CN105037560B - 培育表达shTRAIL植物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了培育表达shTRAIL植物的方法。本发明提供了融合蛋白，其包括shTRAIL蛋白及位于其N端的信号肽。本发明的实验证明，本研究发现使用PHA‑L来源的信号肽将目的蛋白靶向至质外体这一策略最有利于shTRAIL的高表达，其在转基因拟南芥T3代种子中的表达量为442.29pg/mL。同时还发现，shTRAIL在种子中的丰度高于叶片，说明种子是理想的目的蛋白表达器官。该研究结果，可为shTRAIL在烟草和陆地棉中的表达提供参考。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及培育表达shTRAIL植物的方法。
背景技术
药用蛋白质的生产方式主要有微生物发酵、昆虫和哺乳动物细胞培养、转基因动物等传统生产系统。植物生物反应器是指利用植物系统，包括细胞、组织和器官，以及整株植物来生产具有应用价值的生物制品(如人或动物用疫苗、抗体、激素等)，已成为农业和生物工程制药领域生产目的蛋白的理想载体。
具体而言，植物生物反应器生产药用蛋白主要具有以下优势：
1、成本低、易大规模生产：相对于微生物和昆虫细胞、哺乳动物细胞在发酵培养时所需要的培养基和复杂培养条件而言，一旦获得目的蛋白高表达、遗传稳定的转基因植物，则目的蛋白的生产只需要光照、土壤、水分等条件，生产成本较低、易于大规模生产且环境友好。据估计，在目的蛋白表达量占干种子重量的1％且目的蛋白回收率为50％的条件下，植物表达系统生产蛋白质的成本分别为微生物表达系统和哺乳动物表达系统的2-10％和0.1％。
2、安全性好：动物细胞源性生物制品由于其原料来源和工艺流程的特殊性，可能在生产过程中引入毒素、病原体和其它的有毒物质且难以去除。与人们对动物源性生物制品可能由于原料来源而污染有病原微生物的担忧不同，由于未发现人与植物共患病的病原微生物，且植物原料尤其是种子可耐受严格的表面消毒，因此植物源性的药用蛋白具有较高的安全性。
3、原料耐贮存：利用微生物、昆虫细胞及哺乳动物细胞表达系统，待目的蛋白积累至适宜浓度后，需尽快进行下游工艺流程，原料无菌、保鲜等操作工艺复杂且增加成本。相对而言，在谷类作物的种子中表达目的蛋白，种子经收获、干燥处理后，蛋白酶活力较低、生命活动暂停，目的蛋白能够在室温下贮存很长时间而不显著降低活性，能够增强生产工艺的灵活性。
4、较完善的翻译后修饰系统：原核表达系统具有遗传操作简单、生长迅速、表达量高、易于大规模发酵生产的优势。历史上第一款重组蛋白质药物即是由基因泰克公司利用大肠杆菌表达的胰岛素产品。然而，由于原核细胞结构简单，一些对蛋白质活性至关重要的翻译后修饰，如：信号肽切割、前肽加工、蛋白质折叠、二硫键形成和糖基化可能无法完成，结果造成原核表达的一些复杂的药用蛋白质可能由于无法进行正确的折叠、加工而导致生物学活性降低。因此，微生物表达系统一般仅用于表达一些简单的药用蛋白，例如：胰岛素、干扰素、生长激素等。
鉴于原核表达系统在翻译后修饰能力上的缺陷，科研人员开展了哺乳动物细胞、酵母、真菌、昆虫细胞和转基因动物等表达系统的研究工作。发现其存在着下列问题：发酵成本高、产量低、分泌表达困难、不正确的翻译后修饰、难于大规模生产、病毒或朊病毒污染等问题。
植物相对于酵母或大肠杆菌表达系统的一个主要优势是具有实现绝大多数蛋白质类药物生物活性和药代动力学所必需的翻译后修饰能力，如：糖基化、酰基化、信号肽的去除、寡聚化等。
发明内容
本发明的一个目的是提供融合蛋白。
本发明提供的融合蛋白，其包括shTRAIL蛋白及位于其N端的信号肽，所述shTRAIL蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2第29-33位氨基酸残基。
上述的融合蛋白中，所述信号肽为PAH-L或PR-S；
所述PAH-L的氨基酸序列为序列表中序列2第1-20位氨基酸残基；
所述PR-S的氨基酸序列为序列表中序列8第1-25位氨基酸残基。
上述的融合蛋白中，所述融合蛋白还包括位于所述shTRAIL蛋白C端的分选信号蛋白；
所述分选信号蛋白具体为AFVY或KDEL；
所述AFVY的氨基酸序列具体为序列4第202-205位氨基酸残基；
所述KDEL的氨基酸序列具体为序列6第202-205位氨基酸残基。
上述的融合蛋白中，所述融合蛋白为如下1)-6)中任一种：
1)融合蛋白从N端至C端依次包括信号肽PAH-L和shTRAIL；
2)融合蛋白从N端至C端依次包括信号肽PAH-L、shTRAIL和分选信号蛋白AFVY；
3)融合蛋白从N端至C端依次包括信号肽PAH-L、shTRAIL和分选信号蛋白KDEL；
4)融合蛋白从N端至C端依次包括信号肽PR-S和shTRAIL组成；
5)融合蛋白从N端至C端依次包括信号肽PR-S、shTRAIL和分选信号蛋白AFVY；
6)融合蛋白从N端至C端依次包括信号肽PR-S、shTRAIL和分选信号蛋白KDEL。
上述的融合蛋白中，1)所示的融合蛋白为序列2所示的蛋白或将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白质；
2)所示的融合蛋白为序列4所示的蛋白或将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列4衍生的蛋白质；
3)所示的融合蛋白为序列6所示的蛋白或将序列表中序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列6衍生的蛋白质；
4)所示的融合蛋白为序列8所示的蛋白或将序列表中序列8所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列8衍生的蛋白质；
5)所示的融合蛋白为序列10所示的蛋白或将序列表中序列10所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列10衍生的蛋白质；
6)所示的融合蛋白为序列12所示的蛋白或将序列表中序列12所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列12衍生的蛋白质。
上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
编码上述融合蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围，其具体是如下1)-8)中任一种的DNA分子：
1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；
2)编码区为序列表中序列3所示的DNA分子；
3)编码区为序列表中序列5所示的DNA分子；
4)编码区为序列表中序列7所示的DNA分子；
5)编码区为序列表中序列9所示的DNA分子；
6)编码区为序列表中序列11所示的DNA分子；
7)在严格条件下与1)-6)任一限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；
8)与1)-6)任一限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65oC下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。
上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备促进肿瘤细胞凋亡产品中的应用也是本发明保护的范围。
或上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育表达shTRAIL蛋白的植物中的应用也是本发明保护的范围。
本发明另一个目的是提供一种培育表达shTRAIL蛋白的转基因植物的方法。
本发明提供的方法，为将编码上述融合蛋白的DNA分子导入目的植物，获得表达shTRAIL蛋白的转基因植物。
本发明的第三个目的是提供一种制备促进肿瘤细胞凋亡产品的方法。
上述方法中，为提取上述方法制备的表达shTRAIL蛋白的转基因植物的总蛋白，即得到促进肿瘤细胞凋亡产品。
本发明的实验证明，为了实现shTRAIL的高水平表达，本研究确定使用两种信号肽(PR-S来源信号肽、PHA-L来源信号肽)、两种蛋白分选信号(AFVY、KDEL)进行信号序列组合，以造成目的蛋白的三种亚细胞靶向部位——质外体、内质网和蛋白质贮藏型液泡，并比较不同亚细胞靶向对目的蛋白表达量的影响。经过对拟南芥T3代转基因植株叶片和种子、烟草T1代转基因种子的目的蛋白ELISA检测和表达量数据的统计分析，本研究发现使用PHA-L来源的信号肽将目的蛋白靶向至质外体这一策略最有利于shTRAIL的高表达，其在转基因拟南芥T3代种子中的表达量为442.29pg/mL。同时还发现，shTRAIL在种子中的丰度高于叶片，说明种子是理想的目的蛋白表达器官。该研究结果，可为shTRAIL在烟草和陆地棉中的表达提供参考。
提取目的蛋白shTRAIL表达量较高的烟草转基因株系的总蛋白，以野生型烟草总蛋白为对照，检测shTRAIL对人大细胞肺癌细胞NCI-H460的增殖抑制效果，表明植物源性的shTRAIL具有生物学活性，能够抑制NCI-H460的增殖。本研究还在陆地棉中进行了组成型启动子和种子特异性启动子驱动shTRAIL表达的尝试，证明该蛋白可以陆地棉为转基因受体材料进行表达，为将来开展陆地棉种子植物生物反应器、提高陆地棉的经济价值奠定了基础。
附图说明
图1为融合蛋白示意图。
图2为shTRAIL转基因拟南芥PCR鉴定的部分结果。
图3为shTRAIL转基因拟南芥PCR鉴定的部分结果。
图4为不同信号序列组合的shTRAIL表达量。
图5为烟草源性shTRIAL的Western blot检测。
图6为转基因烟草PCR的鉴定结果。
图7为GV3101(pEXPR-PPvphas::shTRAIL-211)转基因陆地棉的PCR检测。
图8为pEXPR-PGh α GLOA::shTRAIL-211转基因烟草不同株系shTRAIL的表达量。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
拟南芥(col-0)记载在如下文献中：拟南芥PMRP的表达特性及功能分析，中国农业科学,2014,47(15):3094-3102，以下也称为野生型拟南芥。
本氏烟草(N.benthamiana)NC89记载在如下文献中：同步抑制FAD2与FatB基因提高烟草种子油酸组分含量的研究；西北植物学报，2015,35(2):0245-0251，以下也称为野生型烟草。
陆地棉(Gossypium hirsutum)品种‘珂字312’(Coker312)，记载在如下文献中：Effects of hygromycin on cotton cultures and its application inAgrobacterium-mediated cotton transformation[J].In Vitro Cellular&Developmental Biology-Plant.2007,43(2):111-118。
人大细胞肺癌细胞(NCI-H460)，购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。
大肠杆菌菌株Trans5α、BL21(DE3)购自北京全式金生物技术有限公司，货号分别为CD201-01、CD601-01。
农杆菌菌株GV3101::pMP90购自北京华越洋生物科技有限公司，货号：GT707s。
pEarleyGate 303载体记载在如下文献中：Gateway-compatible vectors forplant functional genomics and proteomics.The Plant Journal,2006,45(4):616-629.DOI:10.1111/j.1365-313X.2005.02617.x。
pET 28a为默克密理博公司产品，货号69864-3CN。
pENTR-P35S::GUS载体按照如下方法构建：
1、合成linker-1/2
linker-1
AATTCGCCCTTGCGATCGCATGCGACTGCGGCCGCTCAGTGCACCCGGGCATGTCATGGCGCGCCAAGGGCG
linker-2
GCGGGAACGCTAGCGTACGCTGACGCCGGCGAGTCACGTGGGCCCGTACAGTACCGCGCGGTTCCCGCTTAA
2、用EcoRI对Invitrogen公司产品/GW/(货号：K250020SC)进行酶切。
3、linker-1/2退火形成具有粘性末端的双链后，连入/GW/的酶切后载体大片段，命名为pENTR-MCS。
4、用T35S(F)/(R)对pCAMBIA2300进行PCR扩增，获得CaMV35S终止子；
T35S(F):CCCGGGCGGCCATGCTAGAGTCCGCA
T35S(R):GGCGCGCCATGTCACTGGATTTTGGTTT
pCAMBIA2300记载在如下文献中：Production of early flowering transgenicbarley expressing the early flowering allele of Cryptochrome2gene.GMCrops.2011,2(1):50-7.doi:10.4161/gmcr.2.1.15627.
5、将CaMV35S终止子和pENTR-MCS用XmaI/AscI双酶切，将CaMV35S终止子连入pENTR-MCS的酶切后载体大片段，命名为pENTR-MCS-T35S；
6、用引物P35S(F)/P35S(R)对pMON82053进行PCR扩增，获得P35S；
P35S(F)：GCGATCGCGTCCGATGTGAGACTTTTC
P35S(R)：GCGGCCGCCCTCTCCAAATGAAATGAAC
pMON82053记载在如下文献中：Expression of the Arabidopsis thalianaBBX32 gene in soybean increases grain yield.PLoS One.2012；7(2):e30717.doi:10.1371/journal.pone.0030717。
7、将P35S和pENTR-MCS-T35S用AsiSI/NotI双酶切，将P35S连入pENTR-MCS-T35S的酶切后载体大片段，命名为pENTR-P35S。
6、用引物GUS(F)/GUS(R)对pBI 121进行PCR扩增，获得GUS片段；
GUS(F):GCGGCCGCATGTTACGTCCTGTAGAAAC
GUS(R):CCCGGGTCATTGTTTGCCTCCCTGCT
pBI 121记载在如下文献中：Complete sequence of the binary vector pBI121 and its application in cloning T-DNA insertion from transgenicplants.Molecular Breeding,2003,11(4):287-293.
7、将GUS片段和pENTR-P35S用NotI/XmaI双酶切，将GUS片段连入pENTR-P35S的酶切后大片段，命名为pENTR-P35S::GUS。
下述实施例中所用引物序列见表1：
表1为引物信息
(5’-GCGGCCGC、5’-CCCGGG分别为Not I、Xma I的限制性内切酶识别位点；5’-CTGCAG、5’-CTCGAG分别为Pst I、Xho I的限制性内切酶识别位点。)
实施例1、不同融合蛋白的合成
本研究拟考察由不同信号序列的组合所导致的可溶性人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(shTRAIL)不同亚细胞靶向在转基因植物种子和叶片中对目的蛋白表达量的影响。不同信号序列组合造成的目的蛋白不同的靶向部位对其表达量具有显著影响，为了筛选出shTRAIL适宜的信号序列组合，本研究除采用上述来源于PR-S的信号肽和AFVY蛋白质分选信号以外，另外选择了来源于菜豆凝集素PHA-L的信号肽(MASSKFFTVLFLVL LTHANS)和蛋白质内质网驻留信号——KDEL。通过上述四种不同的信号序列的组合，拟实现shTRAIL的多种细胞内运输机制和靶向：1、细胞质起始翻译→驻留于内质网(shTRAIL-112/212)；2、细胞质起始翻译→内质网→高尔基体→蛋白质贮藏型液泡(shTRAIL-111/211)；3、细胞质起始翻译→内质网→高尔基体→质外体(shTRAIL-110/210)。
shTRAIL为hTRAIL的C端可溶性活性区114-281aa，在其N端或C端添加信号肽或者分选信号蛋白，组成如下融合蛋白(如图1所示)：
融合蛋白shTRAIL-110：从N端至C端依次由信号肽PAH-L、Strep-tagII标签、肠激酶识别位点和shTRAIL组成；其氨基酸序列为序列2，第1-20位为信号肽PAH-L、第21-28位为Strep-tagII标签、第29-33位为肠激酶识别位点、第34-201位为shTRAIL。
融合蛋白shTRAIL-111：从N端至C端依次由信号肽PAH-L、Strep-tagII标签、肠激酶识别位点、shTRAIL和分选信号蛋白AFVY组成；其氨基酸序列为序列4，第1-20位为信号肽PAH-L、第21-28位为Strep-tagII标签、第29-33位为肠激酶识别位点、第34-201位为shTRAIL、第202-205位为分选信号蛋白AFVY；
融合蛋白shTRAIL-112：从N端至C端依次由信号肽PAH-L、Strep-tagII标签、肠激酶识别位点、shTRAIL和分选信号蛋白KDEL组成；其氨基酸序列为序列6，第1-20位为信号肽PAH-L、第21-28位为Strep-tagII标签、第29-33位为肠激酶识别位点、第34-201位为shTRAIL和第202-205位为分选信号蛋白KDEL；
融合蛋白shTRAIL-210：从N端至C端依次由信号肽PR-S、Strep-tagII标签、肠激酶识别位点和shTRAIL组成；其氨基酸序列为序列8；第1-25位为信号肽PR-S、第26-33位为Strep-tagII标签、第34-38位为肠激酶识别位点、第39-206位为shTRAIL；
融合蛋白shTRAIL-211：从N端至C端依次由信号肽PR-S、Strep-tagII标签、肠激酶识别位点、shTRAIL和分选信号蛋白AFVY组成；其氨基酸序列为序列10；第1-25位为信号肽PR-S、第26-33位为Strep-tagII标签、第34-38位为肠激酶识别位点、第39-206位为shTRAIL、第207-210位为分选信号蛋白AFVY；
融合蛋白shTRAIL-212：从N端至C端依次由信号肽PR-S、Strep-tagII标签、肠激酶识别位点、shTRAIL和分选信号蛋白KDEL组成；其氨基酸序列为序列12，第1-25位为信号肽PR-S、第26-33位为Strep-tagII标签、第34-38位为肠激酶识别位点、第39-206位为shTRAIL和第207-210位为分选信号蛋白KDEL。
上述融合蛋白在活性验证时都可以为剪切信号肽后的蛋白。
人工合成上述各融合蛋白的编码基因：
融合蛋白shTRAIL-110编码基因：从5‘端至3’端依次由信号肽PAH-L编码基因、Strep-tagII标签编码基因、肠激酶识别位点编码基因和shTRAIL编码基因组成；其核苷酸序列为序列1，第13-72位为信号肽PAH-L编码基因、第73-96位为Strep-tagII标签编码基因、第97-111位为肠激酶识别位点编码基因、第112-615位为shTRAIL编码基因。
融合蛋白shTRAIL-111编码基因：从5‘端至3’端依次由信号肽PAH-L、Strep-tagII标签、肠激酶识别位点、shTRAIL和分选信号蛋白AFVY组成；其核苷酸序列为序列3，第13-72位为信号肽PAH-L编码基因、第73-96位为Strep-tagII标签编码基因、第97-111位为肠激酶识别位点编码基因、第112-615位为shTRAIL编码基因、第616-627位为分选信号蛋白AFVY编码基因；
融合蛋白shTRAIL-112编码基因：从5‘端至3’端依次由信号肽PAH-L编码基因、Strep-tagII标签编码基因、肠激酶识别位点编码基因、shTRAIL编码基因和分选信号蛋白KDEL编码基因组成；其核苷酸序列序列为序列5，第13-72位为信号肽PAH-L编码基因、第73-96位为Strep-tagII标签编码基因、第97-111位为肠激酶识别位点编码基因、第112-615位为shTRAIL编码基因和第616-627位为分选信号蛋白KDEL编码基因；
融合蛋白shTRAIL-210编码基因：从5‘端至3’端依次由信号肽PR-S编码基因、Strep-tagII标签编码基因、肠激酶识别位点编码基因和shTRAIL编码基因组成；其核苷酸序列为序列7；第13-87位为信号肽PR-S编码基因、第88-111位为Strep-tagII标签编码基因、第112-126位为肠激酶识别位点编码基因、第127-630位为shTRAIL编码基因；
融合蛋白shTRAIL-211编码基因：从5‘端至3’端依次由信号肽PR-S编码基因、Strep-tagII标签编码基因、肠激酶识别位点编码基因、shTRAIL编码基因和分选信号蛋白AFVY编码基因组成；其核苷酸序列为序列9；第13-87位为信号肽PR-S编码基因、第88-111位为Strep-tagII标签编码基因、第112-126位为肠激酶识别位点编码基因、第127-630位为shTRAIL编码基因、第631-642位为分选信号蛋白AFVY编码基因；
融合蛋白shTRAIL-212编码基因：从5‘端至3’端依次由信号肽PR-S编码基因、Strep-tagII标签编码基因、肠激酶识别位点编码基因、shTRAIL编码基因和分选信号蛋白KDE编码基因L组成；其核苷酸序列为序列11，第13-87位为信号肽PR-S、编码基因第88-111位为Strep-tagII标签编码基因、第112-126位为肠激酶识别位点编码基因、第127-630位为shTRAIL编码基因和第631-642位为分选信号蛋白KDEL编码基因。
实施例2、表达融合蛋白的转基因植物构建及其功能验证
一、表达融合蛋白的转基因植物构建
1、表达融合蛋白的重组载体构建
将融合蛋白shTRAIL-110、shTRAIL-111、shTRAIL-112、shTRAIL-210、shTRAIL-211、shTRAIL-212编码基因分别替换入门载体pENTR-P35S::GUS中Not I和Xma I酶切位点间的DNA片段，得到连接融合蛋白shTRAIL-110编码基因的入门载体、连接融合蛋白shTRAIL-111码基因的入门载体、连接融合蛋白shTRAIL-112码基因的入门载体、连接融合蛋白shTRAIL-210码基因的入门载体、连接融合蛋白shTRAIL-211码基因的入门载体、连接融合蛋白shTRAIL-212编码基因的入门载体；
再将连接融合蛋白shTRAIL-110编码基因的入门载体、连接融合蛋白shTRAIL-111码基因的入门载体、连接融合蛋白shTRAIL-112码基因的入门载体、连接融合蛋白shTRAIL-210码基因的入门载体、连接融合蛋白shTRAIL-211码基因的入门载体、连接融合蛋白shTRAIL-212编码基因的入门载体分别通过LR反应与目的载体pEarleyGate 303进行同源重组，得到表达融合蛋白的重组载体pEXPR-P35S::shTRAIL-110、pEXPR-P35S::shTRAIL-111、pEXPR-P35S::shTRAIL-112、pEXPR-P35S::shTRAIL-210、pEXPR-P35S::shTRAIL-211、pEXPR-P35S::shTRAIL-212。
2、重组菌的构建
将上述各重组载体导入农杆菌GV3101::pMP90，得到重组农杆菌GV3101::pMP90/pEXPR-P35S::shTRAIL-110、GV3101::pMP90/pEXPR-P35S::shTRAIL-111、GV3101::pMP90/pEXPR-P35S::shTRAIL-112、GV3101::pMP90/pEXPR-P35S::shTRAIL-210、GV3101::pMP90/pEXPR-P35S::shTRAIL-211、GV3101::pMP90/pEXPR-P35S::shTRAIL-212(提取质粒测序验证正确性。)。
3、转基因烟草和转基因拟南芥的获得
A、农杆菌蘸花法进行拟南芥的遗传转化
1)以转化的当天为T日。在“T-2”日夜晚，分别挑取重组农杆菌GV3101::pMP90/pEXPR-P35S::shTRAIL-110、GV3101::pMP90/pEXPR-P35S::shTRAIL-111、GV3101::pMP90/pEXPR-P35S::shTRAIL-112、GV3101::pMP90/pEXPR-P35S::shTRAIL-210、GV3101::pMP90/pEXPR-P35S::shTRAIL-211、GV3101::pMP90/pEXPR-P35S::shTRAIL-212单克隆，接种于10mL YEB+Rif 50mg/L+Kan 50mg/L+Gent 50mg/L。28℃，220rpm培养24h。在“T-1”日夜晚，以1:100的比例扩大培养。
2)配制浸染液(1L)：MSB5干粉2.2g，蔗糖50g，6-BA 0.044μmol/L，Silwet L-77200μL，pH 5.7。
3)T日中午，待农杆菌OD600＝1时，停止摇菌。4,000rpm离心15min，富集菌体。
4)将菌体沉淀用浸染液重新悬浮，调整菌液OD600＝0.8-1.0。
5)将野生型拟南芥剪去果荚，将花序浸入浸染液恰好30s。
6)将浸染完毕的拟南芥侧放在大塑料托盘的底部。避光14h左右后正常培养。
得到T0代转shTRAIL-110拟南芥、T0代转shTRAIL-111拟南芥、T0代转shTRAIL-112拟南芥、T0代转shTRAIL-210拟南芥、T0代转shTRAIL-211拟南芥、T0代转shTRAIL-212拟南芥。
B、农杆菌介导的叶盘法转化野生型烟草
1)无菌苗的获得：取适量本氏烟草(N.benthamiana)NC89种子于无菌2mL离心管中，75％乙醇消毒30s，10％NaClO消毒30min，无菌水洗10遍。置于1/2MS培养基上，黑暗下28℃萌发。待萌发后光照培养。
2)工程菌的活化：以转化的当天为“T”日。在“T-2”日夜晚，挑取上述各种重组农杆菌工程菌单克隆，接种于10mL YEB+Rif 50mg/L+Kan 50mg/L+Gent 50mg/L。28℃，220rpm培养24h。在“T-1”日夜晚，以1:100的比例扩大培养。至“T”日，OD600＝0.4-0.6时，结束培养。
3)工作菌液的制备：室温下，1,500g，离心10min富集菌体。弃上清，加入与菌液等体积的液体MS 0培养基，重悬菌体沉淀并调整OD600＝0.3～0.4。
4)侵染：将烟草叶片在无菌纸上修剪成1×1cm左右的叶盘，尽量去除较大叶脉，浸入菌液30min左右。
5)共培养：将侵染后的叶盘摆放于MS 1培养基表面，上下各覆盖一层无菌滤纸。28℃暗培养3d。
6)选择培养：将共培养后的叶盘置于附加相应选择压的MS 2培养基，视生长状态一周转接一次。
7)生根培养：待抗性芽长到2-3cm时，切下转到附加相应选择压的MS 3培养基，诱导生根。
8)炼苗、移栽：待幼苗叶片生长至组培瓶的瓶口附近时，开盖炼苗3d左右，并移栽至营养土中，进行常规管理。
得到T0代转shTRAIL-110烟草、T0代转shTRAIL-111烟草、T0代转shTRAIL-112烟草、T0代转shTRAIL-210烟草、T0代转shTRAIL-211烟草、T0代转shTRAIL-212烟草。
C、分子鉴定
收取上述T0代转shTRAIL-110拟南芥、T0代转shTRAIL-111拟南芥、T0代转shTRAIL-112拟南芥、T0代转shTRAIL-210拟南芥、T0代转shTRAIL-211拟南芥、T0代转shTRAIL-212拟南芥的种子，播种，用Basta筛选得到T1代抗性植株。提取T1代抗性植株的基因组DNA，用TRAIL引物进行PCR扩增。
结果如图2所示，M：DNA分子量标准；1-9：拟南芥株系编号；10：阴性对照(野生型拟南芥)；pEXPR-P35S::shTRAIL-110为T1代转shTRAIL-110拟南芥、pEXPR-P35S::shTRAIL-111为T1代转shTRAIL-111拟南芥、pEXPR-P35S::shTRAIL-112为T1代转shTRAIL-112拟南芥、pEXPR-P35S::shTRAIL-210为T1代转shTRAIL-210拟南芥、pEXPR-P35S::shTRAIL-211为T1代转shTRAIL-211拟南芥、pEXPR-P35S::shTRAIL-212为T1代转shTRAIL-212拟南芥，可以看出，除个别株系表现为Basta抗性的假阳性外，大部分Basta抗性植株经PCR后，扩增出与预期大小相一致的目的条带，判定为转基因阳性株系，即为阳性T1代转shTRAIL-110拟南芥、阳性T1代转shTRAIL-111拟南芥、阳性T1代转shTRAIL-112拟南芥、阳性T1代转shTRAIL-210拟南芥、阳性T1代转shTRAIL-211拟南芥、阳性T1代转shTRAIL-212拟南芥。
将上述阳性T1代播种，直到得到T3代转shTRAIL-110拟南芥、T3代转shTRAIL-111拟南芥、T3代转shTRAIL-112拟南芥、T3代转shTRAIL-210拟南芥、T3代转shTRAIL-211拟南芥、T3代转shTRAIL-212拟南芥。
收取上述T0代转shTRAIL-110烟草、T0代转shTRAIL-111烟草、T0代转shTRAIL-112烟草、T0代转shTRAIL-210烟草、T0代转shTRAIL-211烟草、T0代转shTRAIL-212烟草的种子，播种，用草铵膦筛选得到T1代抗性植株。提取T1代抗性植株的基因组DNA，用TRAIL引物进行PCR扩增。
结果如图3所示，M：DNA分子量标准；1-9：烟草株系编号；10：阴性对照(野生型烟草)；pEXPR-P35S::shTRAIL-110为T1代转shTRAIL-110烟草、pEXPR-P35S::shTRAIL-111为T1代转shTRAIL-111烟草、pEXPR-P35S::shTRAIL-112为T1代转shTRAIL-112烟草、pEXPR-P35S::shTRAIL-210为T1代转shTRAIL-210烟草、pEXPR-P35S::shTRAIL-211为T1代转shTRAIL-211烟草、pEXPR-P35S::shTRAIL-212为T1代转shTRAIL-212烟草，除个别株系表现为Basta抗性的假阳性外，大部分Basta抗性植株经PCR后，扩增出与预期大小相一致的目的条带，判定为转基因阳性株系，即为阳性T1代转shTRAIL-110烟草、阳性T1代转shTRAIL-111烟草、阳性T1代转shTRAIL-112烟草、阳性T1代转shTRAIL-210烟草、阳性T1代转shTRAIL-211烟草、阳性T1代转shTRAIL-212烟草。
D、蛋白水平检测
阳性T1代转shTRAIL-110烟草、阳性T1代转shTRAIL-111烟草的种子用RIPA(强)试剂提取总蛋白，Western Blot检测目的蛋白表达，一抗为兔源性shTRAIL多抗(北京义翘神州生物技术有限公司,10409-MM03-50)，二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗(EarthOx,E030120-02)。以原核表达的shTRAIL为阳性对照。
阳性T1代转shTRAIL-110烟草、阳性T1代转shTRAIL-111烟草结果如图5所示，1；阳性对照shTRAIL；2：蛋白质分子量标准；3：阳性T1代转shTRAIL-110烟草；4：阳性T1代转shTRAIL-111烟草；5：野生型烟草；A：三聚体；B:疑似糖基化单体；C：单体，可以看出，阳性T1代转shTRAIL-110烟草和阳性T1代转shTRAIL-111烟草分别得到表观分子量约为21KD的融合蛋白shTRAIL-110/111(分选信号为4个氨基酸，对110和111分子量差别影响极小，故通过Western blot无法检出)。
二、转基因烟草和转基因拟南芥中shTRAIL表达量
ELISA试剂盒(为Human TRAIL/TNFSF10Immunoassay，购自R&D Systems,Inc.，货号DTRL00)检测T3代转shTRAIL-110拟南芥、T3代转shTRAIL-111拟南芥、T3代转shTRAIL-112拟南芥、T3代转shTRAIL-210拟南芥、T3代转shTRAIL-211拟南芥、T3代转shTRAIL-212拟南芥、阳性T1代转shTRAIL-110烟草、阳性T1代转shTRAIL-111烟草、阳性T1代转shTRAIL-112烟草、阳性T1代转shTRAIL-210烟草、阳性T1代转shTRAIL-211烟草、阳性T1代转shTRAIL-212烟草中目的蛋白的表达。每个样本至少重复两次。
具体如下：
1.蛋白提取：称取10mg种子或100mg叶片，装入2mL离心管中加钢珠液氮速冻砸样。加入100μL植物蛋白提取缓冲液。4℃放置1h，不时摇动。
2.标准曲线制作
(1)在TRAIL标准品试剂瓶中加入1mL去离子水，充分混匀，使标准品彻底溶解。所得母液浓度为10,000pg/mL。
(2)准备7只1.5mL离心管，分别标记为A-G，按照下表2加入相应试剂，充分混匀后备用。
表2
3.揭去微孔板封条，将试剂平衡至室温。
4.在微孔中各加入100μL的Assay Diluent RD1S。
5.在为空中加入50μL的标准品溶液/样品/阴性对照。用封条封闭微孔。将微孔板置于微孔板摇床，室温下，500rpm，振荡2h。
6.吸除微孔中的液体，加入300μL Wash Buffer洗涤2min，温和晃动微孔板。洗涤结束后弃去液体并在滤纸上拍干。重复3次。
7.在各孔中加入200μL TRAIL Conjugate，用封条封闭微孔后，将微孔板置于微孔板摇床，室温下，500rpm，振荡2h。
8.吸除微孔中的液体，加入300μL Wash Buffer洗涤2min，温和晃动微孔板。洗涤结束后弃去液体并在滤纸上拍干。重复3次。
9.在各孔中加入200μL的Substrate Solution，室温下避光30min。
10.在各孔中加入50μL的Stop Solution。如果反应孔中颜色不均匀，应吹打或晃动混匀。按照酶标仪说明书指示，在450nm波长下读数。
T3代转shTRAIL-110拟南芥、T3代转shTRAIL-111拟南芥、T3代转shTRAIL-112拟南芥、T3代转shTRAIL-210拟南芥、T3代转shTRAIL-211拟南芥、T3代转shTRAIL-212拟南芥、阳性T1代转shTRAIL-110烟草、阳性T1代转shTRAIL-111烟草、阳性T1代转shTRAIL-112烟草、阳性T1代转shTRAIL-210烟草、阳性T1代转shTRAIL-211烟草、阳性T1代转shTRAIL-212烟草种子和叶片中shTRAIL的表达量如图4所示，可以看出，目的蛋白在上述各个转基因植株的种子和叶片中得到表达。
运用SPSS软件对上述各组织中的shTRAIL表达量分别进行了成组样本均数的差异显著性检验(t检验)，结果如表3。
表3不同信号序列组合shTRAIL表达量的t检验
如：上述拟南芥T3代种子shTRAIL-110/210为T3代转shTRAIL-110拟南芥叶片、T3代转shTRAIL-210拟南芥叶片的shTRAIL表达量比较组，其余组解释同上。
从上述可以看出，
1)PHA-L来源信号肽与PR-S来源信号肽对目的蛋白表达量影响的比较
对使用不同信号肽但亚细胞靶向相同、材料来源部位相同(如拟南芥种子shTRAIL-110和拟南芥种子shTRAIL-210)的各组样本均值进行t检验，结果表明：除了在拟南芥种子中shTRAIL-112(平均表达量为52.18pg/mg TSP)和shTRAIL-212(平均表达量为34.15pg/mg TSP)差异不显著以外，来源于PHA-L的信号肽与蛋白质分选信号的组合，shTRAIL无论在拟南芥种子(如：shTRAIL-110的平均表达量为442.29pg/mg TSP)还是叶片(shTRAIL-110的平均表达量为192.21pg/mg TSP)中的表达量均极显著或显著高于来源于PR-S的信号肽与相同蛋白质分选信号的组合(如：shTRAIL-210，在拟南芥种子和叶片中的平均表达量分别为294.54pg/mg TSP和153.04pg/mg TSP)。该结果说明，对于shTRAIL在烟草和拟南芥中的而言，PHA-L信号肽较PR-S信号肽效果要好。
2)不同亚细胞靶向对目的蛋白表达量的影响
在采用相同的信号肽时，定位于内质网的目的蛋白表达量均是材料来源相同但亚细胞靶向不同的各组表达量中最低的。如：在烟草T1代种子中表达的shTRAIL-112和212，目的蛋白表达量仅分别为11.38和3.20pg/mg TSP。该结果说明，内质网不是shTRAIL的适宜靶向部位。
在均采用PHA-L信号肽的前提下，shTRIAL-110和111在T3代转基因拟南芥种子中的表达量均值分别为442.29和293.47pg/mg TSP，即shTRIAL-110的平均表达量是shTRIAL-111的1.51倍，差异达到极显著水平，但二者在T1代转基因烟草种子中的表达量分别为377.38和464.60pg/mg TSP，平均表达量的差异不显著。
在均采用PR-S信号肽的前提下，shTRAIL-210和211在T3代转基因拟南芥种子中的表达量均值分别为294.54和36.35pg/mg TSP，即shTRIAL-210的平均表达量是shTRIAL-211的8.10倍，差异达到极显著水平，但二者在T1代转基因烟草种子中的表达量分别为16.03和5.86pg/mg TSP，平均表达量的差异不显著。
从上述可以看出，在转基因拟南芥或者转基因烟草中，shTRAIL-110蛋白的表达量高于shTRAIL-111，更高于其余融合蛋白。
总体而言，在以后进行shTRAIL的高表达研究中，应该选择PHA-L信号肽不加合成后分选信号的载体构建形式(shTRAIL-110)：一方面，该策略对提高shTRAIL在转基因植物中表达量的优势已在模式植物拟南芥中被证实，另一方面，消除了蛋白质分选信号在蛋白质合成后加工过程中能否被有效切除的顾虑。
三、植物源性shTRAIL活性的细胞生物学检测
选取目的蛋白shTRAIL表达量较高的T1代转shTRAIL-110烟草株系110-24和T1代转shTRAIL-111烟草株系111-4叶片为试材，用PBS提取总可溶性蛋白。通过噻唑蓝比色法(MTT法)检测shTRAIL对NCI-H460的凋亡诱导效果。野生型烟草叶片提取的对照蛋白CK为对照。
具体如下：
1.取T1代转shTRAIL-110烟草株系110-24、T1代转shTRAIL-111烟草株系111-4叶片和野生型烟草叶片各10g，液氮研磨后加入15mL的PBS缓冲液，冰浴振荡提取90min。
2.12,000rpm，4℃离心10min。
3.取上清，用0.22μm的无菌滤器过滤除菌，即为含有shTRAIL的110-24总蛋白、含有shTRAIL的111-4总蛋白、WT总蛋白。
4.对含有shTRAIL的110-24总蛋白(shTRAIL粗提液)、含有shTRAIL的111-4总蛋白(shTRAIL粗提液)进行ELISA定量。
5.用PBS缓冲液含有shTRAIL的110-24总蛋白、含有shTRAIL的111-4总蛋白中的shTRAIL浓度均调整至200pg/mL，使含有shTRAIL的110-24总蛋白、含有shTRAIL的111-4总蛋白的浓度分别为0.47mg/mL和0.58mg/mL；再用PBS缓冲液将WT总蛋白浓度分别调整与含有shTRAIL的110-24总蛋白、含有shTRAIL的111-4总蛋白浓度一致，分别为CK110(浓度为0.47mg/mL)和CK111(浓度为0.58mg/mL)。
6.将人大细胞肺癌细胞NCI-H460培养至对数生长期，0.25％(W/V)胰蛋白酶消化后用RPMI 1640(w/o Hepes)培养基附加10％FBS悬浮细胞，使其终浓度为3-5×104个/mL。
7.每孔200μL细胞悬液加入96孔细胞培养板中，37℃5％CO2培养箱中培养24h后弃去上清。
8.每孔加入200μL处理液(V培养基:VshTRAIL粗提液或WT粗提液＝1:1)。同时以相同体积的PBS缓冲液(V培养基:VPBS＝1:1)做空白对照。每个样品做三个复孔。
9.培养条件同前，培养24h后，每孔加入20μL的MTT(5mg/mL)，37℃培养4h，终止培养，吸去孔内上清液。
10.每孔加入150μL DMSO，微孔板摇床上振荡10min，使结晶物充分溶解。
在酶标仪上测定490nm各孔吸光度值。酶标仪检测各孔的OD490值，按公式：(OD490WT对照孔-OD490给药孔)/OD490WT对照孔×100％，计算抑制率。
人大细胞肺癌细胞(NCI-H460)，购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心，资源编号：3111C0001CCC000355。
结果如表4示，可以看出，相对于野生型烟草叶片总蛋白对照，在T1代转shTRAIL-110烟草株系110-24和T1代转shTRAIL-111烟草111-4中用PHA-L信号肽指导共翻译转运的shTRAIL(114-281aa)和shTRAIL(114-281aa)-AFVY均有生物学活性，其对NCI-H460的抑制率分别为37.21％和31.31％。
对照蛋白CK和PBS均没有任何抑制作用。
表明，融合蛋白shTRAIL-110和shTRAIL-111均具有shTRAIL活性，促进NCI-H460细胞凋亡。
表4植物源性shTRAIL的细胞生物学活性分析
需要说明的是，用于阴性对照的总可溶性蛋白样品——CK110和CK111，均来源于同一份野生型烟草叶片提取物，但经二者分别处理后的NCI-H460在OD490指标上表现出一定的差异，原因在于：为了客观评价转基因烟草叶片总蛋白提取物中shTRAIL对NCI-H460的凋亡诱导效果，根据来源于转基因株系110-24和111-4的样品总蛋白浓度，分别为其配制总蛋白浓度一致的野生型烟草叶片来源总蛋白作为阴性对照，以平衡植物源性总蛋白中除目的蛋白外的杂蛋白对测试结果的影响，而CK111的蛋白浓度高于CK110；因此推测，二者总可溶性蛋白浓度的差异是造成其处理后细胞的OD490出现差异的主要原因。
实施例2、利用转基因烟草和陆地棉表达shTRAIL
1、表达载体的构建
1)提取陆地棉珂字312的总DNA，用下列引物进行PCR扩增，获得启动子PGh αGLOA。
P α GLOA Fwd:CGATCGCGTCAGCAACCTCTAGACCTAGT
Rev:GCGGCCGCGATTACTATAAGCTCTGTAT
2)用AsiS I/Not I双酶切启动子PGh α GLOA和pENTR-P35S::GUS，并用T4 DNA连接酶将启动子序列和载体骨架序列进行连接，获得pENTR-PGh α GLOA::GUS。
3)将序列表中序列9所示的shTRAIL-211编码基因插入pENTR-PGh α GLOA::GUS中，获得pENTR-PGh α GLOA::shTRAIL-211。
4)再将pENTR-PGh α GLOA::shTRAIL-211通过LR反应分别与目的载体pEarleyGate 303-Kan(R)进行同源重组，得到重组载体pEXPR-PGh α GLOA::shTRAIL-211。
pEarleyGate 303-Kan(R)按照如下方法制备：
1)用下列引物，以pBI 121为模板，扩增得到Kan片段。
Kan(F):GGTACCGATCATGAGCGGAGAATTAAG
kan(R):GGTACCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG
将Kan片段插入pEarleyGate 303的Kpn I酶切位点间，得到pEarleyGate 303-Kan(R)。
将上述重组载体pEXPR-PGh α GLOA::shTRAIL-211和实施例1构建的重组载体pEXPR-P35S::shTRAIL-211(35S启动子启动shTRAIL-211表达)分别导入农杆菌GV3101::pMP90中，得到各种重组农杆菌GV3101(pEXPR-PGh α GLOA::shTRAIL-211)和GV3101(pEXPR-P35S::shTRAIL-211)(提取质粒测序验证正确性。)。
3、转shTRAIL-211烟草的获得及PCR鉴定
运用农杆菌工程菌GV3101(pEXPR-PGh α GLOA::shTRAIL-211)按照前面的农杆菌介导的叶盘法转化野生型烟草，得到T0代转shTRAIL-211烟草。
提取T0代转shTRAIL-211烟草叶片的基因组DNA作为模板，用TRAIL引物进行PCR鉴定。
结果如图6所示，M：DNA分子量标准；1-8：烟草株系编号；CK：阴性对照，可以看出，均得到约500bp的片段，为阳性T0代转shTRAIL-211烟草。
阳性T0代转shTRAIL-211烟草播种，得到T1代转shTRAIL-211烟草。
4、转shTRAIL-211陆地棉的获得及PCR鉴定
运用农杆菌工程菌GV3101(pEXPR-PPvphas::shTRAIL-211)分别进行了陆地棉的遗传转化(方法见Meng Z,Liang A,Yang W.Effects of hygromycin on cotton culturesand its application in Agrobacterium-mediated cotton transformation[J].InVitro Cellular&Developmental Biology-Plant.2007,43(2):111-118)，得到T0代转shTRAIL-211陆地棉(Pvphas)。
陆地棉R18记载在如下文献中：陆地棉品种对多个大丽轮枝菌菌株的抗性分析.棉花学报,2001,13(1):3-6.
T0代转shTRAIL-211陆地棉(Pvphas)结果如图7所示，M：DNA分子量标准；1-4：转基因陆地棉株系编号；CK：阴性对照，可以看出，均得到约500bp的片段，为阳性T0代转shTRAIL-211陆地棉。
阳性T0代转shTRAIL-211陆地棉播种，得到T1代转shTRAIL-211陆地棉.
5、shTRAIL在转基因植物中表达的ELISA检测
T1代转shTRAIL-211烟草种子中目的蛋白表达量经ELISA检测，方法同时实施例2。
结果如图8所示，可以看出，T1代转shTRAIL-211烟草种子shTRAIL的平均表达量为5.86pg/mg TSP；与实施例1获得的T1代转shTRAIL-211烟草相比，为实施例1的2.39倍，表明Gh α GLOA启动子驱动目的蛋白的表达水平显著高于CaMV 35S启动子。
T1代转shTRAIL-211陆地棉种子中目的蛋白表达量经ELISA检测，方法同时实施例2。
结果如表5所示，其中14号植株的目的蛋白表达量最高，为31.84pg/mg TSP。
表5转基因陆地棉中shTRAIL的表达量
因此，可以看出，shTRAIL可在植物中获得表达。
Claims (6)
1.融合蛋白，其包括shTRAIL蛋白及位于其N端的信号肽，所述shTRAIL蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2第34-201位氨基酸残基；所述信号肽为PAH-L；所述PAH-L的氨基酸序列为序列表中序列2第1-20位氨基酸残基；所述融合蛋白为序列2所示的蛋白。
2.编码权利要求1所述融合蛋白的DNA分子，是编码区为序列表中序列1所示的DNA分子。
3.含有权利要求2所述DNA分子的重组载体、表达盒或重组菌。
4.权利要求1所述蛋白、权利要求2所述DNA分子或权利要求3所述重组载体、表达盒或重组菌在制备促进肿瘤细胞凋亡产品中的应用。
5.权利要求2所述DNA分子或权利要求3所述重组载体、表达盒或重组菌在培育表达shTRAIL蛋白的植物中的应用；
所述植物为拟南芥、烟草或陆地棉。
6.一种培育表达shTRAIL蛋白的转基因植物方法，为将编码权利要求1所述融合蛋白的DNA分子导入目的植物，获得表达shTRAIL蛋白的转基因植物；
所述植物为拟南芥、烟草或陆地棉。
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|---|
| PDB：1D0G_A;Hymowitz,S.G.等;《NCBI GeneBank》;20121010;全文 * |
| 高效双价( Bt + cpti) 表达载体的构建及其表达分析;薛计雄等;《中国农业科技导报》;20130425;第15卷(第3期);摘要 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105037560A (zh) | 2015-11-11 |
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