JP2012525826A - Cho/cert細胞系 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞培養技術の分野、具体的には、セラミドトランスファータンパク質(CERT)発現カセットを含むベクターコンストラクトを含む産生宿主細胞系に関する。それらの細胞系は、非トランスジェニック細胞系と比較して、改善された分泌特徴を有する。
ヒト治療における使用のための生物医薬品についてのマーケットは、高速で成長を続けており、900を超える生物医薬品が臨床試験において評価されており、推定売上は2010年で500億である。長年にわたり、増加数の生物医薬品が、ヒトタンパク質を正確にプロセシングし、修飾するそれらの能力のため、哺乳動物細胞から産生される。哺乳動物細胞からの生物医薬品の成功裏の高収量産生が、このように、重大であり、プロセスにおいて使用される組換えモノクローナル細胞系の特徴に依存する。
タンパク質分泌は、複雑な複数工程の機構である:細胞外空間又は外側細胞膜に輸送されることが運命付けられたタンパク質が、最初に、同時翻訳的に小胞体中に移入される。そこから、それらは脂質小胞中に充填され、ゴルジ装置に、最終的にはトランスゴルジネットワーク(TGN)から細胞膜に輸送され、そこで、それらは培養液中に放出される。
−ER常在分子シャペロンBiP(結合タンパク質BiP/GRP78)の過剰発現は、予想外に、低下した分泌をもたらした;
−酵素タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)の増強発現は、矛盾した結果を示した。
転写因子Xボックス結合タンパク質1(XBP−1)を使用した分泌操作が、効果を有さない、又は、分泌を増強することが観察されたが、しかし、アポトーシス細胞死が同時に増加し、不安定な表現型に導き、XBP−1高発現クローンの単離を予防した。
本発明は、2つの特定の新規産生宿主細胞系CHO/CERT 2.20及びCHO/CERT 2.41を記載する。これらの2つの細胞系は、DSMZにナンバーDSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)及びDSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)の下で寄託されており、組換えタンパク質産生のための理想的な宿主細胞系である。なぜなら、それらは、改善された分泌能力ならびに良好な増殖特徴を有するからである。
本発明者らは、本明細書で、CERT突然変異体S132Aが、Ser→Ala点突然変異を持ち、タンパク質キナーゼDによりもはやリン酸化されず、分泌を増強する際、野生型タンパク質よりも有意に効果的であることを実証することができた。
さらに、本発明者らは、本明細書で、CERT S132A発現レベルがその分泌増強効果と相関することを示し、細胞中の異種CERT S132Aのレベルが高いほど、前記細胞の分泌能力が高いことを意味する(図2)。
CERT S132A発現レベルと特異的な抗体産生性の間の相関を検討するために、本発明者らは、CERT突然変異体の低発現レベルを伴う2つのクローン細胞系及び高発現レベルを伴う2つのクローン細胞系(細胞内FACS染色におけるシグナル強度により判断する)を分析した(図2A)。7日間の流加プロセスにおいて、偽トランスフェクションされたコントロール細胞系は、平均産生性15pcdを示した(図2B)。低レベルのCERT SA突然変異体を発現する細胞クローンの特異的な産生性が、わずかに上昇しただけであったのに対し、高レベルのCERT突然変異体を伴うそれらのクローンは、約23pcdのIgG産物を分泌し、このように偽コントロールと比較して、明確に増加した特異的な産生性を示した(図2B)。これらのデータは、相関が、組換えタンパク質分泌に対するポジティブな効果とCERT S132A過剰発現のレベルとの間に存在することを示す。
・細胞の長期生成時間(それは、細胞系の開発において長期時系列をもたらす)
・単一細胞クローニング後のより低い効率及びその後のより遅い増殖
・スケールアップの間でのより長いタイムフレーム(特に、大スケールでの産生発酵槽のための接種の場合において)
・発酵槽運転当たりより低い産物収量。
・CERT突然変異体S132Aの高発現レベル、及び
・最適な細胞増殖。
・細胞内染色及びウエスタンブロッティングにより決定された高レベルのCERT発現
・シードストック培養における良好な増殖(生存率、倍加時間)ならびに
・工業的な産生プロセスを反映する流加培養中での最適な増殖(ピーク細胞密度、経時的な生細胞の積分(IVC)、生存率)。
−細胞系は、本発明者らが「CHO/CERT 2.20」と呼び、それは、DSMZにナンバーDSM ACC2989の下で寄託されており、非常に高いCERT S132A発現レベル及び非常に良好な増殖特徴を有し、それらは、親CHO野生型細胞のものよりもさらにより良好である。
この細胞系は、細胞系での挿入DNAと細胞の隣接染色体DNAの間で接合フラグメントを同定することにより固有に記載することができる。例えば、細胞系のDNAを1つ又は複数の制限酵素を用いて消化し、そのような接合フラグメントを、例えば、挿入DNAの適した標識フラグメントを使用したサザンブロット解析(ゲノム中の挿入部位を同定する特定のバンドパターンに導く)により同定する。そのような制限酵素は、例えば、以下に記載され、EcoRV、HindIII、KpnI、NcoI、NdeI、PvuII、SpeI、XhoI、AvaII、BstXI、SalIを含む。
−細胞系は、本発明者らが「CHO/CERT 2.41」と呼び、それは、DSMZにナンバーDSM ACC2990の下で寄託されており、非常に高いCERT S132A発現レベル及び非常に良好な増殖特徴を有し、それらは、親CHO野生型細胞のものよりもさらにより良好である。
この細胞系は、細胞系での挿入DNAと細胞の隣接染色体DNAの間で接合フラグメントを同定することにより固有に記載することができる。例えば、細胞系のDNAを1つ又は複数の制限酵素を用いて消化し、そのような接合フラグメントを、例えば、挿入DNAの適した標識フラグメントを使用したサザンブロット解析(ゲノム中の挿入部位を同定する特定のバンドパターンに導く)により同定する。そのような制限酵素は、例えば、以下に記載され、EcoRV、HindIII、KpnI、NcoI、NdeI、PvuII、SpeI、XhoI、AvaII、BstXI、SalIを含む。
−サイトメガロウイルス(CMV)エンハンサー/プロモーター、複数のクローニング部位(MCS)、ポリアデニル化シグナル、
−CERT S132A発現カセット、
−真核細胞においてピューロマイシンNアセチルトランスフェラーゼを選択マーカーとしてコードする発現カセット、
−複製起点、及び
−細菌におけるアンピシリン耐性のためのベータ−ラクタマーゼ発現カセット。
本発明のconCERT(商標)細胞系は、さらに、薬物開発をスピードアップしうる。なぜなら、しばしば、前臨床試験のための十分量の材料の生成が、時系列に関する決定的なワーク・パッケージであるからである。
本発明の最適化されたconCERT(商標)細胞系を、診断目的、研究目的(標的同定、リード同定、リード最適化)、又は販売中のもしくは臨床開発中の治療用タンパク質の製造のいずれかのための1つ又はいくつかの特定のタンパク質の生成のために使用することができる。それらは、分泌又は膜結合タンパク質(例えば表面受容体、GPCR、メタロプロテイナーゼ、又は受容体キナーゼなど)を発現又は産生するために等しく適用可能であり、それらは、同じ分泌経路を共有し、脂質小胞中に等しく輸送される。タンパク質は、次に、研究目的のために使用することができ、それは、細胞表面受容体の機能を特徴付けることを目的とする(例、表面タンパク質の産生ならびにその後の精製、結晶化、及び/又は分析のため)。これは、新たなヒト薬物治療の開発のために決定的に重要である。なぜなら、細胞表面受容体は、薬物標的の優勢なクラスであるからである。さらに、それは、細胞表面受容体と会合する細胞内シグナル伝達複合体の試験又は同じもしくは別の細胞上での可溶性増殖因子とそれらの対応する受容体との相互作用により部分的に媒介される細胞間コミュニケーションの分析のために有利になりうる。
定義
一般的な実施態様「含む」又は「含まれる」は、より具体的な実施態様「からなる」を包含する。さらに、単数形及び複数形は限定的な方法で使用されない。
本発明の経過において使用する用語は、以下の意味を有する。
用語「CERT」はセラミドトランスファータンパク質CERTを指し、それは、また、グッドパスチュア抗原結合タンパク質として公知である。CERTは、小胞体(ER)でのその産生部位からゴルジ膜へのセラミドの非小胞送達のために必須の細胞質タンパク質であり、そこでは、スフィンゴミエリン(SM)への変換が起こる(Hanada et al., 2003)。
用語「CHO/CERT」、「CHO/CERT SA」、「CHO/CERT S132A」を互換的に使用する。さらに、細胞系の命名「CHO/CERT 2.20」、「CHO/CERT SA 2.20」、「CHO/CERT S132A 2.20」を互換的に使用し、それらの全てが同じ細胞系クローン2.20(アクセッションナンバーDSMZ DSM ACC2989の下で寄託される)を記載する。細胞系の命名「CHO/CERT 2.41」、「CHO/CERT SA 2.41」、「CHO/CERT S132A 2.41」を互換的に使用し、それらの全てが同じ細胞系クローン2.41(アクセッションナンバーDSMZ DSM ACC2990の下で寄託される)を記載する。
本発明は、生物医薬品ポリペプチド/タンパク質の産生のための宿主細胞を生成するために適する。本発明は、特に、増強された細胞産生性を示す細胞による、目的の多数の異なる遺伝子の高収量発現のために適する。
より複雑な分子(例えばモノクローナル抗体など)の場合において、GOIは、2つの抗体鎖の1つ又は両方をコードする。
近年、種々の戦略が、scFvを多量体派生物として調製するために開発されてきた。これは、特に、改善された薬物動態及び体内分布特性を伴うならびに増加した結合アビディティーを伴う組換え抗体に導くことが意図される。scFvの多量体化を達成するために、scFvを、多量体化ドメインを伴う融合タンパク質として調製した。多量体化ドメインは、例えば、IgGのCH3領域又はコイルドコイル構造(ヘリックス構造)、例えばロイシンジッパードメインなどでありうる。しかし、scFvのVH/VL領域の間での相互作用を多量体化(例、ダイア、トリ、及びペンタボディ)のために使用する戦略もある。ダイアボディにより、当業者は二価ホモ二量体scFv派生物を意味する。scFv分子中のリンカーの5〜10アミノ酸への短縮は、ホモ二量体化の形成に導き、それにおいて鎖内VH/VLの重ね合わせが起こる。ダイアボディは、加えて、ジスルフィド架橋の取り込みにより安定化されうる。ダイアボディ−抗体タンパク質の例は、先行技術において公知である。
本発明は、DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)にナンバーDSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)の下で寄託されている細胞に関する。本発明は、細胞/細胞系に関し、その代表的なものがDSMZにナンバーDSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)の下で寄託されている。この細胞系は、細胞系の細胞の挿入DNAと隣接染色体DNAの間で接合フラグメントを同定することにより、固有に記載することができる。例えば、細胞系のDNAを1つ又は複数の制限酵素を用いて消化し、そのような接合フラグメントを、例えば、挿入DNAの適した標識フラグメントを使用したサザンブロット解析(ゲノム中の挿入部位を同定する特定のバンドパターンに導く)により同定する。そのような制限酵素は、例えば、以下に記載され、EcoRV、HindIII、KpnI、NcoI、NdeI、PvuII、SpeI、XhoI、AvaII、BstXI、SalIを含む。
本発明のさらなる好ましい実施態様において、全てのベクターコンストラクトが細胞ゲノム中に安定的に組み込まれる。
ゲノムDNAを鋳型として使用する場合での特定のPCRバンドパターン/フィンガープリント、それにより、2373bpのPCR産物が、配列番号2及び配列番号3のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して生成される、又は、
ゲノムDNAを鋳型として使用する場合での特定のPCRバンドパターン/フィンガープリント、それにより、660bpのPCR産物(配列番号6)が、配列番号4及び配列番号5のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して生成される、又は、
(a)のCERT特異的な2373bpのPCR産物と以下の制限酵素とのインキュベーションに起因する特定数のフラグメント及びフラグメントサイズ:
それにより、HindIIIを用いたインキュベーションが好ましい。
本発明の最も好ましい実施態様において、前記細胞は、CERT特異的な2373bpのPCR産物(ゲノムDNAを鋳型としてならびに配列番号2及び配列番号3のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して生成される)の制限酵素HindIIIとのインキュベーションに起因するサイズ2176bp及び197bpをそれぞれ伴う2つの特定のフラグメントにより特徴付けられる。
(a)親宿主細胞、好ましくはCHO又はNSO細胞、最も好ましくはCHO DG44細胞を提供すること、
(b)ベクターコンストラクトを、CERT S132A発現カセットを含む工程(a)の前記細胞中に導入すること、
(c)安定的にトランスフェクションされた細胞集団について選択すること、
(d)FACSベースの単一細胞クローニングによりモノクローナル細胞系を単離すること、
(e)以下についてスクリーニングすること
−高レベルなCERT S132A発現、
−シードストック培養中での最適な増殖、
−流加培養中での最適な増殖、
(f)工程(e)のスクリーニング基準に従って工程(d)の細胞クローンからモノクローナル細胞系を選択すること。
a)親宿主細胞、好ましくはCHO又はNSO細胞を提供すること、
b)ベクターコンストラクトを、CERT S132A発現カセットを含む工程(a)の前記親宿主細胞中に導入すること、
c)安定的にトランスフェクションされた細胞集団について選択すること、
d)FACSベースの単一細胞クローニングによりモノクローナル細胞系を単離すること、
e)以下について前記モノクローナル細胞系をスクリーニングすること
i)高レベルなCERT S132A発現、
ii)シードストック培養中での最適な増殖、
iii)流加培養中での最適な増殖、
工程(e)のスクリーニング基準に従って工程(d)の細胞クローンからモノクローナル細胞系を宿主細胞系として選択すること。
a)親宿主細胞、好ましくはCHO又はNSO細胞を提供すること、
b)ベクターコンストラクトを、CERT S132A発現カセットを含む工程(a)の前記親細胞中に導入すること、
c)安定的にトランスフェクションされた細胞集団について選択すること、
d)FACSベースの単一細胞クローニングにより細胞を単離すること、
e)以下について前記細胞をスクリーニングすること
i)高レベルなCERT S132A発現、
ii)シードストック培養中での最適な増殖、
iii)流加培養中での最適な増殖、
f)宿主細胞としての使用のために工程(e)のスクリーニング基準に従って単一クローン又は細胞のプールを選択すること。
好ましくは、工程(a)の前記親宿主細胞は、上に記載される定義下の宿主細胞である。好ましくは、工程(a)の前記親宿主細胞は、齧歯類細胞、例えばマウス又はハムスター細胞など、最も好ましくはCHO DG44細胞である。
好ましくは、工程(b)の前記ベクターコンストラクトは、図1Bに描写する以下の機能的エレメントを含む:
−サイトメガロウイルス(CMV)エンハンサー/プロモーター、
−複数のクローニング部位(MCS)、−CERT S132A発現カセット、
−真核細胞中での選択マーカーとしてピューロマイシンNアセチルトランスフェラーゼをコードする発現カセット、
−ポリアデニル化シグナル、
−複製起点、
−細菌中でのアンピシリン耐性のためのベータ−ラクタマーゼ発現カセット。
シードストック培養物を、工程(e)ii)において最適な増殖についてスクリーニングするための具体的な基準は、生存率、倍加時間である。
流加培養物を、工程(e)iii)において最適な増殖についてスクリーニングするための具体的な基準は、ピーク細胞密度、経時的な生細胞の積分(IVC)、生存率である。
流加培養中での前記スクリーニング基準は、特に有意である。なぜなら、それらは、工業的な産生プロセスにおける環境条件を反映するからである。
好ましい方法において、工程(b)のCERT S132A発現カセットは配列番号1からなる。
(a)発明の細胞を提供すること、
(b)細胞の増殖及び目的の少なくとも1つの遺伝子の発現を可能にする条件下で前記細胞を培養すること、
(c)目的のタンパク質を収集すること、及び
(d)目的のタンパク質を精製すること。
好ましい産生方法において、宿主細胞は、目的の遺伝子についての選択及び/又は増幅マーカーとして、グルタミンシンセターゼ(GS)又はDHFR、好ましくはDHFRを含む。
(a)ポリメラーゼ連鎖反応PCRを実施すること、
(b)ゲノムDNAを鋳型として使用すること、及び
(c)配列番号2及び配列番号3を伴うオリゴヌクレオチドプライマーを使用すること、
それにより2373bpのPCR産物が生成される。
前記方法の最も好ましい実施態様において、前記細胞は、CERT特異的な2373bpのPCR産物(ゲノムDNAを鋳型としてならびに配列番号2及び配列番号3のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して生成される)の制限酵素HindIIIとのインキュベーションに起因するサイズ2176bp及び197bpをそれぞれ伴う2つの特定のフラグメントにより特徴付けられる。
本発明は、さらに、タンパク質の製造のための発明の細胞(CHO/CERT 2.20=DSM ACC2989又はCHO/CERT 2.41=DSM ACC2990)の使用に関する。
さらに、本発明は、培地中に発明の細胞を含むリアクター/発酵容器に関する。
本発明は、また、発明の細胞、目的の遺伝子の発現のための発現ベクター、及び前記細胞の培養のための細胞培養液を含むキットに関する。本発明の特定の実施態様において、前記キットは発明の細胞を含み、それは、加えて、目的のタンパク質をコードする目的の遺伝子を含む少なくとも1つの(2つめの)ベクターコンストラクトを含み、それにより、前記細胞を培地中で培養し、それによってリアクター/発酵容器中での前記細胞の増殖を可能にする。
f)ゲノムDNAを鋳型として使用する場合での特定のPCRバンドパターン/フィンガープリント、それにより、2373bpのPCR産物が、配列番号2及び配列番号3のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して生成される、又は、
g)ゲノムDNAを鋳型として使用する場合での特定のPCRバンドパターン/フィンガープリント、それにより、660bpのPCR産物(配列番号6)が、配列番号4及び配列番号5のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して生成される、又は、
h)(a)のCERT特異的な2373bpのPCR産物と以下の制限酵素とのインキュベーションに起因する特定数のフラグメント及びフラグメントサイズ:
好ましい実施態様において、前記細胞は、DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)にナンバーDSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)の下で寄託される。
さらなる好ましい実施態様において、前記細胞は、DSMZにナンバーDSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)の下で寄託される。
材料及び方法
細胞培養
産生及び開発スケールで使用される全ての細胞系を、インキュベーター(Thermo, Germany)中の表面エアレーションTフラスコ(Nunc, Denmark)又は振盪フラスコ(Nunc, Denmark)中の連続シードストック培養において、温度37℃で及び5% CO2を含む大気中で維持する。シードストック培養物を、2〜3日ごとに播種密度1−3E5個細胞/mLで継代培養する。細胞濃度を、全ての培養物中で、血球計を使用することにより決定する。生存率をトリパンブルー色素排除方法により評価する。
細胞を、3x105個細胞/mlで、125ml振盪フラスコ中に、30mlのBI専売産生培地(抗生物質又はMTX(Sigma-Aldrich, Germany)を伴わない)中に播種する。培養物を120rpmで37℃及び5% CO2(続く3日目に2%に低下させる)において撹拌する。BI専売フィード溶液を毎日加え、pHを、必要に応じてNaCO3を使用してpH 7.0に調整する。細胞密度及び生存率を、トリパンブルー色素排除方法により、自動CEDEX細胞定量化システム(Innovatis)を使用して決定する。
細胞内染色のために、1×106個細胞を、PBS中の1%パラホルムアルデヒド中で20分間固定し、0.05% Tween−20を含むPBS中で透過処理する。その後に、細胞を1% BSA/PBS中に再浮遊させ、抗Flag M2モノクローナルマウス抗体(Sigma)及びAlexa488標識ヤギ抗マウス抗体(Invitrogen)を使用して染色する。蛍光シグナルをフローサイトメトリー(FACScalibur, Coulter)により定量的に解析する。ウエスタンブロッティング用の全細胞抽出物を、NP40緩衝液[1%(v/v)NP40、50mM HEPES pH 7.9、150mM NaCl、1mM EDTA、5mM EGTA、25mM NaF、及び40μL/mL完全プロテアーゼ阻害剤溶液(Roche)]中での15分間にわたる氷上での5×106個細胞の溶解により調整する。ライセートを、16,000xgで10分間にわたる遠心分離により取り除き、サンプル中のタンパク質濃度を、BCA1アッセイキット(Sigma)を使用して決定する。ウエスタンブロット解析のために、等量のタンパク質を、MOPS緩衝液を用いて、NuPAGE 10% Bis−Trisゲル(Invitrogen)上で、製造者のプロトコールに従って分離する。タンパク質を、PVDFメンブレン(Millipore)上に、トランスファー緩衝液を使用し、XCell IIブロットモジュール(Invitrogen)を使用してトランスファーする。1時間にわたる室温でのブロッキング薬剤(Invitrogen)を用いたブロッキング後、メンブレンを、抗Flag M2抗体(Sigma)を用いてプローブする。タンパク質を、ペルオキシダーゼ共役二次抗体を用いて、ECL Plus化学発光検出システム(Amersham Pharmacia)を使用して可視化する。
CHO−DG44細胞ならびにconCERT(商標)細胞系を、IgG1型抗体の重鎖及び軽鎖をコードする発現プラスミドを用いて安定的にトランスフェクションする。選択的条件下でのその後の培養により、安定的にトランスフェクションされたIgG産生細胞集団を、DG44親細胞系及びconCERT(商標)細胞の両方から生成する。細胞プールを、さらに、2〜3日ごとの継代培養を伴う標準的なストック培養計画に従って培養する。
CHO−DG44細胞及びCERT S132A突然変異体を発現するように操作されたconCERT(商標)細胞系に由来するIgG産生細胞における組換え抗体産生を評価するために、細胞上清からのサンプルを、標準的な接種培養から、3回連続の継代について各継代の終わりに回収する。産物濃度を、次に、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)により分析する。分泌されたモノクローナル抗体産物の濃度を、ヒトFcフラグメント(Jackson Immuno Research Laboratories)及びヒトカッパ軽鎖(Sigma)に対するHRPコンジュゲーションされた抗体を使用して測定する。
「FACS Vantage」(Becton Dickinson)フローサイトメーター(パルスプロセシング、ソート増強モジュール、及び自動細胞沈着ユニットを備える)を、分析及び細胞選別のために使用する。前方及び側方散乱(FSC/SSC)のドットプロット上で、ゲートを単一の生細胞の周辺に設定する。選別された細胞を、200μL増殖培地を含む96ウェルマイクロタイタープレート中に、1ウェル当たり1個の細胞で、自動細胞沈着ユニットを用いて沈着させる。
増殖中の細胞からのゲノムDNA及び全RNAを、TRIzol(登録商標)(Invitrogen, Germany)を使用し、製造者の指示に従って単離する。RNAを、次に、DNase Iを用いて30分間にわたり37℃で処理する。第1鎖cDNA合成を、Cloned AMV First-Strand cDNA Synthesis Kit(Invitrogen, Germany)を使用して行う。3μgの全RNA及びオリゴ(dT)オリゴヌクレオチドを用いて開始する。ヒトCERT転写物の定量的レベルを、Absolute(商標)QPCR SYBR(登録商標)Green Fluorescein Mix(ABgene, Surrey, UK)及びMyIQ Real Time Detectionソフトウェア(BioRad, Germany)により制御されるサーマルサイクラーを使用したリアルタイムPCRにより決定する。
CMVセンス:
及び
ターミネーターアンチセンス:
DNA又はmRNAのいずれかを鋳型として使用し、CERT S132A発現を、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用したRT−PCRにより検出する:
及び
(660bpのPCR産物(配列番号6)をもたらす)。
実施例1:CHO/CERT S132A細胞系の特徴付け及び固有の同定
CHO/CERT S132A細胞系(本明細書において「conCERT(商標)」細胞系とも呼ぶ)は、一般的に、ヒトCERT突然変異体S132Aの異種発現を伴う細胞として記載することができる。
・サイトメガロウイルス(CMV)エンハンサー/プロモーター
・Flag(商標)タグ付きCERT−SAをコードする発現カセット
・ウシ成長ホルモンからのポリアデニル化シグナル(bGH pA)
・ピューロマイシン耐性のための発現カセット
・複製起点
・細菌中でのアンピシリン耐性のためのベータ−ラクタマーゼ発現カセット
ターミネーターアンチセンス:
及びCERT−rev:
(以下の配列(配列番号6)を伴う660bpのPCR産物をもたらす):
本発明において記載されるCHO/CERT S132A細胞系を生成するために、CHO−DG44細胞[Urlaub et al., Cell 33, 1983]を、N末端Flag(商標)エピトープタグに融合されたヒトCERTタンパク質の突然変異体バリアント(CERT Ser132→Ala、本明細書において「CERT−S132A」とも呼ばれる)についての発現カセットを保有する発現コンストラクトを用いてトランスフェクションする(図1)。
CERT−S132Aを過剰発現する安定的にトランスフェクションされた細胞プールを、FACSベースの単一細胞クローニングに供し、モノクローナルconCERT(商標)細胞系を生成する。CHO/CERT S132Aクローンを、次に、2つのパラメータに関して広範にスクリーニングする:a)高レベルのCERT−S132A発現、b)接種培養及び流加プロセスの両方における最適な細胞増殖特性。第1回の選択中に、CERT−S132A発現を、>100のCHO/CERT S132Aクローンにおいて、細胞内染色により評価する。これらから、最も高いレベルの細胞内CERT−S132Aを伴う15のクローンを、増殖及びさらなる解析のために選択する。15の選択されたCHO/CERT S132AクローンにおけるCERT−S132A発現を、さらに、抗Flag(商標)抗体を使用したウエスタンブロットにより評価する(図3)。CERT−SA突然変異体の過剰発現は、クローン1.15、2.20、2.31、2.41、2.65、2.67、3.11、及び3.31において最も高い。工業的な産生宿主細胞系について、シードストック培養ならびに無血清の化学的に定義された培地中での流加プロセスの両方における良好な増殖特徴が、非常に重要である。従って、CHO/CERT S132Aクローンを、標準的な工業的接種計画に従って培養し、倍加時間及び生存率を評価した。図4は、増殖速度(A)及びいくつかの培養継代にわたるその生存率(B)に従った15のCHO/CERTクローンのランキングを示す。2つの細胞系CHO/CERT S132A 2.20(DSMZにナンバーDSM ACC2989の下で寄託されている)及びCHO/CERT S132A 2.41(DSMZにナンバーDSM ACC2990の下で寄託されている)は、最も高い倍加時間を伴う4つのクローンの内にあり、生存率80〜100%を示す(図5A)。次に、CHO/CERT S132A細胞クローンの増殖を、振盪フラスコ中での流加発酵(生物医薬品産生プロセスについての小規模モデルを表す)において検討する。図5Aに示す通り、全てのCHO/CERT S132Aクローンが、増加する細胞濃度により特徴付けられる初期増殖期を伴う通常の増殖プロファイルを示し、それは、次に、プラトーに達し、その後に発酵の終わりに向かって減少する。しかし、CHO/CERT S132Aクローンの性能は、初期段階における増殖スピードならびに最高細胞密度に関して変動する。これは、産生プロセスにわたる生細胞の全積分(IVC)における差に言い換えられる(図5B)。全ての解析されたCHO/CERT S132A細胞系から、クローン1.13、2.20、及び2.41が、最も高いIVCを示し、それは、親CHO−DG44細胞系と比較してさらにより高い(図5B)。しかし、クローン1.13は低いCERT−S132A発現だけを示し、従って、除外される。従って、本発明において記載される2つの細胞系CHO/CERT 2.20(DSMZにナンバーDSM ACC2989の下で寄託されている)及びCHO/CERT 2.41(DSMZにナンバーDSM ACC2990の下で寄託されている)が、高レベルのCERT−SA発現ならびに優れた増殖特性を伴う細胞として選択される。両方の細胞系が、組換えタンパク質の産生のための最適化された宿主細胞系として理想的な候補である。
DSMZにナンバーDSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)及びDSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)の下で寄託されている細胞は、組換えタンパク質産生のための理想的な宿主細胞である。なぜなら、それらは、改善された分泌能力ならびに良好な増殖特徴を有するからである。親DG44細胞系として、それらはdhfr欠損であり、そのため生物医薬品工業における組換えタンパク質のための最も広く使用される発現システム、即ち、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)に適合する。それらは、さらに、グルタミンシンセターゼ(GS)選択/増幅システムならびに他の一般的に使用される選択戦略(例えばネオマイシン、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、及びゼオジン(zeozine)など)に適合する。
それらの優れた特性を実証するために、本発明において記載されるconCERT(商標)細胞ならびに親CHO−DG44細胞系を、ヒトモノクローナルIgG1型抗体をコードする発現コンストラクトを用いてトランスフェクションする。安定的なIgG産生細胞集団を、HT添加を伴わない無血清の化学的に定義された培地中での抗生物質G418の存在における選択により生成する。その後、それらを、標準的な工業的細胞系開発プログラムの部分として、メトトレキサート(MTX)を使用した遺伝子増幅に供した。結果として得られる安定的な細胞プールを、次に、振盪フラスコ中の流加発酵プロセスに供する。10日後、培養物を収集し、上清中のIgG濃度をELISAにより決定する。図6に示す通り、親CHO−DG44細胞に由来する10の最も高い産生プールでの収集力価の中央値は、conCERT(商標)細胞系に由来する産生細胞と比較して顕著に低い。さらに、DG44抗体産生細胞の25〜75%幅が400mg/L未満であるのに対し、それは、 CHO/CERT S132A IgG産生細胞において>400から1g/L近辺までの範囲である。このように、CHO/CERT S132A細胞からの産生細胞プールを用いて得られた収集力価は、親細胞系に由来する産生細胞プールと比較して約2倍高い。
これらのデータは、DSMZにナンバーDSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)及びDSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)の下で寄託されているCHO/CERT S132A細胞が、親DG44細胞系と比較して、組換えタンパク質産生のための優れた宿主細胞であることを実証する。
それらの優れた特性を実証するために、本発明において記載されるconCERT(商標)細胞ならびに親CHO−DG44細胞系を、ヒトモノクローナルIgG4型抗体をコードする発現コンストラクトを用いてトランスフェクションする。安定的なIgG産生細胞集団を、HT添加を伴わない無血清の化学的に定義された培地中での抗生物質G418の存在における選択により生成する。その後、それらを、標準的な工業的細胞系開発プログラムの部分として、メトトレキサート(MTX)を使用した遺伝子増幅に供した。結果として得られる安定的な細胞プールを、次に、振盪フラスコ中の流加発酵プロセスに供する。10日後、培養物を収集し、上清中のIgG濃度をELISAにより決定する。
親CHO−DG44細胞に由来する10の最も高い産生プールでの収集力価の中央値は、conCERT(商標)細胞系に由来する産生細胞と比較して顕著に低い。さらに、DG44抗体産生細胞の25〜75%幅が400mg/L未満であるのに対し、それは、 CHO/CERT S132A IgG産生細胞において>400から1g/L近辺までの範囲である。このように、CHO/CERT S132A細胞からの産生細胞プールを用いて得られた収集力価は、親細胞系に由来する産生細胞プールと比較して約2倍高い。
例は、DSMZにナンバーDSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)及びDSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)の下で寄託されているCHO/CERT S132A細胞が、親DG44細胞系と比較して、組換えタンパク質産生のための優れた宿主細胞であることを示す。
DSMZにナンバーDSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)及びDSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)の下で寄託されているconCERT(商標)細胞及びCHO DG 44細胞を、Fc融合タンパク質(IgG抗体のFc部分に共有結合的に連結された治療的に活性である(ポリ)ペプチドを意味する)をコードするベクターを目的の遺伝子として用いてトランスフェクションする。選択後、上清を、4回のその後の継代の期間にわたる全ての安定細胞プールのシードストック培養から取り、産物力価をELISAにより決定し、細胞の平均数により割り、特異的な産生性を算出する。比較において、産物力価は、Fc融合タンパク質を発現するDG44由来細胞と比較して、conCERT(商標)宿主細胞から生成された産生細胞において顕著に高い。
また、流加培養において、conCERT(商標)由来細胞は、融合タンパク質の有意に増加した産生性ならびに収集時でのより高い力価を有する。
これは、細胞系開発におけるconCERT(商標)宿主細胞の使用によって、連続培養中での又はバイオリアクターバッチ培養もしくは流加培養中での増強された特異的な産生能力ならびにより高い力価を伴う産生細胞系の生成が可能になることを実証する。
DSMZにナンバーDSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)及びDSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)の下で寄託されているconCERT(商標)細胞及びCHO DG 44細胞を、単鎖Fv(scFv)又はドメイン抗体(ラマ又はラクダ科からの他の動物に由来する単鎖抗体の可変領域の1つ又は複数のドメインを含む)をコードするベクターを目的の遺伝子として用いてトランスフェクションする。選択後、上清を、4回のその後の継代の期間にわたる全ての安定細胞プールのシードストック培養から取り、産物力価をELISAにより決定し、細胞の平均数により割り、特異的な産生性を算出する。比較において、産物力価は、scFvタンパク質又はドメイン抗体を発現するDG44由来細胞と比較して、conCERT(商標)宿主細胞から生成された産生細胞において顕著に高い。
また、流加培養において、conCERT(商標)由来細胞は、融合タンパク質の有意に増加した産生性ならびに収集時でのより高い力価を有する。
これは、細胞系開発におけるconCERT(商標)宿主細胞の使用によって、連続培養中での又はバイオリアクターバッチ培養もしくは流加培養中での増強された特異的な産生能力ならびにより高い力価を伴う産生細胞系の生成が可能になることを実証する。
配列番号1 Flag−CERT−SAコード領域(プライマーCMVセンス(配列番号2)及びターミネーターアンチセンス(配列番号3)を使用して生成される2373bpフラグメント)
配列番号2 プライマーCMVセンス
配列番号3 プライマーターミネーターアンチセンス
配列番号4 プライマーCERT−for
配列番号5 プライマーCERT−rev
配列番号6 CERT−for(配列番号4)及びCERT−rev(配列番号5)を用いて得られる660bpのPCR産物
Claims (17)
- DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)にナンバーDSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)の下で寄託されている細胞。
- DSMZにナンバーDSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)の下で寄託されている細胞。
- 細胞が、加えて、目的のタンパク質をコードする目的の遺伝子を含む少なくとも1つの2つめのベクターコンストラクトを含む、請求項1又は2記載の細胞。
- 全てのベクターコンストラクトが細胞ゲノム中に安定的に組み込まれる、請求項3記載の細胞。
- 請求項1〜4記載の細胞であって、該細胞が以下により特徴付けられる:
a)ゲノムDNAを鋳型として使用する場合での特定のPCRバンドパターン/フィンガープリント、それにより、2373bpのPCR産物が、配列番号2及び配列番号3のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して生成される、又は、
b)ゲノムDNAを鋳型として使用する場合での特定のPCRバンドパターン/フィンガープリント、それにより、660bpのPCR産物(配列番号6)が、配列番号4及び配列番号5のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して生成される、又は、
c)(a)のCERT特異的な2373bpのPCR産物と以下の制限酵素とのインキュベーションに起因する特定数のフラグメント及びフラグメントサイズ:
それにより、HindIIIを用いたインキュベーションが好ましい。 - CERT S132A発現カセットが配列番号1からなる、請求項1〜5記載の細胞。
- 目的のタンパク質が、治療用タンパク質、好ましくは抗体又は抗体融合タンパク質である、請求項3〜6記載の細胞。
- 宿主細胞系を生成するための方法であって、以下の工程により特徴付けられる:
a)親宿主細胞、好ましくはCHO又はNSO細胞を提供すること、
b)ベクターコンストラクトを、CERT S132A発現カセットを含む工程(a)の該親細胞中に導入すること、
c)安定的にトランスフェクションされた細胞集団について選択すること、
d)FACSベースの単一細胞クローニングによりモノクローナル細胞系を単離すること、
e)以下について該モノクローナル細胞系をスクリーニングすること
i)高レベルなCERT S132A発現、
ii)シードストック培養中での最適な増殖、
iii)流加培養中での最適な増殖、
f)工程(e)のスクリーニング基準に従って工程(d)の細胞クローンからモノクローナル細胞系を宿主細胞系として選択すること。 - 宿主細胞系を生成するための方法であって、以下の工程により特徴付けられる:
a)親宿主細胞、好ましくはCHO又はNSO細胞を提供すること、
b)ベクターコンストラクトを、CERT S132A発現カセットを含む工程(a)の該親細胞中に導入すること、
c)安定的にトランスフェクションされた細胞集団について選択すること、
d)FACSベースの単一細胞クローニングにより細胞を単離すること、
e)以下について該細胞をスクリーニングすること
i)高レベルなCERT S132A発現、
ii)シードストック培養中での最適な増殖、
iii)流加培養中での最適な増殖、
f)宿主細胞としての使用のために工程(e)のスクリーニング基準に従って単一クローン又は細胞のプールを選択すること。 - 工程(b)のCERT S132A発現カセットが配列番号1からなる、請求項8又は9記載の方法。
- 請求項3〜7のいずれか一項記載の細胞において目的の遺伝子によりコードされる目的のタンパク質を産生する方法であって、以下の工程により特徴付けられる:
a)請求項3〜7のいずれか一項記載の細胞を提供すること、
b)少なくとも1つの目的の遺伝子の発現を可能にする条件下で細胞を培養すること。 - 方法がc)目的のタンパク質を収集する追加工程を含む、請求項11記載の方法。
- 方法がd)目的のタンパク質を精製する追加工程を含む、請求項12記載の方法。
- 以下により、CERT S132A(配列番号1)についてトランスジーンである細胞を同定する方法:
a)ポリメラーゼ連鎖反応PCRを実施すること、
b)ゲノムDNAを鋳型として使用すること、及び
c)配列番号2及び配列番号3を伴うオリゴヌクレオチドプライマーを使用すること、
それにより2373bpのPCR産物が生成される。 - 細胞を培養するための方法であって、以下を含む:
a)請求項1〜7のいずれか一項記載の細胞を提供すること、及び
b)該細胞の増殖を可能にする条件下で該細胞を培養すること。 - タンパク質の製造のための請求項1〜7のいずれか一項記載の細胞の使用。
- 請求項1又は2のいずれか一項記載の細胞、目的の遺伝子の発現のための発現ベクター、及び該細胞の培養のための細胞培養液を含むキット。
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