CN110996658B - 包含人源化asgr1基因座的非人动物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含人源化Asgr1基因座的非人动物细胞和非人动物，以及使用此类非人动物细胞和非人动物的方法。包含人源化Asgr1基因座的非人动物细胞或非人动物表达人ASGR1蛋白或其片段来自人ASGR1的Asgr1蛋白。本发明提供了关于使用包含人源化Asgr1基因座的此类非人动物，来评价人ASGR1介导的治疗性分子或治疗性复合物对肝的递送的体内功效，并且评价经由人ASGR1介导的机制起作用的治疗性分子或治疗性复合物的功效的方法。

Description

包含人源化ASGR1基因座的非人动物
技术领域
本发明涉及包含人源化Asgr1基因座的非人动物细胞和非人动物，以及使用此类非人动物细胞和非人动物的方法。
背景技术
对序列表的提及，所述序列表经由EFS WEB作为文本文件提交
写入文件10362WO01_ST25.txt的序列表为50千字节，于2018年6月26日创建，且在此以引用的方式并入。
由于治疗性分子对相关组织或器官的弱靶向，许多疾病未得到充分治疗。生物活性剂对受试者的递送经常由于组分难以到达靶细胞或组织而受阻。
细胞类型特异性内在化效应子，例如由靶细胞间接或直接内在化的细胞类型特异性受体，如人ASGR1，可以用于促进且增强治疗性分子对体内特定靶细胞的递送。类似地，此类细胞类型特异性内在化效应子可以适合于治疗目的，以促进靶细胞表面受体或靶性可溶性蛋白质在体内的内在化。然而，仍然需要合适的模型用于评价此类递送机制和治疗机制在体内的功效。
发明内容
本发明提供了包含人源化的Asgr1基因座，并且从人源化的Asgr1基因座表达人源化或嵌合ASGR1蛋白的非人动物，以及使用此类非人动物(例如啮齿类动物，例如大鼠或小鼠)、源自此类非人动物的细胞和/组织、以及可用于制备此类动物的核苷酸(例如靶向载体、基因组等)的方法。
在一个方面，本发明提供的是非人动物，其包含编码修饰的Asgr1蛋白的遗传修饰的内源Asgr1基因座，其中所述修饰的Asgr1蛋白包含胞质结构域、跨膜结构域和细胞外结构域，并且细胞外结构域的全部或部分由内源Asgr1基因座的区段编码，所述区段已被缺失且替换为直系同源人ASGR1序列。在一些此类非人动物中，细胞外结构域包含卷曲螺旋结构域和C型凝集素结构域，并且C型凝集素结构域的全部或部分由内源Asgr1基因座的区段编码，所述区段已被缺失且替换为直系同源人ASGR1序列。任选地，C型凝集素结构域是人ASGR1C型凝集素结构域。任选地，C型凝集素结构域包含SEQ ID NO:28中所示的序列。
在一些此类动物中，细胞外结构域包含卷曲螺旋结构域和C型凝集素结构域，并且卷曲螺旋结构域的全部或部分由内源Asgr1基因座的区段编码，所述区段已被缺失且替换为直系同源人ASGR1序列。任选地，卷曲螺旋结构域是人ASGR1卷曲螺旋结构域。任选地，卷曲螺旋结构域包含SEQ ID NO:27中所示的序列。
在一些此类动物中，卷曲螺旋结构域和C型凝集素结构域两者的全部或部分由内源Asgr1基因座的区段编码，所述区段已被缺失且替换为直系同源人ASGR1序列。任选地，C型凝集素结构域是人ASGR1C型凝集素结构域，并且卷曲螺旋结构域是人ASGR1卷曲螺旋结构域。任选地，C型凝集素结构域包含SEQ ID NO:28中所示的序列，并且卷曲螺旋结构域包含SEQ ID NO:27中所示的序列。
在一些此类动物中，直系同源人ASGR1序列包含人ASGR1基因的外显子3-8。任选地，直系同源人ASGR1序列编码包含SEQ ID NO:31中所示序列的ASGR1蛋白区段。
在一些此类动物中，胞质结构域的全部或部分由内源性非人动物Asgr1序列编码。在一些此类动物中，跨膜结构域的全部或部分由内源性非人动物Asgr1序列编码。任选地，胞质结构域和跨膜结构域两者的全部或部分由内源性非人动物Asgr1序列编码。
在另一个方面，本发明提供的是包含人源化Asgr1基因座、以及包含其的体外组合物的非人动物细胞或组织(例如非人肝细胞、非人胚胎干(ES)细胞或其它多能细胞，例如生殖细胞)。在一个方面，本发明提供的是非人动物细胞，其包含编码修饰的Asgr1蛋白的遗传修饰的内源Asgr1基因座，其中所述修饰的Asgr1蛋白包含胞质结构域、跨膜结构域和细胞外结构域，并且细胞外结构域的全部或部分由内源Asgr1基因座的区段编码，所述区段已被缺失且替换为直系同源人ASGR1序列。在一些此类非人动物细胞中，细胞外结构域包含卷曲螺旋结构域和C型凝集素结构域，并且C型凝集素结构域的全部或部分由内源Asgr1基因座的区段编码，所述区段已被缺失且替换为直系同源人ASGR1序列。任选地，C型凝集素结构域是人ASGR1C型凝集素结构域。任选地，C型凝集素结构域包含SEQ ID NO:28中所示的序列。
在一些此类非人动物细胞中，细胞外结构域包含卷曲螺旋结构域和C型凝集素结构域，并且卷曲螺旋结构域的全部或部分由内源Asgr1基因座的区段编码，所述区段已被缺失且替换为直系同源人ASGR1序列。任选地，卷曲螺旋结构域是人ASGR1卷曲螺旋结构域。任选地，卷曲螺旋结构域包含SEQ ID NO:27中所示的序列。
在一些此类非人动物细胞中，卷曲螺旋结构域和C型凝集素结构域两者的全部或部分由内源Asgr1基因座的区段编码，所述区段已被缺失且替换为直系同源人ASGR1序列。任选地，C型凝集素结构域是人ASGR1C型凝集素结构域，并且卷曲螺旋结构域是人ASGR1卷曲螺旋结构域。任选地，C型凝集素结构域包含SEQ ID NO:28中所示的序列，并且卷曲螺旋结构域包含SEQ ID NO:27中所示的序列。
在一些此类非人动物细胞中，直系同源人ASGR1序列包含人ASGR1基因的外显子3-8。任选地，直系同源人ASGR1序列编码包含SEQ ID NO:31中所示序列的ASGR1蛋白区段。
在一些此类非人动物细胞中，胞质结构域的全部或部分由内源性非人动物Asgr1序列编码。在一些此类动物细胞中，跨膜结构域的全部或部分由内源性非人动物Asgr1序列编码。任选地，胞质结构域和跨膜结构域两者的全部或部分由内源性非人动物Asgr1序列编码。
一些此类动物和/或动物细胞对于遗传修饰的内源Asgr1基因座是杂合的。一些此类动物和/或动物细胞对于遗传修饰的内源Asgr1基因座是纯合的。
一些此类非人动物和/或动物细胞是哺乳动物和/或哺乳动物细胞。任选地，哺乳动物是啮齿类动物。任选地，啮齿类动物是大鼠或小鼠。任选地，啮齿类动物是小鼠。任选地，胞质结构域的全部或部分由内源性小鼠Asgr1序列编码。任选地，胞质结构域包含SEQID NO:29中所示的序列。任选地，跨膜结构域的全部或部分由内源性小鼠Asgr1序列编码。任选地，跨膜结构域包含SEQ ID NO:30中所示的序列。任选地，胞质结构域和跨膜结构域两者的全部或部分由内源性小鼠Asgr1序列编码。任选地，胞质结构域包含SEQ ID NO:29中所示的序列，并且跨膜结构域包含SEQ ID NO:30中所示的序列。任选地，细胞外结构域包含卷曲螺旋结构域和C型凝集素结构域，并且其中卷曲螺旋结构域和C型凝集素结构域两者的全部或部分由内源Asgr1基因座的区段编码，所述区段已被缺失且替换为直系同源人ASGR1序列，并且胞质结构域和跨膜结构域两者的全部或部分由内源性小鼠Asgr1序列编码。任选地，C型凝集素结构域是人ASGR1C型凝集素结构域，且卷曲螺旋结构域是人ASGR1卷曲螺旋结构域，胞质结构域是小鼠Asgr1胞质结构域，且跨膜结构域是小鼠Asgr1跨膜结构域。任选地，C型凝集素结构域包含SEQ ID NO:28中所示的序列，卷曲螺旋结构域包含SEQ ID NO:27中所示的序列，胞质结构域包含SEQ ID NO:29中所示的序列，且跨膜结构域包含SEQ IDNO:30中所示的序列。任选地，修饰的Asgr1蛋白包含SEQ ID NO:3中所示的序列。
在另一个方面，本发明提供的是评价治疗性复合物在体内经由人ASGR1介导的内在化对肝的递送的方法。一些此类方法包括：(a)将治疗性复合物施用于上述非人动物中的任一种，其中所述治疗性复合物包含治疗性分子和特异性结合人ASGR1的抗原结合蛋白或配体；并且(b)评价治疗性分子对非人动物的肝的递送。任选地，治疗性分子是溶酶体替代蛋白或酶或者编码溶酶体替代蛋白或酶的核酸，并且步骤(b)包括评价溶酶体替代蛋白或酶在非人动物的肝中的存在或活性。任选地，治疗性分子是编码治疗性分泌蛋白的核酸，并且步骤(b)包括评价治疗性分泌蛋白在非人动物中的血清水平或活性。
在另一个方面，本发明提供的是评价靶向肝中的肝细胞表面蛋白或可溶性蛋白的治疗性分子在体内经由人ASGR1内在化的功效的方法。一些此类方法包括：(a)将治疗性分子施用于上述非人动物中的任一种，其中所述治疗性分子包含特异性结合肝细胞表面蛋白或可溶性蛋白、并且特异性结合人ASGR1的双特异性抗原结合蛋白；并且(b)评价肝细胞表面蛋白在非人动物的肝中的细胞表面水平或活性，或者评价可溶性蛋白在非人动物的肝中的表达或活性。
在另一个方面，本发明提供的是核酸，例如用于产生如本文所述的人源化Asgr1基因座的靶向载体、表达人源化或嵌合ASGR1蛋白的内源性非人动物Asgr1基因座、和/或如本文所述的包含人Asgr1基因座的非人动物基因组。一些此类核酸包含选自SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23及其组合的序列。一些此类核酸包含编码如SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的序列，例如包含如SEQ ID NO:24中所示的序列。
附图说明
专利或申请文件含有至少一张彩色附图。应要求并支付必要费用后，向专利局提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。
图1A显示了人ASGR1基因座的示意图。八个外显子由黑色方框指示，非翻译区(UTR)由白色方框指示，并且跨膜、卷曲螺旋和C型凝集素结构域在图的顶部处指示。星号指示用于等位基因获得测定的上游(7302hTU)和下游(7302hTD)引物的位置。待插入小鼠Asgr1基因座内用于人源化的片段显示于底部处。
图1B显示了小鼠Asgr1基因座的示意图。八个外显子由黑色方框指示，UTR由白色方框指示，并且跨膜、卷曲螺旋和C型凝集素结构域在图的顶部处指示。星号指示用于等位基因丧失测定的上游(7302mTU)和下游(7302mTD)引物的位置。待缺失且替换为来自人ASGR1基因座的相应片段的片段显示于底部处。
图2A显示了用于生成含有潮霉素抗性自缺失盒的人源化Asgr1等位基因(7302等位基因)的大型靶向载体的示意图。小鼠外显子由灰色方框指示，人外显子由黑色方框指示，且UTR由白色方框指示。不同区域之间的边界(小鼠/人、人/盒和盒/小鼠)分别由在图的底部处标记为A、B和C的线指示。
图2B显示了图2A中的人源化Asgr1等位基因的盒缺失形式的示意图。小鼠外显子由灰色方框指示，人外显子由黑色方框指示，且UTR由白色方框指示。不同区域之间的边界(5'小鼠/人边界、3'人/小鼠边界)分别由在图的底部处标记为A和D的线指示。
图3显示了人ASGR1蛋白(hASGR1；SEQ ID NO:1)、小鼠Asgr1蛋白(mAsgr1；SEQ IDNO:2)、以及人源化小鼠Asgr1蛋白(7302humIn；SEQ ID NO:3)的比对。加下划线的残基是由引入的人外显子编码的残基。加方框的残基构成跨膜结构域。虚线表示C型凝集素结构域。粗实线表示卷曲螺旋区域。
图4显示了人源化的Asgr1小鼠(Asgr1hu/hu)具有与其野生型(Asgr1+/+)同窝仔畜相似的血浆脂质谱(包括总胆固醇、甘油三酯、LDL-C和HDL-C)。
图5显示了人源化的Asgr1小鼠(Asgr1hu/hu)具有与其野生型同窝仔畜相似的体重和血糖。
图6显示了类似于小鼠Asgr1，人源化的Asgr1小鼠(Asgr1hu/hu)中的人源化Asgr1蛋白共定位至肝膜。转铁蛋白受体(TRFR)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)分别用作肝的膜和细胞溶质级分的加载对照。N＝4/所示的组。
图7显示了人ASGR1蛋白(SEQ ID NO:1)，食蟹猴(Macaca fascicularis)(cyno)(SEQ ID NO:39)、小鼠Asgr1蛋白(SEQ ID NO:2)和大鼠Asgr1蛋白(SEQ ID NO:41)的比对。加下划线的残基是由引入的人外显子编码的残基。在人与cyno ASGR1蛋白之间存在97.6％的序列同一性(细胞外结构域中98.3％的序列同一性)，在人与小鼠ASGR1蛋白之间存在77％的序列同一性，并且在人与大鼠ASGR1蛋白之间存在78.4％的序列同一性。
图8A-8C提供了在用1x1011野生型scAAV2-CMV-eGFP(i、v)、盐水(ii、vi)、1x1011单独的scAAV2-N587myc-CMV-eGFP病毒载体(iii、vii)、或具有双特异性抗myc-ASGR1抗体的scAAV2-N587myc-CMV-eGFP病毒载体(iv、viii)静脉内注射后十天，取自转基因修饰为通过肝细胞表达人ASGR1的C57BL/6小鼠(i-iv)或野生型C57BL/6小鼠(v-viii)的肝(A)、脾(B)或肾(C)样品的免疫荧光显微镜检查图像。
图9A-9R提供了在用2.18x1011野生型scAAV2-CAGG-eGFP(图9B、9C、9E、9F)、盐水(图9A、9D)、2.18x1011单独的ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP病毒载体(图9G-9I、9J-9L)、或具有双特异性抗myc-ASGR1抗体的ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP病毒载体(图9M-9O、9P-9R)静脉内注射后四周，取自转基因修饰为通过肝细胞表达人ASGR1的C57BL/6小鼠(图9D-9F、9J-9L、9P-9R)或野生型C57BL/6小鼠(图9A-9C、9G-9I、9M-9O)的肝样品的免疫荧光显微镜检查图像。每个图像代表一只小鼠。
定义
本文可互换使用的术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”包括任何长度的氨基酸的聚合形式，包括编码的和非编码的氨基酸以及化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸。该术语还包括已进行修饰的聚合物，例如具有修饰的肽主链的多肽。术语“结构域”指具有特定功能或结构的蛋白质或多肽的任何部分。
蛋白质被说成具有“N末端”和“C末端”。术语“N末端”指蛋白质或多肽的起始，由具有游离胺基(-NH2)的氨基酸终止。术语“C末端”指氨基酸链(蛋白质或多肽)的末端，由游离羧基(-COOH)终止。
本文可互换使用的术语“核酸”和“多核苷酸”包括任何长度的核苷酸的聚合形式，包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或其类似物或修饰形式。它们包括单链、双链和多链DNA或RNA，基因组DNA，cDNA，DNA-RNA杂交体，以及包含嘌呤碱基，嘧啶碱基或者其它天然、化学修饰、生物化学修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。
核酸被说成具有“5’末端”和“3’末端”，因为单核苷酸以这样的方式反应以制备寡核苷酸，使得一个单核苷酸戊糖环的5'磷酸盐经由磷酸二酯键合附着至其在一个方向上的邻居的3'氧。如果寡核苷酸的5’磷酸盐未与单核苷酸戊糖环的3'氧连接，则将寡核苷酸的末端称为“5’末端”。如果寡核苷酸的3'氧未与另一个单核苷酸戊糖环的5'磷酸盐连接，则将寡核苷酸的末端称为“3’末端”。即使是对于较大的寡核苷酸内部的核酸序列，也可以被说成具有5'末端和3’末端。在线性或环状DNA分子中，不连续元件称为5'元件的“下游”或3'元件的“下游”。
术语“基因组整合的”指这样的核酸，其已被引入细胞内，使得核苷酸序列整合到细胞的基因组内，并且能够被其子代遗传。任何方案都可以用于将核酸稳定整合到细胞的基因组内。
术语“靶向载体”指这样的重组核酸，其可以通过同源重组、非同源末端连接介导的连接、或以任何其它重组手段引入细胞的基因组中的靶位置。
术语“病毒载体”指重组核酸，其包括至少一个病毒起源的元件，并且包括足以或允许包装到病毒载体颗粒内的元件。该载体和/或颗粒可以用于将DNA、RNA或其它核酸离体或体内转移到细胞内的目的。众多形式的病毒载体是已知的。
术语“野生型”包括具有如在正常(与突变、患病、改变等等形成对比)状态或背景下发现的结构和/或活性的实体。野生型基因和多肽经常以多重不同形式(例如等位基因)存在。
术语“内源”指天然存在于细胞或非人动物内的核酸序列。例如，非人动物的内源Asgr1序列指天然存在于非人动物中的Asgr1基因座处的天然Asgr1序列。
“外源”分子或序列包括通常不以该形式存在于细胞中的分子或序列。正常存在包括关于细胞的特定发育阶段和环境条件的存在。例如，外源分子或序列可以包括细胞内的相应内源序列的突变形式，例如内源序列的人源化形式，或者可以包括与细胞内的内源序列相对应，但以不同形式(即，不在染色体内)的序列。相比之下，内源分子或序列包括在特定环境条件下、在特定发育阶段、在特定细胞中通常以该形式存在的分子或序列。
当在核酸或蛋白质的上下文中使用时，术语“异源的”指示该核酸或蛋白质包含通常不在相同分子中一起存在的至少两个部分。例如，当关于核酸的一部分或蛋白质的一部分使用时，术语“异源的”指示该核酸或蛋白质包含在自然界中未发现处于彼此的相同关系中(例如，连接在一起)的两个或更多个子序列。作为一个例子，核酸载体的“异源”区域是在自然界中未发现与另一种分子结合的、在另一种核酸分子内或附着至另一种核酸分子的核酸的区段。例如，核酸载体的异源区域可以包括侧翼为在自然界中未发现与编码序列结合的序列的编码序列。同样地，蛋白质的“异源”区域是在自然界中未发现与另一种肽分子结合的、在另一种肽分子内或附着至另一种肽分子的氨基酸的区段(例如，融合蛋白或具有标签的蛋白质)。类似地，核酸或蛋白质可以包含异源标记或者异源分泌序列或定位序列。
“密码子优化”利用密码子的简并性，如通过指定氨基酸的三碱基对密码子组合的多样性显示出的，并且一般包括通过用宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子替换天然序列的至少一个密码子，同时维持天然氨基酸序列，修饰核酸序列用于在特定宿主中的增强表达的过程。例如，可以修饰编码Cas9蛋白的核酸，以取代与天然存在的核酸序列相比、在给定的原核或真核细胞中具有更高使用频率的密码子，所述原核或真核细胞包括细菌细胞、酵母细胞、人细胞、非人细胞、哺乳动物细胞、啮齿类动物细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、仓鼠细胞或任何其它宿主细胞。密码子使用表例如在“密码子使用数据库(Codon UsageDatabase)”处可容易获得。这些表可以通过多种方式进行修改。参见Nakamura等人(2000)Nucleic Acids Research 28:292，其以引用的方式整体并入本文用于所有目的。用于在特定宿主中表达的特定序列的密码子优化的计算机算法也是可获得的(参见例如，GeneForge)。
术语“基因座”指基因(或重要序列)、DNA序列、多肽编码序列的特定定位、或在生物的基因组的染色体上的位置。例如，“Asgr1基因座”可以指Asgr1基因、Asgr1DNA序列、Asgr1编码序列的特定定位、或在生物的基因组的染色体上的Asgr1位置，其已关于此类序列位于其中的位置进行鉴定。“Asgr1基因座”可以包含Asgr1基因的调节元件，包括例如增强子、启动子、5'和/或3'非翻译区(UTR)或其组合。
术语“基因”指染色体中的DNA序列，其编码产物(例如，RNA产物和/或多肽产物)，并且包括被非编码内含子中断的编码区、以及在5'和3'末端两者上与编码区相邻的序列，使得该基因对应于全长mRNA(包括5'和3'非翻译序列)。术语“基因”还包括其它非编码序列，包括调节序列(例如，启动子、增强子和转录因子结合位点)、聚腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点、沉默子、绝缘序列和基质附着区。这些序列可能靠近基因的编码区(例如，在10kb内)或在遥远位点处，并且它们影响基因的转录和翻译水平或速率。
术语“等位基因”指基因的变体形式。一些基因具有各种不同形式，其定位于染色体上的相同位置或遗传基因座处。二倍体生物在每个基因基因座处上具有两个等位基因。每对等位基因代表特定基因基因座的基因型。如果在特定基因座处存在两个相同的等位基因，则基因型被描述为纯合的；如果两个等位基因不同，则被描述为杂合的。
“启动子”是DNA的调节区，其通常包含能够指导RNA聚合酶II在特定多核苷酸序列的适当转录起始位点处起始RNA合成的TATA盒。启动子可以另外包含影响转录起始速率的其它区域。本文公开的启动子序列调节可操作地连接的多核苷酸的转录。启动子可以在本文公开的一种或多种细胞类型(例如，真核细胞、非人哺乳动物细胞、人细胞、啮齿类动物细胞、多能细胞、单细胞期胚胎、分化细胞或其组合)中是活跃的。启动子可以是例如组成型活性启动子、条件启动子、诱导型启动子、时间受限的启动子(例如，发育调节的启动子)或空间受限的启动子(例如，细胞特异性或组织特异性启动子)。启动子的例子可以例如在WO2013/176772中发现，所述专利以引用的方式整体并入本文用于所有目的。
“可操作的连接”或“可操作地连接”包括两个或更多个组分(例如启动子和另一个序列元件)这样的并置，使得两个组分均正常起作用，并且允许至少一个组分可以介导对其它组分中的至少一个发挥的功能的可能性。例如，如果启动子响应一种或多种转录调节因子的存在或不存在而控制编码序列的转录水平，则该启动子可以与编码序列可操作地连接。可操作的连接可以包括彼此邻接或反式起作用的此类序列(例如，调节序列可在一定距离处起作用，以控制编码序列的转录)。
术语“变体”指不同于群体中最普遍的序列(例如，相差一个核苷酸)的核苷酸序列，或不同于群体中最普遍的序列(例如，相差一个氨基酸)的蛋白质序列。
当涉及蛋白质时，术语“片段”意指比全长蛋白质更短或具有更少氨基酸的蛋白质。当涉及核酸时，术语“片段”意指比全长核酸更短或具有更少核苷酸的核酸。片段可以是例如N末端片段(即去除蛋白质的C末端的一部分)、C末端片段(即，去除蛋白质的N末端的一部分)、或内部片段。
在两个多核苷酸或多肽序列的上下文中，“序列同一性”或“同一性”指当在指定的比较窗上就最大对应性进行比对时，两个序列中相同的残基。当序列同一性的百分比提及蛋白质使用时，并不相同的残基位置经常因保守的氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被具有相似化学特性(例如电荷或疏水性)的其它氨基酸残基取代，且因此不改变分子的功能特性。当序列在保守取代中不同时，可以向上调整序列同一性百分比，以校正取代的保守性质。通过此类保守取代而不同的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行这种调整的方法是众所周知的。通常，这涉及将保守取代评分为部分错配而不是完全错配，从而增加序列同一性百分比。因此，例如，当相同氨基酸给予得分1，而非保守取代给予得分零时，保守取代给予在零至1之间的得分。例如，如程序PC/GENE(Intelligenetics,MountainView,California)中实现的计算保守取代的得分。
“序列同一性百分比”包括通过在比较窗中比较两个最佳比对的序列(完全匹配残基的最大数目)而确定的值，其中在比较窗中的多核苷酸序列的部分可以包含与参考序列(其不包含添加或缺失)相比的添加或缺失(即，缺口)，用于两个序列的最佳比对。该百分比通过以下来计算：测定在其处相同的核酸碱基或氨基酸残基在两个序列中出现的位置数目，以得出匹配位置数目，将匹配位置数目除以比较窗中的位置总数目，并且将结果乘以100，以得出序列同一性的百分比。除非另有说明(例如，较短的序列包括连接的异源序列)，否则比较窗是待比较的两个序列中的较短者的全长。
除非另有说明，否则序列同一性/相似性值包括使用GAP版本10使用下述参数获得的值：关于核苷酸序列的％同一性和％相似性，使用GAP权重50和长度权重3以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；关于氨基酸序列的％同一性和％相似性，使用GAP权重8和长度权重2以及BLOSUM62评分矩阵；或其任何等价程序。“等价程序”包括任何序列比较程序，当与通过GAP版本10生成的相应比对相比较时，对于所讨论的任何两个序列，所述序列比较程序生成具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的序列百分比同一性的比对。
术语“保守氨基酸取代”指序列中通常存在的氨基酸被具有相似大小、电荷或极性的不同氨基酸取代。保守取代的例子包括非极性(疏水性)残基，例如异亮氨酸、缬氨酸或亮氨酸被另一个非极性残基的取代。同样，保守替换的实例包括对另一种极性(亲水性)残基(诸如精氨酸与赖氨酸)之间的替代、谷氨酰胺与天冬酰胺之间或甘氨酸与丝氨酸之间的替代。另外，对另一种酸性残基，诸如赖氨酸、精氨酸或组氨酸，或者一种酸性残基(诸如天冬氨酸或谷氨酸)的取代是保守替代的另外实例。非保守替代的实例包括对非极性(疏水性)氨基酸残基诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸或甲硫氨酸进行取代，所述极性(亲水性)残基诸如半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或赖氨酸和/或极性残基用于非极性残基。典型的氨基酸分类概括于下文。
“同源”序列(例如，核酸序列)包括与已知参考序列相同或基本上相似的序列，使得它与已知参考序列例如至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同。同源序列可以包括例如直系同源序列和旁系同源序列。同源基因例如通常通过物种形成事件(直系同源基因)或遗传复制事件(旁系同源基因)，遗传自共同的祖先DNA序列。“直系同源”基因包括通过物种形成由共同的祖先基因进化的在不同物种中的基因。直系同源物通常在进化过程中保留相同的功能。“旁系同源”基因包括通过基因组内的复制相关的基因。旁系同源物可以在进化过程中进化出新功能。
术语“体外”包括人工环境，以及在人工环境(例如，试管)内发生的过程或反应。术语“体内”包括自然环境(例如，细胞或生物或机体)，以及在自然环境内发生的过程或反应。术语“离体”包括已从个体体内取出的细胞，以及在此类细胞内发生的过程或反应。
术语“报道基因”指具有编码基因产物(通常是酶)的序列的核酸，当包含与异源启动子和/或增强子元件可操作地连接的报道基因序列的构建体，被引入含有(或其可以制备为含有)启动子和/或增强子元件活化所必需的因子的细胞内时，所述核酸很容易且可定量地测定。报道基因的例子包括但不限于编码β-半乳糖苷酶(lacZ)的基因，细菌氯霉素乙酰转移酶(cat)基因，萤火虫萤光素酶基因，编码β-葡糖醛酸酶(GUS)的基因和编码荧光蛋白的基因。“报道蛋白”指由报道基因编码的蛋白质。
如本文使用的，术语“荧光报道蛋白”意指基于荧光可检测的报道蛋白，其中荧光可以直接来自报道蛋白、报道蛋白对荧光底物的活性、或对于与加上荧光标签的化合物结合具有亲和力的蛋白质。荧光蛋白的例子包括绿色荧光蛋白(例如GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、eGFP、Emerald、Azami Green、Monomeric Azami Green、CopGFP、AceGFP和ZsGreenl)，黄色荧光蛋白质(例如YFP、eYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP和ZsYellowl)，蓝色荧光蛋白(例如BFP、eBFP、eBFP2、Azurite、mKalamal、GFPuv、Sapphire和T-sapphire)，青色荧光蛋白(例如CFP、eCFP、Cerulean、CyPet、AmCyanl和Midoriishi-Cyan)，红色荧光蛋白(例如RFP、mKate、mKate2、mPlum、DsRed monomer、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed-Monomer、HcRed-Tandem、HcRedl、AsRed2、eqFP611、mRaspberry、mStrawberry和Jred)，橙色荧光蛋白(例如mOrange、mKO、Kusabira-Orange、MonomericKusabira-Orange、mTangerine和tdTomato)，以及其在细胞中的存在可以通过流式细胞术方法检测的任何其它合适的荧光蛋白。
术语“重组”包括在两个多核苷酸之间交换遗传信息的任何过程，并且可以通过任何机制发生。响应双链断裂(DSB)的重组主要通过两个保守的DNA修复途径发生：非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HR)。参见Kasparek&Humphrey(2011)Seminars in Cell&Dev.Biol.22:886-897，其以引用的方式整体并入本文用于所有目的。同样地，由外源供体核酸介导的靶核酸的修复可以包括在两个多核苷酸之间交换遗传信息的任何过程。
NHEJ包括通过断裂末端彼此的直接连接或无需同源模板与外源序列的直接连接，来修复核酸中的双链断裂。NHEJ包括通过断裂末端彼此的直接连接或无需同源模板与外源序列的直接连接，来修复核酸中的双链断裂。非邻接序列通过NHEJ的连接经常可以导致接近双链断裂位点的缺失、掺入或易位。例如，NHEJ还可以通过断裂末端与外源供体核酸的末端的直接连接，导致外源供体核酸的靶向整合(即，基于NHEJ的捕获)。当同源性指导的修复(HDR)途径不易使用时(例如，在非分裂细胞、原代细胞、以及弱执行基于同源性的DNA修复的细胞)，此类NHEJ介导的靶向整合对于外源供体核酸的插入可以是优选的。另外，与同源性指导的修复形成对比，不需要关于侧接切割位点的序列同一性的大区域的了解，当尝试靶向插入具有关于其存在基因组序列的有限了解的基因组的生物内时，这可以是有益的。整合可以经由在外源供体核酸与切割的基因组序列之间平端连接、或经由使用侧翼为突出端(所述突出端与在切割的基因组序列中由核酸酶试剂生成的那些相容)的外源供体核酸的粘性末端(即具有5'或3'突出端)连接来进行。参见例如，US2011/020722、WO 2014/033644、WO 2014/089290和Maresca等人(2013)GenomeRes.23(3):539-546，其各自以引用的方式整体并入本文用于所有目的。如果连接平端，则可能需要靶和/或供体切除，以生成片段连接所需的微同源区域，其可能在靶序列中产生不需要的改变。
重组也可以经由同源性指导的修复(HDR)或同源重组(HR)发生。HDR或HR包括核酸修复形式，其可能需要核苷酸序列同源性，使用“供体”分子作为用于修复“靶”分子(即，经历双链断裂的分子)的模板，并且导致遗传信息从供体转移到靶。不希望受到任何特定理论的束缚，此类转移可以涉及在断裂的靶和供体之间形成的异源双链体DNA的错配校正和/或合成依赖性链退火，其中供体用于重新合成将成为靶和/或相关过程的部分的遗传信息。在一些情况下，供体多核苷酸、供体多核苷酸的一部分、供体多核苷酸的拷贝、或供体多核苷酸的拷贝的一部分整合到靶DNA内。参见Wang等人(2013)Cell153:910-918；Mandalos等人(2012)PLOS ONE 7:e45768:1-9；以及Wang等人(2013)Nat Biotechnol.31:530-532，其各自以引用的方式整体并入本文用于所有目的。
术语“抗原结合蛋白”包括与抗原结合的任何蛋白质。抗原结合蛋白的例子包括抗体，抗体的抗原结合片段，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，scFV，双scFV，双抗体，三抗体，四抗体，V-NAR，VHH，VL，F(ab)，F(ab)2，DVD(双可变结构域抗原结合蛋白)，SVD(单可变结构域抗原结合蛋白)，双特异性T细胞衔接子(BiTE)或Davisbody(美国专利号8,586,713，其以引用的方式整体并入本文用于所有目的)。
提及抗原结合蛋白的术语“多特异性”或“双特异性”意指该蛋白识别相同抗原或不同抗原上的不同表位。多特异性抗原结合蛋白可以是单个多功能多肽，或者它也可以是彼此共价或非共价结合的两个或更多个多肽的多聚体复合物。例如，抗体或其片段可与一个或多个其它分子实体例如蛋白质或其片段功能性连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其它方式)，以产生具有第二结合特异性的双特异性或多特异性抗原结合分子。
术语“抗原”指物质，无论是整个分子还是分子内的结构域，其能够引发对该物质具有结合特异性的抗体产生。术语抗原还包括这样的物质，其在野生型宿主生物中不由于自身识别引发抗体产生，但可以用适当的基因工程来破坏免疫耐受性而在宿主动物中引发此类应答。
术语“表位”指抗原上抗原结合蛋白(例如抗体)与之结合的位点。表位可以由邻接氨基酸、或者通过一种或多种蛋白质的三级折叠并置的非邻接氨基酸形成。由邻接氨基酸形成的表位(也称为线性表位)通常在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位(也称为构象表位)通常在用变性溶剂处理后丧失。表位通常包括处于独特的空间构象中的至少3个，且更通常为至少5个或8-10个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如x射线晶体学和2维核磁共振。参见例如，Epitope Mapping Protocols，于Methods in MolecularBiology，第66卷，Glenn E.Morris，编辑(1996)，其以引用的方式整体并入本文用于所有目的。
如本文所述的抗体互补位一般至少包含特异性识别异源表位的互补决定区(CDR)(例如，重链和/或轻链可变结构域的CDR3区)。
术语“抗体”包括免疫球蛋白分子，其包含通过二硫键互连的四条多肽链，两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链包含重链可变结构域和重链恒定区(CH)。重链恒定区包含三个结构域：CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变结构域和轻链恒定区(CL)。重链可变结构域和轻链可变结构域还可以细分成称为互补决定区(CDR)的高变区，其间散布着更保守的、称为构架区(FR)的区域。每个重链可变结构域和轻链可变结构域包含三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端按下述次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(重链CDR可缩写为HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链CDR可缩写为LCDR1、LCDR2和LCDR3)。术语“高亲和力”抗体指关于其靶表位具有约10-9M或更低(例如，约1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M、或约1×10-12M)的KD的抗体。在一个实施例中，KD通过表面等离振子共振例如BIACORETM进行测量；在另一个实施例中，KD通过ELISA进行测量。
术语“双特异性抗体”包括能够选择性结合两个或更多个表位的抗体。双特异性抗体一般包含两条不同的重链，其中每条重链特异性结合不同的表位—在两种不同的分子上(例如，在两种不同的抗原上)或在相同的分子上(例如在相同的抗原上)。如果双特异性抗体能够选择性结合两个不同的表位(第一表位和第二表位)，则第一重链对于第一表位的亲和力一般比第一重链对于第二表位的亲和力低至少一个到两个或三个或四个数量级，并且反之亦然。由双特异性抗体识别的表位可在相同或不同的靶上(例如在相同或不同的蛋白质上)。双特异性抗体可例如通过组合识别相同抗原的不同表位的重链来制备。例如，编码识别相同抗原的不同表位的重链可变序列的核酸序列可与编码不同重链恒定区的核酸序列融合，并且这样的序列可在表达免疫球蛋白轻链的细胞中表达。通常的双特异性抗体具有两条重链以及免疫球蛋白轻链，所述两条重链各自具有三个重链CDR，随后为(N末端至C末端)CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域，所述免疫球蛋白轻链不赋予抗原结合特异性，但可与每条重链结合，或者可与每条重链结合并且可结合由重链抗原结合区结合的一个或多个表位，或者可与每条重链结合并且使得重链之一或两者能够与一个或两个表位结合。
术语“重链”或“免疫球蛋白重链”包括来自任何生物的免疫球蛋白重链序列，包括免疫球蛋白重链恒定区序列。除非另有说明，否则重链可变结构域包含三个重链CDR和四个FR区。重链的片段包括CDR、CDR和FR及其组合。典型的重链在可变结构域(从N末端到C末端)之后具有CH1结构域，铰链，CH2结构域和CH3结构域。重链的功能片段包括这样的片段，其能够特异性识别表位(例如，用在微摩尔、纳摩尔或皮摩尔范围内的KD识别表位)，能够由细胞表达且分泌，且包含至少一个CDR。重链可变结构域由可变区核苷酸序列编码，所述可变区核苷酸序列一般包含源自种系中存在的VH、DH和JH区段储库的VH、DH和JH区段。关于各种生物的V、D和J重链区段的序列、定位和命名法可以在IMGT数据库中找到，所述IMGT数据库可经由因特网在万维网(www)上的URL“imgt.org”处访问。
术语“轻链”包括来自任何生物的免疫球蛋白轻链序列，并且除非另有说明，否则包括人kappa(κ)和lambda(λ)轻链和VpreB以及替代轻链。除非另有说明，否则轻链可变结构域通常包括三个轻链CDR和四个构架(FR)区。一般地，全长轻链从氨基末端到羧基末端包括可变结构域和轻链恒定区，所述可变结构域包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4和轻链恒定区氨基酸序列。轻链可变结构域由轻链可变区核苷酸序列编码，所述轻链可变区核苷酸序列一般包含源自种系中存在的轻链V和J基因区段储库的轻链VL和轻链JL基因区段。关于各种生物的轻链V和J基因区段的序列、定位和命名法可以在IMGT数据库中找到，所述IMGT数据库可经由因特网在万维网(www)上的URL“imgt.org”处访问。轻链包括例如不选择性结合第一表位或第二表位的那些，所述第一表位或第二表位被它们在其中出现的表位结合蛋白选择性结合。轻链还包括这样的轻链，其结合且识别或帮助重链结合且识别，被它们在其中出现的表位结合蛋白选择性结合的一个或多个表位。
如本文使用的，术语“互补决定区”或“CDR”包括由生物的免疫球蛋白基因的核酸序列编码的氨基酸序列，其通常(即，在野生型动物中)出现在免疫球蛋白分子(例如抗体或T细胞受体)的轻链或重链可变区中的两个构架区之间。CDR可以由例如种系序列或重排序列编码，并且例如由幼稚或成熟B细胞或T细胞编码。CDR可以进行体细胞突变(例如，不同于动物的种系中编码的序列)，人源化和/或用氨基酸取代、添加或缺失进行修饰。在一些情况下(例如，对于CDR3)，CDR可以由两个或更多个序列(例如，种系序列)编码，所述两个或更多个序列并非邻接的(例如，在未重排的核酸序列中)，但在B细胞核酸序列中是邻接的，例如，由于剪接或连接序列(例如V-D-J重组以形成重链CDR3)。
抗原结合蛋白与其靶抗原的特异性结合包括以至少106、107、108、109或1010M-1的亲和力的结合。特异性结合在量级中可检测地更高，并且可与对至少一种无关靶发生的非特异性结合区分开。特异性结合可以是特定官能团之间或特定空间配合(例如锁和钥匙类型)之间的键形成的结果，而非特异性结合通常是范德华力的结果。然而，特异性结合不一定暗示抗原结合蛋白结合一个靶且仅结合一个靶。
“包含”或“包括”一个或多个所述要素的组合物或方法可以包括未具体叙述的其它要素。例如，“包含”或“包括”蛋白质的组合物可以含有单独或与其它成分组合的蛋白质。过渡短语“基本上由……组成”意指权利要求的范围应解释为涵盖权利要求中所述的特定要素，以及实质上不影响本发明的基本和新型特征的要素。因此，当在本发明的权利要求中使用时，术语“基本上由……组成”并不预期解释为等价于“包含”。
“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情形可能发生或可能不发生，并且该描述包括其中事件或情形发生的情况、以及其中事件或情形不发生的情况。
值范围的指定包括在该范围内或定义该范围的所有整数，以及由在该范围内的整数定义的所有子范围。
除非由上下文显而易见的，否则术语“约”涵盖所述值的标准测量误差界限内的值(例如，SEM)。
术语“和/或”指并且涵盖一个或多个相关联的所列项目的任何和所有可能的组合，以及当以替代方式(“或”)解释时组合的缺乏。
术语“或”指特定列表的任何一个成员，并且还包括该列表的成员的任何组合。
除非上下文另有明确说明，否则冠词“一个”、“一种”和“该/所述”的单数形式包括复数所指物。例如，术语“一种蛋白质”或“至少一种蛋白质”可以包括多种蛋白质，包括其混合物。
统计学显著的意指p≤0.05。
具体实施方式
I.概述
本文公开的是包含人源化Asgr1基因座的非人动物细胞和非人动物，以及使用此类非人动物细胞和非人动物的方法。包含人源化Asgr1基因座的非人动物细胞或非人动物表达人ASGR1蛋白，或者包含人ASGR1蛋白一个或多个片段(例如，人ASGR1细胞外结构域的全部或部分)的嵌合Asgr1蛋白。作为高效率内吞作用肝特异性受体，人ASGR1可以用于治疗剂的肝特异性递送，所述治疗剂例如抗体、小分子(作为抗体-药物缀合物的部分)和DNA。然而，由于人ASGR1和非人动物Asgr1之间的序列差异，特异性结合人ASGR1的抗原结合蛋白或双特异性抗原结合蛋白经常不与直系同源非人动物ASGR1蛋白，例如小鼠ASGR1结合。例如，针对人ASGR1细胞外结构域生成的抗体不与小鼠Asgr1直系同源物结合(数据未显示)。由于这点，无法在具有未修饰的内源(即天然)Asgr1基因座的野生型非人动物中有效地评价人ASGR1介导的递送机制或治疗机制的体内功效。人源化的Asgr1非人动物(例如人源化的Asgr1小鼠)可以用于利用多种不同方法，来验证不同治疗剂经由人ASGR1介导的内在化的肝特异性递送。例如，包含人源化Asgr1基因座的非人动物可以用于评价人ASGR1介导的治疗性分子或治疗性复合物对肝的递送的体内疗效。类似地，包含人源化Asgr1基因座的非人动物可以用于评价经由人ASGR1介导的机制起作用的治疗性分子或治疗性复合物的功效。
II.包含人源化Asgr1基因座的非人动物
本文公开的细胞和非人动物包含人源化的Asgr1基因座。包含人源化Asgr1基因座的细胞或非人动物表达人ASGR1蛋白或部分人源化的嵌合Asgr1蛋白，其中天然Asgr1蛋白的一个或多个片段已替换为来自人ASGR1的相应片段(例如，细胞外结构域的全部或部分)。
A.去唾液酸糖蛋白受体1(ASGR1)
本文所述的细胞和非人动物包含人源化的Asgr1基因座。去唾液酸糖蛋白受体1(C型凝集素结构域家族4成员H1、肝凝集素H1、HL-1、ASGP-R 1、ASGPR 1、ASGR1)由ASGR1(CLEC4H1)基因编码，并且是去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR或ASGR)的主要亚基。ASGPR是主要在肝细胞的细胞表面上表达的杂寡聚蛋白，具有大约1-5x 105个结合位点/细胞，以及在脱唾液酸化糖蛋白的内在化和降解中的作用，以将其从循环中去除。ASGPR是充分表征的C型肝凝集素，主要在肝细胞的窦状表面(sinusoidal surface)上表达。ASGPR负责经由受体介导的内吞作用，通过肝实质细胞的半乳糖终止和N-乙酰半乳糖胺终止的糖蛋白的选择性结合和内在化。它包含由基因ASGR1和ASGR2编码的两种蛋白质：去唾液酸糖蛋白受体1和2(ASGR1和ASGR2)。两个亚基均为II型单次跨膜蛋白，其广泛包含N末端胞质结构域、单次跨膜结构域和C末端细胞外碳水化合物识别结构域(CRD)。ASGR1含有N末端胞质结构域(～40个氨基酸)，单次跨膜结构域(～20个氨基酸)，细胞外卷曲螺旋茎(寡聚)区(～80个氨基酸)，以及功能性C型(钙依赖性)碳水化合物识别结构域(C型凝集素结构域)(～140个氨基酸)。CRD结合具有末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺(GalNac)基序的糖蛋白。CRD对于处于单体状态的脱唾液酸化糖蛋白具有低亲和力。
编码ASGR1和ASGR2的基因(分别为ASGR1和ASGR2)位于第17号染色体的短臂上，相距大约58.6千碱基(kb)。基因是进化上相关的，但在其结构组构方面显著不同：ASGR1包含8个外显子且为大约6kb长，而ASGR2含有9个外显子且为大约13.5kb长。
关于人ASGR1的示例性编码序列分配NCBI登录号NM_001671(SEQ ID NO:5)。关于小鼠Asgr1的示例性编码序列分配NCBI登录号NM_009714(SEQ ID NO:4)。示例性的人ASGR1蛋白分配UniProt登录号P07306(SEQ ID NO:1)。示例性的小鼠Asgr1蛋白分配UniProt登录号P34927(SEQ ID NO:2)。具有人源化的卷曲螺旋和C型凝集素结构域的示例性的小鼠Asgr1蛋白在SEQ ID NO:3中示出。示例性的大鼠Asgr1蛋白分配UniProt登录号：P02706。示例性的猩猩Asgr1蛋白分配UniProt登录号Q5RBQ8。
B.人源化的Asgr1基因座
人源化的Asgr1基因座可以是其中整个Asgr1基因替换为相应的直系同源人ASGR1序列的Asgr1基因座，或者它可以是其中仅一部分Asgr1基因替换为相应的直系同源人ASGR1序列(即，人源化的)的Asgr1基因座。任选地，基于非人动物中的密码子使用，将相应的直系同源人ASGR1序列修饰为密码子优化的。替换的(即，人源化的)区域可以包括编码区例如外显子、非编码区例如内含子、非翻译区或调节区(例如启动子、增强子或转录阻遏物结合元件)、或其任何组合。作为一个例子，对应于人ASGR1基因的1、2、3、4、5、6、7或所有8个外显子的外显子可以进行人源化。例如，与人ASGR1基因的外显子3-8相对应的外显子可以进行人源化。可替代地，编码被抗人ASGR1抗原结合蛋白识别的表位的Asgr1区域可以进行人源化。作为另一个例子，N末端胞质结构域、跨膜结构域、卷曲螺旋结构域或C型凝集素结构域中的一个或多个或全部可以进行人源化。例如，编码卷曲螺旋结构域的Asgr1基因座的全部或部分区域可以进行人源化，编码C型凝集素结构域的Asgr1基因座的全部或部分区域可以进行人源化，编码跨膜结构域的Asgr1基因座的全部或部分区域可以进行人源化，和/或编码胞质结构域的Asgr1基因座的全部或部分区域可以进行人源化。在一个例子中，仅编码卷曲螺旋结构域的Asgr1基因座的全部或部分区域是人源化的，仅编码C型凝集素结构域的Asgr1基因座的全部或部分区域是人源化的，或仅编码胞外区域(即，卷曲螺旋结构域和C型凝集素结构域)的Asgr1基因座的全部或部分区域是人源化的。例如，编码卷曲螺旋结构域和C型凝集素结构域的Asgr1基因座区域可以进行人源化，使得产生具有内源性N末端胞质结构域、内源性跨膜结构域、人源化卷曲螺旋结构域和人源化C型凝集素结构域的嵌合Asgr1蛋白。同样地，与人ASGR1基因的1、2、3、4、5、6或所有7个内含子相对应的内含子可以进行人源化。侧翼非翻译区包括调节序列也可以进行人源化。例如，5'非翻译区(UTR)、3'UTR、或5'UTR和3'UTR两者可以进行人源化，或5'UTR、3'UTR、或5'UTR和3'UTR两者可以保持内源的。在一个具体例子中，3'UTR是人源化的，但5'UTR保持内源的。取决于由直系同源序列替换的程度，调节序列例如启动子可以是内源的，或可以由替换的人直系同源序列提供。例如，人源化的Asgr1基因座可以包括内源性非人动物Asgr1启动子。
由人源化的Asgr1基因座编码的Asgr1蛋白可以包含来自人ASGR1蛋白的一个或多个结构域。例如，Asgr1蛋白可以包含人ASGR1卷曲螺旋结构域、人ASGR1C型凝集素结构域、人ASGR1跨膜结构域和人ASGR1胞质结构域中的一个或多个或全部。作为一个例子，Asgr1蛋白可以仅包含人ASGR1卷曲螺旋结构域、仅包含人ASGR1C型凝集素结构域、或仅包含人ASGR1细胞外结构域(即，卷曲螺旋结构域和C型凝集素结构域)。任选地，由人源化Asgr1基因座编码的Asgr1蛋白还可以包含来自内源性(即，天然的)非人动物Asgr1蛋白的一个或多个结构域。作为一个例子，由人源化Asgr1基因座编码的Asgr1蛋白可以包含来自人ASGR1蛋白的卷曲螺旋结构域、来自人ASGR1蛋白的C型凝集素结构域、来自内源性(即，天然的)非人动物Asgr1蛋白的N末端胞质结构域、以及来自内源性(即，天然的)非人动物ASGR1蛋白的跨膜结构域。来自人ASGR1蛋白的结构域可以由完全人源化的序列(即，编码该结构域的整个序列替换为直系同源人ASGR1序列)编码，或可以由部分人源化序列(即，编码该结构域的一些序列替换为直系同源人ASGR1序列，并且编码该结构域的剩余内源(即，天然)序列编码与直系同源的人ASGR1序列相同的氨基酸，使得编码的结构域与人ASGR1蛋白中的该结构域等同)编码。
作为一个例子，由人源化的Asgr1基因座编码的Asgr1蛋白可以包含人ASGR1卷曲螺旋结构域。任选地，人ASGR1卷曲螺旋结构域包含序列、基本上由序列或由序列组成，所述序列与SEQ ID NO:27至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％等同，并且Asgr1蛋白保留天然Asgr1的活性(即，保留经由受体介导的内吞作用，选择性地结合且内在化半乳糖终止和N-乙酰半乳糖胺终止的糖蛋白的能力)。作为另一个例子，由人源化的Asgr1基因座编码的Asgr1蛋白可以包含人ASGR1C型凝集素结构域。任选地，人ASGR1C型凝集素结构域包含序列、基本上由序列或由序列组成，所述序列与SEQ ID NO:28至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％等同，并且Asgr1蛋白保留天然Asgr1的活性。例如，来自人ASGR1的Asgr1蛋白区域可以包含序列、基本上由序列或由序列组成，所述序列与SEQ IDNO:31至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％等同，并且Asgr1蛋白保留天然Asgr1的活性。作为另一个例子，由人源化的Asgr1基因座编码的Asgr1蛋白可以包含内源性非人动物Asgr1胞质结构域(例如，小鼠Asgr1胞质结构域)。任选地，非人动物Asgr1胞质结构域包含序列、基本上由序列或由序列组成，所述序列与SEQ ID NO:29至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％等同，并且Asgr1蛋白保留天然Asgr1的活性。作为另一个例子，由人源化的Asgr1基因座编码的Asgr1蛋白可以包含内源性非人动物Asgr1跨膜结构域(例如，小鼠Asgr1跨膜结构域)。任选地，非人动物Asgr1跨膜结构域包含序列、基本上由序列或由序列组成，所述序列与SEQ ID NO:30至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％等同，并且Asgr1蛋白保留天然Asgr1的活性。例如，由人源化的Asgr1基因座编码的Asgr1蛋白可以包含序列、基本上由序列或由序列组成，所述序列与SEQ ID NO:3至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％等同，并且Asgr1蛋白保留天然Asgr1的活性。
任选地，人源化的Asgr1基因座可以包含其它元件。此类元件的例子可以包括选择盒、报道基因、重组酶识别位点或其它元件。可替代地，人源化的Asgr1基因座可以缺乏其它元件(例如，可以缺乏选择标记物或选择盒)。合适的报道基因和报道蛋白的例子在本文其它地方公开。合适的选择标记物的例子包括新霉素磷酸转移酶(neor)、潮霉素B磷酸转移酶(hygr)、嘌呤霉素-N-乙酰基转移酶(puror)、杀稻瘟菌素S脱氨酶(bsrr)、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(gpt)和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-k)。重组酶的例子包括Cre、Flp和Dre重组酶。Cre重组酶基因的一个例子是Crei，其中编码Cre重组酶的两个外显子被内含子分开，以防止其在原核细胞中表达。此类重组酶还可以包含核定位信号，以促进对核的定位(例如NLS-Crei)。重组酶识别位点包括这样的核苷酸序列，其被位点特异性重组酶识别，并且可以充当重组事件的底物。重组酶识别位点的例子包括FRT、FRT11、FRT71、attp、att、rox和lox位点，例如loxP、lox511、lox2272、lox66、lox71、loxM2和lox5171。
其它元件，例如报道基因或选择盒可以是侧翼为重组酶识别位点的自缺失盒。参见例如，US 8,697,851和US2013/0312129，其各自以引用的方式整体并入本文用于所有目的。作为一个例子，自缺失盒可以包含与小鼠Prm1启动子可操作连接的Crei基因(包含编码Cre重组酶的两个外显子，其由内含子分开)、以及与人泛素启动子可操作连接的新霉素抗性基因。通过采用Prm1启动子，自缺失盒可以在F0动物的雄性生殖细胞中特异地缺失。可以将编码选择标记物的多核苷酸可操作地连接到在待靶性的细胞中活跃的启动子。启动子的例子在本文其它地方描述。作为另一个具体例子，自缺失选择盒可以包含与一个或多个启动子(例如，人泛素和EM7启动子两者)可操作连接的潮霉素抗性基因编码序列，随后为聚腺苷酸化信号，随后为与一个或多个启动子(例如mPrm1启动子)可操作连接的Crei编码序列，随后为另一个聚腺苷酸化信号，其中整个盒侧翼为loxP位点。
人源化的Asgr1基因座也可以是条件等位基因。例如，条件等位基因可以是多功能等位基因，如US2011/0104799中所述，其以引用的方式整体并入本文用于所有目的。例如，条件等位基因可以包含：(a)在关于靶基因转录的有义取向上的致动序列；(b)在有义或反义取向上的药物选择盒(DSC)；(c)在反义取向上的目的核苷酸序列(NSI)；以及(d)在反义取向上的通过倒置有条件的模块(COIN，其利用外显子拆分内含子和可逆基因陷阱样模块)。参见例如，US2011/0104799。条件等位基因还可以包含可重组单元，其在暴露于第一重组酶时重组，以形成条件等位基因，所述条件等位基因(i)缺乏致动序列和DSC；并且(ii)含有在有义取向上的NSI和在反义取向上的COIN。参见例如，US2011/0104799。
一种示例性的人源化的Asgr1基因座(例如，人源化的小鼠Asgr1基因座)是其中编码外显子3-8替换为相应的人序列的基因座。这些外显子编码Asgr1的卷曲螺旋和C型凝集素结构域。任选地，人源化序列可以通过终止密码子和3'UTR，并且任选地进入紧在3'UTR下游的序列内。任选地，编码外显子3上游的内含子的一部分也被人源化。参见图2A和2B以及SEQ ID NO:21和24。
C.包含人源化Asgr1基因座的非人细胞和非人动物
本发明提供了如本文其它地方所述的包含人源化Asgr1基因座的非人动物细胞和非人动物。所述细胞或非人动物对于所述人源化Asgr1基因座可以是杂合的或纯合的。二倍体生物在每个基因基因座处上具有两个等位基因。每对等位基因代表特定基因基因座的基因型。如果在特定基因座处存在两个相同的等位基因，则基因型被描述为纯合的；如果两个等位基因不同，则被描述为杂合的。
本文提供的非人动物细胞可以是例如包含Asgr1基因座或者与人ASGR1基因座同源或直系同源的基因组基因座的任何非人细胞。细胞可以是真核细胞，其包括例如真菌细胞(例如酵母)、植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞、非人哺乳动物细胞和人细胞。术语“动物”包括哺乳动物、鱼类和鸟类。哺乳动物细胞可以是例如非人哺乳动物细胞、啮齿类动物细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或仓鼠细胞。其它非人哺乳动物包括例如非人灵长类动物、猴、猿、猩猩、猫、犬、兔、马、公牛、鹿、野牛、家畜(例如牛族物种，例如母牛、阉牛等等；绵羊科物种，例如绵羊、山羊等等；以及猪科物种，例如猪、公猪)。鸟类包括例如鸡、火鸡、鸵鸟、鹅、鸭等等。还包括驯养动物和农业动物。术语“非人”排除人。
细胞也可以是任何类型的未分化或分化状态。例如，细胞可以是全能细胞、多能细胞(例如人多能细胞或非人多能细胞，例如小鼠胚胎干(ES)细胞或大鼠ES细胞)、或非多能细胞。全能细胞包括可以产生任何细胞类型的未分化细胞，并且多能细胞包括具有发展成多于一个分化细胞类型的能力的未分化细胞。此类多能和/或全能细胞可以是例如ES细胞或ES样细胞，例如诱导性多能干(iPS)细胞。ES细胞包括胚胎衍生的全能或多能细胞，其在引入胚胎内之后能够促成发育中的胚胎的任何组织。ES细胞可以源自胚泡的内细胞团，并且能够分化成三个脊椎动物胚层(内胚层、外胚层和中胚层)中任一个的细胞。
本文提供的细胞也可以是生殖细胞(例如，精子或卵母细胞)。细胞可以是有丝分裂感受态细胞或无有丝分裂活性细胞，减数分裂感受态细胞或无减数分裂活性细胞。类似地，细胞也可以是原代体细胞或并非原代体细胞的细胞。体细胞包括并非配子，生殖细胞，配子体或未分化干细胞的任何细胞。例如，细胞可以是肝脏细胞，例如成肝细胞或肝细胞。
本文提供的合适的细胞还包括原代细胞。原代细胞包括已直接从生物、器官或组织中分离的细胞或细胞培养物。原代细胞包括既不转化也不是永生的细胞。它们包括得自生物、器官或组织的任何细胞，其先前未在组织培养中传代，或者先前已在组织培养中传代，但不能在组织培养中无限期地传代。此类细胞可以通过常规技术分离，且包括例如肝细胞。
本文提供的其它合适的细胞包括永生化细胞。永生化细胞包括来自多细胞生物的细胞，其通常不无限期地增殖，但由于突变或改变，已逃避正常的细胞衰老，而是可以保持经历分裂。此类突变或改变可以天然发生或被有意诱导。永生化细胞系的一个具体例子是HepG2人肝癌细胞系。众多类型的永生化细胞是众所周知的。永生化细胞或原代细胞包括通常用于培养或者用于表达重组基因或蛋白质的细胞。
本文提供的细胞还包括单细胞期胚胎(即，受精卵母细胞或受精卵)。此类单细胞期胚胎可以来自任何遗传背景(例如来自小鼠的BALB/c、C57BL/6、129或其组合)，可以是新鲜的或冷冻的，并且可以源自自然繁殖或体外受精。
本文提供的细胞可以是正常的健康细胞，或者可以是患病细胞或携带突变的细胞。
如本文所述的包含人源化Asgr1基因座的非人动物可以通过本文其它地方描述的方法制备。术语“动物”包括哺乳动物、鱼类和鸟类。非人哺乳动物包括例如非人灵长类动物、猴、猿、猩猩、猫、犬、兔、马、公牛、鹿、野牛、绵羊、兔、啮齿类动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、以及家畜(例如牛族物种，例如母牛和公牛；绵羊科物种，例如绵羊和山羊；以及猪科物种，例如猪和公猪)。鸟类包括例如鸡、火鸡、鸵鸟、鹅和鸭。还包括驯养动物和农业动物。术语“非人动物”排除人。优选的非人动物包括例如啮齿类动物，例如小鼠和大鼠。
非人动物可以来自任何遗传背景。例如，合适的小鼠可以来自129品系、C57BL/6品系、129和C57BL/6的混合物、BALB/c品系或Swiss Webster品系。129品系的例子包括129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如129S1/SV、129S1/Svlm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1和129T2。参见例如，Festing等人(1999)Mammalian Genome 10:836，其以引用的方式整体并入本文用于所有目的。C57BL品系的例子包括C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/Kal wN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola。合适的小鼠也可以来自上述129品系和上述C57BL/6品系的混合物(例如50％129和50％C57BL/6)。同样地，合适的小鼠可以来自上述129品系的混合物或上述BL/6品系的混合物(例如129S6(129/SvEvTac)品系)。
类似地，大鼠可以来自任何大鼠品系，包括例如ACI大鼠品系、Dark Agouti(DA)大鼠品系、Wistar大鼠品系、LEA大鼠品系、Sprague Dawley(SD)大鼠品系、或Fischer大鼠品系例如Fisher F344或Fisher F6。大鼠也可以得自源自上述两种或更多种品系的混合物的品系。例如，合适的大鼠可以来自DA品系或ACI品系。ACI大鼠品系表征为具有黑灰色，具有白色腹部和足部以及RT1av1单体型。此类品系可得自各种来源包括Harlan Laboratories。Dark Agouti(DA)大鼠品系表征为具有野灰色皮毛和RT1av1单倍型。此类大鼠可得自各种来源包括Charles River和Harlan Laboratories。一些合适的大鼠可来自近交大鼠品系。参见例如，US2014/0235933，其以引用的方式整体并入本文用于所有目的。
III.使用包含人源化Asgr1基因座的非人动物用于评价人ASGR1介导的治疗性复合物对肝的递送和经由人ASGR1介导的机制起作用的治疗性分子的体内功效的方法
本发明提供了关于使用如本文其它地方所述的包含人源化Asgr1基因座的非人动物，用于评价人ASGR1介导的治疗性分子或复合物对肝的递送或者人ASGR1介导的治疗机制的体内功效的各种方法。由于非人动物包含人源化Asgr1基因座，因此与具有非人源化Asgr1基因座的非人动物相比，非人动物更准确地反映由人ASGR1介导的递送或人ASGR1介导的治疗机制。作为一个例子，该方法可以评价治疗性复合物在体内经由人ASGR1介导的内在化对肝的递送，其包括将所述治疗性复合物施用于包含人源化Asgr1基因座的非人动物，其中所述治疗性复合物包含治疗性分子和特异性结合人ASGR1的抗原结合蛋白或配体，然后评价治疗性分子对非人动物的肝的递送。作为另一个例子，该方法可以评价设计为经由人ASGR1介导的内在化起作用的治疗性分子或复合物，例如设计为经由人ASGR1内在化靶肝细胞表面蛋白的治疗性复合物的体内功效。
A.评价治疗性分子经由人ASGR1介导的内在化递送至肝的体内功效的方法
本发明提供了关于使用如本文其它地方所述的包含人源化Asgr1基因座的非人动物，用于评价治疗性分子经由人ASGR1介导的内在化递送至肝的体内功效的各种方法。例如，此类方法可以包括：(a)将所述治疗性复合物施用于包含人源化Asgr1基因座的非人动物，其中所述治疗性复合物包含治疗性分子和特异性结合人ASGR1的抗原结合蛋白或配体；并且(b)评价治疗性分子对非人动物的肝的递送。
治疗性分子可以是可用于治疗或预防任何疾病或病症中的任何生物或化学试剂。例如，治疗性分子可以是治疗性核酸(例如，CRISPR/Cas指导RNA、短发夹RNA(shRNA)或小干扰RNA(siRNA))、或编码治疗性蛋白(例如Cas蛋白例如Cas9蛋白、替代酶、分泌的治疗性蛋白等等)的核酸。可替代地，治疗性分子可以是治疗性蛋白、治疗性抗体或抗原结合蛋白、或者任何其它治疗性大分子或小分子。
治疗性分子和人ASGR1抗原结合蛋白或配体可以通过任何手段复合在一起。例如，治疗性分子和人ASGR1抗原结合蛋白或配体可以通过直接共价缀合而偶联，或可以通过接头例如肽接头或化学接头偶联。治疗性分子和人ASGR1抗原结合蛋白或配体还可以通过在特定官能团之间的键形成或特定空间配合(例如，锁和钥匙类型)而复合在一起。作为一个具体例子，人ASGR1抗原结合蛋白可以是双特异性抗原结合蛋白，其也特异性结合治疗性分子。
治疗性复合物的施用可以通过如本文其它地方更详细地公开的任何手段以及任何施用途径。递送治疗性复合物和分子的手段以及施用途径在本文其它地方更详细地公开。
可以使用特异性结合人ASGR1的人ASGR1抗原结合蛋白或人ASGR1配体。因为人ASGR1蛋白是介导某些糖蛋白在肝中的内吞作用的跨膜蛋白，所以变得与人ASGR1复合的分子可以连同人ASGR1一起内在化。合适的抗原结合蛋白的例子包括受体融合分子、陷阱分子、受体-Fc融合分子、抗体、Fab片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、单链Fv(scFv)分子、dAb片段、分离的互补决定区(CDR)、CDR3肽、受约束的FR3-CDR3-FR4肽、结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失的抗体、嵌合抗体、CDR嫁接的抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微型抗体、纳米抗体、单价纳米抗体、二价纳米抗体、小模块免疫药物(SMIP)、骆驼科抗体(VHH重链同源二聚体抗体)、鲨鱼可变IgNAR结构域等等。在一个特定例子中，抗原结合蛋白是与人ASGR1和治疗性分子结合的双特异性抗体(例如替代蛋白或酶或者递送媒介物例如AAV)。可替代地，可以使用与人ASGR1特异性相互作用的配体或配体的一部分(例如无唾液酸血清类粘蛋白(ASOR)或者β-Ga1NAc或其对于ASGR1的受体结合部分)。
可以通过任何已知的手段来评价治疗性分子对非人动物的肝的递送。作为一个例子，可以评价治疗性分子在肝中的存在。例如，如果治疗性分子是治疗性蛋白，则可以使用用于检测蛋白质的已知测定来评价该治疗性蛋白在非人动物的肝中的存在。类似地，如果治疗性分子是编码治疗性蛋白的核酸，则可以使用已知测定来评价该核酸在非人动物的肝中的表达(例如，mRNA表达或蛋白质表达)。如果编码的治疗性蛋白是分泌蛋白，则可以测量治疗性蛋白的血清水平，或者可以通过已知测定来评价分泌的治疗性蛋白在其预期的靶细胞类型、组织类型或器官处的活性。取决于治疗性分子的预期功能，可以通过已知测定来评价治疗性分子在非人动物的肝中的活性。例如，如果引入基因组编辑剂例如CRISPR/Cas，则可以使用已知测定来评价在特定靶基因组位点处的基因组编辑。
在一个具体例子中，治疗性复合物可以包含病毒载体组合物(例如，肝特异性病毒载体组合物)。此类病毒载体组合物可以具有减少或消除的天然向性，其被设计为针对人ASGR1用于靶向肝。例如，此类修饰的病毒载体复合物可以包含：(i)包含编码治疗性核酸或蛋白质的核酸的修饰的病毒载体，其中所述修饰的病毒载体具有消除或减少的天然向性，并且包含异源表位；以及(ii)重靶向部分，其包含：(1)特异性结合异源表位的抗原结合蛋白(例如抗体)互补位；以及(2)特异性结合人ASGR1的靶向配体。
作为如何实现这点的一个例子，蛋白质加标签系统例如SpyCatcher-SpyTag可以用于将抗体与病毒表面共价偶联。可替代地，可以使用双特异性抗原结合蛋白(例如双特异性抗体，其中抗体的一个臂结合病毒，且另一个臂介导与人ASGR1的结合)。在一个具体例子中，重定向部分是包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的双特异性抗原结合蛋白(例如，双特异性抗体)，其中所述第一抗原结合结构域包含特异性结合异源表位的互补位，所述异源表位插入重组人病毒衣壳蛋白内/由重组人病毒衣壳蛋白展示，并且所述第二抗原结合结构域特异性结合人ASGR1。
合适的异源表位的一个例子是Myc标签。例如，Myc标签可以在AAV2的N587之后插入。此类插入消除了AAV2的天然配体结合活性，并且还允许修饰的AAV由抗Myc抗体的识别。特异性结合Myc和人ASGR1两者的双特异性抗体的使用随后可以将AAV(例如AAV2 N587Myc)重靶向表达人ASGR1(或人源化Asgr1)的肝脏细胞。
在另一个例子中，治疗性复合物包含溶酶体替代酶或蛋白质、或者编码溶酶体替代酶或蛋白质的核酸。溶酶体贮积病是一类罕见疾病，其影响溶酶体中的不同底物的降解，所述底物包括鞘脂、粘多糖、糖蛋白、糖原和寡糖，其可以在患病细胞中累积，导致细胞死亡。受溶酶体贮积病影响的器官包括肝。该疾病的发病机制归于不完全降解产物在溶酶体的积累，通常是由于蛋白质功能的丧失。溶酶体贮积病一般由蛋白质的功能丧失或减弱变体引起，所述蛋白质的正常功能是降解或协调溶酶体内容物的降解。溶酶体贮积病的例子在WO 2017/100467中提供，其以引用的方式整体并入本文用于所有目的。例如，最常见的溶酶体贮积病之一是庞贝氏症。庞贝氏症由有缺陷的溶酶体酶α-葡糖苷酶(GAA)引起，这导致溶酶体糖原的加工缺陷。溶酶体糖原的累积主要发生在骨骼、心脏和肝组织中。
用于治疗溶酶体贮积病的一个选项是酶或蛋白质替代疗法。当替代酶或蛋白质在治疗复合物(所述治疗复合物具有特异性结合人ASGR1的抗原结合蛋白或配体)中结合时，可以有效地递送至特定靶细胞的溶酶体。参见以引用的方式整体并入本文用于所有目的的WO 2017/100467。可以将此类治疗性复合物施用于受试者，并且该治疗性复合物可以进入受试者的靶向细胞的溶酶体，并且提供的酶活性替代与溶酶体贮积病有关的酶促活性。人ASGR1蛋白是跨膜蛋白，其介导糖蛋白的内吞作用和溶酶体降解，具有在肝中暴露的末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺残基。因而，与人ASGR1结合并且连同其一起内在化的分子将靶向溶酶体。像这样，将治疗性分子或复合物引导至人ASGR1的递送方法可以用于将治疗剂靶向溶酶体(例如肝中的溶酶体)。
相应地，本文提供的一些方法是评价包含溶酶体替代蛋白或酶的治疗性复合物在体内经由人ASGR1对肝的递送的方法。例如，此类方法可以包括(a)将治疗性分子或治疗性复合物施用于本文其它地方所述的非人动物，其中所述治疗性分子或治疗性复合物包含溶酶体替代蛋白或酶(或者编码溶酶体替代蛋白或酶的核酸)和特异性结合人ASGR1的抗原结合蛋白，其中ASGR1介导细胞结合和摄取到溶酶体区室内；并且(b)评价溶酶体替代蛋白或酶在非人动物的肝中的存在或活性。可以通过关于特定替代蛋白或酶的已知测定、或通过经由已知测定测量溶酶体中的不同受影响底物的降解，来评价替代蛋白或酶在非人动物的肝中的活性。
作为另一个例子，治疗性分子可以是编码治疗性分泌蛋白的核酸。肝在产生分泌到血液内的蛋白质中起主要作用，所述蛋白质包括主要血浆蛋白、止血和纤维蛋白溶解因子、载体蛋白、激素、激素原和载脂蛋白。人ASGR1蛋白是跨膜蛋白，其介导某些糖蛋白在肝中的内吞作用。因而，变得与人ASGR1复合的分子可以连同人ASGR1一起内在化。像这样，编码治疗性分泌蛋白的核酸可以通过将其在靶向人ASGR1的复合物中递送而靶向肝。核酸可以经由ASGR1内在化，并且肝可以制造且分泌治疗性蛋白。
相应地，本文提供的一些方法是评价编码治疗性分泌蛋白的核酸在体内经由人ASGR1对肝的递送的方法。例如，此类方法可以包括(a)将编码治疗性分泌蛋白的核酸(例如，DNA)施用于本文其它地方所述的非人动物，其中所述核酸在与人ASGR1特异性结合的治疗性复合物中递送，并且ASGR1介导该复合物的内在化；并且(b)评价治疗性分泌蛋白在非人动物中的分泌水平(例如血清水平)或活性。
治疗性蛋白的产生和分泌可以通过任何已知手段进行评价。例如，可以通过使用已知测定，测量编码的mRNA在非人动物的肝中的水平或编码的治疗性蛋白在非人动物的肝中的水平来评价引入核酸的表达。可以通过使用已知测定，测量编码的治疗性蛋白在非人动物中的血清水平来评价治疗性蛋白的分泌。另外，如果分泌的治疗性蛋白作用于特定的细胞类型、组织或器官，则可以在靶细胞类型、组织或器官中评价分泌的治疗性蛋白的活性。
B.评价经由人ASGR1介导的内在化用于在肝中内在化靶肝细胞表面蛋白或靶可溶性蛋白的治疗性复合物的体内功效的方法
本发明提供了关于使用如本文其它地方所述的包含人源化Asgr1基因座的非人动物，用于评价设计为经由人ASGR1在肝中内在化靶肝细胞表面蛋白或靶可溶性蛋白的治疗性复合物的体内功效的各种方法。治疗性治疗往往需要灭活或阻断作用于细胞或细胞附近的一个或多个靶分子。例如，基于抗体的治疗剂经常通过结合至细胞的表面上表达的特定抗原或结合至可溶性配体来起作用，从而干扰抗原的正常生物活性。这种类型的治疗剂通常通过阻断细胞因子与其受体之间的相互作用，以便减弱或抑制细胞信号传导而起作用。然而，在某些情况下，以不一定涉及阻断靶分子与另一组分的物理相互作用的方式灭活或抑制靶分子的活性是治疗有益的。可以实现对靶分子的这种非阻断性减弱的一种方式是减少靶分子的细胞外或细胞表面浓度。例如，通过促进或达到在靶分子和内在化效应蛋白例如ASGR1之间的物理连接，可以减弱或灭活靶分子。这可以例如通过使用多特异性(例如双特异性)抗原结合分子来实现，所述多特异性抗原结合分子包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域。每个抗原结合结构域结合不同的分子：第一个特异性结合靶分子，且第二个特异性结合ASGR1。通过这种类型的物理分子间连接，可以迫使靶分子连同ASGR1一起内在化到细胞内，并且通过细胞内降解机制进行处理，或以其它方式减弱、隔离或灭活。参见WO 2013/138400和US2013/0243775，其各自以引用的方式整体并入本文用于所有目的。
因为人ASGR1蛋白是跨膜蛋白，其介导糖蛋白的内吞作用和溶酶体降解，具有在肝中暴露的末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺残基，所以变得与人ASGR1复合的细胞表面蛋白可以连同人ASGR1一起内在化，将靶细胞表面蛋白或靶可溶性蛋白重新路由(re-routing)至降解区室、或者在内部区室或外来体中隔离靶细胞表面蛋白或靶可溶性蛋白。
相应地，本文提供的是关于使用如本文其它地方所述的包含人源化Asgr1基因座的非人动物，用于评价设计为经由人ASGR1在肝中内在化靶肝细胞表面蛋白或靶可溶性蛋白的治疗性复合物的体内功效的各种方法。例如，此类方法可以包括(a)将治疗性复合物施用于本文其它地方所述的非人动物，其中所述治疗性复合物包含特异性结合靶细胞表面蛋白或靶可溶性蛋白且特异性结合人ASGR1的双特异性抗原结合蛋白，其中ASGR1介导靶细胞表面蛋白或靶可溶性蛋白的内在化；并且(b)评价靶肝细胞表面蛋白在非人动物的肝中的细胞表面水平或活性，或者评价靶可溶性蛋白在非人动物的肝中的表达水平或活性。治疗性复合物的施用可以通过任何合适的手段，如本文其它地方所述。
靶细胞表面蛋白可以包括在肝中表达的任何细胞表面蛋白。靶可溶性蛋白可以包括在肝中表达的任何可溶性蛋白。可以通过用于测量受体和其它蛋白质的细胞表面水平的已知测定，来评价靶肝细胞表面蛋白在非人动物的肝中的细胞表面水平或活性。同样地，可溶性蛋白的水平可以通过已知测定进行评价。
C.将分子施用于非人动物
本文公开的方法包括将包括核酸、蛋白质或蛋白质复合物的各种分子(治疗性分子或复合物)引入非人动物内。引入可以通过任何手段来完成。例如，此类分子可以例如通过载体递送、颗粒介导的递送、外来体介导的递送、脂质纳米颗粒介导的递送、细胞穿透肽介导的递送、或可植入装置介导的递送引入非人动物内。作为具体例子，分子可以在载体中引入细胞或非人动物内，所述载体例如聚乳酸(PLA)微球体、聚(D,L-乳酸共乙醇酸)(PLGA)微球体、脂质体、胶束、反胶束、脂质耳蜗(lipid cochleate)或脂质微管。递送至非人动物的一些具体例子包括流体力学递送、病毒介导的递送(例如，腺相关病毒(AAV)介导的递送)、以及脂质纳米颗粒介导的递送。
核酸、蛋白质或其它组分引入非人动物内可以通过流体力学递送(HDD)来实现。流体力学递送已成为用于体内细胞内DNA递送的理想方法。关于对实质细胞的基因递送，仅需要经由选择的血管注射必需的DNA序列，消除了与当前病毒和合成载体相关的安全关注。当注射到血流内之时，DNA能够到达血液可及的不同组织中的细胞。流体力学递送采用通过将大量溶液快速注射到循环中的不可压缩的血液内生成的力，以克服内皮和细胞膜的物理屏障，其阻止大化合物和膜不可渗透的化合物进入实质细胞。除DNA递送之外，这种方法还可用于在体内有效地细胞内递送RNA、蛋白质和其它小分子化合物。参见例如，Bonamassa等人(2011)Pharm.Res.28(4):694-701，其以引用的方式整体并入本文用于所有目的。
核酸的引入也可以通过病毒介导的递送，例如AAV介导的递送或慢病毒介导的递送来完成。其它示例性病毒/病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、牛痘病毒、痘病毒和单纯疱疹病毒。病毒可以感染分裂细胞、非分裂细胞、或分裂细胞和非分裂细胞两者。病毒可以整合到宿主基因组内，或可替代地不整合到宿主基因组内。此类病毒也可以进行改造，以具有减少的免疫力。病毒可以是有复制能力的，或可以是复制缺陷的(例如，在对于另一轮病毒粒子复制和/或包装所必需的一个或多个基因中缺陷的)。病毒可以引起瞬时表达，长效表达(例如至少1周、2周、1个月、2个月或3个月)，或永久表达(例如Cas9和/或gRNA的)。示例性病毒滴度(例如AAV滴度)包括1012、1013、1014、1015和1016个载体基因组/mL。
ssDNA AAV基因组由两个开放读码框Rep和Cap组成，所述两个开放读码框侧翼为两个反向末端重复，其允许合成互补的DNA链。当构建AAV转移质粒时，将转基因置于两个ITR之间，并且Rep和Cap可以反式提供。除Rep和Cap之外，AAV还可能需要含有来自腺病毒的基因的辅助质粒。这些基因(E4、E2a和VA)介导AAV复制。例如，可以将转移质粒、Rep/Cap和辅助质粒转染到含有腺病毒基因E1+的HEK293细胞内，以产生感染性AAV颗粒。可替代地，Rep、Cap和腺病毒辅助基因可以组合到单个质粒内。类似的包装细胞和方法可以用于其它病毒，例如逆转录病毒。
已鉴定了AAV的多重血清型。这些血清型在它们感染的细胞类型(即它们的向性)方面不同，允许特定细胞类型的优先转导。用于肝组织的血清型包括AAV7、AAV8和AAV9，且特别是AAV8。
向性可以通过假型化进一步改良，所述假型化是衣壳和来自不同病毒血清型的基因组的混合。假型化病毒的使用可以改善转导效率，以及改变向性。源自不同血清型的杂合衣壳也可以用于改变病毒向性。例如，AAV-DJ含有来自八种血清型的杂合衣壳，并且在体内展示跨越广泛范围的细胞类型的高感染力。AAV血清型也可以通过突变进行修饰。其它假型化/修饰的AAV变体包括AAV2/1、AAV2/6、AAV2/7、AAV2/8、AAV2/9、AAV2.5、AAV8.2和AAV/SASTG。
为了加速转基因表达，可以使用自互补的AAV(scAAV)变体。因为AAV依赖于细胞的DNA复制机制来合成AAV的单链DNA基因组的互补链，所以转基因表达可能延迟。为了解决这种延迟，可以使用含有在感染后能够自发退火的互补序列的scAAV，消除了关于宿主细胞DNA合成的需要。
为了增加包装容量，较长的转基因可以在两个AAV转移质粒之间拆分，第一个具有3'剪接供体，且第二个具有5'剪接受体。在细胞的共感染后，这些病毒形成串联体，一起剪切，并且可以表达全长转基因。虽然这允许较长转基因的表达，但表达较不有效。用于增加容量的类似方法利用同源重组。例如，转基因可以在两个转移质粒之间分开，但具有基本序列重叠，使得共表达诱导全长转基因的同源重组和表达。
核酸和蛋白质的引入也可以通过脂质纳米颗粒(LNP)介导的递送来完成。例如，LNP介导的递送可以用于递送以RNA形式的指导RNA。通过此类方法的递送导致指导RNA的瞬时存在，并且可生物降解的脂质改善清除率，改善耐受性并且降低免疫原性。脂质制剂可以保护生物分子免于降解，同时改善其细胞摄取。脂质纳米颗粒是包含通过分子间力彼此物理结合的多个脂质分子的颗粒。这些包括微球体(包括单层和多层囊泡，例如脂质体)，乳液中的分散相，胶束或悬浮液中的内相。此类脂质纳米颗粒可以用于包封用于递送的一种或多种核酸或蛋白质。含有阳离子脂质的制剂可用于递送聚阴离子，例如核酸。可以包括的其它脂质是中性脂质(即，不带电荷的或两性离子脂质)，阴离子脂质，增强转染的辅助脂质，以及增加纳米颗粒可以在体内存在的时间长度的隐形脂质。合适的阳离子脂质，中性脂质，阴离子脂质，辅助脂质和隐形脂质可以在WO 2016/010840A1中找到，其以引用的方式整体并入本文用于所有目的。示例性的脂质纳米颗粒可以包含阳离子脂质和一种或多种其它组分。在一个例子中，其它组分可以包含辅助脂质如胆固醇。在另一个例子中，其它组分可以包含辅助脂质如胆固醇和中性脂质如DSPC。在另一个例子中，其它组分可以包含辅助脂质如胆固醇，任选的中性脂质如DSPC，以及隐形脂质如S010、S024、S027、S031或S033。
可以选择递送模式以降低免疫原性。不同的模式可以对主题递送分子赋予不同的药效学或药代动力学特性。例如，不同的模式可以导致不同的组织分布、不同的半衰期、或不同的时间分布。一些递送模式(例如，通过自主复制或基因组整合而在细胞中持久的核酸载体的递送)导致分子的更持久表达和存在，而其它递送模式是瞬时的和较不持久的(例如，RNA或蛋白质的递送)。以更短暂的方式递送组分，例如RNA或蛋白质，可以确保组分仅在短时间段内存在且活跃，并且可以减少免疫原性。
体内施用可以通过任何合适的途径，包括例如肠胃外、静脉内、皮下、动脉内或腹膜内。全身施用模式包括例如肠胃外途径，例如静脉内、动脉内、皮下、腹膜内途径。具体例子是静脉内输注。也可以使用局部施用模式。
包含核酸或蛋白质的组合物可以使用一种或多种生理和药学可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂进行配制。该制剂可以取决于选择的施用途径。术语“药学可接受的”意指载体、稀释剂、赋形剂或助剂与制剂的其它成分相容，并且对其接受者基本上无害。
施用频率和剂量数目可以取决于所引入的组分的半衰期和施用途径以及其它因素。核酸或蛋白质引入非人动物内可以执行一次或在一段时间内执行多次。举例来说，所述引入可以在一段时间内执行至少两次、在一段时间内执行至少三次、在一段时间内执行至少四次、在一段时间内执行至少五次、在一段时间内执行至少六次、在一段时间内执行至少七次、在一段时间内执行至少八次、在一段时间内执行至少九次、在一段时间内执行至少十次、在一段时间内执行至少十一次、在一段时间内执行至少十二次、在一段时间内执行至少十三次、在一段时间内执行至少十四次、在一段时间内执行至少十五次、在一段时间内执行至少十六次、在一段时间内执行至少十七次、在一段时间内执行至少十八次、在一段时间内执行至少十九次，或在一段时间内执行至少二十次。
IV.制备包含人源化Asgr1基因座的非人动物的方法
本发明提供了用于制备如本文其它地方公开的包含人源化Asgr1基因座的非人动物的各种方法。用于产生遗传修饰的生物的任何方便的方法或方案都适合于产生此类遗传修饰的非人动物。参见例如，Cho等人(2009)Current Protocols in Cell Biology 42:19.11:19.11.1-19.11.22，以及Gama Sosa等人(2010)Brain Struct.Funct.214(2-3):91-109，其各自以引用的方式整体并入本文用于所有目的。例如，可以通过在靶向Asgr1基因座处的基因敲入来生成此类遗传修饰的非人动物。
例如，产生包含人源化Asgr1基因座的非人动物的方法包括：(1)修饰多能细胞的基因组，以包含人源化Asgr1基因座；(2)鉴定或选择包含人源化Asgr1基因座的遗传修饰的多能细胞；(3)将遗传修饰的多能细胞引入非人动物宿主胚胎内；并且(4)在代孕母亲中植入并孕育宿主胚胎。任选地，可以将包含修饰的多能细胞(例如，非人ES细胞)的宿主胚胎孵育直至胚泡期，然后在代孕母亲中植入并孕育，以产生F0非人动物。代孕母亲然后可以产生包含人源化Asgr1基因座的F0代非人动物。
该方法还可以包括鉴定具有修饰的靶基因组基因座的细胞或动物。各种方法可以用于鉴定具有靶向遗传修饰的细胞和动物。
筛选步骤可以包括例如用于评价亲本染色体的等位基因修饰(MOA)的定量测定。例如，可以经由定量PCR，例如实时PCR(qPCR)来进行定量测定。实时PCR可以利用识别靶基因座的第一引物组，以及识别非靶向参考基因座的第二引物组。引物组可以包含识别扩增序列的荧光探针。
合适的定量测定的其它例子包括荧光介导的原位杂交(FISH)，比较基因组杂交，等温DNA扩增，与固定探针的定量杂交，探针，/>MolecularBeacon探针或ECLIPSETM探针技术(参见例如，US2005/0144655，其以引用的方式整体并入本文用于所有目的)。
合适的多能细胞的一个例子是胚胎干(ES)细胞(例如，小鼠ES细胞或大鼠ES细胞)。修饰的多能细胞可以例如经由重组通过以下生成：(a)将一种或多种靶向载体引入细胞内，所述靶向载体包含侧翼为与5'和3'靶位点相对应的5'和3'同源臂的插入核酸，其中所述插入核酸包含人源化Asgr1基因座；并且(b)鉴定在其基因组中包含在靶基因组基因座处整合的插入核酸的至少一个细胞。可替代地，修饰的多能细胞可以通过以下生成：(a)向细胞内引入：(i)核酸酶试剂，其中所述核酸酶试剂在靶基因组基因座内的识别位点处诱导切口或双链断裂；以及(ii)包含定位与识别位点足够接近的插入核酸的一种或多种靶向载体，所述插入核酸侧翼为与5'和3'靶位点相对应的5'和3'同源臂，其中所述插入核酸包含人源化Asgr1基因座；并且(c)鉴定在靶基因组基因座处包含修饰(例如，插入核酸的整合)的至少一个细胞。可以使用在所需识别位点内诱导切口或双链断裂的任何核酸酶试剂。合适的核酸酶的例子包括转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)，锌指核酸酶(ZFN)，大范围核酸酶和成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)/CRISPR相关的(Cas)系统或此类系统的组分(例如，CRISPR/Cas9)。参见例如，US2013/0309670和US2015/0159175，其各自以引用的方式整体并入本文用于所有目的。
可以将供体细胞引入任何阶段(例如囊胚期或桑椹体前期(即，4细胞期或8细胞期))的宿主胚中。产生能够通过所述生殖系传递所述基因修饰的后代。参见例如，美国专利号7,294,754，其以引用的方式整体并入本文用于所有目的。
可替代地，本文其它地方描述的产生非人动物的方法可以包括：(1)使用用于修饰多能细胞的上述方法，将单细胞期胚胎的基因组修饰为包含人源化的Asgr1基因座；(2)选择遗传修饰的胚胎；并且(3)在代孕母亲中植入并孕育遗传修饰的胚胎。产生能够通过所述生殖系传递所述基因修饰的后代。
也可以利用核转移技术产生非人哺乳动物。简言之，用于核转移的方法可以包括以下步骤：(1)将卵母细胞去核或提供去核的卵母细胞；(2)分离或提供待与去核的卵母细胞组合的供体细胞或核；(3)将细胞或核插入去核的卵母细胞内，以形成重建细胞；(4)将重建细胞植入动物的子宫内，以形成胚胎；并且(5)允许胚胎发育。在此类方法中，卵母细胞通常从已死亡的动物中回收，但它们也可以从活动物的输卵管和/或卵巢中分离出来。在去核之前，卵母细胞可以在各种众所周知的培养基中成熟。卵母细胞的去核可以以许多众所周知的方式执行。将供体细胞或核插入去核的卵母细胞中以形成重建细胞可以是将供体细胞显微注射于透明带下再融合来实现。融合可以通过跨越接触/融合平面施加DC电脉冲(电融合)、通过使细胞暴露于促进融合的化学物质(例如聚乙二醇)或借助于灭活病毒(例如仙台病毒)来诱导。重建的细胞可以在核供体和接受者卵母细胞融合之前、期间和/或之后，通过电学和/或非电学方式活化。活化方法包括电脉冲、化学上诱导的休克、利用精子穿透、增加卵母细胞中的二价阳离子含量，和减少卵母细胞中的细胞蛋白质磷酸化(如通过激酶抑制剂)。活化的重建细胞或胚胎可以在众所周知的培养基中培养，然后转移至动物的子宫。参见例如，US2008/0092249、WO 1999/005266、US2004/0177390、WO 2008/017234和美国专利号7,612,250，其各自以引用的方式整体并入本文用于所有目的。
本文提供的各种方法允许生成遗传修饰的非人F0动物，其中所述遗传修饰的F0动物的细胞包含人源化Asgr1基因座。应认识到，取决于用于生成F0动物的方法，具有人源化Asgr1基因座的F0动物内的细胞数目将改变。经由例如方法，将供体ES细胞从相应的生物(例如8细胞期的小鼠胚胎)引入桑椹体前期胚胎，允许F0动物的更大百分比的细胞群体包含具有目的核苷酸序列的细胞，所述目的核苷酸序列包含靶向遗传修饰。例如，非人F0动物的至少50％、60％、65％、70％、75％、85％、86％、87％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的细胞贡献可以包含具有靶向修饰的细胞群体。
遗传修饰的F0动物的细胞对于人源化Asgr1基因座可以是杂合的，或者对于人源化Asgr1基因座可以是纯合的。
上文或下文引用的所有专利文件、网站、其它出版物、登录号等等都以引用的方式整体并入用于所有目的，其程度与每个个别项目具体地且个别地指出以引用的方式如此并入相同。如果序列的不同版本在不同时间与一个登录号相关联，则意指在本专利申请的有效提交日期与该登录号相关联的版本。有效提交日期意指实际提交日期，或适用的提及登录号的优先权申请的提交日期中的较早者。同样地，如果出版物的不同版本、网站等等在不同时间公布，则除非另有说明，否则意指在专利申请的有效提交日期最近公布的版本。除非另有具体说明，否则本发明的任何特征、步骤、要素、实施例或方面都可以与任何其它组合使用。尽管本发明已通过说明和实例略微详细地进行描述用于清楚和理解的目的，但显而易见的是可以在所附权利要求的范围内实践某些改变和修改。
序列简述
所附序列表中列出的核苷酸和氨基酸序列使用用于核苷酸碱基的标准字母缩写和用于氨基酸的三字母代码显示。核苷酸序列遵循从序列的5’末端开始并继续前进(即，每行从左到右)到3’末端的标准惯例。每个核苷酸序列仅显示一条链，但互补链应理解为通过对所展示链的任何引用包括。氨基酸序列遵循从序列的氨基末端开始并继续前进(即，每行从左到右)到羧基末端的标准惯例。
表1.序列描述。
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实施例
实施例1.包含人源化Asgr1基因座的小鼠的生成
去唾液酸糖蛋白受体(Ashwell Receptor,ASGR)是属于C型类别的凝集素受体，占优势地肝膜结合的碳水化合物结合蛋白受体(～33kDa)。ASGR结合具有末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺(GalNac)基序的糖蛋白。它可以通过受体介导的内吞作用从循环中去除脱唾液酸化的糖蛋白。配体经历了溶酶体降解，而ASGR被循环回到细胞表面。受体是两个亚基ASGR1和ASGR2(H1和H2)的杂合寡聚体。作为高效率内吞作用肝特异性受体，ASGR1可以用于治疗剂的肝特异性递送，所述治疗剂例如抗体、小分子(作为抗体-药物缀合物的部分)和DNA。然而，我们已针对人ASGR1细胞外结构域生成的抗体和双特异性抗体不与小鼠Asgr1直系同源物结合(Biacore数据未显示)。因此，我们已生成了人源化的Asgr1小鼠，用于利用多种不同方法来验证不同治疗剂的肝特异性递送。
生成了大靶向载体，其包括包含来自bMQ-69B11的24kb的5'同源臂和包含来自bMQ-69B11的67kb的3'同源臂，以用相应的ASGR1人序列替换编码小鼠Asgr1的外显子3-8(通过终止密码子和3'UTR，进入3'UTR紧下游的序列内)。编码的Asgr1蛋白具有小鼠Asgr1跨膜结构域，随后为人卷曲螺旋和C型凝集素结构域。参见图2A和3。为了生成突变型等位基因，将CRISPR/Cas9组分连同大靶向载体一起引入F1H4小鼠胚胎干细胞内。执行使用表2中所示的引物和探针的等位基因丧失测定，以检测内源性小鼠等位基因的丧失，并且执行使用表3中所示的引物和探针的等位基因获得测定，以检测人源化等位基因的获得。等位基因丧失和等位基因获得测定例如在US 2014/0178879；US 2016/0145646；WO 2016/081923；以及Frendewey等人(2010)Methods Enzymol.476:295-307中描述，其各自以引用的方式整体并入本文用于所有目的。
表2.小鼠等位基因丧失测定/>
表3.人等位基因获得测定
然后使用方法生成F0小鼠。参见例如，US 7,576,259；US 7,659,442；US 7,294,754；US2008/007800；以及Poueymirou等人(2007)Nature Biotech.25(1):91-99，其各自以引用的方式整体并入本文用于所有目的。编码外显子3上游的内含子的一部分也进行人源化。总共将1863bp的小鼠Asgr1序列替换为3907bp的人ASGR1序列。loxP-hUb1-em7-潮霉素抗性基因-聚腺苷酸化信号-mPrm1-Crei-聚腺苷酸化信号-loxP盒(5218bp)也插入在人3'UTR的下游，具有紧在盒之前的大约190bp的3'UTR的3'人序列的缓冲区。所得到的具有潮霉素抗性自缺失盒的部分人源化的小鼠Asgr1等位基因在SEQ IDNO:21中列出(称为7302等位基因)。图2A中的序列边界区域A、B和C分别在SEQ ID NOS：18、19和20中列出。人ASGR1蛋白(SEQ ID NO:1)、小鼠Asgr1蛋白(SEQ ID NO:2)和部分人源化的小鼠Asgr1蛋白(SEQ ID NO:3)的比较显示于图3中。
在用Cre重组酶去除自缺失盒后，loxP和克隆位点(77bp)保留在人3'UTR的下游，具有紧在剩余loxP之前在3'UTR之后的大约190bp的3'人序列的缓冲区。参见图2B。所得到的部分人源化的小鼠、盒缺失的Asgr1等位基因在SEQ ID NO:24中列出(称为7303等位基因)。图2B中的序列边界区域A和C分别在SEQ ID NO:22和23中列出。
实施例2.包含人源化Asgr1基因座的小鼠的验证
为了验证作为有效模型的人源化的Asgr1小鼠(Asgr1hu/hu)，对Asgr1hu/hu小鼠进行表型分析，并且将其表型与野生型同窝仔畜的表型进行比较。与野生型同窝仔畜相比，Asgr1hu/hu小鼠未显示在血脂水平方面的差异(总胆固醇、甘油三酯、HDL-C、LDL-C)。参见图4。同样地，与野生型同窝仔畜相比Asgr1hu/hu小鼠未显示在体重或血糖水平方面的差异。参见图5。与小鼠Asgr1相似，人ASGR1蛋白共定位于肝膜。参见图6。总之，Asgr1hu/hu小鼠在肝膜上表达人ASGR1蛋白，并且具有正常的血浆脂质谱。
方法
在Asgr1人源化小鼠中的循环脂质水平评估。在非禁食条件下收集来自雄性Asgr1人源化小鼠(Asgr1hum/hum)及其野生型同窝仔畜(Asgr1+/+)的血浆，并且使用血清化学分析仪Chemistry XPT System(Siemens)，分析血清脂质(甘油三酯(TG)、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C))。N＝8/组，11周龄。数据表示为每个的平均值±SEM。
血糖评估。在禁食(16小时)和进食(非禁食)条件下，使用Accu-Chek血糖仪(Roche)从尾尖测量血糖。
Asgr1的蛋白质印迹评估。从Asgr1人源化小鼠和WT小鼠(n＝8/基因型)收获全肝，且冷冻保存于-80℃下直至处理。对于每个样品，从全肝切除～40mg的冷冻肝小片，并且将每个小片置于杜恩斯匀浆器内，并且匀浆直至获得均匀的悬浮液。根据制造商的“软组织”方案，使用基于去污剂的商业试剂盒(Thermo#89842)，分开每个肝样品的胞浆级分和膜级分。一旦分离出每个样品的胞浆级分和膜级分，就根据用于微板程序的试剂盒方案，对每个样品的两个级分运行BCA蛋白定量测定(Thermo#23225)。使用5X还原染料，对于每个样品的每个胞浆级分和膜级分制备蛋白质印迹样品。所有样品都以0.8μg/μL制备，并且将每个样品的20μg总蛋白加载到蛋白质印迹凝胶内。使用兔抗hASGR1多克隆抗体(Abgent#AP16133a，以在2.5％阻断乳的TBS-T溶液中的1:1,000稀释度)检测hASGR1。因为该抗体显示与小鼠蛋白质的交叉反应性，所以用相同的抗体检测在同窝小鼠中的小鼠Asgr1。用于hASGR1检测的二抗是驴抗兔IgG-HRP(Jackson#711-035-152，以在2.5％阻断乳的TBS-T溶液中的0.1μg/mL)。作为胞浆级分的加载对照，使用兔抗GAPDH单克隆抗体(CellSignaling#2118S，以在2.5％阻断乳的TBS-T溶液中的1:10,000稀释度)，在所有样品中检测GAPDH。用于GAPDH检测的二抗是驴抗兔IgG-HRP(Jackson#711-035-152，以在2.5％阻断乳的TBS-T溶液中的0.1μg/mL)。作为膜级分的加载对照，使用兔抗转铁蛋白受体多克隆抗体(R&D#AF2472，以在2.5％阻断乳的TBS-T溶液中的0.25μg/mL)，在所有样品中检测转铁蛋白受体。用于转铁蛋白受体检测的二抗是驴抗山羊IgG-HRP(Jackson#705-035-147，以在2.5％阻断乳的TBS-T溶液中的0.2μg/mL)。
实施例3.具有异源表位的腺相关病毒载体的产生
然后执行实验以确定双特异性抗myc-ASGR1抗体是否可以将scAAV-N587myc病毒颗粒重靶向实施例1中产生的小鼠体内表达人源化ASGR1的肝细胞。为了测试此点，首先产生病毒颗粒。
使用PCR将AAV衣壳蛋白修饰为含有几种异源表位之一：FLAG、c-myc、六组氨酸等，以生成编码重组衣壳蛋白的质粒。简言之，将编码FLAG、c-myc或六组氨酸的序列插入框内编码AAV2的N587或AAV6VP1衣壳蛋白的Q585的密码子之后。
使用三重转染方法，用HEK293细胞执行腺相关病毒的产生(参见例如，Erik Arden和Joseph M.Metzger,J Biol Methods.2016；3(2))。在用适当载体的PEFpro(Polyplustransfection,New York,NY)介导的转染前一天，将细胞铺平板：
-辅助质粒，pHelper(Agilent，目录#240074)；
-编码野生型或修饰的AAV rep/cap基因的质粒(pAAV RC2(Cell biolabs，目录#VPK-422)，例如pAAV RC2/6(Cell Biolabs，目录#VPK-426)、pAAV RC2-N587myc、pAAV RC2/6-Q585myc)等；和
-编码目的核苷酸和AAV ITR序列的质粒，例如pscAAV CMV-eGFP、pAAV-CMVGFP(Agilent目录#240074)、pAAV-EF1a-eGFP或pAAV-CAGG-eGFP)等。
转染后七十二小时，收集培养基，并且将细胞在缓冲液[50mM Tris-HCl、150mMNaCl和0.5％脱氧胆酸钠(Sigma，目录#D6750-100G)]中裂解。接下来，将benzonase(Sigma,St.Louis,MO)加入培养基和细胞裂解产物两者中至0.5U/μL的最终浓度，然后在37℃下温育60分钟。将细胞裂解产物以4000rpm向下旋转30分钟。将细胞裂解产物和培养基组合在一起，并且用最终浓度为8％的PEG 8000(Teknova目录#P4340)沉淀。将团块重悬浮于400mMNaCl中，并且以10000g离心10分钟。上清液中的病毒通过以149,000g超速离心3小时形成团块，并且通过qPCR滴定。
对于滴定AAV基因组的qPCR，将AAV样品在37℃下用DNA酶I(ThermofisherScientific，目录#EN0525)处理一小时，并且使用DNA提取All Reagents(ThermofisherScientific目录#4403319)进行裂解。使用QuantStudio 3Real-Time PCR System(Thermofisher Scientific)，使用针对AAV2ITR的引物，来定量衣壳化的病毒基因组。AAV2ITR引物的序列为5′-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3′(正向ITR；SEQ ID NO:36)和5′-CGGCCTCAGTGAGCGA-3′(反向ITR；SEQ ID NO:37)(Aurnhammer等人，2012)，分别从AAV衍生出左内部反向重复(ITR)序列和从AAV衍生出右内部反向重复(ITR)序列。AAV2ITR探针的序列为5’-6-FAM-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-TAMRA-3’(SEQ ID NO:38)(Aurnhammer等人(2012)Hum.Gene Ther.Methods 23:18-28)。在95℃激活步骤10分钟后，两步PCR循环在95℃下执行15分和在60℃下执行30秒，共40个循环。在qPCR中使用TaqMan Universal PCRMaster Mix(Thermofisher Scientific，目录#4304437)。DNA质粒(Agilent，目录#240074)用作确定绝对滴度的标准。
产生包含其中插入c-myc表位的衣壳的腺相关病毒载体。在这个例子中，将c-myc表位(EQKLISEEDL；SEQ ID NO:25)掺入AAV2VP1衣壳蛋白的氨基酸N587和R588之间，即，将编码c-myc表位的核苷酸序列(GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG；SEQ ID NO:26)插入质粒pAAV RC2(Cell Biolabs,Inc.,San Diego,CA)内，并且修饰的pAAV RC2-N587Myc质粒用于编码关于具有中和向性的AAV病毒载体的修饰衣壳蛋白。
具体地，使用表4中所示的引物产生包含(从5'到3')BsiW1限制性位点、在pAAVRC2的位置3050和3773之间的核苷酸序列和c-myc表位突出端核苷酸序列的第一聚合酶链反应(PCR)产物，以及包含(从5'到3')c-myc表位突出端核苷酸序列、在pAAV RC2的位置3774和4370之间的核苷酸序列和Pme1限制性位点的第二PCR产物。通过用BsiW1(NewEngland Biolabs,R0553L)和Pme1(New England Biolabs,R0560L)消化pAAV RC2，并且如Li等人(2012)Methods Mol.Biol.852:51-59中所述，经由连接非依赖性克隆插入两种PCR产物，产生pAAV RC2-N587Myc质粒(即，修饰为编码在VP1衣壳蛋白的氨基酸N587和R588之间的c-myc表位的pAAV RC2质粒)。
表4.
具体地，从Integrated DNA Technologies(Coralville,Iowa)订购包含pAAVRC2/6的位置3700和3940的gblock DNA片段，其中c-myc-表位序列插入在3757和3758之间。通过如Li等人(2012)Methods Mol.Biol.852:51-59中所述，经由连接非依赖性克隆，将gblock片段插入用MscI(New England Biolabs，目录#R0534L)和AflII(New EnglandBiolabs，目录#R0520L)消化的pAAV RC2/6内，产生pAAV RC2/6-Q585Myc质粒。
具体地，通过使用BamHI和NotI限制性位点，将GFP片段引入pscAAV MCS载体(CellBiolabs，目录#VPK-430)内，产生pscAAV-CMV-eGFP。pAAV-EF1a-eGFP质粒和pAAV-CAGG-eGFP由Scientific(Waltham,MA)从头合成制备。
实施例4.双特异性抗体介导的scAAV-N587Myc颗粒在具有人源化ASGR1基因座的小鼠体内的内在化
为了确定双特异性抗myc-ASGR1抗体是否可以将scAAV2 N587myc-CMV-eGFP病毒载体重靶向体内表达hASGR1的肝细胞，小鼠这样进行遗传修饰，使得其肝细胞在C57BL/6背景上表达hASGR1，并且对照野生型C57BL/6型小鼠用以下进行血管内注射：1x1011(通过qPCR滴定)单独的野生型scAAV2-CMV-eGFP，或与双特异性抗myc-ASGR1抗体组合、并且按病毒基因组与抗体分子的1:8比率的scAAV2 N587myc-CMV-eGFP病毒载体。对照包括用盐水[250mMNaCl]或单独的scAAV2 N587myc-CMV-eGFP病毒载体注射的小鼠。注射后十天，处死小鼠，并且用4％PFA经心脏灌注。收集肝、肾和心脏器官，并且在15％的蔗糖，随后为30％的蔗糖中脱水。然后将器官在载玻片上冷冻切片，并且用鸡抗EGFP抗体(Jackson ImmunoResearchLabs,Inc.West Grove,PA)和Alexa-488缀合的抗鸡二抗(Jackson ImmunoResearch Labs,Inc.West Grove,PA)进行染色(图8A-8C)。在来自修饰为在肝中表达ASGR1，并且用野生型scAAV2-CMV-eGFP、或与双特异性抗myc-ASGR1抗体组合的scAAV2-N587myc-CMV-eGFP注射的那些转基因动物的肝中(图8A(i)和8A(iv))，以及在来自用野生型scAAV2-CMV-eGFP注射的野生型C57BL/6小鼠的肝中(图8A(v))，检测到GFP阳性细胞。在任何脾或肾样品中(图8B和8C)，在来自用盐水或单独的scAAV2-N587myc-CMV-eGFP病毒载体注射的任何动物的肝、脾或肾样品中(图8A(ii、iii、vi、vii))，在取自用与双特异性抗myc-ASGR1抗体组合的scAAV2-N587myc-CMV-eGFP注射的野生型C57BL/6动物的肝样品中(图8A(viii))，均未检测到GFP。总之，scAAV2-N587myc-CMV-eGFP病毒载体和双特异性抗myc-ASGR1抗体的组合仅感染表达hASGR1的那些(肝)细胞，强烈暗示scAAV2-CMV-eGFP病毒载体通过衣壳蛋白的修饰而失活，例如，scAAV病毒载体的天然向性可以例如用c-myc表位中和，并且此类病毒载体可以例如通过双特异性抗myc-ASGR1抗体特异性地再活化，例如特异性地重靶向例如体内的肝细胞。
类似地，为了确定双特异性抗myc-ASGR1抗体是否可以将ssAAV2N587myc-CAGG-eGFP病毒载体重靶向体内表达hASGR1的肝细胞，小鼠这样进行遗传修饰，使得其肝细胞在C57BL/6背景上表达hASGR1，并且对照野生型C57BL/6型小鼠用以下进行血管内注射：2.18x1011(通过qPCR滴定)单独的野生型ssAAV2-CAGG-eGFP，或与双特异性抗myc-ASGR1抗体组合、并且按病毒基因组与抗体分子的1:4比率的ssAAV2 N587myc-CAGG-eGFP病毒载体。对照包括用PBS或单独的ssAAV2 N587myc-CAGG-eGFP病毒载体注射的小鼠。注射后四周，处死小鼠，并且用4％PFA经心脏灌注。收集肝、肾和心脏器官，并且在15％的蔗糖，随后为30％的蔗糖中脱水。然后将器官在载玻片上冷冻切片，并且用鸡抗EGFP抗体(JacksonImmunoResearch Labs,Inc.West Grove,PA)和Alexa-488缀合的抗鸡二抗(JacksonImmunoResearch Labs,Inc.West Grove,PA)进行染色(图9A-9O)。在来自修饰为在肝中表达ASGR1，并且用野生型ssAAV2-CAGG-eGFP、或与双特异性抗myc-ASGR1抗体组合的ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP注射的那些转基因动物的肝中(图9E-9F、9P-9R)，以及在来自用野生型ssAAV2-CAGG-eGFP注射的野生型C57BL/6小鼠的肝中(图9B-9C)，检测到GFP阳性细胞。令人惊讶的是，与双特异性抗myc-ASGR1抗体组合的ssAAV2-N587myc-CAGG-eGFP的感染效率远高于WT ssAAV2-CAGG-GFP(图9E-9F、9P-9R)。在来自用盐水或单独的ssAAV2 N587myc-CAGG-eGFP病毒载体注射的任何动物的肝样品中(图9A、9D、9G-9L)，在取自用与双特异性抗myc-ASGR1抗体组合的scAAV2-N587myc-CMV-eGFP注射的野生型C57BL/6动物的肝样品中(图9M-9O)，均未检测到或几乎未检测到GFP。总之，ssAAV2 N587myc-CAGG-eGFP病毒载体和双特异性抗myc-ASGR1抗体的组合仅感染表达hASGR1的那些(肝)细胞，强烈暗示ssAAV2N587myc-CAGG-eGFP病毒载体通过衣壳蛋白的修饰而失活，例如，scAAV病毒载体的天然向性可以例如用c-myc表位中和，并且此类病毒载体可以例如通过双特异性抗myc-ASGR1抗体特异性地再活化，例如特异性地重靶向例如体内的肝细胞。
该实施例证实人源化的ASGR1小鼠可以用于测试与人ASGR1特异性结合用于靶向递送至肝细胞的潜在治疗剂。
序列表
<110> 瑞泽恩制药公司
A·O·穆希卡
V·古萨洛娃
C·王
C·基拉索斯
T·波托奇
K·席格纳
J·马丁
<120> 包含人源化ASGR1基因座的非人动物
<130> 009108.362WO1
<150> 62/525,524
<151> 2017-06-27
<160> 42
<170> PatentIn版本 3.5
<210> 1
<211> 291
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(40)
<223> 胞质结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(61)
<223> 跨膜结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (61)..(123)
<223> 卷曲螺旋结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (161)..(278)
<223> C型凝集素结构域
<400> 1
Met Thr Lys Glu Tyr Gln Asp Leu Gln His Leu Asp Asn Glu Glu Ser
1 5 10 15
Asp His His Gln Leu Arg Lys Gly Pro Pro Pro Pro Gln Pro Leu Leu
20 25 30
Gln Arg Leu Cys Ser Gly Pro Arg Leu Leu Leu Leu Ser Leu Gly Leu
35 40 45
Ser Leu Leu Leu Leu Val Val Val Cys Val Ile Gly Ser Gln Asn Ser
50 55 60
Gln Leu Gln Glu Glu Leu Arg Gly Leu Arg Glu Thr Phe Ser Asn Phe
65 70 75 80
Thr Ala Ser Thr Glu Ala Gln Val Lys Gly Leu Ser Thr Gln Gly Gly
85 90 95
Asn Val Gly Arg Lys Met Lys Ser Leu Glu Ser Gln Leu Glu Lys Gln
100 105 110
Gln Lys Asp Leu Ser Glu Asp His Ser Ser Leu Leu Leu His Val Lys
115 120 125
Gln Phe Val Ser Asp Leu Arg Ser Leu Ser Cys Gln Met Ala Ala Leu
130 135 140
Gln Gly Asn Gly Ser Glu Arg Thr Cys Cys Pro Val Asn Trp Val Glu
145 150 155 160
His Glu Arg Ser Cys Tyr Trp Phe Ser Arg Ser Gly Lys Ala Trp Ala
165 170 175
Asp Ala Asp Asn Tyr Cys Arg Leu Glu Asp Ala His Leu Val Val Val
180 185 190
Thr Ser Trp Glu Glu Gln Lys Phe Val Gln His His Ile Gly Pro Val
195 200 205
Asn Thr Trp Met Gly Leu His Asp Gln Asn Gly Pro Trp Lys Trp Val
210 215 220
Asp Gly Thr Asp Tyr Glu Thr Gly Phe Lys Asn Trp Arg Pro Glu Gln
225 230 235 240
Pro Asp Asp Trp Tyr Gly His Gly Leu Gly Gly Gly Glu Asp Cys Ala
245 250 255
His Phe Thr Asp Asp Gly Arg Trp Asn Asp Asp Val Cys Gln Arg Pro
260 265 270
Tyr Arg Trp Val Cys Glu Thr Glu Leu Asp Lys Ala Ser Gln Glu Pro
275 280 285
Pro Leu Leu
290
<210> 2
<211> 284
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(39)
<223> 胞质结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(60)
<223> 跨膜结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (60)..(122)
<223> 卷曲螺旋结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (160)..(277)
<223> C型凝集素结构域
<400> 2
Met Thr Lys Asp Tyr Gln Asp Phe Gln His Leu Asp Asn Asp Asn Asp
1 5 10 15
His His Gln Leu Arg Arg Gly Pro Pro Pro Thr Pro Arg Leu Leu Gln
20 25 30
Arg Leu Cys Ser Gly Ser Arg Leu Leu Leu Leu Ser Ser Ser Leu Ser
35 40 45
Ile Leu Leu Leu Val Val Val Cys Val Ile Thr Ser Gln Asn Ser Gln
50 55 60
Leu Arg Glu Asp Leu Leu Ala Leu Arg Gln Asn Phe Ser Asn Leu Thr
65 70 75 80
Val Ser Thr Glu Asp Gln Val Lys Ala Leu Ser Thr Gln Gly Ser Ser
85 90 95
Val Gly Arg Lys Met Lys Leu Val Glu Ser Lys Leu Glu Lys Gln Gln
100 105 110
Lys Asp Leu Thr Glu Asp His Ser Ser Leu Leu Leu His Val Lys Gln
115 120 125
Leu Val Ser Asp Val Arg Ser Leu Ser Cys Gln Met Ala Ala Phe Arg
130 135 140
Gly Asn Gly Ser Glu Arg Thr Cys Cys Pro Ile Asn Trp Val Glu Tyr
145 150 155 160
Glu Gly Ser Cys Tyr Trp Phe Ser Ser Ser Val Arg Pro Trp Thr Glu
165 170 175
Ala Asp Lys Tyr Cys Gln Leu Glu Asn Ala His Leu Val Val Val Thr
180 185 190
Ser Arg Asp Glu Gln Asn Phe Leu Gln Arg His Met Gly Pro Leu Asn
195 200 205
Thr Trp Ile Gly Leu Thr Asp Gln Asn Gly Pro Trp Lys Trp Val Asp
210 215 220
Gly Thr Asp Tyr Glu Thr Gly Phe Gln Asn Trp Arg Pro Glu Gln Pro
225 230 235 240
Asp Asn Trp Tyr Gly His Gly Leu Gly Gly Gly Glu Asp Cys Ala His
245 250 255
Phe Thr Thr Asp Gly Arg Trp Asn Asp Asp Val Cys Arg Arg Pro Tyr
260 265 270
Arg Trp Val Cys Glu Thr Lys Leu Asp Lys Ala Asn
275 280
<210> 3
<211> 290
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(39)
<223> 胞质结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(60)
<223> 跨膜结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (60)..(122)
<223> 卷曲螺旋结构域
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (62)..(290)
<223> 由引入的人外显子编码的残基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (160)..(277)
<223> C型凝集素结构域
<400> 3
Met Thr Lys Asp Tyr Gln Asp Phe Gln His Leu Asp Asn Asp Asn Asp
1 5 10 15
His His Gln Leu Arg Arg Gly Pro Pro Pro Thr Pro Arg Leu Leu Gln
20 25 30
Arg Leu Cys Ser Gly Ser Arg Leu Leu Leu Leu Ser Ser Ser Leu Ser
35 40 45
Ile Leu Leu Leu Val Val Val Cys Val Ile Thr Ser Gln Asn Ser Gln
50 55 60
Leu Gln Glu Glu Leu Arg Gly Leu Arg Glu Thr Phe Ser Asn Phe Thr
65 70 75 80
Ala Ser Thr Glu Ala Gln Val Lys Gly Leu Ser Thr Gln Gly Gly Asn
85 90 95
Val Gly Arg Lys Met Lys Ser Leu Glu Ser Gln Leu Glu Lys Gln Gln
100 105 110
Lys Asp Leu Ser Glu Asp His Ser Ser Leu Leu Leu His Val Lys Gln
115 120 125
Phe Val Ser Asp Leu Arg Ser Leu Ser Cys Gln Met Ala Ala Leu Gln
130 135 140
Gly Asn Gly Ser Glu Arg Thr Cys Cys Pro Val Asn Trp Val Glu His
145 150 155 160
Glu Arg Ser Cys Tyr Trp Phe Ser Arg Ser Gly Lys Ala Trp Ala Asp
165 170 175
Ala Asp Asn Tyr Cys Arg Leu Glu Asp Ala His Leu Val Val Val Thr
180 185 190
Ser Trp Glu Glu Gln Lys Phe Val Gln His His Ile Gly Pro Val Asn
195 200 205
Thr Trp Met Gly Leu His Asp Gln Asn Gly Pro Trp Lys Trp Val Asp
210 215 220
Gly Thr Asp Tyr Glu Thr Gly Phe Lys Asn Trp Arg Pro Glu Gln Pro
225 230 235 240
Asp Asp Trp Tyr Gly His Gly Leu Gly Gly Gly Glu Asp Cys Ala His
245 250 255
Phe Thr Asp Asp Gly Arg Trp Asn Asp Asp Val Cys Gln Arg Pro Tyr
260 265 270
Arg Trp Val Cys Glu Thr Glu Leu Asp Lys Ala Ser Gln Glu Pro Pro
275 280 285
Leu Leu
290
<210> 4
<211> 855
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 4
atgacaaagg attatcaaga tttccagcac ctggacaatg ataatgacca tcatcaactc 60
cggagagggc cgcctcccac tccacggctc ttgcagcgac tctgctctgg atcccgcctc 120
ctcctgctct cctcgagcct cagcattctg ttgctggtgg ttgtctgtgt gatcacatcc 180
caaaattccc aactccggga agatctgctg gctctaaggc agaatttcag caacctcact 240
gtgagcactg aggaccaggt caaggccctg agcacccagg gaagtagtgt gggaagaaag 300
atgaagttag tggagtcgaa gctggaaaaa cagcagaagg atctgactga agatcactcc 360
agtttgctac tgcacgtgaa gcagttagtg tctgacgtgc gaagcttgag ctgccagatg 420
gctgcatttc ggggcaatgg ctctgaaagg acctgctgcc ccatcaactg ggtggagtat 480
gaaggcagct gctactggtt ctccagctct gtgaggcctt ggactgaagc tgacaagtac 540
tgccagctgg aaaatgccca tctggtggtg gtgacctcca gggatgagca gaacttcctc 600
cagcgccaca tgggcccctt aaacacttgg attggcctaa ctgaccagaa cgggccctgg 660
aaatgggtgg atggaacaga ctacgagaca ggcttccaga attggagacc agagcagcca 720
gataactggt acggacatgg gcttggagga ggcgaggact gtgcccactt cacgacggat 780
ggccgctgga atgacgacgt ctgcaggagg ccctaccgct gggtctgtga gacaaagttg 840
gataaggcta attag 855
<210> 5
<211> 876
<212> DNA
<213> 智人
<400> 5
atgaccaagg agtatcaaga ccttcagcat ctggacaatg aggagagtga ccaccatcag 60
ctcagaaaag ggccacctcc tccccagccc ctcctgcagc gtctctgctc cggacctcgc 120
ctcctcctgc tctccctggg cctcagcctc ctgctgcttg tggttgtctg tgtgatcgga 180
tcccaaaact cccagctgca ggaggagctg cggggcctga gagagacgtt cagcaacttc 240
acagcgagca cggaggccca ggtcaagggc ttgagcaccc agggaggcaa tgtgggaaga 300
aagatgaagt cgctagagtc ccagctggag aaacagcaga aggacctgag tgaagatcac 360
tccagcctgc tgctccacgt gaagcagttc gtgtctgacc tgcggagcct gagctgtcag 420
atggcggcgc tccagggcaa tggctcagaa aggacctgct gcccggtcaa ctgggtggag 480
cacgagcgca gctgctactg gttctctcgc tccgggaagg cctgggctga cgccgacaac 540
tactgccggc tggaggacgc gcacctggtg gtggtcacgt cctgggagga gcagaaattt 600
gtccagcacc acataggccc tgtgaacacc tggatgggcc tccacgacca aaacgggccc 660
tggaagtggg tggacgggac ggactacgag acgggcttca agaactggag gccggagcag 720
ccggacgact ggtacggcca cgggctcgga ggaggcgagg actgtgccca cttcaccgac 780
gacggccgct ggaacgacga cgtctgccag aggccctacc gctgggtctg cgagacagag 840
ctggacaagg ccagccagga gccacctctc ctttaa 876
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 6
tcccaactcc gggaagatc 19
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 7
tgctggctct aaggcagaat ttca 24
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 8
tcagtgctca cagtgaggtt 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
gggttggctc atgttaggaa gg 22
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
tcagcagccg agctgtgaaa 20
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 11
caggctgtgc tacccaaagt tc 22
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 12
ggaggcaatg tgggaagaaa g 21
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
tgaagtcgct agagtcccag ctgg 24
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 14
tcaggtcctt ctgctgtttc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 15
gattgggaat ccgcccatct 20
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 16
cctcttctgc tttctcggga attttcatc 29
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 17
aaagcgccac gggtttcaag 20
<210> 18
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(60)
<223> 小鼠序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (61)..(120)
<223> 人序列
<400> 18
catcccaaag tgggtggcca gggctgggca gagaaagggg gcaacttcgg gtgtgtgtga 60
caagggagtg gtgggtgcag tggtggcgga cacagcgatc ccgttttctt ctctctgcac 120
<210> 19
<211> 160
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(60)
<223> 人序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (61)..(66)
<223> XhoI
<220>
<221> misc_feature
<222> (67)..(100)
<223> loxP
<220>
<221> misc_feature
<222> (101)..(160)
<223> 盒
<400> 19
tgttatttac agatacgtga gtttgggcaa attattgttc tctgtgtccc agctgtaaac 60
ctcgagataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat atgcatggcc tccgcgccgg 120
gttttggcgc ctcccgcggg cgcccccctc ctcacggcga 160
<210> 20
<211> 191
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(60)
<223> 盒
<220>
<221> misc_feature
<222> (61)..(94)
<223> loxP
<220>
<221> misc_feature
<222> (100)..(125)
<223> I-CeuI
<220>
<221> misc_feature
<222> (126)..(131)
<223> NheI
<220>
<221> misc_feature
<222> (132)..(191)
<223> 小鼠序列
<400> 20
tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctgga 60
ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatgctagt aactataacg gtcctaaggt 120
agcgagctag ccgtggacag atacagcaac gtgagctagt tattctgtcc taaagtctca 180
gttggaagat g 191
<210> 21
<211> 9692
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(69)
<223> 小鼠序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(3976)
<223> 人序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (3977)..(3982)
<223> XhoI
<220>
<221> misc_feature
<222> (3983)..(4016)
<223> loxP
<220>
<221> misc_feature
<222> (4023)..(5235)
<223> 人泛素启动子
<220>
<221> misc_feature
<222> (5236)..(5302)
<223> EM7启动子
<220>
<221> misc_feature
<222> (5303)..(6328)
<223> 潮霉素抗性基因
<220>
<221> misc_feature
<222> (6329)..(6813)
<223> PGK聚A
<220>
<221> misc_feature
<222> (6825)..(7506)
<223> Prm启动子
<220>
<221> misc_feature
<222> (7507)..(8646)
<223> Crei
<220>
<221> misc_feature
<222> (8909)..(9119)
<223> SV40聚A
<220>
<221> misc_feature
<222> (9124)..(9157)
<223> loxP
<220>
<221> misc_feature
<222> (9163)..(9188)
<223> I-CeuI
<220>
<221> misc_feature
<222> (9189)..(9194)
<223> NheI
<220>
<221> misc_feature
<222> (9195)..(9692)
<223> 小鼠序列
<400> 21
gtgtgatcac atcccaaagt gggtggccag ggctgggcag agaaaggggg caacttcggg 60
tgtgtgtgac aagggagtgg tgggtgcagt ggtggcggac acagcgatcc cgttttcttc 120
tctctgcacg ctgtcctggc cagactccca gctgcaggag gagctgcggg gcctgagaga 180
gacgttcagc aacttcacag cgagcacgga ggcccaggtc aagggcttga gcacccaggg 240
tgagggcgct ggggcggggc tggggctggg gctggggctg gggggctgtc gggaacgctg 300
agcgagcctc tcccgcagga ggcaatgtgg gaagaaagat gaagtcgcta gagtcccagc 360
tggagaaaca gcagaaggac ctgagtgaag gtcagagagg gagtgtgtgt gtgtgtgtgt 420
gtgtgtgaaa gagagtgaga atgtgtggat gtgtgtgaga aagtgtgagt gtgtgtggat 480
gtgtgtgaga atgagaggga gtgtgtgtgt gtgtgagtct gtgtgtgaga atgaggggga 540
gtgtgttttg ggtgtgtgta tgagagcctt gtgtggatgt gagaatgaga gggagtgtgt 600
atgtctgtga gtgtgagaat gagatggagt gtgtgtgagt ctgtgtgtga gaatgaggtg 660
tgtgtgtgtg agaatgagat ggtgtgtgtg tgggaatgag agggggtgtg tgtctgagtg 720
tgagaatgag atagagtgtg tgtgagacag tctgtgggaa tgagagggag tgtgtgtgag 780
agtgtgagaa tgacggagtg tgtctgtgag tgtgataatg aggtgtgtgt gagtctgagt 840
gtaagaatga gatggggtgt gtgtgtctgt gagtgtgaga gtgtgagaat gaggggtgtt 900
tgtgtctgag tgtgagtctg tgagtgtgag aatgagatgg ggtgtgtgag tgagtgtgag 960
aatgagatgg ggtgtgtgtg tctgtgagtg tgtgtgtgtt tgtgagtgtg agaatgagat 1020
ggggtgtgtg tgagtgtgag aatgagatgg ggtgtgtgtc tgtgtgtgag aatgagatgg 1080
gtgtgtgtgt gacagagtct gagtgtgaga atgagaggga gtgtgtgtga gtgtgagaat 1140
gagaaggagt ggatgggtgt gtgagtctgt gtgaatgagg gagtgggtgt gtgtacgagt 1200
gtgagtctgt gtttatgtgt gagaatgtgt cagtgtatgt gtgtgagaac gtgtgtatgt 1260
gtgttagtgt gtgttgcgtg tgtgggggaa tgagagggat tgtgtctgtg agtgtgagaa 1320
tgagatggag tgtctgtgag actgtgtgtg aggagtggga gtgtgtgtga gaatgagatg 1380
ggtgtgtgtg tctgagtgtg tgtctgtgag aatgagaggg agtgtgtgtg tgtgtgagag 1440
cctgtgtgaa aatgagaagg agtgtggatg ggtgtttgtg agtgggagag tctgtgtgtt 1500
tatgtgtgtg agaatgaggg agtgtgggtg tgtgtgcgaa tgtgagtctg tgtttatgtg 1560
tgtgagaatg tgtcagtgta tgtgagaacg tgtgtgttag tgtgttgcgt gtgtgagaat 1620
gtaagtatat gtgtaagtgc atgtgagtgt gtgtatgtgc gtgttgtgtg aatgtgcatt 1680
gtgtgtgcat gtgtgaaaga gtatatgtgt gttgtgggtg agtgtgtgtg gtgtgtgtag 1740
tgggtgaggg tgtgttgtat gtgtgggtgt gcgttgtgtg aatgtgtgta tgtgggtgag 1800
ggtgtgtgtg cctgtgtgag ggtgtgttgt ggtttttgtg tgtgtttggg tgagggtgtg 1860
ttgtgtgtgt gtgtgggtga aggtgtgttg tgtgtgtcgt gggtgaaggt gtgttgtgtg 1920
tgtagtgact gtagattagg gtgtgttccg tgtgtgtgtg tgagggtgta tgttgtgggt 1980
gttttgtgtg tgagtgggtg tgtaagggtg tgttgtgtgt atgtgggtta aggtgtgtta 2040
tgcgtgaggg tgtattgtgt gtgtgttttg tgtgtgttgt gtgtatgtgg gttagggtgt 2100
gttgtgtgtt tgtgtgtttt gtgtgttgtc tgtgtatgtg ggttacggtg tgttgtgcgt 2160
gtgagggtgt gttgtgtatg gtgtgttgtg tgtgttgtgt gagtgtgtat gtgagttagg 2220
gtgtgttgtg tctatgtatg tgtgtgtaag ggtgtgttgt gtgtctgtgg gtgtgttttg 2280
tgtatgtggg ttagggtgtg ttgtgtgttc tgtattgtgt gttttatgtg ttgtctgtat 2340
gtgggttatg tgtgttgtgt gtgttgtgga tgtatgtggg ttagggtgtg ttgtgtgtct 2400
ctgtgtgttg tctgcgtttg tgtctgtggg ttagggtgtg ttgtatgtgt tgtgttttgt 2460
gtgttgtccg tgtgtgtgta tgtgggttag gttgtgtgtg tgtgtgttgt atattgtctg 2520
tgtgtgtgtg ttaggatgtg ttgtgtgtct gtgtgagtgt gtgtgtaagg gtgtgttgtg 2580
tgtgtaggag tgtgtgtgtg tgtgtgtatg ggggtctctc aggccaactc cgctgctgtt 2640
tgtggcaatg cgacgggtgt tcgggtccca gcaggaggat gtagggctga cctcgtttcc 2700
cgtttccctc cccgtggttt ccgcatctcc tcccgctccc ctccgcccgg tctccccaga 2760
tcactccagc ctgctgctcc acgtgaagca gttcgtgtct gacctgcgga gcctgagctg 2820
tcagatggcg gcgctccagg gcaatggtaa ggaggccagc ccggcccgct ctctgcctcc 2880
ccccttctct gggcagcgct tagcccctgc gccccgtttc tcccgctcag gctcagaaag 2940
gacctgctgc ccggtcaact gggtggagca cgagcgcagc tgctactggt tctctcgctc 3000
cgggaaggcc tgggctgacg ccgacaacta ctgccggctg gaggacgcgc acctggtggt 3060
ggtcacgtcc tgggaggagc aggtgaggac ccggagggtc tgggaggctg gctggcctcg 3120
gagagatcac cacccgcctt ctctctcctc agaaatttgt ccagcaccac ataggccctg 3180
tgaacacctg gatgggcctc cacgaccaaa acgggccctg gaagtgggtg gacgggacgg 3240
actacgagac gggcttcaag tgagtgcgcg ccctccctcg gcctgggtcc ggccgccttc 3300
gcgccctggg gccctgggct gaggagtctg gagcgacccg cctgcggatc cgacctcctg 3360
gggcccacag ctggctctgt ccccaggaac tggaggccgg agcagccgga cgactggtac 3420
ggccacgggc tcggaggagg cgaggactgt gcccacttca ccgacgacgg ccgctggaac 3480
gacgacgtct gccagaggcc ctaccgctgg gtctgcgaga cagagctgga caaggccagc 3540
caggagccac ctctccttta atttatttct tcaatgcctc gacctgccgc aggggtccgg 3600
gattgggaat ccgcccatct gggggcctct tctgctttct cgggaatttt catctaggat 3660
tttaagggaa ggggaaggat agggtgatgt tccgaaggtg aggagcttga aacccgtggc 3720
gctttctgca gtttgcaggt tatcattgtg aacttttttt ttttaagagt aaaaagaaat 3780
atacctaaac cttctgttag ttgtctggtt attggggatt cggaagcagg agtgggctgg 3840
ttggcattac gaagccttag cgggtgctgt ggcatcatga gaactgtgtg ggctttgggc 3900
cagaatggcc agactttgtt atttacagat acgtgagttt gggcaaatta ttgttctctg 3960
tgtcccagct gtaaacctcg agataacttc gtataatgta tgctatacga agttatatgc 4020
atggcctccg cgccgggttt tggcgcctcc cgcgggcgcc cccctcctca cggcgagcgc 4080
tgccacgtca gacgaagggc gcagcgagcg tcctgatcct tccgcccgga cgctcaggac 4140
agcggcccgc tgctcataag actcggcctt agaaccccag tatcagcaga aggacatttt 4200
aggacgggac ttgggtgact ctagggcact ggttttcttt ccagagagcg gaacaggcga 4260
ggaaaagtag tcccttctcg gcgattctgc ggagggatct ccgtggggcg gtgaacgccg 4320
atgattatat aaggacgcgc cgggtgtggc acagctagtt ccgtcgcagc cgggatttgg 4380
gtcgcggttc ttgtttgtgg atcgctgtga tcgtcacttg gtgagtagcg ggctgctggg 4440
ctggccgggg ctttcgtggc cgccgggccg ctcggtggga cggaagcgtg tggagagacc 4500
gccaagggct gtagtctggg tccgcgagca aggttgccct gaactggggg ttggggggag 4560
cgcagcaaaa tggcggctgt tcccgagtct tgaatggaag acgcttgtga ggcgggctgt 4620
gaggtcgttg aaacaaggtg gggggcatgg tgggcggcaa gaacccaagg tcttgaggcc 4680
ttcgctaatg cgggaaagct cttattcggg tgagatgggc tggggcacca tctggggacc 4740
ctgacgtgaa gtttgtcact gactggagaa ctcggtttgt cgtctgttgc gggggcggca 4800
gttatggcgg tgccgttggg cagtgcaccc gtacctttgg gagcgcgcgc cctcgtcgtg 4860
tcgtgacgtc acccgttctg ttggcttata atgcagggtg gggccacctg ccggtaggtg 4920
tgcggtaggc ttttctccgt cgcaggacgc agggttcggg cctagggtag gctctcctga 4980
atcgacaggc gccggacctc tggtgagggg agggataagt gaggcgtcag tttctttggt 5040
cggttttatg tacctatctt cttaagtagc tgaagctccg gttttgaact atgcgctcgg 5100
ggttggcgag tgtgttttgt gaagtttttt aggcaccttt tgaaatgtaa tcatttgggt 5160
caatatgtaa ttttcagtgt tagactagta aattgtccgc taaattctgg ccgtttttgg 5220
cttttttgtt agacgtgttg acaattaatc atcggcatag tatatcggca tagtataata 5280
cgacaaggtg aggaactaaa ccatgaaaaa gcctgaactc accgcgacgt ctgtcgagaa 5340
gtttctgatc gaaaagttcg acagcgtgtc cgacctgatg cagctctcgg agggcgaaga 5400
atctcgtgct ttcagcttcg atgtaggagg gcgtggatat gtcctgcggg taaatagctg 5460
cgccgatggt ttctacaaag atcgttatgt ttatcggcac tttgcatcgg ccgcgctccc 5520
gattccggaa gtgcttgaca ttggggaatt cagcgagagc ctgacctatt gcatctcccg 5580
ccgtgcacag ggtgtcacgt tgcaagacct gcctgaaacc gaactgcccg ctgttctgca 5640
gccggtcgcg gaggccatgg atgcgattgc tgcggccgat cttagccaga cgagcgggtt 5700
cggcccattc ggaccgcaag gaatcggtca atacactaca tggcgtgatt tcatatgcgc 5760
gattgctgat ccccatgtgt atcactggca aactgtgatg gacgacaccg tcagtgcgtc 5820
cgtcgcgcag gctctcgatg agctgatgct ttgggccgag gactgccccg aagtccggca 5880
cctcgtgcac gcggatttcg gctccaacaa tgtcctgacg gacaatggcc gcataacagc 5940
ggtcattgac tggagcgagg cgatgttcgg ggattcccaa tacgaggtcg ccaacatctt 6000
cttctggagg ccgtggttgg cttgtatgga gcagcagacg cgctacttcg agcggaggca 6060
tccggagctt gcaggatcgc cgcggctccg ggcgtatatg ctccgcattg gtcttgacca 6120
actctatcag agcttggttg acggcaattt cgatgatgca gcttgggcgc agggtcgatg 6180
cgacgcaatc gtccgatccg gagccgggac tgtcgggcgt acacaaatcg cccgcagaag 6240
cgcggccgtc tggaccgatg gctgtgtaga agtactcgcc gatagtggaa accgacgccc 6300
cagcactcgt ccgagggcaa aggaataggg ggatccgctg taagtctgca gaaattgatg 6360
atctattaaa caataaagat gtccactaaa atggaagttt ttcctgtcat actttgttaa 6420
gaagggtgag aacagagtac ctacattttg aatggaagga ttggagctac gggggtgggg 6480
gtggggtggg attagataaa tgcctgctct ttactgaagg ctctttacta ttgctttatg 6540
ataatgtttc atagttggat atcataattt aaacaagcaa aaccaaatta agggccagct 6600
cattcctccc actcatgatc tatagatcta tagatctctc gtgggatcat tgtttttctc 6660
ttgattccca ctttgtggtt ctaagtactg tggtttccaa atgtgtcagt ttcatagcct 6720
gaagaacgag atcagcagcc tctgttccac atacacttca ttctcagtat tgttttgcca 6780
agttctaatt ccatcagacc tcgacctgca gcccctagcc cgggcgccag tagcagcacc 6840
cacgtccacc ttctgtctag taatgtccaa cacctccctc agtccaaaca ctgctctgca 6900
tccatgtggc tcccatttat acctgaagca cttgatgggg cctcaatgtt ttactagagc 6960
ccacccccct gcaactctga gaccctctgg atttgtctgt cagtgcctca ctggggcgtt 7020
ggataatttc ttaaaaggtc aagttccctc agcagcattc tctgagcagt ctgaagatgt 7080
gtgcttttca cagttcaaat ccatgtggct gtttcaccca cctgcctggc cttgggttat 7140
ctatcaggac ctagcctaga agcaggtgtg tggcacttaa cacctaagct gagtgactaa 7200
ctgaacactc aagtggatgc catctttgtc acttcttgac tgtgacacaa gcaactcctg 7260
atgccaaagc cctgcccacc cctctcatgc ccatatttgg acatggtaca ggtcctcact 7320
ggccatggtc tgtgaggtcc tggtcctctt tgacttcata attcctaggg gccactagta 7380
tctataagag gaagagggtg ctggctccca ggccacagcc cacaaaattc cacctgctca 7440
caggttggct ggctcgaccc aggtggtgtc ccctgctctg agccagctcc cggccaagcc 7500
agcaccatgg gtacccccaa gaagaagagg aaggtgcgta ccgatttaaa ttccaattta 7560
ctgaccgtac accaaaattt gcctgcatta ccggtcgatg caacgagtga tgaggttcgc 7620
aagaacctga tggacatgtt cagggatcgc caggcgtttt ctgagcatac ctggaaaatg 7680
cttctgtccg tttgccggtc gtgggcggca tggtgcaagt tgaataaccg gaaatggttt 7740
cccgcagaac ctgaagatgt tcgcgattat cttctatatc ttcaggcgcg cggtctggca 7800
gtaaaaacta tccagcaaca tttgggccag ctaaacatgc ttcatcgtcg gtccgggctg 7860
ccacgaccaa gtgacagcaa tgctgtttca ctggttatgc ggcggatccg aaaagaaaac 7920
gttgatgccg gtgaacgtgc aaaacaggct ctagcgttcg aacgcactga tttcgaccag 7980
gttcgttcac tcatggaaaa tagtgatcgc tgccaggata tacgtaatct ggcatttctg 8040
gggattgctt ataacaccct gttacgtata gccgaaattg ccaggatcag ggttaaagat 8100
atctcacgta ctgacggtgg gagaatgtta atccatattg gcagaacgaa aacgctggtt 8160
agcaccgcag gtgtagagaa ggcacttagc ctgggggtaa ctaaactggt cgagcgatgg 8220
atttccgtct ctggtgtagc tgatgatccg aataactacc tgttttgccg ggtcagaaaa 8280
aatggtgttg ccgcgccatc tgccaccagc cagctatcaa ctcgcgccct ggaagggatt 8340
tttgaagcaa ctcatcgatt gatttacggc gctaaggtaa atataaaatt tttaagtgta 8400
taatgtgtta aactactgat tctaattgtt tgtgtatttt aggatgactc tggtcagaga 8460
tacctggcct ggtctggaca cagtgcccgt gtcggagccg cgcgagatat ggcccgcgct 8520
ggagtttcaa taccggagat catgcaagct ggtggctgga ccaatgtaaa tattgtcatg 8580
aactatatcc gtaacctgga tagtgaaaca ggggcaatgg tgcgcctgct ggaagatggc 8640
gattgatcta gataagtaat gatcataatc agccatatca catctgtaga ggttttactt 8700
gctttaaaaa acctcccaca cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt 8760
gttgttaaac ctgccctagt tgcggccaat tccagctgag cgtgcctccg caccattacc 8820
agttggtctg gtgtcaaaaa taataataac cgggcagggg ggatctaagc tctagataag 8880
taatgatcat aatcagccat atcacatctg tagaggtttt acttgcttta aaaaacctcc 8940
cacacctccc cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaat tgttgttgtt aacttgttta 9000
ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat 9060
ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct 9120
ggaataactt cgtataatgt atgctatacg aagttatgct agtaactata acggtcctaa 9180
ggtagcgagc tagccgtgga cagatacagc aacgtgagct agttattctg tcctaaagtc 9240
tcagttggaa gatgggagga tttttgacct ctgtctgctg ggggcaggac caaccaccag 9300
ggaactgcag cccccctgtg ctgagtgcat cagagacttg gaatggaaca cactggcctg 9360
cgacactcat cacaacgaac agaaactgct ttgtacactg aataaacgca gtgaataccc 9420
agctcaggat cacagacaca tgaatgcaaa gttatattag tataaccaag ggtgggaatg 9480
agggcaatta cagataactt atagacatga attactaaca aaacagggca aaatgtttgc 9540
tcataaataa catgaaaata caatatatag tcatatgtat atatacatgt atatatataa 9600
atgacataat atgtatatat ttttacaaat acactgcagg aaaataatat ttttcctcta 9660
cagaagagat tggcaaatct gacatctaaa at 9692
<210> 22
<211> 160
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(90)
<223> 小鼠序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (91)..(160)
<223> 人序列
<400> 22
catgatgttt ctttcttagg aaagccaggg catttctcta ttctccaatc tcttggctca 60
atgcccttgg cctctctttt gttccactag tgaagcctct ccagccaggg gctgaggtcc 120
cggtggtgtg ggcccaggag ggggctcctg cccagctccc 160
<210> 23
<211> 197
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(60)
<223> 人序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (61)..(66)
<223> XhoI
<220>
<221> misc_feature
<222> (67)..(100)
<223> loxP
<220>
<221> misc_feature
<222> (106)..(131)
<223> I-CeuI
<220>
<221> misc_feature
<222> (132)..(137)
<223> NheI
<220>
<221> misc_feature
<222> (138)..(197)
<223> 小鼠序列
<400> 23
tgttatttac agatacgtga gtttgggcaa attattgttc tctgtgtccc agctgtaaac 60
ctcgagataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat gctagtaact ataacggtcc 120
taaggtagcg agctagccgt ggacagatac agcaacgtga gctagttatt ctgtcctaaa 180
gtctcagttg gaagatg 197
<210> 24
<211> 4551
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(69)
<223> 小鼠序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (70)..(3976)
<223> 人序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (3977)..(3982)
<223> XhoI
<220>
<221> misc_feature
<222> (3983)..(4016)
<223> LoxP
<220>
<221> misc_feature
<222> (4022)..(4047)
<223> I-CeuI
<220>
<221> misc_feature
<222> (4048)..(4053)
<223> NheI
<220>
<221> misc_feature
<222> (4054)..(4551)
<223> 小鼠序列
<400> 24
gtgtgatcac atcccaaagt gggtggccag ggctgggcag agaaaggggg caacttcggg 60
tgtgtgtgac aagggagtgg tgggtgcagt ggtggcggac acagcgatcc cgttttcttc 120
tctctgcacg ctgtcctggc cagactccca gctgcaggag gagctgcggg gcctgagaga 180
gacgttcagc aacttcacag cgagcacgga ggcccaggtc aagggcttga gcacccaggg 240
tgagggcgct ggggcggggc tggggctggg gctggggctg gggggctgtc gggaacgctg 300
agcgagcctc tcccgcagga ggcaatgtgg gaagaaagat gaagtcgcta gagtcccagc 360
tggagaaaca gcagaaggac ctgagtgaag gtcagagagg gagtgtgtgt gtgtgtgtgt 420
gtgtgtgaaa gagagtgaga atgtgtggat gtgtgtgaga aagtgtgagt gtgtgtggat 480
gtgtgtgaga atgagaggga gtgtgtgtgt gtgtgagtct gtgtgtgaga atgaggggga 540
gtgtgttttg ggtgtgtgta tgagagcctt gtgtggatgt gagaatgaga gggagtgtgt 600
atgtctgtga gtgtgagaat gagatggagt gtgtgtgagt ctgtgtgtga gaatgaggtg 660
tgtgtgtgtg agaatgagat ggtgtgtgtg tgggaatgag agggggtgtg tgtctgagtg 720
tgagaatgag atagagtgtg tgtgagacag tctgtgggaa tgagagggag tgtgtgtgag 780
agtgtgagaa tgacggagtg tgtctgtgag tgtgataatg aggtgtgtgt gagtctgagt 840
gtaagaatga gatggggtgt gtgtgtctgt gagtgtgaga gtgtgagaat gaggggtgtt 900
tgtgtctgag tgtgagtctg tgagtgtgag aatgagatgg ggtgtgtgag tgagtgtgag 960
aatgagatgg ggtgtgtgtg tctgtgagtg tgtgtgtgtt tgtgagtgtg agaatgagat 1020
ggggtgtgtg tgagtgtgag aatgagatgg ggtgtgtgtc tgtgtgtgag aatgagatgg 1080
gtgtgtgtgt gacagagtct gagtgtgaga atgagaggga gtgtgtgtga gtgtgagaat 1140
gagaaggagt ggatgggtgt gtgagtctgt gtgaatgagg gagtgggtgt gtgtacgagt 1200
gtgagtctgt gtttatgtgt gagaatgtgt cagtgtatgt gtgtgagaac gtgtgtatgt 1260
gtgttagtgt gtgttgcgtg tgtgggggaa tgagagggat tgtgtctgtg agtgtgagaa 1320
tgagatggag tgtctgtgag actgtgtgtg aggagtggga gtgtgtgtga gaatgagatg 1380
ggtgtgtgtg tctgagtgtg tgtctgtgag aatgagaggg agtgtgtgtg tgtgtgagag 1440
cctgtgtgaa aatgagaagg agtgtggatg ggtgtttgtg agtgggagag tctgtgtgtt 1500
tatgtgtgtg agaatgaggg agtgtgggtg tgtgtgcgaa tgtgagtctg tgtttatgtg 1560
tgtgagaatg tgtcagtgta tgtgagaacg tgtgtgttag tgtgttgcgt gtgtgagaat 1620
gtaagtatat gtgtaagtgc atgtgagtgt gtgtatgtgc gtgttgtgtg aatgtgcatt 1680
gtgtgtgcat gtgtgaaaga gtatatgtgt gttgtgggtg agtgtgtgtg gtgtgtgtag 1740
tgggtgaggg tgtgttgtat gtgtgggtgt gcgttgtgtg aatgtgtgta tgtgggtgag 1800
ggtgtgtgtg cctgtgtgag ggtgtgttgt ggtttttgtg tgtgtttggg tgagggtgtg 1860
ttgtgtgtgt gtgtgggtga aggtgtgttg tgtgtgtcgt gggtgaaggt gtgttgtgtg 1920
tgtagtgact gtagattagg gtgtgttccg tgtgtgtgtg tgagggtgta tgttgtgggt 1980
gttttgtgtg tgagtgggtg tgtaagggtg tgttgtgtgt atgtgggtta aggtgtgtta 2040
tgcgtgaggg tgtattgtgt gtgtgttttg tgtgtgttgt gtgtatgtgg gttagggtgt 2100
gttgtgtgtt tgtgtgtttt gtgtgttgtc tgtgtatgtg ggttacggtg tgttgtgcgt 2160
gtgagggtgt gttgtgtatg gtgtgttgtg tgtgttgtgt gagtgtgtat gtgagttagg 2220
gtgtgttgtg tctatgtatg tgtgtgtaag ggtgtgttgt gtgtctgtgg gtgtgttttg 2280
tgtatgtggg ttagggtgtg ttgtgtgttc tgtattgtgt gttttatgtg ttgtctgtat 2340
gtgggttatg tgtgttgtgt gtgttgtgga tgtatgtggg ttagggtgtg ttgtgtgtct 2400
ctgtgtgttg tctgcgtttg tgtctgtggg ttagggtgtg ttgtatgtgt tgtgttttgt 2460
gtgttgtccg tgtgtgtgta tgtgggttag gttgtgtgtg tgtgtgttgt atattgtctg 2520
tgtgtgtgtg ttaggatgtg ttgtgtgtct gtgtgagtgt gtgtgtaagg gtgtgttgtg 2580
tgtgtaggag tgtgtgtgtg tgtgtgtatg ggggtctctc aggccaactc cgctgctgtt 2640
tgtggcaatg cgacgggtgt tcgggtccca gcaggaggat gtagggctga cctcgtttcc 2700
cgtttccctc cccgtggttt ccgcatctcc tcccgctccc ctccgcccgg tctccccaga 2760
tcactccagc ctgctgctcc acgtgaagca gttcgtgtct gacctgcgga gcctgagctg 2820
tcagatggcg gcgctccagg gcaatggtaa ggaggccagc ccggcccgct ctctgcctcc 2880
ccccttctct gggcagcgct tagcccctgc gccccgtttc tcccgctcag gctcagaaag 2940
gacctgctgc ccggtcaact gggtggagca cgagcgcagc tgctactggt tctctcgctc 3000
cgggaaggcc tgggctgacg ccgacaacta ctgccggctg gaggacgcgc acctggtggt 3060
ggtcacgtcc tgggaggagc aggtgaggac ccggagggtc tgggaggctg gctggcctcg 3120
gagagatcac cacccgcctt ctctctcctc agaaatttgt ccagcaccac ataggccctg 3180
tgaacacctg gatgggcctc cacgaccaaa acgggccctg gaagtgggtg gacgggacgg 3240
actacgagac gggcttcaag tgagtgcgcg ccctccctcg gcctgggtcc ggccgccttc 3300
gcgccctggg gccctgggct gaggagtctg gagcgacccg cctgcggatc cgacctcctg 3360
gggcccacag ctggctctgt ccccaggaac tggaggccgg agcagccgga cgactggtac 3420
ggccacgggc tcggaggagg cgaggactgt gcccacttca ccgacgacgg ccgctggaac 3480
gacgacgtct gccagaggcc ctaccgctgg gtctgcgaga cagagctgga caaggccagc 3540
caggagccac ctctccttta atttatttct tcaatgcctc gacctgccgc aggggtccgg 3600
gattgggaat ccgcccatct gggggcctct tctgctttct cgggaatttt catctaggat 3660
tttaagggaa ggggaaggat agggtgatgt tccgaaggtg aggagcttga aacccgtggc 3720
gctttctgca gtttgcaggt tatcattgtg aacttttttt ttttaagagt aaaaagaaat 3780
atacctaaac cttctgttag ttgtctggtt attggggatt cggaagcagg agtgggctgg 3840
ttggcattac gaagccttag cgggtgctgt ggcatcatga gaactgtgtg ggctttgggc 3900
cagaatggcc agactttgtt atttacagat acgtgagttt gggcaaatta ttgttctctg 3960
tgtcccagct gtaaacctcg agataacttc gtataatgta tgctatacga agttatgcta 4020
gtaactataa cggtcctaag gtagcgagct agccgtggac agatacagca acgtgagcta 4080
gttattctgt cctaaagtct cagttggaag atgggaggat ttttgacctc tgtctgctgg 4140
gggcaggacc aaccaccagg gaactgcagc ccccctgtgc tgagtgcatc agagacttgg 4200
aatggaacac actggcctgc gacactcatc acaacgaaca gaaactgctt tgtacactga 4260
ataaacgcag tgaataccca gctcaggatc acagacacat gaatgcaaag ttatattagt 4320
ataaccaagg gtgggaatga gggcaattac agataactta tagacatgaa ttactaacaa 4380
aacagggcaa aatgtttgct cataaataac atgaaaatac aatatatagt catatgtata 4440
tatacatgta tatatataaa tgacataata tgtatatatt tttacaaata cactgcagga 4500
aaataatatt tttcctctac agaagagatt ggcaaatctg acatctaaaa t 4551
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 25
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 26
gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg 30
<210> 27
<211> 63
<212> PRT
<213> 智人
<400> 27
Ser Gln Asn Ser Gln Leu Gln Glu Glu Leu Arg Gly Leu Arg Glu Thr
1 5 10 15
Phe Ser Asn Phe Thr Ala Ser Thr Glu Ala Gln Val Lys Gly Leu Ser
20 25 30
Thr Gln Gly Gly Asn Val Gly Arg Lys Met Lys Ser Leu Glu Ser Gln
35 40 45
Leu Glu Lys Gln Gln Lys Asp Leu Ser Glu Asp His Ser Ser Leu
50 55 60
<210> 28
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
His Glu Arg Ser Cys Tyr Trp Phe Ser Arg Ser Gly Lys Ala Trp Ala
1 5 10 15
Asp Ala Asp Asn Tyr Cys Arg Leu Glu Asp Ala His Leu Val Val Val
20 25 30
Thr Ser Trp Glu Glu Gln Lys Phe Val Gln His His Ile Gly Pro Val
35 40 45
Asn Thr Trp Met Gly Leu His Asp Gln Asn Gly Pro Trp Lys Trp Val
50 55 60
Asp Gly Thr Asp Tyr Glu Thr Gly Phe Lys Asn Trp Arg Pro Glu Gln
65 70 75 80
Pro Asp Asp Trp Tyr Gly His Gly Leu Gly Gly Gly Glu Asp Cys Ala
85 90 95
His Phe Thr Asp Asp Gly Arg Trp Asn Asp Asp Val Cys Gln Arg Pro
100 105 110
Tyr Arg Trp Val Cys Glu
115
<210> 29
<211> 39
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 29
Met Thr Lys Asp Tyr Gln Asp Phe Gln His Leu Asp Asn Asp Asn Asp
1 5 10 15
His His Gln Leu Arg Arg Gly Pro Pro Pro Thr Pro Arg Leu Leu Gln
20 25 30
Arg Leu Cys Ser Gly Ser Arg
35
<210> 30
<211> 21
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 30
Leu Leu Leu Leu Ser Ser Ser Leu Ser Ile Leu Leu Leu Val Val Val
1 5 10 15
Cys Val Ile Thr Ser
20
<210> 31
<211> 229
<212> PRT
<213> 智人
<400> 31
Asn Ser Gln Leu Gln Glu Glu Leu Arg Gly Leu Arg Glu Thr Phe Ser
1 5 10 15
Asn Phe Thr Ala Ser Thr Glu Ala Gln Val Lys Gly Leu Ser Thr Gln
20 25 30
Gly Gly Asn Val Gly Arg Lys Met Lys Ser Leu Glu Ser Gln Leu Glu
35 40 45
Lys Gln Gln Lys Asp Leu Ser Glu Asp His Ser Ser Leu Leu Leu His
50 55 60
Val Lys Gln Phe Val Ser Asp Leu Arg Ser Leu Ser Cys Gln Met Ala
65 70 75 80
Ala Leu Gln Gly Asn Gly Ser Glu Arg Thr Cys Cys Pro Val Asn Trp
85 90 95
Val Glu His Glu Arg Ser Cys Tyr Trp Phe Ser Arg Ser Gly Lys Ala
100 105 110
Trp Ala Asp Ala Asp Asn Tyr Cys Arg Leu Glu Asp Ala His Leu Val
115 120 125
Val Val Thr Ser Trp Glu Glu Gln Lys Phe Val Gln His His Ile Gly
130 135 140
Pro Val Asn Thr Trp Met Gly Leu His Asp Gln Asn Gly Pro Trp Lys
145 150 155 160
Trp Val Asp Gly Thr Asp Tyr Glu Thr Gly Phe Lys Asn Trp Arg Pro
165 170 175
Glu Gln Pro Asp Asp Trp Tyr Gly His Gly Leu Gly Gly Gly Glu Asp
180 185 190
Cys Ala His Phe Thr Asp Asp Gly Arg Trp Asn Asp Asp Val Cys Gln
195 200 205
Arg Pro Tyr Arg Trp Val Cys Glu Thr Glu Leu Asp Lys Ala Ser Gln
210 215 220
Glu Pro Pro Leu Leu
225
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 32
ggagtaccag ctcccgtacg 20
<210> 33
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 33
ctcttctgag atgagttttt gttcgttgcc tctctggagg ttg 43
<210> 34
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 34
aaactcatct cagaagagga tctgagacaa gcagctaccg cag 43
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 35
tccgcccgct gtttaaac 18
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 36
ggaaccccta gtgatggagt t 21
<210> 37
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 37
cggcctcagt gagcga 16
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 38
cactccctct ctgcgcgctc g 21
<210> 39
<211> 291
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 39
Met Thr Lys Glu Tyr Gln Asp Leu Gln His Leu Asp Asn Glu Glu Ser
1 5 10 15
Asp His His Gln Leu Gly Lys Gly Pro Pro Pro Pro Gln Ser Leu Leu
20 25 30
Arg Arg Leu Cys Ser Gly Pro Arg Leu Leu Leu Leu Ser Leu Gly Leu
35 40 45
Ser Leu Leu Leu Leu Val Val Val Cys Val Ile Gly Ser Gln Asn Ala
50 55 60
Gln Leu Gln Arg Glu Leu Arg Gly Leu Arg Glu Thr Leu Ser Asn Phe
65 70 75 80
Thr Ala Ser Thr Glu Ala Gln Val Lys Gly Leu Ser Thr Gln Gly Gly
85 90 95
Asn Val Gly Arg Lys Met Lys Ser Leu Glu Ser Gln Leu Glu Lys Gln
100 105 110
Gln Lys Asp Leu Ser Glu Asp His Ser Ser Leu Leu Leu His Val Lys
115 120 125
Gln Phe Val Ser Asp Leu Arg Ser Leu Ser Cys Gln Met Ala Ala Leu
130 135 140
Gln Gly Asn Gly Ser Glu Arg Ala Cys Cys Pro Val Asn Trp Val Glu
145 150 155 160
His Glu Arg Ser Cys Tyr Trp Phe Ser Arg Ser Gly Lys Ala Trp Ala
165 170 175
Asp Ala Asp Asn Tyr Cys Arg Leu Glu Asp Ala His Leu Val Val Val
180 185 190
Thr Ser Trp Glu Glu Gln Lys Phe Val Gln His His Ile Gly Pro Val
195 200 205
Asn Thr Trp Met Gly Leu His Asp Gln Asn Gly Pro Trp Lys Trp Val
210 215 220
Asp Gly Thr Asp Tyr Glu Thr Gly Phe Lys Asn Trp Arg Pro Glu Gln
225 230 235 240
Pro Asp Asp Trp Tyr Gly His Gly Leu Gly Gly Gly Glu Asp Cys Ala
245 250 255
His Phe Thr Asp Asp Gly Arg Trp Asn Asp Asp Val Cys Gln Arg Pro
260 265 270
Tyr Arg Trp Val Cys Glu Thr Glu Leu Asp Lys Ala Ser Gln Glu Pro
275 280 285
Pro Leu Leu
290
<210> 40
<211> 876
<212> DNA
<213> 食蟹猴
<400> 40
atgaccaagg agtatcagga cctgcagcat ctggacaatg aggagagtga ccaccatcag 60
ctcggaaaag ggccacctcc tccgcagtcc ctcctgcggc gtctctgctc cggccctcgc 120
ctcctcctgc tctccctggg cctcagcctc ctgctgctgg tggttgtctg tgtgatcgga 180
tcccaaaacg cccagctgca gcgggagctg cggggcctga gagagacgct cagcaacttc 240
acagcgagca ccgaggccca ggtcaagggc ttgagcaccc agggaggcaa tgtgggaaga 300
aagatgaagt cgctggagtc ccagctggag aaacagcaga aggacttgag tgaagatcac 360
tccagcctgc tgctccacgt gaagcagttc gtgtctgacc tgcggagcct gagctgtcag 420
atggcggcgc tccagggcaa tggctcggaa agggcctgct gcccagtcaa ctgggtggag 480
cacgagcgca gctgctactg gttctctcgc tccgggaagg cctgggccga cgccgacaac 540
tactgccggc tggaggacgc gcacctggtg gtggtcacgt cctgggagga gcagaaattt 600
gtccagcacc acataggtcc tgtgaacacc tggatgggcc tccacgacca aaacgggccc 660
tggaagtggg tggacgggac ggactacgag acgggcttca agaactggag accggagcag 720
ccggacgact ggtacggcca cgggctcggg ggaggggagg actgtgccca cttcaccgac 780
gacggccgct ggaacgacga cgtctgccag aggccctacc gctgggtctg cgagacagag 840
ctggacaagg ccagtcagga gccacctctc ctttaa 876
<210> 41
<211> 284
<212> PRT
<213> 褐家鼠
<400> 41
Met Thr Lys Asp Tyr Gln Asp Phe Gln His Leu Asp Asn Glu Asn Asp
1 5 10 15
His His Gln Leu Gln Arg Gly Pro Pro Pro Ala Pro Arg Leu Leu Gln
20 25 30
Arg Leu Cys Ser Gly Phe Arg Leu Phe Leu Leu Ser Leu Gly Leu Ser
35 40 45
Ile Leu Leu Leu Val Val Val Cys Val Ile Thr Ser Gln Asn Ser Gln
50 55 60
Leu Arg Glu Asp Leu Arg Val Leu Arg Gln Asn Phe Ser Asn Phe Thr
65 70 75 80
Val Ser Thr Glu Asp Gln Val Lys Ala Leu Thr Thr Gln Gly Glu Arg
85 90 95
Val Gly Arg Lys Met Lys Leu Val Glu Ser Gln Leu Glu Lys His Gln
100 105 110
Glu Asp Leu Arg Glu Asp His Ser Arg Leu Leu Leu His Val Lys Gln
115 120 125
Leu Val Ser Asp Val Arg Ser Leu Ser Cys Gln Met Ala Ala Leu Arg
130 135 140
Gly Asn Gly Ser Glu Arg Ile Cys Cys Pro Ile Asn Trp Val Glu Tyr
145 150 155 160
Glu Gly Ser Cys Tyr Trp Phe Ser Ser Ser Val Lys Pro Trp Thr Glu
165 170 175
Ala Asp Lys Tyr Cys Gln Leu Glu Asn Ala His Leu Val Val Val Thr
180 185 190
Ser Trp Glu Glu Gln Arg Phe Val Gln Gln His Met Gly Pro Leu Asn
195 200 205
Thr Trp Ile Gly Leu Thr Asp Gln Asn Gly Pro Trp Lys Trp Val Asp
210 215 220
Gly Thr Asp Tyr Glu Thr Gly Phe Lys Asn Trp Arg Pro Gly Gln Pro
225 230 235 240
Asp Asp Trp Tyr Gly His Gly Leu Gly Gly Gly Glu Asp Cys Ala His
245 250 255
Phe Thr Thr Asp Gly His Trp Asn Asp Asp Val Cys Arg Arg Pro Tyr
260 265 270
Arg Trp Val Cys Glu Thr Glu Leu Gly Lys Ala Asn
275 280
<210> 42
<211> 855
<212> DNA
<213> 褐家鼠
<400> 42
atgacaaagg attatcaaga tttccagcac ttggacaatg agaacgacca ccatcaactc 60
cagagagggc cacctcccgc tccaaggctc ttgcagcgac tctgctctgg attccgtctc 120
ttcctgcttt ccctgggcct cagcatcctg ctgctggtgg ttgtctgtgt gatcacatcc 180
caaaattccc aactccggga agatctgcgg gttctaaggc agaatttcag caactttacc 240
gtgagcactg aggaccaggt caaggccctg accacccagg gagagagagt gggaagaaag 300
atgaagttag tcgagtcaca gctggaaaaa catcaggagg atctgaggga agaccactct 360
agattgctac tgcatgtaaa gcagttagtg tctgacgtgc gaagcttgag ctgccagatg 420
gccgcacttc ggggcaatgg ctctgaaagg atctgctgcc ccatcaactg ggtggagtat 480
gaaggcagct gctactggtt ctccagctct gtgaagcctt ggacggaagc tgacaagtac 540
tgccagctgg agaacgccca cctggtggtg gtgacttcct gggaggagca gagattcgtc 600
cagcaacaca tgggcccctt aaatacttgg attggcctaa ctgaccagaa cggaccctgg 660
aaatgggtgg atgggacaga ctatgagaca ggcttcaaga actggagacc agggcagcca 720
gatgactggt acggacatgg gcttggaggg ggtgaagact gtgcccactt caccaccgat 780
ggccactgga atgatgacgt ctgcaggagg ccctaccgct gggtctgtga gacagagttg 840
ggcaaggcca attag 855

Claims (65)

1.一种非人动物基因组，其包含：
(i)编码野生型内源Asgr2蛋白的野生型内源Asgr2基因和
(ii)编码修饰的Asgr1蛋白的遗传修饰的内源Asgr1基因座，
其中所述修饰的Asgr1蛋白包含胞质结构域、跨膜结构域和细胞外结构域，
其中所述细胞外结构域包含卷曲螺旋结构域和C型凝集素结构域，
其中所述卷曲螺旋结构域由所述内源Asgr1基因座的区段编码，所述区段已被缺失且替换为直系同源人ASGR1序列，并且
其中包含所述非人动物基因组的非人动物：(a)表达野生型内源Asgr2蛋白和所述修饰的Asgr1蛋白，并且(b)包含的总胆固醇和甘油三酯水平与表达野生型Asgr1蛋白的对照小鼠相比无显著差异。
2.根据权利要求1所述的非人动物基因组，其中所述C型凝集素结构域的全部或部分由内源Asgr1基因座的区段编码，所述区段已被缺失且替换为直系同源人ASGR1序列。
3.根据权利要求2所述的非人动物基因组，其中所述C型凝集素结构域是人ASGR1 C型凝集素结构域。
4.根据权利要求2所述的非人动物基因组，其中所述C型凝集素结构域包含SEQ ID NO:28中所示的序列。
5.根据权利要求1所述的非人动物基因组，其中所述卷曲螺旋结构域包含SEQ ID NO:27中所示的序列。
6.根据权利要求1所述的非人动物基因组，其中所述卷曲螺旋结构域包含SEQ ID NO:27中所示的序列，并且所述C型凝集素结构域包含SEQ ID NO:28中所示的序列。
7.根据权利要求1所述的非人动物基因组，其中所述直系同源人ASGR1序列包含人ASGR1基因的外显子3-8。
8.根据权利要求7所述的非人动物基因组，其中所述直系同源人ASGR1序列编码包含SEQ ID NO:31中所示的序列的ASGR1蛋白区段。
9.根据权利要求1所述的非人动物基因组，其中所述胞质结构域的全部或部分由内源性非人动物Asgr1序列编码。
10.根据权利要求1所述的非人动物基因组，其中所述跨膜结构域的全部或部分由内源性非人动物Asgr1序列编码。
11.根据权利要求1所述的非人动物基因组，其中所述胞质结构域和所述跨膜结构域两者的全部或部分由内源性非人动物Asgr1序列编码。
12.根据权利要求1所述的非人动物基因组，其中所述非人动物基因组对于所述遗传修饰的内源Asgr1基因座是杂合的。
13.根据权利要求1所述的非人动物基因组，其中所述非人动物基因组对于所述遗传修饰的内源Asgr1基因座是纯合的。
14.根据前述权利要求中任一项所述的非人动物基因组，其中所述非人动物基因组是哺乳动物基因组。
15.根据权利要求14所述的非人动物基因组，其中所述非人动物基因组是啮齿类动物基因组。
16.根据权利要求15所述的非人动物基因组，其中所述非人动物基因组是大鼠基因组或小鼠基因组。
17.根据权利要求16所述的非人动物基因组，其中所述非人动物基因组是小鼠基因组。
18.根据权利要求17所述的非人动物基因组，其中所述胞质结构域的全部或部分由内源性小鼠Asgr1序列编码。
19.根据权利要求18所述的非人动物基因组，其中所述胞质结构域包含SEQ ID NO:29中所示的序列。
20.根据权利要求17所述的非人动物基因组，其中所述跨膜结构域的全部或部分由内源性小鼠Asgr1序列编码。
21.根据权利要求20所述的非人动物基因组，其中所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:30中所示的序列。
22.根据权利要求17所述的非人动物基因组，其中所述胞质结构域和所述跨膜结构域两者的全部或部分由内源性小鼠Asgr1序列编码。
23.根据权利要求22所述的非人动物基因组，其中所述胞质结构域包含SEQ ID NO:29中所示的序列，并且所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:30中所示的序列。
24.根据权利要求17所述的非人动物基因组，其中所述卷曲螺旋结构域和C型凝集素结构域两者的全部或部分由内源Asgr1基因座的区段编码，所述区段已被缺失且替换为直系同源人ASGR1序列，并且所述胞质结构域和所述跨膜结构域两者的全部或部分由内源性小鼠Asgr1序列编码。
25.根据权利要求17所述的非人动物基因组，其中所述C型凝集素结构域是人ASGR1 C型凝集素结构域，并且所述卷曲螺旋结构域是人ASGR1卷曲螺旋结构域，所述胞质结构域是小鼠Asgr1胞质结构域，并且所述跨膜结构域是小鼠Asgr1跨膜结构域。
26.根据权利要求17所述的非人动物基因组，其中所述C型凝集素结构域包含SEQ IDNO:28中所示的序列，所述卷曲螺旋结构域包含SEQ ID NO:27中所示的序列，所述胞质结构域包含SEQ ID NO:29中所示的序列，并且所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:30中所示的序列。
27.根据权利要求26所述的非人动物基因组，其中所述修饰的Asgr1蛋白包含SEQ IDNO:3中所示的序列。
28.一种评价治疗性复合物在体内经由人ASGR1介导的内在化对肝的递送的方法，其包括：
(a)将所述治疗性复合物施用于包含根据权利要求1-27中任一项所述的非人动物基因组的动物，其中所述治疗性复合物包含治疗性分子和特异性结合人ASGR1的抗原结合蛋白或配体；和
(b)评价所述治疗性分子对所述非人动物的肝的递送，
其中包含所述非人动物基因组的动物(a)表达野生型内源Asgr2蛋白和所述修饰的Asgr1蛋白，并且(b)包含的总胆固醇和甘油三酯水平与表达野生型Asgr1蛋白的对照小鼠相比无显著差异。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述治疗性分子是溶酶体替代蛋白或酶或者编码溶酶体替代蛋白或酶的核酸，并且步骤(b)包括评价所述溶酶体替代蛋白或酶在所述非人动物的肝中的存在或活性。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述治疗性分子是编码治疗性分泌蛋白的核酸，并且步骤(b)包括评价所述治疗性分泌蛋白在所述非人动物中的血清水平或活性。
31.一种评价靶向肝细胞表面蛋白或可溶性蛋白的治疗性分子在体内经由人ASGR1内在化进入肝的功效的方法，其包括：
(a)将所述治疗性分子施用于包含根据权利要求1-27中任一项所述的非人动物基因组的非人动物，其中所述治疗性分子包含特异性结合所述肝细胞表面蛋白或所述可溶性蛋白、并且特异性结合人ASGR1的双特异性抗原结合蛋白；和
(b)评价所述肝细胞表面蛋白在所述非人动物的肝中的细胞表面水平或活性，或者评价所述可溶性蛋白在所述非人动物的肝中的表达或活性，
其中包含所述非人动物基因组的所述非人动物：(a)表达野生型内源Asgr2蛋白和所述修饰的Asgr1蛋白，并且(b)包含的总胆固醇和甘油三酯水平与表达野生型Asgr1蛋白的对照小鼠相比无显著差异。
32.一种非人动物细胞，其包含：
(i)编码野生型内源Asgr2蛋白的野生型内源Asgr2基因和
(ii)编码修饰的Asgr1蛋白的遗传修饰的内源Asgr1基因座，
其中所述修饰的Asgr1蛋白包含胞质结构域、跨膜结构域和细胞外结构域，
其中所述细胞外结构域包含卷曲螺旋结构域，所述卷曲螺旋结构域由所述内源Asgr1基因座的区段编码，所述区段已被缺失且替换为直系同源人ASGR1序列，
其中所述细胞在体外维持，不能发育为非人动物。
33.根据权利要求32所述的非人动物细胞，其中所述非人动物细胞是肝细胞，并且其中所述肝细胞表达所述野生型内源Asgr2蛋白和所述修饰的Asgr1蛋白。
34.根据权利要求32所述的非人动物细胞，其中所述非人动物细胞是多能细胞。
35.一种组合物，其包含根据权利要求32至34中任一项所述的非人动物细胞。
36.根据权利要求1所述的非人动物基因组，其中所述遗传修饰的内源Asgr1基因座包含选自SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:23及其组合的核苷酸序列。
37.根据权利要求1所述的非人动物基因组，其中所述遗传修饰的内源Asgr1基因座包含如SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列。
38.一种多肽，其由权利要求36或37中所述的遗传修饰的内源Asgr1基因座编码。
39.一种制备非人动物的方法，所述方法包括修饰所述非人动物的基因组以使其包含编码修饰的Asgr1蛋白的遗传修饰的内源Asgr1基因座，
其中所述修饰的Asgr1蛋白包含胞质结构域、跨膜结构域和细胞外结构域，
其中所述细胞外结构域包含卷曲螺旋结构域和C型凝集素结构域，
其中所述卷曲螺旋结构域由所述内源Asgr1基因座的区段编码，所述区段已被缺失且替换为直系同源人ASGR1序列，
其中所述非人动物表达所述修饰的Asgr1蛋白和野生型内源Asgr2蛋白，并且
其中所述非人动物的总胆固醇和甘油三酯水平与表达野生型Asgr1蛋白的对照非人动物相比无显著差异。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述C型凝集素结构域的全部或部分由所述内源Asgr1基因座的区段编码，所述区段已被缺失且替换为直系同源人ASGR1序列。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述C型凝集素结构域是人ASGR1 C型凝集素结构域。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述C型凝集素结构域包含SEQ ID NO:28中所示的序列。
43.根据权利要求39所述的方法，其中所述卷曲螺旋结构域包含SEQ ID NO:27中所示的序列。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述卷曲螺旋结构域包含SEQ ID NO:27中所示的序列，并且所述C型凝集素结构域包含SEQ ID NO:28中所示的序列。
45.根据权利要求39所述的方法，其中所述直系同源人ASGR1序列包含人ASGR1基因的外显子3-8。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述直系同源人ASGR1序列编码包含SEQ ID NO:31中所示的序列的ASGR1蛋白区段。
47.根据权利要求39所述的方法，其中所述胞质结构域的全部或部分由内源性非人动物Asgr1序列编码。
48.根据权利要求39所述的方法，其中所述跨膜结构域的全部或部分由内源性非人动物Asgr1序列编码。
49.根据权利要求39所述的方法，其中所述胞质结构域和所述跨膜结构域两者的全部或部分由内源性非人动物Asgr1序列编码。
50.根据权利要求39所述的方法，其中所述非人动物对于所述遗传修饰的内源Asgr1基因座是杂合的。
51.根据权利要求39所述的方法，其中所述非人动物对于所述遗传修饰的内源Asgr1基因座是纯合的。
52.根据权利要求39-51中任一项所述的方法，其中所述非人动物是哺乳动物。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述非人动物是啮齿动物。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述非人动物是大鼠或小鼠。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述非人动物是小鼠。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述胞质结构域的全部或部分由内源性小鼠Asgr1序列编码。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述胞质结构域包含SEQ ID NO:29中所示的序列。
58.根据权利要求55所述的方法，其中所述跨膜结构域的全部或部分由内源性小鼠Asgr1序列编码。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:30中所示的序列。
60.根据权利要求55所述的方法，其中所述胞质结构域和所述跨膜结构域两者的全部或部分由内源性小鼠Asgr1序列编码。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述胞质结构域包含SEQ ID NO:29中所示的序列，并且所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:30中所示的序列。
62.根据权利要求55-61中任一项所述的方法，其中所述卷曲螺旋结构域和C型凝集素结构域两者的全部或部分由内源Asgr1基因座的区段编码，所述区段已被缺失且替换为直系同源人ASGR1序列，并且所述胞质结构域和所述跨膜结构域两者的全部或部分由内源性小鼠Asgr1序列编码。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述C型凝集素结构域是人ASGR1 C型凝集素结构域，并且所述卷曲螺旋结构域是人ASGR1卷曲螺旋结构域，所述胞质结构域是小鼠Asgr1胞质结构域，并且所述跨膜结构域是小鼠Asgr1跨膜结构域。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述C型凝集素结构域包含SEQ ID NO:28中所示的序列，所述卷曲螺旋结构域包含SEQ ID NO:27中所示的序列，所述胞质结构域包含SEQID NO:29中所示的序列，并且所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:30中所示的序列。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述修饰的Asgr1蛋白包含SEQ ID NO:3中所示的序列。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11202008620VA (en) 2018-03-26 2020-10-29 Regeneron Pharma Humanized rodents for testing therapeutic agents
MX2021009855A (es) 2019-02-22 2021-09-10 Regeneron Pharma Roedores que tienen canales de sodio modificados geneticamente y metodos de uso de los mismos.
CN115785251A (zh) * 2021-07-16 2023-03-14 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 Tfr1基因人源化非人动物及其构建方法和应用
AU2022380841A1 (en) 2021-11-04 2024-05-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Viral particles retargeted to skeletal muscle

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009019312A2 (en) * 2007-08-09 2009-02-12 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti cd37 antibodies
WO2014023709A1 (en) * 2012-08-09 2014-02-13 Roche Glycart Ag Asgpr antibodies and uses thereof
WO2017087780A1 (en) * 2015-11-20 2017-05-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized lymphocyte-activation gene 3
WO2017100467A2 (en) * 2015-12-08 2017-06-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for internalizing enzymes

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU8587598A (en) 1997-07-26 1999-02-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Trans-species nuclear transfer
US20050144655A1 (en) 2000-10-31 2005-06-30 Economides Aris N. Methods of modifying eukaryotic cells
AUPR451401A0 (en) 2001-04-20 2001-05-24 Monash University A method of nuclear transfer
US7612250B2 (en) 2002-07-29 2009-11-03 Trustees Of Tufts College Nuclear transfer embryo formation method
AU2005295269B2 (en) 2004-10-19 2010-05-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method for generating an animal homozygous for a genetic modification
JP4692417B2 (ja) 2006-06-30 2011-06-01 富士ゼロックス株式会社 画像形成装置
CN101117633B (zh) 2006-08-03 2011-07-20 上海交通大学附属儿童医院 一种细胞核移植方法
KR20100120226A (ko) 2008-04-11 2010-11-12 유티씨 파워 코포레이션 매니폴드 섬프를 갖는 바이폴라 플레이트 및 연료 전지
KR102010827B1 (ko) 2009-06-26 2019-08-14 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 천연 면역글로불린 포맷을 가지는 용이하게 분리된 이중특이성 항체
WO2011020005A1 (en) 2009-08-14 2011-02-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. miRNA-REGULATED DIFFERENTIATION-DEPENDENT SELF-DELETING CASSETTE
DK2494047T3 (en) 2009-10-29 2017-04-10 Regeneron Pharma MULTIFUNCTIONAL ALLELS
EP2825553B1 (en) 2012-03-14 2018-07-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
CA2869016C (en) 2012-04-25 2020-05-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nuclease-mediated targeting with large targeting vectors
LT2800811T (lt) 2012-05-25 2017-09-11 The Regents Of The University Of California Būdai ir kompozicijos, skirti tikslinės dnr modifikavimui, panaudojant adresuotą rnr, ir transkripcijos moduliavimui, panaudojant adresuotą rnr
WO2014033644A2 (en) 2012-08-28 2014-03-06 Novartis Ag Methods of nuclease-based genetic engineering
PL3138910T3 (pl) 2012-12-06 2018-01-31 Sigma Aldrich Co Llc Oparta na CRISPR modyfikacja i regulacja genomu
SG10201706741VA (en) 2013-02-20 2017-10-30 Regeneron Pharma Genetic modification of rats
RU2725520C2 (ru) 2013-12-11 2020-07-02 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Способы и композиции для направленной модификации генома
ES2949172T3 (es) 2014-07-16 2023-09-26 Novartis Ag Método de encapsulamiento de un ácido nucleico en un hospedante de nanopartículas lipídicas
KR20230070319A (ko) 2014-11-21 2023-05-22 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 쌍 형성된 가이드 rna를 사용하는 표적화된 유전자 변형을 위한 방법 및 조성물
KR20240055876A (ko) * 2014-11-24 2024-04-29 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화 cd3 복합체를 발현하는 비인간 동물

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009019312A2 (en) * 2007-08-09 2009-02-12 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti cd37 antibodies
WO2014023709A1 (en) * 2012-08-09 2014-02-13 Roche Glycart Ag Asgpr antibodies and uses thereof
WO2017087780A1 (en) * 2015-11-20 2017-05-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized lymphocyte-activation gene 3
WO2017100467A2 (en) * 2015-12-08 2017-06-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for internalizing enzymes

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Liu et al..A New Splice Variant of the Major Subunit of Human Asialoglycoprotein Receptor Encodes a Secreted Form in Hepatocytes.PLoS ONE.2010,第5卷(第9期),1-13. *
Meier et al .Crystal Structure of the Carbohydrate Recognition Domain of the H1 Subunit of the Asialoglycoprotein Receptor.J. Mol. Biol. .2000,第300卷857-865. *
Sands et al..Gene Therapy for Lysosomal Storage Diseases.Mol.Ther..2006,第13卷(第5期),839-849. *
Spiess et al..Sequence of Human Asialoglycoprotein Receptor cDNA.J.Biol.Chem..1985,第260卷(第4期),1979-1982. *
Tan et al..Antibody targeted gene transfer to endothelium.J.Gene Med..2003,第5卷311-323. *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2020529837A (ja) 2020-10-15
WO2019006034A9 (en) 2019-10-31
JP7278978B2 (ja) 2023-05-22
RU2020101936A3 (zh) 2022-03-01
JP2022171807A (ja) 2022-11-11
AU2018295358A1 (en) 2020-01-16
RU2020101936A (ru) 2021-07-27
EP3644722A1 (en) 2020-05-06
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