JP2022171807A - ヒト化asgr1座位を含む非ヒト動物 - Google Patents
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Abstract
Description
10362WO01_ST25.txtファイルに記述されている配列表は、50キロバイトであり、2018年6月26日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。
(項目1)
改変Asgr1タンパク質をコードする遺伝子改変内因性Asgr1座位を含む非ヒト動物または非ヒト動物ゲノムであって、前記改変Asgr1タンパク質は、細胞質ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含み、前記細胞外ドメインのすべてまたは一部は、欠失され、オルソロガスなヒトASGR1配列と置き換えられた内因性Asgr1座位のセグメントによりコードされ、および
前記非ヒト動物は、前記改変Asgr1タンパク質を発現する、非ヒト動物または非ヒト動物ゲノム。
(項目2)
前記細胞外ドメインは、多重コイルドメインとC型レクチンドメインを含み、前記C型レクチンドメインのすべてまたは一部は、欠失され、オルソロガスなヒトASGR1配列と置き換えられた前記内因性Asgr1座位のセグメントによりコードされる、項目1に記載の非ヒト動物または非ヒト動物ゲノム。
(項目3)
前記C型レクチンドメインは、ヒトASGR1のC型レクチンドメインである、項目2に記載の非ヒト動物または非ヒト動物ゲノム。
(項目4)
前記C型レクチンドメインは、配列番号28に記載される配列を含む、項目2もしくは3に記載の非ヒト動物または非ヒト動物ゲノム。
(項目5)
前記細胞外ドメインは、多重コイルドメインとC型レクチンドメインを含み、前記多重コイルドメインのすべてまたは一部は、欠失され、オルソロガスなヒトASGR1配列と置き換えられた前記内因性Asgr1座位のセグメントによりコードされる、項目1に記載の非ヒト動物または非ヒト動物ゲノム。
(項目6)
前記多重コイルドメインは、ヒトASGR1の多重コイルドメインである、項目5に記載の非ヒト動物または非ヒト動物ゲノム。
(項目7)
前記多重コイルドメインは、配列番号27に記載される配列を含む、項目5もしくは6に記載の非ヒト動物または非ヒト動物ゲノム。
(項目8)
前記多重コイルドメインと前記C型レクチンドメインの両方のすべて、または一部は、欠失され、オルソロガスなヒトASGR1配列と置き換えられた前記内因性Asgr1座位のセグメントによりコードされる、項目2~7のいずれか1項に記載の非ヒト動物または非ヒト動物ゲノム。
(項目9)
前記C型レクチンドメインは、ヒトASGR1のC型レクチンドメインであり、前記多重コイルドメインは、ヒトASGR1のC型レクチンドメインである、項目8に記載の非ヒト動物または非ヒト動物ゲノム。
(項目10)
前記C型レクチンドメインは、配列番号28に記載される配列を含み、前記多重コイルドメインは、配列番号27に記載される配列を含む、項目8または9に記載の非ヒト動物または非ヒト動物ゲノム。
(項目11)
前記オルソロガスなヒトASGR1配列は、ヒトASGR1遺伝子のエクソン3~8を含む、項目1~10のいずれか1項に記載の非ヒト動物または非ヒト動物ゲノム。
(項目12)
前記オルソロガスなヒトASGR1配列は、配列番号31に記載される配列を含むASGR1タンパク質セグメントをコードする、項目11に記載の非ヒト動物または非ヒト動物ゲノム。
(項目13)
前記細胞質ドメインのすべてまたは一部は、内因性非ヒト動物Asgr1配列によりコードされる、項目1~12のいずれか1項に記載の非ヒト動物または非ヒト動物ゲノム。
(項目14)
前記膜貫通ドメインのすべてまたは一部は、内因性非ヒト動物Asgr1配列によりコードされる、項目1~13のいずれか1項に記載の非ヒト動物または非ヒト動物ゲノム。
(項目15)
前記細胞質ドメインと前記膜貫通ドメインの両方のすべて、または一部は、内因性非ヒト動物Asgr1配列によりコードされる、項目13または14に記載の非ヒト動物または非ヒト動物ゲノム。
(項目16)
前記非ヒト動物または非ヒト動物ゲノムが、前記遺伝子改変された内因性Asgr1座位に対してヘテロ接合性である、項目1~15のいずれか1項に記載の非ヒト動物または非ヒト動物ゲノム。
(項目17)
前記非ヒト動物または非ヒト動物ゲノムが、前記遺伝子改変された内因性Asgr1座位に対してホモ接合性である、項目1~15のいずれか1項に記載の非ヒト動物または非ヒト動物ゲノム。
(項目18)
前記非ヒト動物が哺乳動物であり、または前記非ヒト動物ゲノムが哺乳動物ゲノムである、項目1~17のいずれか1項に記載の非ヒト動物または非ヒト動物ゲノム。
(項目19)
前記非ヒト動物が齧歯類であり、または前記非ヒト動物ゲノムが齧歯類ゲノムである、項目18に記載の非ヒト動物または非ヒト動物ゲノム。
(項目20)
前記非ヒト動物がラットもしくはマウスであり、または前記非ヒト動物ゲノムがラットゲノムもしくはマウスゲノムである、項目19に記載の非ヒト動物または非ヒト動物ゲノム。
(項目21)
前記非ヒト動物がマウスであり、または前記非ヒト動物ゲノムがマウスゲノムである、項目20に記載の非ヒト動物または非ヒト動物ゲノム。
(項目22)
前記細胞質ドメインのすべてまたは一部は、内因性マウスAsgr1配列によりコードされる、項目21に記載の非ヒト動物または非ヒト動物ゲノム。
(項目23)
前記細胞質ドメインは、配列番号29に記載される配列を含む、項目22に記載の非ヒト動物または非ヒト動物ゲノム。
(項目24)
膜貫通ドメインのすべてまたは一部は、内因性マウスAsgr1配列によりコードされる、項目21に記載の非ヒト動物または非ヒト動物ゲノム。
(項目25)
前記膜貫通ドメインは、配列番号30に記載される配列を含む、項目24に記載の非ヒト動物または非ヒト動物ゲノム。
(項目26)
前記細胞質ドメインと前記膜貫通ドメインの両方のすべて、または一部は、内因性マウスAsgr1配列によりコードされる、項目22~25のいずれか1項に記載の非ヒト動物または非ヒト動物ゲノム。
(項目27)
前記細胞質ドメインは、配列番号29に記載される配列を含み、前記膜貫通ドメインは、配列番号30に記載される配列を含む、項目26に記載の非ヒト動物または非ヒト動物ゲノム。
(項目28)
前記細胞外ドメインは多重コイルドメインとC型レクチンドメインを含み、前記多重コイルドメインと前記C型レクチンドメインの両方のすべてまたは一部は、欠失され、オルソロガスなヒトASGR1配列と置き換えられた前記内因性Asgr1座位のセグメントによりコードされ、前記細胞質ドメインと前記膜貫通ドメインの両方のすべてまたは一部は、内因性マウスAsgr1配列によりコードされる、項目21~27のいずれか1項に記載の非ヒト動物または非ヒト動物ゲノム。
(項目29)
前記C型レクチンドメインは、ヒトASGR1のC型レクチンドメインであり、前記多重コイルドメインは、ヒトASGR1の多重コイルドメインであり、前記細胞質ドメインは、マウスAsgr1の細胞質ドメインであり、そして前記膜貫通ドメインは、マウスAsgr1の膜貫通ドメインである、項目21~28のいずれか1項に記載の非ヒト動物または非ヒト動物ゲノム。
(項目30)
前記C型レクチンドメインは、配列番号28に記載される配列を含み、前記多重コイルドメインは、配列番号27に記載される配列を含み、前記細胞質ドメインは、配列番号29に記載される配列を含み、そして前記膜貫通ドメインは、配列番号30に記載される配列を含む、項目28または29に記載の非ヒト動物または非ヒト動物ゲノム。
(項目31)
前記改変Asgr1タンパク質は、配列番号3に記載される配列を含む、項目30に記載の非ヒト動物または非ヒト動物ゲノム。
(項目32)
ヒト-ASGR1-介在性内部移行を介したインビボでの治療用複合体の肝臓への送達を評価する方法であって、
(a) 項目1~31のいずれか1項に記載の非ヒト動物に治療用複合体を投与することであって、前記治療用複合体は、治療用分子と、ヒトASGR1に特異的に結合する抗原結合タンパク質またはリガンドを含む、投与すること、および
(b) 前記非ヒト動物の肝臓への前記治療用分子の送達を評価すること、を含む、方法。
(項目33)
前記治療用分子は、リソソーム置換タンパク質または酵素であるか、または前記リソソーム置換タンパク質または酵素をコードする核酸であり、そして工程(b)は、前記非ヒト動物の肝臓中の前記リソソーム置換タンパク質もしくは酵素の存在または活性を評価することを含む、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記治療用分子は、治療用分泌タンパク質をコードする核酸であり、そして工程(b)は、前記非ヒト動物中の前記治療用分泌タンパク質の血清レベルまたは活性を評価することを含む、項目32に記載の方法。
(項目35)
インビボでのヒトASGR1を介した内部移行に関し、肝臓細胞表面タンパク質または肝臓中の可溶性タンパク質を標的とする治療用分子の有効性を評価する方法であって、
(a) 項目1~31のいずれか1項に記載の非ヒト動物に前記治療用分子を投与することであって、前記治療用分子は、前記肝臓細胞表面タンパク質または前記可溶性タンパク質に特異的に結合し、およびヒトASGR1に特異的に結合する二重特異性抗原結合タンパク質を含む、投与すること、および
(b) 前記非ヒト動物の肝臓中の前記肝臓細胞表面タンパク質の細胞表面レベルまたは活性を評価すること、または前記非ヒト動物の肝臓中の前記可溶性タンパク質の発現または活性を評価すること、を含む方法。
(項目36)
改変Asgr1タンパク質をコードする遺伝子改変内因性Asgr1座位を含む非ヒト動物細胞であって、前記改変Asgr1タンパク質は、細胞質ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含み、前記細胞外ドメインのすべてまたは一部は、欠失され、オルソロガスなヒトASGR1配列と置き換えられた内因性Asgr1座位のセグメントによりコードされる、非ヒト動物細胞。
(項目37)
前記非ヒト動物細胞が、肝細胞である、項目36に記載の非ヒト動物細胞。
(項目38)
前記非ヒト動物細胞が、多能性細胞である、項目36に記載の非ヒト動物細胞。
(項目39)
前記非ヒト動物細胞が、ES細胞である、項目38に記載の非ヒト動物細胞。
(項目40)
前記非ヒト動物細胞が、生殖細胞である、項目38に記載の非ヒト動物細胞。
(項目41)
項目36~40のいずれか1項に記載の非ヒト動物細胞を含む組成物。
(項目42)
配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号22、配列番号23、およびそれらの組み合わせを含む群から選択される配列を含む核酸。
(項目43)
配列番号24として記載される配列を含む、項目42に記載の核酸。
(項目44)
配列番号3として記載されるアミノ酸配列をコードすることを特徴とする、項目42または請求項43に記載の核酸。
特許または出願の書類は、色付きで描かれた少なくとも一つの図面を含有する。色付きの図面を伴う本特許または特許出願公開の写しは、要求により、および必要な料金を支払うことにより、当局に提供されるであろう。
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、本明細書において相互交換可能に使用され、コードアミノ酸および非コードアミノ酸、ならびに化学改変アミノ酸または生化学改変アミノ酸または誘導体化アミノ酸を含むアミノ酸の任意の長さの多量体型を含む。この用語はさらに、例えば修飾されたペプチド主鎖を有するポリペプチドなどの修飾されたポリマーも含む。用語「ドメイン」は、特定の機能または構造を有するタンパク質またはポリペプチドの任意の部分を指す。
本明細書において、ヒト化Asgr1座位を含む非ヒト動物細胞および非ヒト動物、ならびに当該非ヒト動物細胞および非ヒト動物を使用する方法が開示される。ヒト化Asgr1座位を含む非ヒト動物細胞または非ヒト動物は、ヒトASGR1タンパク質の一つまたは複数の断片(例えばヒトASGR1細胞外ドメインのすべてまたは一部)を含むヒトASGR1タンパク質またはキメラAsgr1タンパク質を発現する。高効率エンドサイトーシスの肝臓特異的受容体として、ヒトASGR1は、例えば抗体、低分子(抗体-薬剤複合体の一部として)、およびDNAなどの治療剤の肝臓特異的送達に利用することができる。しかしヒトASGR1に特異的に結合する抗原結合タンパク質または二重特異性抗原結合タンパク質は、例えばマウスAsgr1などのオルソロガスな非ヒト動物Asgr1タンパク質には結合しないことが多く、その原因は、ヒトASGR1と非ヒト動物Asgr1の間の配列の差異にある。例えばヒトASGR1細胞外ドメインに対して生成された抗体は、マウスAsgr1オルソログには結合しない(データは示さず)。これがあるために、ヒトASGR1介在性の送達機序または治療機序のインビボ有効性を、非改変の内因性(すなわち天然型)Asgr1座位を有する野生型非ヒト動物で効率的に評価することができない。ヒト化Asgr1非ヒト動物(例えば、ヒト化Asgr1マウス)は、多くの様々な方法を利用した、ヒトASGR1介在性内部移行を介した様々な治療剤の肝臓特異的送達の検証に使用することができる。例えば、ヒト化Asgr1座位を含む非ヒト動物を使用して、肝臓への治療用分子または治療用複合体のヒトASGR1介在性送達のインビボ有効性を評価することができる。同様に、ヒト化Asgr1座位を含む非ヒト動物を使用して、ヒトASGR1介在性機序を介して作用する治療用分子または治療用複合体の有効性を評価することができる。
本明細書に開示される細胞および非ヒト動物は、ヒト化Asgr1座位を含む。ヒト化Asgr1座位を含む細胞または非ヒト動物は、ヒトASGR1タンパク質を発現するか、または天然型Asgr1タンパク質の一つまたは複数の断片が、ヒトASGR1由来の対応する断片(例えば細胞外ドメインのすべてまたは一部)で置き換えられた、部分的にヒト化されたキメラAsgr1タンパク質を発現する。
本明細書に記載される細胞および非ヒト動物は、ヒト化Asgr1座位を含む。アシアロ糖タンパク質受容体1(C-type lectin domain family 4 member H1、hepatic lectin H1、HL-1、ASGP-R 1、ASGPR 1、ASGR1)は、ASGR1(CLEC4H1)遺伝子にコードされる、アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPRまたはASGR)の主要サブユニットである。ASGPRは主に肝細胞の細胞表面上に発現されるヘテロオリゴマータンパク質であり、約1~5×105の結合部位/細胞を有し、脱シアル化された糖たんぱく質を内部移行させ、分解して、循環系からそれらを除去する役割を負う。ASGPRは、良く特徴解析されたC型肝臓レクチンであり、肝細胞の類洞表面上に主に発現されている。ASGPRは、肝臓実質細胞による受容体介在エンドサイトーシスを介したガラクトース末端型およびN-アセチルガラクトサミン末端型の糖タンパク質の選択的結合と内部移行において役割を担っている。アシアロ糖タンパク質受容体1および2(ASGR1およびASGR2)の2種のタンパク質が含まれ、それらはASGR1遺伝子およびASGR2遺伝子にコードされている。両サブユニットともにII型の単回通過タンパク質であり、N末端細胞質ドメイン、単一膜貫通ドメイン、およびC末端細胞外糖認識ドメイン(CRD)を広く含む。ASGR1は、N末端細胞質ドメイン(約40アミノ酸)、単回通過膜貫通ドメイン(約20アミノ酸)、細胞外多重コイル軸(オリゴマー形成)領域(約80アミノ酸)、および機能性C型(カルシウム依存性)糖認識ドメイン(C型レクチンドメイン)(約140アミノ酸)を含有する。CRDは、末端ガラクトースまたはN-アセチルガラクトサミン(GalNac)モチーフを有する糖タンパク質に結合する。CRDは、単量体状態の脱シアル化糖たんぱく質に対し、低いアフィニティを有する。
ヒト化Asgr1座位は、Asgr1遺伝子全体が、対応するオルソロガスなヒトASGR1配列で置き換えられているAsgr1座位であってもよく、またはAsgr1遺伝子の一部が、対応するオルソロガスなヒトASGR1配列で置き換えられているAsgr1座位(すなわちヒト化されている)であってもよい。任意で、対応するオルソロガスなヒトASGR1配列は改変されて、非ヒト動物におけるコドン使用頻度に基づきコドン最適化される。置換された(すなわち、ヒト化された)領域は、例えばエクソン、非コード領域、例えばイントロン、非翻訳領域、もしくは制御性領域(例えば、プロモーター、エンハンサー、または転写リプレッサー結合エレメント)、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。一つの例として、ヒトASGR1遺伝子の1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、または8個すべてのエクソンに対応するエクソンがヒト化されることができる。例えば、ヒトASGR1遺伝子のエクソン3~8に対応するエクソンがヒト化されることができる。あるいは抗ヒトASGR1抗原結合タンパク質に認識されるエピトープをコードするAsgr1の領域が、ヒト化されることができる。別の例として、N末端細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、多重コイルドメイン、またはC型レクチンドメインのうちの一つまたは複数またはすべてがヒト化されることができる。例えば多重コイルドメインをコードするAsgr1座位の領域のすべてまたは一部がヒト化されることができ、C末端レクチンドメインをコードするAsgr1座位の領域のすべてまたは一部がヒト化されることができ、膜貫通ドメインをコードするAsgr1座位の領域のすべてまたは一部がヒト化されることができ、および/または細胞質ドメインをコードするAsgr1座位の領域のすべてまたは一部がヒト化されることができる。一つの例において、多重コイルドメインをコードするAsgr1座位の領域のすべてまたは一部のみがヒト化され、C型レクチンドメインをコードするAsgr1座位の領域のすべてまたは一部のみがヒト化され、または細胞外領域(すなわち多重コイルドメインとC型レクチンドメイン)をコードするAsgr1座位の領域のすべてまたは一部のみがヒト化される。例えば多重コイルドメインとC型レクチンドメインをコードするAsgr1座位の領域がヒト化されることができ、それによりキメラAsgr1タンパク質は、内因性N末端細胞質ドメイン、内因性膜貫通ドメイン、ヒト化多重コイルドメインおよびヒト化C型レクチンドメインを有して産生される。同様にヒトASGR1遺伝子の1、2、3、4、5、6、または7個すべてのイントロンに対応するイントロンがヒト化されることができる。制御性配列を含む隣接非翻訳領域もヒト化されることができる。例えば、5’非翻訳領域(UTR)、3’UTR、もしくは5’UTRと3’UTRの両方がヒト化されることができ、または5’UTR、3’UTR、もしくは5’UTRと3’UTRの両方が内因性を維持することもできる。一つの特定の例では、3’UTRはヒト化されるが、5’UTRは内因性を維持する。オルソロガス配列による置換の程度に応じて、例えばプロモーターなどの制御性配列は内因性であってもよく、または置換ヒトオルソロガス配列により供給されてもよい。例えばヒト化Asgr1座位は、内因性の非ヒト動物Asgr1プロモーターを含んでもよい。
本明細書において別に記載されるヒト化Asgr1座位を含む非ヒト動物細胞および非ヒト動物が提供される。当該細胞および非ヒト動物は、ヒト化Asgr1座位に対してヘテロ接合性またはホモ接合性であってもよい。二倍体の生物は、各遺伝子座位に二つのアレルを有する。アレルの各ペアは、特定の遺伝子座位の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の座位に二つの同一アレルがある場合にはホモ接合性、二つのアレルが異なる場合にはヘテロ接合性として記載される。
本明細書において別に記載されるヒト化Asgr1座位を含む非ヒト動物を、肝臓への治療用分子または治療用分子のヒトASGR1介在性送達のインビボ有効性評価に使用するための様々な方法、およびヒトASGR1介在性機序の評価に使用するための様々な方法が提供される。非ヒト動物がヒト化Asgr1座位を含むことで、当該非ヒト動物は、非ヒト化Asgr1座位を有する非ヒト動物よりも、ヒトASGR1により介在される送達、またはヒトASGR1介在性治療機序をより正確に反映するであろう。一例として、当該方法は、インビボのヒトASGR1介在性内部移行を介した肝臓への治療用複合体の送達を評価することができ、当該方法は、ヒト化Asgr1座位を含む非ヒト動物に治療用複合体を投与することであって、当該治療用複合体は、治療用分子と、ヒトASGR1に特異的に結合する抗原結合タンパク質またはリガンドを含む、投与すること、次いで当該非ヒト動物の肝臓への当該治療用分子の送達を評価することを含む。別の例としては、当該方法は、ヒトASGR1介在性内部移行を介して作用するように設計された治療用分子または治療用複合体、例えばヒトASGR1を介して標的肝臓細胞表面タンパク質を内部移行させるよう設計された治療用複合体のインビボ有効性を評価することができる。
本明細書において別に記載されるヒト化Asgr1座位を含む非ヒト動物を、ヒトASGR1介在性内部移行を介した治療用分子の肝臓への送達のインビボ有効性評価に使用するための様々な方法が提供される。例えばかかる方法は、(a)ヒト化Asgr1座位を含む非ヒト動物に治療用複合体を投与することであって、当該治療用複合体は、治療用分子と、ヒトASGR1に特異的に結合する抗原結合タンパク質またはリガンドを含む、投与すること、および(b)当該非ヒト動物の肝臓への当該治療用分子の送達を評価すること、を含んでもよい。
ヒトASGR1を介して、標的肝臓細胞表面タンパク質または肝臓中の標的可溶性タンパク質を内部移行するよう設計された治療用複合体のインビボ有効性を評価するための、本明細書において別に記載されるヒト化Asgr1座位を含む非ヒト動物を使用する様々な方法が提供される。治療処理はしばしば、細胞上で、または細胞の近くで作用する一つ以上の標的分子の不活化または遮断を必要とする。例えば、抗体に基づく治療はしばしば、細胞の表面にて発現する特定の抗原、または可溶性リガンドと結合することによって機能し、結果として抗原の通常の生物活性を妨害する。このタイプの治療薬は典型的に、細胞シグナル伝達を減弱または抑制するため、サイトカインとその受容体との間での相互作用を遮断することによって機能する。特定の文脈においては、しかしながら、別の成分とのその物理的相互作用を遮断することを必ずしも伴わない方法で、標的分子の活性を不活化または抑制するために、治療に有益であり得る。標的分子のそのような非遮断減弱が達成され得る一つの方法として、細胞外または細胞表面における標的分子の濃度を減少させることを挙げることができる。例えば、標的分子と、例えばASGR1などの内部移行エフェクタータンパク質の間の物理的結合を促進することで、または実行することで、標的分子は減弱化され、または不活化され得る。これは例えば第一の抗原結合ドメインと第二の抗原結合ドメインを備えた多重特異性(例えば二重特異性)抗原結合分子の使用を介して実現することができる。各抗原結合ドメインは、異なる分子に結合する。第一のドメインは標的分子に特異的に結合し、第二のドメインはASGR1に特異的に結合する。このタイプの物理的分子間結合を通じて、標的分子を、ASGR1と共に細胞へ内部移行させ、細胞内部の分解機構によって処理することができるか、そうでなければ減弱する、隔離する、または不活化することができる。例えば、WO2013/138400およびUS2013/0243775を参照のこと。それら各々が参照によりその全体ですべての目的に対し本明細書に組み込まれる
本明細書に記載される方法は、非ヒト動物に、核酸、タンパク質またはタンパク質複合体を含むある様々な分子(治療用分子または治療用複合体)を導入することを含む。導入は任意の手段により達成することができる。例えば当該分子は、例えばベクター送達、粒子介在送達、エクソソーム介在送達、脂質ナノ粒子介在送達、細胞浸透ペプチド介在送達、または埋め込み型装置介在送達により非ヒト動物内に導入されてもよい。具体的な例としては、分子は、例えばポリ(乳酸)(PLA)マイクロスフィア、ポリ(D,L-乳酸-コグリコール酸)(PLGA)マイクロスフィア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、渦巻き型脂質または脂質微小管などの担体中で、細胞または非ヒト動物内に導入されてもよい。非ヒト動物への送達に関するいくつかの具体的な例としては、水力学的送達、ウイルス介在送達(例えばアデノ随伴ウイルス(AAV)介在送達)、および脂質ナノ粒子介在送達が挙げられる。
本明細書において別に記載されるヒト化Asgr1座位を含む非ヒト動物の作製に関する様々な方法が提供される。遺伝子改変生物を作製するための任意の便利な方法またはプロトコルが、かかる遺伝子改変非ヒト動物の作製に適している。例えば、Cho et al.(2009)Current Protocols in Cell Biology 42:19.11:19.11.1-19.11.22およびGama Sosa et al.(2010)Brain Struct.Funct.214(2-3):91-109を参照のこと。それら各々が参照によりその全体ですべての目的に対して本明細書に組み込まれる。かかる遺伝子改変非ヒト動物は、例えば標的とされるAsgr1座位での遺伝子ノックインを介して作製されてもよい。
添付の配列表に列挙されるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基に関しては標準的な文字略語を使用して示され、アミノ酸に関しては3文字コードを使用して示されている。ヌクレオチド配列は、配列の5’末端で始まり、3’末端へと進む(すなわち各ラインで左から右へ)標準的な慣例に従っている。各ヌクレオチド配列の一つの鎖のみが示されているが、提示された鎖に対する任意の参照によって相補鎖も含まれると理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端で始まり、カルボキシ末端へと進む(すなわち各ラインで左から右へ)標準的な慣例に従っている。
アシアロ糖タンパク質受容体(Ashwell Receptor、ASGR)は、レクチン受容体のC型クラスに属する、肝臓膜結合優位型糖結合タンパク質受容体(約33kDa)である。ASGRは、末端ガラクトースまたはN-アセチルガラクトサミン(GalNac)モチーフを有する糖タンパク質に結合する。受容体介在エンドサイトーシスにより循環系から脱シアル化糖タンパク質を除去することができる。リガンドはリソソーム分解を経る一方で、ASGRは細胞表面へとリサイクルで戻される。この受容体はASGR1とASGR2(H1およびH2)の二つのサブユニットのヘテロオリゴマーである。高効率エンドサイトーシスの肝臓特異的受容体として、ASGR1は、例えば抗体、低分子(抗体-薬剤複合体の一部として)、およびDNAなどの治療剤の肝臓特異的送達に利用することができる。しかしながらヒトASGR1細胞外ドメインに対して本発明者らが作製した抗体および二重特異性抗体は、マウスAsgr1オルソログには結合しない(Biacoreデータは示さず)。ゆえに本発明者らは、多くの様々な方法を利用して、様々な治療剤の肝臓特異的送達の検証における使用のためのヒト化Asgr1マウスを作製した。
有効モデルとしてのヒト化Asgr1マウス(Asgr1hu/hu)の検証を行うために、Asgr1hu/huマウスを表現型解析し、その表現型を野生型同腹仔の表現型と比較した。Asgr1hu/huマウスは、野生型同腹仔と比較して血漿脂質レベル(総コレステロール、トリグリセリド、HDL-C、LDL-C)における差異は示さなかった。図4を参照のこと。同様に、Asgr1hu/huマウスは、野生型同腹仔と比較して、体重または血中グルコースレベルにおける差異は示さなかった。図5を参照のこと。ヒトASGR1タンパク質は、マウスAsgr1と同様に、肝臓膜に共局在していた。図6を参照のこと。結論として、Asgr1hu/huマウスは肝臓膜上でヒトASGR1タンパク質を発現するとともに、正常な血漿脂質プロファイルを有している。
Asgr1ヒト化マウスにおける循環脂質レベルの評価 オスAsgr1ヒト化マウス(Asgr1hum/hum)およびそれらの野生型同腹仔(Asgr1+/+)の血漿を非絶食状態で採取し、血清化学分析器のADVIA(登録商標)Chemistry XPT System(Siemens社)を使用して血清脂質(トリグリセリド(TG)、総コレステロール、低密度リポタンパク質コレステロール(LDL-C)、高密度リポタンパク質コレステロール(HDL-C))について分析した。N=8匹/群、11週齢。データはそれぞれに対する平均±SEMとして表された。
次いで二重特異性抗myc-ASGR1抗体が、scAAV-N587mycウイルス粒子を、実施例1で作製されたマウスにおいてインビボでヒト化ASGR1を発現する肝臓細胞に再標的化させ得るかどうかを決定するための実験を行った。これを検証するために、ウイルス粒子を最初に作製した。
- ヘルパープラスミド、pHelper(Agilent社、Cat#240074);
- 野生型または改変型のAAV rep/cap遺伝子をコードするプラスミド(pAAV RC2(Cell biolabs社、カタログ番号 VPK-422)、例えば、pAAV RC2/6(Cell Biolabs社、カタログ番号VPK-426)、pAAV RC2-N587myc、pAAV RC2/6-Q585myc);および
- 対象ヌクレオチド配列およびAAV ITR配列をコードするプラスミド、例えば、pscAAV-CMV-eGFP、pAAV-CMVGFP (Agilent社、カタログ番号240074)、pAAV-EF1a-eGFPまたはpAAV-CAGG-eGFP)などを用いたPEFpro(Polyplus transfection社、ニューヨーク州ニューヨーク)介在トランスフェクションの1日前に播種される。
二重特異性抗myc-ASGR1抗体が、scAAV2-N587myc-CMV-eGFPウイルスベクターをインビボでhASGR1を発現する肝臓細胞に再標的化させることができるかどうかを決定するために、C57BL/6の背景でその肝臓細胞がhASGR1を発現するように遺伝子改変されたマウス、および対照の野生型C57BL/6マウスに、1x1011(qPCRによる力価測定)の野生型scAAV2-CMV-eGFP単独、またはウイルスゲノムと抗体分子の比率が1:8で、二重特異性抗myc-ASGR1抗体と組み合わされたscAAV2-N587myc-CMV-eGFPウイルスベクターを 血管内に注射した。対照には、生理食塩水[250mMのNaCl]、またはscAAV2-N587myc-CMV-eGFPウイルスベクター単独を注射したマウスが含まれた。注射の10日後、マウスを屠殺し、4%のPFAで経心腔的灌流を行った。肝臓、腎臓、および心臓の器官を収集し、15%のスクロース、続いて30%のスクロース中で脱水した。次いで、器官をスライド上で凍結切片にして、ニワトリ抗EGFP抗体(Jackson ImmunoResearch Labs,Inc.、ペンシルバニア州ウェストグローブ)およびAlexa-488結合抗ニワトリ二次抗体(Jackson ImmunoResearch Labs,Inc.、ペンシルバニア州ウェストグローブ)を用いて染色した(図8A~図8C)。肝臓中でASGR1を発現するように改変され、野生型scAAV2-CMV-eGFP、または二重特異性抗myc-ASGR1抗体と組み合わされたscAAV2-N587myc-CMV-eGFPを注射されたトランスジェニック動物からの肝臓(図8A(i)および8A(iv))、ならびに野生型scAAV2-CMV-eGFPを注射された野生型C57BL/6マウスからの肝臓(図8A(v))において、GFP陽性細胞を検出した。すべての脾臓または腎臓サンプル(図8Bおよび8C)、さらには生理食塩水またはscAAV2-N587myc-CMV-eGFPウイルスベクター単独を注射されたすべての動物からの肝臓、脾臓、もしくは腎臓サンプル(図8A(ii、iii、vi、vii))、さらには二重特異性抗myc-ASGR1抗体と組み合わされたscAAV2-N587myc-CMV-eGFPを注射された野生型C57BL/6動物から採取された肝臓サンプル(図8A(viii))では、GFPは検出されなかった。要約すると、scAAV2-N587myc-CMV-eGFPウイルスベクターと二重特異性抗myc-ASGR1抗体との組み合わせは、hASGR1を発現する(肝)細胞のみに感染した。このことから、scAAV2-CMV-eGFPウイルスベクターが、カプシドタンパク質の改変によって不活性化されたこと、例えばscAAVウイルスベクターの本来の指向性が、例えばc-mycエピトープによって中立状態となり得たこと、そしてそのようなウイルスベクターは、例えば二重特異性抗myc-ASGR1抗体によって、インビボで肝臓細胞に対して特異的に再標的化されるなど、特異的に再活性化され得たことを強く示唆するものである。
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- 明細書に記載の発明。
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