KR20110059873A - Ｈｓａ-생산 세포의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포 배양 기술 분야에 관한 것이며, 또한 생물약제의 생산에 중요한 세포, 바람직하게는 세포주의 증식/클로닝 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 단백질을 제조하는 방법, 단세포 분류를 통해 추출 및 증식된 세포의 용도, 및 단세포의 증식을 가능하는 배지 조성물에 관한 것이다. 배지의 조정을 위한 피더 세포로서 또는 숙주 세포로서, 알부민-생산, 바람직하게는 HSA-생산 세포의 사용을 통해, 재클로닝 효율 및 이에 따라 수득된 클론의 양이 유의적으로 증가할 수 있다. 또한, 이러한 접근법들의 조합도 가능하다. 알부민-생산, 바람직하게는 HSA-생산 세포의 사용을 통해 무혈청 및/또는 인슐린 무함유 배지뿐만 아니라 다른 세포 종류에서도 재클로닝 효율의 증가가 달성될 수 있다.

Description

ＨＳＡ-생산 세포의 용도{Use of HSA-producing cells}
본 발명은 세포 배양 기술 분야에 관한 것이며, 또한 생물약제의 생산에 중요한 세포, 바람직하게는 세포주를 복제/클로닝하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 수득하여 복제한 세포를 이용하여 단백질을 제조하는 방법 및 각 세포를 복제 가능하게 하는 조성물에 관한 것이다.
사람 치료용 생물약제 시장은 세계적으로 빠르게 성장하고 있다. 현재 임상 실험에서 검사되고 있는 생물약제는 900가지가 넘으며 2010년 잠재적 매출액이 500억불로 추정된다(Datamonitor 2007). 현재, 포유동물 세포에서 생산되는 생물약제의 수가 증가하고 있는데, 그 이유는 이러한 세포가 사람 단백질을 정확하게 프로세싱 및 변형시키는 능력이 있기 때문이다. 따라서, 포유동물 세포에서 생물약제를 고 수율로 수득하는 성공적인 생산은 중요하며 이는 제조 공정에 사용되는 재조합 모노클로날 생산 세포주의 특징에 달려 있다. 또한, 세포주의 개발 기간은 생물약제가 얼마나 빠르게 임상 실험에 돌입할 수 있는지에 관한 중요한 시간 요인이다. 이러한 관점에서, 세포주 개발 방법의 가속화와 효율성 증대가 절실하다.
포유동물 세포에서의 생물학적 활성 단백질 또는 치료 단백질, 소위 생물약제의 생물공학적 생산을 위해, 해당 포유동물 세포는 생물학적 활성 단백질(또는 이의 서브유닛)을 암호화하는 DNA로 안정하게 형질감염된다. 형질감염 과정 후, 일반적으로 수백만의 상이하게 형질감염된 세포 풀(pool)이 수득된다. 따라서, 효율적인 생산 세포주를 제조하기 위한 결정적인 단계는, 한편으로는 매우 안정하게 성장하고 다른 한편으로는 치료 단백질(산물 형성 등)의 비생산성(specific productivity)이 높은 세포 클론의 선택 및 복제이다. 수백만 개의 상이한 산물 발현 세포가 있기 때문에 다수의 세포를 각각 높은 처리량과 자동화로 분석하여 매우 왕성하게 성장하면서 높은 산물 역가도 초래하는 적당한 후보(단세포 클론)를 분류할 수 있는 것이 매우 중요하다. 이러한 단세포 분리 및 계대배양 방법은 클로닝 또는 재클로닝(recloning)이라 알려져 있다.
생물약제를 생산하기 위한 동물 세포 배양의 사용은 유전형적, 표현형적 동질성, 즉 모노클로날 세포 배양물을 요구한다. 이것은 "한계 희석"과 같은 재클로닝 기술이나 또는 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의한 각 세포의 자동 공급에 의해 달성된다.
하지만, 전형적인 재조합 생산 세포, 예컨대 마우스 골수종(NS0), 햄스터 난소(CHO) 또는 햄스터 신장 세포(BHK)는, 특히 무혈청 현탁 배양물에서, 즉 현대식 생산-관련 세포 배양 조건 하에서 성장하도록 적응된 경우, 이 세포들은 무혈청 배양 조건 하에서 미세역가 플레이트에 개별적으로 공급되어 재클로닝 후 효과적으로 복제하는데 문제가 있다.
그 이유는 생체내 세포는 조직 기질에 매립되어 있고 분비된 자가분비 성장인자 및 인접 세포에 의한 주변분비 성장인자가 공급되기 때문이다. 따라서, 이 세포들은 분리된 성장에 적응하지 못하고, 새로운 조건에 천천히 적응하지 못하면 성장인자에 의한 자극의 부재하에 사멸한다.
특히, 재클로닝 단계에서 무혈청 또는 화학적으로 정의된 배지의 사용은 재클로닝 효율을 제한하고, 즉 공급된 세포의 작은 비율만이 생존하여 모노클로날 세포주로 성장한다.
현재 사용되는 "한계 희석" 및 FACS 재클로닝 기술은 당업계에 익히 공지되어 있다.
"한계 희석"에서, 세포 현탁액은 연속해서 희석된 다음에 웰마다 다른 수의 세포가 미세역가 플레이트에 공급된다. 다수의 세포를 함유하는 웰에서, 세포는 다수 또는 전부가 자가분비 성장인자의 적당한 분비 결과로 생존한다. 웰마다 접종되는 세포 수가 적을수록, 생존하는 세포 수가 적어지고, 이러한 식으로 희석은 웰마다 통계학상 하나의 세포만이 생존하여 모노클로날 주로 성장하도록 조정할 수 있다. 이러한 개별 세포 클론은 육안 및/또는 영상촬영 기술에 의해 검출되고, 세포 클론은 더 큰 배양 용기에서 성장시킨다.
FACS 기술에서는 단세포 클론의 생성에 유세포분석기가 사용된다. 이를 위해, 세포는 층류로 배치되고 미세역가 디쉬의 웰 내로 개별적으로 인도된다. 이것은 생존 콜로니가 실제로 개별 클론이게 한다. 따라서, FACS 기술은 한계 희석에 비해 바람직한 방법이다.
재클로닝 단계에서 무혈청 배지 또는 화학적으로 정의된 배지의 사용은 재클로닝 효율을 제한하고, 즉 개별적으로 공급된 세포의 몇 퍼센트만이 모노클로날 세포주로 성장한다.
따라서, 재클로닝 효율이 낮으면 원하는 수의 개별 클론을 수득하기 위해 다수의 미세역가 플레이트에 단세포를 채워야 하고, 이는 시간소모적이고 비용이 많이 든다(예컨대, 배지, 디쉬 등의 면에서).
낮은 재클로닝 효율은 특히 단세포 클론의 후속 분석이 자동 시스템에 의해 수행될 경우 불리하다. 분석 로봇은 생세포 또는 사세포를 함유하는 웰을 일반적으로 구별할 수 없고, 미세역가 플레이트의 모든 웰을 자동으로 계측한다. 재클로닝 효율이 단지 10%라는 것은, 90%의 경우는 로봇이 빈 웰을 분석하고 생세포 클론의 분석과 관련하여 이를 위해 동량의 시약을 사용할 것이라는 것을 의미한다. 따라서, 이러한 예에서는 어떠한 데이터도 수득되지 않으면서 시간의 90%와 재료 비용의 90%가 낭비된다.
이 문제를 해결하기 위해, 과거에는 종종 배지에 혈청(예: 소 태아 혈청, FCS)이 첨가되었다. 혈청은 세포의 생존과 증식을 지지하는 여러 가용성 단백질과 성장인자의 불확실한 혼합물을 함유한다. 하지만, 규제상의 이유로, 혈청과 같은 명확하지 않은 첨가물의 사용은 부분적으로는 소 바이러스 감염의 위험으로 인해 점차 허용되기가 어려워진다. 따라서, 전적으로 무혈청 하에서의 세포주 생산이 규제적 관점에서의 당해 기술 상태이다.
다른 가능한 해답은 재클로닝을 위해 "한계 희석"을 수행하는 것이다. 이 방법은 통계학상 단세포 클론의 생산만을 초래하지만 또한 많은 클론들이 하나의 웰에서 성장할 수 있으므로, 수득되는 세포주가 실제로 단일 클론으로부터만 기원하도록 하기 위해서는 여러 번(보통 2 내지 3회) 반복해야 한다. 이러한 반복 사이클은 노동 및 시간 비용을 높여, 필요한 비용과 일정에 좋지 않은 영향을 미친다.
다른 접근법은 "피더(feeder)" 세포의 사용이다. 이 명칭은 영어 단어 "피드(feed)"에서 유래한 것으로, 배양물 중의 목표 세포에 영양소와 분비되는 성장 인자를 공급하는 작용을 하는 일반적 비분열 세포와의 공동 배양을 의미한다. 재클로닝 효율은 피더 세포에 의해 유의적으로 증가할 수 있다.
다른 접근법으로, 재조합 단백질을 재클로닝 배지에 첨가하여 개별적으로 공급된 세포의 생존 및 성장을 촉진한다. 사용된 재조합 단백질의 예는 인슐린, 인슐린-유사 성장인자(IGF), 상피 성장인자(EGF) 또는 사람 혈청 알부민(HSA)이다. 이 첨가제들은 정제 단백질 또는 단백질 용액으로 수득되어 배지에 첨가된다. 이 방법의 단점은 비용, 재조합 단백질의 입수용이성에 대한 의존성 및 이의 불안정성이다. 그 단점으로는 특히 다음을 포함한다:
- -70℃에서 보관해야 하는 필요성,
- 동결/해동 사이클이 불활성화를 유도하고, 따라서 이를 피해야 한다.
- 배양 조건 하에 용액 중에서의 활성의 급속한 상실.
본 발명의 목적은 생산 세포의 무혈청 FACS-기반 클로닝 시의 재클로닝 효율을 증가시키는 것이다.
무혈청 배지, 바람직하게는 화학적으로 정의된 및/또는 인슐린-무함유(insulin-free) 배지에서 저하된 재클로닝 효율의 기술적 문제점에 대한 해결책은 유전자도입 알부민 또는 HSA-생산 세포의 사용에 의해, 또는 이러한 HSA-생산 세포에 의해 조정된 배지의 사용에 의해 수득된다. 따라서, HSA는 정제된 단백질로서 외부로부터 배지에 첨가되지 않고, 생 세포에 의해 재클로닝 배지 내로 직접 방출된다.
다음과 같은 양태가 가능하다:
1. 단세포의 공급을 위한 조정 배지(conditioned medium)를 제조하기 위한 HSA-생산 세포의 사용.
2. 피더 세포로서 HSA-생산 세포의 사용. 배지에 한꺼번에 첨가되는 재조합 HSA의 사용과 반대로, 다중웰 플레이트에서 피더 세포는 단세포의 공급 후에 HSA를 연속해서 생산하고, 이로 인해 재조합 단백질의 1회 첨가 후보다 더 오랜 시간 동안 공급 세포의 성장을 돕는다.
3. 생물약제를 생산하기 위한 숙주 세포로서 HSA-생산 세포의 사용. 따라서, 이 세포는 피더 세포 및 재조합 첨가제의 부재 하에서도 스스로 HSA를 분비하여 자신의 성장을 촉진할 수 있다.
최고의 재클로닝 효율은 상기 접근법들의 조합, 즉 HSA-생산 세포와 HSA-조정 배지의 사용에 의해 바람직하게 수득될 수 있다. 경우에 따라 그리고 후속 분석 방법의 성질에 따라, 피더 세포가 추가로 사용될 수 있다.
배지 조정제 또는 숙주 또는 피더 세포로서 HSA-생산 세포의 사용에 의해, 재클로닝 효율과 이에 따라 수득되는 클론의 양은 유의적으로 증가할 수 있다. 이 효과는 클로닝 배지 중의 HSA 농도가 200 mg/L 미만, 심지어 <100 mg/L일 때에도 관찰된다. 재클로닝 효율에 미치는 분비된 HSA의 활성/효과는 보통 400mg/L 내지 >2g/L의 농도로 첨가되는 재조합 HSA의 활성/효과보다 상당히 더 높다.
바람직한 양태는 인슐린-무함유 배지에서 HSA-생산 세포의 사용이다. 재클로닝 효율에 HSA-생산 세포 및/또는 이들의 배지가 미치는 긍정적인 영향은 다른 배지에 피더 세포의 존재 및 부재 시에 분명하게 나타난다. 또한, 다른 세포주/세포 종류, 예컨대 햄스터 세포 및 마우스 세포뿐만 아니라, 사람 및 다양한 다른 세포계에서도 분명하게 나타난다.
사용된 HSA-생산 세포는 자연 HSA-생산 세포(예: 사람 간 세포) 및 다른 종의 유전자 변경 세포일 수 있다. 바람직한 양태는 유전자도입 HSA-생산형 생산 세포주, 예컨대 CHO, BHK, NS0, Sp2/0 또는 Per.C6 세포로 이루어진다. 특히 바람직한 양태는 HSA-생산 CHO 세포를 포함한다.
HSA-생산 세포 또는 이에 의해 조정된 배지의 사용에 의해 무혈청 배지 중에서의 재클로닝 효율을 증가시키기 위한 본원에 기술된 방법은 결과적으로 더욱 효과적인 클론 선별과 이에 따른 더욱 효율적인 세포주 개발 방법을 초래한다.
생물약제 개발에서 재클로닝의 1차 목표는 고-생산성 세포 클론을 동정하는 것이다. 더 높은 재클로닝 효율은, 수득되는 클론의 더 광범한 기반을 통해 그리고 생산성 측면에서 클론의 정규 분포의 결과로서, 고-생산성 세포 클론을 수득할 가능성을 더욱 높여준다.
재클로닝 효율이 더 높으면 동일한 수의 생 세포 클론을 수득하기 위해 더 적은 수가 디쉬에 공급되어야 하므로, 시간과 노력뿐만 아니라 결과적으로 비용도 유의적으로 절감된다. 따라서, 당해 공정 단계는 전반적으로 더욱 경제적이다.
더욱이, 증가된 재클로닝 효율은 고 효율적 자동 클론 선별 방법(선별 로봇)의 사용을 위한 기초를 형성한다.
이러한 종류의 시스템에서는 일반적으로 미세역가 플레이트 중의 개별 웰에 대한 선택이 없고, 생 세포 집단의 함유 여부에 관계없이 모두 동일하게 측정된다. 플레이트 중의 모든 웰이 분석된 결과로서, 조사된 클론의 수는 출현 클론의 수에 정비례하여 증가한다. 재클로닝 효율이 단지 10%인 것은 웰의 90%가 비어있어 이용가능한 어떠한 데이터도 공급할 수 없으나, 여전히 분석된다는 것을 의미한다. 경제적 측면에서, 이것은 90%의 경우에는 어떠한 데이터도 수득되지 않으면서 시간과 시약 형태의 돈이 소비된다는 것을 의미한다. 따라서, 초기 클론 선택용 고 처리량 자동화 시스템의 효율은 단일 세포의 공급 후에 수득되는 클론의 수에 비례해서 증가한다.
당해 기술된 방법의 다른 장점은 숙주 세포로서 HSA-생산 세포 및/또는 배지 조정제의 첨가가 피더 세포가 필요없는 정도까지 재클로닝 효율을 증가시킨다는 점이다.
한편으로, 이것은 피더 세포의 생산 및 예비배양에 수반되는 노력을 줄이며 동시에 단세포 클로닝의 재현성을 증가시킨다. 또한, 클론 분석의 수단으로서 생세포 수를 육안으로 검출하는 기술도 사용 가능할 수 있게 한다. 배양 배지 중의 산물의 양은 생산 세포의 수와 선형 상관관계가 있으므로, 산물의 양과 세포 수를 검출하여 이로부터 최고의 생산 세포 클론, 즉 최고의 비생산성을 갖는 세포 클론을 측정하는 것이 기술 개발이 추구하는 것이다.
피더 세포는 출현 생산 세포로부터 육안으로 구별하기 어려우므로, 피더 세포는 세포 수의 육안 측정 시에 포함되기도 하여 총 세포 수의 계산을 부정확하게 하고, 이에 따라 비생산성의 중요한 파라미터의 측정이 부정확해진다. 따라서, 피더 세포가 없는 공정이 유리하며 바람직한 양태이다.
당해 기술된 방법의 적용가능한 분야는 특히 생물약제의 생산에서 찾아볼 수 있다. 생물약제를 생산하는 생산 세포의 생성에서 재클로닝 효율의 증가는 고-생산성 클론의 확률을 높이고, 이에 따라 제품 개발이 개선되고 가속화된다. 또한, 이 공정은 당해 단계의 경제성을 증가시켜 고-처리량 자동 클론 분석 기술을 사용 가능하게 한다.
재클로닝 효율을 증가시키기 위한 목적으로 인슐린-함유 배지에 재조합 단백질을 첨가하는 것은 사실상 종래 기술에 개시되어 있다(WO 2006047380). 하지만, 이에 반해, 본 특허원에는 알부민-생산 또는 HSA-생산 세포 유래의 배지 또는 분비된 알부민 또는 HSA의 사용이, 대안적이고 뛰어난 가능성으로서 분명하게 설명되고 있다. HSA는 재조합 정제 단백질로서 배지에 외인적으로 첨가되지 않고, 오히려 HSA는 알부민-유전자도입 세포에 의해 재클로닝 배지 내로 직접 분비된다.
HSA-생산 CHO 세포는 사실상 문헌에 기술되어 있지만, HSA 외에 다른 단백질을 생산하기 위한 숙주 세포로서의 HSA-생산 세포의 사용이나 또는 재클로닝 효율을 증가시키기 위한 배지 조정제로서 또는 피더 세포로서의 HSA-생산 세포의 사용에 대한 설명은 전혀 없다.
도 1: 본 발명의 가능한 이용분야
HSA-생산 세포의 가능한 양태에 대한 개략도:
(1) 조정 배지 제조용
(2) 피더 세포로서
(3) 생물약제 생산용 숙주 세포로서 HSA-생산 세포의 사용, 즉 관심 단백질을 생산하는 세포가 추가로 HSA를 분비하여 재클로닝 동안 자신의 성장을 촉진시킨다.
이러한 이용 가능 분야는 추가로 재클로닝 효율을 증가시키기 위해 조합될 수 있다.
도 2: 재클로닝 효율을 증가시키기 위한 HSA-생산 세포의 조정 배지 제조
(A) 이 도면은 임의의 첨가물 없이 새로운 재클로닝 배지의 사용 시의 상대적 재클로닝 효율(음성 대조군, 백색) 및 500 mg/L 재조합 HSA의 첨가 시에 재클로닝의 상대적 증가(양성 대조군, 회색) 또는 표시된 일 수 후에 배양물에서 분리해 첨가되는 HSA-생산 세포 배양물 유래의 50% 조정 배지의 첨가 시에 상대적 재클로닝 효율(흑색 막대)을 도시한 것이다.
(B) 상기 배지에서 측정된 HSA 농도를 표로 정리한 것이다. 재클로닝 효율은 2 내지 5일 동안 조정된 배지를 사용할 때 최대였다. 조정 배지에서 측정되는 HSA 농도는 5 내지 50배 더 낮았지만, 재조합 HSA를 배지에 첨가할 때보다 재클로닝 효율은 상당히 더 높았다. 조정이 더 길어지면 배지 중의 HSA 함량은 높아져도 재클로닝 효율은 감소했다.
도 3: HSA-조정 배지의 사용 결과로서 재클로닝 효율의 증가
(A) 피더 세포의 존재 하에 HSA-조정 배지의 영향. 이 도면은 10,000개의 성장-정지된 피더 세포에 개별적으로 공급된 세포의 상대적 재클로닝 효율을 나타낸다. 음성 대조군은 어떤 첨가물도 없는 베링거(Boehringer) 자체 배지에서의 재클로닝 효율(여기서는 1로 설정함)을 나타내고, 양성 대조군에서는 500mg/L 재조합 HSA를 배지에 첨가했다. HSA-생산 세포의 2 내지 4일째 배양물의 조정 배지를 사용한 결과로, 재클로닝 효율은 더 증가될 수 있다. 이 배지에서 측정된 HSA-농도는 막대 위에 표시했다.
(B) 시판 배지(HyQ SFM 4 CHO 배지)에 HSA-조정 배지의 첨가의 영향. 이 그래프는 피더 세포의 사용 없이 (A)에서와 다른 배지에서의 재클로닝 효율을 나타낸다. 이 배지에서는 어떠한 개별적으로 공급된 세포도 첨가제 없는 배지에서 생 배양물로 성장하지 못한다. 재조합 HSA(500mg/L, 암회색 막대)를 첨가한 덕분에 몇몇 세포는 생존한다. 한편, HSA-생산 세포의 조정 배지를 사용한 경우(밝은 회색 막대)에는 더 높은 재클로닝 효율이 달성되었다. 막대들은 각 조건마다 3 내지 5회 평가된 96웰 플레이트의 평균이고, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 4: HSA-생산 피더 세포에 의해 유발된 재클로닝 효율의 증가
세포 집단 유래의 단세포를 자기 유래의 CHO-DG44 피더 세포 또는 유전자도입 HSA-생산 피더 세포 상에 공급한다. DG44-세포 이용 시의 재클로닝 효율을 1로 정했다(흑색 막대). 회색 막대는 HSA-생산 피더 세포를 사용할 때의 재클로닝 효율의 상대적 증가를 제공한다. 이 막대는 각 조건마다 3회 평가된 96웰 플레이트의 평균을 나타낸다.
도 5: HSA-생산 피더 세포 및 숙주 세포의 조합
이 도면은 자기 유래 피더 세포에 공급된 형질감염되지 않은 DG44 세포를 함유하는 배치(batch)의 재클로닝 효율(1로 정함, 흑색), DG44-피더 세포의 존재 하에 HSA-생산 세포를 재클로닝할 때의 재클로닝 효율(회색)을 나타낸다. 조합, 즉 HSA 유전자도입 피더 세포 상에 HSA-생산 세포의 공급(백색)은 재클로닝 효율의 추가의 유의적인 증가를 초래한다. 이 도면은 3회 평가된 96웰 플레이트의 평균을 나타내며, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 6: 재조합 HSA의 첨가 결과로서 재클로닝 효율의 농도-의존적 증가
이 그래프는 특정 농도로 재조합 HSA를 첨가할 때의 재클로닝 효율을 나타낸다. 본 실험에서 최대 효율은 재클로닝 배지에 1000 mg/L 재조합 HSA를 첨가했을 때 달성되었고; 이 값을 100%로 정하고 다른 배치에서 측정된 효율을 상대적으로 기록했다.
정의
본 발명을 이하 비제한적 예시 양태로 더 상세하게 설명하기 전에, 부정관사, 예컨대 "a" 또는 "an" 및 정관사, 즉 "the"는, 이 두 형태 중 하나가 분명하게 배제되고 특정 형태(단수 또는 복수)로 언급되지 않는 한, 당해 용어의 단수 및 복수를 모두 포함한다는 것을 유념해야 한다. 따라서, "세포"란 용어는 단세포만을 의미하는 분명한 언급이 없는 한, 자동적으로 "복수의 세포"도 포함하는 것이다. 단수는 예컨대 "a" 또는 "하나"가 (1)로 보충 설명되는 경우에는 분명하게 단수를 의미한다.
"인슐린"이란 용어는 췌장 베타 세포에 의해 분비되는 성장 인자를 의미한다. 인슐린은 당업자에게 공지되어 있다. 사람 아연 인슐린 또는 재조합 인슐린은 세포 배양물에 흔히 사용된다. 인슐린의 농도는 시판 인슐린-특이적 ELISA와 같은 통상의 실험으로 배양 배지에서 측정할 수 있다.
"인슐린-무함유"란 용어는 배양 배지가 임의의 인슐린, 특히 임의의 재조합 인슐린을 함유하지 않으며, 인슐린이 전혀 첨가되지 않은 것을 의미한다.
알부민은 혈장에서 가장 흔한 단백질이다. 이것은 간에서 생산되고 혈액에서 삼투압을 유지하는데 기여한다. 알부민은 영양소 및 대사산물에 결합하여 이들의 수송을 돕는다.
본 발명에서 "알부민"이란 용어는 알부민의 생물학적 활성이 있는 폴리펩타이드 성분을 의미한다. 알부민은 일반적으로 동물 알부민, 특히 사람, 소, 말, 쥐, 래트류 및 돼지 알부민과 같은 포유동물 알부민, 및 특히 병아리와 같은 새 유래의 알부민 등을 의미한다. 바람직하게는, 알부민은 사람 혈청 알부민(HSA)이다. 본 발명에서, "HSA" 및 "알부민"이란 용어는 동의어로 사용되고, 즉 "HSA"는 사람 알부민 및 다른 동물 종 유래의 알부민을 모두 의미한다. 본 발명에서, 외부에서 배양 배지에 첨가되는 재조합 HSA와 살아있는 HSA-생산 세포에 의해 직접, 즉 정제 또는 분리 없이 재클로닝 배지에 방출되는 "분비된" HSA 간에는 분명한 차이가 있다. 살아있는 알부민-유전자도입 세포에 의해 세포 배양 배지로 직접 분비된 알부민 또는 HSA를 언급할 때, 이것은 알부민 또는 HSA가 정제 단백질로서 외부로부터 첨가된 것이 아님을 의미한다.
재조합 HSA의 생산은 종래 기술에 익히 공지되어 있고, 예를 들어 유전자 변형 효모(미국 특허 5,612,197) 등을 이용하여 수행할 수 있다. 재조합 HSA는 다양한 공급원, 예컨대 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)(재조합 HSA, Cat. No. A-7223)로부터 구입할 수 있다. 이것은 배양 배지에 첨가될 수 있는 정제된 단백질이다.
본 발명의 데이터는 "분비된 HSA"가 상당히 더 낮은 농도에서 재클로닝 효율의 실질적인 증가를 야기하므로, HSA보다 상당히 더 높은 활성/효과가 있음을 보여준다.
본 발명에서 "상당히 더 낮은 농도"란 용어는 다음을 의미한다:
- 재조합 또는 정제된 알부민에 비해 적어도 2배 더 낮은 농도,
- 재조합 또는 정제된 알부민에 비해 적어도 5배 더 낮은 농도,
- 재조합 또는 정제된 알부민을 함유하는 비슷한 배양 혼합물보다 적어도 2배 더 낮은 알부민 농도,
- 재조합 또는 정제된 알부민을 함유하는 비슷한 배양 혼합물보다 적어도 5배 더 낮은 알부민 농도,
- 재조합 또는 정제된 알부민을 함유하는 비슷한 배양 혼합물보다 적어도 2 내지 100, 2 내지 5, 5 내지 100, 20 내지 100, 5 내지 10배 더 낮은 알부민 농도,
- 200 mg/L 미만, 바람직하게는 100 mg/L 미만, 특히 바람직하게는 60 mg/L 미만의 알부민 농도.
재조합 HSA와 대조적으로, 분비된 HSA는 생 배양물의 HSA-생산 세포에 의해 재클로닝 배지 내로 직접 방출된다. 이것은 3가지 기원에서 유래될 수 있다: (1) 조정 배지를 제조하는데 사용된 예비 배양물의 HSA-생산 세포로부터, (b) HSA-생산 피더 세포로부터, 또는 (3) HSA-분비 숙주 세포로부터(개별적으로 공급된 생산 세포가 HSA를 스스로 분비하도록 유전자 변형된 경우).
HSA의 농도는 시중에서 입수할 수 있는 ELISA(예컨대, 베틸 레보러토리즈(Bethyl Laboratories, Montgomery, TX)의 제품인 "Human Albumin ELISA Quantitation Kit")와 같은 통상의 방법으로 측정할 수 있다.
"알부민 또는 HSA-유전자도입 세포", "알부민- 또는 HSA-생산 세포" 또는 "알부민- 또는 HSA-분비 세포"란 용어는 배지 내로 알부민을 방출하는 임의의 세포를 의미한다. 이것은 자연적으로 알부민을 분비하는 세포(예: 간 세포) 또는 예컨대 알부민- 또는 HSA-발현 작제물의 도입 등에 의해 알부민 또는 HSA를 발현하여 이를 배지 내로 방출하도록 유전자 변형된 세포일 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태는 일부민- 또는 HSA-생산 포유동물 세포, 가장 바람직하게는 알부민- 또는 HSA-생산 설치류 세포, 특히 알부민- 또는 HSA-생산 CHO- 또는 NS0-세포로 이루어진다. "알부민- 또는 HSA-유전자도입 세포", "알부민- 또는 HSA-생산 세포" 및 "알부민- 또는 HSA-분비 세포"와 같은 구체화된 용어는 본 발명에서 상호 호환해서 사용된다.
세포의 "비생산성"은 단위 시간당 세포에 의해 생산되는 특정 단백질의 양, 즉 분비 단백질의 경우에는 배지로 방출되는 양을 의미한다. 비생산성은 배지 중의 산물 농도(= 예컨대 ELISA로 측정한 역가)와 고려 중인 시간 기간 동안에 존재하는 생산 세포의 수의 지수로부터 계산하고, "IVC"(시간 경과에 따른 생 세포 수의 적분값)라고도 알려져 있다. 비생산성은 보통 'pcd'(= pg/세포*일 = 세포당 1일당 분비된 단백질의 pg)로 제공된다.
세포 배양과 관련하여 사용된 "클로닝/재클로닝", "클론/재클론"이란 용어는 기원 세포로부터 동일한 세포의 세포 집단을 수득할 수 있는 기술을 의미한다. 따라서, "세포 클로닝" 또는 "단세포 클로닝"이란 용어는 유전형이 상이한 세포들을 갖는 세포 풀(cell pool)로부터 단세포를 동정 및 분리한 뒤, 복제하여 유전자적으로 동일한 복수의 세포로 이루어진 세포 집단을 형성시키는 방법을 의미한다. 세포가 개별적으로, 즉 배양 용기 안에 하나의 세포만이 공급된 다음, 동일한 세포의 세포 집단으로 증대된다면 이 과정이 "직접 단세포 클로닝"이다. 많은 세포가 배양 용기 안에 동시에 공급되어 세포 집단으로 증대된다면, 이것은 반복 희석(=한계 희석)에 의해 동일 세포의 세포 집단으로 분류되며, 이는 "간접 클로닝" 방법이라 기술된다.
"단일 클론" 또는 "단세포 클론" 또는 간단히 "클론"은 하나의 단세포에서 기원하는 유전자적으로 동일한 세포이다. 동일 기원의 동일 세포로 이루어진 세포 집단은 결과적으로 이하 "모노클로날 세포 집단"이라 불린다. 동일 기원의 세포를 배양하는 동안, 게놈의 자발적 변화, 예컨대 돌연변이 및/또는 전좌(translocation)가 일어나면, 이 세포 집단의 개별 세포는 본 발명의 목적상 그대로 동일한 세포로 간주하고, 배양물은 모노클로날 세포 집단으로 간주한다. 이에 반해, 안정하게 형질감염된 세포 풀(형질감염체)은, 유전자적으로 동일한 출발 세포가 동일한 핵산에 의해 형질감염되더라도, 동일 계열의 세포 클론이 아니고, 즉 모노클로날 세포 집단이 아니다.
"서브클론/계대배양물"이란 용어는 분열 세포의 1회 또는 수회 계대에 의해 기원 세포 또는 기원 배양물로부터 생산되는 다른 세대의 세포를 의미한다. "서브클론/계대배양물"이란 용어는 예컨대 동일한 세포 또는 세포 배양물이 배양되어 여러 세대 동안 복제될 때 사용된다.
"클로닝 효율" 또는 "재클로닝 효율"이란 용어는 공급된 후 생존하고 분열하여 살아있는 세포 집단을 형성하는 세포의 백분율로 정의된다. 예컨대, 세포 분류 작업에서 100개의 세포가 100개의 배양 용기 안에 분산되고, 이 100개의 개별적으로 공급된 세포 중 25개가 성장하여 배양물을 형성한다면 클로닝 효율은 25%이다.
"효과적인 또는 효율적인 재클로닝"이란, 클로닝 효율이 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 더욱 바람직하게는 적어도 30%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 40%인 것을 의미한다. 본 발명의 특히 바람직한 양태에 따르면, 효과적인 재클로닝 이란 용어는 효율이 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 가장 바람직하게는 적어도 70%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 80%인 클로닝을 의미한다.
본 발명의 목적상 "분열할 수 있는/증대될 수 있는"란 용어는 무한 분열하지만, 최소 2회 이상 계대, 바람직하게는 4회 계대로 분열하는 세포/세포 집단의 잠재력을 나타낸다. 이 잠재력은 예컨대 [137]Cs 조사 또는 미토마이신 C 처리에 의해 전부 감소되거나 파괴될 수 있다.
"유도체/후손"이란 용어는 특정 출발 세포로 유전자적으로 역추적될 수 있고, 예컨대 계대배양(선택 압력의 존재 또는 부재 하에)에 의해 형성되고/되거나 유전자 조작에 의해 생성되는 세포를 의미한다. 동일 세포 종류의 세포의 재분리물도 역시 "유도체/후손"이란 용어에 포함된다. 따라서, 예컨대 모든 CHO 세포주는 계대배양, 재분리 또는 유전자 조작에 의해 수득되든지 간에 상관없이, 퍽 등(Puck et al., 1958)에 의해 크리세툴루스 그리세우스(Cricetulus griseus)로부터 분리된 햄스터 난소 세포의 유도체/후손이다.
"피더 세포(feeder cell)"란 용어는 영어 단어 "피드(feed)"에서 유래한 것으로, 배양물 중 목표 세포에 영양소와 분비되는 성장 인자를 공급하는 작용을 하는 일반적 비분열 세포와의 공동배양을 의미한다. 준비를 위해, 생세포를 UV 또는 감마선 조사로 또는 미토마이신 C 처리로 성장-정지시킨다. 수득되는 피더 세포는 생존하고 성장 인자를 생산하여 분비하지만 더 이상 분열할 수는 없다.
"자기 유래의 피더 세포"란 용어는 피더 세포와 이 피더 세포의 존재 하에 배양될 세포가 분류학상 동일 기원에서 유래되는 것을 의미한다. 예를 들어, 배양될 세포가 햄스터 세포(크리세티네(Cricetinae) 아과), 바람직하게는 크리세툴루스(Cricetulus) 또는 메소크리세투스(Mesocricetus) 속의 세포, 예컨대 CHO 또는 BHK 세포라면, 이 아과에서 처음 분리된 각 피더 세포는 상기 크리세티네 아과의 햄스터 세포에 자기 유래인 피더 세포이다.
바람직한 양태에 따르면, "자기 유래의 피더 세포"란 용어는 피더 세포와 배양될 세포가 분류학상 동일한 속에서 유래하거나 또는 동일한 속으로부터 최초 분리된 세포(크리세툴루스 또는 메소크리세투스 유래의 세포)인 것을 의미한다. 예를 들어, 배양될 세포가 크리세툴루스 또는 메소크리세투스 속의 햄스터 세포, 바람직하게는 CHO 또는 BHK 세포이면, 당해 속으로부터 최초 분리된 각 피더 세포는 본 발명의 관점에서 자기 유래의 피더 세포이다.
다른 바람직한 양태에 따르면, 피더 세포와 배양될 세포가 동일한 종, 예컨대 크리세툴루스 그리세우스(Cricetulus griseus) 또는 메소크리세투스 아우라투스(Mesocricetus auratus)에서 유래한다면, 자기 유래의 피더 세포가 존재한다. 특히 바람직한 양태에 따르면, 피더 세포와 배양될 세포가 동일한 종에서 유래하고 동일한 조직 향성(예컨대, 크리세툴루스 그리세우스 유래의 난소 세포 - CHO 세포)을 나타낸다면 자기 유래의 피더 세포가 존재한다. 특히 바람직한 양태에 따르면, 피더 세포와 배양될 세포가 동일한 기본 세포에서 유래하면, 예컨대 두 세포가 모두 본래 CHO-DG-44 세포 또는 이 세포의 후손이라면 자기 유래의 피더 세포이다. 다른 바람직한 양태에 따르면, 피더 세포는 항생제 등에 대한 동일한 내성을 부여하며, 배양될 세포도 마찬가지이다. 이것은 항생제와 같은 선택제의 존재 하에 세포 공급이 수행될 때 특히 유리하다.
한 관점에서, 본 발명은 특히 재클로닝 효율을 증가시키기 위한 HSA-생산 피더 세포의 용도에 대해 기술한다. 바람직한 양태에서, 자기 유래의 HSA-생산 피더 세포가 사용된다.
"한계 희석"이란 용어는 대안적인 재클로닝 방법을 의미한다. 세포 현탁액은 연속해서 희석한 다음 세포를 미세역가 플레이트에 웰마다 다른 수의 세포로 공급한다. 세포 수가 많은 웰에서, 세포는 다수 또는 전부가 자가분비성 성장인자의 적당한 분비 결과로 생존할 것이다. 웰마다 접종된 세포가 적을수록 생존 세포가 적고, 이것은 통계학상 웰마다 하나의 단세포만이 생존하여 모노클로날 주로 성장하도록 희석률이 조정될 수 있다는 것을 의미한다. 이 방법은 통계적으로 오직 단세포 클론의 형성을 유도하지만, 여러 클론이 하나의 웰에서 성장할 가능성이 있어, 이 방법은 수득된 세포주가 실제로 단일 클론에서 유래하도록 하기 위해 여러 번 반복해야 한다(보통 2 내지 3회).
"조정 배지"란 용어는 생 세포의 배양물에서 유래된 배지를 의미한다. 조정 배지의 효과는 예비 배양 세포에 의해 배지로 분비되고 이에 따라 "조정된" 배지를 나타내는 성장 인자의 함유를 기초로 한다. 따라서, "배지-조정 세포" 또는 "배지 조정제"란 용어는 조정 배지를 제조하는데 사용된 세포를 의미한다. 한 관점에서, 본 발명은 배지 조정제로 사용되는 HSA-생산 세포의 용도로서, 결과적으로 수득된 조정 배지가 특히 상기 세포에 의해 분비된 HSA를 함유하는 용도에 대해 기술한다.
"혈청"이란 용어는 혈액의 무세포 성분을 의미한다. 혈청은 여러 가용성 단백질과 세포의 생존 및 증식을 보조하는 성장 인자의 불확실한 혼합물을 함유한다. 세포 배양물에는 소 태아 혈청(FCS) 또는 소 혈청(FBS)이 주로 사용된다. 일반적인 농도 범위는 배양 배지에 첨가물로서 10 내지 20% FCS 또는 FBS이다.
"무혈청"이란 용어는 동물 및/또는 사람 혈청의 부재, 바람직하게는 혈청에서 분리된 임의의 단백질의 부재, 바람직하게는 비-재조합적으로 생산된 단백질의 부재 하에 세포가 성장한 점을 특징으로 하는 배양 조건 및 배양 배지를 의미한다. 결과적으로, "무혈청 조건에 적응된 세포"란 용어는 동물 또는 사람 혈청 또는 혈청 단백질의 부재 하에 복제될 수 있는 세포를 의미한다.
"무단백질"이란 용어는 배양 배지가 임의의 동물 단백질을 함유하지 않는다는 것을 의미하며; 세균, 효모 또는 진균에서 분리된 단백질은 동물 단백질로 간주되지 않는다.
"화학적으로 정의된"이란 용어는 무혈청, 바람직하게는 무단백질이고, 화학적으로 정의된 물질로 이루어진 세포 배양 배지를 나타낸다. 따라서, 화학적으로 정의된 배지는 주로 순수한 개별 물질의 혼합물로 이루어진다. 화학적으로 정의된 배지의 한 예는 메서즈 인비트로겐(Messrs Invitrogen, Carlsbad, CA, US) 제품인 CD-CHO 배지이다.
"현탁액에서 배양될 수 있는 세포"란 표현은 액체 배양물("현탁 배양물")에서 성장하도록 적응되고 세포 배양 디쉬 또는 플라스크 등의 용기 표면에 부착하는 능력이 제한되거나 상실된 세포를 의미한다. 무혈청 성장 및 현탁 성장하도록 적응된 세포는 "무혈청 배지에 적응된 비-부착성 세포"라고 불린다. 피더 세포가 이러한 배양물로부터 제조된다면, 이러한 세포는 정의에 따르면 "무혈청 배지에 적응된 비-부착성 피더 세포"이다.
관심 단백질/산물이란 용어는 항체, 효소, 사이토킨, 림포킨, 부착 분자, 수용체 및 이의 유도체 또는 단편 등을 포함하는 생물약제학적으로 중요한 단백질/폴리펩타이드를 의미한다. 하지만, 관심 단백질/산물은 이러한 예에 제한되지 않는다. 일반적으로, 작용제 또는 길항제로 작용하고/하거나 치료 또는 진단 용도가 있는 모든 폴리펩타이드는 중요하거나 관심대상이다. 다른 관심 단백질은 예컨대 소위 "세포 유전자조작"의 범위 내에서 숙주 세포의 성질을 변경시키는데 사용되는 단백질/폴리펩타이드, 예컨대 항-아폽토시스 단백질, 샤페론, 대사 효소, 글리코실화 효소 및 이의 유도체 또는 단편이 있지만, 이에 국한되지는 않는다.
"폴리펩타이드"란 용어는 아미노산 서열 또는 단백질에 사용되며 임의의 길이의 아미노산 중합체를 의미한다. 또한, 이 용어는 글리코실화, 인산화, 아세틸화 또는 단백질 프로세싱 등과 같은 반응에 의해 해독후 변형된 단백질을 포함한다. 폴리펩타이드의 구조는, 생물학적 활성을 유지하면서, 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입 및 다른 단백질과의 융합 등에 의해 변형될 수 있다. 또한, 폴리펩타이드는 다량체화하고 호모머 및 헤테로머를 형성할 수 있다.
재조합 단백질이란, 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 생산되는 단백질을 의미한다. 이러한 재조합 단백질은 오염의 위험을 최소화하기 위해 가장 엄격한 순도 조건 하에서 생산한다. 재조합 단백질은 일반적으로 숙주 세포에 재조합 단백질을 도입하기 위해 플라스미드, 박테리오파지, 나출형 DNA 또는 바이러스 등의 발현 벡터를 이용하여 효모 세포, 동물 세포 또는 원핵생물 세포(이.콜라이(E. coli) 또는 다른 세균 균주) 등의 적당한 숙주 세포에서 생산한다. 재조합 단백질은 일반적으로 농축 단백질 용액과 같은 정제 형태 또는 분말 형태로 시중에서 입수할 수 있다. 재조합 HSA는 시그마 알드리치와 같은 다양한 시판업자로부터 수득할 수 있다.
치료 단백질의 예는 인슐린, 인슐린-유사 성장인자, 사람 성장 호르모(hGH) 및 다른 성장 인자, 수용체, 조직 플라스미노겐 활성인자(tPA), 에리트로포이에틴(EPO), 사이토킨, 예컨대 인터루킨(IL), 예컨대 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, 인터페론(IFN)-알파, -베타, -감마, -오메가 또는 -타우, 종양 괴사 인자(TNF), 예컨대 TNF-알파, -베타 또는 -감마, TRAIL, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 및 VEGF이다. 다른 예는 모노클로날, 폴리클로날, 다중특이성, 단일쇄 항체 및 이의 단편, 예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fc 및 Fc' 단편, 경쇄(L) 및 중쇄(H) 면역글로불린 쇄 및 이의 불변 영역, 가변 영역 또는 초가변 영역뿐만 아니라 Fv 및 Fd 단편이다(Chamov et al., 1999). 항체는 사람 또는 비-사람 기원일 수 있다. 또한, 사람화된 항체 및 키메라성 항체도 가능하다. Fab 단편(단편 항원 결합 = Fab)은 인접 불변 영역에 의해 함께 유지되는 두 쇄의 가변 영역으로 이루어진다. 이것은 예를 들어 DNA 클로닝 또는 파파인과 같은 프로테아제 처리에 의해 종래 항체로부터 생산될 수 있다. 다른 항체 단편으로는 펩신에 의한 단백분해적 절단에 의해 생산될 수 있는 F(ab')2 단편이 있다.
유전자 클로닝으로 중쇄(VH)와 경쇄(VL)의 가변 영역으로만 이루어진 단축된 항체 단편을 제조하는 것도 가능하다. 이것은 Fv 단편(가변성 단편 = 가변성 부분의 단편)으로 알려져 있다. 이러한 Fv 단편에서는 불변 쇄의 시스테인 그룹을 통한 공유 결합이 가능하지 않으므로, 종종 몇몇 다른 방법에 의해 안정화된다. 이 목적을 위해, 중쇄와 경쇄의 가변 영역이 약 10 내지 30개의 아미노산, 바람직하게는 15개의 아미노산으로 이루어진 짧은 펩타이드 단편에 의해 함께 결합된다. 이것은 VH와 VL이 펩타이드 링커에 의해 함께 결합된 단일 폴리펩타이드 쇄를 생산한다. 이러한 항체 단편은 또한 단일쇄 Fv 단편(scFv)이라고도 불린다. scFv 항체의 예는 공지되어 있고, 예컨대 문헌[Huston et al., 1988]에 기술되어 있다.
과거에 다량체성 scFv 유도체를 생산하기 위한 전략은 다양하게 개발되었다. 목적은 약동학적 성질이 향상되고 결합 화합도가 증가된 재조합체 항체를 생산하는 것이다. scFv 단편의 다량체화를 달성하기 위해, 다량체화 도메인을 지닌 융합 단백질로서 생산된다. 다량체화 도메인은 예컨대 IgG의 CH3 영역 또는 헬릭스 구조("코일형 코일 구조"), 예컨대 류신 지퍼 도메인일 수 있다. 다른 전략에 따르면, scFv 단편의 VH 영역과 VL 영역 사이의 상호작용이 다량체화에 사용된다(예컨대, 디아바디, 트리아바디 및 펜타바디).
디아바디(diabody)란 용어는 당업계에서 2가 동종이량체성 scFv 유도체를 나타내는데 사용되고 있다. scFv 분자 중의 펩타이드 링커를 5 내지 10개의 아미노산으로 단축화한 결과, 중첩성 VH/VL 쇄에 의한 동종이량체가 형성된다. 디아바디는 또한 삽입된 디설파이트 가교에 의해 안정화될 수 있다. 디아바디의 예는 문헌[Perisic et al., 1994]에서 찾아볼 수 있다.
미니바디(minibody)란 용어는 당업계에서 2가 동종이량체성 scFv 유도체를 나타내는데 사용된다. 이것은 면역글로불린, 바람직하게는 IgG, 가장 바람직하게는 IgG1의 CH3 영역을 이량체화 영역으로서 함유하는 융합 단백질로 이루어진다. 이것은 scFv 단편을 힌지 영역, IgG 및 링커 영역을 이용하여 연결한다. 이러한 미니바디의 예는 문헌[Hu et al., 1996]에 기술되어 있다.
트리아바디(triabody)란 용어는 당업계에서 3가 동종삼량체성 scFv 유도체를 나타내는데 사용된다(Kortt et al., 1997). 링커 서열을 사용함이 없이 VH-VL의 직접 융합은 삼량체를 형성시킨다.
2가, 3가 또는 4가 구조의 미니 항체로서 당업계에 공지된 단편도 역시 scFv 단편의 유도체이다. 다량체화는 이량체성, 삼량체성 또는 사량체성 코일형 코일 구조을 이용하여 달성한다(Pack et al., 1993 and 1995; Lovejoy et al., 1993).
"항체 융합체" 또는 "항체 융합 단백질"이란 용어는 항체 또는 항체 일부에 대한 단백질의 융합/커플링을 나타낸다. 특히, 이것은 혈청 중의 단백질의 반감기/안정성을 증가시키기 위해 항체의 Fc 부분에 치료 단백질을 커플링시키는 유전자 조작에 의해 생산된 융합 단백질을 포함한다. 또한, 이 용어는 펩타이드와 항체 또는 항체 일부로 이루어진 항체 융합체를 포괄한다.
본 발명의 목적에 바람직한 숙주 세포는 햄스터 세포, 예컨대 BHK21, BHK TK-, CHO, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX B1 및 CHO-DG44 세포 또는 이러한 세포주의 유도체/후손이다. 특히, CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-K1 및 BHK21 세포가 바람직하고, 특히 CHO-DG44 및 CHO-DUKX 세포가 바람직하다. 또한, 마우스 유래의 골수종 세포, 바람직하게는 NS0 및 Sp2/0 세포와 이러한 세포주의 유도체/후손도 적합하다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 햄스터 및 마우스 세포의 예는 이하 표 1에 제시한다. 하지만, 이 세포들의 유도체 및 후손, 다른 포유동물 세포, 예컨대 비제한적으로 사람, 마우스, 래트, 원숭이, 설치류의 세포주 또는 진핵생물 세포, 예컨대 비제한적으로 효모, 곤충, 새 및 식물 세포도 생물약제 단백질의 생산용 숙주 세포로서 사용할 수 있다.
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본 발명에 따르면, 재조합 포유동물 세포, 바람직하게는 설치류 세포, 가장 바람직하게는 쥐 세포, 예컨대 NS0 및 햄스터 세포, 예컨대 CHO 또는 BHK가 특히 바람직하다.
본 발명에 따르면, 숙주 세포는 전적으로 무혈청 조건 하에서 확립, 적응 및 배양된다. 특히, 숙주 세포는, 무혈청일뿐만 아니라 임의의 동물 단백질/펩타이드가 없는 배지에서 전적으로 확립, 적응 및 배양되는 것이 바람직하다.
적당한 영양소 용액의 예로는 시중에서 입수할 수 있는 배지, 예컨대 Ham's F12(Sigma, Deisenhofen, DE), RPMI-1640(Sigma), 둘베코 변형 이글 배지(DMEM; Sigma), 최소 필수 배지(MEM; Sigma), 이소코브 변형 둘베코 배지(IMDM; Sigma), CD-CHO(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), CHO-S(Invitrogen), 무혈청 CHO-배지(Sigma) 및 무단백질 CHO 배지(Sigma)를 포함한다.
"생산 세포" 또는 "생산자 세포" 또는 "생산 클론"이란 용어는 단백질을 제조하는 방법에 사용되는 세포를 의미한다. 구체적으로, 이것은 재조합 단백질의 산업적 생산에 사용되는 유전자 변형 세포를 포함한다. 본 발명의 범위 내에서, 이 용어는 특히 재조합 단백질을 발현하여 이 단백질을 제조하는데 사용되는 유전자 변형된 진핵생물 숙주 세포를 포함한다. 이것은 특히 치료용 단백질을 생산하기 위한 모노클로날 세포주를 포함한다.
본 발명은 다음과 같은 단계를 포함하는 단세포 배양 방법을 기술한다: (a) 세포 집단을 배양하는 단계, (b) 상기 세포 풀(cell pool)로부터 단세포를 분리하는 단계 및 (c) i) 살아있는 알부민-유전자도입 세포에 의해 배지 내로 직접 분비되는 알부민, 바람직하게는 사람 혈청 알부민(HSA)을 함유하는 조정 배지에서 상기 단세포를 배양하는 단계. 구체적 양태에서, 본 발명은 살아있는 알부민-유전자도입 세포에 의해 분비되는 알부민이, 상당히 더 낮은 농도에서, 재조합 알부민 또는 정제된 알부민이 재클로닝 효율에 미치는 효과와 동일한 효과를 나타내는 방법을 제공한다. 본 발명은 다음과 같은 단계를 포함하는 단세포 배양 방법을 기술한다: (a) 세포 집단을 배양하는 단계, (b) 상기 세포 풀로부터 단세포를 분리하는 단계, 및 (c) 상기 단세포를 조정 배지, 즉 i) 살아있는 알부민-유전자도입 세포에 의해 상기 배지 내로 직접 분비되는 알부민, 바람직하게는 사람 혈청 알부민(HSA), ii) 상당히 더 낮은 농도에서, 재조합 알부민 또는 정제된 알부민이 재클로닝 효율에 미치는 효과와 동일한 효과를 달성하는, 살아있는 알부민-유전자도입 세포에 의해 분비되는 알부민을 함유하는 조정 배지에서 배양하는 단계.
구체적 양태에서, 본 발명은 살아있는 알부민-유전자도입 세포에 의해 분비된 알부민이, 적어도 2배 더 낮은 농도에서, 재조합 알부민 또는 정제된 알부민이 재클로닝 효율에 미치는 효과와 동일한 효과를 나타내는 방법을 제공한다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 살아있는 알부민-유전자도입 세포에 의해 분비된 알부민이, 적어도 5배 더 낮은 농도에서, 재조합 알부민 또는 정제된 알부민이 재클로닝 효율에 미치는 효과와 동일한 효과를 나타내는 방법을 제공한다. 구체적 양태에서, 본 발명은 i)의 알부민 농도가 재조합 알부민 또는 정제된 알부민을 함유하는 비슷한 배양 혼합물보다 적어도 2, 바람직하게는 적어도 5배 더 낮은 방법을 제공한다. 다른 구체적 양태에서, 본 발명은 단계 (b) 및 (c)의 단세포가 관심 단백질을 발현하는 방법을 제공한다.
바람직한 양태에서, 단계 c)는 무혈청 조건 하에서, 바람직하게는 화학적으로 정의된 및/또는 인슐린 무함유 배지에서 수행된다. 구체적 양태에서, 본 발명은 단계 (c)에서 알부민이 200 mg/L 미만, 바람직하게는 100 mg/L 미만, 특히 바람직하게는 60 mg/L 미만의 농도로 존재하는 방법을 제공한다. 다른 구체적 양태에서, 본 발명은 단계 (c) ii)의 알부민이 2 내지 100, 2 내지 5, 5 내지 100, 20 내지 100 또는 5 내지 10배 더 낮은 농도, 바람직하게는 5배 더 낮은 농도, 가장 바람직하게는 10배 낮은 농도로 존재하는 방법을 제공한다.
바람직한 양태에서, 본 발명은 단계 (c)에서, 배양 1일 내지 4일 사이에 분리한 살아있는 알부민-유전자도입 세포의 세포 상청액이 첨가되는 방법을 제공한다. 특히 바람직한 양태에서, 본 발명은 단계 (c)에서, 배양 2일째에 분리한 살아있는 알부민-유전자도입 세포의 세포 상청액이 첨가되는 방법을 제공한다. 다른 구체적 양태에서, 본 발명은 세포 상청액이 1 내지 4백만, 바람직하게는 1 내지 2백만 알부민-유전자도입 세포/ml의 세포 배양물로부터 분리되는 방법을 제공한다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 세포 상청액은 1 내지 4백만, 바람직하게는 1 내지 2백만 알부민-유전자도입 세포/ml의 세포 배양물에서 분리되고, i)에서의 알부민 농도는 재조합 알부민 또는 정제된 알부민을 함유하는 비슷한 배양 혼합물보다 적어도 5 내지 10배, 바람직하게는 적어도 10배 더 낮다.
다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 단계 c)의 조정 배지가, 살아있는 알부민-유전자도입 피더 세포의 첨가에 의해 생산되는 방법을 제공한다. 알부민-유전자도입 피더 세포는 ml당 최대 500,000개가 첨가되는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에 따른 방법은 알부민-유전자도입 피더 세포가 적어도 2주 동안 계속적으로 단계 c)의 배지에 남아있는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 단계 c)의 조정 배지는, 500,000개 이하의 알부민-유전자도입 피더 세포/ml가 첨가되고 i)의 알부민 농도가 재조합 알부민 또는 정제된 알부민을 함유하는 비슷한 배양 혼합물의 농도보다 적어도 5 내지 100배, 바람직하게는 20 내지 100배(바람직하게는 100배 초과) 더 낮은, 살아있는 알부민-변이유전자 피더 세포의 첨가에 의해 생산된다.
다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 단계 (c)의 조정 배지가, 단계 (b) 및 (c) 유래의 단세포가 알부민-유전자도입 세포라는 사실에 의해 생산되는 방법을 제공한다. 특히 바람직한 양태에서, 단세포는 알부민 및 관심 유전자에 대한 유전자도입 세포이고, 단세포는 알부민과 동시에 관심 단백질을 생산한다. 구체적 양태에서, 본 발명은 단계 c)에서,
a) 살아있는 알부민-유전자도입 피더 세포가 첨가되거나,
b) 배양 1일 내지 4일 사이, 바람직하게는 배양 2일째에 분리한 살아있는 알부민-유전자도입 세포의 세포 상청액이 첨가되는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 방법 중 하나에 의해 생성되는 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 관심 단백질을 세포에서, 바람직하게는 CHO 세포에서, 바람직하게는 무혈청 배양 조건 하에 생산하는 방법으로서,
a) 관심 단백질을 암호화하는 관심 유전자를 함유하는 세포 집단을 생산하는 단계,
b) 상기 세포들의 성장을 허용하는 배양 조건 하에 상기 세포들을 배양하는 단계,
c) 단세포를 분리하여 용기, 예컨대 96웰 플레이트에 공급하는 단계,
d) a) 배양 1일 내지 3일 사이, 바람직하게는 배양 2일째에 분리한 살아있는 알부민-유전자도입 세포의 세포 상청액, 또는 b) 살아있는 알부민-유전자도입 피더 세포의 존재 하에 조정 배지에서 상기 단세포를 배양하는 단계,
e) 상기 관심 단백질의 발현 수준에 상응하는 세포를 선택하는 단계,
f) 상기 관심 단백질을, 예컨대 상청액으로부터 세포 성분을 분리하여, 수거하는 단계, 및
g) 상기 관심 단백질을 정제하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
구체적 양태에서, 본 발명은 관심 단백질이 재조합 단백질, 바람직하게는 치료용 단백질, 바람직하게는 항체 또는 항체 융합 단백질 또는 항체 단편인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
구체적 양태에서, 본 발명은 단세포가 햄스터 또는 쥐 세포, 바람직하게는 마우스 골수종 세포, 특히 바람직하게는 CHO 또는 BHK 세포 또는 NS0 세포인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 다른 구체적 양태에서, 본 발명은 살아있는 알부민-유전자도입 세포가, 상기 개별적으로 공급되는 세포와 동일한 종에서 유래되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 세포는 "중국 햄스터 난소"(CHO) 세포인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 세포는 개별적으로 공급되는 세포의 종에 따라, 햄스터 또는 쥐 세포, 바람직하게는 마우스 골수종 세포, 특히 바람직하게는 CHO 또는 BHK 세포 또는 NS0 세포이다.
특별한 양태에 따르면, 본 발명은 자기 유래의 알부민-유전자도입 세포 또는 피더 세포와 관련이 있는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
다른 특별한 양태에 따르면, 본 발명은 단계 b)에서 단세포의 분리가 "한계 희석" 또는 "형광 활성화 세포 분류"(FACS) 장치에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 단계 (b) 및 (c)에서 세포가 관심 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 특히, 관심 단백질은 치료용 단백질, 바람직하게는 항체, 항체 융합 단백질 또는 항체 단편이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따라 제공되는 방법에 의해 제조되는 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 방법을 이용하여, 생산 세포를 선택하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 생물약제 단백질 제조를 위한 본 발명에 따른 생산 세포의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은
a) 배양 1일 내지 4일 사이, 바람직하게는 배양 2일째에 분리한 살아있는 알부민-유전자도입 세포의 세포 상청액, 또는
b) 상기 배지의 조정을 위한 살아있는 알부민-유전자도입 피더 세포를 함유하는, 단세포 배양을 가능하게 하는 무혈청 조정 배양 배지를 제공한다.
본 발명에 따른 배지는 알부민 농도가 200 mg/L 미만, 보다 바람직하게는 100 mg/L 미만, 특히 바람직하게는 60 mg/L 미만인 것이 바람직하다. 자기 유래의 피더 세포가 사용되는 것이 바람직하다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 배양되는 단세포가 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 배지를 제공한다. 특히 바람직하게는, 이 단세포가 관심 단백질을 발현한다.
본 발명을 실시하기 위해, 다른 언급이 없는 한, 세포생물학, 분자생물학, 세포배양, 발효기술 등의 당업자에게 일반적으로 공지된 통상의 기술이 사용된다. 이하 실험 데이터는 본질적으로 예시적이며, 제한적이지 않다.
실험 부문
장치 및 방법
세포 배양
세포 CHO-DG44/dhfr-/-(Urlaub et al., 1983)은 세포 배양 플라스크에서 하이포잔틴 또는 티미딘이 보충된 무혈청 HyQ SFM 4 CHO 배지(HyClone) 또는 BI 자체 배지에 세포를 현탁시켜 가습 대기 및 5% CO2 하에 37℃에서 영구 배양한다. 세포수와 생존성은 CEDEX Cell Counter(Innovatis, DE) 또는 트립판 블루 염색으로 측정한 다음, 세포는 1 내지 3 x 105/ml의 농도로 접종하고 2 내지 3일마다 수행한다. 재조합 CHO-DG44는 단세포 클로닝에 사용한다. 클로닝된 재조합 세포의 배양은 상기 세포와 유사하게 수행한다. 또한, 하이포잔틴 및 티미딘 없는 HyQ 배지, Ex-Cell 배지(JRH, USA) 또는 BI 자체 배지를 배지로서 사용했다.
세포 NS0은 세포 배양 플라스크에서 무혈청 하이브리도마 배지, 동물 성분-무함유 배지(Sigma, Aldrich, St. Louis, USA)에 세포를 현탁시켜 가습 대기 및 5% CO2 하에 37℃에서 영구 배양할 수 있다. 세포수와 생존성은 CEDEX Cell Counter(Innovatis, DE) 또는 트립판 블루 염색으로 측정한 다음, 세포는 1 내지 3 x 105/ml의 농도로 접종하고 2 내지 3일마다 수행한다.
방사선조사에 의한 피더 세포의 제조
혈청 및 단백질 없이 성장하는 현탁된 CHO-세포(형질감염되지 않은 세포)를 180g에서 10분 동안 원심분리하고 HBSS(행크스(Hank's) 평형 염 용액)에 1 x 106/ml의 세포 농도로 조정했다.
그 다음, 세포는 방사선원(Cs137-방사선조사장치, Gammacell 2000, Molsgaard Medical A/S, Denmark)을 이용하여 에너지 조사 선량 4 Gy/분으로 방사선조사했다. 방사선조사 후, 세포는 세포에 특이적인 Ex-Cell 배지(JRH, USA) 또는 BI 자체 배지(예: TH-9) 중에서 96웰 미세역가 플레이트에 웰마다 약 10000 세포씩 접종하고, 약 37℃ 및 5% CO2에서 항온배양실 대기에 보관했다.
HSA-생산 피더 세포는 동일한 방식으로 생산한다.
이 과정은 NS0 세포로도 적절히 수행하고, 피더 세포는 세포에 특이적인 특정 배지에 유지/접종한다.
조정 배지의 제조
조정 배지는 동물 세포 배양물의 상청액으로부터 수득한다. 세포는 충분한 접종 밀도로 투입하고 1 내지 7일 동안 배양한다. 상청액은 원심분리하여 세포로부터 분리하고 그 후 멸균 여과한다. 수득되는 여과액을 조정 배지로 사용한다.
ELISA 에 의한 HSA 농도 측정
HSA 농도는 Bethyl(Cat.-No. E80-129)에 의해 제조된 사람 알부민 ELISA 정량 키트를 이용하여 제조자의 설명서에 따라 측정한다.
FACS -기반 세포 공급
자동 세포 공급(단세포 또는 다중세포 공급)은 Autoclone 유닛을 이용하여 아르곤 레이저(488nm)가 장착된 유세포분석기(Coulter EPICS Altra(Messrs. Beckman-Coulter, Miami, FL, USA)로 수행한다. 세포는 대수증식기에 원심분리하고, 필요한 세포 농도가 수득될 때까지 완충액에 흡수시킨다. 그 다음, 세포는 산란광에서 자신의 위치에 따라 8000 내지 12000 세포/초의 속도로 "Hypersort Option"을 사용하여 분류한다. 형광 단백질을 발현하는 세포는 대안적으로 세포내 발현된 형광 단백질과 비교한 형광 강도에 따라 분류할 수 있다. 세포는 피더 세포가 제공된 96웰 미세역가 플레이트(선택적)에 각각 개별적으로 공급한다. CHO 세포의 분류 동안, 세포는 HSA의 상응한 보충물 및 바람직하게는 IGF 또는 인슐린을 구비한 BI 자체 배지 또는 Ex-Cell 배지(JRH, USA)에 공급한다.
NS0 세포의 경우, 세포 공급은 하이브리도마 배지, 동물 성분-무함유 배지(Sigma, Aldrich, St.Louis, USA)에서 적절히 수행한다.
재클로닝 효율의 계산
재클로닝 효율은 플레이트당 총 웰 수에 대한 플레이트당 양성 웰의 비율로부터 계산한다. 양성 웰의 정의는 정확하게 하나의 클론이 존재하는 것이다.
실시예
실시예 1: HSA -생산 CHO -세포의 제조
현탁액에서 무혈청 하에 성장하는 CHO-DG44 세포(Urlaub and Chasin, 1980)는 선택성 마커로서 DHFR과 사람 혈청 알부민(HSA)에 대한 발현 카세트를 보유하는 플라스미드로 형질감염시킨다. HT-무함유 배지에서 연속 배양하여 안정하게 형질감염된 HSA-세포 풀을 생산한다. HSA-특이적 ELISA를 이용하여 대부분의 HSA를 분비하는 풀을 선택한다. 그 다음, 메토트렉세이트(MTX)의 존재 하에 배양하여 유전자 증폭을 실시한다. 이어서 한계 희석에 의해 HSA-생산 세포주를 초기 불균질 세포 집단으로부터 제조한 다음, 이 세포주를 특이적 HSA-생산성에 대해 시험한다. 이 세포주는 MTX 농도가 증가된 배지에서 배양하여 추가 유전자 증폭 단계로 실질적으로 처리하여 HSA 분비율을 더욱 증가시킨다. MTX는 또한 동시에 세포 성장의 감소를 유도할 수 있으므로, 수득되는 세포주는 그 다음 생산성 증가 및 생육성에 대해 조사하고, 최고의 생산성과 양호한 생육을 나타내는 세포주를 선택한다. 이 세포로부터 향후 모든 실험에서 입수할 수 있는 세포 은행이 생산된다.
실시예 2: HSA -생산 세포 유래의 조정 배지의 사용에 의한 재클로닝 효율의 증가
본 발명의 한가지 가능한 양태는 재클로닝 효율을 증가시키기 위한 HSA-생산 세포의 이용으로 이루어진다. 재클로닝 전에, 수일 동안 배양 배지를 조정하는, 즉 성장 인자 및 특히 세포에 의해 배지 내로 분비되는 HSA를 방출하는, HSA-생산 세포의 배양을 개시한다. 재클로닝 일에, 이와 같이 조정된 배지를 원심분리, 여과(선택적)에 의해 살아있는 HSA-생산 세포로부터 분리하고, 재클로닝 배지에 1:1의 비율로 첨가한다.
배지 조정에 최적인 기간을 측정하기 위해, 조정된 배지를 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 및 7일째 배양물로부터 수득하고 재클로닝 실험에 사용했다. 사용된 양성 대조군은 정제된 재조합 HSA 500 mg/L가 첨가된 새로운 배지이다.
도 2A, B에서 볼 수 있듯이, HSA-생산 세포의 조정 배지를 사용한 결과, 음성 대조군에 비해 단세포 공급 효율의 유의적인 증가가 초래된다. 재조합 HSA를 첨가해도(양성 대조군) 재클로닝 효율이 증가하지만, 2 내지 5일 동안 조정된 HSA-분비 세포의 배지만큼은 아니었다. 조정 배지 중의 HSA 농도는 시간이 경과함에 따라 연속해서 증가하지만, 재클로닝 효율은 5일 넘게 조정된 배지가 사용될 때에는 감소한다. 놀랍게도, 효율의 최대 증가는 HSA 농도 10 내지 약 60 mg/L가 양성 대조군에 사용된 재조합 HSA의 농도보다 상당히 더 낮은, 2일, 3일 또는 4일째 조정 배지에 의해 수득된다. 이것은 분비된 HSA가 저농도에서도 활성이고 재조합 HSA에 비해 재클로닝 효율의 증가와 관련하여 5 내지 50배 높은 효과를 나타낸다는 것을 보여준다.
실시예 3: 다른 배지에서 재클로닝 효율의 증가
HSA-생산 세포 유래의 조정 배지의 사용에 의한 재클로닝 효율의 증가가 배지와 무관한 것인지를 시험하기 위해, 단세포를 여러 배지에서 재클로닝했다: 하나의 배치에서는 단세포를 BI 자체 배지에서 CHO-DG44 피더 세포의 존재 하에 공급하고(도 3A), 다른 배치에서는 피더 세포 없이 시판 배지 중에서 공급했다(도 3B).
두 배지에서, HSA-분비 세포 유래의 조정 배지를 사용한 결과, 재클로닝 효율이 유의적으로 증가하여, 둘 다 재조합 HSA가 재클로닝 배지에 첨가된 양성 대조군 및 음성 대조군에서보다 높았다. 시판 배지에 피더 세포가 없는 배치에서는, 음성 대조군에서는 세포가 전혀 생존하지 않았지만, HSA-생산 세포의 조정 배지를 사용한 결과 5 내지 13%의 재클로닝 효율이 달성될 수 있다.
두 실험 모두, 조정 배지 유래의 분비된 HSA는 유의적으로 더 낮은 농도에서 작용하여 배지에 재조합적으로 첨가된 HSA보다 더 효율적이라는 것을 보여준다.
실시예 4: HSA -생산 피더 세포의 결과로서 재클로닝 효율의 증가
HSA-생산 세포의 예비 배양물 유래의 조정 배지를, 개별적으로 공급되는 세포를 접종하기 전에 재클로닝 배지에 한 번 첨가한다. 따라서, 이 세포는 재클로닝 후 출현 3주 단계 동안 초기에 한번만 HSA-함유 배지를 공급받는다. 이에 반해, HSA-생산 피더 세포는 출현하는 단세포 클론에 HSA를 연속해서 공급할 수 있다.
HSA-생산 피더 세포의 사용이 재클로닝 효율을 더욱 증가시키는지를 조사하기 위해, CHO-DG44 세포를 HSA-생산 피더 세포 및 비-HSA-생산 피더 세포와 함께 4개의 96웰 플레이트에 단독으로 공급한다. 이전 실시예에서처럼, 재클로닝 배지는 HSA-생산 예비 배양물 유래의 조정 배지 50%를 함유한다. 3주 후, 각 세포 배양 플레이트에서 출현하는 모노클로날 세포 콜로니를 계수하고 재클로닝 효율을 계산한다.
도 4에 도시된 바와 같이, 재클로닝 효율은 HSA-생산 피더 세포의 사용 시에, 정상 피더 세포를 함유하는 플레이트에서보다 상당히 더 높다. 증가율은 약 25%이다. 따라서, HSA-조정 배지와 HSA-생산 피더 세포를 조합하면, 재클로닝 효율의 더욱 유의적인 증가가 달성될 것이다.
실시예 5: HSA -생산 숙주 세포는 재클로닝 효율의 증가를 나타낸다.
재클로닝 효율을 증가시키는 다른 가능한 방식은 치료용 단백질을 생산하는 HSA-생산 숙주 세포를 사용하는 것일 수 있다. 이 방식에서 재클로닝 동안 개별적으로 공급되는 생산자 세포는 스스로 HSA를 생산할 수 있고, 스스로 자가분비 루프를 통해 스스로 자극할 수 있다. 이 과정이 실제 재클로닝 효율의 증가를 유도하는지를 점검하기 위해, 정상 CHO-DG44 세포와 HSA-생산 세포를 DG44- 및 HSA-생산 피더 세포 위에 각각 접종했다. 3주 후, 출현하는 콜로니를 계수하고 3개 배치 모두의 재클로닝 효율을 계산한다.
도 5는 변경되지 않은 CHO-DG44 숙주와 피더 세포를 보유한 배양 디쉬에서 재클로닝 효율이 가장 낮다는 것을 보여준다. 한편, HSA-생산 세포가 재클로닝되면, 더 많은 모노클로날 콜로니가 바로 출현한다. 이것은 HSA-생산 세포가 생존하여 재클로닝하고 복제할 수 있는 배양물을 형성할 확률이 HSA를 분비하지 않는 세포보다 높다는 것을 보여준다.
재클로닝 효율의 최대 증가는 HSA-생산 숙주 세포가 HSA-생산 피더 세포에 접종된 조합에 의해 수득된다. 이 혼합물은 재클로닝 효율을 40% 이상 추가로 증가시킨다. 이것은 HSA-생산 피더 세포가 없는 대조 혼합물과 비교 시, 50% 이상 증가될 수 있다.
실시예 6: NS0 -세포의 재클로닝 효율 증가
이상의 실험들은 햄스터 세포의 재클로닝 효율이, 분비된 사람 혈청 알부민에 의해 증가될 수 있다는 것을 보여준 것이다. 이 결과는 HSA가 다른 종의 재클로닝 효율에 긍정적인 효과를 미친다는 것을 시사하는 경향이 있다.
이 가설을 시험하기 위해, 치료용 단백질을 생산하는 쥐 NS0 하이브리도마 세포를 재클로닝으로 처리한다. 이 세포는 1차로 새 배지에 놓고, 2차로 HSA-생산 CHO 세포 배양물 유래의 조정 배지가 첨가된 배지에, 3차로 HSA-생산 피더 세포 상에 놓는다. 새 배지 또는 비-HSA-분비 세포의 세포 배양물 유래의 조정 배지에서 재클로닝한 결과와 비교 시, HSA-생산 세포의 사용은 재클로닝 효율에 긍정적인 효과를 나타낸다. 이것은 HSA-분비 세포 유래의 조정 배지의 사용 및 HSA-생산 피더 세포의 사용 시에도 모두 해당된다. 이것은 햄스터 세포에 의해 분비된 사람 HSA가 쥐 세포의 재클로닝을 보조할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 7: 분비된 HSA 의 사용은 사람 세포의 재클로닝 효율을 증가시킨다.
이 발견을 더 넓은 기반에서 정착시키기 위해, 사람 HEK293계 생산 세포를 HSA-생산 세포 유래의 조정 배지의 존재 및 부재 하에 재클로닝한다.
새 배지 또는 비-HSA-분비 세포의 세포 배양물 유래의 조정 배지에서의 재클로닝과 비교 시, HSA-생산 세포의 사용은 재클로닝 효율에 긍정적인 효과를 나타낸다. 이것은 HSA-분비 세포의 조정 배지 및 HSA-생산 피더 세포의 사용 시에도 모두 해당된다. 이로부터 분비된 HSA의 효과가 여러 종의 개별적으로 공급된 세포의 재클로닝 효율에 작용하고, 즉 활성이 종마다 작용한다는 결론을 내릴 수 있다.
실시예 8: HSA -생산 세포의 재클로닝 효율 증가는 고-생산성 세포의 동정 확률을 증가시킨다.
불균질 세포 집단에서 생산자 세포의 비생산성 수준은 정규분포되어 있다. 이것은 대부분의 세포가 평균 생산성을 나타내는 반면, 몇몇 세포가 다량을 생산하고 아주 적은 비율의 세포만이 매우 다량의 재조합체 산물을 생산한다는 것을 의미한다. 이 사실은 산업적 세포주 개발 프로그램에서 세포 선별과 고 생산성 세포의 동정에 드는 노력을 설명한다. 또한, 이러한 고 생산자를 발견할 가능성이 재클로닝 효율과 직접적인 상관관계가 있다는 것을 의미하기도 한다: 즉 재클로닝 후 더 많은 세포가 출현할수록 이 중에서 고 생산성 세포가 존재할 가능성이 높아진다.
이것을 실제로 입증하기 위해, 치료용 단백질을 분비하는 안정하게 형질감염된 CHO 생산 세포의 불균질 집단을 재클로닝으로 처리한다. 일부는 모 CHO-DG44 세포 유래의 50% 조정 배지가 첨가된 재클로닝 배지(배치 1)에 넣고, 일부는 HSA-생산 세포의 배양물 유래의 50% 조정 배지(배치 2)에 넣었다.
이전 실시예에서처럼, HSA-생산 세포 유래의 배지가 사용된 배치에서 더 많은 세포가 클론성 세포주로 성장했다.
다음 단계로, 두 재클로닝 실험으로부터 100개의 클론을 선택하여 산물-특이적 ELISA로 생산성을 측정했다. 이러한 100개 클론에서의 비생산성 분포는 두 경우 모두 정규분포를 보여준다. HSA-조정 배지 유래의 배지를 이용하여 재클로닝된 세포에서 출현한 100개 클론에서(배치 2), 이 곡선의 평균 값은 유의적으로 오른쪽으로, 즉 더 높은 생산성 쪽으로 이동했다. 이 배치 2 유래의 10개의 최대 생산성 세포의 평균 생산성 값은 HSA-생산 세포가 없는 재클로닝 배치(배치 1) 유래의 10개의 최대 세포주의 생산성보다 높았다. 따라서, 치료용 단백질을 생산하기 위한 최대 생산성 클론으로 선택된 세포주는 배치 2에서 유래한다.
이것은 생산성이 높은 더 많은 세포가 실제로 HSA-생산 세포를 보유한 재클로닝 배치에서 수득되어, 이들을 동정할 확률을 증가시킨다는 것을 확인시켜준다. 동시에, 재조합 단백질 산물을 매우 다량으로 생산하여 생산용 고-생산성 클론을 선택 및 사용할 수 있게 하는 몇몇 세포의 발견 가능성을 증대시킨다.

Claims (17)

  1. (a) 세포 집단을 배양하는 단계,
    (b) 상기 세포 풀(cell pool)로부터 단세포를 분리하는 단계, 및
    (c) 살아있는 알부민-유전자도입 세포에 의해 배지 내로 직접 분비되는 알부민, 바람직하게는 사람 혈청 알부민(HSA)을 함유하는 조정 배지(conditioned medium)에서 상기 단세포를 배양하는 단계
    를 포함하는, 단세포의 배양 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 c)의 상기 살아있는 알부민-유전자도입 세포에 의해 분비되는 알부민이, 상당히 더 낮은 농도에서, 재조합 알부민 또는 정제된 알부민이 재클로닝(recloning) 효율에 미치는 효과와 동일한 효과를 달성하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (c)의 알부민이 200 mg/L 미만, 바람직하게는 100 mg/L 미만, 특히 바람직하게는 60 mg/L 미만의 농도로 존재하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서, 배양 1일 내지 4일 사이에 분리한 살아있는 알부민-유전자도입 세포의 세포 상청액이 첨가되는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 단계 (c)에서, 배양 2일째에 분리한 살아있는 알부민-유전자도입 세포의 세포 상청액이 첨가되는, 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 세포 상청액이 1 내지 4백만, 바람직하게는 1 내지 2백만 알부민-유전자도입 세포/ml의 세포 배양물로부터 분리되는, 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)의 상기 조정 배지가, 살아있는 알부민-유전자도입 피더 세포(feeder cell)의 첨가에 의해 생산되는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 최대 500,000 알부민-유전자도입 피더 세포/ml가 첨가되는, 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 알부민-유전자도입 피더 세포가 적어도 2주의 기간 동안 계속적으로 단계 c)의 상기 배지에 남아있는, 방법.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)의 상기 조정 배지가, 단계 (b) 및 (c) 유래의 상기 단세포가 알부민-유전자도입 세포라는 사실에 의해 생산되는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 단계 c)에서
    a) 살아있는 알부민-유전자도입 피더 세포가 첨가되거나, 또는
    b) 배양 1일 내지 4일 사이, 바람직하게는 배양 2일째에 분리한 살아있는 알부민-유전자도입 세포의 세포 상청액이 첨가되는, 방법.
  12. 세포에서 관심 단백질을 생산하는 방법으로서,
    a) 관심 단백질을 암호화하는 관심 유전자를 함유하는 세포 집단을 생산하는 단계,
    b) 상기 세포들의 성장을 허용하는 배양 조건 하에 상기 세포들을 배양하는 단계,
    c) 단세포를 분리하여 용기 안에 공급하는 단계,
    d) i) 배양 1일 내지 3일 사이, 바람직하게는 배양 2일째에 분리한 살아있는 알부민-유전자도입 세포의 세포 상청액, 또는
    ii) 살아있는 알부민-유전자도입 피더 세포
    의 존재하에 조정 배지에서 상기 단세포를 배양하는 단계,
    e) 상기 관심 단백질의 발현 수준에 상응하는 세포를 선택하는 단계,
    f) 상기 관심 단백질을 수거하는 단계, 및
    g) 상기 관심 단백질을 정제하는 단계
    를 포함하여, 세포에서 관심 단백질을 생산하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단세포가 햄스터 또는 쥐 세포, 바람직하게는 마우스 골수종 세포, 가장 바람직하게는 CHO 또는 BHK 세포 또는 NS0 세포임을 특징으로 하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 살아있는 알부민-유전자도입 세포가, 상기 개별적으로 공급되는 세포와 동일한 종에서 유래함을 특징으로 하는, 방법.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 및 (c)의 상기 단세포가 관심 단백질을 발현함을 특징으로 하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 관심 단백질이 치료용 단백질, 바람직하게는 항체, 항체 융합 단백질 또는 항체 단편인, 방법.
  17. 단세포의 배양을 가능하게 하는 무혈청 조정 배양 배지로서,
    i. 배양 1일 내지 3일 사이에 분리한 살아있는 알부민-유전자도입 세포의 세포 상청액, 또는
    ii. 상기 배지의 조정을 위한 살아있는 알부민-유전자도입 피더 세포
    를 함유하는, 단세포의 배양을 가능하게 하는 무혈청 조정 배양 배지.
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