ES2313726T3

ES2313726T3 - Genes de regulacion de la cromatina.

Info

Publication number: ES2313726T3
Application number: ES96914165T
Authority: ES
Inventors: Thomas Jenuwein; Gotz Laible
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 1995-05-10
Filing date: 1996-05-02
Publication date: 2009-03-01
Anticipated expiration: 2016-05-02
Also published as: DK0827537T3; CA2220442C; CA2220442A1; ATE404667T1; WO1996035784A2; WO1996035784A3; JP4295824B2; DE19516776A1; DE59611481D1; JP2001505402A; EP0827537A2; EP0827537B1; US7252968B2; MX9708401A; US6689583B1; PT827537E; US20050089880A1

Abstract

LA DESREGULACION DE GENES REGULADORES DE CROMATINA QUE PRESENTAN UN DOMINIO SET DESEMPEÑA UN PAPEL IMPORTANTE EN CIERTOS CANCERES. ESTOS GENES, EN PARTICULAR EL DOMINIO SET COMO TAL, PUEDEN UTILIZARSE PARA EL DIAGNOSTICO Y TRATAMIENTO DE ESTAS ENFERMEDADES

Description

Genes de regulación de la cromatina.

La presente invención se refiere a genes, que juegan un papel en la regulación estructural y funcional de la cromatina, y a su empleo para la terapia y diagnóstico.

La organización funcional de los cromosomas eucarióticos en centrómeros, telómeros, así como en regiones eu- y heterocromáticas representa un decisivo mecanismo para la garantía de la exacta replicación y distribución de la información genética en cada división celular. Por el contrario las células tumorales se caracterizan a menudo por redistribuciones cromosómicas, translocaciones y aneuploidia (Solomon et al., 1991; Pardue, 1991). Aunque los mecanismos que conducen a una elevada inestabilidad de los cromosomas en las células tumorales no están todavía aclarados, han hecho posibles recientemente una serie de sistemas experimentales empezando con los efectos teloméricos de posición en levaduras (Renauld et al., 1993; Buck y Shore, 1995; Allshire et al; 1994) sobre la variegación por efecto de la posición (PEV) en la Drosophila (Reuter y Spierer, 1992), hasta análisis de puntos de rotura de translocación en leucemias humanas (Solomon et al., 1991; Cleary, 1991), algunas proteínas cromosómicas para identificar, que participaron originalmente en la proliferación incontrolada.

En primer lugar, se comprobó que la sobrexpresión de una versión acortada de la proteína SIR4 conduce en la levadura, a una duración de vida más larga (Kennedy et al; 1995). Dado que las proteínas SIR contribuyen a la aparición de complejos multímeros en los tranquilos "Mating Type Loci" ("sitios de tipo mateado") y en el telómero, podría ser que la sobreexpresada SIR4 interfiriera con estos complejos del tipo heterocromatina, lo cual conduce finalmente a una proliferación incontrolada. Esta suposición está de acuerdo con la frecuencia de la aparición de una longitud de telómeros incontrolados en la mayoría de tipos de cáncer humano (Counter et al; 1992).

En segundo lugar se identificaron mediante análisis genético del PEV en la Drosophila, una serie de productos genéticos, los cuales modifican la estructura de la cromatina en las posiciones heterocromáticas y dentro del conjunto homeótico de genes (Reuter y Spierer, 1992). Las mutaciones de algunos de estos genes, como la mutación módulo (Garzino et al; 1992) y la polihomeótica (Smouse y Perrimon, 1990), pueden causar en la Drosophila la proliferación celular incontrolada o la muerte de las células. En tercer lugar se describieron homólogos de mamíferos tanto activadores (del grupo trithorax o del grupo trx) como también represores (por ejemplo el grupo polycomb o el grupo Pc) de la estructura de la cromatina de los genes del selector homeótico de la Drosophila. Entre éstos, se ha mostrado por el HRX/ALL-1 humano (grupo trx), que participa en la leucemiogénesis inducida mediante translocación (Tkachuk et al., 1992; Gu et al., 1992), y que la sobreexpresión del bmi del ratón (grupo Pc) conduce a la aparición de linfomas (Haupt et al., 1991; Brunk et al., 1991; Alkema et al., 1995). Un modelo para las proteínas de función cromosómica deja deducir que estas forman complejos multímeros, los cuales determinan en función del equilibrio entre activadores y represores en el complejo, el grado de condensación de la región adyacente de la cromatina (Locke et al., 1988). Una desviación de este equilibrio mediante la sobreexpresión de uno de los componentes del complejo mostró una nueva distribución de las regiones eu- y heterocromáticas (Buck y Shore, 1995; Reuter y Spierer, 1992; Eissenberg et al., 1992). Este efecto de la dosis puede desestabilizar la estructura de la cromatina en sitios predeterminados, lo cual finalmente conduce al paso del estado normal al transformado.

A pesar de la caracterización de HRX/ALL-1 y bmi como protooncogenes, los cuales pueden modificar la estructura de la cromatina, el conocimiento sobre los productos de los mamíferos que interaccionan con la cromatina, es todavía muy limitado. Por el contrario, se describieron mediante análisis genético del PEV en la Drosophila aproximadamente 120 alelos como reguladores de la cromatina (Reuter y Spierer, 1992). Recientemente ha sido identificada una región carboxiterminal de secuencia semejante, la cual es conjuntamente un regulador positivo (trx, grupo trx) y un regulador negativo (E(z), grupo Pc) de la cromatina de la Drosophila (Jones y Gelbart, 1993). Además, este carboxiterminal está conservado también en el Su(var)3-9, un supresor dominante de la distribución de la cromatina en la Drosophila (Tschiersch et al., 1994).

En la presente invención, se desprende de la reflexión, que este dominio de la proteína al que se denomina "SET" (Tschiersch et al., 1994) a causa de su conservación evolucionada y de la presencia en productos génicos antagonistas, define una nueva familia de genes desde el punto de vista histórico del desarrollo de importantes reguladores de la cromatina de mamíferos. Además, la caracterización de otros miembros del grupo de genes del dominio SET junto con HRX/ALL-1, contribuye al esclarecimiento de los mecanismos, que son responsables de los cambios estructurales de la cromatina que pueden conducir a una transformación maligna.

La presente invención tiene en consecuencia la finalidad fundamental de identificar los genes reguladores de la cromatina humana, aclarar su función, y emplearlos para el diagnóstico y la terapia.

Para solucionar esta tarea se aprovecha en primer lugar la información secuencial del dominio SET para obtener a partir de los bancos de ADNc humanos los ADNc humanos homólogos a los genes del dominio SET de la Drosophila. Se obtuvieron dos ADNc, los cuales representan homólogos humanos de E(z) ó respectivamente Su(var)3-9; los correspondientes genes humanos se designaron como EZH2 y SUV39H (ver más abajo); además se identificó una forma variante de EZH2, la cual se designó como EZH1.

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La presente invención se refiere por lo tanto a una molécula de ADN, la cual codifica una proteína humana reguladora de la cromatina o una secuencia parcial de la misma, la cual corresponde al dominio SET, caracterizado porque se escoge del grupo de moléculas de ADN, las cuales tienen las secuencias de nucleótidos representadas en la figura 6 ó respectivamente la figura 7, que codifican proteínas de la designación EZH2 ó respectivamente SUV39H, ó fragmentos de esta secuencia las cuales corresponden al dominio SET de EZH2 ó respectivamente SUV39H.

Los genes según la invención llevan la designación EZH2 y SUV39H, los cuales se designaban anteriormente como "HEZ-2" y "H3-9".

La invención se refiere en otro aspecto, a los ADNc derivados de estos genes, incluidas sus variantes degenerativas; mutantes los cuales codifican reguladores funcionales de la cromatina, así como unas variantes que se atribuyen a una duplicación de genes (EZH1, cuya secuencia parcial está representada en la figura 8, en comparación con EZH2).

Para solucionar la tarea propuesta en el marco de la presente invención, se procedió como se describe brevemente a continuación: a partir de la información de la secuencia del dominio SET conservado, se efectuó el screening con restricción reducida de una biblioteca de ADNc específico de células B humanas, con una mezcla de sondas de ADN de Drosophila que codifican los dominios SET de E(z) y Su(var)3-9. A partir de 500.000 placas se escogieron 40 fagos primarios. Después de dos ciclos más de screening, se constató que 31 fagos codificaban las secuencia auténticas E(z) y que cinco fagos representaban las variantes E(z). Por el contrario, hibridaron solamente dos fagos con la sonda, los cuales contenían el dominio SET de Su(var)3-9 sólo. Los insertos de los fagos fueron amplificados mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se analizaron mediante mapeado por restricción y secuenciación parcial. Se subclonaron los insertos representativos de ADNc y se secuenció toda su longitud. Los extremos 5' se aislaron, efectuando el screening de los fagos positivos una vez más con sondas de ADN-5', con lo cual después de la subclonación, se obtuvieron ADNc completos.

El ADNc completo que codifica el homólogo humano de E(z) fué denominado EZH2, y el ADN que codifica el homólogo humano de Su(var)3-9 fué denominado SUV39H. En conjunto, la identidad de los aminoácidos entre la Drosophila y las proteínas humanas es del 61% para el EZH2 y el 43% para el SUV39H, en donde el C-terminal del dominio SET está muy altamente conservado (88% para EZH2 y 53% para SUV39H). La comparación de las secuencias mostró otras claras regiones de homología, por ejemplo un dominio rico en cisteína en EZH2 y una Chromo-Box en SUV39H (en el polycomb se demostró que la Chromo-Box es un dominio esencial para la interacción entre el ADN y la cromatina; Messmer et al., 1992). Por el contrario, faltan los 207 aminoácidos, los cuales contienen el motivo de unión GTP amino terminal de la proteína de la Drosophila en el homólogo humano SUV39H.

La comparación de las secuencias de aminoácidos entre los genes de la Drosophila y los genes humanos está representada en las figuras 1 y 2:

La figura 1 muestra la comparación de la secuencia de aminoácidos entre EZH2 y el potenciador de la Drosophila de "zeste" (E(z)). Se muestran los aminoácidos idénticos de los carboxiterminales conservados del dominio SET (cajetín sombreado) y de la región rica en Cys (los radicales Cys están resaltados). Las supuestas señales de localización del núcleo están subrayadas.

La figura 2 muestra la comparación de la secuencia de aminoácidos entre el homólogo humano SUV39H y Su(var)3-9 de la Drosophila. Están representados los aminoácidos idénticos de los dominios SET carboxiterminales conservados (cajetín sombreado) y el dominio Chromo (cajetín sombreado en oscuro). Las supuestas señales de localización del núcleo están subrayadas. En la parte superior de la figura está representada una vista esquemática de las dos estructuras de proteína, la cual muestra que en el homólogo humano faltan 207 aminoácidos en el terminal N.

Puesto que las secuencias de consenso translacionales en el entorno del ATG de partida del ADNc de SUV39H humano también están presentes en la correspondiente posición interna en Su(var)3-9, la proteína de la Drosophila debería contener exones adicionales, los cuales en un posterior estadio de la evolución serían innecesarios para la función. (La exactitud de esta hipótesis puede ser confirmada expresando el ADNc de la SUV39H humana y completa, o bien los ADNc acortados en el extremo 5' de Su(var)3-9 de la Drosophila. Además se describió otro ADNc con la denominación MG-44 (ver más abajo), el cual igualmente carece del extremo 5' del gen de la Drosophila. Adicionalmente al ADNc humano de la SUV39H, fue aislado también el sitio homólogo en el ratón (Suv39h; ver más adelante), cuyo análisis de la secuencia y estructura del promotor confirman claramente el acortamiento amino terminal de los genes mamíferos homólogos en comparación con el Su(var)3-9 de la Drosophila.

En el marco de la presente invención los análisis Blot del ADN aclaran que los genes homólogos de mamíferos de Su(var)3-9 en el ratón y en el hombre están representados por sitios individuales, mientras que los genes homólogos de mamíferos de E(z) en el ratón y en el hombre están codificados mediante dos sitios separados. El segundo sitio humano (denominado EZH1) fue confirmado también mediante la caracterización de un pequeño número de variantes de ADNc, las cuales se diferencian por sus secuencias flanqueantes 3' de la mayor parte de los clones aislados de la biblioteca de ADNc humano. Las diferencias entre EZH2 y EZH1 en las zonas secuenciadas están representadas en la figura 8: el dominio SET de EZH1 muestra mutaciones frente a la EZH2; además la variante EZH1, aislada por nosotros, (muy probablemente un ADNc aberrantemente empalmado) lleva un codon de interrupción que se encuentra en el marco de lectura, el cual acorta la proteína aproximadamente en 47 terminales C de aminoácidos. En la figura 8 se representa la secuencia de nucleótidos del ADNc de EZH2 desde la posición 1844 a la 2330 siempre en la línea superior, en donde el sitio del empalme 5' y el codon potencial de interrupción están subrayados. Para subordinar una secuencia parcial del ADNc de la variante EZH1 de la secuencia de EZH2, se empleó al programa gap del servicio informático del GCG de Wisconsin. El codon de interrupción en EZH1 anticipado (posición 353) está subrayado. Las secuencias que codifican el dominio SET conservado están resaltadas. Además está representado el extremo 3' (posición 151 del EZH1) del transcripto aberrante B52 (ver más abajo). En cuanto a la secuencia disponible, el B52 se mostró en un 97% idéntico al EZH1 y en un 72% idéntico al EZH2. La comparación de las secuencias de EZH1 con EZH2, así como la confirmación de que aparecen en el hombre y en el ratón dos sitios del homólogo E(z) separados, permiten concluir que en los mamíferos tiene lugar una duplicación de los genes.

En una comparación con las secuencias del ADNc en el banco de genes del banco de datos se comprobó sorprendentemente que determinadas secuencias parciales del ADNc introducidas en el banco de datos, derivadas de transcriptos aberrantes en los tejidos tumorales, representan versiones mutadas de los ADNc según la invención:

Por una parte, en la búsqueda de BRCA1 se aisló un gen, que predisponía al cáncer de mama y de útero, una secuencia parcial de ADNc con 271 nucleótidos, denominada B52 la cual codifica una variante mutada del dominio SET, y se mapeó el cromosoma humano 17q21 (Friedman et al., 1994). En el marco de la presente invención se comprobó sorprendentemente que el 97% del B52 es idéntico a la variante del ADNc de EZH1 según la invención (comparar más arriba); posiblemente EZH1 representa un gen, cuya reactivación juega un papel en la proliferación incontrolada.

Por otra parte, se aisló un ADNc (2.800 nucleótidos; MG-44) del cromosoma humano Xp11 (Geraghty et al., 1993), de una región que predisponía a molestias degenerativas de la retina, y sarcomas sinoviales. Se comprobó sorprendentemente que este ADNc tiene el 98% de identidad con el ADNc del SUV39H según la invención.

Los nuevos genes preparados en el marco de la presente invención hacen posible deducir que existe una dependencia entre determinadas enfermedades cancerígenas y las mutaciones en los reguladores de la cromatina; en el caso del ADNc de MG-44 se pudo aclarar, puesto que éste tiene varias mutaciones puntuales y de cambio de marco, las cuales interrumpen los dominios Chromo y SET, solamente a la vista del ADNc de SUV39H según la invención, una dependencia entre Su(var)3-9 y MG-44.

Junto a las secuencias ya citadas, están incorporadas al banco de genes del banco de datos de secuencias, como otros miembros humanos de la familia de proteínas SET el bien documentado homólogo humano de la Drosophila trx, HRX/ALL-1 (Tkachuk et al., 1992); Gu et al., 1992), además un gen de función desconocida, con la denominación G9a, el cual se encuentra en el complejo de histocompatibilidad Major humano (Milner y Campbell, 1993), en tercer lugar un ADNc (KG-1) no publicado, el cual fue aislado de células tumorales mieloides inmaduras (Nomura et al., 1994). Mientras que el G9a es actualmente el único gen humano con un dominio SET, para el cual no se conoce hasta ahora ninguna versión mutada, el KG-1 lleva una inserción de 342 aminoácidos la cual divide el dominio SET en una mitad aminoterminal y otra mitad carboxi-terminal. Probablemente este ADNc de KG-1 representa una variante aberrante empalmada, puesto que los puntos 5' y 3' del empalme del consenso se encuentran en ambos extremos de la inserción. En conjunto, se someten cuatro de los cinco miembros humanos conocidos en la actualidad de la familia de proteínas de SET, a modificaciones, las cuales mutan el dominio SET (HRX/ALL-1, EZH1/B52, SUV39H/MG-44 y KG-1). Además, en tres casos se mapearon los correspondientes sitios de genes humanos en la proximidad de los puntos de ruptura de la translocación o regiones cromosómicas inestables (HRX/ALL-1, EZH1/B52 y SUV39H/MG-44). En la figura 3 están representados los transcritos aberrantes de los genes del dominio SET humano. A la izquierda de la figura está indicada la posición de los cinco genes del dominio SET actualmente conocidos, sobre el correspondiente cromosoma. Entre otros están representados los tres genes (HRX/ALL-1, EZH1/B52 y SUV39H/MG-44), mapeados para los ADNc aberrantes sobre los puntos de ruptura de la translocación o regiones inestables de la cromatina. Cuatro de los cinco genes de los dominios SET representados, presentan mutaciones, las cuales interrumpen todas ellas, los dominios SET carboxiterminales, los cuales están representados en la figura, por el cajetín obscuro. Una translocación une la mitad amino terminal de HRX con una secuencia de genes no correlacionada la cual está representada en el cajetín punteado con la denominación ENL. Las mutaciones y un codon de interrupción prematuro modifican el dominio SET de EZH1/B52. Mutaciones puntuales y de cambio de marco interrumpen los dominios Chromo y SET en el MG-44. Una gran inserción divide el dominio SET de KG-1 en dos mitades. No se conocen en la actualidad transcriptos aberrantes para el G9a. El grupo rico en cisteína en el B52 está representado como un cajetín punteado; en el HRX/ALL-1 están representados la región de homología a las metil transferasas así como un cajetín con líneas inclinadas, y los ganchos A/T como líneas verticales. Los nombres de los correspondientes auténticos genes están indicados a la derecha de la figura.

El hecho de que un gen de un mamífero, de la familia de las proteínas SET, el HRX/ALL-1, fuera puesto en relación con la génesis leucémica inducida por translocación (Tkachuk et al., 1992; Gu et al., 1992), es una fuerte indicación de que las proteínas que contienen el dominio SET, no solamente son importantes reguladoras del desarrollo, cogestionando las modificaciones dependientes de la cromatina, de la expresión génica, sino que ellas mismas, después de la mutación obstaculizan también la normal proliferación celular.

Puesto que todas las mutaciones descritas hasta aquí, interrumpen la estructura primaria del dominio SET, existe la sospecha de que el dominio SET como tal, juega un papel decisivo en la conversión del estado normal al transformado. Una función importante del dominio SET puede sospecharse además debido a su conservación evolutiva en productos génicos, los cuales aparecen desde las levaduras hasta el hombre.

La figura 4 muestra la conservación evolutiva de las proteínas del dominio SET: con el empleo del programa
"tfasta" del servicio informático GCG de Wisconsin, se identificaron proteínas y marcos abiertos de lectura con homología al dominio SET. En la figura se muestra una elección representativa desde levaduras hasta el hombre. Las cifras indican aminoácidos. El dominio SET carboxiterminal está representado por un cajetín de color negro, las regiones ricas en Cys, por un cajetín punteado en oscuro, el motivo de unión GTP en Su(var)3-9 mediante un cajetín punteado en claro, y el dominio Chromo de Su(var)3-9 y H3-9 mediante un cajetín abierto con puntos claros. Una región con homología a la metiltransferasasa (trx y HRX) está representada como un cajetín rayado con líneas inclinadas. Los "ganchos" A/T (en inglés, "A/T Hooks") están representados mediante líneas verticales. Otra región rica en Ser (S en C26E6.10) y una región rica en Glu (E en G9a) ó repeticiones de "Ankyrin" (ANK en G9a) están igualmente resaltadas. Las YHR119 (Banco de genes, registro nº U00059) y C26E6.10 (Banco de genes, registro nº U13875) son a menudo marcos de lectura de cósmidos, incorporados recientemente al banco de datos sin una caracterización funcional. Los tantos por cientos indican el total de las identidades de los aminoácidos entre las proteínas humanas y las proteínas de la Drosophila.

La figura 5 muestra la coincidencia en los aminoácidos del dominio SET. El dominio SET de los genes representados en la figura 4 ha sido colocado mediante el empleo del programa Pileup del servicio informático GCG de Wisconsin. Para la comparación del dominio KG-1-SET se eliminó antes del Pileup, la gran inserción de aminoácidos que el dominio SET divide en dos mitades. Las posiciones de los aminoácidos que tienen de 8 a 10 coincidencias están resaltadas.

En base a los criterios fijados en el marco de la presente invención, se establece una distribución de los genes que tienen un dominio SET, al comienzo en función de la cromatina de la proliferación incontrolada; estos genes o respectivamente los ADNc derivados de los mismos, así como secuencias parciales y mutadas, pueden en consecuencia emplearse en la terapia y diagnosis de enfermedades, las cuales se atribuyen a una proliferación de esta clase:

Diferencias en el nivel de transcripción del ARN del dominio SET, entre células normales y transformadas pueden emplearse como parámetros de diagnóstico para enfermedades, en los cuales está incontrolada la expresión de los genes del dominio SET:

De esta forma pueden emplearse oligonucleótidos, que codifican el dominio SET como tal o respectivamente trozos parciales de los mismos, como marcadores para diagnóstico, para diagnosticar determinadas clases de cáncer, en los cuales el dominio SET está mutado. Para el análisis detallado de la función de los ADNc según la invención, o fragmentos de los mismos, con respecto al empleo diagnóstico de secuencias de los genes del dominio SET, se aislaron en el marco de la presente invención los homólogos de los ADNc del ratón de EZH1 (Ezh1) y SUV39H (Suv39h). En el empleo de un ratón específico, una sonda de ADN que codifica el dominio SET, en el análisis "protección de ARNasa" para la investigación de la actividad génica de Ezh1 durante el desarrollo normal de ratones, mostró un perfil de expresión más bien amplio, que es semejante al de bmi (Haupt et al., 1991). Los análisis efectuados con las secuencias de ratón son ampliados con las secuencias humanas, para comparar las cantidades de ARN entre células precursoras inmaduras, células tumorales y células diferenciadas en varios sistemas de cultivo de células humanas. Para la comprobación de si el dominio SET es correspondientemente adecuado como marcador tumoral para el diagnóstico de enfermedades de cánceres específicos o como parámetros generales de diagnóstico, pueden emplearse métodos de uso corriente para la determinación de la concentración de ARN, los cuales están descritos en manuales de laboratorio competentes (Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press ("Departamento de prensa del Laboratorio de Cold Spring Harbor"), como por ejemplo el Northern Blot, Análisis de Protección de la S1-nucleasa, ó el Análisis de Protección de la ARNasa.

Para la investigación de la frecuencia con la cual el dominio SET es sometido a mutaciones específicas pueden emplearse las sondas de ADN específicas para SET, para el análisis de polimorfismo de conformación de una sola cadena (en ingles "single strand conformation polymorphisms"); SSCP; Gibbons et al., 1995).

Las clases de cánceres, en los cuales pueden ser empleadas las sondas de ADN específicas para SET, como marcadores de diagnóstico, son el cáncer de mama (EZH1; Friedman et al.,, 1994), el sarcoma sinovial (SUV39H; Geraghty et al.; 1993) y las leucemias.

Tomando como base el conocimiento de la secuencia de nucleótidos de los genes del dominio SET pueden obtenerse en forma recombinante las correspondientes proteínas derivadas de la secuencia del ADNc, las cuales son igualmente objeto de la presente invención, insertando los ADNc que las codifican en vectores adecuados y expresando en organismos anfitriones. Las técnicas empleadas para la producción de proteínas recombinantes son familiares al especialista medio y pueden encontrarse en manuales competentes (Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T., 1989, Departamento de Prensa del Laboratorio de Cold Spring Harbor.

Objeto de la presente invención son en consecuencia en otro aspecto, las moléculas de ADN recombinante que contiene el ADN que codifican las EZH2, SUV39H ó EZH1, así como las secuencias para el control de la expresión unidas funcionalmente con las mismas, así como los organismos anfitriones transformados con ello.

Las proteínas recombinantes según la invención pueden emplearse para el análisis de la interacción de las proteínas del dominio SET con la cromatina o respectivamente con otros miembros de heterocomplejos de la cromatina; a partir de los conocimientos obtenidos sobre la forma de funcionar de estos complejos, se definen en particular las posibilidades para la intervención selectiva en los mecanismos implicados en los mismos, y pueden utilizarse para aplicaciones terapéuticas.

Las investigaciones que sirven para otros análisis de la función del dominio SET, se efectúan por ejemplo expresando in vitro así como en cultivos de tejidos, los ADNc que codifican el EZH2 ó respectivamente SUV39H y provistos de un epítopo, están disponibles frente al anticuerpo. Después de la inmunoprecipitación con los correspondientes anticuerpos específicos del epítopo, puede comprobarse si el EZH2 y el SUV39H pueden interaccionar entre sí in vitro, o bien si in vivo tiene lugar la formación de un complejo entre el EZH2 y/o el SUV39H con otros reguladores de la cromatina.

Ya fue sospechado por otros autores (DeCamillis et al., 1992; Rastelli et al., 1993; Orlando y Paro, 1993), que la formación de un complejo entre diferentes miembros de héteroproteínas de cromatina es esencial para su función. Tomando como base la disponibilidad de los genes del dominio SET según la invención, puede comprobarse, si la región SET representa un dominio, el cual funciona a base de interacciones o si contribuye a la aparición de complejos multímeros heterocromáticos. Igualmente puede comprobarse si el dominio SET tiene una función inhibidora, similar al dominio BTB amino terminal de diferentes reguladores de la cromatina incluido el factor GAGA (Adams et al., 1992). En conjunto los análisis de interacciones con las proteínas EZH2 y SUV39H provistas con epitopo, permiten otra caracterización de la función del dominio SET. Con ello se abren posibilidades de avanzar contra la actividad incontrolada, por ejemplo introduciendo en la célula mediante métodos terapéuticos génicos, variantes dominante-negativas de las secuencias del ADNc del dominio SET. Esta clase de variantes se obtiene por ejemplo definiendo en primer lugar los dominios funcionales de las proteínas SET, por ejemplo los fragmentos de secuencia responsables de la interacción ADN/cromatina o proteína/proteína, y a continuación expresando alrededor del o de los correspondiente(s)
dominio(s) o alrededor de fragmentos de los mismos, secuencias acortadas de ADN, en las células en cuestión, para competir con la proteína funcional intacta en el descontrol causado en la proliferación.

La disponibilidad de los ADNc según la invención, permite además la obtención de animales transgénicos por ejemplo, ratones en los cuales los genes del dominio SET o bien pueden ser sobreexpresados (en inglés "gain-of-function")("aumento de función"), o bien en los cuales estos genes pueden ser desconectados (en inglés "loss-of-function")("pérdida de función"); para los últimos análisis se emplean las correspondientes secuencias de animales, en particular las secuencias de ratón, de los genes según la invención. Estos ratones son igualmente objeto de la presente invención.

En particular el análisis "gain-of-function" ("aumento de la función") en el cual los alelos de los genes según la invención se introducen en el ratón, da finalmente explicación sobre la implicación original de las EZH2 y SUV39H en favorecer, en dependencia de la cromatina, la aparición del tumor. Para el análisis "gain-of-function" ("aumento de la función") pueden emplearse las secuencias completas de ADNc de las EZH2 y SUV39H humanas así como sus versiones mutadas como EZH1/B52 y MG-44, mediante vectores que hacen posible altas proporciones de expresión, por ejemplo plásmidos con el promotor \beta-actina humana, tanto del potenciador de la cadena pesada de las inmunoglobulinas (E\mu) como también los potenciadores del virus Moloney (Mo-LTR). Recientemente se mostró que la sobreexpresión del gen bmi, dependiente de la E\mu/Mo-LTR, el cual cuenta juntamente con EZH2 para el grupo Pc de reguladores de la cromatina, es suficiente para generar linfomas de ratones transgénicos (Alkema et al., 1995).

Interrumpiendo en los análisis "loss-of-function" ("pérdida de función"), los sitios endógenos del ratón para Ezh1 y Suv39h mediante la recombinación homóloga en células madre embrionarias, puede determinarse si la pérdida de la función génica in vivo, conduce a un anormal desarrollo del ratón.

Tomando como base este sistema in vivo puede confirmarse la acción del EZH2 y SUV39H; estos sistemas sirven además como fundamento para modelos animales con respecto a una terapia génica humana.

El empleo de una terapia génica de las secuencias de ADN según la invención o de las secuencias derivadas de las mismas (por ejemplo oligonucleótidos anti sentido complementarios), según si la enfermedad a tratar es atribuible a un descontrol de la cromatina a causa de la falta de la secuencia génica funcional, o es atribuible a una sobreexpresión de los correspondientes genes que - mediante la introducción de la secuencia de genes funcionales, mediante la inhibición de la expresión de genes, por ejemplo, mediante la ayuda de oligonucleótidos antisentido, o mediante la introducción de una secuencia codificadora de un mutante dominante-negativo. La introducción de las correspondientes secuencias de ADN en la célula puede efectuarse con ayuda de métodos estándar para la transfección de células eucarióticas superiores, entre los cuales se cuenta la transferencia de genes mediante vectores virales (retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados) o mediante sistemas no víricos a base de endocitosis mediada por el receptor; una vista general sobre los métodos de uso corriente incluye por ejemplo a Mitani y Caskey, 1993; Jolly, 1994; Vile y Russel, 1994; Tepper y Mule, 1994; Zatloukal et al, 1923, WO 93/07283.

Para una inhibición de la expresión de los genes según la invención, entran en consideración también las sustancias de bajo peso molecular, que actúan en la maquinaria de la transcripción; después del análisis de la región reguladora 5' de los genes pueden seleccionarse por screening, substancias que bloquean la interacción de los correspondientes factores de transcripción con esta región de manera completa o parcial, por ejemplo con ayuda del método descrito en la patente WO 92/13092.

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Una inhibición de la proliferación descontrolada puede aplicarse terapéuticamente también al producto génico empleando los correspondientes anticuerpos contra la proteína EZH2 ó la SUV39H, de preferencia humana o anticuerpos humanizados. La obtención de dichos anticuerpos tienen lugar mediante métodos ya conocidos, como por ejemplo los descritos por Malavsi y Albertini, 1992, ó por Rhein, 1993.

Los anticuerpos contra EZH2 ó SUV39H, los cuales pueden ser utilizados terapéuticamente o para el diagnóstico, son igualmente objeto de la presente invención.

Descripción de las figuras

Figura 1: comparación de las secuencias de aminoácidos entre EZH2 y E(z)

Figura 2: comparación de las secuencias de aminoácidos entre SUV39H y Su(var)3-9

Figura 3: transcrito aberrante de los genes del dominio SET humano

Figura 4: conservación evolutiva de las proteínas del dominio SET

Figura 5: determinación de los aminoácidos del dominio SET

Figura 6: secuencia de ADN y de aminoácidos de EZH2

Figura 7: secuencia de ADN y aminoácidos de SUV39H

Figura 8: comparación parcial de las secuencias de los ADNc de las EZH2 y EZH1 humanas.

Ejemplo a) Obtención de una biblioteca de ADNc

Se preparó una biblioteca de ADNc específica de células B humanas, como se describe por Bardwell y Treisman, 1994, aislando el poli(A)^{+}- ARN de células BJA-B humanas, mediante transcripción inversa con cebador poli(dT)_{15}- y convirtiendo en ADNc de doble cadena. Después de la adición de un adaptador EcoRI de la secuencia 5' AATTCTC
GAGCTCGTCGACA se ligó el ADNc en el sitio EcoRI del bacteriófago gt10. La propagación y amplificación de la biblioteca se efectuó en E. coli C600.

b) Obtención de sondas de ADN

Las sondas de ADN de Drosophila que codifican los dominios SET conservados, de E(z) y Su(var)3-9, se obtuvieron sobre la base de las secuencias de Drosophila publicadas (Jones y Gelbart, 1993; Tschiersch et al., 1994) mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR): 1 \mug del ADN de la Drosophila melanogaster (Clontech) fue sometido con los dos cebadores E(z) 1910 (5'ACTGAATTCGGCTGGGGCATCTTTCTTAAGG) y E(z) 2280 (5' ACTCTAGA
CAATTTCCATTTCACGCTCTATG) de una amplificación PCR (35 ciclos a 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 55ºC y 30 segundos a 72ºC. La sonda correspondiente del dominio SET para Su(var)3-9 fue amplificada por 10 ng de ADN de plásmido (Tschiersch et al., 1994; Klon M4) con el par cebador suvar.up (5' ATATAGTACTTCAAGTCCATT
CAAAAGAGG) y suvar.dn (5' CCAGGTACCGTTGGTGCTGTTTAAGACCG), en donde se utilizaron las mismas condiciones de los ciclos. Los fragmentos de ADN del dominio SET obtenidos fueron limpiados de Gel y secuenciados parcialmente, para confirmar la idoneidad de las secuencias amplificadas.

c) Screening de la biblioteca de ADNc

5 x 10^{5} unidades formadoras de placas (en inglés "plaque forming units", pfu) se suspendieron con 5 ml de cultivo de la cepa bacteriana hospedadora E. coli C600 (con una densidad óptica de OD_{600}, de 0,5 en MgSO_{4} 10 mM), se incubaron a 37ºC durante 15 minutos y a continuación se vertieron sobre una cápsula LB de tamaño (200 mm x 200 mm) previamente calentada. Después de un crecimiento durante la noche a 37ºC, se absorbieron los fagos sobre una membrana de nylon (GeneScreen). La membrana se deja flotando, con el lado en donde se han absorbido los fagos mirando hacia arriba, durante 30 segundos en una solución de desnaturalización (1,5 M de NaCl, 0,5 M de NaOH), a continuación se sumerge durante 60 segundos en la solución de desnaturalización y a continuación se neutraliza durante 5 minutos con 3 M de NaCl, 0,5 M de Tris, pH 8. A continuación, se enjuaga la membrana durante breve tiempo en 3 x SSC, y el ADN de los fagos se filtra mediante reticulación mediante UV sobre el filtro de nylon. El filtro se prehibrida durante 30 minutos a 50ºC en 30 ml de tampón Church (1% de BSA, 1 mM de EDTA y 0,5 M de NaHPO_{4}, pH 7,2), a continuación se añadieron 2 x 10^{6} cpm de la mezcla de sondas de ADN marcadas radiactivamente (E(z)-SET y Su(var)3-9; las sondas de ADN se obtuvieron mediante encebado al azar mediante el empleo del kit RediPrime (Amersham). La hibridación se efectuó durante la noche a 50ºC. Después de la eliminación de la solución de hibridación, se lavó el filtro durante 10 segundos en 2xSSC, 1% de SDS a temperatura ambiente y a continuación durante 10 segundos a 50ºC. El filtro se enrolló en Saranwrap, y con el empleo de un folio de refuerzo se sometió a autorradiografía.

Se identificaron colonias de fagos positivas en la placa original mediante realización del autorradiograma, y se eliminaron los correspondientes trocitos de agar con el extremo grande de una pipeta Pasteur. El conjunto de fagos se eluyó durante la noche a 4ºC en 1 ml de tampón SM (5,8 g de NaCl, 2 g de MgSO_{4}-H_{2}O, 50 ml de Tris pH 7,5, 5 ml de gelatina al 2% en 1 litro de H_{2}O), conteniendo algunas gotas de CHCl_{3}. El listado de fagos se plaqueó una segunda y tercera vez para efectuar el screening, para obtener buenas placas positivas aisladas (de 20 a 100 placas por placa en la tercera vuelta).

d) Análisis de la secuencia

Los insertos de ADNc de los fagos recombinantes fueron subclonados en el polylinker del pBluescript KS (Stratagene), y se secuenciaron en un secuenciador automático (Applied Biosystems) mediante el empleo del método didesoxi. La secuencia completa de por lo menos dos aislados independientes por gen obtenido se determinó mediante el "Primer walking" ("paseo de cebadores"). Las secuencias se analizaron con el paquete de software GCG (Universidad de Wisconsin), la investigación sobre la homología se efectuó con el servicio informático "Blast and fasta" ó "tfasta". Las secuencias completas de EZH2 y SUV39H están representadas en las figuras 6 y 7.

Literatura

1: Genes y Dev.

2: Naturaleza

3: La célula

4: Genética

5: Investigación del cáncer

6: Genómica

7: Terapia de los genes del cáncer

8: Tendencias en Biotecnología

9: Sin públicar. Número de registro en el banco de genes

10: Bioensayos

11: Revista de investigación NIH

12: Ciencia

13: Terapia de los genes humanos

14: Terapia de los genes

15: Genes 135, 199

Claims

1. Molécula de ADN, que codifica una proteína humana reguladora de la cromatina, o una secuencia parcial de la misma, la cual corresponde a un dominio SET, caracterizado porque éste está escogido del grupo formado por moléculas de ADN, las cuales tienen las secuencias de nucleótidos representadas en la figura 6 ó respectivamente figura 7, y que codifican las proteínas denominadas EZH2 ó respectivamente SUV39H, ó fragmentos de estas secuencias las cuales corresponden al dominio SET de EZH2 ó respectivamente SUV39H.

2. Molécula de ADN según la reivindicación 1, caracterizada porque es una molécula de ADNc, la cual codifica la EZH2 humana funcional o respectivamente la SUV39H, incluyendo sus variantes degeneradas así como también una variante de la EZH2 con la denominación EZH1, la cual contiene como secuencia parcial, la secuencia según la figura 8.

3. Molécula de ADN según la reivindicación 1, caracterizada porque es una molécula de ADNc, la cual codifica la EZH2.

4. Molécula de ADN según la reivindicación 1, caracterizada porque es una molécula de ADNc, la cual codifica el dominio SET de EZH2.

5. Molécula de ADN según la reivindicación 1, caracterizada porque es una molécula de ADNc, la cual codifica la SUV39H.

6. Molécula de ADN según la reivindicación 1, caracterizada porque es una molécula de ADNc, la cual codifica el dominio SET de la SUV39H.

7. Molécula de ADN recombinante, la cual contiene una molécula de ADNc definida en la reivindicación 3 ó 5, funcionalmente unida con las secuencias de control de la expresión, para la expresión en organismos anfitriones procarióticos o eucarióticos.

8. Organismos anfitriones procarióticos o eucarióticos no humanos, transformados con una molécula de ADN recombinante, según la reivindicación 7.

9. Proteína recombinante reguladora de la cromatina humana EZH2 ó su dominio SET, que puede obtenerse mediante la expresión de una molécula de ADNc definida en la reivindicación 3 ó 4.

10. Proteína recombinante reguladora de la cromatina humana SUV39H ó su dominio SET, que puede obtenerse mediante la expresión de una molécula de ADNc definida en la reivindicación 5 ó 6.

11. Anticuerpo contra una proteína denominada EZH2, la cual tiene la secuencia representada en la figura 6.

12. Anticuerpo contra una proteína denominada SUV39H, la cual tiene la secuencia representada en la figura 7.

13. Molécula de ADNc según la reivindicación 4 ó 6, para el tratamiento y diagnóstico de enfermedades del ser humano las cuales se atribuyen a un descontrol de los genes reguladores de la cromatina que tienen un dominio SET.

14. Anticuerpo según la reivindicación 11 ó 12, para el tratamiento y diagnóstico de enfermedades del ser humano, las cuales se atribuyen a una descontrol de los genes reguladores de la cromatina que tienen un dominio SET.