WO2005054467A1 - 哺乳類βアクチンプロモーターを利用した発現系 - Google Patents

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WO2005054467A1
WO2005054467A1 PCT/JP2004/018006 JP2004018006W WO2005054467A1 WO 2005054467 A1 WO2005054467 A1 WO 2005054467A1 JP 2004018006 W JP2004018006 W JP 2004018006W WO 2005054467 A1 WO2005054467 A1 WO 2005054467A1
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mammalian
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Hiroyuki Tsunoda
Kiyoshi Habu
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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Definitions

  • the present invention relates to the development of stronger promoters and the vectors carrying them in the production of recombinant proteins.
  • Non-patent Document 1 Non-patent Documents 1 and 2.
  • CAG promoter combination of human CMV enhancer and the 13-actin promoter of chicken
  • CEF promoter human CMV enhancer and human EF1 ⁇ promoter
  • Patent Document 1 W092 / 19759
  • Non-patent document l Mol.Cell.Biol., Vol. 8 (1), p. 466-472, 1988
  • Non-Patent Document 2 Gene, Vol. 87 (2), p.291-294, 1990
  • Non-Patent Document 3 Gene, Vol.272, p.149-156, 2001
  • Non-Patent Document 4 nalytical Biochemistry, Vol.247, p.179-181, 1997
  • Non-Patent Document 5 Gene, Vol. 108, p. 193-200, 1991
  • an object of the present invention is to provide a promoter that is stronger than an existing animal cell expression promoter and a vector using the promoter.
  • Another object of the present invention is to develop a method for producing a desired protein and a method for expressing a desired DNA using the vector.
  • the present inventors have compared and examined the promoter activities of various combinations of promoters of various genes to solve the above problems.
  • the sequence information of ⁇ -actin was obtained, and the 5 ′ region of mouse 13-actin was amplified by PCR.
  • the amplified PCR product was cloned into pGEM-T-Easy vector and sequenced to confirm the nucleotide sequence. Thereafter, only the promoter region of mouse
  • the post-transcriptional regulatory region (WPRE) of the Woodchuck hepatitis virus genome sequence was amplified by PCR, the reaction product was cloned into a pGEM-T-Easy vector, and the nucleotide sequence was determined. Further, this pGEM-T / WPRE was digested with Xbal, and the obtained WPRE fragment was inserted into the Xbal site of pmAct-Luc-neo to prepare pmAct-WPRE-Luc-neo.
  • the expression vector pmAct-Luc-neo or the human CMV enhancer is incorporated by incorporating the CMV enhancer region into the MCS (multi cloning site: position 5 to position 53) of the pGL3-Basic vector.
  • the expression vector phCMV-mAct-Luc-neo was completed by incorporating the mouse 13 actin promoter (Fig. 1).
  • the human EF1a promoter was incorporated into the pGLN vector MCS together with the CMV enhancer from DHFR- ⁇ E-RVh-PM1-f (Reference W092 / 19759), resulting in pCEF-Luc- neo was prepared (Fig. 1).
  • Each of these vectors is introduced into CHO cells, and is then placed in a CO incubator for 2 days.
  • mice cH-ras Cloning of the mouse cH-ras gene, mouse active cH-ras and human active K-ras was performed and inserted into the pCXN vector, and the resulting clones were pCXN-H-Ras (mouse c-H-ras) and pCXN-ras, respectively.
  • A-H-Ras (mouse-activated cH-ras) and pCXN-A-K-Ras (human-activated K-ras) were used.
  • Two or three types of vectors were introduced into CHO cells at various ratios, and luciferase activity was measured.
  • the present inventors can provide a strong promoter combining CMV enhancer and mammalian j8 actin promoter, or a combination of the post-transcriptional regulatory region (WPRE) of the Woodchuck Hepatitis Virus genomic sequence and the mammalian ⁇ -actin promoter. I found that. Furthermore, they have found that the expression system retaining these promoters can further enhance the expression activity by co-expression of Ras, a cancer gene product that is one of the transactivators, and completed the present invention.
  • WPRE post-transcriptional regulatory region
  • the present invention more specifically relates to the following [1]-[37].
  • a DNA construct in which a mammalian ⁇ -actin promoter is operably linked to an enhancer is operably linked to an enhancer.
  • the mammalian ⁇ -actin promoter is a rodent ⁇ -actin promoter
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and the mammalian / 3 actin promoter comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, DNA construct.
  • [7] A vector comprising the DNA construct of any one of [1] to [6].
  • a method for producing a desired protein comprising culturing cells carrying the vector according to [12], and collecting the expressed protein from the cultured cells or medium.
  • [25] expressing the desired DNA in a host cell, comprising introducing the vector according to any of [8] to [12] into a host cell derived from the same animal order as the ⁇ -actin promoter on the vector.
  • (26) expressing the desired DNA in a host cell comprising introducing the vector according to any of (8) to (12) into a host cell derived from the same animal species as the ⁇ -actin promoter on the vector Method.
  • the vector according to [8] and a vector capable of expressing the DNA encoding the transactivator are transferred to a host cell derived from the same species as the ⁇ -actin promoter on the vector according to [8].
  • a method for expressing a desired DNA in a host cell comprising introducing the DNA.
  • a method for increasing the expression level of a desired DNA comprising incorporating a ⁇ -actin promoter derived from the same animal order as the host cell upstream of the desired DNA.
  • a method for increasing the expression level of a desired DNA comprising incorporating a ⁇ -actin promoter derived from the same animal species as the host cell upstream of the desired DNA.
  • FIG. 1 is a view showing a vector used in an experiment.
  • FIG. 2 is a diagram comparing the existing promoter, the CEF promoter, with the mouse 13 actin promoter.
  • FIG. 3 is a view showing the effects of WPRE and CMV enhancer on the mouse 13 actin promoter.
  • FIG. 4 is a view showing the effect of mouse Ras protein on mouse ⁇ -actin promoter.
  • the present invention provides a DNA construct in which a mammalian ⁇ -actin promoter is operably linked to an enzyme, and a vector comprising the DNA construct.
  • the DNA construct or vector of the present invention can be used for expression of desired DNA (for example, expression of DNA encoding a desired protein, expression of antisense DNA, expression of DNA encoding dsRNA, etc.).
  • “functionally linked” between a mammalian j8 actin promoter and an enhancer is defined as a mammalian 13 actin promoter and an enhancer having the promoter activity of the present invention so that the promoter activity is enhanced. And combine with each other. Therefore, even if the distance between the mammalian j8 actin promoter and the enhancer is large or if another gene is inserted between them, if the promoter activity of the mammalian j8 actin promoter increases, the above “Functionally coupled”. Enhancers can be located either upstream or downstream of the mammalian ⁇ -actin promoter.
  • a mammalian 13 actin promoter and a desired DNA are defined as It means that the mammalian j8-actin promoter is bound to the desired DNA such that the expression of the desired DNA is induced by the activity of the milk j8-actin promoter.
  • An arbitrary DNA sequence may be present between the DNA and the mammalian j8 actin promoter as long as the expression of the DNA can be induced. “Expression of DNA” in the present invention includes both transcription and translation. Further, a DNA encoding a desired protein may be used.
  • the enhancer is not limited as long as it results in an increase in the amount of messenger RNA (mRNA) generated by transcription.
  • the promoter is a nucleotide sequence having an effect of promoting the action of the promoter, and generally has a sequence of around 100bp. Encoders can promote transcription regardless of sequence orientation. Moreover, since the enhancer itself does not have a promoter activity, the enhancer can activate transcription at a distance of several thousand base pairs. In addition, Enhancers are present upstream, downstream, and within the gene to be transcribed, and can activate transcription.
  • the eno and nsa-1 of the present invention are not limited as long as they increase the amount of mRNA generated by transcription !, so they inhibit degradation of mRNA after transcription of mRNA,
  • the present invention also includes those that increase the amount of mRNA present in cells by increasing the stability and increase the translation efficiency of amino acids.
  • the enhancer used in the present invention may be of one type, two or more of the same enhancers may be used in plural, or different plural enhancers may be used in combination.
  • Enhancers used in the present invention include WPRE, CMV enhancer, and the R-U5 'segment present in the LTR of HTLV-1 (Mol. Cell. Biol, Vol. 8 (l), p. 466-472, 1988), an intron sequence between the second and third exons of SV40 enhancer, ephedra j8 globin (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 78 (3), p. 1527). -31, 1981), genomic region of human growth hormone 0 Immunol., Vol. 155 (3), p. 1286-95, 1995), and more preferably WPRE or CMV enhancer. .
  • WPRE is HBVPRE (human hepatitis B virus posttranscriptional reguratory) present in the Woodchuck hepatitis virus genomic sequence (GenBank Accession No. J04514). element), and it has been reported that 592 bases from the 1093th position to the 1684th position in the genome sequence are regulatory regions after transcription (Journal of Virology, Vol. 72, p. 5085-5092, 1998). . Subsequently, analysis using a retroviral vector showed that WPRE could produce a 5-8-fold higher protein production by inserting it into the untranslated region at the 3 'end of the target gene.
  • HBVPRE human hepatitis B virus posttranscriptional reguratory
  • WPRE suppresses the degradation of mRNA (Journal of Virology, Vol. 73, p. 2886-2892, 1999). Like WPRE, those that increase the translation efficiency of amino acids by stabilizing mRNA are considered to be broadly defined.
  • the WPRE used in the present invention is more preferable than the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
  • a CMV enhancer can also be used for the same purpose as WPRE.
  • the cytomegalovirus used in the present invention may be a cytomegalovirus that infects humans (human cytomegalovirus) or a cytomegalovirus that infects non-human animals.
  • cytomegalovirus that infects non-human animals for example, cytomegalovirus that infects rodents (eg, mouse cytomegalovirus) can be used.
  • a known sequence can be used for the CMV enhancer.
  • GenBank Accession No. X17403 human cytomegalovirus
  • L06816 (mouse cytomegalovirus) can be used. It is possible.
  • CMV enhancer is incorporated into many commercially available expression vectors (ex. PCMV-Script from Stratagene, pcDNA3.1 from Invitrogen) as part of the CMV promoter.
  • the CMV enhancer used in the present invention is more preferable than the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • a promoter is a specific base sequence on DNA that initiates transcription of DNA into type II, and generally has a common sequence.
  • prokaryotes such as E. coli usually have a TATAATG sequence at a ⁇ 10 base pair site and a TTGACA sequence at a ⁇ 35 base pair site of the transcription initiation site.
  • Eukaryotes usually have a TATA box at -20 base pairs.
  • a mammalian j8-actin promoter can be used as the ⁇ -actin promoter used in the present invention.
  • the mammalian j8 actin promoter can be any human-derived ⁇ -actin promoter, including the human j8 actin promoter, the rodent ⁇ -actin promoter.
  • a motor may be used, but preferably a rodent ⁇ -actin promoter may be used.
  • a rodent ⁇ -actin promoter for example, mouse j8 actin promoter (GenBank Accession No. NT-039317), rat j8 actin promoter (GenBank Accession No. NW_042778) and the like can be used.
  • the mammalian j8 actin promoter used in the present invention is more preferable than the DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 2.
  • rodents examples include animals belonging to rodents, squirrels, beavers, paramis, pares, rodents, marsupials, dendrobates, and the like.
  • Can include mice, rats, hamsters and the like.
  • Vector generally refers to a carrier DNA molecule for introducing a desired gene into a host and amplifying or expressing the desired gene, and preferably has a known restriction enzyme site.
  • auxotrophic and capable of replicating in the host usually contain a promoter, enhancer, terminator, SD sequence, translation start codon, and translation stop codon.
  • the vector can further carry a selection marker or the like that can select cells into which the vector has been introduced, if necessary.
  • a selection method a marker that can be selected based on an enzyme activity such as ampicillin, tetracycline, kanamycin, chloramphenicol, neomycin, dygromycin, puromycin, zeocin, or galactosidase, or Markers that can be selected using fluorescence emission such as GFP as an index are exemplified.
  • a selection marker that can select a surface antigen such as an EGF receptor or B7-2 as an index may be used.
  • the vector may contain a signal sequence for polypeptide secretion.
  • the pelB signal sequence J. BacterioL, Vol. 169 (9), p. 4379-4383, 1987
  • the pelB signal sequence may be used for production in E. coli periplasm.
  • the vector used in the present invention is not particularly limited, and any vector may be used.
  • vectors derived from mammals for example, pcDNA3 (Invitrogen), pEGF-BOS (Nucleic Acids.Res., 18 (17), p.5322, 1990), pEF, pCDM8, pCXN, vector derived from insect cysts (f) Invitrogen), P BacPAK8), plant-derived expression vectors (eg, ⁇ 1, pMH2), animal virus-derived vectors (eg, pHSV, pMV, pAdexLcw), retrovirus-derived vectors (eg, pZIPneo), yeast-derived (Eg, “Pichia Expression Kit” (Invitrogen), pNVll, SP-Q01), Bacillus subtilis-derived vectors (eg, pPL608, pKTH50), Escherichia coli vectors (M13-based vectors, pUC-based vectors, pBR322, pBluescript , PCR-Script), and the like.
  • mammals for example,
  • the host cell is a CHO cell
  • the CHO cell lacking the nucleic acid synthesis pathway is used for the purpose.
  • a vector having a complementary DHFR gene eg, pCHOI
  • MTX methotrexate
  • the vector of the present invention further includes a DNA encoding a transactivator!
  • Transactivator is a trans-acting factor that activates the transcription of a gene, and is also called a trans-activator.
  • Transactivators include those that have the ability to bind DNA and directly promote transcription through binding to cis elements, and those that do not have the ability to bind DNA and indirectly activate other factors to activate transcription. It is known that it promotes environmental protection.
  • the transactivator used in the present invention is not particularly limited, and any transactivator may be used. Specific examples of transactivators include adenovirus E1A, human immunodeficiency virus Tat, human T-cell leukemia virus Tax, oncogene products, etc.
  • Oncogenes are a general term for a group of genes that are endogenous to normal cells of animals and induce cancerous cells by activating mutations.
  • the oncogene of the virus is called a viral oncogene
  • the gene of normal cells from which it is derived is called a cellular oncogene.
  • the fef sequence X ⁇ includes src ⁇ yes ⁇ fgr ⁇ fins ⁇ erbB ⁇ aol, Kit ⁇ crk ⁇ mos ⁇ raf ⁇ sis ⁇ ras, myc, fos, and jun.
  • H-Ras Human activated H-Ras is human ⁇ -actin promoter Although it has been reported that the expression efficiency of an expression vector that incorporates a specific expression is enhanced (Cytotechnology, Vol. 16, p. 167-178, 1994), it is preferable to use Ras also in the present invention.
  • Ras includes K-ras, H-ras, N-ras, and c-ras, and if it contains the rho 1ZS childhood family and the rab gene family, it is called the ras superfamily.
  • H-ras can be suitably used.
  • Ras When Ras is used as a transactivator, Ras may be wild-type or active.
  • the H-ras used in the present invention is more preferable than the DNA of any of SEQ ID NO: 5 or 6, or the DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or 8.
  • the vector of the present invention may be designed to express a gene in a time-specific manner.
  • Examples of a method for expressing a gene in a time-specific manner include a method using site-specific recombination such as the Cre-loxP system.
  • Cre is a recombinase derived from E. coli Batateeriophage P1 that mediates site-specific recombination between two ⁇ sequences.
  • the LoxP sequence is an 8 bp spacer region flanked by two 13 bp inverted repeats that serve as recognition sequences for Cre binding. If the ⁇ sequence is introduced into the vector so that the expression of the desired gene is suppressed, it is possible to express the desired gene at any time by administering Cre to remove the ⁇ sequence. is there.
  • the insertion site for the ⁇ sequence may be any site that suppresses the expression of the desired gene, such as between the promoter and the desired gene.
  • Cre itself may be administered, or a gene encoding Cre may be administered.
  • the desired gene can be expressed by, for example, infecting a Cre-expressing adenovirus (Nucleic. Acids. Vol.23 (19), p.3816-3821, 1995).
  • Other site-specific recombination using such enzymes include Flp-FRT, Zygosaccharomyces rouxii pSRl, resolvase-rfsF, phage Mu Gin and the like.
  • the present invention also provides a host cell into which the vector of the present invention has been introduced.
  • the host cell of the present invention can be used, for example, as a production system for producing or expressing a desired protein.
  • the host cell into which the vector of the present invention is introduced is not particularly limited, and may be any cell type such as established cell lines, primary passage cells, animal individuals, and fertilized eggs.
  • various animal cells for example, mammalian cells
  • eukaryotic cells for example, animal cells, plant cells, and fungal cells can be used as hosts.
  • Animal cells include mammalian cells such as human, mouse, mouse, and muster (eg, CHO, COS, 3T3, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero), amphibian cells (eg, African oocyte (Nature, Vol.291, p.358-360, 1981)) or insect cells (eg, S19, S121, Tn5) and the like.
  • mammalian cells such as human, mouse, mouse, and muster
  • amphibian cells eg, African oocyte (Nature, Vol.291, p.358-360, 1981)
  • insect cells eg, S19, S121, Tn5
  • CHO cells DHfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 77, p. 4216-4220, 1980) and CHO K-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 60, p. 1275, 1968) can be suitably used
  • Nicotiana tabacum As plant cells, for example, cells derived from Nicotiana tabacum (Nicotiana tabacum) are known as a polypeptide production system, which may be callus cultured. Is a fungal cell, a yeast, e.g., Saccharomyces (Saccharomyces) genus, for example, Saccharomyces 'selenides Pine (Saccharomyces cerevisiae), filamentous fungi, Column if, Fusupe Honoré 3 r Noresu (Aspergillus Bruno genus, for example, Asuperugirusu' two When prokaryotic cells are used, there is a production system using bacterial cells, such as Escherichia coli (E.
  • Saccharomyces Saccharomyces genus
  • Saccharomyces 'selenides Pine Saccharomyces cerevisiae
  • filamentous fungi Column if, Fusupe Honoré 3 r Noresu
  • Preferred host cells in the present invention include animal cells, more preferably mammalian cells, particularly preferably rodent cells (eg, CHO cells).
  • a cell in which an oncogene is activated can be used as the host cell of the present invention.
  • the cells in which the oncogene is active include cells in which the oncogene is expressed in a higher amount than normal cells, or cells in which the mutated oncogene is expressed, and the like.
  • Cells in which the oncogene is activated are non-human cells in which the oncogene is activated.
  • Cells in which an oncogene is artificially activated may be used.
  • Specific examples of cells in which an oncogene is artificially activated include cells into which a vector containing an oncogene (wild type or active type) has been introduced, and cells in which an oncogene has been artificially mutated. And so on.
  • Specific examples of non-artificially activated oncogenes include cancerous cells
  • a person skilled in the art can appropriately select a method for introducing the vector of the present invention into the above-mentioned cells depending on the type of the cells.
  • the calcium phosphate method (Virology, Vol. 52, p. 456, 1973), the DEAE dextran method, and the cationic ribosome DOTAP (Roche's Diagnostics) are used.
  • Elect-Mouth Pollution Method (Nucleic Acids Res., Vol.15, p.1311, 1987), Lipofection Method 0. Clin. Biochem. Nutr., Vol.7, p.175, 1989) (Sci. Am., P. 34, 1994)
  • force such as particle gun can also be selected, and for introduction into plant cells, the eletatroporation method (Nature, Vol. 319, p. 791, 1986), Polyethylene glycol method
  • a kit such as LipofectAMINE (Invitrogen) may be used.
  • the host cell of the present invention may further contain, in addition to the vector of the present invention, a vector having a DNA encoding a transactivator.
  • the present invention further relates to a method for producing a desired protein using the vector of the present invention and a method for expressing a desired DNA.
  • Production systems for protein production include in vitro and in vivo production systems.
  • the in vitro production system include a production system using eukaryotic cells and a production system using prokaryotic cells.
  • a desired protein can be obtained by culturing the above-mentioned host cell in vitro. The culturing can be performed according to a known method.
  • DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM, F10 medium, F12 medium and the like can be used.
  • a serum replacement solution such as fetal calf serum (FCS) may be used in combination, or serum-free culture may be performed.
  • FCS fetal calf serum
  • the transactivator may be added to the medium.
  • the pH during the culture is preferably about 6-8.
  • Culture is usually performed at about 30-40 ° C for about 15-200 hours, and the medium is replaced, aerated, and agitated as necessary. Since culture conditions vary depending on the type of cells used, those skilled in the art can appropriately determine suitable conditions. For example, for CHO cells, gas phase CO
  • the cells may be cultured in an atmosphere having a concentration of 0 to 40%, preferably 2 to 10%, at 30 to 39 ° C, preferably about 37 ° C, for 114 days.
  • various culture devices for culturing animal cells include a fermenter tank culture device, an air lift culture device, a culture flask culture device, a spinner flask culture device, a microcarrier culture device, and a fluidized bed culture device.
  • the culture can be performed using a device, a hollow fiber type culture device, a roller bottle type culture device, a filling tank type culture device, or the like.
  • examples of a system for producing a protein in vivo include a production system using animals and a production system using plants.
  • the desired DNA is introduced into these animals or plants, and the polypeptide is produced in the animals or plants and collected.
  • the “host” in the present invention includes these animals and plants.
  • animals there are production systems using mammals and insects. Goats, pigs, sheep, mice, and pests can be used as mammals (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993).
  • a transgenic animal can be used.
  • DNA encoding the desired protein is prepared as a fusion gene with a gene encoding a polypeptide that is specifically produced in milk, such as goat j8 casein.
  • the desired protein can be obtained from the milk produced by the born transgenenic goat or its progeny. Hormones may also be used in transgeneic goats as appropriate to increase the amount of milk containing the polypeptide that is produced by transgeneic mosquitoes (Bio / Technology, Vol. 12, p. 699-702). , 1994).
  • silkworms can be used as insects, for example. When a silkworm is used, the body fluid of the silkworm can be obtained by infecting the silkworm with a baculovirus into which DNA encoding a desired protein has been inserted. Thus, a desired protein can be obtained (Nature, Vol. 315, p. 592-594, 1985).
  • tobacco when using a plant, for example, tobacco can be used.
  • a DNA encoding the desired protein is inserted into a plant expression vector, for example, pMON530, and this vector is introduced into a bacterium such as Agrobacterium tumefaciens.
  • This bacterium is infected to tobacco, for example, Nicotiana tabacum, and the desired protein can be obtained from the leaves of this tobacco (Eur. J. Immunol, Vol. 24, p. 131-138, 1994). ).
  • the expression of the gene may be transient expression!
  • the vector can be transformed with a vector (such as pcD) having an SV40 origin of replication. Conversion method.
  • the replication origin those derived from poliovirus, adenovirus, dys-pipilloma virus (BPV) and the like can also be used.
  • the expression vector is used as a selectable marker such as aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, Escherichia coli xanthinguanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, It can contain the folate reductase (dhfr) gene and the like.
  • APH aminoglycoside transferase
  • TK thymidine kinase
  • dhfr folate reductase
  • the desired gene is inserted into a vector, for example, retrovirus method, ribosome method, catonic ribosome method, adenovirus method, etc.
  • adenovirus vectors eg, pAdexlcw
  • retrovirus vectors eg, pZIPneo
  • General genetic manipulation such as insertion of a desired gene into a vector can be performed according to a conventional method
  • Administration into a living body may be an ex vivo method or an in vivo method.
  • the desired protein obtained by the present invention can also be purified as a substantially pure and homogeneous protein by isolating the intracellular or extracellular (eg, medium) power of the host cell.
  • the separation and purification of the protein is not particularly limited as long as the separation and purification methods used in ordinary protein purification are used. For example, chromatography column, fill Filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. It can be separated and purified.
  • chromatography examples include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, and adsorption chromatography (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laooratory and our Manual). Ea Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). These chromatographies can be performed using liquid-phase chromatography, for example, liquid-phase chromatography such as HPLC and FPLC.
  • the protein can be arbitrarily modified or partially removed by reacting the protein with an appropriate protein modifying enzyme before or after purification.
  • the protein modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, lysyl endopeptidase, protein kinase, dalcosidase and the like are used.
  • the vector, DNA construct or host cell of the present invention can be used for producing a desired protein.
  • the desired protein includes protein fragments and peptides that can be any protein.
  • desired proteins include antibodies, erythropoietin, colony stimulating factors (granulocytes, macrophages, granulocyte macrophages), interleukin 131, interferon, RANTES, lymphotoxin 13, Fas ligand, fit 3 ligand NF- ⁇ - receptor activator ligand (RANK L), TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL), CD40 ligand, OX40 ligand, 4-1BB ligand (and other members of the TNF family), derived from thymic stroma Cytokines, growth factors, etc., including lymphopoietin, mast cell growth factor, stem cell growth factor, epidermal growth factor, growth hormone, tumor necrosis factor, leukemia inhibitory factor, hema
  • the vector or DNA construct of the present invention can also be used for producing transgenic animals.
  • Transgenic animals can be prepared by known methods, for example, as follows. First, a gene to be expressed in a transgenic animal is inserted into the DNA construct of the present invention or the vector of the present invention.
  • the vector, The DNA constructs, or expression cassettes excised therefrom, are introduced into totipotent cells. Fertilized eggs, early embryos, embryonic stem cells (ES cells) and the like can be used as totipotent cells. Introduction into a totipotent cell can be performed by a commonly used method such as an electrostatic pulse method, a ribosome method, a calcium phosphate method, a micromouth injection method, or retrovirus infection.
  • the totipotent cells treated as described above are transplanted into the oviduct of a foster parent, and offspring are born, and an individual having the target gene is selected from the offspring. Whether an individual has the target gene or not can be determined by Southern blotting using primers specific to the target gene or confirmation by PCR.
  • the transgenic animal is not particularly limited as long as it is a non-human animal other than a human. Mammals, birds such as birds, fish, insects, nematodes and the like. From the viewpoint of operation and the like, rodents are preferred, and mice are particularly preferred.
  • the vector or DNA construct of the present invention can also be used for the antisense method, RNAi, and the like.
  • the antisense method when an oligonucleotide having a sequence complementary to a target gene is present in a cell, the antisense (antisense DNA, antisense RNA, etc.) is replaced with the target gene (target mRNA, target DNA, etc.). By inhibiting the transcription of the target gene, the expression of the target gene is suppressed. Therefore, by inserting the antisense oligonucleotide into the DNA construct of the present invention or the vector of the present invention and transforming the cell with the DNA construct or the vector, the expression of the target DNA in the cell is inhibited. Becomes possible.
  • RNAi refers to a phenomenon in which, when double-stranded RNA (dsRNA) is introduced into a cell, an intracellular mRNA corresponding to the RNA sequence is specifically degraded and is not expressed as a protein.
  • dsRNA double-stranded RNA
  • double-stranded RNA is usually used, but double-stranded RNA formed in self-complementary single-stranded RNA can also be used.
  • the double-stranded region may be formed by forming a double-stranded region in all regions, or a partial region (for example, both ends or one end) may be a single-stranded region or the like. It may be.
  • RNAi As the oligo RNA used for RNAi, 10-lOObp RNA is often used, and usually 19-123bp RNA is used. Therefore, By inserting a gene designed to form double-stranded RNA in a cell into a DNA construct or a vector of the present invention and transforming a cell with the DNA construct or the vector, a cell is obtained. It is possible to inhibit the expression of the target gene in the cell.
  • RNAi method is described in Nature, Vol.391, p.806, 1998, Proc.Natl.Acsd.Sci.USA, Vol.95, p.15502, 1998, Nature, Vol.395, p.854, 1998, Proc.
  • the vector or DNA construct of the present invention can be used for gene therapy.
  • Gene therapy is a method of treating diseases by introducing a normal gene into a patient's cells from the outside and correcting the phenotype of the cells, with the aim of correcting the mutated gene.
  • Gene therapy is considered to be effective not only for the treatment of genetic diseases but also for other diseases such as AIDS and cancer.
  • Gene therapy involves directly introducing a gene into a living body and incorporating the gene into cells (in vivo method), or collecting the patient's cells, introducing the gene into cells outside the body, and then transplanting the cells back into the patient. (Ex vivo method).
  • the gene can be administered by any method such as microinjection, calcium phosphate method, electoral poration method, particle gun, and method using a virus vector such as retrovirus.
  • a virus vector such as retrovirus.
  • viral vectors are widely used for gene therapy. Examples of viruses used as viral vectors include adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia inoles, retrovirus, poliovirus, papilloma virus, lentivirus, and the like.
  • a method for directly introducing a gene has been established, such as introduction using a particle gun.
  • the administration route is not limited, and it can be administered by any route, such as intravenous, muscle, subcutaneous, intradermal, mucosal, and direct administration to organs such as the heart and liver. Good.
  • a gene to be introduced into a patient's cell is inserted into the DNA construct of the present invention or the vector of the present invention, and the DNA construct or the vector is subjected to an in vivo method or Gene therapy can be achieved by introducing into a patient's cells by an ex vivo method.
  • the vector or DNA construct of the present invention can be used for expression of a DNA vaccine.
  • DNA vaccines include two methods: expressing antigen DNA in the body and inducing an immune response to the antigen; and inoculating a repeat sequence of CpG as an immunopotentiator. When a DNA vaccine is vaccinated, antigen proteins are synthesized in the body and induce an immune response similar to that of natural infections such as viruses.
  • Vectors for DNA vaccine expression, administration methods, administration routes, and the like can be performed in the same manner as in gene therapy.
  • the vector or DNA construct of the present invention can be used as an immunogen for producing an antibody (J. Virol, Vol. 70 (9), p. 6119-25, 1996).
  • the DNA construct or vector of the present invention so as to express the protein or peptide serving as an immunogen, and administering the vector or DNA construct to the immunized animal, the protein serving as the immunogen in the body of the immunized animal is obtained.
  • a peptide is expressed, and an antibody against the protein or peptide is produced.
  • an antibody can be prepared by the following method.
  • a gene encoding a protein or peptide serving as an immunogen is inserted into the DNA construct or vector of the present invention.
  • the DNA construct or vector is administered to an immunized animal (non-human animal).
  • the administration can be carried out by any method other than the method of administering the vector as it is, for example, by an electoral poration method, a method using a virus vector such as a particle gun, a retrovirus, or the like. It may also be administered together with other substances, such as chemicals (such as bupiva power-in).
  • the administration route may be any route including intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, mucosal, and direct administration to organs such as the heart and liver.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is generally selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion.
  • Dental animals for example, mice, rats, wild, muster, or egrets, monkeys, etc. are used. In this way, the mammal is immunized, and the desired antibody level in the serum is increased.
  • mammalian immune cells are collected and subjected to cell fusion.
  • the immune cells include spleen cells.
  • Mammalian myeloma cells are used as the other parent cells to be fused with the immune cells.
  • This myeloma cell can be obtained from various known cell lines, for example, P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immnol., Vol.123, p.1548-1550, 1979), P3x63Ag8U.l (Current Topics in
  • the cell fusion between the immune cells and myeloma cells is basically performed according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein et al. (Methods EnzymoL, Vol. 73, p. 3-46, 1981). Can be. More specifically, the cell fusion is performed in a usual nutrient culture solution, for example, in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) or the like is used, and if necessary, an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added to enhance the fusion efficiency.
  • the use ratio of the immune cells and the myeloma cells can be arbitrarily set. For example, it is preferable that the number of immune cells be 1 to 10 times that of myeloma cells.
  • the culture solution used for the cell fusion for example, RPMI1640 culture solution, MEM culture solution, and other ordinary culture solutions used for this type of cell culture suitable for the growth of the myeloma cell line can be used.
  • a serum replacement solution such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture solution, and a PEG solution (for example, having an average molecular weight of about 1000 to 6000) preheated to about 37 ° C. is usually used for 30 to 60%. (w / v), and form the desired fused cells (hybridoma) by mixing. Subsequently, by successively adding an appropriate culture medium and centrifuging to remove the supernatant, a cell fusion agent or the like unfavorable for the growth of the hybridoma is removed.
  • a PEG solution for example, having an average molecular weight of about 1000 to 6000 preheated to about 37 ° C.
  • hybridomas are selected by culturing them in a normal selective culture medium, for example, a HAT culture medium (a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Selected. The culturing in the HAT culture solution is continued for a time (usually several days to several weeks) sufficient for the death of cells (non-fused cells) other than the target hybridoma. Then, a conventional limiting dilution method is performed, and screening and single cloning of hybridomas producing the desired antibody are performed.
  • a normal selective culture medium for example, a HAT culture medium (a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Selected. The culturing in the HAT culture solution is continued for a time (usually several days to several weeks) sufficient for the death of cells (non-fused cells) other than the target hybridoma. Then, a conventional limiting dilution method is performed, and screening and single cloning of hybrid
  • human lymphocytes are sensitized in vitro, and the sensitized lymphocytes are fused with human-derived myeloma cells capable of permanent division.
  • a desired human antibody having binding activity can be obtained (see Japanese Patent Publication No. 1-59878).
  • an antigen may be administered to a transgenic animal having the entire repertoire of human antibody genes to obtain antibody-producing cells, and human antibodies to the antigen may be obtained from the immortalized cells ( International Patent Application Publication Nos. WO 94/25585, WO 93/12227, WO 92/03918, and WO 94/02602).
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody thus produced can be subcultured in a usual culture solution, and can be stored for a long time in liquid nitrogen.
  • the hybridoma is cultured according to a conventional method and obtained as a culture supernatant, or the hybridoma is administered to a mammal compatible with the hybridoma and expanded. Then, a method of obtaining ascites is used.
  • the former method is suitable for obtaining high-purity antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • a recombinant type antibody antibody gene is also cloned with the ability of a hybridoma, inserted into an appropriate vector, introduced into a host, and produced using a gene recombination technique. (See, for example, Eur. J. Biochem., Vol. 192, p. 767-775, 1990).
  • mRNA encoding the variable (V) region of the antibody is isolated from the hybridoma producing the antibody.
  • the mRNA can be isolated by known methods, for example, guanidine ultracentrifugation (Biochemistry, Vol. 18, p. 5294-5299, 1979), AGPC method (Anal. Biochem., Vol. 162, p. 156-). 159, 1987) to prepare total RNA, and then use the mRNA Purification Kit (manufactured by Pharmacia) to prepare the desired mRNA.
  • mRNA can be directly prepared by using QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia). Got Synthesize antibody V region cDNA from mRNA using reverse transcriptase.
  • cDNA is synthesized using AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (manufactured by Seikagaku Corporation) or the like.
  • AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit manufactured by Seikagaku Corporation
  • 5'-RACE method using 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) and PCR (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 85, p. 8998-9002, 1988, Nucleic Acids Res., Vol. 17, p. 2919-2932, 1989) and the like can be used.
  • a target DNA fragment is purified from the obtained PCR product and ligated to a vector DNA.
  • a recombinant vector is prepared therefrom, introduced into Escherichia coli or the like, and a colony is selected to prepare a desired recombinant vector. Then, the base sequence of the target DNA is confirmed by a known method, for example, a dideoxynucleotide chain termination method or the like. After obtaining the DNA encoding the V region of the desired antibody, this is incorporated into an expression vector containing the DNA encoding the desired antibody constant region (C region).
  • an antibody gene is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region, for example, an enhancer or a promoter.
  • host cells are transformed with the expression vector to express the antibody.
  • Antibody gene expression can be achieved by co-transforming host cells by separately incorporating DNAs encoding the antibody heavy chain (H chain) or light chain (L chain) into an expression vector; The host cell may be transformed by incorporating the DNA encoding the L chain into a single expression vector (see WO 94/11523).
  • the DNA construct or vector of the present invention is applied to production of a desired protein and the like, antisense method, RNAi method, gene therapy, DNA vaccine, transgenic animal, production of antibody, and the like. It is possible.
  • the present invention relates to a method for expressing a desired DNA in a host cell, comprising introducing the vector of the present invention into a host cell derived from the same animal order as the ⁇ -actin promoter on the vector.
  • mammals refers to the basic class or the taxon in the class below the class or the family class group in the Linnaean hierarchical classification of biological classification.
  • Specific animal eyes include, for example, rodents, hares, rodents, rodents, etc., with rodents being preferred.
  • rodents In rodents, nose, muster, rat, mouse, mole Mott, squirrel, beaver, etc. are included.
  • the present invention also relates to a method for expressing a desired DNA in a host cell, comprising introducing the vector of the present invention into a host cell derived from the same animal species as the ⁇ -actin promoter on the vector.
  • the human ⁇ -actin promoter is used when the host cell is a human cell
  • the mouse j8 actin promoter is used when the host cell is a mouse cell
  • the host cell is a hamster cell.
  • it means using the hamster j8 actin promoter.
  • the expression level of a desired gene can be increased by using a ⁇ -actin promoter derived from the same species as the host cell.
  • the present invention relates to a method for increasing the expression level of a desired gene, which comprises using a ⁇ -actin promoter derived from the same animal order as a host cell.
  • Animalia is as defined above.
  • the expression level of the desired gene can be increased.
  • the present invention also relates to a method for increasing the expression level of a desired gene, which comprises using a ⁇ -actin promoter derived from the same animal species as the host cell. “Derived from the same animal species” is as defined above. By using the j8 actin promoter derived from the same animal species as the host cell, it becomes possible to increase the expression level of the desired gene.
  • a transactivator may be used for the purpose of increasing the expression level of a desired DNA.
  • the transactivator may be constructed by introducing a vector containing the DNA encoding the transactivator into a host cell so that the transactivator is expressed during culture, and May be added to the medium.
  • the DNA encoding the transactivator may be incorporated on the same vector as the DNA encoding the desired protein, or may be incorporated into a different vector and both vectors introduced into the cell.
  • mice ⁇ -actin The sequence information of mouse ⁇ -actin was obtained from mouse genome information published at http: ⁇ www.jax.org /).
  • Primers mAct5-Fl (5'-GGGGAGTGACTCTCTGTCCATTCAATCC-3'Z SEQ ID NO: 9) and mAcr5-R1 (5'-TTGTCGACGACCAGCGCAGCGATATCG-3 '/ SEQ ID NO: 10) having the following sequences were synthesized (ESP Oligo),
  • the promoter region of mouse 13 actin (1,577 bp) was amplified by PCR.
  • Reagents include Takara Bio's TaKaRa LA Taq with GC Buffer (cat.
  • PCR reaction solution was type II DNA (100 ng / ml) l .O ⁇ U 2 X GC buffer I 25.0 ⁇ l, dNTP Mixture 8.0 ⁇ 1, mAct5—Fl (10 ⁇ M) 2.0 ⁇ 1, mAcr5—Rl (10 ⁇ ) 2.0 1, HO 11.5 / z 1, LA Taq (5U / ⁇ 1) 0.5 ⁇ 1.
  • PCR conditions are 95 ° C
  • the T starting at the 305th force was a sequence of 13 consecutive force-crossing regions, and was 14 consecutive Ts according to the sequence described. Although the sequence differs from the database, we decided to use it as it was in the experiment.
  • CAAT starting at the 414th position and TATAA starting at the 475th position shown in italics are sequences that are frequently found in the promoter region of the house keeping gene, and the obtained region is the promoter region of mouse ⁇ -actin. was inferred.
  • the cloned region contains the initiation codon of mouse beta-actin (ATG that also starts at position 1543 in the above sequence), and primers mAct5-BG (5'-AGATCTGGGAGTGACTCTCTGTCCAT-3 for the subsequent vector construction) '/ SEQ ID NO: 11, including Bgl II site) and mAct5-HN (5, -AAGCTTGGCGAACTATCAAGACACAA-3'Z SEQ ID NO: 12, including Hind II site) (Espec Oligo) and re-PCR
  • Bgl11 (5'-end) and Hind111 (3'-end) sites were added to the necessary regions (1-1542Z SEQ ID NO: 2).
  • composition of the PCR reaction solution was as follows: type I DNA (about 10 ng / ml) 1.0 1, 2X GC buffer I 25.0 ⁇ l, dNTP Mixture 8.0 ⁇ 1, mAct5-HN (10 M) 11, mAct5-BG (10 M) 1.0 1, HO
  • PCR conditions are 95 ° C for 30 seconds, 30 cycles at 95 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 60 seconds for 30 cycles and 72 ° C for 7 minutes. It is.
  • Gene Amp PCR System 2400 (Applied Biosystems) was used for PCR.
  • the amplified PCR product was cloned into the pGEM-T-Easy vector as described above, and the sequence was confirmed.
  • the thus prepared mouse ⁇ -actin fragment was incorporated into the Bgl II-Hind III site of pGL3-Basic (Promega, cat. E1751).
  • pGL3-Basic converts the NotI site at position 4650 in the vector into a BamHI site, and replaces the vector backbone with the BamHI site at position 2004 with the vector backbone of the pCXN vector (BamHI-BamHI).
  • BamHI-BamHI the vector backbone of the pCXN vector
  • the post-transcriptional regulatory region was amplified by the Assemble PCR method using the 592th base at the 1093th position and the 592th base at the 1684th position in the Woodchuck hepatitis virus genomic sequence (GenBank Accession No. J04514) as follows. Takara Bio's TaKaRa Ex Taq (cat.
  • PCR was performed under the following two conditions.
  • the composition of the reaction solution synthetic DNA (WP-1—WP-6, each lOuM, each luL) 6.0 1, 10x Ex Taq buffer 5.0 ⁇ 1, dNTP Mixture 8.0 1, HO 28.5 ⁇ 1, Ex Taq (5U / ⁇ 1) 0.5 jul, anti Reaction conditions: The PCR reaction was performed at 94 ° C for 5 minutes and 2 cycles of “94 ° C for 2 minutes, 55 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 2 minutes”. In addition, add primers WP-f (lOuM) 1.0 ⁇ l and WP-r2 (lOuM) 1.0 ⁇ l, and add a total of 50,01. Reaction conditions: “30 seconds at 94 ° C, 30% at 55 ° C The reaction was carried out for 30 cycles at “second, 1 minute at 72 ° C.” and 5 minutes at 72 ° C.
  • composition of the reaction solution synthetic DNA (WP-5—WP-17, each lOuM, each luL) 13.0 1, 10 1 Ex Taq buffer 5.0 ⁇ 1, dNTP Mixture 8.0 1, HO 21.5 ⁇ 1, Ex Taq (5U / ⁇ 1) 0.5 ⁇ 1,
  • a PCR reaction was performed in two cycles of 94 ° C for 5 minutes and “2 minutes at 94 ° C, 2 minutes at 55 ° C, and 2 minutes at 72 ° C”. Further, primers WP-12 (lOuM) 1.01, WP-r (lOuM) l.OuL were added to make a total amount of 50,01, and the reaction conditions were: "94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, PCR reaction was carried out for 30 cycles at 72 ° C for 1 minute and at 72 ° C for 5 minutes.
  • Gene Amp PCR System 2400 (Applied Biosystems) was used for PCR. After the amplified PCR product was electrophoresed on a 1% agarose gel, a band of about 200 bp was cut out in reaction 1 and a band of about 400 bp was cut out in reaction 2, and purified with a QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, cat.28704).
  • reaction 1 product 1.0
  • Reaction 2 product 1.0 ⁇ 1
  • 10x Ex Taq buffer 5.0 ⁇ 1
  • dNTP Mixture 8.0 ⁇ 1, WP-f (lOuM) 1.0 ⁇ 1, WP-r (lOuM) 1.0 / z1, HO 32.5 ⁇ 1
  • Ex Taq 5 U / ⁇ 1) 0.5 ⁇ 1, reaction conditions: 94 ° C for 30 seconds, “94.C
  • the amplified PCR product was electrophoresed on a 1% agarose gel, and then a band of about 600 bp was cut out and purified using a QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, cat.28704).
  • the reaction product was cloned into pGEM-T-Easy vector (Promega, cat.A1360) and the nucleotide sequence was determined. The sequence was confirmed to be the same as the sequence from the 1093th position to the 1684th position of GenBank Accession No. J04514.
  • pGEM-T / WPRE was digested with Xbal, and the obtained WPRE fragment was inserted into the Xbal site of pmAct-Luc-neo to prepare pmAct-WPRE-Luc-neo.
  • SEQ ID NO: 3 The WPRE sequence cleaved to 3 and the synthetic DNA used were combined with the synthetic DNA ( SEQ ID NOs: 13 to 33) are shown below.
  • WP-2 GCGTATCCACATAGCGTAAAAGGAG
  • WP-9 SEQ ID NO: 21
  • WP-10 SEQ ID NO: 21
  • WP-f TCTAGAAATCAACCTCTGGATTACAAAATT
  • WP-r TCTAGAAGGCGGGGAGGCGGCCCAAA
  • WP-12 ATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAG
  • WP-r2 GTGCACACCACGCCACGTTGCC (SEQ ID NO: 33)
  • the CMV enhancer region (SEQ ID NO: 4) was cloned into the EcoRI site of the pmAct-Luc-neo vector to complete phCMV-mAct-Luc-neo (FIG. 1).
  • PCEF-Luc-neo was prepared by incorporating the human EF1a promoter into the pGLN vector MCS together with the CMV enhancer from DHFR- ⁇ E-RVh-PM1-f (ref. W092 / 19759) (FIG. 1). All vectors used in the experiments were purified using Qiagen's EndoFree Plasmid Maxi Kit (cat.12362).
  • the vector was introduced into CHO cells. Thereafter, the culture supernatant was gently removed, and the medium for CHO was dried.
  • the medium for CHO is CHO-S-SFMII medium (Invitrogen, Cat. No. 12052-098) in 1/100 amount of HT Supplement (100X), liquid (Invitrogen, Cat. No. 11067-030). And 1/100 amount of Penicillin-Streptomycin (Invitrogen, Cat. No. 15140-122) was used. In this state, the cells were cultured in a CO incubator at 37 ° C for 2 days.
  • Luciferase activity was measured using a Luciferase Assay System (Promega, Cat. No. E1501). The medium was removed, and 100 ⁇ l of a 5 ⁇ diluted 5 ⁇ passive lysis buffer attached to the kit was added per 1 ⁇ l, and the cells were lysed by shaking. The cell The lysate was transferred to Assay Plate Tissue Culture Treated White with Clear Bottom (Koningu, Cat No. 437842) in 10 1 portions. The measurement was performed using MicroLuMAT (Berthold), and the data was imported using the soft Window-Control Program LB96PV ver.1.24.
  • TCCTGGATTGGCAGCCGCTGTAGAAGC-3 '/ SEQ ID NO: 34) and mRas-R1 (5'-GTTCATCTGGCTAGCTGAGGTCACTGC-3'Z SEQ ID NO: 35) were synthesized (ESP Oligo Inc.), and the mouse c-H-ras gene was amplified by PCR.
  • PCR was carried out using TaKaRa LA Taq with GC Buffer (Takara Bio Inc.) as reagent and Embryo Marathon-Ready DNA dayl5 (cat. 7459-1) from Clontech for Type I cDNA.
  • composition of the PCR reaction solution was type II DNA 1.01, 2X GC buffer I 25.0 ⁇ l, dNTP Mixture 8.0 ⁇ 1, mRas-Fl (10 ⁇ M) 2.0 ⁇ 1, mRas-Rl (10 M) 2.0 1, HO 11.5 1, LA Taq (
  • the PCR conditions are: 95 ° C for 60 seconds, 35 cycles of ⁇ 95 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 60 seconds '', and termination at 72 ° C for 7 minutes. It is.
  • Gene Amp PCR System 2400 (Applied Biosystems) was used for PCR. The amplified PCR product was electrophoresed on a 1% agarose gel, and then a 660 bp band was cut out and purified with Mag Extractor (Toyobo). This was cloned into pGEM-T-Easy vector (Promega) and sequenced to confirm the nucleotide sequence.
  • the confirmed cDNA sequence of mouse c-H-ras is shown in SEQ ID NO: 5.
  • the force-cloned c-H-ras which was the 62nd base force, was G.
  • a search of NCBI's mouse genome database revealed that the sequence of this part was G, so we decided to use it in the experiment.
  • primers RAS-ATG (5'-GCCACCATGACAGAATACAAGCTT-3'Z SEQ ID NO: 36) and RAS-R2 (5'-TCCAGGACAGCACACATTTGC-3'Z SEQ ID NO: :
  • the sequence upstream of the initiation codon is converted to a sequence according to Kozak rule (Nicleic Acids Research, Vol.15 (20), p.8125-8148, 1987) by PCR using Removed coded 3'UTR.
  • PCR was performed using TaKaRa LA Taq (cat.RR002A) from Takara Bio Inc., and mouse cH-ras previously cloned into the pGEM-T-Easy vector was used for type III for PCR under the following conditions. Was done.
  • composition of the PCR reaction solution was type I DNA 1.01, 10X LA PCR buffer II (Mg2 + free) 5.0 ⁇ 1, dNTP Mixture 5.0 ⁇ 1, MgCl (25mM) 5.0 ⁇ 1, RAS-ATG ( 10 ⁇ M) 2.0 ⁇ 1, RAS-R2 (
  • PCR reactions were performed at 12 ° C for 30 seconds and 12 cycles of “95 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 1 minute, 68 ° C for 7 minutes and 20 seconds”.
  • Gene Amp PCR System 2400 was used for PCR.
  • the amplified PCR product was treated with DpnI according to the kit manual and then transformed into E. coli. Then, the plasmid was recovered from the obtained Escherichia coli and sequenced to confirm that the mutation was introduced.
  • the amino acid sequence of mouse activated H-Ras is shown in SEQ ID NO: 7.
  • 2 g of the vector to be introduced into CHO cells was prepared by mixing two or three types of vectors at various ratios as shown below (Table 1). The cells were introduced into CHO cells in the same manner as in Example 2, and the luciferase activity was measured.
  • pmAct-Luc-neo was pCXN-H-Ras (mouse c-H-ras), pCXN-A-H-Ras (mouse-activated cH-ras), and pCXN-A-K- Promoter activity was found to be enhanced by the presence of Ras (human activated c-K-ras) (Fig. 4). From the above, it can be seen that the mouse j8 actin promoter of the present invention is imparted with stronger activity by Ras (regardless of active type, wild type, H-Ras, K-Ras) of the oncogene product. Indicated.
  • EF1 ⁇ promoter W092 / 19759
  • CMV promoter have been used as vectors for producing proteins in animal cells.
  • the market for biopharmaceuticals in pharmaceuticals has increased, and in particular, many antibody pharmaceuticals have been improved.
  • Antibody drugs are required to be administered in larger doses compared to conventional biologics that use cytopotin, such as erythropoietin, G-CSF, and interferon. Therefore, for stable supply of inexpensive antibody drugs, it is essential to express proteins in large amounts in animal cells.
  • the method of the present invention has made it possible to produce proteins in larger amounts as compared with conventional techniques, and is therefore considered to be useful from an industrial viewpoint.
  • the production of antibody drugs requires the process of immunizing an animal with an antigen. It has become clear that it is possible to immunize an animal with the vector itself by incorporating the antigen gene into such an expression vector. Was.
  • the advantage of this method is that the step of purifying the antigen as a protein can be omitted. It is important for the immunization process how many antigens are produced in the animal to which the vector has been administered, and therefore the more powerful the expression vector, the better.
  • Mouse and rat are generally used for monoclonal antibody production. It is considered suitable. Furthermore, it can be applied clinically by incorporating it into humans and other vectors used for gene therapy.

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Abstract

　様々な遺伝子のプロモーターやエンハンサーの組み合わせによるプロモーター活性の比較、検討を行った結果、CMVエンハンサーと哺乳類βアクチンプロモーター、もしくはWoodchuck Hepatitis Virusゲノム配列の転写後調節領域(WPRE)と哺乳類βアクチンプロモーターを組み合わせたハイブリッドプロモーターが、既存のプロモーターよりも強力であることを見出した。さらに、このβアクチンプロモーターは、トランスアクティベーターである癌遺伝子産物のRasの同時発現によって、活性が高められることを見出した。

Description

明 細 書
哺乳類 13ァクチンプロモーターを利用した発現系
技術分野
[0001] 本発明は、組換えタンパク質の産生における、より強力なプロモーターおよび、そ れらを保持するベクターの開発に関する。
背景技術
[0002] 近年、多くのノィォ製剤が輩出されている力 こうした医薬品の多くが動物細胞に 遺伝子を導入し、組換えタンパク質として産生させたものである。こうした組換えタン ノ ク質を効率よく動物細胞に産生させる技術は、バイオ製剤の低コスト化につながり 、患者への安定な供給を約束する。
[0003] 従来は、 EF1 a (elongation factor 1)プロモーターや SR aプロモーターなどが、そう した発現ベクターに用いられてきた (特許文献 1 ,非特許文献 1 ,2)。また、最近ではさ らに発現の改良が進み、 CAGプロモーター（ヒト CMVェンハンサ一に-ヮトリの 13ァク チンプロモーターを糸且み合わせたもの）や、 CEFプロモーター（ヒト CMVェンハンサー にヒト EF1 αプロモーター）などの強力なプロモーターが作られ、こうした用途に使わ れるようになってきた (非特許文献 3— 5)。
[0004] し力しながら、さらに強力なプロモーターを保持するベクターの開発の必要性はい まなお存在し、これによりバイオ製剤のより一層の低コストィ匕ゃ安定な供給に大きく貢 献できるものと考えられる。
特許文献 1： W092/19759
非特許文献 l : Mol. Cell. Biol., Vol.8 (1), p.466-472, 1988
非特許文献 2 : Gene, Vol.87(2), p.291-294, 1990
非特許文献 3 : Gene, Vol.272, p.149- 156, 2001
非特許文献 4 nalytical Biochemistry, Vol.247, p.179-181 , 1997
非特許文献 5 : Gene, Vol.108, p.193- 200, 1991
発明の開示
発明が解決しょうとする課題 [0005] 本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は既存の動物細 胞発現プロモーターよりも強力なプロモーターと、それを利用したベクターの提供で ある。また、本発明は、該ベクターを利用した、所望タンパク質の製造方法および所 望の DNAの発現方法の開発をも目的とする。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは、上記の課題を解決すベぐ様々な遺伝子のプロモーターゃェンノヽ ンサ一の組み合わせによるプロモーター活性の比較、検討を行った。
[0007] まず、 NCBI、及び Jackson laboratoryで公開されて!、るマウスゲノム情報より、マウス
βァクチンのシーケンス情報を得て、 PCRによってマウス 13ァクチンの 5'領域を増幅 した。増幅した PCR産物を pGEM- T- Easy vectorにクローユングし、シーケンスするこ とによって塩基配列を確認した。その後、 PCRによりマウス |8ァクチンのプロモーター 領域のみを増幅し、 pGL3-Basicの Bgl II- Hind IIIサイトに組み込んだ。さらにこのべク ターに、ネオマイシン耐性遺伝子を導入し、 pmAct- Luc- neoとした。
[0008] Woodchuck hepatitis virusゲノム配列の転写後調節領域 (WPRE)を PCRにより増幅 し、反応産物を pGEM-T-Easy vectorにクローニングし、塩基配列を決定した。さらに この pGEM- T/WPREを Xbalで消化し、得られた WPRE断片を pmAct- Luc- neoの Xbal 部位に挿入し、 pmAct- WPRE- Luc- neoを作製した。
[0009] 次に pGL3- Basicベクターの MCS (multi cloning site：配列 5位一 53位）に CMVェン ハンサー領域を組み込むことによって発現ベクターの pmAct-Luc-neoを、あるいはさ らにヒト CMVェンハンサ^ マウス 13ァクチンプロモーターを組み込むことによって発 現ベクターの phCMV- mAct- Luc- neoを完成させた（図 1)。
[0010] 比較対象となるベクターとして、ヒト EF1 aプロモーターは DHFR- Δ E- RVh- PM1- f ( 参考文献 W092/19759)より CMVェンハンサーと共に pGLNベクターの MCSに組み 込むことで、 pCEF- Luc- neoを作製した（図 1)。
[0011] これらのベクターをそれぞれ CHO細胞へ導入し、 COインキュベーター内で 2日間
2
培養して、ルシフェラーゼ活性を Luciferase Assay Systemを用いて測定した。これら の測定の結果より、作製した pmAct-Luc-neoが他のベクターよりも有意に活性が高い ことが明らかになった（図 2)。以上のことから、本発明であるマウス |8ァクチンプロモ 一ターは、既存の CEFプロモーターよりも強力であることが示された。さらに、 WPREェ レメントの付カ卩や、あるいは CMVェンハンサーを付カ卩することによって、マウス βァク チンのプロモーター活性が有意に亢進することも明らかになった（図 3)。
[0012] さらに、トランスァクティベータ一を同時に発現させた場合の効果について検討した 。マウス c-H- ras遺伝子、マウス活性型 c-H- ras及びヒト活性型 K- rasのクロー-ングを 行い、 pCXNベクターに組み込んで、それぞれを pCXN- H- Ras (マウス c- H- ras)、 pCXN- A- H- Ras (マウス活性型 c-H- ras)、及び pCXN- A- K- Ras (ヒト活性型 K- ras)と した。様々な割合で 2種類、あるいは 3種類のベクターを CHO細胞に導入し、ルシフエ ラーゼ活性を測定した。これらの結果より、 pmAct- Luc- neo力 ¾CXN- H- Ras (マウス c-H-ras)、 pCXN- A- H- Ras (マウス活性型 c-H- ras)、及び pCXN- A- K- Ras (ヒト活性 型 c-K-ras)の存在によって、プロモーター活性が亢進することが明らかになった（図 4)。以上のことから、本発明のマウス |8ァクチンプロモーターは、癌遺伝子産物の Ras (活性型、野生型、 H-Ras、 K-Rasを問わない）によってより強力な活性を付与され ることが示された。
[0013] 即ち、本発明者らは、 CMVェンハンサ一と哺乳類 j8ァクチンプロモーター、もしくは Woodchuck Hepatitis Virusゲノム配列の転写後調節領域 (WPRE)と哺乳類 βァクチ ンプロモーターの組み合わせ力 強力なプロモーターになりうることを見出した。さら に、これらのプロモーターを保持した発現系は、トランスァクティベータ一である癌遺 伝子産物の Rasの同時発現によって、さらに発現活性が高められることを見出し、本 発明の完成に至った。
[0014] 本発明は、より具体的には、以下の〔1〕一〔37〕に関する。
〔1〕 ェンハンサ一に哺乳類 βァクチンプロモーターが機能的に結合した DNA構 築物。
〔2〕 ェンハンサ一がサイトメガロウィルス（CMV)である〔1〕に記載の DNA構築物。 〔3〕 ェンノヽンサ 1 ~~力 SWooachuck Hepatitis Virus Posttranscnptional Regulatory
Element(WPRE)である〔1〕に記載の DNA構築物。
〔4〕 哺乳類 βァクチンプロモーターがげつ歯類 βァクチンプロモーターである、〔
1〕から〔3〕の 、ずれかに記載の DNA構築物。 〔5〕 CMVェンノヽンサ一が配列番号: 4に記載の塩基配列からなり、哺乳類 13ァク チンプロモーターが配列番号： 2に記載の塩基配列力もなる、〔2〕に記載の DNA構築 物。
[D] Wooachuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element (WPRE)力 配列番号： 3に記載の塩基配列からなり、哺乳類 /3ァクチンプロモーターが配列番号 : 2に記載の塩基配列からなる、〔3〕に記載の DNA構築物。
〔7〕 〔1〕から〔6〕の 、ずれかに記載の DNA構築物を含むベクター。
〔8〕 哺乳類 /3ァクチンプロモーターの下流に所望の DNAが機能的に結合された DNAを有する〔7〕に記載のベクター。
〔9〕 トランスァクティベータ一をコードする DNAを発現可能に保持する、〔7〕または 〔8〕に記載のベクター。
〔10〕 トランスァクティベータ一が癌遺伝子産物である〔9〕に記載のベクター。
〔11〕 癌遺伝子産物が Rasである、〔10〕に記載のベクター。
〔12〕 所望の DNA力 所望のタンパク質をコードする DNAである、〔8〕から〔11〕の V、ずれかに記載のベクター。
〔13〕 〔8〕から〔12〕のいずれかに記載のベクターを保持する細胞。
〔14〕 〔8〕から〔12〕のいずれかに記載のベクターを保持し、癌遺伝子が活性化し ている細胞。
[15] 癌遺伝子が活性ィ匕している細胞が、トランスァクティベータ一をコードする遺 伝子を含むベクターが導入された細胞である〔14〕記載の細胞。
〔16〕 癌遺伝子が活性ィ匕している細胞が、癌化している細胞である〔14〕記載の細 胞。
〔17〕 哺乳動物細胞である、〔13〕から〔16〕のいずれかに記載の細胞。
〔18〕 げっ歯類細胞である、〔17〕に記載の細胞。
〔19〕 ァクチンプロモーターと同じ動物目であることを特徴とする〔 13〕から〔 18〕 の！、ずれかに記載の細胞。
〔20〕 ァクチンプロモーターと同じ動物種であることを特徴とする〔19〕に記載の 細胞。 〔21〕 〔8〕から〔12〕のいずれかに記載のベクターが導入されたトランスジエニック 非ヒト動物。
[22] 〔8〕から〔12〕のいずれかに記載のベクターが導入された全能性細胞。 〔23〕 〔12〕に記載のベクターを保持する細胞を培養し、培養した細胞又は培地か ら発現させたタンパク質を回収することを含む、所望のタンパク質の製造方法。
〔24〕 培地にトランスァクティベータ一を添加することを含む、〔23〕に記載の方法
〔25〕 〔8〕から〔12〕のいずれかに記載のベクターを、ベクター上の βァクチンプロ モーターと同じ動物目由来の宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞において所 望の DNAを発現させる方法。
〔26〕 〔8〕から〔12〕のいずれかに記載のベクターを、ベクター上の βァクチンプロ モーターと同じ動物種由来の宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞において所 望の DNAを発現させる方法。
[27] 〔8〕に記載のベクターおよびトランスァクティベータ一をコードする DNAを発 現可能に保持するベクターを、〔8〕に記載のベクター上の βァクチンプロモーターと 同種由来の宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞における所望の DNAを発現さ せる方法。
〔28〕 宿主細胞が哺乳動物細胞である、〔25〕から〔27〕のいずれかに記載の方法 〔29〕 宿主細胞がげつ歯類細胞である、〔25〕から〔27〕のいずれかに記載の方法
〔30〕 宿主細胞と同じ動物目由来の βァクチンプロモーターを所望の DNAの上流 に組み込むことを特徴とする、所望の DNAの発現量を増加させる方法。
〔31〕 宿主細胞と同じ動物種由来の βァクチンプロモーターを所望の DNAの上流 に組み込むことを特徴とする、所望の DNAの発現量を増加させる方法。
〔32〕 ェンノ、ンサ一をさらに組み込むことを特徴とする〔30〕もしくは〔31〕に記載の 方法。
〔33〕 ェンノヽンサ^ 力 ^Wooachuck Hepatitis Virus Posttranscnptional Regulatory Element(WPRE)である〔32〕に記載の方法。
〔34〕 ェンハンサ一が CMVェンハンサーである〔32〕に記載の方法。
〔35〕 トランスァクティベータ一をコードする遺伝子を組み込むことを特徴とする〔3
0〕から〔34〕の 、ずれかに記載の方法。
〔36〕 宿主細胞が哺乳動物細胞である〔30〕から〔35〕 V、ずれかに記載の方法。 〔37〕 宿主細胞がげつ歯類細胞である〔30〕から〔35〕いずれかに記載の方法。 図面の簡単な説明
[0015] [図 1]実験に使用したベクターを示した図である。
[図 2]既存のプロモーターである CEFプロモーターとマウス 13ァクチンプロモーターを 比較した図である。
[図 3]マウス 13ァクチンプロモーターに対する WPRE、 CMVェンハンサ一の効果を示 した図である。
[図 4]マウス Ras蛋白質のマウス βァクチンプロモーターに対する効果を示した図であ る。
発明を実施するための最良の形態
[0016] 本発明はェンノヽンサ一に哺乳類 βァクチンプロモーターが機能的に結合した DNA 構築物、及び該 DNA構築物を含むベクターを提供する。本発明の DNA構築物やべ クタ一は、所望の DNAの発現 (例えば、所望のタンパク質をコードする DNAの発現、 アンチセンス DNAの発現、 dsRNAをコードする DNAの発現など）に用いることができる
[0017] 本発明において、哺乳類 j8ァクチンプロモーターとェンハンサ一とが「機能的に結 合した」とは、プロモーター活性が高まるように、本発明のプロモーター活性を有する 哺乳類 13ァクチンプロモーターとェンハンサ一とが結合して 、ることを 、う。従って、 哺乳類 j8ァクチンプロモーターとェンハンサ一の距離が離れていたり、間に他の遺 伝子が挿入された場合であっても、哺乳類 j8ァクチンプロモーターのプロモーター活 性が高まるのであれば、上記の「機能的に結合した」の意に含まれる。ェンハンサー は哺乳類 βァクチンプロモーターの上流下流どちらに存在して 、ても良 、。
[0018] また、哺乳類 13ァクチンプロモーターと所望の DNAが「機能的に結合した」とは、哺 乳類 j8ァクチンプロモーターの活性ィ匕により、所望の DNAの発現が誘導されるように 、哺乳類 j8ァクチンプロモーターと所望の DNAとが結合していることをいう。該 DNAと 哺乳類 j8ァクチンプロモーターとの間には、該 DNAの発現の誘導が起こり得る限り、 任意の DNA配列を有していても良い。本発明における「DNAの発現」には、転写およ び翻訳の双方が含まれる。また、所望の DNA力 所望のタンパク質をコードする DNA であってもよい。
[0019] 本発明においてェンハンサ一とは、転写により生成するメッセンジャー RNA(mRNA) の量を結果的に増加させるものであれば限定されない。ェンノヽンサ一はプロモータ 一の作用を促進する効果を持つ塩基配列であり、一般的には lOObp前後からなるも のが多い。ェンノヽンサ一は配列の向きにかかわらず転写を促進することができる。又 、ェンハンサー自体はプロモーター活性を持っていないのである力 ェンハンサ一は 数千塩基対も離れた所力 転写を活性ィ匕することができる。さらに、ェンハンサ一は 転写される遺伝子領域の上流、下流、および遺伝子内にも存在し、転写を活性化す ることができる。また、上述したように本発明のェンノ、ンサ一は、転写により生成する mRNAの量を増加させるものであれば限定されな!、ので、 mRNAの転写後に mRNAの 分解を阻害したり、 mRNAを安定ィ匕することによって、細胞内に存在する mRNAの量を 増加させ、アミノ酸の翻訳効率を上げるものも本発明のェンノヽンサ一に含まれる。
[0020] 本発明で用いられるェンハンサ一は 1種類でもよぐ又、 2つ以上の同一のェンハン サーを複数用いたり、あるいは異なる複数のェンノヽンサ一を組み合わせて用いても 良い。
[0021] 本発明にお 、て用いられるェンハンサ一としては、 WPRE、 CMVェンハンサー、 HTLV- 1の LTRに存在する R- U5'セグメント（Mol. Cell. Biol, Vol.8(l), p.466-472, 1988 )、 SV40ェンハンサー、ゥサギ j8グロビンの第二エタソンと第三ェクソン間に存 在するイントロン配列（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.78(3), p.1527-31, 1981)、ヒ ト成長ホルモンのゲノム領域 0 Immunol., Vol. 155(3), p.1286-95, 1995)などを挙げる ことができるが、より好ましいものは WPREまたは CMVェンハンサーである。
[0022] WPREは、 Woodchuck hepatitis virusゲノム配列 (GenBank Accession No. J04514) に存在する HBVPRE(human hepatitis B virus posttranscriptional reguratory element)に類似した領域であり、ゲノム配列の 1093番目から 1684番目の 592塩基が 転写後調節領域であることが報告されている（Journal of Virology, Vol.72, p.5085-5092, 1998)。その後、レトロウイルスベクターを用いた解析により、 WPREは 目的遺伝子 3'末端の非翻訳領域に挿入することにより、 5— 8倍高い蛋白産生が得ら れることが示された。また、 WPREの導入により、 mRNAの分解が抑制されることも報告 された（Journal of Virology, Vol.73, p.2886- 2892, 1999)。 WPREのように mRNAの安 定ィ匕により、アミノ酸の翻訳効率を上げるものも広義のェンノ、ンサ一と考えられる。本 発明において用いられる WPREとしては、配列番号： 3に記載の塩基配列力 なる DNA力 より好ましい。
[0023] また、 CMVェンハンサーも WPREと同様の目的で用いることができる。本発明で用 V、られるサイトメガロウィルスはヒトに感染するサイトメガロウィルス（ヒトサイトメガロウイ ルス）でもよぐ又、非ヒト動物に感染するサイトメガロウィルスでもよい。非ヒト動物に 感染するサイトメガロウィルスとしては、例えば、げっ歯類に感染するサイトメガロウイ ルス（例えば、マウスサイトメガロウィルスなど）を用いることが可能である。 CMVェン ハンサ一は公知の配列を用いることが可能であり、例えば GenBank Accession No. X17403 (ヒトサイトメガロウィルス）、 GenBank Accession No. L06816 (マウスサイトメガ ロウィルス）に記載の CMVェンハンサーを用いることが可能である。また、 CMVェンハ ンサ一は市販されている発現ベクター（ex.ストラタジーン社の pCMV-Script、インビト ロジェン社の pcDNA3.1)の多くに、 CMVプロモーターの一部として組み込まれている 。本発明において用いられる CMVェンハンサ一としては、配列番号: 4に記載の塩基 配列からなる DNA力 より好ましい。
[0024] プロモーターは DNAを铸型に転写を開始する DNA上の特定の塩基配列であり、一 般的に、共通の配列を持つ。例えば、大腸菌などの原核生物では、通常、転写開始 部位の- 10塩基対部位に TATAATG配列を、 -35塩基対部位に TTGACA配列を持つ 。又、真核生物では、通常、 -20塩基対部位に TATAボックスを持つ。
[0025] 本発明で用いられる βァクチンプロモーターとしては、哺乳類 j8ァクチンプロモータ 一を用いることができる。哺乳類 j8ァクチンプロモーターは、ヒト j8ァクチンプロモータ 一やげつ歯類 βァクチンプロモーターなど、どのような哺乳類由来の βァクチンプロ モーターを用いてもょ 、が、好ましくはげつ歯類 βァクチンプロモーターを用いること 力 Sできる。げっ歯類 βァクチンプロモーターとしては、例えば、マウス j8ァクチンプロ モーター（GenBank Accession No. NT— 039317)、ラット j8ァクチンプロモーター（ GenBank Accession No. NW_042778)などを用いることができる。本発明において用 いられる哺乳類 j8ァクチンプロモーターとしては、配列番号： 1もしくは 2に記載の塩 基配列からなる DNA力 より好ましい。
[0026] げっ歯類としては、ネズミ下目、リス下目、ビーバー下目、パラミス下目、デバネズミ 下目、ャマァラシ下目、デンジタネズミ下目などに属する動物を挙げることができ、よ り具体的には、マウス、ラット、ハムスターなどを挙げることができる。
[0027] ベクターは、一般的には、所望の遺伝子を宿主に導入して、所望の遺伝子を増幅 や発現させる為の運搬体 DNA分子のことをいい、好ましくは、公知の制限酵素部位 を持ち、栄養要求性であり、宿主内で複製できる能力を持つ。ベクターは通常、プロ モーター、ェンハンサー、ターミネータ一、 SD配列、翻訳開始コドン、翻訳終止コドン
、複製開始点などを含むことができる。ベクターには、必要に応じて、ベクターが導入 された細胞を選択し得る選択マーカーなどをさらに保持させることができる。選択マ 一力一としては、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフエ二コール、 ネオマイシン、ノヽィグロマイシン、ピューロマイシン、ゼォシンのような薬剤耐性遺伝 子、ガラクトシダーゼなどの酵素活性を指標に選択し得るマーカー、あるいは、 GFP などの蛍光発光などを指標に選択し得るマーカーなどが挙げられる。また、 EGFレセ プター、 B7-2などの表面抗原を指標に選択し得る選択マーカーなども用いてもよい。 このように選択マーカーを用いることにより、該ベクターが導入された細胞、すなわち 、本発明のベクターが導入された細胞のみを選択することが可能となる。又、ベクタ 一には、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリべプチ ド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリブラズムに産生させる場合、 pelBシグナル配列（J. BacterioL, Vol.169(9), p.4379- 4383, 1987)を使用すればよい
[0028] 本発明で用いられるベクターは特に制限されず、いかなるベクターを用いてもよい。
具体的には、哺乳動物由来のベクター（例えば、 pcDNA3 (インビトロジヱン社製)や、 pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res., 18(17), p.5322, 1990)、 pEF、 pCDM8、 pCXN、昆 虫糸田胞由来のベクター (f列えば「Bac— to— BAC baculovairus expression system」 (イン ビトロジェン社製）、 PBacPAK8)、植物由来の発現ベクター（例えば ρΜΗ1、 pMH2)、 動物ウィルス由来のベクター（例えば、 pHSV、 pMV、 pAdexLcw)、レトロウイルス由来 のベクター（例えば、 pZIPneo)、酵母由来のベクター（例えば、「Pichia Expression Kit 」（インビトロジェン社製）、 pNVll 、 SP- Q01)、枯草菌由来のベクター（例えば、 pPL608、 pKTH50)、大腸菌ベクター（M13系ベクター、 pUC系ベクター、 pBR322、 pBluescript、 pCR-Script)、などが挙げることができる。本発明においては、哺乳動物 細胞内で発現可能なベクターを用いることが好ましぐ又、発現ベクターを用いること が好ましい。
[0029] 宿主細胞が CHO細胞である場合、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での 遺伝子のコピー数の増幅を目的とする為に、核酸合成経路を欠損した CHO細胞に それを相補する DHFR遺伝子を有するベクター（例えば、 pCHOIなど）を導入し、メトト レキセート (MTX)により増幅させることができる。
[0030] さらに本発明のベクターには、トランスァクティベータ一をコードする DNAが含まれ て!、てもよ 、。トランスァクティベータ一は遺伝子の転写を活性ィ匕するトランス作動性 因子であり、トランス活性ィ匕因子ともいわれる。トランスァクティベータ一には、 DNA結 合能を持ちシスエレメントへの結合を介して直接転写を促進するものや、 DNA結合能 を持たず、他の因子を活性化することで間接的に転写を促進するもの、等が知られ ている。本発明で使用されるトランスァクティベータ一は特に限定されず、どのようなト ランスァクティベータ一を用いてもよい。トランスァクティベータ一の具体的な例として は、アデノウイルスの E1A、ヒト免疫不全ウィルスの Tat、ヒト T細胞白血病ウィルスの Tax,癌遺伝子産物などを挙げることができる力 本発明においては癌遺伝産物を用 いることが好ましい。癌遺伝子は動物の正常細胞に内在し、その活性化突然変異に より細胞の癌化を誘導する遺伝子群の総称である。ウィルスがもつ癌遺伝子はウィル ス性癌遺伝子、その由来である正常細胞の遺伝子は細胞性癌遺伝子と呼ばれてい る。 遺伝ナとし飞 fef列 X·は、 srcゝ yesゝ fgrゝ finsゝ erbBゝ aol、 Kitゝ crkゝ mosゝ rafゝ sisゝ ras、 myc、 fos、 junなどを挙げることができる。ヒト活性型 H- Rasがヒト βァクチンプロモ 一ターを み込んだ発現ベクターの発現効率を亢進することが報告されて 、るが（ Cytotechnology, Vol.16, p.167-178, 1994)、本発明においても Rasを用いることが好 ましい。 Rasには K— ras、 H— ras、 N— ras、 c— ras あり、 らに、 rho遺 1ZS子ファ^リー、 rab 遺伝子ファミリーを含む場合には、 rasスーパーファミリーと呼ばれている。本発明に おいては H-rasを好適に用いることができる。トランスァクティベータ一として Rasを用 いる場合、 Rasは野生型でも活性型でもよい。本発明において用いられる H-rasとして は、配列番号： 5又は 6のいずれかの DNA又は配列番号： 7又は 8のアミノ酸配列をコ ードする DNA力 より好ましい。
[0031] さらに、本発明のベクターを、時期特異的に遺伝子を発現するよう設計してもよい。
時期特異的に遺伝子を発現させる方法としては、例えば、 Cre-loxPシステムなどの部 位特異的組換えを用いた方法を挙げることができる。
[0032] Creは、 2個の ΙοχΡ配列間の部位特異的組換えを仲介する、 E.coliバタテリオファー ジ P1由来の組換え酵素である。 LoxP配列は、 Creが結合するための認識配列として 働く 2個の 13bpの逆方向反復配列に両側を挟まれた 8bpのスぺーサー領域力 なる 。所望の遺伝子の発現が抑制されるように ΙοχΡ配列をベクターに導入しておけば、 Creを投与して ΙοχΡ配列を除去することにより、好きな時期に所望の遺伝子を発現さ せることが可能である。 ΙοχΡ配列の挿入部位は、プロモーターと所望の遺伝子の間な ど、所望の遺伝子の発現が抑制される部位であればよい。又、 Creの投与は、 Cre自 体を投与してもよいし、 Creをコードする遺伝子を投与してもよい。トランスジェニック 動物などの動物で Cre-loxPシステムを用いる場合には、例えば、 Creを発現するアデ ノウィルスを感染させることなどにより、所望の遺伝子を発現させることができる (Nucleic. Acids. Res., Vol.23(19), p.3816- 3821, 1995)。このような酵素を利用した部 位特異的組換えとしては、他に Flp- FRT、 Zygosaccharomyces rouxii pSRl、レソルバ ーゼ -rfsF、ファージ Mu Ginなどを挙げることができる。
[0033] さらに、上述した時期特異的発現システム以外に、テトラサイクリンなどの抗生物質 を利用した方法や、ェクジソンなどのホルモンを利用した方法などを用いることが可 能である。これらの方法は当業者に公知であり、市販されているキットを用いることが 可能である（エタジソン発現システム (インビトロジェン社)、テトラサイクリン発現システ ム（クロンテック社)、など)。
[0034] また、本発明は、本発明のベクターが導入された宿主細胞を提供する。本発明の 宿主細胞は、例えば、所望のタンパク質の製造や発現のための産生系として使用す ることができる。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなぐ株 化された細胞、初代継代細胞、動物個体、受精卵など細胞種を問わない。本発明の 宿主細胞としては、例えば、種々の動物細胞 (例えば、哺乳動物細胞)や大腸菌など を用いることが可能である。真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞 、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、ヒト、マウス、ノ、ムスター などの哺乳類細胞（例えば、 CHO、 COS, 3T3、ミエローマ、 BHK (baby hamster kidney)、 HeLa、 Vero)、両生類細胞（例えばアフリカッメガエル卵母細胞（Nature, Vol.291, p.358-360, 1981) )、あるいは昆虫細胞（例えば、 S19、 S121、 Tn5)などが知 られている。 CHO細胞としては、特に、 DHFR遺伝子を欠損した CHO細胞である dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.77, p.4216-4220, 1980)や CHO K— 1 ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.60, p.1275, 1968)を好適に使用することができる。 植物細胞としては、例えば、ニコチアナ'タパカム（Nicotiana tabacum)由来の細胞が ポリペプチド生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞とし ては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces)属、例えば、サッカロミセス'セレ ピンェ (Saccharomyces cerevisiae)、糸状菌、 [列 ば、フスぺノレ3 rノレス (Aspergillusノ 属、例えば、ァスペルギルス '二ガー（Aspergillus niger)が知られている。原核細胞を 使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌 . coli )、例えば、 JM109、 DH5 a、 HB101等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。 本発明において好ましい宿主細胞としては、動物細胞を挙げることができ、さらに好 ましくは哺乳動物細胞、特に好ましくはげつ歯類細胞 (例えば CHO細胞）を挙げるこ とがでさる。
[0035] 又、本発明の宿主細胞として、癌遺伝子が活性ィ匕している細胞を用いることも可能 である。癌遺伝子が活性ィ匕している細胞とは、正常細胞と比較して癌遺伝子が多量 に発現して 、る細胞、または変異した癌遺伝子が発現して 、る細胞などを 、う。
[0036] 癌遺伝子が活性ィ匕している細胞は、人為的に癌遺伝子が活性化された細胞でも非 人為的に癌遺伝子が活性化された細胞でもよい。人為的に癌遺伝子が活性化され た細胞の具体的な例としては、癌遺伝子 (野生型または活性型)を含むベクターが導 入された細胞や、癌遺伝子に人為的に変異を導入した細胞などを挙げることができ る。非人為的に癌遺伝子が活性化された細胞の具体的な例としては、癌化した細胞
(ex. T24ヒト膀胱癌細胞 Nature, Vol.302, p.33-37, 1983)などを挙げることができる 。癌遺伝子の活性ィ匕のメカニズムとしては、プロモーター 'インサーシヨン、点突然変 異、遺伝子増幅、転座などによると考えられている。
[0037] また、本発明のベクターの上記細胞への導入方法は、当業者においては、細胞の 種類により適宜選択することができる。例えば、哺乳動物細胞への導入では、リン酸 カルシウム法 (Virology, Vol.52, p.456, 1973)、 DEAEデキストラン法、カチォニックリボ ソーム DOTAP (ロッシュ 'ダイァグノスティックス社製）を用いた方法、エレクト口ポレー シヨン法 (Nucleic Acids Res., Vol.15, p.1311, 1987)、リポフエクシヨン法 0. Clin. Biochem. Nutr., Vol.7, p.175, 1989)、ウィルスによる感染導入方法 (Sci.Am., p.34, 1994)、パーティクルガンなど力も選択することができ、植物細胞への導入では、エレ タトロポレーシヨン法 (Nature, Vol.319, p.791, 1986)、ポリエチレングリコール法
(EMBO J., Vol.3, p.2717, 1984)、パーティクルガン法 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vo 1.85, p.8502, 1988)、ァグロバタテリユウムを介した方法 (Nucleic. Acids Res., Vol.12, p.8711, 1984)等により行うことができる。
[0038] また、 Trans IT (タカラ社)、 PolyFect Transfection Reagent (キアゲン社)、
LipofectAMINE (インビトロジェン社)などのキットを利用してもよい。さらに、本発明の 宿主細胞は、本発明のベクター以外に、トランスァクティベータ一をコードする DNAを 有するベクターをさらに含んで 、てもよ 、。
[0039] 本発明はさらに本発明のベクターを用 Vヽた所望のタンパク質の製造方法及び所望 の DNAを発現させる方法に関する。タンパク質製造のための産生系は、 in vitroおよ び in vivoの産生系がある。 in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や 原核細胞を使用する産生系が挙げられる。例えば、上述した宿主細胞を in vitroで培 養することにより所望のタンパク質が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことが できる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、 DMEM、 MEM, RPMI1640, IMDM、 F10培地、 F12培地などを使用することができる。その際、牛胎児血清（FCS )等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。さらに、トランスァク ティベータ一を培地に添カ卩してもよい。培養時の pHは、約 6— 8であるのが好ましい。 培養は、通常、約 30— 40°Cで約 15— 200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気 、攪拌を加える。培養条件は使用する細胞の種類によって異なるので、当業者は適 宜好適な条件を決定することができる。例えば CHO細胞であれば通常、気相の CO
2 濃度が 0— 40%、好ましくは、 2— 10%の雰囲気下、 30— 39°C、好ましくは、 37°C程 度で、 1 14日間培養すればよい。また、動物細胞培養用の各種の培養装置として は、例えば発酵槽型タンク培養装置、エアーリフト型培養装置、カルチャーフラスコ型 培養装置、スピンナーフラスコ型培養装置、マイクロキャリアー型培養装置、流動層 型培養装置、ホロファイバー型培養装置、ローラーボトル型培養装置、充填槽型培 養装置等を用いて培養することができる。
一方、 in vivoでタンパク質を産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生 系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とする DNA を導入し、動物又は植物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。本発明におけ る「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。動物を使用する場合、哺乳類動物、 昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ャギ、ブタ、ヒッジ、マウス、ゥシを 用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993)。 また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジエニック動物を用いることができる。例えば 、所望のタンパク質をコードする DNAを、ャギ j8カゼインのような乳汁中に固有に産 生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、こ の融合遺伝子を含む DNA断片をャギの胚へ注入し、この胚を雌のャギへ移植する。 胚を受容したャギカ 生まれるトランスジエニックャギ又はその子孫が産生する乳汁 から、所望のタンパク質を得ることができる。トランスジエニックャギカも産生されるポリ ペプチドを含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジエニックャギに 使用してもよい（Bio/Technology, Vol.12, p.699- 702, 1994)。また、昆虫としては、例 えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、所望のタンパク質をコードする DNAを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液か ら所望のタンパク質を得ることができる（Nature, Vol.315, p.592-594, 1985)。
[0041] さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場 合、所望のタンパク質をコードする DNAを植物発現用ベクター、例えば pMON 530に 挿入し、このベクターをァグロバタテリゥム'ッメファシエンス (Agrobacterium tumefaciens)のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチ アナ 'タパカム（Nicotiana tabacum)に感染させ、本タバコの葉より所望のタンパク質を 得ることができる（Eur. J. Immunol, Vol.24, p.131- 138, 1994)。
[0042] 本発明のタンパク質製造方法にお!ヽて、遺伝子の発現は一過性発現でもよ!/ヽ。遺 伝子の一過性の発現を目的とする場合には、例えば、 SV40 T抗原を発現する遺伝 子を染色体上に持つ COS細胞を用いて SV40の複製起点を持つベクター（pcDなど） で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオ一マウィルス、 アデノウイルス、ゥシパピローマウィルス (BPV)等の由来のものを用いることもできる。 さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーと して、アミノグリコシドトランスフェラーゼ (APH)遺伝子、チミジンキナーゼ (TK)遺伝子 、大腸菌キサンチングァニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt)遺伝子、ジヒド 口葉酸還元酵素 (dhfr)遺伝子等を含むことができる。さら〖こ、遺伝子治療などのよう に所望の遺伝子を生体内で発現させる場合には、所望の遺伝子をベクターに組み 込み、例えば、レトロウイルス法、リボソーム法、カチォニックリボソーム法、アデノウィ ルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。用いられるベクターとして は、例えば、アデノウイルスベクター（例えば pAdexlcw)やレトロウイルスベクター (例え ば pZIPneo)などが挙げられる力 これらに制限されない。ベクターへの所望の遺伝子 の挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である（
Molecular Cloning, 5.61-5.63)。生体内への投与は、 ex vivo法であっても、 in vivo法 であってもよい。
[0043] 本発明により得られた所望のタンパク質は、宿主細胞内または細胞外 (培地など） 力も単離し、実質的に純粋で均一なタンパク質として精製することができる。タンパク 質の分離、精製は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製方法を使 用すればよぐ何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィル ター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、 SDS-ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせれ ばタンパク質を分離、精製することができる。クロマトグラフィーとしては、例えばァフィ 二ティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、 ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Purincation and Characterization: A Laooratoryし ourse Manual. Ea Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。これらのクロ マトグラフィ一は、液相クロマトグラフィー、例えば HPLC、 FPLC等の液相クロマトグラ フィーを用いて行うことができる。なお、タンパク質を精製前又は精製後に適当なタン パク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、部分的にペプチドを 除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシ ン、リシルエンドべプチダーゼ、プロテインキナーゼ、ダルコシダーゼなどが用いられ る。
[0044] 本発明のベクター、 DNA構築物または宿主細胞は、所望のタンパク質を製造する 際に用いることができる。本発明において、所望のタンパク質とはいかなるタンパク質 でもよぐタンパク質断片やペプチドなども含まれる。所望のタンパク質の具体例とし ては、抗体、エリスロポイエチン、コロニー刺激因子 (顆粒球、マクロファージ、顆粒球 マクロファージ）、インターロイキン 1一 31、インターフェロン、 RANTES,リンホトキシ ン 13、 Fasリガンド、 fit 3リガンド、 NF- κ Βの受容体活性化因子のリガンド (RANK L)、TNF関連ァポトーシス誘導リガンド(TRAIL)、 CD40リガンド、 OX40リガンド、 4— 1BBリガンド（および TNFファミリーの他のメンバー）、胸腺ストロマ由来リンホポェ チン、マスト細胞増殖因子、幹細胞増殖因子、上皮増殖因子、成長ホルモン、腫瘍 壊死因子、白血病阻害因子、オンコスタチン M、トロンボポェチンのような造血因子 などのサイト力イン、成長因子、などを挙げることができる。
[0045] さらに、本発明のベクター又は DNA構築物はトランスジエニック動物の作製に用い ることも可能である。トランスジエニック動物の作製は公知の方法、例えば、以下のよう にして作製することが可能である。まず、トランスジエニック動物内で発現させたい目 的遺伝子を、本発明の DNA構築物又は本発明のベクターに挿入する。該ベクター、 該 DNA構築物、又はそれらから切り出した発現カセットを全能性細胞に導入する。全 能性細胞としては、受精卵、初期胚、胚性幹細胞 (ES細胞)等を用いることが可能で ある。全能性細胞への導入は、静電パルス法、リボソーム法、リン酸カルシウム法、マ イク口インジェクション法、あるいはレトロウイルスを感染させるなど、通常用いられる方 法により行うことができる。上記処理を行った全能性細胞を仮親の卵管に移植し、産 仔を出生させ、その産仔の中から、目的遺伝子を有する個体を選抜する。目的遺伝 子を有する個体である力否かは、目的遺伝子に特異的なプライマーを用いたサザン ブロッテイングや PCRによる確認などで判定することができる。
[0046] トランスジエニック動物としては、ヒト以外の非ヒト動物であれば特に制限されず、マ ウス、ラット、ノヽムスター、モルモット、ゥサギ、ブタ、ミニブタ、ゥシ、ヒッジ、ネコ、ィヌ 等の哺乳動物、 -ヮトリ等の鳥類、魚類、昆虫類、線虫類などを挙げることができる。 操作上の点などから、好ましくはげつ歯類であり、特に好ましくはマウスである。
[0047] 又、本発明のベクター又は DNA構築物は、アンチセンス法や RNAiなどに用いること も可能である。アンチセンス法は、標的遺伝子に対して相補的な配列を持つオリゴヌ クレオチドが細胞内に存在すると、該アンチセンス（アンチセンス DNA、アンチセンス RNAなど）が標的遺伝子 (標的 mRNA、標的 DNA、など）と対合することにより、翻訳' 転写を阻害し、標的遺伝子の発現を抑制することをいう。従って、アンチセンスオリゴ ヌクレオチドを、本発明の DNA構築物又は本発明のベクターに挿入し、該 DNA構築 物または該ベクターで細胞を形質転換することにより、細胞内での標的 DNAの発現 を阻害することが可能となる。
[0048] 又、 RNA干渉（RNA interfearenece： RNAi)を用いて標的遺伝子を阻害することも可 能である。 RNAiは、二本鎖 RNA(dsRNA)を細胞内に導入した際に、その RNA配列に 対応する細胞内の mRNAが特異的に分解され、蛋白質として発現されなくなる現象を いう。 RNAiの場合、通常、二本鎖 RNAが用いられるが、自己相補的な一本鎖 RNA中 で形成される二本鎖を用いることも可能である。二本鎖を形成する領域は、全ての領 域にぉ 、て二本鎖を形成して 、てもよ 、し、一部の領域 (例えば両末端又は片方の 末端など）がー本鎖等になっていてもよい。 RNAiに用いられるオリゴ RNAは 10— lOObpの RNAが用いられることが多ぐ通常 19一 23bpの RNAが用いられる。従って、細 胞内で二本鎖 RNAを形成するように設計された遺伝子を、本発明の DNA構築物又 は本発明のベクターに挿入し、該 DNA構築物または該ベクターで細胞を形質転換す ることにより、細胞内での標的遺伝子の発現を阻害することが可能となる。 RNAi法は 、 Nature, Vol.391, p.806, 1998、 Proc.Natl.Acsd.Sci.USA, Vol.95, p.15502, 1998、 Nature, Vol.395, p.854, 1998、 Proc.Natl.Acsd.Sci.USA, Vol.96, p.5049, 1999、 Cell, Vol.95, p.1017, 1998、 Proc.Natl.Acsd.Sci.USA, Vol.96, p.1451, 1999、
Proc.Natl.Acsd.Sci.USA, Vol.95, p.13959, 1998、 Nature Cell Biol., Vol.2, p.70, 2000等の記載に従って行うことができる。
[0049] さらに、本発明のベクター又は DNA構築物は、遺伝子治療に用いることも可能であ る。遺伝子治療は、変異した遺伝子を補正することを目的に、外部から患者の細胞に 正常な遺伝子を導入し、細胞の表現型を変化させることにより、病気の治療を行う方 法である。又、遺伝子治療は、遺伝子病の治療のみならず、エイズや癌などの他の 疾患に対しても有効であると考えられている。遺伝子治療は、生体に直接遺伝子を 導入し、細胞に遺伝子を組み込む方法 (in vivo法）と、患者の細胞を採取し、体外で 細胞に遺伝子を導入した後、該細胞を再度、患者に移植する方法 (ex vivo法)に分け られる。
[0050] 遺伝子の投与は如何なる方法を用いてもよぐマイクロインジェクション、リン酸カル シゥム法、エレクト口ポレーシヨン法、パーティクルガン、レトロウイルスなどのウィルス ベクターを用いた方法などにより投与することが可能である。現在、遺伝子治療には ウィルスベクターが広範に用いられて 、る。ウィルスベクターとして用いられるウィル スの例としては、アデノウイルス、アデノ関連ウィルス、ヘルぺスウィルス、ワクシニアゥ イノレス、レトロウイルス、ポリオ一マウィルス、パピローマウィルス、レンチウィルスなど を挙げることができる。
[0051] 又、パーティクルガンでの導入のように、遺伝子を直接導入する方法も確立されて いる。 in vivo法で遺伝子を導入する場合、その投与経路は限定されず、静脈内、筋 肉、皮下、皮内、粘膜、心臓や肝臓などの臓器に直接投与、など如何なる経路で投 与してもよい。このように、患者の細胞に導入したい遺伝子を、本発明の DNA構築物 又は本発明のベクターに挿入し、該 DNA構築物または該ベクターを、 in vivo法又は ex vivo法により患者の細胞内に導入することにより、遺伝子治療が可能となる。遺伝 子治療の具体的な方法は、別冊実験医学遺伝子治療の基礎技術 (羊土社)、別冊 実験医学遺伝子導入と発現解析実験法 (羊土社)、 日本遺伝子治療学会編遺伝子 治療開発研究ハンドブック (ェヌ ·ティー ·エス)などを参考に行うことができる。
[0052] さらに、本発明のベクター又は DNA構築物は、 DNAワクチンの発現の為に用いるこ とも可能である。 DNAワクチンは、抗原 DNAを体内で発現させ、その抗原に対する免 疫反応を誘起する方法と、 CpGの繰り返し配列を免疫増強物質として接種する方法 の二つがある。 DNAワクチンを接種すると、体内で抗原タンパク質が合成され、ウィル スなどの自然感染と同様の免疫反応を誘導する。 DNAワクチン発現の為のベクター 、投与方法、投与経路などは遺伝子治療と同様の方法により行うことが可能である。
[0053] さらに、本発明のベクター又は DNA構築物は、免疫原として抗体作製に用いること も可能である（J. Virol, Vol.70(9), p.6119-25, 1996)。免疫原となるタンパク質又は ペプチドを発現するよう、本発明の DNA構築物又はベクターを構築し、該ベクター又 は DNA構築物を免疫動物に投与することにより、免疫動物の体内で免疫原となるタ ンパク質又はペプチドが発現し、該タンパク質又はペプチドに対する抗体が産生され る。より具体的には、例えば、以下のような方法により抗体を作製することが可能であ る。
[0054] まず、免疫原となるタンパク質又はペプチドをコードする遺伝子を、本発明の DNA 構築物又はベクターに挿入する。該 DNA構築物またはベクターを免疫動物（非ヒト動 物）に投与する。投与は如何なる方法を用いてもよぐベクターをそのまま投与する方 法以外に、例えば、エレクト口ポレーシヨン法、パーティクルガン、レトロウイルスなどの ウィルスベクターを用いた方法などにより投与することが可能である。又、化学物質（ ブピバ力インなど)など、他の物質と一緒に投与してもよい。投与経路は静脈内、筋 肉、皮下、皮内、粘膜、心臓や肝臓などの臓器に直接投与など、如何なる経路で投 与してもよい。感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではな いが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましぐ一 般的にはげつ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ノ、ムスター、あるいはゥサギ、サル 等が使用される。このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇 するのを確認した後に、哺乳動物力 免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、 好ま 、免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
[0055] 前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用い る。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、 P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immnol., Vol.123, p.1548- 1550, 1979)、 P3x63Ag8U.l (Current Topics in
Microbiology and Immunology, Vol.81, p.l- 7, 1978)、 NS- 1 (Eur. J. Immunol., Vol.6, p.511-519, 1976)、 MPC- 11 (Cell, Vol.8, p.405-415, 1976)、 SP2/0 (Nature, Vol.276, p.269-270, 1978)、 FO (J. Immunol. Methods, Vol.35, p.l- 21, 1980)、 S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. Vol.148, p.313- 323, 1978)、 R210 (Nature, Vol.277, p.131-133, 1979)等が好適に使用される。前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞 融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルスティンらの方法（ Methods EnzymoL, Vol.73, p.3-46, 1981)等に準じて行うことができる。より具体的に は、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実 施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール (PEG)、センダイウイ ルス (HVJ)等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキ シド等の補助剤を添加使用することもできる。
[0056] 免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミ エローマ細胞に対して免疫細胞を 1-10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用い る培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適な RPMI1640培養液 、 MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能 であり、さらに、牛胎児血清 (FCS)等の血清補液を併用することもできる。細胞融合 は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め 37 °C程度に加温した PEG溶液 (例えば平均分子量 1000-6000程度）を通常 30-60% ( w/v)の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞 (ハイプリドーマ）を 形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰 り返すことによりハイプリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
[0057] このようにして得られたノヽイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば HAT培養液（ ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液)で培養することにより選 択される。上記 HAT培養液での培養は、目的とするハイプリドーマ以外の細胞 (非融 合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日一数週間)継続する。ついで、通常 の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイプリドーマのスクリーニング および単一クローユングを行う。
[0058] また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリドーマを得る他に、ヒトリンパ球 を in vitroで感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と 融合させ、結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平 1-59878号公 報参照)。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジエニック動 物に抗原を投与して抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞から抗原に対 するヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号 WO 94/25585号公報、 WO 93/12227号公報、 WO92/03918号公報、 WO 94/02602号公報参照）。このようにし て作製されるモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマは、通常の培養液中で継 代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。 当該ハイプリドーマ力 モノクローナル抗体を取得するには、当該ハイプリドーマを通 常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイプリドーマ をこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが 採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法 は、抗体の大量生産に適している。
[0059] 本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をノヽイブリドーマ力もクロー- ングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用 いて産生させた組換え型のものを用いることができる（例えば、 Eur. J. Biochem., Vol.192, p.767-775, 1990参照）。
[0060] 具体的には、抗体を産生するハイプリドーマから、抗体の可変 (V)領域をコードす る mRNAを単離する。 mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グァ-ジン超遠心法（ Biochemistry, Vol.18, p.5294- 5299, 1979)、 AGPC法（Anal. Biochem., Vol.162, p.156-159, 1987)等により行って全 RNAを調製し、 mRNA Purification Kit (フアルマ シァ製）等を使用して目的の mRNAを調製する。また、 QuickPrep mRNA Purification Kit (フアルマシア製)を用いることにより mRNAを直接調製することもできる。得られた mRNAから逆転写酵素を用いて抗体 V領域の cDNAを合成する。 cDNAの合成は、 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生化学工業社製）等 を用いて行う。また、 cDNAの合成および増幅を行うには、 5'- Ampli FINDER RACE Kit (クロンテック製）および PCRを用いた 5'- RACE法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.85, p.8998-9002, 1988、 Nucleic Acids Res., Vol.17, p.2919-2932, 1989)等を使 用することができる。得られた PCR産物から目的とする DNA断片を精製し、ベクター DNAと連結する。さら〖こ、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロ ニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とする DNAの塩基配 列を公知の方法、例えば、ジデォキシヌクレオチドチェインターミネーシヨン法等によ り確認する。目的とする抗体の V領域をコードする DNAを得たのち、これを、所望の抗 体定常領域 (C領域)をコードする DNAを含有する発現ベクターへ組み込む。
[0061] 抗体を製造するには、通常、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、ェンハンサー、 プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現 ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。抗体遺伝子の発現は、 抗体重鎖 (H鎖)または軽鎖 (L鎖）をコードする DNAを別々に発現ベクターに組み込 んで宿主細胞を同時形質転換させてもょ 、し、あるいは H鎖および L鎖をコードする DNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもょ ヽ (WO 94/11523号公報参照)。
[0062] 以上のように、本発明の DNA構築物又はベクターは、所望のタンパク質などの製造 、アンチセンス法、 RNAi法、遺伝子治療、 DNAワクチン、トランスジエニック動物、抗 体の作製などに適用することが可能である。
[0063] さらに本発明は、本発明のベクターを、該ベクター上の βァクチンプロモーターと同 じ動物目由来の宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞において所望の DNAを 発現させる方法に関する。
[0064] 動物目とは、生物分類のリンネ式階層分類にお!ヽて、綱の次下位、科階級群の上 位におかれる基本的階級あるいは、その階級にあるタクソンのことをいう。具体的な 動物目としては、例えば、ネズミ目、ゥサギ目、ハネジネズミ目、ッノ ィ目などを挙げる ことができるが、ネズミ目が好ましい。ネズミ目には、ノ、ムスター、ラット、マウス、モル モット、リス、ビーバーなどが含まれる。宿主細胞と同じ動物目由来の j8ァクチンプロ モーターを用いることにより、所望の遺伝子の発現量を増加させることが可能となる。
[0065] 又本発明は、本発明のベクターを、該ベクター上の βァクチンプロモーターと同じ 動物種由来の宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞において所望の DNAを発 現させる方法に関する。
[0066] 同じ動物種由来とは、宿主細胞がヒト細胞の場合にはヒト βァクチンプロモーターを 用い、宿主細胞がマウス細胞の場合にはマウス j8ァクチンプロモーターを用い、宿主 細胞がハムスター細胞の場合にはハムスター j8ァクチンプロモーターを用いることを いう。本方法によって、宿主細胞と同種由来の βァクチンプロモーターを用いること により、所望の遺伝子の発現量を増加させることが可能となる。
[0067] さらに本発明は、宿主細胞と同じ動物目由来の βァクチンプロモーターを用いるこ とを特徴とする所望の遺伝子の発現量を増加させる方法に関する。動物目とは、上 記に記載の定義による。宿主細胞と同じ動物目由来の βァクチンプロモーターを用 いることにより、所望の遺伝子の発現量を増加させることが可能となる。
[0068] 又、本発明は、宿主細胞と同じ動物種由来の βァクチンプロモーターを用いること を特徴とする所望の遺伝子の発現量を増加させる方法に関する。同じ動物種由来と は、上記に記載の定義による。宿主細胞と同じ動物種由来の j8ァクチンプロモータ 一を用いることにより、所望の遺伝子の発現量を増加させることが可能となる。
[0069] 又、本発明にお 、ては所望の DNAの発現量を増加させる目的で、トランスァクティ ベータ一を用いてもよい。トランスァクティベータ一は、トランスァクティベーターをコ ードする DNAを含むベクターを宿主細胞に導入し、培養時にトランスァクティベータ 一が発現するようにしてもょ ヽし、トランスァクティベータ一を培地に添加してもよ ヽ。 トランスァクティベータ一をコードする DNAは、所望のタンパク質をコードする DNAと 同一のベクター上に組み込んでもよいし、異なるベクターに組み込んで両方のベクタ 一を細胞に導入してもよい。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
実施例 [0070] 以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に 制限されるものではない。
[0071] 〔実施例 1〕 発現ベクター pmAct- Luc- neoの構築
( 1)マウス βァクチンプロモーターのクローニング
NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、及び JacKson laboratory、
http：〃 www. jax.org/)で公開されているマウスゲノム情報より、マウス βァクチンのシ 一ケンス情報を得た。以下に示す配列のプライマー mAct5-Fl (5'- GGGAGTGACTCTCTGTCCATTCAATCC - 3'Z配列番号： 9)および mAcr5- R1 ( 5'- TTGTCGACGACCAGCGCAGCGATATCG -3'/配列番号： 10)を合成し（エス ペックオリゴ社）、 PCRによってマウス 13ァクチンのプロモーター領域（1 ,577 bp)を増 幅した。試薬としてはタカラバイオ社の TaKaRa LA Taq with GC Buffer(cat.
RR02AG)、铸型 DNAにはクロンテック社の Mouse Genomic DNA(cat. 6650- 1)を使用 して PCRを行った。 PCR反応溶液の組成は、铸型 DNA(100ng/ml) l .O ^ U 2 X GC buffer I 25.0 μ 1、 dNTP Mixture 8.0 μ 1、 mAct5— Fl (10 μ M) 2.0 μ 1、 mAcr5— Rl (10 μ Μ) 2.0 1、 H O 11.5 /z 1、 LA Taq (5U/ μ 1) 0.5 μ 1である。また PCRの条件は、 95°Cで 1
2
分、「95°Cで 30秒、 60°Cで 30秒、 72°Cで 90秒」を 35サイクル、 72°Cで 7分にて終結させ る条件である。 PCRには Gene Amp PCR System 2400 (アプライドバイオシステム社） を用いた。増幅した PCR産物は 1%ァガロースゲルに電気泳動した後に、 l ,577bpの バンドを切り出し、 Mag Extractor (東洋紡社、 cat.NPK-601)で精製した。これを pGEM-T-Easy vector (プロメガ社、 cat.A1360)にクロー-ングし、シーケンスすること によって塩基配列を確認した。クローユングしたマウス /3ァクチン 5'領域を配列番号： 1に示す。
[0072] 公共のデータベースの配列では、 305番目力 始まる Tは 13個の連続である力 クロ 一ユングした領域は記載した配列の通り 14個の連続した Tであった。データベースと 配列が異なるが、これをそのまま実験に用いることにした。また、上記の配列中、斜体 で示した 414番目力 始まる CAAT、及び 475番目力 始まる TATAAは house keeping 遺伝子のプロモーター領域によく見出される配列であり、得られた領域はマウス βァ クチンのプロモーター領域であることが推察された。 [0073] クローユングした領域はマウスベータァクチンの開始コドン（上記配列中の 1543番 目力も始まる ATG)を含むこと、及びその後のベクター構築のために、プライマー mAct5-BG (5'- AGATCTGGGAGTGACTCTCTGTCCAT -3'/配列番号： 11、 Bgl IIサイトを含む）および mAct5- HN (5，- AAGCTTGGCGAACTATCAAGACACAA -3' Z配列番号： 12、 Hind ΠΙサイトを含む）を合成し (エスペックオリゴ社)、再度 PCRする ことによって必要な領域（1一 1542Z配列番号： 2)に Bgl 11 (5'末）、 Hind 111 (3'末)サイ トを付加した。
[0074] PCR反応溶液の組成は、铸型 DNA (約 10ng/ml) 1.0 1、 2 X GC buffer I 25.0 μ 1、 dNTP Mixture 8.0 μ 1、 mAct5— HN (10 M) 1 1、 mAct5— BG (10 M) 1.0 1、 H O
2
13.5 μ 1、 LA Taq (5U/ μ 1) 0.5 μ 1である。また PCRの条件は、 95°Cで 30秒、「95°Cで 30 秒、 60°Cで 30秒、 72°Cで 60秒」を 30サイクル、 72°Cで 7分にて終結させる条件である。 PCRには Gene Amp PCR System 2400 (アプライドバイオシステム社）を用いた。増幅 した PCR産物は前述のように pGEM- T- Easy vectorにクローユングし、シーケンス確 認を行った。こうして作製したマウス βァクチンフラグメントを pGL3-Basic (プロメガ社 、 cat. E1751)の Bgl II- Hind IIIサイトに組み込んだ。さらに、 pGL3- Basicはベクターに おける配列 4650位の Not Iサイトを BamH Iサイトに変換し、配列 2004位の BamH Iサイ トとの間のベクター骨格を、 pCXNベクターのベクター骨格 (BamH I- BamH Iフラグメ ント)と変換することで、ネオマイシン耐性遺伝子を導入し、 pmAct-Luc-neoとした（図 Doなお、 pGL3-Basicのベクター骨格を変換したベクターを、以下 pGLNベクターと 称する。
[0075] (2) WPREのクローユングと pmAct- WPRE- Luc- neoの作製
Woodchuck hepatitis virusゲノム配列 (GenBank Accession No. J04514)の 1093番目 力 1684番目の 592塩基が転写後調節領域 (WPRE)は、以下のように Assemble PCR 法を用いて増幅し、クローユングした。タカラバイオ社の TaKaRa Ex Taq (cat.
RR001B)を使用して、以下のような二つの条件系で PCRを行った。
[0076] < PCR反応 1 >
まず、反応溶液の組成：合成 DNA(WP-1— WP-6,各 lOuM,各 luL) 6.0 1、 10x Ex Taq buffer 5.0 μ 1、 dNTP Mixture 8.0 1、 H O 28.5 μ 1、 Ex Taq (5U/ μ 1) 0.5 ju l、反 応条件： 94°Cで 5分、「94°Cで 2分、 55°Cで 2分、 72°Cで 2分」を 2サイクル、により PCR 反応を行った。さらに、プライマー WP- f (lOuM) 1.0 μ 1、 WP-r2 (lOuM) 1.0 μ 1を添カロ し総量を 50,0 1とし、反応条件：「94°Cで 30秒、 55°Cで 30秒、 72°Cで 1分」で 30サイク ル、 72°Cで 5分、により PCR反応を行った。
[0077] < PCR反応 2 >
まず、反応溶液の組成：合成 DNA(WP-5— WP-17,各 lOuM,各 luL) 13.0 1、 10χ Ex Taq buffer 5.0 μ 1、 dNTP Mixture 8.0 1、 H O 21.5 μ 1、 Ex Taq (5U/ μ 1) 0.5 μ 1、
2
反応条件： 94°Cで 5分、「94°Cで 2分、 55°Cで 2分、 72°Cで 2分」を 2サイクル、により PCR反応を行った。さらに、プライマー WP— 12 (lOuM) 1.0 1、 WP— r (lOuM) l.OuLを 添カ卩し総量を 50,0 1とし、反応条件：「94°C 30秒、 55°C 30秒、 72°C 1分」で 30サイク ル、 72°C 5分、により PCR反応を行った。
[0078] PCRには Gene Amp PCR System 2400 (アプライドバイオシステム社）を用いた。増 幅した PCR産物は 1%ァガロースゲルに電気泳動した後に、反応 1は約 200bp、反応 2 は約 400bpのバンドを切り出し、 QIAquick Gel Extraction Kit (キアゲン社、 cat.28704 )で精製した。
[0079] 各反応産物を用いて、さらに PCRを行った。試薬は、タカラバイオ社の TaKaRa Ex Taq (cat. RROOIB)を使用した。反応溶液の組成:反応 1産物 1.0 1、反応 2産物 1.0 μ 1、 10x Ex Taq buffer 5.0 μ 1、 dNTP Mixture 8.0 μ 1、 WP-f (lOuM) 1.0 μ 1、 WP— r (lOuM) 1.0 /z 1、 H O 32.5 μ 1、 Ex Taq (5U/ μ 1) 0.5 μ 1、反応条件： 94°C 30秒、「94。C
2
15秒、 72°C 2分」を 5サイクル、「94°C 15秒、 70°C 2分」を 5サイクル、「94°C 15秒、 68 °C 2分」を 28サイクル、 72°C 5分、により PCR反応を行った。
[0080] 増幅した PCR産物は 1%ァガロースゲルに電気泳動した後に、約 600bpのバンドを切 り出し、 QIAquick Gel Extraction Kit (キアゲン社、 cat.28704)で精製した。反応産物 を pGEM- T- Easy vector (プロメガ社、 cat.A1360)にクロー-ングし、塩基配列を決定 した。 GenBank Accession No. J04514の 1093番目から 1684番目の配列と同じ配列で あることを確認した。 pGEM- T/WPREを Xbalで消化し、得られた WPRE断片を pmAct- Luc- neoの Xbal部位に挿入し、 pmAct- WPRE- Luc- neoを作製した。配列番 号： 3にクローユングした WPRE配列および使用した合成 DNAを、使用した合成 DNA ( 配列番号： 13から 33)を以下に示す。
く使用した合成 DNA>
WP-1:
AATC
列番号： 13)
WP-2: GCGTATCCACATAGCGTAAAAGGAG
CAACATAGTTAAGAATACCAGTCAA (配列番号： 14) WP-3:
ACGC
列番号： 15)
WP-4:
TTATノ
配列番号： 16)
WP-5:
TTCTi
列番号： 17)
WP-6:
GTGC
配列番号： 18)
WP-7:
CGTG
配列番号： 19)
WP-8:
GTCC
配列番号： 20)
WP-9: 配列番号： 21) WP-10:
TGTCC
配列番号： 22)
WP-11:
TTGCC
配列番号： 23)
WP-12:
CCATC
配列番号： 24)
WP-13:
TGACC
配列番号： 25)
WP-14:
GAGGC
配列番号： 26)
WP-15:
ACGTC
配列番号： 27)
WP-16:
GAGGC CGGGAAG (配列番号： 28)
WP-17:
CGCCTG (配列番号： 29)
WP-f: TCTAGAAATCAACCTCTGGATTACAAAATT (配列番号： 30) WP-r: TCTAGAAGGCGGGGAGGCGGCCCAAA (配列番号： 31) WP-12: ATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAG (配列番号： 32) WP-r2: GTGCACACCACGCCACGTTGCC (配列番号： 33) [0081] (3) phCMV- mAct- Luc- neoの作製
CMVェンハンサー領域（配列番号： 4)を pmAct- Luc- neoベクターの EcoR Iサイトに クロー-ングし、 phCMV- mAct- Luc- neoを完成させた（図 1)。
[0082] (4)比較対象となるベクターの構築
ヒト EF1 aプロモーターは DHFR- Δ E- RVh- PM1- f (参考文献 W092/19759)より CMVェンハンサーと共に pGLNベクターの MCSに組み込むことで、 pCEF- Luc- neoを 作製した（図 1)。実験に用いた全てのベクターは、キアゲン社の EndoFree Plasmid Maxi Kit (cat.12362)によって精製した。
[0083] 〔実施例 2〕ベクターの CHO細胞への導入および発現測定
( 1)ベクターの CHO細胞への導入
2 μ gのベクターをそれぞれ 20 μ 1の PLUS(tm) Reagent (インビトロジェン社、 Cat. No. 11514—015 )と混合し、 OPTI-MEM I Reduced-Serum Medium (インビトロジェン社、 Cat. No. 11058- 021)で容量を 200 /z lに調整し、室温で 15分間保温した。ここに、 LipofectAMINE (インビトロジェン社、 Cat. No. 18324-012；)を 20 μ 1、 OPTI-MEM I Reduced-Serum Mediumを 180 加え、室温でさらに 15分間保温した。 CHO細胞は 96well Cell Culture Cluster (コ一-ング社、 Cat. No. 3595)で 1ゥエルあたり 2 X 104 cells, 50 μ 1の OPTI- MEM I Reduced-Serum Mediumで調整した。上記で作製した DNA溶液 20 μ 1を CHO細胞に添カ卩し、 37°C、 3時間、 COインキュベーター内で培養
2
することで、ベクターを CHO細胞に導入した。その後、培養上清を静かに除き、 CHO 用の培地をカ卩えた。 CHO用の培地は、 CHO- S- SFMII培地（インビトロジェン社、 Cat. No. 12052-098)に 1/100量の HT Supplement (100 X ), liquid (インビトロジェン社、 Cat. No. 11067- 030)と、 1/100量の Penicillin- Streptomycin (インビトロジェン社製、 Cat. No. 15140-122)を添加することで作製したものを使用した。この状態のまま、 37 °C、 COインキュベーター内で 2日間培養した。
2
[0084] (2)ルシフ ラーゼ活性の測定
ルシフェラーゼ活性は、 Luciferase Assay System (プロメガ社、 Cat. No. E1501)を用 いて測定した。培地を除き、 1ゥエルあたりキットに添付されている 5 X Passive lysis bufferを 5倍に薄めたものを 100 μ 1加え、振とうすることで細胞を溶解した。その細胞 溶解液を Assay Plate Tissue Culture Treated White with Clear Bottom (コ一二ング 社、 Cat No. 437842)に 10 1ずつ移した。測定は MicroLuMAT (バートホールド社)を 用いて行い、データはソフト Window- Control Program LB96PV ver.1.24を用いて取 り込んだ。
[0085] 以上の測定の結果より、作製した pmAct- Luc- neoが pCEF- Luc- neoよりも有意に (pく 0.0009：対応のな!ヽ t検定)活性が高 、ことが明らかになった（図 2)。以上のことから、 本発明であるマウス βァクチンプロモーターは、既存の CEFプロモーターよりも強力 であることが示された。さらに、 WPREエレメントの付カ卩や、あるいは CMVェンハンサー を付加することによって、マウス j8ァクチンのプロモーター活性が有意に（ pmAct— WPRE— Luc— neoと pmAct— Luc— neoの比較： p〈0.0005、
phCMV- mAct- Luc- neoと pmAct- Luc- neoの比較： p〈0.0007：対応のな!ヽ t検定）亢進 することも明らかになった（図 3)。
[0086] 〔実施例 3〕 マウス C- H- ras遺伝子のクローユングおよび改変
(1)マウス c-H-ras遺伝子のクロー-ング
ヒト活性型 H- Rasがヒト 13ァクチンプロモーターを組み込んだ発現ベクターの発現効 率を亢進することは既に報告されている（Cytotechnology, Vol. 16, p.167-178, 1994 )。しかし、マウス j8ァクチンプロモーターに対する活性型 H- Ras、あるいは野生型の H-Ras,活性型 K-Rasの効果に関する報告は無いことから、マウス H-Ras (活性型、野 生型）、ヒト活性型 K-Rasのマウス 13ァクチンプロモーターに対する効果について検 討を行った。
[0087] NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)で公開されて 、る GenBank Accession No.
M30733の情報より、プライマー mRas- F1 (5'-
TCCTGGATTGGCAGCCGCTGTAGAAGC -3'/配列番号： 34)および mRas- R1 ( 5'- GTTCATCTGGCTAGCTGAGGTCACTGC -3'Z配列番号： 35)を合成し（エス ペックオリゴ社)、 PCRによってマウス c-H-ras遺伝子を増幅した。試薬としてはタカラ バイオ社の TaKaRa LA Taq with GC Buffer,铸型 cDNAにはクロンテック社の Embryo Marathon-Ready DNA dayl5(cat. 7459- 1)を使用して PCRを行った。
[0088] PCR反応溶液の組成は、铸型 DNA 1.0 1、 2 X GC buffer I 25.0 μ 1、 dNTP Mixture 8.0 μ 1、 mRas-Fl (10 μ M) 2.0 μ 1、 mRas-Rl (10 M) 2.0 1、 H O 11.5 1、 LA Taq (
2
5U/ μ 1) 0.5 μ 1である。また PCRの条件は、 95°Cで 60秒、「95°Cで 30秒、 60°Cで 30秒、 72°Cで 60秒」を 35サイクル、 72°Cで 7分にて終結させる条件である。 PCRには Gene Amp PCR System 2400 (アプライドバイオシステム社）を用いた。増幅した PCR産物は 1%ァガロースゲルに電気泳動した後に、 660bpのバンドを切り出し、 Mag Extractor ( 東洋紡社）で精製した。これを pGEM- T- Easy vector (プロメガ社）にクロー-ングし、 シーケンスすることによって塩基配列を確認した。確認したマウス c-H-rasの cDNA配 列を配列番号： 5に示す。データベースでは 62番目の塩基力 であった力 クロー二 ングした c-H-rasは Gあった。 NCBIのマウスゲノムデータベースで検索したところ、こ の部分の配列は Gであったので、そのまま実験に使用することにした。
[0089] (2)マウス C- H- rasの改変
CHO細胞で効率よくマウス C- H- Rasを発現させるために、プライマー RAS- ATG (5'- GCCACCATGACAGAATACAAGCTT - 3'Z配列番号： 36)および RAS- R2 (5'- TCAGGACAGCACACATTTGC -3'Z配列番号： 37)を用いた PCRによって、開始コ ドンの上流の配列を Kozak rule (Nicleic Acids Research, Vol.15(20), p.8125-8148, 1987)に従った配列に変換するとともに、タンパク質がコードされている 3'UTRを除去 した。試薬としてはタカラバイオ社の TaKaRa LA Taq(cat. RR002A)、铸型 cDNAには 先に pGEM-T- Easyベクターにクローユングしたマウス c-H- rasを铸型に用いて以下 のような条件系で PCRを行った。
[0090] PCR反応溶液の組成は、铸型 DNA 1.0 1、 10 X LA PCR buffer II(Mg2+free) 5.0 μ 1 、 dNTP Mixture 5.0 μ 1、 MgCl (25mM) 5.0 μ 1、 RAS— ATG (10 μ M) 2.0 μ 1、 RAS-R2 (
2
10 μ M) 2.0 1、 H O 29.5 μ 1、 LA Taq (5U/ μ 1) 0.5 μ 1である。また PCRの条件は、 95
2
°Cで 60秒、「95°Cで 30秒、 60°Cで 30秒、 72°Cで 60秒」を 35サイクル、 72°Cで 7分にて 終結させる条件である。 PCRには Gene Amp PCR System 2400 (アプライドバイオシス テム社)を用いた。増幅した PCR産物は 1%ァガロースゲルに電気泳動した後に、 576bpのバンドを切り出し、 Mag Extractor (東洋紡社)で精製した。これを
pGEM-T-Easy vector (プロメガ社）にクロー-ングし、シーケンスすることによって塩 基配列を確認した。改変したマウス c-H-rasの cDNA配列を配列番号： 6に示す。 [0091] (3)マウス活性型 H- Rasの作製
ストラタジーン社の QuikChange™ Site- Directe Mutagenesis Kit(cat.#200518)を用 V、て、上記のマウス c-H-rasに点変異（上の配列の下線を引 、た Gを Tに変換)を入 れることによって 12番目のアミノ酸をパリンに変換することで活性型 H- Rasを作製した 使用したプライマーは、 mRasV12-F (5'- GTGGTGGGCGCTGTAGGCGTGGGA AAG- 3'Z配列番号： 38)および、 mRasV12- R(5，-
CTTTCCCACGCCTACAGCGCCCACCAC- 3'Z配列番号： 39)であり、反応溶液 の組成：铸型 DNAゝ H- Ras/pGEM- T- Easy(10ng/ μ 1) 2.0 μ 1、 10 X reaction buffer 5.0 μ 1、 dNTP Mix 1.0 μ 1、 mRasV12— F (lOOng/ μ 1) 1.25 μ 1、 mRasV12- R(100ng/ μ 1) 1.25 1、 H O 38.5 μ 1、 PluTurbo DNA polymerase (2.5U/ ^ 1) 1.0 1、反応条件： 95
2
°Cで 30秒、「95°Cで 30秒、 55°Cで 1分、 68°Cで 7分 20秒」で 12サイクルにて PCR反応を 行った。 PCRには Gene Amp PCR System 2400を用いた。増幅した PCR産物をキット のマニュアルに従って、 Dpn I処理した後に大腸菌にトランスフォームした。そして、得 られた大腸菌からプラスミドを回収してシーケンスすることによって変異が導入されて いることを確認した。マウス活性型 H-Rasのアミノ酸配列を配列番号： 7に示す。
[0092] 同様にヒト活性型 K-Rasを準備した。実験に使用した K-Rasのアミノ酸配列を配列 番号: 8に示す。
これらの遺伝子は、すべて pCXNベクター（Gene, Vol.108, p.193- 200, 1991)に糸且 み込んで、それぞれを pCXN- H- Ras (マウス c- H- ras)、 pCXN- A- H- Ras (マウス活性 型 c- H- ras)、及び pCXN- A- K- Ras (ヒト活性型 K- ras)とした。
[0093] 〔実施例 4〕癌遺伝子産物 Rasのプロモーター活性への影響
(1)ベクターの CHO細胞への導入
CHO細胞に導入する 2 gのベクターは、以下のように 2種類、あるいは 3種類のベタ ターを、様々な割合で混合することで調整した (表 1)。実施例 2と同じ方法で CHO細 胞に導入し、ルシフェラーゼ活性を測定した。
[0094] [表 1] 10:1 100:1 1000:1 1:0 pmAct-Luc-neo 1 g 1 g 1 g 1 μ g pCXN-H Ras
もしくは
pCXN-A-H-Ras 0.1 u g 0.01 0.001 g
もしくは
pCXN-A-K-Ras
pCXN 0.9 μ g 0.99 M 0.999 g I ,"
Total g / g 2 β g 2 x g
[0095] この結果より、 pmAct— Luc— neoが pCXN— H— Ras (マウス c— H— ras)、 pCXN— A— H— Ras ( マウス活性型 c-H- ras)、及び pCXN- A- K- Ras (ヒト活性型 c- K- ras)の存在によって、 プロモーター活性が亢進することが明らかになった（図 4)。以上のことから、本発明で あるマウス j8ァクチンプロモーターは、癌遺伝子産物の Ras (活性型、野生型、 H- Ras 、 K-Rasを問わない）によってより強力な活性を付与されることが示された。
産業上の利用の可能性
[0096] これまでは、動物細胞でタンパク質を産生させるために使用されて!/、たベクターに は、 EF1 αプロモーター（W092/19759)や CMVプロモーターが使用されてきた。近 年、医薬品におけるバイオ製剤のシ アが大きくなり、特に多くの抗体医薬品が上巿 されるようになつてきた。抗体医薬品は、従来のエリスロポエチン、 G-CSF、インターフ ヱロンなどのサイト力インをバイオ製剤としていたものと比較して、大量の投与が必要 とされている。従って安価な抗体医薬品の安定な供給には、動物細胞で大量にタン ノ ク質を発現させることが必須となっている。本発明の方法は、従来の技術と比較し てタンパク質をより大量に産生させることを可能としたことから、産業上の観点から有 用性があるものと考えられる。また、抗体医薬の作製においては、抗原を動物に免疫 する過程が必要である力 こうした発現ベクターに抗原の遺伝子を組み込み、ベクタ 一そのものを動物に免疫することが可能であることが明らかになつてきた。本方法のメ リットは、抗原をタンパク質として精製する過程を省略できることにある。免疫過程に は、いかに多くの抗原がベクターを投与された動物個体内で産生されるかが重要で あり、従って発現ベクターが強力なものであるほど好ましい。モノクローナル抗体作製 には、マウスやラットが一般に用いられている力 本発明のベクターはこうした用途に 好適であると考えられる。さらに、ヒトにおいても遺伝子治療に使用されるベクターな どに組み込むことで、臨床に応用することも可能である。

Claims

請求の範囲
[I] ェンハンサ一に哺乳類 βァクチンプロモーターが機能的に結合した DNA構築物。
[2] ェンハンサ一がサイトメガロウィルス (CMV)である請求項 1に記載の DNA構築物。
[3] ェンノヽンサ■ ~~力 ^Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory
Element(WPRE)である請求項 1に記載の DNA構築物。
[4] 哺乳類 13ァクチンプロモーターがげつ歯類 j8ァクチンプロモーターである、請求項
1から 3の!、ずれかに記載の DNA構築物。
[5] CMVェンノ、ンサ一が配列番号: 4に記載の塩基配列力 なり、哺乳類 βァクチンプ 口モーターが配列番号： 2に記載の塩基配列からなる、請求項 2に記載の DNA構築 物。
[り」 Woodcnuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element(WPRE)力 S目 歹 lj 番号： 3に記載の塩基配列からなり、哺乳類 /3ァクチンプロモーターが配列番号： 2に 記載の塩基配列力 なる、請求項 3に記載の DNA構築物。
[7] 請求項 1から 6の 、ずれかに記載の DNA構築物を含むベクター。
[8] 哺乳類 βァクチンプロモーターの下流に所望の DNAが機能的に結合された DNAを 有する請求項 7に記載のベクター。
[9] トランスァクティベータ一をコードする DNAを発現可能に保持する、請求項 7または
8に記載のベクター。
[10] トランスァクティベータ一が癌遺伝子産物である請求項 9に記載のベクター。
[II] 癌遺伝子産物が Rasである、請求項 10に記載のベクター。
[12] 所望の DNA力 所望のタンパク質をコードする DNAである、請求項 8から 11のいず れかに記載のベクター。
[13] 請求項 8から 12のいずれかに記載のベクターを保持する細胞。
[14] 請求項 8から 12のいずれかに記載のベクターを保持し、癌遺伝子が活性化してい る細胞。
[15] 癌遺伝子が活性ィ匕している細胞力 トランスァクティベータ一をコードする遺伝子を 含むベクターが導入された細胞である請求項 14に記載の細胞。
[16] 癌遺伝子が活性ィ匕して 、る細胞が、癌化して 、る細胞である請求項 14に記載の細 胞。
[17] 哺乳動物細胞である、請求項 13から 16のいずれかに記載の細胞。
[18] げっ歯類細胞である、請求項 17に記載の細胞。
[19] βァクチンプロモーターと同じ動物目であることを特徴とする請求項 13から 18のい ずれかに記載の細胞。
[20] βァクチンプロモーターと同じ動物種であることを特徴とする請求項 19に記載の細 胞。
[21] 請求項 8から 12のいずれかに記載のベクターが導入されたトランスジエニック非ヒト 動物。
[22] 請求項 8から 12のいずれかに記載のベクターが導入された全能性細胞。
[23] 請求項 12に記載のベクターを保持する細胞を培養し、培養した細胞又は培地から 発現させたタンパク質を回収することを含む、所望のタンパク質の製造方法。
[24] 培地にトランスァクティベータ一を添加することを含む、請求項 23に記載の方法。
[25] 請求項 8から 12のいずれかに記載のベクターを、ベクター上の βァクチンプロモー ターと同じ動物目由来の宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞において所望の
DNAを発現させる方法。
[26] 請求項 8から 12のいずれかに記載のベクターを、ベクター上の βァクチンプロモー ターと同じ動物種由来の宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞において所望の
DNAを発現させる方法。
[27] 請求項 8に記載のベクターおよびトランスァクティベータ一をコードする DNAを発現 可能に保持するベクターを、請求項 8に記載のベクター上の βァクチンプロモーター と同種由来の宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞における所望の DNAを発現 させる方法。
[28] 宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項 25から 27のいずれかに記載の方法。
[29] 宿主細胞がげつ歯類細胞である、請求項 25から 27のいずれかに記載の方法。
[30] 宿主細胞と同じ動物目由来の βァクチンプロモーターを所望の DNAの上流に組み 込むことを特徴とする、所望の DNAの発現量を増加させる方法。
[31] 宿主細胞と同じ動物種由来の βァクチンプロモーターを所望の DNAの上流に組み 込むことを特徴とする、所望の DNAの発現量を増加させる方法。
[32] ェンノヽンサ一をさらに組み込むことを特徴とする請求項 30もしくは 31に記載の方法
[33] ェンノヽンサ■ ~~力 SWoodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory
Element(WPRE)である請求項 32記載の方法。
[34] ェンハンサ一が CMVェンハンサーである請求項 32に記載の方法。
[35] トランスァクティベータ一をコードする遺伝子を組み込むことを特徴とする請求項 30 力 34のいずれかに記載の方法。
[36] 宿主細胞が哺乳動物細胞である請求項 30から 35の 、ずれかに記載の方法。
[37] 宿主細胞がげつ歯類細胞である請求項 30から 35の 、ずれかに記載の方法。
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009072604A1 (ja) 2007-12-05 2009-06-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗nr10抗体、およびその利用
JP2010512782A (ja) * 2006-12-20 2010-04-30 ジ チャン ユウ， Ｈｉｖのｎｃ蛋白質発現用ベクター及びこれを利用したｎｃ蛋白質の生産方法
JP2010104326A (ja) * 2008-10-31 2010-05-13 Japan Health Science Foundation 加齢黄斑変性モデル動物、及び、その作成方法
WO2010064697A1 (ja) 2008-12-05 2010-06-10 中外製薬株式会社 抗nr10抗体、およびその利用
KR101038126B1 (ko) 2010-11-30 2011-05-31 주식회사 엘지생명과학 새로운 융합 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터
JP2014530634A (ja) * 2011-10-28 2014-11-20 ラボラトワール フランセ ドゥ フラクションマン エ デ バイオテクノロジーズＬａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｆｒａｎｃａｉｓ ＤｕＦｒａｃｔｉｏｎｎｅｍｅｎｔ Ｅｔ Ｄｅｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ 発現ベクターにおける転写単位およびその使用
JP2015523080A (ja) * 2012-07-10 2015-08-13 ヒプラ サイエンティフィック， エセ． エレ． ウ． マイコプラズマ・ハイオニューモニエを形質転換するためのベクター、形質転換されたマイコプラズマ・ハイオニューモニエの株、及びそれらの使用
WO2020059848A1 (ja) * 2018-09-20 2020-03-26 国立大学法人東京医科歯科大学 レンチウイルスベクター産生の増強方法
CN112481418A (zh) * 2020-12-25 2021-03-12 湖南丰晖生物科技有限公司 一种实时荧光定量pcr引物及其应用

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2986536A1 (fr) * 2012-02-08 2013-08-09 Lfb Biotechnologies Unites de transcription et leur utilisation dans des vecteurs d'expression (cho)
CN103525868B (zh) * 2013-10-17 2015-01-21 百泰生物药业有限公司 哺乳动物细胞高效表达载体的构建及应用
CN103525867B (zh) * 2013-10-17 2015-01-21 北京东方百泰生物科技有限公司 用于高表达细胞株开发的载体的构建及应用
CN105037560B (zh) * 2015-08-06 2019-02-05 中国农业科学院生物技术研究所 培育表达shTRAIL植物的方法
CN110484563B (zh) * 2019-07-25 2023-04-07 新乡医学院 哺乳动物细胞组合表达载体、表达系统、制备方法和应用
US11401531B2 (en) 2020-09-24 2022-08-02 University Of Massachusetts AAV vectors encoding NF1 and uses thereof

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0159878B2 (ja) 1982-05-21 1989-12-20 Yunibaashitei Obu Karifuorunia
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1992019759A1 (en) 1991-04-25 1992-11-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reconstituted human antibody against human interleukin 6 receptor
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1994002602A1 (en) 1992-07-24 1994-02-03 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
WO1994011523A2 (en) 1992-11-13 1994-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Fully impaired consensus kozac sequences for mammalian expression
WO1994025585A1 (en) 1993-04-26 1994-11-10 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
JPH07502510A (ja) * 1991-12-17 1995-03-16 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 嚢胞性繊維症膜貫通型コンダクタンス調節活性（ｃｆｔｒ）のための遺伝子治療
WO2000015764A2 (en) 1998-09-11 2000-03-23 University Of Edinburgh Propagation and/or derivation of embryonic stem cells
US20030072938A1 (en) * 1998-06-03 2003-04-17 Kappes John C. Trans-lentiviral vector particles and transduction of eukaryotic cells therewith
WO2005000888A2 (en) * 2003-06-24 2005-01-06 Genzyme Corporation NOVEL β-ACTIN AND RPS21 PROMOTERS AND USES THEREOF

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU629554B2 (en) * 1988-06-24 1992-10-08 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Exogenous gene expression vector containing chick beta-actin gene promoter
US5858784A (en) * 1991-12-17 1999-01-12 The Regents Of The University Of California Expression of cloned genes in the lung by aerosol- and liposome-based delivery
GB9415319D0 (en) 1994-07-29 1994-09-21 Medical Res Council HSV viral vector
DE19516776A1 (de) 1995-05-10 1996-11-14 Boehringer Ingelheim Int Chromatin-Regulatorgene
WO2002024932A2 (en) 2000-09-18 2002-03-28 Genzyme Corporation Expression vectors containing hybrid ubiquitin promoters
DE10128832A1 (de) 2001-06-15 2003-02-06 Jochen Reis Vektor und dessen Verwendung in gentherapeutischen Verfahren
EP1490113A4 (en) 2002-03-20 2007-05-02 Univ Florida ADENO-ASSOCIATED RECOMBINANT VIRAL VECTOR (RAAV) COMPOSITIONS AND CORRESPONDING METHODS FOR THE TREATMENT OF CHOROIDAL NEOVASCULARIZATION
WO2003093479A1 (en) 2002-05-01 2003-11-13 University Of Florida Research Foundation, Inc. Improved raav expression systems and methods for enhancing transduction of mammalian neural cells
AU2003234337B2 (en) 2002-05-02 2008-08-07 University Of Rochester Vectors having both isoforms of beta-hexosaminidase
US20030224477A1 (en) * 2002-05-31 2003-12-04 Heartlein Michael W. Optimized promoter constructs
AU2003277191A1 (en) 2002-10-01 2004-04-23 Duke University Targeted tumor therapy by use of recombinant adenovirus vectors that selectively replicate in hypoxic regions of tumors

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0159878B2 (ja) 1982-05-21 1989-12-20 Yunibaashitei Obu Karifuorunia
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1992019759A1 (en) 1991-04-25 1992-11-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reconstituted human antibody against human interleukin 6 receptor
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
JPH07502510A (ja) * 1991-12-17 1995-03-16 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 嚢胞性繊維症膜貫通型コンダクタンス調節活性（ｃｆｔｒ）のための遺伝子治療
WO1994002602A1 (en) 1992-07-24 1994-02-03 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
WO1994011523A2 (en) 1992-11-13 1994-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Fully impaired consensus kozac sequences for mammalian expression
WO1994025585A1 (en) 1993-04-26 1994-11-10 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US20030072938A1 (en) * 1998-06-03 2003-04-17 Kappes John C. Trans-lentiviral vector particles and transduction of eukaryotic cells therewith
WO2000015764A2 (en) 1998-09-11 2000-03-23 University Of Edinburgh Propagation and/or derivation of embryonic stem cells
WO2005000888A2 (en) * 2003-06-24 2005-01-06 Genzyme Corporation NOVEL β-ACTIN AND RPS21 PROMOTERS AND USES THEREOF

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DONIS J.A. ET AL.: "Comparison of expression of a series of mammalian vector promoters in the neuronal cell lines PC12 and HT4", BIOTECHNIQUES, vol. 15, no. 5, 1993, pages 786 - 787, XP008049562 *
JAFFE L. ET AL.: "Developmental failure of chimeric embryos expressing high levels of H-2Dd transplantation entigens", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 89, no. 13, 1992, pages 5927 - 5931, XP002987153 *
KIM T. ET AL.: "Gene transfer into bovine cells and embryos using replication-defective retroviral vectors encapsidated with xenotropic murine leukemia virus envelopes", ANIMAL BIOTECHNOLOGY, vol. 4, no. 1, 1993, pages 53 - 69, XP008049586 *
MORGENSTERN J.P. ET AL.: "A series of mammalian expression vectors and characterisation of their expression of a reporter gene in stably and transiently transfected cells", NUCLEIC ACID RES., vol. 18, no. 4, 1990, pages 1068, XP002987151 *
NUDEL U. ET AL.: "The nucleotide sequence of the rat cytoplasmic beta-actin gene", NUCLEIC ACID RES., vol. 11, no. 6, 1983, pages 1759 - 1771, XP002312115 *
XU Z.L. ET AL.: "Optimization of transcriptional regulatory elements for constructing plasmid vectors", GENE, vol. 272, no. 1-2, 2001, pages 149 - 156, XP002279973 *
YANO T. ET AL.: "Ras oncogene enhances the production of a recombinant protein regulated by the cytomegalovirus promoter in BHK-21 cells", CYTOTECHNOLOGY, vol. 16, no. 3, 1994, pages 167 - 178, XP008049587 *
ZUFFEREY R. ET AL.: "Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances expression of transgenes delivered by retroviral vectors", J. VIROL., vol. 73, no. 4, 1999, pages 2886 - 2892, XP000906913 *

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010512782A (ja) * 2006-12-20 2010-04-30 ジ チャン ユウ， Ｈｉｖのｎｃ蛋白質発現用ベクター及びこれを利用したｎｃ蛋白質の生産方法
EP3095862A1 (en) 2007-12-05 2016-11-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-nr10 antibody and use thereof
WO2009072604A1 (ja) 2007-12-05 2009-06-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗nr10抗体、およびその利用
JP2010104326A (ja) * 2008-10-31 2010-05-13 Japan Health Science Foundation 加齢黄斑変性モデル動物、及び、その作成方法
WO2010064697A1 (ja) 2008-12-05 2010-06-10 中外製薬株式会社 抗nr10抗体、およびその利用
EP2949672A1 (en) 2008-12-05 2015-12-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-nr10 antibody, and use thereof
US9234211B2 (en) 2010-11-30 2016-01-12 Lg Life Sciences Ltd. Hybrid promoter and recombinant vector comprising the same
KR101038126B1 (ko) 2010-11-30 2011-05-31 주식회사 엘지생명과학 새로운 융합 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터
JP2014530634A (ja) * 2011-10-28 2014-11-20 ラボラトワール フランセ ドゥ フラクションマン エ デ バイオテクノロジーズＬａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｆｒａｎｃａｉｓ ＤｕＦｒａｃｔｉｏｎｎｅｍｅｎｔ Ｅｔ Ｄｅｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ 発現ベクターにおける転写単位およびその使用
JP2015523080A (ja) * 2012-07-10 2015-08-13 ヒプラ サイエンティフィック， エセ． エレ． ウ． マイコプラズマ・ハイオニューモニエを形質転換するためのベクター、形質転換されたマイコプラズマ・ハイオニューモニエの株、及びそれらの使用
JP2019176861A (ja) * 2012-07-10 2019-10-17 ヒプラ サイエンティフィック， エセ． エレ． ウ． マイコプラズマ・ハイオニューモニエを形質転換するためのベクター、形質転換されたマイコプラズマ・ハイオニューモニエの株、及びそれらの使用
WO2020059848A1 (ja) * 2018-09-20 2020-03-26 国立大学法人東京医科歯科大学 レンチウイルスベクター産生の増強方法
JPWO2020059848A1 (ja) * 2018-09-20 2021-10-07 国立大学法人 東京医科歯科大学 レンチウイルスベクター産生の増強方法
JP7538531B2 (ja) 2018-09-20 2024-08-22 国立大学法人 東京医科歯科大学 レンチウイルスベクター産生の増強方法
CN112481418A (zh) * 2020-12-25 2021-03-12 湖南丰晖生物科技有限公司 一种实时荧光定量pcr引物及其应用

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