CN102812121A - 用于改善蛋白质生产的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及有益于培养的真核细胞的组合物及其用途，以及它们用于促进细胞生长、生存力和重组蛋白表达的方法。本申请中公开的方法，例如用于改善细胞生存力和加速在培养下所培育细胞的细胞生长速率。在一个方面，本发明的补充物用于改善或提高来自细胞培养物的重组蛋白的产率。

Description

用于改善蛋白质生产的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本发明要求2010年1月25日提交的美国临时专利申请号61/298,100的权益，所述美国临时专利申请号61/298,100的整体内容在此引用作为参考。
技术领域
本发明涉及有益于培养真核细胞的组合物及其用途，和使用它们促进细胞生长、生存力和重组蛋白表达的方法。
背景技术
研究生物学过程经常需要在构成上比完整生物体小的细胞、组织和器官中检验那些过程。许多年来，这些细胞、组织和器官已经从生物体中分离并且在离体或体外模型中在支持它们存活的条件下独立地加以研究。一般而言，从生物体中取出细胞、组织或器官并且将其在支持存活和/或被研究的生物过程的培养基中维持。鉴于丰富多样的细胞、组织和器官类型，在完整生物体外部支持其存活、生长和生物特性的培养基的配方不是无价值的。出于没有完全理解的原因，许多细胞和组织难以在培养下维持。此外，细胞和组织经常用于以下过程中，所述过程涉及体外制造对于生物医学研究和基于生物制品的药品为关键的重组蛋白、疫苗、病毒原液和其他产品。因此，需要识别支持细胞、组织和器官培养物在体外和离体条件下生长和存活的条件和培养基组分。
此类细胞组分包括例如，白蛋白、转铁蛋白、谷胱甘肽S-转移酶、超氧化物歧化酶、乳铁蛋白和生长因子。
白蛋白是血浆中存在的最丰富的蛋白质。它在哺乳动物中由肝脏产生并且在多种能力方面发挥作用。白蛋白是一种可溶性单体蛋白质，其包含约一半的血清蛋白。白蛋白主要作为类固醇、脂肪酸和甲状腺激素的载体蛋白发挥作用并且在稳定细胞外液容量方面发挥作用。白蛋白是分子量67,000的球状非糖基化的血清蛋白并且含有5个或6个内部二硫键。白蛋白作为前白蛋白合成，所述前白蛋白具有在新生蛋白质从糙面内质网释放之前移去的N端肽。产物白蛋白原依次在高尔基囊泡中经切割以产生分泌型白蛋白。
白蛋白对于维持体液在血管内区室和身体组织之间适当分布所需要的渗透压是必需的。它还通过非特异性结合几种疏水性类固醇激素充当血浆载体并且作为氯高铁血红素和脂肪酸的转运蛋白。牛血清白蛋白(BSA)已经长期用作细胞培养基中的补充物，因为它是常以1-20％总体积添加至基础培养基的胎牛血清(FBS)的组分。BSA是众多确定无血清培养基配方中的主要组分，原因是它是容易大批获得的，相对便宜并且可以相对容易地纯化至均一。白蛋白的代表性来源包括例如源自牛、马、猪和其他哺乳动物物种的血浆。
随着用于人类临床使用的重组蛋白、疫苗和其他产品的大规模生产的来临，已经对生产这些产品时所用的配方提出更严格要求。因为动物源材料携带可能影响产品安全性的病原体的威胁，已经调整许多现存的重组生产工艺，从而整个过程中所用的全部材料或培养组分避免动物源产物。即，细胞培养组分已经不能从完整动物来源分离或纯化。因此，作为从完整动物直接纯化出这些补充物的替代，优选重组产生培养基补充物。因此，使用重组手段，使用保证无病毒和毒素的确定成分的组织培养培养基以及高度表征的组织培养细胞，可以制造人和来自其他物种的细胞培养组分。
一种基于细胞培养组分制备重组蛋白的方法是工程化酵母或植物以过量表达这种蛋白质并且随后纯化这种蛋白质。作为用于意在治疗性使用的人蛋白质的重组蛋白生产细胞培养组分的来源，植物衍生的重组蛋白是特别有吸引力的，因为没有植物病毒也可以感染人的实例。
目前迫切需要支持重组产生人治疗用蛋白质以及培育和分化干细胞的重组细胞培养组分，并且随着此类产品在市场上的继续成功和巨大潜力，产生重组细胞培养组分的更有效方式是合乎需要的。特别是，用于重组产生蛋白质和培育及分化干细胞的现有方法是缓慢、昂贵和费力的。这些方法分别部分地受到涉及细胞生长速率和重组宿主细胞或干细胞生存力的基本方面限制。这些限制的关键方面包括i)从细胞的复杂混合物中快速分离和扩增单一细胞克隆的能力，ii)促进快速细胞生长的能力，尤其在低密度和在无血清培养基中，iii)在生物反应器中以极高密度维持细胞生长和生存力的能力，iv)冷冻保存、解冻细胞和细胞库同时维持高生存力的能力，v)有效培育和分化干细胞培养物的能力。因此，需要满足这些需求和使培养细胞的生长和生存力能够改进的改良培养基和培养条件。通过改善生存力和细胞生长的速率，本发明的补充物和方法满足这些需求并且也可以导致从哺乳动物细胞培养生产过程获得的重组产物有改善的产率和质量。
发明内容
本发明部分地基于以下展示：在添加至培养中培育的哺乳动物细胞时，植物衍生的重组细胞培养组分蛋白令人惊讶地增强细胞的生长和生存力至大于标准纯化蛋白质的程度。此类植物衍生的细胞培养组分可以用来产生在组织和细胞培养中有用的补充物。
本申请中公开的方法和补充物，例如，用于改善细胞生存力和加速培养中培育的细胞的细胞生长速率。在一个方面，本发明的补充物用于改善或提高从细胞培养物中产生的重组蛋白的产率。下文详细描述由本发明提供的进一步改善。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于增强培养细胞的细胞生长的方法，所述方法包括添加补充物至细胞培养基。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于增强已经适应于无血清培养基的细胞的生产率的方法，所述方法包括添加补充物至无血清培养基。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于减少生物反应器中乳酸积累的方法，所述方法包括添加补充物至生物反应器中的培养细胞。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于减少生物反应器中葡萄糖和其他糖消耗的方法，所述方法包括添加补充物至生物反应器中的培养细胞。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于减少在生物反应器中从开始培养到收获以产生蛋白质所需时间的方法，所述方法包括添加补充物至生物反应器中的培养细胞。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善生物反应器中细胞生存力的方法，所述方法包括添加补充物至生物反应器。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善在无血清条件下培养细胞的生存力的方法，所述方法包括添加补充物至无血清培养基。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善细胞以低密度铺种时的生存力的方法，所述方法包括添加补充物至细胞培养基。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善从单一细胞克隆培育而来的细胞的生存力的方法，所述方法包括添加补充物至细胞培养基。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善在培养下培育的原代细胞的生存力的方法，所述方法包括添加补充物至培养基。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善转染后细胞的生存力的方法，所述方法包括在转染之前、期间或紧随之后添加补充物至细胞培养基。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善冷冻保存后的细胞生存力的方法，所述方法包括在冷冻保存或解冻之前、期间或紧随之后添加补充物至细胞培养基。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善从培养细胞产生的重组产物的产率的方法，所述方法包括添加补充物至培养物。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善从培养细胞产生的重组产物的纯化的方法，所述方法包括添加补充物至培养物。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于减少从培养细胞产生的重组产物的蛋白水解的方法，所述方法包括添加补充物至培养物。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善从培养细胞产生的重组产物的生物活性的方法，所述方法包括添加补充物至培养物。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善从培养细胞产生的重组产物的稳定性的方法，所述方法包括添加补充物至培养物。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善从培养细胞产生的重组产物的装配的方法，所述方法包括添加补充物至培养物。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于产生从培养细胞产生的重组产物的更人性化的糖基化模式的方法，所述方法包括添加补充物至培养物。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于从培养细胞产生具有更小免疫原性的重组产物的方法，所述方法包括添加包含重组白蛋白的补充物至培养物。
在重组细胞生产方法的一个方面，培养细胞的生存力增加。
在这些方法中的任一个方面，补充物包含重组白蛋白；其中所述重组白蛋白在植物中产生，其中所述补充物具有小于约1EU内毒素/mg的白蛋白；并且其中所述白蛋白包含小于约2％的聚合白蛋白。
在这些方法中的任一个方面，细胞是原代细胞。在这些方法中的任一个方面，细胞是干细胞。在这些方法中的任一个方面，细胞是组织培养细胞。在这些方法中的任一个方面，细胞是血液细胞。在这些方法中的任一个方面，细胞是原代单核细胞。在这些方法中的任一个方面，细胞是CHO细胞。在这些方法中的任一个方面，细胞是杂交瘤细胞。在这些方法中的任一个方面，细胞是Vero细胞。在这些方法中的任一个方面，细胞由流式细胞术分选。在这些方法中的任一个方面，细胞是通过梯度离心分离的原代细胞。在这些方法中的任一个方面，细胞是B细胞。在这些方法中的任一个方面，细胞是T-细胞。在这些方法中的任一个方面，细胞由流式细胞术分离。在这些方法中的任一个方面，细胞由微流体装置分离。
在这些方法中的任一个方面，补充物包含至少约0.01％wt/wt的热休克蛋白。在该方法的一个方面，热休克蛋白是稻热休克蛋白。在该方法的一个方面，热休克蛋白选自稻HSP70基因和稻胚乳腔结合蛋白。在该方法的一个方面，热休克蛋白选自稻(gb|ACJ54890.1|)、EEC69073/OsI_37938和AAB63469。
在这些方法中的任一个方面，补充物包含至少约0.01％wt/wt的HSP70。在这些方法中的任一个方面，补充物包含至少约0.04％wt/wt的HSP70。在这些方法中的任一个方面，补充物包含至少约0.06％wt/wt的HSP70。在这些方法中的任一个方面，补充物包含至少约0.08％wt/wt的HSP70。在这些方法中的任一个方面，补充物包含至少约0.1％wt/wt的HSP70。
在这些方法中的任一个方面，补充物包含添加至约100mg/L和约200mg/L之间终浓度的重组白蛋白。在这些方法中的任一个方面，补充物包含添加至约200mg/L和约400mg/L之间终浓度的重组白蛋白。在这些方法中的任一个方面，补充物包含添加至约400mg/L和约600mg/L之间终浓度的重组白蛋白。在这些方法中的任一个方面，补充物包含添加至约600mg/L和约800mg/L之间终浓度的重组白蛋白。在这些方法中的任一个方面，补充物包含添加至约800mg/L和约1000mg/L之间终浓度的重组白蛋白。在这些方法中的任一个方面，补充物包含添加至约1000mg/L和约2000mg/L之间终浓度的重组白蛋白。在这些方法中的任一个方面，补充物包含添加至约2000mg/L和约5000mg/L之间终浓度的重组白蛋白。在这些方法中的任一个方面，补充物包含添加至约5000mg/L和约10000mg/L之间终浓度的重组白蛋白。在这些方法中的任一个方面，补充物包含添加至约10000mg/L和约20000mg/L之间终浓度的重组白蛋白。
在这些方法中的任一个方面，与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于10％。在这些方法中的任一个方面，与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于15％。在这些方法中的任一个方面，与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于20％。在这些方法中的任一个方面，与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于25％。在这些方法中的任一个方面，与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于30％。在这些方法中的任一个方面，与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于40％。在这些方法中的任一个方面，与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于50％。在这些方法中的任一个方面，与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于60％。在这些方法中的任一个方面，与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于70％。在这些方法中的任一个方面，与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于80％。在这些方法中的任一个方面，与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于90％。在这些方法中的任一个方面，与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于100％。
附图说明
可以通过参考阐述说明性实施方案的以下详细描述，获得对本发明特征和优点的更好理解，在所述实施方案中使用本发明的原理，并且其附图是：
图1显示通过HPLC大小排阻层析比较从稻产生的重组白蛋白和其他来源的白蛋白以及纯化的方法。图1A显示血清源(非重组)白蛋白的层析图。图1B显示使用“老方法”B000纯化所产生的稻重组白蛋白(Cellastim P0107)的层析图。图1C显示使用“新方法”B0000C纯化所产生的稻重组白蛋白(CellastimP0171)的层析图。图1D显示血清源白蛋白(1A；虚线)和使用新方法制备的Cellastim((1C；实线)的层析图的重叠。图1E显示使用老方法B000制备的Cellastim(Cellastim P0107)(1B；虚线)和使用新方法B0000C制备的Cellastim(Cellastim P0171)(1C；实线)的层析图的重叠。
图2比较显示了通过SDS PAGE分析的从稻产生的重组白蛋白和其他来源的白蛋白以及纯化的方法。图2A显示Cellastim P0171和Cellprime白蛋白(Millipore/Novozymes)的比较。泳道1是分子量标记。泳道4是Cellastim白蛋白(10μg)并且泳道7是Cellprime白蛋白(10μg)。图2B比较显示了通过SDSPAGE分析的来自先前方法(B000)(泳道2、3和4)和新Cellastim方法(B0000C)(泳道6、7和8)的3个Cellastim批次。这六份样品以20μg/泳道上样。
图3：显示酵母重组白蛋白(Cellprime)、人源白蛋白(Seracare)和植物重组白蛋白(Cellastim P0171)对细胞生长和生存力的影响的比较(图3A)。图3B显示在使用重组白蛋白生产的老方法(B000)和新方法(B0000C)所产生的分批白蛋白中内毒素水平的比较。图3C显示细胞的细胞生长和生存力的比较，所述细胞在使用重组白蛋白生产的老方法(B000)和新方法(B0000C)所产生的Cellastim存在下培育。
图4：显示使用抗热休克蛋白抗体的蛋白质印迹，以显示在ATP亲和层析后从重组白蛋白获得的不同级分的热休克蛋白含量。(见实施例3)
图5：显示在使用新方法所产生的白蛋白通过ATP亲和柱以除去热休克蛋白后Cellastim重组白蛋白的细胞生长和生存力影响的比较。(详见文字)。
图6A显示CHO-K1在未补充和补充培养基的摇瓶中的生长曲线。图6B显示在未补充和补充的培养基中CHO-K1的活细胞百分比。
图7A：显示在补充和未补充(对照)培养基的摇瓶中培育的CHO K1细胞的比净生长速率。图7B显示在补充和未补充(对照)培养基的摇瓶内培育的CHO K1细胞的比净死亡速率。
图8A显示在未补充和补充的培养基中(在第4日添加营养进料)的生存力细胞密度。图8B显示在未补充和补充的培养基中(在第4日添加营养进料)CHO-K1的活细胞百分比。
图9A：显示在补充和未补充(对照)培养基的摇瓶(在第4日以营养进料强化)中培育的CHO K1细胞的比净生长速率。图9B显示在补充和未补充(对照)培养基的摇瓶(在第4日以营养进料强化)中培育的CHO K1细胞的比净死亡速率。图9C显示在有补充物的培养基的摇瓶中增加的抗体浓度。
图10A显示在加料时不良事件后生物反应器中CHO K1的生长曲线。针对250mg/LCellastim条件运行两个生物反应器。图10B显示在加料时不良事件后生物反应器中CHO K1的活细胞百分比。针对250mg/L Cellastim条件运行两个生物反应器。
图11A显示在补充和未补充对照培养基(在第3日和第7日强化营养)的生物反应器中CHO K1的生长曲线。显示随时间推移的活细胞密度。图11B显示在补充和未补充对照培养基(在第3日和第7日营养进料)的生物反应器中CHO K1的比生长速率。显示随时间推移的活细胞密度。
图12A显示在不良事件后未补充和补充的培养基(在第3日和第7日营养进料)的生物反应器中CHO K1的活细胞百分比。图12B显示在补充和未补充(对照)培养基的生物反应器中(在第3日和第7日以营养进料强化)培育的CHO K1细胞的比净死亡速率。
图13A显示在补充和未补充培养基的生物反应器中培育的CHO K1的pH趋势。图13B显示在补充和未补充培养基的生物反应器中培育的CHO K1的渗透压趋势。
图14A显示在补充和未补充培养基的生物反应器内培育(在第3日和第7日营养进料)的CHO K1的葡萄糖趋势。图14B显示在补充和未补充培养基的生物反应器中培育(在第3日和第7日营养进料)的CHO K1的乳酸趋势。
图15A显示在补充和未补充(对照)培养基的生物反应器中培育(在第3日和第7日以营养进料强化)的CHO K1细胞的比葡萄糖消耗量。图15B显示在补充和未补充(对照)培养基的生物反应器中培育(在第3日和第7日以营养进料强化)的CHO K1细胞的比乳酸产量。
图16A显示在补充和未补充培养基的生物反应器中(在第3日和第7日营养进料)由CHO K1产生的产物的浓度。图16B显示在补充和未补充培养基的生物反应器中(在第3日和第7日营养进料)CHO K1的比生产率。
图17A显示通过蛋白A层析法纯化抗体时所使用的方法的示意图。图17B：显示吸光度层析图，其显示平衡、上样、洗涤和洗脱的级分。注意，在代表已纯化抗体的洗脱级分中存在有蛋白质的强峰。
图18显示采用考马斯蓝染色的SDS-PAGE，其显示抗体的纯化和通过蛋白A层析法成功移除培养基补充物。
图19显示采用银染色的SDS-PAGE，其显示抗体的纯化和通过蛋白A层析法成功移除培养基补充物。
具体实施方式
定义
为了可以更容易地理解本公开内容，首先定义某些术语。在整个详细描述中阐述额外的定义。
术语“约”或“大约”意指处于由本领域技术人员所确定的特定值的可接受误差范围内部，这将部分地取决于怎样测量或确定该值，即，测量系统的局限性。例如，本领域每次实践，“约”可以意指1或多于1的标准偏差之内。或者，就组合物而言，“约”可以意指加上或减去最多至20％的范围内、优选地最多10％、更优选最多5％。如本文所用，术语“增加”或相关的术语“增加的”指统计上地显著的增加。为避免不确定，这些术语通常指所给定的参数增加至少10％，并且可以包括至少20％、50％、75％、100％、150％或更多。
术语“抗原结合片段”指免疫球蛋白或抗体的多肽部分，这些多肽部分结合抗原或与完整抗体(即，与衍生它们的完整抗体)竞争结合抗原(即，特异性结合)。可以通过重组DNA技术或通过酶切割或化学切割完整免疫球蛋白产生结合性片段。结合性片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fabc、Fv、单链和单链抗体。
术语“凋亡”(“正常”或“程序性”细胞死亡)指在发育和其他正常生物学过程期间借以消除不需要或无用的细胞的生理过程。凋亡是在正常生理条件下出现的细胞死亡模式，并且细胞是其自身死亡的积极参与者(“细胞自杀”)。凋亡最经常出现在正常细胞周转和组织稳态、胚胎发生、免疫耐受性的诱导和维持、神经系统发育和内分泌依赖性组织萎缩期间。凋亡也可以在组织培养条件下培育的细胞中应答于应激而触发。经历凋亡的细胞显示特征性形态学特征和生物化学特征，所述特征可以容易地测量和定量。这些特征包括染色质聚集、胞核和胞质凝结、胞质和胞核分割成含有核糖体、形态完整的线粒体和胞核物质的膜结合囊泡(凋亡体)。在体内，这些凋亡体被巨噬细胞或相邻的上皮细胞迅速识别并吞噬。由于体内移除凋亡细胞的这种高效机制，未激发炎症反应。在体外，凋亡体以及剩余的细胞片段最终膨胀并且最后裂解。体外细胞死亡的这种终末期已经命名为“继发性坏死”。
如本文所用，术语“细胞”、“细胞”、“细胞系”、“宿主细胞”、和“宿主细胞”可互换地使用，并且包括植物细胞和动物细胞，并且包括无脊椎动物细胞、非哺乳脊椎动物细胞和哺乳动物细胞。全部此类命名均包括细胞群体和子代。因而，术语“转化体”和“转染子”包括原代实验细胞和源自其中的细胞系，无论转移次数是多少。示例性非哺乳脊椎动物细胞包括，例如，鸟类细胞、爬行动物细胞和两栖动物细胞。示例性无脊椎动物细胞包括，但不限于如昆虫细胞，例如毛虫(草地夜蛾(Spodoptera frugiperda))细胞、蚊(埃及伊蚊(Aedesaegypti))细胞、果蝇(黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))细胞、施耐德细胞和家蚕(Bombyx mori)细胞。参见，例如，Luckow等人，Bio/Technology 6：47-55(1988)。细胞可以是分化的、部分分化的或未分化的，例如，干细胞，包括胚胎干细胞和多潜能干细胞。另外，根据本发明可以使用源自器官或器官系统的组织样品。示例性哺乳动物细胞包括，例如源自人、非人灵长类、猫、犬、羊、山羊、牛、马、猪、兔，包括小鼠、仓鼠、大鼠和豚鼠的啮齿类及其任何衍生物和子代的细胞。
术语“细胞培养”或“组织培养”指在如转瓶、组织培养瓶、平皿、多孔平板等的容器中悬浮培育或附着于多种表面或基材上所培育的细胞。术语“细胞培养”也包括大规模方法，如生物反应器，包括在搅拌的酵罐中附着在微载体上生长的贴壁细胞。另外，不仅可以培养接触依赖性细胞，还可以在要求保护的本发明的方法中使用悬浮培养技术。示例性微载体包括，例如，葡聚糖、胶原蛋白、塑料、明胶和纤维素和如Butler，Spier和Griffiths，Animal cellBiotechnology 3：283-303(1988)中所述的其他微载体。也可以使用多孔载体，例如CytolineTM或CytoporeTM，以及基于葡聚糖的载体，如DEAE-葡聚糖(Cytodex 1TM季胺包覆的葡聚糖(CytodexTM)或基于明胶的载体，如明胶包覆的葡聚糖(Cytodex 3TM)。本发明包括用于大规模和小规模生产蛋白质的细胞培养方法。可以使用的方法包括，但不限于流体床生物反应器、中空纤维生物反应器、转瓶培养或搅拌罐生物反应器系统，伴以或不伴以微载体，并且可选地以批、补料分批或灌注模式操作。
术语“细胞培养液”、“细胞培养基”和“培养基”指用于培育、储存、操作和维持细胞和细胞系的溶液。此类溶液通常包括细胞贴附、生长和细胞环境维持必需的多种因子。例如，常见溶液可以包括基础培养基配方、取决于细胞类型和偶而取决于抗生素的多种补充物。在一些实施方案中，溶液可以包括来自以下分类的一个或多个中的至少一种组分：1)能源，通常为碳水化合物形式如葡萄糖；2)全部必需氨基酸和通常一套基础的20种氨基酸外加胱氨酸；3)需要在低浓度的维生素和/或其他有机化合物；4)游离脂肪酸；和5)微量元素，其中微量元素定义为一般需要在极低浓度(通常在微摩尔范围内)的无机化合物或天然存在的元素。溶液可以任选地补充有来自以下任何分类的一种或多种组分：1)激素和其他生长因子，例如，胰岛素、转铁蛋白、和表皮生长因子；2)盐和缓冲液，例如，钙、镁、Tris、HEPES和碳酸氢钠；3)核苷和碱基，例如，腺苷和胸苷、次黄嘌呤；以及4)蛋白质和组织水解物。通常，可以使用任何适合的细胞培养基。培养基可以包含血清，例如胎牛血清、小牛血清等。可选地，培养基可以是无血清的、无动物组分或无蛋白质的。
在指干细胞培养物时，术语“细胞系”指细胞类型的全部发育阶段，从最早前体细胞至完全成熟细胞(即，特化细胞)。
术语“细胞生存力”或“生存力”指在任何给定的时间随细胞群体一起存在的活细胞和死细胞的相对量。细胞生存力可以通过测量该群体的任何给定样品中活细胞和死细胞的相对数目来确定。细胞生存力也可以通过测量整个群体的细胞增殖速率进行估计，所述细胞增殖速率代表细胞生长速率和细胞死亡速率的总体平衡。细胞生长的速率也可以通过计算细胞数目和通过使用直接评定细胞生长速率的无数市售细胞增殖测定法来直接测量。
“条件培养基”指从饲养细胞的培养物获得的细胞培养基，其中干细胞可以依赖所述饲养细胞来培养并且维持在多潜能状态。饲养细胞耗尽了条件培养基的一些组分，但也用细胞衍生物质(可能包括少量生长因子)丰富了这种培养基。如本文所用的术语“饲养细胞因子”意指由饲养细胞释放至条件培养基中的细胞衍生物质。释放至细胞培养基中的细胞因子用于增强干细胞的生长，或用于维持胚干细胞处于多潜能状态。饲养细胞因子可以使用本领域技术人员已知和本文描述的技术进行识别和纯化。
短语“保守性氨基酸置换”或“保守性突变”指一个氨基酸由具有共同特性另一个氨基酸置换。定义各个氨基酸之间共同特性的功能性方式是分析同源生物的相应蛋白质之间氨基酸变化的归一化频率(Schulz，G.E.和R.H.Schirmer，Principles of Protein Structure，Springer-Verlag)。根据此类分析，可以定义氨基酸的组，其中组内的氨基酸优先交换彼此，并且因此在它们影响总体蛋白质结构方面彼此最相似(Schulz，G.E.和R.H.Schirmer，Principles of ProteinStructure，Springer-Verlag)。
以这种方式定义的氨基酸组的实例包括：“由Glu、Asp、Asn、Gln、Lys、Arg和His组成的“带电荷/极性组”；由Pro、Phe、Tyr和Trp组成的“芳香族或环状组”；和由Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Ser、Thr和Cys组成“脂族组”。
在每个组内部，也可以识别出亚组，例如，带电荷/极性氨基酸组可以进一步划分成以下亚组：由Lys、Arg和His组成的“带正电荷亚组”；由Glu和Asp组成的“带负电荷亚组”；和由Asn和Gln组成的“极性亚组”。芳香族或环状组可以进一步划分成以下亚组：由Pro、His和Trp组成的“氮环亚组”；和由Phe和Tyr组成的“苯基亚组”。脂族组可以进一步划分成以下亚组：由Val、Leu和Ile组成的“大脂族非极性亚组”；由Met、Ser、Thr和Cys组成的“脂族轻微极性亚组”；和由Gly和Ala组成的“小残基亚组”。
保守性突变的实例包括取代以上亚组中的氨基酸，例如，Lys取代Arg并且反之亦然，从而可以维持正电荷；Glu取代Asp并且反之亦然，从而可以维持负电荷；Ser取代Thr，从而可以维持游离-OH；Gln取代Asn，从而可以维持游离-NH2。
术语“细胞毒性”指化学化合物(如化学或蛋白质杂质、去垢剂或毒素)杀死细胞的特性。与坏死和凋亡相反，术语细胞毒性不需要必然指示具体的细胞死亡机制。
如本文所用，术语“减少”或相关的术语“减少的”、“降低”或“降低的”指统计上的显著减少。为避免不确定，这些术语通常指给定的参数减少至少10％，并且可以包括至少20％减少、30％减少、40％减少、50％减少、60％减少、70％减少、80％减少、90％减少、95％减少、97％减少、99％或甚至100％减少(即，测量的参数是处于零)。
如本文所用，术语“发育”、“分化”和“成熟”，作为用来描述干细胞，指细胞从具有分化成至少两个不同细胞谱系的潜能的阶段进展到变成特化并最终变成分化的细胞。为本申请的目的，此类术语可以互换使用。
如本文所用的术语“表达”指核苷酸序列在宿主细胞内的转录和/或翻译。宿主细胞中所需产物的表达水平可由基于细胞中存在的相应mRNA的量或由所选择序列编码的所需多肽的量确定。例如，从选择的序列中转录的mRNA可以通过Northern印迹杂交、核糖核酸酶RNA保护、与细胞RNA原位杂交或通过PCR定量。由选择的序列编码的蛋白质可以通过多种方法定量，所述的多种方法包括，但不限于，例如，ELISA、蛋白质印迹法、放射免疫测定、免疫沉淀测定，对这种蛋白质的生物学活性的测定，或通过蛋白质的免疫染色，随后FACS分析来定量。
“表达调控序列”是引起编码序列在宿主细胞中表达的DNA调节序列，如启动子、增强子、多聚腺苷酸化信号、终止子、内部核糖体进入位点(IRES)等等。示例性表达调控序列在Goeddel，Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif(1990)中描述。
术语“饲养细胞”指在体外生长并分泌至少一种因子至培养基中，并且可以用来支持培养中的另一种目的细胞生长的细胞培养物。如本文所用，“饲养细胞层”可以与术语“饲养细胞”互换使用。饲养细胞可以包括其中饲养细胞在彼此顶部上生长之前以完整层覆盖培养皿表面的单层，或可以包含细胞簇。
术语细胞培养物的“生长期”指其中以恒定速率分裂的细胞指数型生长时期(对数期)。在这个时相期间，将细胞培养一段时间和在细胞生长最大化的此类条件下培养。对特定宿主细胞可确定该宿主细胞生长周期的测定，无需过度实验设想。“一段时间和在细胞生长最大化的此类条件下”等等，指就特定细胞系而言，经确定是用于细胞生长和分裂的那些最佳培养条件。在生长期期间，通常将细胞在约30-40℃，总体上约37℃，在加湿受控的气氛下，在含有必需添加物的营养培养基中培养，从而实现特定细胞系(例如哺乳动物细胞)的最佳生长，例如哺乳动物细胞。
术语“同源性”描述基于数学的序列相似比较结果，其用来识别具有相似功能或基序的基因或蛋白质。本发明的核酸和蛋白质序列可以用作“查询序列”以针对公共数据库执行进行检索，例如，识别其他家族成员、相关序列或同源物。此类检索可以使用Altschul等人的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)(Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-10)进行。可以用NBLAST程序，评分＝100、字长度＝12进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序、评分＝50、字长度＝3进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对结果，可以使用如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中所述的空位BLAST。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和BLAST)的默认参数。
术语“同源的”指拥有“共同进化起源”的两个蛋白质之间的关系，所述蛋白质包括相同动物物种中来自超家族的蛋白质(例如，免疫球蛋白超家族)，以及来自不同动物物种的同源蛋白(例如，肌球蛋白轻链多肽等；见Reeck等人，Cell，50：667，1987)。此类蛋白质(和它们的编码核酸)具有序列同源性，如其序列相似性所反映的，无论就同一性百分比而言或通过存在的特定残基或基序和保守位置。
术语“生长因子”指双调蛋白、血管生成素、B细胞生长因子、(骨形态发生蛋白-13、骨形态发生蛋白-14、骨形态发生蛋白-2、人BMP-3、骨形态发生蛋白-4、人BMP-5、骨形态发生蛋白-6、骨形态发生蛋白-7、人CD135配体/Flt-3配体、人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、人巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、人Cripto-l、人CTGF(结缔组织生长因子)、人EGF(表皮生长因子)、人EG-VEGF(内分泌腺体衍生血管内皮生长因子)、人促红细胞生成素(EPO)、人FGF(成纤维细胞生长因子1-23)、人GDF-11、人GDF-15、人GDF-8、人生长激素释放因子(GHRF、GRF、GHRH、生长激素释放激素)、人肝素结合性表皮生长因子(HB-EGF)、人肝细胞生长因子(HGF)、人神经生长因子β1、人胰岛素、人IGF-1(胰岛素样生长因子-1)、人IGF-2(胰岛素样生长因子)、人IGFBP-1(胰岛素样生长因子结合蛋白1)、人IGFBP-3(胰岛素样生长因子结合蛋白3)、肠三叶因子(ITF)、人角质细胞生长因子1&2、人白血病抑制因子(LIF)、人MSP、人肌肉抑制素、人肌肉抑制素、原(肽原)、人NRG1、人NGF、人制癌素M、人成骨细胞特异性因子1(OSF-1、多效蛋白)、人PD-ECGF(血小板衍生内皮细胞生长因子)、人PDGF、人PIGF、人胎盘生长因子1(PLGF1)、人胎盘生长因子2(PLGF2)、人SCGF-a(干细胞生长因子-α)、人SCGF-b(干细胞生长因子-β)、人干细胞因子(SCF)/CD117配体、人血小板生成素(TPO、THPO)、人转化生长因子、人TGF-α(转化生长因子、TGFa)、人TGF-β1(转化生长因子β、TGFb)、人TGF-β1.2(转化生长因子-β1、TGFb)、人TGF-β2(转化生长因子-β2、TGFb)、人TGF-β3(转化生长因子-β3、TGFb)、人VEGF(血管内皮生长因子)、人VEGF-121、人VEGF-165、人VEGF-A。
如本文所用，“同一性”意指当排列两个或更多个序列以使序列匹配最大化，即计入空位和插入时，在所述序列中相应位置处的相同核苷酸或氨基酸残基的百分比。可以通过已知方法容易的计算同一性，所述方法包括但不限于在(Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.编著，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.编著，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，第I部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编著，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；及Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.编著，M StocktonPress，New York，1991；以及Carillo，H.，和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988)中描述那些方法。设计了确定同一性的方法以产生所检测序列之间的最大匹配。另外，确定同一性的方法编纂于中可公共获得的计算机程序中。确定两个序列之间同一性的计算机程序方法包括，但不限于GCG程序组(Devereux，J.等人，Nucleic Acids Res 12(1)：387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.等人，J.Molec.Biol.215：403-410(1990)和Altschul等人Nuc.Acids Res.，28：3389-3402(1997))。BLAST X程序是从NCBI和其他来源可公共获得的(BLAST手册，Altschul，S.等人，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)。熟知的SmithWaterman算法也可以用来确定同一性。
术语“免疫球蛋白”或“抗体”(本文中可互换使用)一般指具有由两条重链和两条轻链组成的基本4多肽链结构的蛋白质，所述链例如由链间二硫键稳定，这种蛋白质具有特异性结合抗原的能力。术语“单链免疫球蛋白”或“单链抗体”(本文中可互换使用)指具有由一条重链和一条轻链组成的基本2多肽链结构的蛋白质，所述链例如由链间肽接头稳定，这种蛋白质具有特异性结合抗原的能力。术语“结构域”指包含有由例如由β-折叠片和/或链内二硫键稳定的肽环(例如，包含3～4个肽环)的重链或轻链多肽的球状区域。根据在“恒定区”多类别成员的结构域内部相对缺少序列变异的情况下，或根据在“可变区”多类别成员的结构域内部的显著变异，结构域在本文中还称作“恒定的”或“可变的”。在本领域中抗体或多肽“结构域”经常可互换称作抗体或多肽“区域”。抗体轻链的“恒定区”可互换地称作“轻链恒定区”、“轻链恒定域”、“CL”区或“CL”结构域。抗体重链的“恒定区”可互换称作“重链恒定区”、“重链恒定域”、“CH”区或“CH”结构域。抗体轻链的“可变区”可互换称作“轻链可变区”、“轻链可变域”、“VL”区或“VL”结构域。抗体重链的“可变区”可互换称作“重链可变区”、“重链可变域”、“VH”区或“VH”结构域。免疫球蛋白或抗体可以是单克隆或多克隆的并且可按单体或多聚体形式存在，例如，以五聚体形式存在的IgM抗体和/或以单体、二聚体或多聚体形式存在的IgA抗体。术语“片段”指抗体或抗体链中比完整或完全抗体或抗体链包含更少氨基酸残基的局部或部分。片段可以通过化学处理或酶处理完整或完全抗体或抗体链获得。也可以通过重组手段获得片段。示例性片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fabc和/或Fv片段。
用来描述本文中公开的细胞培养组分或热休克蛋白时，术语“分离的”意指已经识别过并且与其自然环境的组分分开和/或从中同收的蛋白质。其自然环境的杂质组分是一般会干扰这种蛋白质的研究、诊断性或治疗性用途，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质溶质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中，蛋白质将被纯化到至少95％均一性，该均一性通过在非还原性或还原性条件下使用考马斯蓝或优选地使用银染的SDS-PAGE所评估。分离的蛋白质包括在重组细胞内的原位蛋白，因为目的蛋白的自然环境的至少一种组分将不存在。然而，将通过至少一个纯化步骤制备分离的蛋白质。
如本文所用的“标记”是在目的细胞中差异性表达的核酸或多肽分子。在这种情境下，差异表达意指增加的阳性标记水平和减少的阴性标记水平。与其他细胞相比，标记核酸或多肽的可检测水平在目的细胞中是足够的更高或更低的，从而可以使用本领域已知的多种方法中任一种识别目的细胞并且与其他细胞区分。
表达“胰内分泌谱系标记”的细胞指具有转录因子PDX-1和以下转录因子中至少一种的阳性基因表达的细胞：NGN-3、NRx2.2、NRx6.1、NeuroD、Isl-1、HNF-3β、MAFA、Pax4和Pax6。表达胰细胞谱系特征性标记的细胞包括胰β细胞。
如本文所用，表达“内胚层谱系特征性标记”的细胞是指表达下列标记物中至少一种的细胞：SOX-17、GATA-4、HNF-3β、GSC、Cer1、Nodal、FGF8、短尾蛋白、Mix样同源框蛋白、FGF4CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA-6、CXCR4、C-Kit、CD99或OTX2。表达限定性内胚层谱系特征性标记的细胞包括原条前体细胞、原条细胞、中内胚层细胞和限定性内胚层细胞。
通过本发明方法衍生的表达多潜能性标记的细胞表达选自以下多潜能性标记的至少一种：ABCG2、cripto、FoxD3、连接蛋白43、连接蛋白45、Oct4、SOX-2、Nanog、hTERT、UTF-1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tral-60和Tral-81。
如本文所用，表达“中胚层谱系特征性标记”的细胞是指表达下列标记物中至少一种的细胞：CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、SOX-17、DKK4、HNF-3β、GSC、FGF17、GATA-6。
如本文所用，表达“外胚层谱系特征性标记”的细胞是指表达下列标记物中至少一种的细胞：BMP-4、Noggin、Chordin、Otx2、FoxJ3、Nestin、p63/TP73L、β-III微管蛋白。
如本文中可互换使用的术语“有效连接”和“有效连接的”指将两个或更多个核苷酸序列或序列元件以允许它们按照预期方式发挥作用的方式安置。在一些实施方案中，根据本发明的核酸分子包括与编码重组蛋白的核苷酸序列有效连接的能够使染色质开放和/或维持染色质处于开放状态的一个或多个DNA元件。在其他实施方案中，核酸分子可以额外地包括一个或多个核苷酸序列，其选自：(a)能够提高翻译的核苷酸序列；(b)促进重组蛋白分泌于细胞外部的核苷酸序列；和(c)能够增加mRNA稳定性的核苷酸序列，其中此类核苷酸序列与编码重组蛋白的核苷酸序列有效连接。通常但不一定，有效连接的核苷酸序列是连续的，并且根据需要，是在阅读框内的。然而，虽然，有效连接的能够使染色质开放和/或维持染色质处于开放状态的DNA元件通常位于编码重组蛋白的核苷酸序列上游；但是它不需要与该核苷酸序列连续。通过本领域熟知的重组方法，例如使用PCR方法，通过在适宜的限制性位点处连接或通过复性，完成多种核苷酸序列的有效连接。如果合适的限制性位点不存在，可以根据常规惯例使用合成的寡核苷酸接头或衔接子。
本文中可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸分子”指任何长度的聚合物形式的核苷酸，无论是核糖核苷酸或是脱氧核糖核苷酸。这些术语包括单链、双链或三链的DNA、基因组DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA杂合体或包含嘌呤和嘧啶碱基，或其他天然的、化学的、生物化学修饰的、非天然或衍生化核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸的骨架可以包含糖和磷酸基(如一般可以在RNA或DNA中找到)或修饰或取代的糖或磷酸基。此外，双链多核苷酸可以通过合成互补链并且使该链在适宜的条件下复性，或通过使用DNA聚合酶以适宜的引物从头合成互补链，而从化学合成的单链多核苷酸产物获得。核酸分子可以有许多不同的形式，举例来说，基因或基因片段、一个或多个外显子、一个或多个内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离DNA、任意序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸(如甲基化核苷酸)与核苷酸类似物、尿嘧啶(uracyl)、其他糖及连接基团如氟代核糖(fluororibose)与硫代酯(thioate)，和核苷酸分支(nucleotide branches)。如本文所用，“DNA”或“核苷酸序列”不仅包括碱基A、T、C和G，还包括以下情况的任一者：这些碱基的类似物或修饰形式如甲基化核苷酸、核苷酸间修饰如不带电荷的连接和硫代酯、糖类似物的使用、修饰的和/或可替代的骨架结构如聚酰胺。
术语“多潜能干细胞”包括从胚、胚胎或成体组织获得的干细胞。在一个优选的实施方案中，多潜能干细胞是胚干细胞。在另一个实施方案中，多潜能干细胞是胎儿干细胞，如原始生殖细胞。在另一个实施方案中，多潜能干细胞是成体干细胞。
如本文所用，术语“多潜能”指能够至少发育成外胚层细胞、内胚层细胞和中胚层细胞之一的细胞。如本文所用，术语“多潜能”包括全能细胞和多能细胞。如本文所用，术语“全能细胞”指能够发育成全部细胞谱系的细胞。术语“多能”指最终不分化的细胞。
“启动子”是能够在细胞中结合RNA聚合酶并且启动下游(3′方向)编码序列转录的DNA调节区。如本文所用，启动子序列由转录起始位点结合到其3′末端并且向上游(5′方向)延伸以包括为高于背景的可检测启动转录水平所需要的最少数目的碱基或元件。转录起始位点(通过用核酸酶S1作图便利地限定)可以存在于启动子序列以及负责结合RNA聚合酶的蛋白质结合域(共有序列)内部。真核启动子可以经常，但是不总是含有“TATA”框和“CAT”框。除-10和-35共有序列之外，原核启动子还含有Shine-Dalgarno序列。
本领域已熟知有来自多种不同来源的大量启动子，包括组成型、诱导型和阻遏型动子。代表性来源包括例如，病毒、哺乳动物、昆虫、植物、酵母和细菌细胞类型，并且源自这些来源的合适启动子是轻易可获得的，或可基于在线或例如从保藏中心如ATCC以及其他商业或个人来源可公共获得的序列以合成方法产生。启动子可以是单向的(即，以一个方向启动转录)或双向的(即，以3′或5′方向启动转录)。启动子的非限制性实例包括例如T7细菌表达系统，pBAD(araA)细菌表达系统、巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子、稻胚乳特异性谷蛋白(Gt1)启动子、CaMV35S病毒启动子。诱导型启动子包括Tet系统(美国专利5,464,758和5,814,618)、蜕皮激素诱导系统(No等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(1996)93(8)：3346-3351；T-REx TM系统(InvitrogenCarlsbad，CA)，(Stratagene，(San Diego，CA)和Cre-ERT他莫西芬诱导的重组酶系统((Indra等人Nuc.Acid.Res.(1999)27(22)：4324-4327；Nuc.Acid.Res.(2000)28(23)：e99；美国专利号7,112,715；以及Kramer和Fussenegger，Methods Mol.Biol.(2005)308：123-144)或本领域已知适于在所需细胞中表达的任何启动子。
术语“目的蛋白”指可以用于研究、诊断或治疗目的的任何蛋白质。目的蛋白可以包括哺乳动物蛋白质或非哺乳动物蛋白质，并且可以任选地包括受体或配体。示例性目的蛋白包括，但不限于分子，如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；卵泡刺激素；降钙素；促黄体激素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC、因子IX、组织因子和von Willebrands因子；抗凝血因子如蛋白C；心钠素；肺表面活性剂；组织型纤维蛋白溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或组织纤维蛋白溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；TNF和TNF受体(TNFR)家族的成员，如肿瘤坏死因子-α和-β、CD40配体、Apo-2配体、DR4、DR5、DcR1、DcR2、DcR3、OPG、Fas配体；脑啡肽酶；RANTES(调节激活正常T-细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；缪勒氏管抑制物质；松弛素A-链；松弛素B-链；松弛素原；小鼠促性腺促素相关肽；微生物蛋白，如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原(CTLA)，如CTLA-4；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子如骨源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)、或神经生长因子如NGF-β；血小板衍生的生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，其包括TGF-β1、TGF-β2、TG-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；血小板生成素(TPO)；白介素(IL)、例如，IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原例如，AIDS包膜蛋白gp120的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原如HER2、HER3或HER4受体；以及以上任意多肽的变体和/或片段；以及针对多种蛋白质抗原如CD蛋白如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20和CD34的抗体；ErbB受体家族的成员如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；细胞黏附分子如LFA-1、Mac1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和包括α或β亚基(例如，抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗体)αv/β3整联蛋白；生长因子如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖症(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白C；Apo-2L受体如Apo-2(DR5)、DR4、DcR1、DcR2、DcR3；以及以上确定的抗体的变体和/或片段等。在本发明的一个实施方案中，目的蛋白将包括自身能够在体外或体内哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞中诱导凋亡的蛋白质，如Apo-2配体/TRAIL、Fas配体或TNF-α。
术语细胞培养物的“生产期”指在细胞生长已经达到停滞期时的时间段。在生产期期间，对数细胞生长已经结束并且主要是蛋白质生产。在这个时间段期间，通常对培养基补充以支持持续的蛋白质产生并获得所需的蛋白质产物。
术语“重组蛋白”或“重组多肽”指相对于产生多肽的细胞而言，外源即异源或外来多肽。
在凋亡或细胞培养的背景下，术语“应激”指组织培养的非最佳条件，包括以下情况的任意组合；存在毒素、养分或生长因子耗尽或撤除、缺氧、热应激(与优选的范围相比，温度太高或太低)、细胞-细胞接触丧失、病毒感染、渗透性应激(与优选的范围相比，摩尔渗透压浓度太高或太低)、氧化应激、细胞密度(与优选的范围相比，细胞密度太高或太低)，和pH应激(与优选的范围相比，pH太高或太低)。
术语“转化”指将一个或多个核酸分子转移至宿主细胞或生物体中。将核酸分子导入到宿主细胞中的方法包括，例如，磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导转染、微量注射、阳离子脂类介导转染、电穿孔、划痕荷载、射弹导入或病毒或其他感染介质感染。“经转化”、“经转导”、“转基因的”和“重组”指已经导入有重组或异源核酸分子(例如，一个或多个DNA构建体或RNA或siRNA对应物)的宿主细胞或生物体。核酸分子可以稳定地表达(即，以有功能的形式在细胞中维持超过约三个月)或以有功能的形式在细胞中不稳定地维持不足三个月，即，瞬时表达。例如，“转化的”、“转化体”、和“转基因”细胞已经经历转化过程并且含有外来核酸分子。术语“未转化的”指未曾经历转化过程的细胞。
术语细胞培养物的“过渡期”指在占用生产阶段的培养条件的时间段。在过渡期期间，环境因素如pH、离子浓度和温度可以从生长状况转向生产状况。
术语“序列相似性”指在可以或可以不共有共同进化起源的核酸或氨基酸序列之间的同一性或一致性的程度(见Reeck等人，上文)。然而，在常见用途中和在本申请中，术语“同源的”，当用副词如“高度地”修饰时，可以指序列相似性并且可以或可以不涉及共同进化起源。
在具体实施方案中，如已知的序列比较算法如BLAST、FASTA、DNAStrider、CLUSTAL等所确定，当至少约85％和更优选地至少约90％或至少约95％核苷酸在限定长度的核酸序列范围内匹配时，两个核酸序列是“基本上同源的”或“基本上相似的”。这种序列的实例是本发明特定基因的等位基因或物种变体。也可以通过杂交识别出基本上同源的序列，例如在DNA印迹杂交实验中，例如相对于这个特定系统所定义的严格条件下。
类似地，在本发明的实施方案中，当多于80％的氨基酸残基相同时，或当多于90％的氨基酸残基相似时(即，是功能上相同的)，两个氨基酸序列是“基本上同源的”或“基本上相似的”。优选地，通过使用，例如GCG(GeneticsComputer Group，第7版，Madison，Wis.)pileup程序或使用上述任何程序和算法比对，识别相似或同源的多肽序列。所述程序可以使用Smith和Waterman局部同源性算法，采用默认值：空位产生罚分＝-(1+1/k)，k是空位延伸数目，平均匹配＝1，平均错配＝-0.333。
如本文中所用，并在所附的权利要求书中，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数对象，除非上下文清楚地另有说明。因而，例如，对“一个分子”的指称包括一个或多个此类分子，对“一种试剂”的指称包括一种或多种此类不同的试剂，对“一种抗体”的指称包括一种或多种此类不同的抗体，并且对“该方法”的指称包括对本领域普通技术人员已知的等效步骤和方法的指称，所述等效步骤和方法可以修改或替换为本文所述的方法。
除非另有说明，本发明的实施将采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术属于本领域普通技术人员的能力范围。在文献中解释了此类技术。参见，例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，1-3卷，Cold SpringHarbor Laboratory Press；Ausubel，F.M.等人(1995年和定期增补内容；CurrentProtocols in Molecular Biology，第9、13和6章，John Wiley & Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree和A.Kahn，1996，DNA Isolation and Sequencing：Essential Techniques，John Wiley & Sons；J.M.Polak和James O′D.McGee，1990，In Situ Hybridization：Principles and Practice；Oxford University Press；M.J.Gait(编者)，1984，Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，Irl Press；D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg，1992，Methods of Enzymology：DNA StructurePart A：Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology，Academic Press；Using Antibodies：A Laboratory Manual：Portable Protocol NO.I编者Edward Harlow，David Lane，Ed Harlow(1999，Cold Spring HarborLaboratory Press，ISBN 0-87969-544-7)；Antibodies：A Laboratory Manual byEd Harlow(编者)，David Lane(编者)(1988，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN 0-87969-3，4-2)，1855.Handbook of Drug Screening，Ramakrishna Seethala，Prabhavathi B.Fernandes编著(2001，New York，N.Y.，Marcel Dekker，ISBN0-8247-0562-9)；和Lab Ref：A Handbook of Recipes，Reagents，and OtherReference Tools for Use at the Bench，Jane Roskams和Linda Rodgers编著，2002，Cold Spring Harbor Laboratory，ISBN 0-87969-630-3。这些通用教材的每一部都被引入本文作为参考。
除非另有规定，本文中所用的全部术语及科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同意义。尽管与本文所述的那些方法、组合物、试剂、细胞相似或等效的任意方法、组合物、试剂、细胞可以用于实施或检验本发明中，然而在此描述优选的方法和材料。将本说明书中引用的全部出版物和参考文献，包括但不限于专利和专利申请，通过引用方式完整并入本文，如同特别地和逐一地指明，将每份单独的出版物或参考文献通过引用方式并入本文，作为完全阐述。本申请要求优先权的任何专利申请也通过引用的方式以针对出版物和参考文献所描述的上述方式完整并入本文。
上文所讨论的出版物仅是为了揭示在本申请的申请日之前的出版物而提供的。本文中任何内容均不得解释为承认由于在先发明而使得本发明不早于这种公布。
I  使用本发明补充物的方法
要求保护的补充物对广泛应用的组织和细胞培养以及重组蛋白生产是有用的，其中它们在组织培养期间在防止凋亡和改善细胞生存力方面并且尤其在应激反应方面，提供显著的改善。
凋亡包括一系列导致特征性细胞形态和死亡的生物化学事件。这些变化包括，细胞膜的变化，如膜的非对称性和附着作用的丧失、细胞空泡化、细胞皱缩、核破碎、染色质浓缩和染色体DNA片段化。
凋亡过程受种类多样的细胞信号控制，所述细胞信号可以源于细胞外(外源诱导物)或胞内(内源诱导物)。细胞外信号可以包括可以在组织培养基中不同程度地存在的毒素、激素、生长因子、一氧化氮、细胞因子。这些信号可以正向地(即，触发)或负向地(即，阻抑、抑制或消弱)影响凋亡，并且因此影响总细胞生存力。众多胞内组分，包括ATP含量、钙水平和众多凋亡基因和抗凋亡基因，也帮助调节凋亡。细胞可以应答于可能引起细胞自杀的应激而启动胞内凋亡信号。在组织培养期间遭遇的应激诱导介质包括例如与组织培养组合物相关的毒素如内毒素和从塑料器具浸出的重金属、转染试剂(例如，Lipofectamine和相似的基于脂质的转染试剂)、病毒转化、与无血清培养相关的营养和生长因子缺乏、或与生物反应器中高密度培养相关的细胞分化协议缺氧和氧化应激、和增加的胞内钙浓度，例如，因去垢剂和电穿孔引起膜损伤所致。
在细胞死亡的实际过程发生之前，凋亡信号必须克服调节蛋白，该调节蛋白起监督凋亡途径活化的看门人的作用。在体内，这个步骤允许终止该过程，细胞不再需要死亡。但在这个步骤中涉及几种蛋白质，尽管已经识别两个主要调节机制并且包括那些与线粒体功能性相关的蛋白质，和那些直接通过衔接蛋白参与转导信号至凋亡机制的蛋白质。
如上文所述，在细胞培养条件下培育的细胞可以经历与常规组织培养过程相关的细胞应激，所述细胞应激可以触发凋亡信号并增加细胞对凋亡的易感性。例如，与无血清培养相关的营养缺乏、与生物反应器中高密度生长相关的氧化应激、与DNA转染试剂相关的细胞毒化合物的使用、和与冷冻保存相关的热应激，可能会使细胞进入凋亡。通过增强细胞在此类信号下生存的能力，可以在这些过程期间通过防止细胞发生细胞死亡而改善细胞生存力，从而提高这些方法的成功和效用。
近来，已经在真核细胞中识别到抑制凋亡开始或减少其影响的众多基因。其中一些基因抑制细胞中的caspase依赖性凋亡途径，并且实际上，用抗凋亡基因转染细胞可有助于延长在生物学需要的条件下培育的转染细胞的寿命和生产率。(美国专利号6,586,206；7,531,327；美国专利申请US2009/0170165；US2009/0181426)。
另外，在一些情况下，外源热休克蛋白的添加已经显示在多种条件下改善培养细胞的存活。(Novoselova等人，J.Neurochem.94597-606(2005)；Tidwell等人，Cell Stress & Chap 9(1)88-90(2004)；Guzhova等人，Cell Stress& Chap.3(1)67-77(1998)；Hounenou等人，Cell Stress & Chap 1(3)161-166(1996)；Johnson等人，In vitro Cell.Dev.Biol.，29A 807-812(1993)。
本发明部分地基于以下展示：在添加至培养基中培育的哺乳动物细胞时，植物衍生的重组细胞培养组分蛋白令人惊讶地增强培养下培育的哺乳动物细胞的生长和生存力。具体而言，此类补充物导致培养物生存力的提高、细胞存活的延长、细胞生长速率的改善和从组织培养生物反应器产生的重组蛋白产率的提高。因为这些补充物显示出乎意料地改善活性和稳定性，所以它们提供与使用标准重组或纯化的蛋白质相比更显著的改善。
本申请中公开的方法，例如，用于改善细胞生存力和加速在培养下所培育细胞的细胞生长速率。在一个方面，本发明的补充物用于改善或提高从细胞培养物中产生的重组蛋白的产量。下文详细描述由本发明提供的进一步改善。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于增强培养细胞的细胞生长的方法，所述方法包括添加补充物至细胞培养基。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于增强已经适应于无血清培养基的细胞的生产率的方法，所述方法包括添加补充物至无血清培养基。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于减少生物反应器中乳酸积累的方法，所述方法包括添加补充物至生物反应器中的培养细胞。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于减少生物反应器中葡萄糖和其他糖消耗的方法，所述方法包括添加补充物至生物反应器中的培养细胞。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于减少在生物反应器中从开始培养到收获以产生蛋白质所需时间的方法，所述方法包括添加补充物至生物反应器中的培养细胞。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善生物反应器中细胞生存力的方法，所述方法包括添加补充物至生物反应器。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善在无血清条件下培养细胞的生存力的方法，所述方法包括添加补充物至无血清培养基。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善细胞以低密度铺种时的生存力的方法，所述方法包括添加补充物至细胞培养基。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善从单一细胞克隆培育而来的细胞的生存力的方法，所述方法包括添加补充物至细胞培养基。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善在培养下培育的原代细胞的生存力的方法，所述方法包括添加补充物至培养基。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善转染后细胞的生存力的方法，所述方法包括在转染之前、期间或紧随之后添加补充物至细胞培养基。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善冷冻保藏后的细胞的生存力的方法，所述方法包括在冷冻保存或解冻之前、期间或紧随之后添加补充物至细胞培养基。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善在培养下培育的干细胞的细胞生长速率或生存力的方法，所述方法包括添加本发明的补充物至细胞培养基。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善从培养细胞产生的重组产物的产率的方法，所述方法包括在培养物的生长期、过渡期或生产期中一个或多个期间添加本发明的补充物至细胞培养基。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善从培养细胞产生的重组产物的纯化的方法，所述方法包括在培养物的生长期、过渡期或生产期中一个或多个期间添加补充物至培养基。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于减少从培养细胞产生的重组产物的蛋白水解的方法，所述方法包括在培养物的生长期、过渡期或生产期中一个或多个期间添加补充物至培养基。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善从培养细胞产生的重组产物的生物活性的方法，所述方法包括在培养物的生长期、过渡期或生产期中一个或多个期间添加补充物至培养基。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善从培养细胞产生的重组产物的稳定性的方法，所述方法包括在培养物的生长期、过渡期或生产期中一个或多个期间添加补充物至培养基。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于改善从培养细胞产生的重组产物的装配的方法，所述方法包括在培养物的生长期、过渡期或生产期中一个或多个期间添加补充物至培养基。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于产生从培养细胞产生的重组产物的更人性化的糖基化模式的方法，所述方法包括在培养物的生长期、过渡期或生产期中一个或多个期间添加补充物至培养基。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于从培养细胞产生具有更小免疫原性的重组产物的方法，所述方法包括在培养物的生长期、过渡期或生产期中一个或多个期间添加包含重组白蛋白的补充物至培养基。
在这些方法的任一种中，通过增加培养下(和发酵期间)的宿主细胞生存力，本发明的补充物提供简单和成本-效果合算的方法以增加功能性重组蛋白的产率和或纯度、生物活性、稳定性和装配。另外，通过减少或抑制细胞培养中的细胞凋亡，本发明的补充物可以减少培养基中有害蛋白酶的数目或存在并且保护表达的目的蛋白免遭蛋白酶降解，从而提高产生的目的蛋白的质量，以通过增加活性蛋白的量和增加完整蛋白质的产量所证实。另外，申请人已经发现，本发明的补充物可以保护细胞免受培养组合物中存在的物质(如去垢剂、重金属和内毒素杂质)的潜在副作用，或保护细胞免遭转染或冷冻保存期间引入到细胞的有毒试剂影响。
在所要求保护的方法的任一种中，本发明的补充物可以在任何便利时间，例如在改变培养基、细胞传代时或以低密度铺种细胞时，直接添加至或混合至培养基。任选地，补充物在细胞培养过程开始时(在开始时，第0日)添加至培养基。在一个方面，本发明的补充物可以在预期的应激事件之前(例如在冷冻保存、转染或血清撤除之前，等等)添加。
在另一个方面，在细胞培养期间补充物在细胞凋亡的诱导一般发生的时点之前添加至培养基。例如，在大规模细胞培养期间，可以在培养的约第3日或第4日观察到凋亡的诱导，并且因此，补充物将优选地在第3日或第4日之前添加。任选地，所需量的补充物在细胞培养自始至终或在其持续期添加，例如，基于整个发酵过程的每日持续。例如，对于5日培养，补充物可以在第0日添加，并且此后每24小时添加直至培养终止。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了通过添加本发明的补充物至生物反应器来改善生物反应器中产生的重组蛋白的产率和质量的方法。在一个实施方案中，生物反应器包含细菌细胞。在另一个方面生物反应器包含酵母细胞。在另一个方面生物反应器包含植物细胞。在另一个方面生物反应器包含哺乳动物细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了通过添加本发明的补充物至细胞培养物来改善细菌细胞中产生的重组蛋白的产率和质量的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了通过添加本发明的补充物至细胞培养物来改善酵母细胞中产生的重组蛋白的产率和质量的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了通过添加本发明的补充物至细胞培养物来改善植物细胞中产生的重组蛋白的产率和质量的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了通过添加本发明的补充物至细胞培养物来改善昆虫细胞中产生的重组蛋白的产率和质量的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了通过添加本发明的补充物至细胞培养物来改善哺乳动物细胞中产生的重组蛋白的产率和质量的方法。
在另一个实施方案中，本发明提供了通过在细胞培养系统的生产期之前或在其期间添加本发明的补充物至细胞培养系统，增加细胞培养系统的生产期的产率并且从而增加生物反应器的生产率的方法。在本方法的一个方面，生产期的产率增加约10％。在本方法的一个方面，生产期的产率增加约20％。在本方法的一个方面，生产期的产率增加约30％。在本方法的一个方面，生产期的产率增加约40％。在本方法的一个方面，生产期的产率增加约50％。在本方法的一个方面，生产期的产率增加约60％。在本方法的一个方面，生产期的产率增加约70％。在本方法的一个方面，生产期的产率增加约80％。在本方法的一个方面，生产期的产率增加约90％。在本方法的一个方面，生产期的产率增加约100％。在本方法的一个方面，生产期的产率增加约200％。在本方法的一个方面，生产期的产率增加约500％。
在另一个实施方案中，本发明提供了与生产目的蛋白的正常生长条件相比在升高的温度产生这种蛋白质的方法，所述方法包含添加本发明的补充物至表达目的蛋白的细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供一种通过倾向于聚集目的蛋白来减少细胞培养表达系统中形成的聚集物量的方法，所述方法包括添加本发明的补充物至细胞培养表达系统，因而减少蛋白质的聚集状态。
在另一个实施方案中，本发明提供一种通过防止重组蛋白变性和聚集而增加由细胞表达的目的蛋白的活性的方法，所述方法包括添加本发明的补充物至细胞，因而增加目的蛋白的比活性。
在另一个实施方案中，本发明提供一种改善易聚集、引起沉淀发生或本身对细胞有毒的蛋白质在细胞培养表达系统中表达的方法，所述方法包括添加本发明的补充物至细胞培养表达系统，因而增加目的蛋白的表达。
在另一个实施方案中，本发明提供一种改善糖基化蛋白质的糖基化模式的方法，所述方法包括添加本发明的补充物至细胞培养表达系统，由此糖基化的程度增加和/或糖基化模式的获得是更接近于人的。
这些方法的任一种中添加的补充物的量将取决于多种因素，例如，宿主细胞类型、细胞密度、目的蛋白和培养条件，等等。确定待添加至培养基的补充物的所需浓度处于本领域技术范围内并且可通过常规优化而无需过多实验经验地确定。
技术人员将容易地理解，不同的细胞类型将对本发明的补充物具有不同幅度的反应，并且这将某种程度上由补充物中HSP的量或类型决定。另外，不同密度的细胞将要求适当调节添加至培养物的补充物总量及HSP浓度以解释增加的细胞数目。另外，以悬浮培养或贴壁培养而培育的细胞将具有可用于HSP进入的不同膜表面积并且通常表现出不同的响应速率和程度。因此，应当选择引起充分抑制凋亡、或增加生存力或净细胞生长的浓度。通常本发明的补充物将添加至终浓度为约0.1％、约0.5％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约25％、约30％、约40％或约50％Wt/wt或wt/体积。
通常有一个补充物浓度的上限范围，超过所述上限范围，细胞存活的进一步增加不出现。如下文实施例中所述，申请人已经发现，以约200mg/L～约2g/L、或更优选地约200mg/L～约1000mg/L、或更优选地约250～约500mg/L的浓度添加至细胞培养物时，本发明的补充物可以抑制凋亡。
II.补充物
在一个方面，本发明的补充物包含一种或多种植物衍生的重组细胞培养组分。在本发明的一个实施方案中，一种或多种重组细胞培养组分独立地选自白蛋白和乳铁蛋白或其混合物。
在本发明的另一个方面，补充物含有选自转铁蛋白、谷胱甘肽S-转移酶、超氧化物歧化酶或生长因子的一种或多种额外因子。
在本发明的另一个方面，生长因子独立地选自胰岛素、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子1-23(FGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF)、角质细胞生长因子1和2(KGF)，和白血病抑制性因子(LIF)。
在本发明补充物的一个方面，重组细胞培养组分的至少一种是白蛋白。在另一个方面，白蛋白包含少于约2％的聚合白蛋白。在另一个方面，白蛋白包含少于约1％的聚合白蛋白。
在本发明补充物的一个方面，重组细胞培养组分的至少一种包含白蛋白和乳铁蛋白的混合物。在另一个方面，白蛋白包含少于约2％的聚合白蛋白。在另一个方面，白蛋白包含少于约1％的聚合白蛋白。
在另一个方面，本发明的补充物包含重组白蛋白和稻热休克蛋白。在另一个方面，本发明的补充物包含重组白蛋白和稻hsp70同源物。在一个方面，稻hsp70同源物选自HSP70、Bip和稻基质蛋白。
在一个实施方案中，本发明的补充物包含共纯化的重组白蛋白和稻hsp的制备物，所述制备物还基本上不含则将会掩蔽或抑制hsp的积极影响的去垢剂和内毒素。在一个方面，本发明的补充物具有小于约1EU内毒素，并且所述白蛋白是至少约95％纯的。
在这些方法的任一种中，本发明的补充物可以通过共纯化来制备，或将细胞培养组分连同热休克蛋白在水溶液中混合来制备。
术语“白蛋白”指全部天然存在形式和合成形式的白蛋白。优选地，术语“白蛋白”指重组白蛋白。在一个方面，白蛋白来自脊椎动物。在一个方面，白蛋白来自哺乳动物。此外在一个实施方案中，白蛋白是人的。在另一个方面，重组白蛋白从植物细胞产生。在一个特别优选的实施方案中，重组白蛋白从转基因稻(Oryza sativa)中产生。下表D1中列出不同物种的白蛋白的代表性物种和Gene bank登录号。
Figure BDA00002156224600331
应当理解，对于在不同物种中重组产生白蛋白而言，一般需要将基因的核酸序列对所讨论的宿主生物进行密码子优化。此类密码子优化可以通过所讨论宿主生物的优选密码子使用的标准分析并通过标准DNA合成法合成优化的核酸来完成。众多公司基于收费服务提供此类服务并且包括例如，DNA2.0(CA，USA)和Operon Technologies.(CA，USA)。
白蛋白可以处于其天然形式，即，作为如它们在自然界中出现那样的不同等位变体，所述等位变体可以在它们的氨基酸序列方面例如，因截短作用(例如，从N端或C端或两端)或其他氨基酸缺失、添加、插入、取代或翻译后修饰而不同。在本发明的任何方法中也特别地包括白蛋白的天然存在的化学修饰形式，包括白蛋白的翻译后修饰和降解产物，包括例如，白蛋白的焦谷氨酰基变体、异天冬胺酰基变体、蛋白水解性变体、磷酸化变体、糖基化变体、还原变体、氧化变体、异构化变体和脱氨基变体。
天然或合成白蛋白序列的片段也可以具有从它们衍生的这些序列以及可在本发明的任何方法中使用的肽的所需的功能特性。如本文所用的术语“片段”因而包括白蛋白的片段，前提是这种片段保留了完整分子的生物学活性或治疗有益活性。
例如，白蛋白含有至少2个对众多生理重要的金属离子(包括铜、锌、镉和镍)的高亲和力、多金属结合位点。(Carter等人，Advances in ProteinChemistry 45153-203(1994)；Bai等人，J.Inorg Biochem 70(1)33-39(1998)，Blindauer等人，J Biol Chem.284(34)23116-24(2009)；美国专利号6,787,636)。由于这些痕量的金属一般存在于白蛋白的重组生产中，故而显著量的这些金属离子可以与这种蛋白质螯合。当作为组织培养组分添加至细胞时，这些离子结合，并且特别镉和镍结合于重组白蛋白与这种蛋白质的细胞毒性相关。
因此，在一个方面，术语“白蛋白”可以包括白蛋白片段，该片段包括参与白蛋白的多金属结合位点的一个或多个氨基酸的缺失。在一个方面，通过在成熟蛋白的N端缺失一个或多个氨基酸产生白蛋白片段。在另一个方面，白蛋白可以包含参与白蛋白的N端金属结合位点的任何氨基酸的一个或多个缺失或突变。在一个方面，待缺失或突变的氨基酸独立地选自序列5′DAHKSEVAH 3′(SEQ ID NO.1)。
如本文所用的术语“衍生物“因而指与天然序列相比已经被修饰的白蛋白序列或其片段。此类修饰可以是一个或多个氨基酸缺失、添加、插入和/或置换。这些修饰可以是连续或非连续的。代表性变体可以包括与表D1中所列的任何基因相比，具有1～20个、或更优选地1～15个、1～10个或者1～5个氨基酸置换、插入和/或缺失的那些变体。置换的氨基酸可以是任何氨基酸，特别是熟知的20种常规氨基酸(Ala(A)；Cys(C)；Asp(D)；Glu(E)；Phe(F)；Gly(G)；His(H)；Ile(I)；Lys(K)；Leu(L)；Met(M)；Ash(N)；Pro(P)；Gin(Q)；Arg(R)；Ser(S)；Thr(T)；Val(V)；Trp(W)；和Tyr(Y))的一种。白蛋白的任何此类变体或衍生物可以用于本发明的任何方法中。
因而，本发明的白蛋白可以在白蛋白的任何功能性结合结构域中包含氨基酸缺失、插入或突变。在一个方面，白蛋白可以在白蛋白的结合结构域中包含突变。在一个方面，突变的结合结构域是如美国专利号5,780,593中概述的参与结合阿斯匹灵、华法令、地西泮、洋地黄毒甙、度洛贝特(dlofibrate)、布洛芬或AZT的结构域，或如Blindauer等人，J.Biol.Chem.284(34)23116-24(2009)中概述的多金属结合位点。
因而，可以在本发明的任何方法中使用的白蛋白可以具有与天然白蛋白氨基酸序列(例如与表D1中所列的任何天然白蛋白基因序列)基本上同源或基本上相似的氨基酸序列。可选地，这种白蛋白可以具有与表D1中所列的白蛋白具有至少30％优选地至少40、50、60、70、75、80、85、90、95、98或99％同一性的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，用于本发明的任何方法中的白蛋白是与成熟的分泌型人血清白蛋白(SEQ ID NO.2)至少80％相同，如下文加下划线部分所示(Swiss-Prot P02768)：
MKWVTFISLL FLFSSAYSRG VFRRDAHKSE VAHRFKDLGE ENFKALVLIA FAQYLQQCPF
EDHVKLVNEV TEFAKTCVAD ESAENCDKSL HTLFGDKLCT VATLRETYGE MADCCAKQEP
ERNECFLQHK DDNPNLPRLV RPEVDVMCTA FHDNEETFLK KYLYEIARRH PYFYAPELLF
FAKRYKAAFT ECCQAADKAA CLLPKLDELR DEGKASSAKQ RLKCASLQKF GERAFKAWAV
ARLSQRFPKA EFAEVSKLVT DLTKVHTECC HGDLLECADD RADLAKYICE NQDSISSKLK
ECCEKPLLEK SHCIAEVEND EMPADLPSLA ADFVESKDVC KNYAEAKDVF LGMFLYEYAR
RHPDYSVVLL LRLAKTYETT LEKCCAAADP HECYAKVFDE FKPLVEEPQN LIKQNCELFE
QLGEYKFQNA LLVRYTKKVP QVSTPTLVEV SRNLGKVGSK CCKHPEAKRM PCAEDYLSVV
LNQLCVLHEK TPVSDRVTKC CTESLVNRRP CFSALEVDET YVPKEFNAET FTFHADICTL
SEKERQIKKQ TALVELVKHK PKATKEQLKA VMDDFAAFVE KCCKADDKET CFAEEGKKLV
AASQAALGL(SEQ ID NO.2)
也包括白蛋白与其他蛋白质的融合蛋白，并且这些融合蛋白可以增强活性、靶向性、稳定性或效力。
天然白蛋白结构的化学修饰，其保留或稳定白蛋白活性或生物学半衰期，也可以随本文所述的任何方法一起使用。此类化学修饰策略包括，而不限于PEG化、糖基化和酰化(见Clark等人：J. Biol.Chem.271(36)：21969-21977，1996；Roberts等人：Adv.Drug.Deliv.Rev.54(4)：459-476，(2002)；Felix等人：Int.J. Pept.Protein.Res.46(3-4)：253-264，(1995)；Garber Diabetes Obes.Metab.7(6)666-74(2005))，也可以包括C-端和N端保护基团和拟肽单位。
可以将天然L-氨基酸的异构体例如D-氨基酸掺入到以上形式的白蛋白的任一者中，并且用于本发明的任何方法中。白蛋白的全部此类变体、衍生物、融合蛋白或片段均包括在本文所公开或要求保护的任何方法中并且可以用于其中，并且均归于术语“白蛋白”。
术语“转铁蛋白”指全部天然存在形式和合成形式的转铁蛋白。在一个方面，术语“转铁蛋白“指重组转铁蛋白。在一个方面，转铁蛋白来自脊椎动物。在一个方面，转铁蛋白来自哺乳动物。此外在一个实施方案中，转铁蛋白是人的。在另一个方面，重组转铁蛋白从植物细胞产生。在一个特别优选的实施方案中，重组转铁蛋白从转基因稻(Oryza sativa)产生。下表D2中列出不同物种的转铁蛋白的代表性物种和Gene bank登录号。
Figure BDA00002156224600361
转铁蛋白可以处于其天然形式，即，作为如它们在自然界中出现那样的不同载脂蛋白形式或等位变体，所述载脂蛋白形式或等位变体可以在它们的氨基酸序列方面例如，因截短作用(例如，从N端或C端或两端)或其他氨基酸缺失、添加、插入、置换或翻译后修饰而不同。在本发明的任何方法中也特别地包括转铁蛋白的天然存在的化学修饰形式，包括转铁蛋白的翻译后修饰和降解产物，包括例如，转铁蛋白的焦谷氨酰基变体、异天冬胺酰基变体、蛋白水解性变体、磷酸化变体、糖基化变体、还原变体、氧化变体、异构化变体和脱氨基变体。
可以在本发明的任何方法中使用的转铁蛋白可以具有与天然转铁蛋白氨基酸序列(例如与表D2中所列的任何天然转铁蛋白基因序列)基本上同源或基本上相似的氨基酸序列。可选地，这种转铁蛋白可以具有与表D2中所列的转铁蛋白具有至少30％优选地至少40、50、60、70、75、80、85、90、95、98或99％同一性的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，用于本发明的任何方法中的转铁蛋白是与成熟的人转铁蛋白至少80％相同。
术语“谷胱甘肽S-转移酶”指全部天然存在形式和合成形式的谷胱甘肽S-转移酶。在一个方面，术语“谷胱甘肽S-转移酶“指重组谷胱甘肽S-转移酶。在一个方面，谷胱甘肽S-转移酶来自脊椎动物。在一个方面，谷胱甘肽S-转移酶来自哺乳动物。此外在一个实施方案中，谷胱甘肽S-转移酶是人的。在另一个方面，重组谷胱甘肽S-转移酶从植物细胞产生。在一个特别优选的实施方案中，重组谷胱甘肽S-转移酶从转基因稻(Oryza sativa)产生。下表D3中列出不同物种的谷胱甘肽S-转移酶的代表性物种和Gene bank登录号。
Figure BDA00002156224600371
谷胱甘肽S-转移酶可以处于其天然形式，即，作为如它们在自然界中出现那样的不同载脂蛋白形式或等位变体，所述载脂蛋白形式或等位变体可以在它们的氨基酸序列方面例如，因截短作用(例如，从N端或C端或两端)或其他氨基酸缺失、添加、插入、置换或翻译后修饰而不同。在本发明的任何方法中也特别地包括谷胱甘肽S-转移酶的天然存在的化学修饰形式，包括谷胱甘肽S-转移酶的翻译后修饰和降解产物，包括例如，谷胱甘肽S-转移酶的焦谷氨酰基变体、异天冬胺酰基变体、蛋白水解性变体、磷酸化变体、糖基化变体、还原变体、氧化变体、异构化变体和脱氨基变体。可以在本发明的任何方法中使用的谷胱甘肽S-转移酶可以具有与天然谷胱甘肽S-转移酶氨基酸序列(例如与表D2中所列的任何天然谷胱甘肽S-转移酶基因序列)基本上同源或基本上相似的氨基酸序列。可选地，这种谷胱甘肽S-转移酶可以具有与表D2中所列的谷胱甘肽S-转移酶有至少30％优选地至少40、50、60、70、75、80、85、90、95、98或99％同一性的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，用于本发明的任何方法中的谷胱甘肽S-转移酶是与成熟的人谷胱甘肽S-转移酶至少80％相同。
术语“超氧化物歧化酶”指全部天然存在形式和合成形式的超氧化物歧化酶。在一个方面，术语“超氧化物歧化酶“指重组超氧化物歧化酶。在一个方面，超氧化物歧化酶来自脊椎动物。在一个方面，超氧化物歧化酶来自哺乳动物。此外在一个实施方案中，超氧化物歧化酶是人的。在另一个方面，重组超氧化物歧化酶从植物细胞产生。在一个特别优选的实施方案中，重组重组从转基因稻(Oryza sativa)产生。下表D4中列出不同物种的超氧化物歧化酶的代表性物种和Gene bank登录号。
Figure BDA00002156224600391
Figure BDA00002156224600401
超氧化物歧化酶可以处于其天然形式，即，作为如它们在自然界中出现那样的不同载脂蛋白形式或等位变体，所述载脂蛋白形式或等位变体可以在它们的氨基酸序列方面例如，因截短作用(例如，从N端或C端或两端)或其他氨基酸缺失、添加、插入、置换或翻译后修饰而不同。在本发明的任何方法中也特别地包括超氧化物歧化酶的天然存在的化学修饰形式，包括超氧化物歧化酶的翻译后修饰和降解产物，包括例如，超氧化物歧化酶的焦谷氨酰基变体、异天冬胺酰基变体、蛋白水解性变体、磷酸化变体、糖基化变体、还原变体、氧化变体、异构化变体和脱氨基变体。可以在本发明的任何方法中使用的超氧化物歧化酶可以具有与天然超氧化物歧化酶氨基酸序列(例如与表D4中所列的任何天然超氧化物歧化酶基因序列)基本上同源或基本上相似的氨基酸序列。可选地，这种超氧化物歧化酶可以具有与表D4中所列的超氧化物歧化酶有至少30％优选地至少40、50、60、70、75、80、85、90、95、98或99％同一性的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，用于本发明的任何方法中的超氧化物歧化酶是与成熟的人超氧化物歧化酶至少80％相同。
术语“乳铁蛋白”指全部天然存在形式和合成形式的乳铁蛋白。在一个方面，术语“乳铁蛋白“指重组乳铁蛋白。在一个方面，乳铁蛋白来自脊椎动物。在一个方面，乳铁蛋白来自哺乳动物。此外在一个实施方案中，乳铁蛋白是人的。在另一个方面，重组乳铁蛋白从植物细胞产生。在一个特别优选的实施方案中，重组乳铁蛋白从转基因稻(Oryza sativa)产生。下表D5中列出不同物种的乳铁蛋白的代表性物种和Gene bank登录号。
Figure BDA00002156224600402
Figure BDA00002156224600411
乳铁蛋白可以处于其天然形式，即，作为如它们在自然界中出现那样的不同载脂蛋白形式或等位变体，所述载脂蛋白形式或等位变体可以在它们的氨基酸序列方面例如，因截短作用(例如，从N端或C端或两端)或其他氨基酸缺失、添加、插入、置换或翻译后修饰而不同。在本发明的任何方法中也特别地包括乳铁蛋白的天然存在的化学修饰形式，包括乳铁蛋白的翻译后修饰和降解产物，包括例如，乳铁蛋白的焦谷氨酰基变体、异天冬胺酰基变体、蛋白水解性变体、磷酸化变体、糖基化变体、还原变体、氧化变体、异构化变体和脱氨基变体。可以在本发明的任何方法中使用的乳铁蛋白可以具有与天然乳铁蛋白氨基酸序列(例如与表D5中所列的任何天然乳铁蛋白基因序列)基本上同源或基本上相似的氨基酸序列。可选地，这种乳铁蛋白可以具有与表D5中所列的乳铁蛋白有至少30％优选地至少40、50、60、70、75、80、85、90、95、98或99％同一性的氨基酸序列。在一个优选实施方案中，用于本发明的任何方法中的乳铁蛋白是与成熟的人乳铁蛋白至少80％相同。
在一个方面，本发明的补充物可以通过在水溶液中将分离的细胞培养组分与纯化或半纯化的一种或多种热休克蛋白制备物混合来制备。此类热休克蛋白一般以细胞培养组分对hsp约1∶1、约1∶10、约1∶20、约1∶50、约1∶100、约1∶200、约1∶500、约1∶1000，或约1∶10,000的摩尔比混合。在一个方面，细胞培养组分和一种或多种热休克蛋白的混合物可以在水性缓冲液中以约4℃～25℃一起孵育，时间范围从几分钟至过夜。在另一个方面，细胞培养组分和一种或多种热休克蛋白的混合物可以在水性缓冲液中以约20℃～37℃一起孵育，时间范围从几分钟至过夜。在一个方面，细胞培养组分和hsp可以在ATP存在时混合以使hsp能够经历与细胞培养组分的ATP依赖性构象结合。在这些方法中的任一个方面，水性缓冲液具有约6.5～约7.5的pH。在这些方法的任何另一个方面，缓冲水溶液包含选自磷酸盐、TRIS，HEPES和乙酸盐的缓冲剂。在这些方法中的任一个方面，分离细胞培养组分和热休克蛋白的复合物。
在所要求保护的方法中的任一个方面，细胞培养组分是白蛋白。在所要求保护的方法中的任一个方面，细胞培养组分是乳铁蛋白。在所要求保护的方法中的任一个方面，细胞培养组分是转铁蛋白。在所要求保护的方法中的任一个方面，细胞培养组分是人生长因子。
含有一种组分A部分(白蛋白或另一种细胞培养组分)的浓度已知的液体也可合并含有B部分(如热休克蛋白)的液体，以获得含有相对于细胞培养组分大约0.01％～0.5％wt/wt的比例的hsp。粉状、冻干或用不同方法干燥的粉末(Hsp)可以直接添加至含有细胞培养组分的水溶液，以获得基于Hsp干重相对于细胞培养组分的0.01％～0.5％的比例的Hsp。粉状、冻干或用不同方法干燥的Hsp也可以在质量对质量而获得完全基于重量分析的比例的基础上，与细胞培养组分粉末掺合。所得到的粉末可以按范围从非常低(皮摩尔)至非常高浓度(毫摩尔)而溶解于本领域常见的合适缓冲液中，以重构细胞培养组分/hsp复合物。
在一个方面，本发明的补充物将因此包含白蛋白和一种或多种热休克蛋白。通常将此类补充物制备为无菌液体或粉末形式。hsp在组合物中的总量可以从1％至0.001％的细胞培养组分重量变动。在其他方面中，hsp在组合物中的量可以从约0.01％至约0.02％、或约0.01％至约0.09％、或约0.02％至约0.04％、或约0.02％至约0.06％、或约0.02％至约0.08％变动。在其他方面中，hsp在组合物中的量是大于约0.02％、或更优选地大于约0.03％、或更优选地大于约0.04％wt/wt、或更优选地大于约0.05％wt/wt(hsp相对于细胞培养组分)。
在所要求保护的补充物的任一个方面，补充物基本上不含内毒素和去垢剂。在另一个方面，补充物具有小于约1EU/mg的内毒素。在又一个方面，补充物含有小于约10ppm去垢剂。在所要求保护的补充物的任何另一个方面，细胞培养组分具有大于95％的纯度。
在要求保护的补充物的任何另一个方面，补充物包含与稻热休克蛋白结合的重组白蛋白，其中该复合物具有小于约1EU的内毒素并且是至少95％纯的。在一个方面，重组白蛋白在稻中产生。
在这些方法中的任何另一个方面，补充物含有白蛋白作为细胞培养组分，并且白蛋白基本上不含聚合白蛋白。在这些补充物中的任何另一个方面，白蛋白具有少于约2％的聚合白蛋白。
III.示例性热休克蛋白
如本文所用的术语“热休克蛋白”、“HSP”或“hsp”包括保留抗凋亡活性的热休克蛋白超家族的全部天然存在形式和合成形式。此类热休克蛋白包括小热休克蛋白/HSPB家族、Hsp40/DnaJ家族、HSP70/HSPA家族、HSP90/HSPC家族、HSP110/HSPH家族和chapererone家族、以及源自其中的两种或更多种热休克蛋白或核苷酸交换因子的多肽片段和蛋白复合物(例如，HSP70和HSP40的复合物)。
另外，来自众多不同物种的热休克基因已经测序并且在本领域已知至少是部分功能上可互换的。因而选择除了稻热休克蛋白之外的来自某个科或种或属的热休克蛋白的变体将是例行事项。热休克蛋白的几种此类变体(即，代表性热休克蛋白)显示于表D6-D8。
最初将热休克蛋白识别为适应于热应激和其他应激所需要的应激反应蛋白。此后很快弄清，全部HSP家族还编码组成型表达的成员如HSP70家族中的Hsc70(HSPA8)。已被最广泛研究的热休克基因(和它们编码的蛋白质家族成员)是具有热诱导性的那些，如HSP70i(HSPA1A/B)、HSP40(DNAJB1)和HSP27(HSPB1)。作为一类，热休克蛋白属于跨越全部物种的最高度表达的细胞蛋白质。如它们的名称所暗示，当细胞因升高的温度而应激时，热休克蛋白保护细胞。它们在未应激的细胞中占总蛋白的1-2％。然而当细胞受热时，热休克蛋白的比例增加至细胞蛋白质的约4-6％。
编码不同HSP家族成员的基因数目在不同的生物中变化很多。例如，在HSPA(HSP70)家族中，成员的数目从大肠杆菌中的3个变化至人类中的13个。进化期间的基因重复可能满足对不同胞内区室中以及用于组织特异性或发育性表达的额外成员的需要。另外，基因重复为客户特异性和/或加工提供功能多样性。
本发明的任何方法中包括来自真核生物、原核生物、脊椎动物、无脊椎动物和植物以及其他物种的热休克蛋白的全部此类同源物、直向同源物和天然存在的亚型，只要它们保留可检测的抗凋亡活性。
随着人类基因组的注释，文献中用于Hsp家族成员的名称已经变得混乱，并且有多达10个不同名称用于相同的基因产物。下表中使用的命名基于已经由HUGO基因命名委员会(HGNC)指定并且在数据库如Entrez Gene和Ensemble中作为一级标示符使用的系统基因符号。(Kaminga等人，Cell Stress7 Chaperones 14105-111(2009)).
人类基因组编码HSPA家族的13个成员(表D6)，不包括许多假基因。研究最多的基因是HSPA1A和HSPA1B，其产物仅因两个氨基酸而不同并被认为是完全可互换的蛋白质。连同HSPA6，这些基因是最具热诱导性家族成员。长期以来HSPA7被视为假基因，但是最近的分析显示，它可能是与HSPA6高度同源的真基因。HSPA8是同族的HSPA并且以往命名为Hsc70(或HSP73)。它是重要的“持家”HSPA成员并且参与共翻译折叠和蛋白质跨胞内膜易位。HSPA1L和HSPA2是在睾丸中高表达的两个胞质家族成员。HSPA9是线粒体持家HSPA成员(HSPA9也称作mortalin/mtHSP70/GRP75/PBP74)。
Figure BDA00002156224600451
Hsp70家族的成员因热应激和有毒化学品、尤其重金属如砷、镉、铜、汞等而强烈上调。Hsp70最初由FM Ritossa在二十世纪六十年代发现，当时一位实验室工作人员偶然升高果蝇(Drosophila)(果蝇)的孵育温度。当检查染色体时，Ritossa发现了表示未知蛋白质的基因转录升高的“膨化样式”。后来，将这种现象描述为“热休克反应”。
Hsp70蛋白在指导新蛋白质折叠，从而提高蛋白质完整性方面扮演着重要角色，并且还通过将蛋白质稳定在部分折叠状态而有助于它们的跨膜转运。除了提高整体蛋白质的完整性之外，Hsp 70还直接抑制凋亡，并参与受损或缺陷蛋白质的识别和处置。
与Hsp70提高蛋白质折叠的中心作用一致，Hsp 70的表达也可起到在常规组织培养过程，如冷冻保存和生物处理期间，保护细胞免受热应激或氧化应激影响的作用。这些应激通常采取行动损伤蛋白质，导致部分解折叠和可能的聚集。通过暂时结合于因应激而暴露的疏水性残基，Hsp70防止这些部分变性的蛋白质聚集，并且允许它们再折叠。有低ATP特征的热休克进一步增强HSP70的持久结合并且进一步发挥作用以增强HSP抑制聚集的能力。在嗜热厌氧菌(海栖热袍菌(Thermotoga maritima))中，Hsp70表现出与模式肽的氧化还原敏感性结合，提示了基于氧化应激的结合调节的第二模型。
Hsp 70还通过阻断胱天蛋白酶原-9召集，从而导致胱天蛋白酶3活化来抑制凋亡，并且似乎至能够通过与CHIP(Hsp70羧基端相互作用蛋白)E3泛素连接酶相互作用而参与受损或缺陷蛋白质的处置。
因此，Hsp 70蛋白不仅防止对蛋白质的损伤，还采取行动直接防止应激条件下程序性细胞死亡。人类基因组还编码4个HSP110(HSPH；表D7)基因，所述基因编码除了N端ATP酶结构域和C端肽结合结构域之间存在的较长接头结构域之外与HSPA成员高同源的HSP家族。实际上，两个成员HSPA4(HSPH2)和HSPA4L(HSPH3)以往在Entrez Gene数据库中命名为HSPA成员。除了3个胞质成员之外，一个区室特异性HSPH成员(HYOU1/Grp170)存在于ER中(HSPH4)。最近证据显示，HSPH成员是HSPA家族的核苷酸交换因子。
Figure BDA00002156224600461
Figure BDA00002156224600471
在任一项权利要求的实施方案中，本发明的补充物包含选自小热休克蛋白家族成员的Hsp。在另一个方面，Hsp选自HSP40/DnaJ家族成员。在另一个方面，Hsp选自HSP70家族成员。在另一个方面，Hsp选自HSP90家族成员。在另一个方面，Hsp选自HSP110家族成员。在另一个方面，Hsp选自伴侣家族成员。
在任一项权利要求的一个方面，本发明的补充物包含源自哺乳动物、昆虫、酵母或植物细胞的Hsp超家族成员。在另一个方面，Hsp超家族成员源自植物细胞。在又一个实施方案中，HSP超家族成员源自稻(Oryza sativa)。
在任一项权利要求的一个方面，本发明的补充物包含在具有一种或多种其他蛋白质的蛋白质复合物中存在的hsp超家族成员。在一个方面，HSP超家族成员与另一个核苷酸交换因子的Hsp超家族成员复合。在任一项权利要求的另一个方面，Hsp超家族成员与白蛋白结合。
在一个实施方案中，本发明的补充物包含HSP70家族成员。在一个方面，这个HSP70家族成员选自HSPA1A(HSP72)、HSPA8(Hsc72)和HSPA9(Grp78)。在任一项权利要求的一个方面，HSP超家族成员源自哺乳动物、昆虫、酵母或植物细胞。在优选的方面，HSP超家族成员源自植物细胞。在一个特别优选的实施方案中，HSP超家族成员源自稻(Oryza sativa)。
在任一项权利要求的一个方面，本发明的补充物包含从来自表D8的序列中选出的HSP70家族成员。
HSPA1A
Figure BDA00002156224600472
Figure BDA00002156224600481
Figure BDA00002156224600491
Figure BDA00002156224600501
Figure BDA00002156224600511
Figure BDA00002156224600522
热休克蛋白可以处于其天然形式，即，作为如它们在自然界中出现于不同物种内那样的不同变体，所述变体可以视为功能上等同的变体，或它们可以是其功能上等同的天然衍生物，这些衍生物可以在它们的氨基酸序列方面例如，因截短作用(例如，从N端或C端或两端)或其他氨基酸缺失、添加、插入、置换或翻译后修饰而不同。在本发明的任何方法中也特别地包括HSP的天然存在的化学衍生物，包括HSP的翻译后修饰和降解产物，包括例如，HSP的焦谷氨酰基变体、异天冬胺酰基变体、蛋白水解性变体、磷酸化变体、糖基化变体、还原变体、氧化变体、异构化变体和脱氨基变体。
本领域已知，可合成地修饰蛋白质或肽的序列，同时保留它们的有用活性，并且这可以使用本领域内标准的和文献中广泛描述的技术实现，例如，随机诱变或位点定向诱变、切割和连接核酸、或通过氨基酸或多肽链的化学合成或修饰。
因而如本文所用的术语“衍生物“指与天然序列相比已经被修饰的HSP序列或其片段。此类修饰可以是一个或多个氨基酸缺失、添加、插入和/或置换。这些修饰可以是连续或非连续的。代表性变体可以包括与表D6至D8中所列的任何基因相比，具有1～100个、或更优选地1～50个、1～25个或者1～10个氨基酸置换、插入和/或缺失的那些变体。置换的氨基酸可以是任何氨基酸，特别是熟知的20种常规氨基酸(Ala(A)；Cys(C)；Asp(D)；Glu(E)；Phe(F)；Gly(G)；His(H)；Ile(I)；Lys(K)；Leu(L)；Met(M)；Asn(N)；Pro(P)；Gin(Q)；Arg(R)；Ser(S)；Thr(T)；Val(V)；Trp(W)；和Tyr(Y))的一种。HSP的任何此类变体或衍生物可以用于本发明的任何方法中。
因而，可以在本发明的任何方法中使用的HSP可以具有与天然HSP氨基酸序列(例如与表D6至D8中所列的任何天然HSP基因序列)基本上同源或基本上相似的氨基酸序列。可选地，这种HSP可以具有与表D6至D8中所示的任一个基因的氨基酸序列具有至少30％优选地至少40、50、60、70、75、80、85、90、95、98或99％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，用于本发明的任何方法中的HSP是与选自表D6的序列至少80％相同。在另一个实施方案中，用于本发明的任何方法中的HSP是与选自表D6至D8的序列至少80％相同。在另一个方面，用于本发明的任何方法中的HSP是与选自表D8的Hspa8基因至少80％相同。
也包括HSP与其他蛋白质的融合蛋白，并且这些融合蛋白可以增强HSP生物学活性、靶向性、生物学寿命或稳定性。
天然HSP结构的化学修饰，其保留或稳定HSP活性或生物学半衰期，也可以随本文所述的任何方法一起使用。此类化学修饰策略包括，而不限于PEG化、糖基化和酰化(见Clark等人：J. Biol.Chem.271(36)：21969-21977，1996；Roberts等人：Adv.Drug.Deliv.Rev.54(4)：459-476，(2002)；Felix等人：Iht.J. Pept.Protein.Res.46(3-4)：253-264，(1995)；Garber Diabetes Obes.Metab.7(6)666-74(2005))，也可以包括C-端和N端保护基团和拟肽单位。
可以将天然L-氨基酸的异构体例如D-氨基酸掺入任何以上形式的HSP中，并且用于本发明的任何方法中。额外的变体可以包括单个或多个氨基酸的氨基端和/或羧基端融合物以及序列内插入。更长的肽可以包含HSP肽序列的一个或多个的多重拷贝。插入型氨基酸序列变体是在蛋白质中的某位点处导入一个或多个氨基酸残基的那些变体。
天然或合成HSP序列的片段也可以具有从它们衍生的这些序列以及可在本发明的任何方法中使用的肽的所需的功能特性。如本文所用的术语“片段”因而包括HSP的片段，前提是这种片段保留了完整分子的生物学活性或治疗有益活性。缺失型变体的特点是从序列中切除一个或多个氨基酸。变体也可包括，例如它们在自然界(例如，其他物种中或归因于地理变异)中出现的不同等位变体。HSP的全部此类变体、衍生物、融合蛋白或片段均包括在本文所公开或要求保护的任何方法中并且可以用于其中，并且均归于术语“热休克蛋白“或“hsp”。
这些变体、衍生物和片段是功能上等同的，因为它们具有可检测的抗凋亡活性。更具体地，它们显示至少40％、优选地至少60％、更优选地至少80％的HSP70的活性，尤其是稻HSP70。因而，它们能够在与白蛋白共同施用时作为抗凋亡剂发挥作用，即，可以替代HSP70自身。
这种活性意指天然稻HSP所显示的任何活性，无论是在体内或体外试验系统中显示的生理学反应，或是由天然HSP介导的任何生物学活性或反应，例如，在酶测定、细胞生长测定中或通过在应激存在下测试hsp对细胞生存力的影响。
因而，可使用任何先前公开的测定细胞生存力和凋亡的方法容易地评估HSP的活性，所述方法适用于培养下培育的任何细胞，所述细胞可以适应于无血清或低血清含量培养基或可选地适应于含有凋亡性或有毒性组分的培养基。
另外，可以使用适应于在低血清或无血清条件生长的细胞，通过铺覆限定数目的细胞至多孔平板中来测定生长速率。细胞可以根据所用的细胞和组织培养平板以不同的密度接种。例如，适应于无血清条件的杂交瘤细胞可以按初始密度0.5×105个细胞/mL培养基接种。一般而言，该细胞最初洗涤3次，并且支持培养下生长所要求的特定成分如白蛋白、候选hsp、谷胱甘肽S-转移酶、超氧化物歧化酶或转铁蛋白在磷酸盐缓冲生理盐水中至约1份/10份液体培养基(例如，Dulbecos)的所需浓度添加。在37℃和5％CO2的生长期结束时，计数细胞以测生存力。双标记物染色法是用于在有活力细胞和无活力细胞的混合物中确定生存力的优选方法。相对于总细胞数确定活细胞数目(活力百分比)的优选方法是使用本领域常见的细胞计数装置。可以使用的其他方法包括双标记物流式细胞术或可选地使用显微镜、用台盼蓝染色和细胞计数装置手工计数细胞。实验样品生存力和细胞数目与阴性对照(培养基组分减去实验因子)和阳性对照(胎牛血清或其他已知的细胞培养物支持成分)比较。通常，必须基于重复样品的信号信噪比以及与阳性对照和阴性对照相比所观察到的差异或缺少的差异，确定计数的统计显著性。对于本领域技术人员，考虑到必须建立允许无血清生长的稳定的细胞平台，生存力相对于对照的20％变化将在大约95％置信度的情况下视为显著差异，假定重复样品的信噪比低。
潜在因素的性能也可以根据生产率指示物(包括内源蛋白质或有意表达的蛋白质的产量)加以测量或可选地作为凋亡指示物的应变量测量。凋亡测定法是众多的并且依赖于细胞中的上游变化如DNA片段化和胞核降解。下游测定法依赖于此类凋亡途径组分(如胱天蛋白酶3)活性的测量。也可以用市售的凋亡测定法分析如先前方法中适应培养的细胞以确定添加的组分对细胞培养物的影响。
IV.组织组分的生产
用于本发明补充物中的白蛋白和其他蛋白质因子可以按任何适合的方式制备，例如通过从天然存在来源、从包含表达系统的基因工程宿主细胞(见下文)中分离，或通过使用例如自动化肽合成仪的化学合成法或此类方法的任何组合制备。用于制备此类多肽的方法是本领域充分理解。
对于重组生产，宿主细胞可以经基因修饰以并入编码培养组分和/或目的hsp的核酸。一般地，核酸将经密码子优化以在选择的表达系统中高水平表达，并且导入表达载体内使目的蛋白能够在宿主细胞中表达。载体可以作为环形双链DNA存在并且大小范围从几千碱基(kb)至上百kb。优选的克隆载体与天然存在的质粒相比已被修饰，以促进多核苷酸序列的克隆和重组操作。许多此类载体是本领域熟知并且可商业获得的；参见例如，Sambrook(引自“Molecular Cloning：A Laboratory Manual，”第2版，Sambrook，Fritsch和Maniatis编著，Cold Spring Harbor Laboratory，(1989))，Maniatis，引自：Cell Biology：AComprehensive Treatise，第3卷，Gene Sequence Expression，Academic Press，NY，563-608(1980)。
在一个方面，表达载体用来增加培养组分在宿主细胞中的表达，同时通过激活宿主细胞基因的表达完成宿主细胞内源性热休克蛋白的表达。在另一个方面，表达载体用来增加热休克蛋白的表达。在另一个方面，表达载体用来增加热休克蛋白和细胞培养组分的表达。在另一个方面，编码热休克蛋白和细胞培养组分的核酸序列位于相同的表达载体上。
表达载体包括质粒、附加体、粘粒、逆转录病毒或噬菌体；表达载体可以用来表达编码细胞培养组分或hsp的DNA序列，并且在一个方面中包含表达控制序列的组件。启动子和其他调节元件的选择可以根据预定的宿主细胞而变化，而且许多此类元件是市售的，并且可以很容易的从独立的组合物中分离，如来自Invitrogen的Gateway系统(CA，USA)。用于hsp或组织培养组分的表达系统可以是稳定或瞬时表达系统。
在这些方法中的任一个方面，hsp表达可以是诱导性的，在另一个方面，hsp表达可以是组成型的。用于hsp的诱导型表达系统可以包含在白蛋白的表达载体中，或可以包含在独立的表达系统或载体中。
在这些方法中的任一个方面，细胞培养组分表达可以是诱导性的，在另一个方面，hsp表达可以是组成型的。用于组织培养组分的诱导型表达系统可以包含在hsp的表达载体中，或可以包含在独立的表达系统或载体中。
用于从植物细胞中产生蛋白质的一般和具体技术可以从以下专利和专利申请获得，其中每一份的全部内容通过参考并入本文：美国专利申请公开号2003/0172403 A1(“Plant Transcription Factors and Enhanced GeneExpression(植物转录因子和增强的基因表达)”)；美国专利号6,991,824(“Expression of Human Milk Proteins in Transgenic Plants(人乳蛋白在转基因植物中的表达)”)；美国专利申请公开号2003/0221223(“Human BloodProteins Expressed in Monocot Seeds(人血液蛋白在单子叶植物种子中的表达)”)；美国专利申请公开号2004-0078851(“Production of Human GrowthFactors in Monocot Seeds(在单子叶植物种子中生产人生长因子)”)；美国专利申请公开号2004/0063617(“Method of Making an Anti-infective Composition forTreating Oral Infections(制造用于治疗口腔感染的抗感染组合物的方法)”)；和国际申请号PCT/US2004/041083(“High-level Expression of Fusion Polypeptidesin Plant Seeds Utilizing Seed-Storage Proteins as Fusion Carriers(使用种子贮藏蛋白作为融合载体在植物种子中高水平表达的融合多肽)”)。用于从植物细胞中产生蛋白质的其他一般和具体技术例如可以从以下参考文献获得，其中每一份的全部内容通过参考并入本文：美国专利号5,693,507、美国专利号5,932,479、美国专利号6,642,053和6,680,426(每份均名为“Genetic Engineeringof Plant Chloroplasts(植物叶绿体的遗传工程)”)；美国专利申请公开号2005/0066384(“Site-Targeted Transformation Using Amplification Vectors(使用扩增载体的位点定向转化)”)；美国专利申请公开号2005/0221323(“Amplification Vectors Based on Trans-Splicing(基于反式剪接的扩增载体)”)；美国专利申请公开号2006/0026718(“Method of Controlling Cellular Processesin Plants(控制植物中细胞过程的方法)”)；和(Method of Controlling A CellularProcess in a Multi-Cellular Organism(控制多细胞生物体中细胞过程的方法))；Marillonnet等人，Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection ofviral replicons for efficient transient expression in plants(系统性根癌农杆菌介导的转染病毒的复制子在植物中有效的瞬时表达(Agrobacterium tumefaciens)转染)，Nature Biotech.(2005)23(6)：718-723。
代表性的市售病毒表达载体包括，但不限于基于腺病毒的系统，如从Crucell，Inc.可获得的Per.C6系统，基于慢病毒的系统如来自Invitrogen的pLP1，和逆转录病毒载体如基于烟草花叶病毒的载体(Lindbo等人，BMCBiotechnol.(2007)752-58)。
附加表达载体能够在宿主细胞中复制，并且作为染色体外附加体在适宜的选择压力存在下在宿主细胞内部维持。(参见例如，Conese等人，Gene Therapy11：1735-1742(2004))。代表性市售的附加表达载体包括，但不限于使用了Epstein Barr核抗原1(EBNA1)和Epstein Barr病毒(EBV)复制起点(oriP)的附加质粒，具体实例包括来自Invitrogen的载体pREP4、pCEP4、pREP7。基于EBV的载体的宿主范围实际上可以通过共表达EBNA1结合蛋白2(EPB2)扩展至任何真核细胞类型(Kapoor等人，EMBO.J.20：222-230(2001))，来自Invitrogen的载体pcDNA3.1和来自Stratagene的pBK-CMV代表了使用T-抗原和SV40复制起点来替代EBNA1和oriP的游离型载体的非限制性实例。
整合型表达载体可以随机地整合入宿主细胞DNA，或可以包括使表达载体和宿主细胞染色体之间能够特异性重组的重组位点。此类整合型表达载体可以利用宿主细胞染色体的内源表达调控序列来影响所需蛋白质的表达。以位点特异性方式整合的载体的实例包括例如，来自Invitrogen的flp-in系统(例如，pcDNATM5/FRT)的组分，或cre-lox系统，如可以在来自Stratagene的pExchange-6Core载体中找到。以随机方式整合至宿主细胞染色体中的载体的实例包括，例如，来自Invitrogen的pcDNA3.1(在T-抗原不存在下导入时)、来自Promega的pCI或pFN10A(ACT)
Figure BDA00002156224600591
可选地，表达载体可以用来将强启动子或增强子序列导入和整合至细胞中的基因座内，以便调节内源目的基因(如热休克蛋白)的表达(Capecchi MR.Nat Rev Genet.(2005)；6(6)：507-12；Schindehutte等人，Stem Cells(2005)；23(1)：10-5)。这种方法也可以用来将诱导型启动子如Tet-On启动子(美国专利5,464,758和5,814,618)插入到细胞的基因组DNA中，以便提供内源目的基因(如热休克蛋白)的诱导型表达。激活型构建体也可以包括定位序列以使激活序列的同源重组或非同源重组进入对目的基因特异的所需基因座中(参见例如，Garcia-Otin和Guillou，Front Biosci.(2006)11：1108-36)。可选地，诱导型重组酶系统，如Cre-ER系统，可以用来在4-羟他莫昔芬存在时激活转基因(Indra等人Nuc.Acid.Res.(1999)27(22)：4324-4327；Nuc.Acid.Res.(2000)28(23)：e99；和美国专利号7,112,715)。
可选地，在一个实施方案中，宿主细胞可以内源地表达目的hsp或通过上文描述的手段(如，但不限于热升温)进行诱导以表达目的hsp。多核苷酸可以通过许多标准实验室手册中描述的方法导入宿主细胞中，如Davis等人，Basic Methods in Molecular Biology(1986)和Sambrook等人(引自“MolecularCloning：A Laboratory Manual，”第2版，Sambrook，Fritsch和Maniatis编著，ColdSpring Harbor Laboratory，(1989))，Maniatis，引自：Cell Biology：AComprehensive Treatise，第3卷，Gene Sequence Expression，Academic Press，NY，第563-608页(1980)。将多核苷酸导入宿主细胞的示例性方法包括，例如磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖介导转染法、转染法、微量注射法、阳离子脂质介导转染法、电穿孔法、转导、划痕荷载法、射弹导入法或感染法。
用于产生组织培养组分和热休克蛋白的合适细胞包括原核细胞、酵母、昆虫细胞、植物表达系统和哺乳动物表达系统。在这些一般指导范围内，有用的微生物宿主包括，但不限于来自芽孢杆菌属(Bacillus)、埃西氏菌属(Escherichia)(如大肠杆菌)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、沙门氏菌属(Salmonella)、欧文氏菌属(Erwinia)的细菌，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、大肠杆菌的多个菌株(例如，HB101(ATCC NO.33694)、DH5α、DH10和MC1061(ATCC NO.53338))。
本领域技术人员已知的酵母细胞的许多菌株也可作为表达白蛋白和hsp的宿主细胞，包括来自汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、Rhino-sporidium、酵母属(Saccharomyces)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的那些菌株和其他真菌。优选的酵母细胞包括例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerivisae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。
另外，根据需要，昆虫细胞系统可以用于本发明的方法中。此类系统例如由Kitts等人，Biotechniques，14：810-817(1993)；Lucklow，Curr.Opin.Biotechnol.，4：564-572(1993)；和Lucklow等人(J.Virol.，67：4566-4579(1993)描述。优选的昆虫细胞包括Sf-9和HI5(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)。
许多合适的植物表达系统可以用于表达白蛋白和hsp。实例包括例如，任何单子叶或双子叶植物。合适的单子叶植物包括而不限于稻、大麦、小麦、黑麦、玉米、粟、黑小麦或高粱，优选是稻。其他合适的植物包括拟南芥、苜蓿、烟草、花生和大豆。
众多合适的哺乳动物宿主细胞也是本领域已知的，并且许多是从美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209)可获得的。实例包括，但不限于哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(ATCC No.CCL61)、CHO DHFR-细胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：4216-4220(1980))、人胚肾(HEK)293或293T细胞(ATCCNo.CRL1573)或3T3细胞(ATCC No.CCL92)。选择合适的哺乳动物宿主细胞和用于转化、培养、扩增、筛选和产品生产及纯化的方法是本领域已知的。其他合适的哺乳动物细胞系是猴COS-1(ATCC No.CRL1650)和COS-7细胞系(ATCC No.CRL1651)及CV-1细胞系(ATCC No.CCL70)。其他示例性哺乳动物宿主细胞包括灵长类细胞系和啮齿类细胞系，包括转化的细胞系。
使用本发明的DNA构建体(或源自所述DNA构建体的RNA)，无细胞转录和翻译系统也可以用来产生此类蛋白质。
因此，在另一个方面，本发明包括一种用于产生补充物的方法，所述补充物具有增强培养下的细胞或组织存活和/或生长的能力。这种方法包括在能充分表达细胞培养组分和热休克蛋白的条件下培养本发明的宿主细胞并且回收白蛋白和热休克蛋白的复合物。
可以通过本领域熟知的方法，从包含表达系统的基因修饰的宿主细胞中准备好本发明重组蛋白的产生。因此，在又一个方面，本发明涉及了包含编码白蛋白的一个多核苷酸或多个多核苷酸的表达系统，并且涉及用遗传工程修饰的此类表达系统的宿主细胞并涉及通过重组技术产生此类蛋白质。在一个实施方案中，宿主细胞内源地表达目的热休克蛋白。
在需要纯化本发明的补充物的表达蛋白的情况下，本发明的蛋白质可以在裂解细胞之前从细胞环境同收，或在细胞裂解后同收。蛋白质可以通过熟知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀法、酸提取法、阴离子或阳离子交换层析法、磷酸纤维素层析法、疏水相互作用层析法、亲和层析法、羟基磷灰石层析法和凝集素层析法。也可采用高效液相色谱进行纯化。
用于纯化热休克蛋白的方法，包括阴离子交换层析法和ATP琼脂糖亲和层析法，是本领域熟知的。(Welch和Feramisco，J.Biol.Chem.257(24)14949-14959；(1982)；Welch和Feramisco，Mol.Cell.Biol.5(6)1229-1237(1985)。当多肽在胞内合成、分离和/或纯化期间变性时，用于再折叠蛋白质的熟知技术可以用来再生活性构象。
专利、公布的专利申请和相关出版物的检索也将为阅读本公开内容的本领域技术人员提供用于制备和纯化白蛋白的具有明显可能性的方法。例如，美国专利号4,075，197；4,086,222；4,093,612；4,097,473；4,136,094；4,228,154；5,250,662；5,656,729；5,677,424；5,710,253；5,728,553；5,994,507；6,001,974；6,638,740；6,617,133和7,423,124公开了用于纯化白蛋白的多种方法。在一个方面，使用上文列出的任何这些技术所认可方法来用于纯化本发明中的白蛋白，随后在水溶液中与热休克蛋白混合。
在一个优选的方面，使用能够直接共纯化重组白蛋白和热休克蛋白或hsp蛋白复合物的方法，纯化重组白蛋白。在一个方面，重组白蛋白在稻中产生，并且热休克蛋白是内源性稻热休克蛋白。
由于白蛋白和hsp70的相似电负性，阴离子交换层析法是制备富含Hsp的白蛋白的优选方法。例如，白蛋白和Hsp70均在高pH(7.5及以上)与具有以下树脂的阴离子交换柱结合，所述树脂由封固在适于多肽离子交换的珠子(大分子排阻限值和合适大小)上的季胺或二乙基氨基乙基组成。此类树脂的实例是General Electric(GE)Q琼脂糖凝胶和GE DEAE琼脂糖凝胶。由于它们相似的电负性，使用低pH条件(低于pH 6.5)也允许在阳离子交换剂上共纯化这两种分子。此类阳离子交换剂的实例是基于GE羧甲基琼脂糖凝胶和基于磺酸基琼脂糖凝胶的树脂。因为白蛋白和Hsp70具有相似的等电点，所以混合模式树脂也可以用于白蛋白和Hsp70的共纯化。因为众所周知Hsp70和白蛋白与脂肪酸和其他疏水性分子结合，还可能在基于疏水性的树脂(如辛基琼脂糖凝胶(GE))上共纯化白蛋白和Hsp70。由于Hsp70蛋白和白蛋白的相似大小(65-75kDa)，通过使用高于和低于65-75kDa的分子排阻的切向流超滤法共纯化这两种蛋白质和富集Hsp70，也可以用来共纯化和因而富集带有hsp的白蛋白。
另外，由于它们的相似分子量，基于大小分离多肽的任何方法应当有效地共纯化白蛋白和hsp70，如分子筛法和凝胶过滤法或大小排阻层析法。此外，归因于Hsp70和白蛋白在疏水性和电负性或表面电荷方面的相似性质，它们可以在众多条件下通过沉淀法共纯化。这些条件的一些是通过硫酸铵沉淀、通过变性剂(如尿素)沉淀或基于等电点和溶解度的沉淀。
这些方法也适用于从其他来源富集带有hsp的白蛋白。例如，源自天然和转基因动物原料血清的白蛋白以及从基于原核和真核细胞(包括脊椎动物细胞(如哺乳动物细胞)、和非脊椎动物细胞(如昆虫)、以及植物，和真菌(如酵母)，等等)的重组生物体和组织培养系统产生的白蛋白。
V示例性细胞
不希望受理论约束，构思了可以在本发明的方法中使用易受凋亡的任何细胞，包括原代细胞、永生化细胞、分化细胞、未分化的细胞或特化程度不定的细胞如干细胞。在一个具体实施方案中，在本发明的方法中使用的细胞转染有核酸分子，所述核酸分子包含编码目的蛋白(例如治疗性蛋白或抗体)的核苷酸序列。
在一个具体实施方案中，在本发明的方法中使用的细胞是真核细胞，例如，哺乳动物细胞。哺乳动物细胞的实例包括，但不限于例如，人B细胞和T细胞及其衍生物，如杂交瘤，和表达B细胞或T细胞标记的细胞、由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293细胞或经亚克隆用于悬浮培养下生长的293细胞，Graham等人，J.Gen Virol.，36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK、ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，Proc Natl Acad Sci USA，77：4216(1980))；CHO-K1细胞(ATCCCCL-61)、人PER.C6细胞(Crucell，NV)、小鼠睾丸支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)；大肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.，383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；NSO小鼠骨髓瘤细胞(ECACC；SIGMA)和人肝细胞瘤系(Hep G2)。有用细胞系的额外实例包括，但不限于HT1080细胞(ATCC CCL 121)、MCF-7乳腺癌细胞(ATCC BTH22)、K-562白血病细胞(ATCC CCL 243)、KB癌细胞(ATCC CCL 17)、2780AD卵巢癌细胞(见Van der Blick，A.M.等人，Cancer Res.48：5927-5932(1988)、Raji细胞(ATCC CCL 86)、Jurkat细胞(ATCC TIB 152)、Namalwa细胞(ATCC CRL 1432)、HL-60细胞(ATCC CCL 240)、Daudi细胞(ATCC CCL213)、RPMI 8226细胞(ATCC CCL 155)、U-937细胞(ATCC CRL 1593)、Bowes黑色素瘤细胞(ATCC CRL 9607)、WI-38VA13亚系2R4细胞(ATCCCLL 75.1)，和Molt-4细胞(ATCC CRL 1582)以及通过人细胞和另一个物种的细胞融合产生的异种杂交瘤(heterohybridoma)细胞。这些以及其他细胞和细胞系是商业可获得的，例如从美国典型培养物保藏中心(Virginia，USA)可获得。许多其他细胞系是本领域已知的并是普通技术人员熟悉的；因此此类细胞系也可以同等地用于本发明的方法中。在一个具体实施方案中，在本发明的方法中使用的细胞是CHO细胞或NSO细胞。杂交瘤和抗体产生细胞也可用于本发明的方法中。
在另一个实施方案中，在本发明的任何方法中使用的细胞是干细胞。干细胞是由它们在单细胞水平上既自我更新又分化产生子代细胞的能力来定义的未分化细胞，包括自我更新性祖细胞、非更新性祖细胞和末端分化细胞。干细胞还以它们的以下能力为特征：在体外从多个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)分化成多种细胞谱系的功能细胞的能力，以及在移植后产生多个胚层组织的能力和在注射到胚泡后对大多数组织(如果不是全部组织的话)作出重要贡献的能力。
可以在本发明的任何方法中使用的人干细胞的类型包括建立的人细胞系，其源自妊娠后形成的组织，所述组织包括在妊娠期间的任何时间(一般但不必然地在大约10-12周妊娠之前)取得的前胚性组织(例如，胚泡)、胚性组织或胎儿组织。建立人胚胎干细胞系或人胚胎生殖细胞系的非限制性实例是例如人胚胎干细胞系H1、H7和H9(WiCell)。也构思了在此类细胞的初始建立或稳定期间本公开内容的组合物的使用，在这种情况下，来源细胞将是从来源组织直接取得的原代多潜能细胞。同样，从血液或脐带血分离的干细胞也是合适的。同样，从在饲养细胞缺乏时已培养的多潜能干细胞群体取得的细胞也是合适的。同样，突变人干细胞系也是合适的，例如，BG01v(BresaGen，Athens，Ga.)。在一个实施方案中，人干细胞如Thomson等人所描述那样制备(美国专利号5,843,780；Science 282：1145，1998；Curr.Top.Dev.Biol.38：133 ff.，1998；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：7844，1995)。
另外，杂交瘤细胞也可在本发明的方法中使用。术语“杂交瘤”指通过免疫起源的永生细胞系与抗体发生细胞融合而产生的杂合细胞系。该术语包括异种杂交骨髓瘤融合物的子代，所述子代是人细胞和鼠骨髓瘤细胞系融合，随后与浆细胞融合的结果，常称作三体瘤细胞系。另外，该术语是指包括产生抗体的任何永生化杂合细胞系，例如，四体瘤(quadroma)。参见，例如，Milstein等人，Nature，537：3053(1983)。杂交细胞系可以是任何物种，包括人、兔和小鼠。
在一些实施方案中，在本发明的方法中使用的细胞系是抗体产生的细胞系。使用技术人员熟知的技术可以选择和培养抗体产生的细胞系。参见，例如，Current Protocols in Immunology，Coligan等人，(编著).，Green PublishingAssociates and Wiley-Interscience，John Wiley and Sons，New York(1991)，在此引入所述文献的全部内容作为参考，包括附录。通常，适于在细胞培养物中重组蛋白表达的任何细胞可用于本发明的方法中。
在一些实施方案中，本发明方法中使用的细胞可以包括编码所需重组蛋白(例如，治疗性蛋白或抗体)的异源核酸分子，所述重组蛋白需要使用本发明方法产生。在一个具体实施方案中，本发明的方法用于在一种或多种杂质降低水平的情况下产生高滴度的所需重组蛋白，例如，治疗性蛋白或抗体。
VI.细胞培养基
适于细胞生长和蛋白质产生的任何适合的培养基或补料培养基可以在本发明的方法中使用。选择合适的培养基或补料培养基以适合于它们与目的宿主细胞和目标方法的相容性。合适的培养基或补料培养基是本领域熟知的并且包括，但不限于商业培养基如Ham′s F10(SIGMA)，最小基本培养基(SIGMA)、RPMI-1640(SIGMA)和Dulbecco改良Eagle培养基(SIGMA)适于培养动物细胞。此外，可以使用在Ham和Wallace，(1979)Meth.Enz.，58：44；Barnes和Sato，(1980)Anal.Biochem.102：255；美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；5，122,469或4,560,655；国际公开号WO 90/03430和WO 87/00195中描述的任何培养基。
任何的此类培养基可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷(如腺苷和胸苷)、抗生素(如庆大霉素TM)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效的能量来源。也可以按本领域技术人员已知的适宜浓度包括任何其他的必需补充物。培养条件如温度、pH等是先前被选择用于表达的宿主细胞所用的那些培养条件，并且对普通技术人员是明晰可见的。用于特定细胞的必需生长因子通过经验很容易确定，无需过多实验，例如Mammalian Cell Culture(Mather，J.P.编著，Plenum Press，N.Y.(1984)，以及Barnes和Sato，Cell，22：649(1980)中所述。
适于在重组脊椎动物细胞培养物中合成目的蛋白的合适的其他方法、载体和宿主细胞在Gething等人，Nature，293：620-625(1981)；Mantei等人，Nature，281：40-46(1979)；EP 117,060；和EP 117,058中描述。通常，用于最大化哺乳动物细胞培养物生产率的原理、操作方案和实用技术可以在Mammalian Cell Biotechnology：A Practical Approach，M.Butler，编著(IRL Press，1991)中找到。
VII.示例性细胞培养物表达产物
在所要求保护的方法中的任一个方面，本发明的补充物用来改善细胞的生存力和生长，所述细胞用来表达和产生目的蛋白。细胞可以内源地表达目的蛋白或可以是工程化细胞系，所述工程化细胞系已经被基因修饰以在该细胞的背景之上的水平表达目的蛋白。
细胞可以通过用编码目的蛋白的核酸转化或通过激活序列的转化促进内源基因表达从而修饰基因以表达蛋白质。在一个方面，目的蛋白可以从表达载体中表达，在所述表达载体中如本领域已知，目的蛋白的编码序列与表达调控序列有效连接以启动组成型或诱导型表达。
目的蛋白可以是具有商业、治疗或诊断价值的任何蛋白质或其片段，包括而不限于细胞因子、趋化因子、激素、抗体、抗氧化剂分子、工程化的免疫球蛋白样分子、单链抗体、人源化抗体、融合蛋白、酶、免疫共刺激分子、免疫调节分子、靶蛋白的转显性负向突变体、毒素、条件性毒素、抗原、肿瘤抑制蛋白、生长因子、膜蛋白、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白和核酶、及其衍生物(如，相关联的报道基团)。目的蛋白也可以包括前体药物激活酶。
在一些实施方案中，目的蛋白包括糖蛋白或具有一种或多种翻译后修饰的任何其他蛋白质。例如，适于在真核宿主中产生的任何蛋白质可以使用本文所述的方法和组合物表达。
本发明的方法可以用来产生任何所需的重组蛋白或其片段。在一些实施方案中，使用本文所述方法产生的重组蛋白是治疗性蛋白。在其他实施方案中，重组蛋白是抗体或其功能片段。可以使用本发明方法产生的抗体包括例如，多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、完全人抗体、人源化抗体、单链抗体、嵌合抗体、杂交抗体、CDR移植抗体。它可以包括完整长度的IgG1抗体或其抗原结合片段如Fab、F(ab′)2、Fv和scfv。
在本发明范围内的抗体包括，但不限于：抗HER2抗体，包括曲妥珠单抗(赫赛汀TM)(Carter等人，Proc Natl Acad Sci USA，89：4285-4289(1992)，美国专利号5,725,856)；抗CD20抗体，如美国专利号5,736,137中的嵌合抗CD20“C2B8“(RITUXANTM)，如美国专利号5,721,108中的2H7抗体的嵌合或人源化变体B1、或托西莫单抗(BEXXARTM.)；抗IL-8(St John等人，Chest，103：932(1993)，和国际公开号WO 95/23865)；抗VEGF抗体，包括人源化和/或亲和成熟抗VEGF抗体，如人源化抗VEGF抗体huA4.6.1AVASTINTM.(Kim等人，Growth Factors，7：53-64(1992)，国际公开号WO 96/30046和WO 98/07409，1998年10月15日公布)；抗PSCA抗体(WO01/40309)；抗CD40抗体，包括S2C6及其人源化变体(WO00/75348)；抗CD11a(美国专利号5,622,700，WO98/23761，Steppe等人，Transplant Intl.4：3-7(1991)，和Hourmant等人，Transplantation 58：377-380(1994))；抗IgE(Presta等人，J.Immunol.151：2623-2632(1993)，和国际公开号WO 95/19181)；抗CD18(1997年4月22日颁布的美国专利号5,622,700，或如1997年7月31日公布的WO 97/26912中所述)；抗IgE(包括E25、E26和E27；1998年2月3日颁布的美国专利号5,714,338或1992年2月25日颁布的美国专利号5,091,313，1993年3月4日公布的WO 93/04173或1998年6月30日提交的国际申请号PCT/US98/13410，美国专利号5,714,338)；抗Apo-2受体抗体(1998年11月19日公布的WO98/51793)；抗TNF-α抗体，包括cA2(REMICADETM)、CDP571和MAK-195(参见，1997年9月30日颁布的美国专利号5,672,347，Lorenz等人，J.Immunol.156(4)：1646-1653(1996)，和Dhainaut等人，Crit.Care Med.23(9)：1461-1469(1995))；抗组织因子(TF)(1994年11月9日授予的欧洲专利号0 420 937 B1)；抗人α4β7整合蛋白(1998年2月19日公布的WO 98/06248)；抗EGFR(如1996年12月19日公布的WO 96/40210中的嵌合化或人源化225抗体)；抗CD3抗体如OKT3(1985年5月7日颁布的美国专利号4,515,893)；抗CD25或抗tac抗体如CHI-621(SIMULECTTM)和(ZENAPAXTM)(见1997年12月2日颁布的美国专利号5,693,762)；抗CD4抗体如cM-7412抗体(Choy等人，ArthritisRheum 39(1)：52-56(1996))；抗CD52抗体如CAMPATH-1H(Riechmann等人，Nature 332：323-337(1988))；抗Fc受体抗体如针对Fc γRI的M22抗体，如Graziano等人，J.Immunol.155(10)：4996-5002(1995)中所述；抗癌胚抗原(CEA)抗体如hMN-14(Sharkey等人，Cancer Res.55(23Suppl)：5935s-5945s(1995)；针对乳腺上皮细胞的抗体，包括huBrE-3、hu-Mc 3和CHL6(Ceriani等人，CancerRes.55(23)：5852s-5856s(1995)；和Richman等人，Cancer Res.55(23 Supp)：5916s-5920s(1995))；与结肠癌细胞结合的抗体如C242(Litton等人，Eur J.Immunol.26(1)：1-9(1996))；抗CD38抗体，例如，AT 13/5(Ellis等人，J.Immunol.155(2)：925-937(1995))；抗CD33抗体如Hu M195(Jurcic等人，CancerRes 55(23 Suppl)：5908s-5910s(1995)和CMA-676或CDP771；抗CD22抗体如LL2或LymphoCide(Juweid等人，Cancer Res 55(23 Suppl)：5899s-5907s(1995))；抗EpCAM抗体如17-1A(PANOREXTM.)；抗GpIIb/IIIa抗体如abciximab或c7E3Fab(REOPROTM抗RSV抗体如MEDI-493(SYNAGISTM.)；抗CMV抗体如PROTOVIRTM；抗HIV抗体如PRO542；抗肝炎抗体如抗Hep B抗体OSTAVIRTM；抗CA 125抗体OvaRex；抗个体基因型GD3抗原决定簇抗体BEC2；抗αvβ3抗体VITAXINTM；抗人肾细胞癌抗体如ch-G250；ING-1；抗人17-1A抗体(3622W94)；抗人结肠直肠肿瘤抗体(A33)；针对GD3神经节苷脂的抗人黑色素瘤抗体R24；抗人鳞状细胞癌(SF-25)；和抗人白细胞抗原(HLA)抗体如Smart ID 10和抗HLA DR抗体Oncolym(Lym-1)。本文抗体的优选靶抗原是：HER2受体、VEGF、IgE、CD20、CD11a和CD40。
重组蛋白可以是细胞蛋白如受体(例如，膜结合或胞质受体)或结构蛋白(例如，细胞骨架蛋白)。重组蛋白可以是由细胞分泌的或在一条或多条信号转导通路中内部使用的细胞因子。非限制性实例包括，但不限于CD2、CD3、CD4、CD8、CD11a、CD14、CD18、CD20、CD22、CD23、CD25、CD33、CD40、CD44、CD52、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD147、IL-1、IL-2、IL-3、IL-7、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、IL-2受体、IL-4受体、IL-6受体、IL-13受体、IL-18受体亚基、PDGF、EGF受体、VEGF受体、肝细胞生长因子、骨保护素配体、干扰素γ、B淋巴细胞刺激因子C5补体TAG-72、整联蛋白α4β7、整联蛋白VLA-4、B2整联蛋白、TRAIL受体1、2、3和4、RANK、RANK配体、TNF、黏附分子VAP-1、上皮细胞黏附分子(EpCAM)、胞间黏附分子(ICAM-3)、白细胞整合素黏附因子、血小板糖蛋白gp IIb/IIIa、心肌肌球蛋白重链、甲状旁腺激素、rNAPc2，和CTLA4(其是细胞毒性T淋巴细胞相关抗原)。
重组蛋白也可以源自感染介质如病毒、细菌或真菌。例如，蛋白质可以源自病毒外壳或可以是病毒酶或病毒转录因子。蛋白质可以源自细菌膜或细胞壁，或可源自细菌的细胞质。蛋白质可以是酵母酶、转录因子或结构蛋白。酵母蛋白可以是膜结合的、胞质的或分泌的。感染介质的实例包括，但不限于呼吸道合胞体病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、变异链球菌(Streptococcus mutans)和金黄色葡萄球菌(Staphlycoccus aureus)和白色念珠菌(Candida albicans)。另外，细胞培养系统的产物可以是病毒，如上文指出的任一种病毒。这些病毒包括活病毒、减毒病毒和其他方式失活的病毒或其组分如病毒颗粒或病毒样颗粒。病毒也可以是在该病毒的组分中包含两种或更多种不同病毒组分的假型病毒。此外，细胞培养的产物可以是疫苗。疫苗可以有治疗或预防的性质。培养物中产生的疫苗经常是活病毒或减毒病毒或其组分，例证为亚单位疫苗，或可以是包含多于一种病毒的组分的重组病毒或病毒样颗粒。
本发明的方法也可以用来产生重组融合蛋白，其包含上述任一种蛋白的全部或部分。例如，包含上述蛋白之一外加多聚化结构域(如亮氨酸拉链、卷曲螺旋、抗体Fc部分)的重组融合蛋白或基本上相似的蛋白质可以使用本发明的方法产生。参见，例如，国际申请号WO 94/10308；Lovejoy等人(1993)，Science 259：1288-1293；Harbury等人(1993)，Science 262：1401-05；Harbury等人(1994)，Nature 371：80-83；Hang.kansson等人(1999)，Structure 7：255-64。
另外，本发明包括药物组合物，其包含由本文所述方法产生的一种或多种重组蛋白。在一些实施方案中，药物组合物还包含药学上可接受的载体。如本文所用的术语“药学上可接受的载体”是指适于施用到受试者的一个或多个相容性固体或液体填充剂、稀释剂或胶囊化物质。
VIII干细胞
在一个实施方案中，在培养系统中培养的人干细胞基本上不含饲养细胞，虽然如此，但是饲养细胞却支持未经历完全分化的人胚胎干细胞的增殖，所述培养系统包含本发明的补充物。使用下述培养基支持人干细胞在无饲养细胞培养下无分化的生长，所述培养基通过事先与另一个细胞类型培养，并进一步包含本发明补充物来条件化。可选地，使用包含本发明补充物的化学上确定成分的培养基支持人干细胞在无饲养细胞培养下无分化时的生长。无饲养细胞、无血清培养系统的实例包括在美国专利申请、US20050148070、US20050244962、US20050233446、美国专利号6,800,480和PCT公开WO2005065354和WO2005086845中公开的那些，在所述培养系统中，干细胞在补充有能够触发干细胞自我更新的不同生长因子的无条件的血清替换(SR)培养基中维持。
在另一个实施方案中，人干细胞起初随支持人干细胞的饲养细胞层一起培养，培养物还包含本发明的补充物。人干细胞随后转移至培养系统，所述培养系统基本上不含饲养细胞，虽然如此但却支持未经历完全分化的人胚胎干细胞增殖，并且还包含本发明的补充物。在这些方法的任一种中，本发明补充物的使用导致细胞生长速率的显著增强和细胞生存力的改善。
适于使用本发明补充物的条件培养基的实例在US20020072117、美国专利号6,642,048、WO2005014799和Xu等人(Stem Cells 22：972-980，2004)中公开。适于使用本发明补充物的化学上确定成分的培养基的实例可以在US20070010011中找到。
饲养细胞的实例包括的饲养细胞选自成纤维细胞、MRC-5细胞、胚肾细胞、间充质细胞、骨肉瘤细胞、角质形成细胞、软骨细胞、输卵管导管上皮细胞、肝细胞、心肌细胞、骨髓基质细胞、颗粒细胞、骨骼肌细胞、肌肉细胞和主动脉内皮细胞。在一个优选实施方案中，MRC-5细胞，具有ATCC目录号55-X；转化和具有ATCC登录号CRL-2309；具有ATCC登录号HTB-96的人骨肉瘤细胞；并且间充质细胞是具有ATCC登录号CRL-1486的人类胚胎腭间充质细胞。在其他优选实施方案中，人成纤维细胞是具有ATCC登录号CRL-1762的皮肤瘢痕疙瘩成纤维细胞KEL FIB，或是胎儿皮肤成纤维细胞；以及具有ATCC登录号CRL-11882的骨髓间质细胞HS-5。
合适的培养基可以通过以下组分制成，例如，Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)，Gibco#11965-092；敲除Dulbecco的改良Eagle培养基(KODMEM)，Gibco#10829-018；Ham′s F12/50％DMEM基础培养基；200mM L-谷氨酰胺，Gibco#15039-027；非必需氨基酸溶液，Gibco 11140-050；β-巯基乙醇，Sigma#M7522；人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，Gibco#13256-029。
在一个实施方案中，根据本发明的方法，人干细胞处理之前是铺种到用包含本发明补充物的组合物处理过的合适培养基材上。在一个实施方案中，该处理是胞外基质组分，如源自基膜或可组成黏附分子受体-配体偶联的一部分的那些。在一个实施方案中，合适的培养基材是MATRIGEL(BectonDickenson)。MATRIGEL是来自Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤细胞的可溶性制备物，它在室温凝胶化以形成重构的基膜。
其他胞外基质组分和组分混合物适合作为替代物并且可以随本发明的补充物一起使用。这可以包括单独或与本发明补充物进行各种组合的层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素等。
在另一个实施方案中，本发明包括干细胞培养物，其包含人多潜能干细胞和包含本发明补充物的无饲养细胞、无血清培养系统。在一个实施方案中，本发明包括人多潜能干细胞培养物，其包含人多潜能干细胞和包含本发明补充物的无饲养细胞、无血清培养系统。
在另一个实施方案中，本发明包括干细胞培养物，其包含人干细胞和包含本发明补充物的人饲养细胞培养物。在另一个实施方案中，本发明包括人多潜能干细胞培养物，其包含人多潜能干细胞和包含本发明补充物的人饲养细胞培养物。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于衍生包含表达多能性标记细胞的细胞群体的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
a.培养人干细胞，
b.将人干细胞分化成表达多能性标记的细胞，其中在本发明补充物存在时实施分化。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于衍生细胞群体的方法，所述细胞群体包含表达有外胚层细胞、内胚层细胞或中胚层细胞之特征的标记的细胞，所述方法包括步骤：
a.培养多能性干细胞；
b.将多能性干细胞分化成表达有外胚层细胞、内胚层细胞或中胚层细胞之特征的标记的细胞，其中在本发明的补充物存在时实施分化。
在这些方法的任一种中，可以通过本领域的任何方法，将干细胞分化成表达有内胚层谱系、外胚层谱系或中胚层谱系之特征的标记的细胞。例如，表达多能性标记的细胞可以根据在D′Amour等人，Nature Biotechnology 23，1534-1541(2005)中、由Shinozaki等人，Development 131，1651-1662(2004)、McLean等人，Stem Cells 25，29-38(2007)、D′Amour等人，Nature Biotechnology24，1392-1401(2006)公开的方法分化成表达有发育完全的内胚层谱系之特征的标记的细胞。
表达作为内胚层谱系之标记特征的细胞可以通过本领域的任何方法进一步分化成表达作为胰腺内分泌谱系之标记特征的细胞。例如，表达作为胰内胚层谱系之标记特征的细胞可以根据D′Amour等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中所公开方法，分化成表达作为胰内分泌谱系之标记特征的细胞，其中分化是在本发明补充物存在下实施的。
在分化的这些方法中的任一个方面，将人干细胞在涂覆有胞外基质的组织培养基上培养和分化。胞外基质可以是从小鼠肉瘤细胞提取的溶解基底膜制备物(其由BD Biosciences公司出售，商品名MATRIGEL)。可选地，胞外基质可以是减除生长因子的MATRIGEL。可选地，胞外基质可以是纤维连接蛋白。在替代性实施方案中，将人干细胞在涂覆有人血清的组织培养基上培养和分化。在一个方面，组织培养基涂覆有胞外基质和本发明的补充物。
在涂敷组织培养基之前可稀释胞外基质。用于稀释胞外基质和用于涂敷组织培养基的合适方法的实例可以在Kleinman，H.K.等人，Biochemistry25：312(1986)，和Hadley，M.A.等人，J.Cell.Biol.101：1511(1985)中找到。
在干细胞分化方法的一个方面，培养基应当含有允许人干细胞分化成内胚层谱系、外胚层谱系或中胚层谱系细胞的足够低浓度的某些因子，例如胰岛素和IGF(如WO2006020919中公开)。这可以通过降低血清浓度，或可选地通过使用缺少胰岛素和IGF的化学上确定成分的培养基来实现。化学上确定成分的培养基的实例在Wiles等人(Exp Cell Res.1999年2月25日；247(1)：241-8.)中公开。在这些方法中的任一种的优选实施方案中，培养基包含本发明的补充物。
培养基也可以含有至少一种其他的额外因子，所述的额外因子可以增强从人干细胞到作为内胚层、中胚层或外胚层谱系之标记特征表达的细胞形成。至少一种额外因子可以是，例如，烟酰胺、TGF-β家族的成员，包括TGF-β1、2和3、血清白蛋白、成纤维细胞生长因子家族的成员、血小板衍生生长因子-AA和-BB、富含血小板的血浆、胰岛素生长因子(IGF-I、II)、生长分化因子(GDF-5、-6、-8、-10、11)、胰高血糖素样肽I和II(GLP-I和II)、GLP-1和GLP-2mimetobody、毒蜥激动肽-4、视黄酸、甲状旁腺激素、胰岛素、孕酮、抑肽酶、氢化可的松、乙醇胺、β巯基乙醇、表皮生长因子(EGF)、胃泌素I和II、铜螯合剂如三亚乙烯五胺、毛喉素、丁酸钠、活化素、β细胞素(betacellulin)、ITS、noggin、神经突生长因子、nodal、丙戊酸、曲古抑菌素A、丁酸钠、肝细胞生长因子(HGF)、鞘氨醇1、VEGF、MG132(EMD，CA)、N2和B27补充物(Gibco、CA)、类固醇生物碱如环巴胺(EMD，CA)、角质细胞生长因子(KGF)、Dickkopf蛋白质家族、牛垂体提取物、胰岛新生相关蛋白(INGAP)、印度刺猬因子、刺猬索尼克(sonic hedgehog)、蛋白酶体抑制剂、Notch途径抑制剂、刺猬索尼克抑制剂或其组合。在这些方法中的任一种的优选实施方案中，含有上文所列至少一个额外因子的培养基还包含本发明的补充物。
至少一个其他的额外因子可以由条件培养基供应，所述条件培养基从胰细胞系如PANC-1(ATCC No：CRL-1469)、CAPAN-1(ATCC No：HTB-79)、BxPC-3(ATCC No：CRL-1687)、HPAF-II(ATCC No：CRL-1997)，肝细胞系如HepG2(ATCC No：HTB-8065)和肠细胞系如FHs 74(ATCC No：CCL-241)中获得。在这些方法中的任一种优选实施方案中，条件培养基还包含本发明的补充物。在另一个实施方案中，本发明包括一种使用任何前述干细胞的细胞或组织用以实验性、治疗性和预防性治疗人或动物的疾病或病状的方法。优选地，疾病选自帕金森氏症、阿尔茨海默氏症、多发性硬化、脊髓损伤、中风、黄斑变性、烧伤、肝衰竭、心脏病、糖尿病、杜氏肌营养不良、成骨不全症、骨关节炎、类风湿性关节炎、贫血、白血病、乳腺癌、实体瘤和AIDS。在一个优选的实施方案中，所述疾病是帕金森氏症或阿尔茨海默氏症。在一个更优选的实施方案中，所述疾病是帕金森氏症。
IX.重组蛋白的大规模生产
在一个实施方案中，本发明的补充物可以用来通过在该补充物存在的情况下培育宿主细胞而产生目的蛋白。在一个实施方案中，在搅拌罐生物反应器系统中进行细胞培养，并且使用补料分批培养方法。在另一个实施方案中，使用wave一次性生物反应器(wave disposable bioreactor)。在这种生物反应器系统中，生物反应器的尺寸足够大到生产所需量的目的蛋白，如1,000升或12,000升大小，但不限于此类尺寸，同样小得多(即，2升、400升)或大得多(即，25,000升、50,000升)的生物反应器容器可以是合适的。在优选的补料分批培养中，将哺乳动物宿主细胞和培养基最初供应至培养容器中，并且将额外的培养养分在培养期间连续地或以离散增量的方式补充到培养物中，在终止培养之前定期收获或不收获细胞和/或产物。补料分批培养可以包括，例如半连续补料分批培养，其中定期将整个培养物(包括细胞和培养基)取出并由新鲜培养基替换。补料分批培养不同于简单分批培养，所述简单分批培养将用于细胞培养的全部组分(包括细胞和全部培养养分)在培养过程开始时供应到培养容器中。补料分批培养还可以不同于灌注培养，因为上清液在这个过程期间不从培养容器移出，而是在培养过程终止时移出(在灌注培养中，培养时细胞是固定的，例如通过过滤、胶囊化、锚定于微载体等，并且培养基连续地或间歇地从培养容器中引入和除去)。
另外，培养的细胞可以根据可以适用于构思的特定宿主细胞和特定生产计划的任何方案或惯例来增殖。因此，本发明构思了单步骤或多步骤培养方法。在单步骤培养中，将宿主细胞接种至培养环境中并且在细胞培养的单个生产期期间使用本发明的方法步骤。可选地，预想了多级培养。在多级培养中，可以在众多步骤或阶段中培育细胞。例如，可以在第一步骤或生长期培养中培育细胞，其中将细胞(可能从贮藏物去除)接种至包含适于促进生长和高生存力的本发明补充物的培养基中。可以通过添加新鲜培养基至宿主细胞培养物，将细胞维持在适合生长期持续的时间段。
根据本发明的优选方面，构想了补料分批或连续细胞培养条件以增强处于细胞培养生长期的哺乳动物细胞的生长。在生长期，在使生长最大化的条件和时间段培育细胞。培养条件如温度、pH、溶解氧(dO2)等是使用特定宿主所用的那些培养条件，并且所述培养条件对普通技术人员是明晰可见的。通常，使用酸(例如，CO2)或碱(例如，Na2CO3或NaOH)，将pH调整至约6.5～7.5的水平。用于培养哺乳动物细胞如CHO细胞的合适温度范围是约30～38℃，并且优选地是约37℃，并且合适的dO2是在5～90％空气饱和度。
在特定阶段，在细胞培养的生产期或步骤接种细胞。可选地，如上文所述的，生产期或步骤可随着接种或生长期或步骤而连续。
根据本发明，在细胞培养的生产期期间控制细胞培养环境。根据目前所公开方法的步骤，可以协调添加本发明补充物，从而在所得到的细胞培养流体中实现和维持所需含量和质量的目的蛋白。在优选的方面中，细胞培养的生产期在细胞培养的过渡期之前，在所述过渡期之中，本发明补充物的添加启动细胞培养的生产期。
在任何上述方法中，据设想，包含在细胞培养基中与本发明补充物混合的所需量的化学物质如丁酸盐或曲古抑菌素A是合乎需要的。丁酸盐及其盐的多种形式是本领域已知的，如丁酸和丁酸钠，并且是来源(如Sigma ChemicalCo)是可公开获得的。已有文献报道了丁酸盐增强细胞培养物的生产率和蛋白质表达[Arts等人，Biochem J.，310：171-176(1995)；Gorman等人，NucleicAcids Res.，11：7631-7648(1983)；Krugh，Mol.Cell.Biochem.，42：65-82(1982)；Lamotte等人，Cytotechnology，29：55-64(1999)；Chotigeat等人，Cytotechnology，15：217-221(1994)]。曲古抑菌素A(TSA)是组蛋白脱乙酰酶的抑制剂并且可以在细胞培养物中增强生产率和蛋白质表达方面发挥与丁酸盐类似的作用[Medina等人，Cancer Research，57：3697-3707(1997)]。虽然丁酸盐对蛋白质表达具有一些积极作用，但是本领域中也理解，在某些浓度，丁酸盐可以在培养物细胞中诱导凋亡，从而降低培养物的生存力以及活细胞密度[Hague等人，Int.J.Cancer，55：498-505(1993)；Calabresse等人，Biochim.Biophys.Res.Comm.，195：31-38(1993)；Fillipovich等人，Biochim.Biophys.Res.Comm.，198：257-265(1994)；Medina等人，Cancer Research，57：3697-3707(1997)]。在本发明的方法中，所需量的丁酸盐或TSA可以在生产期开始时添加至细胞培养物，并且更优选地，可以在温度变动已生效后添加至细胞培养物。丁酸盐或TSA可以按照由本领域技术人员经验确定的所需量添加，但是优选地，丁酸盐以约1mM至约25mM的浓度并且更优选地以约1mM至约6mM的浓度添加至细胞培养物。
目的蛋白的表达可以直接在样品中测量，例如，使用适当标记的探针，通过ELISA、常规DNA印迹法、定量mRNA转录的RNA印迹法[Thomas，Proc Natl Acad Sci USA，77：5201-5205(1980)]、斑点印迹法(DNA分析)或原位杂交测量。可以使用多种标记物，最常见的是放射性同位素，特别是32P。然而，也可以使用其他技术，如使用导入多核苷酸中的生物素修饰的核苷酸。生物素随后充当与可以用多种标记物(如放射性核苷酸、荧光团或酶)标记的抗生物素蛋白或抗体结合的位点。可选地，可以使用这样的抗体，所述抗体可以识别特定双链体，包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂交双链体或DNA-蛋白质双链体。抗体转而可以被标记并且可以实施这样的测定法，其中双链体结合到表面，从而当双链体在表面上形成时，可以检测到双链体结合的抗体的存在。
可选地，可通过免疫学方法，如细胞切片或组织切片的免疫组织化学染色法，和细胞培养物或体液测定法，测量基因表达以直接定量基因产物的表达。采用免疫组织化学染色技术，制备细胞样品，一般通过脱水和固定，随后与针对偶联的基因产物特异的标记抗体反应，其中标记物通常是目视可检测的，如酶标记物、荧光标记物、发光标记物等。
用于免疫组织化学染色和/或液体样品测定法的抗体可以是单克隆或多克隆的，并且可以在任何哺乳动物中制备。许多抗体是市售的。
本文中要求保护的补充物也可以用来在转染期间增加细胞的转染效率和生存力。许多转染技术中所用的条件和试剂(如Lipofectamine)相对细胞是有毒的，而电穿孔可以能严重应激细胞。优选使用更高浓度的转染试剂和更广泛的电穿孔条件以实现更高的转染效率。因而在转染之前、与其一起或其之后添加本发明的补充物可以导致更高的转染效率和重组蛋白的更高产率。
本发明的补充物可以用来表达诱导凋亡的目的蛋白，如Apo-2配体/TRAIL或Fas配体。本发明补充物的存在可以阻断此类凋亡活性并且允许改善目的蛋白的表达。
此外，这些方法可以用来增加经历冷冻/贮存/解冻程序的细胞的生存能力。在这些过程期间，通常细胞可能丧失生存力。添加至细胞培养基的凋亡抑制剂的存在可以提供增加的细胞生存力并且有助于减少或消除等份或小瓶中的细胞之间细胞生存力的变异性。
X.试剂盒
另外，本发明也包括用于促进细胞生存力的试剂盒。在一个实施方案中，本发明的试剂盒包括：(a)一种或多种用于转染的试剂或装置和(b)本发明的补充物。在一些实施方案中，本文中表征的试剂盒包括说明书和/或宣传材料，所述说明书和/或宣传材料包括关于使用转染装置、转染剂和补充物的详细资料。
在另一个实施方案中，根据本发明的试剂盒包括：(a)一种或多种用于冷冻或解冻细胞的试剂或装置和(b)本发明的补充物。在一些实施方案中，本文中表征的试剂盒包括说明书和/或宣传材料，所述说明书和/或宣传材料包括关于冷冻或解冻细胞系的操作方案和试剂用途的详细资料。
在另一个实施方案中，根据本发明的试剂盒包括：(a)一种或多种用于培养细胞的组织培养产物和(b)本发明的补充物。在一些实施方案中，本文中表征的试剂盒包括说明书和/或宣传材料，所述说明书和/或宣传材料包括关于稀释克隆技术的操作方案和此类方法中试剂用途的详细资料。
实施例
实施例1.重组稻粉的产生
方法：比较了来自多个数据库的人血清白蛋白的蛋白质序列。使用由登录号P02768代表的共有序列作为用于稻谷粒中适于表达人血清白蛋白的基因密码子优化的基础，如WO2007/002762中先前描述那样。基因合成由BlueHeron(Seattle，WA)完成，并且将合成的片段插入基于pUC的载体以产生pUC-HSA。在正确的DNA序列确认后，将这种载体用Mly I和Xho I消化。将含有密码子优化的HSA基因的片段插入已经用Nae I和Xho I预切割的pAP1405中。质粒AP1405是包括Gt1启动子、Gt1信号序列和nos终止子的载体pAP1441的衍生物(WO2007/002762)。Mly/Xho I片段插入pAP1405中产生了通过下文所述的轰击法用于转染的载体pAP1504。
粒子轰击介导的稻转化和植物再生的基本程序如先前所述那样实施(YiChuan Xue Bao.2001；28(11)：1012-8.Chinese and Biotechnol Prog.2001；17(1)：126-33)。将稻品种TP309种子脱壳、在50％(v/v)商业漂白剂中消毒25分钟并且用无菌水洗涤。消毒的种子置于含有[N6盐(Sigma)、B5维生素(Sigma)、2mg/L 2，4-D和3％蔗糖]的稻愈伤组织诱导培养基(RCI)平板上。将稻种子培养10日以诱导愈伤组织形成。从种子中分割原代愈伤组织并且将其置于RCI上3周。这样进行2次才能生成用于轰击和继续继代培养的二级和三级愈伤组织。在轰击之前5-24小时，将1-4mm直径的愈伤组织置于含有0.3M甘露醇、0.3M山梨醇的RCI的4cm圆上。使用Biolistic PDC-1000/He系统(Bio-Rad)进行微粒轰击。该方法需要在1.5mg金粒子(60ug/ml)上涂覆2.5ug DNA。涂覆DNA的金粒子用1100psi的He压力轰击到稻愈伤组织中。
在轰击后，允许愈伤组织恢复48小时并且随后转移至含有30mg/L潮霉素B的RCI用于选择，并且在26℃黑暗中培养45日。选择转化的愈伤组织并且转移至含有5mg/L ABA、2mg/L BAP、1mg/L NAA和30mg/L潮霉素B的RCI(无2，4-D)持续9-12日。转化的愈伤组织转移至由RCI(无2，4-D)、3mg/LBAP和0.5mg/L NAA在无潮霉素B情况下组成的再生培养基并且在连续光照条件下培养2-4周。再生植株(1-3cm高)转移至其浓度为MS培养基(Sigma)浓度一半外加1％蔗糖和0.05mg/L NM的生根培养基。在生根培养基上2周后，植株形成根并且幼苗生长至约10cm。将该植物转移至含有50％商业土壤(Sunshine#1)和50％稻田土壤的混合物的6.5×6.5cm盆钵。植物由塑料容器覆盖以维持近乎100％湿度并且在连续光照下培育1周。透明塑料罩经1日时间缓慢地移开以逐渐减少湿度和水，并且根据需要添加肥料。在转基因R0植物大约20cm高时，将它们转移至温室，在那里它们生长至成熟。
把来自各株R0再生植物的各个R1种子粒剖开成胚和胚乳。测定分离的稻胚乳中重组白蛋白的表达水平。来自重组蛋白高表达的各个R1谷粒的胚在50％漂白剂中消毒25分钟并且用无菌蒸馏水洗涤。消毒的胚置于含有1/2MS基础盐并添加1％蔗糖和0.05mg/L NAA的组织培养管中。胚胎发芽并且在约2周获得具有约7cm幼苗和健康根系的植株。获得成熟的R1植物作为再生体。
含有异源多肽的转基因稻可以通过干磨法或湿磨法转化成稻提取物。在干磨法中，含有异源多肽的转基因稻种子用脱壳机脱壳。随后通过干磨法将脱壳的稻研磨成细粉，例如，在一个实验中，以来自K-TEC的91型Kitchen Mill的速度3研磨。
实施例2重组白蛋白的纯化(B0000C)
方法：对于Ventria培育的稻，通过联合收割机或通过手工收获稻。在这个过程期间，成熟种子通过联合收割机分离器或通过手工劳动与营养性植物物质分开。将收获的稻干燥至大约12％水分，此时它适于储存在将保护谷粒免遭鸟类、啮齿类、蜥蜴、昆虫和其他害虫损害的干净谷仓、储存包、超大袋或其他容器中。当需要稻粒制粉时，首先将它脱壳或脱皮。这个过程在真空下进行，因而从胚乳和胚芽或糠层中卷走种子的残片和外侧部分。脱壳的谷粒随后进行洗涤和干燥，或洗涤并直接加工如湿式均化法中那样，或以干燥、脱壳状态进一步加工。干燥、脱壳的物料可以由白米生产商常见的米抛光机或去糠机去糠。
去糠、脱壳的稻可以在此时洗涤并且湿磨或为干磨法干燥或通过研磨直接加工成粉末。优选具有最低量的剪切力和热的研磨法，如采用辊式磨机或针式磨机。锤式磨机也适用。粉末应当如此研磨，从而可以在不到5分钟在水中伴以激烈搅拌时提取蛋白质至90％。通常，这需要小于400微米或4mm大小的粒子。然而，如果给予更长的时间，则可以提取更大的粒子。可选地，可以将谷粒洗涤，然后用液体均化器湿磨，所述液体均化器如此设置，从而90％的可提取蛋白质溶解。
粉浆一般地按至少3份水对1份粉末和直至20份水至1份粉末的比率混合。水一般含有合适的缓冲剂如Tris/HCl、柠檬酸盐、磷酸盐、HEPES等，和少量盐如100mM NaCl，从而将pH维持在pH 7附近。浆液在湿磨情况下均化后，或彻底混合用于获得干粉后，通过固液分离法从浆液中移除大块固体。通过滗析、离心或过滤进行该过程；例如使用板框垫、压力过滤器、带式过滤器、真空瓶、水力旋流器或真空带式过滤器。在过滤后，压缩的滤饼应当用提取缓冲液洗涤以从滤饼中回收蛋白质。硅藻土或其他过滤介质对于促进滤液的澄清是有用的，但是假定设备正确，则不是必需的。可选地，絮凝剂可以用来有助于澄清。应当对澄清的滤液检查其白蛋白含量并且验证回收率与种子中测定的稻表达水平一致。
为了除去淀粉、可沉淀的蛋白质、病毒和其他杂质，将5M乙酸添加至澄清的滤液直至pH达到5.0并且溶液变成白色。将白色溶液搅动至少20分钟以促进不溶性物质的沉淀。沉淀的溶液随后通过深层过滤器过滤，如筒式过滤器，滤芯过滤器或其他过滤装置，至达到适于超滤或小于10NTU(比浊法浊度单位)的澄清度。它也可以用压滤机(压力过滤器)或可选地通过使用陶瓷过滤器或利用横流的其他材料来澄清。此外，这种物料适于直接施加至膨胀床层析柱。
在优选的方法中，澄清的滤液借助经过0.2微米过滤器的过滤来澄清，并且用1M NaOH中和至pH 7.0。这种物料随后适于通过中空纤维过滤、平片(flat sheet)过滤或螺旋缠绕交叉流过滤进行超滤。物料可以通过100千道尔顿(kDa)尺寸或更大的膜以除去病毒、无用的较大杂质和聚集物。通过这种膜的物料可以由10或30kDa交叉膜浓缩，并且随后，相同的膜可以用来制备用于层析的溶液。浓缩的物料随后可以与柱平衡缓冲液渗滤直至导电性和pH相等。
在GE DEAE琼脂糖凝胶或GE Q琼脂糖凝胶上用于阴离子交换层析的优选缓冲液是10或20mM Tris/HCl缓冲液，pH平衡至pH 8.0。相反，用于阳离子交换(例如通过使用带负电荷树脂或与疏水性接头混合的带负电荷树脂(混合模式吸收剂)，或可选地蓝色Cibicron如Blue Sepharose(GE))的优选缓冲液是醋酸或柠檬酸盐缓冲液，pH平衡至4.8～5.0。
对于任一系统，白蛋白和其他带相似电荷的蛋白质将由基质保留，并且通过用至少5个柱体积的上样缓冲液洗涤，实施洗涤以除去松散结合的物质，所述上样缓冲液洗涤也可以包含如视为必要的去垢剂以帮助除去疏水性杂质。可以通过用相同或改良的缓冲液填充该柱来洗脱物料，同时对于阳离子交换，pH增加2-4个单位，或对于阴离子交换，降低2-4个单位。由此产生的pH变化将允许离子交换，并且蛋白质将以尖锐的带洗脱。为增加洗脱级分的纯度，可以细查洗脱峰，从而可以从主要洗脱峰排除头部分(10％)或尾部分(10％)或这两个部分。在优选的方法中，包含10mM NaCl的溶液用来从GE Q琼脂糖凝胶(快流)中洗脱蛋白质，所述溶液含有100mM的磷酸盐和调整至pH 4.0的pH。在这种情况下，pH和导电性用来洗脱物料，这允许区分未结合的杂质(流动和洗涤)和更紧密结合的杂质(在100mM磷酸盐，10mM NaCl和调节至4.0的pH中保留于柱上的那些)。
在洗脱后，如果洗脱材料的pH具有小于6.0的pH，则用1M NaOH中和这种材料。所得到的溶液随后针对相同的缓冲液渗滤用于下一个层析步骤，在优选的方法中，所述层析步骤包括使洗脱液经相同基质(即Q琼脂糖凝胶)的柱流过，除了以非结合模式，采用100mM磷酸盐，10mM NaCl和pH 7.0。
第二柱步骤使用与第一柱步骤相同的原理，但是以反向模式进行，从而在结合柱上共洗脱的杂质有机会在中性pH保留在基质上。来自第一捕获柱的通流物质也可以用多种替代类型的层析手段处理，例如，阳离子交换法、疏水性混合模式或凝胶过滤层析法。
在优选的方法中，来自Q琼脂糖凝胶非结合柱的通流物质在10kDa或30kDa错流膜上浓缩直至白蛋白浓度为15～25％。随后，通过透滤至用于细胞培养的合适缓冲液如Dulbeccos PBS或可选地20mM磷酸盐，50mM NaCl和pH 7.0中改变缓冲液。物料随后经无菌级过滤至无菌容器中。无菌的过滤物料可以用去垢剂处理以摧毁包膜病毒并且有助于除去疏水性毒素和杂质。在优选的方法中，将0.5％v/v Triton X-114或X-100在室温(小于23℃和大于18℃)添加至15％～25％白蛋白溶液，并且将溶液搅动或搅拌至少一小时。随后使物料在分子量排阻限值比白蛋白分子量小得多的疏水性树脂上通过。许多市售树脂是可获得的，包括来自Biorad和Pall公司的那些。
在这个柱上通过的物料可以随后在对于去垢剂敏感的细胞中测试，以证实生物学活性，残留的去垢剂通常仍然应相对于白蛋白溶液小于0.005％。无去垢剂的通流可以随后经无菌过滤至容器中直接运走，或可以添加稳定剂，或可以伴随稳定剂的情况下经历巴氏消毒，或可以在干燥之前添加稳定剂或直接干燥。物料可以通过冻干法或喷雾干燥法干燥。在干燥之前，在一些情况下，可能有用的是，使用一次性、经验证的病毒移除胶囊(virus removing capsule)(如从GE、Pall和Millipore可获得)使物料经历病毒过滤步骤。本领域通常理解，为了有效地和经济地将浓缩的物料通过20nm滤器，预过滤步骤可能是必要的。
结果：稻粉以1∶5比率在磷酸盐缓冲盐水中提取并且混合20分钟。使用Nalgene滤瓶，使液体澄清。随后澄清提取物经历酸沉淀，如方法中所述。溶液随后进行过滤和中和以产生澄清的滤液。这种物料对50mM Tris/Cl pH 8.0渗滤直至物料和缓冲液平衡。随后将物料加载(300-600cmh)于预平衡的GE Q-琼脂糖凝胶柱上以允许50g/L的结合能力。加载的物料用相同的缓冲液洗涤，并且物料随后用上文所述的100mM磷酸盐，10mM NaCl和pH 4.0洗脱。物料以尖锐的峰洗脱并且收集的洗脱物具有约5.8的稳定pH。使用这种方法产生的白蛋白与如下文更充分公开的其他来源的白蛋白比较：将洗脱物收集于一个池中并且添加1M NaOH直至pH大于6.0。物料随后在10kDa再生的纤维素膜上浓缩大约5倍，并且用100mM磷酸盐，10mM NaCl，pH 7.0实施大约5个等体积渗滤。检查渗滤的最终物料中的白蛋白的蛋白质含量(相对于原料中的表达水平应当是大于80％的)和内毒素水平(根据进料应当是小于500EU/mg的)。使这种物料在具有足够大小以允许大约2-3倍上样量的Q-琼脂糖凝胶柱上通过(60-160cmh)，所述Q-琼脂糖凝胶柱用100mM磷酸盐，10mMNaCl，pH 7.0平衡。物料经过树脂用相同的缓冲液洗涤并收集。收集的物料在10kDa再生的纤维素膜上渗滤，并浓缩大约10倍或直至白蛋白浓度达到至少10％或不多于20％，并且用20mM磷酸盐，50mM NaCl，pH 7.0进行大约5个等体积渗滤。在无菌级过滤(0.2μm)后，在20+/-2℃将溶液随0.5％(v/v)Triton X-100一起搅动1小时。在孵育后，根据制造商的指导，使材料通过PallSDR树脂。通流材料经无菌级过滤至无菌容器中并且冷藏或冷冻干燥，如常见于蛋白质溶液和盐溶液。
实施例3与其他来源的白蛋白相比，比较使用B0000C方法从稻产生的重组 白蛋白和使用以前的方法产生的白蛋白
方法：使用实施例2中描述的方法所制备的白蛋白与使用先前用来制备Cellastim(批次B202至B217)的替代性方法(B000)所制备的白蛋白比较。
白蛋白生产(老方法，B000)：
稻粉和25mM磷酸钠，50mM氯化钠用NaOH进行pH平衡到6.5并且在室温以大约1∶10的S/L率混合20分钟。以10g/L添加助滤剂(Cellpure 300)并且通过压滤机、真空过滤或离心过滤浆液。澄清的滤液用1M乙酸进行酸沉淀至pH 5.0。所得到的溶液如上文所述在添加5g/L助滤剂(Cellpure 300)时过滤。物料立即用1M NaOH中和至pH 6.5～7.0。将物料(10kDa再生纤维素用于全部UFDF步骤)用5个等体积倍数的相同缓冲液渗滤以用于提取。将物料以60cmh加载于预平衡Q-琼脂糖凝胶柱(GE Healthcare)上以允许8g白蛋白结合/升树脂。
用5个柱体积的相同缓冲液洗涤该柱后，在一个步骤中白蛋白通过增加盐浓度至250mM NaCl而洗脱。所得到的物料对100mM磷酸钠，10mM NaCl，pH 7.0以5-7个相等体积倍数透滤。所得到的物料在用100mM磷酸钠，10mMNaCl，pH 7.0平衡的Q-琼脂糖凝胶柱上通过并且作为通流收集。随后将通流物料浓缩并且对20mM磷酸钠，10mM NaCl，pH 7.0以5个体积倍数透滤。浓缩的最终物料经无菌过滤并且在室温与10g/L去垢剂CHAPS((3-胆酰胺丙基)二甲氨基)-1-丙磺酸)孵育并混合1小时。在1小时孵育后，使物料在BioradSM-2柱上通过。物料经无菌过滤并冷冻干燥。
大小排阻层析分析
在100mM磷酸盐，pH 7.0中，在GF-250柱(Agilent Technologies)上以流速1ml/分钟用设置在214和280nm的检测器进行HPLC纯度分析。通过注射用干粉制成的5个不同稀释物，在盐和水分的校正系数为0.92的情况下形成标准曲线。来自214nm的主要峰由保留时间或可选地由基线来积分。未知样品在标准进样量范围内的浓度进样。从标准曲线计算出每个干燥粉末重量的白蛋白的未知浓度(纯度)。在常见实验中，将0、5、8、10、15和20μg的标准物进样，随后是约50μL进样量中的约10μg未知样品。在各峰积分后标准曲线的相关系数一般是0.98以上。
SDS PAGE和光密度测定法：(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)
通过稀释蛋白溶液至1-2mg/ml以使确定量的每种蛋白质能够加载于每个孔上，制备样品。将样品与含有还原剂(Invitrogen NP0004)的Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液(LC2673 Novex)1∶1混合并且加热至70℃持续5分钟。将样品上样(10、20或30μg)到Novex 4-20％预铸凝胶上并且在标准Tris-甘氨酸电泳缓冲液中以恒定电压(130V)分离。在示踪染料抵达凝胶末端时，结束电泳。分子量标记被列入第一泳道作为参考。
凝胶用G Bioscience(786-35G)染色并用水脱色。用Hewlett Packard扫描仪(G4010)获得数字图像。图像文件随后用UN-SCAN-IT(Silk Scientific Corp.)打开。用阳性图像分析在256灰阶进行光密度测定，所述256灰阶中包括作为独立区段的全部可视条带。背景噪声通过如软件中指明的四角插值法对每个区段校正。随后从像素#和平均像素强度(0-255)的乘积计算出每个区段或条带的信号。取整条泳道(全部可视区段或条带)的信号总和为100％并且扣除杂质条带以计算白蛋白纯度。计算每个条带中每种掺杂蛋白质的百分比，所述计算为将确定为杂质蛋白的肽的数目除以特定条带中识别的全部肽的总数，其中所述杂质蛋白如通过肽作图法确定。图像分析重复3次，从而标准偏差小于100％中的0.5％。
通过热原rFC法测定内毒素
内毒素含量通过热原rFC法测定。如制造商(Lonza)所述那样混合冻干的内毒素标准物与不含内毒素的水以制成标准曲线。将蛋白样品稀释为液体，或可选地，用不含内毒素的水用于重构粉末。制备不同的稀释物，使得读数应当出现在标准曲线的范围内。将样品加热至100℃10分钟以分解无用分子相互作用。在常见实验中，按100μl/孔添加样品和标准物，每孔0、0.001、0.005、0.01、0.05和0.1内毒素单位/孔。样品还以100μl添加，并且包括额外的样品，使得添加0.001-0.01内毒素单位/孔的内标到试验中以测定抑制作用或干扰作用。根据制造商(Lonza)通过以1∶4∶5比率混合rFC酶、分析缓冲液和底物分别制备工作试剂。将工作试剂以与样品或标准物相等的体积添加至各孔。荧光平板读数仪(Biotek FLX 800T)设置成在380nm激发(带宽＝20nm)，并且发射波长设置在440nm(带宽＝30nm)。在37℃时，将时间零处取得的读数从在1小时后取得的读数中减去。如果标准物的相关系数、斜率和Y-截距处于设定限值内，则将读数视为有效，并且内标实验显示内标的内毒素在设定限值内是可测量和可同收的。此外，重复样品的标准偏差应当合理地符合，从而标准偏差处于指定的主观选择的限值以内。遵照良好实验室规范，无菌收集全部样品并且验证用于测试的管/小瓶/容器具有极低内毒素，因为它们影响准确和精确的内毒素测试。
细胞生存力的确定
杂交瘤细胞系AE1(ATCC)维持在含有5％胎牛血清(FBS)的DMEM基础培养基中。白蛋白在无血清条件(AFM6，KC Bio，Kansas)下不补充胎牛血清时测试。将细胞从5％FBS至无血清培养基经多个代次继代培养。在每个继代培养，分析细胞在指定浓度的白蛋白存在下的总细胞数和生存力。(如通过胰蛋白酶消化和使用Neubauer血细胞计数器直接计数而进行评估)。细胞在标准培养条件下(5％CO2和37℃)培育大约70小时，此后测量培养物的生存力。实验重复进行两次。日期显示活细胞数目/ml除以105。
去垢剂的测定
白蛋白的去垢剂浓度由去垢剂(基于细胞的)测定法测定。简而言之，去垢剂敏感的细胞以不同量的去垢剂内标并且所得到的细胞生存力用来产生由16个独立数据点组成的标准曲线。生存力变化相对于去垢剂浓度的变化作图并且用对数函数拟合。这个等式随后用来计算在样品中未知的去垢剂浓度，其中所述样品在相同的基于细胞的实验中测试。所给出数据的标准曲线的相关系数是0.9816。一般地，大于约10ppm/Cellastim干重的去垢剂浓度导致可觉察的中毒活性。通过在10％白蛋白溶液中比较，当去垢剂浓度高于约100ppm至200ppm或0.01％至0.02％(v/v)时，去垢剂的毒性作用变得明显。
结果和讨论：
I通过大小排阻层析分析血浆衍生的血清(Sigma白蛋白)和使用实施例2的方法(Cellastim P0171)和老方法(Cellastim P0107)产生的重组HSA(Cellastim)。
3种类型白蛋白的HPLC大小排阻图谱(图1A、C和D)显示，就总纯度而言，不同白蛋白制备物一般是相似的。具体而言，在大约4.5kDa和240kDa的峰是内对照，而全部三种产物均含有在约10-12kDa处的很少量的偏主峰信号。
尽管人血清衍生的白蛋白(Sigma白蛋白)(图1A)含有约17kDa的杂质，但是使用新方法(Cellastim P0171)产生的重组稻衍生白蛋白(图1C)含有约44KDa和55kDa的两种蛋白质杂质，比在使用老方法(Cellastim P0107)(图1B)时，显著较高的水平出现在采用新方法产生的Cellastim中。这些峰没有在HPLC分离时彻底地解析，但是可以在使用图1E中所示的老方法和新方法产生的Cellastim和Sigma白蛋白(图1D)和Cellastim P0171的重叠图谱中更清晰地看出。
如下文进一步讨论的，这些峰对应的蛋白质代表约5％通过肽质量指纹分析Cellastim中的主要白蛋白峰所识别的全部杂质蛋白质，其中所述的主要白蛋白峰使用实施例2中所述方法产生。
测试的全部白蛋白产物也含有最可能代表白蛋白二聚体的约130 kDa的峰，值得注意的是，Cellastim二聚体峰明显小于血浆衍生的白蛋白。聚合白蛋白的产生是蛋白质降解的指示物，其中使用所述指示物作为工业范围降解或损失的一个标记。存在于Cellastim中的Hsp很可能促进白蛋白的解聚集，所以减少二聚体的数目，因为这是Hsp 70和其他Hsp蛋白的常见的已知功能。
II.与通过Millipore/Novozymes(目录号9301-01)产生的白蛋白相比，通过SDSPAGE分析Cellastim批次P0171(新方法)
结果：SDS-PAGE分析(图2A和B)显示，就总纯度而言，这些产物通常是相似的。图2A显示Cellastim P0171和Cellprime白蛋白(Millipore/Novozymes)的比较。泳道1是分子量标记。泳道4是Cellastim白蛋白(10μg)和泳道7是Cellprime白蛋白(10μg)。图2B显示通过SDS PAGE分析比较来自先前方法(B000)(泳道2、3和4)和新Cellastim方法(B0000C)(泳道6、7和8)的3个Cellastim批次。这六份样品以20μg/泳道上样。
凝胶的视检显示，符合更严格规定的新方法在所测试的3个批次之间更一致。(图2B，泳道2、3、4对泳道6、7、8)。与新方法相比，带型在来自先前方法的3份样品之间是显著差异的。重要的是，新方法样品比老方法样品具有显著较少的约250KDa的聚集物。(对于老方法，平均数大于2％，并且对于新方法，平均数小于1％)。下文进一步讨论在使用新方法产生的Cellastim中富集的蛋白质杂质的身份。
III.老批次和新批次Cellastim的内毒素、去垢剂和生长促进能力的分析
比较用于制备几个不同批次白蛋白的两种不同方法的性能(表E1和E2)显示，与实施例2中描述的新方法相比，老方法产生的重组白蛋白含有显著更多的内毒素和去垢剂，并且产生显著增强细胞生存力的产物。
Figure BDA00002156224600891
讨论：重新设计老方法，以建立实施例2中所述的新方法导致产物总纯度和性能的显著变化，如下文更全面地描述。
这些变化使得生产去垢剂更低、内毒素更低和纯度增加的产物成为可能。特别地，新方法经常产生总纯度大于约95％的重组白蛋白。相比之下，老方法经常产生最大纯度约90％的白蛋白。令人惊讶地，尽管产物纯度增加，但是工艺上的这些变化还导致热休克蛋白和重组白蛋白的增强的共纯化(见下文)。不受任何具体操作理论约束，可以认为高白蛋白纯度、相对缺少的内毒素和/或去垢剂、和热休克蛋白共纯化的组合产生了显著优于用于制备白蛋白的先前方法的产物。
具体而言，表E1和E2表明，用于产生Cellastim的新方法产生了例如在5mg/ml时导致平均批次间100％改善细胞生存力(在5mg/ml)的产物，并且与老方法相比，还产生内毒素平均少100倍和去垢剂平均少100-100倍的产物。
实施例4分析对细胞生长和生存力的影响
为了与其他市售白蛋白产品比较本发明补充物的细胞生长促进能力，在细胞生长和生存力测定法中这些不同来源的白蛋白它们一起进行比较。测试的3种产品是(Cellastim，批号#P0153)、Cellprime白蛋白(Millipore/Novozymes目录号#9301-01)和血浆衍生白蛋白(Seracare目录号#HS-400-60)。
方法：用DF12/ITSE洗涤2次以除去残余培养基后，将专门条件化的杂交瘤细胞AE1以密度0.5x 105个细胞/ml培养基接种在相同的培养基中。培养基和细胞随后不作处理(阴性对照)、以图注中所示的浓度用Seracare白蛋白处理、用Cellprime白蛋白处理并且用Cellastim处理。细胞在标准培养条件下(5％CO2和37℃)培育大约70小时，此后测量培养物的生存力。实验重复进行两次。结果在图3中显示。
结果：Novazyme的Cellprime引起生存力的丧失(交叉线条)。Seracare白蛋白(白色条)导致可测量的生存力增加，但是其增加不如随包含重组白蛋白连同稻hsp的本发明补充物所见到(黑色条)那样大。在这些条件下，在测试的任何浓度，Cellastim作为活性在促进细胞生存力方面是任何其他白蛋白产品的大约5倍。阴性对照由斜纹条代表。
讨论：假定这种可能性：其他市售白蛋白产品可以具有与Cellastim相似的总纯度、内毒素和去垢剂水平，则与其他市售白蛋白相比，本发明重组白蛋白的显著优越性能表明，与血清衍生的白蛋白相比，在Cellastim中识别出的先前未识别的蛋白质杂质(实施例2)可能对细胞生存力具有积极影响。为识别并随后表征这些蛋白质对Cellastim性能的影响，如下文描述，对重组白蛋白样品进行肽质量指纹图谱分析。
实施例5 重组人血清白蛋白的肽质量指纹图谱分析
方法：分析白蛋白样品以使用NanoL CMS/MS肽测序系统(ProtTech，Inc.)和基于肽片段的分子量识别蛋白质的专有软件而测定值得注意的蛋白质杂质。简言之，通过SDS-PAGE分析白蛋白的样品，并且将每条主要凝胶条带脱色、清洁和用测序级改良胰蛋白酶进行凝胶内消化。通过LC-MS/MS系统分析所得到的肽混合物，在所述LC-MS/MS系统中，使用与离子阱质谱仪串接偶联的具有75微米内径反相C18柱的高压液相色谱(HPLC)。采用ProtTech专利软件套件，使用获得的质谱数据检索最新非冗余蛋白质数据库。在报告之前，手动验证来自数据库检索的输出。
结果：当测试3个代表性批次的重组白蛋白时，通过肽质量指纹图谱分析识别出3种Hsp70蛋白(表E3)。识别的这3个具体序列：ABF95267、ABA97211和BAD 07938与非冗余数据库比较，以识别高度相关和同源的蛋白质。来自这些比较中每一个的最佳命中结果示于表E4、E5和E6中。
Figure BDA00002156224600921
Figure BDA00002156224600931
下表E4中显示在
Figure BDA00002156224600932
中蛋白序列的非冗余数据库(Nucleic AcidsRes，2008年1月；36(Database issue)：D25-30)内针对ABF95267序列的序列比较结果。
Figure BDA00002156224600933
Figure BDA00002156224600941
下表E5中显示在
Figure BDA00002156224600942
中蛋白序列的非冗余数据库内针对ABB63469序列的序列比较结果。
Figure BDA00002156224600951
下表E6中显示在
Figure BDA00002156224600961
中蛋白序列的非冗余数据库内针对序列ABA97211的序列比较结果。
Figure BDA00002156224600962
讨论：肽质量指纹分析识别出与白蛋白共纯化的3种稻热休克蛋白超家族成员、2种稻HSP70基因、(gb|ACJ54890.1|)、EEC69073和AAB63469-来自稻胚乳组织的BiP同源物(胚乳管腔结合蛋白)。下文列出由这些基因编码的完整氨基酸序列：
基因gb|ACJ54890.1|热休克蛋白70[水稻粳组]。发现HSP70在重组白蛋白中在Cellastim中以大约0.07％wt/wt出现。下面提供其完整氨基酸编码序列：
1   magnkgegpa igidlgttys cvgvwqhdrv eiiandqgnr ttpsyvaftd terligdaak
61   nqvamnptnt vfdakrligr rfsdpsvqad mkmwpfkvvp gpadkpmivv tykgeekkfs
121  aeeissmvlt kmkeiaeafl sttiknavit vpayfndsqr qatkdagvis glnvmriine
181  ptaaaiaygl dkkaastgek nvlifdlggg tfdvsiltie egifevkata gdthlggedf
241  dnrmvnhfvq efkrkhkkdi tgnpralrrl rtacerakrt lsstaqttie ieslyegidf
301  yatitrarfe elnmdlfrrc mepvekclrd akmdkaqihdvvlvggstri pkvqqllqdf
361  fngkelcksi npdeavayga avqaailsge gnqrvqdlll ldvtplslgl etaggvmtvl
421  iprnttiptk keqvfstysd nqpgvliqvy egertrtkdn nllgkfeltg ippaprgvpq
481  invtfdidan gilnvsaedk ttgkknkiti tndkgrlske eiermvqeae kykaedeqvr
541  hkvearnale nyaynmrntv rdekiasklp addkkkieda iedaikwldg nqlaeadefe
601  dkmkeleslc npiiskmyqg gaggpagmde dapngsagtg ggsgagpkie evd
(SEQ ID.NO.12)
来自稻胚乳组织的AAB63469 BiP同源物(胚乳管腔结合蛋白[稻])。发现BiP在重组白蛋白中在Cellastim中以约0.09％wt/wt出现。下面提供其完整氨基酸编码序列：
1   mdrvrgsafl lgvllagslf afsvakeetk klgtvigidl gttyscvgvy knghveiian
61   dqgnritpsw vaftdserli geaaknqaav npertifdvk rdigrkfeek evqrdmklvp
121  ykivnkigkp yiqvkikdge nkvfspeevs amilgkmket aeaylgkkin davvtvpayf
181  ndaqrqatkd agviaglnva riineptaaa iaygldkkgg eknilvfdlg ggtfdvsilt
241  idngvfevla tngdthlgge dfdqrimeyf iklikkkysk diskdnralg klrreaerak
301  ralsnqhqvr veieslfdgt dfsepltrar feelnndlfr ktmgpvkkam ddagleksqi
361  heivlvggst ripkvqqllr dyfegkepnk gvnpdeavay gaavqgsils geggdetkdi
421  llldvapltl gietvggvmt kliprntvip tkksqvftty qdqqttvsiq vfegersmtk
481  dcrllgkfdl sgipaaprgt pqievtfevd angilnvkae dkgtgkseki tithekgrls
541  qeeidrmvre aeefaeedkk vkeridarnq letyvynmkn tvgdkdklad kleseekekv
601  eealkealew ldenqtaeke eyeeklkeve avcnpiisav yqrtggapgg rrrgrlddeh
661  del
(SEQ ID.NO.13)
EEC69073/OsI_37938[籼稻组]。发现基质HSP70在重组白蛋白中在Cellastim中以约0.06％wt/wt出现。下面提供其完整氨基酸编码序列：
1    masftsqlga macgaapsts plaarrsgql fvgrkpaaas vqmrvpragr argvamrvac
61   ekvvgidlgt tnsavaameg gkptvitnae gqrttpsvva ytkggerlvg qiakrqavvn
121  pentffsvkr figrkmaevd deakqvsyhv vrddngnvkl dcpaigkqfa aeeisaqvlr
181  klvddaskfl ndkitkavvt vpayfndsqr tatkdagria glevlriine ptaaslaygf
241  ekknnetilv fdlgggtfdv svlevgdgvf evlstsgdth lggddfdkfy fcwvfyfgam
301  thetpkvvdw lasnfkkdeg idllkdkqal qrlteaaeka kmelstlsqt nislpfitat
361  adgpkhiett lsrakfeelc sdlidrlktp vtnalrdakl svdnldevil vggstripsv
421  qelvkkitgk dpnvtvnpde vvslgaavqg gvlagdvkdv vlldvtplsl gletlggvmt
481  kiiprnttlp tsksevfsta adgqtsvein vlqgerefvr dnkslgsfrl dgippaprgv
541  pqievkfdid angilsvaai dkgtgkkqdi titgastlpk devermveea dkfaqedkek
601  rdaidtknqa dsvvyqtekq lkelgdkvpa pvkekvdakl nelkeaiagg stqsmkdama
661  alneevmqig qamynqqpna gaagptpgad agptssggkg pndgdvidad ftdsn
(SEQ ID.NO.14)
因为这些蛋白质在新批次的Cellastim中相对于白蛋白仅以低水平出现，所以为了证实这些杂质实际上负责新批次Cellastim的优越生长促进作用的先决条件是，确定将这些组分添加同至白蛋白是否恢复或增强白蛋白的生长促进活性，这对比于实际上针对Cellastim中每种组分所识别的那些水平。
实施例6.通过亲和层析从重组白蛋白分离热休克蛋白
方法：使用新方法产生的Cellastim[批号P0153、P0156和或P0171]粉末以大约20g/L与纯水混合。所得到的溶液针对50mM Tris/Cl，pH 7.0以至少5个相等体积的缓冲液透滤。所得到的溶液通过ATP琼脂糖柱，并且将所得到的通流标记为级分A。该柱用5个柱体积的平衡缓冲液洗涤，然后将与ATP-琼脂糖结合的物质用50mM Tris/Cl，1M KCl，pH7.0洗脱。将洗脱的物质标记为级分B。将洗液作为级分C保存。将级分A直接浓缩至100g/L并且用d-PBS透滤。将级分B在50mM Tris/Cl中明显浓缩直至20倍或100倍用于进一步分析。将洗液级分C保留用于进一步参考。对于蛋白质印迹法，将10μg每种蛋白质级分(通过A280，其中白蛋白的e.c.(消光系数)是0.53cm2/mg并且Hsp70的e.c.是0.41cm2/mg)加载到在2×SDS上样缓冲液中的4-20％SDSPAGE凝胶上。上样之前，将样品加热至80℃大约5分钟。分离在200V(恒定电压)进行并且运行大约90分钟。所得到的凝胶在水中冲洗30分钟至2小时，并且随后将蛋白质转移至30mA(恒流)的硝酸纤维素膜持续2小时。所得到的印迹物含有分子量标记蛋白作为转移对照并且随后在5％(w/v)乳粉的水中封闭。将第一单克隆抗体(小鼠抗牛Hsp70(Sigma/Aldrich #H5147))在5％乳溶液中添加至印迹物(1∶2500)，并且将印迹物于4℃在摇床上孵育过夜，伴以温和振摇。随后将印迹物在TDN中洗涤4次每次10分钟，并且将5％乳溶液中的第二抗体(HRP缀合的Pierce抗小鼠)以1∶2500稀释度添加。在4℃孵育2至3小时后，将印迹物用TDN洗涤4次每次10分钟。所得到的印迹物随后与pico(Pierce)化学发光底物孵育5分钟。Kodak照相胶片在暗室中曝光印迹物，并且将后续胶片显影、漂洗、定影、漂洗和干燥。为确定分子量标记位置精确转印到胶片上，使用光发射标记物。
结果：结果在图4中显示。拍摄的蛋白质印迹物显示，这种分离方案产生在级分A(通流)和级分B(ATP结合)中的两个蛋白质群体。测试起始物料(泳道2)、级分A通流(泳道3)、级分C洗液(泳道4)和级分B(泳道5)与单克隆抗体反应的能力。此外，将市售Hsp70蛋白作为阳性对照加载于最末泳道(泳道10)中。如图4中的印迹物中所示，通流级分A(泳道3不含有显著量的Hsp70。洗脱并浓缩的级分B(泳道4)与抗体高度反应，如印迹物中所示，并且显示至少两种不同条带围绕着75kDa分子量标记。洗液级分C(泳道5)显示存在有略低于75kDa运行的两个条带。在单独的独立实验中，通流级分A(泳道7)再次不与抗体反应，并且洗液级分C(泳道8)也不与抗体反应，但是在泳道9中所示的ATP结合蛋白(级分B)内富集的级分产生如从第一次分离中所见相同的带型。
讨论：开发一种分离方案以基于HSP70蛋白结合到ATP琼脂糖亲和树脂的能力以分离HSP70蛋白，并且测试其有效性。这种方法仅包括最少样品操作(仅使用ATP琼脂糖)，和浓缩并引起缓冲液变化的超滤，以及检测hsp存在的抗hsp70抗体。该方法的结果(图4)清楚地显示，在10μg起始物料、10μg通流或10μg洗液级分中，存在不足以由抗Hsp抗体检测的hsp70。相反，在从ATP琼脂糖柱洗脱的级分中，含有由抗Hsp70抗体明确识别的至少两种蛋白质。所以结果显示，这种分离方案对于两个独立层析运行和透滤是成功的和可预测的。另外，数据证实了由肽质量指纹图谱作出的热休克蛋白的识别结果并且表明这些蛋白质是有功能的并且可以通过简单的ATP琼脂糖层析随后透滤而轻易地分离和富集。得出结论是热休克蛋白与重组白蛋白共纯化。此类共纯化与以下假设一致：热休克蛋白与白蛋白结合并且白蛋白在使热休克蛋白稳定处于稳定构象中起作用。令人惊讶地，重组白蛋白/热休克蛋白复合物保留明显的ATP酶活性(数据未显示)，这与功能性热休克蛋白的存在一致。随着提供如下文所述的生长促进作用，这种增加的活性得到进一步证实。
实施例7.从Cellastim移除Hsps对细胞生存力的影响
方法：实施例6中描述的分离方案还用来产生适于细胞培养测试级分A(图5)。该方法包括级分A的最少操作，因为它流过ATP琼脂糖柱并且随后由透滤浓缩，然后用适于细胞培养物的PBS缓冲。本方法的意图不在于将新变量引入实验中以便观察到生存力的丧失，而是由于去除ATP结合蛋白之外的一些其他理由或原因。将级分A针对纯正对照(起始物料)测试促进杂交瘤细胞培养物生存力的能力。图5中显示试验的结果。
结果：如图5中所示，Cellastim起始物料(交叉阴影线)和部分A(实线)以相同的浓度进行测试并且与阴性对照(条纹线)。在测试的全部4个浓度均可观察到统计上显著减少。这个结果显示在ATP琼脂糖处理后Cellastim性能有重大损失。与移除ATP结合蛋白之前的Cellastim相比，这种处理导致28.0、21.7、26.7和79.5％的损失。在这个实验中，在样品的设计和处理时谨慎从事以确保性能因样品处理的任何不经意损失或新杂质的意外导入而最小化。
讨论：细胞培养结果(图5)表明，单纯使Cellastim在ATP结合柱上经过而降低Cellastim的性能是可能的。与实施例5中所示的结果合并时，这份数据表明，通过ATP琼脂糖柱从白蛋白中损耗hsp直接降低白蛋白的细胞生长促进作用。这个结果因此表明白蛋白的优越性能源产生于，至少部分的，白蛋白中的掺杂性热休克蛋白。
实施例8分析了振荡培养时细胞生长和生存力的影响
在细胞以高密度在摇瓶和生物反应器中培育时，为确定本发明的补充物对细胞生长和生存力的影响，直接比较一系列研究。
方法：在研究之前，使表达人源化单克隆抗体的CHO K1细胞适应于含有10mg/L胰岛素的无血清基础培养基(SFM4CHO，Thermo ScientificHyclone)6周。适应的细胞在用于储存的摇瓶中培育。将细胞储存并在由含有DMSO 8％v/v的生长培养基组成的冷冻保存培养基中贮藏于液氮中。
在摇瓶实验中，细胞以3.0×105个活细胞/ml的浓度接种在基础培养基中或在含有补充物的培养基中，即125ml/摇瓶Corning#431405中的30ml培养基。将细胞在37℃在110转/分钟的增湿的CO2培养箱中维持整个运行阶段。补料分批生物反应器实验在1L或2LApplikon生物反应器(ApplikonBiotechnology，NE)中的基础培养基中或在具有补充物的基础培养基内实施。细胞在第0日以3.0×105个活细胞/ml接种。生物反应器的温度、pH和溶解氧(DO)由自动化控制器监测和控制。反应器温度由加热毯维持在37℃。通过添加CO2或6％Na2CO3维持培养pH在7.1。通气经圆柱状烧结喷雾器以10ml/分钟进行。通过间歇喷射O2到培养基中，将溶解氧控制在50％空气饱和。叶轮的搅拌速率维持在180转/分钟。
在培育期间，定期取出生物反应器样品用于离线分析。通过0.4％台盼蓝的膜排斥法和Beckman ViCell细胞计数器计数细胞来测量活细胞密度(VCD)和细胞生存力。在一些情况下，通过细胞生存力用模具的排除、Viacount试剂(Millipore)，随后在Guava PCA细胞计数器上如制造商所指导那样分析，测量活细胞密度和细胞生存力。使用标准临床分析，用Nova 400Bioprofile分析仪测量葡萄糖浓度和乳酸浓度。比净生长速率和比净死亡速率根据Gaudy等人(Guady，AF，A.Obaysahi和E.T.Gaudy.1971.Applied Microbiology，22(6)：第1041-1047页)来测定。通过抗人IgG ELISA，根据制造商的指导(BethylLaboratories)测定抗体浓度。培养基补充物包含重组人白蛋白(如上文实施例2所述的Cellastim)或重组人乳铁蛋白(rLF，Lacromin(L))或两种蛋白质的组合。除非另外说明，否则补充物在第0日在细胞接种时添加。在摇瓶和生物反应器系统中在上述相同参数下实施多个实验，除非指明。
结果：图6A显示在摇瓶中在补充的基础培养基内或在未补充(对照)的基础培养基内培育细胞的活细胞密度VCD。在这个实验中，细胞以3.0×105个活细胞/ml的浓度接种在基础培养基中或在含有补充物的培养基中，125ml/摇瓶(Corning#431405)中的30ml培养基。将细胞在37℃在110转/分钟的增湿的CO2培养箱中维持整个运行阶段，并且从第0日在所示浓度的Cellastim或Cellastim和乳铁蛋白的1∶1混合物存在或不存在下培育。本图显示，细胞生长至较高的密度并且与未补充的培养基相比，在具有本发明补充物的培养基中以较高密度保持。令人惊讶地，在这个实验中，生存力在250mg/ml浓度的Cellastim良好维持，在500mg/ml Cellastim时也是如此。图6B显示摇瓶中存在的活细胞的百分比(％生存力)。数据显示当补充物在培养基中存在时，细胞维持较高的生存力。因而，与缺少补充物而培育的对照细胞相比，本发明的补充物在整个实验期间增加细胞的绝对活细胞密度和生存力百分比。图7A显示在摇瓶中补充和未补充(对照)的培养基内处于生长曲线不同时期的细胞的比生长速率。注意，补充的细胞从第0-8日自始至终维持正生长速率，而未补充的培养物中的比净生长速率在第5-8日显著下降。图7B显示在生长曲线的3个时期中细胞的比净死亡速率。注意，在未补充的培养基中培育的细胞在第5-8日期间达到最大峰死亡。与未补充的对照孵育相比，在具有补充物的培养基中培育的细胞稍后在第9-10日达到最大峰死亡。
实施例9.补充物补送对细胞生存力和密度及产物生产的影响
方法：细胞以3.0×105个活细胞/ml的浓度接种在基础培养基中或在含有补充物的培养基中，125ml/摇瓶(Corning#431405)中的30ml培养基。将细胞在37℃在110转/分钟的增湿的CO2培养箱中维持整个运行阶段，并且在所示浓度的Cellastim或Cellastim和乳铁蛋白的1∶1混合物存在或不存在下培育。在这个实验中，根据制造商的说明书，在第0日添加补充物并且在第4日添加营养强化物(补料)(Efficient Feed A，Invitrogen)。
结果：图8A中显示在第4日用营养补料强化时CHO-K1在摇瓶中未补充和补充的培养基中的生长曲线。该图显示，与未补充的对照相比，在具有补充物的培养基中培育16日，细胞达到较高的细胞密度。图8B显示在第4日以营养进料强化时与未补充的对照相比，摇瓶中存在的活细胞的百分比(生存力％)。数据显示当本发明的补充物存在于用作第4日添加的营养进料的培养基中时，细胞维持较高的生存力。图9A显示在摇瓶研究中与未补充的对照摇瓶相比，在补充(在第4日用营养进料强化)的摇瓶内处于生长曲线不同时期的细胞的比生长速率。注意，补充的细胞从第0-8日自始至终维持正生长速率。图9B显示在生长曲线的4个不同时期(在第4日用营养进料强化)中细胞的比净死亡速率。注意，在补充的培养基中培育的细胞在第12-16日表现出较小的细胞死亡。图9C显示由CHO K1产生的抗体产物的浓度，所述CHO K1在摇瓶中补充的培养基和未补充的对照培养基内培育。培养基中的单克隆抗体(MAb)浓度在补充的培养基内更高。根据他们的方法(Bethyl实验室)，通过抗人IgG ELISA测定由细胞产生并分泌至培养基中的抗体的浓度。
实施例10保护免受不良事件影响
方法：细胞以3.0×105个活细胞/ml的浓度接种在基础培养基中或在含有补充物的培养基中，125ml/摇瓶(Corning#431405)中的30ml培养基。将细胞在37℃在110转/分钟的增湿的CO2培养箱中维持整个运行阶段，并且在所示浓度的Cellastim或Cellastim和乳铁蛋白的1∶1混合物存在或不存在下培育。在这个实验中，在生物反应器加载有细胞期间，一个不明事件造成细胞死亡。
结果：图10A和10B显示在生物反应器运行期间，补充物保护细胞免受不良事件影响。在补充的培养基中培育的CHO K1细胞幸免于不良事件并且生长至高密度(图10A)然后达到高生存力(图10B)。在未补充的对照培养基中培育的细胞不生长。
实施例11在生物反应器中双重营养进料情况下补充物的活性
当细胞在未补充的对照培养基中培育时，与补充有250mg/L Cellastim的培养基相比，还在生物反应器中实施一系列实验(Exp 4)以比较细胞生长和生物反应器性能。
方法如上文所述，补料分批生物反应器实验在1L或2LApplikon生物反应器(Applikon Biotechnology，NE)中的基础培养基中或在具有补充物的基础培养基内实施。培养物在第3日和第7日用营养进料如制造商所指示(EfficientFeed A，Invitrogen)那样强化。因而，这些数据显示与双重强化进料策略组合的补充物的效果。此外，pH随第一个营养进料从7.2降至6.8。
结果：在补充的培养基中培育的细胞比在未补充的培养基中培育的细胞生长至更高的最大细胞密度(图11A)。与对照培养基中的800万个活细胞/ml相比，细胞在补充的情况下达到1100万个活细胞/ml的密度。计算生长曲线不同时期的比生长速率。如11B图中所示，补充物在预进料期间第0-3日增加生长速率最多。图12A和12B显示在第3日和第7日使用双重营养强化时，在具有补充的培养基和未补充的培养基的生物反应器中培育的CHO K1细胞的活细胞百分比和死亡专率。在补充的培养基中培育的大部分细胞在13日期间维持高生存力，尽管细胞密度较高。死亡专速率也在13日期间自始至终是相似的，尽管细胞密度较高。图13A和13B显示CHO K1的pH趋势和重量摩尔渗透压浓度趋势，所述CHO K1在使用补充和未补充的培养基的生物反应器中培育。细胞在第3日补料，在此时间，pH从7.10降至6.8。pH在第7日随第二次补料维持在6.8。图13A显示补充物没有不利地影响生物反应器内部pH的调节并且维持pH控制。图13B显示在补充和未补充的培养基内培育的细胞的重量摩尔渗透压浓度趋势。补充的培养基的重量摩尔渗透压浓度低于未补充的培养基并且更接近于正常重量摩尔渗透压浓度300。这份数据显示补充物有利地导致较低的重量摩尔渗透压浓度。图14A和B显示在生物反应器中在补充和未补充的培养基内培育(在第3日和第7日营养进料)的CHO K1的葡萄糖和乳酸趋势。葡萄糖水平在补充和未补充的培养基中是相似的。然而，乳酸的水平有利地在具有补充物的培养基中较低。图15A和B显示在第3日和第7日具有营养进料的生物反应器中补充和未补充的培养基内培育的CHO K1细胞的比葡萄糖消耗量和比乳酸消耗量。数据显示，细胞在补充的培养基中有利地消耗更少的葡萄糖。数据还显示，细胞在补充的培养基中有利地产生更少的乳酸。图16A和B显示CHO K1细胞中所产生抗体的浓度和抗体的比生产率，所述CHO K1细胞在第3日和第7日具有营养进料的生物反应器中补充和未补充的培养基内培育。在补充的培养基中培育细胞时，所产生抗体的浓度显著较高。在补充和未补充的培养基中培育细胞时，抗体的比生产量是相似的。
实施例12在接种时添加补充物或采用营养进料的比较(EXP4摇瓶研究)
方法：CHO K1细胞以3.0×105个活细胞/ml接种至如上文所述的培养基中，125ml摇瓶中30ml培养基。在这些实验中，如制造商所指示，细胞在第3日和第7日用营养进料(Efficient Feed A，Invitrogen，按照制造商的指示)补料。补充物在第0日随细胞接种物一起添加或在第3日上随第一营养进料添加。
结果：数据(未显示)表明，无论补充物在第0日添加还是在第3日添加，葡萄糖水平、重量摩尔渗透压浓度、pH、乳酸水平或生产量、葡萄糖水平或葡萄糖消耗量几乎不存在差异。然而，在补充物随接种物一起添加时，在后期阶段的开始(第11日)，存在生产率的适度改善。表E7显示当在第0日添加补充物或在第3日随进料添加补充物时，由CHO K1所产生产物的改善百分比。与无补充物相比，更多的抗体随补充物产生，并且与补充物随进料一起添加相比，随细胞接种物一起添加补充物产生更多产物。
Figure BDA00002156224601061
表E8显示在摇瓶和生物反应器培养系统中的多个实验内，随补充的培养基一起看见的改善百分比。
实施例13Cellastim和Lacromin对下游抗体纯化的影响
以下数据显示，作为培养基补充物使用时，Cellastim和重组人乳铁蛋白(Lacromin)对从细胞上清液回收的抗体的产率和总纯度具有积极影响。
方法：在如上文所述的具有补充物或没有补充物的培养基中培育针对白介素8(a-IL*)产生抗体的CHO K1细胞。对照培养物使用未补充的培养基。细胞在具有3种补充物之任一种的培养基中培育：1)250mg/L Cellastim；2)500mg/L Cellastim；或3)125mg/L Cellastim和125mg/L乳铁蛋白(Lacromin)。
如图17A中示意性显示，当细胞生存力达到80-50％时，在批次结束时从细胞收获培养基。首先通过离心和经0.2微米过滤器微过滤，从收获的细胞培养液去除颗粒状细胞碎片。滤液(上清液)在两个尺寸的蛋白A柱的任一种上加工：GE-
Figure BDA00002156224601072
(带有1ml蛋白A层析柱的小规模亲和层析系统(GEHealthcare HiTrapTM MabSelectTM SuRe)用于AKTA试验前/后样品测试或GE-
Figure BDA00002156224601073
(带有100ml蛋白A层析柱的亲和层析系统(GE HealthcareXK50MABSELECTTM SuRe)。在图17B中显示洗脱图的结果。
在蛋白A层析后，通过透滤，使用带有10kD GE KVICKTM Start聚醚砜膜的错流装置如制造商所述那样浓缩洗脱的抗体。在纯化后，通过SDS-PAGE分析抗体以检测杂质，然后使用考马斯蓝染色法和银染法检测靶蛋白的存在。
结果：图18显示采用考马斯蓝染色法的多个级分的SDS-PAGE分析，其显示抗体的纯化和通过蛋白A层析成功移除培养基补充物。图19显示采用银染法的多个级分的SDS-PAGE分析，其显示抗体的纯化和通过蛋白A层析成功移除培养基补充物。在补充物的全部情况下，增强了抗体的纯化。这些凝胶清楚地确定，本发明补充物的使用导致i)产物的更高产率，ii)以正确折叠形式而富集的产物；特别是正确装配的多聚体抗体重链和轻链，iii)纯度更高的产物，iv)较少受其他内源性细胞蛋白污染的产物和iv)与没有本发明补充物而产生的产物批次相比，较少受细胞蛋白酶降解的产物。另外，如下表E9中所示，用培养基中的补充物也改善了从收获的培养基中回收抗体。
Figure BDA00002156224601081
这些数据显示，补充物可以按不同的浓度并与不同的培养基组合物组合后使用，并且可以对回收具有积极影响--在蛋白A层析后没有不利地影响产物回收的纯度。重要地，这个实施例表明，本发明的补充物提供了用于纯化过程期间改善产物回收的优越方法和改进的产物纯化，同时产物在纯化的每个步骤期间含较少的污染性细胞蛋白。与没有本发明的补充物而产生的产物相比，此类产物预计显示出改善的生物活性、稳定性并且具有较小免疫原性和异体性。

Claims (72)

1.一种用于增强培养细胞的细胞生长的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至细胞培养基；
其中所述重组白蛋白在植物中产生；
其中所述补充物具有小于约1EU内毒素/mg白蛋白；并且
其中所述白蛋白包含小于约2％的聚合白蛋白。
2.一种用于增强已经适应于无血清培养基的细胞的生产率的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至无血清培养基；
其中所述重组白蛋白在植物中产生；
其中所述补充物具有小于约1EU内毒素/mg白蛋白；并且
其中所述白蛋白包含小于约2％的聚合白蛋白。
3.一种用于减少生物反应器中乳酸积累的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至生物反应器中的培养细胞；
其中所述重组白蛋白在植物中产生；
其中所述补充物具有小于约1EU内毒素/mg白蛋白；并且
其中所述白蛋白包含小于约2％的聚合白蛋白。
4.一种用于减少生物反应器中葡萄糖和其他糖消耗的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至生物反应器中的培养细胞；
其中所述重组白蛋白在植物中产生；
其中所述补充物具有小于约1EU内毒素/mg白蛋白；并且
其中所述白蛋白包含小于约2％的聚合白蛋白。
5.一种用于减少在生物反应器中从开始培养到收获以产生蛋白质所需时间的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至生物反应器中的培养细胞；
其中所述重组白蛋白在植物中产生；
其中所述补充物具有小于约1EU内毒素/mg白蛋白；并且
其中所述白蛋白包含小于约2％的聚合白蛋白。
6.一种用于改善生物反应器中细胞生存力的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至生物反应器；
其中所述重组白蛋白在植物中产生；
其中所述补充物具有小于约1EU内毒素/mg白蛋白；并且
其中所述白蛋白包含小于约2％的聚合白蛋白。
7.一种用于改善在无血清条件下培养细胞的生存力的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至无血清培养基；
其中所述重组白蛋白在植物中产生；
其中所述补充物具有小于约1EU内毒素/mg白蛋白；并且
其中所述白蛋白包含小于约2％的聚合白蛋白。
8.一种用于改善细胞以低密度铺种时的生存力的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至细胞培养基；
其中所述重组白蛋白在植物中产生；
其中所述补充物具有小于约1EU内毒素/mg白蛋白；并且
其中所述白蛋白包含小于约2％的聚合白蛋白。
9.一种用于改善从单一细胞克隆培育而来的细胞的生存力的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至细胞培养基；
其中所述重组白蛋白在植物中产生；
其中所述补充物具有小于约1EU内毒素/mg白蛋白；并且
其中所述白蛋白包含小于约2％的聚合白蛋白。
10.一种用于改善在培养下培育的原代细胞的生存力的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至培养基；
其中所述重组白蛋白在植物中产生；
其中所述补充物具有小于约1EU内毒素/mg白蛋白；并且
其中所述白蛋白包含小于约2％的聚合白蛋白。
11.一种用于改善转染后细胞的生存力的方法，包括在转染之前、期间或紧随之后添加包含重组白蛋白的补充物至细胞培养基；
其中所述重组白蛋白在植物中产生；
其中所述补充物具有小于约1EU内毒素/mg白蛋白；并且
其中所述白蛋白包含小于约2％的聚合白蛋白。
12.一种用于改善冷冻保存后的细胞的生存力的方法，包括在冷冻保存或解冻之前、期间或紧随之后添加包含重组白蛋白的补充物至细胞培养基；其中所述重组白蛋白在植物中产生；
其中所述补充物具有小于约1EU内毒素/mg白蛋白；并且
其中所述白蛋白包含小于约2％的聚合白蛋白。
13.一种用于改善从培养细胞产生的重组产物的产率的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至培养物；
其中所述重组白蛋白在植物中产生；
其中所述补充物具有小于约1EU内毒素/mg白蛋白；并且
其中所述白蛋白包含小于约2％的聚合白蛋白。
14.一种用于改善从培养细胞产生的重组产物的纯化的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至培养物；
其中所述重组白蛋白在植物中产生；
其中所述补充物具有小于约1EU内毒素/mg白蛋白；并且
其中所述白蛋白包含小于约2％的聚合白蛋白。
15.一种用于减少从培养细胞产生的重组产物的蛋白水解的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至培养物；
其中所述重组白蛋白在植物中产生；
其中所述补充物具有小于约1EU内毒素/mg白蛋白；并且
其中所述白蛋白包含小于约2％的聚合白蛋白。
16.一种用于改善从培养细胞产生的重组产物的生物活性的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至培养物；
其中所述重组白蛋白在植物中产生；
其中所述补充物具有小于约1EU内毒素/mg白蛋白；并且
其中所述白蛋白包含小于约2％的聚合白蛋白。
17.一种用于改善从培养细胞产生的重组产物的稳定性的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至培养物；
其中所述重组白蛋白在植物中产生；
其中所述补充物具有小于约1EU内毒素/mg白蛋白；并且
其中所述白蛋白包含小于约2％的聚合白蛋白。
18.一种用于改善从培养细胞产生的重组产物的装配的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至培养物；
其中所述重组白蛋白在植物中产生；
其中所述补充物具有小于约1EU内毒素/mg白蛋白；并且
其中所述白蛋白包含小于约2％的聚合白蛋白。
19.一种用于产生从培养细胞产生的重组产物的更人性化的糖基化模式的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至培养物；
其中所述重组白蛋白在植物中产生；
其中所述补充物具有小于约1EU内毒素/mg白蛋白；并且
其中所述白蛋白包含小于约2％的聚合白蛋白。
20.一种用于从培养细胞产生具有更小免疫原性的重组产物的方法，包括添加包含重组白蛋白的补充物至培养物；
其中所述重组白蛋白在植物中产生；
其中所述补充物具有小于约1EU内毒素/mg白蛋白；并且
其中所述白蛋白包含小于约2％的聚合白蛋白。
21.根据权利要求13至20中任一项所述的方法，其中培养细胞的生存力增加。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述细胞是组织培养细胞。
23.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述细胞是CHO细胞。
24.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述细胞是杂交瘤细胞。
25.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述细胞是vero细胞。
26.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述细胞由流式细胞术分选。
27.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述细胞是原代细胞。
28.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述原代细胞是干细胞。
29.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述原代细胞是B细胞衍生的。
30.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述原代细胞是T细胞衍生的。
31.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述细胞是B细胞或是B细胞衍生的。
32.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述细胞是T细胞或是T细胞衍生的。
33.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述细胞由流式细胞术分离。
34.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述细胞由微流体装置分离。
35.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述细胞由单细胞亚克隆法分离。
36.根据权利要求13至21中任一项所述的方法，其中所述产物是蛋白质、疫苗、细胞结合的细菌或病毒。
37.根据权利要求13至21、4中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是抗体。
38.根据权利要求13至21中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是重组蛋白。
39.根据权利要求13至21中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是单体。
40.根据权利要求13至21中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是多聚体蛋白。
41.根据权利要求37所述的方法，其中所述抗体是全长的。
42.根据权利要求37所述的方法，其中所述抗体是单链抗体。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的方法，其中所述补充物包含至少约0.01％wt/wt的热休克蛋白。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述热休克蛋白是稻热休克蛋白。
45.根据权利要求43所述的方法，其中所述热休克蛋白选自稻HSP70基因和稻胚乳管腔结合蛋白。
46.根据权利要求43所述的方法，其中所述热休克蛋白选自稻(gb|ACJ54890.1|)、EEC69073/OsI_37938和AAB63469。
47.根据权利要求43所述的方法，其中所述补充物包含至少约0.01％wt/wt的HSP70。
48.根据权利要求43所述的方法，其中所述补充物包含至少约0.04％wt/wt的HSP70。
49.根据权利要求43所述的方法，其中所述补充物包含至少约0.06％wt/wt的HSP70。
50.根据权利要求43所述的方法，其中所述补充物包含至少约0.08％wt/wt的HSP70。
51.根据权利要求43所述的方法，其中所述补充物包含至少约0.1％wt/wt的HSP70。
52.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中将所述重组白蛋白添加至约100mg/L和约200mg/L之间的终浓度。
53.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中将所述重组白蛋白添加至约200mg/L和约400mg/L之间的终浓度。
54.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中将所述重组白蛋白添加至约400mg/L和约600mg/L之间的终浓度。
55.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中将所述重组白蛋白添加至约600mg/L和约800mg/L之间的终浓度。
56.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中将所述重组白蛋白添加至约800mg/L和约1000mg/L之间的终浓度。
57.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中将所述重组白蛋白添加至约1000mg/L和约2000mg/L之间的终浓度。
58.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中将所述重组白蛋白添加至约2000mg/L和约5000mg/L之间的终浓度。
59.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中将所述重组白蛋白添加至约5000mg/L和约10000mg/L之间的终浓度。
60.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中将所述重组白蛋白添加至约10000mg/L和约20000mg/L之间的终浓度。
61.根据权利要求6-12和21中任一项所述的方法，其中与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于10％。
62.根据权利要求6-12和21中任一项所述的方法，其中与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于15％。
63.根据权利要求6-12和21中任一项所述的方法，其中与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于20％。
64.根据权利要求6-12和21中任一项所述的方法，其中与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于25％。
65.根据权利要求6-12和21中任一项所述的方法，其中与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于30％。
66.根据权利要求6-12和21中任一项所述的方法，其中与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于40％。
67.根据权利要求6-12和21中任一项所述的方法，其中与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于50％。
68.根据权利要求6-12和21中任一项所述的方法，其中与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于60％。
69.根据权利要求6-12和21中任一项所述的方法，其中与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于70％。
70.根据权利要求6-12和21中任一项所述的方法，其中与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于80％。
71.根据权利要求6-12和21中任一项所述的方法，其中与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于90％。
72.根据权利要求6-12和21中任一项所述的方法，其中与相同条件下但无所述补充物时培育的细胞的细胞生存力相比，细胞生存力的改善大于100％。
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