PT1324652E - Drosophila melanogaster transgénica expressando beta-amilóide - Google Patents

Description

ΡΕ1324652 1 DESCRIÇÃO "DROSOPHILA MELANOGASTER TRANSGÉNICA EXPRESSANDO BETA-AMILOIDE"

ANTECEDENTES DO INVENTO A doença de Alzheimer (DA) é um distúrbio neurológico que resulta na degeneração e eventual morte de neurónios em centros do cérebro que controlam a memória, a cognição e o comportamento. A caracteristica principal da doença é a formação de depósitos insolúveis de amilóide (placas senis), cujo componente principal é o péptido beta-amilóide (Αβ) de 40/42 aminoácidos, um produto proteolitico da proteina precursora amilóide (APP). Crê-se geralmente que estas placas sejam os principais agentes causadores que conduzem à degeneração e morte das células neuronais.

Os três genes principais conhecidos associados à hereditariedade da doença de Alzheimer familiar (DAF) nos seres humanos são o receptor transmembranar proteína precursora amilóide (APP) e os dois genes de presenilina (PS1 e PS2). Mutações "missense" (de sentido errado) nestes genes resultam numa maior produção do péptido Αβ, sublinhando a importância deste péptido na contribuição para o estado de doença. A APP é clivada em dois locais, beta e gama, para libertar um péptido de 40/42 aminoácidos, 2 ΡΕ1324652 Αβ (revisto em Mills, J. e Reiner, P.B., J. Neurochem. 72: 443-460, 1999) . Mutações "missense" em APP perto do local gama (Goate, A. et al., Nature 349: 704-706, 1991), onde a extremidade C-terminal do péptido é clivada, resultam na produção de mais Αβ 42, através da alteração da proporção de 40/42 (Suzuki, N., et al. Science 264: 1336-1340, 1994). Mutações em torno do local beta resultam em mais produção global de ambas as formas (Mullan, M., et al., Nat. Genet. 1: 345-347, 1992; Citron, M. et al. Neuron 14: 661-670, 1995).

As presenilinas são proteínas transmembranares de passagem múltipla, cujas funções são actualmente matéria de debate. Mutações "missense" nas presenilinas aumentam a libertação da forma Αβ 42 (Borchelt, D.R., et al. Neuron 17: 1005-1013, 1996; Citron, M., et al. Nat. Med. 3: 67-72, 1997; Murayama, O. et al. Neurosci. Lett. 265: 61-63, 1999) e contribuem para a maioria dos casos de DAF (Sherrington, R., et al. Nature 375: 754-760, 1995).

Muitos estudos examinaram os papéis das formas solúvel e insolúvel (agregada) de Αβ e crê-se amplamente que a forma agregada do péptido seja responsável pelos efeitos tóxicos observados (Pike, C.J., et al., J. Neurosci. 13: 1676-1687, 1993; Lorenzo, A. e Yankner, B.A., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 12243-12247, 1994; Giovannelli, L., et al., Neurosci. 87: 349-357, 1998). Existem vários mecanismos que contribuem para a morte de neurónios induzida por Αβ, incluindo a destruição dos 3 ΡΕ1324652 níveis de cálcio intracelular (para revisões, ver Fraser, S.P., et al. Trends Neurosci. 20: 67-72, 1997; Mattson, M.P., Physiol . Rev. 77: 1081-1132, 1997; Coughlan, C.M. e Breen, K.C., Pharmacol. and Ther. 86: 111-144, 2000), a indução de uma resposta inflamatória causada pela activação de células da microglia (revisto em Coughlan, C.M. e Breen, K.C., Pharmacol. and Ther. 86: 111-144, 2000) e a marcada degeneração e/ou destruição do sistema colinérgico basal-prosencéfalo, que está envolvido na aprendizagem e na memória (revisto em Hellstrõm-Lindahl e Court, Behav. Brain Res. 113(1-2): 159-68, 2000). Assim, é claro que os efeitos deletérios da sobreprodução de Αβ e sua contribuição para a DA são numerosos e complexos.

Embora tenha sido dedicada muita investigação ao estudo da Doença de Alzheimer e à sua patologia geral, a análise genética de distúrbios neurodegenerativos humanos é limitada. Em consequência, os acontecimentos que provocam a acumulação de beta-amilóide, assim como o papel exacto de genes tais como APP e outros suspeitos de terem um papel na Doença de Alzheimer, estão mal compreendidos.

Numerosas contribuições para o estabelecimento do papel central de Αβ na manifestação e progressão da DA vieram de estudos em sistemas modelo. Ratinhos transgénicos expressando formas de tipo selvagem ou formas mutantes de APP exibem patologia de DA, em muitos casos desenvolvendo placas de amilóide de um modo dependente da idade e nalguns casos apresentando comportamento e cognição alterados (para 4 ΡΕ1324652 revisões, ver Price, D.L., et al., Annu. Rev. Genet. 32: 461-493, 1998; van Leuven, F., Progress in Neurobiol. 61: 305-312, 2000). Ratinhos transgénicos expressando somente o péptido Αβ 42 exibem extensa degeneração nervosa em regiões do cérebro normalmente afectadas em DA, e 50% morre aos 12 meses de idade (LaFerla, F.M. et al., Nature Genet. 9: 21-30, 1995). As células neurais destes ratinhos eventualmente sofrem apoptose, seguida de astrogliose e espongiose. Isto demonstra que expressão de Αβ 42 é tóxica in vivo e resulta em degeneração e apoptose neuronais. A utilização de Drosophila como organismo modelo provou ser uma ferramenta importante na elucidação das vias de doenças neurodegenerativas humanas (revisto em Fortini, M. e Bonini, N., Trends Genet. 16: 161-167, 2000), uma vez que o genoma de Drosophila contém muitos ortólogos humanos relevantes que estão extremamente bem conservados na função (Rubin, G.M., et al., Science 287: 2204-15, 2000). Por exemplo, a Drosophila melanogaster possui um gene que é homólogo ao APP humano que está envolvido na função do sistema nervoso. O gene, "APP-like" {Appl, semelhante a APP), é aproximadamente 40% idêntico à isoforma neurogénica (695) do gene APP humano ao longo de três grandes domínios (Rosen et al., PNAS USA 86: 2478-2482, 1988) e, tal como o APP695 humano, é exclusivamente expresso no sistema nervoso. As moscas deficientes para o gene Appl mostram defeitos comportamentais que podem ser recuperados pelo gene humano APP, sugerindo que os dois genes possuem funções semelhantes nos dois organismos (Luo et al., Neuron 9: 595-605, 1992) . 5 ΡΕ1324652

Adicionalmente, modelos de Drosophila de doenças de repetição de poliglutamina (Jackson, G.R. et al., Neuron 21: 633-642, 1998; Kazemi-Esfarjani, P. e Benzer, S., Science 287: 1837-1840, 2000; Fernandez-Funez et al., Nature 408(6808): 101-6, 2000), e da doença de Parkinson (Feany, M.B. e Bender, W.W., Nature 404: 394-398, 2000) imitam muito bem o estado de doença nos seres humanos, tanto ao nivel celular como ao nivel fisiológico e foram utilizados com sucesso para identificar outros genes que têm um papel nestas doenças. Assim, o poder da Drosophila como sistema modelo é demonstrado na capacidade para representar o estado da doença e executar pesquisas genéticas em larga escala.

Este invento refere-se geralmente a um método para identificar compostos e genes que actuem na via de APP em Drosophila melanogaster transgénica expressando ectopicamente genes relacionados com DA. A expressão destes transgenes pode induzir fenótipos visíveis e é aqui contemplado que as pesquisas genéticas aqui divulgadas podem ser utilizadas para identificar genes envolvidos na via de APP através da identificação de mutações que modificam os fenótipos visíveis induzidos. Os genes afecta-dos por estas mutações serão aqui chamados "modificadores genéticos". É aqui contemplado que os homólogos humanos dos modificadores genéticos assim identificados seriam alvos úteis para o desenvolvimento de produtos terapêuticos para tratar condições associadas a anomalias na via de APP, 6 ΡΕ1324652 incluindo, mas não se limitando ao desenvolvimento de terapêuticos para a Doença de Alzheimer (DA). É também aqui contemplado que alguns destes homólogos humanos podem ocorrer numa área do cromossoma 10 humano, que se mostrou estar ligada à doença de Alzheimer (Bertram et al., Ertekin-Taner et al., Myers et al., Science 290: 2302-2305, 2000). Tais homólogos humanos podem ter o potencial para estar geneticamente ligados à DA e servir como marcadores para a DA ou como alvos para o desenvolvimento de terapêuticos para tratar condições associadas a anomalias na via de APP, incluindo, mas não se limitando ao desenvolvimento de terapêuticos para a Doença de Alzheimer (DA) . Tais homólogos humanos podem também actuar em vias celulares envolvendo genes ligados à DA e estes homólogos humanos podem ser utilizados para identificar os genes nestas vias.

SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento refere-se a uma mosca transgénica cujo genoma compreende uma sequência de ADN codificando um polipéptido compreendendo a porção Abeta da APP humana em que a referida sequência de ADN codifica Abeta40 (SEQ ID NO: 1) ou Abeta42 (SEQ ID NO: 2), fundidas a uma sequência sinal, estando a referida sequência de ADN operativamente ligada a uma sequência de controlo da expressão especifica de tecido; e expressão da referida sequência de ADN, em que a expressão da referida sequência de ADN resulta na referida mosca apresentar um fenótipo 7 ΡΕ1324652 alterado. Numa concretização particular, a sequência de ADN codifica Abeta42, a sequência de controlo da expressão especifica de tecido compreende o promotor especifico do olho GMR e a expressão da sequência de ADN resulta num fenótipo alterado referido como o fenótipo "olho rugoso" ("rough eye"). É também divulgada uma mosca transgénica cujo genoma compreende uma sequência de ADN codificando um polipéptido compreendendo a porção C99 de tipo selvagem da APP humana (SEQ ID NO: 3) ou a porção C99 da APP humana com a Mutação London (SEQ ID NO: 4) fundida a uma sequência sinal, estando a referida sequência de ADN operativamente ligada a uma sequência de controlo especifica de tecido; e expressão da referida sequência de ADN, em que a expressão da referida sequência de ADN resulta na referida mosca apresentar um fenótipo alterado. Numa concretização, a sequência de ADN codifica a C99 de tipo selvagem, a sequência de controlo da expressão especifica de tecido é o elemento de controlo UAS, que é activado pela proteína Gal4 produzida no cérebro pelo transgene 7B-Gal4 e a expressão da sequência de ADN resulta num fenótipo alterado caracterizado por um defeito locomotor. Noutra concretização particular, a sequência de ADN codifica a porção C99 de tipo selvagem ou a C99 da APP humana com a Mutação London, a sequência de controlo da expressão específica de tecido é o elemento do controlo UAS activado pela proteína Gal4 produzida pelo transgene apterous-Gal4 e a expressão da sequência de ADN resulta num fenótipo ΡΕ1324652 alterado referido como o fenótipo da "asa côncava" ("concave wing").

Noutro aspecto, o invento refere-se a um método para identificar modificadores genéticos da via de APP, compreendendo o referido método o proporcionar de uma mosca transgénica cujo genoma compreenda uma sequência de ADN codificando um polipéptido compreendendo a porção Abeta da APP humana em que a referida sequência de ADN codifica

Abeta40 (SEQ ID NO: 1) ou Abeta42 (SEQ ID NO: 2), fundida a uma sequência sinal, estando a referida sequência de ADN operativamente ligada a uma sequência de controlo da expressão especifica de tecido; e expressão da referida sequência de ADN, em que a expressão da referida sequência de ADN resulta na referida mosca apresentar um fenótipo alterado; cruzamento da referida mosca transgénica com uma mosca contendo uma mutação num gene conhecido ou previsto; e pesquisa na descendência dos referidos cruzamentos quanto a moscas que possuam a referida sequência de ADN e a referida mutação e apresentem uma expressão modificada do fenótipo transgénico em comparação com os controlos. Numa concretização, a sequência de ADN codifica Abeta42, a sequência de controlo da expressão especifica de tecido compreende o promotor especifico do olho GMR e a expressão da referida sequência de ADN resulta na referida mosca apresentar um fenótipo alterado referido como o fenótipo do "olho rugoso". É também divulgado um método para identificar 9 ΡΕ1324652

modificadores genéticos da via de APP, compreendendo o referido método: proporcionar uma mosca transgénica cujo genoma compreenda uma sequência de ADN codificando um polipéptido compreendendo a porção C99 de tipo selvagem da APP humana (SEQ ID NO: 3) ou a porção C99 da APP humana com a Mutação London (SEQ ID NO: 4) fundida a uma sequência sinal, estando a referida sequência de ADN operativamente ligada a uma sequência de controlo da expressão especifica de tecido; e expressão da referida sequência de ADN, em que a referida expressão da referida sequência de ADN resulta na referida mosca apresentar um fenótipo alterado; cruzamento da referida mosca transgénica com uma mosca contendo uma mutação num gene conhecido ou previsto; e, pesquisa da descendência dos referidos cruzamentos quanto a moscas que possuam a referida sequência de ADN e a referida mutação e apresentem expressão modificada do fenótipo transgénico em comparação com os controlos. Numa concretização, a sequência de ADN codifica a C99 de tipo selvagem, a sequência de controlo da expressão especifica de tecido é o elemento de controlo UAS, activado pela proteina Gal4 produzida no cérebro pelo transgene 7B-Gal4 e a expressão da referida sequência de ADN resulta na referida mosca apresentar um fenótipo alterado caracterizado por um defeito locomotor. Noutra concretização, a sequência de ADN codifica a porção C99 de tipo selvagem ou a C99 da APP humana com a Mutação London, a sequência de controlo da expressão especifica de tecido é o elemento de controlo UAS activado pela proteina Gal4 produzida pelo transgene apterous-Gal4 e a expressão da referida sequência de ADN 10 ΡΕ1324652 resulta na referida mosca apresentar um fenótipo alterado referido como o fenótipo da "asa côncava".

Um outro aspecto do invento refere-se a um método para identificar compostos que actuem sobre produtos génicos envolvidos na via de APP através de ensaio de compostos que possam modificar os fenótipos induzidos pela expressão de Abeta, compreendendo o referido método: proporcionar uma mosca transgénica cujo genoma compreenda uma sequência de ADN codificando um polipéptido compreendendo a porção Abeta do APP humano em que a referida sequência de ADN codifica Abeta40 (SEQ ID NO: 1) ou Abeta42 (SEQ ID NO: 2), fundida a uma sequência sinal, estando a referida sequência de ADN operativamente ligada a uma sequência de controlo da expressão especifica de tecido; e expressão da referida sequência de ADN, em que a expressão da sequência de ADN resulta na referida mosca apresentar um fenótipo alterado; administração de um composto candidato à referida mosca; e, ensaio quanto a alterações no fenótipo da referida mosca em comparação com o fenótipo de uma mosca transgénica semelhante à qual não foi administrado o composto candidato. Numa concretização, a sequência de ADN codifica Abeta42, a sequência de controlo da expressão especifica de tecido é o promotor especifico do olho GMR e a expressão da referida sequência de ADN resulta na referida mosca apresentar um fenótipo alterado referido como o fenótipo do "olho rugoso". É divulgado também um método para identificar 11 ΡΕ1324652 compostos que actuem sobre produtos génicos envolvidos na via de APP através de ensaio de compostos que possam modificar os fenótipos induzidos pela expressão de C99, compreendendo o referido método: proporcionar uma mosca transgénica cujo genoma compreenda uma sequência de ADN codificando um polipéptido compreendendo a porção C99 de tipo selvagem do APP humano (SEQ ID NO: 3) ou a porção C99 do APP humano com a Mutação London (SEQ ID NO: 4) fundida a uma sequência sinal, estando a referida sequência de ADN operativamente ligada a uma sequência de controlo da expressão especifica de tecido; e expressão da referida sequência de ADN, em que a expressão da referida sequência de ADN resulta na referida mosca apresentar um fenótipo alterado; administração de um composto candidato à referida mosca; e, ensaio quanto a mudanças no fenótipo da referida mosca em comparação com o fenótipo de uma mosca transgénica semelhante à qual não foi administrado o composto candidato. Numa concretização, a sequência de ADN codifica C99 de tipo selvagem, a sequência de controlo da expressão especifica de tecido é o elemento de controlo UAS activado pela proteina Gal4 produzida no cérebro pelo transgene 7B-Gal4 e a expressão da referida sequência de ADN resulta na referida mosca apresentar um fenótipo caracterizado como um defeito locomotor. Noutra concretização, a sequência de ADN codifica a porção C99 de tipo selvagem ou C99 do APP humano com a Mutação London, a sequência de controlo da expressão especifica de tecido é o elemento de controlo UAS activado pela proteina Gal4 produzida pelo transgene apterous-Gal4 e a expressão da referida sequência de ADN resulta na 12 ΡΕ1324652 referida mosca apresentar um fenótipo alterado referido como fenótipo de "asa côncava". 0 invento permite um método para identificar genes envolvidos no estabelecimento ou na progressão das condições associadas à regulação anormal da via de APP, incluindo mas não se limitando à Doença de Alzheimer, e cujos produtos proteicos podem servir como potenciais marcadores para a Doença de Alzheimer, compreendendo o referido método a identificação de homólogos humanos dos genes da mosca que foram identificados como modificadores genéticos de acordo com os métodos do presente invento.

Noutro aspecto, o invento permite um método para identificar genes envolvidos no estabelecimento ou na progressão das condições associadas à regulação anormal da via de APP, incluindo mas não se limitando à Doença de Alzheimer, e cujos produtos proteicos podem servir como potenciais marcadores para a Doença de Alzheimer, compreendendo o referido método a identificação de homólogos humanos dos genes modificadores genéticos da mosca que estão situados próximo da área do cromossoma 10 humano que foi mostrado ter ligação genética à Doença de Alzheimer. É também divulgado um método para identificar genes envolvidos no estabelecimento ou na progressão da Doença de Alzheimer e cujos produtos proteicos podem servir como potenciais marcadores para a DA, compreendendo o referido método a identificação de genes que estão 13 ΡΕ1324652 envolvidos nas vias reguladas pelos factores de transcrição codificados pelas sequências humanas hCP50765 (SEQ ID NO: 35, codificada pelo gene EGR2) e hCP41313 (SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 53, codificadas pelo homólogo humano do gene de nocA de Drosófila), sequências humanas estas que estão situadas próximo da área do cromossoma 10 humano que foi mostrado ter ligação genética à Doença de Alzheimer.

Ainda noutro aspecto, a presente divulgação refere-se a um método para identificar compostos úteis para o tratamento, prevenção ou melhoria das condições patológicas associadas a defeitos na via de APP, incluindo mas não se limitando à Doença de Alzheimer, compreendendo a administração de compostos candidatos a um modelo in vitro ou in vivo da Doença de Alzheimer; e ensaio das mudanças na expressão de um homólogo genético de um modificador genético, em que a expressão alterada de qualquer um dos referidos homólogos em comparação com os níveis num controlo ao qual não foi administrado um composto candidato indica um composto de potencial valor terapêutico. É também divulgado um método para o tratamento, prevenção ou melhoria das condições patológicas associadas a defeitos na via de APP, incluindo, mas não se limitando à Doença de Alzheimer, compreendendo a administração a um sujeito necessitado desta de uma quantidade terapeutica-mente eficaz de um composto que possa inibir ou promover a função de qualquer um ou mais dos polipéptidos codificados 14 ΡΕ1324652 pelos homólogos humanos dos modificadores genéticos aqui identificados. É também divulgado um método para o tratamento, prevenção ou melhoria das condições patológicas associadas a defeitos na regulação da via de APP, incluindo mas não se limitando à Doença de Alzheimer, compreendendo a administração a um sujeito necessitado desta de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo qualquer uma ou mais das substâncias selec-cionadas de entre o grupo que consiste em: ADN de tripla hélice, oligonucleótidos anti-sentido ou ribozimas, todos complementares à sequência apropriada de um ARNm que derive de qualquer um ou mais dos homólogos humanos dos genes modificadores genéticos identificados de acordo com os métodos do presente invento. É também divulgado um método para o tratamento, prevenção ou melhoria de condições patológicas associadas a defeitos na regulação da via de APP, incluindo mas não se limitando à Doença de Alzheimer, compreendendo a administração a um sujeito necessitado desta de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo moléculas de ARN de cadeia dupla dirigidas a um ou mais dos homólogos humanos dos modificadores genéticos identificados de acordo com os métodos do presente invento. É também divulgado um método para o tratamento, 15 ΡΕ1324652 prevenção ou melhoria de condições patológicas associadas a defeitos na via de APP, incluindo mas não se limitando à Doença de Alzheimer, compreendendo a administração a um sujeito necessitado desta de uma quantidade terapeutica-mente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou anticorpos e/ou fragmentos destes dirigidos ao polipéptido codificado por qualquer um ou mais dos homólogos humanos dos modificadores genéticos identificados de acordo com os métodos do presente invento. É também divulgado um método para o diagnóstico de condições patológicas associadas a anomalias na via de APP num sujeito, incluindo mas não se limitando à Doença de Alzheimer, que compreende a medição do nivel de ARNm ou do nível ou da actividade dos polipéptidos codificados por um ou mais dos homólogos humanos de um modificador genético numa amostra biológica de um sujeito, em que um nível anormal relativamente ao nível deste num sujeito de controlo é diagnóstico das referidas condições. É também divulgado um estojo compreendendo os componentes necessários para detectar níveis de expressão dos polipéptidos codificados por qualquer um ou mais dos homólogos humanos de um modificador genético ou de fragmentos deste ou de polinucleótidos codificando qualquer um ou mais dos referidos polipéptidos ou fragmentos destes, numa amostra biológica de um sujeito, compreendendo tais estojos anticorpos que se ligam aos referidos polipéptidos ou aos referidos fragmentos destes, ou sondas oligonu- 16 ΡΕ1324652 cleotídicas que hibridam com os referidos polinucleótidos ou com os referidos fragmentos destes e instruções para utilização do referido estojo. É também divulgada uma composição farmacêutica compreendendo substâncias seleccionadas de entre o grupo que consiste em: ARN anti-sentido, ribozima, de cadeia dupla ou ácidos nucleicos de tripla hélice dirigidos a qualquer um ou a mais dos homólogos humanos de um modificador genético ou de fragmentos deste, polipéptidos codificados por qualquer um ou mais dos homólogos humanos dos modificadores genéticos ou fragmentos destes, polinucleótidos codificando os referidos polipéptidos ou fragmentos destes, e anticorpos que se ligam aos referidos polipéptidos ou fragmentos destes, conjuntamente com um transportador, excipiente ou diluente farmaceuticamente adequado, para o tratamento de condições patológicas associadas a anomalias na via de APP, incluindo mas não se limitando à Doença de Alzheimer. É também divulgado um método para o tratamento de condições patológicas associadas a anomalias na via de APP incluindo mas não se limitando à Doença de Alzheimer, compreendendo a introdução de ácidos nucleicos codificando qualquer um ou mais dos homólogos humanos de um modificador genético num ou em mais tecidos de um sujeito necessitado destes resultando em que uma ou mais das proteínas codificadas pelos ácidos nucleicos sejam expressas e ou segregadas por células dentro do tecido. 17 ΡΕ1324652

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

Ao praticar o presente invento, são utilizadas muitas técnicas convencionais em biologia molecular e ADN recombinante. Estas técnicas são bem conhecidas e são explicadas, por exemplo, em "Current Protocols in Molecular Biology", Volumes I, II e III, 1997 (F.M. Ausubel ed.); Sambrook et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; "ADN Cloning: A Practical Approach", Volumes I e II, 1985 (D.N. Glover ed.); "A Practical Guide to Molecular Cloning"; a série, Methods in Enzymology, (Academic Press, Inc.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells", 1987 (J.H. Miller e M.P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory); e Methods in Enzymology, Vol. 154 e Vol. 155 (Wu e Grossman, e Wu, eds., respectivamente). Técnicas de genética molecular de Drosophila bem conhecidas podem ser encontradas, por exemplo, em Robert, D.B., "Drosophila, A Practical Approach" (IRL Press, Washington, D.C., 1986). As descrições das reservas de moscas podem ser encontradas na base de dados Flybase em http://flybase.bio.indiana.edu.

Um organismo "transgénico" tal como aqui utilizado refere-se a um organismo que tenha tido material genético extra introduzido no seu genoma. Tal como aqui utilizado, "uma mosca transgénica" inclui as formas embrionária, larvar e adulto de Drosophila melanogaster que 18 ΡΕ1324652 contenham uma sequência de ADN do mesmo ou de outro organismo introduzida aleatoriamente no seu genoma. Embora seja preferida a Drosophila melanogaster, está contemplado que qualquer mosca do género Drosophila pode ser utilizada no presente invento.

Tal como aqui utilizado, a expressão "ectópica" do transgene refere-se à expressão do transgene num tecido ou célula ou num estádio de desenvolvimento especifico onde este não é normalmente expresso.

Tal como aqui utilizado, "fenótipo" refere-se às características físicas ou bioquímicas observáveis de um organismo tal como determinadas tanto pela composição genética como por influências ambientais.

Tal como aqui utilizado, um composto que pode "inibir ou promover a função de qualquer um ou mais dos polipéptidos codificados pelo homólogo humano de um modificador genético" inclui compostos que o podem fazer indirectamente (através de efeitos a jusante) ou directamente, através da ligação à proteína ou interagindo de outra forma com a proteína e inclui, mas não se limita a, antagonistas ou agonistas da proteína.

Tal como aqui utilizado, "um ortólogo estrito" é definido como verificando os seguintes critérios: a proteína X da mosca tem a melhor correspondência com a proteína Y humana e a proteína X da mosca não tem uma 19 ΡΕ1324652 correspondência com nenhuma outra proteína da mosca melhor do que com a proteína Y humana e a proteína Y humana tem a melhor correspondência com a proteína X da mosca e a proteína Y humana não tem nenhuma correspondência com nenhuma outra proteína humana melhor do que com proteína X da mosca, em que "X" e "Y" representam quaisquer duas proteínas da mosca e do ser humano que estejam a ser comparadas.

Um "ortólogo putativo" é aqui definido como verificando apenas os seguintes dois critérios: a proteína X da mosca tem a melhor correspondência com a proteína Y humana e a proteína Y humana tem a melhor correspondência com a proteína X da mosca, independentemente se a proteína X da mosca tem uma correspondência melhor com outra proteína da mosca e/ou se a proteína Y humana tem uma correspondência melhor com uma outra proteína humana. Tal como aqui divulgado, todos as outras correspondências de proteínas humana/de mosca são consideradas "homólogas".

Tal como aqui utilizado, o termo "sequência de controlo da expressão" refere-se a promotores e estimuladores. 0 termo "promotor" refere-se a sequências de ADN que são reconhecidas directamente ou indirectamente e se ligam através de uma ARN-polimerase dependente de ADN durante o início da transcrição e inclui elementos estimuladores. Os estimuladores utilizados no presente invento incluem o elemento UAS que é activado pelo regulador da transcrição de levedura Gal4. 20 ΡΕ1324652 O termo "factor de transcrição" refere-se a qualquer proteína necessária para iniciar ou regular a transcrição em eucariotas. Por exemplo, o promotor específico do olho GMR é um local de ligação para o factor de transcrição específico do olho, GLASS (Moses, K. e Rubin, G.M., Genes Dev. 5(4): 583-93, 1991)).

Tal como aqui utilizado, o termo "Abeta" (Αβ) refere-se ao péptido beta-amilóide que é um péptido curto (de 40/42 aminoácidos) produzido através de clivagem proteolítica de APP por secretases beta e gama. É o principal componente dos depósitos amilóides, a caracte-rística principal da DA e a causa de morte e degeneração das células neuronais. O péptido Abeta do presente invento inclui, mas não está limitado a, péptidos de 40 e 42 aminoácidos que são referidos, respectivamente, como

Abeta40 (ou Αβ40) (SEQ ID NO: 1) e Abeta42 (ou Αβ42) (SEQ ID NO: 2). "C99" refere-se a um péptido que contém a região Abeta mais a cauda citoplasmática de APP (SEQ ID NO: 3) . Tal como aqui utilizado, o termo inclui também a sequência C99 London, que possui a mutação London associada à Alzheimer DAF (SEQ ID NO: 4) (Goate, A., et al., Nature 349: 704-706, 1991). Os péptidos Abeta e C99 são bem conhecidos dos peritos na técnica (ver, por exemplo, Golde et al., Science 255: 728-730, 1992; Coughlan, C.M. e Breen, K.C., Pharmacol. and Ther. 86: 111-144, 2000). 21 ΡΕ1324652 A região "UAS" tal como aqui utilizada refere-se a uma sequência de activação a montante reconhecida pelo activador da transcrição GAL-4.

Tal como aqui utilizado, uma "sequência sinal" refere-se a uma curta sequência de aminoácidos que determina a eventual posição de uma proteína numa célula, por exemplo, a sequência N-terminal ou os cerca de 20 aminoácidos que dirigem as proteínas transmembranares e secretoras nascentes para o retículo endoplasmático. É aqui contemplado que qualquer sequência sinal convencional familiar a um perito na técnica pode ser utilizada para assegurar a transferência das proteínas C99 ou Abeta codificadas através da via secretora, incluindo, mas não se limitando à sequência sinal de Appl ou presenilina endógena de Drosophila, ou do gene de "windbeutel", codificando para uma proteína residente no RE (retículo endoplasmático) (Konsolaki e Schupbach, Genes & Dev. 12: 120-131, 1998), ou o sinal do gene humano da pre-proencefalina (SEQ ID NO: 5).

Tal como aqui utilizado, uma mosca de "controlo" refere-se a uma larva ou a uma mosca que seja do mesmo genótipo que as larvas ou as moscas utilizadas nos métodos do presente invento excepto que a larva ou a mosca de controlo não possui a mutação que está a ser testada quanto a modificação do fenótipo, ou não lhe são administrados os compostos candidatos. 22 ΡΕ1324652

Tal como aqui utilizado, um "sujeito de controlo" refere-se a um organismo que não sofre de uma condição associada a anomalias na via de APP.

Tal como aqui utilizado, um "vector de transformação de Drosophila" é um plasmídeo de ADN que contém sequências de um elemento transponivel e podem mediar a integração de uma pedaço de ADN no genoma do organismo. Esta tecnologia é familiar a um perito na técnica.

Tal como o termo é aqui utilizado, o fenótipo do "olho rugoso" caracteriza-se por desorganização dos omatidios e das cerdas inter-omatídios e pode ser causado por degeneração de células neuronais. Este fenótipo é visivel através de uma lupa de dissecção.

Tal como o termo é aqui utilizado, o fenótipo da "asa côncava" caracteriza-se pela dobragem anormal da asa da mosca tal que as asas ficam dobradas para cima ao longo de suas margens compridas.

Tal como aqui utilizado, um "defeito locomotor" refere-se a um fenótipo em que as moscas apresentam respostas afectadas à agitação mecânica em comparação com moscas de tipo selvagem em ensaios convencionais de actividade locomotora.

Tal como aqui utilizado, o seguinte e frases relacionadas, condições patológicas associadas a anomalias 23 ΡΕ1324652 na via de APP, condições associadas a regulação anormal da via de APP, condições relacionadas à Doença de Alzheimer, condições patológicas associadas a defeitos na via de APP, incluem todas, mas não se limitam à Doença de Alzheimer, e incluem aquelas condições caracterizadas por degeneração e eventual morte de neurónios em conjuntos do cérebro que controlam a memória, a cognição e o comportamento.

Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se à quantidade de ingrediente activo, por exemplo de composto ou produto génico que melhora os sintomas da condição a tratar.

Os métodos de obtenção de organismos transgé-nicos, incluindo Drosophila transgénica, são bem conhecidos de um perito na técnica. Por exemplo, uma referência geralmente utilizada para transformação mediada pelo elemento P é Spradling, "P element mediated transfor-mation". Em Drosophila: A practical approach (ed. D.B. Roberts), págs. 175-197, IRL Press, Oxford, UK, 1986. A tecnologia do elemento EP refere-se a um sistema binário, utilizando o activador da transcrição de levedura Gal4, que é utilizado para regular ectopicamente a transcrição de genes endógenos de Drosophila. Esta tecnologia é descrita em: Brand e Perrimon, "Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes", Development 118: 401-415, 1993; e em Rorth et al., "Systematic gain-of-function genetics in Drosophila", Development 125(6): 1049-1057, 1998. 24 ΡΕ1324652 A presente divulgação divulga uma mosca transgénica, Drosophila melanogaster, contendo no seu genoma uma sequência de ADN codificando um polipéptido compreendendo a porção beta-amilóide (SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2) ou a porção C99 do gene humano de APP (SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4) que é fundida no seu terminal N de acordo com métodos convencionais a uma sequência de péptido sinal, por exemplo, SEQ ID NO: 5, para assegurar a transferência do polipéptido codificado através da via secretora. As sequências de ADN fundidas são operativamente ligadas a sequências de controlo da expressão específicas de tecido tais como regiões promotoras ou sequências de activação a montante (UAS), dependendo do sistema de expressão utilizado. Estas sequências de controlo da expressão incluem aquelas que são específicas para tecido neural na mosca e incluem órgãos tais como o olho, a asa, o notum, o cérebro, o SNC e o SNP. Sob o controlo destas sequências de controlo específicas de tecido, os péptidos codificados são transcritos para formar ARNm que é traduzido em níveis detectáveis de beta-amilóide ou de péptido C99 e que causam fenótipos alterados nas moscas. Através do ensaio das mudanças nestes fenótipos, estas moscas podem ser utilizadas para identificar genes ou compostos que podem afectar a via de APP e podem proporcionar uma perspectiva sobre os mecanismos moleculares e bioquímicos da via de APP e da Doença de Alzheimer.

Sistemas convencionais de controlo da expressão podem ser utilizados para se alcançar expressão ectópica de 25 ΡΕ1324652 proteínas de interesse, incluindo os péptidos beta-amilóide e C99 do presente invento. Tal expressão pode resultar no distúrbio de vias bioquímicas e na geração de fenótipos alterados. Um tal sistema de controlo da expressão envolve a fusão directa da sequência de ADN com sequências de controlo da expressão de genes expressos de modo específico de tecido, tais como promotores ou estimuladores. Um outro sistema de controlo da expressão que pode ser utilizado é o sistema binário de activação da transcrição Gal4 (Brand e Perrimon, Development 118: 401-415, 1993). O sistema Gal4 utiliza o activador da transcrição de levedura Gal4, para dirigir a expressão de um gene de interesse de um modo específico de tecido. O gene de Gal4 foi introduzido de modo aleatório no genoma da mosca, utilizando um sistema de transformação convencional, de modo a que ficasse sob o controlo de estimuladores genómicos que dirigem a expressão de um modo temporal e específico de tecido. Foram estabelecidas estirpes individuais de moscas, chamadas "condutores" ("drivers"), que transportam essas inserções (Brand e Perrimon, Development 118: 401-415, 1993) .

No sistema Gal4, um gene de interesse é clonado num vector de transformação, de modo a que a sua transcrição esteja sob o controlo da sequência UAS (Sequência de Activação a Montante, do inglês "Upstream Activating Sequence"), o elemento que responde a Gal4. Quando uma estirpe de mosca que transporta a sequência de UAS-gene de 26 ΡΕ1324652 interesse é cruzada com uma estirpe de mosca que expressa o gene Gal4 sob o controlo de um estimulador especifico de tecido, o gene será expresso num padrão especifico de tecido.

Para gerar fenótipos que sejam facilmente visíveis em tecidos de adulto e que possam ser assim utilizados em pesquisas genéticas, podem ser utilizados no presente invento "condutores" de Gal4 que conduzem a expressão em estádios mais tardios do desenvolvimento da mosca. Utilizando estes condutores, a expressão resultará em possíveis defeitos nas asas, nos olhos, nas patas, em diferentes órgãos sensitivos e no cérebro. Estes "condutores" incluem, por exemplo, apterous-Gal4 (asas), elav-Gal4 (SNC), sevenless-Gal4, eyeless-Gal4 e pGMR-Gal4 (olhos). Adicionalmente, uma vez que Appl, o homólogo de mosca de APP, é expresso exclusivamente em tecido neural, são preferidas estirpes "condutoras" nas quais pelo menos um subconjunto da expressão seja dirigido a uma parte do sistema nervoso. Isto inclui o condutor 7B-Gal4 específico do cérebro. Descrições das linhas Gal4 e notas sobre os seus padrões de expressão específicos estão disponíveis em Flybase (http://flybase,bio.indiana.edu).

Para gerar a Drosophila melanogaster transgénica do presente invento podem ser utilizadas várias construções de ADN. Por exemplo, a construção pode conter a porção beta-amilóide ou C99 do gene humano de APP fundida com a sequência do péptido sinal do gene da pré-proencefalina e 27 ΡΕ1324652 operativamente ligada ao promotor especifico do olho, GMR. Noutro exemplo, a construção pode conter a porção beta- amilóide ou C99 do gene humano de APP fundida com a sequência humana do péptido sinal do gene da pré- proencefalina clonada no vector pUAST (Brand e Perrimon, Development 118: 401-415, 1993) que coloca a sequência de UAS a montante da região transcrita. A inserção destas construções no genoma da mosca pode ocorrer através de recombinação do elemento P, recombinação do elemento Hobo (Blackman et al., EMBO J. 8: 211-217, 1989), recombinação homóloga (Rong e Golic, Science 288: 2013-2018, 2000) ou outras técnicas padrão conhecidas dos peritos na técnica.

Tal como discutido acima, um gene expresso ectopicamente pode resultar num fenótipo alterado através da destruição de uma determinada via bioquímica. Espera-se que mutações em genes que actuem na mesma via bioquímica causem modificação do fenótipo alterado. Assim, as moscas do presente invento podem ser utilizadas para identificar genes que actuem na via de APP através do cruzamento de uma mosca transgénica C99 ou Abeta com uma mosca contendo uma mutação num gene conhecido ou previsto; e pesquisar a descendência dos cruzamentos quanto a moscas que apresentem uma modificação quantitativa ou qualitativa do fenótipo alterado da mosca transgénica C99 ou Abeta, em comparação com os controlos. Assim, este sistema é extremamente benéfico para a elucidação da função de produtos processados do gene de APP, bem como a identificação de outros genes que interajam directamente ou indirectamente com 28 ΡΕ1324652 eles. As mutações que podem ser pesquisadas incluem, mas não se limitam a, alelos de perda de função de genes conhecidos, estirpes de deleção, estirpes de "aprisionamento por estimulador" ("enhancer-trap") geradas através do elemento P e mutações de ganho de função geradas através de inserções aleatórias no genoma de Drosophila de uma construção indutivel por Gal4 que possa activar a expressão ectópica de genes na vizinhança da sua inserção. É aqui contemplado que os genes envolvidos na via de APP podem ser identificados deste modo e estes genes podem então servir como alvos para o desenvolvimento de terapêuticos para tratar condições associadas a anomalias na via de APP, conduzindo a doenças que incluem mas não se limitam à Doença de Alzheimer.

As moscas transgénicas C99 e Abeta do presente invento podem também ser utilizadas num método para identificar compostos que podem modificar a via de APP e que se pode assim provar serem úteis para o tratamento das condições discutidas acima. 0 referido método pode compreender a administração de compostos candidatos a moscas transgénicas C99 ou Abeta e depois o ensaio das mudanças no fenótipo da mosca transgénica C99 ou Abeta em comparação com o fenótipo das moscas transgénicas C99 ou Abeta de controlo às quais não foi administrado o composto. Por exemplo, utilizando métodos convencionais, os compostos candidatos podem ser dados a larvas expressando um beta-amilóide ou C99. As larvas podem então ser criadas até ao estádio adulto e ensaiada a modificação do fenótipo 29 ΡΕ1324652 induzido por C99 ou Abeta. Os compostos candidatos podem também ser dados a moscas adultas e as modificações do fenótipo ensaiadas. 0 mecanismo da acção dos compostos assim identificados pode ser examinado através da comparação dos fenótipos produzidos através de manipulação genética com os induzidos através da administração de um composto de interesse. Tais compostos incluem os que podem melhorar ou piorar o fenótipo alterado criado nas moscas transgénicas. A expressão de um fenótipo induzido por um composto semelhante a um associado a uma modificação genética conhecida sugeriria que o composto tem um efeito na mesma via que a modificação genética está a afectar.

Para além de pesquisar compostos nas moscas transgénicas do presente invento, tais compostos podem também ser ainda ensaiados através do emprego de modelos in vitro e outros in vivo de DA utilizando métodos convencionais. Por exemplo, numerosas linhas celulares podem ser utilizadas como modelos in vitro da DA e são familiares aos peritos na técnica, incluindo, por exemplo, as linhas celulares descritas em Xia et ai., PNAS USA 94(15): 8208-13, 1997. Também existem modelos in vivo e incluem, por exemplo, o modelo de ratinho de DA divulgado em WO 94/00569. A elucidação do mecanismo de acção de compostos que afectem a acção do beta-amilóide ou do C99 em moscas 30 ΡΕ1324652 transgénicas aqui divulgado pode também ser efectuada utilizando perfil de ARN em chips (Affymetrix, Santa Clara) ou utilizando outros métodos convencionais. Por exemplo, os perfis de ARN de moscas às quais foram administrados compostos candidatos podem ser ensaiados e comparados com os de moscas que foram geneticamente modificadas. Perfis semelhantes sugeririam que o composto actua de algum modo na via afectada pelo beta-amilóide ou o C99. É aqui contemplado que, ainda noutro aspecto, o invento se refere a um método para identificação de genes envolvidos no estabelecimento ou na progressão da Doença de Alzheimer e cujos produtos proteicos podem servir como potenciais marcadores da DA, compreendendo o referido método a identificação de genes que estão envolvidos nas vias reguladas pelos factores de transcrição codificados pelas sequências humanas hCP50765 (SEQ ID NO: 35, codificada pelo gene EGR2) e hCP41313 (SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 53, codificadas pelo homólogo humano do gene nocA de Drosophila), cujas sequências humanas são homólogas dos modificadores genéticos de Drosophila identificados tal como descrito aqui e se situam próximo da área do cromossoma 10 humano que se mostrou ter uma ligação genética à Doença de Alzheimer. A identificação de tais genes, regulados pelos factores de transcrição acima mencionados, pode ser alcançada utilizando métodos convencionais, incluindo mas não se limitando a uma tecnologia designada SELEX, referida em Tuerk e Gold, Science 249: 505-510, 1990, e Brown e Gold, Biochemistry 31 ΡΕ1324652 34: 14765-14774, 1995. Por exemplo, os genes que são regulados por um factor de transcrição específico podem ser identificados através da determinação da sequência de ADN alvo do factor de transcrição específico. Tal identificação da sequência alvo pode ser alcançada através de diferentes métodos, incluindo mas não se limitando a SELEX. Uma vez a sequência alvo identificada, a presença desta sequência nas regiões reguladoras a montante de genes conhecidos e previstos pode ser determinada, utilizando ferramentas bio-informáticas bem conhecidas dos peritos na técnica. Pode-se esperar que os genes contendo a sequência alvo nas suas regiões reguladoras a montante sejam regulados pelo factor de transcrição específico.

Está contemplado que os compostos que podem afectar (e.g., inibir ou promover) a função ou expressão das proteínas codificadas pelos homólogos humanos dos modificadores genéticos identificados de acordo com o presente invento podem ser úteis para tratar a Doença de Alzheimer ou outras condições associadas a defeitos na regulação da via de APP. Adicionalmente, é também contemplado que, utilizando métodos convencionais, podem ser criados oligonucleótidos anti-sentido, ribozimas, ADN de tripla hélice e/ou ARN de cadeia dupla com valor terapêutico com base nas sequências nucleotídicas destes homólogos humanos dos modificadores genéticos. A utilização terapêutica de anticorpos dirigidos aos polipéptidos codificados por homólogos humanos de modificadores genéticos e criados utilizando métodos convencionais é 32 ΡΕ1324652 também aqui contemplada. Assim, um aspecto adicional do invento refere-se à administração de uma composição farmacêutica, em conjunto com um transportador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável, para o tratamento da Doença de Alzheimer e de condições relacionadas. Tais composições farmacêuticas podem compreender os compostos, oligonucleótidos anti-sentido, ribozimas, ADN de tripla hélice, ARN de cadeia dupla e/ou os anticorpos discutidos acima. As composições podem também conter produtos de expressão de homólogos humanos dos modificadores genéticos (e.g., polipéptidos ou fragmentos destes) identificados de acordo com o presente invento. As composições podem ser administradas sozinhas ou em combinação com pelo menos um outro agente, tal como um composto estabilizante, que pode ser administrado em qualquer transportador estéril farmaceuticamente biocompativel, incluindo, mas não se limitando a, solução salina, solução salina tamponada, dextrose e água. As composições podem ser administradas a um sujeito necessitado destas sozinhas ou em combinação com outros agentes, fármacos ou hormonas.

As composições farmacêuticas podem ser administradas através de qualquer número de vias, incluindo, mas não se limitando aos meios oral, intravenoso, intramuscular, intra-articular, intra-arterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmico, subcutâneo, intraperitoneal, intranasal, entérico, tópico, sublingual ou rectal. 33 ΡΕ1324652

Para além dos ingredientes activos, estas composições farmacêuticas podem conter transportadores farmaceuticamente aceitáveis adequados compreendendo excipientes e auxiliares que facilitem o processamento dos compostos activos em preparações que podem ser utilizadas farmaceuticamente. Mais detalhes sobre técnicas para formulação e administração podem ser encontrados na última edição de "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Publishing Co., Easton, Pa.).

As composições farmacêuticas para administração oral podem ser formuladas utilizando transportadores farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica em dosagens adequadas para administração oral. Tais transportadores permitem que as composições farmacêuticas sejam formuladas como comprimidos, pilulas, drageias, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões e semelhantes para ingestão pelo paciente.

As preparações farmacêuticas para utilização oral podem ser obtidas através da combinação de compostos activos com o excipiente sólido, moendo opcionalmente uma mistura resultante, e processando a mistura dos grânulos, após adição dos auxiliares adequados, se desejado, para obter comprimidos ou núcleos de drageias. Excipientes adequados são enchimentos de hidrato de carbono ou proteína, tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol; amido de milho, trigo, arroz, batata, ou de outras plantas; celulose, tal como metilcelulose, hidroxipropilmetil-celulose ou carboximetilcelulose de 34 ΡΕ1324652 sódio; gomas incluindo arábica e tragacanto; e proteínas tais como gelatina e colagénio. Se desejado, podem ser adicionados agentes desintegrantes ou solubilizantes, tais como polivinil-pirrolidona com ligações cruzadas, agar, ácido algínico ou um sal deste, tal como alginato de sódio.

Os núcleos das drageias podem ser utilizados em conjunto com revestimentos adequados, tais como soluções concentradas de açúcar, que podem também conter goma-arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilenoglicol e/ou dióxido de titânio, soluções de laca, e solventes ou misturas de solventes orgânicos adequados. Podem ser adicionados corantes ou pigmentos aos comprimidos ou revestimentos das drageias para identificação do produto ou para caracterizar a quantidade de composto activo, í.e., a dosagem.

As preparações farmacêuticas que podem ser utilizadas oralmente incluem cápsulas duras feitas de gelatina, bem como cápsulas moles seladas feitas de gelatina e um revestimento, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas duras podem conter os ingredientes activos misturados com um enchimento ou aglomerantes, tais como lactose ou amido, lubrificantes, tais como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizantes. Em cápsulas moles, os compostos activos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como óleos gordos, líquidos ou polietilenoglicol líquido com ou sem estabilizantes . 35 ΡΕ1324652

As formulações farmacêuticas adequadas para administração parentérica podem ser formuladas em soluções aquosas, de preferência em tampões fisiologicamente compatíveis tais como solução de Hank, solução de Ringer, ou solução salina fisiologicamente tamponada. As suspensões aquosas de injecção podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, tais como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol ou dextrano. Adicionalmente, as suspensões dos compostos activos podem ser preparadas como suspensões de injecção oleosas apropriadas. Solventes ou veículos lipófilos adequados incluem óleos gordos tais como óleo de sésamo ou ésteres de ácidos gordos sintéticos, tais como o oleato de etilo ou triglicéridos, ou lipossomas. Amino-polímeros policatiónicos não lipídicos podem também ser utilizados para distribuição. Opcionalmente, a suspensão pode também conter estabilizantes ou agentes adequados que aumentem a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.

Para administração tópica ou nasal, são utilizados na formulação penetrantes apropriados da barreira particular a permear. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica.

As composições farmacêuticas podem ser fabricadas de um modo que seja conhecido na técnica, e.g., por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, produção de drageias, amassamento, emulsionamento, enca-psulação, aprisionamento ou liofilização. 36 ΡΕ1324652 A composição farmacêutica pode ser proporcionada como um sal e pode ser formada com muitos ácidos, incluindo mas não se limitando a, clorídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succinico, etc. Os sais tendem a ser mais solúveis em solventes aquosos ou outros solventes protónicos que sejam as formas base livres correspondentes. Noutros casos, a preparação preferida pode ser um pó liofilizado que pode conter qualquer um ou todos dos seguintes: histidina 1-50 mM, sacarose a 0,l%-2% e manitol a 2-7%, num intervalo de pH de 4,5 a 5,5, que sejam combinados com tampão antes da utilização.

Depois das composições farmacêuticas serem preparadas, podem ser colocadas num recipiente apropriado e etiquetadas para tratamento de uma condição indicada. Para administração dos compostos ou dos produtos génicos identificados de acordo com o presente invento, tal etiquetagem incluiria a quantidade, a frequência e o método de administração .

As composições farmacêuticas adequadas para utilização no invento incluem composições em que os ingredientes activos estão contidos numa quantidade eficaz para se alcançar o fim pretendido. A determinação de uma dose eficaz está bem dentro das capacidades dos peritos na técnica.

Para qualquer composto, a dose terapeuticamente 37 ΡΕ1324652 eficaz pode ser estimada inicialmente quer em ensaios de culturas celulares, e.g., de células neoplásicas, ou em modelos animais, geralmente ratinhos, coelhos, cães ou porcos. 0 modelo animal pode também ser utilizado para determinar o intervalo de concentrações e a via de administração apropriados. Tal informação pode então ser utilizada para determinar doses e vias úteis para administração a seres humanos. "Uma dose terapeuticamente eficaz" refere-se à quantidade de ingrediente activo, por exemplo um composto ou produto génico que melhora os sintomas ou a condição. A eficácia terapêutica e a toxidade podem ser determinadas através de procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou em animais experimentais, e.g., DE50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população) e DL50 (a dose letal em 50% da população) . A razão de dose entre os efeitos tóxico e terapêutico é o índice terapêutico, e pode ser expressa como a razão DL50/DE50. São preferidas composições farmacêuticas que exibam índices terapêuticos grandes. Os dados obtidos a partir dos ensaios de culturas celulares e estudos animais são utilizados na formulação de um intervalo de dosagem para utilização humana. A dosagem contida em tais composições está de preferência dentro de um intervalo de concentrações em circulação que inclui a DE50 com pouca ou nenhuma toxidade. A dosagem varia dentro deste intervalo dependendo da forma de dosagem empregue, da sensibilidade do paciente e da via de administração. 38 ΡΕ1324652 A dosagem exacta será determinada pelo médico, à luz de factores relacionados com o sujeito que requer tratamento. A dosagem e a administração são ajustadas para proporcionar niveis suficientes da porção activa ou para manter o efeito desejado. Os factores que podem ser tidos em conta incluem a gravidade do estado de doença, a saúde geral do sujeito, a idade, o peso e o género do sujeito, a dieta, o momento e a frequência de administração, a combinação ou combinações de fármacos, as sensibilidades de reacção e a tolerância/resposta à terapia. As composições farmacêuticas de acção prolongada podem ser administradas cada 3 a 4 dias, cada semana ou uma vez cada duas semanas dependendo da semi-vida e da taxa de eliminação da formulação particular.

As quantidades normais de dosagem podem variar de 0,1 a 100000 microgramas até uma dose total de cerca de 1 g, dependendo da via de administração. É proporcionada orientação quanto a dosagens e métodos particulares de distribuição na literatura que está geralmente disponível aos praticantes na técnica. Os peritos na técnica empregarão diferentes formulações para nucleótidos e para proteínas ou seus inibidores. Semelhantemente, a distribuição de polinucleótidos ou polipéptidos será específica de determinadas células, condições, localizações, etc. Formulações farmacêuticas adequadas para administração oral de proteínas são descritas, e.g., nas Patentes U.S. 5008114; 5505962; 5641515; 5681811; 5700486; 5766633; 5792451; 5853748; 5972387; 5976569; e 6051561. 39 ΡΕ1324652 É também aqui contemplado que um método para o diagnóstico de condições patológicas associadas a anomalias na via de APP num sujeito, incluindo mas não se limitando à Doença de Alzheimer, é possível dados os dados da Tabela 1. Por exemplo, o método pode compreender a medição do nível de polipéptidos codificados por qualquer um ou mais dos homólogos genéticos humanos dos genes da Tabela 1 numa amostra biológica de um sujeito, em que um nível anormal de qualquer um ou mais dos referidos polipéptidos relativamente ao nível destes num sujeito normal é diagnóstico das referidas condições. Um tal ensaio podia ser efectuado utilizando tecnologias convencionais familiares aos peritos na técnica.

Noutra concretização, ácidos nucleicos compreendendo uma sequência codificando um homólogo humano de um modificador genético ou um derivado funcional deste são administrados para promover a função da via de APP, através de terapia génica. A terapia génica refere-se à terapia efectuada através da administração de um ácido nucleico a um sujeito. Nesta concretização do invento, o ácido nucleico produz a sua proteína codificada que medeia um efeito terapêutico promovendo a função normal da via de APP.

Qualquer um dos métodos para terapia génica disponíveis na técnica pode ser utilizado de acordo com o presente invento. Os métodos exemplares são descritos abaixo. 40 ΡΕ1324652

Num aspecto preferido, o terapêutico compreende o ácido nucleico para um modificador genético que faça parte de um vector de expressão que expresse uma proteína modificadora genética ou um fragmento ou proteína quimérica desta num hospedeiro adequado. Em particular, um tal ácido nucleico possui um promotor operativamente ligado à região de codificação da proteína modificadora genética específica, sendo o referido promotor indutível ou constitutivo, e, opcionalmente, específico de tecido. Noutra concretização particular, é utilizada uma molécula de ácido nucleico em que as sequências de codificação da proteína modificadora e qualquer outra sequência desejada são flanqueadas por regiões que promovem a recombinação homóloga num local desejado do genoma, proporcionando assim expressão intracromossómica do ácido nucleico do modificador (Koller e Smithies, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 8932— 8935, 1989; Zijlstra et al., Nature 342: 435-438, 1989). A distribuição do ácido nucleico num paciente pode ser directa, caso em que o paciente é exposto directamente ao ácido nucleico ou ao vector transportando o ácido nucleico, ou indirecta, caso em que as células são primeiro transformadas com o ácido nucleico in vitro e depois transplantadas para o paciente. Estas duas abordagens são conhecidas, respectivamente, como terapia génica in vivo ou ex vivo.

Numa concretização específica, o ácido nucleico é administrado directamente in vivo, onde é expresso para 41 ΡΕ1324652 produzir o produto codificado. Isto pode ser conseguido através de qualquer um de numerosos métodos conhecidos na técnica, e.g., através da sua construção como parte de um vector de expressão do ácido nucleico apropriado e da sua administração de modo a que este se torne intracelular, e.g., através de infecção utilizando um vector retroviral defeituoso ou atenuado ou outro vector virai (ver, e. g., Pat. U.S. N° 4980286 e outras mencionadas abaixo), ou através de injecção directa de ADN nu, ou através da utilização de bombardeamento de micropartículas (e.g., uma pistola génica; Biolistic, Dupont), ou de revestimento com lipidos ou receptores da superfície celular ou agentes de transfecção, de encapsulamento em lipossomas, micropar-tícuias ou microcápsulas, ou através da sua administração em ligação com um péptido que se saiba entrar no núcleo, através da sua administração em ligação com um ligando sujeito a endocitose mediada por receptores (ver, e.g., as Patentes U.S. 5166320; 5728399; 5874297; e 6030954) (que pode ser utilizado para atingir tipos celulares expressando especificamente os receptores), etc. Noutra concretização, pode-se formar um complexo ácido nucleico-ligando no qual o ligando compreende um péptido virai fusogénico para romper endossomas, permitindo que o ácido nucleico evite a degradação lisossómica. Ainda noutra concretização, o ácido nucleico pode ser direccionado in vivo para tomada e expressão por células específicas, através do direccio-namento para um receptor específico (ver, e.g., as Publicações PCT WO 92/06180; WO 92/22635; WO 92/20316; WO 93/14188; e WO 93/20221) . Alternativamente, o ácido nucleico pode ser introduzido intracelularmente e incorporado 42 ΡΕ1324652 dentro do ADN da célula hospedeira para expressão, através de recombinação homóloga (ver, e.g., as Patentes U.S. 5413923; 5416260; e 5574205; e Zijlstra et al., Nature 342: 435-438, 1989) .

Numa concretização específica, é utilizado um vector virai que contém um ácido nucleico do modificador. Por exemplo, pode ser utilizado um vector retroviral (ver, e.g., as Patentes U.S. 5219740; 5604090; e 5834182). Estes vectores retrovirais foram modificados para suprimir sequências retrovirais que não são necessárias para o empacotamento do genoma virai e integração no ADN da célula hospedeira. O ácido nucleico do modificador a utilizar em terapia génica é clonado no vector, o que facilita a distribuição do gene num paciente.

Os adenovírus são outros vectores virais que podem ser utilizados em terapia génica. Os adenovírus são veículos especialmente atractivos para distribuir genes pelo epitélio respiratório. Os adenovírus infectam naturalmente o epitélio respiratório onde causam uma doença suave. Outros alvos para sistemas de distribuição baseados em adenovírus são o fígado, o sistema nervoso central, células endoteliais e músculo. Os adenovírus têm a vantagem de ser capazes de infectar células que não se dividem. Os métodos para conduzir terapia génica baseada em adenovírus são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. 5824544; 5868040; 5871722; 5880102; 5882877; 5885808; 5932210; 5981225; 5994106; 5994132; 5994134; 6001557; e 60338843. 43 ΡΕ1324652 0 vírus adeno-associado (AAV) foi também proposto para utilização em terapia génica. Os métodos para produzir e utilizar AAV são descritos, e.g., nas Patentes U.S. 5173414; 5252479; 5552311; 5658785; 5763416; 5773289; 5843742; 5869040; 5942496; e 5948675.

Outra abordagem à terapia génica envolve a transferência de um gene para células em cultura de tecidos por métodos tais como electroporação, lipofecção, trans-fecção mediada por fosfato de cálcio ou infecção virai. Geralmente, o método de transferência inclui a transferência de um marcador seleccionável para as células. As células são então colocadas sob selecção para isolar as células que tomaram e estão a expressar o gene transferido. Essas células são então distribuídas a um paciente.

Nesta concretização, o ácido nucleico é introduzido numa célula antes da administração in vivo da célula recombinante resultante. Tal introdução pode ser realizada através de qualquer método conhecido na técnica, incluindo mas não se limitando a transfecção, electroporação, microinjecção, infecção com um vector virai ou bacteriófago contendo as sequências de ácido nucleico, fusão celular, transferência génica mediada por cromossomas, transferência génica mediada por microcélulas, fusão de esferoplastos, etc. Numerosas técnicas são conhecidas na técnica para a introdução de genes estranhos em células e podem ser utilizadas de acordo com o presente invento, desde que não sejam destruídas as funções de desenvolvimento e fisio- 44 ΡΕ1324652 lógicas necessárias das células receptoras. A técnica deve proporcionar a transferência estável do ácido nucleico para a célula, de modo que o ácido nucleico possa ser expresso pela célula e possa de preferência ser herdado e expresso pela sua descendência celular.

As células recombinantes resultantes podem ser distribuídas a um paciente através de vários métodos conhecidos na técnica. Numa concretização preferida, células epiteliais são injectadas, e.g., subcutaneamente. Noutra concretização, células recombinantes da pele podem ser aplicadas como um enxerto de pele no paciente. As células do sangue recombinantes (e.g., células estaminais ou progenitoras hematopoiéticas) são administradas de preferência intravenosamente. A quantidade de células considerada para utilização depende do efeito desejado, do estado do paciente, etc., e pode ser determinada por um perito na técnica.

As células nas quais um ácido nucleico pode ser introduzido para fins da terapia génica abrangem qualquer tipo celular desejado disponível e incluem mas não se limitam a células epiteliais, células endoteliais, queratinó-citos, fibroblastos, células musculares, hepatócitos; células do sangue tais como linfócitos T, linfócitos B, monócitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megaca-riócitos, granulócitos; várias células estaminais ou progenitoras, em particular células estaminais ou progenitoras hematopoiéticas, e.g., tal como obtidas a partir da medula 45 ΡΕ1324652 óssea, do sangue do cordão umbilical, do sangue periférico, do fígado fetal, etc.

Numa concretização preferida, a célula utilizada para terapia génica é autóloga ao paciente.

Numa concretização em que são utilizadas células recombinantes em terapia génica, um ácido nucleico do modificador é introduzido nas células de modo a que possa ser expresso pelas células ou pela sua descendência, e as células recombinantes são então administradas in vivo para um efeito terapêutico. Numa concretização específica, são utilizadas células estaminais ou progenitoras. Quaisquer células estaminais e/ou progenitoras que possam ser isoladas e mantidas in vitro podem potencialmente ser utilizadas de acordo com esta concretização do presente invento. Tais células estaminais incluem mas não se limitam a células estaminais hematopoiéticas (HSC), células estaminais de tecidos epiteliais tais como a pele e o forro do intestino, células musculares cardíacas embrionárias não humanas, células estaminais do fígado (ver, e.g., WO 94/08598) e células estaminais neurais (Stemple e Anderson, Cell 71: 973-985, 1992).

As células estaminais epiteliais (ESCs) ou queratinócitos podem ser obtidas a partir de tecidos tais como a pele e o forro do intestino através de procedimentos conhecidos (Rheinwald, Meth. Cell Βίο. 21A: 229, 1980) . Em tecido epitelial estratificado tal como a pele, a renovação 46 ΡΕ1324652 ocorre através de mitose de células estaminais da camada germinal, a camada mais próxima da lâmina basal. As células estaminais dentro do forro do intestino proporcionam uma rápida taxa de renovação deste tecido. As ESCs ou queratinócitos obtidas a partir da pele ou do forro do intestino de um paciente ou doador podem ser criadas em cultura de tecidos (Pittelkow e Scott, Mayo Clinic Proc. 61: 771, 1986) . Se as ESCs forem proporcionadas por um doador, pode também ser utilizado um método para supressão da reactividade do hospedeiro versus o enxerto (e.g., irradiação, administração de fármacos ou anticorpos para promover imunossupressão moderada).

Em relação às células estaminais hematopoiéticas (HSC), qualquer técnica que proporcione o isolamento, a propagação, e a manutenção in vitro de HSC pode ser utilizada nesta concretização do invento. As técnicas através das quais isto pode ser conseguido incluem (a) o isolamento e estabelecimento de culturas de HSC a partir de células da medula óssea isoladas do futuro hospedeiro ou de um dador, ou (b) a utilização das culturas de HSC de longo prazo previamente estabelecidas, que podem ser alogeneicas ou xenogeneicas. As HSC não autólogas são utilizadas de preferência em conjunto com um método de supressão de reacções imunitárias à transplantação do futuro hospedeiro/paciente. As células humanas de medula óssea podem ser obtidas a partir da cristã ilíaca posterior através de aspiração por uma agulha (ver, e.g., Kodo et al., J. Clin. Invest. 73: 1377-1384, 1984). As HSCs podem 47 ΡΕ1324652 ser tornadas altamente enriquecidas ou produzidas de forma substancialmente pura. Este enriquecimento pode ser alcançado antes, durante ou após cultura de longo prazo, e pode ser feito através de qualquer uma das técnicas conhecidas na especialidade. Culturas de longo prazo de células da medula óssea podem ser estabelecidas e mantidas utilizando, por exemplo, técnicas de cultura de células de Dexter modificadas (Dexter et al., J. Cell Physiol. 91: 335, 1977) ou as técnicas de cultura de Witlock-Witte (Witlock e Witte, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79: 3608-3612, 1982) .

Numa concretização especifica, o ácido nucleico a introduzir para fins de terapia génica compreende um promotor indutivel operativamente ligado à região de codificação, de modo a que a expressão do ácido nucleico seja controlável através do controlo da presença ou ausência do indutor da transcrição apropriado.

Outra concretização da presente divulgação refere-se à utilização terapêutica de um anticorpo purificado ou de um fragmento deste para tratamento de condições associadas a anomalias na via de APP, incluindo mas não se limitando a DA. É contemplado que o anticorpo purificado ou um fragmento deste se liga especificamente a um polipéptido que compreenda a sequência de aminoácidos de qualquer um dos homólogos humanos dos modificadores genéticos identificados na Tabela 1, de preferência os polipéptidos dos homólogos humanos situados no cromossoma 10 aqui 48 ΡΕ1324652 divulgados, de maior preferência o polipéptido codificado por SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 53, i.e. as sequências de noc A conservadas, ou a um fragmento dos referidos polipéptidos. Uma concretização preferida refere-se a um fragmento de um tal anticorpo, fragmento esse que é um Fab ou um F(ab')2- Em particular, o anticorpo pode ser um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal. São aqui descritos métodos para a produção de anticorpos capazes de reconhecer especificamente um ou mais epitopos do gene diferencialmente expressos. Tais anticorpos podem incluir, mas não se limitam a anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais (mAbs), anticorpos humanizados ou quiméricos, anticorpos de cadeia simples, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id) e fragmentos de ligação ao epitopo de qualquer um dos de cima. Tais anticorpos podem ser utilizados, por exemplo, na detecção de um gene alvo de impressão digital numa amostra biológica, ou, alternativamente, como um método para a inibição de uma actividade anormal do gene alvo. Assim, tais anticorpos podem ser utilizados como parte dos métodos de tratamento da doença de Alzheimer e/ou podem ser utilizados como parte de técnicas de diagnóstico por meio das quais os pacientes podem ser testados quanto a niveis anormais de um polipéptido modificador, ou quanto à presença de formas anormais de um polipéptido modificador.

Para a produção de anticorpos para um polipéptido 49 ΡΕ1324652 modificador especifico, os vários animais hospedeiros podem ser imunizados através de injecção com o polipéptido, ou uma porção deste. Tais animais hospedeiros podem incluir mas não se limitam a coelhos, ratinhos e ratos, para nomear apenas alguns. Podem ser utilizados vários adjuvantes para aumentar a resposta imunológica, dependendo da espécie hospedeira, incluindo mas não se limitando aos de Freund (completo e incompleto), géis minerais tais como hidróxido de alumínio, substâncias activas de superfície tais como lisolecitina, polióis plurónicos, polianiões, péptidos, emulsões de óleo, hemocianina da lapa, dinitrofenol e adjuvantes humanos potencialmente úteis tais como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum.

Os anticorpos policlonais são populações heterogéneas de moléculas de anticorpo derivadas do soro de animais imunizados com um antigénio, tal como o produto do gene alvo ou um derivado funcional antigénico deste. Para a produção de anticorpos policlonais, animais hospedeiros tais como os descritos acima, podem ser imunizados através de injecção com um polipéptido modificador, ou uma porção deste, suplementado com adjuvantes tal como descrito acima.

Os anticorpos monoclonais, que são populações homogéneas de anticorpos para um determinado antigénio, podem ser obtidos através de qualquer técnica que proporcione a produção de moléculas de anticorpo através de linhas celulares contínuas em cultura. Estas incluem, mas não se limitam à técnica de hibridoma de Kohler e Milstein 50 ΡΕ1324652 (Nature 256: 495-497, 1975; e Pat. U.S. N° 4376110), à técnica de hibridoma de células B humanas (Kosbor et al., Immunology Today 4: 72, 1983; Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 2026-2030, 1983), e à técnica de hibridoma de EBY (Cole et ai., 1985, "Monoclonal Antibodies And Câncer Therapy", Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96) . Tais anticorpos podem ser de qualquer classe de imunoglobulinas incluindo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD e qualquer subclasse destas. O hibridoma que produz o mAb deste invento pode ser cultivado In vitro ou In vivo. A produção de títulos elevados de mAbs in vivo torna-o o método de produção presentemente preferido.

Adicionalmente, podem ser utilizadas técnicas desenvolvidas para a produção "de anticorpos quiméricos" (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Scl. USA 81: 6851-6855, 1985; Neuberger et al., Nature 312:604-608, 1984; Takeda et ai., Nature 314: 452-454,1985) através da união dos genes de uma molécula de anticorpo de ratinho com a especificidade de antigénio apropriada com genes de uma molécula humana de anticorpo com a actividade biológica apropriada. Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual as diferentes porções são derivadas de diferentes espécies animais, tais como as que têm uma região variável ou hipervariável derivada de um mAb de murídeo e uma região constante de uma imunoglobulina humana.

Alternativamente, as técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia simples (Pat. U.S. N° 51 ΡΕ1324652 4946778; Bird, Science 242: 423-426, 1988; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879-5883, 1988; e Ward et al., Nature 334: 544-546, 1989) podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia simples de genes diferencialmente expressos. Os anticorpos de cadeia simples são formados através da ligação dos fragmentos de cadeia pesada e leve da região Fv através de uma ponte de aminoácidos, resultando num polipéptido de cadeia simples.

De maior preferência, as técnicas úteis para a produção "de anticorpos humanizados" podem ser adaptadas para produzir anticorpos para os polipéptidos, fragmentos, derivados e equivalentes funcionais aqui divulgados. Tais técnicas são divulgadas nas Patentes U.S. N° 5932448; 5693762; 5693761; 5585089; 5530101; 5910771; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5545580; 5661016; e 5770429.

Os fragmentos de anticorpo que reconhecem epitopos específicos podem ser gerados através de técnicas conhecidas. Por exemplo, tais fragmentos incluem mas não se limitam a: os fragmentos F(ab')2 que podem ser produzidos através de digestão com pepsina da molécula de anticorpo e os fragmentos Fab que podem ser gerados através da redução das pontes dissulfureto dos fragmentos F(ab')2. Alternativamente, podem ser construídas bibliotecas de expressão de Fab (Huse et al., Science 246: 1275-1281, 1989) para permitir a identificação rápida e fácil de fragmentos Fab monoclonais com a especificidade desejada. 52 ΡΕ1324652

Um anticorpo pode ser utilizado de preferência num método para o diagnóstico de uma condição associada a regulação anormal da via de APP e/ou à Doença de Alzheimer num sujeito, ou para identificar um sujeito com uma predisposição para as referidas condições, que compreenda: medição da quantidade de um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos de alguns dos homólogos humanos dos modificadores genéticos identificados na Tabela 1, de preferência, os polipéptidos dos homólogos humanos situados no cromossoma 10 aqui divulgados, de maior preferência, o polipéptido codificado por SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 53, í.e., as sequências nocA conservadas, ou fragmentos destas, num tecido ou numa célula apropriados de um sujeito em que a presença de uma quantidade elevada do referido polipéptido ou de fragmentos deste, relativamente à quantidade do referido polipéptido ou fragmentos deste no respectivo tecido de um sujeito de controlo é diagnóstico da referida condição. Um tal método forma uma outra concretização do presente invento. De preferência, o referido passo de detecção compreende o contacto do referido tecido ou célula apropriados com um anticorpo que se ligue especificamente a um polipéptido que compreenda a sequência de aminoácidos de qualquer um ou mais dos polipéptidos discutidos acima ou um fragmento destes e a detecção da ligação específica do referido anticorpo com um polipéptido no referido tecido ou célula apropriados, em que a detecção da ligação específica a um polipéptido indica a presença de qualquer um ou mais dos referidos polipéptidos ou um fragmento destes. 53 ΡΕ1324652

Particularmente preferido, para maior facilidade de detecção, é o ensaio em sanduíche, do qual existe uma quantidade de variações, que se pretende que sejam todas englobadas pelo presente invento.

Por exemplo, num ensaio directo típico, o anticorpo não marcado é imobilizado num substrato sólido e a amostra a testar é colocada em contacto com a molécula ligada. Depois um período adequado de incubação, durante um período de tempo suficiente para permitir a formação de um complexo binário anticorpo-antigénio. Neste momento, um anticorpo secundário, marcado com uma molécula repórter capaz de induzir um sinal detectável, é então adicionado e incubado, dando um tempo suficiente para a formação de um complexo ternário anticorpo-antigénio-anticorpo marcado. Todo o material que não reagiu é lavado e a presença do antigénio é determinada através da observação de um sinal, ou pode ser quantificada através de comparação com uma amostra de controlo contendo quantidades conhecidas de antigénio. As variações no ensaio directo incluem o ensaio simultâneo, no qual tanto a amostra como o anticorpo são adicionados simultaneamente ao anticorpo ligado, ou um ensaio reverso no qual o anticorpo marcado e a amostra a testar são primeiro combinados, incubados e adicionados ao anticorpo ligado à superfície não marcado. Estas técnicas são bem conhecidas dos peritos na técnica e a possibilidade de variações menores será facilmente aparente. Tal como aqui utilizado, pretende-se que "ensaio em sanduíche" 54 ΡΕ1324652 englobe todas as variações da técnica básica de dois locais. Para os imunoensaios do presente invento, o único factor limitante é que o anticorpo marcado seja um anticorpo que seja especifico para o polipéptido modificador ou para um fragmento deste.

As moléculas repórter mais vulgarmente utilizadas neste tipo de ensaio são enzimas, moléculas contendo fluoróforos ou radionúclidos. No caso de um imunoensaio enzimático é conjugada uma enzima com o anticorpo secundário, geralmente por meio de glutaraldeído ou periodato. Tal como será facilmente reconhecido, existe, no entanto, uma grande variedade de técnicas de ligação diferentes, que são bem conhecidas dos peritos na técnica. Enzimas vulgarmente utilizadas incluem a peroxidase de rábano, glucose-oxidase, beta-galactosidase e fosfatase alcalina, entre outras. Os substratos a utilizar com as enzimas especificas são geralmente escolhidos pela produção, após hidrólise pela enzima correspondente, de uma mudança de cor detectável. Por exemplo, o p-nitrofenil-fosfato é adequado para utilização com conjugados de fosfatase alcalina; para conjugados de peroxidase, são geralmente utilizados 1,2-fenilenodiamina ou toluidina. É também possível empregar substratos fluorogénicos, que produzem um produto fluorescente em vez dos substratos cromogénicos citados acima. Uma solução contendo o substrato apropriado é então adicionada ao complexo terciário. 0 substrato reage com a enzima ligada ao anticorpo secundário, dando um sinal visual qualitativo, que possa 55 ΡΕ1324652 ainda ser quantificado, geralmente espectrofotometrica-mente, para dar uma avaliação da quantidade de proteína modificadora que está presente na amostra de soro.

Alternativamente, compostos fluorescentes, tais como fluoresceína e rodamina, podem ser quimicamente conjugados com anticorpos sem alterar a sua capacidade de ligação. Quando activados através de iluminação com luz de um determinado comprimento de onda, o anticorpo marcado com um fluorocromo absorve a energia luminosa, induzindo um estado de excitabilidade na molécula, seguido da emissão de luz a um comprimento de onda mais longo característico. A emissão aparece como uma cor característica visualmente detectável com um microscópio óptico. As técnicas de imunofluorescência e EIA estão ambas muito bem estabelecidas na técnica e são particularmente preferidas para o presente método. Contudo, podem também ser empregues outras moléculas repórter, tais como radioisótopos, moléculas quimioluminescentes ou bioluminescentes. Será facilmente aparente ao perito como variar o procedimento para servir a utilização necessária.

Polinucleótidos codificando homólogos humanos dos modificadores genéticos identificados de acordo com os métodos do presente invento podem ser utilizados num método para diagnosticar condições associadas a defeitos na regulação da via de APP, incluindo mas não se limitando à Doença de Alzheimer ou para identificar indivíduos com uma predisposição genética para tais condições. Por exemplo, o 56 ΡΕ1324652 referido método compreende a detecção do nível de transcrição do ARNm transcrito a partir do gene codificando um homólogo humano de um modificador genético aqui divulgado num tecido ou numa célula apropriados de um ser humano, em que uma transcrição anormal em comparação com os níveis de controlo é diagnóstico da referida condição ou de uma predisposição para a referida condição. Em particular, o referido modificador genético compreende a sequência nucleotídica de qualquer um dos homólogos humanos dos modificadores genéticos identificados na Tabela 1, de preferência, os polipéptidos dos homólogos humanos situados no cromossoma 10 aqui divulgados, de maior preferência, os polipéptidos codificados por SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 53, i.e. as sequências noc A conservadas, ou o polipéptido codificado por SEQ ID NO: 35, i.e. a sequência de EGR2, ou os polipéptidos codificados por SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 43, as sequências relacionadas com anquirina. A detecção de uma forma mutada de um gene codificando um modificador genético identificado de acordo com os métodos do presente invento que está associada a uma disfunção proporcionará uma ferramenta de diagnóstico que pode adicionar, ou definir, um diagnóstico de uma doença, ou uma susceptibilidade para uma doença, que resulta da sob-expressão, da sobre-expressão ou da expressão espacialmente ou temporalmente alterada do gene. As referidas doenças podem incluir, mas se limitam à Doença de Alzheimer ou outras condições caracterizadas por erros na 57 ΡΕ1324652 regulação da via de APP. Indivíduos possuindo mutações nos referidos genes podem ser detectados ao nivel do ADN através de uma variedade de técnicas.

Os ácidos nucleicos, em particular ARNm, para diagnóstico podem ser obtidos a partir de células de um sujeito, tais como do sangue, urina, saliva, tecido de biopsia ou material de autópsia. 0 ADN genómico pode ser utilizado directamente para detecção ou pode ser amplificado enzimaticamente através da utilização de PCR ou de outras técnicas de amplificação antes da análise. 0 ARN ou o ADNc podem também ser utilizados de um modo semelhante. As deleções e inserções podem ser detectadas através de uma mudança no tamanho do produto amplificado em comparação com o genótipo normal. A hibridação do ADN amplificado com sequências nucleotidicas marcadas codificando o homólogo humano de um polipéptido modificador genético do presente invento pode identificar mutações pontuais. As sequências perfeitamente emparelhadas podem ser distintas dos duplexes mal emparelhados através de digestão com ARNase ou através de diferenças nas temperaturas de fusão. As diferenças na sequência de ADN podem também ser detectadas através de alterações na mobilidade electroforética de fragmentos de ADN em géis, com ou sem agentes desnaturantes, ou através de sequenciação directa do ADN (e.g., Myers et al., Science 230: 1242, 1985). As mudanças na sequência em posições especificas podem também ser reveladas através de ensaios de protecção de nucleases, tais como protecção de ARNase e 58 ΡΕ1324652

Sl ou do método de clivagem química (ver Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 4397-4401, 1985). Noutra concretização, uma placa ("array") de sondas oligonucleo-tídicas compreendendo a sequência nucleotídica codificando um polipéptido modificador genético do presente invento ou fragmentos de uma tal sequência nucleotídica pode ser construída para conduzir uma pesquisa eficiente de, e.g., mutações genéticas. Os métodos da tecnologia de "arrays" são bem conhecidos e têm uma aplicabilidade geral e podem ser utilizados para responder a uma variedade de questões em genética molecular incluindo expressão génica, ligação genética e variabilidade genética (ver por exemplo: M. Chee et al., Science, Vol 274, págs. 610-613, 1996).

Os ensaios de diagnóstico oferecem um processo para diagnosticar ou determinar uma susceptibilidade a uma doença através da detecçâo de uma mutação num homólogo humano de um gene do modificador através dos métodos descritos. Adicionalmente, tais doenças podem ser diagnosticadas através de métodos compreendendo a determinação a partir de uma amostra derivada de um sujeito de um nível anormalmente diminuído ou aumentado do polipéptido ou do ARNm. A expressão diminuída ou aumentada pode ser medida ao nível do ARN utilizando qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica para a quantificação de polinucle-ótidos, tais como, por exemplo, amplificação de ácidos nucleicos, por exemplo PCR, RT-PCR, protecção de ARNase, "Northern blotting" e outros métodos de hibridação. As técnicas de ensaio que podem ser utilizadas para determinar 59 ΡΕ1324652 níveis de uma proteína, tais como um polipéptido do presente invento, numa amostra derivada de um hospedeiro são bem conhecidas dos peritos na técnica. Tais métodos de ensaio incluem radioimunoensaios, ensaios de ligação competitiva, análise de "Western blot" e ensaios ELISA.

Tais condições de hibridação podem ser altamente rigorosas ou menos altamente rigorosas, tal como descrito acima. Nos casos em que as moléculas de ácido nucleico são desoxioligonucleótidos ("oligos"), as condições altamente rigorosas podem se referir, e.g., a lavagem em SSC 6></pirofosfato de sódio a 0,05% a 37°C (para oligos de 14 bases), 48°C (para oligos de 17 bases), 55°C (para oligos de 20 bases) e 60°C (para oligos de 23 bases). Os intervalos apropriados de tais condições de rigor para ácidos nucleicos de composições variáveis são descritos em Krause e Aaronson, Methods in Enzymology 200: 546-556, 1991, para além de Maniatis et al., citado acima.

Assim noutro aspecto, o presente invento refere-se a um estojo de diagnóstico que compreende: a) um polinucleótido de um homólogo humano de um modificador genético identificado de acordo com os métodos do presente invento, de preferência, um polipéptido de um homólogo humano situado no cromossoma 10 aqui divulgado, ou um fragmento deste, b) uma sequência nucleotídica complementar à de (a) ; c) um polipéptido de um modificador genético do 60 ΡΕ1324652 presente invento, de preferência o polipéptido de um homólogo humano dos modificadores genéticos identificados na Tabela 1, de preferência, o polipéptido de um homólogo humano situado no cromossoma 10 aqui divulgado, ou um fragmento deste; ou d) um anticorpo para um polipéptido de um modificador genético do presente invento, de preferência o polipéptido de um homólogo humano dos modificadores genéticos identificados na Tabela 1, de preferência, o polipéptido de um homólogo humano situado no cromossoma 10 aqui divulgado.

Apreciar-se-á que num tal estojo, (a), (b), (c) ou (d) pode compreender um componente substancial. É também contemplado que um tal estojo pode compreender componentes dirigidos a um ou mais dos referidos homólogos humanos. Tal estojo será útil em diagnóstico de uma doença ou susceptibilidade a uma doença, particularmente a uma doença ou condição associada a erros na regulação da via de APP incluindo, mas não se limitando à Doença de Alzheimer.

As sequências nucleotidicas dos homólogos humanos dos modificadores genéticos do presente invento podem também ser utilizadas para análise de ligação genética. Desde que a sequência humana completa do genoma seja conhecida, a sequência nucleotídica de interesse pode ser especificamente mapeada numa determinada posição num cromossoma humano individual. O mapeamento das sequências relevantes nos cromossomas de acordo com o presente invento 61 ΡΕ1324652 é um importante primeiro passo na correlação das sequências com a doença associada ao gene. Uma vez mapeada uma sequência numa posição cromossómica exacta, a posição física da sequência no cromossoma pode ser correlacionada com dados do mapa genético. Tais dados são encontrados, por exemplo, em V. McKusick, "Mendelian Inheritance in Man" (disponível "on-line" em Johns Hopkins University Welch Medicai Library). A relação entre genes e doenças que foram mapeados na mesma região cromossómica é então identificada através de análise de ligação (co-hereditariedade de genes fisicamente adjacentes). Dados recentes indicam que existe uma região no cromossoma 10 humano ligada à Doença de Alzheimer (Bertram et al., Ertekin-Taner et al., Myers et ai., Science 290: 2302-2305, 2000), assim, homólogos humanos dos modificadores genéticos identificados de acordo com os métodos do presente invento podem ser sujeitos a análise de mapeamento cromossómico utilizando técnicas convencionais. É também divulgada uma molécula de ácido nucleico isolada, de preferência uma molécula de ADN, em que a molécula de ácido nucleico é uma das sequências conservadas do homólogo nocA humano expostas em SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 53. Igualmente preferida é uma molécula de ácido nucleico isolada, de preferência uma molécula de ADN, codificando um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos codificada pela sequência de EGR2, exposta em SEQ ID NO: 35. Igualmente preferida é uma molécula de ácido nucleico isolada, de preferência uma 62 ΡΕ1324652 molécula de ADN, codificando um polipéptido consistindo nas sequências de aminoácidos codificadas por qualquer uma das sequências das proteínas com repetição de anquirina, expostas em SEQ ID NO: 41 ou SEQ ID NO: 43.

Utilizando técnicas convencionais, podem ser criadas moléculas anti-sentido, ARN de cadeia dupla, ADN de tripla hélice e ribozimas, dirigidas a uma sequência nucleotídica apropriada de um modificador genético. Modificações da expressão génica podem ser obtidas através do desenho de moléculas anti-sentido, ADN ou ARN, para as regiões de controlo dos genes listados na Tabela 1, i.e. os promotores, estimuladores e intrões. Oligonucleótidos derivados do local de início da transcrição, e.g., entre as posições -10 e +10 do local de início da transcrição, são preferidos. De modo semelhante, a inibição pode ser alcançada utilizando metodologia de emparelhamento de bases em "tripla hélice". O emparelhamento em tripla hélice é útil porque causa a inibição da capacidade da dupla hélice para se abrir suficientemente para a ligação de polime-rases, factores de transcrição ou moléculas reguladoras. Avanços terapêuticos recentes utilizando ADN triplex foram descritos na literatura (Gee, J.E. et al. (1994) Em: Huber, B.E. e B.I. Carr, "Molecular and Immunologic Approaches", Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y.). Moléculas anti-sentido podem também ser desenhadas para bloquear a tradução do ARNm impedindo que o transcrito se ligue aos ribossomas. 63 ΡΕ1324652

As ribozimas, moléculas de ARN enzimáticas, podem também ser utilizadas para catalisar a clivagem especifica de ARN. 0 mecanismo de acção das ribozimas envolve a hibridação especifica de sequência da molécula de ribozima ao ARN alvo complementar, seguido de clivagem endonucleo-lítica. Exemplos que podem ser utilizados incluem moléculas de ribozima com um motivo de cabeça de martelo modificadas que podem especificamente e eficientemente catalizar a clivagem endonucleolitica de sequências codificando os produtos génicos da Tabela 1.

Os locais específicos de clivagem por ribozimas dentro de qualquer potencial alvo de ARN são identificados inicialmente fazendo um varrimento da molécula alvo quanto a locais de clivagem por ribozima que incluem as seguintes sequências: GUA, GUU e GUC. Uma vez identificadas, sequências curtas de ARN de entre 15 a 20 ribonucleótidos correspondendo à região do gene alvo contendo o local de clivagem podem ser avaliadas quanto a características estruturais secundárias que possam tornar os oligonucleó-tidos inoperantes. A adequabilidade dos alvos candidatos pode também ser avaliada através de testes de acessibilidade à hibridação com oligonucleótidos complementares utilizando ensaios de protecção de ribonucleases.

As moléculas anti-sentido e as ribozimas podem ser preparadas através de qualquer método conhecido na técnica para síntese de moléculas de ácido nucleico. Estas incluem técnicas para síntese química de oligonucleótidos 64 ΡΕ1324652 tais como síntese química de fosforamidite em fase sólida. Alternativamente, moléculas de ARN podem ser geradas através de transcrição in vitro e in vivo de sequências de ADN codificando os genes da Tabela 1. Tais sequências de ADN podem ser incorporadas numa ampla variedade de vectores com promotores de ARN-polimerase adequados tais como T7 ou SP6. Alternativamente, estas construções de ADNc que sintetizam constitutivamente ou indutivamente ARN anti-sentido podem ser introduzidas em linhas celulares, células ou tecidos.

Os vectores podem ser introduzidos em células ou tecidos através de muitos meios disponíveis, e podem ser utilizados in vivo, in vitro ou ex vivo. Para terapia ex vivo, os vectores podem ser introduzidos em células estaminais tomadas do paciente e propagadas de modo clonal para transplante autólogo de volta ao mesmo paciente. A distribuição através de transfecção e através de injecções de lipossomas pode ser alcançada utilizando métodos que são bem conhecidos na técnica. A inibição específica de genes da expressão génica pode também ser alcançada através da utilização de tecnologias convencionais de ARN de cadeia dupla. Uma descrição de tal tecnologia pode ser encontrada em WO 99/32619.

Mais ainda, tais moléculas podem ser utilizadas como componentes de métodos de diagnóstico e estojos por 65 ΡΕ1324652 meio dos quais pode ser detectada a presença de um alelo que cause doenças associadas a anomalias na via de APP e/ou Doença de Alzheimer.

Outros objectivos, características, vantagens e aspectos do presente invento tornar-se-ão aparentes aos peritos na técnica a partir da seguinte descrição. Deve-se, contudo, compreender que a seguinte descrição e os exemplos específicos, embora indicando concretizações preferidas do invento, são dados apenas para fins de ilustração.

EXEMPLOS

Os seguintes procedimentos são efectuados para conduzir os exemplos:

Moscas Transqénicas

Os métodos para a criação de moscas Drosophila melanogaster transgénicas são bem conhecidos dos peritos na técnica. Pode ser empregue qualquer método convencional, por exemplo, as técnicas básicas de laboratório que estão envolvidas na criação das moscas do presente invento estão descritas em Spradling, acima. Tal como contemplado aqui, moscas transgénicas podem ser criadas através de fusão directa de sequências de ADN de interesse com sequências de controlo da expressão como descrito abaixo. Por exemplo, as estirpes transformadas são geradas utilizando as construções discutidas acima de acordo com métodos convencionais. Diversas inserções independentes podem ser obtidas para as 66 ΡΕ1324652 construções, UAS-Abeta40, UAS-Abeta42, UAS-C99wt, UAS-C99V717I (Mutação London) e pGMR-Abeta42.

Reserva de moscas

As linhas Gal4 que podem ser utilizadas para dirigir a expressão dos transgenes nas moscas transgénicas do presente invento incluem, mas não se limitam a, apterous-Gal4 e 7B- -Gal4 . Descrições das linhas Gal4 mencionadas e notas sobre os seus padrões de expressão específicos podem ser encontradas em Flybase (http://flybase.bio.indiana.edu). As novas estirpes transgénicas geradas no laboratório incluem estirpes possuindo os transgenes UAS Abeta4o e Abeta42, UAS C99 de tipo selvagem e UAS C99 London (possuindo a mutação associada à doença de Alzheimer FAD) e GMR Abeta42. A estirpe yw;BcElp/CyOHop, expressando uma transposase, e as estirpes yw;Gla/SM6a e yw;Dr/TM3 Sb Ser foram obtidas a partir de R. Padgett, Waksman Institute, Rutgers University. As moscas W1118 e as moscas GMR-GAL4 eram do centro de reserva Bloomington. A estirpe pGMR-1 é uma reserva publicamente disponível e foi obtida no laboratório de G. Rubin em UC Berkeley.

Construções de ADN e técnicas moleculares

Um fragmento de ADN codificando para o péptido Αβ 42 e fundido com o péptido sinal humano da pré- 67 ΡΕ1324652 proencefalina é amplificado por PCR e clonado no local BglII do vector de transformação do elemento P específico do olho de Drosophila, pGMR (Hay et al., Development 120: 2121-2129, 1994) e a inserção é sequenciada através de sequenciação de fluorescência automática (ACGT Inc.). Mostrou-se que o péptido sinal humano da pré-proencefalina dirige com sucesso a secreção de Αβ 42 a partir de células de mamífero transfectadas. GMR é composto por cinco cópias em cadeia de um elemento de resposta derivado do promotor do gene rodopsina-1, um local de ligação para o factor de transcrição específico do olho GLASS (Ellis et al., Development 119 (3): 855-65, 1993). Assim, a expressão de Abeta é dirigida no padrão do activador da transcrição GLASS no olho. O fragmento de ADN de cima é subsequentemente clonado num elemento P contendo o vector que facilita a inserção do transgene no genoma da Drosophila. Todas as manipulações moleculares são feitas de acordo com protocolos padrão (ver, por exemplo, Sambrook, Fritsch e Maniatis, "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) .

Um fragmento de ADN codificando para o péptido C99 e fundido com o péptido sinal humano da pré-proencefalina é amplificado por PCR e clonado no vector de transformação pUAST tal como descrito em Brand e Perimmon.

As construções UAS-Abeta40, UAS-Abeta42, UAS-C99wt e UAS-C99V7171 contêm o péptido sinal do gene da pré-proencefalina seguido de fragmentos de Abeta humano (40 ou 68 ΡΕ1324652 42) ou C99 (de tipo selvagem ou com a mutação London) . Os fragmentos humanos são clonados no vector pUAST tal como descrito em Brand e Perrimon, acima. A clonagem neste vector coloca a sequência UAS a montante da região transcrita do gene inserido e permite também a integração no genoma da mosca através de recombinação do elemento P.

Cruzamentos genéticos, análise e visualização dos fenótipos

As moscas são cruzadas de acordo com métodos convencionais excepto que todos os cruzamentos são mantidos a 29°C para uma expressão máxima dos fenótipos. No sistema de expressão binário de Gal4, esta temperatura maximiza a actividade da proteína Gal4. No caso de pGMR-Abeta42, observa-se que o fenótipo é mais forte a 29°C e assim estas moscas são também mantidas a esta temperatura.

Análise de "Western" A expressão génica ectópica pode ser ensaiada efectuando análise de "Western" de acordo com métodos convencionais. Os anticorpos que podem ser utilizados incluem o anticorpo monoclonal humano 6E10 criado contra a porção beta-amilóide do gene de APP e que reconhece também a porção C99 de APP (Senetek PLC, Napa, CA).

Protocolo do "Western"

Para detectar a expressão do péptido Αβ 42, moscas dos genótipos K18.1/K18.1, K18.3/K18.3, 69 ΡΕ1324652 K18.1/K18.1;K18.3/K18.3, KJl03/TM3Sb Ser, KJ103/KJ103, KJ54/CyO;KJ54/TM2 Ubx e pGMR-1 (moscas possuindo o vector pGMR sem inserção) são criadas a 29°C. 80-90 Cabeças de Drosophila de cada uma das estirpes de cima são colhidas, colocadas num tubo eppendorf em gelo seco contendo 100 μΐ de SDS a 2%, sacarose a 30%, Bistris 0,718 M e Bicina 0,318 M, com inibidores de proteases "Completos" (Boehringer Mannheim) e são moídas utilizando um homogeneizador mecânico. As amostras são aquecidas durante 5 minutos a 95°C, centrifugadas durante 5 minutos a 12000 rpm, e os sobrenadantes são transferidos para um tubo eppendorf novo. São adicionados β-mercaptoetanol a 5% e azul de bromofenol a 0,01% e as amostras são fervidas antes de serem carregadas. Para cada amostra são carregados aproxima-damente 200 ng de extracto de proteína total, num gel SDS-PAGE de Tricina/Tris a 15% contendo Ureia 8 Μ. O péptido Αβ 1-42 de controlo é o β-amilóide humano [1-42] (BIOSOURCE International, #03-111). As amostras são corridas a 40 V no gel de empacotamento e a 120 V no gel de separação. As amostras são transferidas para membranas de PVDF (BIO-RAD, #162-0174) durante 1 hora 0 100 V, e as membranas são subsequentemente fervidas em PBS durante 3 minutos. A hibridação do anticorpo é como se segue: o Ac primário 6E10 (SENETECK PLC, #300-02), que reconhece os primeiros 19 aminoácidos do péptido Αβ, é utilizado para sondagem (a uma concentração de 1:2000) em leite magro a 5%, PBS 1χ contendo Tween 20 a 0,1%, durante 90 minutos à TA. As amostras são lavadas 3 vezes durante 5 minutos, 15 minutos e 15 minutos cada em PBS lx-Tween-20 a 0,1%. O Ac 70 ΡΕ1324652 secundário é anti-ratinho-HRP (Amersham Pharmacia Biotech, #NA 931) e é utilizado a 1:2000 em leite magro a 5%, PBS 1χ contendo Tween 20 a 0,1%, durante 90 minutos à TA. As amostras são lavadas 3 vezes durante 5 minutos, 15 minutos e 15 minutos cada em PBS lx-Tween-20 a 0,1%. Para detecção é utilizado ECL (ECL Western Blotting Detection Reagents, Amersham Pharmacia Biotech, #RPN 2209) .

Histologia São efectuadas secções plásticas das cabeças das moscas de acordo com métodos convencionais, por exemplo, de acordo com os protocolos descritos em: "Drosophila

Protocols", página 236. Eds. W. Sullivan, M. Ashbumer, S. Hawley, CSHL Press 2000.

Crio-secções

Os olhos de adulto são crio-seccionados de acordo com Wolff, em "Drosophila Protocols", CSHL Press 2000, secções 13.1 e 13.2. O anticorpo primário é o monoclonal 6E10 (Senetek), que reconhece o péptido humano Αβ 42, utilizado a uma diluição de 1:3000. O sistema de detecção é o Vectastain ABC Kit (com o secundário IgG anti-ratinho biotinilado, e peroxidase de rábano H) (Vector Laboratories) . São feitas as seguintes modificações ao protocolo de Wolff: antes da incubação com o anticorpo primário 6E10, as crio-secções são bloqueadas em solução de bloqueio contendo soro normal de cavalo, de acordo com o protocolo 71 ΡΕ1324652 do Vectastain ABC Kit. A incubação com o secundário (pré-adsorvido com tecido de olho pGMR-1) é feita em PBS/BSA a 1% contendo soro normal de cavalo a 1-2%, também de acordo com o protocolo do Vectastain ABC Kit. O procedimento para o ABC Kit é seguido; as incubações com o reagente ABC são feitas em PBS/saponina a 0,1%, seguido de lavagens de 4* 10 min. em PBS/saponina a 0,1%. As secções são então incubadas em 0,5 ml por lâmina da solução de substrato de Peroxidase de Rábano H, 400 yg/ml de 3,3'-diaminobenzideno (DAB), H2O2 a 0,006% em PBS/saponina a 0,1%, e a reacção é parada após 3 min. com azida de sódio a 0,02% em PBS. As secções são lavadas várias vezes em PBS e desidratadas através de uma série de etanol antes de serem montadas em DPX (Fluka).

Caracterização do perfil de ARN para pesquisa de compostos

Os perfis de ARN podem ser ensaiados de acordo com a metodologia conhecida, incluindo a utilização de análise de "Northern blot" tradicional bem como tecnologia de chips de "microarrays" (Incyte Pharmaceuticals, Paio Alto, CA; Affymetrix, Santa Clara, CA). EXEMPLO 1 O Fenótipo de Olho Rugoso induzido por Expressão Ectópica de Αβ 42

Para elucidar as vias e o(s) mecanismo (s) em grande medida desconhecidos através dos quais Αβ 42 causa 72 ΡΕ1324652 neurodegeneração, é utilizado como modelo o olho de Drosophila, um tecido neural. Num esforço para imitar a sobre-expressão de Αβ 42 especifica de doença, são criadas moscas transgénicas cujo genoma compreende o transgene GMR-Abeta42-amilóide utilizando o sistema de expressão da fusão de GMR divulgado acima para expressar ectopicamente o transgene no olho de Drosophila em desenvolvimento. I. A sobre-expressão de Αβ 42 causa fenótipos de olho rugoso

Para expressar o péptido Αβ 42 no olho de Drosophila, a sequência de Αβ 42 é clonada no vector pGMR. 0 vector pGMR ("GLASS Multimer Repórter") contém um pentâmero de locais de ligação truncados para o factor de transcrição GLASS. GLASS é expresso extensamente durante o desenvolvimento do olho, começando nos discos oculares, os precursores dos olhos de Drosophila adulta, onde é detectado em neurónios foto-receptores em diferenciação. Continua a ser expresso especificamente no olho durante o desenvolvimento da pupa e do adulto (Moses et al., Nature 340(6234): 531-536, 1989; Moses e Rubin, Genes Dev. 5: 583-593, 1991) . A expressão do elemento GMR em moscas com 2 semanas de idade é examinada utilizando um gene repórter e é detectada uma boa expressão, sugerindo que o elemento GMR está bem activo na fase adulta. Assim, a expressão regulada por GMR é dirigida para o tecido do olho ao longo de todo o desenvolvimento do olho, bem como durante a fase adulta, tornando-o um sistema adequado para expressão de Αβ 42. 73 ΡΕ1324652

Duas linhas transgénicas independentes são originalmente estabelecidas com a construção pGMR-Αβ 42, K18.1 e Kl 8.3. Adicionalmente, outra linha transgénica, pGMR-1, expressando o mesmo vector sem uma inserção, é examinada como controlo negativo. As moscas de controlo com o transgene pGMR-1 e as moscas possuindo uma cópia do transgene K18.3 ou Kl8.1 não apresentam um olho rugoso. Semelhantemente, as moscas possuindo uma cópia de cada um de ambos os transgenes de cima (K18.3 e K18.1) ou duas cópias do transgene Kl 8.1 têm também olhos de tipo selvagem. Em contraste, as moscas com duas cópias de Kl 8.3 têm um fenótipo suave de olho rugoso; o exame dos olhos das moscas ao microscópio óptico indica que a sobre-expressão ectópica de Αβ 42 destrói o arranjo trapezoidal regular das células fotorreceptoras dos omatidios (unidades singulares idênticas, que formam o olho composto de Drosophila) . As observações acima sugerem que pode haver uma resposta à dose do fenótipo de olho rugoso ao número de cópias dos transgenes presentes no genoma da mosca. Para examinar melhor esta hipótese, o número de transgenes é aumentado para três (2 cópias de Kl 8.1 com uma cópia de K18.3 ou uma cópia de Kl 8.1 com duas cópias de Kl8.3). Estas estirpes apresentaram também olhos rugosos. Finalmente, quando estavam presentes quatro cópias do transgene (2 cópias de K18.1 com 2 cópias de K18.3), as moscas apresentaram um fenótipo de olho rugoso muito mais severo confirmando a hipótese de resposta à dose. A penetrância dos fenótipos de olho rugoso é de 100% em todas as combinações genéticas. Deve observar-se também que um fenótipo mais severo é observado quando as moscas são criadas a 29°C. Uma 74 ΡΕ1324652 exigência de temperatura para expressividade de fenótipos do olho foi descrita anteriormente (Karim e Rubin, Development 125(1): 1-9, 1998) e pode ser especifica para o olho, apesar de não estar restringida a sistemas de expressão contendo GMR. Tal dependência pode ser atribuída a uma taxa de transcrição e/ou metabólica mais elevada, ou a uma conformação alterada da proteína a uma temperatura mais alta. II. Os transgénicos Αβ 42 apresentam fenótipos de olho rugoso, cuja severidade depende do número de cópias do transgene

Está bem estabelecido que o nível de expressão dos transgenes em Drosophila depende da localização cromossómica das inserções específicas, um fenómeno conhecido como "efeito de posição" (Kellum, R. e Schedl, P., Cell 64: 941-50, 1991). É possível então, gerando inserções independentes adicionais com o mesmo transgene, recuperar linhas transgénicas expressando níveis diferentes da proteína transgénica. Assim, poderia ser possível isolar linhas transgénicas que expressassem o transgene Αβ 42 a um nível suficientemente elevado para causar um fenótipo a uma temperatura mais baixa (25°C) , reflectindo assim condições mais fisiológicas. Para testar esta hipótese, são geradas novas inserções do transgene pGMR-Αβ 42 no genoma da mosca, utilizando o "saltar do elemento P" (Robertson, H.M. et al.

Genetics 118: 461-470, 1988). 75 ΡΕ1324652 É estabelecido um total de 19 linhas independentes da construção pGMR-Αβ 42 em novas posições cromossómicas. As novas estirpes são avaliadas como possuindo novas inserções com base na ligação cromossómica ou condição letal homozigótica do transgene, bem como através de diferenças na cor do olho (causada por níveis de expressão diferenciais do gene branco, utilizado como marcador de transformação). Larvas jovens das estirpes novas acima são subsequentemente criadas a 29°C até à eclosão e examinadas quanto à presença de um fenótipo do olho. Das 19 linhas novas, 7 linhas, ou 38%, mostram um fenótipo de olho rugoso. As estirpes que apresentam um fenótipo de olho rugoso são subsequentemente criadas a 25°C e registadas quanto a um fenótipo do olho.

As novas linhas transgénicas apresentam graus variáveis de severidade fenotípica, apresentando algumas delas um fenótipo mais severo do que o que foi originalmente observado na linha K18.1 e K18.3. Um tal exemplo é a linha KJ.103, na qual uma cópia do transgene dá olhos de adulto suavemente rugosos, caracterizada pela presença de "pontos" mais escuros espalhados (que correspondem a um omatídio pigmentado de vermelho mais escuro) no lado ventral do olho, enquanto que duas cópias do transgene causam extensa desorganização dos foto-receptores. Mais importante, esta linha específica apresenta o fenótipo de olho rugoso mesmo quando as moscas são criadas a 25°C. Quando as moscas KJ.103 são criadas a 29°C, a severidade do 76 ΡΕ1324652 fenótipo causado por uma ou duas cópias do transgene é dramaticamente aumentada.

Em resumo, os fenótipos de olho rugoso causados pelo péptido Αβ 42 mostram um espectro de severidade. As linhas muito suaves apresentam tipicamente numerosos "pontos" escuros/negros no lado ventral do olho, enquanto que as linhas suaves possuem uma aparência mais rugosa, desorganizada que cobre a parte ventral do olho. As linhas moderadas apresentam maior rugosidade no olho inteiro, enquanto que nas linhas mais severas o olho inteiro parece ter perdido/fundido muitas das cerdas dos omatidios e inter-omatidios, e o olho inteiro possui uma aparência lisa e brilhante. De modo interessante, o tamanho do olho é afectado de forma apenas moderada nas moscas com o nivel de expressão mais elevado de Αβ 42 (estirpe KJ54) . Isto é consistente com observações em moscas expressando a-sinucleína humana (Feany, M.B. e Bender, W.W., Nature 404: 394 -398, 2000). Nas moscas expressando poli-glutamina, huntingtina humana expandida, é observada uma redução muito ligeira do tamanho do olho, nas linhas transgénicas de expressão mais forte (Warrick, J.M. et al., Cell 93: 939-949, 1998) . Os resultados acima sugerem que a neurodege- neração induzida pela sobre-expressão de genes humanos da doença difere dos fenótipos causados pela sobre-expressão de genes que actuam em vias apoptóticas (Grether, M.E. et al., Genes Dev. 9: 1694-1708, 1995), nos quais o tamanho ou o olho são primeiramente afectados. 77 ΡΕ1324652

Com base nos resultados acima, coloca-se a hipótese de que a severidade do fenótipo de olho rugoso depende da quantidade de proteína Abeta presente. Em consequência desta hipótese, deve-se esperar que o transgene KJ. 103 apresente um nível de expressão proteica mais elevado do que o transgene K18.3 (ver abaixo). III. A expressividade do fenótipo de olho rugoso correlaciona-se com os níveis de proteína Αβ 42

Para determinar se a severidade do fenótipo de olho rugoso se correlaciona com os níveis de expressão do péptido Αβ 42, são efectuadas análises de "Western blot" de extractos proteicos de cabeças de Drosophila (as estirpes utilizadas estão descritas nos métodos acima). Os resultados indicam que os animais com duas cópias do transgene têm aproximadamente duas vezes mais a quantidade de péptido Αβ 42 do que os animais com uma cópia do transgene. De modo interessante, apesar das moscas com duas cópias de K18.1 expressarem o péptido Αβ 42 em quantidades detectáveis, não têm nenhum fenótipo no olho adulto visível. As moscas com as duas cópias do transgene Kl 8.3 de expressão mais elevada, expressando quantidades globalmente maiores do péptido Αβ 42 mostram o fenótipo de olho rugoso. Isto também é verdadeiro para moscas expressando duas cópias do K18.1 e duas cópias dos transgenes K18.3. As moscas expressando apenas uma cópia do transgene KJ103 têm quantidades de proteína aproximadamente iguais às das moscas expressando duas cópias do transgene K18.3, 78 ΡΕ1324652 confirmando a hipótese de que o transgene KJ103 apresenta niveis mais elevados de expressão proteica relativa.

Os resultados acima indicam que existe a necessidade de um certo nivel de proteina Αβ 42 para se gerar um fenótipo visível. É ainda possível que quantidades mais baixas de expressão de Αβ 42 causem menores destruições que seriam apenas visíveis ao nível ultra-estrutural. Para testar isto, são examinadas secções finas (1,5 ym) de cabeças de moscas adultas. Estes dados indicam que, em comparação com os olhos de uma mosca possuindo o vector pGMR vazio, no qual os foto-receptores que coram com azul de toluidina estão dispostos regularmente, as moscas possuindo uma cópia do transgene K18.3 que se expressa de modo moderado possuem pequenas anomalias: faltam alguns foto-receptores, formam-se massas coradas de azul em torno dos omatídios e surgem alguns espaços no tecido. Estes olhos parecem normais macroscopicamente.

Secções de olhos expressando duas cópias do transgene K18.3, de acordo com observações ao nível macroscópico, apresentam uma desorganização variável. À medida que o fenótipo piora, a concentração de massas densas coradas em torno dos omatídios aumenta, tal como os espaços no tecido. Os omatídios parecem menores e faltam foto-receptores. Duas cópias do transgene KJ103 de maior expressão apresentam um fenótipo semelhante em severidade. Finalmente, os olhos de Drosophila que expressam quatro cópias do transgene KJ54 de forte expressão apresentam uma 79 ΡΕ1324652 perda quase completa dos foto-receptores. Adicionalmente, estes olhos mostram uma abundância de massas densas coradas e de espaços no tecido. Apesar de não ser claro neste ponto se as massas densas coradas que cercam os omatidios são células anormais/a morrer ou se contêm péptido Abeta agregado, é claro que a sua acumulação é coincidente com a degeneração global do olho observada.

Para visualizar a expressão do beta-amilóide no tecido do olho, secções de olhos expressando Αβ são coradas com um anticorpo que reconhece o péptido Αβ humano. As secções transversais do tecido do olho apresentam uma coloração pontuada que está ausente nos controlos. Coloca-se a hipótese de esta coloração pontuada corresponder a pequenos agregados/depósitos de beta-amilóide. A localização celular desta coloração bem como a natureza exacta do agregado/depósito, utilizando corantes conhecidos para Αβ está sob investigação. stress

Em resumo, divulga-se aqui que a introdução de mais cópias do transgene Αβ 42 no olho de Drosophila, reflectido por niveis aumentados da proteína Αβ, tem um efeito aditivo no fenótipo de olho rugoso. É possível que seja necessária uma certa concentração do péptido Αβ 42 para afectar o seu estado de agregação/conformação. Alternativamente, podem ser necessários níveis de saturação do péptido para manifestação do efeito tóxico. 0 facto de Αβ exercer efeitos neurotóxicos em várias vias de sinalização, (níveis de cálcio intracelular, 80 ΡΕ1324652 oxidativo, resposta inflamatória, sinalização dos receptores muscarinicos e nicotinicos, revisto em Fraser, S.P., et al., Trends Neurosci. 20: 67-72, 1997; Mattson, M.P. Physiol. Rev. 77: 1081-1132, 1997; e Coughlan, C.M. e Breen, K.C., Pharmacol. and Ther. 86: 111-144, 2000; Hellstrõm-Lindahl e Court, Behav. Brain Res. 113(1-2): 159-168, 2000), pode indicar a necessidade de níveis saturantes para causar destruições. Está contudo claro que expressar quantidades moderadas do péptido parece não ter nenhuma consequência para a estrutura do olho adulto ao nível morfológico grosseiro. IV. O fenótipo do olho rugoso induzido pelo péptido Αβ 42 piora com a idade

Está bem estabelecido que em pacientes de Alzheimer, a acumulação crónica do péptido Αβ conduz à manifestação inicial da doença e ao progressivo agravamento dos sintomas. Para testar se se poderia imitar este aspecto da doença no modelo de Drosophila, é registado o grau de rugosidade do fenótipo do olho em moscas envelhecidas. São examinadas duas estirpes de moscas, expressando pGMRl (como controlo negativo) e K18.3. As moscas K18.3 são utilizadas porque nesta estirpe transgénica há um espectro de severidade fenotipica e é assim mais fácil registar as mudanças. As moscas das duas estirpes são criadas a 25°C e 0-2 dias após a eclosão são 81 ΡΕ1324652 transferidas para 29°C, para induzir uma expressão mais elevada do transgene. As moscas são registadas quanto ao fenótipo do olho aproximadamente todas as semanas, durante um total de um mês, a partir dai. As moscas K18.3 são classificadas em três grupos diferentes (moderado, suave, intermédio), de acordo com a severidade observada do fenótipo do olho. Tal como mencionado anteriormente, as moscas que expressam pGMRl não apresentaram nenhum fenótipo do olho.

Os dados indicam uma mudança na severidade fenotipica das moscas que expressam Abeta à medida que envelhecem: quando as moscas eclodem, não se observam olhos com um fenótipo intermédio, enquanto que 15% da população aos sete dias tem um fenótipo intermédio. Também aos sete dias, toda a descendência apresenta algum grau de fenótipo de olho rugoso, enquanto que 42% não apresentam nenhum fenótipo após a eclosão. Aos 32 dias, apesar de um grande número de moscas ter morrido, a razão global de moscas com fenótipo suave versus intermédio não é significativamente alterada, sugerindo que foi alcançado o efeito máximo da expressão de Abeta. 0 modelo de Drosophila aqui divulgado parece imitar o agravamento progressivo e associado à idade dos sintomas da doença de Alzheimer, um importante aspecto da doença. 0 aumento observado na severidade do fenótipo do olho à medida que as moscas envelhecem pode ser atribuído à 82 ΡΕ1324652 maior sensibilidade das células neuronais aos níveis do péptido Αβ. De facto, tal como mencionado acima, o péptido Αβ está a ser produzido durante todo o estádio adulto de Drosophila. É assim possível que níveis aumentados de Αβ não possam ser eficazmente reciclados, resultando em acumulação do péptido nas células de Drosophila. Alternativamente, é possível que as células envelhecidas sejam mais vulneráveis à presença do péptido Αβ. V. 0 fenótipo de olho rugoso e o grau de células apoptóticas nos discos imaginais do olho das larvas e do olho adulto

Tal como mencionado anteriormente, o péptido Αβ 42 possui efeitos tóxicos conhecidos e foi sugerido ter um papel na apoptose. Com base nisto, discos imaginais de olhos de larvas da terceira fase, os precursores do olho adulto, são examinados quanto a evidências de apoptose ou morte celular programada. Discos imaginais dos olhos retirados de larvas K18.1/K18.1;K18.3/K18. .3, criadas a 29°C, são corados com laranja de acridina de acordo com métodos convencionais, o que causa fluorescência das células apoptóticas. Como controlos são utilizadas as seguintes estirpes, nenhuma das quais apresenta qualquer anomalia do olho: W1118 (um controlo de tipo selvagem) e pGMR-1 (possuindo o vector pGMR "vazio") criadas a 29°C e GMR-GAL4 (expressando Gal4 sob o controlo do elemento GMR), criada a 18°C. 83 ΡΕ1324652

Os resultados indicam que quase nenhuma ou nenhuma morte celular é observada no controlo de tipo selvagem, w1118. Em contraste, alguma quantidade de morte celular pode ser detectada na linha K18.1/K18.1;K18.3/K18.3. Quando os controlos que possuem o vector pGMR mas não apresentam nenhum fenótipo do olho (pGMR-Ι e GMR-GAL4) são examinados, é também observada alguma morte celular, comparável em extensão à observada nas moscas experimentais, K18.1/K18.1;K18.3/K18.3. Consequentemente, parece provável que uma certa quantidade de morte celular seja tolerada durante o desenvolvimento do olho e que não cause nenhuns defeitos no olho adulto, pelo menos ao nivel morfológico grosseiro. Adicionalmente, sugere-se aqui que se a apoptose tiver qualquer envolvimento na criação do fenótipo do olho rugoso, não se manifesta durante o desenvolvimento inicial do olho.

Para testar se o fenótipo do olho rugoso observado é causado por apoptose durante os estádios adultos de Drosophila, o inibidor de apoptose DIAPl é co-expresso no olho de Drosophila. Esperar-se-ia que a co-expressão de DIAPl em olhos expressando Abeta suprimisse, pelo menos parcialmente, o fenótipo de olho rugoso (dados não mostrados) . Uma vez que não se observa nenhuma supressão com duas estirpes diferentes expressando DIAP, pode ser que o fenótipo de olho rugoso observado não seja causado por morte celular apoptótica ectopicamente induzida. Os mesmos 84 ΡΕ1324652 resultados foram obtidos quando foi utilizado o gene de P35 de baculovírus anti-apoptótico. Estes resultados sugerem que os efeitos causados pelo péptido Αβ 42 no olho de Drosophila podem ser mediados por vias celulares que não resultam em apoptose.

As acções de Αβ 42 são bastante complexas e podem afectar outras proteínas conhecidas como sendo factores do desenvolvimento da DA. Mostrou-se que PS 1 e PS 2 co-imunoprecipitam com APP (Xia et al., PNAS USA 94(15): 8208-13, 1997) e que Αβ 42 se pode ligar directamente a PS 2 in vitro (Czech et al.r Society for Neuroscience 25: 641.1, 1999) . É interessante observar que a sobre-expressão das formas de tipo selvagem e mutante de PS resultam também numa maior susceptibilidade a apoptose em diversos sistemas experimentais, incluindo o olho de Drosophila (Ye, Y. e Fortini, M., j. Cell Biol. 146: 1351-1364, 1999). Nestes estudos, é sugerido que a presenilina de Drosophila (Dps) exerce um efeito negativo dominante quando expressa a níveis elevados. Não é claro como é que Dps causa apoptose das células, mas o mecanismo poderá envolver a desregulação das vias de sinalização do desenvolvimento de Notch e/ou Wnt (revisto em Anderton et al., Mol. Med. Today 6: 54-59, 2000) . Não é claro se a sobre-expressão de Αβ 42 no sistema aqui divulgado pode afectar a função de Dps através, possivelmente, da interferência com uma ou o mais destas vias de sinalização. De modo interessante, a sobre-expressão de Αβ 40 ou de Αβ 42 realça um fenótipo induzido 85 ΡΕ1324652 por Dps (presenilina de Drosophila) no mesmo tecido (dados não mostrados), sugerindo o envolvimento das duas proteínas na mesma via. EXEMPLO 2

Fenótipo da Asa Côncava Induzido pela Expressão Ectópica de C99

As Drosophila transgénicas que possuem uma cópia de pUAS-C99 (de tipo selvagem ou com a mutação London) e uma cópia de apterous-Gal4 são criadas utilizando métodos padrão tal como discutido acima. Os dados indicam que estas moscas exibem uma malformação das suas asas por a lâmina da asa estar curvada de um modo côncavo. Estes efeitos são confirmados com múltiplas inserções independentes do transgene C99. A análise de "Western" confirma a expressão deste transgene. Extractos proteicos de larvas inteiras expressando C99 (de tipo selvagem ou com a mutação London) sob o controlo de daughterless-Gal4 (um condutor de Gal4 expresso em todo o lado) apresentam uma banda proteica do tamanho previsto para C99, que imuno-reage com o anticorpo 6E10 (criado contra os primeiros 16 aminoácidos de C99) . Existem dados de que quando a porção do gene humano de APP referida como C100 era inserida no genoma de Drosophila e expressa no disco da asa, não gerava qualquer fenótipo visível (Fossgfreen et al., PNAS USA 95: 13703-13708, 1998) . Em contraste, os dados aqui relatados indicam que as 86 ΡΕ1324652 moscas transgénicas com a região C100 equivalente do APP humano (aqui designado C99), fundida com um péptido sinal diferente, apresentam uma malformação da asa. EXEMPLO 3

Defeitos Cognitivos Induzidos pela Expressão Ectópica de C99

As Drosophila transgénicas que possuem uma cópia de UAS-C99 (de tipo selvagem ou com a mutação London) e uma cópia de 7B-Gal4 (que permite a expressão nos corpora pedunculata do cérebro) são criadas utilizando técnicas padrão. Os defeitos cognitivos destas moscas podem ser examinados conduzindo ensaios olfactivos, de locomoção ou de aprendizagem e memória de acordo com métodos convencionais. Por exemplo, um comportamento locomotor alterado é observado nas moscas de cima, testadas utilizando a instalação de "reactividade ao escuro", descrita por Benzer, S., PNAS USA 58: 1112-1119, 1967). Especificamente, as moscas contendo uma cópia de UAS-C99 e uma cópia de 7B-Gal4 não respondem a agitação mecânica tão bem como as moscas de tipo selvagem, andando menos rapidamente do que as moscas de tipo selvagem após serem deitadas para o fundo do instrumento de ensaio. 0 teste de "reactividade ao escuro" para a locomoção é também descrito em "Behaviour, Learning and Memory" em: "Drosophila, A Practical Approach", Ed. D.B. Roberts (1998) Oxford University Press Inc. New York página 273. 87 ΡΕ1324652 EXEMPLO 4

Genes que Modificam Fenótipos de Drosophila como Alvos de Terapêuticos da Doença de Alzheimer

Tal como divulgado em detalhe abaixo, foram montadas pesquisas genéticas a fim de identificar os modificadores genéticos do fenótipo da asa côncava descrito no Exemplo 2. Os modificadores candidatos testados incluíram modificadores conhecidos de dois fenótipos de Drosophila induzidos pela expressão ectópica da presenilina de Drosophila (Dps) na asa e no escutelo (G. Boulianne, Hospital for Sick Children, Toronto, Canadá, comunicação pessoal), bem como mutações noutros genes candidatos. Com base na descoberta recente de um "ponto quente" ("hot spot") de genes de DA no cromossoma 10, foi efectuado o mapeamento cromossómico dos homólogos humanos dos modificadores genéticos de Drosophila acima mencionados. Os dados divulgados abaixo indicam que os homólogos humanos de vários dos modificadores genéticos aqui divulgados se localizam também no cromossoma 10 e é aqui contemplado que estes genes são alvos relevantes para o desenvolvimento de produtos farmacêuticos úteis para o tratamento da Doença de Alzheimer bem como de outras condições associadas a erros na regulação da via de APP.

Foi pesquisado um total de 93 mutações para identificar modificadores genéticos do fenótipo da asa 88 ΡΕ1324652 côncava induzido pela expressão ectópica de C99 na asa de Drosophila. A pesquisa baseia-se na medição da alteração na penetrância do fenótipo da asa quando a mutação externa está presente. Mais especificamente, o número de moscas com asas mutantes em comparação com o número de moscas com asas de tipo selvagem é contado no grupo experimental (moscas expressando C99 e a mutação a testar) e no grupo de controlo (moscas expressando apenas C99). A significância da alteração na penetrância do fenótipo mutante é avaliada através da medição do valor de P através de um teste T, nos quatro grupos acima mencionados. As mutações foram consideradas como modificando significativamente o fenótipo C99 quando P<0,05.

Uma lista dos modificadores genéticos que afectam o fenótipo de sobre-expressão de C99 e dos genes de Drosophila associados a estes modificadores genéticos é proporcionada na Tabela 1.

Todas as mutações identificadas como modificadores dos fenótipos de sobre-expressão de presenilina e C99 eram mutações de inserção (mediadas pela inserção no genoma de Drosophila do elemento transposão P semelhante a um retrovirus). A localização cromossómica exacta de cada uma destas inserções foi determinada anteriormente (Drosophila Genome Project BDGP, httpJ/www.fruitfly.org) . Para identificar o transcrito ou transcritos afectados por cada uma destas inserções, fizemos o varrimento de uma área genómica de 10 kB à direita e à esquerda de cada inserção quanto a transcritos de Drosophila conhecidos ou previstos. 89 ΡΕ1324652

Foram adoptados os seguintes critérios para selecção do transcrito mais provável afectado por uma dada inserção: a) distância dos transcritos ao local da inserção, e b) orientação de um transcrito relativamente à inserção.

Se uma área genómica contivesse mais de um transcrito candidato com a mesma orientação que a inserção, toda aqueles mais próximos da inserção eram seleccionados para mais análises. As sequências proteicas traduzidas dos transcritos de Drosophila da análise de cima formam o "Conjunto A". A presença de homólogos humanos das proteínas de Drosophila acima (no "Conjunto A") numa área ligada à DA do cromossoma 10 humano foi examinada. Foram identificadas duas regiões candidatas em torno de marcadores de Local Marcado da Sequência (STS) no cromossoma humano 10 (Bertram et al., Ertekin-Taner et al., Myers et al., Science 290: 2302-2305, 2000) por análise de ligação. Mapeámos as sequências dos marcadores STS utilizadas nestes estudos de análise de ligação ou sequências STS adjacentes a estes marcadores nos dados do genoma de Celera através de comparações de sequências por blastn (Altschul et al., 1997). Com base nesta informação de mapeamento foi definido um subconjunto do cromossoma 10 humano que incluía as duas regiões candidatas mostrando ligação significativa (Bertram et al., 2000; Ertekin-Taner et al., 2000; Myers et al., 2000) e a região entre elas. A sequência de ADN (sequências contíguas de Celera) e a lista correspondente de traduções proteicas de Celera foram retiradas para o subconjunto 90 ΡΕ1324652 definido e colocadas na forma de bases de dados de formato blast. A sequência de ADN e a lista de traduções proteicas de Celera para as regiões genómicas acima descritas formam o "Conjunto B" e o "Conjunto C", respectivamente.

Uma pesquisa tblastn com o "Conjunto A" contra o "Conjunto B" e uma pesquisa blastp com o "Conjunto A" contra o "Conjunto C" foram então efectuadas. Inicialmente foram seleccionados os resultados de tblastn e blastp com valores de E inferiores a IO’5. Depois a melhor correspondência de cada proteína de mosca resultante destas pesquisas foi escolhida e os genes/transcritos de mosca correspondentes foram verificados quanto à sua associação com os modificadores genéticos do fenótipo Dps e C99. Os catorze pares resultantes de transcritos/proteínas de mosca e humanos formam o "Conjunto D".

Os catorze pares de proteínas no "Conjunto D" foram testados quanto a ortologia estrita ou putativa. Isto foi alcançado através de comparações blastp com uma base de dados combinada de todas as proteínas Celera humanas e todas as de mosca. Primeiro, as proteínas de mosca do "Conjunto D" foram comparadas com cada proteína nesta base de dados. Depois as melhores correspondências humanas resultantes para cada uma das proteínas de mosca foram novamente comparadas com a base de dados de proteínas humana/de mosca combinada. Uma correspondente humana era classificada como um ortólogo estrito se todos os quatro critérios seguintes fossem cumpridos: 91 ΡΕ1324652 1. a proteína X de mosca tem a melhor correspondência com a proteína Y humana 2. a proteína X de mosca não tem melhor correspondência com nenhuma outra proteína de mosca do que com a proteína Y humana 3. a proteína Y humana tem a melhor correspondência com a proteína X de mosca 4. a proteína Y humana não tem melhor correspondência com nenhuma outra proteína humana do que com a proteína X de mosca.

Se somente os critérios 1) e 3) forem cumpridos, uma correspondente humana é classificada como um ortólogo putativo independentemente de se a proteína X de mosca tinha uma melhor correspondência com outra proteína de mosca, a proteína Y humana tinha uma melhor correspondência com uma outra proteína humana ou ambos. Todas as outras correspondentes humanas são consideradas homólogas. Após o teste de ortologia, é dada prioridade aos genes humanos candidatos de acordo com o seguinte: a) o gene humano ser homólogo do gene de mosca afectado pelo modificador genético de Drosophila, identificado na pesquisa genética b) o grau de semelhança de sequência da proteína humana (codificada pelo gene humano em a) com a proteína da Drosophila (codificada pelo gene de Drosophila em a). c) a proteína humana ser um ortólogo estrito ou putativo da proteína de mosca d) a localização cromossómica do gene humano em 92 ΡΕ1324652

relação aos marcadores STS, outros genes candidatos ou genes conhecidos da DA e) a função putativa da proteína humana e/ou da proteína homóloga de Drosophila f) a evidência de que o gene humano previsto é expresso g) a existência de SNPs validados ou previstos de codificação e/ou não codificantes na região de codificação do gene humano.

Para verificar se o gene homólogo humano é expresso, a base de dados de EST Incyte LifeSeq foi pesquisada com os transcritos humanos previstos correspondentes identificados a partir da base de dados Celera utilizando blastn.

Com base nestes critérios, é aqui contemplado que 4 genes humanos diferentes são genes relacionados com DA situados no cromossoma 10 humano. Abaixo são listadas as proteínas putativas, codificadas por estes genes humanos propostos. 1) hCP50765 (EGR2) SEQ ID NO: 35 2) hCP41313 (homólogo ao gene de mosca nocA)SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 53 3) hCP33787 (proteína relacionada com anqui-rina) SEQ ID NO: 41 4) hCP51594 (anquirina-3) SEQ ID NO: 43 93 ΡΕ1324652 0 transcrito previsto de Celera hCTl5097 foi manualmente conservado para produzir duas formas putativas da proteína hCP41313. A conservação foi efectuada através da identificação de ESTs correspondentes a este locus através de pesquisas blastn das bases de dados de EST Incyte LifeSeq e públicas e alinhando as ESTs identificadas com a sequência do transcrito previsto de Celera. A conservação produziu mudanças ligeiras na sequência de aminoácidos C-terminal e putativos resíduos adicionais no terminal N da sequência de aminoácidos prevista. As mudanças na parte C-terminal da sequência da proteína humana conduziram a um melhor alinhamento com a nocA de mosca nesta região. Devido aos resíduos adicionais no terminal N, Met 64 e Met 100 na sequência proteica de Celera (hCP41313) correspondem a Met 114 e Met 150 na tradução da nocA conservada completa, uma sequência de um transcrito homólogo, respectivamente. Subsequentemente analisámos e comparámos sequências de ADNc da colecção de ADNc FGA de Novartis e da colecção de ADNc de Incyte. Com base nestas análises clonámos e sequenciámos um clone de ADNc correspondendo ao gene nocA humano no cromossoma 10. A extremidade 5' deste clone de ADNc consiste no ADNc obtido a partir do clone fga94341 propriedade de Novartis e a extremidade 3' deste clone consiste no ADNc obtido a partir do clone 242278.1 de Incyte (SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53). EGR2 é um putativo ortólogo do transcrito de mosca previsto de Celera CT23724 (ver Tabela 1), que corresponde ao gene st ripe de Drosophila. A mutação P1505 94 ΡΕ1324652 de mosca (ver Tabela 1), que afecta o gene stripe, modifica somente o fenótipo de presenilina. 0 nocA humano é um putativo ortólogo do transcrito de mosca previsto de Celera CT14619 (ver Tabela 1), que corresponde ao gene nocA de Drosophila. A mutação de mosca EP2173 (ver Tabela 1) , que afecta o gene nocA, modifica os fenótipos de sobre-expressão de presenilina e C99. EGR2 é um factor de transcrição de dedos de zinco de tipo C2H2 que regula a mielinização do SNP. Em ratinhos foi mostrado que é importante para o desenvolvimento do proencéfalo (Schneider-Maunoury et al., Cell 75: 1199-1214, 1993; Swiatek & Gridley, Gene Dev. 7: 2071-2084, 1993). Quatro mutações em EGR2 foram descritas como associadas a neuropatias periféricas herdadas (Warner et al., Nature Genet. 18: 382-384, 1998; Timmerman et al., Neurology 52: 1827-1832, 1999). O homólogo humano de nocA é um putativo factor de transcrição com um domínio de dedos de zinco de tipo C2H2. Embora a sua função exacta não esteja ainda determinada, de acordo com os dados aqui divulgados, pode ter um papel significativo na patologia da Doença de Alzheimer. A proteína de Drosophila codificada pelo gene nocA é um factor de transcrição envolvido no desenvolvimento do cérebro embrionário e das estruturas ocelares do adulto. 95 ΡΕ1324652 A anquirina-3 existe em duas isoformas específicas do cérebro de 480 kDa e 270 kDa (Kordeli et al., J. Biol. Chem. 270: 2352-2359, 1995). Os polipéptidos de anquirina-3 específicos do tecido neural são candidatos para participar na manutenção e direccionamento de canais iónicos e moléculas de adesão celular para os nós de Ranvier e os segmentos iniciais dos axónios. Foi mostrado que a anquirina-3 se associa ao canal de sódio dependente de voltagem in vitro e se co-localiza com esta molécula nos nós de Ranvier, nos segmentos iniciais dos axónios e na junção neuromuscular (Srinivasan et al., Nature 333: 177-180, 1988; Kordeli et al., J. Cell Biol. 110: 1341-1352, 1990; Kordeli & Bennett, J. Cell Biol. 114: 1243-1259, 1991; Flucher & Daniles, Neuron 3: 163-175, 1989). O segundo homólogo humano do transcrito de mosca CT18415 pertence à família das proteínas relacionadas com anquirina (hCP33787) . O gene correspondente situa-se a 469 kpb da enzima que degrada a insulina (IDE) . Para além das repetições de anquirina, hCP33787 contém um domínio do motivo alfa estéril (SAM) . Foi sugerido que o domínio SAM estava envolvido na regulação de processos de desenvolvimento (Shultz et al., Protein Sei. 6: 249-253, 1997), foi descrito como mediando interaeções específicas proteína-proteína, e foi sugerido que formava estruturas poliméricas prolongadas (Thanos et al., Science 283: 833— 836) . O domínio SAM é incluído no alinhamento entre o transcrito de mosca CT18415 e hCP33787. Especulamos que pode ter um papel na agregação do β-amilóide. 96 ΡΕ1324652

Foi colocada a hipótese da γ-sinucleína poder estar envolvida na DA (Luedecking et al., Neuroscience Letters 261: 186-188, 1999). Postulamos que a γ-sinucleína poderia interagir com a proteína contendo repetições de anquirina hCP33787. Apoiando isto, foi mostrada uma interacção proteína-proteína entre a sinfilina, uma proteína relacionada com repetições de anquirina, e a a-sinucleína (Engelender et al., Nature Gen. 22: 110-114, 1999). Sabe-se também que os membros da família da sinucleína partilham um elevado grau de semelhança de sequência (64% de identidade de sequência entre a a-sinucleína e a γ-sinucleína, Lavedan, Genoma Res. 8: 871-880, 1998). Uma vez que a dobra da unidade de repetição de anquirina é conservada, os argumentos acima adicionam suporte a uma putativa interacção proteína-proteína entre hCP33783 ou hCP51594 e γ-sinucleína. É interessante notar que um SNP de codificação (E->K) está previsto para hCP33787 na posição 48 da sequência, que corresponde ao começo da região de repetição de anquirina. Esta variação da sequência poderia ser relevante no contexto de uma putativa interacção γ-sinucleína-anquirina porque envolve cadeias laterais de aminoácidos com cargas opostas. O SNP previsto na proteína relacionada com anquirina é particularmente interessante uma vez que a γ-sinucleína tem um SNP de codificação validado (V->E) na posição 110 (Ninkina et al., Hum. Mol. Genet. 7: 1417-1424, 1998), que codifica para a troca de uma cadeia lateral de aminoácidos neutra por uma carregada negativamente. Postulamos que estes polimorfismos podem ser relevantes para uma putativa interacção da γ-sinucleína com qualquer uma de hCP33783 ou hCP51594. ΡΕ1324652 - 1 -

Tabela 1: Modificadores genéticos modificador moscaCT Início Fim hCG hO hl Início Fim Valor de E nane do gene/família da proteína corentários SEQIDNO (hCT/hCP) EP(2)2107 CT253 94 183 hCG37225 hCT28457 hCP47994 96 185 4,00E-32 factor de interacção TG/ TALE/proteína homeobox KNOX modificador de Dps e C99 6/7 EP(2)2122 CT11970 54 411 KG22190 1013283 hCP39677 12 348 4,00E-75 n/a modificador de Dps e C99 8/9 EP(2)2151 CT3996 27 392 hCG22926 hCT14025 KP40373 39 415 1,00E- 109 mi relacionada com aspartil-protease modificador de C99 10/11 EP(2)2162 CT7676 15 374 hCG30594 hCT21765 KP44907 13 373 3,00E-97 n/a modificador de Dps e C99, letal sobre C99 12/13 EP(2)2173 014619 10 531 KG23983 hCT15097 hCP41313 100 564 l,00E-25 ortólogo do factor de transcrição de dedos de Zn nocA de Drosophílã modificador de Dps e C99, ortólogo hunano em lOg 14/15, 16/17, 52/53 EP(2)2205 09828 93 619 KG41821 hO33094 hCP51674 co 1180 4,00E-66 enzima conversora da angiotensina I (peptidil-dipeptidase A) 1 (ACE) modificador de Dps e C99, metaloprotease 18/19 - 2 - ΡΕ1324652 ΕΡ(2)2511 CT11457 6 258 hCG20663 hCT11743 hCP38288 28 2,76E+ 02 2,00E-65 chaperona de cobre para a superóxido dismutase/ superóxido dismutase [CU-ZN] modificador de Eps e C99 20121 ΕΡ(2)2554 CT10410 6 192 hCG39955 hCT31207 hCP49745 5 198 2f00E-16 glutationa-S-transferase teta 1 modificador de Dps e C99 22/23 ΕΡ(2)2554 CT10310 15 661 hCG40293 hCT31548 hCP50060 18 617 2,00E-90 relacionada com interseclina modificador de Dps e C99 24/25 ΕΡ(3)3041 CT5336 14 227 hCG42003 hCT33279 hCP51813 29 246 1,00E-39 HSA011916 modificador de Dps e C99 26127 ΕΡ(Χ)1526 CT10709 7 597 hCG37950 hCT29186 hCP47880 6 519 1,00E- 168 relacionada com o inibidor da proteina-cinase P58 modificador de Dps e C99 28/29 Ρ139β=1(2)0 5206 CI13013 316 655 hCG20435 hCT11514 KP38090 106 404 2,00E-72 ciclina modificador de Dps e C99 30131 Ρ148β=1(3)0 0090 CT22943 1818 2491 hCG32338 hCT23526 hCP46544 663 1248 2,00E-84 relacionada com a proteína de ligação de retinoblastoma modificador de Dps e C99 32/33 Ρ1505=1 (3) 0 0643 CT23724 760 1123 hCG40234 hCT31488 hCP50765 131 439 3,00E-63 resposta inicial de crescimento 2 (hcmólogo de Krox-20 (.Drosophila)) modificador de Dps, ortólogo humano em lOq 34/35 Ρ1548=1(3)0 1814 CI24038 75 167 hCG18539 hCT9598 KP36359 1 93 1,OOE-31 nla modificador de Dps e C99 36/37 - 3 - ΡΕ1324652 P2093=l(3)j 5C8 CT18339 218 438 hCG14845 hCT5866 hCP35211 38 278 6,00E-31 IAPde baculovírus contendo repetições 4/ iniMdor relacionado com apoptose modificador de Dps e C99 38/39 P2093=l(3)j 5C8 CT18415 62 293 hCG17907 hCT8961 hCP33787 353 569 2,00E-18 relacionada com anquirina modificador de Dps, homólogo humano em lOq 40/41 P2093=l(3)j 5C8 CT18415 50 349 hCG41783 1)033056 hCP51594 7 307 2,00E-23 anquirina-3, anquirina-G modificador de Dps, homólogo humano em lOq 42/43 021044 (3)) j3B3 CT13750 372 733 hCG20126 3 hCT20126 5 hCP201588 61 432 Ι,ΟΟΕ- 111 hidrolase carboxi-terminal da ubiquitina modificador de Dps e C99 44/45 Ρ2121=1(3)j 4Ε1 CT23760 87 283 hCG25031 hCT16153 hCP41935 239 437 2,OOE-37 proteína fosfatase com dupla especificidade modificador de Dps e C99 46/47 P2122=l(3)r L074 CT23073 5 879 hCG39269 hCT30519 hCP50592 21 902 0 deficiente na manutenção do minicromossoma (5. cerevísíae) 2 (mitotina)/ factor MCM de licenciamento da replicação do ADN modificador de Dps e C99 48/49 Ρ23194 (2) 0 6694 CT13966 1 932 hCG21123 hCT12209 hCP38695 18 937 0 alfa-adaptina modificador de C99 50/51 ΡΕ1324652 1

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS <110> Cohen, Dalia et al., <120> Identificação de Genes Envolvidos na Doença de Alzheimer utilizando Drosophila melanogaster

<130> 4-31612A <150> 60/236893 <151> 2000-09-29 <150> 60/298309 <151> 2001-06-14 <160> 53 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0

<210> 1 <211> 123 <212> ADN <213> Homo Sapiens <4 0 0 > 1 íjacçjcaQâât ttcgae&tga ctcaggata* gaagttcatc atesaaaatt ggtgttcttt 60 geagssgistg tgggtteaàa caaaggtgça áteatt^aç tcatggtgoí* 120

<210> 2 <211> 129 <212> ADN <213> Homo Sapiens <4 00> 2 g&egeagMt tecgaeatfa cteaggatat gaa§tt«ate «**«»«&** c gffcgttfcttt €0 gçap&ptg tofgttçuaa CMât$gt$c& atcàfctggáé tcatggtggg cggtptgtc 120 atagegt&g .... ^

<210> 3 <211> 300 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 3 gácgcâg&at tctgatatga ctcaggatat gaagttcatc atcaaaaátt ggtgttcttt 60 gc&gaagatg tgggttcaaa caaaggtgça atc&ttggâc teatggtggg cggtgttgtc 120 aiageg&çag tgategtçat çaccttggtg atgctga&ga agaaacagta cacatccatt 180 eâicstgftg tggtgpggfc tgaegccgct gtcaccccág agpgcgeea cetgtceMg 240 atgc&páp aeggettòp aMtçea&cc tacaagttcfc ttgagçagat gcagaactsg 300

<210> 4 <211> 300 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 4 gaçgçaga&t tccgacatgã ctcagg&tat gaagttcatc atcaaaaatt ggtgttcttt 60 geapagatg tgggttcaaa cãaaggtgca atcattggac tcatggtggg cggtgttgtc 120 atagcgacag tgátCâfccat cacettggtg atgctgaaga agaaacagta cacatctatt 180 cateatggtg tggtggaggt tgacgcegct gtcaccccag aggagcgcca cctgtccaag 240 atgcagcaga acggctàcga aa&tccaacc tacaagttct ttgagçagat geagaactag 300

<210> 5 <211> 72 <212> ADN ΡΕ1324652 2 <213> Homo Sapiens ãtggegeagt tectgagaet ttgeatetgg etgetagege ttggqtectg acagtgcâgg ca cctcctggct m 72

<210> 6 <211> 1537 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 6 ggtgcgccga gcaggagcag ggaacaaagg ageggagagg ggaggggaga aggg&gagcc ceeggccggc tgccagaaga tcceggeggg aggaagceca gaattccace caaggagegg gegcetggga tcagagcgtc etgfcttagca gagcaegtcc tscaagttae gggagagtcg getgtgaagg agacgttcgc tgteeeegct çetggcccct ccagaccccc gccttgcetc gcgctgggag gaatgaaagg caagaaaggt attgttgcag catctggcag tgagactgag gcatggacat tcccttggac ctttcttc&t ccgctggctc aggcaagaga gcaacctacc caaggagtct gtgcsgattc ttcgggattg gctgtatgag atgcct&tcc tteãgagcaa gaaaaegcgt tgctgtceea gçaaacae&c tac&ggtetg taaciggtte atcaacgccc gcegc&ggct cctccctgac aggatggcaa agatcca&at cagtteàcaa ttteccgccg tggggçcaap tgagctctgt ggagtccgtg ãtgggçatcã aaáácttéat gcc&gctcta catttcattc ctgtácagct gggccaaarc caaccctagg gaggccactg cgtcatcccc gggatcagtt ttggctcgtc eatcagtgat ctgccatacc cattga&âga tgtccctttc tctctctgcc agtcggtcgg tgtgggacaa tacagcagat ageggccsae aacttcacag acacctctct catgtaccça gtaaatctgg accaagtaeg aatacacaga gtggtcmt caaçactcçt caceggacct caaccaggac ttcagtggat ttcagcttct agtggatgtt gggetgieaga gatggagctt câggcaaaas: ttâcàgcttà acccattttc gtteteegaa àtgtcatgat tgccggggtg aaggeaagag atgaattgea tatttfcttat taatatttge aeatgggatt gctàaaacag cttcctgtta ttcáatggáa tacagtcatt ccaagaaetâ taaacttaaa gctactgtag ttttcttttt taeatgtttc ttggtagãtt attcataatg tgagatggtt tgtgattttt tttttcctcc ccttcecttt ttttgttatt tttteagact tagagaaect atagcatctt cteattccea tgtggaacag gatgcccaca tt&atMâtt ttccattttt tttcaaacaa gtatg&a gagttgggcg agtgtcactt ataacggctg ttatcocctg gggagatccà gatgagg&ca aggagaaggg caccgttaca ctgtctacgc âtgctgagaa atttctgaaa gaggsgaccc tctcctaagc aetgtgactg aaeaeagata gaggacactt ccccctactc gçactcaaac aagcaââacã ttattttata ctgagatgtc aaacaâãggg cccaatatca gtgcaatact tactgtctaa 60 120 ISO 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 060 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1537 <210> 7 <211> 332 <212> PRT <213> Homo Sapiens <4 00> 7 ile Pro 1 Pro Lys 5 Arg Ala pro Gly lie 10 Arg Ala ser Ile Thr Ala Gly >A Ala Arg Pro Thr ser 25 Tyr Gly Arg Vai Gly Asp vai 35 Arg teu ser pro Vai Ser 40 pro Leu Leu Ala 45 Pro Arg 50 Leu Ala Ser Arg Trp 55 Glu Gly Arg Ser Arg 60 Lys Gly 6$ lie Vai Ala Ala 70 ser Gly ser Glu Thr 75 Glu ASP Môt ASp n« Pro Leu ôc Asp Leu Ser ser ser Ala Gly Ser Arg Arg Arg Gly 100 Gly 85 Asn Leu pro Lys Glu 105 sv Ser vai Gin ile Glu 125 τρρ Leu Yyr 115 Hfs Arg Tyr Asn Ala 120 tyr ΡΓ0 Ser Ala leu 130 Leu ser Gin Gin thr 135 His Leu ser Thr Leu 140 Gin trp Phe 145 Ile Asn Ala íi Arg Arg; Leu leu Pro 155 Asp Met Asp Gly Lys Asp Pro 165 Asn Gin Phe Thr Ile 170 ser Arg Arg 11e Ser 01« Thr 180 Ser Ser Vai Glu Ser 185 Vâl Met Gly Ile cys Leu Ala ' 15

Gly Cys Glu 30

Pro pro Asp lys Gly lys

Glu Asp Ser E0

Gly Lys Arg 95

Leu Arg Asp 110

Gin Glu Lys

Vai Cys Asn

Leu Arg Lys 160

Gly Ala lys 175

Lys ASP Phe 3 ΡΕ1324652

Met Pr© Ala leu Glu Glu Thr Pro Phe HÍS Ser Cys Thr Ala Gly Pr© 195 Gly 200 205 Asa pr© Thr leu Arg pro Leu ser pro lys Pro Ser ser Pro Gly 210 Ala 215 220 ser vai leu Arg Pro ser vai Π e cys HÍ S Thr Thr vai Thr Ala 225 vai 230 235 240 leu Lys Asp Pro 245 Gin Phe Ser Leu Cys Glrc 250 Lys Ser Vai <3iy vai Gly 255 Thr Gin Asa Thr Asp fie Gin Ile Ala Ala Asn Phe Thr ASp Ser 260 Glu 265 270 leu Net ΤΫΓ Pr© Asp Thr CVS tys ser Gly pro ser Thr ASrt Thr <3l« 275 Phe 280 285 ser Gly leu Asp Thr Pr© Pro Pr© Thr Pro pro Asp leu Asn 290 295 300 Gin 305 ASP Phe Ser Gly Phe 310 Gin Leu leu Vai As© 315 Vai Ala leu lys Arg 320 Ala Ala Glu Met Glu leu Gin Ala ty$ UU Thr Ala 325 330

<210 > 8 <211> 1053 <212 > ADN <213> Homo Sapiens <4 00> 8 gtggtgcgaa tcctggagcg gcaaggcect cgggcagett ctgggggtgc agâcgatctc ¢0 agtgctgtge gcaaecaeac ttaccagatg ttgacacfcgc tggcagagga cçgtgcagtt 120

ccctcggccc ccaeaggccc tgggccçctg ttggagtttg ctctgcacga ggatctgttg ISO acccgtgtgt tgacatggca gctgcaatgg gátgagtttg gggatggggt tgeggaacgg 240 egggctgagc «actgaaact «tttgaaatg ctãgtg&gcg aagetcgcea gctaetgttg 300 cggcatggtc cagttxgtga ggctetgctc accctgctgg atgcetgtgg cegcectgtg 360 cecagtágcc cagcactgga tgaaggcttg gtgcúcttc tcagecàgct gtgtgtttgt 420

Gtggcceagg agtetteatt gctcgagttc ttcctgtagc cacctcctga gectggagcc 480 gctccecgtc ttcttctctt ttctcgcctt gtcecttttg tgeátcgaga gggcaccetg 540 ggccagcagg cccgtgatgc cctacttctt ctcatggctt tgtcagctgg gagccccact 600 gtgggccgct acatcgcgga tcacicttac ttctgécqjg tgttggccac agggctcagt: 660 gceetfitãct catcactgcc tcgaaagatt gaggttccagi gggatgattg gcactgtctg 720 çgaçgggiig actggctggg «gtgçcagcc cttgcaçwt tatgagttç çctggigttc ?89 tfçaàtgcag taattcaggt ggcteacccc ctggtgcãga agcagttggt tgattmtc 840 catããtgggt txctggtgcc tgtcatgggt cctgccttge acaagacctc tgtggaggag §00 atgatcgeea gtaccgccta cctggaactt ttccíacgga gtatctcaga gccfcgctttg 060 etecgtacct tcctgcgatt cctgttgttg caccggcatg acacctacac catcctcgac 1020 accctcgttg ctcgtattgg cagtaactcc cgg; 3.053

<210> 9 <211> 351 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 9

Vai vai Arg He leu 5 Ser G1 u Arg Gin Ala ASp ASP teu Ala Vai Arg Leu leu Ala GÍU Asp Arg Ala Vai 35 40 pro leu leu Glu Phe Alá LeU HÍS 50 55 Glu Thr Trp Gin teu Gin Trp ASp 65 Ala 70 Arg Glu Gin leu 85 Arg lys leu Phe Gin ΡΓ© leu teu HÍS Gly Pro Ala 100 val Leu Asp cys Gly Arg Pro 115 120 Gly Leu Vai leu leu leu Ser Gin 130 135 pro Ser leu leu Glu Phe Phe Leu

Gly Pro 10 HÍS Arg Ala Ai a Pro Gly 15 leu Gly Asn Thr Tyr Gin «et Thr 25 30 Gly pr© ser Ala pro Thr 45 Thr Gly Pro Glu ASp leu leu Arg Val leu 60 leu Gly Asp 75 teu Gly Val Glu Glu Arg 80 Arg GÍU «et val ser Glu Ala §0 95 val Arg Glu Ala leu leu Thr teu 105 110 Glu pro Ser ser Pro Ala 125 val leu Asp leu cys val cys 140 Ala Gin Glu Gin Pro Pr© Pro Glu pr© Gly Ala ΡΕ1324652 4 143 150 155 ISO Ala Pro Arg Leu Leu Leu Phe Ser Arg Leu Val Pro Phe Val; Hiis Arg 165 170 175 Glu oi y Thr Leu Gly Gin Glii Ala Arg ÁSp Ala teu i m Leu Leu N©t 180 163 Tle 190 Ala Leu ser Ala Gly ser Pro Thr val Gly Arg Tyr Ala A$p HIS 195 200 205 ser Tyr Phe Cys Pro Vãl Leu AU Thr Gly Leu ser Ala Leu Tyr ser 210 215 220 Hls Ser Leu Pro Arg Lys Ile Glu val pro Gly ASP Asp Trp Cys lsu 225 230 235 240 Arg Arg Glu AS p Trp Leu Gly Vai Pro Ala Leu Ala Leu Phe Het Ser 245 250 2S5 ser Leu Glu Phe eys Asn Ala Val 11 e Gin Val Ala His pro Leu val Gin 260 265 270 Lys Gin ?7t Leu vai Asp Tyr Ile His Asn Gly Phe Leu ?OÇ val Pro Val Met õly Pro Ala Leu Hls Lys «qU Thr Ser val Glu Glu set Ile Ala Ser Thr 290 295 300 Ala Tyr Leu GlU Leu Phe Leu Arg ser Ilé Ser Glu Pro Ala Leu 305 310 315 320 Lsa Arg Thr Phe Leu Arg Phe Leu Leu Leu His Arg HlS Asp Thr His 32S 330 335 Thr lie teu Asp 340 Thr Leu Vai Ala Arg 345 He Sly ser ASn Sêr 350 Arg

<210 > 10 <211> 1425 <212> ADN <213> Homo Sapiens <4 0 0 > 10 ggpaagaaa atgaggceee aggacacetg ggttxaeaee caggtcccca gegatgtctc 60 caccac cgct gctgcaacce ctgctgctgc tgctgcctct gctgaatgtg gagccttccg 120 gggoc&cact gatccgcatc cctcttcatc gagtccaacc tggacgcagg atcctgaacc 180

tactgagggg atggagagaa ccagcagagc tccceaagtt gggggcccca teccctgggg 24Q acaagcccat cttcgtâcct ctctcgaact ãcagggatgt geagtatttt ggggaaattg 300 ggctgggaac gcctctacaa; aacttcactg ftgcctttga cactggctcc tccaatctct 380 gggtcccgtc eaggsgatgc cacttcttca gtgtgecctg ctggttaeac caccgattíg 420 atcccaaagc ctctagetcc ttccaggeca atgggaccaa gtttgccatt caatatggaa 480 ctgggcgggt ag&ttyjaate Gtgagçgagg acaagçtgac tattggtgga atcaagggtg 540 catcagtgat tttcggggag gctctctggg âfcceagcct ggtcttegct tttgcccatt 800 ttgatggáat tttgggtm ggttttxm ttctgtctat ggãâggigtt cggcccecga 600 tggatgtaçt ggtggagcag gggçtattes ataagççtft cmtccttt taectesaca 720 gggaccctga agagcctgat fiaggagage tggtcctggg gggctcggac ecpgeacact 780 acatcccacc cctcaccttc gtgccagtca eggtccccgc ctactggcag atccacatgg 840 agegtg tgaa ggtgggccea gggctgactc tctgtgccaa gggctgtget gccatcctgg 000 atacgggcac gtccctcatc acaggaccca ctgaggagat ccgggccctg catgcagcca 960 ttgggggaat cccettgctg gttggggagt acatcatcct gtgctcggaa atcccaaagc 1020 tccccgcagt ctccttcctt; ettggggggg tctggtttaa cctcacggcc eatgattacg 1080 tcatccagac tactcgaaat ggcgtccgcc tctgcttgtc cggtttccag gccctggatg 1140 tccctccgcc tgcagggccc ttctggatce teggtgacgt cttcttgggg acgtatgtgg 1200 cegtcttcga ecgegggpc atgaagsgca çjcgcecgggt gggeetggcg cgcgettgcáj 1200 ctcfcggagc ggacctcgga tggggagaga ctgegcággc gcagttcccc gggtgacgce 1320 caagtgaagc gcátgegcag cgggtggtcg cigaggtect gctaeccagt aaaaatccac 1380 tatttccatt gagcgaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa atcaa 1425

<210> 11 <211> 433 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 11

Gly pro Arg Thr Pro «ly phe Ttir Pro Arg ser Pro Ala mt ser pro 1 S 10 15 , pro pro Leu uu cfln Pro Leu leu teu Leu Leu pro uu Leu Mn vai 20 25 30

Glu Pro Ser Gly Ala Thr Leu ile Arg Ile Pro Leu His Arg Vai Gin 3$ 40 4$ 5 ΡΕ1324652

Pro £ly t.n Arg Arg Ile Leu Asn çe leu Leu Arg Gly Trp βΛ Arg Glu Pro Ala gIu Leu Pro Lys leu fly 3 3 Ala pro ser pro Gly ον Asp Lys pro ile Phe 65 70 75 80 val Pro Leu ser ASO 85 Tyr Arg Asp val Gin Tyr Phe Gly Glu Ile Gly 90 95 Leu Gly Thr ΡΓΟ Pro gIu ASR Phe Thr val Ala Phe ASp Thr Gly ser 100 val 105 His 110 Ser Asn Leu Trp Pro Ser Arg Arg Cys Phe Phe Ser val Pro 115 Phe 120 125 cys Trp Leu His HÍ S Arg ASp Pró Lys Ala Ser ser Ser Phe Gin 130 135 140 Alâ ASR Gly Thr Lys Phe Ala ile Gin Tyr Gly Thr Gly Arg val Asp 145 150 155 160 Gly lie Leu ser Glu Asp Lys leu Thr lie Gly Gly Ile Lys Gly Ala 165 170 175 Ser val lie phe ISO Gly Glu Ala Leu Trp 18$ Glu Pro ser Leu Val 190 phe Ala Phe Ala HÍ 5 Phe ASp Gly lie Leu Gly Leu Gly Phe Pro Ile teu Ser 195 2QG 205 val Glu Gly Val Arg pro Pro ttet Asp val leu val elu Gin Gly Leu 210 215 220 Leu Asp Lys Pro Val Phe Ser Phe Tyr Leu Asn Arg Asp Pro GlU GlU 225 230 235 240 pro ASp Gly Gly Glu Leu val Leu Gly Gly 250 Thr ser Asp Pro Ai a His Tyr Ile Pro pro Leu Thr Phe val Pro Val Val pro Ala Tyr Trp Gin 260 val 265 270 11® HÍS Met 01 u Arg val Lys Gly Pro Gly Leu Thr Leu cys Ala 275 280 285 Lys aly Cys Ala Ala Ile leu Asp Thr Gly Thr ser 300 Leu ile Thr Gly 28o 295 Ala ΡΓΌ Thr Glu 61U íle Ara Ala leu his Ala Ile Gly Gly Ile Pro 305 310 ile 315 320 Leu Leu Ala Gly Glu Tyr Ile Leu Cys Ϊ5Λ Ser GlU lie Pro 3¾ Lêil ΡΓΟ Ala Val ser Phe Leu Leu Gly Gly ÍW val Trp Phe Asn Leu Thr Ala 340 345 350 His Asp Tyr Val lie Gin Thr thr Arg Asn Gly val Arg Leu cys Leu 355 360 365 ser Gly Phe Gin Ala Leu Asp Val Pro Pro Pro Ala Gly Pro Phe trp 370 375 Val 39$ 380 Ile 38$ LéU Gly Asp val Phe 390 Leu Gly Thr Tyr Ala val Phe Asp Ώ Gly ÃSp Met Lys ser Ser Ala Arg val Gly Leu Ala Arg Ala Arg Thr 405 410 4a! Arg sly Alâ ASP Leu Gly Trp Gly Glu Thr Ala Gin Ala Gin phe Pro 420 425 430 Gly

<210> 12 <211> 1242 <212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 12 cggtgtgtgc ggaacatggc ggagcgcggc aggaagcggc cgtgcggccc gggtgaacac 60 ggccàaagga ttg&gtggcg aaaatggaag caacagaaga aagaggagaa aaaaaaatgg 120

aaggatctca agctgatgaa aaaactggag cggcagcggg cacaggagga acaggcaaag ISO tgectggaag aggaggaggc agcggcagag aaggaggacç gçgggoggcc ctacacactg 240 agcgtagccc tgccgggctx catcctggac aatgctcagt cgccggagct tcgcacctac 500 ttggccggtc agattgecag agcctgtgtc accttctgtg tggatgagat cgtggtgttt 360 gatgaggagg gccaggatgc caagactgtg gagggggaat tcacsggagt tgggaagaag 420 gggcaggcgt gcgtacagct ggcccggatc ctgeagtacç tggagtgtec acagtacctg 480 aggaaggcgt tcttccccaa gcaccaggat ctacagtttg cagggctcct gaaccccctg 540 gacagccccc accacatgeg tcaggatgag gaatccgagt tccgagaggg eatcgtggtg 600 gatcggecca eccggccagg ccacggctcc tttgtcaact gtggcatgaa aaaggaggtg &60 aagattgaca agaaectgga gcccgggctt cgggtgactg tgcgactgaa cc&gcagcag 720 6 ΡΕ1324652 840 900 360 1020 isso 1140 1ZÚÚ 1242 eacccagact gcaagaccta ccatggcaaa gtggtateat cgcaggaccc tcgeaccaaa gctggtctct actggggcta caccgtccga ctggcttcct gcctcàgtgc tgtgtttget gaggccccct tccaagatgg gtatgatctg accatcggga cgtcagagcg cggctcagat gtggcctctg cccagcttcc caacttcagg catgctcttg tggtgttegg gggcctcouj ggtctggaag ctggagcgga tgctgacccc aacctggagg tggctgaacc cagtgtcctc tttgacctgt aegtcaatac ctgtccfeggc cagggtagcc gtaee&tccg caeggaggaa gccatcctca tctccctggc cgccctgcag cctggcctca cccaggcggg tgcccggcac acctfaaagt tctaaggggc cgaggacatc agigaageag eagtga&áec aggggctctg caggtcactt gggacggàeg ccaccagact tgtctccaaa aa

<210 > 13 <211> 381 <212> PRT <213> Homo Sapiens <4 0 0 > 13

Arg Cys vai Arg Asn Met Ala Glu Arg Gly 10 trp Arg Lys Arg Pro 1¾5 Gly Pro Gly Glu His Gly 20 Glu Lys Gin Arg lia Glu 25 Lys Arg Lys Trp a* Gin Gin iys lys Glu Lys Lys Trp Asp Leu Lys Leu Kfit Lys Lys 35 40 45 Glu Glu Leu Glu Arg Gin Arg Ala Gin Glu Glu Gin Ala Lys Arg Leu 50 5S 60 Thr Gíu Glu Ala Ala Ala Glu Lys GlU Asp Arg Gly Arg Pro Tyr Leu 65 70 75 30 ser vai Ala Leu Pro Gly ser íle ieu ASp 90 Asn Ala Gin Ser Pro Glu m 95 Phe Leu Arg thr fyr Leu Ala Gly Glu lie Ala Arg Ala cys Ala 11« 100 105 110 Cys Vai Asp Glu ile Vâl vai p-he ASp GlU Glu Gly Gin Asp Ala tys 115 120 125 Thr Vai Glu Gly Glu Phe Thr Gly val Gly Lys Lys Gly Gin Ala Cys 130 B5 140 Gin vai Gin Leu Ala Arg tu Leu Gin Tyr Leu Glu Cys pro Tyr Leu 145 ISO 15S phs Ala ISO Arg lys Ala Phe Phe 165 Prô Lys Hfs Gin ASO 170 teu Gin Sí Leu Leu aso Pro Leu Asp Ser Pro His Pis Mêt Arg Gin ASp Glu GlU ser tm 185 100 Gly His Glu Phe Arg Glu Gly lie vai Vai Asp Arg pro Thr Ara Pro 195 200 205 11« Gly Ser Phe Vai ÀSh cys Gly Mftt Lys Lys Glu val iys Asp iys 210 215 220 Gin Gin Asm Leu Glu Pro Gly Leu Arg Vai Thr val Arg Leu Asn Gin 225 230 235 Gin 255 240 His Pro Asp Cys Lys 245 Thr Tyr His Gly Lys aso Val val ser ser Asp Pro Arg Thr iys Ala 260 Gly Leu Tyr Trp 265 Gly Tyr Thr val Aro 270 Leu Ala âer cys Leu Ser Ala Vai Phe Ala Glu Ala pro Phe Gin ASP Gly Tyr 275 im 285 Ala Ala A$p Leu Thr fie Gly Thr ser Glu Arg Gly Ser Asp val ser 200 m 300 Gly Gly Gin Gin teu Pro Asn Phe Arg ítis Ala Leu val val phe Leu 305 320 315 Glu val Ala 335 320 Gly teu Glu Ala |1y Ala A5p Ala Asp Pro 330 Asn Leu Glu Pr© ser Vai Leu Phe ASp Leu Tyr vai Asn Thr cys Pro «]y Gin Gly 340 345 350 Ala Ser Arg Thr tle Arg Thr Glu Glu AU Ile Leu lie Ser Leu Ala 355 360 365 teu Gin Pro Gly Leu Thr Gin Ala Gly Ala Arg HlS Thr 370 375 380 <210 > 14

<211> 1779 <212 > ADN <213> Homo Sapiens 7 ΡΕ1324652 <400> 14 cecgqeeacg gcttccgctg cgggçcaetc caggattact cgcgtctgge tcçaggcgcc 60 gagaàggegc gctgggcgcc çgtggeçgeç gçgceagetc ctcctectee cgctgctcct 120 gctcccgggg cgagcgtgea gccccgagce cgceccgcgc ctcccggagc cctecccccc 180 qctqctceca tgegtgeggg ctcgtceccg gecggcagca ccaagecttt tgtgcaegcc 240 gtgccaxet çtgaccccct gçgeesggee aacçgcetgc caatcaaggt getgaagàtg 300 ctgacggcac gaactggcca cattttgcac cccgagmcc tgcagcccet gccttccacg 360 ccggtcagcc ccatcgaget cgatgccaag aagagcccgt tggcgctgtt ggcgcaaaca 420 tgttegcága t.cgggaagcc cgacccctcg ccctcctcca aactctcctc gaagtcgggá 480 ttccgggtac egàgcgccac ctgccagcca ttcãcgccca ggacaggcag cccgagctcc 540 âgcgcctcgg cctgctcgce gggaggtatg ctgtcctcgg ccgggggtgc ecçggagggç 600 aaggacgaea agaaagacac cgacgtgggc ggcggtggca agggcaccgg gggcgcçtcg 660 gcígaagggg gsccgacggg gctggcacac ggccggatta gctqcggcqg cgggattaat 720 gtggatgtga aecagcatec ggatgggggc çcgggaggca aggctctggg ctcggactgc 780 gfcggttcat cgggetceag ctccggctcc ggccceagcg cgcccacctc ctcctcagtg 840 ttgggctctg ggctggtggc tcccgtgtca ccctacaagc cgggccagac agtqttecct 900 ctgcctcccg cgggtatgac ctacccaggc agcctggccg gggcctacgc cggctacccg 860 ccrcagttec tgeçacaçgg cgtggeaett gaccccacta agccgggcag cctggtgggg 1020 gcicagctgg cggcggccgc ggccgggtct ctgggctgca gtaagccggc cggctccagc 1080 ccittggccg gagcgtctcc gccgtccgtg atgacagcea gtttgcgccg ggacccttac 1140 tgcctcagct accactgcgc tagccacctg geaggggçgg cggccgceag cgcttcttgc 1200 gcaeatgate cggctgctgc ggctgcggcg ctgaagtccg gatacccgct ggtgtaecce 1260 acgcacecge tgcacggtgt gcactcctcg ctaacggccg ccgcggctgc tggcgccaca 1320 ccgccctccc tggccggcca ccccctctac ccctacggct tt&tgctecc taacgaccca 1380 ttcerceara tctgcaactg gqtgtcggcc aacgggccgt gcgãcâagcg cttcgccaçg 1440 tccgaagagc tgctgaqcca cttgcggacc catacggcat ttcccgggac agaeaaactg 1500 çtgtçgggct aceccagcfc gtcgtctatg gccagcgcty ccgcggccgc catggcttgc 1560 cacatgcaca tçcccacctc gggcgcaccg ggcagccctg gggacgctgg cgctgcgcag 1620 cccccàccac gcgctggpac tcagcagccg etaccacccc tactccaaga gàxgcttee 1680 çacgcctggc gçccecgtge cggtgccxge cgccaccgga ccgtactact ccecctacgc 1740 cctctacgga c&gag&ctga ccacegcctc ggcgctggg 1779

<210> 15 <211> 593 <212> PRT <213> Homo Sapiens <4 0 0 > 15

Pro 6iy Hl s sly Phe Arg Cys Gly Pre pro o!n ASp Tyr Ser Arg Leu 1 5 10 val IS AI*. Pro dy Ala Glíí Lys Alá Arg Jrp Ala pro Ala Ala Ala pro 20 25' 30 Gin Ala pro Pro Pro Pro Al% Ala pro Ala pro Gly Ala ser Ala Pro 3S 40 45 Ala Arg Ala Arg pro .Ala Pro ΡΓΟ Gly aU Leu pro Pro Ala Pro «et 50 5$ 60 Arg Ala Gly ser Ser Pro Ala Gly Ser Thr Lys Pro Phe val His Ala 6$ 76 75 80 vai Pro pro ser ASp Pro Leu Arg Gin Ala Asn Arg Leu Pro lie Lys 85 §0 Kis 95 Vá] Leu Lys Mêt Leu thr Ala Arg Thr Gly lie Leu His Pro Glu 100 10S ílé 110 Tyr leu Slo m Leu pro ser Thr Pro vai Ser pro Glií Leu Asp 115 120 Gin Thr 125 Ala tys tys ser pro Leu Ala teu Leu Ala cys ser Gin lie 14Ϊ 130 135 14Õ tys pro ASp pro ser 150 Ala Pro ser ser Lys teu 155 Pfre ser Ser tys ser 1¾ JUtj Ph® Arg Vai Pro ser Thr Cys Glo Pro Thr Pro Arg Thr Gly .165 170 Gly 17 S Sèr pro sar ser Ser Ala ser Ala cys Ser pro Gly suet tm ser 1½ Sly 180 185 190 Thr ser Ala sly Ala pro Glu 1¾Lys Asp ASp Lys Lys 205 Ala Asp ASp Vai Gly 51« Gly Gly tys Gly 215 Gly Thr Gly Gly Ala Ser 220 GlU Gly Gly pro 225 Thr· sly Leu Ala Mís 230 Arg lie Ser cys 235 Gly Gly Gly Xl e Asn 240 8 ΡΕ1324652

Val Asp vai AStt Gin «is Pro Asp Gly Gly Pro Gly Gly iys Ala Leu 245 Gly 250 255 Gly Ser ASp CVS 280 Gly ser ser Gly 265 Ser ser ser Gly Ser 270 Gly Pro ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Vai Leu Gly Ser Gly Leu Val Ala Pro vai 275 280 285 ser pro Tyr ty$ pro Gly Gin thr Val Pha pro Ltu pro Pro Ala. 200 295 Gly Ala 300 Gly mt rhr Tyr Pro Gly Ser Leu Ala Tyr Ala cly Tyr Pro 305 310 31$ 32© Pro Gin phe Leu Pro HÍS Gly Vai Ala Leu Asp Pro Thr iys Pro Gly 325 330 335 $sr Leu vai Çly Ala Gin Leu Al a Al a Ala Ala Ala Gly Ser Leu Gly 340 Ala 345 3$0 Cys ser lys Pro Gly ser Ser pro Leu Ala Gly Ala Ser Pro pro 355 Ala 360 365 ser vai 370 cys mt Thr Ser leu 37$ Ala cys arg Asp Pro M Cys Leu Ser lyr HÍS 385 Ala ser HiS Leu 390 Gly Ala Ala Ala 395 Ala Sêr Ala ser cys 400 Ala h1s ASp Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala teu iys ser Gly Tyr pro 405 410 415 Leu vai Tyr Pro Thr His Pró Léu His Gly Vál His Ser ser Leu Thr 420 425 430 Ala AT a Ala Ala Ala Gly Ala Thr pro Pro ser teu Ala Gly His pro 435 440 445 LSU lyr 450 Pro Tyr Gly phe Mét Leu Pro Asn Asp Pro Léu Pro Mis lie 455 460 Ala Thr 480 ey$ 46$ Asr Trp vai Sfef Ala 470 Asrc Gly Pro cys ASO 475 Iys Arg Phe Ser Glu Glu Leu Leu ser His uu Arg fhr HÍS Thr Ala Phe pro Gly 485 400 495 Thr Asp iys Leu Leu ser Gly Tyr Pro Ser Ser Ser Ser Wet Ala Ser 500 505 510 Ala Ala Ala 515 Ala Ala Met Ala cys His 520 Met His xle Pro 525 Thr Ser Gly Ala pro Gly se r pro Gly ASP Ala Gly Ala Ala Gin pro Pro pro Arg 530 $3$ 540 Ala Gly Thr Gin Gin Pro Leu Pro Pro Leu leu Gin Glu Pro Ala Ser 545 S50 Gly Ala 5SS HiS 560 HÍS Ala Trp m Pro $65 pro Arg Ala Aro 570 Thr Arg Arg Thr Val teu 575 Gly Ala ISO pro leu Arg 580 Leu Arg Thr Glu 585 Asp His Arg teu 590

<210 > 16 <211> 1938 <212 > ADN <213> Homo Sapiens <4 0 0 > 16 gtttcctcgc cagagccceg getggseacg cagcggeteg eatcgtasgag egcagcgeeg 60 gegcggggcc gcgagaacgc ãgeecagggg agcagcccga ggtggacace gcgagcegcc 120 cggcaetcce gcâgtccagc cggctcctct ageccggeca cggctecgct gcgggccacc 180 caggattact cgcgtctggc tecaggcgcc gagaagfçgc gctgggegce egtggecgçç 240 gcgccagctc ctsctectcc cgetgctca gctcscgggg cgagcgcgca gccccgagcc 300 egeceegcgc ctcccggagc cctccccccc gctgetèecá tgegegeggg ctcgtceceg 380 gccggcagcâ ccâagccttt tgtgcacgcc gtgcccccct ctgaccccet gcgccaggcc 420 aaccgcctgc caatcaaggt gctgaagatg ctgacggcac gaaetggeca eattttgcac 480 cccgagtacc tgçagcccct gccttccacg ceggtcagcc ccatcgagct cgatgccaag 540 aagageccge tggcgctgtt ggcgcaaaca tgttcgcaga tcgggaagcc cgaceccteg 800 ccctcctcca aaetctcçtç gaagtcggga ttccgggtac cgagcgecac ctgccagcca 680 ttcacgccca ggacaggcag cccgagctcc agcgcctcgg cetgctcgcc gggaggtatg 220 ctgtcctcíjg tcgggggtgc cccggaggge aagg&epca agaaagacac cgacgtgggc 780 ggcggtggca agggcacccg gggcgcctcg gccgaagggg gacccacggg getggcacac 840 ggccggatta gctgcggcgg cgggattaat gtggatgtga accagcatcc gptggggge 900 cegggaggca aggctctggg ctcggactgc ggcggttcat cgggctccag ctccggctcc 960 9 ΡΕ1324652 ggccecagcç cgcccacctc etectcagtg ccctacsagc egggccagac agtqttccct agcctggccg gggcctacge eggètaçceg gaccccacca agccgggcag cetggtgggg etgggctgca gtaagccgge cggctocagc atpcagecâ gtttgtgccg ggacccttae gcaggggcgg cggccgccag cgcttcttgc ctgaãgtccg gatacçcgct ggtgtaccce cmeggcqj ccgcggctgc tggcgceaca ccctacggct ttatgctccc taacgaceca aacgggccgt gcgacaagcg cttcgceacg catacggcat ttcccgggac agacaaactg gccagcgctg ccgcggecgc catggcttgc ggcagtmtg ggacgctggc gctgcgcagc tatccacccct actccaagag cccgcttccc gccaccggac cgtaetactx cccctacgcc gcgctggggt atcagtga ttgggctctg ggctggtggc tcecgtgtca ctgcctcccg cgggtâtgac ctacccaggc çiccicagttcc tgccacãcgg cgtggeactt gçgcagctgg cggcggccgc ggccgtmct cctttggccg gagcgtctcc gccgtccgtg tgcctcagct accactgcgc tagccacctg gcacat$atc cgocigagç ggctgcggcg acgcacccic tgêacggtgt gcactcctcg ccgccctcct tggccggcca ccccetctac ctcccccaca tctgcaactg ggtgtcggcc tccgaagagc tgefegageçã çttgcggaçc ctgtcgggct acçctagçTt gtcgtctatg cacatgcaca tccccacctc gggcgcaccg ccceaccacg cgctgggact cagcagccgc acgcctggcg cccccgtgce ggtgcccgcc ctctacggac agagactgac eaccgectcg 1020· 1080· 1140 1200 1260 um 1380 1440 1500 1530 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1938

<210 > 17 <211> 645 <212> PRT <213> Homo Sapíens <4 0 0 > 17

Vai Ser ser pro Glu PfO Arg uu 1 5 Ser Ala Ala pro 20 Thr Ala Arg ely Arg ΡΓ0 Arg Arg pro Arg Ala Ala 15 Ala Ala 40 ser ser ser Pm Thr Pro 50 55 Arg Leu Ala prn Gly Ala Glu lys 65 Ala 70 Ala Pr© pro pro Pro Pro Ala 85 61 n Pro Arg Ala AP§ PfO Ala Pro 100 pro Met Arg Ala Gly Ser Ser Pro 115 120 BÍS Ala vai pro PfO ser ASO pro 130 vai m xle m Leu Lys Met Leu Thr 145 ISO pro Glu Tyr Leu Gin Pro teu Pro 165 Leu Asp Ala 35 tys Ser Pro teu cln Ila Gly Lys Pro Asp Pro ser 195 Vai 2G0 ser Gly Phe Arg Pro ser Ala 210 215 Ala Thr Gly ser Pro Ser Ser ser 225 Ala 230 U« ser ser fô Gly Ala Pro thr ASp vai Gly 260 Gly ely Gly Lys Gly 61 y Pro Thr Gly Leu Ala his 275 280 ílè Asn vai ASp vai Asn Gin nis m oly 295 Gly AH 30$ lêtt Ser ASP Cys 510 6ly Gly Pro Stf Ala Pro 325 Pro Thr ser Ser Ala Pro vai ser Tyr tys ΡΓΟ 340 Pro Ala sly Met Thr Tyr pro Gly

Asp Thr Gin Arg Leu Ala ser Gin 10 Ala 15 Glu Aso Ala Gin Gly ser Ser 25 tHs 30 Arg Ser Arg Ser Pro Ala Gly 45 Leu Arg Ala Thr m' Ala Gin ASp Tyr Ser Ala Arg ΤΓΡ Pro Val Ala Ala 75 80 Ala Pro Ala pro Gly Ala Ser Ala 90 95 Pro Gly Ala teu pro Pro Ala Ala 105 110 Ala Gly Ser Tftr ul Pro Phe Val leu Arg Gin Ala 140 Gly ASO Arg Leu Pro Ala Arg Thr Hi5 Tle teu Bis 155 160 Ser Thr Pro val ser Pro Ile Glu Ala 170 Ala 175 teu Leu Gin Thr Cys Ser 185 190 Pro Ser Ser tys Leu Ser Ser Lys Gin 205 Thr cys pro 220 Ser phe Thr Pro Arg Ser Ala cys pro Gly Gly mt Gly Gly 2 50 235 240 Lys ASp Asp Lys Lys ASp Gly 2íS Thr Gly Gly Ala Ser 270 a j J Ala Gllí Gly Arg Ile Ser CVS 285 Gly Gly Gly pro Asp Gly Gly 100 6(lw Pro Gly Gly Lys Ser ser fH ser Ser ser ily Ser Val 315 320 ser Leu Gly Ser Gly Leu val fll ser 330 Thr 335 610 val Phs Pro 350 Tyr Leu Pro teu Ala Gly Ala Ala Gly 10 ΡΕ1324652 3SS Phe 360 365 iyr pro Pro Gin Leu Pro His Gly Val Ala Leu Asp Pro Thr tys 370 375 380 pm Gly ser Leu val Gly Ala Gin Leu Ala Ala AU Ala Ala Gly Ser 385 390 395 Ala 400 leu Gly Cys Ser lys 405 Pro AU Gly Ser Ser 410 Pro teu Gly Ala 415 ser Pm Pro ser Vai Met Thr Ala ser Leu cys Arg Asp pro Tyr cys Leu 420 425 Ala Ala 430 Ser Tyr HÍS cys Ala ser HÍS Leu Ala cly Ala Ala ser Ala 435 440 44$ Ser cys Ala His Asp Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Lys Ser Gly 450 455 Mis 460 Val Tyr Pm Leu val Tyr Pro Thr Pro Leu His sly His Ser Ser 465 leu Thr 470 475 480 Ala Ala Ala Ala Ala Gty Ala Thr Pro Pro Ser Leu Ala Gly His Pro 485 Gly 490 495 Leu Tyr 500 Pro Tyr Phe «et SOS Leu Pro ASO Asp Pro 5X0 Leu pro His 11e CVS Asn Trp val ser Ala Aso Gly pro cys Asp Lys Arg Phe Ala Thr sis 520 525 ser õlu Glu Leu Leu Ser His Leu Arg Thr His Thr Ala Phe 530 Thr 535 Gly 54Õ pm Gly ASf> Lys LM l@u ser Tyr pro ser ser ser Ser «ét 545 550 555 560 Ala ser Ala Ala Ala Ala Ala «et Ala Cys His net HÍS ile Pro Thr Ser Gly 5 65 S70 575 Ala Pro Gly ser pro Gly Thr Leu Ala Leu Arg ser Pro His His Ala 580 585 590 Leu 595 61 y Leu ser ser Arg 600 Tyr His Pro Tyr $er· 605 Lys Ser Pro Lm Pro Thr Pr® Gly Ala Pro val Pro val Pro Ala Ala Thr Gly Pro 610 Ala 015 620 Thr m Ty r ser Pro Tyr Leu Tyr Gly g!r Arg Leu Thr Ala Ser 625 630 635 646 Ala Leu eiy Tyr Gin 645

<210> 18 <211> 4022 <212> ADN <213> Homo Sapiens <220> <221> misc_característica <222> (1) ... (4022)

<223> η = A, Τ, C ou G <4 0 0 > 18 getgagcacc gcgcacegcg tcatgggggc tgtctcgggc cgecggggge cggggctgct 60 gctgccgctg ccgctgctgt tgctgctgcc gccgcagccc gccctggegt tggacctcgq 120 gctgcagccc ggeaactfctt etgctgacga ggccggggcg cagctcttçg egcagageta 180 caactceage gcogaacagg tgctgttcca gagcgtggcc gccagctggg cgmcgacac 240 caacateacc gcggagaatg rtcrcaaggcgc caggagQaag cagccctgct cagccaggag B00 tttgcggagg cctggggccá gaaggccaag gagctgtatg aaecgatetg gcagaacttc 360 acggacccgc agctgcgcag gatcátcgga gctgtgccca cçctgggctc tgecaaõctf 420 ctcÊtsgcta ãgcggcagca gtaca&cgcc etfctãâgeã acãtgagcag gatetâctce 480 accfccaagg tctgcctccc caacaagact gccacctict ggtccctgga ©ccagatctc S40

acca&citcc tggcttcctc gcga.sgctac gccatgctcc tgtttgcctg gpgggctgg SOO cac&acgetg cgggcatccc gctgfts&ccg ctgtacgagg atttcaetgc cctcagcaat 660 gaagcctaca ageaggacgg cttcâcsgac «gggggcct actggcgctc ctggtacaac 720 tcccccacct teg&gg&cga tctggaacac ctctaetasc agctagagct ectetatctg 789 aacctccatg ecttcgtccg ccgcgcactg catcgccgat acggagacag atacatcaac B4Õ ctcagsggec ccatccctgc tcatctgCtg ggagac&tgt gggcccagag ctgggaaaac 900 âtctacgaea tggtggtgèc ttteceag*C aagcccaacc tcgaígtíac çaitáctatg 960 «tgeagcagg gçtggaacgc çaegcacatg tuccgggtgg cagaggagtt mcacctcc 1020 ctggagctct cccccatgcc tcccgagttc tgggaagggt cgâtgctgga gaagccggec 1080 gacgggcggg aagtggtgtg ccacgcctoi gcttgggact tctAcaaceg gmgacttc 1140 aggatcaage agtgcacac# ggtcacgatg gacoigctct ccacagtgca cc&tgãgatg 1200 11 ΡΕ1324652 ggccatatac agtactacet gcagtaeaag gatctfcccg tçtçtttgeg tcggggggçç 1260 aaccccgget tccatgaggc cattggggae gtgctggcgc teteggtetc caetcctgaa 1320 catetgcaca aaatcggcet gctggaccgt gtcaccaatg acacggaaag tgacatcaat 1380 tacttgciaa aaatggcact ggaaaaaatt gccttcctgc cctttggcta cttggtggac 1440 cagtggegct ggggggtctt tagtgggcgt accc«cctt cccgctacaa cttegactgg 1500 tggtatcttc gaaccãâgta ícaggggatc tgtceicctg ttacccgaaa cgaaacccac 1560 tttgatgctg gagctaagtt tcatgtteca aatgtgacat catacatcag gtacíttgtg 1620 agttttgtcc tgcagttcca gttccatgaa gccctgtgca aggaggcagg ctatgagggc 1680 ccactgcacc agigtgaeat ctaccggtec accaaggeag gggccaagct ccggaaggtg 1740 ctgcaggctg gctcctccag gccctggcag gaggtgctga aggacatggt cggcttagat 1800 gccctggatg cccagccgçt gctcaãgtâc ttecâgccag tcacccagtg gctgcaggag 1860 cagaaccágc aga&ggcga ggtcetgggo tggcecgagt aceagtggea cccgccgttg 1920 cctgacaact acccggaggg çafcagacctg gtgaetgatg aggetgaggc eageaagttfc 1980 gtggaggaat atgaecggac atcccaggtg gtgtggáacg agtatgscga ggecaactgg 2040 aactâcaaca ccaacatcac cacagagacc agcaagattç tgctgcagaa gaaeatgcaa 2100 atagccaacc acaccctgaa gtacggcaec caggecagga agtttgatgt gaaccagttg 2160 cagaacaéca ctatcaagcg gatcataaag aaggttcagg acctagãacg ggcagcactg 2220 cctgoccagg agctggagga gtacsatãag atcctgttgg atatggaaac cacctacagc 2280 gtggccactg tgtgccaccc gaatqgcage tgcctgcagc tegagccaga tctgacgaat 2340 gtgatggcca cgtcccggaa atatgaagac ctgttatggg eatgggaggg etggcgagac 2400 aaggcgggga gagccatcct ccagttttac ccgaaataeg tggaactcat caaccaggct 2460 gcccggctca atggctatgt agatgcaggg gactcgtgga ggtctatgta egagaeacca 2520 tccctggagc aagaectgga gcggctcttc caggagctgc agcxactcta cctcaacctg 2580 catgectacg tgcgccgggc cctgcaccgt câctacgggg cccagcacat caacctggâg 2640 §ggccc*ttc ctsgfctcacct fCtggggaãí atgtgggcgc agacetggtc caacatctat 2700 gácttgoteq tocccttccc t«eagccc<x tcgatggaea ccacagaggc tatgctaaag 2760 cagggctgga cgcccaggag gatgtttaag gaggctgatg atttcttcac ctecctgggg 2820 ctgctgcccq tgectcetge gtfcctggaac àagtegatgc tggagaagcc aacegacggg 2880 cgggagptgci tetgccacgc etcggcctgg gactttctaca acggcaaggã cttcçggatc 2940 aagcâgtgca ccaccgtg*» cttggãfgac ctgfltggtgg cccaccacga aatgggccac 3000 atccagtàtt -testqcagta caaagactta ectgtggcct tgagggaggg tgccãácccc 3060 ggcttccatg aggccattgg ggaegtgm geeetetcag sgtmcgcç caagcacctg 3120 cãcagtctca acctgttgag cagtgagggt ggcagcgaeg agcatgacat eaactttctg 3180 atgaagatgg cccttgacaa gategccttt atccccttca gctacctcgt cgatcâgtgg 3240 cgctggaggg tatttgatgg aagcatcaec aaggagaact átaacca^a gtggtggagc 3300 ctcaggttgà agíaecâggg cctctgcccc ccagtgccca ggsctcaagg tgactttgac 3360 ccaggflgeca agttccacat tccttctagc gtgccttaca teaggtactt tgtcagcttc 3420 atcat<ccagt tccagttcca cgaggcaetg tgccaggcag etggteacae gggccccctg 3480 cacaagtgtg acatctacca gtccaaggag gccgggcagc gççtggcgac cgccatgaag 3540 ctgggcttca gtaggccgtg gccggaagcc atgcagctga tcacgggeca gcccaacatg 3600 agcgcctcgg ccatgttgag ctactteaag ccgctgctgg actggctccg cacggagaac 3660 qagctgcãtg gggagaaqct sggctggccg cagtaeaact ggacgccgaa ctccgctcgç 3720 tcafaaggge ccctcccága cagçggccgç gtcagcticç tgggcctgga cctggatgcg 3780 cagcaggccc gcgtgggcca gtggctgctg ctcttcctgg gcatcgccct gctggtagcc 3840 accctgggcc tcagccagcg gctettcagç atccgccacc gcagcctcca ccggçactcc 3900 cacgggcccc agttcggctc çgaggtggag ctgagacact cctgaggtga cccggctggg 3960 tcgeccctgc «caagggcct cccaccagag actgggatgg gsacactggt gggçagctga 4020 m m22

<210> 19 <211> 1265 <212> PRT <213> Homo Sapíens <22 0 > <221> VARIANTE <222> (1) . . . (1265) <223> Xaa = Qualquer Aminoácido <4 0 0 > 19

Arg sly Arg Gly Ala Ais im árg Tíir sly Ala vat Pro «lu Arg sly 20 Hís His Arg 6ly 6lu xaa Xaa Arg 35 40 ser Gin Gla PNé Ala Oiti Ala Trp 50 55

Glu Pro He frp Gin Asn Phe Thr

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<210> 27 <211> 254 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 27 pro Gly Ala Gly Gly Ala Gly Vai Π* Gly mt «et Arg Thr flrt Cys 1 5 10 15

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<212 > DNA <213> Homo Sapiens <400> 32 26 ΡΕ1324652 gatctíjtctg gctccattga tgaeeteccc acgggaacgg aagcaacttt gagíteagca 60 gtcagtgtst ccgggtceac gagcagecaa ggggatcaga geaacccsgc gcagtcgcct 120 ttcteeccac. atgcgtcccc tmxctcttc agcatcccgg ggggçeeats tccctctcct ISO gttggctctc ctgtagga&g caaççagtçç cgâtcfggcc caatctctct: t§<-aagtatc 240 ccaggtttta tggcaggeac acaaagàaac cctcagatgg ctcagtatgg acctcaacag 300 acaggaccat ccatgtcgcc tcatccttct cctgggggcc agatgcatge tggaatcagt 360 agctttcagc agagtaactc aagtgggact tacggtccac agatgagtca gtatggacca 420 caaggtaact actccagacc cccagcgtat agtggggtgc ccagtgcaag etaeageggc 480 ccagggcccg gtatgggtafc cagtgccaac aaccagatgc atggacaagg §e<aagecag 540 ccatgtggtg ctgtgcccct gggscgaatg ccatcagctg ggatgcagaa cagaccattt 600 cctggaaata tgageagcat gacccccagt tctcctggca tgtctcagca gggagggcca §60 ggastgggge cgccaatgcc aactgtgaac cgtaaggcac aggaggcagc cgcagcagtg 720 atgcaggctg ctgcgaactc agcacaaagc aggtacgcca cccaggagca egçctcgggc 780 aggcaaggca gtttccccgg catgaaceag agtggactta tggcttcçag ctctccctac $40 agccagccea tgaaçaacag ctctagcctg atg&aeacgc aggcgccgcc ctacagcatg $00 gcgcccgcta tggtgaacág ctcggcagca tctgtgggtc ttgcagatat gatgtctcct 060 ggtgaatcca aactgcccct gcttcteaaa gcagacggca aagfaagaagg cattccacag 1020 cccgagagca agtcaaagga tagctacagc tctcagggta tttctcagcc cccãâcccca 1080 ggcaacctgc cagtcccttc cccaatgtçe cccagctctg çtagcatçtc ctcatttcat 1140 ggagatgaaa gtgatagcat tageagecca ggctggccãã agactccatc aagccctaag 1200 tccagctcct ccaccactac tggggagaag atcacgaagg tgtacgagct ggggaatgag 1260 ccagagag&a agctctgggt cgaçcgatac ctcaccttca tgfaagagag aggctctcct 1320 gtctcaagtc tgeetgcco* gggcaagaag cccctggacc tgttcçgact ctacgtctgc 1380 gteaaagaga tcgggggttt ggcccaggtt aataaaaaca agaagtggcg tgagctggca 1440 assaacctaa acgttggcaç otcsagoag* çcagçppt çcatgaaaàa gcagtatatt 1500 cagtacctgt ttscctttga gagçaagatc gaacctaact cgggatcctt gcaaggccca 1560 cagacccccc agtcaactgg cagçaattcc atggcagagg ttccaggtga cctgaagcca 1620 27 ΡΕ1324652 cctaccccag cctccacccc tc&cggecag atgaetecaa tgcaaggtgg aagaagcagt 1680 acaatcagtg tgcacgaccc attcteagat gtgagtgatt catccttccc gaaacggaac 1740 tcçatgactc caaacgcccc ctaccagcag ggcatgagea tgcccgatgt gatgggcagg 1800 átgtcctatg agcccaacaa ggaccccttt gggggaatga gaaaagtgec tggaagcagc 1860 gagcccttta tgaegcaagg acagatgccc aacagcagca tgcaggacat gtaeaaccaa 1020 agtccctccg gagcaatgte taaèetgggc atggggeagc gccagcagtt tcectaígga 19SÔ gccagttacg accgaagcâe tgttgctact ttcaatctct cccagttgtc tggatttctc 2040 gaacttttag tcgagtactt tagaaaatgc ctgattgaca tttttggaat tcttatggaa 2100 tatgaagtgg gagaccccag ccaaaaagca cttgatcaca acgcageaag gaaggátgae 2160 agccagtc« tggçagacga ttctgggaaa gaggaggaag atgctgaátg tattgatgac 2220 gaçgaggâaç aegaggagga tgaggaggaa gacagcgaga agacagaaag egatgaaaag 2280 agcagcatcg ctcfcgactgc çccggacgce gctgcagacc caaaggagaa gcccsagcsa 2340 gccagtaagt tcgacaaget geeaktaaag atagtcaaaa agaacaacct gtttgttgtt 2400 gaccgatctg acaagttggg gcgtgtggag gagttcaata gtggccttct gcactggcag 2460 ctcggcgggg gtgacaccac cgagcacatt cagacteact ttgagagcaa g&tggaaatt 2520 cctcctcgca ggcgcccacc tcecccctta agctccgcag gtagaaagaa agagcaagaa 2580 gccaaaggcg actctgaaga gcagcaagag aaaagcatca tagcaaccat çgatgacgtc 2640 ctctctgctc ggeeaggggc attgcctgaa gacgcaaacc ctgggçccca gaccgaaagc 2700 agtaagtttc cctttggtat ccagcaagcc aaaagtcacc ggaacatcaa petgctggag 2760 gacpgecca gpgccgaga egagaeteci ctgtgtacca tcgcgcactg geaggactcg 2820 ctggctaagc gatgcatctg tgtgtctaat attgteegta gcttgtcatt cgtgcctggc 2|80 aatgatgccg aaatgtccãã àcãtccaggc ctggtgctga tcctggggaa gctgattctt 2940 cttcaccacg agcatccagã gagaaagega gcaccgcaga cctatgagaa agaggaggat 3000 gaggacaagg gggtggcctg eagcaaagat gagtggtggt gggactgçct cgaggtcttg 3060 aflagataaca cgttggtcac gttggccaac atttccgggc agctagactt gtctgcttac 3120 acggaaaqca tctgcttgcc aattttggat ggcttgctgc actggatggt gtgcccgtct 3180 gcagaggêâç áãgèteeett tccaactgte ggacccaact cggtcctgtc gcctcagaga 3240 ettgtgctgg agaeectetg taaactcagt atccaggaca ataatgtgga cctgatcttg 3300 gccactcctc catttagtcg tcaggagaaa ttctatgcta cattagltag gtacgttggg 3360 gatogtaaaa acccagtctg tcgagàaàtg tccatggcgc ttttatcgaa ccttgcccaa 3420 ggggacgcac tagcagcaag ggccatafct gtgcagaaag gaagcattgg aaacttgata 3480 agcttcctag aggatggggt cacgatggcc cagtaccagc agagceagca caacctcatg 3540 cacatgcage ccccgcccct ggaaccàcct agcgtâgaca tgâtgtgcag ggeggccasg 3600 gctttgctag ccatggccag agtggacgaa àaccgctcgg aattcctttt gcacgagggc 3660 CQgttgctgg atatctcgat atcagctgtc ctgaactctc tggttgcatc tgtcatcrgt 3720 gatgtactgt ttcagattgg gcagttatga 3750

<210> 33 <211> 1249 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 33

Asp 1 teu ser sly ser S ile Asp Asp teu Pm 10 Thr Sly Thr Glu Ala 15 Thr teu Ser Ser Ala 20 Vai Ser Ala ser ely 25 ser Thr ser ser Gin 30 ely Asp Hls Glrí Ser Asrt 35 Pro Ala Gin sar pro Phe 40 Ser Pro Bis Ala ser 45 pro leu Sér 50 ser Ille Prô ely ely 55 pro ser Pro ser Pro 60 Vai sly ser pro Vai 65 sly ser ASn Glii Ser 70 Arg ser ely Pro lie 7$ Ser Pro Ala Ser Ile 80 Pro sly Phe Met Ala S5 Gly Thr siri Arg Aso 90 Pro elo Met Ala Gin n Tyr PfO Gl π Gin 1Λ-Λ Tfir sly Pro ser Met ser pro HÍS Pro Ser Pro ely 61 y sln Met 115 Hf s Ala Gly 11* ser Ser 120 Phe elo Gin jJLkíLv Ser Asn 125 Ser Ser ely Thr 130 Tyr Sly Pro eln Met 135 Ser eln Tyr sly pro 140 Gin ely Asn tyr ser 145 Arg Pro Pro Ala Tyr 150 Ser el y va i Pro ser 155 Ala ser Tyr ser ely 160 Pro ely Pro Sly Met 165 ely Ile ser Ala A$n 170 ASP Gin Met Bis ely 175 Gin Oly pro Ser Sln ISO pro cys ely Ala vai 185 pm teu ely Arg Mtt 190 pro ser Ala Sly mt m Gin Asn Arg pro phe Pro 200 sly Asn Met ser ser 205 Met Thr ΡΕ1324652 - 28 - pro ser ser Pro Gly «et ser Gin Gin Gly Gly Pm Gly mt Gly pro 210 215 220 Pro «et Pro Thr Vai Asn Arg Lys Ala Gin Glu Ala Ala Ala Ala Vai 225 230 235 240 «st Gin Ala Ala Ala Asn ser Ala Gin ser Arg Tvr Ala Thr cln GlU 245 2$0 255 His Ala Pro Gly Arg Gin Gly Ser Phe Pro Gly «et Asn Si n Ser Gly Ala 260 265 Gin Pro 270 Leu «et ser Ser ser Pro Tyr ser «et Ases Asn Ser ser 275 210' 285 ser Leu «et ASP Thr Gin Ala Pro pro Tyr ser «et Ala Pro Ala «et 200 m 300· vai Asn Ser Ser Ala Ala ser vai Gly Leu Ala ASp «et «et ser pro 305 310 315 Glu 320 Gly Glu ser Lys Leu Pro Leu pro Leu Lys Ala Asp Gly Lys 0l« 325 330 335 Gin Gly Thr Pro Gin Pro Glu Ser tys Ser Lys Asp ser Tyr Ser 350 Ser 340 345 Gly lie ser Gin Pro Pro Thr pro Gly Asn teu pro Vai 3CC pro Ser Pro «et Ser pro Ser Ser Ala ser Sm He ser ser Phe His St» Gly Asp Glu ser 370 lie 375 380 Asp ser 385 ser Ser pro 390 Gly Trp pro Lys Thr 395 Pm Ser Ser pro Lys 400 Ser ser Ser ser Thr Thr Thr Gly Glu Lys Ile Tfer Lys Vai Tyr Glu m 410 415 leu Gly Asn Glu Pro Glu Arg Lys Leu Trp vai Asp Arg Tyr Leu Thr 420 423 430 Phe Met Gllt Glu Arg Gly ser Pm vai ser Ser Leu Pm .titi Ala Vai Gly Lys Lys 450 eS J Pró Leu Asp Leu Phe 455 Arg Leu Tyr Vai Cys 460 TT.3· val Lys Glu ile Gly Gly Leu Ala Gin vai Am Lys Α5Π Lys Lys 475 Trp Arg Glu Leu Ala 465 470 400 Thr Asn leu Asn Vai Gly Thr Ser ser Ser Ala Ala ser ser «et tys 485 400 #5 Lys Gin Tyr Ile 500 Gin Tyr Leu Phe Ala 505 Phs Gly ser lys ile 510 Glu Pro Asn ser Gly Ser leu Gin Gly Pro Gin Thr Pro Gin ser Thr Gly Ser SIS 520 Gly 52 S Ala Asn ser «et Ala Gl fe| vai pro ASp Leu Lys prp Pro Thr Pro 530 535 540 Gly Ser Thr Pro Mis dy Gin mt Thr Pro «et Gin Gly Arg Ser ser 545 550 555 560 Thr Tle ser Vai Hl® Asp pro Phe ser Asp vai ser Asp ser Ser Phe 565 570 $75 Pro Lys Arg Asn sao Ser «et Thr Pro Asn 585 Ala Pro Tyr Gin Gin 590· Gly «et ser «et Pro 595 ASf) vai Met Gly Arg 60§ «et pro Tyr Glu Pro 605 Asn Lys Asp pro Phe Gly Gly «et Arg cys Vai Pro Gly Ser ser Gltí Pro Phe «et 610 61$ 620 Gin Thr Gin Gly Gin «et Pro ASO Ser Ser «et Gin Asp Met tyr Asn 625 630 S35 Gin 640 Ser pro Ser Gly Ala «et ser Asn Leu Gly «et Gly Gin Arg çtn Phe Pro Tyr Gly «4;> Ala Ser Tyr Asp Arg 665 o)v Ser Thr Vai Ala Thr Phe Asn 660 vai Glu 670 Leu ser Gin Leu ser Gly phe Leu GlU Leu Leu Tyr Phe Arg 675 tsSO §85 lys Cys Leu ile ASp Ilfâ phe Gly íle teu «et Glu 700' Tyr Glu vai Gly elo 695 Asn Ala Asp Pro Ser Gin Lys Ala Leu Asp His Ala Arg Lys ASP Asp 705 710 ?is Ala 720 ser Gin Ser Leu Ala Asp ASP ser Gly Lys Glu slu GlU Asp Glu 72$ 730 735 cys lie Asp ASp ASp GlU Glu ASp Glu Glu Asp Glu Glu Glu 750 Asp Ser 740 745 Ala Ala Glu i.ys Thr Glu ser Asp GlU Lys ser Ser lie Leu Thr Pro 29 ΡΕ1324652 755 Asp Ala Ala Ala ASp Pro 770 ASp Lys Leu pro ile iys 785 790 ASP Arg Ser Asp Lys shc teu Leu His Trp sln vvl leu Gly 820 HiS Phe Glu stae ser lys Met pro Leu Ser Ser Ala Gly ser a5U Glu Glu Gin Gin Glu 865 870 Leu ser Ala Arg pro Gly 760 765 lys Glu Lys Pro lys Gin Ala ser lys phe 775 780

Ile Vil Lys Lys Asn Asn Leu Fhe vai Vai 795 600

Gly Aro Vai Gin Glu Phe Asn ser Gly teu 810 815

Gly Gly Asp Thr Thr Glu hís Tle Gin Thr , nl aio

Glu lie Pro Pró Arg Arq Arq Pro Pro Pro 840 845

Arg Lys Lys Glu Gin Glu Gly Lys Gly Asp 855 860

Lys ser lie Ile Ala Thr lie Asp A$p Vai 875 880

Ala Lee Pro Glu Asp Ala Asn Pro Gly Pro 885 ' 890 895

Gin Thr Glu Ser ser Lvs Phe Pro Phe Gly He Gin Gin Ala Lys Ser 900 90$ 910

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Thr Pro leu cys Thr lie Ala Kl a Trp Gin Asp ser Leu Ala Lys Arg 930 935 940 cys ile Cys vai ser Asn Ile vai Arg Ser Leu ser Phe vai pro Gly 945 950 955 960

Asn Asp Ala Glu Met Ser Lys Bis Pro Gly Leu Vai Leu Ile Leu Gly 985 970 975

Lys Leu lie Leu Leu Mis His Glu «is Pro Glu Arg Lys Arg Ala Pro 980 985 990

Gin Thr Tyr Glu LyS Glu Glu Asp Glu Asp Lys Gly Vai Ala cys Ser

995 1000 IDOS

Lys Asp Glu Trp Trp Trp Asp cys Leu Glu Vai Leu Arg Asp ASh Thr 1010 1015 1020

Leu Vai Thr Leu Ala Asn Ile Ser Gly Gin Leu Asp Leu Ser Ala Tyr 1025 1030 103 S 1040

Thr Glu Ser lie Cys Leu Pro Ile Leu Asp Gly Leu Leu His Trp Met 1045 1050 1055

Vai Cys Pro Ser Ala Glu Ala Gin Asp Pro Phe Pro Thr Vai Gly Pro 1060 1065 1070

Asn ser Vai Leu ser pro Gin Arg Leu vai Leu Glu Thr Leu Cys Lys 1075 1080 1085 leu ser ile Glh Asp aso asp vai asb Leu xle Leu Ala Thr Pm Pro 1090 1095 1100

Phe ser Arg Gin Glu Lys Ph« TVr Ala Thr Leu Vai Ara Tyr vai Gly 1105 1110 1115 1120 aso Arg lys Asn pro vai cys Arg Glu «et ser mt Ala Leu teu ser - ' 1125 1130· 1135 asi* teu Ala Gin Gly Asp Ala Leu Ala Ala Ara Ala ile Ala vai Gin 1140 U45 1150

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Ala teu Leu Ala Met Ala Arg vai Asp Glu Asn Arg ser Glu Phe Leu 1205 1210 1215 teu His Glu Gly Arg Leu Leu Asp Ile Ser Ile ser Ala Vai Leu Asn 1220 1225 1230 ser Leu vai Ala ser vai ile Cys Asp Vai teu phe Gin Ile Gly Gin 1235 1240 1245

Leu <210> 34 <211> 2887

<212 > DNA <213> Homo Sapíens 30 ΡΕ1324652 <400> 34 taactfagcg aggageaatt gattaatagc teggcgaggf gactcsetga cfgttataat 60 aacactaCÃC c&qtaactec tggcttocca gcagccggaa eaeagacagg agagagtcag 120 tggcaaatag acatttttet tatttcttaa aaaacagtaa cttgtttgct acttttattt 180 ctgttg&ttt ttttttcttg gtgtgtgtgg tggttgtttt tãagtgtgga gggcaaaagg 240 agataccate ecaggeteag tcca&cccct ctccaaaacg gettttctga cáctccaggt 300 agçgagggag ttgggtetee aggttgtgcg aggageaaat gatgacegcc aaggcegtag 360 acaáaafeccc agfcaaetetc agtggttttg tgeaccaget gtctgacaaç atctacccgg 420 tggaigacct cgcçgteacg tcggtgacca tctttccca* tgccgaactg ggaggcccct 460 ttgacc&pt gaacggagtg gccggagatg geatgatcaa cattgacatg actggagaga 340 ag&ggtcgtt ggatctceea tatcccagca gctttgctcc cgtctctgca ectagaaacc 600 agaècttéac ttacatgggc aagttctcca ttgaceetca gtaccetggt gccagctgct 660 acccagaagg cataatcaat sttgtgagtg caggcatctt geaaggggtc acttceccag 720 cttcmcc&t ageetcatcc agcgtcicct ctgcctcccc caacccactg gccacaggac 780 eectgggtgt gtgcaccatg teccagaccc agcctgaect ggaccacctg táctctccgc 840 caccgcctcc tcctccttat tctggctgtg caggagacct ctaccaggac ccttctgcgt 900 tcctgtcagc agccaccacc tceacctcU cçtctctgge ctacccacca çctccttcct 060 atccatcccc caagccagcc aeggaceeag ptetctteee aatgatccca gactattetg 1020 gattctttec atcteagtgc cagagagacc taçatggtac agctggccc* gaccgtaagc 1080 cctttccetg cccactggac aecctgcggg tgccceetcc acieactcca ctctctacaa 1140 teegtaactt taoxtgggg ggccccagtg etggggtgac cggaccaggg gecagtggag 1200 gcagcgaggg accccggctg cctggtagca gctcagcagc agcagcagcc gccgccgccg 1260 ccgíxtataa cecataccac ctgccactgc ggcccattct gaggcrtcgc aagtacccca 1320 acagacccag caágacgccg gtgcãcgaga ggeeetaecc gtgcccagca gaaggctgcg 1380 accggcggtt ctcccgctct pegagetga çqçggatçst ccgaatccac actgggeata 1440 agcccttcca gtgtcggatc tgcatgcgca acttcagccg cagtgaccac cicsccãccc 1500 atatccgcac ccàçaccggt gagaagccct tcgcctgtga ctaetgtggc cgaaagtttg 1560 ccegg&gtia tgagaggaag cgccacáccã agatccacct gagacagaaa gagcggaaaa 1620 gcagtgcccc ctctgcatcg gtgccagccc cctctacagc çtcctgctct gggggcgtgc 1680 agcetggggg taccetgtgc agcagtaaca gcagcagtet tggcggaggg eegctegocc 1740 etft#ctcct<c tcggaecegg acaccttgag atgagactcâ ggétgataea ccagctcceia 1800 <iaggtoccgg aggccctttg tccactggag ctgcácaaca aacactacca ççctttcctg 1860 tccctetett cctttgttgg geaaagggct ttggtggágc tageactgce ccctttccac 1920 etagaagcag gttcttceta aaacttagcc cattctagtc tctcttaggt gagttgacta 1980 tcaaccc&ag gcaaagggga ggctcagaag gaggtggtgt ggggacccct ggccaagagg 2040 gctgagitct gaccctgctt táaagqqttg tttgactagg ttttgctacc cçacttcccc 2100 ttattttgac ccatcacagg tttttgàccc tggatgtcag agttgatcta agacgttttc 2160 tacaátaggt tgggagatgc tgatcccttc aagtggggac sgcaaaaaga caagcaaaac 2220 tgatgtgcac tttatggctt gggactgatt tgggggacat tgtacagtga gtgaagtata 2280 qccttmtgc cacactctgt ggccctaaaa tggtgaatca gagcatatct agítgtctca 2340 aceçtígaag çaatatgtat tataaactca gagaaeagaa gtgcaatgtg atgggaggaa 2400 catageaata tctgctcctt ttcgagttgt ttgagaaatg taggctattt tttcagtgta 2460 tatccasitca gattttgtgt atttttgatg tacactftiç tctaaattct gaatctttgg 2520 gãaaâãâtgt aaagcattta tgatctcaga ggttaactta tttaaggggg atgtaeatat 2580 attctctgaa actaggatgc atgcaattgt gttggaagtg tccttggtgc cttgtgtgat 2640 gtagacaatg ttacaaggtc tgcatgtaaa tgggttgcct tattatggag aaaaaaatca 2700 ctccctgsgt ttagtatgoc: tgtatàtttc tgectattaa tatttggaat tftttttaga 3760

Mgtatattt ttgtatgctt tgttttgtga cttaaaagtg ttacctttgt agtcaaattt 2820 cagataagaa tgtacataat gttaccggag ctgatttgtt tggtcattag ctcttaatag 2880 ttgtgaa 2887 <210> 35 <211> 488 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 35 Arg Gly Ser Trp vai Ser Arg Leu Cys Glu Glu Gin mt «et Thr 5 10 15 tys Ali Vai A$p tys lie Pro vai Thr leu Ser Gly Phe vai 20 25 30 L«u sar ASp 1Ç Asn m Tyr Pro Vai ΛΛ Glu Asp Léu Ala Ala ir Thr ser Thr Ile D phe Pro Am Ala Glu W leu 6ly Gly Prõ Phe W ASP Gin «et 50 $5 60 Gly Glu oly Vai Ala Gly ASp Gly ile Asn ile Asp Met Thr 65 70 75 Ala Vai Arg Ssr Leu ASp Leu Pfõ Tyr Pro Ser ser Phe Pro ser 85 90 95

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<212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 36 ttggacgatg agatccgcta catcetggat gaggaçcagt ggâtceggat cttcatggag atctatcacc gettcacggt gqacgagaag ggagaaccgg tgtggacagc gtacaaccgg tacgtgaaat ttctggcsca gaccgcctag attaagatgt tcfcacgagga gcatttgcac ggoagtgggt acttogatgt gagggaçaag aagggagaca tggtgaegct ccecgegggg aactacaega aggccatgcg gctgtttgtg cccgcígacc attttgaagc ccgcgggcag

<210> 37 <211> 99 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 37 32 ΡΕ1324652

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<210> 43 <211> 1724 <212> PRT <213> Homo Sapiens

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<210> 51 <211> 937 <212> PRT <213> Homo Sapiens <4 00> 51

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<212 > DNA <213> Homo Sapíens <4 00> 52 tcacatcctc ttgaccetcc ctttaatctc ccccttggtg tggacacgca gcggctcgca cgc&egggag eafoccgagg gctcctctag cccggccaeg caggcgccga gaaggegcgc ctqctcetoc tccctjgggcg tcccccccgc tfctcccatg rctasgaagc agtaagcaca ccctgcctgg accagegcge ggtçggcãit accâagcett caaccgcctg ccaatcaagg ceccgagtac ctftagcccc gaaaagcctg ctggcgctgt gceetcettc aaactetect cggtgctgcg ggcgacaagg ggaggãcaag tcgagtttca aggcggcggt ggaggeggtg gtcpggattG Cfpgtaeega gagctccafç gçctcggçct 98*899easg gaegacaaga cgcctcggcc gaagggggat gattaatgtg gatgttjaacc ggsetgpggc gfttcatcgg ctcagtgttg ggctctgggc fttccctctg cctcccgtgg etaetcgccc cagtteetge fgtgfgggcg eafctggcgg ctccagccet ttggccffèg cccttaetgc cteagctacc ttcttgcgca catgatccgg gtaccceaeg cacccgctgc cgccacaccg ccctccctqg ega.ccca.ctc ccccacattt cgccacgtcc gaagagctgt caaãctgctg tcgggetacc aatcacctcg ggctcccatt cagctgcttt tgaagtgagt tegcagageg cagcgccgge cgeacàccgc gagtcgcecg getccqctgc gggccaccca tgggcgcccg tggccgccge agegcgcaqc cccgagcccg cgcgtfQgtg ggtcatgage gcggcggcgg cggcggcgga tctttggaaa tagctccggc ttgtgcacgc cçitgcccccc tgetgaagat gctgaeggca tgccttccac gccggtcagc tggcfcaaac atgttcgcaf cggttfcctc eaacgggggc acaccaa&tc gggctctctg ãgtegtactc caa&cccggc gtggtggcff gsgcggtfgc gcgccacetg ccsgccattc fckcgccggg aggt&tgttg aagacaccga cgtgggcggc ccàcgewct gfcaeaegfc agcatcegpa tgggggeccg gctccagctc çggctceggc tggtQgctee egtgtcacce gtátg&ecta cccàgtftagc c&cacgecgt fpeacttgac cggtcgcggc cgggtctctg cgtetccgcc gtecgtgatg actfcecfcâB ecâcttisca ctgctgcggc tgeggcgctg acfgtgtgca ctectcgcta ccggccaccc cctctacccc gcaactgggt gtcggccaac tgagccaett gcfgacccat ccagctcgtc qtetctggcc tgattggaag geggeaaagg ttectqgcca gagccccggc gcgõffceae gagaaegc&g gç&etáxgç aftcçagccg ggattacttg egtctggctc gccagctcct cctcctcccg ccccgcgcct cccggafccc acaqçgccct cgctctctgç ggtggaggcg gcggtgcaga cccggceçág gctcqtcccc tctgaeccct tgcgtcaggc cgaactggcc acattttgca cecatcgágc tcgatgecaa atcgggaagc ccgacccctc ffcgcggftg gtgccggcgg aagctgagcg acatcpgcgt tcggataaga aggagecggg flS989tgttt cgtcggsgaa âcgctcagga caggeaqccc tcttcggcog gfSOtgecee gftggcãágg gcacoggggg eggattagct gcggcggcgg ggaggeaagg ctctgggctc cccagtgcgt ccacctccte tacaagccgg gccagatagt ctggccgggg cctacgccgg cccaccaagc cgggcagcct ggictfCâfta agctggccgg acagccagtt t^tgecggga mmmm «sccagcec aagtccggat acccgetggt acggccgccg cggttgctgg taeggcttta tgctccctaa qggccgtgcg acaagcgctt ãcggcatttc ccgggacaga agcgctgccg cggccgccat 60 120

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<210> 53 <211> 646 <212 > PRT <213> Homo Sapíens <400> 53 «et Ser Thr AU Pro ser Leu Ser Ala Leu Arg ser Ser Lys His ser 1 5 IQ 15 Gly Gly Gly Gly 20 teu Gly Gly Gly Gly Gly 25 ser Gly Gly Ala Asp Pro 30 Ala Trp Thr ser Ala ser Gly ASO ser Gly Pro Gly Pro Gly ser ser 35 40 45 Pro Ala Gly ser Thr Lys Pro Phe Vai His AU vai pro Pro ser ASp 50 55 60 Pro teu Arg Gl;n AU Aso Arg teu Pro lie tys Vai teu Lys ííet Leu 65 70 75 Leu Gin 80 Thr Ala Arg Thr Gly tils Ile Leu hU Pro Glu Tyr pro teu 85 90 95 PH3 ser Thr pro Vai Ser Pro lie Glu Leu Asp Ala Lys Lys Ser Pro 100 105 m teu Ala Leu 115 teu AU Glr» Thr CVS 120 Ser Gin IU Gly tys Pro 125 Asp Pro Ser Pró Ser ser Lys Lee ser ser Vâl Ala ser Aso Gly Gly Gly Ala 130 135 140 Gly 160 Gly 145 pro Gly Ala Gly Gly 15¾ AÍ a AU Gly ASp i?I ASP Thr tys ser L m Lys leu ser A*p TU Gly vai Glu ASp Lys ser ser Phe tys 165 170 Gly Si 175 Gly Pro Tyr Ser tys 180 Pro Gly Ser ASp Lys 115 Lys Glu pro Gly Gly Gly Gly 195 Gly Gly Gly Gly Gly 200 Gly Gly Gly Gly vai Ser 205 Ser Glu tys ser Gly Phe Arg v*l pro ser aU Thr cys GU pro Phe Thr Pro 210 215 220 Gly Gly 240 Arg '225 Ket Thr Gly Ser Pro ser 230 Gly ser Ser aU Ser Ala 235 Gly Cys Ser Pro teu ser ser AU Gly AU Pro Glu tys Asp Asp tys Lys 245 250 Gly AU 255 Ala Asp Thr ÂSp Vai Gly Gly Gly Gly Lys Gly Thr Gly Ser 260 265 Hl S 270 Gly Gly 01 li Gly Gly Pro Thr Gly Leu Ala Gly Arg ile ser cys 275 280 285 Gly Gly Gly lis Asn vai ASp Vai Aso Gin HU Pro Aãp fiy Gly Pro 290 295 300 Gly 320 Lys 305 AU Leu Gly Ser Asp 310 cys Gly Gly ser Ser 315 Gly ser ser ser ser Gly Pro ser AU 325 Pro Thr ser Ser Ser 330 Vai Leu Gly ser GÍy 335 teu ΡΕ1324652 - 51 - v&1 Ala Pro vai ser pro Tyr lys pro Gly Gin Thr Val Phe ΡΓΟ teu Ala 340 Thr 345 350 Pro Pro Gly «et Tyr Pro Gly Ser teu Ala Gly Ala Tyr Ala 355 360 365 Gly Tyr 370 Pro Pro 01« teu 375 Pro His Gly val Ala 380 Leu Asp pro Thr lys m Pm Gly ser leu val Gly Ala Gin leu Ala Ala Alã Alã Ala Gly 390 305 400 ser Leu Gly eys Ser Lys Pro Ala Gly ser Ser pro Leu Ala Gly Ala 4GS vai 410 415 Ser Pm Pro Ser 420 «et Thr Ala Ser 425 Leu cys Arg A$p Pro 430 Tyr cys leu ser Tyr HiS Cys Ala Ser MÍS Leu Ala Gly Ala Ala Alã Ala Ser 435 440 445 Ala Ser 450 cys Ala Mi S Asp Pro Ala Ala A1 a Ala Ala Ala Leu Lys Ser 455 460 βΐγ tyr pro Leu vai Tyr pro Thr Mis pro Leu HÍS Gly Val «is ser 465 470 475 480 ser teu Thr Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Thr Pro Pro ser Leu Ala Hi$ 485 490 495 Gly Pro Leu Tyr Pré Tyr Gly Phe «et Leu Pro Asn Asp Pro Leu HlS SOO 505 510 Pro He EI Ç cys ASM Trp val ser Ala Asn Gly Pro Cys ASp Lys Arg Phe Ala Thr ser Glu slu Leu I^JI ví Leu Ser HÍS Leu Arg u£ J Thr HÍS Thr Ala Phe 530 535 540 Pm Gly Thr Asp Lys Leu teu Ser Gly Tyr Pro ser Ser ser Ser 545 550 555 His lia 560 Léu Ala ser Ala Ala Ala Ala Ala «et Ala Cys Mis «et Pro Thr 565 570 575 Ser 61 y Ala Pro Gly Sor Pro Gly 5SS Thr leu Ala Leu Arg Ser pro §80 S90 His HiS Ala Leu Gly Leu ser ser Arg Tyr Mis Pro Tyr ser Lys Ser §95 600 605 Ala Pro Leu Pro Thr Pro Gly Ala pm Vai pro Val Pro Ala Thr Gly 610 615 620 Thr Pro Tyr Tyr ser Pro Tyr Ala L«U Tyr Gly Gin Arg Leu Thr Alã 625 630 635 640 ser Ala Leu Gly Tyr Gin 645

Lisboa 10 de Julho de 2007

Claims (14)

1. ΡΕ1324652 1 REIVINDICAÇÕES 1. Mosca transgénica cujo genoma compreende uma sequência de ADN codificando um polipéptido consistindo numa porção Abeta da APP humana em que a referida sequência de ADN codifica Abeta40 (SEQ ID NO: 1) ou Abeta42 (SEQ ID NO: 2), fundida com uma sequência sinal, estando a referida sequência de ADN operativamente ligada a uma sequência de controlo da expressão; e expressando a referida sequência de ADN, em que a expressão da referida sequência de ADN resulta na referida mosca transgénica apresentar um fenótipo alterado.
2. 2. Mosca transgénica da reivindicação 1, em que a referida sequência de ADN codifica Abeta42 e em que a referida sequência de controlo da expressão especifica de tecido compreende o promotor especifico do olho GMR.
3. 3. Mosca transgénica da reivindicação 2 em que a referida expressão da referida sequência de ADN resulta na referida mosca apresentar o fenótipo do "olho rugoso".
4. 4. Método para identificar modificadores genéticos da via de APP, compreendendo o referido método: a) proporcionar uma mosca transgénica cujo genoma compreende uma sequência de ADN codificando um polipéptido consistindo na porção Abeta da APP humana em que a referida sequência de ADN codifica 2 ΡΕ1324652 Abeta40 (SEQ ID NO: 1) ou Abeta42 (SEQ ID NO: 2), fundida com uma sequência sinal, estando a referida sequência de ADN operativamente ligada a uma sequência de controlo da expressão especifica de tecido; e expressão da referida sequência de ADN, em que a expressão da referida sequência de ADN resulta na referida mosca apresentar um fenótipo alterado; b) cruzamento da referida mosca transgénica com uma mosca contendo uma mutação num gene conhecido ou previsto; e c) pesquisa na descendência dos referidos cruzamentos de moscas que possuam a referida sequência de ADN e a referida mutação e que apresentem uma expressão modificada do fenótipo transgénico em comparação com os controlos.
5. 5. Método da reivindicação 4, em que o referido modificador genético e/ou o seu homólogo humano é um gene que afecta o decurso da Doença de Alzheimer.
6. 6. Método da reivindicação 4, em que a referida sequência de ADN codifica Abeta42 e em que a referida sequência de controlo da expressão especifica de tecido compreende o promotor especifico do olho GMR.
7. 7. Método da reivindicação 6, em que a referida expressão da sequência de ADN resulta na referida mosca apresentar o fenótipo do "olho rugoso". 3 ΡΕ1324652
8. 8. Método para identificar alvos para o desenvolvimento de terapêuticos para tratar, prevenir ou melhorar condições associadas a regulação anormal da via de APP, compreendendo o referido método: a) proporcionar uma mosca transgénica cujo genoma compreende uma sequência de ADN codificando um polipéptido consistindo na porção Abeta da APP humana em que a referida sequência de ADN codifica Abeta40 (SEQ ID NO: 1) ou Abeta42 (SEQ ID NO: 2), fundida com uma sequência sinal, estando a referida sequência de ADN operativamente ligada a uma sequência de controlo da expressão especifica de tecido; e expressão da referida sequência de ADN, em que a expressão da referida sequência de ADN resulta na referida mosca apresentar um fenótipo alterado; b) cruzamento da referida mosca transgénica com uma mosca contendo uma mutação num gene conhecido ou previsto; e pesquisa na descendência dos referidos cruzamentos de moscas que possuam a referida sequência de ADN e a referida mutação e apresentem uma expressão modificada do fenótipo transgénico em comparação com os controlos; e c) identificação dos homólogos humanos da sequência de ADN de (b).
9. 9. Método da reivindicação 8, em que a referida condição é a Doença de Alzheimer. 4 ΡΕ1324652
10. 10. Método da reivindicação 8 compreendendo ainda a identificação dos homólogos humanos dos modificadores genéticos que se mapeiam na área do cromossoma 10 humano que se mostrou ter ligação genética com a Doença de Alzheimer.
11. 11. Método para identificar compostos úteis para o tratamento, prevenção e melhoria das condições associadas a regulação anormal da via de APP compreendendo o ensaio de compostos que podem modificar os fenótipos induzidos pela expressão de Abeta, compreendendo o referido método: a) proporcionar uma mosca transgénica cujo genoma compreende uma sequência de ADN codificando um polipéptido compreendendo a porção Abeta da APP humana em que a referida sequência de ADN codifica Abeta4 0 (SEQ ID NO: 1) ou Abeta42 (SEQ ID NO: 2), fundida com uma sequência sinal, estando a referida sequência de ADN operativamente ligada a uma sequência de controlo da expressão especifica de tecido; e expressão da referida sequência de ADN, em que a expressão da referida sequência de ADN resulta na referida mosca apresentar um fenótipo alterado; b) administração à referida mosca de um composto candidato; e c) ensaio das alterações no fenótipo da referida mosca do passo (a) em comparação com o fenótipo de uma mosca do passo (a) à qual não foi administrado o composto candidato. 5 ΡΕ1324652
12. 12. Método da reivindicação 11, em que a referida condição é a Doença de Alzheimer.
13. 13. Método da reivindicação 11, em que a referida sequência de ADN codifica Abeta42 e em que a referida sequência de controlo da expressão especifica de tecido é o promotor especifico do olho GMR.
14. 14. Método da reivindicação 13, em que a referida expressão da referida sequência de ADN resulta na referida mosca apresentar o referido fenótipo alterado referido como fenótipo do "olho rugoso". Lisboa, 10 de Julho de 2007