아니라 세포 수준에서도 이 질병에 중요한 역할을 하는 다른 유전자를 성공적으로 인식하는데 사용되고 있다. 그러므로, 모델계로서의 초파리의 힘은 질병 상태를 나타내고 대규모 유전자 선별을 수행하는 능력으로 입증된다.

본 발명은 일반적으로 AD 관련 유전자를 전위적으로 발현하는 형질전환 노랑초파리에서 APP 경로에 대해 작용하는 화합물 및 유전자를 확인하는 방법에 관한것이다. 이들 형질전환유전자의 발현은 가시적 표현형을 유도하고 이는 본 명세서에서 개시된 유전자 선별은 상기 유도된 가시적 표현형을 변형시키는 돌연변이의 확인에 의해 APP 경로 내에 수반되는 유전자를 확인하는데 사용될 수 있다. 이들 돌연변이에 의해 영향받는 유전자는 "유전자 변형자"라고 본 명세서에서 일컬어질 것이다. 그리하여 확인된 유전적 변형자의 인간 상동체는 알츠하이머병(AD) 치료의 전전을 포함하지만 이에 제한되지 않는 APP 경로에서의 비정상과 관련있는 이상을 치료하는 치료제 개발에 대한 유용한 표적으로 생각된다. 이들 인간 상동체 중 일부는 알츠하이머 병과 관련있다고 알려진 인간 염색체 10의 영역상에서 일어나는 것으로 생각된다 (Bertram et al., Ertekin-Taner et al., Myers et al., Science 290,2302-2305,2000). 그러한 인간 상동체는 AD와 유전적으로 연결될 가능성을 갖고, AD에 대한 마커로서 또는, 알츠하이머병(AD) 치료의 전전을 포함하지만 이에 제한되지 않는 APP 경로에서의 비정상과 관련있는 이상을 치료하는 치료제 개발에 대한 유용한 표적으로서 작용한다. 그러한 인간 상동체는 AD와 연관된 유전자를 수반하는 세포 경로에도 작용하고 이들 인간 상동체는 이들 경로에서 유전자를 확인하는데 사용될 수 있다.

발명의 요약

본 발명은 그 게놈이 인간 APP의 A베타 부분을 포함하는 폴리펩티드를 엔코드하고, 신호 서열에 융합된, A베타40 (SEQ ID : NO 1) 또는 A베타42 (SEQ ID : NO 2)를 엔코드하고, 조직-특이적 발현 제어 서열에 작동적으로 연결된 DNA 서열을 포함하고; 초파리 내에서 이 DNA 서열이 변형된 표현형을 나타내는 것을 유도하는DNA 서열을 발현시키는 형질전환 초파리에 관한 것이다. 특정 실시예에서, DNA 서열은 A베타42을 엔코드하고, 조직 특이적 발현 제어 서열은 눈-특이적 프로모터 GMR를 포함하고 DNA 서열의 발현은 "러프 아이(rough eye)" 표현형으로서 언급되는 변형된 표현형을 유도한다.

본 발명의 또다른 양상에서, 본 발명은 그 게놈이 인간APP(SEQ ID : NO 3)의 야생형 C99 부분 또는 신호 서열에 융합된 London 돌연변이(SEQ ID : NO 4)을 갖는 인간APP의 C99 부분을 포함하는 폴리펩티드를 엔코드하고, 조직-특이적 발현 제어 서열에 기능적으로 연결된 DNA 서열을 포함하고; 이 초파리 내에서 이 DNA 서열이 변형된 표현형을 나타내는 것을 유도하는 DNA 서열을 발현시키는 형질전환 초파리에 관한 것이다. 이 구체예에서, DNA 서열은 야생형 C99을 엔코드하고, 조직 특이적 발현 제어 서열은 UAS 제어 요소를 포함하고, 이는 7B-Gal4 형질전환유전자에 의해 뇌 내에서 생성된 Gal4 유전자에 의해 활성화되고, 이 DNA 서열의 발현은 이동 결함에 의해 특징지워지는 변형된 표현형을 유도한다. 또다른 특정 구체예에서, DNA 서열은 야생형 C99 또는 London 돌연변이를 갖는 인간APP의 C99 부분을 엔코드하고, 조직-특이적 발현 제어 서열은,apterous-Gal4 형질전환유전자에 의해 생성된 Gal4 단백질에 의해 활성화된 UAS 제어 요소를 포함하고, 이 DNA 서열의 발현은 "오목 날개(concave wing)" 표현형으로 불리는 변형된 표현형을 유도한다.

본 발명의 또다른 양상에서, 본 발명은 그 게놈이 인간 APP의 A베타 부분을 포함하는 폴리펩티드를 엔코드하고, 신호 서열에 융합된, A베타40 (SEQ ID : NO 1)또는 A베타42 (SEQ ID : NO 2)를 엔코드하고, 조직-특이적 발현 제어 서열에 작동적으로 연결된 DNA 서열을 포함하고; 이 초파리 내에서 이 DNA 서열이 변형된 표현형을 나타내는 것을 유도하는 DNA 서열의 발현하는 형질전환 초파리를 제공하는 단계; 공지된 또는 예상되는 유전자 내에 돌연변이를 함유하는 초파리와 상기 형질변환 초파리를 교배시키는 단계; 및 상기 DNA 서열 및 상기 돌연변이를 운반하고 대조구와 비교하여 형질전환된 표현형의 변형된 발현을 나타내는 초파리에 대한 상기 교배의 자손을 선별하는 단계를 포함하는, APP 경로에서의 유전적 변형자(genetic modifier)를 확인하는 방법에 관한 것이다. 한 실시예에서, DNA 서열은 A베타42을 엔코드하고, 조직 특이적 발현 제어 서열은 눈-특이적 프로모터 GMR를 포함하고 DNA 서열의 발현은 "러프 아이" 표현형으로서 언급되는 변형된 표현형을 나타내는 파리를 유도한다.

본 발명의 또다른 양상에서, 본 발명은 APP 경로의 유전적 변형자(genetic modifiers)를 확인하는 방법에 관한 것인데, 이 방법은: 그 게놈이 인간APP(SEQ ID : NO 3)의 야생형 C99 부분 또는 신호 서열에 융합된 London 돌연변이(SEQ ID : NO 4)을 갖는 인간APP의 C99 부분을 포함하는 폴리펩티드를 엔코드하고, 조직-특이적 발현 제어 서열에 기능적으로 연결된 DNA 서열을 포함하고; 이 초파리 내에서 이 DNA 서열이 변형된 표현형을 나타내는 것을 유도하는 DNA 서열의 발현하는 형질전환 초파리를 제공하는 단계; 공지된 또는 예상되는 유전자 내에 돌연변이를 함유하는 초파리와 상기 형질변환 초파리를 교배시키는 단계; 및 상기 DNA 서열 및 상기 돌연변이를 운반하고 대조구와 비교하여 형질전환된 표현형의 변형된 발현을 나타내는 초파리에 대한 상기 교배의 자손을 선별하는 단계를 포함한다. 이 구체예에서, DNA 서열은 야생형 C99을 엔코드하고, 조직 특이적 발현 제어 서열은 UAS 제어 요소를 포함하고, 이는 7B-Gal4 형질전환유전자에 의해 뇌 내에서 생성된 Gal4 유전자에 의해 활성화되고, 이 DNA 서열의 발현은 이동 결함에 의해 특징지워지는 변형된 표현형을 유도한다. 또다른 특정 구체예에서, DNA 서열은 야생형 C99 또는 London 돌연변이를 는 인간 APP의 C99 부분을 엔코드하고, 조직-특이적 발현 제어 서열은, apterous-Gal4 형질전환유전자에 의해 생성된 Gal4 단백질에 의해 활성화된 UAS 제어 요소를 포함하고, 이 DNA 서열의 발현은 "오목 날개" 표현형으로 불리는 변형된 표현형을 유도한다.

본 발명의 또다른 양상에서, 본 발명은 A베타의 발현에 의해 유도된 표현형을 변형할 수 있는 화합물을 평가함으로써 APP 경로에 수반되는 유전자 산물에 작용하는 화합물을 확인하는 방법에 관한 것인데, 이 방법은:

그 게놈이 인간 APP의 A베타 부분을 포함하는 폴리펩티드를 엔코드하고, 신호 서열에 융합된, A베타40 (SEQ ID : NO 1) 또는 A베타42 (SEQ ID : NO 2)를 엔코드하고, 조직-특이적 발현 제어 서열에 작동적으로 연결된 DNA 서열을 포함하고 ; 이 초파리 내에서 이 DNA 서열이 변형된 표현형을 나타내는 것을 유도하도록 DNA 서열을 발현하는 형질전환 초파리를 제공하는 것; 후보 화합물을 상기 초파리에 투여하는 것; 및 상기 후보 화합물을 투여받지 않은 형질전환된 파리의 표현형과 비교하여 상기 초파리 내의 표현형의 변화를 평가하는 것이다. 한 실시예에서, DNA 서열은 A베타42을 엔코드하고, 조직 특이적 발현 제어 서열은 눈-특이적 프로모터GMR를 포함하고 DNA 서열의 발현은 "러프 아이" 표현형으로서 언급되는 변형된 표현형을 유도한다.

본 발명의 또다른 양상에서, 본 발명은 C99의 발현에 의해 유도된 표현형을 변형할 수 있는 화합물을 평가함으로써 APP 경로에 수반되는 유전자 산물에 작용하는 화합물을 확인하는 방법에 관한 것인데, 이 방법은:

그 게놈이 인간APP(SEQ ID : NO 3)의 야생형 C99 부분 또는 신호 서열에 융합된 London 돌연변이(SEQ ID : NO 4)을 갖는 인간 APP의 C99 부분을 포함하는 폴리펩티드를 엔코드하고, 조직-특이적 발현 제어 서열에 기능적으로 연결된 DNA 서열을 포함하고 이 초파리 내에서 이 DNA 서열이 변형된 표현형을 나타내는 것을 유도하도록 DNA 서열을 발현시키는 형질전환 초파리를 제공하는 것; 후보 화합물을 상기 초파리에 투여하는 것; 및 상기 후보 화합물을 투여받지 않은 형질전환된 파리의 표현형과 비교하여 상기 초파리 내의 표현형의 변화를 평가하는 것이다. 한 구체예에서, DNA 서열은 야생형 C99을 엔코드하고, 조직 특이적 발현 제어 서열은 7B-Gal4 형질전환유전자에 의해 뇌 내에서 생성된 Gal4 유전자에 의해 활성화되는 UAS 제어 요소이고, 이 DNA 서열의 발현은 이동 결함에 의해 특징지워지는 변형된 표현형을 유도한다. 또다른 특정 구체예에서, DNA 서열은 야생형 C99 또는 London 돌연변이를 갖는 인간 APP의 C99 부분을 엔코드하고, 조직-특이적 발현 제어 서열은,apterous-Gal4 형질전환유전자에 의해 생성된 Gal4 단백질에 의해 활성화된 UAS 제어 요소이고, 이 DNA 서열의 발현은 "오목 날개" 표현형으로 불리는 변형된 표현형을 유도한다.

본 발명의 또다른 양상에서, 본 발명은 알츠하이머병 및, 알츠하이머병에 대한 잠재적인 마커로서 작용할 수 있는 단백질 생성물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 APP 경로의 비정상적인 조절과 관련된 이상의 개시 및 진전에 수반되는 유전자를 확인하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 본 발명의 방법에 따른 유전적 변형자로서 확인된 파리 유전자의 인간 상동체를 확인하는 것을 포함한다.

본 발명의 또다른 양상에서, 본 발명은 알츠하이머병 및, 알츠하이머병에 대한 잠재적인 마커로서 작용할 수 있는 단백질 생성물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 APP 경로의 비정상적인 조절과 관련된 이상의 개시 및 진전에 수반되는 유전자를 확인하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 알츠하이머병에 대한 유전적 연관성을 갖는 것으로 나타난 인간 염색체 10의 영역에 인접하게 위치한 초파리 유전적 변형자 유전자의 인간 상동체를 확인하는 것을 포함한다.

본 발명의 또다른 양상에서, 본 발명은 알츠하이머병 및, 알츠하이머병에 대한 잠재적인 마커로서 작용할 수 있는 단백질 생성물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 APP 경로의 비정상적인 조절과 관련된 이상의 개시 및 진전에 수반되는 유전자를 확인하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 인간 서열 hCP50765 (SEQ ID 35, EGR2 유전자에 의해 엔코드됨), 및 hCP41313 (Seq ID NO 15, SEQ ID N017 또는 SEQ ID NO 53, 초파리 nocA 유전자의 인간 상동체에 의해 엔코드됨)에 의해 엔코드된 전사 인자에 의해 조절되는 경로 내에 수반되는 유전자를 확인하는 것을 포함하고, 이 인간 서열은 알츠하이머병에 대한 유전적 연관성을 갖는 것으로 나타난 인간 염색체 10의 영역에 인접하게 위치한다.

본 발명의 또다른 양상에서, 본 발명은 알츠하이머병을 포함하지만 이에 제한되지 않는, APP 경로 내의 결함과 관련된 병리학적 이상의 치료, 예방 또는 개선에 유용한 화합물을 확인하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 알츠하이머병의 인 비트로 또는 인 비보 모델에 후보 화합물을 투여하는 것; 및 유전적 변형자의 유전적 상동체의 발현에서의 변화를 평가하는 것을 포함하고, 여기서 후보 화합물이 투여되지 않은 대조구 내의 수준과 비교되는 상기 상동체의 변화된 발현은 화합물의 잠재적 치료 지수를 나타낸다.

본 발명은 알츠하이머병을 포함하지만 이에 제한되지 않는, APP 경로 내의 결함과 관련된 병리학적 이상의 치료, 예방 또는 개선 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 본 명세서에서 확인된 유전적 변형자의 인간 상동체에 의해 엔코드된 폴리펩티드의 하나 이상의 기능을 저해 또는 촉진하는 화합물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 알츠하이머병을 포함하지만 이에 제한되지 않는, APP 경로 내의 결함과 관련된 병리학적 이상의 치료, 예방 또는 개선 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 본 명세서에서 확인된 유전적 변형자의 인간 상동체로부터 유래한 적절한 서열의 mRNA에 상보적인, 삼중나선 DNA, 안티센스 올리고누클레오티드 또는 리보자임으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 알츠하이머병을 포함하지만 이에 제한되지 않는, APP 경로 내의 결함과 관련된 병리학적 이상의 치료, 예방 또는 개선 방법에 관한 것으로서,이 방법은 본 명세서에서 확인된 유전적 변형자의 인간 상동체의 하나 이상에 관한 두 가닥 RNA 분자를 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량 을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 알츠하이머병을 포함하지만 이에 제한되지 않는, APP 경로 내의 결함과 관련된 병리학적 이상의 치료, 예방 또는 개선 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 본 명세서에서 확인된 유전적 변형자의 인간 상동체의 하나 이상에 의해 엔코드된 폴리펩티드에 관한 항체 및/또는 그의 단편을 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함한다.

또다른 양상에서, 본 발명은 또한 알츠하이머병을 포함하지만 이에 제한되지 않는, APP 경로 내의 결함과 관련된 병리학적 이상의 치료, 예방 또는 개선 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 개체로부터의 생물학적 샘플 내의 유전적 변형자의 인간 상동체의 하나 이상에 의해 엔코드된 폴리펩티드의 mRNA 수준 또는 활성을 측정하는 것을 포함하고, 여기서 대조 개체내의 수준과 상대적인 비정상 수준은 상기 이상을 진단한다.

또다른 양상에서, 본 발명은 개체로부터의 생물학적 샘플 내의 유전적 변형자의 인간 상동체의 하나 이상에 의해 엔코드된 폴리펩티드 또는 사익 폴리펩티드 또는 그 단편의 하나 이상을 엔코드하는 폴리누클레오티드의 발현 수준을 검출하는데 필요한 성분을 포함하는 키트에 관한 것이고, 이 키트는 상기 폴리펩티드 또는 상기 그의 단편에 결합하는 항체, 또는 상기 폴리쿠클레오티드 또는 그의 단편과 혼성화하는 올리고누클레오티드 프로브 및 이 키트를 사용하는 설명서를 포함한다.

또다른 양상에서, 본 발명은 적절한 약제학적 담체, 부형제 또는 희석제와 함께, 유전적 변형자 또는 그의 단편의 인간 상동체의 하나 이상에 관한 안티센스, 리보자임 이중 가닥 RNA 또는 삼중 나선 핵산, 유전적 변형자의 인간 상동체의 하나 이상에 의해 엔코드된 폴리펩티드 또는 그의 단편, 상기 폴리펩티드를 엔코드하는 폴리누클레오티드 또는 그의 단편, 및 상기 폴리펩티드와 결합하는 항체 또는 그의 단편으로 구성된 그룹으로부터 선택된 물질을 포함하는, 알츠하이머병을 포함하지만 이에 제한되지 않는, APP 경로 내의 비정상과 관련된 병리학적 이상의 치료를 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 알츠하이머병을 포함하지만 이에 제한되지 않는, APP 경로 내의 비정상과 관련된 병리학적 이상의 치료 방법에 관한 것으로서, 유전적 변형자의 인간 상동체의 하나 이상을 엔코드하는 핵산을 이를 필요로 하는 개체의 하나 이상의 조직에 도입하여 핵산에 의해 엔코드된 하나 이상의 단백질이 발현 또는 조직 내의 세포에 의해 분비되는 것을 유도하는 것을 포함한다.

알츠하이머병(AD)은 기억, 인지 및 행동을 제어하는 뇌 중추 내의 신경의 퇴화 및 궁극적인 죽음을 유도하는 신경학적 장애이다. 이 질병의 특징은 불용성 아밀로이드 축적물(노인 반점)이고, 그 중요 성분은 40-42 아미노산 아밀로이트 베타(Aβ) 펩티드, 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 단백 분해 산물이다. 이들 반점은 신경 세포의 퇴화 및 죽음을 유도하는 주요 원인 물질로 널리 고려되고 있다.

본 명세서에서 인용된 모든 특허출원, 특허, 문헌 및 웹사이트는 전체로서 참고문헌으로서 본 명세서에 포함된다.

본 발명의 수행에 있어서, 분자 생물학 및 재조합 DNA에서의 많은 종래 기술이 사용된다. 이들 기술은 널리 공지되어 있고, 예를 들면 다음에 설명되어 있다: Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II, and IIl, 1997 (F. M. Ausubel ed.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual,Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N. Y.; DNA Cloning : A Practical Approach, Volumes I and II, 1985 (D. N. Glover ed.); A Practical Guide to Molecular Cloning ; the series, Methods in En. zymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory); 및 Methods in Enzymology Vol. 154 and Vol. I55 (Wu and Grossman, and Wu, eds., respectively). 널리 공지된 초파리 분자 유전학 기술은 예를 들면 Robert, D. B., Drosophila, A Practical Approach (IRL Press, Washington, D. C., 1986)에서 알 수 있다. 초파리 스톡에 대한 설명은 http ://flybase. bio. indiana. edu에서 Flybase 데이터 베이스에서 찾을 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "형질전환" 유기체는 게놈 내에 삽입되는 여분의 유전 물질을 갖는 유기체를 언급한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "형질전환 파리"는 그 게놈 내에 무작위로 삽입된 같거나 또다른 유기체로부터의 DNA 서열을 포함하는 노랑초파리의, 배, 유충 또는 성체 형태를 포함한다. 노랑초파리가 바람직하긴 하지만, 초파리 속의 어떠한 파리도 본 발명에서 사용될 수 있다고 생각된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 형질전환유전자의 "전위" 발현은 정상적으로 발현되지 않은 특정 발육 단계에서 조직 또는 세포 내의 형질전환유전자의 발현을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이,"표현형"은 유전적 구성 및 환경 영향 모두에 의해 결정된 유기체의 관찰가능한 물리적 또는 생물화학적 특징을 언급한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "유전적 변형자의 인간 상동체에 의해 엔코드된 폴리펩티드의 하나 이상의 기능을 저해 또는 촉진"하는 화합물은, 단백질과의 결합 또는 상호작용에 의해, 간접적으로(다운스트림 효과를 통해) 또는 직접적으로 작용하는 화합물을 포함하고, 상기 단백질의 길항제 또는 효능제를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "엄격한 오르톨로그"는 다음 기준을 만족하는 것으로 정의된다: 파리 유전자 X는 인간 단백질과 가장 잘 일치하고 파리 단백질 X는 인간 유전자 Y외의 다른 파리 유전자와는 더 잘 일치하지 않고 인간 단백질 Y는 파리 단백질과 가장 잘 일치하고 인간 단백질 Y는 파리 단백질 X 외의 다른 인간 단백질과는 더 잘 일치하지 않고, 여기서 "X" 및 "Y"는 비교되는 어떠한 두 마리 파리 또는 인간 단백질을 나타낸다.

"추정적 오르톨로그"는 다음 두 가지 기준만을 만족하는 것으로 정의된다: 파리 단백질 X가 다른 파리 단백질과 더 많이 일치하는지 및/또는 인간 단백질 Y가 다른 인간 단백질과 더 많이 일치하는지의 여부와 관계없이, 파리 유전자 X는 인간 단백질과 가장 잘 일치하고 인간 단백질 Y는 파리 단백질 X과 가장 잘 일치한다. 본 명세서에서, 모든 기타 인간/파리 일치성은 "상동체"로 간주된다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "발현 제어 서열"은 프로모터 및 인헨서를 의미한다. 용어 "프로모터"는 전사의 개시 중 DNA-의존적 RNA 폴리머라제에 의해 결합되고 직접 또는 간접적으로 인지되는 DNA 서열을 의미하고 인헨서 요소를 포함한다. 본 발명에서 사용된 인헨서는 이스트 Gal4 전사 조절자에 의해 활성화되는UAS 요소를 포함한다.

용어 "전사 인자"는 진핵세포에서 전사를 개시 또는 조절하는데 필요한 어떠한 단백질을 의미한다. 예를 들면, 눈-특이적 프로모터 GMR은 눈-특이적 전사 인자, GLASS 에 대한 결합 부위이다. (Moses, K and Rubin, GM Genes Dev.5 (4): 583-93 (1991)).

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "A베타" (Aβ)는 β 및 γ 세크레타제에 의한 APP의 단백분해적 절단에 의해 생성된 짧은(40-42 아미노산) 펩티드인 베타 아밀로이드 펩티드를 의미한다. 이는 아밀로이드 축적의 주요 성분이고, AD의 특징이고 신경 세포 죽음 및 퇴화의 원인이다. 본 발명의 A베타 펩티드는 40 및 42 아미노산의 펩티드를 포함하지만 이에 제한되지 않고, 각각 A베타40 (또는 Ap40) (SEQ ID NO: 1) 및 A베타42 (또는 Aβ42) (SEQ ID NO: 2)로서 언급된다.

"C99"는 A베타 영역과 더불어 세포질 꼬리인 APP (SEQ ID NO: 3)를 포함하는 펩티드를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 이 용어는, C99 London 서열도 포함하는데, 이는 London FAD 알츠하이머 관련 돌연변이(SEQ ID NO: 4) (Goate, A., et al (1991) Nature 349: 704-706)를 운반한다. A베타 및 C99 펩티드는 업계에 널리 공지되어 있다(참조, 예를 들면, Golde et al., Science 255 : 728-730 (1992); Coughlan, C. M. and Breen, K. C. (2000). Pharmacol. and Ther. 86: 111-144).

본 명세서에서 사용된 바와 같이 "UAS" 영역은 GAL-4 전사 활성자에 의해 인식되는 업스트림 활성 서열을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "신호 서열"은 세포 내에서 단백질의 최종적인 위치를 결정하는 아미노산의 짧은 서열로서, 예를 들면 N-말단 서열 또는 소포체에 대한 초기 분비 및 막통과 단백질에 관한 20 가량의 아미노산을 들 수 있다. 본 업계의 숙련자에게 익숙한 어떠한 종래 신호 서열은 분리 경로를 통해 엔코드된 C99 또는 A베타 단백질의 전이에 사용될 수 있고, 내인성 초파리 Appl 또는 프레세닐린, 또는 윈드뷰텔(windbeutel) 유전자를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니고, 소포체 (endoplasmic reticulum) 상주 단백질(Konsolaki and Schupbach, Genes & Dev. 12: 120-131 (1998)), 또는 인간 프리-프로엔케팔린 유전자 신호(SEQ ED NO: 5)을 엔코드한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "대조" 파리는 대조 유충 또는 파리는 표현형 변형에 대해 시험되는 돌연변이를 운반하지 않고, 후보 화합물을 투여받지 않는다는 점을 제외하고는 본 발명의 방법에서 사용된 유충 또는 파리와 동일한 유전형인 유충 또는 파리를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "대조 개체"는 APP 경로 내의 비정상과 관련된 이상을 격지 않는 유기체를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "초파리 형질전환 벡터"는 전위가능한 요소 서열을 함유하고 유기체의 게놈 내의 DNA조각의 삽입을 매개할 수 있는 DNA 플라스미드이다. 이 기술은 이 업계의 숙련자에게 익숙하다.

본 명세서에서, "러프 아이" 표현형은 낱눈 및 상호-낱눈 털(inter-ommatidial bristles)의 무조직에 의해 특징지워지고 신경 세포의 퇴화에 의해 유발될 수 있다. 이 표현형은 해부 스테레오-현미경을 통해 볼 수 있다.

본 명세서에서, "오목 날개(concave wing)" 표현형은 날개가 길이 차이에 의해 위쪽으로 접히는 파리 날개의 비정상적 접힘에 의해 특징지워진다.

본 명세서에서, "이동성 결함"은 파리가 종래의 운동 활성 평가에서 야생형 파리와 비교되는 기계적 교반에 대해 결함있는 반응을 나타내는 표현형을 의미한다.

본 명세서에서, 다음 및 관련 문장, APP 경로 내의 비정상과 관련된 병리적 이상, APP 경로의 조절과 관련된 이상, 알츠하이머병과 관련된 이상, APP 경로 내의 비정상 조절과 관련된 병리적 이상은 모두 알츠하이머병을 포함하지만 이에 제한되지 않고, 기억, 인지 및 행동을 제어하는 뇌 클러스터 내의 뉴런이 퇴화 및 궁극적인 죽음에 의해 특징지워지는 이상을 포함한다.

"치료적 유효량"은 활성 성분, 예를 들면 치료될 이상 증상을 개선하는 화합물 또는 유전자 산물의 양을 의미한다.

형질전환 초파리를 포함하는, 형질전환 유기체를 얻는 방법은 업계의 숙련자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들면, P-요소 매개된 형질전환에 대해 통상 사용되는 참고문헌은 Spradling, 1986. P element mediated transformation. In Drosophila: A practical approach (ed. D. B. Roberts), pp 175-197. IRL Press, Oxford,UK))이다. EP 요소 기술은 이스트 Gal4 전사 활성자를 이용한 이원 시스템을 의미하고, 이는 내인성 초파리 유전자의 전사를 전위적으로 조절하는데 사용된다. 이 기술은: Brand and Perrimon, 1993. Targeted gene expression as a meansof altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development 118, pp401-415 and in: Rorth et al, 1998. Systematic gain-offunction genetics in Drosophila. Development, 125 (6), ppl049-1057에 기술되어 있다.

본 발명은 형질전환 파리, 노랑초파리를 개시하는데, 이는, 통상의 방법에 따라 N-말단에서 신호 서열, 예를 들면 SEQ ID NO : 5에 융합하는 베타 아밀로이드 부분 (SEQ ID NO : 1 또는 SEQ ID NO: 2) 또는 인간 APP 유전자의 C99 부분 (SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 4)을 포함하는 폴리펩티드를 엔코드하는 DNA 서열을 그 게놈 내에 함유하여, 분비 경로를 통해 엔코드된 폴리펩티드의 전이를 보장한다. 융합된 DNA 서열은 사용되는 발현 시스템에 따라, 프로모터 영역 또는 업스트림 활성 서열 (UAS)과 같은 조직-특이적 발현 제어 서열에 기능적으로 연결된다. 이들 발현 제어 서열은 파리 내의 신경 조직에 특이적인 것을 포함하고 눈, 날개, 가슴등판(notum), 뇌, CNS 및 PNS과 같은 기관을 포함한다. 이들 조직 특이적 제어 서열의 제어 하에, 엔코드된 펩티드가 전사되어 mRNA를 형성하고 이는 검출가능한 수준의 베타아밀로이드 또는 C99 펩티드로 번역되고 이는 파리 내의 변화된 표현형을 유발한다. 이들 표현형에서의 변화를 평가함으로써, 이들 파리는 APP 경로에 영향을 미쳐 APP 경로 및 알츠하이머병의 분자적 및 생물화학적 매카니즘에 대한 식견을 제공할 수 있는 유전자 또는 화합물을 확인하는데 사용될 수 있다.

통상의 발현 제어 시스템은, 본 발명의 베타아밀로이드 및 C99 펩티드를 포함하는, 목적 단백질의 전위적 발현을 이루는데 사용될 수 있다. 그러한 발현은 생물화학적 경로의 교란 및 변화된 표현형을 유발한다. 그러한 발현 제어 시스템은 프로모터 또는 인헨서와 같은 조직-특이적으로 발현된 유전자의 발현 제어 서열에 대한 DNA 서열의 직접 융합을 수반한다. 사용가능한 또다른 발현 제어 시스템은 이원 Gal4-전사 활성화 시스템 (Brand and Perrimon, Development 118: 401-415 (1993))이다.

Gal4 시스템은 목적 유전자의 발현을 조직 특이적 방법으로 유발하는데, 이스트 전사 활성자 Gal4을 사용한다. Gal4 유전자는 통상의 형질전환 시스템을 사용하여, 파리 게놈 내로 무작위로 삽입되어, 일시적으로 조직-특이적 방법으로 발현을 유발하는 게놈 인헨서의 제어 하에 놓이게 된다. 파리의 각 변종은 확인되어 있고, "drivers"로 명명되고, 이들 삽입물을 운반한다 (Brand and Perrimon, Development 118: 401- 415 (1993)).

Gal4 시스템에서, 목적 유전자는 형질전환 벡터 내로 클로닝되어, 그 전사가 UAS 서열 (UpstreamActivatingSequence), Gal4-반응성 요소의 제어 하에 있게 된다. 목적 서열의 UAS-유전자를 운반하는 파리 변종이 조직 특이적 인헨서 제어 하에서 Gal4 유전자를 발현하는 파리 변종과 교배될 때, 유전자는 조직 특이적 패턴으로 발현된다.

성인 조직에서 쉽게 볼 수 있는 표현형을 발생시켜 유전적 선별에 사용하기 위해, 파리 발육의 이후 단계에서 발현을 유발하는 Gal4 "드라이버"는 본 발명에서 사용될 수 있다. 이들 드라이버를 사용하여, 발현이 날개, 눈, 다리, 서로 다른 감각 기관 및 뇌 내의 가능한 결함을 유발할 수 있다. 이들 "드라이버"는 예를 들면,apterous-Gal4 (날개), elav-Gal4 (CNS),sevenless-Gal4,eyeless-Gal4 및pGMR-Gal4 (눈)을 포함한다. 부가적으로Appl, 즉 APP의 파리 상동체는 신경 조직에서만 발현하기 때문에, 최소한 발현의 서브셋이 신경계의 일부분으로 지향된 "드라이버" 변종이 바람직하다. 이는 뇌 특이적 7B-Gal4 드라이버를 포함한다. Gal4 라인에 대한 기술 및 그 특이적 발현 패턴에 대한 사항은 Flybase (http ://flybase. bio. indiana. edu)에서 찾을 수 있다.

다양한 DNA 구성체가 본 발명의 형질전환 노랑초파리를 발생시키는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 이 구성체는 프리-프로엔케팔린 유전자 신호 펩티드 서열에 융합된 인간 APP 유전자의 베타 아밀로이드 또는 C99 부분을 포함할 수 있고 눈-특이적 프로모터, GMR에 기능적으로 연결될 수 있다. 또다른 예에서, 구성체는 프리-프로엔케팔린 유전자 신호 펩티드 서열에 융합되고, UAS 서열을 전사 영역의 업스트림에 위치시킨 pUAST 벡터 (Brand and Perrimon, Development 118: 401-415 (1993)) 내로 클로닝된 인간 APP 유전자의 베타 아밀로이드 또는 C99 부분을 포함할 수 있다. 이들 구성체의 파리 게놈 내로의 삽입은 P-요소 재조합, Hobo 요소 재조합 (Blackman et al., EMBO J. 8: 211-217 (1989)), 상동적 재조합 (Rong and Golic, Science 288: 2013-2018 (2000)) 또는 업계의 숙련자에게 공지된 기타 기술을 통해 발생할 수 있다.

상기에서 기술한 바와 같이, 전위적으로 발현된 유전자는 특정 생화학적 경로의 교란에 의해 변화된 표현형을 유발할 수 있다. 동일한 생화학적 경로에서 작용하는 유전자 내의 돌연변이는 변화된 표현형의 변형을 유발할 것으로 예상된다. 그러므로, 본 발명의 파리는 C99 또는 A베타 형질전환 파리를, 공지된 또는 예상되는 유전자 내의 돌연변이를 함유한 파리와 교배시키고; 및 교배된 자손을 대조구와 비교하여 C99 또는 A베타 형질전환 파리의 변화된 표현형의 정성적 또는 정량적 변형을 나타내는 파리를 선별함으로써 APP 경로 내에 작용하는 유전자를 확인하는데 사용될 수 있다. 그러므로, 이 시스템은 가공된 APP 유전자 산물의 기능을 규명하는데 극히 유용할 뿐만 아니라, 그 생성물과 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 기타 유전자도 확인할 수 있다. 선별될 수 있는 돌연변이는, 공지된 유전자의 기능상실 대립상실 유전자, 결실 변종, 삽입부 근처의 유전자의 전위적 발현을 활성화할 수 있는 Gal4-유도가능 구성체의 초파리 게놈 내로 무작위 삽입하여 발생한 기능-획득 돌연변이 및 P-요소에 의해 발생한 "인헨서-트랩"변종을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. APP 경로에 수반되는 유전자는 이런 식으로 확인되고 이들 유전자는 이후 APP 경로의 비정상과 관련되어, 알츠하이머병을 포함하지만 이에 제한되지 않는 질병을 유도하는 이상을 치료하는 치료제의 개발을 위한 표적으로서 작용할 수 있다.

본 발명의 C99 및 A베타 형질전환 파리는 APP 경로를 변형할 수 있고 그리하여 상기에서 논의된 이상을 치료하는데 유용할 수 있는 화합물을 확인하는 방법에도 사용될 수 있다. 상기 방법은 C99 및 A베타 형질전환 파리에 대한 후보 화합물을 투여한 다음 이 화합물을 투여받지 않은 대조 C99 및 A베타 형질전환 파리의 표현형과 비교하여 이 C99 및 A베타 형질전환 파리의 표현형에서의 변화를 평가하는 것을 포함한다. 예를 들면, 통상의 방법을 사용하여, 후보 화합물은 베타아밀로이드 또는 C99를 발현하는 유충에 대해 투여될 수 있다. 유충은 이후 성체 단계까지성장하고 C99 또는 A베타-유도된 표현형의 변형이 평가된다. 후보 화합물은 성체 파리에 대해서도 투여될 수 있고 표현형의 변형이 평가된다.

그리하여 확인된 화합물의 작용 메카니즘은 유전자 조작에 의해 생성된 표현형을 대상 화합물을 투여하여 유도된 것과 비교함으로써 검사될 수 있다. 그러한 화합물은 형질전환 파리에서 발생된 변화된 표현형을 개선 또는 악화시키는 것을 포함한다. 공지의 유전자 변형과 관련된 것과 유사한 화합물-유도된 표현형의 발현은 이 화합물이 유전자 변형이 영향을 미치는 동일 경로에 대한 작용을 갖는다는 것을 암시한다.

본 발명의 형질전환 파리에서의 화합물 선별에 부가하여, 그러한 화합물은 AD의 인 비트로 및 기타 인 비보 모델을 이용하여 통상의 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들면, 여러 세포주가 DA의 인 비트로 모델로서 사용될 수 있고 당업자에게는 친숙하고, 예를 들면, Xia et al, 1997 PNAS USA 94 (15): 8208-13에 기술된 세포주를 포함한다. 인 비보 모델도 또한 존재하고, 예를 들면 WO 94/00569에 개시된 AD의 마우스 모델을 포함한다.

본명세서에서 개시된 형질전환 파리 내의 베타 아밀로이드 또는 C99에 대한 작용에 영향을 미치는 화합물의 작용 메카니즘 규명은 칩상의 RNA 프로파일링 (Affymetrix, Santa Clara) 또는 기타 통상의 방법을 사용하여서도 수행될 수 있다. 예를 들면, 후보 화합물을 투여한 초파리의 RNA 프로파일은 유전적으로 변형된 초파리의 그것과 비교하여 평가될 수 있다. 유사한 프로파일은 그 화합물이 베타 아밀로이드 또는 C99 영향을 받은 경로 상에 어떤 식으로 작용함을 암시한다.

본 명세서에서, 본 발명은 알츠하이머병 및, 알츠하이머병에 대한 잠재적인 마커로서 작용할 수 있는 단백질 생성물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 APP 경로의 비정상적인 조절과 관련된 이상의 개시 및 진전에 수반되는 유전자를 확인하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 인간 서열 hCP50765 (SEQ ID 35, EGR2 유전자에 의해 엔코드됨), 및 hCP41313 (Seq ID NO 15, SEQ ID N0 17 또는 SEQ ID NO 53, 초파리 nocA 유전자의 인간 상동체에 의해 엔코드됨)에 의해 엔코드된 전사 인자에 의해 조절되는 경로 내에 수반되는 유전자를 확인하는 것을 포함하고, 이 인간 서열은 알츠하이머병에 대한 유전적 연관성을 갖는 것으로 나타난 인간 염색체 10의 영역에 인접하게 위치한다. 상기에서 언급된 전사 인자에 의해 조절되는 그러한 유전자의 확인은 SELEX이라고 불리는 기술을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 통상의 방법을 이용하여 이루어질 수 있는데,이 기술은 Tuerk and Gold, 1990, Science 249,505-510 and Brown and Gold, 1995, Biochemistry 34, 14765-14774에 개시되어 있다. 예를 들면, 특이전 전사 인자에 의해 조절되는 유전자는 특이적 전사 인자의 표적 DNA 서열을 결정하는 것에 의해 확인될 수 있다. 그러한 표적 서열 확인은 SELEX을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 서로 다른 방법에 의해 이루어질 수 있다. 일단 표적 서열이 확인되면, 공지되고 예상되는 유전자의 업스트림 조절 영역 내의 이 서열의 존재는, 당업자에게 널리 공지된 생물정보학 수단을 사용하여 결정될 수 있다. 업스트림 조절 영역 내에 표적 서열을 포함하는 유전자는 특이적 전사 인자에 의해 조절될 수 있다고 예상될 수 있다.

본 발명에 의해 확인된 유전적 변형자의 인간 상동체에 의해 엔코드된 단백질의 기능 또는 발현에 영향을 주는(예를 들면 저해 또는 촉진) 화합물은 알츠하이머병 또는 APP 경로의 조절에서의 결함과 관련된 기타 이상을 치료하는데 유용할 수 있다고 생각된다. 부가적으로, 통상의 방법을 사용하여, 치료적 지수의 안티센스 올리고누클레오티드, 리보자임, 삼중 나선 DNA 및/또는 이중 가닥 RNA를 유전적 변형자의 이들 인간 상동체의 누클레오티드 서열에 기초하여 생성할 수 있다고 생각된다. 유전적 변형자의 인간 상동체에 의해 엔코드되고 통상의 방법을 사용하여 생성된 폴리펩티드에 관한 항체의 치료적 사용이 본 명세서에서 생각된다. 그러므로, 본 발명의 부가적 양상은, 적절한 약제학적 담체, 부형제 또는 희석제와 함께, 알츠하이머병 및 관련 이상을 치료하기 위한 약제학적 조성물을 투여하는 것에 관한것이다. 그러한 약제학적 조성물은, 상기에서 논의된 안티센스 올리고누클레오티드, 리보자임, 삼중 나선 DNA, 이중 가닥 RNA 및/또는 항체를 포함한다. 이 조성물은 본 발명에 의해 확인된 유전적 변형자의 인간 상동체의 발현 산물(예를 들면 폴리펩티드 또는 그의 단편)도 포함할 수 있다. 본 조성물은 안정화 화합물과 같은 최소한 하나의 기타 시약과 조합하여 또는 단독으로 투여될 수 있고, 식염수, 버퍼된 식염수, 덱스트로스, 및 물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 무균, 생체적합성 약제학적 담체 내에서 투여될 수 있다. 본 조성물은 다른 시약, 약물 또는 호르몬과 조합하여, 또는 단독으로 이를 필요로 하는 개체에 투여될 수 있다.

본 발명의 범위에 포함되는 본 약제학적 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 골수내, 척수강내, 정맥내, 피부내, 피하, 복강내, 비강내, 장내, 외용적, 설하, 또는 직장 수단을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 다수의 경로로 투여될 수 있다.

활성 성분에 부가하여, 이들 약제학적 조성물은 활성 화합물이 약제학적으로 사용될 수 있도록 가능하는 것을 촉진하는 부형제 및 보조제를 포함하는 적절한 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 제제화 및 투여에 대한 기술에 관한 상세 사항은 Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, Pa.)의 최종판에서 찾을 수 있다.

경구 투여를 위한 약제학적 조성물은 경구 투여에 적합한 투여량에서 당업자에게 널리 공지된 약제학적으로 허용가능한 담체를 사용하여 제제화될 수 있다. 적절한 담체는 환자에 의한 소화를 위한 정제, 환, 당의정, 캅셀제, 액제, 겔제, 시럽제, 스러리, 현탁제 등으로 제제화되는 것을 가능하게하다.

경구 사용을 위한 약제학적 제제는 고형 부형제와 활성 화합물을 조합시키고, 결과의 혼합물을 임의적으로 분쇄하고, 혼합물을 과립으로 가공하고, 적절한 보조제를 부가한 후, 필요한 경우, 정제 또는 당의정 코어를 얻음으로써 얻어질 수 있다. 적절한 부형제는 단수화물 또는 단백질 충전제이고, 예를 들면 다음과 같다: 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 솔비톨을 포함하는 당; 옥수수, 밀, 쌀, 감자, 또는 기타 식물로부터의 전분; 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀풀로스, 또는 소듐 카복시메틸셀룰로스와 같은 셀룰로스; 아라비아 및 트라가칸트를 포함하는 검; 및 젤라틴 및 콜라겐과 같은 단백질. 필요한 경우, 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 아가, 알긴산, 또는 소듐 알기네이트와 같은 그의 염과 같은 붕해제 또는 가용화제를 부가할 수 있다.

당의정 코어는 농축된 당 용액과 같은 적절한 코팅제와 함께 사용될 수 있고, 이 용액은 아라비아 검, 탈크, 폴리비닐피롤리돈, 카보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 및/또는 티타늄 디옥사이드, 래커 용액, 및 적절한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 포함할 수 있다. 제품 식별 또는 활성 화합물의 양, 즉, 투여량을 특성화하기 위해 염료 또는 안료를 정제 또는 당의정에 부가할 수 있다.

경구적으로 사용가능한 약제학적 제제는 젤라틴으로 만들어진 밀어서 고정시키는(push-fit) 캡슐뿐만 아니라, 젤라틴 및 글리세롤 또는 솔비톨 같은 코팅제로 만들어진 연성, 밀봉 캡슐도 포함한다. 밀어서 고정시키는 캡슐은 락토스 또는 전분과 같은 충전제 또는 결합제, 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 활택제, 및 임의적으로 안정화제와 혼합된 활성 성분을 포함할 수 있다. 연성 캡슐에서, 활성성분은 안정화제와 함께 또는 없이, 지방 오일, 액체, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적절한 액체 내에 용해되거나 현탁될 수 있다.

비경구 투여를 위해 적절한 약제학적 제제는 바람직하게는 Hanks' 용액, Ringer's 용액, 또는 생리학적으로 완충된 식염수와 같은 생리학적으로 적합한 버퍼 내에서, 수성 용액으로 제제화될 수 있다. 수성 주사 현탁액은 소듐 카복시메틸 셀룰로스, 솔비톨, 또는 덱스트란과 같은, 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 부가적으로, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적절한 친유성 용매 또는 담체는 참기름, 또는 에틸 올레이트 또는 트리글리세리드, 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 비-지방 다중양이온 아미노 폴리머도 송달용으로 사용될 수 있다. 임의적으로, 현탁액은 화합물의 용해도를 증가시켜 고농축 용액의 제조를 가능하게 하는 적절한 안정화제 또는 시약을 함유할 수도 있다.

외용 또는 비강 투여를 위해, 투과될 특정 장벽에 적합한 투과제가 제제에 사용된다. 그러한 투과제는 업계에 통상 공지되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 예를 들면 통상의 혼합, 용해, 과립화, 당의-피복, 분쇄, 유화, 캡슐화, 포접, 또는 동결건조 공정과 같은 수단에 의해, 업계에 공지된 방법으로 제조될 수 있다.

본 약제학적 조성물은 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 숙신산 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 많은 산과 함께 형성될 수 있다. 염은 상응하는 유리 염기 형태보다 수성 또는 기타 프로톤성 용매에 더욱 가용성인 경향이 있다. 다른 경우, 바람직한 제제는 다음 중 일부 또는 전부를 포함하는 동결 분말이다: : 1-50 mM 히스티딘, 0.1% - 2% 수크로스, 및 2-7% 만니톨, 4.5 내지 5.5의 pH 범위에서 사용 전에 버퍼와 조합된다.

약제학적 조성물을 제조한 후, 적절한 용기 내에 배치되고 이들은 표시된 이상의 치료를 위해 라벨링된다. 본 발명에 따라 확인된 화합물 도는 유전자 산물의 투여를 위해, 그러한 라벨링은 투여의 양, 빈도, 및 방법을 포함한다.

본 발명에 사용하기에 적절한 약제학적 조성물은 활성 성분이 의도하는 목적을 이루기에 효과적인 양으로 함유된 조성물을 포함한다. 유효 용량의 결정은 당업자의 능력 범위 내의 것이다.

어떠한 화합물에 대해, 치료적으로 유효한 용량은 예를 들면, 종양 세포같은세포 배양 어세이, 또는 통상, 마우스, 토끼, 개, 또는 돼지 같은 동물 모델 내에서 초기에 측정될 수 있다. 동물 모델은 적절한 농도 범위 및 투여경로를 결정하는데 사용될 수 있다. 그러한 정보는 이후 인간에서의 유효한 용량 및 경로를 결정하는데 사용될 수 있다.

"치료적으로 유효한 용량"은 예를 들면 증상 또는 이상을 개선하는 화합물 또는 유전자 산물과 같은 활성 성분의 양을 언급한다. 치료 유효성 및 독성은 세포 배양물 또는 실험 동물 내에서 예를 들면 ED₅₀(집단의 50%에서 치료적으로 유효한 용량) 및 LD₅₀(집단의 50%에 대해 치사하는 용량)가 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 사이의 용량비는 치료 지수이고, 이는 LD₅₀/ED₅₀비로서 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 약제학적 조성물이 바람직하다. 세포 배양 어세이 및 동물 연구로부터 얻어진 데이터는 인간에서의 사용에 대한 용량의 범위를 결정하는데 사용된다. 그러한 조성물 내에 함유된 용량은 독성이 없거나 거의 없이 ED₅₀을 포함하는 순환 농도의 범위 내인 것이 바람직하다. 이 범위 내의 용량은 사용된 투여 형태, 환자의 민감도, 및 투여 경로에 따라서 다르다.

정확한 용량은 치료를 요하는 개체와 관련된 인자의 관점에서, 치료자에 의해 결정될 수 있다. 용량 및 투여는 활성 부분의 충분한 수준을 제공하도록 또는 소기의 효과를 유지하도록 조정된다. 고려되어야 할 인자는 병 상태의 정도, 개체의 일반적 건강상태, 나이, 체중, 개체의 성별, 식이, 시간, 및 투여빈도, 약물병용, 반응 민감도, 및 치료에 대한 내약성/반응을 포함한다. 장시간-작용 약제학적 조성물은 3 내지 4일, 매주, 매 2주마다, 특정 제제의 반감기 및 클리어란스 속도에 따라 투여될 수 있다.

정상 투여량은 0.1 내지 100,000 마이크로그램까지, 투여경로에 다라 약 1g의 총용량까지 변화될 수 있다. 특정 용량 및 송달 방법에 대한 가이드는 선행 문헌에서 제동되고 있고 당업계의 숙련자에게 일반적으로 이용가능하다. 당업자는 단백질 또는 그 저해제보다 누클레오티드에 대해 서로 다른 제제를 사용할 것이다. 유사하게, 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드의 송달은 특정 세포, 질병, 위치 등에 특이적이다. 단백질의 경구 투여에 적합한 약제학적 제제는 예를 들면 미국 특허 5,008,114; 5,505,962; 5,641,515; 5,681, 811; 5,700,486; 5,766,633; 5,792,451; 5,853,748; 5,972,387; 5,976,569; 및 6,051,561에 기술되어 있다.

본 명세서에서, 알츠하이머병을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 개체 내의 APP 경로에서의 비정상과 관련된 병리학적 이상의 진단 방법은 표 1의 데이터가 주어지는 것이 가능하다. 예를 들면, 이 방법은 개체로부터 생물학적 샘플 내에서 표 1의 유전자의 인간 유전적 상동체의 하나 이상에 의해 엔코드된 포리펩티드의 수준을 측정하는 것을 포함하는데, 여기서 정상 개체 내의 수준과 비교되는 하나 이상의 상기 폴리펩티드의 비정상 수준은 이 질병의 진단이다. 그러한 어세이는 당업자에게 인숙한 통상의 기술을 사용하여 수행될 수 있다.

또다른 구체예에서, 유전적 변형자의 인간 상동체 또는 그의 기능적 유도체를 엔코드하는 서열을 포함하는 핵산은 유전자 치료를 통해, APP 경로 기능을 촉진하도록 투여된다. 유전자 치료는 개체에 대해 핵산을 투여함에 의해 수행되는 치료를 의미한다. 본 발명의 이 구체예에서, 핵산은 정상적인 APP 경로 기능을 촉진함으로써 치료적 효과를 매개하는 그의 엔코드된 단백질을 생성한다.

업계에서 이용가능한 유전자 치료의 어떠한 방법도 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 예시적 방법은 아래에 기술된다.

바람직한 양상에서, 치료는 적절한 숙주 내에서 유전적 변형자 단백질 또는 단편 또는 그의 키메릭 단백질을 발현하는 발현 벡터의 일부인 유전적 변형자에 대한 핵산을 포함한다. 특히, 그러한 핵산은 특정 유전적 변형자 단백질 코딩 영역에 기능적으로 연결된 프로모터를 갖고, 이 프로모터는 유도가능하거나 구축가능하고, 임의적으로 조직 특이적이다. 또다른 특정 구체예에서, 핵산 분자는 변형자 단백질 코팅 서열 및 기타 필요한 서열이 게놈 내의 소기의 부위에서 상동적 재조합을 촉진하는 영역에 인접하게 위치하여, 변형자 핵산의 염색체 내 발현을 제공하도록 하는데 사용될 수 있다 (Koller and Smithies, 1989,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342: 435-438).

환자에 대한 핵산의 송달은 직접적이거나, 이 경우 환자는 핵산 또는 핵산-운반 벡터에 바로 노출된다, 또는 간접적, 이 경우 세포는 인 비트로에서 핵산으로 먼저 형질전환되고, 이후 환자내로 이식된다. 이들 두가지 방법은 각각 인 비보 또는 엑스 비보 유전자 치료로서 공지되어 있다.

특정 구체예에서, 핵산은 인 인보에서 직접 투여되고, 이 때 엔코드된 생성물이 생성하도록 발현된다. 이는 예를 들면, 이를 적절한 핵산 발현 벡터의 일부분으로서 축조하고 이를 투여하여, 예를 들면 결손된 또는 약화된 레트로바이러스 또는 기타 바이러스 벡터를 이용하여 감염시켜 세포내로 넣음으로써(참조, 예를 들면, 미국 특허 제 4,980,286 및 그 내부에 언급된 것들), 또는 naked DNA의 직접적 주입에 의해, 또는 미립자 충격의 사용 (예를 들면 유전자 총; Biolistic, Dupont), 또는 지방 또는 세포-표면 수용체 또는 형질감염 시약으로 코팅, 또는 리포좀, 미립자, 또는 마이크로캡슐 내 캡슐화에 의해, 또는 핵으로 진입하는 것으로 알려진 펩티드에 대해 연결되도록 투여함으로써, 수용체-매개된 엔도시토시스에 대해 리간드 개체와 연결되도록 투여함으로써(참조, 예를 들면, 미국 특허 5,166,320; 5,728,399; 5,874,297; 및 6,030,954, 이들은 모두 전체로서 본 명세서에 참고문헌으로서 포함되어 있다)(이는 수용체를 특이적으로 발현하는 세포 타입을 표적화하는데 사용될 수 있다), 등의 여러 공지된 방법에 의해 이루어 질 수 있다. 다른 구체예에서, 핵산-리간드 복합체는 리간드가 엔도좀을 교란하는 용해성 바이러스 펩티드를 포함하여, 핵산이 리소좀 분해를 회피하도록 하도록 형성될 수 있다. 또다른 구체예에서, 핵산은 특이적 수용체를 표적화함으로써 인 비보에서 세포 특이적 섭취 및 발현에 대해 표적화될 수 있다(참조, 예를 들면, PCT 공개공보 WO 92/06180 ; WO 92/22635; W092/20316 ; W093/14188 ; 및 WO 93/20221). 택일적으로, 핵산은 상동적 재조합에 의해 세포내로 도입되어 발현을 위한 숙주 세포 DNA 내로 함입될 수 있다(참조, 예를 들면, 미국 특허 5,413,923; 5,416,260; 및 5,574,205; 및 Zijlstra et al., 1989, Nature 342: 435-438).

특정 구체예에서, 변형자 핵산을 함유한 바이러스 벡터가 사용된다. 예를 들면, 레트로바이러스 벡터가 사용될 수 있다 (참조, 예를 들면, 미국 특허 5,219,740; 5,604,090; 및 5,834,182). 이들 레트로바이러스 벡터는 바이러스 게놈을 충전하고 숙주 세포 DNA 내로 함입하는데 필요하지 않은 레트로바이러스 서열을 삭제하도록 변형된다. 유전자 치료에서 사용된 변형자 핵산은 벡터 내로 클로닝되고, 이는 유전자가 환자로 송달되는 것을 촉진한다.

아데노바이러스는 유전자 치료에서 사용가능한 기타 바이러스 벡터이다. 아데노바이러스는 유전자를 호흡기 상피로 자연적으로 감염시키고 여기서 이들은 약한 질병을 유발한다. 아데노바이러스-기초 송달 시스템의 다른 표적은 간, 중추신경계, 상피 세포, 및 근육이다. 아데노바이러스는 비-분화 세포를 감염시킬 수 있는 장점을 갖는다. 아데노바이러스-기초 유전자 치료 수행 방법은 예를 들면, 미국 특허 5,824,544; 5,868,040; 5,871,722; 5,880,102; 5,882,877; 5,885,808; 5,932,210; 5,981,225; 5,994,106; 5,994,132; 5,994,134; 6,001,557; 및 6,033,8843에 기술되어 있고, 이들은 모두 전체로서 본 명세서에 참고문헌으로서 포함되어 있다.

아데노-관련 바이러스 (AAV)는 유전자 치료용으로 또한 제안되어 왔다. AAV의 생성 및 이용 방법은 예를 들면, 미국 특허 5,173,414; 5,252,479; 5,552,311; 5,658,785; 5,763,416; 5,773,289; 5,843,742; 5,869,040; 5,942,496; 및 5,948,675에 기술되어 있고, 이들은 모두 전체로서 본 명세서에 참고문헌으로서 포함되어 있다.

유전자 치료에 대한 또다른 접근법은 전기영동, 리포펙션(lipofection), 인산 칼슘 매개된 형질감염, 또는 바이러스 감염과 같은 방법에 의해 조직 배양 내에서 유전자를 세포로 전이시키는 것을 수반한다. 통상, 전이 방법은 세포에 대해 선택가능한 마커의 전이를 포함한다. 세포는 이후 형질전환 유전자를 취하여 이를 발현시킨 세포를 분리하도록 하는 선택 하에 놓이게 된다.

이 구체예에서, 핵산은 인 비보의 결과의 재조합 세포 내로 투여되기 이전에 세포 내로 도입된다. 그러한 도입은 형질감염, 전기영동, 마이크로주입, 핵산 서열을 함유하는 바이러스 또는 박테리오파지 벡터와 주입, 세포 융합, 염색체-매개된 세포 전이, 마이크로세포-매개된 유전자 전이, 등형질체(spheroplast) 융합, 등과 같은 업계에 공지된 어떠한 방법에 의해 수행될 수 있다. 외부 유전자를 세포 내로 도입하기 위한 다수의 기술이 업계에 공지되어 있고, 수혜자 세포의 필요한 발육 및 생리학적 기능이 교란되지 않는 한, 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 이 기술은 핵산의 세포로의 안정한 전이를 제공하여, 핵산이 세포에 의해 발현가능하고 바람직하게는 세포 자손에 의해 유전가능하고 발현가능하다.

결과의 재조합 세포는 업계에 공지된 다양한 방법에 의해 환자에 송달될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상피 세포는 피하로 주입될 수 있다. 또다른 구체예에서, 재조합 피부 세포는 환자에 대해 피부 이식으로서 적용될 수 있다. 재조합 혈액 세포(예를 들면, 조혈작용 줄기 또는 선조 세포)는 바람직하게는 정맥내로 투여된다. 예상되는 사용양은 원하는 효과, 환자 상태 등에 따르고 당업자에 의해 결정될 수 있다.

핵산이 유전자 치료 목적으로 도입될 수 있는 세포는 어떠한 바람직한, 사용가능한 세포 타입을 포함하고, 상피 세포, 내피 세포, 케라틴세포, 섬유아세포, 근육 세포, 간세포; T 림프구, B 림프구, 단구, 대식세포, 호중구, 호산구, 거핵세포, 과립세포와 같은 혈액 세포; 다양한 줄기 또는 선조 세포, 특히 조혈 줄기 또는 선조 세포, 예를 들면, 골수, 탯줄 혈액, 말초 혈액, 태아 간, 등으로부터 얻어진 것을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직한 구체예에서, 유전자 치료에 사용되는 세포는 환자 자신의 것이다.

재조합 세포가 유전자 치료에 사용된 구체예에서, 변형자 핵산은 세포 내로 도입되어 세포 또 그 자손에 의해 발현가능하고, 재조합 세포는 이후 인 비보에서 치료적 효과를 위해 투여된다. 특정 구체예에서, 줄기 또는 선조 세포가 사용된다. 인 비트로에서 분리되어 보존될 수 있는 어떠한 줄기 및/또는 선조 세포가 본 발명에 따른 구체예에서 사용될 수 있다. 그러한 줄기 세포는 조혈작용 줄기 세포(HSC), 피부 및 장관 겉면과 같은 상피 조직의 줄기 세포, 배 심장 근육 세포, 간 줄기 세포 (참조, 예를 들면, WO 94/08598), 및 신경 줄기 세포 (Stemple and Anderson, 1992, Cell 71: 973-985)를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.

상피 줄기 세포(ESC) 또는 케라틴세포는 피부 또는 장관 겉면과 같은 조직으로부터 공지의 절차에 따라 얻어질 수 있다(Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio.21A: 229). 피부와 같은 계층화된 상피 조직에서, 재생은 기저층과 가장 가까운 층은, 초기 층 내에서 줄기 세포의 유사 분열에 의해 일어난다. 장관 겉면 내의 줄기 세포는 이 조직의 빠른 재생 속도를 제공한다. 환자 또는 기증자의 피부 또는 장관 겉면으로부터 얻어진 ESC 또는 케라틴세포는 조직 배양 내에서 성장가능하다(Pittelkow and Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61: 771). ESC가 기증자에 의해 제공되면, 숙주 대 이식 반응성을 억제하기 위한 방법(예를 들면, 조사, 적당한 면역억제를 촉진하기 위한 약물 또는 항체 투여)이 제공될 수 있다.

조혈 줄기 세포(HSC)에 대해, HSC의 분리, 증식, 및 인 비트로에서의 유지를 위한 어떠한 기술이 본 발명의 이 구체예에서 사용될 수 있다. 이에 의해 이루어질 수 있는 기술은 장래의 숙주 또는 기증자로부터 분리된 골수 세포로부터의 HSC 배양물의 분리 및 확립, 또는 동종 또는 이종유래의 이전에 확립된 장시간 HSC 배양물의 사용을 포함한다. 비-자가 HSC는 장래 숙주/환자의 이식 면역 반응 억제 방법과 함께 바람직하게는 사용된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 인간 골수 세포는 침흡인에 의해 후장골능으로부터 얻어질 수 있다(참조, 예를 들면, Kodo et al., 1984, J. Clin. Invest. 73: 1377-1384). 본 발명의 바람직한 구체예에서, HSC는 고도로 농축되거나 실질적으로 순수한 형태로 만들어질 수 있다. 이 농축은 장시간 배양 이전, 도중, 또는 이후 이루어질 수 있고, 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다. 골수 세포의 장시간 배양은 예를 들면 변형된 Dexter 세포 배양 기술(Dexter et al., 1977, J. Cell Physiol. 91: 335) 또는 Witlock-Witte 배양 기술 (Witlock and Witte, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 3608-3612)을 사용하여 이루어지고 유지될 수 있다 .

특이적 구체예에서, 유전자 치료를 위해 도입되는 핵산은 코딩 영역에 기능적으로 연결된 유도가능한 프로모터를 포함하여, 핵산의 발현이 적절한 전사 유도자의 존재 또는 부존재의 제어에 의해 제어가능하다.

본 발명의 또다른 구체예는 AD를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 APP 경로의 비정상과 관련된 이상의 치료를 위한 정제된 항체 또는 그의 단편의 치료적 사용에 관한 것이다. 상기 정제된 항체 또는 그의 단편은 표 1에서 확인된 유전적 변형자의 인간 상동체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 바람직하게는 본 명세서에서 개시된 염색체 10 상에 위치한 인간 상동체의 폴리펩티드, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 또는 SEQ ID NO 53,즉 큐레이트된 noc A 서열에 의해 엔코드된 폴리펩티드 또는 그 폴리펩티드의 단편에 특이적으로 결합한다. 바람직한 구체예는 그러한 항체의 단편에 관한 것인데, 이 단편은 Fab 또는 F (ab')₂단편이다. 특히, 항체는 폴리클론 항체 또는 모노클론 항체이다.

본 명세서에 하나 이상의 서로 다르게 발현된 유전자 에피토프를 특이적으로 인식할 수 있는 항체의 제조 방법이 기술된다. 이 항체는, 모노클론항체(mAbs), 인간화된 또는 키메라 항체, 단쇄 항체, Fab 단편, F (ab')₂단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 이디오타입(anti-Id) 항체, 및 상기의 어느 것의 에피토프-결합 단편을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 그러한 항체는 예를 들면, 지문 표적의 검출, 생물학적 샘플 내의 유전자, 또는 택일적으로 비정상 표적 유전자 활성의 저해 방법으로서 사용될 수 있다. 그러므로, 그러한 항체는 알츠하이머병 치료의 일부로서 이용되거나, 및/또는 진단 기술의 일부로서 사용되어 환자는 변형자 폴리펩티드의 비정상 수준, 또는, 변형자 폴리펩티드의 비정상 형태의 존재에 대해 검사될 수 있다.

특이적 변형자 폴리펩티드에 대한 항체 생산을 위해, 다양한 숙주 동물이 이 폴리펩티드 또는 그 일부를 주입함에 의해 면역화된다. 그러한 숙주 동물은 토끼, 마우스, 래트 등을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 다양한 보조제가 숙주 종에 따라 면역 반응을 증가시키기 우해 사용될 수 있는데, Freund's (완전 및 불완전), 수산화 알루미늄과 같은 미네랄 겔, 리소레시틴 같은 계면활성 물질, 플루로닐 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, KLH(keyhole limpet hemocyanin), 디니트로페놀 및 BCG (bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum) 같은 잠재적으로 유용한 인간 보조제를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.

폴리클론 항체는 표적 유전자 산물 또는 그의 항원 기능성 유도체와 같은 항원으로 면역화된 동물의 혈청으로부터 유래한 항원 분자의 이종 집단이다. 폴리클론 항체의 생산을 위해, 상기에서 기술된 숙주 동물은 변형자 폴리펩티드, 또는 그의 일부를 주사하여 면역화되고 또한 상기에서 기술된 보조제로 보충된다.

단클론 항체는, 특정 항원에 대한 항체의 동종 집단인데, 배양물에서의 연속 세포주에 의해 항체 분자의 생산을 위한 방법에 의해 얻어진다. 이들은 Kohler 및 Milstein의 하이브리도마 기술 (1975, Nature 256: 495-497; 및 미국 특허 제 4,376,110), 인간 B-세포 하이브리도마 기술 (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4 : 72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030), 및 EBV-하이브리도마 기술 (Cole et al., 1985, 모노클론 Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 그러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 및 이들의 하위군을 포함하는 이뮤노글로불린 군일 수 있다. 본발명의 mAb를 생성하는 하이브리도마는 인 비트로 또는 인 비보로 배양될 수 있다. 인 비보에서의 mAbs 고 적정 생산은 현재의 가장 바람직한 생산방법이다.

부가적으로, 적절한 항원 특이성의 마우스 항체 분자로부터의 유전자를 적절한 생물학적 활성의 인간 항체로부터의 유전자와 함께 스플라이싱함으로써 "키메라 항체"의 생산을 위해 개발된 기술 (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851-6855 ; Neuberger et al., 1984, Nature, 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452-454)이 사용될 수 있다. 키메라 항체는, 뮤린 nAb 및 인간 이뮤노글로불린 불변 영역으로부터 유래한 가변 또는 초가변 영역을 갖는 것과 같이, 서로 다른 부분이 서로 다른 동물 종으로부터 유래한 분자이다.

택일적으로 단일 사슬 항체의 생성을 위해 기술된 기술(미국 특허 제 4,946,778 호; Bird, 1988, Science 242: 423-426; Huston et al., 1988, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; 및 Ward et al., 1989, Nature 334: 544-546)은 서로 다르게 발현된 유전자-단일 사슬 항체를 생산하는데 적용될 수 있다. 단일 사슬 항체는 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 단편을 아미노산 가교를 통해 연결함으로써 형성되어, 단쇄 폴리펩티드를 유도한다.

가장 바람직하게는, "인간화된 항체"의 생산을 위해 유용한 기술이, 본 명세서에 개시된 폴리펩티드, 단편, 유도체, 및 기능적 동등물을 생산하는데 적용될 수 있다. 그러한 기술은 미국 특허 제 5,932,448; 5,693,762; 5,693,761;5,585,089; 5,530,101; 5,910,771; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,545,580; 5,661,016; 및 5,770,429호에 기재되어 있고, 이들은 모두 전체로서 본 명세서에 참고문헌으로서 포함되어 있다.

특이적 에피토프를 인식하는 항체 단편은 공지된 기술에 의해 발생될 수 있다. 예를 들면, 그러한 단편은 비제한적으로 다음을 포함한다: 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생산가능한 F (ab')₂단편 및 F (ab')₂단편의 디설파이드 가교를 환원시켜 생성될 수 있는 Fab 단편. 택일적으로, Fab 발현 라이브러리가 축조되어 (Huse et al., 1989, Science, 246: 1275-1281) 원하는 특이성으로 단클론 Fab 단편을 빠르고 쉽게 인식할 수 있다.

본 발명의 항체는 바람직하게는 개체 내의 비정상 APP 경로 조절 및/또는 알츠하이머병과 관련된 이상을 진단하는 방법, 또는 상기 이상에 대한 경향을 갖는 개체를 인식하는데 사용될 수 있고, 다음을 포함한다: 표 1에서 확인된 유전적 변형자의 인간 호몰로그 중의 어느 아미노산 서열, 바람직하게는 본 명세서에서 개시된 염색체 10 상에 위치한 인간 호몰로그의 폴리펩티드, 가장 바람직하게는, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 또는 SEQ ID NO 53, 즉 큐레이트된 noc A 서열에 의해 엔코드된 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드, 또는 그의 단편의 양을, 개체로부터의 적절한 조직 또는 세포 내에서 측정하여 대조 개체로부터의 각각의 조직 내의 상기 폴리펩티드 또는 단편에 상대적인 상기 폴리펩티드 또는 그의 단백의 상승된양의 존재가 상기 이상을 진단하는 단계. 그러한 방법은 본 발명의 또다른 구체예를 형성한다. 바람직하게는, 상기 검출 단계는 상기 적절한 조직 또는 세포를 상기에서 논의한 폴리펩티드 또는 그의 단편과 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키고 상기 적절한 조직 또는 세포 내에서 폴리펩티드와 특이적 결합 하는 상기 항체를 검출하는 단계를 포함하고, 여기서 폴리펩티드에 대한 특이적 결합의 검출은 하나 이상의 상기 폴리펩티드 또는 그의 단편의 존재를 나타낸다.

검출의 용이성을 위해 특히 바람직한 것은 샌드위치 어세이인데, 그 변형법이 다수 존재하고, 이들 모두는 본 발명의 범위에 포함된다.

예를 들면, 대표적인 포워드 어세이에서, 비표지된 항체는 고체 기질 상에 고정되고 시험될 샘플은 결합된 분자와 접촉하게 된다. 적절한 인큐베이션 기간 후, 충분한 시간 후 항체-항원 2원 복합체를 형성한다. 이 이점에서, 제 2의 항체는, 검출가능한 신호를 유도할 수 있는 리포터 분자로 표지되어 이후 부가되고 충분 시간동안 인큐베이션되어, 항체-항원 표지된 항체의 3원 복합체를 형성한다. 비반응된 물질은 세척되어 제거되고, 항원의 존재는 신호의 관찰에 의해 결정되거나, 또는 공지량의 항원을 함유한 대조 샘플과의 비교에 의해 정량될 수 있다. 포워드 어세이의 변형법은, 샘플 및 항체가 결합된 항체에 동시에 부가되는 동시 어세이, 또는 표지된 항체 및 테스트될 샘플이 일반 조합되고, 인큐베이션되고 비표지된 표면 결합된 항체에 부가되는 리버스 어세이를 포함한다. 이들 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 약간의 변형법의 가능성은 명백한다. 본 명세서에서, "샌드위치 어세이"는 기본적인 2-부위 기술에 대한 모든 변형법을 포함하는 의도이다. 본 발명의 면역어세이에 대해, 유일한 제한 인자는 표지된 항체가 변형자 폴리펩티드 또는 그의 단편에 대해 특이적인 항체라는 점이다.

이런 유형의 어세이에서 가장 통상적으로 사용되는 리포터 분자는 효소, 플루오로포어- 또는 라디오누클리드-함유 분자이다. 효소 면역어세이의 경우 효소가 보통 글루타르알데히드 또는 페리오데이트에 의해, 제 2 항체에 컨쥬게이트된다. 그렇지만, 쉽게 인지될 수 있는 바와 같이, 다양한 결찰 기술이 존재하고, 이는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 통상적으로 사용되는 효소는 서양 고추냉이 퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제, β-갈락토시다제 및 알칼리 포스파타제이다. 특이적 효소와 함께 사용되는 기질은 검출가능한 색변화의, 상응하는 효소에 의한 가수분해에 의해, 생산용으로 일반적으로 선택된다. 예를 들면, p-니트로페닐 포스페이트가 알칼리 포스파타제 컨쥬게이트와 함께 사용되기에 적합하고; 퍼옥시다제 컨쥬게이트를 위해서는, 1,2-페닐렌디아민 또는 톨루이딘이 통상 사용된다. 형광발생 기질을 사용가능 것도 가능한데, 이는 상기에서 언급된 발색성 기질보다는 형광 생성물을 형성한다. 적절한 기질을 함유하는 용액은 이후 3차 복합체에 부가된다. 제 2 항체에 연결되는 효소와 반응하는 기질은, 정성적 시각 신호를 보내고, 이는 통상 분광광도계적으로 추가로 정량되어, 혈청 샘플 내에 존재하는 변형자 단백질의 양에 대한 평가를 제공한다.

택일적으로, 형광 및 로다민과 같은 형광 화합물은 결합 능력에 대한 변화 없이 항체에 화학적으로 커플링될 수 있다. 특정 파장의 빛을 조사하여 활성화되면, 형광-표지된 항체는 빛 에너지를 흡수하여, 분자 내의 여기 상태를 유도하고,특징적인 더 긴 파장에서 빛을 방출한다. 방출은 광 현미경으로 시각적으로 검출가능한 특징적인 색으로서 나타낸다. 면역형광 및 EIA 기술은 본 기술에서 매우 잘 정립되어 있고 본 방법에 대해 특히 바람직하다. 그렇지만, 방사성동위원소와 같은 다른 리포터 분자는, 화학발광 또는 생물발광 분자도 또한 사용될 수 있다. 당업자에게는 필요한 용도에 맞게 절차를 어떻게 변형시키는지가 명백하다.

본 발명의 방법에 따라서 확인된 유전적 변형자의 인간 호몰로그를 엔코드하는 폴리누클레이티드는, 비제한적으로 알츠하이머병을 포함하는 APP 경로의 조절 결핍과 관련된 이상을 진단하거나, 또는 그러한 이상에 대한 유전적 경향을 갖는 개인을 확인하는 방법에서 사용된다. 예를 들면, 상기 방법은 인간으로부터의 적절한 조직 또는 세포 내의 본 명세서에서 개시된 유전적 변형자의 인간 호몰로그를 엔코드하는 유전자로부터 전사된 mRNA의 전사 수준을 검출하는 것을 포함하는데, 여기서 대조 수준과 비교되는 비정상 전사는 상기 이상 또는 상기 이상에 대한 경향에 대한 진단이다. 특히, 상기 유전적 변형자는 표 1에서 확인된 유전적 변형자의 인간 상동체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 바람직하게는 본 명세서에서 개시된 염색체 10 상에 위치한 인간 상동체의 폴리펩티드, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 또는 SEQ ID NO 53, 즉 큐레이트된 noc A 서열, 또는 SEQ ID NO: 35에 의해 엔코드된 폴리펩티드, 즉 EGR2 서열, 또는 SEQ ID NO: 41, 또는 SEQ ID NO: 43에 의해 엔코드된 폴리펩티드, 안키린-관련된 서열에 의해 엔코드된 폴리펩티드를 포함한다.

기능장애와 관련된 본 발명의 방법에 따라 확인된 유전적 변형자를 엔코드하는 유전자의 돌연변이 형태의 검출은 질병의 진단 또는 질병에 대한 감염가능성을 부가 또는 정의하는 진단 수단을 제공하고, 이는 유전자의 저-발현, 과다-발현 또는 변형된 분리된 또는 일시적 발현을 유도한다. 상기 질병은 APP 경로의 조절 내 에러에 의해 특성화되는 알츠하이머병 또는 기타 이상을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 유전자에서의 돌변변이를 가진 개인은 다양한 기술에 의해 DNA 수준에서 검출될 수 있다.

핵산, 특히 mRNA는 진단용으로, 혈액, 뇨, 침, 조직검사 또는 검시용 물질과 같은 개체의 세포로부터 얻어질 수 있다. 게놈 DNA는 분석이전에 PCR 또는 기타 증폭 기술에 의해 효소적으로 증폭될 수 있다. RNA 또는 cDNA는 동일한 방법으로 사용될 수 있다. 결실 또는 삽입은 정상 유전자형과 대조되는 증폭된 생성물의 크기에서의 변화에 대해 검출될 수 있다. 증폭된 DNA를 본 발명의 유전적 변형자 폴리펩티드의 인간 호몰로그를 엔코드하는 표지된 누클레오티드 서열에 대한 혼성화하는 것은 점 돌연변이를 확인할 수 있다. DNA 서열 차이는 변성화제와 함께 또는 없이, 직접적 DNA 서열화에 의해(예를 들면, Myers et al., Science (1985) 230: 1242), 겔 내의 DNA 단편의 전기영동적 이동에서의 변화에 의해서도 검출될 수 있다. 특이적 위치에서의 서열 변화는 또한 RN에이즈 또는 S1 보호 또는 화학 절단 방법(참조, Cotton et al., Proc Natl Acad Sci USA (1985) 85: 4397-4401)에 의해 밝혀질 수 있다. 다른 구체예에서 본 발명의 유전적 변형자 폴리펩티드를 엔코드하는 누클레오티드 서열 또는 그러한 누클레오티드 서열의 단편은 예를 들면,유전적 돌연변이의 유효한 선별을 수행하여 축조될 수 있다. 어레이 기술 방법은 널리공지되어 있고 일반적으로 응용되고 있고 유전자 발현, 유전적 연결, 및 유전적 다양성을 포함하는 분자 유전학에서의 다양한 문제를 다루는데 사용될 수 있다(참조, 예를 들면: M. Chee et al., Science, Vol 274, pp 610-613 (1996)).

상기 진단 어세이는 전술된 방법에 의해 변형자 유전자의 인간 호몰로그에서의 돌연변이 검출을 통해 질병을 진단하거나 또는 질병에 대한 민감성을 결정하기 위한 방법을 제공한다. 부가적으로, 그러한 질병은 개체로부터 유래한 샘플로부터 폴리펩티드 또는 mRNA의 비정상적인 감소 또는 증가 수준을 결정하는 것을 포함하는 방법에 의해 진단될 수 있다. 감소되거나 증가된 발현은 폴리누클레오티드의 정량을 위해 업계에 널리 공지된 방법, 예를 들면, 핵산 증폭, 예를 들면PCR, RT-PCR, RN에이즈 보호, 노던 블롯팅 및 기타 혼성화 방법을 사용하여 RNA 수준에서 측정될 수 있다. 숙주로부터 유래한 샘플 내에서, 본 발명의 폴리펩티드와 같은 단백질 수준을 결정하는데 사용될 수 있는 어세이 기술은 이 업계의 숙련자에게 널리 공지되어 있다. 그러한 어세이 방법은 방사면역어세이, 경쟁적-결합 어세이, 웨스턴 블롯 분석 및 ELISA 어세이를 포함한다.

그러한 혼성화 조건은 상기에서 기술된 바와 같이, 고도로 엄격하거나 고도보다는 덜 엄격할 수 있다. 예를 들면, 핵산 분자가 데옥시올리고누클레오티드("올리고")인 경우, 고도로 엄격한 조건은 6X SSC/0. 05% 소듐 피로포스페이트 내에서 37 ℃ (14-염기 올리고들에 대해), 48 ℃ ( 17염기 올리고들에 대해), 55 ℃ ( 20-염기 올리고들에 대해), 및 60 ℃ (23-염기 올리고들에 대해)에서 세척하는 것이다. 다양한 조성의 핵산에 대한 그러한 엄격 조건의 적절한 범위는 상기한Maniatis et al.에 부가하여 Krause and Aaronson (1991), Methods in Enzymology, 200: 546-556에 기술되어 있다.

그러므로 다른 면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 진단용 키트에 관한 것이다:

(a) 본 발명에 따른 방법에 의해 확인된 유전자 변형자의 인간 호몰로그의 폴리누클레오티드, 바람직하게는 본 명세서에 개시된 염색체 10 상에 위치한 인간 호몰로그의 폴리펩티드 또는 그의 단편,

(b) 상기 (a)에 대해 상보적인 누클레오티드 서열;

본 발명의 유전적 변형자 폴리펩티드, 바람직하게는 표 1에서 확인된 유전적 변형자의 인간 호몰로그의 폴리펩티드, 바람직하게는 본 명세서에 개시된 염색체 10 상에 위치한 인간 호몰로그의 폴리펩티드 또는 그의 단편; 또는

(d) 본 발명의 유전적 변형자 폴리펩티드에 대한 항체, 바람직하게는 표 1에서 확인된 유전적 변형자의 인간 호몰로그의 폴리펩티드, 바람직하게는 본 명세서에 개시된 염색체 10 상에 위치한 인간 호몰로그의 폴리펩티드 또는 그의 단편의 항체.

이러한 키트 내에 (a), (b), (c) 또는 (d)는 상당한 성분을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 그러한 키트는 하나 이상의 상기 인간 호몰로그에 대한 성분을 포함할 수 있음을 이해해야 한다. 그러한 키트는 질병, 특히 알츠하이머병을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 APP 경로의 이상에서의 에러와 관련된 질병 또는 이상, 또는 이 질병에 대한 감수성에 대한 진단에 유용하다.

본 발명의 유전적 변형자의 인간 호몰로그의 누클레티드 서열이 유전적 연결 분석에도 유용할 수 있다. 완전 인간 게놈 서열은 공지되어 있기 때문에, 대상 누클레오티드 서열은 개별 인간 염색체 상의 특정 위치에 대해 특히 지도화될 수 있다. 본 발명에 따른 염색체에 대한 관련 서열의 지도화는 질병과 유전자를 연관시키는데 중요한 첫 번째 단계이다. 서열이 정확한 염색체 위치에 대해 일단 지도화되면, 염색체 상의 서열에 대한 물리적 위치는 유전자 지도 데이터와 연관시킬 수 있다. 그러한 데이터는 예를 들면, V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (available on-라인 through Johns Hopkins University Welch Medical Library)에 존재한다. 동일한 염색체 영역에 대해 지도화된 유전자 및 질병사이의 관계는 이후 연결 분석(물리적으로 인접한 유전자의 공동상속)을 통해 확인된다. 최근의 데이터는 알츠하이머병에 대해 연결된 인간 염색체 10 상의 영역이 있고(Bertram et al., Ertekin-Taner et al., Myers et al., Science 290,2302-2305, 2000), 그리하여, 본 발명의 방법에 따라 확인된 유전적 변형자의 인간 호몰로그는 통상의 기술을 사용하여 염색체 지도화 분석시킬 수 있음을 나타낸다.

본 발명은 분리된 핵산 분자, 바람직하게는 DNA 분자를 포함하고, 여기서 핵산 분자는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO : 17 또는 SEQ ID NO 53에서 규정된 인간 nocA 호몰로그의 큐레이트된 서열이다. 유사하게, 바람직한 것은 SEQ ID N0 : 41, 또는 SEQ ID NO: 43에 규정된 안키린-반족 단백질의 서열에 의해 엔코드된 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 엔코드하는 분리된 핵산 분자, 바람직하게는 DNA 분자이다.

통상의 기술을 사용하여, 유전적 변형자의 적절한 누클레오티드 서열에 관한 안티센스 분자, 이중 가닥 RNA, 삼중 나선 DNA 및 리보자임이 생성될 수 있다. 유전적 발현의 변형은 표 1에서 나열된 유전자의 제어 영역, 예를 들면 프로모터, 인헨서, 및 인트론에 대한 안티센스 분자, DNA, 또는 RNA를 설계하여 얻어질 수 있다. 전사 개시 부위로부터 유래한 올리고누클레오티드, 예를 들면 전사 시작 부위로부터 -10 및 +10 사이의 위치가 바람직하다. 유사하게, 저해는 "삼중 나선" 염기-짝짓기 기술을 사용하여 이루어질 수 있다. 삼중 나선 짝짓기가 유용한데 왜냐하면 이는 폴리머라제, 전사 인자, 또는 조절 분자의 결합에 대해 충분히 개방하는 이중 나선의 능력을 저해하기 때문이다. 삼중 DNA를 사용한 최근의 치료적 발전은 문헌에 기술되어 있다(Gee, J. E. et al. (1994) In : Huber, B. E. and B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco,N. Y.). 안티센스 분자는 전사물이 리보솜에 대해 결합하는 것을 방해함으로써 mRNA의 번역을 봉쇄하도록 설계될 수도 있다.

리보자임, 효소적 RNA 분자는 RNA의 특이적 절단을 촉매화하는데 사용될 수 있다. 리보자임 작용에 대한 매카니즘은 상보적 표적 RNA에 대한 리보자임 분자의 서열-특이적 혼성화 및, 연이어 엔도누클레오시스적 절단를 수반한다. 사용될 수 있는 예는 표 1의 유전자 산물을 엔코드하는 서열의 엔도누클레오시스적 절단을 특이적 및 효율적으로 촉매화할 수 있는 설계된 해머헤드 모티프 분자를 포함한다.

어떠한 잠재적 RNA 표적 내의 특이적 리보자임 절단 부위는 다음 서열: GUA, GUU 및 GUC를 포함하는 리보자임 절단 부위에 대한 표적 분자를 스캐닝함으로써 초기에 확인된다. 일단 확인되면, 절단 부위를 함유하는 표적 유전자의 영역에 상응하는 15 및 20 리보누클레오티드 사이의 짧은 RNA 서열은 올리고누클레오티드를 작동불가능하게 하는 2차 구조적 특징에 대해 평가될 수 있다. 후보 표적에 대한 적합성은 리보누클레아제 보호 어세이를 사용하여 상보적 올리고누클레오티드와의 혼성화 용이성을 시험하여 또한 평가될 수 있다.

본 발명의 안티센스 분자 및 리보자임은 핵산 분자의 합성에 대해 업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들은 고상 포스포르아미디트 화학 합성과 같은 화학적으로 올리고누클레오티드를 합성하는 기술을 포함한다. 택일적으로, RNA 분자는 표 1의 유전자를 엔코드하는 DNA 서열의 인 비트로 및 인 비보 전사에 의해 발생될 수 있다. 그러한 DNA 서열은 T7 또는 SP6같은 적절한 RNA 폴리머라제 프로모터로 다양한 범위의 벡터 내로 함입될 수 있다. 택일적으로, 안티센스 RNA를 구조적으로 또는 유도적으로 합성하는 이들 cDNA 구성체는 세포계, 세포 또는 조직 내로 도입될 수 있다.

벡터는 많은 사용가능한 수단에 의해 세포 또는 조직 내로 도입될 수 있고, 인 비보, 인 비트로 또는 엑스 비보에서 사용될 수 있다. 엑스 비보 치료를 위해, 벡터는 환자로부터 얻은 줄기 세포 내로 도입되어 동일한 환자 내로 다시 자가 이식을 위해 클론적으로 증식된다. 형질감염 및 리포좀 주사에 의한 전달은 업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 이루어질 수 있다.

유전자 발현의 유전자 특이적 저해는 통상의 이중 가닥 RNA 기술을 사용하여서도 이루어질 수 있다. 그러한 기술에 대한 설명은 WO 99/32619에서 찾을 수 있고, 이는 전체로서 참고문헌으로서 포함되어 있다.

또한, 그러한 분자는 진단 방법 및 키드의 성분으로서 사용될 수 있고 이에 의해 APP 경로에서의 비정상 및/또는 알츠하이머병과 관련된 질병을 야기시키는 대립 유전자의 존재가 검출될 수 있다.

본발명의 기타 목적, 특징, 장점 및 양상은 다음의 기술로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 그렇지만, 다음 기술 및 특정 실시예는, 본 발명의 바람직한 구체예를 나타내지만, 단지 예시를 위해 주어졌다. 개시된 발명의 사상 및 범위 내의 다양한 변경 및 변형은 다음의 기술을 읽고 본 개시물의 다른 부분을 읽음으로서 당업자에게 쉽게 명백해진다.

다음 절차는 실시예를 수행하는데 행해진다.

형질전환 파리들

형질전환 노랑 초파리를 형성시키는 방법은 당업계의 숙련자에게 널리 공지되어있다. 어떠한 통상의 방법이 사용될 수 있는데, 예를 들면 본 발명의 파리의 생성에 수반되는 기본적인 실험실 기술은 상기한 Spradling에 기술되어 있다. 예를 들면, 형질전환된 변종은 통상의 방법에 따라서 상기에서 논의된 구성체를 사용하여 발생될 수 있다. 몇몇 독립적인 삽입물이 구성체, UAS-A베타40, UASA베타42, UAS-C99wt, UAS-C99V717I (London 돌연변이) 및 pGMR-A베타42에 대해 얻어질 수 있다.

파리 원재료

본 발명의 형질전환 파리에서의 형질전환 유전자의 발현을 구동시키는데 사용될 수 있는 Gal4 라인은 apterous-Gal4 및 7B-Gal4를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 언급된 Gla4 라인에 대한 기술 및 특정 발현 패턴에 대한 노트는 Flybase (http : //flybase.bio. indiana. edu)에서 찾을 수 있다. 가정에서 발생되는 새로운 형질전환 변종은 UAS A베타₄₀및 A베타₄₂, UAS C99 야생형 및 UAS C99 London (London FAD 알츠하이머-관련 돌연변이를 운반하는) 및 GMR A베타₄₂형질전환유전자를 운반하는 변종을 포함한다.

yw ; BcElp/CyOHop변종, 트랜스포사제를 발현함, 변종yw; Gla/SM6a및yw ; Dr/TM3 Sb Ser은 R. Padgett, Waksman Institute, Rutgers University로부터 얻어진다.w ¹¹¹⁸ 파리 및GMR-GAL4파리는 Bloomington 원재료 센터로부터 얻어졌다.pGMR-1변종은 공개적으로 이용가능한 원재료이고 UC Berkeley의 G.Rubin 실험실로부터 얻어졌다.

DNA 구성체 및 분자적 기술

Aβ 42 펩티드를 암호화하고 인간 프리-포로엔케팔린 신호 펩티드에 대해 융합하는 DNA 단편은 PCR 증폭되어 초파리 눈-특이적 P 요소 형질전환 벡터, pGMR (Hay et al., 1994 Development 120: 2121-2129)의 Bgl II 부위 내로 클로닝되고 삽입물은 자동화된 형광 서열화(ACGT Inc.)에 의해 서열화된다. 인간 프리-프로엔케팔린 신호 펩티드는 형질감염된 포유 세포로부터 Aβ 42의 분비를 성공적으로 구동하는 것으로 나타났다. GMR은rhodopsin-1 유전자 프로모터, 눈-특이적 전사 인자 GLASS (Ellis et al., Development 119 (3): 855-65 (1993)로부터 유래한 반응 요소의 5 개 직렬적 복사물로 구성된다. 그러므로, A베타 발현은 눈에서 GLASS 전사적 활성자의 패턴으로 구동된다. 상기 DNA 단편은 형질전환유전자의 초파리 게놈 내로의 삽입을 촉진하는 벡터를 함유한 P-요소 내로 순차적으로 클로닝된다. 모든 분자적 조작은 표준 프로토콜에 따라 수행된다(참조, 예를 들면, Sambrook, Fritsch and Maniatis,"Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

C99 펩티드를 암호화하고 인간 프리-프로엔케팔린 신호 펩티드에 융합하는 DNA 단편은 PCR 증폭되고 Brand 및 Perimmon에서 기술된 바와 같은 pUAST 형질전환 벡터 내로 클로닝된다.

구성체 UAS-A베타40, UAS-A베타42, UAS-C99wt 및 UAS-C99V7171는 프리-프로엔케팔린 유전자 신호 펩티드를, 연이어서 인간 A베타 (40 또는 42) 또는 C99 (야생형 또는 London 돌연변이를 갖는)를 함유한다. 인간 단편은 상기 Brand 및 Perrimon 에 개시된 pUAST 벡터 내로 클로닝된다. 이 벡터 내로의 클로닝은 UAS 서열을 삽입된 유전자의 전사영역의 업스트림으로 위치시키고 파리 게놈이 P-요소 재조합 내로 일체화되는 것을 또한 허용한다.

유전자적 교배, 분석 및 표현형의 가시화

파리는 모든 교배가 표현형의 최대 발현을 위해 29 ℃에서 보존된다는 것을 제외하고는 통상의 방법에 따라서 교배되었다. 이원 Gal4 발현 시스템에서, 이 온도는 Gal4 단백질의 활성을 최대화한다. pGMR- A베타42의 경우, 표현형이 29 ℃에서 강해지고, 따라서 이들 파리는 또한 이 온도에서 보존되는 것이 관찰된다.

웨스턴 분석

전위 유전자 발현은 통상의 방법에 따라 웨스턴 분석을 수행함으로써 어세이될 수 있다. 사용될 수 있는 항체는 APP 유전자 베타아밀로이드 부분에 대해 제기되고 APP의 C99 부분(Senetek PLC, Napa, CA)을 인식할 수도 있는 인간 6E10 모노클론 항체를 포함한다.

웨스턴 프로토콜

Aβ 42 펩티드의 발현을 검출하기 위해, 파리의 유전자형 K18. 1/K18. 1, K18. 3/K18. 3, K18. 1/K18. 1 ; K18. 3/K18. 3, KJ103/TM3Sb Ser, KJ103/KJ103, KJ54/CyO ; KJ54/TM2 Ubx 및 pGMR-1 (삽입 없이 pGMR 벡터를 운반하는 파리)이 29 ℃에서 재배되었다. 상기 변종 각각으로부터의 80-90 초파리 머리를 모으고, 100 ul의 2% SDS, 30% 수크로스, 0.718 M Bistris, 0.318 M 및 Bicine를 함유한 건조 얼음 상의 에펜도르프 튜브 내에, "완전" 프로티아제 저해제(Boehringer Mannheim)와 함께 넣고 기계적 균질화기를 이용하여 분쇄시킨다. 샘플은 95 ℃에서 5분간 가열시키고, 12,000 rpm에서 5분간 회전시키고, 상청액을 신선한 에펜도르프 튜브 내로 옮긴다. 5% β-머캅토에탄올 및 0.01 % 브롬페놀 블루를 부가시키고 샘플을 로딩 전에 끓였다. 대략 200 ng의 총단백 추출물을, 8M 우레아를 함유한 15% Tricine/Tris SDS PAGE 겔상에서, 각 샘플에 대해 로딩된다. Aβ 1-42 펩티드 대조구는 인간 β-아밀로이드 [1-42] (BIOSOURCE International, #; 03111)이다. 샘플은 스태킹 겔에서는 40V에서, 분리 겔에서는 120V에서 운영된다. 샘플은 15간 동안 100V에서 PVDF 막 (BIO-RAD, # 162-0174) 으로 옮기고, 막은 PBS 내에서 3분 동안 계속하여 끓인다. 항체 혼성화는 다음과 같다: 일차 Ab 6E10 (SENETECK PLC, #; 300-02)는, Aβ 펩티드의 처음 19개 아미노산을 인식하는데, 실온에서 90분간, 5% 비-지방 우유, 0.1% Tween 20을 함유한 1X PBS 에서 프로빙(1:2000의 농도에서)하는데 사용된다. 샘플은 5분, 15분 및 15분에서 각각 1X PBS-0.1% Tween-20 내에서 3번 세척한다. 2차 Ab는 항-마우스-HRP (Amersham Pharmacia Biotech, #; NA 931)이고 1: 2000에서 5% 비-지방 우유,0.1 % Tween 20을 함유한 1X PBS 내에서 90분간 실온에서 사용된다. 샘플은 5분, 15분 및 15분에서 각각 1X PBS-0.1% Tween-20 내에서 3번 세척한다. ECL (ECL Western Blotting Detection Reagents, Amersham Pharmacia Biotech, #; RPN 2209)이 검출용으로 사용된다.

조직학

파리 머리에 대한 외과 절개가 통상의 방법, 예를 들면, Drosophila Protocols, page 236 Eds. W. Sullivan, M. Ashburner, S. Hawley, CSHL Press 2000 에 기술된 프로토콜에 따라 수행된다.

동결 절개

성인 눈을 Wolff에 의한 Drosophila Protocols, CSHL Press, 2000, sections 13.1 및 13.2에 따라서 동결 절개시킨다. 일차 항체는 모노클론 6E10 (Senetek)인데, 인간 Aβ 42 펩티드를 인식하고 1: 3000의 희석율에서 사용된다. 검출계는 Vectastain ABC Kit (비오틴화된 항-마우스 IgG 2차, 및 Horseradish peroxidase H) (Vector Laboratories)이다. 다음 변형법은 Wolff에 의한 프로토콜에 따라 만들어진다: 6E10 일차 항체로 인큐베이션하기 이전에, 동결 절개를 정상적인 말 혈청을 함유한 봉쇄 용액 내에서, Vectastain ABC Kit 프로토콜에 따라서 봉쇄된다. 2차 항체(pGMR-1 눈 조직으로 미리 흡수됨)와 함께 배양하는 것은 역시, Vectastain ABC Kit 프로토콜에 따라서, 1-2% 정상 말 혈청을 함유하는 PBS/1%BSA 내에서 행해진다. ABC Kit에 대한 절차에 이어, ABC 시약과의 배양이 PBS/0.1% 사포닌 내에서 행해지고, PBS/0.1 % 사포닌 내에서 4X 10 분의 세척이 이어진다. 절개물은 이후 슬라이드 당 Horseradish Peroxidase H 기질 용액 0.5 ml, 400ug/ml 3,3'-디아미노벤지덴 (DAB), PBS/0.1% 사포닌 내 0.006% H₂0₂에서 배양되고, 반응을 3분 후 PBS 내 0.02% 소듐 아지드로 종결시킨다. 절개물은 PBS 내에서 수차례 헹구고 DPX (Fluka) 내에 올려놓기 전에 에탄올 시리즈를 통해 탈수시킨다.

화합물 선별을 위한 RNA 프로파일 특성화

RNA 프로파일은 전통적인 노던 블롯 분석과 더불어 마이크로어레이 칩 기술(Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA; Affymetrix, Santa Clara, CA)의 사용을 포함하는 공지된 방법에 따라서 어세이될 수 있다.

실시예 1

Aβ 42 전위 발현에 의해 유도된 러프 아이 표현형

Aβ 42가 신경퇴화를 유발하는 대부분 알려지지 않은 경로 및 매카니즘을 규명하기 위해, 초파리 눈, 신경 조직이 모델로서 사용된다. 질병-특이적 Aβ 42 과다발현을 모방하기 위한 노력으로, 게놈이 GMR-A베타42 아밀로이드 형질전환유전자를 포함하는 형질전환 파리를 상기에서 개시된 GMR 융합 발현 시스템을 사용하여 초파리 눈의 발육에서 형질전환유전자를 전위적으로 발현시키기 위해 제조한다.

I. Aβ 42 과다발현은 러프 아이 표현형을 유발한다

초파리 눈에서 Aβ 42 펩티드를 발현시키기 위해, Aβ 42 서열이 pGMR 벡터 내로 클로닝된다. pGMR (Glass Multimer Reporter) 벡터는 Glass 전사 인자에 대한 끝이 잘린 결합 부위의 펜타머를 함유한다. Glass는 성인 초파리 눈의 전구체인 눈 디스크를 시작으로 눈 발육 동안 널리 발현되고, 여기서 분화하는 광수용체 뉴런 내에서 검출된다. 이는 용기(pupal) 및 성충 발육 도중 눈에서 특이적으로 발현을 계속한다(Moses et al, 1989 Nature 340 (6234): 531-536; Moses and Rubin, 1991 Genes Dev.5: 583-593). 2주까지의 파리에서의 GMR-요소 발현은 리포터 유전자를 사용하여 검사되고 우수한 발현이 검출되는데, 이는 GMR 요소가 성충기로 우수하게 활성인 것을 암시한다. 그러므로, GMR-조절 발현은 성충기 도중과 더불어, 눈의 발육을 통해 눈 조직에 관한 것이고, Aβ 42의 발현에 적합한 시스템이 되게 한다.

두 개의 독립적인 형질전환유전자 라인은 pGMR-Aβ 42 구성체, K18.1 및 K18.3으로 초기에 확립된다. 부가적으로, 또다른 형질전환 라인,pGMR-1는 삽입물 없이 동일한 벡터를 발현하는데, 음성 대조구로서 검사된다.pGMR-1형질전환유전자를 갖는 대조 파리 및K18.3또는 theK18.1형질전환유전자 중의 하나의 복사본을 운반하는 파리는 러프 아이를 나타내지 않는다. 유사하게, 상기 형질전환유전자 (K18.3및K18.1) 모두의 각각의 복사본 또는K18.1형질전환유전자의 두 개의 복사본을 운반하는 파리는 모두 야생형 눈도 갖는다. 대조적으로,K18.3의 두 개의 복사본을 갖는 파리는 약한 러프 아이 표현형을 갖고; 광 현미경 하에서의 파리 눈 검사는 Aβ 42의 전위적 과다발현이 낱눈(동일한 단일 단위, 초파리 복합 눈을 형성)의 광수용체 세포의 규칙적인 사다리꼴 배치를 교란시킴을 나타낸다. 상기한 관찰은 러프 아이 표현형의 파리 게놈 내에 존재하는 형질전환유전자의 복제수에 대해 용량 의존적임을 암시한다. 이 가정을 검사하기 위해, 형질전환 유전자의 수는 세 개까지 증가된다(하나의K18.3복사본과 함께 두 개의K18.1복사본 또는 두 개의 K18.3 복사본과 함께 하나의K18.1복사본). 이들 변종은 또한 러프 아이를 나타내었다. 마지막으로, 네 개의 형질전환유전자의 복사본이 존재할 때(두 개의K18.3복사본과 함께 두 개의K18.1복사본), 파리는 휠씬 심한 러프 아이 표현형을 나타내었고 용량 의존성 가설을 확인시켰다. 러프 아이 표현형의 투과성은 모든 유전자 조합에서 100%이다. 더욱 심한 표현형은 파리를 29 ℃에서 발육시킬 때 관찰된다는 점 또한 주목해야 한다. 눈 표현형 발현을 위한 온도 요건은 이전에 개시된 바 있고 (Karim and Rubin, 1998 Development 125 (1) : 1-9), 비록 GMR-함유 발현 시스템에 제한되는 것은 아니지만 눈에 특이적으로 적합하다. 그러한 의존성은 더 높은 전사 및/또는 대사 속도, 또는 더 높은 온도에서의 변형된 단백질 컨포메이션에 기여할 수 있다.

II. Aβ 42 형질전환유전자는 러프 아이 표현형을 나타내고, 그 정도는 형질 전환 복제수에 의존한다.

초파리에서의 형질전환유전자의 발현 수준은 특이적 삽입물의 염색체 위치에 의존하는 것이 널리 확립되었고, "위치 효과"로서 공지된 현상이다(Kellum, R. and Schedl, P. (1991). Cell. 64: 941-50). 이후, 동일한 형질전환유전자로 부가적으로 독립적인 삽입물을 발생시킴으로써, 형질전환 단백질의 서로 다른 수준을 발현시키는 형질전환 라인을 회복하는 것이 가능하다. 그러므로, 더 낮은 온도(25 ℃)에서 표현형을 야기하기에 충분히 높은 수준에서 Aβ 42 형질전환유전자를 발현시키는 형질전환 라인을 분리하는 것이 가능하고, 그러므로 더욱 생리학적 조건을 나타낸다. 이 가설을 시험하기 위해, 파리 게놈에서 pGMR-Aβ 42 형질전환유전자의 새로운 삽입물이 "P-요소 호핑(hopping)" (Robertson, H. M. et al. (1988). genetics 118: 461-470)을 사용하여 발생시켰다.

새로운 염색체 위치에서 총 19개의 독립적인 라인의 pGMR-Aβ 42 구성체가 확립되어 있다. 새로운 변종은 염색체 연결 또는 형질전환 유전자의 동형접합형 치사 조건과 더불어 눈 색깔의 차이(white유전자의 서로 다른 발현 수준에 의해 야기됨, 형질전환 마커로서 사용됨)에 기초하여 새로운 삽입물을 운반하는 것으로 판단된다. 상기한 신규 변종의 어린 유충은 우화(eclosion)까지 29 ℃에서 연속하여 배양되고 눈 표현형의 존재에 대해 검사되었다. 19개의 신규 라인 중, 7 라인 즉 38%는 러프 아이 표현형을 나타낸다. 러프 아이 표현형을 나타내는 변종은 25℃에서 연속적으로 배양되고 눈 표현형에 대해 측정되었다.

새로운 형질전환 라인은 다양한 정도의 표현형 정도를 나타내고, 이들 중 일부는 처음에 K18.1 및 K18.3 라인에서 관찰된 것보다 더 심한 표현형을 나타내었다. 그러한 예는 KJ.103 라인인데, 여기서 형질전환유전자의 한 복사본은 성충 눈을 약간 러프하게 만드는데, 이는 눈 아래쪽의 "점"(더 짙은-적색 점의 낱눈에 해당)의 존재에 의해 특성화되고, 반면 형질전환 유전자의 두 개의 복사본은 광범위한 광수용체의 파괴를 야기한다. 더욱 중요한 것은, 이 특이적 라인이 파리가 25 ℃에서 발육될 때도 러프 아이 표현형을 나타낸다는 것이다. KJ. 103 파리가 29 ℃에서 발육될 때, 형질전환유전자의 하나 또는 두 개의 복사본에 의해 야기된 표현형의 정도는 극적으로 증가된다.

요약하면, Aβ 42 펩티드에 의해 야기된 러프 아이 표현형은 어떤 범위의 정도를 나타낸다. 가장 마일드한 라인은 눈의 밑면 상에 수많은 짙은/흑색 "점"을 대표적으로 나타내고, 반면 마일드한 라인은 눈의 밑쪽 부분을 덮는 더욱 러프하고, 무질서한 외관을 갖는다. 마일드한 라인은 전체 눈에 걸쳐 더 강한 러프함을 나타내고, 반면, 더욱 심한 라인에서 전체 눈은 소실/융합된 많은 낱눈 및 상호-낱눈 털을 갖는 것으로 보이고, 전체 눈은 부드럽고, 광택있는 외관을 갖는다. 흥미롭게도, 눈의 크기는 높은 수준의 Aβ 42 발현 (변종 KJ54)을 갖는 파리에 단지 보통 정도(moderately)의 영향을 미친다. 이는 인간 α-시누클레인(시누클레인) (Feany, M. B. and Bender, W. W. (2000) Nature 404: 394-398을 발현하는 파리에서 관찰되는 것과 일치한다. 폴리-글루타민 확장된 인간 헌팅틴(huntingtin)을 발현하는 파리에서, 가장 강력한-발현 형질전환유전자 라인에서 눈 크기가 매우 작게 감소되는 것으로 관찰되었다(Warrick, J. M., et al (1998). Cell 93 : 939-949). 상기 결과는 인간 질병 유전자의 과다-발현에 의해 유도된 신경퇴화는 세포사멸 경로에 작용하는 유전자의 과다발현에 의해 유도된 표현형과 다르다는 것을 암시하는데(Grether, M. E. et al. (1995). Genes Dev. 9,1694-1708), 여기서 눈의 크기가 주로 영향을 받는다.

상기 결과에 기초하여, 러프 아이 표현형의 정도는 존재하는 A베타 단백질의 양에 의존한다고 가정된다. 이 가정의 결과, KJ. 103 형질전환유전자는 K18. 3 형질전환유전자보다 더 높은 수준의 단백질 발현을 나타낸다고 예상된다(아래 참조).

III. 러프 아이 표현형의 발현능력은 Aβ42 단백질 수준과 상관관계가 있다

러프 아이 표현형의 정도와 Aβ 42 펩티드의 발현 수준을 결정하기 위해, 초파리 머리의 단백 추출물의 웨스턴 블롯 분석이 수행된다(사용된 변종은 상기한 방법에서 기술된다). 이 결과는 형질전환 유전자의 두 개의 복사본을 갖는 동물은 하나의 형질전환 유전자 복사본을 갖는 동물보다 Aβ 42 펩티드 양이 대략 두 배임을 나타낸다. 흥미롭게도,K18.1두개의 복사본을 갖는 파리도 검출가능한 양만큼 Aβ 42 펩티드를 발현하고, 가시적인 성충 눈 표현형을 갖지 않는다. 두개의 복사본의 더 높게 발현하는K18.3형질전환 유전자를 갖는 파리는, Aβ 42 펩티드보다 전체적으로 더 받은 양을 발현하고, 러프 아이 표현형을 나타낸다. 이는 두 개의 복사본의K18.3형질전환유전자 및 enrom이 복사본의K18.3형질전환유전자를발현하는 파리에서도 또한 사실이다. 단지 하나의KJ103형질전환유전자를 발현하는 파리는 두 개의 복사본의K18.3형질전환유전자를 발현하는 파리와 대략 동일한 양의 단백질을 가져, KJ103 형질전환유전자가 상대적인 단백질 발현수준이 더 높다는 것을 보여준다.

상기 결과는 가시적 표현형을 발생시키기 위해서는 특정 수준의 Aβ 42 단백질 수준에 대한 요구조건이 있음을 나타낸다. 더 낮은 양의 Aβ 42 발현이 초구조적 수준에서만 단지 가시적인 부수적인 교란을 야기함은 여전히 가능하다. 이를 시험하기 위해, 성충 파리 머리로부터의 얇은 절개물(1.5um)이 검사된다. 이들 데이터는, 톨루이딘-블루 염색 광수용체가 정돈되게 배열된, 빈 pGMR 벡터를 운반하는 파리로부터의 눈과 비교하여,K18.3 형질전환유전자를 보통으로 발현시키는 하나의 복사본을 운반하는 파리는 약간의 비정상-일부 광수용체가 소실되고, 블루-염색 공간이 낱눈 주위로 형성되고 조직에서 일부 캡이 나타나는 것을 의미한다. 이들 눈은 육안으로는 정상으로 보인다.

두 개의 복사본의 K18.3 형질전환유전자를 발현하는 눈으로부터의 절개물은, 육안 수준에서의 관찰과 일치되게, 가변적 파괴를 나타낸다. 표현형이 더 나빠질수록, 낱눈 주위의 조밀한, 염색 부피의 농도는 조직에서의 갭과 같이 증가한다. 낱눈이 더 작아 보이고 광수용체를 소실한다. KJ103 형질전환유전자를 더 높게 발현하는 두 개의 복사본은 유사한 정도의 표현형을 나타내다. 마지막으로, 네 개의 복사본의 강력한 발현 KJ54 형질전환유전자를 발현하는 초파리로부터의 눈은 광수용체가 거의 소실되었음을 나타낸다. 부가적으로, 이들 눈은 조직 캡 및 조밀한,염색 부피가 풍부함을 나타낸다. 낱눈 주위의 조밀한, 염색 부피가 비정상/사멸 세포를 나타내는지 또는 이들이 응집 A베타 펩티드를 함유하는지는 이 시점에서 불분명하지만, 이러한 축적이 전체적인 눈 퇴화가 관찰되는 것과는 일치함은 분명하다.

눈 조직 상의 β-아밀로이드의 발현을 가시화히기 위해, Aβ 발현 눈의 절개물을 인간 Aβ 펩티드를 인식하는 항체로 염색시킨다. 눈 조직의 가로 절개물은 대조구에는 없는 오목한 염색을 나타낸다. 이 오목한 염색은 베타 아밀로이드의 작은 응집물/축적물에 상응한다고 가정한다. 응집물/축적물의 정확한 특성과 함께 이 염색의 세포적 위치설정은, 공지된 Aβ 염색 안료를 사용하여 조사된다.

요약하면, 초파리 눈 내 더 많은 복사본의 Aβ 42 형질전환유전자를 도입하는 것은, 증가된 Aβ 단백질 수준에 의해 알 수 있는데, 러프 아이 표현형에 부가적인 영향을 갖는 것으로 본 명세서에 개시된다. 특정 농도의 Aβ 42 펩티드는 응집/컨포메이션 상태에 형향을 미치는데 필요하다는 것이 가능하다. 택일적으로, 펩티드의 포화 수준은 독성 효과의 확장에 필요할 수 있다. Aβ가 여러 신호 경로에서 신경독성 효과를 갖는다는 사실(세포내 칼슘 수준, 산화적 스트레스, 염증 반응, 무스카린 및 니코틴 수용체 신호, Fraser, S. P., et al (1997). Trends Neurosci. 20: 67-72 ; Mattson, M. P. (1997). Physiol. Rev. 77: 1081-1132; 및 Coughlan, C. M. and Breen, K. C. (2000). Pharmacol. and Ther. 86: 111-144; Hellstrom-Lindahl and Court, 2000 Behav Brain Res.113 (1-2): 159-168에서 검토됨), 교란을 야기하기 위한 포화 수준의 필요성을 나타낸다. 그렇지만, 보통 정도양의 펩티드의 발현은 전체 형태학적 수준에서 성충 눈의 구조에 중요하지 않음이 명백하다.

IV. Aβ 42 펩티드에 의해 유도된 러프 아이 표현형은 나이들수록 나빠진다

알츠하이머병 환자에서, Aβ 펩티드의 만성 축적은 병의 초기 학장 및 증상이 점점 악화되는 것을 유발함은 잘 정립되어 있다. 초파리 모델에서 이 질병의 양상을 모방할 수 있는지를 시험하기 위해, 나이든 파리에서 눈 표현형의 러프함 정도가 기록된다.

pGMR1(음성 대조구로서) 및 K18.3을 발현하는 두 개의 파리 변종이 검사된다. K18.3 파리는 이 형질전환 변종 내에 다양한 범위의 표현형 정도가 있고 따라서 변화를 기록하기 용이하기 때문에 사용된다. 두 개의 변종으로부터의 파리는 25 ℃에서 0-2일간 발육시키고 우화후 29 ℃로 옮겨, 더 높은 형질전환유전자 발현을 유도하였다. 파리는 이후 대략 일주일마다 한달 동안 눈 표현형에 대해 점수가 매겨졌다. K19.3 파리는 눈 표현형이 관찰된 정도에 따라 세 개의 서로 다른 그룹(보통, 약함, 중간)으로 분류되었다. 이전에 언급된 바와 같이 pGMRl 발현 파리는 어떠한 눈 표현형도 나타내지 않았다.

데이터는 A베타 발현 파리가 늙어감에 따라 표현형의 정도에 변화가 있음을 나타낸다: 처음 파리가 우화하면, 중간 표현형을 갖는 눈은 관찰되지 않는 반면, 7일째에 집단의 15%가 중간 표현형을 갖는다. 또한 7일까지, 모든 자손은 어느 정도의 러프 아이 표현형을 나타내는 반면, 42%는 우화에 관한 어떠한 표현형도 나타내지 않는다. 32일까지, 다수의 파리가 죽을지라도, 약한 표현형 대 중간 표현형의 파리의 전체적인 비율이 변경되지 않아, A베타 발현의 최대 효과에 도달되었음을 암시하였다.

본 명세서에서 개시된 초파리 모델은 알츠하이머병의 중요한 양상인, 점진적으로 나이와 관련하여 알츠하이머병 증상이 악화되는 것을 모방하는 것으로 보인다. 파리가 나이듦에 따라 눈 표현형의 정도가 증가되는 것으로 관찰된 것은 Aβ 펩티드의 수준에 대한 신경 세포의 감수성이 증가함에 기인할 수 있다. 실제로, 상기한 바와 같이, Aβ 펩티드는 초파리의 성충 단계 전체를 통해 생성된다. 그러므로 증가된 Aβ 수준을 효과적으로 반전시킬 수 없어서, 초파리 세포 내에 펩티드의 축적이 유발된다. 택일적으로, 늙은 세포는 Aβ 펩티드의 존재에 더욱 민감해진다.

V. 유충 눈 성충 디스크 및 성충 눈에서의 러프 아이 표현형 및 세포사멸 세포의 정도

이전에 언급된 바와 같이, Aβ 42 펩티드는 공지된 독성 효과를 갖고세포사멸에 중요한 역할을 하는 것으로 제안되고 있다. 이에 기초하여, 제 3령 유충 눈 성충 디스크, 성충 눈의 전구체는 세포사멸, 또는 예정된 세포 죽음의 증거에 대해 검사된다.K18.1/K18.1 ; K18.3/K18.3유충으로부터의 절개된 눈 성충 디스크는 29 ℃에서 발육시키고, 통상의 방법에 따라 아크리딘 오렌지로 염색하고, 이는 사멸 세포의 형광을 유발한다. 대조구로서, 다음 변종이 사용되는데, 이들은 아무런 눈 비정상을 나타내지 않는다: 29 ℃에서 발육시킨w ¹¹¹⁸ ( 야생형 대조구) 및pGMR-1("빈" pGMR 벡터를 운반하는) 및 18 ℃에서 발육시킨 GMR-GAL4 (GMR 요소의 제어 하에 Gal4를 발현하는).

결과는 야생형 대조구,w ¹¹¹⁸ 에서 세포 죽음이 거의 또는 전혀 보이지 않앗음을 나타낸다. 대조적으로,K18.1/K18.1;K18.3/K18.3라인에서는 상당량의 세포 죽음이 검출될 수 있다. pGMR 벡터를 운반하지만 어떠한 눈 표현형도 나타내지 않는 대조구(pGMR-1및GMR-GAL4)가 검사되고, 어떤 세포 죽음이 또한 관찰되고, 실험 파리,K18.1/K18.1;K18.3/K18.3에서 관찰되는 것과 비교하여 상대적으로 관찰된다. 그러므로, 특정량의 세포 죽음은 최소한 전체 형태학적인 수준에서 눈 발육 도중 극복되어 어떠한 성인 눈 결함도 유발하지 않는 것으로 보인다. 부가적으로, 세포사멸이 러프 아이 표현형의 발생에 어떠한 관련성이 있다면, 초기 눈 발육 도중에는 나타나지 않음을 암시한다.

관찰된 러프 아이 표현형이 초파리의 성충 단계 동안의 세포사멸에 의해 야기되었는지 여부를 시험하기 위해, 세포사멸 저해제 DIAP1를 초파리 눈 내에서 공동발현시킨다. A베타를 발현하는 눈에서 DIAP1의 공동-발현은 최소한 부분적으로, 러프 아이 표현형을 억제할 것으로 예상된다(데이타 미제시). 두 개의 서로 다른 DIAP-발현 변종에 대해 어떠한 억제도 관찰되지 않았기 때문에, 관찰된 러프 아이 표현형은 전위적으로 유도된 사멸 세포 죽음에 의해 야기된 것은 아니다. 동일한결과는 항-세포사멸 배큘로바이러스 P35 유전자가 사용된 때도 얻어졌다. 이들 결과는 초파리 눈에서의 Aβ 42 펩티드에 의해 야기된 효과는 세포사멸을 일으키지 않는 세포 경로에 의해 매개됨을 암시한다.

Aβ 42의 작용은 상당히 복잡하고 AD 진전에서의 인자라고 공지된 다른 단백질에도 영향을 미친다. PS1 및 PS2는 APP(Xia et al., 1997 PNAS USA 94 (15): 8208-13)와 공동-면역침전하고 Aβ 42는 인 비트로에서 PS 2에 직접 결합할 수 있음이 입증되었다(Czech et al., 1999 Society for Neuroscience 25: 641. 1). 야생형 및 돌연변이 PS 형태의 과다발현도 초파리 눈을 포함하는 몇몇 실험 시스템에서, 세포사멸에 대한 증가된 감수성을 야기함은 주목할 만한다(Ye, Y. and Fortini, M. (1999). J. Cell Biol. 146: 1351-1364). 이들 연구에서,초파리 프레세닐린(Dps)은 높은 수준으로 발현될 때 지배적인 나쁜 영향을 미침이 제안되었다. 어떻게Dps가 세포의 죽음을 유발하는지는 분명하지 않지만, 그 매카니즘은 Notch 및/또는 Wnt 발육 신호 경로의 탈조절을 수반할 수 있다(Anderton et al., 2000 Mol. Med. Today 6: 54-59에서 검토됨). 본 명세서에서 개시된 시스템에서 Aβ 42 과다발현이 하나 이상이 이들 신호 경로를 방해함으로써Dps기능에 영향을 미치는 지는 불분명하다. 흥미롭게도, Aβ 40 또는 Aβ 42의 과다발현은 종일 조직에서의 Dps (초파리 프레세닐린) 유도된 표현형을 향상시켜(데이타 미제시), 동일 경로에서의 두 개의 단백질이 수반됨을 암시한다.

실시예 2

C99 전위 발현에 의해 유도된 오목 날개 표현형

pUAS-C99 (야생형 또는 London 돌연변이를 갖는)의 복사본 및 apterous-Gal4의 복사본을 운반하는 형질전환 초파리가 상기한 바와 같은 표준 방법을 사용하여 만들어진다. 데이타는 날개깃이 오목한 식으로 굽어있다는 점에서 날개 기형을 나타냄을 의미한다. 이들 효과는 C99 형질전환유전자의 여러 독립적 삽입물로 확인된다. 웨스턴 분석은 이 형질전환유전자의 발현을 확인한다. 딸없는-Gal4(Gal4 드라이버를 동시에 발현시키는)의 제어 하에 C99(야생형 또는 London 돌연변이를 갖는)를 발현시키는 전체 유충으로부터의 단백질 추출물은 C99에 대해 예상되는 크기의 단백질 밴드를 나타내고, 이는 6E10 항체와 면역반응한다(C99의 처음 16 아미노산에 대해 생산됨). C100으로서 언급되는 인간 APP 유전자의 일부가 초파리의 게놈 내로 삽입되고 날개 디스크 내에서 발현될 때, 어떠한 가시적 표현형도 발생시키지 않는다는 데이터가 존재한다(Fossgfreen et al., PNAS 95: 13703-13708 (1998)). 대조적으로, 여기서 보고된 데이터는 인간 APP(여기서는 C99로 불림)의 동등한 C100 영역으로 형질전환된 파리는, 서로 다른 신호 펩티드에 대해 융합되고, 날개 기형을 나타냄을 보여준다.

실시예 3

C99의 전위 발현에 의해 유도된 인지 결함

UAS-C99 (야생형 또는 London 돌연변이를 갖는)의 복사본 및 7B-Gal4 (뇌의 버섯모양체의 발현을 허용함)의 복사본을 운반하는 형질전환된 초파리가 표준 기술을 사용하여 만들어진다. 이들 파리의 인지 결함은 통상의 방법에 따라서 후각,이동력 또는 학습 및 기억 평가를 수행함으로써 검사될 수 있다. 예를 들면, 변형된 이동력 행동은 상기 파리에서 관찰되고, Benzer에 의해 S. PNAS 58: 1112-1119 (1967)에 기술된 "암 반응성(dark reactivity)" 시험법을 사용하여 시험된다. 특히, UAS-C99의 복사본 및 7B-Gal4의 복사본을 함유하는 파리는 야생형 파리와 더불어 기계적 교반에 반응하지 않고, 평가 장치의 바닥으로 친 후 야생형 파리보다 덜 빨리 걸었다. 이동력에 대한 "암 반응성" 시험은 "Behaviour, Learning and Memory"In: Drosophila, A Practical Approach. Ed. D. B. Roberts (1998) Oxford University Press Inc. New York page 273에도 기술되어 있다.

실시예 4

알츠하이머병 치료를 위한 표적으로서 초파리 표현형을 변형시키는 유전자

아래에서 상세히 개시된 바와 같이, 유전적 선별은 실시예 2에 기술된 오목 날개 표현형의 유전적 변형자를 확인하기 위해 수립되었다. 시험된 후보 변형자는 날개 및 소순판에서 초파리 프레세닐린(Dps)의 전위적 발현에 의해 유도된 두 개의 초파리 표현형(G.Boulianne, Hospital for Sick Children, Toronto, Canada, personal communication)을, 다른 후보 유전자에서의 돌연변이와 함께 포함한다. 염색체 10 AD 유전자 "위험 지역(hot spot)"의 최근 발견에 기초하여, 상기에서 언급된 초파리 유전자 변형자의 인간 호몰로그의 염색체 지도화가 수행되었다. 아래에서 개시된 데이터는 몇몇 유전적 변형자의 인간 호몰로그가 또한 염색체 10 상에 위치하고 이들 유전자는 APP 경로에서의 조절 에러와 연관된 다른 이상뿐만 아니라알츠하이머 병에 대한 치료용으로 유용한 약물의 개발을 위한 표적과 관련된다고 생각된다.

총 93 돌연변이가 초파리 날개에서 C99의 전위적 발현에 의해 유도된 오목 날개 표현형의 유전적 변형자를 확인하기 위해 선별되었다. 선별은 외부적 돌연변이가 존재할 때 날개 표현형의 투과도 변화의 측정에 기초한다. 더욱 특이적으로, 야생형 날개를 갖는 파리의 수와 비교되는 돌연변이 날개를 갖는 파리의 수가 실험 그룹(C99 및 시험되는 돌연변이 모두를 발현하는 파리) 및 대조 그룹(C99만을 발현하는 파리)에서 카운트된다. 돌연변이 표현형의 투과에서의 변화의 유의성은 상기에서 언급된 네 그룹에서, T 테스트에 의한 P 값을 측정하여 평가된다. 돌연변이는 P<0.05일때 C99 표현형을 상당히 변형하는 것으로 고려된다.

C99-과다발현 표현형에 영향을 미치는 유전적 변형자 및이들 유저적 변형자와 연관된 초파리 유전자의 리스트가 표 1에 제공된다.

프레세닐린 및 C99 과다발현 표현형의 변형자로서 확인된 모든 돌연변이는 삽입 돌연변이이다(P-레트로바이러스형 전위 요소의 초파리 개놈 내로의 삽입에 의해 매개됨). 이들 각 삽입물의 정확한염색체 위치는 이전에 이미 결정되었다 (Drosophila Genome Project BDGP, http ://www. fruitfly. org). 이들 각 삽입물에 의해 영향을 받는 전사물을 확인하기 위해, 공지된 또는 예사되는 초파리 전사물에 대한 각 삽입물의 오른쪽 및 왼쪽에 10 kB 게놈 영역을 스캐닝하였다. 다음 기준은 주어진 삽입물에 의해 수행되는 가장 가능성 높은 전사물을 선택하기 위해 적용되었다:

a) 삽입 부위로부터의 전사 거리, 및 b) 삽입에 상대적인 전사의 배향.

만약 게놈 영역이 삽입물과 동일한 배향을 갖는 하나 이상의 후보 전사물을 함유하면, 삽입물에 가장 가까운 모든 것이 추가 분석을 위해 선택되었다. 상기 분석으로부터의 초파리 전사물의 번역된 단백질 서열은 "Set A"를 형성한다.

인간 염색체 10의 AD-연결된 영역 내의 상기 초파리 단백질("Set A" 내)의 인간 호몰로그의 존재가 검사되었다. 인간 염색체 10 상의 Sequence Tagged Site (STS) 마커 주위의 두개의 후보 영역이 연결 분석에 의해 확인되었다(Bertram et al., Ertekin-Taner et al., Myers et al., Science 290,2302-2305, 2000). 우리는 이 연결 분석 연구에 사용된 STS 마커 서열 또는 이들 마커에 인접한 STS 서열을 Celera 게놈 데이터에 대해 blastn (Altschul et al., 1997) 서열 비교에 의해 지도화하였다. 이 지도화 정보에 기초하여, 상당한 연결을 나타내는 두 개의 후보 영역(Bertram et al., 2000; Ertekin-Taner et al., 2000; Myers et al., 2000) 및 그 사이의 영역을 포함하는 인간 염색체 10의 하위세트가 정의되었다. 상기 DNA 서열 (Celera contigs) 및 Celera 단백질 번역물의 상응하는 리스트는 정의된 하위세트에 대해 추출되고 상기에서 기술된 게놈형역에 대한 Celera 단백질 번역물은 "Set B" 및"Set C"를 각각 형성한다.

"Set B"에 대한 "Set A"를 이용한 tblastn 검색 및 "Set C"에 대한 "Set A"를 이용한 blastp 검색이 이후 수행되었다. 초기에 10^-5보다 낮은 E-값을 갖는 tblastn 및 blastp 히트(hit)가 선택되었다. 이후 이들 검색으로부터의 각 파리단백질의 가장 좋은 일치쌍이 선택되고 상응하는 파리 유전자/전사물이 Dps 및 C99 표현형의 유전적 변형자와의 관련성에 대해 검사되었다. 파리 및 인간 전사물/단백질의 결과적인 14개 쌍은 "Set D"를 형성한다.

"Set D" 내의 14개 단백질 쌍은 엄격한 또는 추정적 오르톨로그 성질(orthology)에 대해 시험되었다. 이는 모든 인간 및 모든 파리 Celera 단백질의 조합된 데이터베이스에 대한 blastp 비교에 의해 이루어졌다. 먼저, "Set D" 내의 파리 단백질은 이 데이터베이스 내의 각 단백질에 대해 비교되었다. 이후 각 파리 단백질에 대한 가장 좋은 인간 매치가 조합된 인간/파리 단백질 데이터베이스와 비교되었다. 인간 매치는 다음 네가지 기준을 모두 충족하면 엄격한 오르톨로그로서 분류되었다:

1. 파리 단백질 X 는 인간 단백질 Y와 가장 좋은 매치를 갖는다

2. 파리 단백질 X는 인간 단백질 Y 외의 다른 파리 단백질과는 더 나은 매치를 갖지 않는다

3. 인간 단백질 Y는 파리 단백질 Y와 가장 좋은 매치를 갖는다

4. 인간 단백질 Y는 파리 단백질 Y외의 다른 인간 단백질과는 더 나은 매치를 갖지 않는다

만약 기준 1) 및 3)이 충족되면, 인간 매치는 파리 단백질 X가 다른 파리 단백질과 더 나은 매치를 갖는지 여부와 관계없이 추정적 오르톨로그로서 분류되고, 인간 단백질 Y는 다른 인간 단백질 또는 모두와 더 좋은 매치를 갖는다. 모든 다른 인간 매치는 호몰로그로서 간주된다. 오르톨로그 성질 시험 후, 후보 인간 유전자는 다음에 따라 순위를 매긴다:

a) 인간 유전자가 유전자 선별에서 확인된, 초파리 유전적 변형자에 의해 영향을 받는 파리 유전자의 호몰로그이다

b) 초파리 단백질( a)에서의 초파리 유전자에 의해 엔코드된)에 대한 인간단백질( a)에서의 인간 유전자에 의해 엔코드됨)의 서열 유사성 정도

c) 인간 단백질은 파리 단백질의 엄격하거나 또는 추정적 오르톨로그이다

d) STS 마커, 기타 후보 유전자 및 공지된 AD 유전자에 대한 인간 유전자의 염색체 위치

e) 인간 단백질 및/또는 호몰로그 초파리 단백질의 추정적 기능

f) 예상되는 인간 유전자가 발현된다는 증거

g) 인간 유전자의 코딩 영역에서의 검증되거나 또는 예상되는 코딩 및/또는 비-코딩 SNP의 존재

인간 호몰로그 유전자가 발현되는지를 조사하기 위해, Incyte LifeSeq EST 데이터염기를, blastn를 사용하여 Celera로부터 확인된 상응하는 예상되는 인간 전사물을 이용하여 검색하였다.

이 기준에 기초하여 네 개의 서로 다른 인간 유전자가 인간 염색체 10 상에 위치한 AD 관련 유전자인 것으로 생각된다. 아래는 이들 제안된 인간 유전자에 의해 엔코드된, 추정적 단백질의 리스트이다.

(1) hCP50765 (EGR2) SEQ ID NO: 35

(2) hCP41313 (파리 유전자 nocA에 대해 상동적) SEQ ID : 15, SEQ ID NO:17 또는 SEQ ID NO 53

(3) hCP33787 (안키린-관련된 단백질) SEQ ID NO: 41

(4) hCP51594 (안키린-3) SEQ ID NO: 43

Celera 예측된 전사물 hCT15097는 두 개의 추정적 형태의 단백질 hCP41313를 생성하도록 수동으로 큐레이트되었다. 큐레이션은 Incyte LifeSeq 및 공개 EST 데이터베이스의 blas수 검색 및 Celera 예측된 전사 서열로 확인된 EST를 배치함으로써 이 위치에 상응하는 EST를 확인하여 수행되었다. 이 큐레이션은 C-말단 아미노산 서열 및 예측되는 아미노산 서열의 N-말단에서의 추정적 부가 잔기 내의 약간의 변화를 만들었다. 인간 단백질 서열의 C-말단 부분에서의 변화는 이 영역에서 파리 nocA를 갖는 향상된 배열을 유도한다. Celera 단백질 서열 (hCP41313) 내의 N-말단 Met 64 및 Met 100은 완전 큐레이트된 nocA 호몰로그 전사 서열 번역에서의 Met 114 및 Met 150에 상응하기 때문이다. 우리는 Novartis FGA cDNA 컬렉션 및 Incyte cDNA 컬렉션으로부터의 cDNA 서열을 계속하여 분석하고 비교하였다. 이들 분석에 기초하여, 우리는 염색체 10 상의 인간 nocA 유전자에 상응하는 cDNA 클론을 콜로닝하고 서열화하였다. 이 cDNA 클론의 5' 말단은 독점적인 Novartis 클론 fga94341로부터 얻어진 cDNA 구성되고 이 클론의 3' 말단은 Incyte clone 242278.1(SEQ ID NO: 52, SEQ ID 제 53)로부터 얻어진 cDNA로 구성된다.

EGR2는 Celera 예측된 파리 전사물 CT23724 (참조 표 1)의 추정적 오르톨로그이고, 이는 초파리stripe유전자에 상응한다. 파리 돌연변이 P1505 (참조 표 1)는 ,stripe유전자에 영향을 미치고, 프레세닐린 표현형만을 변형한다.

인간 nocA는 Celera 예측된 파리 전사물 CT14619 (참조 표 1)의 추정적 오르톨로그이고, 이는 초파리nocA유전자에 상응한다. 파리 돌연변이 EP2173 (참조 표 1)는,nocA유전자에 영향을 미치고, 프레세닐린 및 C99 과다발현 표현형 모두를 변형시킨다.

EGR2는 PNS 미엘린화를 조절하는 C2H2형 아연 손가락 전사 인자이다. 마우스에서 후뇌 발육에 중요한 것으로 입증되었다(Schneider Maunoury et al., Cell 75, 1199-1214,1993; Swiatek & Gridley, Genes Dev. 7,20712084,1993). EGR2에서의 네 개의 돌연변이는 유전적 말초 신증과 연관되는 것으로 기술되었다(Warner et al., Nature Genet 18,382-384,1998; Timmerman et al., Neurology 52, 1827-1832,1999).

nocA 인간 호몰로그는 C2H2형 아연 손가락 도메인을 갖는 추정적 전사 인자이다. 정확한 기능은 아직 결정되지 않았지만, 본 명세서에 개시된 데이터에 따르면, 알츠하이머병의 병리학에 중요한 역할을 한다. nocA 유전자에 의해 엔코드된 초파리 단백질은 태아 뇌 및 성인 홑눈 구조의 발육에 수반되는 전사 인자이다.

안키린-3는 480 및 270 kDa 의 두 개의 뇌 특이적 이소형태로 존재한다(Kordeli et al., J Biol Chem 270,2352-2359,1995). 신경-특이적 안키린-3 폴리펩티드는 이온 채널 및 엑손 초기 세그먼트의 노드에 대한 세포 부착분자의 유지 및 표적화에 참여하는 후보물질이다. 안키린-3는 인 비트로에서 전압 의존적 소듐 채널과 연관되어 있고, Ranvier, 엑손 초기 세그먼트, 및 신경근육 접합부의 노드에서 이 분자와 공동-국소화하는 것으로 나타났다(Srinivasan et al.,Nature 333,177-180,1988; Kordeli et al., J Cell Biol 110, 1341-1352,1990; Kordeli & Bennett, J Cell Biol 114,1243-1259,1991; Flucher & Daniles, Neuron 3,163-175,1989).

파리 전사물 CT18415의 두 번째 인간 호몰로그는 안키린-관련된 단백질 (hCP33787) 군에 속한다. 상응하는 유전자는 인슐린 분해 효소(IDE)로부터 469 kbp에 위치한다. 안키린-반복단위에 부가하여, hCP33787는 무균 α 모티프 (SAM) 도메인을 함유한다. SAM 도메인은 발육 과정의 조절에 수반되는 것으로 제안되었고(Shultz et al., Protein Sci 6,249-253,1997), 특이적 단백질-단백질 상호작용을 매개하는 것으로 기술되었고, 연장된 폴리머 구조를 형성하는 것으로 제안되었다(Thanos et al., Science 283,833-836). SAM 도메인은 파리 전사물 CT18415 및 hCP33787 사이에 위치에 포함된다. 우리는 β-아밀로이드의 응집에 이것이 중요한 역할을 하는 것으로 추측한다.

γ-시누클레인은 AD에 수반되는 것으로 가정되었다 (Luedecking et al., Neuroscience Letters 261, 186-188,1999). 우리는 γ-시누클레인이 안키린 반복단위-함유 단백질 hCP33787와 상호작용하는 것을 가정한다. 이를 입증하기 위해, 신필린, 안키린 반복단위-관련 단백질 및 α-시누클린 사이의 단백질-단백질 상호작용이 입증되었다(Engelender et al., Nature Gen 22,110-114,1999). 시누클레인군의 구성원은 높은 정도의 서열 유사성을 공유하는 것으로 알려져 있다( α-시누클레인 및 γ-시누클레인 사이의 64% 서열 동일성, Genome Res 8, 871-880, 1998). 안키린-반복 단위의 배수(fold)가 보존되기 때문에, 상기한 주장은 hCP33783 또는hCP51594 및 γ-시누클레인 사이의 추정적 단백질-단백질 상호작용을 더욱 뒷받침한다. 코팅 SNP (E -> K)가 안키린-반복 영역의 시작에 상응하는, 서열 위치 48에서 hCP33787에 대해 예측된다는 것은 주목할 만하다. 이 서열 편차는 추정적 γ-시누클레인 -안키린 상호작용이라는 점에서 관련성이 있는데 왜냐하면 그것이 반대로 대전된 아미노산 측쇄를 수반하기 때문이다. 안키린-관련 단백질내의 예측되는 SNP는 γ-시누클레인이 위치 110에서 검증된 코딩 SNP (V->E)를 갖고(Ninkina et al., Hum Mol Genet 7, 1417-1424,1998), 이것은 음으로 대전된 아미노산 측쇄에 의해 신경 교환을 암호화하기 때문에 특히 흥미롭다. 우리는 이들 다형이 hCP33783 또는 hCP51594와 γ-시누클레인과의 추정적 상호작용과 관련이 있는 것으로 추정한다.

표 1: 유전적 변형자

Claims (109)

1. 그 게놈이 인간 APP의 A베타 부분을 포함하는 폴리펩티드를 엔코드하고, 신호 서열에 융합된, A베타40 (SEQ ID : NO 1) 또는 A베타42 (SEQ ID : NO 2)를 엔코드하고, 조직-특이적 발현 제어 서열에 작동적으로 연결된 DNA 서열을 포함하고; 초파리 내에서 이 DNA 서열이 변형된 표현형을 나타내는 것을 유도하는 DNA 서열을 발현시키는 형질전환 초파리.
2. 제 1항에 있어서, 상기 DNA 서열은 A베타42을 엔코드하고, 조직 특이적 발현 제어 서열은 눈-특이적 프로모터 GMR를 포함하는 형질전환 초파리.
3. 제 2항에 있어서, 상기 DNA 서열의 발현은 "러프 아이(rough eye)" 표현형을 나타내는 파리를 유도하는 형질전환 초파리.
4. 그 게놈이 인간APP(SEQ ID : NO 3)의 야생형 C99 부분 또는 신호 서열에 융합된 London 돌연변이(SEQ ID : NO 4)을 갖는 인간APP의 C99 부분을 포함하는 폴리펩티드를 엔코드하고, 조직-특이적 발현 제어 서열에 기능적으로 연결된 DNA 서열을 포함하고; 이 초파리 내에서 이 DNA 서열이 변형된 표현형을 나타내는 것을 유도하는 DNA 서열을 발현시키는 형질전환 초파리.
5. 제 4항에 있어서, 상기 DNA 서열은 야생형 C99을 엔코드하고, 조직 특이적 발현 제어 서열은 7B-Gal4 형질전환유전자에 의해 뇌 내에서 생성된 Gal4 유전자에 의해 활성화되는 UAS 제어 요소를 포함하는 형질전환 초파리.
6. 제 5항에 있어서, 상기 DNA 서열의 발현은 이동 결함에 의해 특징지워지는 변형된 표현형을 유도하는 형질전환 초파리.
7. 상기 제 4항에 있어서, 상기 DNA 서열은 야생형 C99 또는 London 돌연변이를 갖는 인간APP의 C99 부분을 엔코드하고, 조직-특이적 발현 제어 서열은,apterous-Gal4 형질전환유전자에 의해 생성된 Gal4 단백질에 의해 활성화된 UAS 제어 요소인 형질전환 초파리.
8. 제 7항에 있어서, 상기 DNA 서열의 발현은 "오목 날개(concave wing)" 표현형을 나타내는 파리를 유도하는 형질전환 초파리.
9. (a) 그 게놈이 인간 APP의 A베타 부분을 포함하는 폴리펩티드를 엔코드하고, 신호 서열에 융합된, A베타40 (SEQ ID : NO 1) 또는 A베타42 (SEQ ID : NO 2)를 엔코드하고, 조직-특이적 발현 제어 서열에 작동적으로 연결된 DNA 서열을 포함하고; 이 초파리 내에서 이 DNA 서열이 변형된 표현형을 나타내는 것을 유도하는 DNA 서열의 발현하는 형질전환 초파리를 제공하는 단계;

   (b) 공지된 또는 예상되는 유전자 내에 돌연변이를 함유하는 초파리와 상기 형질변환 초파리를 교배시키는 단계; 및

   (c) 상기 DNA 서열 및 상기 돌연변이를 운반하고 대조구와 비교하여 형질전환된 표현형의 변형된 발현을 나타내는 초파리에 대한 상기 교배의 자손을 선별하는 단계를 포함하는, APP 경로에서의 유전적 변형자(genetic modifer)를 확인하는 방법.
10. 제 9항에 있어서, 상기 유전적 변형자 및/또는 그 인간 호몰로그는 알츠하이머병의 진전에 영향을 미치는 유전자인 방법.
11. 제 9항에 있어서, 상기 DNA 서열은 A베타42을 엔코드하고, 조직 특이적 발현 제어 서열은 눈-특이적 프로모터 GMR를 포함하는 방법.
12. 제 11항에 있어서, 상기 DNA 서열의 발현은 "러프 아이" 표현형으로서 언급되는 변형된 표현형을 나타내는 파리를 유도하는 방법.
13. (a) 그 게놈이 인간APP(SEQ ID : NO 3)의 야생형 C99 부분 또는 신호 서열에 융합된 London 돌연변이(SEQ ID : NO 4)을 갖는 인간APP의 C99 부분을 포함하는 폴리펩티드를 엔코드하고, 조직-특이적 발현 제어 서열에 기능적으로 연결된 DNA 서열을 포함하고; 이 초파리 내에서 이 DNA 서열이 변형된 표현형을 나타내는것을 유도하는 DNA 서열의 발현하는 형질전환 초파리를 제공하는 단계;

    (b) 공지된 또는 예상되는 유전자 내에 돌연변이를 함유하는 초파리와 상기 형질변환 초파리를 교배시키는 단계; 및

    (c) 상기 DNA 서열 및 상기 돌연변이를 운반하고 대조구와 비교하여 형질전환된 표현형의 변형된 발현을 나타내는 초파리에 대한 상기 교배의 자손을 선별하는 단계를 포함하는, APP 경로의 유전적 변형자(genetic modifiers)를 확인하는 방법.
14. 제 13항에 있어서, 상기 유전적 변형자 및/또는 그 인간 호몰로그는 알츠하이머병의 진전에 영향을 미치는 유전자인 방법.
15. 제 13항에 있어서, 상기 DNA 서열은 야생형 C99을 엔코드하고, 조직 특이적 발현 제어 서열은 7B-Gal4 형질전환유전자에 의해 뇌 내에서 생성된 Gal4 유전자에 의해 활성화는 UAS 제어 요소를 포함하는 방법.
16. 제 15항에 있어서, 상기 DNA 서열의 발현은 이동 결함에 의해 특징지워지는 변형된 표현형을 유도하는 방법.
17. 제 13항에 있어서, 상기 DNA 서열은 야생형 C99 또는 London 돌연변이를 갖는 인간 APP의 C99 부분을 엔코드하고, 조직-특이적 발현 제어 서열은,apterous-Gal4 형질전환유전자에 의해 생성된 Gal4 단백질에 의해 활성화된 UAS 제어 요소를 포함하는 방법.
18. 제 17항에 있어서, 상기 DNA 서열의 발현은 "오목 날개" 표현형을 나타내는 파리를 유도하는 방법.
19. 제 9항의 방법에 따라 확인된 유전적 변형자의 인간 호몰로그를 확인하는 것을 포함하는, APP 경로의 비정상 조절과 관련된 이상을 치료, 예방 또는 개선시키는 치료제를 개발하기 위한 표적을 확인하는 방법.
20. 제 19항에 있어서, 상기 이상이 알츠하이머병인 방법.
21. 제 19항에 있어서, 알츠하이머병에 유전결 연결성을 갖는 것으로 나타난 인간 염색체 10 상의 영역에 대해 지도화하는 유전적 변형자의 인간 호몰로그를 확인하는 것을 추가로 포함하는 방법.
22. 제 13항의 방법에 따라 확인된 유전적 변형자의 인간 호몰로그를 확인하는 것을 포함하는, APP 경로의 비정상 조절과 관련된 이상을 치료, 예방 또는 개선시키는 치료제를 개발하기 위한 표적을 확인하는 방법.
23. 제 22항에 있어서, 상기 이상이 알츠하이머병인 방법.
24. 제 22항에 있어서, 알츠하이머병에 유전적 연결성을 갖는 것으로 나타난 인간 염색체 10 상의 영역에 대해 지도화하는 유전적 변형자의 인간 호몰로그를 확인하는 것을 추가로 포함하는 방법.
25. hCP50765 (SEQ ID 35), 및 hCP41313 (Seq ID NO 15, SEQ ID N0 17 또는 SEQ ID NO 53)로 구성된 그룹으로부터 선택된 인간 서열에 의해 엔코드된 전사 인자에 의해 조절되는 경로 내에 수반되는 유전자를 확인하는 것을 포함하는, APP 경로의 비정상 조절과 관련된 이상을 치료, 예방 또는 개선시키는 치료제를 개발하기 위한 표적을 확인하는 방법.
26. 제 25항에 있어서, 상기 이상이 알츠하이머병인 방법.
27. (a) 그 게놈이 인간 APP의 A베타 부분을 포함하는 폴리펩티드를 엔코드하고, 신호 서열에 융합된, A베타40 (SEQ ID : NO 1) 또는 A베타42 (SEQ ID : NO 2)를 엔코드하고, 조직-특이적 발현 제어 서열에 작동적으로 연결된 DNA 서열을 포함하고 ; 이 초파리 내에서 이 DNA 서열이 변형된 표현형을 나타내는 것을 유도하도록 DNA 서열을 발현하는 형질전환 초파리를 제공하는 단계;

    (b) 후보 화합물을 상기 초파리에 투여하는 단계; 및

    (c) 상기 후보 화합물을 투여받지 않은 형질전환된 파리의 표현형과 비교하여 상기 초파리 내의 표현형의 변화를 평가하는 단계를 포함하는, A베타의 발현에 의해 유도된 표현형을 변형할 수 있는 화합물을 평가함으로써 APP 경로에 수반되는 유전자 산물에 작용하는 화합물을 확인하는 방법.
28. 제 27항에 있어서, 상기 이상이 알츠하이머병인 방법.
29. 제 27항에 있어서, 상기 DNA 서열은 A베타42을 엔코드하고, 조직 특이적 발현 제어 서열은 눈-특이적 프로모터 GMR를 포함하는 방법.
30. 제 29항에 있어서, 상기 DNA 서열의 발현은 "러프 아이" 표현형으로서 언급되는 변형된 표현형을 나타내는 파리를 유도하는 방법.
31. (a) 그 게놈이 인간APP(SEQ ID : NO 3)의 야생형 C99 부분 또는 신호 서열에 융합된 London 돌연변이(SEQ ID : NO 4)을 갖는 인간 APP의 C99 부분을 포함하는 폴리펩티드를 엔코드하고, 조직-특이적 발현 제어 서열에 기능적으로 연결된 DNA 서열을 포함하고 이 초파리 내에서 이 DNA 서열이 변형된 표현형을 나타내는 것을 유도하도록 DNA 서열을 발현시키는 형질전환 초파리를 제공하는 단계;

    (b)후보 화합물을 상기 초파리에 투여하는 단계; 및

    (c) 상기 후보 화합물을 투여받지 않은 형질전환된 파리의 표현형과 비교하여 상기 초파리 내의 표현형의 변화를 평가하는 단계를 포함하는, C99의 발현에 의해 유도된 표현형을 변형할 수 있는 화합물을 평가함으로써 APP 경로에 수반되는 유전자 산물에 작용하는 화합물을 확인하는 방법.
32. 제 31항에 있어서, 상기 이상이 알츠하이머병인 방법.
33. 제 31항에 있어서, 상기 DNA 서열은 야생형 C99을 엔코드하고, 조직 특이적 발현 제어 서열은 7B-Gal4 형질전환유전자에 의해 뇌 내에서 생성된 Gal4 유전자에 의해 활성화되는 UAS 제어 요소를 포함하는 방법.
34. 제 33항에 있어서, 상기 DNA 서열의 발현은 이동 결함에 의해 특징지워지는 변형된 표현형을 나타내는 파리를 유도하는 방법.
35. 제 31항에 있어서, 상기 DNA 서열은 야생형 C99 또는 London 돌연변이를 갖는 인간 APP의 C99 부분을 엔코드하고, 조직-특이적 발현 제어 서열은,apterous-Gal4 형질전환유전자에 의해 생성된 Gal4 단백질에 의해 활성화된 UAS 제어 요소를 포함하는 방법.
36. 제 35항에 있어서, 상기 이 DNA 서열의 발현은 "오목 날개" 표현형으로 불리는 변형된 표현형을 나타내는 파리를 유도하는 방법.
37. a) 알츠하이머병의 인 비트로 또는 인 비보 모델에 후보 화합물을 투여하는 단계; 및

    b) 제 9항의 방법에 따라 확인된 유전적 변형자의 호몰로그의 발현, 다백질 수준 또는 단백질 활성을 평가하는 단계를 포함하고, 여기서, 후보 화합물이 투여되지 않은 대조구 내의 수준과 비교되는 상기 상동체의 변화된 발현, 단백질 수준 또는 단백질 활성은 화합물의 잠재적 치료 지수를 나타내는, APP 경로의 비정상 조절과 관련된 이상의 치료, 예방 또는 개선에 유용한 화합물을 확인하는 방법.
38. a) 알츠하이머병의 인 비트로 또는 인 비보 모델에 후보 화합물을 투여하는 단계; 및

    b) 제 13항의 방법에 따라 확인된 유전적 변형자의 호몰로그의 발현, 단백질 수준 또는 단백질 활성을 평가하는 단계를 포함하고, 여기서, 후보 화합물이 투여되지 않은 대조구 내의 수준과 비교되는 상기 상동체의 변화된 발현, 단백질 수준 또는 단백질 활성은 화합물의 잠재적 치료 지수를 나타내는, APP 경로의 비정상 조절과 관련된 이상의 치료, 예방 또는 개선에 유용한 화합물을 확인하는 방법.
39. a) 알츠하이머병의 인 비트로 또는 인 비보 모델에 후보 화합물을 투여하는 단계; 및

    b) 표 1에 개시된 것으로 구성된 그룹으로부터 선택된 유전적 변형자의 호몰로그의 발현, 단백질 수준 또는 단백질 활성을 평가하는 단계를 포함하고, 여기서, 후보 화합물이 투여되지 않은 대조구 내의 수준과 비교되는 상기 상동체의 변화된 발현, 단백질 수준 또는 단백질 활성은 화합물의 잠재적 치료 지수를 나타내는, APP 경로의 비정상 조절과 관련된 이상의 치료, 예방 또는 개선에 유용한 화합물을 확인하는 방법.
40. 제 39항에 있어서, 상기 인간 호몰로그가 hCP50765, (SEQ ID 제 35), hCP41313 (SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 53), hCP33787 (SEQ ID NO 41) 및 hCP51594 (SEQ ID NO 43)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
41. 제 9항의 방법에 따라 확인된 유전적 변형자의 인간 호몰로그의 하나 이상의 유전자 또는 엔코드된 폴리펩티드의 발현 및/또는 기능을 저해 또는 촉진하는 화합물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는, APP 경로 내의 비정상 조절과 관련된 이상의 치료, 예방 또는 개선 방법.
42. 제 41항에 있어서, 상기 물질은 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법: 화합물, 삼중나선 DNA, 안티센스 올리고누클레오티드, 이중 가닥 RNA 분자 또는 리보자임, 여기서 상기 물질은 상기 유전적 변형자의 하나 이상의 인간 호몰로그의 발현을 저해하도록 설계된 방법.
43. 제 41항에 있어서, 상기 물질은 상기 유전적 변형자의 하나 이상의 인간 호몰로그에 의해 엔코드된 폴리펩티드에 관한 하나 이상의 항체 및/또는 그의 단편을 포함하는 방법.
44. 제 41항에 있어서, 상기 이상은 알츠하이머병을 포함하는 방법.
45. 제 13항의 방법에 따라 확인된 유전적 변형자의 인간 호몰로그의 하나 이상의 유전자 또는 엔코드된 폴리펩티드의 발현 및/또는 기능을 저해 또는 촉진하는 화합물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는, APP 경로 내의 비정상 조절과 관련된 이상의 치료, 예방 또는 개선 방법.
46. 제 45항에 있어서, 상기 물질은 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법: 화합물, 삼중나선 DNA, 안티센스 올리고누클레오티드, 이중 가닥 RNA 분자 또는 리보자임, 여기서 상기 물질은 상기 유전적 변형자의 하나 이상의 인간 호몰로그의 발현을 저해하도록 설계된 방법.
47. 제 45항에 있어서, 상기 물질은 상기 유전적 변형자의 하나 이상의 인간 호몰로그에 의해 엔코드된 폴리펩티드에 관한 하나 이상의 항체 및/또는 그의 단편을 포함하는 방법.
48. 제 45항에 있어서, 상기 이상은 알츠하이머병을 포함하는 방법.
49. 표 1에 개시된 것으로 구성된 그룹으로부터 선택된 유전적 변형자의 인간 호몰로그의 하나 이상의 유전자 또는 그의 엔코드된 폴리펩티드의 발현 및/또는 기능을 저해 또는 촉진하는 화합물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는, APP 경로 내의 비정상 조절과 관련된 이상의 치료, 예방 또는 개선 방법.
50. 제 49항에 있어서, 상기 물질은 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법: 화합물, 삼중나선 DNA, 안티센스 올리고누클레오티드, 이중 가닥 RNA 분자 또는 리보자임, 여기서 상기 물질은 상기 유전적 변형자의 하나 이상의 인간 호몰로그의 발현을 저해하도록 설계된 방법.
51. 제 49항에 있어서, 상기 물질은 상기 유전적 변형자의 하나 이상의 인간 호몰로그에 의해 엔코드된 폴리펩티드에 관한 하나 이상의 항체 및/또는 그의 단편을 포함하는 방법.
52. 제 49항에 있어서, 상기 인간 호몰로그가 hCP50765, (SEQ ID 제 35), hCP41313 (SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 53), hCP33787 (SEQ ID NO 41) 및 hCP51594 (SEQ ID NO 43)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
53. 제 49항에 있어서, 상기 이상은 알츠하이머병을 포함하는 방법.
54. 제 9항의 방법에 따라 확인된 유전적 변형자의 인간 호몰로그의 하나 이상의 유전자 또는 엔코드된 폴리펩티드의 발현 및/또는 기능을 저해 또는 촉진하는 화합물의 치료적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는, APP 경로 내의 비정상 조절과 관련된 이상의 치료, 예방 또는 개선 방법.
55. 제 54항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 상기 유전적 변형자의 하나 이상의 인간 호몰로그의 발현을 저해하도록 설계되고, 화합물, 삼중나선 DNA, 안티센스 올리고누클레오티드, 이중 가닥 RNA 분자 또는 리보자임으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 물질을 치료적 유효량만큼 포함하는 방법.
56. 제 54항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 상기 유전적 변형자의 하나 이상의 인간 호몰로그에 의해 엔코드된 폴리펩티드에 관한 하나 이상의 항체 및/또는 그의 단편을 치료적 유효량만큼 포함하는 방법.
57. 제 54항에 있어서, 상기 이상은 알츠하이머병을 포함하는 방법.
58. 제 13항의 방법에 따라 확인된 유전적 변형자의 인간 호몰로그의 하나 이상의 유전자 또는 엔코드된 폴리펩티드의 발현 및/또는 기능을 저해 또는 촉진하는 화합물의 치료적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는, APP 경로 내의 비정상 조절과 관련된 이상의 치료, 예방 또는 개선 방법.
59. 제 58항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 의 하나 이상의 인간 호몰로그의 발현을 저해하도록 설계되고, 화합물, 삼중나선 DNA, 안티센스 올리고누클레오티드, 이중 가닥 RNA 분자 또는 리보자임으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 물질을 치료적 유효량만큼 포함하는 방법.
60. 제 58항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 상기 유전적 변형자의 하나 이상의 인간 호몰로그에 의해 엔코드된 폴리펩티드에 관한 하나 이상의 항체 및/또는 그의 단편을 치료적 유효량만큼 포함하는 방법.
61. 제 58항에 있어서, 상기 이상은 알츠하이머병을 포함하는 방법.
62. 표 1에 개시된 것으로 구성된 그룹으로부터 선택된 인간 호몰로그의 하나 이상의 유전자 또는 엔코드된 폴리펩티드의 발현 및/또는 기능을 저해 또는 촉진하는 화합물의 치료적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에투여하는 것을 포함하는, APP 경로 내의 비정상 조절과 관련된 이상의 치료, 예방 또는 개선 방법.
63. 제 62항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 의 하나 이상의 인간 호몰로그의 발현을 저해하도록 설계되고, 화합물, 삼중나선 DNA, 안티센스 올리고누클레오티드, 이중 가닥 RNA 분자 또는 리보자임으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 물질을 치료적 유효량만큼 포함하는 방법.
64. 제 62항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 상기 유전적 변형자의 하나 이상의 인간 호몰로그에 의해 엔코드된 폴리펩티드에 관한 하나 이상의 항체 및/또는 그의 단편을 치료적 유효량만큼 포함하는 방법.
65. 제 62항에 있어서, 상기 이상은 알츠하이머병을 포함하는 방법.
66. 제 62항에 있어서, 상기 인간 호몰로그가 hCP50765, (SEQ ID 제 35), hCP41313 (SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 53), hCP33787 (SEQ ID NO 41) 및 hCP51594 (SEQ ID NO 43)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
67. 제 66항에 있어서, 상기 이상은 알츠하이머병을 포함하는 방법.
68. 제 9항의 방법에 따라 확인된 유전적 변형자의 인간 호몰로그의 하나 이상의 유전자 또는 그의 엔코드된 폴리펩티드의 발현 및/또는 기능을 저해 또는 촉진하는 화합물을, APP 경로 내의 비정상 조절과 관련된 이상의 치료, 예방 또는 개선에 유효한 양으로 포함하는 약제학적 조성물.
69. 제 68항에 있어서, 하나 이상의 인간 호몰로그의 발현을 저해하도록 설계되고, 화합물, 삼중나선 DNA, 안티센스 올리고누클레오티드, 이중 가닥 RNA 분자 또는 리보자임으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 물질을 포함하는 약제학적 조성물.
70. 제 68항에 있어서, 상기 유전적 변형자의 하나 이상의 인간 호몰로그에 의해 엔코드된 폴리펩티드에 관한 하나 이상의 항체 및/또는 그의 단편을 포함하는 약제학적 조성물.
71. 제 68항에 있어서, 상기 이상은 알츠하이머병인 약제학적 조성물.
72. 제 13항의 방법에 따라 확인된 유전적 변형자의 인간 호몰로그의 하나 이상의 유전자 또는 그의 엔코드된 폴리펩티드의 발현 및/또는 기능을 저해 또는 촉진하는 화합물을, APP 경로 내의 비정상 조절과 관련된 이상의 치료, 예방 또는 개선에 유효한 양으로 포함하는 약제학적 조성물.
73. 제 72항에 있어서, 상기 유전적 변형자의 하나 이상의 인간 호몰로그의 발현을 저해하도록 설계되고, 화합물, 삼중나선 DNA, 안티센스 올리고누클레오티드, 이중 가닥 RNA 분자 또는 리보자임으로 구성된 그룹으로부터 선택된 물질을 포함하는 약제학적 조성물.
74. 제 72항에 있어서, 상기 유전적 변형자의 하나 이상의 인간 호몰로그에 의해 엔코드된 폴리펩티드에 관한 하나 이상의 항체 및/또는 그의 단편을 포함하는 약제학적 조성물.
75. 제 72항에 있어서, 상기 이상은 알츠하이머병인 약제학적 조성물.
76. 표 1에 개시된 것으로부터 선택된 인간 호몰로그의 하나 이상의 유전자 또는 그의 엔코드된 폴리펩티드의 발현 및/또는 기능을 저해 또는 촉진하는 화합물을, APP 경로 내의 비정상 조절과 관련된 이상의 치료, 예방 또는 개선에 유효한 양으로 포함하는 약제학적 조성물.
77. 제 76항에 있어서, 상기 유전적 변형자의 하나 이상의 인간 호몰로그의 발현을 저해하도록 설계되고, 화합물, 삼중나선 DNA, 안티센스 올리고누클레오티드, 이중 가닥 RNA 분자 또는 리보자임으로 구성된 그룹으로부터 선택된 물질을 포함하는 약제학적 조성물.
78. 제 76항에 있어서, 상기 유전적 변형자의 하나 이상의 인간 호몰로그에 의해 엔코드된 폴리펩티드에 관한 하나 이상의 항체 및/또는 그의 단편을 포함하는 약제학적 조성물.
79. 제 68항에 있어서, 상기 이상이 알츠하이머병인 약제학적 조성물.
80. 제 76항에 있어서, 상기 인간 호몰로그가 hCP50765, (SEQ ID 제 35), hCP41313 (SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 53), hCP33787 (SEQ ID NO 41) 및 hCP51594 (SEQ ID NO 43)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
81. 제 80항에 있어서, 상기 이상이 알츠하이머병인 약제학적 조성물.
82. 다음 단계를 포함하는, APP 경로 내의 비정상 조절과 관련된 이상의 치료, 예방 또는 개선 방법:

    (a) 개체 내에서, 제 9항의 방법에 따라 확인된 유전적 변형자의 인간 호몰로그의 mRNA 및/또는 단백질 수준을 평가하는 단계; 및,

    (b) 대조구와 비교하여 비정상 mRNA 및/또는 단백질 수준을 갖는 개체에, 상기 이상의 병리학적 현상을 치료 또는 개선하는데 효과적인 양의 물질을 투여하는 단계.
83. 제 82항에 있어서, 상기 이상이 알츠하이머병인 방법.
84. 다음 단계를 포함하는, APP 경로 내의 비정상 조절과 관련된 이상의 치료, 예방 또는 개선 방법:

    (a) 개체 내에서, 제 13항의 방법에 따라 확인된 유전적 변형자의 인간 호몰로그의 mRNA 및/또는 단백질 수준을 평가하는 단계; 및,

    (b) 대조구와 비교하여 비정상 mRNA 및/또는 단백질 수준을 갖는 개체에, 상기 이상의 병리학적 현상을 치료 또는 개선하는데 효과적인 양의 물질을 투여하는 단계.
85. 제 84항에 있어서, 상기 이상이 알츠하이머병인 방법.
86. 다음 단계를 포함하는, APP 경로 내의 비정상 조절과 관련된 이상의 치료, 예방 또는 개선 방법:

    (a) 개체 내에서, 표 1에 개시된 것으로 구성된 그룹으로부터 선택된 유전적 변형자의 인간 호몰로그의 mRNA 및/또는 단백질 수준을 평가하는 단계; 및,

    (b) 대조구와 비교하여 비정상 mRNA 및/또는 단백질 수준을 갖는 개체에, 상기 이상의 병리학적 현상을 치료 또는 개선하는데 효과적인 양의 물질을 투여하는 단계.
87. 제 86항에 있어서, 상기 이상이 알츠하이머병인 방법.
88. 제 86항에 있어서, 상기 인간 호몰로그가 hCP50765, (SEQ ID 제 35), hCP41313 (SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 53), hCP33787 (SEQ ID NO 41) 및 hCP51594 (SEQ ID NO 43)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
89. 제 88항에 있어서, 상기 이상은 알츠하이머인 방법.
90. (a) 유전자 변형자의 인간 호몰로그의 폴리누클레오티드;

    (b) 상기 (a)에 대해 상보적인 누클레오티드 서열;

    (c) 유전적 변형자의 인간 호몰로그의 폴리펩티드, 또는 그의 단편; 또는

    (d) 상기 폴리펩티드에 대한 항체

    를 포함하고, 성분 (a), (b), (c) 또는 (d)는 상당한 성분을 포함하는, 생물학적 샘플 내에서, 제 9항의 방법에 따라 확인된 유전적 변형자의 인간 호몰로그의 mRNA 수준 및/또는 단백질 수준을 검출하기 위한 진단용 키트.
91. (a) 유전자 변형자의 인간 호몰로그의 폴리누클레오티드;

    (b) 상기 (a)에 대해 상보적인 누클레오티드 서열;

    (c) 유전적 변형자의 인간 호몰로그의 폴리펩티드, 또는 그의 단편; 또는

    (d) 상기 폴리펩티드에 대한 항체

    를 포함하고, 성분 (a), (b), (c) 또는 (d)는 상당한 성분을 포함하는, 생물학적 샘플 내에서, 제 13항의 방법에 따라 확인된 유전적 변형자의 인간 호몰로그의 mRNA 수준 및/또는 단백질 수준을 검출하기 위한 진단 키트.
92. (a) 유전자 변형자의 인간 호몰로그의 폴리누클레오티드;

    (b) 상기 (a)에 대해 상보적인 누클레오티드 서열;

    (c) 유전적 변형자의 인간 호몰로그의 폴리펩티드, 또는 그의 단편; 또는

    (d) 상기 폴리펩티드에 대한 항체

    를 포함하고, 성분 (a), (b), (c) 또는 (d)는 상당한 성분을 포함하는, 생물학적 샘플 내에서, 표 1에 개시된 것으로 구성된 그룹으로부터 선택된 유전적 변형자의 인간 호몰로그의 mRNA 수준 및/또는 단백질 수준을 검출하기 위한 진단 키트.
93. 제 92항에 있어서, 상기 인간 호몰로그가 hCP50765, (SEQ ID 제 35), hCP41313 (SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 53), hCP33787 (SEQ ID NO 41) 및 hCP51594 (SEQ ID NO 43)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 진단 키트.
94. 다음 단계를 포함하는 APP 경로의 비정상 조절과 관련된 이상을 격는 개체를 진단하는 방법: 개체로부터의 생물학적 샘플 내에서, 제 9항의 방법에 따라 확인된유전적 변형자의 하나 이상의 호몰로그의 mRNA 수준 및/또는 이에 의해 엔코드된 폴리펩티드의 활성을 측정하는 단계, 여기서 대조 개체 내의 수준에 대해 상대적으로 비정상 수준은 상기 이상을 진단함.
95. 제 94항에 있어서, 상기 이상이 알츠하이머병인 방법.
96. 다음 단계를 포함하는 APP 경로의 비정상 조절과 관련된 이상을 격는 개체를 진단하는 방법: 개체로부터의 생물학적 샘플 내에서, 제 13항의 방법에 따라 확인된 유전적 변형자의 하나 이상의 호몰로그의 mRNA 수준 및/또는 이에 의해 엔코드된 폴리펩티드의 활성을 측정하는 단계, 여기서 대조 개체 내의 수준에 대해 상대적으로 비정상 수준은 상기 이상을 진단함.
97. 제 96항에 있어서, 상기 이상이 알츠하이머병인 방법.
98. 다음 단계를 포함하는 APP 경로의 비정상 조절과 관련된 이상을 격는 개체를 진단하는 방법: 개체로부터의 생물학적 샘플 내에서, 표 1에 개시된 것으로 구성된 그룹으로부터 선택된 유전적 변형자의 하나 이상의 호몰로그의 mRNA 수준 및/또는 이에 의해 엔코드된 폴리펩티드의 활성을 측정하는 단계, 여기서 대조 개체 내의 수준에 대해 상대적으로 비정상 수준은 상기 이상을 진단함.
99. 제 98항에 있어서, 상기 이상이 알츠하이머병인 방법.
100. 제 98항에 있어서, 상기 인간 호몰로그가 hCP50765, (SEQ ID 제 35), hCP41313 (SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 53), hCP33787 (SEQ ID NO 41) 및 hCP51594 (SEQ ID NO 43)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
101. 제 100항에 있어서, 상기 이상은 알츠하이머인 방법.
102. 제 9항의 방법에 따라 확인된 유전적 변형자의 하나 이상의 인간 호몰로그를 엔코드하는 핵산을 이를 필요로 하는 개체의 하나 이상의 조직 내로 도입하여 이 핵산에 의해 엔코드된 하나 이상의 단백질을 개체 내에서 세포에 의해 발현 및/또는 분비시키는 것을 포함하는, APP 경로의 비정상 조절과 관련된 이상을 치료, 예방 또는 개선하는 방법.
103. 제 102항에 있어서, 상기 이상은 알츠하이머인 방법.
104. 제 13항의 방법에 따라 확인된 유전적 변형자의 하나 이상의 인간 호몰로그를 엔코드하는 핵산을 이를 필요로 하는 개체의 하나 이상의 조직 내로 도입하여 이 핵산에 의해 엔코드된 하나 이상의 단백질을 개체 내에서 세포에 의해 발현 및/또는 분비시키는 것을 포함하는, APP 경로의 비정상 조절과 관련된 이상을 치료,예방 또는 개선하는 방법.
105. 제 104항에 있어서, 상기 이상은 알츠하이머인 방법.
106. 표 1에 개시된 것으로 구성된 그룹으로부터 선택된 유전적 변형자의 하나 이상의 인간 호몰로그를 엔코드하는 핵산을 이를 필요로 하는 개체의 하나 이상의 조직 내로 도입하여 이 핵산에 의해 엔코드된 하나 이상의 단백질을 개체 내에서 세포에 의해 발현 및/또는 분비시키는 것을 포함하는, APP 경로의 비정상 조절과 관련된 이상을 치료, 예방 또는 개선하는 방법.
107. 제 106항에 있어서, 상기 이상은 알츠하이머인 방법.
108. 제 106항에 있어서, 상기 인간 호몰로그가 hCP50765, (SEQ ID 제 35), hCP41313 (SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 53), hCP33787 (SEQ ID NO 41) 및 hCP51594 (SEQ ID NO 43)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
109. 제 108항에 있어서, 상기 이상은 알츠하이머인 방법.