CN102498212A

CN102498212A - Cho/cert细胞系

Info

Publication number: CN102498212A
Application number: CN2010800263083A
Authority: CN
Inventors: L.弗洛林; E.贝克; H.考夫曼
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 2009-05-05
Filing date: 2010-05-04
Publication date: 2012-06-13
Anticipated expiration: 2030-05-04
Also published as: SG175332A1; KR20120014899A; US20120100553A1; EP2427557B1; EP2427557A1; CN102498212B; US9340592B2; CA2759602A1; WO2010128032A1; TW201105793A; JP2012525826A

Abstract

本发明系关于细胞培养技术之领域。本发明阐述包括载体构建体之生产用宿主细胞系，该载体构建体包括CERT S132A表达盒。该等细胞系具有改善之生长特性及高CERT S132A表达水平。本发明系特别关于两种细胞系，其系以编号DSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)及DSM ACC2990(CHO/CERT2.41)保藏于DSMZ。本发明另外系关于一种产生该等较佳生产用宿主细胞之方法，及一种利用该等两种以编号DSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)及DSMACC2990(CHO/CERT 2.41)保藏于DSMZ之细胞系产生蛋白质之方法。

Description

CHO/CERT细胞系

发明背景

技术领域

本发明系关于细胞培养技术之领域，明确言之，系关于产生含有载体构建体之宿主细胞系之领域，该载体构建体包括神经酰胺转移蛋白质(ceramidetransfer protein；CERT)表达盒。相较于非转基因细胞系，该等细胞系具有经改善之分泌特性。

背景

生物药剂用于人类疗法的市场持续快速成长，在2010年，超过900种生物药剂正以临床研究进行评估，且预估有500亿销售额。近几年中，由于哺乳动物细胞能正确地加工及修饰人类蛋白质，因此有越来越多的生物药剂系产自哺乳动物细胞。因此，从哺乳动物细胞成功且高产量地产生生物药剂至关重要，且其系取决于工艺中所用重组单克隆细胞系之特性。

由于大多数生物药剂产品是在生产过程期间从细胞所分泌之蛋白质，因此，针对新颖性宿主细胞工程化策略而言，生产用细胞系之分泌运送机制是另一个关注的标的。

蛋白质分泌作用是一种复杂的多步骤机制：注定被运送至胞外空间或外质膜之蛋白质首先系以共翻译方式输送至内质网。于该处，该等蛋白质被封装于脂质囊泡中，并被运送至高尔基体，且最终从跨高尔基网络(trans-Golginetwork；TGN)运送至质膜，在该处将蛋白质释放至培养基中。

许多工程化方法已采用日益了解可驱使诸如转录及翻译之过程，以增加该等步骤产生蛋白质产量的分子网络。然而，对于任一多步骤生产过程而言，解决系列过程中早期步骤的瓶颈可能会使得在下游(尤其是翻译后)产生瓶颈。已有报导指出，高到某一阈值以上，生产用细胞之比生产力系与产物基因之转录作用水平呈线性关连性。然而，在mRNA水平进一步加强产物表达会导致蛋白质合成作用、折叠或运送机制的负荷超载，而导致蛋白质产物在胞内累积。事实上，在现有之制造方法中经常看到此现象。

因此，有需要改善用于产生重组蛋白质之宿主细胞的分泌能力。此在与新颖性转录加强技术组合时，及在高滴度工艺中甚至更为重要，以防止翻译后之瓶颈及蛋白质产物之胞内累积作用。

然而，先前以翻译后机制为标靶之方法未竞全功，反倒是会因研究所用的细胞系或产物、或初始生产力水平而产生了相反的结果：

-过度表达ER-驻留型分子伴侣蛋白BiP(结合蛋白质BiP/GRP78)意外地导致分泌减少；

-酶蛋白二硫化物异构酶(protein disulfide isomerase；PDI)的加强表达显示具有相反的结果。

使用转录因子X-盒结合蛋白1(X-box binding protein 1)(XBP-1)之分泌工程化方法经发现不是没有作用，就是在加强分泌的同时使凋亡性细胞死亡增加，导致表型不稳定，且阻碍了高度表达XBP-1克隆之分离。

因此，在达成对分泌运送机制之目标操纵的道路中，目前存在两种主要阻碍：仍然有限之关于潜在调节机制之知识，及需要防止生产用细胞同时出现生长抑制或凋亡反应。

发明概述

本发明阐述两种特定且新颖之生产用宿主细胞系CHO/CERT 2.20及CHO/CERT 2.41。该等于2009年4月2日以编号DSM ACC2989(CHO/CERT2.20)及DSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)保藏于DSMZ之两种细胞系为用于产生重组蛋白质之理想宿主细胞系，因为其具有经改善的分泌能力、及良好的生长特性。

我们最近已证明，藉由使与类固醇生成急性调节相关之脂质转移(START)域家族中之蛋白质(较佳为神经酰胺转移蛋白质(CERT))过度表达的分泌工程化方法，提供一种有效改善蛋白生产之方法，该蛋白质系从真核细胞经由分泌途径所运送的。参见以引用的方式并入文中之Florin等人，2009及专利申请案WO 2008/107388。

CERT(亦称为古德巴斯得抗原结合蛋白质(Goodpasture antigen-bindingprotein))为一种细胞溶质蛋白质，该蛋白质对于将神经酰胺从其在内质网(ER)产生位置处以非囊泡方式运送至高尔基膜具有重要性，于高尔基膜处，可将神经酰胺转换成成鞘磷脂(SM)(Hanada等人，2003)。

我们现在可证实，带有Ser→Ala点突变，且不再被蛋白激酶D磷酸化之 CERT突变体S132A比野生型蛋白质可明显更有效地加强分泌。

更进一步，我们现在证明，CERT S132A表达水平系与其分泌加强效应具有关联性，其意指：细胞中异源CERT S132A水平越高，该细胞之分泌能力越强(图2)。

为研究CERT S132A表达水平与特异性抗体生产力之间的关联性，我们分析两种具有低CERT突变体表达水平之克隆细胞系及两种具有高CERT突变体表达水平之克隆细胞系，表达水平之高低系由胞内FACS染色时之信号强度加以判定(图2A)。在7天补料分批工艺中，经伪转染处理之对照细胞系所显示之平均生产力为15pcd(图2B)。表达低水平CERT SA突变体之细胞克隆的比生产力仅略为提高，而该等具有高水平之CERT突变体的细胞克隆则分泌出约23pcd之IgG产物，且因此显示出较伪处理对照明显更高之比生产力(图2B)。该等数据显示，对重组蛋白质分泌之正面效应与CERT S132A过度表达水平之间存在关联性。

此外，我们惊奇地证明，所挑选之细胞克隆CHO/CERT S132A 2.20及CHO/CERT S132A 2.41的生长较其它细胞克隆显著更佳，且甚至比亲本CHO野生型细胞系生长更佳(图5A及B)。

良好的生长特性对生产用宿主细胞系而言特别重要，因为低生长能力对生物药剂生产工艺之多个方面具有负面影响，因为其导致：

·细胞生成时间延长，此导致发展细胞系之时间延长；

·单一细胞克隆后的效率降低，且此后生长缓慢；

·扩大规模期间的时间范围会延长，尤其是接种体在大规模生产用发酵槽中的情况；

·每一发酵槽运作产物产量会降低。

因此，经本发明解决之特定问题是产生一种经工程化CERT S132A宿主细胞系，该细胞系显示出：

·高水平表达CERT突变体S132A，及

·最理想的细胞生长。

本发明阐述该等两种经工程化CHO/CERT S132A细胞系之产生，该等细胞系具有最佳化的分泌作用及良好生长特性。本发明所提供之单克隆细胞系特别适于作为最佳宿主细胞系统，其对于重组蛋白产物的表达及制造具有强化的生产能力。

该等两种细胞系之产生方法为：用编码人类CERT S132A蛋白之表达构建体转染CHO-DG44宿主细胞系，且随后经选择产生出具有稳定性细胞库。从这些细胞库，藉由以FACS为基础之单细胞克隆术获得单克隆细胞系，并进行广泛筛选并鉴定特征。共计分析100个以上之克隆，且最终以下列要求为基础挑选出该两种CHO/CERT S132A细胞系2.20及2.41：

·以胞内染色及Western印迹法测定，CERT表达水平高；

·以种子储备培养时，生长良好(存活率、增倍时间)；及

·以补料分批培养时，生长最佳，其反映产业生产工艺(峰细胞密度、一段时间内活细胞之积分值(IVC)、存活率)。

由于本发明所述细胞系仅包含以嘌呤霉素作为选择标记，因此该等细胞系与最广泛使用之选择系统及扩增系统DHFR、谷氨酰胺合成酶(GS)及新霉素(Neo)具有兼容性，且因此可用于表达重组抗体，而无须调整/改变表达系统之设计。

根据该等标准，我们从所产生的100个以上之CHO/CERT S132A克隆中，挑选出特定两种新颖性衍生自CHO-DG44之单克隆细胞系，称为克隆2.20及克隆2.41，该等克隆被保藏于德国微生物与细胞培养物保存中心(DSMZ；Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)：

-我们称为“CHO/CERT 2.20”，且以编号DSM ACC2989保藏于DSMZ之细胞系具有极高之CERT S132A表达水平及极佳生长特性，其甚至比亲本CHO野生型细胞之表达水平及生长特性更佳。

藉由鉴别该细胞系细胞中所插入之DNA与邻近染色体DNA之间的连接片段可独特阐述该细胞系。例如，该细胞系DNA可以一或多种限制酶消化，且(例如)利用该所插入DNA的适宜经标记片段，以Southern印迹分析法鉴别出该等连接片段，产生可鉴别基因组中所插入位点的特定条带图谱。该等限制酶例如阐述于下文，且包括EcoRV、HindIII、KpnI、NcoI、NdeI、PvuII、SpeI、XhoI、AvaII、BstXI、SalI。

-我们称为“CHO/CERT 2.41”，且以编号DSMACC2990保藏于DSMZ之细胞系具有极高之CERT S132A表达水平、及极佳生长特性，其甚至比亲本DHO野生型细胞的表达水平及生长特性更佳。

藉由鉴别该细胞系细胞中所插入DNA与邻近染色体DNA之间的连接片段可独特阐述该细胞系。例如，该细胞系DNA可以一或多种限制酶消化，并 (例如)利用该所插入DNA之适宜经标记片段，以Southern印迹分析法鉴别出该等连接片段，产生可鉴别基因组中所插入位点的特定条带图谱。该等限制酶例如阐述于下文，且包括EcoRV、HindIII、KpnI、NcoI、NdeI、PvuII、SpeI、XhoI、AvaII、BstXI、SalI。

本发明因此特别阐述一种以编号DSM ACC2989保藏于DSMZ之细胞系，及另一种以编号DSM ACC2990保藏于DSMZ之细胞系。为实现本申请案之目的，该等两种细胞系亦称为“conCERT^TM”细胞系。

较之亲本CHO-DG44细胞系，该等两种细胞系在经相应表达质粒转染之后的分泌治疗用蛋白产物之速率会增加，且生长特性良好。该等细胞系整合了CHO-DG44宿主细胞系的优点(已良好阐述其特征、经FDA核准、携带病毒风险低、高生产力、强韧、具有转染能力、于无血清培养基中可悬浮生长)及在生产工艺中具有强化分泌性与最佳化成果之新特性。

本发明所述之特定conCERT^TM细胞系实例包含如图1A及B所述之编码经flag标记之人类CERT突变体S132A之表达盒(SEQ ID NO：1)，其包括衍生自巨细胞病毒(cytomegalovirus；CMV)启动子/增强子区域之上游调节序列(600bp)、与132位置处带有点突变(Ser 132→Ala)之人类CERT cDNA融合之N-末端Flag-表位标记、终止密码子、及包含聚腺苷酸化信号之3′非翻译区域。

用于产生本发明所述conCERT^TM细胞系的载体构建体如图1B所示，且其包含如下功能组件：

-巨细胞病毒(CMV)增强子/启动子、多克隆位点(MCS)、聚腺苷酸化信号；

-CERT S132A表达盒；

-编码于真核细胞中作为选择标记之嘌呤霉素N-乙酰基转移酶的表达盒；

-复制起点；及

-β-内酰胺酶表达盒，用于在细菌中产生氨苄青霉素(ampicillin)抗性。

conCERT^TM细胞系中抗体浓度显著高于经稳定转染之野生型细胞中所测得之滴度，平均差异范围为1.5至2.5倍(图6)。因此，于并列比较时，conCERT^TM细胞系所产生之产物滴度显著高于野生型CHO细胞。该等数据证实，相较于亲本DG44细胞系，以编号DSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)及DSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)保藏于DSMZ之CHO/CERT S132A细胞为用于生产重组蛋白质之较佳宿主细胞。作为用于产生重组蛋白质之宿主细胞的conCERT^TM细胞特定实例系用于产生IgG4亚型及IgGl亚型抗体、Fc融合蛋白质、单链-Fv(scFv)分子及纳米抗体。但conCERT^TM细胞亦为用于重组蛋白质生产以下其它蛋白质、多肽或其片段的较佳宿主细胞：诸如酶、细胞因子、淋巴因子、结构分子、粘附分子、受体及其衍生物或片段、及可作为激动剂或拮抗剂及/或具有治疗或诊断用途之其它多肽。

本发明所提供之细胞系能够增加以真核细胞为基础之生产工艺的蛋白质产量。此将降低该等工艺之商品成本，且同时减少为了产生于研究、诊断、临床研究、或市场供应治疗用蛋白质时所需之物质而需要生产之批次数目。

此外，本发明conCERT^TM细胞系将加快药物发展，因为产生足够量之用于临床前研究之物质通常对时程表而言系重要工作事务。

本发明最佳conCERT^TM细胞系可用于产生一或数种用于诊断目的、研究目的(标靶鉴定、先导鉴定、先导最佳化)之特定蛋白质，或用于制造供出售或临床发展之治疗用蛋白质。该等细胞系同样可用于表达或产生分泌型或膜结合型蛋白质(诸如表面受体、GPCR、金属蛋白酶或受体激酶)，该等蛋白质具有相同之分泌途径，且同样系于脂质囊泡中运送。随后该等蛋白质可用于意欲阐述细胞表面受体之功能特征的研究，例如用于产生且随后纯化、结晶及/或分析表面蛋白质。此对发展新颖性人类药物疗法特别重要，因为细胞表面受体为主要类别之药物标靶。此外，其对研究与细胞表面受体相关之细胞内信号传导复合物、或对分析部份藉由可溶性生长因子与彼等之位于同一或另一细胞上之对应受体的相互作用所介导之细胞-细胞-通信可能有利。

附图说明

图1：CERT S132A表达构建体之概视图

(A)以编号DSM ACC2989保藏于DSMZ之细胞系(CHO/CERT 2.20)、及以编号DSM ACC2990保藏于DSMZ之细胞系(CHO/CERT 2.41)细胞中所含之Flag-CERT S132A表达盒之概视图。CMV＝巨细胞病毒(CMV)早期区域之增强子/启动子；Flag＝Flag^TM表位标记物；CERT-S132A＝人类CERT S132A突变体之cDNA；终止＝TGA终止密码子；3′UTR＝3′非翻译区域。

(B)转染至CHO-DG44细胞，以产生本发明所述之CHO/CERT S132A(conCERT^TM)细胞系的载体构建体之图谱。

该质粒经内部命名为“pBIP-1/Flag-CERT_SA”，且大小为7660bp。黑色箭头指出适于鉴别conCERT^TM细胞系之寡核苷酸引物的结合位置。CMV＝巨细胞病毒(CMV)早期区域之增强子/启动子，随后为多克隆位点(由所示酶之独特识别位点指出)；F1起点＝细菌之复制起点；bla＝用于氨苄青霉素(ampicillin)抗性之β-内酰胺酶(beta-lactamase)基因。

图2：CERT S132A表达与加强分泌之关联

(A)藉由以抗-Flag抗体细胞内标记，测定生产IgG之细胞系中之异源CERT S132A表达。基于信号强度，1至2号克隆归类为“低”(淡灰色带点条)CERT-S132A表达细胞系、3至4号克隆为“高”CERT-S132A表达细胞系(带条形之条)。

(B)于补料分批培养物中之相同细胞系的比抗体生产力。于加工期间之三个时间点计算所有细胞系之生产力，算法为：产物浓度除以IVC(活细胞之积分)。

图3：藉由Western印迹法侦测CERT表达

自14个CHO/CERT S132A细胞克隆制得全细胞裂解物，且等量进行SDS-PAGE，且随后利用针对Flag^TM表位标记之抗体进行免疫学侦测。

于SDS-PAGE中展现出总共14个细胞克隆。各细胞系之名称为其克隆编号。M＝分子量标记；(-)＝阴性对照(经伪转染处理之细胞系的溶胞产物)；(+)＝阳性对照。

图4：接种体培养物中之CHO/CERT S132A(conCERT^TM)细胞系的生长特性

于接种体培养期间之15个CHO/CERT S132A细胞克隆之生长特性。

细胞密度维持在0.15至3×10⁶个细胞/ml之间，且每隔2至3天分拆一次。

(A)根据生长速率将细胞系加以分级。(B)数个继代阶段之成活率；以编号DSM ACC2989(CHO/CERT S132A 2.20)及DSM ACC2990(CHO/CERTS132A2.41)保藏于DSMZ之细胞系系以实线表示，其它所有克隆系以虚线表示。

图5：在发酵期间之单克隆CHO/CERT S132A细胞系的生长

在6天内，使15个单克隆经稳定转染CHO/CERT S132A细胞克隆进行补料分批发酵。

(A)CHO/CERT S132A细胞系及亲本DG44细胞之生长曲线。以编号DSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)及DSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)保藏于DSMZ之细胞系系以实线表示，其它所有克隆系以虚线表示。

(B)于六天工艺期间之所有细胞系之活细胞浓度的积分值(IVC)。斜线长条图系指本发明所选择之CHO/CERT S132A细胞系的IVC，黑色长条图表示其它CHO/CERT S132A克隆之IVC，影线长条图表示亲本细胞之IVC。

图6：对CHO/CERT S132A细胞与亲本CHO DG44细胞系所分泌之抗体滴度/蛋白质生产量的比较

以编码人类IgG1型单克隆抗体之表达构建体转染如下细胞系：以编号DSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)及DSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)保藏于DSMZ之conCERT^TM细胞系及亲本CHO-DG44宿主细胞系(经典)。

以盒状图表示每种基因型中表达量前10之细胞库的抗体滴度，该盒状图说明滴度中间值及以盒状表示25-75％分位数。误差长条图系表示标准偏差。

图7：对CHO/CERT S132A细胞与亲本CHO DG44细胞系所分泌之抗体滴度/蛋白质生产量的比较

以编码人类IgG4型单克隆抗体之表达构建体转染如下细胞系：以编号DSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)及DSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)保藏于DSMZ之conCERT^TM细胞系及亲本CHO-DG44宿主细胞系(经典)。选出每种基因型中表达量前10之细胞库。

(A，B)以盒状图表示自各基因型之细胞库所产生之表达量前10之单克隆细胞系的比生产力(A)及抗体滴度(B)，该等盒状图说明滴度中间值及以盒状表示25-75％分位数。误差长条图系表示标准偏差。

发明详述

定义

通常实施方案“包括”或“包含”涵盖更特定实施方案“由...组成”。此外，单数及复数形式系依不限制性方式使用。

本发明范围中所用之术语具有如下含义。

术语“CERT”系指神经酰胺转移蛋白质CERT，其亦称为古德巴斯得抗原结合蛋白质(Goodpasture antigen-binding protein)。CERT为一种细胞溶质蛋白，其对于将神经酰胺从其在内质网(ER)产生位置处以非囊泡方式运送至高尔基膜具有重要性，并于高尔基膜处，可将神经酰胺转换成鞘磷脂 (SM)(Hanada等人，2003)。

术语“CHO/CERT”、“CHO/CERT SA”、“CHO/CERT S132A”可相互交换使用。此外，可相互交换使用细胞系名称“CHO/CERT 2.20”、“CHO/CERTSA 2.20”、“CHO/CERT S132A 2.20”，且其所有均阐述以编号DSMZ DSMACC2989保藏之相同细胞系克隆2.20。可相互交换使用细胞系名称“CHO/CERT 2.41”、“CHO/CERT SA 2.41”、“CHO/CERT S132A 2.41”，且其所有均阐述以编号DSMZ DSM ACC2990保藏之相同细胞系克隆2.41。

术语“衍生物”一般包括适于实现本发明所需用途的序列，其意指该等序列可介导细胞中分泌运送的增加。

“宿主细胞”于本发明中系意指诸如仓鼠细胞之细胞，较佳为BHK21、BHK TK-、CHO、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX B1、及CHO-DG44细胞；或为任一该细胞系之衍生物/后代。特佳者为CHO-DG44、CHO-DUKX、CHO-K1、CHO-S及BHK21，且更佳者为CHO-DG44及CHO-DUKX细胞。于本发明另一项实施方案中，宿主细胞亦意指鼠骨髓瘤细胞，较佳为NS0及Sp2/0细胞，或为任一该细胞系之衍生物/后代。亦可用于本发明之含意的鼠及仓鼠细胞实例概括于表1中。然而，该等细胞之衍生物/后代、其它哺乳动物细胞(包括但不限于人类、小鼠、大鼠、猴、及鸟类，或较佳为啮齿动物细胞系)、或真核细胞(包括但不限于酵母、昆虫及植物细胞)亦可用于本发明之含意，特定言之用于产生生物医药蛋白质。

表1：真核型生产用细胞系

细胞系	订购号
		NS0	ECACC第85110503号
Sp2/0-Ag14	ATCC CRL-1581
		BHK21	ATCC CCL-10
BHK TK-	ECACC第85011423号
		HaK	ATCC CCL-15
2254-62.2(BHK-21衍生物)	ATCC CRL-8544
		CHO	ECACC第8505302号
CHO野生型	ECACC 00102307
		CHO-K1	ATCC CCL-61
CHO-DUKX	ATCC CRL-9096

[0088]

(＝CHO duk-、CHO/dhfr-)
		CHO-DUKX B11	ATCC CRL-9010
CHO-DG44	Urlaub等人，1983
		CHO Pro-5	ATCC CRL-1781
V79	ATCC CCC-93
		B14AF28-G3	ATCC CCL-14
PER.C6	(Fallaux，F.J.等人，1998)
		HEK 293	ATCC CRL-1573
COS-7	ATCC CRL-1651
		U266	ATCC TIB-196
HuNS1	ATCC CRL-8644
		CHL	ECACC第87111906号

当宿主细胞经建立、适应、且完全培养于不含血清之条件下，且视需要于不含任一动物来源之蛋白质/肽之培养基中时，则该宿主细胞是最佳的。诸如Ham氏F12(Sigma，Deisenhofen，Germany)、RPMI-1640(Sigma)、Dulbecco氏改良之Eagle氏培养基(DMEM；Sigma)、最低基本培养基(MEM；Sigma)、Iscove氏改良之Dulbecco氏培养基(IMDM；Sigma)、CD-CHO(Invitrogen，Carlsbad，CA)、CHO-S(Invtirogen)、无血清CHO培养基(Sigma)及无蛋白质CHO培养基(Sigma)之市售培养基为适宜营养溶液实例。当必要时，可在任一培养基补充多种化合物，化合物实例为激素及/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白、表皮生长因子、胰岛素样生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁、磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷(诸如腺苷、胸苷)、谷氨酰胺、葡萄糖或其它等价能源、抗生素、痕量元素。亦可包含熟习此项技术者所知之适宜浓度之任一其它必要补充物质。于本发明中，较佳使用无血清培养基，但补充适宜量血清的培养基亦可用于培养宿主细胞。为了使表达出选择基因之经遗传学修饰之细胞生长并对其进行挑择，在培养基添加适宜之选择试剂。

术语“蛋白质”可与氨基酸残基序列或多肽相互交换使用，且系指任一长度之氨基酸聚合物。该等术语亦包括透过下列反应经翻译后修饰之蛋白质，该等反应包括但不限于糖基化、乙酰基化、磷酸化或蛋白质加工。在保持多肽分子生物功能活性的同时，可对多肽结构进行修饰及改变，例如与其它蛋白质融合、氨基酸序列取代、删除或插入。例如，某些氨基酸序列取代可在多肽或构成其基础之核酸编码序列下进行，而获得具有类似性质之蛋白质。

术语“多肽”意指具有10个以上氨基酸之序列，且术语“肽”意指长度至多为10个氨基酸之序列。

本发明适于产生供产生生物医药多肽/蛋白质之宿主细胞。本发明特别适于藉由强化细胞生产力之细胞高产量表达许多不同感兴趣之基因。

“感兴趣之基因”(gene of interest；GOI)、“所选择序列”、或“产物基因”于文中具有相同含意，且系指编码感兴趣之产物或“感兴趣之蛋白质”(术语亦称为“期望产物”)的任一长度多核苷酸序列。所选择之序列可为全长或经截断之基因、融合或经标记之基因，且可为cDNA、基因组DNA、或DNA片段，较佳为cDNA。其可为天然序列，亦即天然存在形式，或若需要，则可经突变或修饰。该等修饰包括密码子最佳化作用(以便在所选择之宿主细胞中最佳化密码子使用)、人源化或标记。所选择之序列可编码分泌型、细胞质、核、膜结合型、或细胞表面多肽。

“感兴趣蛋白质”包括蛋白质、多肽、其片段、肽，其全部可于所选择之宿主细胞中表达。期望之蛋白质可为例如抗体、酶、细胞因子、淋巴因子、粘附分子、受体及其衍生物或片段、及可作为激动剂或拮抗剂及/或具有治疗或诊断用途之任一其它多肽。期望之蛋白质/多肽之实例亦出示于下文。

若为诸如单克隆抗体之更复杂分子，GOI可编码两条抗体链中之一条或两条。

“感兴趣产物”亦可为反义RNA。

“感兴趣蛋白质”或“期望蛋白质”为彼等于上文中所提及者。特别地，期望蛋白质/多肽或感兴趣蛋白质为例如但不限于胰岛素、胰岛素样生长因子、hGH、tPA、细胞因子(诸如介白素(IL)，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18；干扰素(IFN)α、IFNβ、IFNγ、IFNω或IFNτ；肿瘤坏死因子(TNF)，诸如TNFα及TNFβ、TNFγ；TRAIL；G-CSF、GM-CSF、M-CSF、MCP-1及VEGF。亦包括红细胞生成素或任一其它激素生长因子生产。根据本发明方法亦可利于用于生产抗体或其片段。该等片段包括例如Fab片段(抗原结合片段＝Fab)。Fab片段系经邻近恒定区连接的两条链之可变区所组成。 Fab片段可藉由(例如利用木瓜蛋白酶)蛋白酶消化常规抗体加以形成，但类似Fab片段亦可藉由遗传工程技术同时产生。其它抗体片段包括F(ab′)2片段，其可利用胃蛋白酶，藉由蛋白质裂解制得。

感兴趣蛋白质系较佳为从培养基回收分泌型多肽，或者，若其表达物没有分泌信号，则其可自宿主细胞溶胞产物回收。必须藉由可获得大体上均质的感兴趣蛋白质制备物的方式，自其它重组蛋白质及宿主细胞蛋白质中纯化出感兴趣蛋白质。第一步，去除培养基或溶胞产物中细胞及/或颗粒细胞碎片。随后自污染性可溶性蛋白质、多肽及核酸中纯化出感兴趣产物，例如，系藉由免疫亲和或离子交换柱分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、Sephadex层析术、硅土或诸如DEAE之阳离子交换树脂层析。通常，相关技术中已熟知教示熟习此项技术者如何纯化由宿主细胞所表达之异源蛋白质之方法。

使用遗传工程方法可能产生缩短的抗体片段，该等片段仅系由重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)组成。其称为Fv片段(可变片段(Fragment variable)＝可变部份之片段)。由于该等Fv-片段缺少由恒定链之半胱氨酸所形成之两条链间的共价键结，因此Fv片段通常稳定。较佳是藉由短肽片段(例如10至30个氨基酸，较佳15个氨基酸)将重链的可变区及轻链可变区连接起来。依此方式，可获得藉由肽接头连接之VH及VL组成之单一肽链。该种类型之抗体蛋白质称为单链-Fv(scFv)。于先前技术中已知该种类型之scFv-抗体蛋白质实例。

近些年，已发展出制备scFv多聚衍生物的多种方法。其意欲产生特定言之具有改善的药物动力学及生物分布性质、及增加的结合亲合力之重组抗体。为了获得scFv多聚化，制得呈具有多聚化域之融合蛋白质的scFv，多聚化域可为例如IgG之CH3区域或卷曲螺旋结构(螺旋结构)，诸如亮氨酸-拉链域。然而，亦存在其中scFv之VH/VL区域之间的相互作用系用于多聚化(例如双功能、三功能、及五功能抗体)的方法。熟习此项技术者所指之双抗体系意指二价同二聚scFv衍生物。将scFv分子中之接头缩短至5-10个氨基酸导致形成同二聚体，其中会发生链间VH/VL叠加。另外可藉由并入二硫桥使双抗体稳定。先前技术中已知双抗体-抗体蛋白质实例。

熟习此项技术者所指之微型抗体(minibody)系意指二价、同二聚scFv衍生物。其系由融合蛋白质组成，其含有作为二聚化区之免疫球蛋白(较佳为IgG，最佳为IgG1)CH3区，及经铰链区(例如亦源自IgG1)及接头区与其相连之scFv。先前技术中已知微型抗体-抗体蛋白质实例。

熟习此项技术者所指之三抗体系意指三价、同三聚scFv衍生物。其中VH-VL直接融合而不经接头序列之scFv衍生物形成三聚体。

熟习此项技术者亦熟悉所谓之微小抗体(miniantibody)，其具有二-、三-或四价结构，且衍生自scFv。藉由二-、三-或四聚卷曲螺旋结构完成多聚化。

熟习此项技术者亦熟悉多肽分子，其系由获自骆马或其它骆驼科动物之单链抗体的一或多个可变域组成。此外，熟习此项技术者已知该等骆驼抗体之衍生物及变体。该等分子亦称为“域抗体”。域抗体变体包括数种由肽接头共价连接之可变域。

为增加血清半衰期，可产生与诸如抗体Fc部份之多肽模块或诸如清蛋白之存在于血清中之另一种蛋白质融合之域抗体。

熟习此项技术者所知之“支架蛋白”系意指藉由基因克隆或藉由共翻译方法，与具有另一功能之另一种蛋白质或蛋白质部份偶联之蛋白质之任一功能域。

根据定义，将任一序列或基因引入至宿主细胞相对于该宿主细胞而言是“异源性之序列”或“异源性之基因”或“转基因”，即使所引入之序列或基因与宿主细胞中之内源性序列或基因相同。

因此，“异源性”蛋白质是由异源性序列所表达之蛋白质。

于本发明之说明书全文中，且尤其系于有关蛋白质表达之内容中，术语“重组”可与术语“异源性”相互交换使用。因此，“重组”蛋白质是由异源性序列所表达之蛋白质。

可藉由利用“表达载体”(较佳为真核表达载体，且更佳为哺乳动物表达载体)，将异源性基因序列导入至标靶细胞中。熟习此项技术者已熟知用于构建载体之方法，且其系阐述于许多公开案中。特定言之，构建适宜载体之技术，包括关于功能性组件(诸如启动子、增强子、终止及聚腺苷酸化信号、选择标记、复制起点、及剪接信号)之阐述可参见先前之技术。载体亦可包括但不限于质粒载体、噬菌粒、粘粒、人工/微型染色体(例如ACE)、或病毒载体，诸如杆状病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、单纯疱疹病毒、逆转录病毒、噬菌体。真核表达载体通常亦含有促进载体在细菌中繁殖之原核序列，诸如细菌中之复制起点及用于选择之抗生素抗性基因。在相关技术中已熟知含有能可操作连接多核苷酸之克隆位点的多种真核表达载体，且其中一些可购自诸如Stratagene，La Jolla，CA；Invitrogen，Carlsbad，CA；Promega，Madison，WI或BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA之公司。

于一项较佳实施方案中，该表达载体包括至少一种核酸序列，其系用于转录及翻译为编码感兴趣之肽/多肽/蛋白质的核苷酸序列所必须之调节序列。

如文中所用，术语“表达”系指于宿主细胞内转录及/或翻译异源性核酸序列。期望产物/感兴趣之蛋白质于宿主细胞中表达水平可基于存在于细胞中之对应mRNA之量；或于该实例中由所选之序列编码之期望多肽/感兴趣蛋白质的量来测定。例如，测定由所选之序列转录的mRNA之方法为：Northern印迹杂交法、核糖核酸酶RNA保护法、与细胞RNA原位杂交、或PCR。测定由所选之序列编码的蛋白质之方法有许多，例如藉由ELISA、藉由Western印迹法、藉由放射免疫分析法、藉由免疫沉淀法、藉由分析蛋白质之生物学活性、藉由免疫染色蛋白质，且随后FACS分析、或藉由均相时间-解析荧光(HTRF)分析法。

可藉由技术中已熟知之任一方法使多核苷酸或表达载体“转染”真核宿主细胞，以产生经遗传修饰之细胞或转基因细胞。转染方法包括但不限于脂质介导之转染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、聚阳离子(诸如DEAE-葡聚糖)-介导之转染、原生质体融合、病毒感染及显微注射。该转染较佳为稳定转染。以可提供最佳转染频率及使异源性基因较佳表达于特定宿主细胞系及类型中的转染方法较佳。可藉由常用步骤确定适宜的方法。为获得稳定转染体，可将构建体整合入宿主细胞基因组或人工染色体/微型染色体，或以游离基因形式，以稳定性存在于宿主细胞内。

除非另外指出，否则本发明实务将采用属于熟习此项技术者能力范围内之细胞生物学、分子生物学、细胞培养、免疫学等中之常用技术。于当前之文献中，已全部揭示该等技术。

实施方案

本发明系关于一种以编号DSM ACC2989保藏于德国微生物与细胞培养物保存中心(DSMZ；Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)之细胞(CHO/CERT 2.20)。本发明系关于一种细胞/细胞系，其代表物系以编号DSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)保藏于DSMZ。可藉由鉴定所插入之DNA与该细胞系之细胞中的相邻染色体DNA之间的连接片段独特阐述该细胞系。例如，利用一或多种限制酶消化该细胞系之DNA，且例如利用所插入DNA之适宜经标记片段，藉由Southern印迹分析，鉴定该等连接片段，产生可鉴别基因组之插入位点的特异性条带图。该等限制酶例如阐述于下文，且包括EcoRV、HindIII、KpnI、NcoI、NdeI、PvuII、SpeI、XhoI、AvaII、BstXI、SalI。

本发明另外关于一种以编号DSM ACC2990保藏于DSMZ之细胞(CHO/CERT 2.41)。本发明系关于一种细胞/细胞系，其代表物系以编号DSMACC2990保藏于DSMZ(CHO/CERT 2.41)。可藉由鉴别所插入之DNA与该细胞系细胞中相邻染色体DNA之间的连接片段独特阐述该细胞系。例如，以一或多种限制酶消化该细胞系之DNA，并例如利用所插入DNA之适宜经标记片段，藉由Southern印迹分析法，鉴别该等连接片段，产生可鉴别基因组中之插入位点的特异性条带图谱。该等限制酶例如阐述于下文，且包括EcoRV、HindIII、KpnI、NcoI、NdeI、PvuII、SpeI、XhoI、AvaII、BstXI、SalI。

于本发明一项特定实施方案中，本发明细胞(CHO/CERT 2.20或CHO/CERT 2.41)还另外含有至少一个第二载体构建体，该构建体包括编码感兴趣蛋白质之感兴趣基因。该细胞较佳另外含有至少一个第二载体构建体，该构建体包括编码感兴趣蛋白质之感兴趣基因、及选择及/或扩增标记。第二载体构建体上之该选择及/或扩增标记系以谷氨酰胺合成酶(GS)或脱氢叶酸还原酶(DHFR)较佳，且以DHFR最佳。

于本发明另一较佳实施方案中，所有载体构建体均稳定性地整合至细胞基因组中。

于本发明另一较佳实施方案中，该细胞之特征为：

当利用基因组DNA作为模板时，具有特异性PCR条带图谱/指纹图谱，其中利用寡核苷酸引物SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3会产生2373bp PCR产物；或

当利用基因组DNA作为模板时，具有特异性PCR条带图谱/指纹图谱，其中利用寡核苷酸引物SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：5会产生660bp PCR产物(SEQ ID NO：6)；或

与如下限制酶一起温育(a)之CERT-特异性2373bp-PCR产物，会产生特异性之片段数目及片段大小：

酶	片段数目	片段大小(bp)
			EcoRV	2	2236、137
HindIII	2	2176、197
			KpnI	2	2142、231
NcoI	2	2096、277
			NdeI	2	1973、400
PvuII	2	1241、1132
			SpeI	2	2128、245
XhoI	2	2257、116
			AvaII	3	1140、832、401
BstXI	3	1980、266、127
			SalI	3	1673、491、209

其中，以与HindIII一起温育为较佳。

于本发明一项较佳实施方案中，该细胞之特征为：在以利用基因组DNA作为模板，且利用寡核苷酸引物SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3所产生之CERT-特异性2373bp PCR产物与如下限制酶一起温育之后，会产生2种具有如上表之大小的特异性片段：EcoRV、KpnI、NcoI、NdeI、PvuII、SpeI、XhoI。

于本发明一项最佳实施方案中，该细胞之特征为：在与限制酶HindIII一起温育经利用基因组DNA作为模板，且利用寡核苷酸引物SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3所产生之CERT-特异性2373bp PCR产物之后，会产生2种大小分别为2176bp及197bp之特异性片段。

于本发明一项特定实施方案中，该CERT S132A表达盒系由SEQ ID NO：1组成。

于本发明另一特定实施方案中，该感兴趣之蛋白质为治疗用蛋白质，较佳为抗体或抗体融合蛋白质。

本发明另外系关于一种产生宿主细胞系之方法，其特征为如下步骤：

(a)提供亲本宿主细胞，较佳为CHO或NSO细胞，最佳为CHO DG44细胞，

(b)将包括CERT S132A表达盒之载体构建体引入至步骤(a)之该细胞，

(c)挑选出经稳定转染之细胞群，

(d)藉由以FACS为基础之单细胞克隆术分离出单克隆细胞系，

(e)根据如下标准筛选

-CERT S132A表达水平高，

-种子储备培养时生长最佳，

-补料分批培养时生长最佳，

(f)根据步骤(e)之筛选标准，自步骤(d)细胞克隆挑选出单克隆细胞系。

a)提供亲本宿主细胞，较佳为CHO或NSO细胞，

b)将包括CERT S132A表达盒之载体构建体引入至步骤(a)之该亲本宿主细胞，

c)挑选出经稳定转染之细胞群，

d)藉由以FACS为基础之单细胞克隆术分离出单克隆细胞系，

e)根据如下标准筛选该单克隆细胞系：

i)CERT S132A表达水平高，

ii)种子储备培养时生长最佳，

iii)补料分批培养时生长最佳，

根据步骤(e)之筛选标准，自步骤(d)中之细胞克隆挑选出单克隆细胞系作为宿主细胞系。

本发明更进一步系关于一种产生宿主细胞之方法，其特征为如下步骤：

a)提供亲本宿主细胞，较佳为CHO或NSO细胞，

c)挑选出经稳定转染之细胞群，

d)藉由以FACS为基础之单细胞克隆术分离细胞，

e)根据如下标准筛选该等细胞：

i)CERT S132A表达水平高，

ii)种子储备培养时生长最佳，

iii)补料分批培养时生长最佳，

f)根据步骤(e)中之筛选标准，选出单一克隆或细胞库作为宿主细胞。

步骤(a)中之该亲本宿主细胞较佳为上述定义下之宿主细胞。步骤(a)中之该亲本宿主细胞较佳为啮齿动物细胞，诸如小鼠或仓鼠细胞，最佳为CHODG44细胞。

步骤(b)之该载体构建体较佳包括如图1B所述之如下功能组件：

-巨细胞病毒(CMV)增强子/启动子；

-多克隆位点(MCS)；

-CERT S132A表达盒；

-表达盒，其编码可于真核细胞中作为筛选标记之嘌呤霉素N-乙酰基转移酶；

-聚腺苷酸化信号；

-复制起点；

筛选生长最佳之步骤(e)ii)中之种子储备培养物的特定标准为：存活率、增倍时间。

筛选生长最佳之步骤(e)iii)中之补料分批培养物的特定标准为：峰细胞密度、一段时间内之存活细胞的积分值(IVC)、存活率。

该补料分批培养物之筛选标准特别具有重要性，此系因为其反映出产业生产工艺中之环境条件。

于一种较佳方法中，步骤(b)之CERT S132A表达盒系由SEQ ID NO：1组成。

本发明另外系关于一种在上述细胞中产生由感兴趣之基因所编码之感兴趣之蛋白质的方法，其特征为如下步骤：a)提供如上所述细胞，b)于允许至少一种感兴趣之基因表达的条件下培养细胞。于一项特定实施方案中，该方法包括额外步骤c)收集感兴趣之蛋白质。于一项更特定之实施方案中，该方法包括另一额外步骤d)纯化感兴趣之蛋白质。

本发明更进一步系关于一种于上述细胞中，产生由感兴趣之基因编码之感兴趣之蛋白质的方法，其特征为如下步骤：a)提供上述细胞，b)于允许该细胞增殖且至少一种感兴趣之基因表达的条件下，培养该细胞。于一项特定实施方案中，该方法包括额外步骤c)收集感兴趣之蛋白质。于一项更特定之实施方案中，该方法包括另一额外步骤d)纯化感兴趣之蛋白质。

本发明特定言之系关于一种于本发明细胞中产生由感兴趣之基因编码之感兴趣之蛋白质的方法，其特征为如下步骤：

(a)提供本发明细胞，

(b)于允许细胞增殖及至少一种感兴趣之基因表达之条件下，培养该细胞，

(c)收集感兴趣之蛋白质，且

(d)纯化感兴趣之蛋白质。

于一较佳产生方法中，该宿主细胞包括作为感兴趣之基因的选择及/或扩增标记之谷氨酰胺合成酶(GS)或DHFR，且以DHFR较佳。

本发明另外系关于一种鉴别出转基因CERT S132A(SEQ ID NO：1)之细胞的方法，其系藉由

(a)进行聚合酶链式反应PCR，

(b)使用基因组DNA作为模板，且

(c)使用具有SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3之寡核苷酸引物，

藉此产生2373bp PCR产物。

视需要，该细胞可藉由下列进一步鉴别特征：与以下限制酶一起培养CERT-特异性2373bp-PCR产物之后，产生特异性片段数目及片段大小：

本发明特定言之系关于一种鉴别经转基因CERT S132A(SEQ ID NO：1)之细胞/阐述其特征之方法，其系藉由PCR，利用基因组DNA作为模板，其中当利用寡核苷酸引物SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3时，产生2373bp PCR产物。

本发明另外系关于一种鉴别经转基因CERT S132A(SEQ ID NO：1)之细胞/阐述其特征之方法，其系藉由PCR，利用基因组DNA作为模板，其中当利用寡核苷酸引物SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3时，产生2373bp PCR产物，且其中该细胞之特征为：在与如下限制酶一起温育CERT-特异性2373bp-PCR产物之后，产生特异性片段数目及片段大小：

于该方法之一项较佳实施方案中，该细胞之特征为：在与限制酶EcoRV、KpnI、NcoI、NdeI、PvuII、SpeI、XhoI一起温育CERT-特异性2373bp PCR产物之后，产生2种大小如上表之特异性片段，其中该PCR产物之产生方法为：利用基因组DNA作为模板，且采用寡核苷酸引物SEQ ID NO：2及SEQ IDNO：3。

于该方法之最佳实施方案中，该细胞之特征为：在与限制酶HindIII一起温育CERT-特异性2373bp PCR产物之后，产生2种大小分别为2176bp及197bp之特异性片段，其中该PCR产物之产生方法为：利用基因组DNA作为模板，且采用寡核苷酸引物SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3。

于另一项实施方案中，该以编号DSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)保藏于德国微生物与细胞培养物保存中心(DSMZ)之细胞的特征为：当利用基因组DNA时，产生特异性限制性消化物或特异性PCR条带图谱，其中该分析产生对克隆DSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)之CERT转基因/CERT S132A表达盒中之基因组插入位点具特异性之独特指纹图谱。该细胞系DSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)可藉由连接片段加以独特性地阐述/鉴别特征。细胞系DSMACC2989(CHO/CERT 2.20)可藉由所插入DNA(＝CERT转基因/CERT S132A表达盒)与邻近染色体DNA之间的连接片段加以独特性地阐述/鉴别特征，其中利用一或多种诸如EcoRV、HindIII、KpnI、NcoI、NdeI、PvuII、SpeI、XhoI、AvaII、BstXI、SalI之限制酶消化该细胞系之DNA(以基因组DNA较佳)，并例如利用一或多种适宜之视需要经标记之DNA片段，藉由Southern印迹分析法或PCR，鉴定该等连接片段。该(等)DNA片段显示特异性条带图谱或指纹图谱，其特征为DSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)基因组中CERT转基因/CERTS132A表达盒之独特插入位点。

于另一实施方案中，该以编号DSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)保藏于德国微生物与细胞培养物保存中心(DSMZ)之细胞的特征为：当利用基因组DNA时，产生特异性限制性消化物或特异性PCR条带图谱，其中该分析产生对克隆DSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)中之CERT转基因/CERT S132A表达盒的基因组插入位点具特异性之独特指纹图谱。该细胞系DSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)可藉由连接片段加以独特阐述/鉴别特征。该细胞系DSMACC2990(CHO/CERT 2.41)可藉由所插入DNA(＝CERT转基因/CERT S132A表达盒)及邻近染色体DNA之间的连接片段加以独特阐述/鉴别特征，其中利用一或多种诸如EcoRV、HindIII、KpnI、NcoI、NdeI、PvuII、SpeI、XhoI、AvaII、BstXI、SalI之限制酶消化该细胞系之DNA(以基因组DNA较佳)，并例如利用一或多种适宜之视需要经标记之DNA片段，藉由Southern印迹分析法或PCR，鉴别该等连接片段。该(等)DNA片段显示特异性条带谱图或指纹图谱，其特征为DSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)基因组中之CERT转基因/CERT S132A表达盒的独特插入位点。

本发明另外系关于一种培养细胞之方法，包括a)提供如权利要求1至7中任一项之细胞，及b)于允许该细胞增殖之条件下，培养该细胞。于该方法之一项特定实施方案中，该细胞另外含有至少一个(第二/额外)载体构建体，其包括编码感兴趣蛋白质的感兴趣之基因。于一项较佳实施方案中，该方法包括另外收集感兴趣蛋白质。于另一项较佳实施方案中，该方法另外包括纯化感兴趣蛋白质。

本发明更进一步系关于一种以本发明细胞(CHO/CERT 2.20＝DSMACC2989或CHO/CERT 2.41＝DSM ACC2990)于制造蛋白质上之用途。

更进一步，本发明系关于一种反应器/发酵容器，其含有于培养基中之本发明细胞。

本发明亦关于一种试剂盒，包括本发明细胞、用于表达感兴趣之基因的表达载体、及用于培养该细胞之细胞培养基。

于本发明之一项特定实施方案中，该试剂盒包括本发明细胞，其另外含有至少一个(第二)载体构建体，该载体构建体包括编码感兴趣蛋白质的感兴趣之基因，其中于反应器/发酵容器中，于允许该细胞增殖之培养基中，培养该细胞。

本发明更进一步系关于一种细胞，其包括CERT S132A表达盒，其中该细胞之特征为：

f)当利用基因组DNA作为模板时，具有特异性PCR条带图谱/指纹图谱，其中采用寡核苷酸引物SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3，会产生2373bpPCR产物，或

g)当利用基因组DNA作为模板时，具有特异性PCR条带图谱/指纹图谱，其中采用寡核苷酸引物SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：5，会产生660bp PCR产物(SEQ ID NO：6)，或

h)(a)中之CERT-特异性2373bp-PCR产物与如下限制酶一起温育，产生特异性片段数目及片段大小：

于一项特定实施方案中，CERT S132A表达盒系由SEQ ID NO：1组成。该细胞较佳为CHO细胞或NSO细胞。

于一项较佳实施方案中，该细胞(CHO/CERT 2.20)系以编号DSMACC2989保藏于德国微生物与细胞培养物保存中心(DSMZ)。

于另一较佳实施方案中，该细胞(CHO/CERT 2.41)系以编号DSMACC2990保藏于DSMZ。

实施例

材料及方法

细胞培养

将所有用于生产及开发规模之细胞系以连续种子储备培养物维持于表面通气之T型烧瓶(Nunc，Denmark)中，并置于37℃温度，且含有5％CO₂之氛围的培养箱(Thermo，Germany)或摇瓶(Nunc，Denmark)中。依接种密度为1-3E5个细胞/mL，每隔2至3天转种种子储备培养物。利用血球计数盘(hemocytometer)测定所有培养物中之细胞浓度。藉由锥蓝排除法(trypan blueexclusion method)分析存活率。

补料分批培养

将细胞依3×10⁵个细胞/ml接种于含于125ml摇瓶中之30ml不含抗生素或MTX之BI-专属生产培养基(Sigma-Aldrich，Germany)。于37℃下，及于5％CO₂中，依120rpm的速度振荡该培养物，且于第3天之后，使CO₂减少至2％。每日添加BI-专属进料溶液，且若需要，利用NaCO₃使pH调节至pH 7.0。利用自动CEDEX细胞计数系统(Innovatis)，藉由锥蓝排除法，测定细胞密度及存活率。

藉由胞内FACS染色及Western印迹法侦测CERT S132A表达

以胞内染色而言，将1×10⁶个细胞固定于含有1％多聚甲醛之PBS溶液中达20分钟，并在含有0.05％Tween-20之PBS中进行渗透。随后，使细胞再悬浮于1％BSA/PBS中，并利用抗-Flag M2单克隆小鼠抗体(Sigma)及经Alexa488标记之山羊抗-小鼠抗体(Invitrogen)染色。藉由流式细胞术(FACScalibur，Coulter)定量分析荧光信号。

于冰上，使5×10⁶个细胞于NP40-缓冲液[1％(v/v)NP40、50mM HEPESpH 7.9、150mM NaCl、1mM EDTA、5mM EGTA、25mM NaF及40μL/mL完全蛋白酶抑制剂溶液(Roche)]中裂解达15分钟，以制得用于Western印迹法之全细胞提取物。裂解物于16,000xg下离心10分钟进行澄清化，并利用BCA1分析试剂盒(Sigma)测定样本中蛋白质浓度。以Western印迹分析而言，根据制造商之说明，于NuPAGE 10％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上，利用MOPS缓冲液分离等量蛋白质。于XCell II印迹模块(Invitrogen)中，利用转移缓冲液使蛋白质转移至PVDF膜(Millipore)。利用封闭剂(Invitrogen)于室温下封闭1小时后，利用抗-Flag M2抗体(Sigma)探查该膜。采用ECL Plus化学法光侦测系统(Amersham Pharmacia)，利用与过氧化物酶偶联之二抗可观察到蛋白质。

产生会产生抗体之细胞

以编码IgG1型抗体重链及轻链的表达质粒稳定转染CHO-DG44细胞及conCERTTM细胞系。藉由随后于选择性条件下培养，自DG44亲本细胞系及conCERTTM细胞皆产生经稳定转染之产生IgG之细胞群体。根据标准贮藏培养物方法进一步培养细胞库，且每隔2至3天转种一次。

藉由ELISA测定重组产物之浓度

为评估自CHO-DG44细胞及conCERT^TM细胞系(经工程化可表达CERTS132A突变体)衍生之产生IgG细胞的重组抗体生产，于三次连续继代中之每次继代结束时，自标准接种培养物的细胞上清液收集样本。随后藉由酶联免疫吸附分析(ELISA)分析产物浓度。利用针对人类Fc片段(Jackson ImmunoResearch Laboratories)及人类κ轻链(HRP偶联)(Sigma)之抗体测定分泌型单克隆抗体产物之浓度。

单细胞分选

使用配备脉冲处理、分选加强模块、及自动细胞沉积组件之“FACSVantage”(Becton Dickinson)流式细胞仪分析细胞并加以分选。于前散射光及侧散射光之点图(FSC/SSC)上，在单一活细胞周围设立栅门(gate)。以自动细胞沉积组件使经分选细胞依每孔一个细胞沉积于含200μL生长培养基之96孔微滴定板中。

核酸分离及RT-PCR

根据制造商之说明，利用

试剂(德国Invitrogen)，自生长中细胞分离出基因组DNA及总RNA。随后，于37℃下，以DNA酶I处理RNA 30分钟。以3μg总RNA及寡聚(dT)寡核苷酸为起始物，利用经克隆AMV第一股cDNA合成试剂盒(德国Invitrogen)进行第一股cDNA合成。利用Absolute^TM QPCR

绿色荧光素混合物(ABgene，Surrey，UK)、及受MyIQ实时侦测软件控制之热循环装置(德国BioRad)，藉由实时PCR定量分析人类CERT转录物水平。

利用如下寡核苷酸引物，藉由对基因组DNA进行PCR，侦测可鉴别 conCERT^TM细胞之独特扩增物：

CMV有义：5′GACGTCAATGGGAGTTTGTTTTG 3′(SEQ ID NO：2)及

终止子反义：5′CAACTAGAAGGCACAGTCGAGG3′(SEQ ID NO：3)。

利用DNA或mRNA作为模板，利用如下寡核苷酸引物，藉由RT-PCR，产生660bp之PCR产物(SEQ ID NO：6)，而侦测CERT S132A表达：

CERT-正向：5′GCGTTCTGATGGTGACTTCTTG 3′(SEQ ID NO：4)及

CERT-反向：5′TGTCCTGTGACGCCTTTAACTG 3′(SEQ ID NO：5)。

实施例：产生细胞并鉴定其特征

实施例1：鉴定CHO/CERT S132A细胞系之特征，并独特鉴定该细胞系

CHO/CERT S132A细胞系(文中亦称为“conCERT^TM”细胞系)大体上可阐述为可异源表达人类CERT突变体S132A之细胞。

本发明中所阐述之CHO/CERT S132A细胞系含有如图1A所示之CERT表达盒，其包括：衍生自CMV增强子/启动子之上游调节序列(0.6kb)；Flag^TM表位标记之后具有突变变化(丝氨酸132突变成丙氨酸)之人类CERT基因(GeneID 10087)编码区(SEQ ID NO：1)；TGA终止密码子及包括聚腺苷酸化信号之0.5kb 3′非翻译区域。

用于产生本发明所述之CHO/CERT S132A细胞系的载体构建体示于图1B，且含有如下功能组件：

·巨细胞病毒(CMV)增强子/启动子

·编码经Flag^TM标记之CERT-SA的表达盒

·来自牛生长激素之聚腺苷酸化信号(bGH pA)

·用于产生嘌呤霉素抗性之表达盒

·复制起点

·用于在细菌中产生氨苄青霉素抗性之β-内酰胺酶表达盒

以编号DSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)及DSM ACC2990(CHO/CERT2.41)保藏于DSMZ之两种CHO/CERT S132A细胞系含有稳定性整合入其基因组之CERT S132A表达构建体。

含有该构建体之CHO/CERT S132A细胞系(诸如以编号DSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)保藏于DSMZ之细胞系、及以编号DSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)保藏于DSMZ之细胞系)可藉由对基因组DNA进行PCR加以鉴别。一组特定之寡核苷酸引物(SEQ ID NO：2及3)在PCR反应中会产生2373bp大小之独特信号，其可以侦测CHO/CERT细胞，且随后可与未转染上述CERT S132A表达构建体之细胞加以鉴别。引物之结合位置及方向显示于图1B(箭头)。

CMV有义：5′GACGTCAATGGGAGTTTGTTTTG 3′(SEQ ID NO：2)

终止子反义：5′CAACTAGAAGGCACAGTCGAGG 3′(SEQ ID NO：3)

当利用限制酶消化2373PCR片段时，会产生如表1中所概括之限制片段图谱。

表1：限制酶；由消化CERT-特异性2373bp-PCR产物所产生之片段数目及片段大小：

酶	片段数目	片段大小(bp)
			EcoRV	2	2236、137
HindIII(较佳)	2	2176、197
			KpnI	2	2142、231
NcoI	2	2096、277
			NdeI	2	1973、400
PvuII	2	1241、1132
			SpeI	2	2128、245
XhoI	2	2257、116
			AvaII	3	1140、832、401
BstXI	3	1980、266、127
			SalI	3	1673、491、209

使用DNA或mRNA作为模板，亦可藉由PCR侦测conCERT细胞系中之CERT S132A表达，其系使用寡核苷酸引物：CERT-正向：5′GCGTTCTGATGGTGACTTCTTG 3′(SEQ ID NO：4)及CERT-反向：5′TGTCCTGTGACGCCTTTAACTG 3′(SEQ ID NO：5)，产生660bp的如下序列(SEQ ID NO：6)之PCR产物：GCGTTCTGATGGTGACTTCTTGCATAGTACCAACGGCAATAAAGAAAAGTTATTTCCACATGTGACACCAAAAGGAATTAATGGTAIAGACTTTAAAGGGGAAGCGATAACTTTTAAAGCAACTACTGCTGGAATCCTTGCAACACTTTCTCATTGTATTGAACTAATGGTTAAACGTGAGGACAGCTGGCAGA AGAGACTGGATAAGGAAACTGAGAAGAAAAGAAGAACAGAGGAAGCATATAAAAATGCAATGACAGAACTTAAGAAAAAATCCCACTTTGGAGGACCAGATTATGAAGAAGGCCCTAACAGTCTGATTAATGAAGAAGAGTTCTTTGATGCTGTTGAAGCTGCTCTTGACAGACAAGATAAAATAGAAGAACAGTCACAGAGTGAAAAGGTGAGATTACATTGGCCTACATCCTTGCCCTCTGGAGATGCCTTTTCTTCTGTGGGGACACATAGATTTGTCCAAAAGGTTGAAGAGATGGTGCAGAACCACATGACTTACTCATTACAGGATGTAGGCGGAGATGCCAATTGGCAGTTGGTTGTAGAAGAAGGAGAAATGAAGGTATACAGAAGAGAAGTAGAAGAAAATGGGATTGTTCTGGATCCTTTAAAAGCTACCCATGCAGTTAAAGGCGTCACAGGACA。

本发明所述之CERT S132A细胞系CHO/CERT S132A 2.20及2.41可另外藉由异源表达Flag-CERT-S132A融合蛋白质而加以鉴别，其系利用针对Flag^TM表位标记(例如抗-Flag M2单克隆小鼠抗体(Sigma))或人类CERT蛋白质(例如CERT/GPBP抗体，克隆BL2222，Bethyl Laboratories公司)之抗体进行Western印迹法。两种抗体皆不会与仓鼠CERT蛋白质交叉反应。因此，仅可在CHO/CERT S132A细胞中测得CERT-特异性信号，而在不含有CERT S132A表达构建体之CHO细胞系中不会存在该信号。

携带CERT表达盒之载体构建体亦含有嘌呤霉素抗性基因。CHO/CERTS132A细胞因此能够在培养基存在5-10μg/ml嘌呤霉素下生长。

以编号DSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)及DSM ACC2990(CHO/CERT2.41)保藏于DSMZ之本发明所述CHO/CERT S132A细胞系为CHO-DG44细胞系之衍生物。因此，其同样需要在培养基中补充次黄嘌呤及胸苷，以进行生长及存活(HT补充作用)。

实施例2：产生经稳定转染CHO/CERT S132A细胞库

为产生本发明所述之CHO/CERT S132A细胞系，以携带与N-末端Flag^TM表位标记融合之人类CERT蛋白质突变变异体(CERT Ser132→Ala，文中称为“CERT-S132A”)表达盒之表达构建体(图1)转染CHO-DG44细胞[Urlaub等人，Cell 33，1983]。

蛋白质编码区具有如下序列(SEQ-ID NO：1；依5′-3′方向出示序列；起始密码子及终止密码子划有底线并加粗印刷，Flag^TM-标记编码区划有底线，且以斜体表示CERT编码区；经突变密码子(变化：Ser132→Ala)系以划底线及加粗印刷标记：GCCAGTGTGCTGGAATTCACC

GCCCCACTAGCCGACTACAAGGACGACGATGACAAG

TATTAACAGGTACTAGAAGATATGTTTTATCTTTTTTTAACTTTATTTGACTAATATGACTG

藉由于存在抗生素嘌呤霉素下之筛选作用，产生经稳定转染细胞库。利用针对Flag^TM标记或CERT-S132A蛋白质本身之抗体，以Western印迹法证实所产生稳定细胞库的CERT-S132A转基因表达。

由于细胞生产力系与CERT水平相关，因此选择CERT-S132A表达水平最高之细胞库用于后续之单细胞克隆术。

实施例3：产生并筛选单克隆CHO/CERT S132A细胞系

过量表达CERT-S132A之经稳定转染细胞库经受以FACS为基础之单细胞克隆术，以便产生单克隆conCERT^TM细胞系。随后根据两个参数进一步筛选出CHO/CERT S132A克隆：a)CERT-S132A表达水平高，b)在接种培养及补料分批工艺时，细胞生长性质皆最佳。在第一轮筛选时，由胞内染色测定＞100株CHO/CERT S132A克隆的CERT-S132A表达。其中，选出细胞内CERT-S132A水平最高之15株克隆用于扩大并进一步分析。利用抗-Flag^TM抗体，藉由Western印迹法进一步测定所选出之15株CHO/CERT S132A克隆的CERT-S132A表达(图3)。于克隆1.15、2.20、2.31、2.41、2.65、2.67、3.11及3.31中，CERT-SA突变体过度表达水平最高。

为了以产业方式生产宿主细胞系，于种子储备培养及补料分批工艺时，可在无血清之化学限定培养基中良好生长特性皆非常重要。因此，根据标准产业接种方法培养CHO/CERT S132A克隆，并测定增倍时间及存活率。图4显示根据生长速度(A)及在数个培养继代时之存活率(B)对15株CHO/CERT克隆之分级。细胞系CHO/CERT S132A 2.20(以编号DSM ACC2989保藏于DSMZ)及CHO/CERT S132A 2.41(以编号DSM ACC2990保藏于DSMZ)为四个具有最高增倍时间之细胞系中的两个细胞系，且所显示之存活率为80-100％(图5A)。随后，研究CHO/CERT S132A细胞克隆在摇瓶中补料分批发酵时之生长，其代表生物医药生产工艺之小规模模型。如图5A所示，所有CHO/CERT S132A克隆均可显示一般生长曲线，且初始生长期之特征为细胞浓度增加，且随后到达高原区，且随后减少，直至发酵结束。然而，CHO/CERTS132A克隆在初始期生长速度及最大细胞密度上不同。其转化成在整个生产工艺中之存活细胞的总积分值(IVC)不同(图5B)。在所有经分析之CHO/CERTS132A细胞系中，克隆1.13、2.20及2.41显示最高之IVC，其甚至比亲本CHO-DG44细胞系更高(图5B)。然而，克隆1.13之CERT-S132A表达水平低，且因此被排除。因此，选出本发明所述之两种细胞系CHO/CERT 2.20(以编号DSM ACC2989保藏于DSMZ)及CHO/CERT 2.41(以编号DSM ACC2990保藏于DSMZ)作为具有高CERT-SA表达水平及良好生长曲线之细胞。两种细胞系皆为用于产生重组蛋白质之较佳宿主细胞系的理想候选细胞系。

实施例4：CHO/CERT S132A细胞作为用于利用GS系统产生重组蛋白质之宿主细胞

以编号DSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)及DSM ACC2990(CHO/CERT2.41)保藏于DSMZ之细胞系为用于产生重组蛋白质之理想宿主细胞，此系因为其具有改善的分泌能力、及良好生长特性。由于亲本DG44细胞系，其为dhfr-缺陷型，且因此系与在生物医药产业中最广泛使用之重组蛋白质表达系统(称为二氢叶酸还原酶(DHFR))相容。此外，其与谷氨酰胺合成酶(GS)筛选/扩增系统及诸如新霉素、博来霉素(bleomycin)、潮霉素(hygromycin)及吉欧辛(zeozine)之其它常用筛选方法兼容。

实施例5：CHO/CERT S132A细胞作为用于产生重组IgG1抗体之宿主细胞

为证实彼等之优良特性，以编码人类单克隆IgG1型抗体之表达构建体转染本发明所述之conCERT^TM细胞及亲本CHO-DG44细胞系。藉由在不补充HT之无血清之化学合成培养基中，在存在抗生素G418下筛选，产生稳定产生IgG之细胞群体。随后，作为标准产业细胞系发展程序的一部份，使其利用甲氨喋呤(MTX)进行基因扩增。随后使所得之稳定的细胞库于摇瓶中进行补料分批发酵工艺。经10天之后，收集培养物，并由ELISA测定上清液中之IgG浓度。如图6中所示，衍生自亲本CHO-DG44细胞之10株产量最高之库的收获滴度中值显著低于衍生自conCERT^TM细胞系的生产用细胞。更进一步，DG44抗体生产者细胞的25-75％范围低于400mg/L，而CHO/CERT S132A IgG生产者细胞的25-75％范围为自＞400直至约1g/L。因此，衍生自CHO/CERT S132A细胞的生产用细胞库中所获之收获滴度比衍生自亲本细胞系之生产用细胞库高约2倍。

该等数据证实，以编号DSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)及DSMACC2990(CHO/CERT 2.41)保藏于DSMZ之CHO/CERT S132A细胞相较于亲本DG44细胞系而言，是用于产生重组蛋白质之较佳宿主细胞。

实施例6：CHO/CERT S132A细胞作为用于重组产生IgG4抗体之宿主细胞

为了证实彼等之较佳特性，以编码人类单克隆IgG4型抗体之表达构建体转染本发明所述之conCERT^TM细胞及亲本CHO-DG44细胞系。藉由于不含HT补充作用之无血清化学限定培养基中，在存在抗生素G418下筛选，产生稳定产生IgG之细胞群体。随后，作为标准产业细胞系发展程序之一部份，使其利用甲氨喋呤(MTX)进行基因扩增。随后，使所得之稳定细胞库于摇瓶中进行补料分批发酵工艺。经10天之后，收集培养物，并由ELISA测测定上清液中之IgG浓度。

衍生自亲本CHO-DG44细胞之10株产量最高之库的收获滴度中值显著低于衍生自conCERT^TM细胞系之生产用细胞。更进一步，DG44抗体生产者细胞之25-75％范围低于400mg/L，而CHO/CERT S132A IgG生产者细胞之25-75％范围为＞400至约1g/L。因此，衍生自CHO/CERT S132A细胞之生产者细胞库的收获滴度比衍生自亲本细胞系的生产者细胞库高约2倍。

制造生物医药需要产生用于产生cGMP之单克隆细胞系。因此，于下一步骤中，自表达水平最高之基因异源性细胞库产生细胞克隆。随后，如上所述，于接种培养及补料分批工艺时，分析各基因型中10株表达水平最高之重组克隆的性能。同样在单克隆细胞系水平上，衍生自conCERT^TM细胞系之IgG4生产者克隆(图7A-衍生自产生IgG4型抗体之CHO/CERT 2.20及2.41重组体(conCERT^TM)的表达水平最高之前10株单克隆细胞系)所显示的比生产力显著高于衍生自DG44细胞之前10株克隆(经典)。更进一步，其意指补料分批工艺时，自conCERT^TM细胞所获之总IgG4滴度最高(图7B)。

本实施例显示，以编号DSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)及DSMACC2990(CHO/CERT 2.41)保藏于DSMZ之CHO/CERT S132A细胞相较亲本DG44细胞系而言，是用于生产重组蛋白质之较佳宿主细胞。

实施例7：conCERT^TM细胞系生产更多生物医药蛋白质(Fc融合蛋白质)

以编码Fc-融合蛋白质(意指具治疗活性之与IgG抗体之Fc部份共价连接之(多)肽)(作为感兴趣之基因)之载体转染以编号DSM ACC2989(CHO/CERT2.20)及DSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)保藏于DSMZ之conCERT^TM细胞、及CHO DG 44细胞。经筛选之后，在四次随后之继代期间，自所有稳定细胞库之种子储备培养物获得上清液，并由ELISA测定产物滴度，并除以细胞平均数，以计算比生产力。比较后发现，衍生自conCERT^TM宿主细胞之生产用细胞的产物滴度显著高于衍生自DG44且表达Fc融合蛋白质之细胞。

于补料分批培养时，同样发现，衍生自conCERT^TM之细胞的融合蛋白质生产力显著增加，且收集时之滴度亦更高。

本实施例证实在细胞系发展时使用conCERT^TM宿主细胞能够产生在连续培养或生物反应器分批培养或补料分批培养时具有改进的比生产能力及更高滴度之生产用细胞系。

实施例8：conCERT^TM细胞系代表较佳之用于生物医药生产单链Fv(scFv)分子及域抗体的宿主细胞

以编码单链Fv(scFv)或域抗体(包括获自骆马或其它骆驼科动物之单链抗体可变区的一或多种域)(作为感兴趣基因)的载体转染以编号DSMACC2989(CHO/CERT 2.20)及DSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)保藏于DSMZ之conCERT^TM细胞、及CHO DG 44细胞。经筛选之后，在四次随后之继代期间，自所有稳定细胞库的种子储备培养物中获得上清液，并以ELISA测定产物滴度，并除以细胞平均数，以计算比生产力。比较后发现，衍生自conCERT^TM宿主细胞之生产用细胞的产物滴度显著高于衍生自DG44且表达scFv蛋白质或域抗体之细胞。

补料分批培养时亦发现，衍生自conCERT^TM之细胞具有显著增加之融合蛋白质生产力、及收集时之更高滴度。

本实施例证实，于细胞系发展时使用conCERT^TM宿主细胞，能够产生在连续培养或生物反应器分批培养或补料分批培养时，具有加强的比生产能力及更高滴度的生产用细胞系。

序列表：

SEQ ID NO：1 Flag-CERT-SA编码序列(利用引物CMV有义(SEQ ID NO：2)及终止子反义(SEQ ID NO：3)所产生之2373bp片段)

SEQ ID NO：2引物CMV有义

SEQ ID NO：3引物终止子反义

SEQ ID NO：4引物CERT-正向

SEQ ID NO：5引物CERT-反向

SEQ ID NO：6利用引物CERT-正向(SEQ ID NO：4)及CERT-反向(SEQ ID NO：5)所获得之660bp PCR产物

参考文献列表：

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Urlaub，G.，Kas，E.，Carothers，A.M.，及Chasin，L.A.(1983).Deletion of thediploid dihydrofolate reductase locus from cultured mammalian cells.Cell 33，405-412.

Claims

1.一种细胞，其系以编号DSM ACC2989(CHO/CERT 2.20)保藏于DSMZ(德国微生物与细胞培养物保存中心；Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)。

2.一种细胞，其系以编号DSM ACC2990(CHO/CERT 2.41)保藏于DSMZ。

3.如权利要求1或2之细胞，其中该细胞另外含有至少一个第二载体构建体，该构建体包括可编码感兴趣之蛋白质的感兴趣基因。

4.如权利要求3之细胞，其中所有载体构建体均稳定性地整合至细胞基因组中。

5.如权利要求1至4中任一项之细胞，其中该细胞之特征为

a)当利用基因组DNA作为模板时，具有特异性PCR条带图谱/指纹图谱，其中利用寡核苷酸引物SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3会产生2373bp PCR产物；或

b)当利用基因组DNA作为模板时，具有特异性PCR条带图谱/指纹图谱，其中利用寡核苷酸引物SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：5会产生660bp PCR产物(SEQ ID NO：6)；或

c)将(a)之CERT-特异性2373bp-PCR产物与下列限制酶温育后，会产生特异性之片段数目及片段大小：

酶片段数目片段大小(bp) EcoRV 2 2236、137 HindIII 2 2176、197 KpnI 2 2142、231 NcoI 2 2096、277 NdeI 2 1973、400 PvuII 2 1241、1132 SpeI 2 2128、245 XhoI 2 2257、116 AvaII 3 1140、832、401

BstXI 3 1980、266、127 SalI 3 1673、491、209

其中，以与HindIII一起温育较佳。

6.如权利要求1至5中任一项之细胞，其中该CERT S132A表达盒系由SEQ ID NO：1组成。

7.如权利要求3至6中任一项之细胞，其中该感兴趣蛋白质为治疗用蛋白质，较佳者为抗体或抗体融合蛋白质。

8.一种产生宿主细胞系之方法，其特征在于下列步骤：

a)提供亲本宿主细胞，较佳者为CHO或NSO细胞，

b)将包括CERT S132A表达盒之载体构建体引入至步骤(a)中之该亲本宿主细胞，

c)选出经稳定转染之细胞群，

d)藉由以FACS为基础之单细胞克隆术分离出单克隆细胞系，

e)根据如下标准筛选该单克隆细胞系：

i)CERT S132A表达水平高，

ii)种子储备培养时生长最佳，

iii)补料分批培养时生长最佳，

f)根据步骤(e)之筛选标准，自步骤(d)中之细胞克隆挑选出单克隆细胞系作为宿主细胞系。

9.一种产生宿主细胞之方法，其特征在于下列步骤：

a)提供亲本宿主细胞，较佳者为CHO或NSO细胞，

c)选出经稳定转染之细胞群，

d)藉由以FACS为基础之单细胞克隆术分离出细胞，

e)根据如下标准筛选该细胞：

i)CERT S132A表达水平高，

ii)种子储备培养时生长最佳，

iii)补料分批培养时生长最佳，

f)根据步骤(e)之筛选标准，挑选出单一克隆或一细胞库作为宿主细胞。

10.如权利要求8或9之方法，其中该步骤(b)中之CERT S132A表达盒系由SEQ ID NO：1组成。

11.一种在权利要求3至7中任一项中之细胞中产生由感兴趣之基因编码之感兴趣蛋白质的方法，其特征在于下列步骤：

a)提供如权利要求3至7中任一项之细胞，

b)在可以使至少一种感兴趣基因表达的条件下，培养该细胞。

12.如权利要求11之方法，其中该方法包括额外步骤c)收集该感兴趣之蛋白质。

13.如权利要求12之方法，其中该方法包括额外步骤d)纯化该感兴趣之蛋白质。

14.一种鉴别经转基因CERT S132A(SEQ ID NO：1)之细胞的方法，其系藉由：

a)进行聚合酶链式反应PCR，

b)使用基因组DNA作为模板，且

c)使用具有SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3之寡核苷酸引物，藉此产生2373bp PCR产物。

15.一种培养细胞之方法，包括

a)提供如权利要求1至7中任一项之细胞，及

b)在可以使该细胞增殖之条件下，培养该细胞。

16.一种以如权利要求1至7中任一项之细胞于制造蛋白质上之用途。

17.一种试剂盒，其包括如权利要求1或2中任一项之细胞、用于表达感兴趣基因的表达载体及用于培养该细胞之细胞培养基。